CN115043946A - 通过模块识别结构域的抗体靶向 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及通过模块识别结构域的抗体靶向。描述了包含用于将抗体靶向到特异性位点的一个或多个模块识别结构域(MRDs)的抗体。也描述了含一个或多个模块识别结构域的抗体治疗疾病的应用和制备含一个或多个模块识别结构域的抗体的方法。

Description

通过模块识别结构域的抗体靶向
本申请是分案申请，基于申请号为201810794874.7的分案申请。原申请的申请日为2008年12月24日，中国申请号为200880127584.1，国际申请号为PCT/US2008/088337，发明名称为“通过模块识别结构域的抗体靶向”。
技术领域
本发明一般涉及包含一个或多个模块识别结构域的抗体，更具体涉及包含一个或多个模块识别结构域的抗体治疗疾病的应用和制备包含一个或多个模块识别结构域的抗体的方法。
背景技术
催化活性单克隆抗体(Abs)可用于选择性前体药物激活和化学转化。具有醛缩酶活性的单克隆抗体已经作为许多化学转化，尤其是醛醇缩合反应和逆醛醇缩合反应的高效催化剂出现。如38C2和93F3的抗体的逆醛缩酶活性已经使得研究人员能够设计、合成和评价多种化疗剂的前体药物，该化疗剂可通过逆醛醇缩合反应激活。(WO 97/21803中描述了38C2的构建，在此引入作为参考)。38C2含有抗体结合部位，其催化脂肪族供体和醛受体之间的醛醇加成反应。在成神经细胞瘤的同源小鼠模型中，鬼臼亚乙苷前体药物的全身给药和38C2的瘤内注射抑制了肿瘤生长。
催化抗体在应用中的一个缺陷在于其缺乏将催化抗体靶向到恶性细胞的装置。以前的研究证明，在抗体导向酶前体药物疗法(ADEPT)或抗体导向的抗体酶前体药物疗法(ADAPT)方法中，酶或催化抗体可通过化学共轭或与靶向抗体重组融合而被导向至肿瘤细胞。但是更有效的选择会是应用融合到定位在抗体结合部位外的靶向肽的催化抗体，从而留下前体药物激活可用的活性位点。例如，抗体38C2与整联蛋白αvβ3-结合肽的融合会选择性地将抗体定位到肿瘤和/或肿瘤血管系统，并在该位点上引发前体药物激活。该方法的潜在疗法得到临床前和第Ill阶段临床数据支持，该数据提出肽可以通过与抗体Fc区域的融合而转变为活药物。
同时靶向两种或更多种癌目标和或激活前体药物的双特异性或多特异性抗体的开发为攻克癌症和其它疾病提供了新颖和有前景的解决方案。该抗体在本申请的图1中例示。同时靶向两种肿瘤相关抗原(如生长因子受体)以下调多细胞增殖/存活途径的双特异性抗体(BsAb)的研究已经为本方法提供了支持。传统上，双特异性抗体通过化学连接两种不同的单克隆抗体或通过融合两种杂交瘤细胞系产生杂种杂交瘤而制备。双特异性、四价IgG样分子或双可变域免疫球蛋白已经从两种单克隆抗体改造而来。这些双可变域免疫球蛋白能在血清存在下结合两种抗原。但是这些方法在制造、产量和纯度方面提出了挑战。
多种重组方法已经发展起来，用于有效生产小BsAb片段，如双抗体、微抗体和Fab-scFv融合蛋白。由于组织渗透更好和从循环中清除更快，这些BsAb片段可能与全长IgG型分子相比对于一些临床应用具有一些优势，如对于肿瘤放射成像和靶向。另一方面，可证实IgG型BsAb对于其它体内应用特别是对于肿瘤指示，通过提供Fc结构域而优选于更小的BsAb片段，该Fc结构域赋予长的血清半衰期并支持二次免疫功能，如抗体依赖性细胞的细胞毒性和补体介导的细胞毒性。不像其片段对应物，重组IgG型BsAb的工程改造和生产却由于其大尺寸(～150-200kDa)和结构复杂性遭遇技术挑战。由动物模型的成功应用判定的本领域成功是非常有限的。最近，通过对多种构建物的检测，包含Fc结构域的BsAb分子在哺乳动物中的有效表达取得了一些进展。
另一种已用于靶向抗体的方法是通过利用肽抗体。肽抗体本质上是肽和抗体Fc区域的融合。鉴于用随机肽库为多种靶标寻找高亲和性肽配体的研究取得的成功，该肽和抗体Fc区域的融合提供了通过以增加的效价增大循环半衰期和活性而将肽制成治疗备选剂的方法。
蛋白质与其它分子的相互作用是生物化学的基础。蛋白质的相互作用包括受体-配体的相互作用、抗体-抗原的相互作用、细胞-细胞接触和病原与靶组织的相互作用。蛋白质的相互作用可包括和其它蛋白质、碳水化合物、低聚糖、脂质、金属离子和类似物的接触。蛋白质相互作用的基本单位为参与接触和识别的蛋白区域，被称为结合位点或目标位点。
得自噬菌体展示文库的肽通常在连接到其它分子时保留其结合特性。该类型的特异肽可作为模块特异性块(modular specificity block)或分子识别结构域(MRDs)处理，其可以结合起来产生对一些限定的靶标具有结合特异性的单一蛋白质。
该限定的靶位点的实例为整联蛋白。整联蛋白是跨膜细胞粘附受体家族，该受体家族由α和β亚基组成，并调控在胞外基质中细胞与蛋白质的附着。目前，已知十八种α和八种β亚基，其形成24种不同的对多种ECM细胞粘附蛋白具有不同特异性的αβ异源二聚体。不同整联蛋白的配体包括纤连蛋白、胶原蛋白、层粘连蛋白、血管性血友病因子、骨桥蛋白、血小板反应蛋白和玻连蛋白，这些配体都是ECM的组分。某些整联蛋白也可结合到如纤维蛋白原的可溶性配体或结合到相邻细胞上的其它粘附分子。已知整联蛋白存在于不同的激活状态，对配体显示出不同的亲和力。整联蛋白识别可溶性配体严格取决于受体构象的具体变化。这提供了控制细胞以整联蛋白依赖性方式聚集和在血管系统动态流动条件下停滞的能力的分子开关。该机制对于白细胞和血小板被充分确立，血小板在血流中以静止状态循环同时表达非激活的整联蛋白。一旦受促炎或促凝激动剂(prothrombotic agonists)刺激时，这些细胞类型迅速通过许多分子变化作出反应，包括关键整联蛋白、β2整联蛋白对白细胞，αvβ3对血小板的开关作用，从“休眠”到“激活”构象。这使这些细胞类型在血管系统中停滞，促使细胞粘合并导致血栓形成。
已证明人类乳腺癌细胞的转移性亚基以组成型激活形式表达整联蛋白αvβ3。该αvβ3异常表达在乳腺癌及前列腺癌、黑色素瘤和成神经细胞瘤转移中发挥作用。激活的受体大力促进癌细胞的迁移，并使细胞能够在血流动条件下停滞。在这种方式下，αvβ3的激活赋予转移性细胞对于靶器官的成功传播和定居可能重要的关键性能。已成功进入靶器官的肿瘤细胞可能进一步利用αvβ3在新环境中壮大，因为αvβ3基质的相互作用可促进细胞存活和增殖。例如，αvβ3结合骨桥蛋白在乳腺癌中促进了恶性和与不良预后相关的骨桥蛋白的升高水平。
基于这些理由及其在血管发生中确立的作用，αvβ3整联蛋白是最受广泛研究的整联蛋白之一。该分子的拮抗物在靶向药物递送的应用中具有巨大的潜力。一种已用于靶向αvβ3整联蛋白的方法应用含有Arg-Gly-Asp(RGD)序列的肽与αvβ3的高结合特异性。该自然存在于胞外基质蛋白中的三肽是αvβ3整联蛋白的主要结合位点。但是由于血液清除快，肾脏和肝脏吸收高及肿瘤洗出快，基于RGD的报道探针存在问题。已被显实循环的RGD肽的化学修饰增加其稳定性和效价。然后连接这些修饰肽到放射性同位素，并用于肿瘤成像或抑制肿瘤生长。
整联蛋白αvβ3是最充分表征的整联蛋白异源二聚体之一和涉及肿瘤-诱导血管发生的几种异源二聚体之一。当在成熟的血管中少量表达时，αvβ3在体内血管发生期间被显著上调。αvβ3的表达与乳腺癌和子宫癌以及恶性黑色素瘤的疾病进攻性有关系。近期的研究提出，对于一些肿瘤αvβ3可用作诊断或预后指示物。整联蛋白αvβ3由于其相对有限的细胞分布，作为治疗靶标尤其引人注意。其一般不在上皮细胞上表达，在其它类型细胞上最低限度地表达。此外，包括循环RGD肽和单克隆抗体在内的αvβ3拮抗物显著抑制细胞因子诱导的血管发生和鸡尿囊绒膜上实体肿瘤的生长。
另一种整联蛋白异源二聚物αvβ5在恶性肿瘤细胞中更为广泛表达，且可能涉及VEGF-介导的血管发生。已经显示，αvβ3和αvβ5通过不同的途径促进血管发生：αvβ3通过bFGF和TNF-a，αvβ5通过VEGF和TGF-α。也已经显示，Src激酶的抑制作用可阻断VEGF-诱导的而非FGF2-诱导的血管发生。这些结果强烈意味着，FGF2和VEGF激活了不同的血管发生途径，分别需要αvβ3和αvβ5。
整联蛋白也涉及肿瘤转移。转移是肿瘤发病和死亡的主要原因。黑色素瘤、神经胶质瘤、卵巢和乳腺癌的恶性进展都已大大与整联蛋白αvβ3的表达，某些情况下与αvβ5的表达联系起来。更近阶段，已经显示整联蛋白αvβ3的激活在人类乳腺癌转移中发挥显著作用。已注意到αvβ3的表达和乳腺癌转移之间强烈的关联性，其中正常的乳腺上皮细胞是αvβ3阴性的，约50％的侵入性小叶癌以及乳腺癌中的几乎所有骨转移表达αvβ3。已经显示，循环肽对αvβ3的拮抗作用在涉及乳腺癌异种移植物的研究中与放射免疫疗法协同作用。
血管发生——由现有血管生成新血管——可能对生理过程和病理过程是必不可少的。通常，血管发生由前血管生成因子和抗血管生成因子严格调控，但是在如癌症、眼部新生血管性疾病、关节炎和牛皮癣的疾病的情况下，该过程会出现偏差。血管发生和疾病的相关性使得发现抗血管生成化合物具有吸引力。迄今为止所描述的最有希望的噬菌体产生的抗血管生成肽由Amgen开发，其抑制了血管生成细胞因子Ang2。
尽管VEGFs及其受体已成为血管发生领域里最广泛的靶向分子之一，靶向更近期发现的血管生成素-Tie2途径的临床前研究在进行之中。两种蛋白质家族都涉及配体受体的相互作用，两者都包括膜，它们的功能很大程度上后天受制于内皮细胞和一些造血干细胞谱系。Tie-2是带有四个已知配体的受体酪氨酸激酶，四个已知配体是血管生成素-1(Ang1)到血管生成素-4(Ang4)，研究得最好的是Angl和Ang2。Ang1刺激Tie2磷酸化，已经证实Ang2和Tie2的相互作用拮抗和激动Tie2受体磷酸化作用。在正常或病态的后天血管发生位点上升高的Ang2表达依据情况暗示对Ang2的促血管生成作用。与血管发生相关的血管-选择性Ang2诱导已经在包括癌症在内的疾病中得到证明。在结肠癌患者中，Ang2在肿瘤上皮细胞中普遍表达，然而经显示Ang1在肿瘤上皮细胞中的表达很少。已经提出，Ang2活性的净增加是肿瘤血管发生的启动因素。
针对细胞受体的其它融合蛋白受到临床评价。由Genentech开发的赫赛汀(曲妥单抗)，是重组人源化单克隆抗体，该抗体针对人表皮细胞酪氨酸激酶受体2(HER2或ErbB2)的胞外结构域。该HER2基因在25％的侵袭性乳腺癌中过度表达，并与不良预后和对化疗剂敏感性的改变相关。赫赛汀阻断了过度表达ErbB2的乳腺癌的增殖，并目前是由FDA批准用于治疗ErbB2过度表达的转移性乳腺癌(MBC)的唯一ErbB2靶向抗体治疗。在正常的成人细胞中，细胞表面上几乎没有ErbB2分子存在，每个细胞～20,000个，因此几乎没有异源二聚体形成，生长信号相对较弱且可控。当ErbB2过度表达时——每个细胞～500,000个，多个ErbB2异源二聚体形成且细胞信号传导较强，从而导致对生长因子的响应增强和恶性生长。这解释了ErbB2过度表达是乳腺癌不良预后的指示的原因并可对治疗的响应作出预测。
ErbB2是乳腺癌有前景并有效的靶标，在原发性肿瘤和转移位点均有发现。赫赛汀诱导ErbB2从细胞表面迅速移除，从而降低其对异源二聚体化和促进生长的可用性。在体外和体内实验模型中观测的赫赛汀的作用机制包括对ErbB2胞外结构域的蛋白质水解的抑制、对如磷脂酰肌醇3-激酶(P13K)和有丝分裂原激活的蛋白激酶(MAPK)级联在内的下游信号传导途径的中断、GI细胞周期阻滞、DNA修复的抑制、对由抗体依赖细胞的细胞毒性(ADCC)引发的血管发生和诱导的抑制。但是大多数起初对赫赛汀有反应的转移性乳腺癌患者，在治疗开始一年内显示出疾病的进展。
另一种靶细胞受体是1型胰岛素样生长因子-1受体(IGF-1R)，IGF-1R是受体-酪氨酸激酶，该激酶在细胞存活和增殖信号传导中起着关键作用。该IGF体系由于涉及IGF-I或-II和/或IGF-1R过度表达的自分泌环的建立常常在癌细胞中被失调。此外，流行病学研究已经提出IGF水平提高和如乳腺癌、结肠癌、肺癌和前列腺癌的主要人类癌症的发展之间的联系。IGFs及其同源受体的表达已经与疾病阶段、降低的存活率、转移的发展和肿瘤去分化联系起来。
除了IGF-1R，表皮细胞生长因子受体(EGFR)也已经涉及在多种癌症的肿瘤发生中。利用拮抗任一种受体活性的许多策略，有效的肿瘤抑制已经在实验上和临床上实现。由于肿瘤细胞中生长信号传导途径的冗余，一种受体功能(如EGFR)的抑制可由其它生长因子受体(如IGF-1R)-介导的途径的上调而被有效补偿。例如，一项最新研究显示，表达等同EGFR的恶性神经胶质瘤细胞系取决于其激活IGF-1R及其下游信号传导途径的能力对EGFR抑制具有显著不同的敏感性。其它研究也证明，肿瘤细胞中IGF-1R的过度表达和/或激活可能有助于其对化疗剂、辐射或如赫赛汀的抗体疗法的耐受性。因此，IGF-1R信号传导的抑制导致了肿瘤细胞对赫赛汀敏感性增加。
EGFR是受体酪氨酸激酶，在许多正常组织及大多数器官的肿瘤病灶上表达。EGFR的过度表达或EGFR突变形式的表达在许多肿瘤尤其上皮细胞肿瘤中观察到，并与不良临床预后相关。通过该受体进行的信号传导的抑制诱导抗肿瘤作用。由于2004年2月FDA批准了西妥昔单抗，西妥昔单抗也被称为艾比特思(小鼠/人类嵌合抗体)，EGFR成为被批准的靶向治疗转移性结肠直肠癌的抗体药物。在2006年3月，艾比特思也得到FDA的批准用于治疗头颈部鳞状细胞癌(SCCHN)。更近阶段，Vectibix——针对EGFR的完全人类抗体——经批准治疗转移性结肠直肠癌。没有药物在结肠直肠癌治疗中是独立药剂——其获批作为现有结肠直肠治疗方案的附加药物。在结肠直肠癌中，结合药物依立替康给予艾比特思，以及在疾病进展后，在含氟嘧啶、奥沙利铂、伊立替康的化疗方案中或在含氟嘧啶、奥沙利铂、伊立替康的化疗方案后，给予Vectibix。艾比特思已得到批准作为单独药剂应用于复发或转移性SCCHN——仅在先前的铂基化疗失败的情况下。使用这些药物靶向非小细胞肺癌的晚期临床试验正在进行中。艾比特思或EGFR抗体的序列在本领域公知，(例如参见Goldstein,etal.,Clin.Cancer Res.1:1311,1995；美国专利号6,217,866)，在此引入作为参考。
在癌症治疗中利用催化抗体进行选择性前体药物激活的阻碍是全身肿瘤靶向。本发明说明了基于对目标结合肽或模块识别结构域(MRDs)适应的方法，目标结合肽或模块识别结构域(MRDs)与有效靶向肿瘤细胞或可溶性分子的全长抗体融合，同时保留催化抗体的前体药物活化能力。因为MRDs融合到抗体，不会显著削弱与抗体常规结合位点的结合，加入MRD后抗体特异性保持完整。
如图2所示，由三角形，圆形和正方形指定的MRDs，可被附于典型抗体重链或轻链的任何末端。第一个示意图表示带有融合到Fc的C-末端的肽的简单肽抗体。提供的该方法用于二、三、四、五特异性抗体的制备。在IgG的每个N-和C-末端单个MRD的显示提供了MRD的八价显示。作为通过抗体可变结构域的组合来构建双功能和多功能抗体的替代，选自噬菌体展示文库或得自天然配体的高亲和性肽可以为多功能抗体的构建提供高度通用和模块化的方法，该多功能抗体保持了传统抗体的结合和半衰期优势。MRDs也能增大非催化抗体的结合力，为增强抗体结合功能特别是用于治疗目的提供了有效方法。
发明内容
本发明涉及全长抗体，该抗体包括模块识别结构域(MRD)。本发明也具体实施了包含MRD的该抗体的变体和衍生物。
一方面，该抗体和MRD通过连接肽可操作地连接。一方面，该连接肽长为2到20个肽之间或4到10个肽之间或约4-15个肽。本发明一方面，该连接肽包括序列GGGS(SEQ ID.NO.:1)，序列SSGGGGSGGGGGGSS(SEQ ID.NO.:2)，或序列SSGGGGSGGGGGGSSRSS(SEQ ID NO.:19)。包含如SEQ ID NO:1所示核心序列GGGS的其它连接体也包括在本文中，其中连接肽为约4-20个氨基酸。
根据本发明的另一个实施方式，MRD可操作地连接到抗体重链的C-末端。另一方面，MRD可操作地连接到抗体重链的N-末端。还有另一方面，MRD可操作地连接到抗体轻链的C-末端。另一方面，MRD可操作地连接到抗体轻链的N-末端。另一方面，两个或多个MRDs可操作地连接到抗体的任意末端。另一方面，两个或多个MRDs可操作地连接到抗体的两个或多个末端。
在本发明的一个实施方式中，MRD的靶标是细胞抗原。在本发明的一个实施方式中，MRD的靶标是CD20。
在本发明的一个实施方式中，MRD的靶标是整联蛋白。一方面，整联蛋白的靶向MRD的肽序列是YCRGDCT(SEQ ID.NO.:3)。另一方面，整联蛋白的靶向MRD的肽序列是PCRGDCL(SEQ ID.NO.:4)。另一方面，整联蛋白靶向MRD的肽序列是TCRGDCY(SEQ ID.NO.:5)。另一方面，整联蛋白的靶向MRD的肽序列是LCRGDCF(SEQ ID.NO.:6)。
在本发明的一个实施方式中，MRD的靶标是血管生成细胞因子。一方面，血管生成细胞因子的靶向MRD的肽序列是MGAQTNFMPMDDLEQRLYEQFILQQGLE(SEQ ID.NO.:7)。另一方面，血管生成细胞因子的靶向MRD的肽序列是MGAQTNFMPMDNDELLLYEQFILQQGLE(SEQID.NO.:8)。还有另一方面，血管生成细胞因子的靶向MRD的肽序列是MGAQTNFMPMDATETRLYEQFILQQGLE(SEQ ID.NO.:9)。另一方面，血管生成细胞因子的靶向MRD的肽序列是AQQEECEWDPWTCEHMGSGSATGGSGSTASSGSGSATHQEECEWDPWTCEHML E(SEQ ID.NO.:10)。另一方面，血管生成细胞因子的靶向MRD的肽序列是MGAQTNFMPMDNDELLNYEQFILQQGLE(SEQ ID.NO.:11)。另一方面，血管生成细胞因子的靶向MRD的肽序列是PXDNDXLLNY(SEQID.NO.:12)，其中X是20种天然存在的氨基酸之一。在其它实施方式中，靶向MRD肽具有核心序列MGAQTNFMPMDXn(SEQ ID NO:56)，其中X是任意氨基酸，n为约0到15。
在其它实施方式中，靶向MRD肽包含核心序列，该序列选自：
XnEFAPWTXn，其中n为约0到50个氨基酸残基(SEQ ID NO:22)；
XnELAPWTXn，其中n为约0到50个氨基酸残基(SEQ ID NO:25)；
XnEFSPWTXn，其中n为约0到50个氨基酸残基(SEQ ID NO:28)；
XnELEPWTXn，其中n为约0到50个氨基酸残基(SEQ ID NO:31)；和
Xn AQQEECEX1X2PWTCEHMXn，其中n为约0到50个氨基酸残基，且X、X1和X2为任意氨基酸(SEQ ID NO:57)。
包含这些核心肽的典型肽包括例如：
AQQEECEFAPWTCEHM(SEQ ID NO:21)；
AQQEECEFAPWTCEHMGSGSATGGSGSTASSGSGSATHQEECEFAPWTCEH MLE(SEQ ID NO:23)；
AQQEECELAPWTCEHM(SEQ ID NO:24)；
AQQEECELAPWTCEHMGSGSATGGSGSTASSGSGSATHQEECELAPWTCEH MLE(SEQ ID NO:26)；
AQQEECEFSPWTCEHM(SEQ ID NO:27)；
AQQEECEFSPWTCEHMGSGSATGGSGSTASSGSGSATHQEECEFSPWTCEHM LE 2xConFS(SEQID NO:29)；
AQQEECELEPWTCEHM(SEQ ID NO:30)；
AQQEECELEPWTCEHMGSGSATGGSGSTASSGSGSATHQEECELEPWTCEHM LE(SEQ ID NO:32)；
AQQEECEFAPWTCEHMGSGSATGGSGSTASSGSGSATHQEECELAPWTCEH MLE(SEQ ID NO:33)；
AQQEECEFAPWTCEHMGSGSATGGSGSTASSGSGSATHQEECEFSPWTCEHM LE(SEQ ID NO:34)；和
AQQEECEWDPWTCEHMGSGSATGGSGSTASSGSGSATHQEECEWDPWTCEH MLE(SEQ ID.NO.:10)。
在本发明的一个实施方式中，MRD的靶标是ErbB2。在本发明的一个实施方式中，MRD的靶标是ErbB3。在本发明的一个实施方式中，MRD的靶标是肿瘤相关表面抗原上皮细胞粘附分子(Ep-CAM)。
在本发明的一个实施方式中，MRD的靶标是VEGF。一方面，VEGF的靶向MRD的肽序列是VEPNCDIHVMWEWECFERL(SEQ ID.NO.:13)。
在本发明的一个实施方式中，MRD的靶标是胰岛素样生长因子-I受体。一方面，胰岛素样生长因子-I受体的靶向MRD的肽序列是SFYSCLESLVNGPAEKSRGQWDGCRKK(SEQ ID NO:14)。其它示例性IGF-1R的靶向MRDs包括，如具有式NFYQCIX1X2LX3X4X5PAEKSRGQWQECRTGG(SEQ ID NO:58)的肽，其中X1是E或D；X2是任意氨基酸；X3是任意氨基酸；X4是任意氨基酸，X5是任意氨基酸。
包含所述式的示例性肽包括：
NFYQCIEMLASHPAEKSRGQWQECRTGG(SEQ ID NO:35)；
NFYQCIEQLALRPAEKSRGQWQECRTGG(SEQ ID NO:36)；
NFYQCIDLLMAYPAEKSRGQWQECRTGG(SEQ ID NO:37)；
NFYQCIERLVTGPAEKSRGQWQECRTGG(SEQ ID NO:38)；
NFYQCIEYLAMKPAEKSRGQWQECRTGG(SEQ ID NO:39)；
NFYQCIEALQSRPAEKSRGQWQECRTGG(SEQ ID NO:40)；
NFYQCIEALSRSPAEKSRGQWQECRTGG(SEQ ID NO:41)；
NFYQCIEHLSGSPAEKSRGQWQECRTG(SEQ ID NO:42)；
NFYQCIESLAGGPAEKSRGQWQECRTG(SEQ ID NO:43)；
NFYQCIEALVGVPAEKSRGQWQECRTG(SEQ ID NO:44)；
NFYQCIEMLSLPPAEKSRGQWQECRTG(SEQ ID NO:45)；
NFYQCIEVFWGRPAEKSRGQWQECRTG(SEQ ID NO:46)；
NFYQCIEQLSSGPAEKSRGQWQECRTG(SEQ ID NO:47)；
NFYQCIELLSARPAEKSRGQWAECRAG(SEQ ID NO:48)；和
NFYQCIEALARTPAEKSRGQWVECRAP(SEQ ID NO:49)。
在本发明的一个实施方式中，MRD的靶标是肿瘤抗原。
在本发明的一个实施方式中，MRD的靶标是表皮细胞生长因子受体(EGFR)。在本发明的一个实施方式中，MRD的靶标是血管生成因子。在本发明的一个实施方式中，MRD的靶标是血管生成受体。
在本发明的一个实施方式中，MRD是血管归巢肽。一方面，血管归巢肽的肽序列是ACDCRGDCFCG(SEQ ID.NO:15)。
在本发明的一个实施方式中，MRD的靶标是神经生长因子。在本发明的一个实施方式中，抗体结合细胞表面抗原。
在本发明的一个实施方式中，抗体或MRD结合EGFR、ErbB2、ErbB3、ErbB4、CD20、胰岛素样生长因子-I受体、或前列腺特异性膜抗原。一方面，EGFR靶向MRD的肽序列是VDNKFNKELEKAYNEIRNLPNLNGWQMTAFIASLVDDPSQSANLLAEAKKLNDAQAPK(SEQ ID NO:16)。一方面，EGFR靶向MRD的肽序列是VDNKFNKEMWIAWEEIRNLPNLNGWQMTAFIASLVDDPSQSANLLAEAKKLNDAQAPK(SEQ ID NO:17)。本发明中一方面，ErbB2靶向MRD的肽序列是VDNKFNKEMRNAYWEIALLPNLNNQQKRAFIRSLYDDPSQSANLLAEAKKLNDAQAPK(SEQ ID NO:18)。
在本发明的一个实施方式中，抗体结合血管生成因子。
在本发明的一个实施方式中，抗体结合血管生成受体。
本发明也涉及分离的多核苷酸，该多核苷酸包括抗体的核苷酸序列。在本发明的一方面，载体包括多核苷酸。另一方面，多核苷酸与调节序列可操作地连接，该序列控制多核苷酸的表达。一方面，宿主细胞包括多核苷酸或子代。
本发明也涉及治疗有所需要的对象的疾病的方法，该方法包括给予含MRD的抗体。一方面，该疾病是癌症。另一方面，不期望的血管发生得到抑制。还有另一方面，血管发生得到调控。还有另一方面，肿瘤生长得到抑制。在另一实施方式中，描述了这样的治疗方法，该方法包括与含MRD的抗体一起给予额外的治疗剂。
本发明也涉及制备含MRD的全长抗体的方法。一方面，MRD得自噬菌体展示文库。另一方面，MRD得自天然配体。
在本发明的一个实施方式中，抗体为嵌合或人源化的。
附图说明
图1显示四价IgG型BsAbs不同设计的示意图。
图2A显示C-末端与Fc融合的典型肽抗体。
图2B显示具有与抗体轻链融合的C-末端MRD的抗体。
图2C显示具有与抗体轻链融合的N-末端MRD的抗体。
图2D显示与抗体各端融合的独特MRD肽的抗体。
图3说明ELISA结果，其中整联蛋白和Ang2通过融合到ang-2靶向MRD的抗整联蛋白抗体结合在一起。
图4说明ELISA结果，其中整联蛋白和Ang2通过融合到ang-2靶向MRD的抗整联蛋白抗体结合在一起。
图5说明ELISA结果，其中抗ErbB2抗体融合到靶向Ang2的MRD。
图6说明ELISA结果，其中Ang2靶向MRD融合到肝细胞生长因子受体结合抗体。
图7说明ELISA结果，其中整联蛋白靶向MRD融合到ErbB2结合抗体。
图8说明ELISA结果，其中整联蛋白靶向MRD融合到肝细胞生长因子受体结合抗体。
图9说明ELISA结果，其中胰岛素样生长因子-I受体靶向MRD融合到ErbB2结合抗体。
图10说明ELISA结果，其中VEGF-靶向MRD融合到ErbB2结合抗体。
图11说明ELISA结果，其中整联蛋白靶向MRD融合到催化抗体。
图12说明ELISA结果，其中Ang-2-靶向MRD融合到催化抗体。
图13说明ELISA结果，其中整联蛋白和Ang-2靶向MRD融合到ErbB2结合抗体。
图14说明ELISA结果，其中整联蛋白靶向MRD融合到ErbB2-结合抗体。
图15说明ELISA结果，其中整联蛋白、Ang-2或胰岛素样生长因子-I受体-靶向MRD利用短连接肽融合到ErbB2或肝细胞生长因子受体-结合抗体。
图16说明ELISA结果，其中整联蛋白、Ang-2或胰岛素样生长因子-I受体-靶向MRD利用长连接肽融合到ErbB2或肝细胞生长因子受体-结合抗体。
具体实施方式
这里用到的术语“抗体”指完整的免疫球蛋白分子，包括多克隆和单克隆抗体，嵌合的、单链和人源化抗体。完整的抗体包括通过二硫键相互连接的至少两条重(H)链和两条轻(L)链。每条重链由重链可变区(这里简写为VH)和重链恒定区组成。重链恒定区由三个结构域组成，CH1、CH2和CH3。每条轻链由轻链可变区(这里简写为VL)和轻链恒定区组成。轻链恒定区由一个结构域CL组成。VH和VL区可再分成高可变区，被称为互补决定区(CDR)，夹杂着更保守的区域，被称为骨架区(FR)。每个VH和VL由三个CDRs和四个FRs组成，从氨基-末端到羧基-末端依下列次序排序：FR1，CDR1，FR2，CDR2，FR3，CDR3，FR4。重链和轻链的可变区含有结合结构域，其与抗原相互作用。
这里用到的“双特异性抗体“指这样的免疫球蛋白分子，该分子含有双可变结构域免疫球蛋白，其中双可变结构域可由任意两个单克隆抗体改造得到。
“抗体结合位点”是抗体分子的结构性部分，由重链和轻链的可变区和高变区组成，与抗原特异性结合(与抗原发生免疫反应)。术语“免疫反应”在其多种形式下表示含抗原决定簇的分子和含抗体结合位点的分子——如整个抗体分子或其部分——之间的特异性结合。
术语“肽抗体”指包括少于一个完整、无缺抗体的肽或多肽。
术语“天然存在的”用于有关生物质，如核酸分子、多肽、宿主细胞和类似物时，指在自然界发现、没有被人类修饰的物质。
“单克隆抗体”指抗体分子群，该抗体分子只含有一种能与特定抗原表位发生免疫反应的抗体结合位点。因而单克隆抗体一般对与其发生免疫反应的任何抗原表位显示出单一结合亲和力。单克隆抗体可能因此包含具有多个抗体结合位点的抗体分子，每个抗体结合位点对不同的抗原表位具有免疫特异性，如双特异性单克隆抗体。
“模块识别结构域”(MRD)或“靶结合肽”是诸如蛋白质、糖蛋白和类似物的分子，能特异性(非随机)结合靶分子。MRD位点的氨基酸序列能耐受某些程度的变化，仍保持一定程度的结合靶分子的能力。此外，序列的变化会导致结合特异性和预选靶分子和结合位点间结合常数的变化。
“细胞表面受体”指能接收信号和穿过细胞质膜传递该信号的分子及分子复合物。本发明的细胞表面受体的实例是激活的整联蛋白受体，例如，转移性细胞上激活的αvβ3整联蛋白受体。
“靶结合位点”或“靶位点”是任何已知或尚未予以描述的氨基酸序列，该序列具有选择性结合预选药剂的能力。典型的参考靶位点得自RGD-依赖性整联蛋白配体，即纤连蛋白、纤维蛋白原、玻连蛋白、血管性血友病因子和类似物，得自诸如VEGF、ErbB2、血管归巢肽或血管生成细胞因子的细胞受体，得自诸如胰岛素样生长因子-I受体、表皮细胞生长因子受体和类似受体的蛋白质激素受体以及得自肿瘤抗原。
术语“蛋白质”定义为含有单元的生物聚合物，该单元来自通过肽键连接的氨基酸；蛋白质可由两条或多条链组成。
“融合多肽”是由至少两个多肽和任选地连接序列组成的多肽，该连接序列将两个多肽可操作地连结成一个连续的多肽。这两个连结成融合多肽的多肽一般由两个独立的来源得到，因此融合多肽包含两个在自然界通常未发现连接在一起的连接多肽。
术语“连接体”指位于抗体和MRD之间的肽。连接体可具有约2到20个氨基酸，通常4到15个氨基酸。
“靶细胞”指对象(如，人或动物)中任何细胞，该细胞可被包括本发明MRD的抗体靶向。该靶细胞可以是表达或过表达靶结合位点如激活的整联蛋白受体的细胞。
“患者”、“对象(被试者)”、“动物”或“哺乳动物”可交替使用，指哺乳动物，如人类患者和非人类灵长类动物以及实验动物，如兔子、大鼠、小鼠及其它动物。动物包括所有脊椎动物，如，哺乳动物和非哺乳动物，如羊、狗、牛、鸡、两栖动物和爬行动物。
“治疗”或“医疗”包括给予包含本发明MRD的抗体以防止或延迟症状、并发症或疾病的生化标记的发作，减轻该症状或者阻止或抑制该疾病、状况或紊乱的进一步发展。治疗可以是在疾病表现后症状的预防性(防止或延迟疾病发作，或防止其临床或亚临床症状的表现)或治疗性抑制或缓和。治疗可单独使用抗体-MRD组合物，或可以结合额外的治疗剂使用。
这里用到的术语“药学上可接受的”或“生理上耐受的”及其语法变化，当它们指组合物、载体、稀释剂和反应试剂时，可交替使用并表示该物质能够给予人或在人上给药，而不产生不希望的生理效应，如恶心、头晕、胃部不适和类似生理效应。
“调控”表示调整或调节幅度、频率、程度或活性。在另一相关方面，这种调控可为正调控(如，频率、程度或活性的增长)或负调控(如，频率、程度或活性的减少)。
“癌症”、“肿瘤”或“恶性肿瘤”用作同义术语，指由细胞不受控的、异常的增殖，感染的细胞局部传播或通过血流和淋巴系统传播到身体其它部位(转移)的能力及许多特征结构和/或分子特征中任意一种表征的多种疾病中的任意一种。“癌细胞”、“肿瘤细胞”或“恶性细胞”理解为具有特定结构性能、缺乏分化和能侵入和转移的细胞。癌的实例是乳腺癌、肺癌、脑癌、骨癌、肝癌、肾癌、结肠癌、头颈部癌、卵巢癌、造血癌症(如，白血病)和前列腺癌。
“人源化抗体”或“嵌合抗体”包括这样的抗体，其中得自另一种哺乳动物物种如小鼠的生殖系的CDR序列已被植入到人类构架序列。
本发明描述了这样的方法，该方法基于对作为与催化或非催化抗体的融合物的靶结合肽或模块识别结构域(MRDs)的适应，所述靶结合肽或模块识别结构域有效靶向肿瘤细胞或可溶性分子同时使得催化抗体的前体药物激活能力完整无损。MRDs也能增大非催化抗体的结合能力，为增强抗体结合功能特别是用于治疗目的提供了有效方法。
本发明一方面涉及包含模块识别结构域(MRD)的全长抗体的开发。蛋白质配体及其靶受体位点之间的相互作用通常发生在相对大的界面处。但是，只有少数界面处的关键残基有助于大多数结合。因此，一定肽长(一般2到60个氨基酸)的分子可结合到给定大蛋白配体的受体蛋白质。考虑本发明所述的MRDs包含肽序列，其结合到感兴趣的靶位点，且约2到60个氨基酸。
如αvβ3和αvβ5的整联蛋白作为肿瘤相关标记物的功能已有案可稽。一项关于25种建立于晚期卵巢癌的永久人细胞系的最近研究证明，所有细胞系对αvβ5表达呈阳性，多数对αvβ3表达呈阳性。研究还已表明，αvβ3和αvβ5在人恶性宫颈肿瘤组织上高度表达。也已证明整联蛋白在卡波西氏肉瘤、黑色素瘤和乳腺癌动物模型中的治疗效果。
许多整联蛋白αvβ3和αvβ5拮抗物处于临床开发中。其包括环RGD肽和合成的小分子RGD模拟物。两种基于抗体的整联蛋白拮抗物目前处于癌症治疗的临床试验中。第一种是Vitaxin，鼠科抗人类αvβ3抗体LM609的人源化形式。癌症患者中剂量升级阶段I研究证明其用于人类是安全的。另一种临床试验中的抗体是CNT095，完全人类mAb，其识别αv整联蛋白。具有多种实体肿瘤的患者中CNT095的阶段I研究已表明其耐受性良好。Cilengitide——αvβ3和αvβ5的肽拮抗剂，也在阶段I试验中证明是安全的。此外，已有多种药物靶向和成像研究，该研究基于使用这些受体的配体。这些临床前和临床观察证明靶向αvβ3和αvβ5的重要性，且涉及抗体在该策略中应用的研究一致报道通过这些整联蛋白的靶向是安全的。
整联蛋白-结合MRD的实例是含RGD三肽的结合位点，是本文所述一般方法的示例。具有该RGD基序作最小识别结构域的配体是众所周知的，其部分清单包括——括号中附带相应的整联蛋白靶标——纤连蛋白(α3β1、α5β1、αvβ1、αIIbβ3、αvβ3和α3β1)、纤维蛋白原(αMβ2和αIIbβ1)、血管性血友病因子(αIIbβ3和αvβ3)和玻连蛋白(αIIbβ3、αvβ3和αvβ5)。
可用于本发明的包含RGD的靶向MRDs的实例具有如下所示的氨基酸残基序列：
YCRGDCT(SEQ ID.NO.:3)
PCRGDCL(SEQ ID.NO.:4)
TCRGDCY(SEQ ID.NO.:5)
LCRGDCF(SEQ ID.NO.:6)
本发明也考虑这样的MRD，其模拟整联蛋白受体上非RGD-依赖性结合位点并具有识别选定整联蛋白的高亲和性配体的靶结合特异性。
血管发生对于许多生理和病理过程是必不可少的。已显示Ang2起促血管生成分子的作用。Ang2-选择性抑制剂的给药足以抑制肿瘤血管发生和角膜血管发生。因此，单独Ang2抑制作用或结合其它如VEGF的血管生成因子的抑制作用可代表治疗实体肿瘤患者的有效抗血管生成策略。
考虑可用于本发明的MRDs包括那些结合血管生成受体、血管生成因子和/或Ang-2的MRD。下面列出了血管生成细胞因子靶向MRD序列的实例：
MGAQTNFMPMDDLEQRLYEQFILQQGLE(SEQ ID.NO.:7)
MGAQTNFMPMDNDELLLYEQFILQQGLE(SEQ ID.NO.:8)
MGAQTNFMPMDATETRLYEQFILQQGLE(SEQ ID.NO.:9)
AQQEECEWDPWTCEHMGSGSATGGSGSTASSGSGSATHQEECEWDPWTCEHMLE(SEQ ID.NO.:10)(2xCon4)
MGAQTNFMPMDNDELLNYEQFILQQGLE(SEQ ID.NO.:11)
PXDNDXLLNY(SEQ ID.NO.:12)，其中X是20种天然存在的氨基酸的其中一种
MGAQTNFMPMDNDELLLYEQFILQQGLEGGSGSTASSGSGSSLGAQTNFMPMDNDELLLY(SEQ IDNO:20)
AQQEECEWDPWTCEHMGSGSATGGSGSTASSGSGSATHQEECEWDPWTCEHMLE(SEQ ID.NO.:10)
AQQEECEFAPWTCEHM ConFA(SEQ ID NO:21)
核心nEFAPWTn(SEQ ID NO:22)，其中n为约0到50个氨基酸残基
AQQEECEFAPWTCEHMGSGSATGGSGSTASSGSGSATHQEECEFAPWTCEHMLE(SEQ ID NO:23)2xConFA
AQQEECELAPWTCEHM(SEQ ID NO:24)ConLA
XnELAPWTXn，其中n为约0到50个氨基酸残基，且X是任意氨基酸(SEQ ID NO:25)
AQQEECELAPWTCEHMGSGSATGGSGSTASSGSGSATHQEECELAPWTCEHMLE(SEQ ID NO:26)2xConLA
AQQEECEFSPWTCEHM ConFS(SEQ ID NO:27)
XnEFSPWTXn，其中n为约0到50个氨基酸残基，且X是任意氨基酸(SEQ ID NO:28)
AQQEECEFSPWTCEHMGSGSATGGSGSTASSGSGSATHQEECEFSPWTCEHMLE 2xConFS(SEQ IDNO:29)
AQQEECELEPWTCEHM ConLE(SEQ ID NO:30)
XnELEPWTXn，其中n为约0到50个氨基酸残基(SEQ ID NO:31)，且其中X是任意氨基酸
AQQEECELEPWTCEHMGSGSATGGSGSTASSGSGSATHQEECELEPWTCEHMLE 2xConLE(SEQ IDNO:32)
应当理解，该肽在自然界可以以同源或异源二聚体、三聚体或其它多聚体存在。例如，一序列可如以2xConFA形式二聚体化相同的Con-基序列，得到同源二聚体，或可混合该Con肽使得ConFA与ConLA结合，生成ConFA-LA异源二聚物，具有如下序列：
AQQEECEFAPWTCEHMGSGSATGGSGSTASSGSGSATHQEECELAPWTCEHMLE(SEQ ID NO:33)。
另一种异源二聚体是ConFA与ConFS结合，生成ConFA-FS，具有如下序列：
AQQEECEFAPWTCEHMGSGSATGGSGSTASSGSGSATHQEECEFSPWTCEHMLE(SEQ ID NO:34)。
本领域技术人员，鉴于本文的教导，会理解其它这类结合会生成在本文所述的功能性Ang2结合MRDs。
一方面，本发明包括肽，该肽具有序列：
NFYQCIX1X2LX3X4X5PAEKSRGQWQECRTGG(SEQ ID NO:58)，其中X1是E或D；X2是任意氨基酸；X3是任意氨基酸；X4是任意氨基酸及X5是任意氨基酸。
本发明也包括具有核心序列的肽，该序列选自：
XnEFAPWTXn其中n为约0到50个氨基酸残基(SEQ ID NO:22)；
XnELAPWTXn其中n为约0到50个氨基酸残基(SEQ ID NO:25)；
XnEFSPWTXn其中n为约0到50个氨基酸残基(SEQ ID NO:28)；
XnELEPWTXn其中n为约0到50个氨基酸残基(SEQ ID NO:31)；或
Xn AQQEECEX1X2PWTCEHMXn，其中n为约0到50个氨基酸残基，及
X、X1和X2为任意氨基酸(SEQ ID NO:57)。
噬菌体展示选择和与VEGF的复合体中VEGF中和肽的结构研究已报道。这些研究揭示，肽v114(VEPNCDIHVMWEWECFERL)(SEQ ID.NO.:13)是VEGF特异性的，以0.2μM亲和性结合VEGF，并中和人脐静脉内皮细胞(HUVEC)的VEGF-诱导增殖。因为VEGF是同源二聚体，该肽在该VEGF同源二聚体任一端占据两个相同位点。本发明考虑靶向VEGF的含MRD抗体。抗-VEGF抗体可于例如Cancer Research 57,4593-4599,Oct.1997；J Biol Chem 281:10 6625,2006中找到，在此引入作为参考。
胰岛素样生长因子-I受体-特异性MRDs可用于本发明。靶向胰岛素样生长因子-I受体的MRD序列的一个实例是SFYSCLESLVNGPAEKSRGQWDGCRKK(SEQ ID NO.:14)。
其它IGF-1R MRDs包括以下：
NFYQCIEMLASHPAEKSRGQWQECRTGG(SEQ ID NO:35)
NFYQCIEQLALRPAEKSRGQWQECRTGG(SEQ ID NO:36)
NFYQCIDLLMAYPAEKSRGQWQECRTGG(SEQ ID NO:37)
NFYQCIERLVTGPAEKSRGQWQECRTGG(SEQ ID NO:38)
NFYQCIEYLAMKPAEKSRGQWQECRTGG(SEQ ID NO:39)
NFYQCIEALQSRPAEKSRGQWQECRTGG(SEQ ID NO:40)
NFYQCIEALSRSPAEKSRGQWQECRTGG(SEQ ID NO:41)
NFYQCIEHLSGSPAEKSRGQWQECRTG(SEQ ID NO:42)
NFYQCIESLAGGPAEKSRGQWQECRTG(SEQ ID NO:43)
NFYQCIEALVGVPAEKSRGQWQECRTG(SEQ ID NO:44)
NFYQCIEMLSLPPAEKSRGQWQECRTG(SEQ ID NO:45)
NFYQCIEVFWGRPAEKSRGQWQECRTG(SEQ ID NO:46)
NFYQCIEQLSSGPAEKSRGQWQECRTG(SEQ ID NO:47)
NFYQCIELLSARPAEKSRGQWAECRAG(SEQ ID NO:48)
NFYQCIEALARTPAEKSRGQWVECRAP(SEQ ID NO:49)
许多研究已经表征了将血管归巢肽连接到其它蛋白质如IL-I2或药物以引导它们在活体动物中的递送的效果。同样，本发明考虑使用血管归巢MRDs。作为血管归巢肽的MRD序列的一个实例是ACDCRGDCFCG(SEQ ID NO.:15)。
本发明考虑许多其它靶结合位点，包括表皮细胞生长因子受体(EGFR)、CD20、肿瘤抗原、ErbB2、ErbB3、ErbB4、胰岛素样生长因子-I受体、神经生长因子(NGR)、肝细胞生长因子受体和肿瘤相关表面抗原上皮细胞粘附分子(Ep-CAM)。MRDs可导向这些靶结合位点。
下面列出结合到EGFR的MRDs序列的实例：
VDNKFNKELEKAYNEIRNLPNLNGWQMTAFIASLVDDPSQSANLLAEAKKLNDAQAPK(SEQID.NO.:16)。
VDNKFNKEMWIAWEEIRNLPNLNGWQMTAFIASLVDDPSQSANLLAEAKKLNDAQAPK(SEQID.NO.:17)。
下面列出结合到ErbB2的MRDs序列的实例：
VDNKFNKEMRNAYWEIALLPNLNNQQKRAFIRSLYDDPSQSANLLAEAKKLNDAQAPK(SEQID.NO.:18)。
可通过几种方式测定MRD的序列。MRD序列可得自天然配体或可以使用结合到特异性靶结合位点的已知序列。另外，噬菌体展示技术已作为鉴定结合靶受体的肽的强大方法出现。在肽噬菌体展示文库中，可通过与丝状噬菌体的外壳蛋白融合展示随机肽序列。用噬菌体展示载体阐明多肽上结合位点的方法之前已述，具体在WO 94/18221中。该方法一般包括使用丝状噬菌体(噬菌粒)表面表达载体体系进行克隆和表达结合感兴趣的预选靶位点的多肽。
本发明制备MRDs的方法包括噬菌体展示载体的使用，原因在于其提供筛选大量表达的展示蛋白质并从而定位一个或多个编码需要的靶结合反应性的具体克隆的工具的特定优势。一旦阐明了MRD的序列，该肽可通过本领域公开的任何方法制备。
MRDs的变体和衍生物也包括在本发明范围内。包括在变体内的是插入，缺失和置换变体以及包含在N-和/或C-末端有额外氨基酸的这里提出的MRDs的变体，该额外氨基酸包含约0到50个、0到40个、0到30个、0到20个和类似范围的氨基酸。应该理解，本发明特定的MRD可以包含一种、两种或全部三种类型的变体。插入和置换变体可以包含天然氨基酸、非常规氨基酸或两者。
经考虑，本发明可以使用催化和非催化抗体。抗体38C2是抗体-分泌杂交瘤细胞，且之前在WO 97/21803中已述。38C2包含抗体结合位点，其催化脂肪族供体和醛受体之间的醛醇加成反应。在成神经细胞瘤的同源小鼠模型中，依托泊苷前体药物的全身给药和Ab38C2的肿瘤内注射抑制肿瘤生长。
本发明感兴趣的其它抗体包括A33结合抗体。人A33抗原是Ig超家族跨膜糖蛋白。人A33抗原在正常和恶性结肠组织中的功能尚未知，但是，A33抗原的几种性质表明其对于结肠癌免疫治疗是有前景的靶标。这些性质包括(i)A33抗原的高度限制的表达模式，(ii)大量A33抗原在结肠癌细胞上的表达，(iii)分泌或释放的A33抗原缺乏，和(iv)一旦抗体A33结合A33抗原，抗体A33在囊泡中内化和隔离的事实，及(v)在初步临床研究中抗体A33靶向到表达A33抗原的结肠癌。指向A33的MRD与催化或非催化抗体的融合会提高A33靶向抗体的治疗效果。
本发明也考虑单特异性、双特异性、三特异性、四特异性和五特异性抗体的制备。考虑本发明所用抗体可由本领域任何已知方法制备。
在根据本发明制备的抗体-MRD融合分子中，该MRD可通过肽的N-末端或C-末端连接到抗体。该MRD可在抗体重链C-末端、抗体重链N-末端、抗体轻链C-末端或抗体轻链N-末端连接到抗体。该MRD可直接连接到抗体，或通过任意连接肽连接，该连接肽可长为2到20个肽。该连接肽可包含具有序列GGGS(SEQ ID.NO.:1)的短连接肽，具有序列SSGGGGSGGGGGGSS(SEQ ID.NO.:2)的中等连接肽，或具有序列SSGGGGSGGGGGGSSRSS(SEQ ID NO.:19)的长连接肽。本发明也提供了连接到抗体的任意末端的两个或更多个MRDs。也考虑两个或更多个MRDs可直接连接或通过连接肽连接到抗体的两个或更多个末端。多个MRDs可靶向相同的靶结合位点，或两种或多种不同的靶结合位点。可添加额外的肽序列来增强MRD的体内稳定性。
抗体-MRD融合分子可由包括核苷酸序列的多核苷酸编码。载体可包含多核苷酸序列。该多核苷酸序列可与控制多核苷酸在宿主细胞内表达的调节序列连接。宿主细胞或其子代可包含编码抗体-MRD融合分子的多核苷酸。
本发明考虑可用于实践本文所述治疗方法的治疗组合物。本发明所述的治疗组合物包含生理上耐受的载体和至少一种包括在此描述的MRDs的抗体种类，该抗体作为活性组分溶解或分散在其中。在优选实施方式中，该治疗组合物当以治疗为目的向人类患者给药时不是免疫原性的。
含溶解或分散于其中的活性组分的药物组合物的制备在本领域中被充分理解。一般地，此组合物作为无菌注射剂或作为水性或非水性液体溶液或悬浮液制备，但是，也可制备适于使用前液体溶液或悬浮液的固体形式。制备物也可乳化。因此，包含抗体-MRD的组合物可采取溶液、悬浮液、片状、胶囊、缓释制剂或粉末的形式，或其它组合物形式。
活性组分可与赋形剂混合，赋形剂是药学上可接受的并与活性组分相容，且数量适用于本文所述的治疗方法。合适的赋形剂是，例如，水、盐水、葡萄糖、甘油、乙醇或类似物及其组合。此外，如果需要，该组合物可包含少量辅料，如润湿剂或乳化剂、pH缓冲剂和类似物，它们增强活性组分的效力。
本发明的治疗组合物可包括其中组分的药学上可接受的盐。药学上可接受的盐包括酸加成盐(与多肽的自由氨基形成)，其与无机酸如，例如，盐酸或磷酸形成，或与有机酸如醋酸、酒石酸、扁桃酸和类似物形成。与自由羧基形成的盐也可得自无机碱如，例如，氢氧化钠、氢氧化钾、氢氧化铵、氢氧化钙或氢氧化铁，以及有机碱如异丙胺、三甲胺、2-乙基氨基乙醇、组氨酸、普鲁卡因和类似物。
生理上耐受的载体在本领域众所周知。示例性的液体载体是无菌水溶液，其除了活性组分和水外不含任何物质，或含有在生理pH值的如磷酸钠的缓冲物、生理盐水或二者都含，如磷酸盐缓冲盐水。更进一步，水性载体可包含多于一种的缓冲盐，以及盐类如氯化钠和氯化钾、葡萄糖、丙二醇、聚乙二醇及其它溶质。
除了水外或排斥水的情况下，液体组合物也可包含液相。
示例性的此类额外的液相是甘油、诸如棉花籽油的植物油、如油酸乙酯的有机酯和水-油乳剂。
治疗组合物含有包括本发明MRD的抗体，一般地数量是每治疗组合物总重量为至少0.1％抗体重量百分比。重量百分比是抗体重量与组合物总重量之比。因此，例如，0.1％重量百分比是每100克组合物总重量为0.1克抗体-MRD。
含抗体的治疗组合物一般含约10微克(ug)/毫升(ml)到约100毫克(mg)/ml抗体作为每体积组合物的活性组分，更优选地含约1mg/ml到约10mg/ml(如，约0.1％到1％重量百分比)。
另一种实施方式中治疗组合物含本发明的多肽，一般地数量是每治疗组合物总重量为至少0.1％多肽重量百分比。重量百分比是多肽重量与组合物总重量之比。因此，例如，0.1％重量百分比是每100克组合物总重量为0.1克多肽。
优选地，含多肽的治疗组合物一般含有约10微克(ug)/毫升(ml)到约100毫克(mg)/ml多肽，作为每体积组合物的活性成分，并且更加优选含有约1mg/ml到约10mg/ml(即，约0.1％到1％的重量百分比)。
考虑到在人类患者中体内使用人源化或嵌合抗体的益处，现在描述的抗体-MRD分子尤其非常适合作为治疗剂体内使用。该方法包括给予患者治疗有效量的生理上耐受的组合物，该组合物含有包含本发明MRD的抗体。
包含本发明MRD的抗体的给药剂量范围大到足以产生理想的效果，其中由靶分子介导的疾病症状得到改善。该剂量不应大到引起不利副作用，如高粘滞综合症、肺水肿、充血性心力衰竭和类似症状。通常，该剂量随着患者年龄、状况、性别和疾病程度而改变，并能够由本领域技术人员确定。如果发生任何并发症，该剂量可由个人医生调整。
包含本发明MRD的抗体的治疗有效量一般是这样的抗体数量，使得当以生理上耐受的组合物给药时，足以达到约0.1微克(ug)/毫升(ml)到约100ug/ml的血浆浓度，优选约1ug/ml到约5ug/ml，通常约5ug/ml。不同陈述的，该剂量可从约0.1mg/kg到约300mg/kg变化，优选从约0.2mg/kg到约200mg/kg，最优选从约0.5mg/kg到约20mg/kg变化，每日一次或多次剂量给药，持续一天或几天。
包含本发明MRD的抗体可通过注射或随时间推移的逐步输注进行肠胃外进药。虽然靶分子一般可通过全身给药进入身体，因而最常见通过治疗组合物静脉给药处理，但也考虑其它的组织和传送方法，其中有该靶向的组织含有靶分子的可能性。因此，包含本发明MRD的抗体可静脉给药、腹腔内给药、肌肉内给药、皮下给药、腔内给药、经皮给药及可以经蠕动方式传送。
含有本发明人类单克隆抗体或多肽的治疗组合物常规下静脉给药，如单位剂量注射。术语“单位剂量”当关于本发明所述治疗组合物使用时，指适于作为对象单一剂量的物理离散单位，每单位含预定量的活性物质，该活性物质的预定量经计算连同所需稀释剂，即载体或媒介物产生预期治疗效果。
该组合物以剂量制剂协调的方式并以治疗有效量给药。给药量取决于将被治疗的对象、对象系统利用活性组分的能力和预期治疗效果的程度。需要给药的活性组分精确量取决于从业者的判断，且因人而异。但是，对全身应用的合适剂量范围在本文中公开，并取决于给药途径。给药的合适方案也是可变的，但典型是经最初的给药，接着通过随后注射或其它方式给药以一个或多个小时间隔的重复剂量。可选择地，考虑足以将血液内浓度保持在体内治疗规定范围的连续静脉内输注。
以下实施例意为说明而非限定本发明。
实施例
实施例1.整联蛋白靶向抗体-MRD分子
新型抗体-MRD融合分子通过将整联蛋白αvβ3-靶向肽融合到催化抗体38C2而制备。在轻链N-末端和C-末端融合和在重链C-末端融合最有效。利用流式细胞仪，显示该抗体结合物有效结合表达整联蛋白αvβ3的人类乳腺癌细胞。该抗体结合物也保持了其亲代催化抗体38C2的逆醛醇缩合活性，如通过methodol和阿霉素前体药物活化衡量。其证明了细胞靶向和催化抗体性能可有效结合起来用于选择性化疗。
实施例2.血管生成细胞因子靶向抗体-MRD分子
构建了血管生成细胞因子靶向抗体-MRD融合分子。使用的抗体是38C2，该抗体与含2xCon4肽(AQQEECEWDPWTCEHMGSGSATGGSGSTASSGSGSATHQEECEWDPWTCEHMLE(SEQ ID.NO.:10))的MRD融合。该MRD肽融合到轻链的N-或C-末端和重链的C-末端。发现其它Ang-2 MRD肽的类似结果。其它Ang-2 MRD肽包括：
LM-2x-32
MGAQTNFMPMDNDELLLYEQFILQQGLEGGSGSTASSGSGSSLGAQTNFMPMDNDELLLY(SEQ IDNO:20)
AQQEECEWDPWTCEHMGSGSATGGSGSTASSGSGSATHQEECEWDPWTCEHMLE(2xCon4)(SEQID.NO.:10)
AQQEECEFAPWTCEHM ConFA(SEQ ID NO:21)
核心XnEFAPWTXn，其中n为约0到50个氨基酸残基(SEQ ID NO:22)
AQQEECEFAPWTCEHMGSGSATGGSGSTASSGSGSATHQEECEFAPWTCEHMLE 2xConFA(SEQ IDNO:23)
AQQEECELAPWTCEHM ConLA(SEQ ID NO:24)
XnELAPWTXn，其中n为约0到50个氨基酸残基(SEQ ID NO:25)
AQQEECELAPWTCEHMGSGSATGGSGSTASSGSGSATHQEECELAPWTCEHMLE2xConLA(SEQ IDNO:26)
AQQEECEFSPWTCEHM ConFS(SEQ ID NO:27)
XnEFSPWTXn，其中n为约0到50个氨基酸残基(SEQ ID NO:28)
AQQEECEFSPWTCEHMGSGSATGGSGSTASSGSGSATHQEECEFSPWTCEHMLE 2xConFS(SEQ IDNO:29)
AQQEECELEPWTCEHM ConLE(SEQ ID NO:30)
XnELEPWTXn，其中n为约0到50个氨基酸残基(SEQ ID NO:31)
AQQEECELEPWTCEHMGSGSATGGSGSTASSGSGSATHQEECELEPWTCEHMLE 2xConLE(SEQ IDNO:32)。
应当理解，该肽在自然界中可以以同源或异源二聚体、三聚体或其它多聚体存在。例如，一序列可如以2xConFA形式二聚体化相同的Con-基序列，得到同源二聚体，或可混合该Con肽使得ConFA与ConLA结合，生成ConFA-LA异源二聚物，具有如下序列：
AQQEECEFAPWTCEHMGSGSATGGSGSTASSGSGSATHQEECELAPWTCEHMLE(SEQ ID NO:33)。
另一种示例性异源二聚体是ConFA与ConFS结合生成的ConFA-FS，该ConFA-FS具有序列：
AQQEECEFAPWTCEHMGSGSATGGSGSTASSGSGSATHQEECEFSPWTCEHMLE(SEQ ID NO:34)。
鉴于本文的教导，本领域技术人员会理解其它这类结合会生成在本文所述的功能性Ang2结合MRDs。
实施例3.与非催化抗体的抗体-MRD融合
针对人类整联蛋白αvβ3的人源化小鼠单克隆抗体LM609之前已述。(Rader,C.et.al.,1998.Rader C,Cheresh DA,Barbas CF 3rd.Proc Natl Acad Sci U SA.1998Jul 21；95(15):8910-5)。
人类非催化单克隆Ab，JC7U融合到抗Ang2 MRD，该抗Ang2 MRD在轻链的N-或C-末端包含2xCon4(AQQEECEWDPWTCEHMGSGSATGGSGSTASSGS GSATHQEECEWDPWTCEHMLE(SEQID.NO.:10))。研究2xCon4(AQQEECEWDPWTCEHMGSGSATGGSGSTASSGSGSATHQEECEWDPWTCEHMLE(SEQ ID.NO.:10))与抗体κ链的N-末端融合(2xCon4-JC7U)和C-末端融合(JC7U-2xCon4)。两种融合都保持了整联蛋白和Ang2的结合。如图3左图所示，两种抗体构建物(2xCon4-JC7U和JC7U-2xCon4)都特异性结合到重组Ang2，如ELISA研究证明。但是，对于结合到Ang2，JC7U-2xCon4明显更高，该JC7U-2xCon4在抗体轻链C-末端具有2xCon4(SEQ ID.NO.:10)融合。图3右图说明了Ang2-JC7U和JC7U-Ang2与整联蛋白αvβ3的结合。结果显示，2xCon4(SEQID.NO.:10)与轻链N-或C-末端的融合都不影响mAb JC7U结合到整联蛋白αvβ3。图4说明用相同抗体-MRD融合构建物的另一ELISA研究。
实施例4.赫赛汀–MRD融合分子
MRD融合到非催化抗体的另一个实例是赫赛汀-MRD融合构建物。该赫赛汀-MRD融合的多功能的，小分子αv整联蛋白拮抗物和化学编程的整联蛋白-靶向抗体都通过干扰αv-介导的细胞粘附和增殖，在预防乳腺癌转移上表现出显著效果。包含赫赛汀-2xCon4(其靶向ErbB2和ang2)和赫赛汀-V114(其靶向ErbB2和VEGF靶位)和赫赛汀-RGD-4C-2xCon4(其靶向ErbB2、ang2和整联蛋白靶位)的MRD融合是有效的。
实施例5.VEGF靶向抗体-MRD分子
构建包含MRD的抗体，该MRD靶向VEGF。靶向v114的MRD(SEQ ID.NO.13)用长连接序列(SEQ ID.NO.2)融合在38C2和赫赛汀的κ链N-末端。由此产生的抗体-MRD融合构建物的表达和测试证明了强VEGF结合力。
实施例6.IGF-1R靶向抗体-MRD分子
研究利用长连接序列作为连接体靶向IGF-1R的MRD(SFYSCLESLVNGPAEKSRGQWDGCRKK(SEQ ID.NO.:14))与38C2和赫赛汀的κ链N-末端的融合。由此产生的抗体-MRD融合构建物的表达和测试证明了强IGF-1R结合力。经过多轮诱变和筛选，也鉴定了其它表现高IGR-1R结合力的克隆。下面列出的优选序列对胰岛素受体没有表现出显著的结合亲和性或没有表现出结合亲和性。(见表2)。
表1：进一步诱变的模板：
Figure BDA0003692422180000221
表2：
Figure BDA0003692422180000231
实施例7.ErbB2结合、Ang-2-靶向抗体-MRD分子
构建了一种抗体，该抗体包含靶向Ang-2的MRD(L17)，该MRD融合到结合ErbB2的抗体轻链。或者短连接序列、长连接序列或者轻链恒定区的第四个环被用作连接体。图5用这样的构建物说明了ELISA结果，该构建物包含Ang-2靶向MRD与ErbB2抗体利用短连接肽(GGGS(SEQ ID NO.:1))的N-末端融合(L17-sL-Her)、Ang-2靶向MRD与ErbB2抗体利用短连接肽的C-末端融合(Her-sL-L17)、Ang-2靶向MRD与ErbB2抗体利用轻链恒定区第四个环的C-末端融合(Her-lo-L17)、或Ang-2靶向MRD与ErbB2抗体利用长连接肽(SSGGGGSGGGGGGSSRSS(SEQ ID NO.:19))的N-末端融合(L17-lL-Her)。ErbB2被所有构建物以不同程度结合。但是，Ang-2仅被Her-sL-L17和L17-lL-Her结合。
实施例8.肝细胞生长因子受体结合、Ang-2-靶向抗体-MRD分子
将靶向Ang-2的MRD(L17)融合到Met抗体轻链的N-末端或C-末端，该Met抗体结合肝细胞生长因子受体。或者短连接序列或者长连接序列被用作连接体。图6用这样的构建物说明了ELISA结果，该构建物包含Ang-2靶向MRD与Met抗体利用短连接肽(GGGS(SEQ IDNO.:1))的N-末端融合(L17-sL-Met)、Ang-2靶向MRD与Met抗体利用长连接肽(SSGGGGSGGGGGGSSRSS(SEQ ID NO.:19))的N-末端融合(L17-lL-Met)，和Ang-2靶向MRD与Met抗体利用长连接肽的C-末端融合(Met-iL-L17)。由此产生的抗体-MRD融合构建物的表达和测试证明了当使用长连接肽时的强Ang-2结合力。Ang-2靶向MRD与抗体轻链C-末端的融合产生比Ang-2靶向MRD与抗体轻链N-末端的融合略高的结合力。
实施例9.ErbB2结合、整联蛋白-靶向抗体-MRD分子
构建了一种抗体，该抗体包含靶向整联蛋白αvβ3(RGD4C)的MRD，该MRD融合到结合ErbB2(Her)的抗体赫赛汀的轻链。或者短连接序列、长连接序列或者轻链恒定区第四个环被用作连接体。图7用这样的构建物说明了ELISA结果，该构建物包含整联蛋白αvβ3靶向MRD与ErbB2抗体利用短连接肽(GGGS(SEQ ID NO.:1))的N-末端融合(RGD4C-sL-Her)、整联蛋白αvβ3靶向MRD与ErbB2抗体利用短连接肽的C-末端融合(Her-sL-RGD4C)、整联蛋白αvβ3靶向MRD与ErbB2抗体利用轻链恒定区第四个环的C-末端融合(Her-lo-RGD4C)、或整联蛋白αvβ3靶向MRD与ErbB2抗体利用长连接肽(SSGGGGSGGGGGGSSRSS(SEQ ID NO.:19))的N-末端融合(RGD4C-lL-Her)。ErbB2被所有构建物以不同程度结合。但是，整联蛋白αvβ3仅被RGD4C-lL-Her结合。
实施例10.肝细胞生长因子受体结合、整联蛋白-靶向抗体-MRD分子
构建了一种抗体，该抗体包含靶向整联蛋白αvβ3(RGD4C)的MRD，该MRD融合到结合肝细胞生长因子受体(Met)的抗体的轻链。利用了包含长连接序列的抗体-MRD构建物。图8用这样的构建物说明了ELISA结果，该构建物包含整联蛋白αvβ3靶向MRD与肝细胞生长因子受体抗体的N-末端融合(RGD4C-lL-Met)或整联蛋白αvβ3靶向MRD与肝细胞生长因子受体抗体的C-末端融合(Met-lL-RGD4C)。该RGD4C-lL-Met证明了强整联蛋白αvβ3结合力。
实施例11.ErbB2结合、胰岛素样生长因子-I受体-靶向抗体-MRD分子
构建了抗体，该抗体包含靶向胰岛素样生长因子-I受体(RP)的MRD，该MRD融合到结合ErbB2(Her)的抗体的轻链。或者短连接序列、长连接序列或者轻链恒定区第四个环被用作连接体。(Carter et al.,Proc Natl Acad Sci U S A.1992May 15；89(10):4285-9。
PMID:1350088[PubMed–索引MEDLINE]；美国专利号5,677,171；ATCC保藏10463，在此全部引入作为参考)。图9用构建物说明了ELISA结果，该构建物包含胰岛素样生长因子-I受体靶向MRD与ErbB2抗体利用短连接肽的N-末端融合(RP-sL-Her)、胰岛素样生长因子-I受体靶向MRD与ErbB2抗体和短连接肽的C-末端融合(Her-sL-RP)、胰岛素样生长因子-I受体靶向MRD与ErbB2抗体利用轻链恒定区第四个环的C-末端融合(Her-lo-RP)、胰岛素样生长因子-I受体靶向MRD与ErbB2抗体利用长连接肽的N-末端融合(RP-lL-Her)、或胰岛素样生长因子-I受体靶向MRD与ErbB2抗体利用长连接肽的C-末端融合(Her-lL-RP)。ErbB2被所有构建物以不同程度结合。但是，胰岛素样生长因子-I受体被RP-lL-Her结合。
实施例12.ErbB2结合、VEGF-靶向抗体-MRD分子
靶向VEGF(V114)的MRD融合到ErbB2-结合抗体(Her)轻链的N-末端。用中等连接肽(SSGGGGSGGGGGGSS(SEQ ID NO.:2))作连接体。图10用构建物说明了ELISA结果，该构建物包含VEGF靶向MRD与ErbB2-结合抗体利用中等连接肽(V114-mL-Her)的N-末端融合。由此产生的抗体-MRD融合构建物的表达和测试证明了强VEGF和ErbB2结合力。
实施例13.整联蛋白靶向抗体-MRD分子
研究了利用中等连接肽作连接体将靶向整联蛋白αvβ3(RGD)的MRD融合到38C2轻链N-末端。图11证明，由此产生的抗体-MRD构建物的表达和测试具有强整联蛋白αvβ3结合力。
实施例14.Ang-2靶向抗体-MRD分子
研究了利用短连接肽作为连接体将靶向Ang-2的MRD(L17)融合到38C2轻链C-末端。图12证明，表达和测试由此产生的抗体-MRD融合构建物具有强Ang-2结合力。
实施例15.ErbB2结合、整联蛋白和Ang-2靶向抗体-MRD分子
用中等连接体将靶向整联蛋白αvβ3(RGD4C)的MRD连接到ErbB2靶向抗体(Her)轻链N-末端，且用短连接体将Ang-2(L17)靶向MRD连接到相同ErbB2靶向抗体的C-末端(RGD4C-mL-Her-sL-L17)。图13证明，由此产生的抗体-MRD融合融合构建物结合到整联蛋白、Ang-2和ErbB2。
实施例16.ErbB2结合、整联蛋白-靶向抗体-MRD分子
用中等连接体作为连接体构建了一种抗体(RGD4C-mL-her-重链)，该抗体包含靶向整联蛋白αvβ3的MRD(RGD4C)，该MRD融合到结合ErbB2(Her)的抗体的重链N-末端。图14用构建物说明了ELISA结果。整联蛋白和ErbB2都被该构建物结合。
实施例17.ErbB2或肝细胞生长因子受体结合、带短连接肽的整联蛋白、Ang-2或胰 岛素样生长因子-I受体-靶向抗体-MRD分子
构建了抗体-MRD分子，该抗体-MRD分子包含ErbB2或肝细胞生长因子受体结合抗体，整联蛋白αvβ3、Ang-2或胰岛素样生长因子-I受体-靶向MRD区域通过短连接肽连接到抗体轻链。图15用构建物说明了ELISA结果，该构建物包含Ang-2靶向MRD与ErbB2抗体的N-末端融合(L17-sL-Her)、整联蛋白-靶向MRD与ErbB2抗体的N-末端融合(RGD4C-sL-Her)、胰岛素样生长因子-I受体靶向MRD与ErbB2结合抗体的N-末端融合(RP-sL-Her)、Ang-2靶向MRD与肝细胞生长因子受体结合抗体的C-末端融合(L17-sL-Met)、Ang-2靶向MRD与ErbB2结合抗体的C-末端融合(Her-sL-L17)、整联蛋白靶向MRD与ErbB2结合抗体的C-末端融合(Her-sL-RGD4C)或胰岛素样生长因子-I受体靶向MRD与ErbB2结合抗体的C-末端融合(Her-sL-RP)。ErbB2被抗体-MRD构建物以不同程度结合，除了包含肝细胞生长因子受体-结合抗体的构建物。抗原仅被Her-sL-L17构建物结合。
实施例18.ErbB2或肝细胞生长因子受体结合、带长连接肽的整联蛋白、Ang-2或胰 岛素样生长因子-I受体-靶向抗体-MRD分子
构建了抗体-MRD分子，该抗体-MRD分子包含ErbB2或肝细胞生长因子受体结合抗体，整联蛋白αvβ3、Ang-2或胰岛素样生长因子-I受体-靶向MRD区域利用长连接肽连接到抗体轻链。图16用构建物说明了ELISA结果，该构建物包含Ang-2靶向MRD融合到ErbB2抗体的N-末端融合(L17-lL-Her)、整联蛋白-靶向MRD与ErbB2抗体的N-末端融合(RGD4C-lL-Her)、胰岛素样生长因子-I受体-靶向MRD与ErbB2结合抗体的N-末端融合(RP-lL-Her)、Ang-2靶向MRD与肝细胞生长因子受体结合抗体的C-末端融合(L17-lL-Met)、整联蛋白靶向MRD与肝细胞生长因子受体结合抗体的C-末端融合(RGD4C-lL-Met)、Ang-2靶向MRD与胰岛素样生长因子-I受体结合抗体的C-末端融合(Her-lL-RP)、Ang-2靶向MRD与肝细胞生长因子受体结合抗体的C-末端融合(Met-lL-L17)或整联蛋白靶向MRD与肝细胞生长因子受体结合抗体的C-末端融合(Met-lL-RGD4C)。如图16所示，抗体-MRD融合物有效地结合抗原和ErbB2。Lu etal.J Biol Chem.2005 May 20；280(20):19665-72.Epub 2005 Mar 9；Lu et al.J BiolChem.2004 Jan 23；279(4):2856-65.Epub 2003 Oct 23。
虽然本发明参考上述实施例进行描述，但要理解的是，修改和变更包括在本发明精神和范围内。因此，本发明仅由所附权利要求书限定。
序列表
<110> 斯克里普斯研究院
<120> 通过模块识别结构域的抗体靶向
<130> SCRIP1890-2WO
<150> US 61/022,767
<151> 2008-01-22
<150> US 61/018,816
<151> 2008-01-03
<160> 58
<170> PatentIn version 3.5
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Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa
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Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa
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Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa
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Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa
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Ser Arg Gly Gln Trp Gln Glu Cys Arg Thr Gly
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<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建物
<400> 46
Asn Phe Tyr Gln Cys Ile Glu Val Phe Trp Gly Arg Pro Ala Glu Lys
1 5 10 15
Ser Arg Gly Gln Trp Gln Glu Cys Arg Thr Gly
20 25
<210> 47
<211> 27
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建物
<400> 47
Asn Phe Tyr Gln Cys Ile Glu Gln Leu Ser Ser Gly Pro Ala Glu Lys
1 5 10 15
Ser Arg Gly Gln Trp Gln Glu Cys Arg Thr Gly
20 25
<210> 48
<211> 27
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建物
<400> 48
Asn Phe Tyr Gln Cys Ile Glu Leu Leu Ser Ala Arg Pro Ala Glu Lys
1 5 10 15
Ser Arg Gly Gln Trp Ala Glu Cys Arg Ala Gly
20 25
<210> 49
<211> 27
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建物
<400> 49
Asn Phe Tyr Gln Cys Ile Glu Ala Leu Ala Arg Thr Pro Ala Glu Lys
1 5 10 15
Ser Arg Gly Gln Trp Val Glu Cys Arg Ala Pro
20 25
<210> 50
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建物
<400> 50
gtggagtgca gggcgccg 18
<210> 51
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建物
<400> 51
Val Glu Cys Arg Ala Pro
1 5
<210> 52
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建物
<400> 52
gctgagtgca gggctggg 18
<210> 53
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建物
<400> 53
Ala Glu Cys Arg Ala Gly
1 5
<210> 54
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建物
<400> 54
caggagtgca ggacgggg 18
<210> 55
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建物
<400> 55
Gln Glu Cys Arg Thr Gly
1 5
<210> 56
<211> 26
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建物
<220>
<221> misc_feature
<222> (12)..(26)
<223> Xaa 可以是任何天然存在的氨基酸
<400> 56
Met Gly Ala Gln Thr Asn Phe Met Pro Met Asp Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa
1 5 10 15
Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa
20 25
<210> 57
<211> 116
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建物
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(50)
<223> Xaa 可以是任何天然存在的氨基酸
<220>
<221> misc_feature
<222> (58)..(59)
<223> Xaa 可以是任何天然存在的氨基酸
<220>
<221> misc_feature
<222> (67)..(116)
<223> Xaa 可以是任何天然存在的氨基酸
<400> 57
Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa
1 5 10 15
Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa
20 25 30
Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa
35 40 45
Xaa Xaa Ala Gln Gln Glu Glu Cys Glu Xaa Xaa Pro Trp Thr Cys Glu
50 55 60
His Met Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa
65 70 75 80
Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa
85 90 95
Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa
100 105 110
Xaa Xaa Xaa Xaa
115
<210> 58
<211> 28
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建物
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (7)..(7)
<223> Xaa is E or D
<220>
<221> misc_feature
<222> (8)..(8)
<223> Xaa 可以是任何天然存在的氨基酸
<220>
<221> misc_feature
<222> (10)..(12)
<223> Xaa 可以是任何天然存在的氨基酸
<400> 58
Asn Phe Tyr Gln Cys Ile Xaa Xaa Leu Xaa Xaa Xaa Pro Ala Glu Lys
1 5 10 15
Ser Arg Gly Gln Trp Gln Glu Cys Arg Thr Gly Gly
20 25

Claims (10)

1.一种分离的全长抗体，其包括模块识别结构域(MRD)。
2.如权利要求1所述的抗体，其中所述抗体和所述MRD通过连接肽可操作地连接。
3.如权利要求2所述的抗体，其中所述连接肽在2至20个肽之间。
4.如权利要求2所述的抗体，其中所述连接肽在4至15个肽之间。
5.如权利要求2所述的抗体，其中所述连接肽包括序列GGGS(SEQ ID.NO.:1)。
6.如权利要求2所述的抗体，其中所述连接肽包括序列SSGGGGSGGGGGGSS(SEQ ID.NO.:2)。
7.如权利要求2所述的抗体，其中所述连接肽包括序列SSGGGGSGGGGGGSSRSS(SEQ IDNO.:19)。
8.如权利要求1所述的抗体，其中所述MRD可操作地连接到所述抗体重链C-末端。
9.如权利要求1所述的抗体，其中所述MRD可操作地连接到所述抗体重链N-末端。
10.如权利要求1所述的抗体，其中所述MRD可操作地连接到所述抗体轻链C-末端。
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