KR101658247B1 - 모듈 인식 도메인을 통한 항체 표적화 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 항체가 특정 부위를 표적으로 하는데 사용되는 1 이상의 모듈 인식 도메인(MRD)을 포함하는 항체에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 질환을 치료하기 위해 상기 1 이상의 모듈 인식 도메인을 포함하는 항체의 용도, 및 1 이상의 모듈 인식 도메인을 포함하는 항체를 제조하는 방법에 관한 것이다.

Description

모듈 인식 도메인을 통한 항체 표적화{ANTIBODY TARGETING THROUGH A MODULAR RECOGNITION DOMAIN}
본 발명은 대체로 1 이상의 모듈 인식 도메인을 포함하는 항체, 특히 질환을 치료하기 위한 1 이상의 모듈 인식 도메인을 포함하는 항체의 용도, 및 1 이상의 모듈 인식 도메인을 포함하는 항체의 제조 방법에 관한 것이다.
촉매 활성 단일클론 항체(Ab)는 선택적인 프로드러그 활성화 및 화학적 변형을 위해 사용될 수 있다. 알돌라제 활성을 갖는 단일클론 Ab가 수많은 화학적 변형, 특히 알돌과 레트로-알돌 반응에 매우 효율적인 촉매로서 부상하였다. Ab, 예컨대 38C2 및 93F3의 레트로-알돌라제 활성은 연구자들로 하여금 레트로-알돌 반응에 의해 활성화되는 다양한 화학치료제의 프로드러그를 디자인, 합성, 및 평가하는 것을 가능하게 하였다. (38C2의 제작에 대해서는 WO 97/21803에 기술되어 있으며, 이 문헌을 참조하여 본원에 포함시킨다). 38C2는 지방족 도너와 알데히드 억셉터 간 알돌 부가 반응을 촉매하는 항체 조합 부위를 함유한다. 신경아세포종의 선천성 마우스 모델에서, 38C2의 종양내 주사 및 에토포시드 프로드러그의 전신 투여가 종양 성장을 억제하였다.
촉매성 Ab 사용의 단점 중 하나는 촉매성 Ab를 악성 세포에 표적화하기 위한 장치가 부족하다는 것이다. 이전 연구들은 항체-유도된 효소 프로드러그 치료법(ADEPT; antibody-directed enzyme prodrug therapy) 또는 항체-유도된 아브자임 프로드러그 치료법(ADAPT; antibody-directed abzyme prodrug therapy) 등에서, 표적화 항체와의 화학 접합 또는 재조합 융합을 통해 효소 또는 촉매성 항체를 종양 세포로 유도할 수 있다는 것을 증명하였다. 그러나, 보다 효율적인 대안은 항체 조합 부위 밖에 존재하는 표적화 펩티드에 융합된 촉매성 항체를 사용하여, 활성 부위를 프로드러그 활성화에 이용가능하도록 남겨두는 것이다. 예를 들어, 인테그린 ανβ3-결합 펩티드와 Ab 38C2의 융합체는 선택적으로 항체를 종양 및/또는 종양 혈관구조에 위치시키고 이 부위에서 프로드러그 활성화를 촉발시킬 수 있다. 이러한 접근법에 의한 가능한 치료법은 펩티드가 항체 Fc 영역과의 융합을 통해 생약으로 전환될 수 있다는 사전임상 및 III기 임상 데이타에 의해 뒷받침된다.
2 이상의 암 표적을 동시에 표적화하고, 하거나 프로드러그를 활성화하는 이중특이적 또는 다중특이적 항체의 개발은 암 및 다른 질환을 공격하기 위한 새롭고 유망한 해결법을 제공한다. 이러한 항체를 본원의 도 1에 예시하였다. 다수의 세포 증식/생존 경로를 하향 조절하기 위해 동시에 2종의 종양 관련 항원(예를 들어, 성장 인사 수용체들)을 표적화하는 이중특이적 항체(BsAb)에 대한 연구들이 이러한 접근법을 위한 증거들을 제공하고 있다. 전통적으로, 이중특이적 항체는 2종의 상이한 단일클론 항체를 화학적으로 연결시키거나 또는 2종의 하이브리도마 세포주를 융합시켜 하이브리드-하이브리도마를 생성시켜서 제조되어 왔다. 이중특이적, 4가 IgG-유사 분자, 또는 이중-가변성-도메인 면역글로불린은 2종의 단일클론 항체로부터 조작되어졌다. 이러한 이중-가변성-도메인 면역글로불린은 혈청에 존재하는 2 항원 모두에 결합할 수 있다. 그러나, 이러한 접근법은 제작, 수율 및 순도 면에서 어려움이 존재한다.
소형 BsAb 예컨대 디아바디, 미니바디 및 Fab-scFv 융합 단백질의 효율적인 제조를 위한 다양한 재조합법이 개발되어 있다. 이러한 BsAb 단편은 일정한 임상 용도, 예컨대 종양 방사성영상화 및 표적화 등을 위해 전체 길이 IgG-유사 분자에 비해 일부 장점을 갖는데, 이들의 보다 양호한 조직 침투성 및 순환계로부터의 빠른 제거율때문이다. 다른 한편으로, IgG-유사 BsAb는, 긴 혈청 반감기를 부여하고 부차적인 면역 기능, 예컨대 항체 의존적 세포내 세포독성 및 보체 매개 세포독성 등을 지원하는 Fc 도메인을 제공함으로써, 다른 생체 내 용도, 특히 종양학적 시도 등에서 소형 BsAb 단편보다 바람직한 것으로 증명되었다. 이들의 단편 대응물과 달리, 재조합 IgG-유사 BsAb의 조작 및 생산은 이들의 거대한 크기(∼150-200 kDa)와 구조적 복잡성으로 인해 다소 기술적인 어려움을 겪고 있다. 동물 모델에서 성공적인 적용으로 판단컨대, 이 분야에서의 성공은 매우 제한적이었다. 최근, 다양한 제작물을 검사하여, Fc 도메인을 포함하는 BsAb 분자를 포유동물 세포에서 효율적으로 발현시키는데 장족의 발전이 이루어졌다.
항체를 표적화하기 위해 사용된 다른 접근법은 펩티바디(petibody)를 사용하는 것이다. 광범위한 표적에 대해 고친화성 펩티드 리간드를 찾기위해 무작위 펩티드 라이브러리를 사용하는 연구의 성공으로, 이러한 펩티드와 항체 Fc 영역의 융합은 원자가 증가를 통해 활성 및 순환 반감기를 증가시켜서 펩티드를 치료 후보물로 만드는 수단을 제공한다.
다른 분자와 단백질의 상호작용은 생화학의 기초이다. 단백질 상호작용은 수용체-리간드 상호작용, 항체-항원 상호작용, 세포-세포 접촉 및 표적 조직과 병원체의 상호작용을 포함한다. 단백질 상호작용은 다른 단백질, 탄수화물, 올리고사카라이드, 지질, 금속 이온 및 기타 물질과의 접촉을 포함할 수 있다. 단백질 상호작용의 기본 단위는 접촉 및 인식에 관여하는 단백질 영역이고, 이를 결합 부위 또는 표적 부위라 한다.
파지 디스플레이 라이브러리에서 유도된 펩티드는 대체로 다른 분자와 연결시 이들의 결합 특징을 보유한다. 이러한 유형의 특이적 펩티드는, 몇몇 정해진 표적에 대해 결합 특이성을 갖는 단일 단백질이 생성되도록 조합시킬 수 있는 분자 인식 도메인(MRD) 또는 모듈 특이성 블록으로서 처리될 수 있다.
이러한 정해진 표적 부위의 예는 인테그린이다. 인테그린은 α 및 β 서브유닛으로 구성되고, 세포외 메트릭스 내 단백질에 세포 부착을 매개하는 경막 세포 부착 수용체 패밀리이다. 현재, 18 α 및 8β 서브유닛이 알려져 있고, 이들은 다양한 ECM 세포 부착 단백질에 대해 다양한 특이성을 갖는 24종의 상이한 αβ 이종이량체를 형성한다. 다양한 인테그린에 대한 리간드는 피브로넥틴, 콜라겐, 라미닌, 폰 빌레브란트 인자, 오스테오폰틴, 트롬보스폰딘, 및 비트로넥틴을 포함하고, 이들은 모두 ECM의 성분이다. 일부 인테그린은 또한 가용성 리간드 예컨대 피브리노겐, 또는 인접한 세포 상의 다른 부착 분자에 결합할 수 있다. 인테그린은 리간드에 대해 상이한 친화성을 나타내는 별개의 활성화 상태들로 존재하는 것으로 알려져 있다. 인테그린에 의한 가용성 리간드의 인식은 수용체 입체구조의 특이적인 변화에 엄격하게 의존적이다. 이는 인테그린 의존적 방식으로 응집하고 혈관구조의 동적 유동 조건 하에서 정지하는 세포의 능력을 제어하는 분자 스위치를 제공한다. 이러한 기전은 비활성화된 인테그린을 발현하는 한편 휴지 상태에서는 혈류를 순환하는 혈소판 및 백혈구에 대해 잘 확립되어 있다. 프로염증성 또는 프로혈전성 작동제를 통한 자극시, 이들 세포 유형은 "휴지"에서 "활성화" 입체구조로, 핵심 인테그린, 백혈구에 대한 β2 인테그린 및 혈소판에 대한 ανβ3 인테그린의 스위치를 포함하는 다수의 분자 변화에 신속하게 반응한다. 이는 이들 세포 유형이 혈관 구조 내에 정지될 수 있게 하여, 세포 부착을 촉진하고 혈전 형성을 일으킨다.
인간 유방암 세포의 전이성 서브세트는 항구적 활성화 형태의 인테그린 ανβ3을 발현하는 것으로 확인되었다. 이러한 ανβ3의 비정상적 발현은 유방암을 비롯하여 전립선암, 흑색종 및 신경아세포 종양의 전이에서 중요한 역할을 한다. 활성화된 수용체는 강력하게 암세포 이동을 촉진시켜서 이들 세포가 혈행 상태에 정지되도록 할 수 있다. 이러한 방식으로, ανβ3의 활성화는 표적 장기로의 성공적인 전파 및 콜로니화에 결정적일 수 있는 핵심 특성을 전이성 세포에 부여한다. 표적 장기에 성공적으로 진입한 종양 세포는, ανβ3 매트릭스 상호작용이 세포 생존과 증식을 촉진하기 때문에, ανβ3을 더욱 활용하여 새로운 환경에서 성장할 수 있다. 예를 들어, 오스테오폰틴과 ανβ3의 결합은 악성도를 촉진하며, 오스테오폰틴 수준의 상승은 유방암의 좋지 않은 예후와 관련이 있다.
이러한 이유들과, 혈관형성에서 확립된 역할들 때문에, ανβ3 인테그린은 가장 광범위하게 연구되는 인테그린 중 하나이다. 이 분자의 길항제는 표적화된 약물 전달에 사용하기에 상당한 잠재력을 지닌다. ανβ3 인테그린을 표적화하는데 사용된 접근법 중 하나는 Arg-Gly-Asp(RGD) 서열을 포함하는 펩티드의 ανβ3에 대한 높은 결합 특이성을 이용한다. 세포외 매트릭스 단백질에 천연적으로 존재하는 이러한 트리펩티드는 ανβ3 인테그린의 주요 결합 부위이다. 그러나, RGD 기반 리포터 프로브는 빠른 혈액 제거율, 높은 신장 및 간 흡수율, 및 빠른 종양 세척율로 인해 문제가 있다. 고리화 RGD 펩티드의 화학적 변형은 이들의 안정성과 원자가를 증가시키는 것으로 확인되었다. 이러한 변형된 펩티드들을 이후 방사성동위원소와 커플링시키고 종양 영상화를 위해서 또는 종양 성장을 억제하는데 사용한다.
인테그린 ανβ3은 가장 특징규명이 잘되어진 인테그린 이종이량체 중 하나이고, 종양 유도된 혈관생성에 연루된 몇몇 이종이량체 중 하나이다. 성숙한 혈관에서 드물게 발현되지만, ανβ3은 생체 내 혈관생성 동안 상당히 상향 조절된다. ανβ3의 발현은 유방과 자궁경부암을 비롯하여 악성 흑색종에서 질환의 공격성과 관련있다. 최근 연구들은 ανβ3이 일부 종양에 대한 진단 또는 예후 지표로서 유용할 수 있음을 시사한다. 인테그린 ανβ3은 이의 비교적 제한된 세포 분포도로 인해 치료 표적으로서 특히 매력적이다. ανβ3은 대체로 상피 세포 상에서는 발현되지 않고, 다른 세포 유형에서는 최소로 발현된다. 또한, 환형 RGD 펩티드 및 단일클론 항체를 포함하여, ανβ3 길항제는 병아리 장뇨막 상에서 사이토카인 유도된 혈관생성 및 고형 종양의 성장을 유의하게 억제하였다.
다른 인테그린 이종이량체, ανβ5는 악성 종양 세포 상에서 보다 광범위하게 발현되고, VEGE-매개된 혈관생성에 관여하는 듯 하다. ανβ3 및 ανβ5는 다른 경로, 즉 ανβ3은 bFGF와 TNF-α를 통해서, ανβ5는 VEGE와 TGF-α를 통해서 혈관생성을 촉진하는 것으로 확인되었다. 또한, Src 키나제의 억제는 VEGF-유도된 혈관생성을 차단하였지만, FGF2-유도된 혈관생성은 차단하지 않은 것으로 확인되었다. 이러한 결과는 FGF2 및 BEGF가 각각 ανβ3 및 ανβ5을 필요로 하는 상이한 혈관생성 경로를 활성화한다는 것을 강하게 암시한다.
인테그린은 또한 종양 전이에 연관된다. 전이는 암의 이환상태 및 사망의 주요 원인이다. 흑색종, 신경교종, 난소 및 유방암의 악성 진행은 모두 인테그린 ανβ3의 발현, 그리고 일부 경우에는 ανβ5의 발현과 강력하게 연관되어 있다. 보다 최근에는, 인테그린 ανβ3이 인간 유방암의 전이에서 상당히 중요한 역할을 수행한다는 것이 확인되었다. ανβ3의 발현과 유방암 전이 사이의 매우 강력한 관련성은 정상 유방 상피가 ανβ3 음성이고 유방암의 거의 모든 골전이 및 대략 50%의 침윤성 소엽암종이 ανβ3을 발현한다는 점에서 주목된다. 환형 펩티드로 ανβ3을 길항한 결과 유방암 이종이식을 포함하는 연구에서 방사성면역치료와의 상승효과가 확인되었다.
현존하는 혈관으로부터 새로운 혈관이 생성되는 과정인, 혈관생성은 생리적 과정 및 병리학적 과정에 필수적이다. 정상적으로, 혈관생성은 프로혈관생성 인자 및 항혈관생성 인자에 의해 단단히 조절되지만, 질환 예컨대 암, 눈 신경혈관 질환, 관절염 및 건선 등의 경우, 이 과정은 빗나갈 수 있다. 질환과 혈관생성의 관련은 항혈관생성 화합물의 발견을 흥미롭게 만들었다. 지금까지 기술된 가장 유망한 파지 유래된 항혈관생성 펩티드는, Amgen에서 개발한 것으로, 혈관생성 사이토카인 Ang2를 중화시킨다.
VEGF 및 이의 수용체가 혈관생성 분야에서 가장 광범위하게 표적화되는 분자 중 하나지만, 보다 최근에 개발된 안지오포이어틴-Tie2 경로를 표적화하려는 전임상 노력이 진행중이다. 양쪽 단백질 패밀리가 리간드 수용체 상호작용에 관여하며, 둘 모두는 그 기능이 생후에 내피 세포 및 일부 조혈 줄기 세포 계통에 주로 국한되는 구성원을 포함한다. Tie-2는 4종의 공지된 리간드, 안지오포이어틴-1(Ang1) 내지 안지오포이어틴-4(Ang4)를 갖는 수용체 티로신 키나제이고, 이들 리간드 중 Ang1 및 Ang2가 최고로 연구중에 있다. Ang1은 Tie2의 인산화를 자극하고 Ang2와 Tie2의 상호작용은 Ti2 수용체 인산화를 길항하고 또한 작동시키는 것으로 알려져 있다. 정상 및 병리적 생후 혈관생성 부위에서 Ang2의 발현 상승은 정황상 Ang2에 대한 프로혈관생성 역할과 연관있다. 혈관생성과 연관된 혈관 선택적 Ang2 유도가 암을 비롯한 질환들에서 확인되었다. 결장 암종이 있는 환자에서, Ang2는 종양 상피에 편재적으로 발현되는 반면, 종양 상피에서 Ang1의 발현은 드문 것으로 나타났다. Ang2 활성의 최종적 증가는 종양 혈관생성에 대한 개시 인자인 것으로 제안되었다.
세포 수용체에 대해 유도되는 다른 융합 단백질들이 임상 평가 중이다. Genentech에서 개발된 헤르셉틴(트라스투주맙)은 인간 상피 티로신 키나제 수용체 2(HER2 또는 ErbB2)의 세포외 도메인에 대해 유도된 재조합 인간화 단일클론 항체이다. HER2 유전자는 침윤성 유방 암의 25%에서 과발현되고, 좋지 않은 예후 및 화학치료제에 대한 감응성 변경과 연관이 있다. 헤르셉틴은 ErbB2-과발현되는 유방암의 증식을 차단하며, 현재 ErbB2 과발현되는 전이성 유방암(MBC)의 치료를 위해 FDA에서 승인된 유일한 ErbB2 표적화된 항체 치료제이다. 정상 성인 세포에서, 소수의 ErbB2 분자가 세포 표면에 세포 당 ∼20,000 정도로 존재하며, 그에 따라 소수의 이종이량체가 형성되고 성장 신호는 비교적 약하고 제어가능하다. ErbB2가 세포 당 ∼500,000 정도로 과발현되는 경우, 다수의 ErbB2 이종이량체가 형성되고 세포 신호전달이 보다 강력해져서, 성장 인자 및 악성 성장에 대한 반응성이 증가된다. 이는 왜 ErbB2 과발현이 유방 종양에서 좋지 않은 예후의 지표가 되고, 치료 반응을 예측할 수 있는지 설명해 주는 것이다.
ErbB2는 원발성 종양 및 전이성 부위 둘 모두에서 발견되는 경우, 유방암에 대한 유망하고 타당한 표적이다. 헤르셉틴은 세포 표면으로부터 ErbB2의 신속한 제거를 유도하여, ErbB2가 이종이량체화되어 성장을 촉진할 수 있는 이의 이용성을 감소시킨다. 시험관 내 및 생체 내 실험 모델에서 관찰된 헤르셉틴의 작용 기전은 ErbB2 세포외 도메인의 단백질가수분해의 억제, 하류 신호전달 경로 예컨대 포스파티딜이노시톨 3-키나제(PI3K) 및 미토겐-활성화된 단백질 키나제(MAPK) 캐스캐이드의 파괴, GI 세포 주기 정지, DNA 복구의 억제, 혈관생성의 억제, 및 항체 의존적 세포의 세포독성(ADCC)의 유도를 포함한다. 그러나, 초기에 헤르셉틴에 반응했던 전이성 유방암 환자의 대부분이 치료 개시 1년 이내에 질병이 진행되는 것으로 확인되었다.
다른 표적 세포 수용체는 제1형 인슐린 유사 성장 인자-1 수용체(IGF-1R)이고, IGF-1R은 세포 생존 및 증식을 신호전달하는데서 핵심적인 역할을 수행하는 수용체-티로신 키나제이다. IGF 시스템은 IGF-I 또는 IGF-II 및/또는 IGF-1R 과발현이 관여하는 자가분비 루프의 확립에 의해 암세포에서 빈번하게 탈조절된다. 또한, 전염병학 연구는 주요 인간 암, 예컨대 유방, 결장, 폐 및 전립선 암의 발병과 IGF 수준 상승 간에 연관성을 시사하였다. IGF 및 이들의 동족 수용체의 발현은 질환기, 생존 감소, 전이 진행 및 종양 탈분화와 상호관련되어 있다.
IGF-1R 이외에도, 상피 성장 인자 수용체(EGFR)가 또한 수많은 암의 종양발생에 연루되어 있다. 효과적인 종양 억제는 어느 쪽이든지 수용체 활성을 길항하는 다수의 전략을 사용하여 실험적으로 또한 임상적으로 둘 모두를 통해 달성되었다. 종양 세포에서 성장 신호전달 경로의 중복으로 인해, 한 수용체 기능(예를 들어, EGFR)의 억제는 다른 성장 인자 수용체(예를 들어, IGF-1R)-매개된 경로의 상향 조절에 의해 효과적으로 상쇄될 수 있다. 예를 들어, 최근 연구는 동등한 EGFR을 발현하는 악성 신경교종 세포주들이 그들의 IGF-1R을 활성화하는 능력 및 그 하류 신호전달 경로에 따라서 EGFR 억제에 대해 유의하게 상이한 감응성을 갖는다는 것을 보여주었다. 다른 연구는 또한 종양 세포에서 IGF-1R의 과발현 및/또는 활성화가 화학치료제, 방사선, 또는 항체 치료제 예컨대 헤르셉틴에 대한 그들 내성의 원인이 된다는 것을 증명하였다. 결론적으로, IGF-1R 신호전달을 억제한 결과, 헤르셉틴에 대한 종양 세포의 감응성이 증가된다는 것이다.
EGFR는 많은 정상 조직을 비롯하여 대다수 장기의 신생물성 병변에서 발현되는 수용체 티로신 키나제이다. EGFR의 과발현 또는 EGFR 돌연변이체의 발현이 많은 종양, 특히 상피 종양에서 관찰되었고, 좋지 않은 임상 예후와 연관이 있었다. 이 수용체를 통한 신호전달 억제는 항종양 효과를 유도하였다. 얼비툭스(Erbitux)라고도 알려진 세툭시맙(마우스/인간 키메라 항체)이 2004년 2월 FDA에 의해 승인된 이래로, EGFR는 전이성 직결장암 치료를 위한 승인된 항체 약물 표적이 되었다. 2006년 3월, 얼비툭스는 또한 두경부의 편평 세포 암종(SCCHN) 치료제로서 FDA의 승인을 받았다. 보다 최근에, EGFR에 대해 유도된 전체 인간 항체인 벡티빅스가 전이성 직결장 암에 대해 승인되었다. 어떠한 약물도 직결장 암의 독립 제제가 아니며, 이들은 현행 직결장 치료계획에 대한 부가 제제로서 승인된 것이다. 직결장 암에서, 얼비툭스는 다른 약물 이리노테칸과 조합되어 제공되고, 벡티빅스는 질환 진행 이후 플루오로피리미딘-, 옥살리플라틴- 및 이리노테칸-함유 화학치료 계획 중에, 또는 그 이후에 투여된다. 얼비툭스는 이전 백금 기반 화학치료제가 실패한 경우에서만 재발성 또는 전이성 SCCHN의 단일 제제로서 승인되었다. 비소세포 폐암종을 표적화하기 위해 이들 약물을 사용하는 진보된 임상 시도가 진행중이다. 얼비툭스 또는 EGFR 항체의 서열은 당분야에 공지되어 있고, 이를 참조하여 본원에 포함시킨다(예를 들어, 문헌 [Goldstein, et al., Clin.Cancer Res. 1:1311, 1995]; U.S. 특허 제6,217,866호 참조).
암치료에서 선택적 프로드러그 활성화에 촉매성 항체를 사용시 장애물은 전신 종양 표적화이다. 본 발명은 촉매성 항체의 프로드러그 활성화 능력을 유지하면서 종양 세포 또는 가용성 분자를 효율적으로 표적화하는 전체 길이 항체에 융합된, 모듈 인식 도메인(MRD), 또는 표적 결합 펩티드의 개조를 기초로 하는 접근법을 기술한다. 항체의 전통적인 결합 부위에 대한 결합성을 유의하게 감소시키지 않도록 MRD를 항체에 융합시켰기 때문에, MRD 부가 이후에도 항체의 특이성은 온전하게 유지된다.
도 2를 참조하면, 삼각형, 원형 및 사각형으로 설계된, MRD를 통상적인 항체의 중쇄 또는 경쇄 말단 중 임의의 말단에 부가할 수 있다. 제1 도식은 Fc의 C 말단에 융합된 펩티드를 갖는 단순한 펩티도바디를 나타낸 것이다. 이러한 접근법은 이중-, 삼중-, 사중- 및 오중-특이적 항체의 제조를 이해 제공되었다. IgG의 각 N 말단 및 C 말단에 단일 MRD의 디스플레이는 MRD의 8가 디스플레이를 제공한다. 항체 가변 도메인의 조합을 통해 이중 및 다중기능성 항체의 제작을 위한 대안법으로서, 파지 디스플레이로부터 선택하거나 또는 천연 리간드에서 유래된 고친화성 펩티드는 전형적인 항체의 결합 및 반감기 장점 둘 모두를 보유하는 다중기능성 항체를 제적하기 위한 고도로 다재다능한 모듈 접근법을 제공할 수 있다. MRD는 또한 비촉매성 항체의 결합 능력을 확장시킬 수 있어서, 특히 치료 목적을 위해, 항체의 결합 기능성을 확대시키기 위한 효율적인 접근법을 제공할 수 있다.
본 발명은 모듈 인식 도메인(MRD)을 포함하는 전체 길이 항체에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 MRD를 포함하는 이러한 항체의 변이체 및 유도체에 관한 것이다.
일 측면에서, 항체 및 MRD는 링커 펩티드를 통해 작동적으로 연결된다. 일 측면에서, 링커 펩티드는 2∼20 펩티드 길이, 또는 4∼10, 또는 약 4∼15 펩티드 길이이다. 본 발명의 일 측면에서, 링커 펩티드는 서열 GGGS(서열 번호 1), 서열 SSGGGGSGGGGGGSS(서열 번호 2), 또는 서열 SSGGGGSGGGGGGSSRSS(서열 번호 19)을 포함한다. 서열 번호 1에 나타낸 바와 같은 코어 서열 GGGS을 포함하는 다른 링커가 포함되며, 여기서 링커 펩티드는 약 4∼20 아미노산이다.
본 발명의 다른 구체예에 따라, MRD는 항체 중쇄의 C 말단부에 작동적으로 연결된다. 다른 측면에서, MRD는 항체 중쇄의 N 말단부에 작동적으로 연결된다. 또 다른 측면에서, MRD는 항체 경쇄의 C 말단부에 작동적으로 연결된다. 다른 측면에서, MRD는 항체 경쇄의 N 말단부에 작동적으로 연결된다. 다른 측면에서, 2 이상의 MRD가 항체의 임의의 말단부에 작동적으로 연결된다. 다른 측면에서 2 이상의 MRD가 항체의 2 이상의 말단부에 작동적으로 연결된다.
본 발명의 일 측면에서, MRD의 표적은 세포의 항원이다. 본 발명의 일 구체예에서, MRD의 표적은 CD20이다.
본 발명의 일 구체예에서, MRD의 표적은 인테그린이다. 일 측면에서, 인테그린 표적화 MRD의 펩티드 서열은 YCRGDCT(서열 번호 3)이다. 다른 측면에서, 인테그린 표적화 MRD의 펩티드 서열은 PCRGDCL(서열 번호 4)이다. 또 다른 측면에서, 인테그린 표적화 MRD의 펩티드 서열은 TCRGDCY(서열 번호 5)이다. 다른 측면에서, 인테그린 표적화 MRD의 펩티드 서열은 LCRGDCF(서열 번호 6)이다.
본 발명의 일 구체예에서, MRD의 표적은 혈관생성 사이토카인이다. 일 측면에서, 혈관생성 사이토카인 표적화 MRD의 펩티드 서열은 MGAQTNFMPMDDLEQRLYEQFILQQGLE(서열 번호 7)이다. 다른 측면에서, 혈관생성 사이토카인 표적화 MRD의 펩티드 서열은 MGAQTNFMPMDNDELLLYEQFILQQGLE(서열 번호 8)이다. 다른 측면에서, 혈관생성 사이토카인 표적화 MRD의 펩티드 서열은 MGAQTNFMPMDATETRLYEQFILQQGLE(서열 번호 9)이다. 다른 측면에서, 혈관생성 사이토카인 표적화 MRD의 펩티드 서열은 AQQEECEWDPWTCEHMGSGSATGGSGSTASSGSGSATHQEECEWDPWTCEHMLE(서열 번호 10)이다. 다른 측면에서, 혈관생성 사이토카인 표적화 MRD의 펩티드 서열은 MGAQTNFMPMDNDELLNYEQFILQQGLE(서열 번호 11)이다. 다른 측면에서, 혈관생성 사이토카인 표적화 MRD의 펩티드 서열은 PXDNDXLLNY(서열 번호 12)이고, 여기서 X는 20종 천연 발생 아미노산 중 하나이다. 다른 구체예에서, 표적화 MRD 펩티드는 코어 서열 MGAQTNFMPMDXn(서열 번호 56)을 가지며, 여기서 X는 임의의 아미노산이고 n은 약 0∼15이다.
다른 구체예에서, 표적화 MRD 펩티드는 하기 서열에서 선택된 코어 서열을 포함한다:
XnEFAPWTXn(여기서, n은 약 0∼50 아미노산 잔기임)(서열 번호 22);
XnELAPWTXn(여기서, n은 약 0∼50 아미노산 잔기임)(서열 번호 25);
XnEFSPWTXn(여기서, n은 약 0∼50 아미노산 잔기임)(서열 번호 28);
XnELEPWTXn(여기서, n은 약 0∼50 아미노산 잔기임)(서열 번호 31); 및
Xn AQQEECEX1X2PWTCEHMXn(여기서, n은 약 0∼50 아미노산 잔기이고, X, X1 및 X2는 임의의 아미노산임)(서열 번호 57).
이러한 코어 펩티드를 포함하는 예시적인 펩티드는 예를 들어, 하기 펩티드들을 포함한다:
AQQEECEFAPWTCEHM (서열 번호 21);
AQQEECEFAPWTCEHMGSGSATGGSGSTASSGSGSATHQEECEFAPWTCEHMLE (서열 번호 23);
AQQEECELAPWTCEHM (서열 번호 24);
AQQEECELAPWTCEHMGSGSATGGSGSTASSGSGSATHQEECELAPWTCEHMLE (서열 번호 26);
AQQEECEFSPWTCEHM (서열 번호 27);
AQQEECEFSPWTCEHMGSGSATGGSGSTASSGSGSATHQEECEFSPWTCEHMLE 2xConFS (서열 번호 29);
AQQEECELEPWTCEHM (서열 번호 30);
AQQEECELEPWTCEHMGSGSATGGSGSTASSGSGSATHQEECELEPWTCEHMLE (서열 번호 32);
AQQEECEFAPWTCEHMGSGSATGGSGSTASSGSGSATHQEECELAPWTCEHMLE (서열 번호 33);
AQQEECEFAPWTCEHMGSGSATGGSGSTASSGSGSATHQEECEFSPWTCEHMLE (서열 번호 34); 및
AQQEECEWDPWTCEHMGSGSATGGSGSTASSGSGSATHQEECEWDPWTCEHMLE (서열 번호 10).
본 발명의 일 구체예에서, MRD의 표적은 ErbB2이다. 본 발명의 일 구체예에서, MRD의 표적은 ErbB3이다. 본 발명의 일 구체예에서, MRD의 표적은 종양 관련 표면 항원 상피 세포 부착 분자(Ep-CAM)이다.
본 발명의 일 구체예에서, MRD의 표적은 VEGF이다. 일 측면에서, VEGF 표적화 MRD의 펩티드 서열은 VEPNCDIHVMWEWECFERL(서열 번호 13)이다.
본 발명의 일 구체예에서, MRD의 표적은 인슐린 유사 성장 인자-I 수용체이다. 일 측면에서, 인슐린 유사 성장 인자-I 수용체 표적화 MRD의 펩티드 서열은 SFYSCLESLVNGPAEKSRGQWDGCRKK(서열 번호 14)이다. 다른 예시적인 IGF-1R 표적화 MRD는 예를 들어, 하기 서열식의 펩티드를 포함한다: NFYQCIX1X2LX3X4X5PAEKSRGQWQECRTGG(서열 번호 58), 여기서 X1은 E 또는 D이고; X2는 임의의 아미노산이고; X3은 임의의 아미노산이며; X4는 임의의 아미노산이고 X5는 임의의 아미노산이다.
상기 식을 포함하는 예시적인 펩티드는 하기 펩티드들을 포함한다:
NFYQCIEMLASHPAEKSRGQWQECRTGG (서열 번호 35);
NFYQCIEQLALRPAEKSRGQWQECRTGG (서열 번호 36);
NFYQCIDLLMAYPAEKSRGQWQECRTGG (서열 번호 37);
NFYQCIERLVTGPAEKSRGQWQECRTGG (서열 번호 38);
NFYQCIEYLAMKPAEKSRGQWQECRTGG (서열 번호 39);
NFYQCIEALQSRPAEKSRGQWQECRTGG (서열 번호 40);
NFYQCIEALSRSPAEKSRGQWQECRTGG (서열 번호 41);
NFYQCIEHLSGSPAEKSRGQWQECRTG (서열 번호 42);
NFYQCIESLAGGPAEKSRGQWQECRTG (서열 번호 43);
NFYQCIEALVGVPAEKSRGQWQECRTG (서열 번호 44);
NFYQCIEMLSLPPAEKSRGQWQECRTG (서열 번호 45);
NFYQCIEVFWGRPAEKSRGQWQECRTG (서열 번호 46);
NFYQCIEQLSSGPAEKSRGQWQECRTG (서열 번호 47);
NFYQCIELLSARPAEKSRGQWAECRAG (서열 번호 48); 및
NFYQCIEALARTPAEKSRGQWVECRAP (서열 번호 49).
본 발명의 일 구체예에서, MRD의 표적은 종양 항원이다.
본 발명의 일 구체예에서, MRD의 표적은 상피 성장 인자 수용체(EGFR)이다.본 발명의 일 구체예에서, MRD의 표적은 혈관생성 인자이다. 본 발명의 일 구체예에서, MRD의 표적은 혈관생성 수용체이다.
본 발명의 일 구체예에서, MRD는 혈관 귀소(homing) 펩티드이다. 일 측면에서, 혈관 귀소 펩티드의 펩티드 서열은 ACDCRGDCFCG(서열 번호 15)이다.
본 발명의 일 구체예에서, MRD의 표적은 신경 성장 인자이다. 본 발명의 일 측면에서, 항체는 세포 표면 항원에 결합한다.
본 발명의 일 구체예에서, 항체 또는 MRD는 EGFR, ErbB2, ErbB3, ErbB4, CD20, 인슐린 유사 성장 인자-I 수용체, 또는 전립선 특이적 막 항원에 결합한다. 일 측면에서, EGFR 표적화 MRD의 펩티드 서열은 하기 서열이다: VDNKFNKELEKAYNEIRNLPNLNGWQMTAFIASLVDDPSQSANLLAEAKKLNDAQAPK(서열 번호 16). 일 측면에서, EGFR 표적화 MRD의 펩티드 서열은 하기 서열이다: VDNKFNKEMWIAWEEIRNLPNLNGWQMTAFIASLVDDPSQSANLLAEAKKLNDAQAPK(서열 번호 17). 본 발명의 일 측면에서, ErbB2 표적화 MRD의 펩티드 서열은 하기 서열이다: VDNKFNKEMRNAYWEIALLPNLNNQQKRAFIRSLYDDPSQSANLLAEAKKLNDAQAPK(서열 번호 18).
본 발명의 일 구체예에서, 항체는 혈관생성 인자에 결합한다.
본 발명의 일 구체예에서, 항체는 혈관생성 수용체에 결합한다.
본 발명은 또한, 항체의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 단리된 폴리뉴클레오티드에 관한 것이다. 본 발명의 일 측면에서, 벡터는 상기 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 또 다른 측면에서, 상기 폴리뉴클레오티드는 이 폴리뉴클레오티드에 대한 발현을 제어하는 조절 서열에 작동적으로 연결된다. 일 측면에서, 숙주 세포는 상기 폴리뉴클레오티드 또는 이의 자손을 포함한다.
본 발명은 또한 질환 치료를 필요로 하는 개체에서 질환을 치료하는 방법을 제공하고, 이 방법은 MRD를 포함하는 항체를 투여하는 것을 포함한다. 일 측면에서, 질환은 암이다. 다른 측면에서, 원하지 않는 혈관생성을 억제한다. 또 다른 측면에서는, 혈관생성을 조정한다. 또 다른 측면에서, 종양 성장을 억제한다. 다른 구체예에서는, MRD를 포함하는 항체를 추가 치료제와 함께 투여하는 것을 포함하는 치료 방법을 기술한다.
본 발명은 또한, MRD를 포함하는 전체 길이 항체를 제조하는 방법에 관한 것이다. 일 측면에서, MRD는 파지 디스플레이 라이브러리로부터 유도된다. 다른 측면에서, MRD는 천연 리간드로부터 유도된다.
본 발명의 일 구체예에서, 항체는 키메라 또는 인간화된 항체이다.
도 1은 4가 IgG-유사 BsAb의 다양한 디자인의 대표예를 개략적으로 나타낸 도면이다.
도 2a는 Fc와 C 말단 융합된 전형적인 펩티바디를 도시한 것이다.
도 2b는 항체의 경쇄와 C 말단 MRD 융합된 항체를 도시한 것이다.
도 2c는 항체의 경쇄와 N 말단 MRD 융합된 항체를 도시한 것이다.
도 2d는 항체의 각 말단에 융합된 고유한 MRD 펩티드를 갖는 항체를 도시한 것이다.
도 3은 ang2 표적화 MRD에 융합된 항인테그린 항체가 인테그린 및 Ang2에 결합된 ELISA 결과이다.
도 4는 인테그린 및 Ang2가 ang2 표적화 MRD에 융합된 항인테그린 항체에 결합된 ELISA 결과이다.
도 5는 ELISA 결과로서 여기서는 항-ErbB2 항체가 Ang2를 표적화하는 MRD에 융합되어 있다.
도 6은 Ang2 표적화 MRD가 간세포 성장 인자 수용체 결합 항체에 융합된 것의 ELISA 결과이다.
도 7은 인테그린 표적화 MRD가 ErbB2 결합 항체에 융합된 것의 ELISA 결과이다.
도 8은 인테그린 표적화 MRD가 간세포 성장 인자 수용체 결합 항체에 융합된 것의 ELISA 결과이다.
도 9는 인슐린 유사 성장 인자-I 수용체 표적화 MRD가 ErbB2 결합 항체에 융합된 것의 ELISA 결과이다.
도 10은 VEGF-표적화 MRD가 ErbB2 결합 항체에 융합된 것의 ELISA 결과이다.
도 11은 인테그린 표적화 MRD가 촉매성 항체에 융합된 것의 ELISA 결과이다.
도 12는 Ang2-표적화 MRD가 촉매성 항체에 융합된 것의 ELISA 결과이다.
도 13은 인테그린 및 Ang2 표적화 MRD가 ErbB2 결합 항체에 융합된 것의 ELISA 결과이다.
도 14는 인테그린 표적화 MRD가 ErbB2 결합 항체에 융합된 것의 ELISA 결과이다.
도 15는 인테그린, Ang-2, 또는 인슐린 유사 성장 인자-I 수용체-표적화 MRD가 짧은 링커 펩티드를 사용하여 ErbB2 또는 간세포 성장 인자 수용체-결합 항체에 융합된 것의 ELISA 결과이다.
도 16은 인테그린, Ang-2, 또는 인슐린 유사 성장 인자-I 수용체-표적화 MRD가 긴 링커 펩티드를 사용하여 ErbB2 또는 간세포 성장 인자 수용체-결합 항체에 융합된 것의 ELISA 결과이다.
본원에서 사용하는 용어 "항체"는 온전한 면역글로불린 분자를 의미하며, 다클론 및 단일클론 항체, 키메라, 단쇄 및 인간화 항체를 포함한다. 온전한 항체는 이황화 결합에 의해 서로 연결되는 적어도 2 중쇄(H) 및 2 경쇄(L)를 포함한다. 각 중쇄는 중쇄 가변 영역(축약하여 VH라함) 및 중쇄 불변 영역을 포함한다. 중쇄 불변 영역은 3 도메인, CH1, CH2 및 CH3을 포함한다. 각각의 경쇄는 경쇄 가변 영역(축약하여 VL이라함) 및 경쇄 불변 영역을 포함한다. 경쇄 불변 영역은 하나의 도메인, CL을 포함한다. VH 및 VL 영역은 보다 보전되고, 프레임워크 영역(FR)이라고 하는 영역이 산재되어 있으며, 상보성 결정 영역(CDR)이라 하는, 초가변성 영역으로 더욱 세분화될 수 있다. 각각의 VH 및 VL은 3 CDR 및 4 FR를 포함하는데, 하기 순서로 아미노 말단에서 카르복실 말단으로 배열된다: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4. 중쇄 및 경쇄의 가변 영역은 항원과 상호작용하는 결합 도메인을 포함한다.
본원에서 사용되는 "이중 특이적 항체"는 이중-가변성-도메인 면역글로불린을 포함하는 면역글로불린 분자를 의미하고, 여기서 이중-가변성-도메인은 임의의 2 단일클론 항체로부터 조작할 수 있다.
"항체 조합 부위"는 항원에 특이적으로 결합하는(면역반응하는) 중쇄 및 경쇄 가변 및 초가변 영역으로 구성된 항체 분자의 구조 부분을 의미한다. 다양한 형태로 용어 "면역반응하다"는 항원성 결정부-함유 분자 및 항체 조합 부위를 포함하는 분자 예컨대 전체 항체 분자 또는 이의 일부 간에 특이적 결합을 의미한다.
용어 "펩티바디(piptibody)"는 완전하고, 온전한 항체 보다 적게 포함하는 펩티드 또는 폴리펩티드를 의미한다.
생물학적 물질 예컨대 핵산 분자, 폴리펩티드, 숙주 세포 등과 관련되어 사용되는 용어 "천연 발생"은 자연계에서 발견되고 인간에 의해 변형되지 않은 것을 의미한다.
"단일클론 항체"는 특정 에피토프와 면역반응할 수 있는 단지 한 종의 항체 조합 부위를 포함하는 항체 분자의 개체군을 의미한다. 따라서 단일클론 항체는 대체로 이것이 면역반응하는 임의의 에피토프에 대해 단일한 결합 친화성을 나타낸다. 그러므로, 단일클론 항체는 각각 상이한 에피토프에 대해 면역특이성인, 다수의 항체 조합 부위를 갖는 항체 분자, 예를 들어 이중특이성 단일클론 항체를 포함할 수 있다.
"모듈 인식 도메인(MRD; modular recognition domain)" 또는 "표적 결합 펩티드"는 표적 분자에 특이적으로(비무작위적으로) 결합할 수 있는, 분자 예컨대 단백질, 당단백질 등이다. MRD 부위의 아미노산 서열은 어느정도로 가변성이 허용되고 여전히 표적 분자에 대한 결합능을 유지할 수 있다. 또한, 이 서열 내 변화는 사전선택된 표적 분자와 결합 부위 간 결합 불변성 및 결합 특이성에 변화를 일으킬 수 있다.
"세포 표면 수용체"는 신호를 받아서 이 신호를 세포의 원형질막을 통해 전달할 수 있는 분자 및 분자 복합체를 의미한다. 본 발명의 세포 표면 수용체의 예는 활성화된 인테그린 수용체, 예를 들어, 전이성 세포 상에서 활성화된 ανβ3 인테그린 수용체이다.
"표적 결합 부위" 또는 "표적 부위"는 임의의 공지되었으나, 아직 기술되지 않은, 사전선택된 제제에 선택적으로 결합하는 능력을 갖는 아미노산 서열이다. 예시적인 기존 표적 부위는 RGD-의존적 인테그린 리간드, 즉 피브로넥틴, 피브리노겐, 비트로넥틴, 폰 빌레브란트 인자 등에서 유래되거나, 또는 세포 수용체 예컨대 VEGF, ErbB2, 혈관 귀소 펩티드 또는 혈관생성 사이토카인에서, 또는 단백질 호르몬 수용체 예컨대 인슐린 유사 성장 인자-I 수용체, 상피 성장 인자 수용체 등에서, 및 종양 항원에서 유래된다.
용어 "단백질"은 펩티드 결합을 통해 연결된 아미노산에서 유도된 단위를 포함하는 생물학적 중합체로 정의되며, 단백질은 2 이상의 사슬로 구성될 수 있다.
"융합 폴리펩티드"는 2 이상의 폴리펩티드, 및 경우에 따라 하나 연속적인 폴리펩티드에 2 폴리펩티드를 작동적으로 연결하는 연결 서열을 포함하는 폴리펩티드이다. 융합 폴리펩티드에서 연결된 2 폴리펩티드는 대체로 2종의 독립적인 공급원에서 유래하게 되며, 그에 따라 융합 폴리펩티드는 자연계에서는 정상적으로는 연결되어 발견되지 않는 연결된 2 폴리펩티드를 포함한다.
용어 "링커"는 항체와 MRD 사이에 존재하는 펩티드이다. 링커는 약 2∼20 아미노산, 일반적으로 4∼15 아미노산을 가질 수 있다.
"표적 세포"는 본 발명의 MRD를 포함하는 항체에 의해 표적이 될 수 있는 피험체(예를 들어, 인간 또는 동물) 내 임의의 세포를 의미한다. 표적 세포는 표적 결합 부위, 예컨대 활성화된 인테그린 수용체를 발현하거나 또는 과발현하는 세포일 수 있다.
"환자", "피험체", "동물" 또는 "포유동물"은 상호교환적으로 사용되며 포유동물 예컨대 인간 환자 및 인간 이외의 영장류를 비롯하여 실험 동물 예컨대 토끼, 래트 및 마우스, 및 기타 다른 동물을 의미한다. 동물은 모든 척추동물 예를 들어 포유동물 및 비포유동물 예컨대 양, 개, 소, 닭, 양서류 및 파충류를 포함한다.
"치료하는" 또는 "치료"는 증상, 합병증, 또는 질환의 생화학적 징후를 예방 또는 지연시키거나, 증상을 완화시키거나, 또는 질환 병태 또는 질병의 추가 발병을 저지 또는 억제하기 위해 본 발명의 MRD를 포함하는 항체를 투여하는 것을 포함한다. 치료는 예방적(질환의 개시를 예방 또는 지연하거나, 또는 임상적 또는 준임상적 증상의 발현을 억제하기 위함)이거나 또는 질환의 발현 후 증상의 치료적 억제 또는 완화일 수 있다. 치료는 항체-MRD 조성물 단독을 사용하거나, 또는 부가적인 치료제와 조합하여 사용될 수 있다.
조성물, 담체 희석제 및 시약과 관련되어, 본원에서 사용되는 용어 "약학적으로 허용되는" 또는 "생리적으로 허용되는" 및 이의 문법적 변형 형태는 상호교환적으로 사용되며, 원치않는 생리적 효과 예컨대 매스꺼움, 현기증, 복통 등이 일어나지 않고 인간에게 또는 인간에 대해 투여될 수 있는 물질을 의미한다.
"조정하다(modulate)"는 진폭, 빈도, 정도 또는 활성의 조절 또는 적합화를 의미한다. 다른 관련 측면에서, 이러한 조정은 양성적인 조정(예를 들어, 빈도, 정도 또는 활성의 증가)이거나 또는 음성적인 조정(예를 들어, 빈도, 정도 또는 활성의 감소)일 수 있다.
"암", "종양" 또는 "악성종양"은 동의어로서 사용되고 세포의 비제어적인, 비정상적인 증식, 영향받은 세포가 국소적으로 또는 혈류 및 림프계를 통해서 신체의 다른 부분으로 분산되는(전이되는) 능력, 및 임의의 다수의 특징적인 구조적 및/또는 분자적 특징들을 특징으로 하는 임의의 다수 질환을 의미한다. "암성", "종양" 또는 "악성 세포"는 특이적인 구조적 특성을 가지고, 분화가 결여되고 침윤 및 전이할 수 있는 세포를 의미한다. 암의 예는 유방암, 폐암, 뇌암, 골암, 간암, 신장암, 결장암, 두경부암, 난소암, 혈액암(예를 들어, 백혈병) 및 전립선암이 있다.
"인간화 항체" 또는 "키메라 항체"는 다른 포유동물 종, 예컨대 마우스의 배선에서 유래된 CDR 서열이 인간 프레임워크 서열 상에 그라프트된 항체를 포함한다.
본 발명은 촉매성 항체의 프로드러그 활성화 능력은 온전하게 남겨두면서, 종양 세포 또는 가용성 분자에 대한 효율적인 표적화 능력을 제공하는 촉매성 또는 비촉매성 항체와의 융합물로서 표적 결합 펩티드 또는 모듈 인식 도메인(MRD)을 개조하는 것을 기초로 하는 접근법을 기술한다. MRD는 또한, 특히 치료 목적을 이해서, 항체의 결합 기능성을 확대하기 위한 효율적인 접근법을 제공하도록 비촉매성 항체의 결합 능력을 확대시킬 수 있다.
본 발명의 일 측면은 모듈 인식 도메인(MRD)을 포함하는 전체 길이 항체를 개발하는 것에 관한 것이다. 단백질 리간드와 이의 표적 수용체간 상효작용은 종종 비교적 넓은 경계면에서 일어난다. 그러나, 경계면에서 단지 소수의 핵심 잔기만이 대부분의 결합에 도움을 준다. 따라서, 펩티드 길이(대체로 2 내지 60 아미노산)의 분자는 주어진 거대 단백질 리간드의 수용체 단백질에 결합할 수 있다. 본 발명의 MRD는 목적하는 표적 부위에 결합하고 약 2 내지 60 아미노산 길이인 펩티드 서열을 포함하는 것을 고려한다.
종양 연관 마커로서 인테그린 예컨대 ανβ3 및 ανβ5의 역할은 잘 검증되어 있다. 진행성 난소암으로부터 확립된 24종의 영구 인간 세포주에 대한 최근 연구는 이들 모든 세포주가 ανβ5 발현에 대해 양성이고 많은 세포주가 ανβ3 발현에 양성임을 보여주었다. 연구들은 또한 ανβ3 및 ανβ5가 악성 인간 자궁경부 종양 조직에서 고도로 발현된다는 것을 밝혀내었다. 또한 인테그린은 카포시 육종, 흑색종 및 유방암의 동물 모델에서 치료적 효능이 검증되었다.
다수의 인테그린 ανβ3 및 ανβ5 길항체가 임상 개발 중이다. 이들은 환형 RGD 펩티드 및 합성 소형 분자 RGD 모방체를 포함한다. 2 항체-기반 인테그린 길항제가 최근 암 치료를 위한 임상 시도 중에 있다. 첫번째로는 비탁신으로서, 쥐의 항-인간 ανβ3 항체 LM609의 인간화된 형태이다. 암환자에서 단계적 용량 상승 제I기 연구는 인간에 사용하기에 안전하다는 것을 증명하였다. 임상 시도 중인 다른 항체는 CNT095로서, αν 인테그린을 인식하는 완전한 인간 mAb이다. 다양한 고형 종양이 있는 환자에서 CNT095의 제I기 연구는 이것이 충분히 허용된다는 것을 보여주었다. ανβ3 및 ανβ5의 펩티드 길항제인 실렌지티드도 역시 제I기 시도에서 안전한 것으로 검증되었다. 또한, 이들 수용체에 대한 리간드의 사용을 기초로 하는 수많은 약물 표적화 및 영상화 연구가 수행되고 있다. 이러한 전임상 및 임상 관찰은 ανβ3 및 ανβ5 표적화의 중요성을 보여주었고, 이러한 전략에서 항체 사용을 포함하는 연구들은 이들 인테그린을 통한 표적화가 안전하다는 것을 일관되게 보고하고 있다.
인테그린-결합 MRD의 예는 RGD 삼중펩티드-함유 결합 부위가 있고, 본연에 기술한 일반적인 방법의 예이다. 최소 인식 도메인으로서 RGD 모티프를 갖는 리간드는 잘 알려져 있으며, 이의 일부 목록은, 괄호안에 상응하는 인테그린 표적과 함께, 피브로넥틴(α3β1, α5β1, ανβ1, αIIbβ3, ανβ3 및 α3β1), 피브리노겐(αMβ2 및 αIIbβ1), 폰 빌레브란트 인자(αIIbβ3 및 ανβ3), 및 비트로넥틴(αIIbβ3, ανβ3 및 ανβ5) 등을 포함한다.
본 발명에서 유용한 RGD를 포함하는 표적화 MRD의 예는 하기 열거한 아미노산 잔기 서열을 갖는다:
YCRGDCT (서열 번호 3)
PCRGDCL (서열 번호 4)
TCRGDCY (서열 번호 5)
LCRGDCF (서열 번호 6)
선택된 인테그린을 인식하는 높은 친화성 리간드의 표적 결합 특이성을 가지며 인테그린 수용체 상이 비-RGD-의존적 결합 부위를 모방한 MRD를 또한 본 발명에서 고려한다.
혈관생성은 수많은 생리학적 및 병리학적 과정에서 필수적이다. Ang2는 프로혈관생성 분자로서 작용하는 것으로 확인되었다. Ang2 선택적 억제제의 투여는 종양 혈관생성 및 각막 혈관생성 둘 모두를 억제하는데 충분하였다. 따라서, Ang2 단독 억제 또는 다른 혈관생성 인자 예컨대 VEGF의 억제와 조합시킨 억제는 고형 종양을 갖는 환자를 치료하기 위한 효율적인 항혈관생성 전략일 수 있다.
본 발명에서 유용한 MRD는 혈관생성 수용체, 혈관생성 인자, 및/또는 Ang2에 결합하는 것들을 포함하는 것을 고려한다. 혈관생성 사이토카인 표적화 MRD 서열의 예는 하기에 열거하였다:
MGAQTNFMPMDDLEQRLYEQFILQQGLE (서열 번호 7);
MGAQTNFMPMDNDELLLYEQFILQQGLE (서열 번호 8);
MGAQTNFMPMDATETRLYEQFILQQGLE (서열 번호 9);
AQQEECEWDPWTCEHMGSGSATGGSGSTASSGSGSATHQEECEWDPWTCEHMLE (2xCon4)(서열 번호 10);
MGAQTNFMPMDNDELLNYEQFILQQGLE (서열 번호 11);
PXDNDXLLNY (여기서, X는 20 천연 발생 아미노산 중 하나임)(서열 번호 12);
MGAQTNFMPMDNDELLLYEQFILQQGLEGGSGSTASSGSGSSLGAQTNFMPMDNDELLLY (서열 번호 20);
AQQEECEWDPWTCEHMGSGSATGGSGSTASSGSGSATHQEECEWDPWTCEHMLE (서열 번호 10);
AQQEECEFAPWTCEHM ConFA (서열 번호 21);
코어 nEFAPWTn (여기서, n은 약 0∼50 아미노산 잔기임)(서열 번호 22);
AQQEECEFAPWTCEHMGSGSATGGSGSTASSGSGSATHQEECEFAPWTCEHMLE 2xConFA(서열 번호 23);
AQQEECELAPWTCEHM ConLA;(서열 번호 24)
XnELAPWTXn(여기서, n은 약 0∼50 아미노산 잔기이고, X는 임의의 아미노산임) (서열 번호 25);
AQQEECELAPWTCEHMGSGSATGGSGSTASSGSGSATHQEECELAPWTCEHMLE 2xConLA(서열 번호 26);
AQQEECEFSPWTCEHM ConFS (서열 번호 27);
XnEFSPWTXn(여기서, n은 약 0∼50 아미노산 잔기이고, X는 임의의 아미노산임)(서열 번호 28);
AQQEECEFSPWTCEHMGSGSATGGSGSTASSGSGSATHQEECEFSPWTCEHMLE 2xConFS (서열 번호 29);
AQQEECELEPWTCEHM ConLE (서열 번호 30);
XnELEPWTXn(여기서, n은 약 0∼50 아미노산 잔기임이고, X는 임의의 아미노산임)(서열 번호 31);
AQQEECELEPWTCEHMGSGSATGGSGSTASSGSGSATHQEECELEPWTCEHMLE 2xConLE (서열 번호 32).
이러한 펩티드들은 사실상 이종성 또는 동종성, 이량체, 삼량체 또는 다른 다량체로 존재할 수 있다는 것을 이해해야 한다. 예를 들어, 동일한 Con-기반 서열 예컨대 2xConFA를 이량체화하여 동종 이량체를 제공하거나, 또는 ConFA가 ConLA와 조합되도록 Con 펩티드를 혼합해서 하기 서열을 갖는 ConFA-LA 이종이량체를 생성시킬 수 있다: AQQEECEFAPWTCEHMGSGSATGGSGSTASSGSGSATHQEECELAPWTCEHMLE (서열 번호 33).
다른 이종이량체는 ConFA와 ConFS를 조합하여 생성된 하기 서열을 갖는 ConFA-FS이다: AQQEECEFAPWTCEHMGSGSATGGSGSTASSGSGSATHQEECEFSPWTCEHMLE(서열 번호 34).
본 명세서에 제시된, 당분야의 숙련가는 이러한 다른 조합을 본원에 기술한 바와 같이 기능성 Ang2 결합 MRD를 생성된다는 것을 이해할 것이다.
일 측면에서, 본 발명은 하기 서열을 갖는 펩티드를 포함한다:
NFYQCIX1X2LX3X4X5PAEKSRGQWQECRTGG (서열 번호 58), 여기서 X1은 E 또는 D이고; X2는 임의의 아미노산이고; X3은 임의의 아미노산이고; X4는 임의의 아미노산이며 X5는 임의의 아미노산이다.
본 발명은 또한, 하기 서열에서 선택되는 코어 서열을 갖는 펩티드를 포함한다:
XnEFAPWTXn (여기서, n은 약 0∼50 아미노산 잔기임)(서열 번호 22);
XnELAPWTXn (여기서, n은 약 0∼50 아미노산 잔기임)(서열 번호 25);
XnEFSPWTXn (여기서, n은 약 0∼50 아미노산 잔기임)(서열 번호 28);
XnELEPWTXn (여기서, n은 약 0∼50 아미노산 잔기임)(서열 번호 31); 또는
Xn AQQEECEX1X2PWTCEHMXn (여기서, n은 약 0∼50 아미노산 잔기이고, X, X1 및 X2는 임의의 아미노산임)(서열 번호 57).
VEGF와의 복합체에서 VEGF 중화 펩티드에 대한 파지 디스플레이 선별 및 구조 연구가 보고되었다. 이러한 연구들은 펩티드 ν114(VEPNCDIHVMWEWECFERL)(서열 번호 13)가 VEGF 특이적이고, 0.2 μM의 친화성으로 VEGF에 결합하며, 인간 제대 정맥 내피 세포(HUVEC)의 VEGF-유도 증식을 중화시킨다는 것을 밝혔다. VEGF는 동종이량체이므로, 펩티드는 VEGF 동종이량체의 양 말단에서 2개의 동일한 부위를 차지한다. VEGF를 표적화하는 MRD를 포함하는 항체를 본 발명에서 고려하다. 항-VEGF 항체는 예를 들어, 하기 문헌에서 확인할 수 있고, 이 문헌을 참조하여 본원에 포함시킨다: Cancer Research 57, 4593-4599, Oct. 1997; J Biol Chem 281:10 6625, 2006.
인슐린 유사 성장 인자-I 수용체-특이적 MRD를 본 발명에서 사용할 수 있다. 인슐린 유사 성장 인자-I 수용체를 표적화하는 MRD 서열의 일례로는 하기 서열이 있다: SFYSCLESLVNGPAEKSRGQWDGCRKK (서열 번호 14).
추가적인 IGF-1R MRD는 하기 서열들을 포함한다:
NFYQCIEMLASHPAEKSRGQWQECRTGG (서열 번호 35);
NFYQCIEQLALRPAEKSRGQWQECRTGG (서열 번호 36);
NFYQCIDLLMAYPAEKSRGQWQECRTGG (서열 번호 37);
NFYQCIERLVTGPAEKSRGQWQECRTGG (서열 번호 38);
NFYQCIEYLAMKPAEKSRGQWQECRTGG (서열 번호 39);
NFYQCIEALQSRPAEKSRGQWQECRTGG (서열 번호 40);
NFYQCIEALSRSPAEKSRGQWQECRTGG (서열 번호 41);
NFYQCIEHLSGSPAEKSRGQWQECRTG (서열 번호 42);
NFYQCIESLAGGPAEKSRGQWQECRTG (서열 번호 43);
NFYQCIEALVGVPAEKSRGQWQECRTG (서열 번호 44);
NFYQCIEMLSLPPAEKSRGQWQECRTG (서열 번호 45);
NFYQCIEVFWGRPAEKSRGQWQECRTG (서열 번호 46);
NFYQCIEQLSSGPAEKSRGQWQECRTG (서열 번호 47);
NFYQCIELLSARPAEKSRGQWAECRAG (서열 번호 48);
NFYQCIEALARTPAEKSRGQWVECRAP (서열 번호 49).
다수의 연구들은 살아있는 동물에서 직접 전달을 유도하기 위해 혈관 귀소 펩티드를 다른 단백질 예컨대 IL-12 또는 약물에 연결하는 효율을 특징규명하였다. 그러한 것으로서, 혈관 귀소 MRD를 본 발명에서 사용하는 것을 고려한다. 혈관 귀소 펩티드인 MRD 서열의 일례는 하기 서열이다: ACDCRGDCFCG (서열 번호 15).
다양한 다른 표적 결합 부위를 본 발명에서 고려하며, 예를 들어, 상피 성장 인자 수용체(EGFR), CD20, 종양 항원, ErbB2, ErbB3, ErbB4, 인슐린 유사 성장 인자-I 수용체, 신경 성장 인자(NGR), 간세포 성장 인자 수용체, 및 종양 관련 표면 항원 상피 세포 부착 분자(Ep-CAM)를 포함한다. MRD를 이들 표적 결합 부위에 대해 유도시킬 수 있다.
EGFR에 결합하는 MRD 서열의 예를 하기에 열거하였다:
VDNKFNKELEKAYNEIRNLPNLNGWQMTAFIASLVDDPSQSANLLAEAKKLNDAQAPK (서열 번호 16);
VDNKFNKEMWIAWEEIRNLPNLNGWQMTAFIASLVDDPSQSANLLAEAKKLNDAQAPK (서열 번호 17).
ErbB2에 결합하는 MRD 서열의 예를 하기에 열거하였다:
VDNKFNKEMRNAYWEIALLPNLNNQQKRAFIRSLYDDPSQSANLLAEAKKLNDAQAPK (서열 번호 18).
MRD의 서열은 몇몇 방식으로 확인할 수 있다. MRD 서열은 천연 리간드에서 유래한 것일 수 있거나 또는 특정 표적 결합 부위에 결합하는 공지 서열을 사용할 수도 있다. 부가적으로, 파지 디스플레이 기술이 표적 수용체에 결합하는 펩티드를 동정하는 강력한 방법으로 부상하였다. 펩티드 파지 디스플레이 라이브러리에서는, 무작위 펩티드 서열은 섬유상 파지의 코트 단백질과 융합되어 디스플레이될 수 있다. 파지 디스플레이 벡터를 사용하여 폴리펩티드 상의 결합 부위를 밝히기 위한 방법은 구체적으로, WO 94/18221에 이미 기술되어 있다. 이 방법을 대체로 목적하는 사전 선택된 표적 부위에 결합하는 폴리펩티드를 클로닝하고 발현하기 위한 섬유상 파지(파지미드) 표면 발현 벡터 시스템의 사용을 포함한다.
MRD를 제조하기 위한 본 발명의 방법은 발현되는 디스플레이 단백질의 대량 모집군을 스크리닝하기 위한 수단을 제공하여, 목적하는 표적 결합 반응성을 코딩하는 1 이상의 특정 클론을 발견할 수 있는 장점때문에 파지 디스플레이 벡터를 사용한다. MRD 서열이 밝혀지면, 펩티드들을 당분야에 개시된 임의의 방법으로 제조할 수 있다.
MRD의 변이체 및 유도체는 본 발명의 범주에 속한다. 변이체에는 삽입, 결실 및 치환 변이체를 비롯하여, 약 0∼50, 0∼40, 0∼30, 0∼20 아미노산 등을 포함해서 N 말단 및/또는 C 말단에 부가 아미노산을 갖는 여기서 제시된 MRD를 포함한 변이체들도 포함된다. 본 발명의 특정 MRD는 1, 2, 또는 모든 3 유형의 변이체를 포함할 수 있다는 것을 이해할 것이다. 삽입 및 치환 변이체는 천연 아미노산, 비통상적 아미노산 또는 이들 둘 모두를 포함할 수 있다.
촉매성 및 비촉매성 항체를 본 발명에 사용하는 것을 고려할 수 있다. 항체 38C2는 항체-분비 하이브리도마이며, 이미 WO 97/21803에 기술되어 있다. 38C2는 지방족 도너와 알데히드 억셉터 간 알돌 부가 반응을 촉매하는 항체 조합 부위를 포함한다. 신경아세포종의 선천성 마우스 모델에서, 에토포시드 프로드러그의 전신 투여 및 Ab 38C2의 종양내 주사는 종양 성장을 억제하였다.
본 발명에서 관심있는 다른 항체는 A33 결합 항체를 포함한다. 인간 A33 항원은 Ig 수퍼패밀리에 속하는 경막 당단백질이다. 정상 및 악성 결장 조직에서 인간 A33 항원의 기능은 아직 알려지지 않았지만, A33 항원의 몇몇 특성은 이것이 결장암의 면역치료를 위해 유망한 표적이라는 것을 시사한다. 이러한 특징들은 (i) A33 항원의 고도로 제한적인 발현 패턴, (ii) 결장 암세포 상에서 A33 항원의 대량 발현, (iii) 분비형 또는 셰드(shed)형 A33 항원의 부재, 및 (iv) 항체 A33이 A33 항원에 결합시, 항체 A33이 세포내이입되어 소포체 내에 격리되는 점, 및 (v) 예비 임상 연구에서 항체 A33이 A33 항원 발현 결장암을 표적으로 하는 점 등이 포함된다. A33에 대해 유도된 MRD와 촉매성 또는 비촉매성 항체의 융합물은 A33 표적화 항체의 치료 효능을 증가시킬 것이다.
본 발명은 또한, 단일-, 이중-, 삼중-, 사중-, 및 오중-특이적 항체의 제조를 고려한다. 본 발명에서 사용되는 항체는 당분야에 공지된 임의의 방법으로 제조하는 것을 고려한다.
본 발명에 따라 제조되는 항체-MRD 융합 분자에서, MRD는 펩티드의 N 말단 또는 C 말단을 통해 항체에 부착될 수 있다. MRD는 항체 중쇄의 C 말단부, 항체 중쇄의 N 말단부, 항체 경쇄의 C 말단부, 또는 항체 경쇄의 N 말단부에 부착될 수 있다. MRD는 항체에 직접 부착되거나, 또는 선택적인 링커 펩티드를 통해 부착될 수 있으며, 이때 링커 펩티드는 2∼20 펩티드 길이일 수 있다. 링커 펩티드는 서열 GGGS(서열 번호 1)을 갖는 짧은 링커 펩티드이거나, 서열 SSGGGGSGGGGGGSS(서열 번호 2)를 갖는 중간 길이 링커 펩티드이거나, 또는 서열 SSGGGGSGGGGGGSSRSS(서열 번호 19)를 갖는 긴 링커 펩티드일 수 있다. 본 발명은 또한 항체의 임의의 말단부에 연결되는 2 이상의 MRD를 제공한다. 또한 2 이상의 MRD는 항체의 2 이상의 말단부에 직접적으로 연결되거나 또는 링커 펩티드를 통해 연결될 수 있다는 것을 고려한다. 다수 MRD가 동일한 표적 결합 부위, 또는 2 이상의 상이한 표적 결합 부위를 표적화할 수 있다. 부가적인 펩티드 서열을 부가하여 MRD의 생체 내 안정성을 증가시킬 수 있다.
항체-MRD 융합 분자는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩될 수 있다. 벡터가 이러한 폴리뉴클레오티드 서열을 포함할 수 있다. 상기 폴리뉴클레오티드 서열은 또한 숙주 세포 내에서 폴리뉴클레오티드의 발현을 제어하는 조절 서열과 연결될 수 있다. 숙주 세포, 또는 이의 자손 세포는 항체-MRD 융합 분자를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함할 수 있다.
본 발명은 본원에 기술된 치료 방법을 실시하는데 유용한 치료 조성물을 고려한다. 본 발명의 치료 조성물은 활성 성분으로서 그 안에 분산되거나 또는 용해되는, 본원에 기술된 바와 같은 MRD를 포함하는 1종 이상의 항체와 함께 생리적으로 허용되는 담체를 포함한다. 바람직한 구체예에서, 치료 조성물은 치료 목적으로 인간 환자에게 투여시 면역원성이 아니다.
용해되거나 또는 분산된 활성 성분을 포함하는 약학 조성물의 제조는 당분야에서 잘 알려져 있다. 대체로 이러한 조성물은 멸균된 주사가능한 액상 용제 또는 현탁제로서 제조되지만, 사용 전에 액체 중에 제조될 수 있는, 액제, 또는 현탁제에 적합한, 수성 또는 비수성 고체 형태로 제조될 수 있다. 이러한 제조물은 또한 유화될 수도 있다. 따라서, 항체-MRD 함유 조성물은 액제, 현탁제, 정제, 캡슐, 서방형 제형 또는 분말 형태, 또는 다른 조성물 형태를 취할 수 있다.
활성 성분은 본원에 기술한 치료 방법에 사용하기 적합한 양으로, 활성 성분과 상용가능하고 약학적으로 허용되는 부형제와 혼합될 수 있다. 적절한 부형제는 예를 들어, 물, 염수, 덱스트로스, 글리세롤, 에탄올 등 및 이의 조합물 등이다. 또한, 원한다면, 조성물은 활성 성분의 효능을 향상시키는 보조물 예컨대 습윤제 또는 유화제, pH 완충제 등을 소량으로 포함할 수 있다.
본 발명의 치료 조성물은 여기에 성분의 약학적으로 허용되는 염을 포함할 수 있다. 약학적으로 허용되는 염은, 무기산 예컨대 염산 또는 인산, 또는 유기산 예컨대 아세트산, 타르타르산, 만델산 등과 함께 형성되는 산부가염(폴리펩티드의 자유 아미노기와 함께 형성됨)을 포함한다. 자유 카르복실산과 함께 형성되는 염은 또한 무기 염기 예컨대 수산화나트륨, 수산화칼륨, 수산화암모늄, 수산화칼슘 또는 수산화제2철, 및 유기 염기 예컨대 이소프로필아민, 트리메틸아민, 2-에틸아미노 에탄올, 히스티딘, 프로카인 등으로부터 유도될 수 있다.
생리적으로 허용되는 담체는 당분야에 공지이다. 액상 담체의 예는 활성 성분 및 물 이외에 어떠한 물질도 함유하지 않거나, 완충제 예컨대 생리적 pH 값의 인산나트륨, 생리적 염수 또는 그 둘 모두, 예컨대 인산-완충된 염수를 포함하는 멸균된 수용액이 있다. 또한, 수성 담체는 1 이상의 완충 염을 비롯하여, 염화나트륨 및 염화 칼륨 등의 염, 덱스트로스, 프로필렌 글리콜, 폴리에틸렌 글리콜, 및 다른 용질을 포함할 수 있다.
액상 조성물은 또한 물이외에도, 그리고 물을 제외하고도 액체 상을 포함할 수도 있다.
이러한 부가적인 액체상의 예는 글리세린, 식물성유 예컨대 면실유, 유기 에스테르 예컨대 에틸 올레에이트, 및 물-오일 에멀션 등이 있다.
치료 조성물은 본 발명의 MRD를 포함하는 항체를 대체로, 전체 치료 조성물 중량 당 항체 0.1 중량% 이상의 양으로 포함한다. 중량%는 전체 조성물에 대한 항체의 중량 비율이다. 따라서, 예를 들어, 0.1 중량%는 전체 조성물 100 그램 당 항체-MRD 0.1 그램이다.
항체 함유 치료 조성물은 대체로 활성 성분으로서 항체를 조성물의 부피 mL 당 약 10 마이크로그램(㎍) 내지 mL 당 약 100 밀리그램(mg)으로 함유하며, 보다 바람직하게는 약 1 mg/mL 내지 약 10 mg/mL(즉, 약 0.1 내지 1 중량%)을 함유한다.
다른 구체예에서, 치료 조성물은 본 발명의 폴리펩티드를, 대체로 전체 치료 조성물의 중량 당 0.1 중량% 이상의 양으로 함유한다. 중량%는 전체 조성물에 대한 폴리펩티드의 중량 비율이다. 따라서, 0.1 중량%는 전체 조성물 100 그램 당 0.1 그램의 폴리펩티드이다.
바람직하게, 폴리펩티드-함유 치료 조성물은 대체로, 활성 성분으로서 폴리펩티드를 조성물의 부피 mL 당 약 10 ㎍ 내지 mL 당 약 100 mg으로 함유하고, 보다 바람직하게는 약 1 mg/mL 내지 약 10 mg/mL(즉, 약 0.1 내지 1 중량%)로 함유한다.
인간 환자의 생체 내에서 인간화 또는 키메라 항체를 사용하는 장점을 고려하여, 본원에서 기술하는 항체-MRD 분자는 치료 시약으로서 생체 내 용도에 특히 매우 적합하다. 이 방법은 환자에게 본 발명의 MRD를 포함하는 항체를 함유하는 생리적으로 허용되는 조성물의 치료 유효량을 투여하는 것을 포함한다.
본 발명의 MRD를 포함하는 항체의 투여를 위한 용량 범위는 표적 분자가 매개하는 질환 증상이 완화되는 목적 효과가 일어나도록 충분하게 큰 범위이다. 용량은 부작용, 예컨대 고점도 증후군, 폐부종, 울혈성 심부전 등이 야기될 정도로 큰 용량이어서는 안된다. 일반적으로, 용량은 환자의 연령, 상태, 성별 및 질환 정도에 따라 다양하게 되며, 당분야의 숙련가가 결정할 수 있다. 용량은 임의의 합병증이 일어나는 경우에는 개별 담당의가 조절할 수 있다.
본 발명의 MRD를 포함하는 항체의 치료 유효량은 생리적으로 허용되는 조성물로 투여시 혈장 농도가 약 0.1 ㎍/mL∼약 100 ㎍/mL, 바람직하게는 약 1 ㎍/mL∼약 5 ㎍/mL, 대체로 약 5 ㎍/mL에 도달하는데 충분한 항체의 양이다. 달리 말해서, 용량은 하루 내지 수일 동안, 하루 당 1 이상의 투여 용량으로, 약 0.1 mg/kg∼약 300 mg/kg, 바람직하게는 약 0.2 mg/kg∼약 200 mg/kg, 가장 바람직하게는 약 0.5 mg/kg∼약 20 mg/kg으로 다양할 수 있다.
본 발명의 MRD를 포함하는 항체는 시간에 따른 점진 주입을 통해서 또는 주사를 통해 비경구적으로 투여될 수 있다. 대체로 전신 투여를 통해 신체 내에서 표적 분자에 접근할 수 있으므로 대개는 치료 조성물의 정맥내 투여로 처리되지만, 표적이 되는 조직이 표적 분자를 포함할 가능성이 있는 경우에는 다른 조직 및 전달 수단을 고려한다. 따라서, 본 발명의 MRD를 포함하는 항체는 정맥내, 복막내, 근육내, 피하내, 강내(intracavity), 경피적으로 투여될 수 있고, 연동 수단으로 전달될 수도 있다.
본 발명의 인간 단일클론 항체 또는 폴리펩티드를 함유하는 치료 조성물은 통상, 정맥내로, 예를 들어 단위 용량의 주사를 통해 투여된다. 본 발명의 치료 조성물과 관련되어 사용되는 용어 "단위 용량(unit dose)"은 피험체에게 단일 용량으로서 적합한 물리적으로 분리된 단위를 의미하며, 각 단위는 필요한 희석제; 즉 담체, 또는 비히클과 함께 목적하는 치료 효과를 일으키기 위해 산출된 활성 물질의 사전정해진 양을 포함한다.
조성물은 용량 제제와 상용되는 방식으로, 치료 유효량으로 투여된다. 투여되는 양은 치료하려는 피험체, 활성 성분을 이용하는 피험체 신체 능력, 및 원하는 치료효과 정도에 따라 좌우된다. 투여에 요구되는 활성 성분의 상세량은 각 개체마다 고유하고 전문의의 판단에 따른다. 그러나, 전신 적용에 적절한 용량 범위는 본원에 개시하였으며 투여 경로에 따라 좌우된다. 적절한 투여 계획도 가변적이지만, 예를 들어 초기 투여 이후에 후속 주사 또는 다른 투여를 통해 1시간 또는 그 이상의 시간 간격으로 반복 투약하는 것으로 전형화시킨다. 다르게는, 생체 내 치료를 위해 지정한 범위로 혈액 내 농도를 유지시키기에 충분한 연속 정맥 내 주입을 고려한다.
하기 실시예는 본 발명을 설명하려는 목적이며 이에 제한하려는 것이 아니다.
실시예
실시예 1: 인테그린 표적화 항체- MRD 분자
신규 항체-MRD 융합 분자를 촉매성 항체 38C2에 인테그린 ανβ3-표적화 펩티드를 융합시켜 제조하였다. 경쇄의 N 말단 및 C 말단에서의 융합 및 중쇄의 C 말단에서의 융합이 가장 효율적이었다. 유세포 측정법을 사용하여, 항체 접합체가 인테그린 ανβ3-발현 인간 유방암 세포에 효율적으로 결합한다는 것을 확인하였다. 또한, 이 항체 접합체는 메토돌 및 독소루비신 프로드러그 활성화를 통해 측정시, 이들의 모촉매성 항체 38C2의 레트로-알돌 활성을 유지하였다. 이는 세포 표적화 및 촉매성 항체의 능력이 선택적인 화학치료를 위해 효과적으로 조합되었다는 것을 보여주는 것이다.
실시예 2: 혈관생성 사이토카인 표적화 항체- MRD 분자
혈관생성 사이토카인 표적화 항체- MRD 융합 분자를 제작하였다. 사용된 항체는 38C2이고, 이를 2xCon4 펩티드 (AQQEECEWDPWTCEHMGSGSATGGSGSTASSGSGSATHQEECEWDPWTCEHMLE(서열 번호 10))를 포함하는 MRD와 융합시켰다. 이 MRD 펩티드를 경쇄의 N 말단 또는 C 말단, 및 중쇄의 C 말단에 융합시켰다. 유사한 결과를 다른 Ang-2 MRD 펩티드를 사용시에도 확인하였다. 추가적인 Ang-2 MRD 펩티드는 하기 서열을 포함한다:
LM-2x-32
MGAQTNFMPMDNDELLLYEQFILQQGLEGGSGSTASSGSGSSLGAQTNFMPMDNDELLLY (서열 번호 20)
AQQEECEWDPWTCEHMGSGSATGGSGSTASSGSGSATHQEECEWDPWTCEHMLE (2xCon4) (서열 번호 10)
AQQEECEFAPWTCEHM ConFA (서열 번호 21)
코어 XnEFAPWTXn(여기서, n은 약 0∼50 아미노산 잔기임)(서열 번호 22)
AQQEECEFAPWTCEHMGSGSATGGSGSTASSGSGSATHQEECEFAPWTCEHMLE 2xConFA (서열 번호 23)
AQQEECELAPWTCEHM ConLA (서열 번호 24)
XnELAPWTXn(여기서, n은 약 0∼50 아미노산 잔기임) (서열 번호 25)
AQQEECELAPWTCEHMGSGSATGGSGSTASSGSGSATHQEECELAPWTCEHMLE 2xConLA (서열 번호 26)
AQQEECEFSPWTCEHM ConFS (서열 번호 27)
XnEFSPWTXn(여기서, n은 약 0∼50 아미노산 잔기임) (서열 번호 28)
AQQEECEFSPWTCEHMGSGSATGGSGSTASSGSGSATHQEECEFSPWTCEHMLE 2xConFS (서열 번호 29)
AQQEECELEPWTCEHM ConLE (서열 번호 30)
XnELEPWTXn(여기서, n은 약 0∼50 아미노산 잔기임) (서열 번호 31)
AQQEECELEPWTCEHMGSGSATGGSGSTASSGSGSATHQEECELEPWTCEHMLE 2xConLE (서열 번호 32).
이러한 펩티드들은 성질상 동종성 또는 이종성으로, 이량체, 삼량체 또는 다른 다량체로 존재할 수 있다는 것을 이해할 것이다. 예를 들어, 동일한 Con-기초 서열 예컨대 2xConFA를 이량체화하여 이종성 이량체를 제공하거나, 또는 ConFA가 ConLA와 조합되도록 Con 펩티드를 혼합해서 하기 서열을 갖는 ConFA-LA 이종이량체를 생성시킬 수 있다:
AQQEECEFAPWTCEHMGSGSATGGSGSTASSGSGSATHQEECELAPWTCEHMLE (서열 번호 33).
다른 예시적인 이종이량체로는, ConFA와 ConFS를 조합하여 생성된, 하기 서열을 갖는 ConFA-FS가 있다:
AQQEECEFAPWTCEHMGSGSATGGSGSTASSGSGSATHQEECEFSPWTCEHMLE (서열 번호 34).
본원에 주어진 교시 내용을 통해 당분야의 숙련가는 이러한 다른 조합으로 본원에 기술된 바와 같은 기능성 Ang2 결합 MRD를 생성시킬 수 있음을 이해하게 될 것이다.
실시예 3: 비촉매성 항체를 이용한 항체- MRD 융합체
인간 인테그린 ανβ3에 대해 유도시킨 인간화 마우스 단일클론 항체, LM609가 이미 기술되어 있다(Rader, C. et. al., 1998. Rader C, Cheresh DA, Barbas CF 3rd. Proc Natl Acad Sci U S A. 1998 Jul 21;95(15):8910-5).
인간 비촉매성 단일클론 Ab, JC7U를 2xCon4(AQQEECEWDPWTCEHMGSGSATGGSGSTASSGSGSATHQEECEWDPWTCEHMLE(서열 번호 10))를 포함하는 항-Ang2 MRD와 경쇄의 N 말단 또는 C 말단에서 융합시켰다. 2xCon4(AQQEECEWDPWTCEHMGSGSATGGSGSTASSGSGSATHQEECEWDPWTCEHMLE(서열 번호 10))는 항체의 카파쇄와의 N 말단 융합체(2xCon4-JC7U) 및 C 말단 융합체(JC7U-2xCon4)로서 연구되었다. 이들 두 융합체는 인테그린 및 Ang2 결합성은 유지하였다. 도 3의 좌측 패널에 도시한 바와 같이, 2 항체 구성체(2xCon4-JC7U 및 JC7U-2xCon4)는 ELISA 실험으로 확인된 바와 같이 재조합 Ang2에 특이적으로 결합하였다. 그러나, Ang2와의 결합은, 항체 경쇄의 C 말단에 2xCon4(서열 번호 10) 융합체를 갖는, JC7U-2xCon4의 경우가 유의하게 더 높았다. 도 3의 우측 패널은 Ang2-JC7U 및 JC7U-Ang2와 인테그린 ανβ3의 결합을 도시한 도면이다. 이 결과들은 경쇄의 N 말단 또는 C 말단에 2xCon4(서열 번호 10)를 융합시킨 경우는 인테그린 ανβ3과 mAb JC7U의 결합에 영향을 주지 않는다는 것을 보여주었다. 도 4는 동일한 항체-MRD 융합 구성체를 사용한 다른 ELISA 실험을 도시한 도면이다.
실시예 4: 헤르셉틴- MRD 융합 분자
비촉매성 항체와 MRD 융합에 대한 다른 예는 헤르셉틴-MRD 융합 구성체이다. 헤르셉틴-MRD 융합체는 다기능성이고, 소형 분자 αν인테그린 길항제면서 화학적으로 프로그램된 인테그린-표적화 항체로서, αν-매개된 세포 부착 및 증식을 방해하면서 유방암 전이를 예방하는데 주목할만한 효능을 보여주었다. 헤르셉틴-2xCon4(ErbB2 및 ang2를 포적화함) 및 헤르셉틴-V114(ErbB2 및 VEGF를 표적화) 및헤르셉틴-RGD-4C-2xCon4(ErbB2, ang2, 및 인테그린 표적화함)을 포함하는 MRD 융합체는 효과적이었다.
실시예 5: VEGF 표적화 항체- MRD 분자
VEGF를 표적으로 하는 MRD를 포함하는 항체를 제작하였다. ν114를 표적으로 하는 MRD(서열 번호 13)를 긴 링커 서열(서열 번호 2)를 사용하여 헤르셉틴 및 38C2의 카파쇄의 N 말단에 융합시켰다. 얻어진 항체-MRD 융합 구성체의 발현 및 실험 결과 강력한 VEGF 결합성이 확인되었다.
실시예 6: IGF -1R 표적화 항체- MRD 분자
연결인자로서 긴 링커 서열을 사용하여 헤르셉틴 및 38C2의 카파쇄의 N 말단에 IGF-1R을 표적으로 하는 MRD(SFYSCLESLVNGPAEKSRGQWDGCRKK(서열 번호 14))가 융합된 융합체를 실험하였다. 얻어진 항체-MRD 융합 구성체의 발현 및 실험 결과 강력한 IGF-1R 결합성이 확인되었다. IGR-1R에 대해 높은 결합성을 보이는 추가 클론을 또한, 수 회의 돌연변이유발 및 스크리닝 이후에 동정하였다. 하기에 열거된 바람직한 서열은 인슐린 수용체에 대해 어떠한 결합 친화성 또는 유의한 결합 친화성을 보이지 않았다(표 2 참조).
추가 돌연변이유발을 위한 주형
Rm2-2-218 GTGGAGTGCAGGGCGCCG VECRAP 서열 번호 50, 51
Rm2-2-316 GCTGAGTGCAGGGCTGGG AECRAG 서열 번호 52, 53
Rm2-2-319 CAGGAGTGCAGGACGGGG QECRTG 서열 번호 54, 55
돌연변이체 아미노산 서열 주형 서열 번호
Rm4-31 NFYQCIEMLASHPAEKSRGQWQECRTGG Rm2-2-319 35
Rm4-33 NFYQCIEQLALRPAEKSRGQWQECRTGG Rm2-2-319 36
Rm4-39 NFYQCIDLLMAYPAEKSRGQWQECRTGG Rm2-2-319 37
Rm4-310 NFYQCIERLVTGPAEKSRGQWQECRTGG Rm2-2-319 38
Rm4-314 NFYQCIEYLAMKPAEKSRGQWQECRTGG Rm2-2-319 39
Rm4-316 NFYQCIEALQSRPAEKSRGQWQECRTGG Rm2-2-319 40
Rm4-319 NFYQCIEALSRSPAEKSRGQWQECRTGG Rm2-2-319 41
Rm4-44 NFYQCIEHLSGSPAEKSRGQWQECRTG Rm2-2-319 42
Rm4-45 NFYQCIESLAGGPAEKSRGQWQECRTG Rm2-2-319 43
Rm4-46 NFYQCIEALVGVPAEKSRGQWQECRTG Rm2-2-319 44
Rm4-49 NFYQCIEMLSLPPAEKSRGQWQECRTG Rm2-2-319 45
Rm4-410 NFYQCIEVFWGRPAEKSRGQWQECRTG Rm2-2-319 46
Rm4-411 NFYQCIEQLSSGPAEKSRGQWQECRTG Rm2-2-319 47
Rm4-415 NFYQCIELLSARPAEKSRGQWAECRAG Rm2-2-316 48
Rm4-417 NFYQCIEALARTPAEKSRGQWVECRAP Rm2-2-218 49
실시예 7: ErbB2 에 결합하고, Ang -2를 표적화하는 항체- MRD 분자
Erb2에 결합하는 항체의 경쇄에 융합된, Ang-2를 표적으로 하는 MRD(L17)를 함유하는 항체를 제작하였다. 짧은 링커 서열, 긴 링커 서열, 또는 경쇄 불변 영역의 제4 루프를 링커로서 사용하였다. 도 5는 짧은 링커 펩티드(GGGS(서열 번호 1))를 사용한 ErbB2 항체와 Ang-2 표적화 MRD의 N 말단 융합체(L17-sL-Her), 짧은 링커 펩티드를 사용한 ErbB2 항체와 Ang-2 표적화 MRD의 C 말단 융합체(Her-sL-L17), 경쇄 불변 영역 내 제4 루프를 사용한 ErbB2 항체와 Ang-2 표적화 MRD의 C 말단 융합체(Her-lo-L17), 또는 긴 링커 펩티드(SSGGGGSGGGGGGSSRSS(서열 번호 19))를 사용한 ERbB2 항체와 Ang-2 표적화 MRD의 N 말단 융합체(L17-lL-Her)를 포함하는 구성체를 이용한 ELISA 결과를 도시한 도면이다. ErbB2는 다양한 정도로 모든 구성체와 결합하였다. 그러나, Ang-2는 단지 Her-sL-L17 및 L17-lL-Her만이 결합하였다.
실시예 8: 간세포 성장 인자 수용체에 결합하고, Ang -2를 표적화하는 항체-MRD 분자
간세포 성장 인자 수용체에 결합하는 Met 항체 경쇄의 N 말단 또는 C 말단에 Ang-2를 표적으로 하는 MRD(L17)를 융합시켰다. 연결인자로서 짧은 링커 서열 또는 긴 링커 서열을 사용하였다. 도 6은 짧은 링커 펩티드(GGGS(서열 번호 1))를 사용한 Met 항체와 Ang-2 표적화 MRD의 N 말단 융합체(L17-sL-Met), 긴 링커 펩티드(SSGGGGSGGGGGGSSRSS(서열 번호 19))를 사용한 Met 항체와 Ang-2 표적화 MRD의 N 말단 융합체(L17-lL-Met), 및 긴 링커 펩티드를 사용한 Met 항체와 Ang-2 표적화 MRD의 C 말단 융합체(Met-iL-L17)를 포함한 구성체를 이용한 ELISA 결과를 도시한 도면이다. 얻어진 항체-MRD 융합 구성체의 발현 및 실험 결과 긴 링커 펩티드를 사용시 강력한 Ang-2 결합이 확인되었다. 항체 경쇄의 C 말단에 Ang-2 표적화 MRD를 융합시킨 경우는 항체 경쇄의 N 말단에 Ang-2 표적화 MRD를 융합시킨 경우보다 약간 높게 Ang-2에 결합하였다.
실시예 9: ErbB2 에 결합하고, 인테그린을 표적화하는 항체- MRD 분자
ErbB2에 결합하는 항체 헤르셉틴(Her)의 경쇄에 융합된, 인테그린 ανβ3을 표적으로 하는 MRD(RGD4C)를 제작하였다. 링커로서 짧은 링커 서열, 긴 링커 서열, 또는 경쇄 불변 영역의 제4 루프를 사용하였다. 도 7은 짧은 링커 펩티드(GGGS(서열 번호 1))를 사용한 ErbB2 항체와 인테그린 ανβ3 표적화 MRD의 N 말단 융합체(RGD4C-sL-Her), 짧은 링커 펩티드를 사용한 ErbB2 항체와 인테그린 ανβ3 표적화 MRD의 C 말단 융합체(Her-sL-RGD4C), 경쇄 불변 영역의 제4 루프를 사용한 ErbB2 항체와 인테그린 ανβ3 표적화 MRD의 C 말단 융합체(Her-lo-RGD4C), 또는 긴 링커 펩티드(SSGGGGSGGGGGGSSRSS(서열 번호 19))를 사용한 ErbB2 항체와 인테그린 ανβ3 표적화 MRD의 N 말단 융합체(RGD4C-lL-Her)를 포함하는 구성체를 이용한 ELISA 결과를 도시한 도면이다. ErbB2는 다양한 정도로 모든 구성체에 결합하였다. 그러나, 인테그린 ανβ3은 단지 RGD4C-lL-Her만 결합하였다.
실시예 10: 간세포 성장 인자 수용체에 결합하고, 인테그린을 표적화하는 항체- MRD 분자
간세포 성장 인자 수용체에 결합하는 항체(Met)의 경쇄에 융합된 인테그린 ανβ3을 표적으로 하는 MRD(RGD4C)를 포함하는 항체를 제작하였다. 긴 링커 서열을 포함하는 항체-MRD 구성체를 사용하였다. 도 8은 간세포 성장 인자 수용체 항체와 인테그린 ανβ3 표적화 MRD의 N 말단 융합체(RGD4C-lL-Met), 또는 간세포 성장 인자 수용체 항체와 인테그린 ανβ3 표적화 MRD의 C 말단 융합체(Met-lL-RGD4C)를 포함하는 구성체들을 이용한 ELISA 결과를 도시한 것이다. RGD4C-lL-Met는 강한 인테그린 ανβ3 결합성을 보여주었다.
실시예 11. ErbB2 에 결합하고, 인슐린 유사 성장 인자-I 수용체를 표적화하는 항체- MRD 분자
ErbB2에 결합하는 항체(Her)의 경쇄에 융합된 인슐린 유사 성장 인자-I 수용체를 표적으로 하는 MRD(RP)를 포함하는 항체를 제작하였다. 링커로서 짧은 링커 펩티드, 긴 링커 펩티드, 또는 경쇄 불변 영역의 제4 루프를 사용하였다(Carter et al., Proc Natl Acad Sci U S A. 1992 May 15;89(10):4285-9). PMID: 1350088[MEDLINE의 PubMed 색인]; US 특허 제5,677,171호; ATCC 수탁번호 10463, 이들 모두를 참조하여 본원에 포함시킴).
도 9는 짧은 링커 서열을 사용한 ErbB2 항체와 인슐린 유사 성장 인자-I 수용체 표적화 MRD의 N 말단 융합체(RP-sL-Her), 짧은 링커 펩티드 및 ErbB2 항체와 인슐린 유사 성장 인자-I 수용체 표적화 MRD의 C 말단 융합체(Her-sL-RP), 경쇄 불변 영역의 제4 루프를 사용한 ErbB2와 인슐린 유사 성장 인자-I 수용체 표적화 MRD의 C 말단 융합체(Her-lo-RP), 긴 링커 펩티드를 사용한 ErbB2 항체와 인슐린 유사 성장 인자-I 수용체 표적화 MRD의 N 말단 융합체(RP-lL-Her), 또는 긴 링커 펩티드를 사용한 ErbB2 항체와 인슐린 유사 성장 인자-I 수용체 표적화 MRD의 C 말단 융합체(Her-lL-RP)를 포함한 구성체들을 이용한 ELISA 결과를 도시한 도면이다. ErbB2는 모든 구성체와 다양한 정도로 결합하였다. 인슐린 유사 성장 인자-I 수용체는 RP-lL-Her와 결합하였다.
실시예 12: ErbB2 에 결합하고, VEGF 를 표적화하는 항체- MRD 분자
VEGF를 표적으로 하는 MRD(V114)를 ErbB2-결합 항체(Her)의 경쇄의 N 말단에 융합시켰다. 중간 길이 링커 펩티드(SSGGGGSGGGGGGSS(서열 번호 2))를 연결인자로서 사용하였다. 도 10은 중간 길이 링커 펩티드를 사용한 Erb2-결합 항체와 VEGF 표적화 MRD의 N 말단 융합체(V114-mL-Her)를 포함하는 구성체를 이용한 ELISA 결과를 도시한 도면이다. 얻어진 항체-MRD 융합 구성체의 발현 및 실험 결과 강한 VEGF 및 ErbB2 결합성이 확인되었다.
실시예 13: 인테그린 표적화 항체- MRD 분자
중간 길이 링커 펩티드를 연결인자로서 사용하여 인테그린 ανβ3을 표적으로 하는 MRD(RGD)를 38C2의 경쇄의 N 말단에 융합시켰다. 도 11은 얻어진 항체-MRD 융합 구성체의 발현 및 실험에서 강력한 인테그린 ανβ3 결합성을 가지고 있음을 보여주는 것이다.
실시예 14: Ang -2 표적화 항체- MRD 분자
연결인자로서 짧은 링커 서열을 사용하여 Ang-2를 표적으로 하는 MRD(L17)를 38C2의 경쇄의 C 말단에 융합시켰다. 도 12는 얻어진 항체-MRD 융합 구성체의 발현 및 실험 결과 강력한 Ang-2 결합성을 가지고 있음을 보여주었다.
실시예 15: ErbB2 에 결합하고, 인테그린 및 Ang -2를 표적화하는 항체- MRD 분자
중간길이 링커를 사용하여 인테그린 ανβ3을 표적으로 하는 MRD(RGD4C)를 ErbB2 표적화 항체(Her)의 경쇄의 N 말단에 연결시켰고, 짧은 링커를 통해 Ang-2 표적화 MRD(L17)를 동일한 ErbB2 표적화 항체의 C 말단에 연결시켰다(RGD4C-mL-Her-sL-L17). 도 13은 얻어진 항체-MRD 융합 구성체가 인테그린, Ang-2, 및 ErbB2에 결합했음을 보여주는 도면이다.
실시예 16: ErbB2 에 결합하고, 인테그린을 표적화하는 항체- MRD 분자
연결인자로서 중간길이 링커를 사용하여 ErbB2에 결합하는 항체(Her)의 중쇄의 N 말단에 융합된 인테그린 ανβ3을 표적으로 하는 MRD(RGD4C)를 포함하는 항체를 제작하였다. 도 14는 이 구성체를 이용한 ELISA 결과를 도시한 도면이다. 인테그린 및 ErbB2 둘 모두에 상기 구성체가 결합하였다.
실시예 17: 짧은 링커 펩티드를 사용한, ErbB2 또는 간세포 성장 인자 수용체 결합하고, 인테그린 , Ang -2 또는 인슐린 유사 성장 인자-I 수용체를 표적화하는 항체- MRD 분자
ErbB2 또는 간세포 성장 인자 수용체 결합 항체를 포함하고, 인테그린 ανβ3, Ang-2 또는 인슐린 유사 성장 인자-I 수용체-표적화 MRD 영역이 이 항체의 경쇄에 짧은 링커 펩티드를 사용하여 연결된 항체-MRD 분자를 제작하였다. 도 15는 ErbB2 항체에 Ang-2 표적화 MRD가 N 말단 융합된 융합체(L17-sL-Her), ErbB2 항체에 인테그린-표적화 MRD가 N 말단 융합된 융합체(RGD4C-sL-Her), ErbB2 결합 항체에 인슐린 유사 성장 인자-I 수용체 표적화 MRD가 N 말단 융합된 융합체(RP-sL-Her), 간세포 성장 인자 수용체 결합 항체에 Ang-2 표적화 MRD가 C 말단 융합된 융합체(L17-sL-Met), ErbB2 결합 항체에 Ang-2 표적화 MRD가 C 말단 융합된 융합체(Her-sL-L17), ErbB2 결합 항체에 인테그린 표적화 MRD에 C 말단 융합된 융합체(Her-sL-RGD4C), 또는 ErbB2 결합 항체에 인슐린 유사 성장 인자-I 수용체 표적화 MRD가 C 말단 융합된 융합체(Her-sL-RP)를 이용한 ELISA 결합 결과를 도시한 도면이다. ErbB2는 간세포 성장 인자 수용체 결합 항체를 포함하는 구성체를 제외한, 항체-MRD 구성체와 다양한 정도로 결합하였다. 항원은 Her-sL-L17 구성체만이 결합하였다.
실시예 18: 긴 링커 펩티드를 사용한, ErbB2 또는 간세포 성장 인자 수용체 에 결합하고, 인테그린 , Ang -2 또는 인슐린 유사 성장 인자-I 수용체를 표적화하는 항체- MRD 분자
ErbB2 또는 간세포 성장 인자 수용체 결합 항체를 포함하고, 인테그린 ανβ3, Ang-2 또는 인슐린 유사 성장 인자-I 수용체-표적화 MRD 영역이 이 항체의 경쇄에 긴 링커 펩티드를 사용하여 연결된, 항체-MRD 분자를 제작하였다. 도 16은 ErbB2 항체에 Ang-2 표적화 MRD가 N 말단 융합된 융합체(L17-lL-Her), ErbB2 항체에 인테그린-표적화 MRD가 N 말단 융합된 융합체(RGD4C-lL-Her), ErbB2 결합 항체에 인슐린 유사 성장 인자-I 수용체-표적화 MRD가 N 말단 융합된 융합체(RP-lL-Her), 간세포 성장 인자 수용체 결합 항체에 Ang-2 표적화 MRD가 C 말단 융합된 융합체(L17-lL-Met), 간세포 성장 인자 수용체 결합 항체에 인테그린 표적화 MRD가 C 말단 융합된 융합체(RGD4C-lL-Met), 인슐린 유사 성장 인자-I 수용체 결합 항체에 Ang-2 표적화 MRD가 C 말단 융합된 융합체(Her-lL-RP), 간세포 성장 인자 수용체 결합 항체에 Ang-2 표적화 MRD가 C 말단 융합된 융합체(Met-lL-L17), 또는 간세포 성장 인자 수용체 결합 항체에 인테그린 표적화 MRD가 C 말단 융합된 융합체(Met-lL-RGD4C)를 포함하는 구성체를 이용한 ELISA 결과를 도시한 도면이다. 도 16에 도시한 바와 같이, 항체-MRD 융합체는 항원 및 ErbB2에 결합하는데 효율적이었다. Lu et al. J Biol Chem. 2005 May 20;280(20):19665-72. Epub 2005 Mar 9;.; Lu et al. J Biol Chem. 2004 Jan 23;279(4):2856-65. Epub 2003 Oct 23,
본 발명을 상기 실시예들을 참조하여 설명하였지만, 본 발명의 범주 및 의도 내에 다양한 변형 및 별법이 포함된다는 것을 이해할 것이다. 따라, 본 발명은 하기 청구항에 의해서만 한정된다.
SEQUENCE LISTING <110> THE SCRIPPS RESEARCH INSTITUTE BARBAS, Carlos F. III <120> ANTIBODY TARGETING THROUGH A MODULAR RECOGNITION DOMAIN <130> SCRIP1890-2WO <150> US 61/022,767 <151> 2008-01-22 <150> US 61/018,816 <151> 2008-01-03 <160> 58 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic construct <400> 1 Gly Gly Gly Ser 1 <210> 2 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic construct <400> 2 Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Gly Gly Ser Ser 1 5 10 15 <210> 3 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic construct <400> 3 Tyr Cys Arg Gly Asp Cys Thr 1 5 <210> 4 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic construct <400> 4 Pro Cys Arg Gly Asp Cys Leu 1 5 <210> 5 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic construct <400> 5 Thr Cys Arg Gly Asp Cys Tyr 1 5 <210> 6 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic construct <400> 6 Leu Cys Arg Gly Asp Cys Phe 1 5 <210> 7 <211> 28 <212> PRT <213> 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Met 1 5 10 15 Gly Ser Gly Ser Ala Thr Gly Gly Ser Gly Ser Thr Ala Ser Ser Gly 20 25 30 Ser Gly Ser Ala Thr His Gln Glu Glu Cys Glu Leu Ala Pro Trp Thr 35 40 45 Cys Glu His Met Leu Glu 50 <210> 34 <211> 54 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic construct <400> 34 Ala Gln Gln Glu Glu Cys Glu Phe Ala Pro Trp Thr Cys Glu His Met 1 5 10 15 Gly Ser Gly Ser Ala Thr Gly Gly Ser Gly Ser Thr Ala Ser Ser Gly 20 25 30 Ser Gly Ser Ala Thr His Gln Glu Glu Cys Glu Phe Ser Pro Trp Thr 35 40 45 Cys Glu His Met Leu Glu 50 <210> 35 <211> 28 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic construct <400> 35 Asn Phe Tyr Gln Cys Ile Glu Met Leu Ala Ser His Pro Ala Glu Lys 1 5 10 15 Ser Arg Gly Gln Trp Gln Glu Cys Arg Thr Gly Gly 20 25 <210> 36 <211> 28 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic construct <400> 36 Asn Phe Tyr Gln Cys Ile Glu Gln Leu Ala Leu Arg Pro Ala Glu Lys 1 5 10 15 Ser Arg Gly Gln Trp Gln Glu Cys Arg Thr Gly Gly 20 25 <210> 37 <211> 28 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic construct <400> 37 Asn Phe Tyr Gln Cys Ile Asp Leu Leu Met Ala Tyr Pro Ala Glu Lys 1 5 10 15 Ser Arg Gly Gln Trp Gln Glu Cys Arg Thr Gly Gly 20 25 <210> 38 <211> 28 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic construct <400> 38 Asn Phe Tyr Gln Cys Ile Glu Arg Leu Val Thr Gly Pro Ala Glu Lys 1 5 10 15 Ser Arg Gly Gln Trp Gln Glu Cys Arg Thr Gly Gly 20 25 <210> 39 <211> 28 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic construct <400> 39 Asn Phe Tyr Gln Cys Ile Glu Tyr Leu Ala Met Lys Pro Ala Glu Lys 1 5 10 15 Ser Arg Gly Gln Trp Gln Glu Cys Arg Thr Gly Gly 20 25 <210> 40 <211> 28 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic construct <400> 40 Asn Phe Tyr Gln Cys Ile Glu Ala Leu Gln Ser Arg Pro Ala Glu Lys 1 5 10 15 Ser Arg Gly Gln Trp Gln Glu Cys Arg Thr Gly Gly 20 25 <210> 41 <211> 28 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic construct <400> 41 Asn Phe Tyr Gln Cys Ile Glu Ala Leu Ser Arg Ser Pro Ala Glu Lys 1 5 10 15 Ser Arg Gly Gln Trp Gln Glu Cys Arg Thr Gly Gly 20 25 <210> 42 <211> 27 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic construct <400> 42 Asn Phe Tyr Gln Cys Ile Glu His Leu Ser Gly Ser Pro Ala Glu Lys 1 5 10 15 Ser Arg Gly Gln Trp Gln Glu Cys Arg Thr Gly 20 25 <210> 43 <211> 27 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic construct <400> 43 Asn Phe Tyr Gln Cys Ile Glu Ser Leu Ala Gly Gly Pro Ala Glu Lys 1 5 10 15 Ser Arg Gly Gln Trp Gln Glu Cys Arg Thr Gly 20 25 <210> 44 <211> 27 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic construct <400> 44 Asn Phe Tyr Gln Cys Ile Glu Ala Leu Val Gly Val Pro Ala Glu Lys 1 5 10 15 Ser Arg Gly Gln Trp Gln Glu Cys Arg Thr Gly 20 25 <210> 45 <211> 27 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic construct <400> 45 Asn Phe Tyr Gln Cys Ile Glu Met Leu Ser Leu Pro Pro Ala Glu Lys 1 5 10 15 Ser Arg Gly Gln Trp Gln Glu Cys Arg Thr Gly 20 25 <210> 46 <211> 27 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic construct <400> 46 Asn Phe Tyr Gln Cys Ile Glu Val Phe Trp Gly Arg Pro Ala Glu Lys 1 5 10 15 Ser Arg Gly Gln Trp Gln Glu Cys Arg Thr Gly 20 25 <210> 47 <211> 27 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic construct <400> 47 Asn Phe Tyr Gln Cys Ile Glu Gln Leu Ser Ser Gly Pro Ala Glu Lys 1 5 10 15 Ser Arg Gly Gln Trp Gln Glu Cys Arg Thr Gly 20 25 <210> 48 <211> 27 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic construct <400> 48 Asn Phe Tyr Gln Cys Ile Glu Leu Leu Ser Ala Arg Pro Ala Glu Lys 1 5 10 15 Ser Arg Gly Gln Trp Ala Glu Cys Arg Ala Gly 20 25 <210> 49 <211> 27 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic construct <400> 49 Asn Phe Tyr Gln Cys Ile Glu Ala Leu Ala Arg Thr Pro Ala Glu Lys 1 5 10 15 Ser Arg Gly Gln Trp Val Glu Cys Arg Ala Pro 20 25 <210> 50 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic construct <400> 50 gtggagtgca gggcgccg 18 <210> 51 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic construct <400> 51 Val Glu Cys Arg Ala Pro 1 5 <210> 52 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic construct <400> 52 gctgagtgca gggctggg 18 <210> 53 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic construct <400> 53 Ala Glu Cys Arg Ala Gly 1 5 <210> 54 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic construct <400> 54 caggagtgca ggacgggg 18 <210> 55 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic construct <400> 55 Gln Glu Cys Arg Thr Gly 1 5 <210> 56 <211> 26 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic construct <220> <221> misc_feature <222> (12)..(26) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <400> 56 Met Gly Ala Gln Thr Asn Phe Met Pro Met Asp Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 1 5 10 15 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 20 25 <210> 57 <211> 116 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic construct <220> <221> misc_feature <222> (1)..(50) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (58)..(59) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (67)..(116) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <400> 57 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 1 5 10 15 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 20 25 30 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 35 40 45 Xaa Xaa Ala Gln Gln Glu Glu Cys Glu Xaa Xaa Pro Trp Thr Cys Glu 50 55 60 His Met Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 65 70 75 80 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 85 90 95 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 100 105 110 Xaa Xaa Xaa Xaa 115 <210> 58 <211> 28 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic construct <220> <221> MISC_FEATURE <222> (7)..(7) <223> Xaa is E or D <220> <221> misc_feature <222> (8)..(8) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (10)..(12) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <400> 58 Asn Phe Tyr Gln Cys Ile Xaa Xaa Leu Xaa Xaa Xaa Pro Ala Glu Lys 1 5 10 15 Ser Arg Gly Gln Trp Gln Glu Cys Arg Thr Gly Gly 20 25

Claims (74)

  1. 모듈 인식 도메인(MRD)을 포함하는, 단리된 전체 길이 항체로서, MRD는 2∼60 아미노산이고 MRD의 표적은 안지오포이어틴-2(Ang-2)이며, 항체 조합 부위의 표적은 종양 항원이고, MRD는 항체의 중쇄 C 말단부, 항체의 중쇄 N 말단부, 항체의 경쇄 C 말단부 또는 항체의 경쇄 N 말단부에 작동적으로 연결되고, 여기서 상기 MRD는
    MGAQTNFMPMDDLEQRLYEQFILQQGLE(서열 번호 7),
    MGAQTNFMPMDNDELLLYEQFILQQGLE(서열 번호 8),
    MGAQTNFMPMDATETRLYEQFILQQGLE(서열 번호 9),
    AQQEECEWDPWTCEHMGSGSATGGSGSTASSGSGSATHQEECEWDPWTCEHMLE(서열 번호 10),
    AQQEECEFAPWTCEHM(서열 번호 21),
    AQQEECEFAPWTCEHMGSGSATGGSGSTASSGSGSATHQEECEFAPWTCEHMLE(서열 번호 23),
    AQQEECELAPWTCEHM(서열 번호 24),
    AQQEECELAPWTCEHMGSGSATGGSGSTASSGSGSATHQEECELAPWTCEHMLE(서열 번호 26),
    AQQEECEFSPWTCEHM(서열 번호 27),
    AQQEECEFSPWTCEHMGSGSATGGSGSTASSGSGSATHQEECEFSPWTCEHMLE(서열 번호 29),
    AQQEECELEPWTCEHM(서열 번호 30),
    AQQEECELEPWTCEHMGSGSATGGSGSTASSGSGSATHQEECELEPWTCEHMLE(서열 번호 32),
    AQQEECEFAPWTCEHMGSGSATGGSGSTASSGSGSATHQEECELAPWTCEHMLE(서열 번호 33),
    AQQEECEFAPWTCEHMGSGSATGGSGSTASSGSGSATHQEECEFSPWTCEHMLE(서열 번호 34),
    MGAQTNFMPMDNDELLNYEQFILQQGLE(서열 번호 11) 및
    PXDNDXLLNY(서열 번호 12)(여기서, X는 20종 천연 발생 아미노산 중 하나에서 선택됨)
    로 이루어진 군에서 선택되는 서열로 구성되는 것인 항체.
  2. 제1항에 있어서, 항체와 MRD는 링커 펩티드를 통해 작동적으로 연결되는 것인 항체.
  3. 제2항에 있어서, 링커 펩티드는 2∼20 아미노산인 항체.
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  5. 제2항에 있어서, 링커 펩티드는 GGGS(서열 번호 1), SSGGGGSGGGGGGSS(서열 번호 2), 및 SSGGGGSGGGGGGSSRSS(서열 번호 19)로 이루어진 군에서 선택된 서열을 포함하는 것인 항체.
  6. 삭제
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  8. 제1항에 있어서, MRD는 항체의 경쇄 C 말단부 또는 항체의 경쇄 N 말단부에 작동적으로 연결되는 것인 항체.
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  12. 제1항에 있어서, 2 이상의 MRD가 항체의 임의의 말단부에 작동적으로 연결되거나 또는 2 이상의 MRD가 항체의 2 이상의 말단부에 작동적으로 연결되는 것인 항체.
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  40. 제1항에 있어서, 키메라 또는 인간화된 항체인 항체.
  41. 제40항에 있어서, 항체 조합 부위는 EGFR, ErbB2, ErbB3, ErbB4, CD20, 인슐린 유사 성장 인자-I 수용체, 및 전립선 특이적 막 항원으로 이루어진 군에서 선택된 세포 표면 항원에 결합하는 것인 항체.
  42. 삭제
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  44. 제1항에 있어서, 항체 조합 부위는 ErbB2에 결합하는 것인 항체.
  45. 제44항에 있어서, 트라스투주맙인 항체.
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  53. 제1항에 있어서, MRD는 서열 번호 8로 구성되는 것인 항체.
  54. 제1항 내지 제3항, 제5항, 제8항, 제12항, 제40항, 제41항, 제44항, 제45항 및 제53항 중 어느 하나의 항에 따른 항체를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 단리된 폴리뉴클레오티드.
  55. 제54항에 따른 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터.
  56. 삭제
  57. 제55항에 따른 벡터를 포함하는 숙주 세포, 또는 이 세포의 자손 세포.
  58. 제1항 내지 제3항, 제5항, 제8항, 제12항, 제40항, 제41항, 제44항, 제45항 및 제53항 중 어느 하나의 항의 항체를 포함하는, 암을 치료하는 데 사용하기 위한 약학 조성물.
  59. 삭제
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  67. Ang-2 폴리펩티드 표적을 사용하여 MRD를 선별하는 단계, 및 선별된 MRD를 전체 길이 항체에 융합시키는 단계를 포함하는 제1항 내지 제3항, 제5항, 제8항, 제12항, 제40항, 제41항, 제44항, 제45항 및 제53항 중 어느 하나의 항에 따른 항체를 제조하는 방법으로서, 상기 MRD는 파지 디스플레이 라이브러리, 또는 천연 리간드로부터 유도되고, 항체 조합 부위의 표적은 종양 항원인 제조 방법.
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J. Immunothera., Vol.27(3):211-219 (2004)

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