WO2023063842A1 - Нуклеотидная последовательность, кодирующая слитый белок - Google Patents
Нуклеотидная последовательность, кодирующая слитый белок Download PDFInfo
- Publication number
- WO2023063842A1 WO2023063842A1 PCT/RU2021/000434 RU2021000434W WO2023063842A1 WO 2023063842 A1 WO2023063842 A1 WO 2023063842A1 RU 2021000434 W RU2021000434 W RU 2021000434W WO 2023063842 A1 WO2023063842 A1 WO 2023063842A1
- Authority
- WO
- WIPO (PCT)
- Prior art keywords
- dii4
- protein
- fusion protein
- seq
- fragment
- Prior art date
Links
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 title claims abstract description 49
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 title claims abstract description 48
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 title claims description 15
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 title claims description 13
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 claims abstract description 60
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims abstract description 43
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims abstract description 41
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims abstract description 23
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 claims abstract description 23
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 claims abstract description 20
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 claims abstract description 20
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 38
- 101100118545 Holotrichia diomphalia EGF-like gene Proteins 0.000 claims description 17
- 239000005557 antagonist Substances 0.000 claims description 17
- 102000018071 Immunoglobulin Fc Fragments Human genes 0.000 claims description 14
- 108010091135 Immunoglobulin Fc Fragments Proteins 0.000 claims description 14
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims description 14
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 claims description 10
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 claims description 10
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 claims description 5
- 108010076504 Protein Sorting Signals Proteins 0.000 claims description 4
- 241000699802 Cricetulus griseus Species 0.000 claims description 3
- 210000001672 ovary Anatomy 0.000 claims description 2
- 210000002308 embryonic cell Anatomy 0.000 claims 1
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 abstract description 54
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 abstract description 53
- 102000005650 Notch Receptors Human genes 0.000 abstract description 36
- 108010070047 Notch Receptors Proteins 0.000 abstract description 36
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 abstract description 18
- 201000010099 disease Diseases 0.000 abstract description 16
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 abstract description 15
- 230000000302 ischemic effect Effects 0.000 abstract description 13
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 abstract description 10
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 abstract description 8
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 abstract description 8
- 230000000771 oncological effect Effects 0.000 abstract description 7
- 230000035515 penetration Effects 0.000 abstract description 6
- 230000019491 signal transduction Effects 0.000 abstract description 5
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 4
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 abstract description 2
- 108700041286 delta Proteins 0.000 description 69
- 238000000034 method Methods 0.000 description 17
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 15
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 15
- 230000011664 signaling Effects 0.000 description 14
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 13
- 108010029741 Notch4 Receptor Proteins 0.000 description 12
- 102000001753 Notch4 Receptor Human genes 0.000 description 12
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 12
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 11
- 230000033115 angiogenesis Effects 0.000 description 10
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 10
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 10
- 239000003446 ligand Substances 0.000 description 10
- 238000011282 treatment Methods 0.000 description 9
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 8
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 8
- 239000000047 product Substances 0.000 description 8
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 7
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 7
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 7
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 6
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 6
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 6
- 208000024172 Cardiovascular disease Diseases 0.000 description 5
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 5
- 210000002889 endothelial cell Anatomy 0.000 description 5
- 208000028867 ischemia Diseases 0.000 description 5
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 5
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 5
- 230000008054 signal transmission Effects 0.000 description 5
- 230000014616 translation Effects 0.000 description 5
- YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N (+)-Biotin Chemical compound N1C(=O)N[C@@H]2[C@H](CCCCC(=O)O)SC[C@@H]21 YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N 0.000 description 4
- 208000025721 COVID-19 Diseases 0.000 description 4
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 4
- 208000035473 Communicable disease Diseases 0.000 description 4
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 description 4
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 description 4
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 description 4
- 230000003213 activating effect Effects 0.000 description 4
- 230000002491 angiogenic effect Effects 0.000 description 4
- 230000010056 antibody-dependent cellular cytotoxicity Effects 0.000 description 4
- 210000004978 chinese hamster ovary cell Anatomy 0.000 description 4
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 4
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 description 4
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 description 4
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 4
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 4
- 210000003606 umbilical vein Anatomy 0.000 description 4
- 230000002792 vascular Effects 0.000 description 4
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 3
- 108010081348 HRT1 protein Hairy Proteins 0.000 description 3
- 102100039990 Hairy/enhancer-of-split related with YRPW motif protein 2 Human genes 0.000 description 3
- 101001002170 Homo sapiens Glutamine amidotransferase-like class 1 domain-containing protein 3, mitochondrial Proteins 0.000 description 3
- 101001035089 Homo sapiens Hairy/enhancer-of-split related with YRPW motif protein 2 Proteins 0.000 description 3
- 101000843556 Homo sapiens Transcription factor HES-1 Proteins 0.000 description 3
- 108010090804 Streptavidin Proteins 0.000 description 3
- 102100030798 Transcription factor HES-1 Human genes 0.000 description 3
- 108010084455 Zeocin Proteins 0.000 description 3
- 230000017531 blood circulation Effects 0.000 description 3
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 3
- 230000008859 change Effects 0.000 description 3
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 3
- 230000004540 complement-dependent cytotoxicity Effects 0.000 description 3
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 3
- 210000003141 lower extremity Anatomy 0.000 description 3
- 108010082117 matrigel Proteins 0.000 description 3
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 3
- CWCMIVBLVUHDHK-ZSNHEYEWSA-N phleomycin D1 Chemical compound N([C@H](C(=O)N[C@H](C)[C@@H](O)[C@H](C)C(=O)N[C@@H]([C@H](O)C)C(=O)NCCC=1SC[C@@H](N=1)C=1SC=C(N=1)C(=O)NCCCCNC(N)=N)[C@@H](O[C@H]1[C@H]([C@@H](O)[C@H](O)[C@H](CO)O1)O[C@@H]1[C@H]([C@@H](OC(N)=O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1)O)C=1N=CNC=1)C(=O)C1=NC([C@H](CC(N)=O)NC[C@H](N)C(N)=O)=NC(N)=C1C CWCMIVBLVUHDHK-ZSNHEYEWSA-N 0.000 description 3
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 description 3
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 3
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 3
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 3
- 230000001629 suppression Effects 0.000 description 3
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 2
- WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N Formaldehyde Chemical compound O=C WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102100021881 Hairy/enhancer-of-split related with YRPW motif protein 1 Human genes 0.000 description 2
- 241000238631 Hexapoda Species 0.000 description 2
- 101000843449 Homo sapiens Transcription factor HES-5 Proteins 0.000 description 2
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 2
- 230000005913 Notch signaling pathway Effects 0.000 description 2
- 206010070834 Sensitisation Diseases 0.000 description 2
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 2
- 230000003042 antagnostic effect Effects 0.000 description 2
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 2
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 2
- 229960002685 biotin Drugs 0.000 description 2
- 235000020958 biotin Nutrition 0.000 description 2
- 239000011616 biotin Substances 0.000 description 2
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 2
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 2
- 230000036770 blood supply Effects 0.000 description 2
- 210000004204 blood vessel Anatomy 0.000 description 2
- 239000012531 culture fluid Substances 0.000 description 2
- 208000035475 disorder Diseases 0.000 description 2
- 239000012636 effector Substances 0.000 description 2
- 238000004520 electroporation Methods 0.000 description 2
- 210000003527 eukaryotic cell Anatomy 0.000 description 2
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 2
- 210000003414 extremity Anatomy 0.000 description 2
- 239000012894 fetal calf serum Substances 0.000 description 2
- 230000006870 function Effects 0.000 description 2
- 230000005714 functional activity Effects 0.000 description 2
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 2
- 238000009776 industrial production Methods 0.000 description 2
- 230000004968 inflammatory condition Effects 0.000 description 2
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 2
- 230000000670 limiting effect Effects 0.000 description 2
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 2
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 2
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 2
- 238000005457 optimization Methods 0.000 description 2
- 230000037361 pathway Effects 0.000 description 2
- 238000001742 protein purification Methods 0.000 description 2
- 238000003753 real-time PCR Methods 0.000 description 2
- 238000010839 reverse transcription Methods 0.000 description 2
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 description 2
- 230000008313 sensitization Effects 0.000 description 2
- 230000000638 stimulation Effects 0.000 description 2
- UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N streptomycin Chemical compound CN[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@](C=O)(O)[C@H](C)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@H]1O UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N 0.000 description 2
- 238000002198 surface plasmon resonance spectroscopy Methods 0.000 description 2
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 2
- 238000004114 suspension culture Methods 0.000 description 2
- 229940124597 therapeutic agent Drugs 0.000 description 2
- FWBHETKCLVMNFS-UHFFFAOYSA-N 4',6-Diamino-2-phenylindol Chemical compound C1=CC(C(=N)N)=CC=C1C1=CC2=CC=C(C(N)=N)C=C2N1 FWBHETKCLVMNFS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229920000936 Agarose Polymers 0.000 description 1
- HJCMDXDYPOUFDY-WHFBIAKZSA-N Ala-Gln Chemical compound C[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCC(N)=O HJCMDXDYPOUFDY-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 1
- 102000004881 Angiotensinogen Human genes 0.000 description 1
- 108090001067 Angiotensinogen Proteins 0.000 description 1
- 101100510615 Caenorhabditis elegans lag-2 gene Proteins 0.000 description 1
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 1
- 241001212789 Dynamis Species 0.000 description 1
- 102000009024 Epidermal Growth Factor Human genes 0.000 description 1
- 102400001368 Epidermal growth factor Human genes 0.000 description 1
- 101800003838 Epidermal growth factor Proteins 0.000 description 1
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 1
- BCCRXDTUTZHDEU-UHFFFAOYSA-N Glycyl-Serine Chemical compound NCC(=O)NC(CO)C(O)=O BCCRXDTUTZHDEU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108090000144 Human Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000003839 Human Proteins Human genes 0.000 description 1
- 206010061218 Inflammation Diseases 0.000 description 1
- 102000003960 Ligases Human genes 0.000 description 1
- 108090000364 Ligases Proteins 0.000 description 1
- 239000012097 Lipofectamine 2000 Substances 0.000 description 1
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 1
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 102000001759 Notch1 Receptor Human genes 0.000 description 1
- 108010029755 Notch1 Receptor Proteins 0.000 description 1
- 108700020796 Oncogene Proteins 0.000 description 1
- 108700026244 Open Reading Frames Proteins 0.000 description 1
- 229930182555 Penicillin Natural products 0.000 description 1
- JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N Penicillin G Chemical compound N([C@H]1[C@H]2SC([C@@H](N2C1=O)C(O)=O)(C)C)C(=O)CC1=CC=CC=C1 JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N 0.000 description 1
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 description 1
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 1
- 229920002684 Sepharose Polymers 0.000 description 1
- 238000012300 Sequence Analysis Methods 0.000 description 1
- 108010036039 Serrate-Jagged Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000011842 Serrate-Jagged Proteins Human genes 0.000 description 1
- 239000008049 TAE buffer Substances 0.000 description 1
- 101710120037 Toxin CcdB Proteins 0.000 description 1
- 102100030853 Transcription factor HES-5 Human genes 0.000 description 1
- 229920004890 Triton X-100 Polymers 0.000 description 1
- 239000013504 Triton X-100 Substances 0.000 description 1
- 206010054880 Vascular insufficiency Diseases 0.000 description 1
- 206010047139 Vasoconstriction Diseases 0.000 description 1
- HGEVZDLYZYVYHD-UHFFFAOYSA-N acetic acid;2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;2-[2-[bis(carboxymethyl)amino]ethyl-(carboxymethyl)amino]acetic acid Chemical compound CC(O)=O.OCC(N)(CO)CO.OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O HGEVZDLYZYVYHD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004480 active ingredient Substances 0.000 description 1
- 239000008186 active pharmaceutical agent Substances 0.000 description 1
- 238000001042 affinity chromatography Methods 0.000 description 1
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 1
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 1
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 1
- 230000001093 anti-cancer Effects 0.000 description 1
- 230000003110 anti-inflammatory effect Effects 0.000 description 1
- 229940088710 antibiotic agent Drugs 0.000 description 1
- 230000008321 arterial blood flow Effects 0.000 description 1
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 1
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 description 1
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 1
- 230000005540 biological transmission Effects 0.000 description 1
- 230000004352 blood vessel remodeling Effects 0.000 description 1
- 230000037396 body weight Effects 0.000 description 1
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 1
- 210000000748 cardiovascular system Anatomy 0.000 description 1
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 1
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 1
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 1
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 1
- 238000000749 co-immunoprecipitation Methods 0.000 description 1
- 238000011284 combination treatment Methods 0.000 description 1
- 238000004891 communication Methods 0.000 description 1
- 238000010835 comparative analysis Methods 0.000 description 1
- 230000002860 competitive effect Effects 0.000 description 1
- 238000004624 confocal microscopy Methods 0.000 description 1
- 238000001816 cooling Methods 0.000 description 1
- 230000001086 cytosolic effect Effects 0.000 description 1
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 1
- 238000007405 data analysis Methods 0.000 description 1
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 1
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 1
- 238000011033 desalting Methods 0.000 description 1
- 238000013461 design Methods 0.000 description 1
- 239000003599 detergent Substances 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I dipotassium trisodium dihydrogen phosphate hydrogen phosphate dichloride Chemical compound P(=O)(O)(O)[O-].[K+].P(=O)(O)([O-])[O-].[Na+].[Na+].[Cl-].[K+].[Cl-].[Na+] LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I 0.000 description 1
- 238000010494 dissociation reaction Methods 0.000 description 1
- 230000005593 dissociations Effects 0.000 description 1
- 238000001647 drug administration Methods 0.000 description 1
- 239000003937 drug carrier Substances 0.000 description 1
- 229940088679 drug related substance Drugs 0.000 description 1
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 230000003511 endothelial effect Effects 0.000 description 1
- 210000003989 endothelium vascular Anatomy 0.000 description 1
- 239000003623 enhancer Substances 0.000 description 1
- 229940116977 epidermal growth factor Drugs 0.000 description 1
- 150000002148 esters Chemical class 0.000 description 1
- 239000012467 final product Substances 0.000 description 1
- 238000001502 gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 1
- 239000010931 gold Substances 0.000 description 1
- 229910052737 gold Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 1
- 230000002209 hydrophobic effect Effects 0.000 description 1
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 1
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 1
- 230000002757 inflammatory effect Effects 0.000 description 1
- 230000004054 inflammatory process Effects 0.000 description 1
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 description 1
- 238000005305 interferometry Methods 0.000 description 1
- 238000007912 intraperitoneal administration Methods 0.000 description 1
- 238000005342 ion exchange Methods 0.000 description 1
- 208000037906 ischaemic injury Diseases 0.000 description 1
- 208000023589 ischemic disease Diseases 0.000 description 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 1
- 238000004811 liquid chromatography Methods 0.000 description 1
- 238000013173 literature analysis Methods 0.000 description 1
- 230000035800 maturation Effects 0.000 description 1
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 1
- 230000010534 mechanism of action Effects 0.000 description 1
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 1
- 239000004005 microsphere Substances 0.000 description 1
- 230000005012 migration Effects 0.000 description 1
- 238000013508 migration Methods 0.000 description 1
- 230000007948 negative regulation of Notch signaling pathway Effects 0.000 description 1
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 1
- -1 nucleotide triphosphates Chemical class 0.000 description 1
- 235000006286 nutrient intake Nutrition 0.000 description 1
- 238000006213 oxygenation reaction Methods 0.000 description 1
- 230000001575 pathological effect Effects 0.000 description 1
- 229940049954 penicillin Drugs 0.000 description 1
- 239000000546 pharmaceutical excipient Substances 0.000 description 1
- 230000000144 pharmacologic effect Effects 0.000 description 1
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 1
- 230000002265 prevention Effects 0.000 description 1
- 230000008569 process Effects 0.000 description 1
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 description 1
- 238000011321 prophylaxis Methods 0.000 description 1
- 230000004845 protein aggregation Effects 0.000 description 1
- 238000001243 protein synthesis Methods 0.000 description 1
- 239000002096 quantum dot Substances 0.000 description 1
- 230000006884 regulation of angiogenesis Effects 0.000 description 1
- 230000029865 regulation of blood pressure Effects 0.000 description 1
- 230000010410 reperfusion Effects 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 230000000717 retained effect Effects 0.000 description 1
- 238000012772 sequence design Methods 0.000 description 1
- 239000004017 serum-free culture medium Substances 0.000 description 1
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 1
- 229960005322 streptomycin Drugs 0.000 description 1
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 1
- 230000002194 synthesizing effect Effects 0.000 description 1
- 238000011287 therapeutic dose Methods 0.000 description 1
- 239000012096 transfection reagent Substances 0.000 description 1
- 108091005703 transmembrane proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000035160 transmembrane proteins Human genes 0.000 description 1
- 239000001226 triphosphate Substances 0.000 description 1
- 235000011178 triphosphate Nutrition 0.000 description 1
- 210000005239 tubule Anatomy 0.000 description 1
- VBEQCZHXXJYVRD-GACYYNSASA-N uroanthelone Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(O)=O)C(C)C)[C@@H](C)O)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC=1NC=NC=1)NC(=O)[C@H](CCSC)NC(=O)[C@H](CS)NC(=O)[C@@H](NC(=O)CNC(=O)CNC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CS)NC(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)CNC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H]1N(CCC1)C(=O)[C@H](CS)NC(=O)CNC(=O)[C@H]1N(CCC1)C(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@@H](N)CC(N)=O)C(C)C)[C@@H](C)CC)C1=CC=C(O)C=C1 VBEQCZHXXJYVRD-GACYYNSASA-N 0.000 description 1
- 208000019553 vascular disease Diseases 0.000 description 1
- 230000006444 vascular growth Effects 0.000 description 1
- 208000023577 vascular insufficiency disease Diseases 0.000 description 1
- 230000025033 vasoconstriction Effects 0.000 description 1
- 230000000304 vasodilatating effect Effects 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000003313 weakening effect Effects 0.000 description 1
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 1
- 230000029663 wound healing Effects 0.000 description 1
- 210000005253 yeast cell Anatomy 0.000 description 1
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
- A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
- A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
- A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
- C12N5/10—Cells modified by introduction of foreign genetic material
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
- C07K2319/01—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif
- C07K2319/02—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif containing a signal sequence
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
- C07K2319/30—Non-immunoglobulin-derived peptide or protein having an immunoglobulin constant or Fc region, or a fragment thereof, attached thereto
Definitions
- NUCLEOTIDE SEQUENCE ENCODING A fusion PROTEIN
- the invention relates to the field of biomolecular pharmacology, biotechnology and genetic engineering and concerns nucleic acid molecules and new soluble proteins encoded by them - functional human DII4 (Delta-like ligand 4) antagonists capable of blocking DII4-Notch signaling pathways, as well as a method for their preparation.
- DII4 Delta-like ligand 4
- DII4 is a transmembrane protein that is a ligand for Notch receptors, including Notchl and Notch4. By activating these receptors, DII4 is involved in angiogenesis, negatively regulates the proliferation and migration of endothelial cells and angiogenic sprouting. Numerous experiments have shown that blocking the interaction of DII4 with its receptors makes it possible to stimulate productive angiogenesis in ischemic tissues, improving their oxygenation and nutrient intake. Blocking the interaction of DII4 with its receptors also has an anti-inflammatory effect on the vascular endothelium due to the suppression of angiotensinogen expression and has a vasodilating effect (Lobov et al.
- the DII4/Notch pathway controls postangiogenic blood vessel remodeling and regression by modulating vasoconstriction and blood flow // Blood, 2011 , Vol 117, Number 24:6728-37 doi: 10.1182/blood-2010-08-302067).
- the anticancer effect of inhibitors of the interaction of DII4 with its receptors is known, which can be achieved through several mechanisms, including suppression of the expression of the cellular oncogene MCC, stimulation of unproductive angiogenesis in the tumor, leading to its nonperfusion, etc.
- DII4 delta ligand antagonist which is a DII4-FC fusion polypeptide that may be involved in the regulation of angiogenesis.
- intraperitoneal administration of DII4-FC at a concentration of 2.5 mg/kg to mice with ischemic extremities was found to stimulate the growth and maturation of new vessels and thus improve blood supply to the extremities (Liu R. et al. Inhibition of Notch signaling by DII4- Fc promotes reperfusion of acutely ischemic tissues // Biochemical and Biophysical Research Communications, 2012, Vol. 418, No 1, pp. 173 - 179).
- the use of the DII4-FC fusion polypeptide as a modulator of Notch signaling, vascular growth promotion, blood pressure regulation, and inflammatory markers has also been published in Lobov et al., Blood, 2011.
- DII4 antagonists A known method for the treatment of ischemic vascular diseases of the eye with DII4 antagonists is described in patent EP2054082B1.
- a delta-like ligand 4 (DII4) antagonist is used, including the extracellular domain of DII4, optionally connected to a multimerized component.
- the DII4 antagonist approximately comprises amino acids 27-172, 27-217, 218-400, 218-360, 218-322, or 218-282 of the DII4 protein amino acid sequence (SEQ ID NO: 1).
- patients are administered an effective amount of a therapeutic polypeptide representing the extracellular portion of the DII4 protein, in one embodiment of the described method, the DSL domain of the DII4 protein.
- the implementation of the approaches described above has a number of limitations: the binding affinity of known therapeutic polypeptides to the Notch receptor is not high enough, and the large size of therapeutic polypeptides leads to a low rate of their penetration into tissues and causes a high dose of the drug administered to the patient, which, in turn, can lead to to patient sensitization and other undesirable effects. Also, the use of DII4-FC molecules with a full-length DII4 extracellular domain in the composition, can lead to activation of Notch signaling. To date, despite promising potential, there are still no clinically approved drugs based on the DII4-FC fusion peptide.
- the present invention has a number of improved properties compared to analogues, and therefore expands the range of available candidates for the treatment of diseases, the mechanism of action of which is based on blocking the interaction of DII4 with Notch receptors.
- the objective of the present invention is to expand the arsenal of technical means for the treatment of diseases of the cardiovascular system, ischemic conditions, inflammatory conditions in the vessels and oncological diseases, stimulation of therapeutic angiogenesis.
- the task concerns obtaining new highly effective polypeptide drugs - DII4 antagonists with high affinity for the Notch receptor, with relatively small size and not activating the transmission of the Notch signal during interaction; the task also concerns the development of nucleotide sequences encoding such polypeptides and being the expression basis for their production.
- a fusion protein hDII4-hFc which is a DII4 antagonist, the structure of which includes a fragment of the soluble extracellular part of the human DII4 protein, including the following functional subunits: the DSL domain of the DII4 protein (173 - 217 SEQ ID NO: 1), at least at least five domains of EGF-like repeats of the DII4 protein, represented by fragments 218-251, 252-282, 284-322, 324-360, 362-400 of the sequence SEQ ID NO: 1; as well as the constant part of the heavy chain (Fc fragment) human lgG4.
- the Fc fragment of human IgG4 is attached to the DII4 protein fragment from the C-terminus directly or through a linker sequence.
- the fusion protein further comprises 1-3 EGF-like repeat domains of the DII4 protein, represented by fragments 402-438, 440-476, and 480-518 of SEQ ID NO: 1.
- the fusion protein further comprises at least one of the domains of 6-8 EGF-like repeats of the DII4 protein located(s) from the C-terminus of the DII4 protein fragment, and the order of these domains of 6-8 EGF-like repeats can be any.
- a human IgG4 Fc fragment is linked to a DII4 protein fragment in a non-linker fashion.
- the human IgG4 Fc fragment is linked to the DII4 protein fragment via a linker peptide.
- the linker peptide is a GS dipeptide.
- a fragment of the soluble extracellular portion of the human DII4 protein is included in the fusion protein structure as the sequence of SEQ ID NO: 6.
- the heavy chain constant portion (Fc fragment) of human IgG4 has the sequence of SEQ ID NO: 7.
- the fusion protein further includes a signal sequence located at the N-terminus of the fusion protein.
- the fusion protein has the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2.
- the fusion protein has the amino acid sequence of SEQ ID NO: 4.
- nucleic acid molecule has the sequence of SEQ ID NO: 3.
- the nucleic acid molecule has the sequence of SEQ ID NO: 5.
- This problem is also solved by creating an expression vector carrying a nucleotide sequence corresponding to the sequence of an isolated nucleic acid molecule encoding such a fusion protein, under the control of regulatory elements necessary for the expression of this nucleotide sequence in the host cell; and also by creating a host cell, including the expression vector described in this application, providing efficient production of such a fusion protein using the above nucleic acid molecule.
- such cells are mammalian cells (in some particular embodiments of the invention, Chinese hamster ovary (CHO) cells).
- the solution to this problem is also achieved by using the above fusion protein for the treatment of a wide range of ischemic conditions (in particular, ischemia of the lower extremities), cardiovascular diseases, oncological diseases, and the treatment of vascular complications of infectious diseases, including COVID-19.
- the solution of the problem is achieved by implementing a method for treating a wide range of ischemic conditions (in particular, ischemia of the lower extremities), cardiovascular diseases, oncological diseases, treating vascular complications of infectious diseases, including COVID-19, which includes administering a fusion protein according to the invention to a patient.
- ischemic conditions in particular, ischemia of the lower extremities
- cardiovascular diseases in particular, ischemia of the lower extremities
- oncological diseases treating vascular complications of infectious diseases, including COVID-19
- administering a fusion protein according to the invention to a patient.
- such a protein is administered to a patient in a therapeutically effective amount, preferably as part of a pharmaceutical composition.
- the developed hybrid constructs include a minimum fragment of the human DII4 protein (DSL domain and, at a minimum, the first 5 domains of EGF-like repeats) necessary and sufficient for interaction with Notch receptors;
- the developed hybrid constructs do not include the MNNL domain of the human DII4 protein involved in the activation of Notch signal transmission;
- the developed hybrid structures have a relatively small molecular weight, which increases the efficiency of the production of these molecules in mammalian cells and improves their properties associated with the speed and efficiency of penetration into tissues;
- Fig.1 Scheme of an expression vector containing a nucleotide sequence encoding a fusion protein having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2.
- Fig.2. Scheme of an expression vector containing a nucleotide sequence encoding a fusion protein having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 4.
- fusion protein fusion protein
- fusion protein fusion protein
- recombinant protein fusion polypeptide
- recombinant polypeptide recombinant polypeptide
- hybrid construct a construction of two or more parts of a polypeptide nature, covalently linked to each other, resulting from the expression a recombinant DNA molecule in which the coding regions, respectively, of two or more different genes or their fragments are connected to each other in the same reading frame.
- isolated has its conventional meaning known to one of ordinary skill in the art, and when used in relation to an isolated nucleic acid or an isolated polypeptide is used without limitation to refer to a nucleic acid or polypeptide which, due to man, exists separately. from their native environment and therefore are not a product of nature.
- An isolated nucleic acid or polypeptide may exist in a purified form, or may exist in a non-native environment such as, for example, a host cell.
- decoy ligand refers to hybrid proteins consisting of the extracellular domain of the ligand of the target molecule (receptor) and the Fc domain of the immunoglobulin.
- the extracellular domain of the ligand is responsible for target binding, while the Fc domain dimerizes the fusion protein. The latter is necessary to increase the efficiency of binding and ensure greater stability of the high-molecular complex.
- the decoy ligand consists of certain fragments of a soluble extracellular fragment of the human DII4 protein (DSL domain and, at a minimum, the first 5 domains of EGF-like repeats), and a human IgG4 heavy chain constant portion.
- treatment means curing, slowing down, stopping, or reversing the progression of a disease or disorder. As used herein, “treatment” also means alleviation of symptoms associated with a disease or disorder.
- terapéuticaally effective amount is meant the amount of drug administered to a patient that is most likely to produce the expected therapeutic effect. The exact amount required may vary from subject to subject depending on numerous factors such as disease severity, age, body weight, general body condition, combination treatment with other drugs, and others. prevention of a disease or condition, carried out in a dose sufficient to achieve a therapeutic effect.
- the administration can be carried out both once and several times a day, more often in the form of a course administration for a period of time sufficient to achieve a therapeutic effect (from several days to a week, several weeks to months), while courses of drug administration may be repeated.
- the fusion protein of the invention is administered to a patient in a pharmaceutical composition comprising, in addition to the active ingredient, pharmaceutically acceptable carriers and/or excipients.
- the present invention provides DNA constructs encoding fusion proteins (recombinant polypeptides) hDII4-hFc - DII4 antagonists that block the Notch signaling pathway, but are relatively small in size compared to decoy ligands using the full-length human DII4 protein ectodomain, which provides their improved properties. concerning the rate and efficiency of tissue penetration, protein production in mammalian cells, and the lack of activation of Notch signaling upon binding.
- the invention relates to nucleotide constructs encoding polypeptides containing functional domains of DSL and EGF-like repeats (from five to eight) of the DII4 protein, fused to the constant part (Fc-domain) of human immunoglobulin IgG4, hDII4-hFc.
- the natural sequence of the human DII4 protein consists of 685 amino acids (aa) (SEQ ID N0:1).
- the protein contains a signal peptide (1-26 aa SEQ ID N0: 1), a transmembrane domain (530-550 aa SEQ ID N0: 1), a Delta/Serrate/Lag-2 domain (DSL, 173-217 aa SEQ ID NO : 1) and eight tandem repeats similar to epidermal growth factor (EGF-like repeat domains) (218-251, 252-282, 284-322, 324-360, 362-400, 402-438, 440-476, 480- 518 ac SEQ ID N0: 1).
- EGF-like repeat domains epidermal growth factor
- the protein contains an extracellular part (27-529 aa SEQ ID N0: 1) and a cytoplasmic part (551-685 aa SEQ ID NO: 1), while the N-terminal end of DII4 (27-172 aa SEQ ID N0: 1) forms a separate functional domain MNNL.
- DII4 a separate functional domain of DII4 protein in interaction with Notch receptors and signaling are known (see, for example, Luca et al. Structural basis for Notchl engagement of Delta-like 4 // Science, 2015, Vol 347, Issue 6224, pp. 847-853 doi: 10.1126/science.1261093; Hirano et al.
- Delta-like 1 and Delta-like 4 differently require their extracellular domains for triggering Notch signaling in mice 11 Elife 2020; 9: e50979 Published online 2020 Jan 16 doi: 10.7554/eLife.50979), however, at the moment, all the subtleties and features of Notch signaling have not yet been fully studied.
- DII4 antagonist hybrid polypeptides hDII4-hFc
- These protein molecules include functional DSL and EGF-like repeat domains (at least the first five domains) of the DII4 protein fused to the constant portion (Fc fragment) of human IgG4.
- Blocking of Notch signal transmission during interaction with the Notch receptor is achieved due to the absence of the MNNL domain in the therapeutic molecule, which is involved in signal transmission.
- Such a design causes, on the one hand, the antagonistic properties of the molecule according to the invention, and on the other hand, a reduced size of the molecule.
- the size of the molecule according to the invention can also be further reduced by reducing the number of EGF-like repeat domains (experiments have shown that the antagonistic properties of the molecule are retained when 5 to 8 EGF domains are included).
- the functional domains of the DII4 protein can be fused to the human IgG4 heavy chain constant portion either directly (ie, without a linker) or via a linker sequence.
- the hDII4-hFc fusion protein of the invention may also optionally contain a signaling a sequence, which may include any sequence known to those skilled in the art of directing the secretion of a polypeptide or protein from a cell, and include natural or synthetic sequences.
- the signal sequence is located at the N-terminus of the fusion protein of the present invention.
- the recombinant polypeptides of the invention include the DSL domain of DII4 and the ECE(1-5) domains of the DII4 protein or the DSL domain of DII4 and the EOP(1-8) domains of the DII4 protein and are soluble recombinant ligands - traps (traps) are DII4 antagonists.
- Such molecules inhibit the Notch signaling pathway by specifically binding to Notchl and Notch4 receptors. In this case, the Notch pathway is not activated; instead, hDII4-hFc molecules prevent the binding of Notch receptors to endogenous full-length activating ligands.
- Notchl and Notch4 signaling pathways are involved in the control of blood vessel growth, and their inhibition by hDII4-hFc leads to activation of new vessel growth (therapeutic angiogenesis) in ischemic tissues and improves wound healing.
- Specific inhibition of Notch signaling pathways through the use of DII4 antagonists can be used to treat a wide range of cardiovascular diseases, oncological diseases, as well as to treat vascular complications of infectious diseases, including COVID-19.
- EFFECT invention makes it possible to obtain polypeptides with high affinity for human Notch receptors, but with a reduced molecular weight in comparison with natural DII4 proteins, and also in comparison with DII4-FC molecules described earlier. Reducing the size of recombinant polypeptides makes it possible to increase the rate of their penetration into body tissues, to reduce the necessary doses of a preparation (pharmaceutical composition) based on them administered to patients, and to reduce the cost of synthesizing the described recombinant polypeptides.
- Preparations based on the described recombinant polypeptides can be used to treat ischemic diseases of various organs and tissues.
- Ischemia is a decrease in blood supply to a part of the body, organ or tissue due to a weakening or cessation of arterial blood flow to it. Ischemia can be caused by various factors and occurs when the volume of blood flow does not match the needs of the organ.
- therapeutic angiogenesis the formation of new functioning vessels based on existing ones, induced by drugs.
- the described DNA constructs make it possible to obtain hDII4-hFc molecules that have a low molecular weight and high bioavailability and can be used to stimulate therapeutic angiogenesis, treat a wide range of ischemic conditions (in particular, ischemia of the lower extremities), cardiovascular diseases, oncological diseases, and treat vascular complications of infectious diseases. diseases, including COVID-19, and other diseases associated with pathological activity of Notch receptors, or in cases where modulation of the DII4-Notch signaling pathway is appropriate.
- Fusion proteins (recombinant polypeptides), which are the subject of the present invention, can be obtained as follows.
- Soluble recombinant DII4 antagonist polypeptides are produced by expression of the nucleotide sequences encoding them in eukaryotic cell lines, followed by purification of the synthesized recombinant proteins using affinity, ion exchange or hydrophobic chromatography, used individually or in various combinations with each other, as well as using other protein purification methods.
- Appropriate nucleotide sequences are obtained by combining DNA regions encoding selected DII4 domains with a DNA sequence encoding a human lgG4 Fc fragment.
- nucleic acid molecules encoding such DII4 antagonist polypeptides have a nucleotide sequence corresponding to SEQ ID NO: 3 or SEQ ID NO: 5.
- the host cell comprising such an expression vector may be Chinese Hamster Ovary CHO cells (eg, CHO-K1 or CHO DG44 cell lines) adapted to produce therapeutic proteins.
- the expression vector is preferably selected for the expression of heterologous sequences in mammalian cells, but in some embodiments of the invention, the expression vector may be selected for expression in other systems, such as, for example, insect cells, yeast or bacterial cells.
- each expression vector has its own set of regulatory elements that allow the expression of a heterologous sequence (product) in the host cell, such as promoters and/or enhancers, Kozak sequences, polyA sequences, and other regulatory sequences. And it can also have sequences encoding leader (signal) peptides that ensure the secretion of recombinant polypeptides into the extracellular environment. Termination of protein synthesis from a given isolated nucleic acid sequence is determined by adding to it from the 3'-end in one reading frame one or more stop codons.
- the recombinant polypeptide After transfection of the vector into cells of a eukaryotic cell line, the recombinant polypeptide is synthesized and secreted into a serum-free culture medium. The resulting recombinant polypeptide is purified from the medium by protein-A or protein-G affinity chromatography, typically, but other methods of protein purification may be used.
- the unity of this invention is achieved through the use of a common minimal DII4 sequence that interacts with Notch receptors in all constructs.
- This sequence is represented by amino acids 21-254 of SEQ ID NO: 2 and SEQ ID NO: 4, and corresponds to the sequence of SEQ ID NO: 6 and amino acids 171-404 of SEQ ID NO: 1. It includes DSL and EOE(1- 5)-like repeats of the human DII4 protein, which are necessary and sufficient for interaction with Notchl and Notch4 receptors. However, they do not contain the DII4 MNNL domain, which is involved in the activation of Notch signal transmission.
- the DII4 antagonist comprises amino acids 171-404 of the DII4 protein.
- This region does not include the 27-172 region corresponding to the MNNL domain (in contrast, among other things, to the polypeptides known from patent EP2054082B1), due to which the molecules of the invention cannot lead to the activation of Notch receptors.
- deletion of the MNNL domain reduces protein aggregation and improves protein solubility, resulting in increased protein production compared to fusion polypeptides that use the full-length DII4 extracellular domain.
- the present invention is unique and represents a new type of molecule that has not been described before.
- nucleotide sequences in private versions, SEQ ID NO: 3 and SEQ ID NO: 5 that encode the corresponding hybrid proteins with sequences (in private versions, respectively, SEQ ID NO: 2 and SEQ ID NO: 4), which includes two main functional parts.
- the common DII4 sequence combining these constructs corresponds to the sequence SEQ ID NO: 6.
- the second functional moiety encodes the human lgG4 heavy chain constant portion (SEQ ID NO: 7) and in The particular embodiments of the invention shown correspond to amino acids 257-482 of SEQ ID NO: 2 and amino acids 368-593 of SEQ ID NO: 4.
- Coding nucleotide sequences can be changed to optimize the level of expression in certain cell types.
- heterologous expression systems for example, insect cells, bacterial or yeast cells
- it may be necessary to optimize the codons in the sequence replacing rarely used codons in the body with frequently used ones. This can be done using algorithms implemented in many available sequence design algorithms, such as Codon optimizer, Gene Designer, or OPTIMIZER.
- the sequences corresponding to SEQ ID NO: 3 and SEQ ID NO: 5 can be cloned into any other vector that allows the production and secretion of the target polypeptides into the culture fluid, in order to further purify the products.
- the Freedom pCHO 1.0 vector (ThermoFisher) can be chosen as such a vector.
- hybrid construct in mammalian cells is possible by creating stable producer clones after cells are transfected with this construct. Transfection by electroporation or using a transfection reagent such as Lipofectamine 2000 can be used. This hybrid construct can also be used to introduce into a lentiviral construct and subsequently infect cells. Various approaches can be used to increase the yield of the fusion protein in mammalian cells. Optimization techniques are known to those skilled in the art and are described, for example, in (Almo et al. Better and faster: improvements and optimization for mammalian recombinant protein production // Curr Opin Struct Biol. 2014 Jun; 26:39-43).
- the proposed products are a previously uncreated combination of nucleotide sequences of the human genome (and have a common sequence corresponding to the Fc fragment of human IgG4, fused in the same reading frame with fragment(s) of the human DII4 sequence) and are intended to be an expression basis for the production of the fusion protein hDII4- hFc, which has a whole range of improved pharmacological properties, namely: (1) the minimum effector function of antibody-dependent cellular cytotoxicity (antibody-dependent cellular cytotoxicity - ADCC) and complement-dependent cytotoxicity (complement-dependent cytotoxicity - CDC) due to the use of the constant part of immunoglobulin human 1gC4 isotype; (2) a relatively small molecular weight, which increases the efficiency of the production of these molecules in mammalian cells and improves their properties associated with the speed and efficiency of penetration into tissues; (3) ability effectively block Notch signaling due to the presence of functional domains necessary for effective binding to Notch receptors; (4) the inability to
- DII4 fragments were selected based on bioinformatic sequence analysis and their corresponding nucleotide sequences encoding them were used for subsequent cloning.
- the following primers were chosen to clone the regions corresponding to amino acids 21-254 of SEQ ID NO: 2 and amino acids 21-365 of SEQ ID NO: 4:
- DLL4DMF AAGAATTCCTACCGGGTCATCTGCAGTGACAACTA
- DLL4DMDE5R TAGGATCCGTCCACTTTCTTCTCGCAGTTGGA
- DLL4DMR2 TAGGATCCGCTGCCCACAAAGCCATAAGGGCA (SEQ ID NO: 10).
- the primers included restriction sites for EcoRI (forward primer DLL4DMF) and BamHI (reverse primers DLL4DMDE5R and DLL4DMR2)
- PCR was performed under the following conditions: 95°C 1 min, 30 cycles (95°C 10 sec, 63°C 10 sec, 72°C 2 min), 72°C 5 min.
- Reaction components polymerase - ExTaq Takara (Takara Bio), buffer containing Mg2+ for ExTaq polymerase (Takara Bio), 12 pmol of each of the primers and 0.25 mM of a mixture of nucleotide triphosphates (Takara Bio).
- Post-PCR The PCR product was purified with the PCR Purification kit QIAquick (QiaGene Cat. No 28106). The concentration and compliance with the predicted molecular weight was checked using gel electrophoresis in 1% agarose (TAE buffer).
- the obtained PCR products were used for further construction.
- the target sequences were cloned using the pFUSE-hlgG4-Fc2 vector (InvivoGen), which makes it possible to obtain sequences fused with the lgG4 Fc-domain and to study their properties.
- the vector was digested with EcoRI and Bglll (Thermo), and the PCR product was digested with EcoRI and BamHI (Thermo) for 1 hour at 37°C, purified with a PCR Purification kit QIAquick (Thermo) and ligated using 1 U (ME) ligases (Thermo) according to the manufacturer's protocol.
- the competent E. coli XL10-Gold cells were transformed with the ligation mixture and plated on LB medium containing zeocin.
- PROMF2 GCCTGACCCTGCTTGCTCAACT (SEQ ID NO: 11)
- FC CTCACGTCCACCACCACGCA (SEQ ID NO: 12)
- the resulting plasmids containing the target nucleotide sequences are shown in FIG. 1 and 2.
- extra pure (“transfection grade”) plasmid DNA was isolated using the EndoFree Plasmid MaxiKit (Qiagen) according to the manufacturer's protocol. Both constructs were linearized according to the Not1 site (Thermo). For transfection, 20 ⁇ g of the linearized vector was added per 100 ⁇ l of cell suspension at a concentration of 5x10 7 cells/ml. Electroporation was carried out according to the protocol: 3 pulses of 1130 V each for 20 ms. Selection was started 48 hours after transfection by adding the antibiotic Zeocin at a concentration of 500 ⁇ g/ml and continued with further passages.
- Culture medium Dynamis + 6 mM Glutamax + 0.5% antidumping reagent B (Lonza, Switzerland) + 500 ⁇ g/mL Zeocin. Cultivation was carried out in a 125 ml Ernlenmeyer flask (Corning, USA) in an atmosphere of 5% CO 2 at a temperature of 37°C and a relative humidity of 95% (Stirring 120 vol/vol.). min). The concentration of target polypeptides in the culture liquid was determined by bilayer interferometry using Protein A biosensors and Octet K2 system (Fortebio, Pall, USA) in real time. The binding of the Fc fragment of the fusion proteins to the Protein A immobilized on the sensor was evaluated.
- the level of production of fusion proteins corresponding to the sequences of SEQ ID NO: 2 and SEQ ID NO: 4 was significantly higher than the level of production of the hDII4-hFc fusion protein containing the full-length extracellular domain of DII4.
- the highest level of production was achieved for the molecule corresponding to SEQ ID NO: 2, which confirms the conclusion that the small size of the molecule and the absence of the MNNL domain play a fundamental role for protein production in CHO cells. This fact is of fundamental importance for the industrial production of protein, since effective production will make it possible to reduce the cost of production of the drug substance.
- the most likely natural targets of the obtained recombinant hDII4-hFc polypeptide are Notchl and Notch4 proteins.
- recombinant human proteins Notchl and Notch4 developed in a suspension culture of HEK293 cells and purified by high pressure liquid chromatography (HPLC), are used as targets.
- HPLC high pressure liquid chromatography
- they are conjugated with biotin by the activated ester method, followed by purification on desalting columns.
- the hDII4-hFc polypeptide is produced in a suspension culture of CHO cells and purified by liquid chromatography on sepharose with Protein A.
- the studied protein is added to the biotinylated target proteins.
- the target polypeptide complexes are incubated with Dynabeads M280 magnetic microspheres (Invitrogen, USA) with streptavidin immobilized on their surface, washed, and eluted according to the manufacturer's protocol.
- the resulting complexes are then purified and bound hDII4-hFc is detected by Western blotting.
- RNA reverse transcription reaction for which the same amount of RNA is taken from different samples (experiment and control).
- Superscript III Invitrogen
- random hexamers were used as primers. This is followed by real-time PCR on a CFX96 Bio-Rad cycler using Sso Fast EvaGreen supermix (Bio-Rad).
- the primer sequences for amplification are shown below:
- HES1-F AAGAAAGATAGCTCGCGGCA (SEQ ID NO: 13)
- HES1 - R TACTTCCCCAGCACACTTGG (SEQ ID NO: 14)
- HES5-F GATTCCTCTGTGTGGGTGGATG (SEQ ID NO: 15)
- HES5-R GATTTTATTATGGCGGCTTCGG (SEQ ID NO: 16)
- HEY1 - F CCTTCCCCTTCTCTTTCGGC (SEQ ID NO: 17)
- HEY1-R AAAAGCTCCGATCTCCGTCC (SEQ ID NO: 18)
- HEY2 - F AAGGCGTCGGGATCGGATAA (SEQ ID NO: 19)
- HEY2-R AGAGCGTGTGCGTCAAAGTAG (SEQ ID NO: 20)
- GAPDH-F CCATCACCATCTTCCAGGAG (SEQ ID NO: 21)
- GAPDH-R AATGAGCCCCAGCCTTCTCC (SEQ ID NO: 22).
- hDII4-hFc trap protein a standard method based on the cultivation of human umbilical vein primary endothelial cells HLIVEC in a three-dimensional matrix was used.
- primary endothelial cells are isolated from the umbilical vein of newborns, and then cultured in enriched M199 medium with the addition of 20% fetal calf serum and a cocktail of antibiotics (penicillin and streptomycin) in culture flasks. When the cells reach 70-80% confluence, the culture is passaged according to the standard method until the 2nd passage. Two hours before the cells are transferred to a three-dimensional matrix (matrigel), they are transferred to a depleted EBM-2 medium supplemented with 0.2% fetal calf serum.
- a suspension of HUVEC cells at a concentration of 5x10 8 cells/ml is mixed with an equivalent volume of Matrigel. After that, 50 ⁇ l of the mixture is applied to the center of the well in 24-well plates.
- the investigated recombinant hDII4-hFc protein in varying concentrations is added to the cells in 1 ml of EBM-2 medium one hour after application and incubation at 37°C. Each experiment is carried out in triplicate.
- As a control cells without the addition of recombinant protein are used. The cells are then incubated for 72 hours in a CO2 incubator and fixed with 4% formalin in PBS.
- Recombinant hDII4-hFc polypeptides have a high selectivity for binding to Notchl and Notch4 target receptors, without leading to their activation, as a result of which such binding provides effective blocking of Notch signaling, manifested, in particular, in the activation of new vessel growth (angiogenic activity) in ischemic tissues.
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Zoology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Public Health (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Toxicology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
Abstract
Настоящее изобретение описывает молекулы нуклеиновых кислот и кодируемые ими новые рекомбинантные полипептиды, способные блокировать сигнальные пути DII4-Notch и состоящие из растворимого внеклеточного фрагмента человеческого DII4 и константной части тяжелой цепи lgG4 человека. Плазмидная конструкция, позволяющая экспрессировать слитый белок, кодируемый указанными нуклеиновыми кислотами, была сконструирована методами генной инженерии. Разработанные гибридные конструкции белков, получаемые при экспрессии данных конструкций нуклеиновых кислот, имеют малую молекулярную массу, что повышает эффективность продукции этих молекул в клетках млекопитающих и улучшает их свойства, связанные со скоростью и эффективностью проникновения в ткани для лечения ишемических, онкологических и других заболеваний, связанных с патологической активностью Notch рецепторов или в тех случаях, когда целесообразно модулирование работы сигнального пути DII4-Notch.
Description
НУКЛЕОТИДНАЯ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЬ, КОДИРУЮЩАЯ СЛИТЫЙ БЕЛОК
Область техники
Изобретение относится к области биомолекулярной фармакологии, биотехнологии и генетической инженерии и касается молекул нуклеиновых кислот и кодируемых ими новых растворимых белков - функциональных антагонистов DII4 (Delta-like ligand 4) человека, способных блокировать сигнальные пути DII4-Notch, а также способа их получения.
Уровень техники
DII4 — трансмембранный белок, являющийся лигандом для рецепторов Notch, включая Notchl и Notch4. Активируя указанные рецепторы, DII4 участвует в ангиогенезе, отрицательно регулирует пролиферацию и миграцию эндотелиальных клеток и ангиогенное прорастание. Многочисленными опытами показано, что блокирование взаимодействия DII4 с его рецепторами позволяет стимулировать продуктивный ангиогенез в ишемизированных тканях, улучшая их окисигенацию и поступление питательных веществ. Блокирование взаимодействия DII4 с его рецепторами также оказывает противовоспалительное воздействие в отношении эндотелия сосудов за счет подавления экспрессии ангиотензиногена и оказывает вазодилатирующий эффект (Lobov et al. The DII4/Notch pathway controls postangiogenic blood vessel remodeling and regression by modulating vasoconstriction and blood flow // Blood, 2011 , Vol 117, Number 24:6728-37 doi: 10.1182/blood-2010-08-302067). Помимо этого, известно противораковое действие ингибиторов взаимодействия DII4 с его рецепторами, которое может достигаться за счет нескольких механизмов, включая подавление эксрессии клеточного онкогена МУС, стимуляции непроизводительного ангиогенеза в опухоли, ведущего к ее неперфузии и др.
Одним из подходов к блокированию взаимодействия DII4 с его рецепторами является создание конкурентных антагонистов, связывающихся с рецепторами Notch, но не вызывающих его активации.
В литературе описан антагонист дельтаобразного лиганда DII4, представляющий собой слитый полипептид DII4-FC, который может участвовать в регуляции ангиогенеза. В частности, обнаружено, что внутрибрюшинное введение мышам с ишемизированными конечностями препарата DII4-FC в концентрации 2,5 мг/кг стимулирует рост и созревание новых сосудов и таким образом улучшает кровоснабжение конечностей (Liu R. et al. Inhibition of Notch signaling by DII4-Fc promotes reperfusion of acutely ischemic tissues // Biochemical and Biophysical Research Communications, 2012, Vol. 418, No 1 , p. 173 — 179).
Использование слитого полипептида DII4-FC в качестве модулятора Notch- сигналлинга, стимуляции роста сосудов, регуляции кровяного давления и маркеров воспаления также опубликовано в статье Lobov et al., Blood, 2011 .
Известен способ лечения ишемических васкулярных заболеваний глаза антагонистами DII4, описанный в патенте ЕР2054082В1. При осуществлении этого способа для предотвращения или снижения утраты кровеносных сосудов и/или промотирования продуктивного ангиогенеза у пациента, имеющего ишемическое повреждение или сосудистую недостаточность, применяют антагонист дельтаобразного лиганда 4 (DII4), включающий внеклеточный домен DII4, необязательно соединенный с мультимеризированным компонентом. В конкретных вариантах осуществления антагонист DII4 приблизительно содержит аминокислоты 27-172, 27-217, 218-400, 218- 360, 218-322, или 218-282 аминокислотной последовательности белка DII4 (SEQ ID NO: 1).
В способе активации ангиогенеза, описанном в US2007213266A1 , пациентам вводят эффективное количество терапевтического полипептида, представляющего собой внеклеточную часть белка DII4, в одном из вариантов осуществления описанного способа — DSL-домен белка DII4.
Однако осуществление описанных выше подходов имеет ряд ограничений: аффинность связывания известных терапевтических полипептидов с Notch-рецептором недостаточно высока, а большой размер терапевтических полипептидов приводит к низкой скорости их проникновения в ткани и обуславливает высокую дозу вводимого пациенту препарата, что, в свою очередь, может приводить к сенсибилизации пациента и другим нежелательным эффектам. Также, использование молекул DII4-FC с полноразмерным экстраклеточным доменом DII4 в составе, может приводить к активации передачи сигнала Notch. На сегодняшний день, несмотря на многообещающий потенциал, все еще нет клинически одобренных лекарственных средств на основе слитого пептида DII4-FC.
Предлагаемое изобретение обладает рядом улучшенных свойств по сравнению с аналогами, и поэтому расширяет круг имеющихся кандидатов для лечения заболеваний, механизм воздействия которых основан на блокировании взаимодействия DII4 с рецепторами Notch.
Сущность изобретения
Задачей настоящего изобретения является расширение арсенала технических средств для лечения заболеваний сердечно-сосудистой системы, ишемических состояний, воспалительных состояний в сосудах и онкологических заболеваний, стимулирования терапевтического ангиогенеза. В частности, задача касается получения новых высокоэффективных полипептидных препаратов - антагонистов DII4, обладающих высокой аффинностью к рецептору Notch, относительно небольшими
размерами и не активирующих при взаимодействии передачу Notch-сигнала; также задача касается разработки нуклеотидных последовательностей, кодирующих такие полипептиды и являющихся экспрессионной основой для их получения.
Решение поставленной задачи осуществляется путем создания слитого белка hDII4-hFc, являющегося антагонистом DII4, в структуру которого входит фрагмент растворимой внеклеточной части белка DII4 человека, включающий следующие функциональные субъединицы: домен DSL белка DII4 (173 — 217 SEQ ID NO: 1), по меньшей мере пять доменов EGF-подобных повторов белка DII4, представленных фрагментами 218 — 251, 252 — 282, 284 — 322, 324 — 360, 362 — 400 последовательности SEQ ID NO: 1; а также константная часть тяжелой цепи (Fc-фрагмент) lgG4 человека. При этом Fc-фрагмент lgG4 человека присоединен к фрагменту белка DII4 с С-конца непосредственно или посредством линкерной последовательности.
В некоторых вариантах осуществления изобретения слитый белок дополнительно включает 1-3 домена EGF-подобных повторов белка DII4, представленных фрагментами 402 — 438, 440 — 476 и 480 — 518 последовательности SEQ ID NO: 1. Другими словами, слитый белок дополнительно включает по меньшей мере один из доменов 6-8 EGF- подобных повторов белка DII4, расположенный(-х) с С-конца фрагмента белка DII4, причем порядок расположения этих доменов 6-8 EGF-подобных повторов может быть любым.
В некоторых вариантах осуществления изобретения Fc-фрагмент lgG4 человека соединен с фрагментом белка DII4 безлинкерно. В некоторых других вариантах осуществления изобретения Fc-фрагмент lgG4 человека соединен с фрагментом белка DII4 через линкерный пептид. В некоторых частных вариантах осуществления изобретения линкерный пептид представляет собой дипептид GS.
В некоторых вариантах осуществления изобретения фрагмент растворимой внеклеточной части белка DII4 человека включен в структуру слитого белка в виде последовательности SEQ ID NO: 6.
В некоторых вариантах осуществления изобретения константная часть тяжелой цепи (Fc-фрагмент) человеческого lgG4 имеет последовательность SEQ ID NO: 7.
В некоторых вариантах осуществления изобретения слитый белок дополнительно включает сигнальную последовательность, локализованную на N-конце слитого белка.
В некоторых частных вариантах осуществления изобретения слитый белок имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 2.
В некоторых других частных вариантах осуществления изобретения слитый белок имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 4.
Поставленная задача также решается путем создания изолированной молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующей такой слитый белок.
В некоторых частных вариантах осуществления изобретения молекула нуклеиновой кислоты имеет последовательность SEQ ID NO: 3.
В некоторых других частных вариантах осуществления изобретения молекула нуклеиновой кислоты имеет последовательность SEQ ID NO: 5.
Указанная задача также решается путем создания экспрессирующего вектора, несущего нуклеотидную последовательность, соответствующую последовательности изолированной молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующей такой слитый белок, под контролем регуляторных элементов, необходимых для экспрессии данной нуклеотидной последовательности в клетке-хозяине; а также путем создания клетки-хозяина, включающей экспрессирующий вектор, описанный в настоящей заявке, обеспечивающей эффективную продукцию такого слитого белка с использованием вышеуказанной молекулы нуклеиновой кислоты. В некоторых вариантах воплощения изобретения в качестве таких клеток выступают клетки млекопитающих (в некоторых частных вариантах воплощения изобретения - клетки яичников китайских хомячков (СНО)).
Решение поставленной задачи также достигается при применении вышеуказанного слитого белка для лечения широкого спектра ишемических состояний (в частности ишемии нижних конечностей), сердечно-сосудистых заболеваний, онкологических заболеваний, лечения сосудистых осложнений инфекционных заболеваний, включая COVID-19.
Также решение поставленной задачи достигается при осуществлении способа лечения широкого спектра ишемических состояний (в частности ишемии нижних конечностей), сердечно-сосудистых заболеваний, онкологических заболеваний, лечения сосудистых осложнений инфекционных заболеваний, включая COVID-19, включающего введение пациенту слитого белка по изобретению. Согласно изобретению, такой белок вводят пациенту в терапевтически эффективном количестве предпочтительно в составе фармацевтической композиции.
При осуществлении изобретения достигаются следующие технические результаты:
- созданы новые варианты терапевтического агента на основе слитого (гибридного) белка hDII4-hFc, содержащего функциональные домены DSL и EGF- подобных повторов (от пяти до восьми) белка DII4, слитые с константной частью (Fc- доменом) иммуноглобулина человека lgG4, и способного селективно блокировать Notch- сигналинг, а также разработаны нуклеотидные последовательности, кодирующие такие слитые белки и являющиеся экспрессионной основой для их получения;
- разработанные гибридные конструкции обладают только минимальной эффекторной функцией антитело-зависимой клеточной цитотоксичности и не обладает комплемент-зависимой цитотоксичностью, что снижает возможный риск воспалительных реакций и сенсибилизацию при использовании терапевтического агента на основе слитого (гибридного) белка hDII4-hFc;
- разработанные гибридные конструкции включают минимальный фрагмент белка DII4 человека (DSL-домен и, минимально, первые 5 доменов EGF-подобных повторов), необходимый и достаточный для взаимодействия с Notch-рецепторами;
- разработанные гибридные конструкции не включают MNNL-домен белка DII4 человека, принимающего участие в активации передачи Notch-сигнала;
- разработанные гибридные конструкции имеют относительно небольшую молекулярную массу, что повышает эффективность продукции этих молекул в клетках млекопитающих и улучшает их свойства, связанные со скоростью и эффективностью проникновения в ткани;
- разработанные гибридные конструкции, за счет отсутствия в конструкции MNNL- домена, обладают пониженной способностью к агрегации и улучшенной растворимостью;
- связывание разработанных гибридных конструкций с Notch-рецепторами не приводит к их активации, за счет отсутствия в конструкции MNNL-домена, в результате чего такое связывание обеспечивает эффективное блокирование Notch-сигналинга.
Краткое описание рисунков
Фиг.1. Схема экспрессирующего вектора, содержащего нуклеотидную последовательность, кодирующую слитый белок, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 2.
Фиг.2. Схема экспрессирующего вектора, содержащего нуклеотидную последовательность, кодирующую слитый белок, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 4.
Определения и термины
Следующие термины и определения применяются в данном документе, если иное не указано явно. Ссылки на методики, используемые при описании данного изобретения, относятся к хорошо известным методам, включая изменения этих методов и замену их эквивалентными методами, известными специалистам.
В документах данного изобретения термины «включает», «включающий» и т.п., а также «содержит», «содержащий» и т.п. интерпретируются как означающие «включает, помимо всего прочего» (или «содержит, помимо всего прочего»). Указанные термины не предназначены для того, чтобы их истолковывали как «состоит только из».
Термины «полипептид», «белок» и «пептид» используют в настоящем документе взаимозаменяемо, и все они означают полимер из аминокислотных остатков. Эти термины также могут использоваться в настоящем описании взаимозаменяемо при обозначении конечного продукта, получаемого в результате экспрессии в клетке- хозяине последовательности нуклеиновой кислоты.
Под «слитым белком» («гибридным белком», «рекомбинантным белком», «слитым полипептидом», «рекомбинантным полипептидом», «гибридной конструкцией») понимают конструкцию из двух или более частей полипептидной природы, ковалентно связанных между собой, образующейся в результате экспрессии рекомбинантной молекулы ДНК, в которой соединены друг с другом в одной рамке считывания кодирующие участки, соответственно, двух или нескольких разных генов или их фрагментов.
Термин «изолированный» («выделенный») имеет свое общепринятое значение, известное среднему специалисту в данной области техники, и при использовании в отношении выделенной нуклеиновой кислоты или выделенного полипептида используется без ограничения для обозначения нуклеиновой кислоты или полипептида, которые, благодаря человеку, существуют отдельно от своего нативного окружения и поэтому не являются продуктом природы. Выделенная нуклеиновая кислота или полипептид могут существовать в очищенной форме или могут существовать в ненативном окружении, в таком как, например, клетка-хозяин.
Термин «синонимичная замена» относится к нуклеотидной последовательности, имеющей последовательность нуклеотидов, которая может отличаться от референсной последовательности нуклеиновой кислоты на одну или более замен, которые не ведут к изменению аминокислотной последовательности белка, кодируемой данной молекулой нуклеиновой кислоты. В связи с тем, что генетический код является «вырожденным», то есть различные по нуклеотидной последовательности триплеты могут кодировать одну и ту же аминокислоту, синонимичные замены в нуклеотидной последовательности не приводят к изменению аминокислотной последовательности белка.
Термин «лиганд-ловушка» (от англ. Decoy ligand, также трап) относится к гибридным белкам, состоящим из внеклеточного домена лиганда молекулы-мишени (рецептора) и Fc-домена иммуноглобулина. Внеклеточный домен лиганда отвечает за связывание мишени, а Fc-домен осуществляет димеризацию гибридного белка. Последнее необходимо для увеличения эффективности связывания и обеспечения большей стабильности высокомолекулярного комплекса. В рамках настоящего изобретения «лиганд -ловушка» состоит из определенных фрагментов растворимого внеклеточного фрагмента человеческого белка DII4 (DSL-домен и, минимально, первые 5 доменов EGF-подобных повторов), и константной части тяжелой цепи lgG4 человека.
Термин «лечение» означает излечение, замедление, остановку, либо реверсию прогрессирования заболевания или нарушения. В настоящем документе «лечение» также означает смягчение симптомов, ассоциированных с заболеванием или нарушением.
Под «терапевтически эффективным количеством (терапевтической дозой)» подразумевается количество лекарственного средства, вводимого пациенту, при котором у него с наибольшей вероятностью проявится ожидаемый терапевтический эффект. Точное требуемое количество может меняться от субъекта к субъекту в зависимости от многочисленных факторов, таких как тяжесть заболевания, возраст, масса тела, общее состояние организма, комбинированное лечение с другими препаратами и др. Введение лекарственного средства по изобретению субъекту, нуждающемуся в лечении и/или профилактике заболевания или состояния, осуществляется в дозе, достаточной для достижения терапевтического эффекта. При проведении лечения и/или профилактики введение может осуществляться как разово, так и несколько раз в день, чаще в виде курсового введения на протяжении времени, достаточного для достижения терапевтического эффекта (от нескольких дней до недели, нескольких недель и до месяцев), при этом курсы введения лекарственного средства могут проводиться повторно. В частности, при среднетяжелых формах заболевания разовая доза, кратность и/или длительность введения лекарственного средства по изобретению могут быть увеличены. Предпочтительно слитый белок по изобретению вводят пациенту в составе фармацевтической композиции, включающей, помимо активного компонента, фармацевтически приемлемые носители и/или наполнители.
Если не определено отдельно, технические и научные термины в данной заявке имеют стандартные значения, общепринятые в научной и технической литературе.
Подробное описание изобретения
В настоящем изобретении предлагаются конструкции ДНК, кодирующие слитые белки (рекомбинантные полипептиды) hDII4-hFc - антагонисты DII4, блокирующие сигнальный путь Notch, но обладающие сравнительно небольшими размерами по сравнению с лигандами-ловушками, использующими полноразмерный эктодомен белка человека DII4, что обеспечивает их улучшенные свойства, касающиеся скорости и эффективности проникновения в ткани, продукции белка в клетках млекопитающих, а также отсутствия активации передачи Notch-сигнала при связывании.
В частности, изобретение относится к нуклеотидным конструкциям, кодирующим полипептиды, содержащие функциональные домены DSL и EGF-подобных повторов (от пяти до восьми) белка DII4, слитые с константной частью (Fc-доменом) иммуноглобулина человека lgG4, hDII4-hFc.
Естественная последовательность белка DII4 человека состоит из 685 аминокислот (ак) (SEQ ID N0: 1). В состав белка входит сигнальный пептид (1 — 26 ак SEQ ID N0: 1), трансмембранный домен (530 — 550 ак SEQ ID N0: 1), домен Delta/Serrate/Lag-2 (DSL, 173 — 217 ак SEQ ID NO: 1) и восемь тандемных повторов, подобных эпидермальному фактору роста (домены EGF-подобных повторов) (218 — 251 , 252—282, 284—322, 324—360, 362—400, 402—438, 440—476, 480—518 ак SEQ ID N0: 1). В составе белка выделяется экстраклеточная часть (27-529 ак SEQ ID N0: 1) и цитоплазматическая часть (551-685 ак SEQ ID NO: 1), при этом N-терминальный конец DII4 (27-172 ак SEQ ID N0: 1) формирует отдельный функциональный домен MNNL. В уровне технике известны работы различных авторов по изучению структуры и роли различных доменов белка DII4 во взаимодействии с рецепторами Notch и передачи сигналов (см., например, Luca et al. Structural basis for Notchl engagement of Delta-like 4 // Science, 2015, Vol 347, Issue 6224, pp. 847-853 doi: 10.1126/science.1261093; Hirano et al. Delta-like 1 and Delta-like 4 differently require their extracellular domains for triggering Notch signaling in mice 11 Elife 2020; 9: e50979. Published online 2020 Jan 16 doi: 10.7554/eLife.50979), однако на настоящий момент все тонкости и особенности Notch- сигналинга до конца еще не изучены.
В рамках настоящего изобретения в процессе разработки новых высокоэффективных полипептидных препаратов - антагонистов DII4 было сделано предположение, что отсутствие в гибридном полипептиде MNNL-домена позволит обеспечить блокирование Notch-сигналинга. В соответствии с поставленной задачей были созданы нуклеотидные последовательности, кодирующие терапевтические молекулы, обладающие свойствами селективно блокировать передачу Notch-сигнала, которые представляют собой гибридные полипептиды-антагонисты DII4 (hDII4-hFc). Данные белковые молекулы включают в себя функциональные домены DSL и EGF- подобных повторов (по меньшей мере, первые пять доменов) белка DII4, слитые с константной частью (Fc-фрагментом) человеческого lgG4. Блокировка передачи Notch- сигнала при взаимодействии с рецептором Notch достигается за счет отсутствия в терапевтической молекуле MNNL-домена, который участвует в передаче сигнала. Такая конструкция обуславливает, с одной стороны, антагонистические свойства молекулы по изобретению, а с другой - уменьшенный размер молекулы. Размер молекулы по изобретению также может быть дополнительно уменьшен при уменьшении количества доменов EGF-подобных повторов (как показали проведенные эксперименты, антагонистические свойства молекулы сохраняются при включении от 5 до 8 доменов EGF). Согласно изобретению, функциональные домены белка DII4 могут быть слиты с константной частью тяжелой цепи lgG4 человека как непосредственно (т.е. безлинкерно), так и посредством линкерной последовательности. Слитый белок hDII4- hFc по изобретению также может необязательно содержать сигнальную
последовательность, которая может включать любую последовательность, известную квалифицированному специалисту в области управления секрецией полипептида или белка из клетки, и включать природные или синтетические последовательности. Обычно сигнальная последовательность размещается на N-конце слитого белка по настоящему изобретению.
В частных вариантах осуществления изобретения рекомбинантные полипептиды по изобретению включают в себя DSL-домен DII4 и ЕСЕ(1-5)-домены белка DII4 или DSL- домен DII4 и ЕОР(1-8)-домены белка DII4 и представляют собой растворимые рекомбинантные лиганды-ловушки (трапы) - антагонисты DII4. Такие молекулы ингибируют путь передачи сигнала Notch, специфически связываясь с рецепторами Notchl и Notch4. При этом не происходит активации Notch-пути, вместо этого молекулы hDII4-hFc препятствуют связыванию рецепторов Notch с эндогенными полноразмерными активирующими лигандами. Сигнальные пути Notchl и Notch4 вовлечены в контроль роста кровеносных сосудов, а их ингибирование за счет действия hDII4-hFc приводит к активации роста новых сосудов (терапевтическому ангиогенезу) в ишемических тканях и улучшает раневое заживление. Специфическое ингибирование сигнальных путей Notch за счет использования антагонистов DII4 может использоваться для лечения широкого спектра сердечно-сосудистых заболеваний, онкологических заболеваний, а также для лечения сосудистых осложнений инфекционных заболеваний, включая COVID-19.
Изобретение позволяет получить полипептиды с высокой аффинностью к Notch- рецепторам человека, но с уменьшенной молекулярной массой по сравнению с природными белками DII4, а также по сравнению с молекулами DII4-FC, описанными ранее. Уменьшение размеров рекомбинантных полипептидов позволяет увеличить скорость их проникновения в ткани организма, уменьшить необходимые дозы вводимого пациентам препарата (фармацевтической композиции) на их основе и уменьшить затраты на синтез описанных рекомбинантных полипептидов.
Препараты на основе описанных рекомбинантных полипептидов могут быть использованы для лечения ишемических заболеваний различных органов и тканей. Ишемия — уменьшение кровоснабжения участка тела, органа или ткани вследствие ослабления или прекращения притока к нему артериальной крови. Ишемия может быть обусловлена различными факторами и возникает при несоответствии объема кровотока потребностям органа. Существует ряд терапевтических подходов к решению проблем восстановления кровотока и лечения ишемических повреждений различных тканей, одним из которых является терапевтический ангиогенез — индуцированное медицинскими препаратами формирование новых функционирующих сосудов на основе уже существующих.
Описанные конструкции ДНК позволяют получать молекулы hDII4-hFc, которые обладают малой молекулярной массой и высокой биодоступностью и могут быть использованы для стимулирования терапевтического ангиогенеза, лечения широкого спектра ишемических состояний (в частности ишемии нижних конечностей), сердечнососудистых заболеваний, онкологических заболеваний, лечения сосудистых осложнений инфекционных заболеваний, включая COVID-19, и других заболеваний, связанных с патологической активностью Notch рецепторов или в тех случаях, когда целесообразно модулирование работы сигнального пути DII4-Notch.
Слитые белки (рекомбинантные полипептиды), являющиеся объектом настоящего изобретения, могут быть получены следующим образом.
Растворимые рекомбинантные полипептиды-антагонисты DII4 производят в результате экспрессии кодирующих их нуклеотидных последовательностей в эукариотических клеточных линиях, с последующей очисткой синтезированных рекомбинантных белков при помощи аффинной, ионобменной или гидрофобной хроматографии, применяемых по отдельности или в различных сочетаниях друг с другом, а также при помощи иных способов очистки белков. Соответствующие нуклеотидные последовательности получают при помощи комбинирования участков ДНК, кодирующих выбранные домены DII4, с последовательностью ДНК, кодирующей Fc-фрагмент lgG4 человека. В некоторых частных вариантах изобретения молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующие такие полипептиды-антагонисты DII4, имеют нуклеотидную последовательность, соответствующую SEQ ID NO: 3 или SEQ ID NO: 5.
Также указанная задача решается путем создания экспрессирующего вектора, содержащего данную молекулу нуклеиновой кислоты под контролем регуляторных элементов, необходимых для экспрессии данной нуклеиновой кислоты в клетке-хозяине. В предпочтительных вариантах изобретения в качестве клетки-хозяина, включающей такой экспрессирующий вектор, могут выступать клетки яичников китайских хомячков СНО (например, клеточные линии СНО-К1 или СНО DG44), адаптированные для производства терапевтических белков. В настоящем изобретении экспрессирующий вектор предпочтительно подбирается для экспрессии гетерологичных последовательностей в клетках млекопитающих, но в некоторых вариантах изобретения экспрессирующий вектор может быть выбран для экспрессии в других системах, таких как, например, клетки насекомых, дрожжевые или бактериальные клетки. Соответственно, каждый экспрессирующий вектор имеет свой набор регуляторных элементов, позволяющих проводить экспрессию гетерологичной последовательности (продукта) в клетке-хозяине, таких как промоторы и/или энхансеры, последовательности Козак, polyA последовательности и другие регуляторные последовательности. А также может иметь последовательности, кодирующие лидерные (сигнальные) пептиды, обеспечивающие секрецию рекомбинантных полипептидов во внеклеточную среду.
Терминация синтеза белка с заданной изолированной последовательности нуклеиновой кислоты определяется добавлением к ней с З’-конца в одной рамке считывания одного или нескольких стоп-кодонов.
После трансфекции вектора в клетки эукариотической клеточной линии происходит синтез рекомбинантного полипептида и его секреция в культуральную бессывороточную среду. Полученный рекомбинантный полипептид очищают из среды при помощи, как правило, аффинной хроматографии на белок протеин-А или белок протеин-G, однако могут использоваться и другие методы очистки белков.
Единство данного изобретения достигается за счет использования во всех конструкциях общей минимальной последовательности DII4, осуществляющей взаимодействие с Notch-рецепторами. Данная последовательность представлена аминокислотами 21-254 в SEQ ID NO: 2 и в SEQ ID NO: 4, и соответствует последовательности SEQ ID NO: 6 и аминокислотам 171-404 в SEQ ID NO: 1. Она включает DSL и домены ЕОЕ(1-5)-подобных повторов белка человека DII4, которые необходимы и достаточны для взаимодействия с рецепторами Notchl и Notch4. При этом они не содержат MNNL-домена DII4, который участвует в активации передачи Notch-сигнала.
В настоящем изобретении антагонист DII4 содержит аминокислоты 171-404 белка DII4. Данный регион не включает участок 27-172, соответствующий MNNL-домену (в отличие, в том числе, от полипептидов, известных из патента ЕР2054082В1), за счет чего молекулы по изобретению не могут приводить к активации рецепторов Notch. Кроме того, делеция MNNL-домена снижает агрегацию белка и улучшает его растворимость, что приводит к повышению продукции белка по сравнению со слитыми полипептидами, в которых используется полноразмерный экстраклеточный домен DII4. Таким образом, настоящее изобретение является уникальным и представляет собой новый тип молекул, которые не были описаны ранее.
Сущность технического решения заключается в создании нуклеотидных последовательностей (в частных вариантах, SEQ ID NO: 3 и SEQ ID NO: 5), которые кодируют соответствующие гибридные белки с последовательностями (в частных вариантах, соответственно, SEQ ID NO: 2 и SEQ ID NO: 4), включающими две основные функциональные части. Первая из которых соответствует части внеклеточного домена человеческого DII4, и в представленных частных вариантах воплощения изобретения соответствует аминокислотам 21-254 для SEQ ID NO: 2 и аминокислотам 21-365 для SEQ ID NO: 4. Общая последовательность DII4, объединяющая эти конструкции, соответствует последовательности SEQ ID NO: 6. Вторая функциональная часть кодирует константную часть тяжёлой цепи человеческого lgG4 (SEQ ID NO: 7) и в
представленных частных вариантах воплощения изобретения соответствует аминокислотам 257-482 для SEQ ID NO: 2 и аминокислотам 368-593 для SEQ ID NO: 4.
Кодирующие нуклеотидные последовательности (в том числе SEQ ID NO: 3 и SEQ ID NO: 5) могут быть изменены для оптимизации уровня экспрессии в клетках определенного типа. При использовании гетерологичных систем экспрессии (например, клетки насекомых, бактериальные или дрожжевые клетки) может потребоваться оптимизация кодонов в последовательности (замена редко используемых в организме кодонов на часто используемые). Это можно сделать с помощью алгоритмов, реализованных во многих имеющихся алгоритмах для проектирования последовательностей, например, Codon optimizer, Gene Designer, или OPTIMIZER. Для промышленного производства слитых белков, последовательности, соответствующие SEQ ID NO: 3 и SEQ ID NO: 5, могут быть переклонированы в любой другой вектор, позволяющий осуществлять наработку и секрецию целевых полипептидов в культуральную жидкость, с целью последующей очистки продуктов. В частности, в качестве такого вектора может быть выбран вектор Freedom рСНО 1.0 (ThermoFisher).
Экспрессия гибридной конструкции в клетках млекопитающих возможна при помощи создания стабильных клонов-продуцентов после трансфекции клеток этой конструкцией. Может быть использована трансфекция электропорацией или с использованием трансфецирующего реагента, такого как Lipofectamine 2000. Данная гибридная конструкция может быть также использована для введения в лентивирусную конструкцию и последующего заражения клеток. Для увеличения выхода гибридного белка в клетках млекопитающих возможно использование различных подходов. Методы оптимизации известны специалистам и описаны, например, в (Almo et al. Better and faster: improvements and optimization for mammalian recombinant protein production // Curr Opin Struct Biol. 2014 Jun; 26:39-43).
Предлагаемые продукты являются ранее не создававшейся комбинацией нуклеотидных последовательностей генома человека (и обладают общей последовательностью, соответствующей Fc-фрагменту человеческого lgG4, слитой в одной рамке считывания с фрагментом(-и) последовательности DII4 человека) и призваны быть экспрессионной основой для производства слитого белка hDII4-hFc, обладающего целым комплексом улучшенных фармакологических свойств, а именно: (1) минимальной эффекторной функцией антитело-зависимой клеточной цитотоксичности (antibody-dependent cellular cytotoxicity - ADCC) и комплемент- зависимой цитотоксичности (complement-dependent cytotoxicity - CDC) благодаря использованию константной части иммуноглобулина человека 1дС4-изотипа; (2) относительно небольшой молекулярной массой, что повышает эффективность продукции этих молекул в клетках млекопитающих и улучшает их свойства, связанные со скоростью и эффективностью проникновения в ткани; (3) способности эффективно
блокировать Notch-сигналинг за счет наличия функциональных доменов, необходимых для эффективного связывания с Notch-рецепторами; (4) неспособности вызвать активацию Notch-рецепторов (за счет отсутствия в конструкции MNNL-домена), а также (5) пониженной способностью белка к агрегации и его улучшенной растворимостью. После прохождения испытаний по безопасности на животных и клинических испытаний, слитый белок по настоящему изобретению может быть включен в состав фармацевтической композиции для лечения заболеваний сердечно-сосудистой системы, ишемических состояний, воспалительных состояний в сосудах и онкологических заболеваний, стимулирования терапевтического ангиогенеза.
Нижеследующие примеры приведены в целях раскрытия характеристик настоящего изобретения, и их не следует рассматривать как каким-либо образом ограничивающие объем изобретения.
Пример 1. Конструирование плазмид
Для конструирования плазмид с заявляемыми нуклеотидными последовательностями была использована последовательность, кодирующая белок человека DII4, полученная из плазмиды RG212628 (OriGene, DII4 (NM_019074) Human Tagged ORF clone).
Фрагменты DII4 были выбраны на основе биоинформатического анализа последовательности и, соответствующие кодирующие их нуклеотидные последовательности, были использованы для последующего клонирования. Для клонирования участков, соответствующих аминокислотам 21-254 для SEQ ID NO: 2 и аминокислотам 21-365 для SEQ ID NO: 4, были подобраны следующие праймеры:
DLL4DMF: AAGAATTCCTACCGGGTCATCTGCAGTGACAACTA (SEQ ID NO: 8) DLL4DMDE5R: TAGGATCCGTCCACTTTCTTCTCGCAGTTGGA (SEQ ID NO: 9) DLL4DMR2: TAGGATCCGCTGCCCACAAAGCCATAAGGGCA (SEQ ID NO: 10).
В праймеры были включены сайты рестрикции для рестриктаз EcoRI (прямой праймер DLL4DMF) и BamHI (обратные праймеры DLL4DMDE5R и DLL4DMR2)
Проведена ПЦР со следующими условиями: 95°С 1 мин, 30 циклов (95°С 10 сек, 63°С 10 сек, 72°С 2 мин), 72°С 5 мин. Компоненты реакции: полимераза - ExTaq Takara (Takara Bio), буфер, содержащий Mg2+ для ExTaq-полимеразы (Takara Bio), по 12 пкмоль каждого из праймеров и 0,25 мМ смеси трифосфатов нуклеотидов (Takara Bio). После ПЦР: ПЦР продукт очищали набором для очистки ПЦР продуктов PCR Purification kit QIAquick (QiaGene Cat.No 28106). Концентрация и соответствие предсказанному молекулярному весу проверяли при помощи гель-электрофореза в 1% агарозе (ТАЕ буфер). Полученные ПЦР продукты были использованы для дальнейшего конструирования.
Для клонирования целевых последовательностей использовался вектор pFUSE- hlgG4-Fc2 (InvivoGen), который позволяет получить слитые с Fc-доменом lgG4 последовательности и проводить исследование их свойств. Вектор обрабатывали рестриктазами EcoRI и Bglll (Thermo), а ПЦР-продукт обрабатывали рестриктазами EcoRI и BamHI (Thermo) в течение 1 часа при 37°С, очищали с помощью PCR Purification kit QIAquick (Thermo) и лигировали, используя 1 Ед (ME) лигазы (Thermo) по протоколу производителя. Лигазной смесью трансформировали компетентные клетки Е. coli XL10- Gold и высевали на среду LB, содержащую зеоцин.
Чашки инкубировали в термостате в течение ночи при 37°С. На следующий день проверяли по 20 колоний из каждой лигазной смеси на присутствие нужной вставки, для этого часть колонии разводили в 20 мкл воды и кипятили в течение 5 минут. После охлаждения смесь откручивали и использовали 1 мкл в качестве матрицы в реакции ПЦР. Присутствие вставки проверяли после электрофореза ПЦР продуктов. Из двух колоний, содержащих вставку, выделяли плазмидную ДНК и секвенировали на секвенаторе Applied Biosystems 3500 по инструкции производителя, используя праймеры PROMF2 (прямой) и FC (обратный).
PROMF2: GCCTGACCCTGCTTGCTCAACT (SEQ ID NO: 11)
FC: CTCACGTCCACCACCACGCA (SEQ ID NO: 12)
Сконструированные в результате плазмиды, содержащие целевые нуклеотидные последовательности, показаны на Фиг. 1 и 2.
Пример 2. Продукция рекомбинантных полипептидов
Для трансфекции клеток СНО выделяли особо чистую (“transfection grade”) плазмидную ДНК с помощью набора EndoFree Plasmid MaxiKit (Qiagen) по протоколу фирмы-производителя. Линеаризацию обеих конструкций осуществляли по сайту Not1 (Thermo). Для трансфекции добавляли 20 мкг линеаризованного вектора на 100 мкл клеточной суспензии с концентрацией 5x107 клеток/мл. Электропорация проводилась по протоколу: 3 импульса по 1130 В продолжительностью 20 мс. Селекцию начинали через 48 часов после трансфекции путем добавления антибиотика зеоцина в концентрации 500 мкг/мл и продолжали ее при дальнейших пересевах. Среда для культивирования: Dynamis + 6 мМ Glutamax + 0,5% antidumping reagent В (Lonza, Швейцария) + 500 мкг/мл зеоцин. Культивирование осуществляли в шейкере-С02-инкубаторе Multitron Cell (Infers, Швейцария) в атмосфере 5%-ного СО2 при температуре 37 °C и относительной влажности 95% в колбах Эрнленмейера (Corning, США) объемом 125 мл (перемешивание 120 об/мин). Концентрацию целевых полипептидов в культуральной жидкости определяли методом бислойной интерферометрии с использованием биосенсоров Protein А и системы Octet К2 (Fortebio, Pall, США) в режиме реального времени. Оценивалось связывание Fc-фрагмента слитых белков с иммобилизованным на сенсоре Protein А. При культивировании данных пулов в режиме fed-batch была
подтверждена продукция слитых полипептидов и их секреция в культуральной жидкости. Уровень продукции слитых белков, соответствующих последовательностям SEQ ID NO: 2 и SEQ ID NO: 4 был значимо больше уровня продукции гибридного белка hDII4-hFc, содержащего полноразмерный экстраклеточный домен DII4. Наибольший уровень продукции достигался для молекулы, соответствующей SEQ ID NO: 2, что подтверждает вывод о том, что малые размеры молекулы и отсутствие MNNL-домена играют принципиальную роль для продукции белка в клетках СНО. Данный факт имеет принципиальное значение для промышленного производства белка, так как эффективная продукция позволит удешевить стоимость производства лекарственной субстанции.
Пример 3. Оценка функциональной активности полученных рекомбинантных полипептидов
Для оценки функциональной активности полученных рекомбинантных полипептидов hDII4-hFc используются стандартные методы и подходы:
(1) сравнительный анализ связывания рекомбинантного полипептида hDII4-hFc с рецепторами-мишенями Notchl и Notch4 методом белковой ко-иммунопреципитации;
(2) исследование кинетики связывания рекомбинантного полипептида hDII4-hFc с рецепторами-мишенями Notchl и Notch4 при помощи анализа изменения угла полного внутреннего отражения за счет эффекта поверхностного плазмонного резонанса;
(3) исследование эффективности подавления Notch-сигналинга в клетках при добавлении рекомбинантного полипептида hDII4-hFc при помощи отПЦР в режиме реального времени, в частности изменения экспрессии генов-мишеней HEY1, HEY2, HES1 и HES5,
(4) исследование ангиогенной активности рекомбинантного полипептида hDII4-hFc в модели эндотелиальных клеток пупочной вены человека (англ. HUVEC - Human umbilical vein endothelial cells).
Ниже приведена подробная методика проводимых экспериментов:
(1) По результатам анализа литературы наиболее вероятными природными мишенями полученного рекомбинантного полипептида hDII4-hFc являются белки Notchl и Notch4. В рамках изучения биологических свойств hDII4-hFc в качестве мишеней используются рекомбинантные белки человека Notchl и Notch4, наработанные в суспензионной культуре клеток НЕК293 и очищенные методом жидкостной хроматографии высокого давления (HPLC). На первом этапе анализа они конъюгируются с биотином методом активированных эфиров с последующей очисткой на обессоливающих колонках. Полипептид hDII4-hFc нарабатывается в суспензионной культуре клеток СНО и очищается методом жидкостной хроматографии на сефарозе с Protein А. Далее к биотинилированным белкам-мишеням добавляется исследуемый
полипептид в молярном соотношении 1 :1 в фосфатно-солевом буфере (PBS, 1 х, рН=7.4) с добавлением БСА, смесь инкубируют при комнатной температуре. Затем комплексы полипептид-мишень инкубируют с магнитными микросферами Dynabeads М280 (Invitrogen, США) с иммобилизованным на их поверхности стрептавидином, промывают и элюируют в соответствии с протоколом производителя. Далее полученные комплексы очищают, и связанный hDII4-hFc детектируют при помощи Вестерн-блоттинга.
(2) Для оценки кинетики связывания полученного полипептида hDII4-hFc с Notch 1 и Notch4 используют метод поверхностного плазмонного резонанса в системе BioRad Proteon XPR36. Для этого полученные ранее биотинилированные рекомбинантные белки Notch 1 и Notch4 иммобилизируют на чипе, покрытом стрептавидином, в буфере HBS-EP (рН=7.4). После этого через аналитическую ячейку пропускается буфер HBS-EP, содержащий варьирующие концентрации hDII4-hFc. При пропускании раствора происходит ассоциация полипептида hDII4-hFc с белками- мишенями. Далее оценивается диссоциация полипептида и мишени. Раствор свободного биотина используется для блокировки незанятых стрептавидиновых сайтов в ячейках с Notchl , Notch4 и в контроле. Анализ данных осуществляют в соответствии с протоколом производителя.
(3) Оценку экспрессии генов HEY1, HEY2, HES1 и HES5 проводят на модели первичной линии HUVEC. Для этого очищенный как описано в методике (1) полипептид hDII4-hFc добавляют к суспензии клеток HUVEC и инкубируют при 37°С в СОг- инкубаторе. В качестве контроля используют клетки HUVEC без добавления белка (буферный раствор). Далее клетки осаждают на центрифуге, и из них выделяют тотальную РНК. Концентрацию полученной РНК измеряют с помощью флуориметра Qubit 2.0 (Invitrogen, США). Удаление ДНК осуществляют с помощью TurboDNA free набора (Invitrogen). Затем проводят реакцию обратной транскрипции, для чего отбирают одинаковое количество РНК из различных образцов (опыт и контроль). Для обратной транскрипции используют Superscript III (Invitrogen) и случайные гексамеры в качестве затравки. После этого проводят ПЦР в режиме реального времени на амплификаторе CFX96 Bio-Rad с использованием смеси Sso Fast EvaGreen supermix (Bio-Rad). Последовательности праймеров для амплификации представлены ниже:
HES1 - F: AAGAAAGATAGCTCGCGGCA (SEQ ID NO: 13)
HES1 - R: TACTTCCCCAGCACACTTGG (SEQ ID NO: 14)
HES5 - F: GATTCCTCTGTGTGGGTGGATG (SEQ ID NO: 15)
HES5 - R: GATTTTATTATGGCGGCTTCGG (SEQ ID NO: 16)
HEY1 - F: CCTTCCCCTTCTCTTTCGGC (SEQ ID NO: 17)
HEY1 - R: AAAAGCTCCGATCTCCGTCC (SEQ ID NO: 18)
HEY2 - F: AAGGCGTCGGGATCGGATAA (SEQ ID NO: 19)
HEY2 - R: AGAGCGTGTGCGTCAAAGTAG (SEQ ID NO: 20)
GAPDH - F: CCATCACCATCTTCCAGGAG (SEQ ID NO: 21)
GAPDH - R: AATGAGCCCCAGCCTTCTCC (SEQ ID NO: 22).
(4) Для оценки ангиогенной активности полученного рекомбинантного белка- трапа hDII4-hFc используют стандартную методику на основе культивирования первичных эндотелиальных клеток пупочной вены человека HLIVEC в трехмерном матриксе. Для этого первичные эндотелиальные клетки изолируют из пупочной вены новорожденных, а затем культивируют в обогащенной среде М199 с добавлением 20% эмбриональной телячьей сыворотки и коктейля антибиотиков (пенициллина и стрептомицина) в культуральных флаконах. При достижении клетками 70-80% конфлюэнтности культуру пассируют по стандартной методике до 2-го пассажа. За два часа до переноса клеток в трехмерный матрикс (матригель), они переводятся на обедненную среду ЕВМ-2 с добавлением 0,2% эмбриональной телячьей сыворотки.
Далее суспензия клеток HUVEC в концентрации 5x108 клеток/мл смешивается с эквивалентным объемом матригеля. После этого 50 мкл смеси наносят по центру лунки в 24-луночные планшеты. Исследуемый рекомбинантный белок hDII4-hFc в варьирующих концентрациях добавляют к клеткам в 1 мл среды ЕВМ-2 спустя час после нанесения и инкубации при 37°С. Каждый эксперимент проводится в трех повторах. В качестве контроля используют клетки без добавления рекомбинантного белка. Затем клетки инкубируют в течение 72 часов в СОг-инкубаторе и фиксируют 4% формалином в PBS.
Анализ формирования первичных сосудов (эндотелиальных трубочек) проводится методом конфокальной микроскопии. После фиксации капель матригеля проводится их пермеабилизация 0,5% раствором детергента Triton Х-100. Далее проводится окрашивание клеток мембранным красителем BDP 505/515 и ядерным красителем DAPI на микроскопе Leica TCS SP5 (Leica, Германия). Характеризация первичных сосудов проводится при помощи программного обеспечения.
Рекомбинантные полипептиды hDII4-hFc обладают высокой селективностью связывания с рецепторами-мишенями Notchl и Notch4, не приводя к их активации, в результате чего такое связывание обеспечивает эффективное блокирование Notch- сигналинга, проявляющееся, в частности, в активации роста новых сосудов (ангиогенной активности) в ишемических тканях.
Несмотря на то, что изобретение описано со ссылкой на раскрываемые варианты воплощения, для специалистов в данной области должно быть очевидно, что конкретные подробно описанные эксперименты приведены лишь в целях иллюстрирования настоящего изобретения, и их не следует рассматривать как каким- либо образом ограничивающие объем изобретения. Должно быть понятно, что возможно осуществление различных модификаций без отступления от сути настоящего изобретения.
Claims
1. Слитый белок - антагонист DII4, содержащий: а) фрагмент растворимой внеклеточной части белка DII4 человека, соответствующий домену DSL и доменам EGF-подобных повторов белка DII4, причем фрагмент белка DII4 включает домен DSL и по меньшей мере домены 1-5 EGF-подобных повторов, расположенных в порядке, соответствующем природной последовательности; б) Fc-фрагмент lgG4 человека, присоединенный к фрагменту белка DII4 (а) с С- конца непосредственно или посредством линкерной последовательности.
2. Слитый белок по п.1 , в котором домен DSL белка DII4 имееет аминокислотную последовательность, соответствующую положениям 173-217 последовательности SEQ ID NO: 1, а домены EGF-подобных повторов белка DII4 имеют аминокислотные последовательности, соответствующие положениям 218-251 , 252-282, 284-322, 324-360 и 362-400 последовательности SEQ ID NO: 1.
3. Слитый белок по п.1 , в котором Fc-фрагмент lgG4 человека имеет аминокислотную последовательность SEQ ID N0:7.
4. Слитый белок по п.1 , дополнительно включающий по меньшей мере один из доменов 6-8 EGF-подобных повторов белка DII4, расположенный(-е) с С-конца фрагмента белка DII4 (а), причем порядок расположения этих доменов 6-8 EGF- подобных повторов может быть любым.
5. Слитый белок по п.4, в котором домены 6-8 EGF-подобных повторов белка DII4 имеют аминокислотные последовательности, соответствующие положениям 402- 438, 440-476 и 480-518 последовательности SEQ ID N0:1.
6. Слитый белок по п.1, в котором Fc-фрагмент lgG4 человека (б) соединен с фрагментом белка DII4 (а) безлинкерно.
7. Слитый белок по п.1, в котором Fc-фрагмент lgG4 человека (б) соединен с фрагментом белка DII4 (а) через линкерный пептид.
8. Слитый белок по п.4, в котором Fc-фрагмент lgG4 человека (б) соединен с фрагментом белка DII4 (а) через линкерный пептид GS.
9. Слитый белок по п.1 , в котором фрагмент белка DII4 имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 6.
10. Слитый белок по п.1 , дополнительно включающий сигнальную последовательность, локализованную на N-конце слитого белка.
11. Слитый белок по п.1, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 2.
12. Слитый белок по п.4, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 4.
13. Изолированная молекула нуклеиновой кислоты, кодирующая слитый белок по любому из п.п.1-12.
14. Изолированная молекула нуклеиновой кислоты по п.13, имеющая последовательность SEQ ID NO: 3.
15. Изолированная молекула нуклеиновой кислоты по п.13, имеющая последовательность SEQ ID NO: 5.
16. Экспрессирующий вектор, несущий нуклеотидную последовательность, соответствующую последовательности изолированной молекулы нуклеиновой кислоты по любому из п.п.7-9 под контролем регуляторных элементов, необходимых для экспрессии указанной нуклеотидной последовательности в клетке-хозяине.
17. Клетка, способная экспрессировать слитый белок по любому из п.п.1-12, не являющаяся эмбриональной клеткой человека.
18. Клетка по п.17, представляющая собой клетку яичников китайского хомячка (СНО).
Priority Applications (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| EP21960763.7A EP4417619A1 (en) | 2021-10-12 | 2021-10-12 | Nucleotide sequence encoding a fusion protein |
| PCT/RU2021/000434 WO2023063842A1 (ru) | 2021-10-12 | 2021-10-12 | Нуклеотидная последовательность, кодирующая слитый белок |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| PCT/RU2021/000434 WO2023063842A1 (ru) | 2021-10-12 | 2021-10-12 | Нуклеотидная последовательность, кодирующая слитый белок |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| WO2023063842A1 true WO2023063842A1 (ru) | 2023-04-20 |
Family
ID=85987637
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| PCT/RU2021/000434 WO2023063842A1 (ru) | 2021-10-12 | 2021-10-12 | Нуклеотидная последовательность, кодирующая слитый белок |
Country Status (2)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP4417619A1 (ru) |
| WO (1) | WO2023063842A1 (ru) |
Citations (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US20070213266A1 (en) | 2005-09-01 | 2007-09-13 | Vasgene Therapeutics, Inc. | Methods for using and identifying modulators of Delta-like 4 |
| US20080107648A1 (en) * | 2005-12-16 | 2008-05-08 | Regeneron Pharmaceuticals, Inc. | Therapeutic methods for inhibiting tumor growth with DII4 antagonists |
| EP2054082B1 (en) | 2006-08-07 | 2012-12-26 | Regeneron Pharmaceuticals, Inc. | Use of Dll4 antagonists in ischemic injury or vascular insufficiency |
| WO2018220446A1 (en) * | 2017-06-01 | 2018-12-06 | Compugen Ltd. | Triple combination antibody therapies |
| RU2689522C1 (ru) * | 2018-09-11 | 2019-05-28 | Общество с ограниченной ответственностью "Пальмира Биофарма" | Нуклеотидная последовательность, кодирующая слитый белок, состоящий из растворимого внеклеточного домена человеческого tnfr1 и константной части тяжёлой цепи человеческого igg4 |
-
2021
- 2021-10-12 WO PCT/RU2021/000434 patent/WO2023063842A1/ru active Application Filing
- 2021-10-12 EP EP21960763.7A patent/EP4417619A1/en active Pending
Patent Citations (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US20070213266A1 (en) | 2005-09-01 | 2007-09-13 | Vasgene Therapeutics, Inc. | Methods for using and identifying modulators of Delta-like 4 |
| US20080107648A1 (en) * | 2005-12-16 | 2008-05-08 | Regeneron Pharmaceuticals, Inc. | Therapeutic methods for inhibiting tumor growth with DII4 antagonists |
| EP2054082B1 (en) | 2006-08-07 | 2012-12-26 | Regeneron Pharmaceuticals, Inc. | Use of Dll4 antagonists in ischemic injury or vascular insufficiency |
| WO2018220446A1 (en) * | 2017-06-01 | 2018-12-06 | Compugen Ltd. | Triple combination antibody therapies |
| RU2689522C1 (ru) * | 2018-09-11 | 2019-05-28 | Общество с ограниченной ответственностью "Пальмира Биофарма" | Нуклеотидная последовательность, кодирующая слитый белок, состоящий из растворимого внеклеточного домена человеческого tnfr1 и константной части тяжёлой цепи человеческого igg4 |
Non-Patent Citations (6)
| Title |
|---|
| ALMO ET AL.: "Better and faster: improvements and optimization for mammalian recombinant protein production", CURR OPIN STRUCT BIOL., vol. 26, June 2014 (2014-06-01), pages 39 - 43 |
| HIRAN ET AL.: "Delta-like 1 and Delta-like 4 differently require their extracellular domains for triggering Notch signaling in mice", ELIFE, 2020, pages e50979 |
| LIU R. ET AL.: "Inhibition of Notch signaling by DII4-Fc promotes reperfusion of acutely ischemic tissues", BIOCHEMICAL AND BIOPHYSICAL RESEARCH COMMUNICATIONS, vol. 418, no. 1, 2012, pages 173 - 179, XP028396211, DOI: 10.1016/j.bbrc.2012.01.002 |
| LOBOV ET AL., BLOOD, 2011 |
| LOBOV ET AL.: "The D114/Notch pathway controls postangiogenic blood vessel remodel-ing and regression by modulating vasoconstriction and blood flow", BLOOD, vol. 117, no. 24, 2011, pages 6728 - 37 |
| LUCA ET AL.: "Structural basis for Notch1 engagement of Delta-like 4", SCIENCE, vol. 347, no. 6224, 2015, pages 847 - 853 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| EP4417619A1 (en) | 2024-08-21 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US8926972B2 (en) | Anti-angiogenesis fusion proteins | |
| KR101658247B1 (ko) | 모듈 인식 도메인을 통한 항체 표적화 | |
| AU2018202982A1 (en) | Fusion immunomodulatory proteins and methods for making same | |
| CN111132999A (zh) | 支架蛋白 | |
| WO2005121176A1 (fr) | Proteine chimerique inhibitrice d'angiogenese et utilisation associee | |
| JP2009517080A (ja) | 非活性Ｗｎｔ抑制ポリペプチド及びその製造方法 | |
| JP2007312778A (ja) | ＨＭＧ蛋白質（ｈｉｇｈｍｏｂｉｌｉｔｙｇｒｏｕｐｐｒｏｔｅｉｎ）遺伝子の核酸配列およびそれらの使用 | |
| JP2002505078A (ja) | 血管内皮増殖因子の可溶性インヒビターおよびその使用 | |
| CZ329595A3 (en) | Nucleic sequences, vectors in which said sequences are comprised, pharmaceutical compositions and their therapeutic use | |
| CN117467025B (zh) | 一种抗vegf和补体双功能融合蛋白及其应用 | |
| WO2018137294A1 (zh) | 共表达抗msln嵌合抗原受体和无功能egfr的转基因淋巴细胞及其用途 | |
| JP2001000194A (ja) | 神経成長因子を真核生物細胞において発現させるための遺伝子ベクター | |
| US20190008897A1 (en) | Compositions and methods for producing pro-inflammatory macrophages | |
| WO2014093387A1 (en) | Vegf receptor fusion proteins for veterinary use | |
| CN115916831A (zh) | 包含抗lag-3抗体和il-2的融合蛋白及其用途 | |
| CN110845621A (zh) | 一种靶向egfr和cd19双靶点的嵌合抗原受体方法 | |
| WO2023063842A1 (ru) | Нуклеотидная последовательность, кодирующая слитый белок | |
| CN112063640A (zh) | 靶向人源化cea的嵌合抗原受体及其用途 | |
| WO2022100585A1 (zh) | 抗Her-2抗体-趋化因子融合蛋白及其制法和应用 | |
| CN111303299B (zh) | 一种mt1-mmp特异性靶向并激活的细胞穿膜肽及应用 | |
| RU2787060C1 (ru) | НУКЛЕОТИДНАЯ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЬ, КОДИРУЮЩАЯ СЛИТЫЙ БЕЛОК, СОСТОЯЩИЙ ИЗ РАСТВОРИМОГО ВНЕКЛЕТОЧНОГО ФРАГМЕНТА ЧЕЛОВЕЧЕСКОГО Dll4 И КОНСТАНТНОЙ ЧАСТИ ТЯЖЕЛОЙ ЦЕПИ ЧЕЛОВЕЧЕСКОГО IgG4 | |
| KR20220006013A (ko) | 보체 경로 억제제를 포함하는 융합단백질 및 이의 용도 | |
| USRE49477E1 (en) | Engineered antibody for inhibition of fibrosis | |
| US20220000980A1 (en) | Compositions and Methods for use of CXCL12 in Treatment of Bone Disorders | |
| JP2002529516A (ja) | ＣＤ６６ａを用いて新脈管形成に影響を及ぼす方法 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| 121 | Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application |
Ref document number: 21960763 Country of ref document: EP Kind code of ref document: A1 |
|
| WWE | Wipo information: entry into national phase |
Ref document number: 2021960763 Country of ref document: EP |
|
| NENP | Non-entry into the national phase |
Ref country code: DE |
|
| ENP | Entry into the national phase |
Ref document number: 2021960763 Country of ref document: EP Effective date: 20240513 |