RU2689522C1 - Нуклеотидная последовательность, кодирующая слитый белок, состоящий из растворимого внеклеточного домена человеческого tnfr1 и константной части тяжёлой цепи человеческого igg4 - Google Patents
Нуклеотидная последовательность, кодирующая слитый белок, состоящий из растворимого внеклеточного домена человеческого tnfr1 и константной части тяжёлой цепи человеческого igg4 Download PDFInfo
- Publication number
- RU2689522C1 RU2689522C1 RU2018132410A RU2018132410A RU2689522C1 RU 2689522 C1 RU2689522 C1 RU 2689522C1 RU 2018132410 A RU2018132410 A RU 2018132410A RU 2018132410 A RU2018132410 A RU 2018132410A RU 2689522 C1 RU2689522 C1 RU 2689522C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- tnfr1
- human
- fusion protein
- extracellular domain
- heavy chain
- Prior art date
Links
- 102100033732 Tumor necrosis factor receptor superfamily member 1A Human genes 0.000 title abstract description 15
- 101710187743 Tumor necrosis factor receptor superfamily member 1A Proteins 0.000 title abstract description 8
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 title abstract description 6
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 title description 8
- 108060008682 Tumor Necrosis Factor Proteins 0.000 claims abstract description 22
- 102000003390 tumor necrosis factor Human genes 0.000 claims abstract description 10
- 239000005557 antagonist Substances 0.000 claims abstract description 8
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 claims abstract description 8
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 claims abstract description 8
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 claims abstract description 8
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 claims description 8
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 claims description 8
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 claims description 8
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 claims description 5
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 claims description 3
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 claims description 3
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims 1
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 abstract description 19
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 abstract description 18
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 abstract description 9
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 abstract description 5
- 230000010056 antibody-dependent cellular cytotoxicity Effects 0.000 abstract description 4
- 230000004540 complement-dependent cytotoxicity Effects 0.000 abstract description 4
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 abstract description 4
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 3
- 101100425753 Homo sapiens TNFRSF1A gene Proteins 0.000 abstract description 2
- 239000012636 effector Substances 0.000 abstract description 2
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract description 2
- 230000004927 fusion Effects 0.000 abstract 1
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 abstract 1
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 26
- 102000000852 Tumor Necrosis Factor-alpha Human genes 0.000 description 12
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 12
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 description 12
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 description 12
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 9
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 8
- 101000801228 Homo sapiens Tumor necrosis factor receptor superfamily member 1A Proteins 0.000 description 6
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 6
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 6
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 6
- 150000001413 amino acids Chemical group 0.000 description 5
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 5
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 description 4
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 4
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 4
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 4
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 4
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 4
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 3
- 108010008165 Etanercept Proteins 0.000 description 3
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 description 3
- 241000238631 Hexapoda Species 0.000 description 2
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 description 2
- 102000003960 Ligases Human genes 0.000 description 2
- 108090000364 Ligases Proteins 0.000 description 2
- TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L Magnesium chloride Chemical compound [Mg+2].[Cl-].[Cl-] TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 108010006785 Taq Polymerase Proteins 0.000 description 2
- 108060008683 Tumor Necrosis Factor Receptor Proteins 0.000 description 2
- 206010046851 Uveitis Diseases 0.000 description 2
- 108010084455 Zeocin Proteins 0.000 description 2
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 2
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 2
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 2
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 description 2
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 2
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 2
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 2
- 210000004978 chinese hamster ovary cell Anatomy 0.000 description 2
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 2
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 2
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 2
- 230000037417 hyperactivation Effects 0.000 description 2
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 description 2
- 230000002757 inflammatory effect Effects 0.000 description 2
- NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N insulin Chemical compound N1C(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(NC(=O)CN)C(C)CC)CSSCC(C(NC(CO)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CCC(N)=O)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CSSCC(NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2C=CC(O)=CC=2)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(C)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2NC=NC=2)NC(=O)C(CO)NC(=O)CNC2=O)C(=O)NCC(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CCCNC(N)=N)C(=O)NCC(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC(O)=CC=3)C(=O)NC(C(C)O)C(=O)N3C(CCC3)C(=O)NC(CCCCN)C(=O)NC(C)C(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(O)=O)=O)NC(=O)C(C(C)CC)NC(=O)C(CO)NC(=O)C(C(C)O)NC(=O)C1CSSCC2NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CC(N)=O)NC(=O)C(NC(=O)C(N)CC=1C=CC=CC=1)C(C)C)CC1=CN=CN1 NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000035778 pathophysiological process Effects 0.000 description 2
- CWCMIVBLVUHDHK-ZSNHEYEWSA-N phleomycin D1 Chemical compound N([C@H](C(=O)N[C@H](C)[C@@H](O)[C@H](C)C(=O)N[C@@H]([C@H](O)C)C(=O)NCCC=1SC[C@@H](N=1)C=1SC=C(N=1)C(=O)NCCCCNC(N)=N)[C@@H](O[C@H]1[C@H]([C@@H](O)[C@H](O)[C@H](CO)O1)O[C@@H]1[C@H]([C@@H](OC(N)=O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1)O)C=1N=CNC=1)C(=O)C1=NC([C@H](CC(N)=O)NC[C@H](N)C(N)=O)=NC(N)=C1C CWCMIVBLVUHDHK-ZSNHEYEWSA-N 0.000 description 2
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 2
- 206010039073 rheumatoid arthritis Diseases 0.000 description 2
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 2
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 2
- 239000012679 serum free medium Substances 0.000 description 2
- 238000002198 surface plasmon resonance spectroscopy Methods 0.000 description 2
- 229940124597 therapeutic agent Drugs 0.000 description 2
- 102000003298 tumor necrosis factor receptor Human genes 0.000 description 2
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 2
- JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 2-[4-(2-hydroxyethyl)piperazin-1-yl]ethanesulfonic acid Chemical compound OCC[NH+]1CCN(CCS([O-])(=O)=O)CC1 JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229920000936 Agarose Polymers 0.000 description 1
- HJCMDXDYPOUFDY-WHFBIAKZSA-N Ala-Gln Chemical compound C[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCC(N)=O HJCMDXDYPOUFDY-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 1
- 208000023275 Autoimmune disease Diseases 0.000 description 1
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 1
- 101150074775 Csf1 gene Proteins 0.000 description 1
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 1
- 108010016626 Dipeptides Proteins 0.000 description 1
- 239000006144 Dulbecco’s modified Eagle's medium Substances 0.000 description 1
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 1
- 241000748691 Furia Species 0.000 description 1
- 101001125540 Homo sapiens 26S proteasome regulatory subunit 6A Proteins 0.000 description 1
- 101000891654 Homo sapiens TATA-box-binding protein Proteins 0.000 description 1
- 101000801232 Homo sapiens Tumor necrosis factor receptor superfamily member 1B Proteins 0.000 description 1
- 102000004877 Insulin Human genes 0.000 description 1
- 108090001061 Insulin Proteins 0.000 description 1
- 239000012097 Lipofectamine 2000 Substances 0.000 description 1
- 208000035719 Maculopathy Diseases 0.000 description 1
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 1
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 1
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 1
- 208000037273 Pathologic Processes Diseases 0.000 description 1
- 229930182555 Penicillin Natural products 0.000 description 1
- JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N Penicillin G Chemical compound N([C@H]1[C@H]2SC([C@@H](N2C1=O)C(O)=O)(C)C)C(=O)CC1=CC=CC=C1 JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N 0.000 description 1
- 108010076504 Protein Sorting Signals Proteins 0.000 description 1
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 description 1
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 1
- BUGBHKTXTAQXES-UHFFFAOYSA-N Selenium Chemical compound [Se] BUGBHKTXTAQXES-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229920002684 Sepharose Polymers 0.000 description 1
- 238000012300 Sequence Analysis Methods 0.000 description 1
- 239000008049 TAE buffer Substances 0.000 description 1
- 102100040296 TATA-box-binding protein Human genes 0.000 description 1
- 102000004338 Transferrin Human genes 0.000 description 1
- 108090000901 Transferrin Proteins 0.000 description 1
- 102000004142 Trypsin Human genes 0.000 description 1
- 108090000631 Trypsin Proteins 0.000 description 1
- 102100033733 Tumor necrosis factor receptor superfamily member 1B Human genes 0.000 description 1
- HGEVZDLYZYVYHD-UHFFFAOYSA-N acetic acid;2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;2-[2-[bis(carboxymethyl)amino]ethyl-(carboxymethyl)amino]acetic acid Chemical compound CC(O)=O.OCC(N)(CO)CO.OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O HGEVZDLYZYVYHD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000001464 adherent effect Effects 0.000 description 1
- 238000001042 affinity chromatography Methods 0.000 description 1
- 108010081667 aflibercept Proteins 0.000 description 1
- 229960002833 aflibercept Drugs 0.000 description 1
- BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N ammonium sulfate Chemical compound N.N.OS(O)(=O)=O BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910052921 ammonium sulfate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000011130 ammonium sulphate Nutrition 0.000 description 1
- 229940088710 antibiotic agent Drugs 0.000 description 1
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 1
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 1
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 1
- 238000001816 cooling Methods 0.000 description 1
- 230000003013 cytotoxicity Effects 0.000 description 1
- 231100000135 cytotoxicity Toxicity 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 238000006471 dimerization reaction Methods 0.000 description 1
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 238000004520 electroporation Methods 0.000 description 1
- 230000008030 elimination Effects 0.000 description 1
- 238000003379 elimination reaction Methods 0.000 description 1
- 229940073621 enbrel Drugs 0.000 description 1
- 239000003623 enhancer Substances 0.000 description 1
- 239000013613 expression plasmid Substances 0.000 description 1
- 230000001605 fetal effect Effects 0.000 description 1
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 1
- 239000012737 fresh medium Substances 0.000 description 1
- 230000005714 functional activity Effects 0.000 description 1
- 238000011990 functional testing Methods 0.000 description 1
- 238000001502 gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 239000010931 gold Substances 0.000 description 1
- 229910052737 gold Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000003053 immunization Effects 0.000 description 1
- 238000002649 immunization Methods 0.000 description 1
- 230000005847 immunogenicity Effects 0.000 description 1
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 1
- 230000002779 inactivation Effects 0.000 description 1
- 229940042040 innovative drug Drugs 0.000 description 1
- 229940125396 insulin Drugs 0.000 description 1
- 208000002780 macular degeneration Diseases 0.000 description 1
- 229910001629 magnesium chloride Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 1
- 238000000034 method Methods 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- -1 nucleotide triphosphates Chemical class 0.000 description 1
- 238000005457 optimization Methods 0.000 description 1
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 1
- 239000006174 pH buffer Substances 0.000 description 1
- 230000009054 pathological process Effects 0.000 description 1
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 1
- 229940049954 penicillin Drugs 0.000 description 1
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 description 1
- 230000000144 pharmacologic effect Effects 0.000 description 1
- 238000002264 polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 1
- 229910052711 selenium Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011669 selenium Substances 0.000 description 1
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 1
- 150000003384 small molecules Chemical class 0.000 description 1
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 1
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 1
- 238000002626 targeted therapy Methods 0.000 description 1
- 229940126585 therapeutic drug Drugs 0.000 description 1
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 1
- 239000012096 transfection reagent Substances 0.000 description 1
- 239000012581 transferrin Substances 0.000 description 1
- 230000014616 translation Effects 0.000 description 1
- 239000001226 triphosphate Substances 0.000 description 1
- 235000011178 triphosphate Nutrition 0.000 description 1
- 239000012588 trypsin Substances 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000005253 yeast cell Anatomy 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
- C07K14/715—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants for cytokines; for lymphokines; for interferons
- C07K14/7151—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants for cytokines; for lymphokines; for interferons for tumor necrosis factor [TNF], for lymphotoxin [LT]
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/10—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA
- C12N15/1034—Isolating an individual clone by screening libraries
- C12N15/1051—Gene trapping, e.g. exon-, intron-, IRES-, signal sequence-trap cloning, trap vectors
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Zoology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Bioinformatics & Computational Biology (AREA)
- Crystallography & Structural Chemistry (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
Abstract
Изобретение относится к области биотехнологии, конкретно к рекомбинантному получению терапевтических белков, и может быть использовано для получения антагониста фактора некроза опухолей. Методами генной инженерии получают слитый полипептид-антагонист фактора некроза опухолей, состоящий из растворимого внеклеточного домена человеческого TNFR1 и константной части тяжёлой цепи человеческого IgG4. Изобретение обеспечивает получение гибридного белка TNFR1-Fc, который обладает потенциально улучшенными фармакокинетическими свойствами и минимальной эффекторной функцией антитело-зависимой клеточной цитотоксичности, но не характеризуется комплемент-зависимой цитотоксичностью, из-за введения шарнирного участка, позволяющего эктодомену TNFR1 и домену Fc действовать независимо друг от друга. 3 н. и 1 з.п. ф-лы, 1 ил., 2 пр.
Description
Область техники
Изобретение относится к биотехнологии, медицинским технологиям, в частности к созданию высокоэффективных лекарственных средств на основе биологических молекул.
Уровень техники
Последние достижения в области молекулярной и клеточной биологии позволили вывести понимание патофизиологических процессов, лежащих в основе большинства социально-значимых заболеваний на качественно новый уровень. В свою очередь это позволило создать новый класс биологических препаратов, специфически воздействующих лишь на ключевые молекулярные звенья патофизиологических процессов. Применение этого класса препаратов в медицине - «таргетная терапия» - по сравнению с предшествующими лекарственными препаратами показывает лучшую эффективность и безопасность за счет узкой направленности конкретные органы, ткани или типы клеток.
На сегодняшний день существует несколько подходов к созданию высоко специфичных препаратов. Из них в качестве лекарственных средств пока зарегистрирован ряд малых молекул, антител и растворимых рецепторов («трапы»). При этом биологические лекарственные препараты, например, на основе антител, в сочетании с равными или более высокими показателями эффективности, имеют лучшую переносимость и меньшие побочные эффекты, чем химические.
Большая часть ключевых игроков на рынке биологических препаратов используют для их создания технологию производства моноклональных антител (Novartis, Roche, Amgen). Она относится к одной из наиболее универсальных для создания лекарственных средств, поскольку позволяет создавать агенты против самых различных терапевтических мишеней. Однако, существенным «минусом» технологии является сложность и высокая стоимость разработки в сочетании с высокой наукоемкостью производством.
Технология, которая решает указанную проблему, это технология производства рецепторов-«трапов». В первую очередь, рецепторы-«трапы» имеют лучшие показатели временных и финансовых затрат на создание и производство терапевтического препарата по сравнению с моноклональными антителами. Это обусловлено отсутствием необходимости проведения длительных и дорогостоящих экспериментов по иммунизации, гуманизации и скринингу антител. Во-вторых, терапевтически агенты рецепторы-«трапы» обладают большей эффективностью. Ключевым игроком на данном рынке является компания Регенерон, имеющая на территории РФ зарегистрированный в качестве лекарственного средства рецептор-«трап» для лечения макулодистрофии - Эйлеа® (Афлиберцепт).
Технология получения рецепторов-«трапов» основана на создании гибридного белка, способного эффективно и быстро связывать молекулу-мишень. Как правило, рецептор-«трап» состоит из двух частей - внеклеточного домена рецептора молекулы-мишени Fc-домена иммуноглобулина. Внеклеточный домен рецептора отвечает за связывание мишени, а Fc-домен осуществляет димеризацию гибридного белка. Последнее необходимо для увеличения эффективности связывания и обеспечения большей стабильности высокомолекулярного комплекса.
Присутствующий на рынке препарат на основе рецептора-«трапа» Etanercept (Enbrel), адресно связывающий фактор некроза опухолей (TNFα, ФНО), характеризуется рядом свойств, которые могут быть существенно превзойдены путем создания новой комбинаторной белковой конструкции, состоящей из частей биологических молекул с заданными свойствами.
Несмотря на наличие нескольких биологических препаратов, нейтрализующих фактор некроза опухолей TNFα, на рынке сохраняется потребность в новых биологических препаратах с улучшенными свойствами. Эта потребность обусловлена высокой стоимостью инновационных препаратов, часто возникающей резистентностью пациентов к определенному препарату (связанную с его иммуногенностью), а также с растущим во всем мире числом аутоиммунных заболеваний, в которых ФНО играет ключевую роль в патологическом процессе. Данное изобретение обладает рядом улучшенных свойств по сравнению с аналогами, и поэтому расширяет круг имеющихся кандидатов для лечения заболеваний, вызванных гиперактивацией ФНО.
Сущность изобретения
Задачей настоящего изобретения является расширение арсенала технических средств для лечения заболеваний, вызванных гиперактивацией TNFα (ФНО), и создание терапевтического агента на основе слитого белка TNFR-Fc с улучшенными свойствами. Указанная задача решается путем создания гибридного полипептид-антагониста фактора некроза опухолей, имеющего аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 2, а также создания молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующей данный гибридный полипептид-антагонист фактора некроза опухолей. В некоторых вариантах изобретения данная молекулы нуклеиновой кислоты имеет нуклеотидную последовательность SEQ ID NO: 1. Также указанная задача решается путем создания экспрессирующего вектора, содержащего данную молекулу нуклеиновой кислоты под контролем регуляторных элементов, необходимых для экспрессии данной нуклеиновой кислоты в клетке-хозяине. В предпочтительных вариантах изобретения в качестве клетки-хозяина могут выступать клетки яичников китайских хомячков CHO (клеточные линии CHO-К1 или CHO DG44), адаптированные для производства терапевтических белков.
В настоящем изобретении экспрессирующий вектор предпочтительно подбирается для экспрессии гетерологичных последовательностей в клетках млекопитающих, но в некоторых вариантах изобретения экспрессирующий вектор может быть выбран для экспрессии в других системах, таких как, например, клетки насекомых, дрожжевые или бактериальные клетки. Соответственно, каждый экспрессирующий вектор имеет свой набор регуляторных элементов, позволяющих проводить экспрессию гетерологичной последовательности (продукта) в клетке-хозяине, таких как промоторы и/или энхансеры, и/или polyA последовательности.
При осуществлении изобретения достигается следующий технический результат: создан новый вариант терапевтического агента на основе гибридного белка с улучшенными свойствами и с последовательностью SEQ ID NO: 2 для блокировки воспалительного цитокина ФНО, при этом данный гибридный белок обладает: а) только минимальной эффекторной функцией антитело-зависимой клеточной цитотоксичности; б) не обладает комплемент-зависимой цитотоксичностью; в) потенциально улучшенными фармакокинетическими свойствами из-за введения шарнирного участка, позволяющего эктодомену TNFR1 и домену Fc действовать независимо друг от друга.
Краткое описание рисунков
Рис.1. Схема экспрессирующего вектора, содержащего заявляемую нуклеотидную последовательность, кодирующую гибридный полипептид-антагонист фактора некроза опухолей TNFR1-hinge-hIgG4_Fc.
Подробное раскрытие изобретения
В описании данного изобретения термины «включает» и «включающий» интерпретируются как означающие «включает, помимо всего прочего». Указанные термины не предназначены для того, чтобы их истолковывали как «состоит только из».
Сущность технического решения заключается в создании нуклеотидной последовательности (SEQ ID No:1), которая кодирует гибридный белок с последовательностью SEQ ID No:2, состоящий из сигнального пептида (аминокислоты 1 - 20) и трех функциональных частей, первая из которых кодирует растворимый внеклеточный домен человеческого TNFR1 (он же TNFRSF1A, CD120a; FPF; MS5; TBP1; TNF-R; TNF-R-I; TNF-R55; TNFAR; TNFR1; TNFR1-d2; TNFR55; TNFR60; p55; p55-R; p60) (аминокислоты 21 - 255), вторая кодирует шарнирный участок (аминокислоты 261 - 267), а третья кодирует константную часть тяжёлой цепи человеческого IgG4 (аминокислоты 268 - 484).
Кодирующая нуклеотидная последовательность SEQ ID No:1 может быть изменена для оптимизации уровня экспрессии в клетках определенного типа. При использовании гетерологичных систем экспрессии (например, клетки насекомых, бактериальные или дрожжевые клетки) может потребоваться оптимизация кодонов в последовательности (замена редко используемых в организме кодонов на часто используемые). Это можно сделать с помощью алгоритмов, реализованных во многих имеющихся алгоритмах для проектирования последовательностей, например, Codon optimizer, Gene Designer, или OPTIMIZER.
Экспрессия гибридной конструкции в клетках млекопитающих возможна при помощи создания стабильных клонов-продуцентов после трансфекции клеток этой конструкцией. Может быть использована трансфекция электропорацией или с использованием трансфецирующего реагента, такого как Lipofectamine 2000. Данная гибридная конструкция может быть также использована для введения в лентивирусную конструкцию и последующего заражения клеток. Для увеличения выхода гибридного белка в клетках млекопитающих возможно использование различных подходов. Методы оптимизации известны специалистам и описаны, например, в (Almo SC, Love JD. Better and faster: improvements and optimization for mammalian recombinant protein production. Curr Opin Struct Biol. 2014 Jun;26:39-43).
Заявляемый продукт является ранее не создававшейся комбинацией нуклеотидных последовательностей генома человека и призван быть экспрессионной основой для слитого белка с предсказываемыми улучшенными фармакологическими свойствами для блокировки воспалительных цитокина ФНО при лечении ревматоидного артрита и увеита, а именно: (1) минимальной эффекторной функцией для антитело-зависимой клеточной цитотоксичности (antibody-dependent cellular cytotoxicity - ADCC) и комплемент-зависимой цитотоксичности (complement-dependent cytotoxicity - CDC) благодаря использованию константной части иммуноглобулина человека IgG4-изотипа; (2) потенциально улучшенными фармакокинетическими свойствами из-за введения шарнирного участка, который позволяет двум частям молекулы, а именно внеклеточному домену TNFR1 и Fc действовать независимо друг от друга за счет увеличения гибкости молекулы на данном участке. Предполагаемая константа связывания гибридного полипептида с фактором некроза опухолей составляет около 1 нM, что достаточно для осуществления эффективной блокировки ФНО in vivo (Lang I et al., "Binding Studies of TNF Receptor Superfamily (TNFRSF) Receptors on Intact Cells" J Biol Chem, 2016 Mar 4;291(10):5022-37). После прохождения испытаний по безопасности на животных и клинических испытаний, гибридный белок по настоящему изобретению может быть включен в состав фармацевтической композиции для лечения заболеваний человека, таких как ревматоидный артрит и увеит.
Нижеследующие примеры приведены в целях раскрытия характеристик настоящего изобретения и их не следует рассматривать как каким-либо образом ограничивающие объем изобретения.
Пример 1. Конструирование плазмиды.
Для конструирования плазмиды с заявляемой нуклеотидной последовательностью использована плазмида RG208641, содержащая участок, кодирующий рецепторную часть белка hTNFR - TNFRSF1B (NM_001066) Human Tagged ORF Clone (CAT#: RG208641, OriGene, US, https://www.origene.com/catalog/cdna-clones/expression-plasmids/rg208641/tnfrsf1b-nm_001066-human-tagged-orf-clone ). Рецепторная (внеклеточная, растворимая) часть белка TNFR1 была выбран биоинформатическим анализом последовательности и использована для последующего клонирования. Для клонирования этого участка подобраны следующие праймеры:
Lob_TNF_F TATGAATTCGTTGCCCGCCCAGGTGGCA
Lob_TNF_R TATCCATGGCGTCGCCAGTGCTCCCTTCA
В праймеры были включены сайты рестрикции для рестриктаз EcoRI (прямой праймер Lob_TNF_F) и NcoI (обратный праймер Lob_TNF_R)
Проведена ПЦР со следующими условиями: 94 оС 3 мин, 25 циклов (94 оС 15 сек, 61 оС 15 сек, 72 оС 1 мин), 72оС 5 мин. Компоненты реакции: полимераза – смесь 9:1 Taq – полимеразы с Furia – полимеразой (производство «Бигль»), буфер для Taq-полимеразы с сульфатом аммония и 2,5 mM MgCl2 (Fermentas), по 0,4 mM каждого из праймеров и 0,25 mM смеси трифосфатов нуклеотидов (Fermentas). После ПЦР: ПЦР продукт очищали набором для очистки ПЦР продуктов PCR Purification kit QIAquick (QiaGene Cat.No 28106). Концентрация и соответствие предсказанному молекулярному весу проверяли при помощи гель-электрофореза в 1% агарозе (ТАЕ буфер). Полученный ПЦР продукт с рестрикционными сайтами EcoRI и NcoI был использован для дальнейшего конструирования.
Целевой вектор (InvivoGen) и ПЦР продукт обрабатывали рестриктазами EcoRI и NcoI (Fermentas) в течение 1 часа при 37 оС, очищали с помощью PCR Purification kit QIAquick и лигировали, используя 1 U лигазы (Fermentas) по протоколу производителя. Лигазной смесью трансформировали компетентные клетки E.coli Xl10-gold и высевали на среду LB, содержащую зеоцин. Чашки инкубировали в термостате в течение ночи при 37 oC. На следующий день из 20 колоний проверяли на присутствие нужной вставки, для этого часть колонии разводили в 50 мкл воды и кипятили в течение 5 минут. После охлаждения смесь использовали в качестве матрицы в реакции ПЦР. Присутствие вставки проверяли после электрофореза ПЦР продуктов. Из двух колоний, содержащих вставку выделяли плазмидную ДНК и секвенировали на секвенаторе Applied Biosystems 3500 по инструкции производителя, используя праймеры F2(прямой) и FC(обратный).
Сконструированная в результате плазмида, содержащая заявляемую нуклеотидную последовательность, была проверена на отсутствие ошибок при помощи секвенирования с двух праймеров F2 (прямой) и FC (обратный), и показана на Рис. 1.
Пример 2. Продукция гибридного белка.
Для продукции гибридного полипептид-антагониста фактора некроза опухолей TNFR1-hinge-hIgG4_Fc получали стабильную клеточную линию на основе клеток яичников китайских хомячков CHO-K1, адаптированных для производства терапевтических белков. Для получения стабильной клеточной линии использовали прибор Nucleofector 2b (Lonza, Швейцария) и набор Amaxa® Nucleofector® kit T (Lonza, Швейцария) согласно инструкции производителя. Клетки, находившиеся в состоянии 60% конфлюэнтности, снимали с флакона обработкой 0.25% раствором трипсина в изотоническом буфере. Открепившиеся клетки ресуспендировали в 4.5 мл среды DMEM с 10% бычьей фетальной сыворотки и использовали 1 млн. клеток для одной трансфекции. Суспензию клеток центрифугировали 5 мин при 150 g. Полученный клеточный осадок ресуспендировали в свежеприготовленном растворе Nucleofector® Solution (Lonza, Швейцария), добавляли 2 мкг соответствующей линеаризованной плазмиды, переносили в кювету и запускали программу трансфекции U-023 (максимальная эффективность, низкая выживаемость). После чего рассевали в 6-луночные планшеты в ростовой среде без селектирующего антибиотика. Спустя 6 часов прикрепившиеся клетки снимали и рассевали 1 лунку 6-луночного планшета на 24-луночный планшет. Спустя 16 часов после трансфекции клеточная культура подвергалась селекции на антибиотике зеоцин с концентрацией 600 мкг/мл. Для этого ростовую среду заменяли на свежую с антибиотиком по 0.5 мл в лунку. Спустя 3 дня среду меняли на 0.5 мл свежей среды с антибиотиком. Процедуру повторяли каждые 3 дня до достижения конфлюэнтности клеток в лунках. После этого лунки тестировали с целью определения уровня экспрессии гибридного белка. Для скрининга на экспрессию Fc-гибрида одиночные колонии выращивали в 96-луночном планшете (Corning, США) с 80 мкл среды CSFM (полная бессывороточная среда, содержащая 25 мM Hepes, 50 IU/мл пенициллина, инсулин, трансферрин и селениум (Invitrogen, США). На следующий день отбирали среду и содержимое анализировали при помощи стандартного гель-электрофореза в полиакриамидном геле (SDS-PAGE). Секретируемый гибридный белок визуализировали с использованием кроличьих антител против человечьего Fc-домена (Jackson Immunoresearch, США). Отдельные отобранные по уровню экспрессии колонии подвергали трипсинизации и клетки переносили в лунку 12-луночного планшета. Далее выросшие клетки частично замораживали, а частично субклонировали, используя 96-луночный планшет. Субклонирование повторяли до тех пор, пока все одиночные колонии показывали стабильно высокий уровень экспрессии гибридного белка, тогда такую колонию сохраняли для создания банка из клонов-продуцентов. Для продукции гибридного белка размороженные клетки ресуспендировали в 10 мл свежей ростовой среды и высевали в 2 флакона (25 см2). По достижении конфлюэнтности клетки пересевали последовательно последовательно во флаконы большей емкости. Спустя 3 дня среду с сывороткой меняли на бессывороточную среду ProCHO4 (Lonza, Швейцария) с добавками 4 мМ дипептида GlutaMAX (Gibco, США) и смеси антибиотиков. Для очистки гибридного белка культуральную среду, полученную в процессе роста клонов-продуцентов, подвергали фильтрации от клеточного дебриса с использованием фильтрационных модулей 0.45 мкм и 0.22 мкм (Millipore, США). Далее гибридный белок очищали при помощи аффинной хроматографии с использованием Протеин А сефарозы (Millipore, США); элицию с колонки проводили при помощи буфера с низким рН. Полученный гибридный белок тестировали на функциональную активность (связывание и инактивация ФНО) при помощи стандартных методов, таких как метод поверхностного плазмонного резонанса (SPR) и функциональные тесты на активность ФНО.
Несмотря на то, что изобретение описано со ссылкой на раскрываемые варианты воплощения, для специалистов в данной области должно быть очевидно, что конкретные подробно описанные эксперименты приведены лишь в целях иллюстрирования настоящего изобретения, и их не следует рассматривать как каким-либо образом ограничивающие объем изобретения. Должно быть понятно, что возможно осуществление различных модификаций без отступления от сути настоящего изобретения.
Claims (4)
1. Гибридный полипептид-антагонист фактора некроза опухолей, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 2.
2. Изолированная молекула нуклеиновой кислоты, кодирующая гибридный полипептид-антагонист фактора некроза опухолей по п. 1.
3. Изолированная молекула нуклеиновой кислоты по п. 2, имеющая последовательность SEQ ID NO: 1.
4. Экспрессирующий вектор, содержащий молекулу нуклеиновой кислоты по п. 2 под контролем регуляторных элементов, необходимых для экспрессии данной нуклеиновой кислоты в клетке-хозяине.
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
RU2018132410A RU2689522C1 (ru) | 2018-09-11 | 2018-09-11 | Нуклеотидная последовательность, кодирующая слитый белок, состоящий из растворимого внеклеточного домена человеческого tnfr1 и константной части тяжёлой цепи человеческого igg4 |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
RU2018132410A RU2689522C1 (ru) | 2018-09-11 | 2018-09-11 | Нуклеотидная последовательность, кодирующая слитый белок, состоящий из растворимого внеклеточного домена человеческого tnfr1 и константной части тяжёлой цепи человеческого igg4 |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
RU2689522C1 true RU2689522C1 (ru) | 2019-05-28 |
Family
ID=67037150
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
RU2018132410A RU2689522C1 (ru) | 2018-09-11 | 2018-09-11 | Нуклеотидная последовательность, кодирующая слитый белок, состоящий из растворимого внеклеточного домена человеческого tnfr1 и константной части тяжёлой цепи человеческого igg4 |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
RU (1) | RU2689522C1 (ru) |
Cited By (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
RU2787060C1 (ru) * | 2021-10-11 | 2022-12-28 | Общество с ограниченной ответственностью "Пальмира Биофарма" | НУКЛЕОТИДНАЯ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЬ, КОДИРУЮЩАЯ СЛИТЫЙ БЕЛОК, СОСТОЯЩИЙ ИЗ РАСТВОРИМОГО ВНЕКЛЕТОЧНОГО ФРАГМЕНТА ЧЕЛОВЕЧЕСКОГО Dll4 И КОНСТАНТНОЙ ЧАСТИ ТЯЖЕЛОЙ ЦЕПИ ЧЕЛОВЕЧЕСКОГО IgG4 |
WO2023063842A1 (ru) * | 2021-10-12 | 2023-04-20 | Общество с ограниченной ответственностью "Пальмира Биофарма" | Нуклеотидная последовательность, кодирующая слитый белок |
Citations (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2012064682A1 (en) * | 2010-11-08 | 2012-05-18 | Regeneron Pharmaceuticals, Inc. | Human antibodies to human tnf-like ligand 1a (tl1a) |
EP3006455A1 (en) * | 2013-05-31 | 2016-04-13 | Hanmi Pharm. Co., Ltd. | Igg4 fc fragment comprising modified hinge region |
RU2625010C1 (ru) * | 2016-11-10 | 2017-07-11 | Илья Петрович Приколаб | Экспрессионный плазмидный вектор для экспрессии активной формы TNFR1-Fc и способ получения рекомбинантного белка |
-
2018
- 2018-09-11 RU RU2018132410A patent/RU2689522C1/ru active
Patent Citations (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2012064682A1 (en) * | 2010-11-08 | 2012-05-18 | Regeneron Pharmaceuticals, Inc. | Human antibodies to human tnf-like ligand 1a (tl1a) |
EP3006455A1 (en) * | 2013-05-31 | 2016-04-13 | Hanmi Pharm. Co., Ltd. | Igg4 fc fragment comprising modified hinge region |
RU2625010C1 (ru) * | 2016-11-10 | 2017-07-11 | Илья Петрович Приколаб | Экспрессионный плазмидный вектор для экспрессии активной формы TNFR1-Fc и способ получения рекомбинантного белка |
Cited By (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
RU2787060C1 (ru) * | 2021-10-11 | 2022-12-28 | Общество с ограниченной ответственностью "Пальмира Биофарма" | НУКЛЕОТИДНАЯ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЬ, КОДИРУЮЩАЯ СЛИТЫЙ БЕЛОК, СОСТОЯЩИЙ ИЗ РАСТВОРИМОГО ВНЕКЛЕТОЧНОГО ФРАГМЕНТА ЧЕЛОВЕЧЕСКОГО Dll4 И КОНСТАНТНОЙ ЧАСТИ ТЯЖЕЛОЙ ЦЕПИ ЧЕЛОВЕЧЕСКОГО IgG4 |
WO2023063842A1 (ru) * | 2021-10-12 | 2023-04-20 | Общество с ограниченной ответственностью "Пальмира Биофарма" | Нуклеотидная последовательность, кодирующая слитый белок |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
JP5372917B2 (ja) | 最適化されたTACI−Fc融合タンパク質 | |
JP4454493B2 (ja) | 新規キメラcd154 | |
JP5432117B2 (ja) | 宿主細胞中の組換えタンパク質の発現を増進するための組換え発現ベクター要素(rEVE) | |
JP2019519223A (ja) | 免疫調節タンパク質及び腫瘍抗原に結合する二重特異性結合タンパク質 | |
KR20230157526A (ko) | T 조절 세포의 증식을 위한 인터류킨-2 뮤테인 | |
EP2956471B1 (en) | Il-1beta inhibitor composition and use thereof | |
JP2022528030A (ja) | 多機能性融合タンパク質及びその使用 | |
KR20110044769A (ko) | 발현 벡터 및 그의 방법 | |
JP3121611B2 (ja) | 神経成長因子を真核生物細胞において発現させるための遺伝子ベクター | |
TR201802431T4 (tr) | Protein üretme usulü. | |
CN110257429A (zh) | 重组表达载体、靶向性的t细胞及它们的应用 | |
CN111989340A (zh) | 一种重组人白细胞介素10融合蛋白及其应用 | |
JP2007500016A (ja) | 培養においてタンパク質生成を増大させるための方法 | |
US20240209049A1 (en) | Heterodimeric fc cytokines and uses thereof | |
RU2689522C1 (ru) | Нуклеотидная последовательность, кодирующая слитый белок, состоящий из растворимого внеклеточного домена человеческого tnfr1 и константной части тяжёлой цепи человеческого igg4 | |
RU2555533C9 (ru) | Рекомбинантная плазмидная днк, кодирующая химерное антитело против фактора некроза опухоли-альфа человека, линия эукариотических клеток-продуцент химерного антитела и способ получения химерного антитела | |
CN111848806A (zh) | Egfr-cd3双功能抗体及其应用 | |
RU2656142C1 (ru) | РЕКОМБИНАНТНАЯ ПЛАЗМИДНАЯ ДНК pBiPr-ABIgA1FI6-ht ДЛЯ ПОЛУЧЕНИЯ РЕКОМБИНАНТНОГО ИММУНОГЛОБУЛИНА А ИЗОТИПА IGA1 | |
WO2023070056A2 (en) | Heterodimeric fc cytokines and uses thereof | |
CN112574315B (zh) | 改变效应功能的Fc变体及其融合蛋白 | |
EP2771356B1 (en) | Chimeric molecule involving oligomerized fasl extracellular domain | |
US20090111146A1 (en) | Antibody Drug | |
EP1365027A2 (en) | Fas ligand-fused proteins | |
RU2821896C1 (ru) | Нуклеотидная последовательность, кодирующая слитый белок, состоящий из функционального фрагмента человеческого IL-1RA и константной части тяжелой цепи человеческого IgG4 | |
RU2818329C1 (ru) | Нуклеотидная последовательность, кодирующая слитый белок, состоящий из растворимого экстраклеточного фрагмента человеческого IL-6R и константной части тяжелой цепи человеческого IgG4 |