BRPI0821906B1

BRPI0821906B1 - Anticorpo isolado de comprimento total, seu uso, polinucleotideo, vetor, e célula hospedeira

Info

Publication number: BRPI0821906B1
Application number: BRPI0821906-0A
Authority: BR
Inventors: Carlos F. Barbas Iii
Original assignee: The Scripps Research Institute
Priority date: 2008-01-03
Filing date: 2008-12-24
Publication date: 2022-06-07
Also published as: KR101658247B1; EA201500156A3; IL248905A0; IL223647A0; CA2711256C; IL206602A0; JP5774851B2; SG189769A1; GEP20156390B; CN108864285A; ES2689274T3; US10030051B2; ZA201004730B; EP2769991A1; EA201500156A2; JP2015227345A; EP2237797A2; WO2009088805A3; DK2769991T3; EA021967B1

Abstract

ANTICORPO ISOLADO DE COMPRIMENTO COM PLETO, SEU PROCESSO DE PRODUÇÃO, SEU USO, POLINUCLEOTIDEO CODIFICANDO TAL ANTICORPO, VETOR COMPREENDENDO O REFERIDO POLINUCLEOTIDEO E CÉLULA HOSPEDEIRA COMPREENDENDO O REFERIDO VETOR. A presente invenção refere-se a anticorpos que contêm um ou mais domínios de reconhecimento modular (MRDs) utilizados como os anticorpos para sítios específicos. Refere-se também ao uso dos anticorpos que contém um ou mais domínios de reconhecimento modular para tratar doença e processos de produção de anticorpos que contêm um ou mais domínios de reconhecimento modular.

Description

CAMPO DA INVENÇÃO

[0001] A presente invenção se refere de forma geral a anticorpos que contêm um ou mais domínios de reconhecimento modular e mais especificamente ao uso dos anticorpos que contêm um ou mais domínios de reconhecimento modular para tratar doença e métodos de produção de anticorpos que contêm um ou mais domínios de reconhecimento modular.

ANTECEDENTE

[0002] Os anticorpos monoclonais cataliticamente ativos (Abs) podem ser utilizados para a ativação seletiva com profármacos e para transformações químicas. Os Abs monoclonais com atividade de aldolase surgiram como catalisadores altamente eficientes para um número de transformações químicas, particularmente reações de aldol e retro-aldol. A atividade de retro-aldolase dos Abs, tais como 38C2 e 93F3, permitiu que os pesquisadores planejassem, sintetizassem e avaliassem profármacos de vários agentes quimioterapêuticos que podem ser ativados através de reações de retro-aldol. (A construção de 38C2 foi descrita na WO 97/21803, incorporada aqui como referência). O 38C2 contém um sítio de combinação de anticorpo que catalisa a reação de adição de aldol entre um doador alifático e um receptor de aldeído. Em um modelo de camundongo singênico de neuroblastoma, a administração sistêmica de um profármaco de etoposídeo e a injeção intratumor de 38C2 inibiam o crescimento de tumor.

[0003] Um inconveniente no uso de Abs catalíticos é que não possuem um dispositivo para direcionar o Ab catalítico para as células malignas. Estudos anteriores demonstraram que em uma abordagem de terapia de profármaco de enzima direcionado pelo anticorpo (ADEPT) ou de terapia de profármaco de abzima direcionado pelo anticorpo (ADAPT), enzimas ou anticorpos catalíticos podem ser direcionados para células tumorais através de conjugação química ou de fusão recombinante com os anticorpos de direcionamento. Entretanto, uma alternativa mais eficiente seria a utilização do anticorpo catalítico fundido com um peptídeo de direcionamento localizado do lado de forma do sítio de combinação com o anticorpo, deixando assim o sítio ativo disponível para a ativação do profármaco. Por exemplo, a fusão de Ab 38C2 com um peptídeo de ligação com a integrina αvβ3 localizaria de forma seletiva o anticorpo no tumor e/ou a vasculatura do tumor e desencadearia a ativação do profármaco em tal sítio. A terapia potencial desta abordagem é sustentada pelos dados pré-clínicos e clínicos de fase III que sugerem que os peptídeos podem ser convertidos em fármacos viáveis através da fusão com regiões Fc do anticorpo.

[0004] O desenvolvimento de anticorpos biespecíficos ou multiespecíficos que se direcionam para dois ou mais alvos de câncer simultaneamente e/ou ativam profármacos oferece uma solução nova e promissora para atacar o câncer e outras doenças. Tais anticorpos são exemplificados na figura 1 do presente pedido de patente. Estudos de anticorpos biespecíficos (BsAb) que se direcionam simultaneamente a dois antígenos associados ao tumor (por exemplo, receptores de fatores de crescimento) para a regulação para menos de várias vias de proliferação/sobrevivência de células forneceram suporte para esta abordagem. Tradicionalmente, os anticorpos biespecíficos foram preparados através da ligação química de dois anticorpos monoclonais diferentes ou através da fusão de linhagens de células de hibridoma para produzir um hibridoma híbrido. Moléculas similares à IgG tetravalentes específicas duais ou imunoglobulinas com domínios variáveis duais, foram engenheiradas partindo de dois anticorpos monoclonais. Estas imunoglobulinas com domínios variáveis duais são capazes de se ligar a ambos os antígenos na presença de soro. Entretanto, estas abordagens apresentam desafios em relação à produção, ao rendimento e à pureza.

[0005] Uma variedade de métodos recombinantes foi desenvolvida para a produção eficiente de fragmentos de BsAb pequenos tais como diacorpo, minicorpo e proteínas de fusão Fab-scFv. Estes fragmentos de BsAb podem possuir algumas vantagens em relação às moléculas similares à IgG de comprimento total para certas aplicações clínicas, tais como a formação de radioimagens e o direcionamento para tumores, devido à melhor penetração no tecido e à eliminação mais rápida da circulação. Por outro lado, o BsAb similar à IgG pode provar ser preferido em relação aos fragmentos de BsAb menores para outras aplicações in vivo, especificamente para indicações oncológicas, através do fornecimento do domínio Fc que confere longa meia-vida no soro e sustenta a função imunológica secundária, tal como a citotoxicidade celular dependente de anticorpo e a citotoxicidade mediada pelo complemento. Ao contrário de seus equivalentes de fragmentos, a engenharia e a produção de BsAb similar à IgG recombinante têm sido, entretanto, bastante desafiadoras tecnicamente devido ao seu tamanho grande (~150-200 kDa) e complexidade estrutural. O sucesso no campo, que é julgado através da aplicação bem-sucedida em modelos de animais, foi muito limitado. Recentemente, com a verificação de uma variedade de construções, a expressão eficiente de moléculas de BsAb contendo domínio Fc em células de mamíferos fez alguns progressos.

[0006] Outra abordagem que foi utilizada para direcionar anticorpos é através do uso de pepticorpos. Os pepticorpos são essencialmente fusões de peptídeos com regiões Fc do anticorpo. Dado o sucesso de estudos utilizando bibliotecas de peptídeos aleatórias para encontrar ligantes de peptídeos com alta afinidade para uma ampla variedade de alvos, a fusão de tais peptídeos com regiões Fc de anticorpos fornece um meio de tornar peptídeos em candidatos terapêuticos através do aumento de sua meia-vida circulatória e da atividade através de valência aumentada.

[0007] As interações de proteínas com outras moléculas são básicas na bioquímica. As interações de proteínas incluem interações de receptor-ligante, interações de anticorpo-antígeno, contato célula- célula e interações dos agentes patogênicos com tecidos-alvo. As interações de proteínas podem envolver o contato com outras proteínas, com carboidratos, oligossacarídeos, lipídeos, íons metálicos e materiais similares. A unidade básica da interação de proteínas é a região da proteína envolvida no contato e no reconhecimento e é referida como o sítio de ligação ou o sítio-alvo.

[0008] Os peptídeos derivados de bibliotecas de exibição de fagos tipicamente mantêm suas características de ligação quando ligados com outras moléculas. Os peptídeos específicos deste tipo podem ser tratados como blocos de especificidade modular ou domínios de reconhecimento modular (MRDs) que podem ser combinados para criar uma única proteína com especificidades de ligação para vários alvos definidos.

[0009] Um exemplo de tal sítio-alvo definido é a integrina. As integrinas são uma família de receptores de adesão celular de transmembrana que são compostos de subunidades α e β e medem a ligação celular com proteínas dentro da matriz extracelular. Atualmente, são conhecidas dezoito subunidades α e oito β; estas formam 24 heterodímeros αβ diferentes com especificidades diferentes para várias proteínas de adesão celular ECM. Os ligantes para várias integrinas incluem fibronectina, colágeno, laminina, fator de von Willebrand, osteopontina, trombospondina e vitronectina, que são todos componentes de ECM. Certas integrinas também podem se ligar a ligantes solúveis tal como fibrinogênio ou a outras moléculas de adesão em células adjacentes. É sabido que as integrinas existem em estados de ativação distintos que exibem afinidades diferentes pelo ligante. O reconhecimento de ligantes solúveis pelas integrinas depende estritamente de alterações específicas na conformação do receptor. Isto fornece uma modificação molecular que controla a capacidade das células de se agregarem de uma maneira dependente de integrina e de serem impedidas sob as condições de fluxo dinâmico da vasculatura. Este mecanismo é bem estabelecido para leucócitos e plaquetas que circulam dentro do fluxo sanguíneo em um estado de repouso enquanto são expressas integrinas não ativadas. Após o estímulo através de agonistas pró-inflamatórios ou pró-trombóticos, estes tipos de células respondem prontamente com um número de alterações moleculares que incluem a modificação de integrinas importantes, integrinas β2 para leucócitos e αvβ3 para plaquetas, partindo de conformações "de repouso" para "ativadas". Isto possibilita que estes tipos de células sejam interrompidas dentro da vasculatura, promovendo a coesão de células e levando à formação de trombo.

[00010] Foi demonstrado que um subconjunto metastásico de células de câncer de mama humanas expressa integrina αvβ3 em uma forma ativada de forma constitutiva. Esta expressão aberrante de αvβ3 desempenha uma função na metástase de câncer de mama bem como de câncer de próstata, melanoma e tumores neuroblásticos. O receptor ativado promove fortemente a migração de células cancerosas e possibilita que estas células sejam interrompidas sob condições de fluxo sanguíneo. Desta maneira, a ativação de αvβ3 favorecem células metastásicas com propriedades importantes prováveis como sendo críticas para a disseminação e a colonização bem-sucedidas de órgãos-alvo. As células tumorais que entraram de forma bem-sucedida em um órgão-alvo podem utilizar também αvβ3 para prosperar no novo ambiente, uma vez que as interações de matriz de αvβ3 podem promover a sobrevivência e a proliferação celular. Por exemplo, αvβ3 que se liga à osteopontina promove malignidade e níveis elevados de osteopontina correlacionados com um fraco prognóstico no câncer de mama.

[00011] Por estas razões é para sua função estabelecida na angiogênese, a integrina αvβ3 é uma das integrinas mais amplamente estudadas. Os antagonistas desta molécula possuem potencial significativo para uso no fornecimento direcionado de fármacos. Uma abordagem que foi utilizada para direcionar a integrina αvβ3 utiliza a especificidade de ligação com αvβ3 de peptídeos que contêm a sequência Arg-Gly-Asp (RGD). Este tripeptídeo, naturalmente presente nas proteínas de matriz extracelular, é o sítio de ligação primário da integrina αvβ3. Entretanto, as sondas repórteres baseadas em RGD são problemáticas devido à eliminação rápida do sangue, alta captação dos rins e do fígado e eliminação do tumor. Foi mostrado que a modificação química de peptídeos RGD ciclizados aumenta sua estabilidade e valência. Estes peptídeos modificados são então acoplados a radioisótopos e utilizados para a produção de imagens do tumor ou para inibir o crescimento do tumor.

[00012] A integrina αvβ3 é um dos homodímeros de integrina mais bem caracterizado e é um dos vários heterodímeros que foram implicados na angiogênese induzida por tumor. Embora expressa de forma reduzida nos vasos sanguíneos maduros, a αvβ3 é significativamente regulada para mais durante a angiogênese in vivo. A expressão de αvβ3 está correlacionada com a agressividade da doença em câncer de mama e cervical bem como no melanoma maligno. Estudos recentes sugerem que a αvβ3 pode ser útil como um indicador para diagnóstico ou prognóstico para alguns tumores. A integrina αvβ3 é particularmente atraente como um alvo terapêutico devido a sua distribuição celular relativamente limitada. Esta não é geralmente expressa em células epiteliais e minimamente expressa em outros tipos de células. Além disso, os antagonistas de αvβ3, incluindo tanto peptídeos RGD cíclicos quanto anticorpos monoclonais, inibem significativamente a angiogênese induzida por citocinas e o crescimento de tumor sólido na membrana corioalantóica de filhote de ave.

[00013] Outro heterodímero de integrina, αvβ5, é mais amplamente expresso em células tumorais malignas e está provavelmente envolvido na angiogênese mediada por VEGF. Foi mostrado que αvβ3 e αvβ5 promovem a angiogênese através de vias distintas: αvβ3 através de bFGF e TNF-a e αvβ5 através de VEGF e TGF-α. Foi também mostrado que a inibição de Src quinase pode bloquear a angiogênese induzida por VEGF, mas não induzida por FGF2. Estes resultados implicam fortemente que FGF2 e VEGF ativam vias angiogênicas diferentes que requerem αvβ3 e αvβ5, respectivamente.

[00014] As integrinas também foram implicadas na metástase de tumores. A metástase é a causa primária de morbidez e mortalidade no câncer. A progressão maligna de todos de melanoma, glioma, câncer de ovário e de mama foi fortemente ligada com a expressão da integrina αvβ3 e em alguns casos com αvβ5. Mais recentemente, foi mostrado que a ativação da integrina αvβ3 desempenha uma função significativa na metástase no câncer de mama humano. Uma correlação muito forte entre a expressão de αvβ3 e a metástase do câncer de mama foi observada quando epitélios de mama normais são negativos para αvβ3 e aproximadamente 50% dos carcinomas lobulares invasivos e quase todas as metástases ósseas no câncer de mama expressam αvβ3. Foi mostrado que o antagonismo de αvβ3 com um peptídeo cíclico é sinérgico com a radioimunoterapia em estudos envolvendo xenoenxertos de câncer de mama.

[00015] A angiogênese, a formação de novos vasos sanguíneos partindo dos existentes, é essencial para possibilitar processos fisiológicos e patológicos. Normalmente, a angiogênese é fortemente regulada por fatores pró- e antiangiogênicos, mas no caso de doenças tais como câncer, doença neovascular ocular, artrite e psoríase, o processo pode sair errado. A associação da angiogênese com a doença tornou a descoberta de composto antiangiogênico atraente. O fago mais promissor derivado de peptídeo antiangiogênico descrito até agora, desenvolvido pela Amgen, neutraliza a citocina angiogênica Ang2.

[00016] Embora os VEGFs e seus receptores estivessem entre as moléculas mais extensivamente direcionadas no campo da angiogênese, os esforços pré-clínicos que se direcionam para a via da angiopoietina-Tie2 mais recentemente descoberta estão em andamento. Ambas as famílias de proteínas envolvem interações de ligantes receptores e ambas incluem membros cujas funções estão enormemente restritas de forma pós-natal às células endoteliais e algumas linhagens de células-tronco hematopoiéticas. Tie-2 é uma tirosina quinase receptora com quatro ligantes conhecidos, angiopoietina-1 (Ang1) até angiopoietina-4 (Ang4), as mais bem estudadas sendo Ang1 e Ang2. Ang1 estimula a fosforilação de Tie2 e foi mostrado que a interação de Ang2 com Tie2 tanto antagoniza quanto agoniza a fosforilação do receptor Tie2. A expressão de Ang2 elevada nos locais de angiogênese normal e pós-natal implica de forma circunstancial uma função pró-angiogênica para Ang2. A indução de Ang2 seletiva para os vasos associada com a angiogênese foi demonstrada em doenças incluindo o câncer. Em pacientes com carcinoma de cólon, a Ang2 é expressa de forma ubíqua no epitélio de tumor, enquanto foi mostrado que a expressão de Ang1 no epitélio de tumor era rara. Foi sugerido que o ganho líquido da atividade de Ang2 é um fator de iniciação para a angiogênese de tumor.

[00017] Outras proteínas de fusão direcionadas para os receptores celulares estão sob avaliação clínica. A Herceptina (Trastuzumab), desenvolvida pela Genentech, é um anticorpo monoclonal humanizado recombinante direcionado contra o domínio extracelular do receptor 2 da tirosina quinase epidérmica humana (HER2 ou ErbB2). O gene HER2 é superexpresso em 25% dos cânceres de mama invasivos e está associado com um fraco prognóstico e uma sensibilidade alterada aos agentes quimioterapêuticos. A Herceptina bloqueia a proliferação de cânceres de mama que superexpressam ErbB2 e é atualmente a única terapia de anticorpo direcionada para ErbB2 aprovada pela FDA para o tratamento de câncer de mama metastásico que superexpressa ErbB2 (MBC). Em células adultas normais, há poucas moléculas de ErbB2 na superfície celular ~ 20,000 por célula, assim poucos heterodímeros são formados e os sinais de crescimento são relativamente fracos e controláveis. Quando o ErbB2 é superexpresso, ~ 500,000 por célula, vários heterodímeros de ErbB2 são formados e a sinalização celular é mais forte, resultando na maior capacidade de resposta para os fatores de crescimento e para o crescimento maligno. Isto explica porque a superexpressão de ErbB2 é um indicador de fraco prognóstico em tumores de mama e pode servir para prever a resposta ao tratamento.

[00018] O ErbB2 é um alvo promissor e válido para câncer de mama, quando este é encontrado tanto no tumor primário quanto em sítios metastásicos. A Herceptina induz a remoção rápida de ErbB2 da superfície celular, reduzindo assim sua disponibilidade para heterodimerizar e promover o crescimento. Os mecanismos de ação da Herceptina observados em modelos experimentais in vitro e in vivo incluem a inibição da proteólise do domínio extracelular de ErbB2, a interrupção de vias de sinalização a jusante tais como fosfatidilinositiol 3-quinase (P13K) e cascatas de proteína quinase ativada por mitógeno (MAPK), interrupção do ciclo celular em GI, inibição do reparo de DNA, supressão da angiogênese e indução da citotoxicidade celular dependente de anticorpo (ADCC). A maior parte dos pacientes com câncer de mama metastásico que respondem inicialmente à Herceptina, entretanto, demonstra progressão da doença dentro de um período de um ano do início do tratamento.

[00019] Outro receptor celular-alvo é o receptor do fator 1 de crescimento similar à insulina do tipo 1 (IGF-1R), o IGF-1R é uma tirosina quinase receptora que desempenha uma função crítica na sinalização da sobrevivência e na proliferação celular. O sistema de IGF é frequentemente desregulado em células cancerosas através do estabelecimento de alças autócrinas que envolvem a superexpressão de IGF-I ou -II e/ou IGF-1R. Além disso, estudos epidemiológicos sugeriram uma ligação entre níveis de IGF elevados e o desenvolvimento de cânceres humanos principais, tal como câncer de mama, de cólon, de pulmão e de próstata. A expressão de IGFs e seus receptores cognatos foram correlacionados com o estágio da doença, a sobrevivência reduzida, o desenvolvimento de metástases e a desdiferenciação de tumores.

[00020] Além do IGF-1R, o receptor do fator de crescimento epidérmico (EGFR) também foi implicado na tumorigênese de vários cânceres. A inibição de tumor efetiva foi conseguida tanto experimentalmente quanto clinicamente com um número de estratégias que antagonizam qualquer atividade do receptor. Devido à redundância das vias de sinalização de crescimento nas células tumorais, a inibição de uma função do receptor (por exemplo, EGFR) poderia ser efetivamente compensada pela regulação para mais de outras vias mediadas por receptores de fator de crescimento (por exemplo, IGF-1R). Por exemplo, um estudo recente mostrou que linhagens de células de glioma maligno expressando EGFR equivalente tinham sensibilidade significativamente diferente à inibição de EGFR dependendo de sua capacidade de ativar IGF-1R e suas vias de sinalização a jusante. Outros estudos também demonstraram que a superexpressão e/ou a ativação de IGF-1R em células tumorais poderia contribuir para sua resistência a agentes quimioterapêuticos, à terapia de radiação ou de anticorpos tal como a Herceptina. E consequentemente, a inibição da sinalização de IGF-1R resultou na maior sensibilidade de células tumorais à Herceptina.

[00021] O EGFR é uma tirosina quinase receptora que é expressa em muitos tecidos normais bem como lesões neoplásicas da maior parte dos órgãos. A superexpressão de EGFR ou a expressão de formas mutantes de EGFR foi observada em muitos tumores, particularmente tumores epiteliais e está associada com um fraco prognóstico clínico. A inibição da sinalização através deste receptor induz um efeito antitumor. Com a aprovação da FDA de Cetuximab, também conhecido como Erbitux (um anticorpo quimérico de camundongo/humano) em fevereiro de 2004, o EGFR se tornou um alvo de fármaco de anticorpo aprovado para o tratamento de câncer colorretal metastásico. Em março de 2006, o Erbitux também recebeu aprovação da FDA para o tratamento de carcinoma de célula escamosa da cabeça e pescoço (SCCHN). Mais recentemente, o Vectibix, um anticorpo completamente humano direcionado contra EGFR, foi aprovado para o câncer colorretal metastásico. Nenhum fármaco é um agente que opera independentemente no câncer colorretal - estes foram aprovados como complementos para regimes colorretais existentes. No câncer colorretal, o Erbitux é fornecido em combinação com o fármaco irinotecan e o Vectibix é administrado após a progressão da doença em ou após regimes de quimioterapia contendo fluoropirimidina, oxaliplatina e irinotecan. O Erbitux foi aprovado como um único agente no SCCHN recorrente ou metastásico apenas quando a quimioterapia à base de platina prévia falhou. Testes clínicos avançados que utilizam estes fármacos para direcionamento para carcinoma pulmonar de células que não são pequenas estão em andamento. A sequência de Erbitux ou do anticorpo para EGFR, é bem conhecida na arte (vide, por exemplo, Goldstein e outros, Clin. Cancer Res. 1:1311, 1995; Patente U.S. No 6.217.866), incorporada aqui como referência.

[00022] Um obstáculo na utilização de um anticorpo catalítico para a ativação seletiva de profármacos na terapia de câncer tem sido o direcionamento para tumores sistêmicos. A presente invenção descreve uma abordagem baseada na adaptação de peptídeos de ligação-alvo ou domínio de reconhecimento modular (MRDs), que são fundidos a anticorpos de comprimento total que se direcionam eficientemente a células tumorais ou moléculas solúveis enquanto mantêm a capacidade de ativação do profármaco do anticorpo catalítico. Uma vez que os MRDs estão fundidos com o anticorpo de forma a não mitigar significativamente a ligação com o sítio de ligação tradicional do anticorpo, a especificidade do anticorpo permanece intacta após a adição de MRD.

[00023] Como observado na figura 2, os MRDs, indicados por triângulos, círculos e quadrados, podem ser anexados em qualquer um dos términos de cadeias pesadas ou leves de um anticorpo típico. O primeiro esquema representa um pepticorpo simples com um peptídeo fundido ao terminal C de um Fc. Esta abordagem fornecia a preparação de anticorpos bi-, tri-, tetra e pentaespecíficos. A exibição de um único MRD em cada términal N e C de uma IgG fornece a exibição octavalente do MRD. Como uma alternativa à construção de anticorpos bi- e multifuncionais através da combinação de domínios variáveis do anticorpo, peptídeos de alta afinidade selecionados de bibliotecas de exibição de fago ou derivados de ligantes naturais podem oferecer uma abordagem altamente versátil e modular para a construção de anticorpos multifuncionais que mantêm as vantagens tanto de ligação quanto de meia-vida de anticorpos tradicionais. Os MRDs também podem estender a capacidade de ligação de anticorpos não catalíticos, fornecendo uma abordagem eficiente para estender a funcionalidade de ligação de anticorpos, particularmente com finalidades terapêuticas.

SUMÁRIO

[00024] A presente invenção se refere a um anticorpo de comprimento total compreendendo um domínio de reconhecimento modular (MRD). São também incorporados na presente invenção variantes e derivados de tais anticorpos compreendendo um MRD.

[00025] Em um aspecto, o anticorpo e o MRD estão operacionalmente ligados através de um peptídeo ligante. Em um aspecto, o peptídeo ligante tem entre 2 até 20 peptídeos de comprimento ou entre 4 até 10 ou aproximadamente 4 até 15 peptídeos de comprimento. Em um aspecto da presente invenção, o peptídeo ligante compreende a sequência GGGS (SEQ ID. NO:1), a sequência SSGGGGSGGGGGGSS (SEQ ID. NO: 2) ou a sequência SSGGGGSGGGGGGSSRSS (SEQ ID NO: 19). São incluídos aqui outros ligantes contendo uma sequência central GGGS que é mostrada na SEQ ID NO:1 em que o peptídeo ligante possui de aproximadamente 4-20 aminoácidos.

[00026] De acordo com outra modalidade da presente invenção, o MRD está operacionalmente ligado à extremidade terminal C da cadeia pesada do anticorpo. Em outro, o MRD está operacionalmente ligado à extremidade terminal N da cadeia pesada do anticorpo. Ainda em outro aspecto, o MRD está operacionalmente ligado à extremidade terminal C da cadeia leve do anticorpo. Em outro, o MRD está operacionalmente ligado à extremidade terminal N da cadeia leve do anticorpo. Em outro, dois ou mais MRDs estão operacionalmente ligados com qualquer extremidade terminal do anticorpo. Em outro, dois ou mais MRDs estão operacionalmente ligados com duas ou mais extremidades terminais do anticorpo.

[00027] Em uma modalidade da presente invenção, o alvo do MRD é um antígeno celular. Em uma modalidade da presente invenção, o alvo do MRD é CD20.

[00028] Em uma modalidade da presente invenção, o alvo do MRD é uma integrina. Em um aspecto, a sequência peptídica do MRD que se direciona à integrina é YCRGDCT (SEQ ID. NO:3). Em outro, a sequência peptídica do MRD que se direciona à integrina é PCRGDCL (SEQ ID. NO:4). Ainda em outro aspecto, a sequência peptídica do MRD que se direciona à integrina é TCRGDCY (SEQ ID. NO:5). Em outro, a sequência peptídica do MRD que se direciona à integrina é LCRGDCF (SEQ ID. NO:6).

[00029] Em uma modalidade da presente invenção, o alvo do MRD é uma citocina angiogênica. Em um aspecto, a sequência peptídica do MRD que se direciona à citocina angiogênica é MGAQTNFMPMDDLEQRLYEQFILQQGLE (SEQ ID. NO:7). Em outro, a sequência peptídica do MRD que se direciona à citocina angiogênica é MGAQTNFMPMDNDELLLYEQFILQQGLE (SEQ ID. NO:8). Ainda em outro aspecto, a sequência peptídica do MRD que se direciona à citocina angiogênica é MGAQTNFMPMDATETRLYEQFILQQGLE (SEQ ID. NO:9). Em outro, a sequência peptídica do MRD que se direciona à citocina angiogênica é AQQEECEWDPWTCEHMGSGSATGGSGSTASSGSGSATHQEECEW DPWTCEHMLE (SEQ ID. NO:10). Em outro, a sequência peptídica do MRD que se direciona à citocina angiogênica é MGAQTNFMPMDNDELLNYEQFILQQGLE (SEQ ID. NO: 11). Em outro, a sequência peptídica do MRD que se direciona à citocina angiogênica é PXDNDXLLNY (SEQ ID. NO: 12), em que X é em um dos 20 aminoácidos que ocorrem naturalmente. Em outra modalidade, o peptídeo de MRD de direcionamento possui a sequência central MGAQTNFMPMDXn (SEQ ID NO:56), em que X é qualquer aminoácido e n é de aproximadamente 0 até 15.

[00030] Em outra modalidade, o peptídeo de MRD de direcionamento contém uma sequência central selecionada de: XnEFAPWTXn em que n possui de aproximadamente 0 até 50 resíduos de aminoácidos (SEQ ID NO: 22); XnELAPWTXn em que n possui de aproximadamente 0 até 50 resíduos de aminoácidos (SEQ ID NO: 25); XnEFSPWTXn em que n possui de aproximadamente 0 até 50 resíduos de aminoácidos (SEQ ID NO: 28); XnELEPWTXn em que n possui de aproximadamente 0 até 50 resíduos de aminoácidos (SEQ ID NO: 31); e Xn AQQEECEX1X2PWTCEHMXn em que n possui de aproximadamente 0 até 50 resíduos de aminoácidos e X, X1 e X2 são qualquer aminoácido (SEQ ID NO:57).

[00031] Os exemplos de peptídeos que contêm tais peptídeos centrais incluem, por exemplo: AQQEECEFAPWTCEHM (SEQ ID NO:21); AQQEECEFAPWTCEHMGSGSATGGSGSTASSGSGSAT HQEECEFAPWTCEHMLE (SEQ ID NO: 23); AQQEECELAPWTCEHM (SEQ ID NO: 24); AQQEECELAPWTCEHMGSGSATGGSGSTASSGSGSATH QEECELAPWTCEHMLE (SEQ ID NO: 26); AQQEECEFSPWTCEHM (SEQ ID NO: 27); AQQEECEFSPWTCEHMGSGSATGGSGSTASSGSGSAT HQEECEFSPWTCEHMLE 2xConFS (SEQ ID NO: 29); AQQEECELEPWTCEHM (SEQ ID NO: 30); AQQEECELEPWTCEHMGSGSATGGSGSTASSGSGSATH QEECELEPWTCEHMLE (SEQ ID NO: 32); AQQEECEFAPWTCEHMGSGSATGGSGSTASSGSGSAT HQEECELAPWTCEHMLE (SEQ ID NO: 33); AQQEECEFAPWTCEHMGSGSATGGSGSTASSGSGSAT HQEECEFSPWTCEHMLE (SEQ ID NO:34); e AQQEECEWDPWTCEHMGSGSATGGSGSTASSGSGSAT HQEECEWDPWTCEHMLE (SEQ ID. NO: 10).

[00032] Em uma modalidade da presente invenção, o alvo do MRD é ErbB2. Em uma modalidade da presente invenção, o alvo do MRD é ErbB3. Em uma modalidade da presente invenção, o alvo do MRD é a molécula de adesão de célula epitelial do antígeno de superfície associado com tumor (Ep-CAM).

[00033] Em uma modalidade da presente invenção, o alvo do MRD é VEGF. Em um aspecto, a sequência peptídica do MRD que se direciona ao VEGF é VEPNCDIHVMWEWECFERL (SEQ ID. NO:13).

[00034] Em uma modalidade da presente invenção, o alvo do MRD é um receptor do fator I de crescimento similar à insulina. Em um aspecto, a sequência peptídica do MRD que se direciona ao receptor do fator I de crescimento similar à insulina é SFYSCLESLVNGPAEKSRGQWDGCRKK (SEQ ID NO:14). Outros MRDs ilustrativos que se direcionam ao IGF-1R incluem, por exemplo, um peptídeo com a fórmula NFYQCIX1X2LX3X4X5PAEKSRGQWQECRTGG (SEQ ID NO:58), em que X1 é E ou D; X2 é qualquer aminoácido; X3 é qualquer aminoácido; X4 é qualquer aminoácido e X5 é qualquer aminoácido.

[00035] Os peptídeos ilustrativos que contêm a fórmula incluem: NFYQCIEMLASHPAEKSRGQWQECRTGG (SEQ ID NO: 35); NFYQCIEQLALRPAEKSRGQWQECRTGG (SEQ ID NO:36); NFYQCIDLLMAYPAEKSRGQWQECRTGG (SEQ ID NO:37); NFYQCIERLVTGPAEKSRGQWQECRTGG (SEQ ID NO:38); NFYQCIEYLAMKPAEKSRGQWQECRTGG (SEQ ID NO: 39); NFYQCIEALQSRPAEKSRGQWQECRTGG (SEQ ID NO: 40); NFYQCIEALSRSPAEKSRGQWQECRTGG (SEQ ID NO: 41); NFYQCIEHLSGSPAEKSRGQWQECRTG (SEQ ID NO: 42); NFYQCIESLAGGPAEKSRGQWQECRTG (SEQ ID NO: 43); NFYQCIEALVGVPAEKSRGQWQECRTG (SEQ ID NO: 44); NFYQCIEMLSLPPAEKSRGQWQECRTG (SEQ ID NO: 45); NFYQCIEVFWGRPAEKSRGQWQECRTG (SEQ ID NO: 46); NFYQCIEQLSSGPAEKSRGQWQECRTG (SEQ ID NO: 47); NFYQCIELLSARPAEKSRGQWAECRAG (SEQ ID NO: 48); e NFYQCIEALARTPAEKSRGQWVECRAP (SEQ ID NO: 49).

[00036] Em uma modalidade da presente invenção, o alvo do MRD é um antígeno de tumor.

[00037] Em uma modalidade da presente invenção, o alvo do MRD é um receptor do fator de crescimento epidérmico (EGFR). Em uma modalidade da presente invenção, o alvo do MRD é um fator angiogênico. Em uma modalidade da presente invenção, o alvo do MRD é um receptor angiogênico.

[00038] Em uma modalidade da presente invenção, o MRD é um peptídeo nativo vascular. Em um aspecto, a sequência peptídica do peptídeo nativo vascular é ACDCRGDCFCG (SEQ ID. NO:15).

[00039] Em uma modalidade da presente invenção, o alvo do MRD é um fator de crescimento de nervo. Em uma da presente invenção, o anticorpo se liga a um antígeno de superfície celular.

[00040] Em uma modalidade da presente invenção, o anticorpo ou o MRD se liga a EGFR, ErbB2, ErbB3, ErbB4, CD20, receptor do fator I de crescimento similar à insulina ou antígeno de membrana específico da próstata. Em um aspecto, a sequência peptídica do MRD que se direciona ao EGFR é VDNKFNKELEKAYNEIRNLPNLNGWQMTAFIASLVDDPSQSANLLAE AKKLNDAQAPK (SEQ ID NO: 16). Em um aspecto, a sequência peptídica do MRD que se direciona ao EGFR é VDNKFNKEMWIAWEEIRNLPNLNGWQMTAFIASLVDDPSQSANLLAE AKKLNDAQAPK (SEQ ID NO: 17). Em um aspecto da presente invenção, a sequência peptídica do MRD que se direciona ao ErbB2 é VDNKFNKEMRNAYWEIALLPNLNNQQKRAFIRSLYDDPSQSANLLAE AKKLNDAQAPK (SEQ ID NO: 18).

[00041] Em uma modalidade da presente invenção, o anticorpo se liga a um fator angiogênico.

[00042] Em uma modalidade da presente invenção, o anticorpo se liga a um receptor angiogênico.

[00043] A presente invenção se refere ainda a um polinucleotídeo isolado compreendendo uma sequência de nucleotídeos do anticorpo. Em um aspecto da presente invenção, um vetor compreende o polinucleotídeo. Ainda em outro aspecto, o polinucleotídeo está operacionalmente ligado com uma sequência reguladora que controla a expressão no polinucleotídeo. Em um aspecto, uma célula hospedeira compreende o polinucleotídeo ou a progênie.

[00044] A presente invenção se refere ainda a um método de tratamento de uma doença de um indivíduo que necessita do mesmo que é fornecido, o método compreendendo a administração de um anticorpo compreendendo um MRD. Em um aspecto, a doença é câncer. Em outro, a angiogênese indesejada é inibida. Ainda em outro aspecto, a angiogênese é modulada. Ainda em outro aspecto, o crescimento de tumor é inibido. Em outra modalidade, é descrito um método de tratamento compreendendo a administração de um agente terapêutico adicional junto com um anticorpo compreendendo um MRD.

[00045] A presente invenção se refere ainda a um método de produção de um anticorpo de comprimento total compreendendo um MRD que é descrito. Em um aspecto, o MRD é derivado de uma biblioteca de exibição de fago. Em outro, o MRD é derivado de ligantes naturais.

[00046] Em uma modalidade da presente invenção, o anticorpo é quimérico ou humanizado.

BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS

[00047] A figura 1 mostra a representação esquemática de planejamentos diferentes de BsAbs tetravalente similar à IgG.

[00048] A figura 2A mostra um pepticorpo típico como fusão de terminal C com Fc.

[00049] A figura 2B mostra um anticorpo com uma fusão de MRD terminal C com a cadeia leve do anticorpo.

[00050] A figura 2C mostra um anticorpo com uma fusão de MRD terminal N com a cadeia leve do anticorpo.

[00051] A figura 2D mostra um anticorpo com peptídeos de MRD exclusivos fundidos com cada término do anticorpo.

[00052] A figura 3 representa os resultados de um ELISA em que a integrina e a Ang2 estavam ligadas através de um anticorpo anti- integrina fundido com um MRD de direcionamento de ang-2.

[00053] A figura 4 representa os resultados de um ELISA em que a integrina e a Ang2 estavam ligadas através de um anticorpo anti- integrina fundido com um MRD de direcionamento de ang-2.

[00054] A figura 5 representa os resultados de um ELISA em que um anticorpo anti-ErbB2 estava fundido com um MRD que se direcionava à Ang2.

[00055] A figura 6 representa os resultados de um ELISA em que um MRD direcionado à Ang2 estava fundido com um anticorpo de ligação com o receptor do fator de crescimento de hepatócitos.

[00056] A figura 7 representa os resultados de um ELISA em que um MRD que se direciona à integrina estava fundido com um anticorpo de ligação a ErbB2.

[00057] A figura 8 representa os resultados de um ELISA em que um MRD que se direciona à integrina estava fundido com um anticorpo que se liga ao receptor do fator de crescimento de hepatócitos.

[00058] A figura 9 representa os resultados de um ELISA em que um MRD que se direciona ao receptor do fator I de crescimento similar à insulina estava fundido com um anticorpo de ligação a ErbB2.

[00059] A figura 10 representa os resultados de um ELISA em que um MRD que se direciona ao VEGF estava fundido com um anticorpo de ligação a ErbB2.

[00060] A figura 11 representa os resultados de um ELISA em que um MRD que se direciona à integrina estava fundido com um anticorpo catalítico.

[00061] A figura 12 representa os resultados de um ELISA em que um MRD que se direciona à Ang-2 estava fundido com um anticorpo catalítico.

[00062] A figura 13 representa os resultados de um ELISA em que um MRD que se direciona à integrina e à Ang-2 estava fundido com um anticorpo de ligação a ErbB2.

[00063] A figura 14 representa os resultados de um ELISA em que um MRD que se direciona à integrina estava fundido com um anticorpo que se liga a ErbB2.

[00064] A figura 15 representa os resultados de um ELISA em que um MRD que se direciona à integrina, à Ang-2 ou ao receptor do fator I de crescimento similar à insulina estava fundido com um anticorpo que se liga a ErbB2 ou ao receptor do fator de crescimento de hepatócitos com um peptídeo ligante curto.

[00065] A figura 16 representa os resultados de um ELISA em que um MRD que se direciona à integrina, à Ang-2 ou ao receptor do fator I de crescimento similar à insulina estava fundido com um anticorpo que se liga a ErbB2 ou ao receptor do fator de crescimento de hepatócitos com um peptídeo ligante longo.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

[00066] O termo "anticorpo" é utilizado aqui para se referir a moléculas de imunoglobulina intactas e inclui anticorpos policlonais e monoclonais, anticorpos quiméricos, de cadeia simples e humanizados. Um anticorpo intacto compreende pelo menos duas cadeias pesadas (H) e duas cadeias leves (L) interconectadas por ligações de dissulfeto. Cada cadeia pesada é compreendida de uma região variável de cadeia pesada (abreviada aqui como VH) e uma região constante de cadeia pesada. A região constante de cadeia pesada é compreendida de três domínios, CH1, CH2 e CH3. Cada cadeia leve é compreendida de uma região variável de cadeia leve (abreviada aqui como VL) e uma região constante de cadeia leve. A região constante de cadeia leve é compreendida de um domínio, CL. As regiões VH e VL podem ser adicionalmente subdivididas em regiões de hipervariabilidade, denominadas de regiões de determinação de complementaridade (CDR), intercaladas com regiões que são mais conservadas, denominadas regiões estruturais (FR). Cada VH e VL é composta de três CDRs e quatro FRs, dispostas do terminal amino para o terminal carboxila na ordem a seguir: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4. As regiões variáveis das cadeias pesadas e leves contêm um domínio de ligação que interage com um antígeno.

[00067] Um "anticorpo com especificidade dual" é utilizado aqui para se referir a uma molécula de imunoglobulina que contém imunoglobulinas com domínios variáveis duais, em que o domínio variável dual pode ser engenheirado partindo de quaisquer dois anticorpos monoclonais.

[00068] Um "sítio de combinação de anticorpos" é a porção estrutural de uma molécula de anticorpo compreendida de uma cadeia pesada e leve variável e regiões hipervariáveis que se ligam especificamente (intergem de forma imunológica com) um antígeno. O termo "reage de forma imunológica" em suas várias formas significa a ligação específica entre uma molécula contendo determinante antigênico e uma molécula contendo um sítio de combinação de anticorpo tal como uma molécula de anticorpo inteira ou uma parte da mesma.

[00069] O termo "pepticorpo" se refere a um peptídeo ou polipeptídeo compreendendo menos que um anticorpo intacto completo.

[00070] O termo "que ocorre naturalmente" quando utilizado em associação com materiais biológicos tais como moléculas de ácidos nucléicos, polipeptídeos, células hospedeiras e similares se refere aqueles que são encontrados na natureza e não são modificados por um ser humano.

[00071] "Anticorpo monoclonal" se refere a uma população de moléculas de anticorpos que contém apenas uma espécie de sítio de combinação de anticorpos capaz de reagir de forma imunológica com um epitopo particular. Um anticorpo monoclonal exibe assim tipicamente uma única afinidade de ligação por qualquer epitopo com o qual reage de forma imunológica. Um anticorpo monoclonal pode, portanto, conter uma molécula de anticorpo que possui um grande número de sítios de combinação de anticorpos, cada um imunoespecífico a um epitopo diferente, por exemplo, um anticorpo monoclonal biespecífico.

[00072] Um "domínio de reconhecimento modular" (MRD) ou "peptídeo de ligação alvo" é uma molécula, tal como uma proteína, uma glicoproteína e similares, que pode se ligar especificamente (não aleatoriamente) com uma molécula-alvo. A sequência de aminoácidos de um sítio de MRD pode tolerar algum grau de variabilidade e ainda manter um grau de capacidade de se ligar com a molécula-alvo. Além disso, alterações na sequência podem resultar em alterações na especificidade de ligação e na constante de ligação entre uma molécula-alvo pré-selecionada e o sítio de ligação.

[00073] "Receptor de superfície celular" se refere a moléculas e complexos de moléculas capazes de receber um sinal e de transmitir tal sinal ao longo da membrana plasmática de uma célula. Um exemplo de um receptor de superfície celular da presente invenção é um receptor de integrina ativado, por exemplo, um receptor de integrina αvβ3 ativado em uma célula metastásica.

[00074] O "sítio de ligação ao alvo" ou "sítio-alvo" é qualquer sequência de aminoácidos conhecida ou que ainda será descrita que possui a capacidade de se ligar seletivamente com um agente pré- selecionado. Os exemplos de sítios-alvo de referência são derivados de ligantes de integrina dependentes de RGD, isto é, fibronectina, fibrinogênio, vitronectina, fator de von Willebrand e similares, de receptores celulares tal como VEGF, ErbB2, peptídeo nativo vascular ou citocinas angiogênicas, de receptores de hormônios protéicos tais como receptor do fator I de crescimento similar à insulina, receptor do fator de crescimento epidérmico e similares e de antígenos tumorais.

[00075] O termo "proteína" é definido como um polímero biológico compreendendo unidades derivadas de aminoácidos ligados através de ligações peptídicas; uma proteína pode ser composta de duas ou mais cadeias.

[00076] Um "polipeptídeo de fusão" é um polipeptídeo compreendido de pelo menos dois polipeptídeos e opcionalmente uma sequência de ligação para ligar de forma operacional os dois polipeptídeos em um polipeptídeo contíguo. Os dois polipeptídeos ligados em um polipeptídeo de fusão são tipicamente derivados de duas fontes independentes e, portanto, um polipeptídeo de fusão compreende dois polipeptídeos ligados não encontrados normalmente ligados na natureza.

[00077] O termo "ligante" se refere a um peptídeo localizado entre o anticorpo e o MRD. Os ligantes podem ter de aproximadamente 2 até 20 aminoácidos, geralmente 4 até 15 aminoácidos.

[00078] "Célula-alvo" se refere a qualquer célula em um indivíduo (por exemplo, um ser humano ou um animal) que pode ser direcionada pelo anticorpo compreendendo um MRD da invenção. A célula-alvo pode ser uma célula que expressa ou superexpressa o sítio de ligação ao alvo, tal como um receptor de integrina ativado.

[00079] "Paciente", "indivíduo", "animal" ou "mamífero" são utilizados de forma intercambiável e referem-se a mamíferos tais como pacientes humanos e primatas não humanos, bem como animais experimentais tais como coelhos, ratos e camundongos e outros animais. Os animais incluem todos os vertebrados, por exemplo, mamíferos e não mamíferos, tais como ovinos, cães, bovinos, frangos, anfíbios e répteis.

[00080] "Tratar" ou "tratamento" inclui a administração do anticorpo compreendendo um MRD da presente invenção para prevenir ou retardar o início dos sintomas, complicações ou indícios bioquímicos de uma doença, aliviando os sintomas ou impedindo ou inibindo o desenvolvimento adicional da doença, do estado de saúde ou do distúrbio. O tratamento pode ser profilático (para prevenir ou retardar o início da doença ou para prevenir a manifestação de sintomas clínicos e subclínicos da mesma) ou supressão terapêutica ou alívio de sintomas após a manifestação da doença. O tratamento pode ser com a composição de anticorpo-MRD isoladamente ou esta pode ser utilizada em combinação com um agente terapêutico adicional.

[00081] Como utilizado aqui, os termos "farmaceuticamente aceitável(is)" ou "fisiologicamente tolerável(is)" e variações gramaticais dos mesmos, quando se referem a composições, carreadores, diluentes e reagentes, são utilizados de forma intercambiável e representam os materiais que são capazes de serem administrados a um ser humano sem a produção de efeitos fisiológicos indesejáveis tais como náusea, vertigem, distúrbios gástricos e similares.

[00082] "Modular", significa o ajuste ou a regulação da amplitude, da frequência, do grau ou da atividade. Em outro aspecto relacionado, tal modulação pode ser positivamente modulada (por exemplo, um aumento na frequência, no grau ou na atividade) ou negativamente modulada (por exemplo, um decréscimo na frequência, no grau ou na atividade).

[00083] "Câncer", "tumor" ou "malignidade" são utilizados como termos sinônimos e referem-se a qualquer um de um número de doenças que são caracterizadas pela proliferação anormal descontrolada de células, pela capacidade das células afetadas de se espalharem localmente ou através da corrente sanguínea e do sistema linfático para outras partes do corpo (metástase) bem como qualquer um de um número de aspectos estruturais e/ou moleculares característicos. Uma "célula cancerosa", "tumoral" ou "maligna" é entendida como uma célula que possui propriedades estruturais específicas, que não possui diferenciação e que é capaz de invadir e realizar metástase. Os exemplos de cânceres são câncer de mama, pulmonar, cerebral, ósseo, hepático, renal, de cólon, de cabeça e pescoço, de ovário, hematopoiético (por exemplo, leucemia) e de próstata.

[00084] "Anticorpo humanizado" ou "anticorpo quimérico" inclui anticorpos em que as sequências de CDR derivadas da linhagem germinativa de outra espécie de mamífero, tal como um camundongo, foram enxertadas nas sequências estruturais humanas.

[00085] A presente invenção descreve uma abordagem baseada na adaptação de peptídeos de ligação-alvo ou domínios de reconhecimento modular (MRDs) como fusões com anticorpos catalíticos ou não catalíticos que fornecem direcionamento eficiente de células tumorais ou moléculas solúveis enquanto deixa intacta a capacidade de ativação do profármaco do anticorpo catalítico. Os MRDs também podem estender a capacidade de ligação de anticorpos não catalíticos fornecendo uma abordagem eficiente para estender a funcionalidade de ligação de anticorpos, particularmente para finalidades terapêuticas.

[00086] Um aspecto da presente invenção se refere ao desenvolvimento de um anticorpo de comprimento total compreendendo um domínio de reconhecimento modular (MRD). A interação entre um ligante de proteína e seu sítio receptor-alvo ocorre frequentemente em uma interface relativamente grande. Entretanto, apenas alguns resíduos principais na interface contribuem para a maior parte da ligação. Assim, as moléculas de comprimento de peptídeo (geralmente 2 até 60 aminoácidos) podem se ligar com a proteína receptora de certo ligante de proteína grande. É considerado que os MRDs da presente invenção contêm uma sequência peptídica que se liga a sítios-alvo de interesse e possuem aproximadamente 2 até 60 aminoácidos.

[00087] A função das integrinas tais como αvβ3 e αvβ5 como marcadores associados a tumores foi bem documentada. Um estudo recente de 25 linhagens de células humanas permanentes estabelecidas de câncer de ovário avançado demonstrou que todas as linhagens eram positivas para a expressão de αvβ5 e muitas eram positivas para a expressão de αvβ3. Estudos também mostraram que αvβ3 e αvβ5 são altamente expressas em tecidos de tumores cervicais humanos. As integrinas também demonstraram efeitos terapêuticos em modelos de animais de sarcoma de Kaposi, melanoma e câncer de mama.

[00088] Um número de antagonistas das integrinas αvβ3 e αvβ5 está em desenvolvimento clínico. Estes incluem peptídeos RGD cíclicos e imitadores de RGD de molécula pequena sintéticos. Dois antagonistas de integrinas baseados em anticorpos estão atualmente em testes clínicos para o tratamento de câncer. O primeiro é Vitaxin, a forma humanizada do anticorpo murino anti-αvβ3 humana LM609. Um estudo de fase I de aumento de dose em pacientes com câncer demonstrou que era seguro para uso em seres humanos. Outro anticorpo em testes clínicos é CNT095, um mAb completamente humano que reconhece integrinas αv. Um estudo de Fase I de CNT095 em pacientes com uma variedade de tumores sólidos mostrou que este é bem tolerado. Também foi provado que o Cilengitide, um antagonista peptídico de αvβ3 e αvβ5, era seguro em testes de fase I. Além disso, havia vários estudos de direcionamento dos fármacos e de obtenção de imagens baseados no uso de ligantes para estes receptores. Estas observações pré-clínicas e clínicas demonstram a importância do direcionamento de αvβ3 e αvβ5 e estudos envolvendo o uso de anticorpos nesta estratégia relataram de forma coerente que o direcionamento através destas integrinas é seguro.

[00089] Um exemplo de um MRD que se liga à integrina é um sítio de ligação contendo o tripeptídeo RGD e é um exemplo dos métodos gerais descritos aqui. Os ligantes que possuem o motivo RGD como um domínio de reconhecimento mínimo são bem conhecidos, cuja uma lista parcial inclui, com o alvo de integrina correspondente entre parênteses, fibronectina (α3β1, α5β1, αvβ1, αIIbβ3, αvβ3 e α3β1) fibrinogênio (αMβ2 e αIIbβ1) fator de von Willebrand (αIIbβ3 e αvβ3) e vitronectina (αIIbβ3, αvβ3 e αvβ5).

[00090] Os exemplos de MRDs de direcionamento que contêm RGD úteis na presente invenção possuem as sequências de resíduos de aminoácidos mostradas a seguir: YCRGDCT (SEQ ID. NO: 3) PCRGDCL (SEQ ID. NO: 4) TCRGDCY (SEQ ID. NO: 5) LCRGDCF (SEQ ID. NO: 6)

[00091] Um MRD que imita um sítio de ligação não dependente de RGD em um receptor de integrina e que possui a especificidade de ligação ao alvo de um ligante de alta afinidade que reconhece a integrina selecionada é também considerado na presente invenção.

[00092] A angiogênese é essencial para muitos processos fisiológicos e patológicos. Foi mostrado que a Ang2 atua como uma molécula pró-angiogênica. A administração de inibidores seletivos de Ang2 é suficiente para suprimir tanto a angiogênese de tumor quanto a angiogênese de córnea. Portanto, a inibição de Ang2 isoladamente ou em combinação com a inibição de outros fatores angiogênicos tal como VEGF pode representar uma estratégia antiangiogênica eficiente para o tratamento de pacientes com tumores sólidos.

[00093] É considerado que os MRDs úteis na presente invenção incluem aqueles que se ligam a receptores angiogênicos, fatores angiogênicos e/ou Ang-2. Os exemplos de sequências de MRD que se direcionam à citocina angiogênica são listados a seguir: MGAQTNFMPMDDLEQRLYEQFILQQGLE (SEQ ID. NO: 7) MGAQTNFMPMDNDELLLYEQFILQQGLE (SEQ ID. NO: 8) MGAQTNFMPMDATETRLYEQFILQQGLE (SEQ ID. NO: 9) AQQEECEWDPWTCEHMGSGSATGGSGSTASSGSGSAT HQEECEWDPWTCEHMLE (SEQ ID. NO: 10) (2xCon4) MGAQTNFMPMDNDELLNYEQFILQQGLE (SEQ ID. NO: 11) PXDNDXLLNY (SEQ ID. NO: 12) em que X é em um dos 20 aminoácidos que ocorrem naturalmente MGAQTNFMPMDNDELLLYEQFILQQGLEGGSGSTASSGS GSSLGAQTNFMPMDNDELLLY (SEQ ID NO: 20) AQQEECEWDPWTCEHMGSGSATGGSGSTASSGSGSAT HQEECEWDPWTCEHMLE (SEQ ID. NO: 10) AQQEECEFAPWTCEHM ConFA (SEQ ID NO:21) nEFAPWTn central (SEQ ID NO: 22) em que n possui de aproximadamente 0 até 50 resíduos de aminoácidos AQQEECEFAPWTCEHMGSGSATGGSGSTASSGSGSAT HQEECEFAPWTCEHMLE (SEQ ID NO: 23) 2xConFA AQQEECELAPWTCEHM (SEQ ID NO: 24) ConLA XnELAPWTXn em que n possui de aproximadamente 0 até 50 resíduos de aminoácidos e X é qualquer aminoácido (SEQ ID NO: 25) AQQEECELAPWTCEHMGSGSATGGSGSTASSGSGSATH QEECELAPWTCEHMLE (SEQ ID NO: 26) 2xConLA AQQEECEFSPWTCEHM ConFS (SEQ ID NO: 27) XnEFSPWTXn em que n possui de aproximadamente 0 até 50 resíduos de aminoácidos e X é qualquer aminoácido (SEQ ID NO: 28) AQQEECEFSPWTCEHMGSGSATGGSGSTASSGSGSAT HQEECEFSPWTCEHMLE 2xConFS (SEQ ID NO: 29) AQQEECELEPWTCEHM ConLE (SEQ ID NO: 30) XnELEPWTXn em que n possui de aproximadamente 0 até 50 resíduos de aminoácidos (SEQ ID NO: 31) e em que X é qualquer aminoácido AQQEECELEPWTCEHMGSGSATGGSGSTASSGSGSATH QEECELEPWTCEHMLE 2xConLE (SEQ ID NO: 32)

[00094] Deve ser entendido que tais peptídeos podem estar presentes em dímeros, trímeros ou outros multímeros de natureza homóloga ou heteróloga. Por exemplo, é possível dimerizar sequências baseadas em Con idênticas tal como em 2xConFA para fornecer um dímero homólogo ou os peptídeos Con podem ser misturados de forma que ConFA seja combinado com ConLA para criar o heterodímero ConFA-LA com a sequência: AQQEECEFAPWTCEHMGSGSATGGSGSTASSGSGSAT HQEECELAPWTCEHMLE (SEQ ID NO: 33).

[00095] Outro heterodímero é ConFA combinado com ConFS para criar ConFA-FS com a sequência: AQQEECEFAPWTCEHMGSGSATGGSGSTASSGSGSAT HQEECEFSPWTCEHMLE (SEQ ID NO:34).

[00096] Um versado na técnica, fornecidos aqui os ensinamentos, considerará que outras tais combinações criarão MRDs de ligação à Ang2 funcionais como descrito aqui.

[00097] Em um aspecto, a invenção inclui um peptídeo que possui a sequência: NFYQCIX1X2LX3X4X5PAEKSRGQWQECRTGG (SEQ ID NO:58), em que X1 é E ou D; X2 é qualquer aminoácido; X3 é qualquer aminoácido; X4 é qualquer aminoácido e X5 é qualquer aminoácido.

[00098] A invenção inclui ainda peptídeos que possuem uma sequência central selecionada de: XnEFAPWTXn em que n possui de aproximadamente 0 até 50 resíduos de aminoácidos (SEQ ID NO: 22); XnELAPWTXn em que n possui de aproximadamente 0 até 50 resíduos de aminoácidos (SEQ ID NO: 25); XnEFSPWTXn em que n possui de aproximadamente 0 até 50 resíduos de aminoácidos (SEQ ID NO: 28); XnELEPWTXn em que n possui de aproximadamente 0 até 50 resíduos de aminoácidos (SEQ ID NO: 31); ou Xn AQQEECEX1X2PWTCEHMXn em que n possui de aproximadamente 0 até 50 resíduos de aminoácidos e X, X1 e X2 são qualquer aminoácido (SEQ ID NO:57).

[00099] As seleções com exibição de fago e os estudos estruturais de peptídeos que neutralizam VEGF em complexo com VEGF foram relatados. Estes estudos revelaram que o peptídeo v114 (VEPNCDIHVMWEWECFERL) (SEQ ID. NO: 13) é específico para VEGF, se liga com VEGF com afinidade de 0,2 μM e neutraliza a proliferação induzida por VEGF de Células Endoteliais da Veia Umbilical Humana (HUVEC). Uma vez que o VEGF é um homodímero, o peptídeo ocupa dois sítios idênticos em cada extremidade do homodímero de VEGF. Um anticorpo contendo um MRD que se direciona ao VEGF é considerado na presente invenção. Os anticorpos anti-VEGF podem ser encontrados, por exemplo, em Cancer Research 57, 4593-4599, outubro de 1997; J Biol Chem 281:10 6625, 2006, incorporado aqui como referência.

[000100] Os MRDs específicos ao receptor do fator I de crescimento similar à insulina podem ser utilizados na presente invenção. Um exemplo de uma sequência de MRD que se direciona ao receptor do fator I de crescimento similar à insulina é SFYSCLESLVNGPAEKSRGQWDGCRKK (SEQ ID NO: 14). MRDs para IGF-1R adicionais incluem os seguintes: NFYQCIEMLASHPAEKSRGQWQECRTGG (SEQ ID NO: 35) NFYQCIEQLALRPAEKSRGQWQECRTGG (SEQ ID NO:36) NFYQCIDLLMAYPAEKSRGQWQECRTGG (SEQ ID NO:37) NFYQCIERLVTGPAEKSRGQWQECRTGG (SEQ ID NO:38) NFYQCIEYLAMKPAEKSRGQWQECRTGG (SEQ ID NO: 39) NFYQCIEALQSRPAEKSRGQWQECRTGG (SEQ ID NO: 40) NFYQCIEALSRSPAEKSRGQWQECRTGG (SEQ ID NO: 41) NFYQCIEHLSGSPAEKSRGQWQECRTG (SEQ ID NO: 42) NFYQCIESLAGGPAEKSRGQWQECRTG (SEQ ID NO: 43) NFYQCIEALVGVPAEKSRGQWQECRTG (SEQ ID NO: 44) NFYQCIEMLSLPPAEKSRGQWQECRTG (SEQ ID NO: 45) NFYQCIEVFWGRPAEKSRGQWQECRTG (SEQ ID NO: 46) NFYQCIEQLSSGPAEKSRGQWQECRTG (SEQ ID NO: 47) NFYQCIELLSARPAEKSRGQWAECRAG (SEQ ID NO: 48) NFYQCIEALARTPAEKSRGQWVECRAP (SEQ ID NO: 49)

[000101] Um número de estudos caracterizou a eficácia de ligação do peptídeo nativo vascular com outras proteínas como IL-I2 ou fármacos para direcionar o seu fornecimento em animais vivos. Como tais, os MRDs nativos vasculares são considerados para uso na presente invenção. Um exemplo de uma sequência de MRD que é um peptídeo nativo vascular é ACDCRGDCFCG (SEQ ID NO: 15).

[000102] Vários outros sítios de ligação ao alvo são considerados pela presente invenção, incluindo o receptor do fator de crescimento epidérmico (EGFR), CD20, antígenos tumorais, ErbB2, ErbB3, ErbB4, o receptor do fator I de crescimento similar à insulina, o fator de crescimento de nervo (NGR), o receptor de fator de crescimento de hepatócitos e a molécula de adesão de célula epitelial do antígeno de superfície associado com tumor (Ep-CAM). Os MRDs podem ser direcionados para estes sítios de ligação ao alvo.

[000103] Os exemplos de sequências de MRD que se ligam ao EGFR são listados a seguir: VDNKFNKELEKAYNEIRNLPNLNGWQMTAFIASLVDDPSQ SANLLAEAKKLNDAQAPK (SEQ ID. NO: 16). VDNKFNKEMWIAWEEIRNLPNLNGWQMTAFIASLVDDPS QSANLLAEAKKLNDAQAPK (SEQ ID. NO: 17).

[000104] Um exemplo de uma sequência de MRD que se liga com ErbB2 é listado a seguir: VDNKFNKEMRNAYWEIALLPNLNNQQKRAFIRSLYDDPS QSANLLAEAKKLNDAQAPK (SEQ ID. NO: 18).

[000105] A sequência do MRD pode ser determinada de várias maneiras. As sequências de MRD podem ser derivadas de ligantes naturais ou sequências conhecidas que se ligam a um sítio de ligação ao alvo específico podem ser utilizadas. Adicionalmente, a tecnologia de exibição de fago surgiu como um método poderoso de identificação de peptídeos que se ligam aos receptores-alvo. Nas bibliotecas de exibição de fago de peptídeos, sequências peptídicas aleatórias podem ser exibidas através da fusão com proteínas do revestimento de fago filamentoso. Os métodos para elucidar os sítios de ligação nos polipeptídeos utilizando vetores de exibição de fago foram descritos anteriormente, em particular, na WO 94/18221. Os métodos envolvem geralmente o uso de um sistema de vetor de expressão de superfície de fago filamentoso (fagemídeo) para a clonagem e a expressão de polipeptídeos que se ligam ao sítio-alvo de interesse pré-selecionado.

[000106] Os métodos da presente invenção para a preparação de MRDs envolvem o uso de vetores de exibição de fago por sua vantagem particular de fornecer um meio para verificar uma população muito grande de proteínas de exibição expressas e dessa maneira localizar um ou mais clones específicos que codificam uma reatividade de ligação ao alvo desejada. Uma vez que a sequência do MRD foi elucidada, os peptídeos podem ser preparados através de qualquer um dos métodos divulgados na arte.

[000107] As variantes e os derivados dos MRDs são incluídos dentro do âmbito da presente invenção. Estão incluídos dentro das variantes as variantes por inserção, por deleção e por substituição bem como variantes que incluem os MRDs apresentados aqui com aminoácidos adicionais no terminal N e/ou C, incluindo de aproximadamente 0 até 50, 0 até 40, 0 até 30, 0 até 20 aminoácidos e similares. É entendido que um MRD particular da presente invenção pode conter um, dois ou todos os três tipos de variantes. As variantes por inserção e por substituição podem conter aminoácidos naturais, aminoácidos não convencionais ou ambos.

[000108] É considerado que anticorpos catalíticos e não catalíticos podem ser utilizados na presente invenção. O anticorpo 38C2 é um hibridoma que secreta anticorpos e foi descrito anteriormente na WO 97/21803. O 38C2 contém um sítio de combinação de anticorpo que catalisa a reação de adição de aldol entre um doador alifático e um receptor de aldeído. Em um modelo de camundongo singênico de neuroblastoma, a administração sistêmcia de um profármaco de etoposídeo e a injeção intratumor do Ab 38C2 inibiam o crescimento de tumor.

[000109] Outros anticorpos de interesse para esta invenção incluem os anticorpos de ligação com A33. O antígeno A33 humano é uma glicoproteína de transmembrana da superfamília de Ig. A função do antígeno A33 humano no tecido de cólon normal e maligno ainda não é conhecida, entretanto, algumas propriedades do antígeno A33 sugerem que é um alvo promissor para imunoterapia de câncer de cólon. Estas propriedades incluem (i) o padrão de expressão altamente restrito do antígeno A33, (ii) a expressão de grandes quantidades do antígeno A33 em células de câncer de cólon, (iii) a ausência de antígeno A33 secretado ou espalhado e (iv) o fato de que após a ligação do anticorpo A33 ao antígeno A33, o anticorpo A33 é internalizado e sequestrado em vesículas e (v) o direcionamento do anticorpo A33 para o câncer de cólon que expressa o antígeno A33 em estudos clínicos preliminares. A fusão de um MRD direcionado para A33 com um anticorpo catalítico ou não catalítico aumentaria a eficiência terapêutica de anticorpos que se direcionam para A33.

[000110] A presente invenção considera também a preparação de anticorpos mono-, bi-, tri-, tetra- e pentaespecíficos. É considerado que os anticorpos utilizados na presente invenção podem ser preparados através de qualquer método conhecido na técnica.

[000111] Nas moléculas de fusão de anticorpo-MRD preparadas de acordo com a presente invenção, o MRD pode ser ligado a um anticorpo através do terminal N ou do terminal C do peptídeo. O MRD pode ser ligado ao anticorpo na extremidade terminal C da cadeia pesada do anticorpo, na extremidade terminal N da cadeia pesada do anticorpo, na extremidade terminal C da cadeia leve do anticorpo ou na extremidade terminal N da cadeia leve do anticorpo. O MRD pode ser ligado ao anticorpo diretamente ou ligado através de um peptídeo ligante opcional, que pode ter entre 2 até 20 peptídeos de comprimento. O peptídeo ligante pode conter um peptídeo ligante curto com a sequência GGGS (SEQ ID. NO:1), um peptídeo ligante médio com a sequência SSGGGGSGGGGGGSS (SEQ ID. NO:2) ou um peptídeo ligante longo com a sequência SSGGGGSGGGGGGSSRSS (SEQ ID NO: 19). A presente invenção fornece ainda dois ou mais MRDs que estão ligados com qualquer extremidade terminal do anticorpo. É também considerado que dois ou mais MRDs podem ser ligados diretamente ou ligados através de um peptídeo ligante com duas ou mais extremidades terminais do anticorpo. Os vários MRDs podem se direcionar para o mesmo sítio de ligação ao alvo ou dois ou mais sítios de ligação ao alvo diferentes. Sequências peptídicas adicionais podem ser adicionadas para aumentar a estabilidade in vivo do MRD.

[000112] As moléculas de fusão de anticorpo-MRD podem ser codificadas por um polinucleotídeo compreendendo uma sequência de nucleotídeos. Um vetor pode conter a sequência de polinucleotídeo. A sequência de polinucleotídeo também pode ser ligada com uma sequência reguladora que controla a expressão do polinucleotídeo em uma célula hospedeira. Uma célula hospedeira ou sua progênie, pode conter o polinucleotídeo que codifica a molécula de fusão de anticorpo- MRD.

[000113] A presente invenção considera composições terapêuticas úteis para a prática dos métodos terapêuticos descritos aqui. As composições terapêuticas da presente invenção contêm um carreador fisiologicamente tolerável junto com pelo menos uma espécie de anticorpo compreendendo um MRD como descrito aqui, dissolvido ou disperso ali como um ingrediente ativo. Em uma modalidade preferida, a composição terapêutica não é imunogênica quando administrada a um paciente humano com finalidades terapêuticas.

[000114] A preparação de uma composição farmacológica que contém ingredientes ativos dissolvidos ou dispersos na mesma é bem entendida na técnica. Tipicamente tais composições são preparadas na forma de esterilizados injetáveis na forma de soluções ou suspensões líquidas, aquosas ou não aquosas, entretanto, formas sólidas adequadas para soluções ou suspensões, em líquido antes do uso também podem ser preparadas. A preparação também pode ser emulsificada. Assim, uma composição contendo anticorpo - MRD pode tomar a forma de soluções, suspensões, comprimidos, cápsulas, formulações de liberação prolongada ou pós ou outras formas de composições.

[000115] O ingrediente ativo pode ser misturado com excipientes que são farmaceuticamente aceitáveis e compatíveis com o ingrediente ativo e em quantidades adequadas para uso nos métodos terapêuticos descritos aqui. Os excipientes adequados são, por exemplo, água, solução salina, dextrose, glicerol, etanol ou similar e combinações dos mesmos. Em adição, se desejado, a composição pode conter quantidades menores de substâncias auxiliares tais como agentes umectantes ou emulsificantes, agentes de tamponamento do pH e similares que aumentam a eficiência do ingrediente ativo.

[000116] A composição terapêutica da presente invenção pode incluir sais farmaceuticamente aceitáveis dos componentes contidos na mesma. Os sais farmaceuticamente aceitáveis incluem os sais de adição ácida (formados com os grupos amino livres do polipeptídeo) que são formados com ácidos inorgânicos tais como, por exemplo, ácidos clorídricos ou fosfóricos ou tais sais orgânicos como acético, tartárico, mandélico e similares. Os sais formados com os grupos carboxila livres também podem ser derivados de bases inorgânicas tais como, por exemplo, hidróxidos de sódio, potássio, amônio, cálcio ou férrico e tais bases orgânicas como isopropilamina, trimetilamina, 2- etilamino etanol, histidina, procaína e similares.

[000117] Os carreadores fisiologicamente toleráveis são bem conhecidos na técnica. Os exemplos de carreadores líquidos são soluções aquosas esterilizadas que não contêm materiais em adição aos ingredientes ativos e água ou contêm um tampão tal como fosfato de sódio em um valor de pH fisiológico, uma solução salina fisiológica ou ambos, tal como solução salina tamponada com fosfato. Ainda, os carreadores aquosos podem conter mais de um sal tamponante, bem como sais tais como cloretos de sódio e potássio, dextrose, propileno glicol, polietileno glicol e outros solutos.

[000118] As composições líquidas também podem conter fases líquidas em adição a e à exclusão de água.

[000119] Os exemplos de tais fases líquidas adicionais são glicerina, óleos vegetais tal como óleo de semente de algodão, ésteres orgânicos tal como oleato de etila e emulsões de água-óleo.

[000120] Uma composição terapêutica contém um anticorpo compreendendo um MRD da presente invenção, tipicamente em uma quantidade de pelo menos 0,1 porcento em peso de anticorpo por peso de composição terapêutica total. Uma porcentagem em peso é uma proporção em peso de anticorpo em relação à composição total. Assim, por exemplo, 0,1 porcento em peso é 0,1 gramas de anticorpo- MRD por 100 gramas de composição total.

[000121] Uma composição terapêutica que contém anticorpo contém tipicamente aproximadamente 10 microgramas (μg) por mililitro (mL) até aproximadamente 100 miligramas (mg) por mL de anticorpo como o ingrediente ativo por volume de composição e mais preferencialmente contém aproximadamente 1 mg/mL até aproximadamente 10 mg/mL (isto é, aproximadamente 0,1 até 1 porcento em peso).

[000122] Uma composição terapêutica em outra modalidade contém um polipeptídeo da presente invenção, tipicamente em uma quantidade de pelo menos 0,1 porcento em peso de polipeptídeo por peso de composição terapêutica total. Uma porcentagem em peso é uma proporção em peso de polipeptídeo em relação à composição total. Assim, por exemplo, 0,1 porcento em peso é 0,1 gramas de polipeptídeo por 100 gramas de composição total.

[000123] Preferencialmente, uma composição terapêutica que contém polipeptídeo contém tipicamente aproximadamente 10 microgramas (μg) por mililitro (mL) até aproximadamente 100 miligramas (mg) por mL de polipeptídeo como o ingrediente ativo por volume de composição e mais preferencialmente contém aproximadamente 1 mg/mL até aproximadamente 10 mg/mL (isto é, aproximadamente 0,1 até 1 por cento em peso).

[000124] Em vista do benefício de utilizar anticorpos humanizados ou quiméricos in vivo em pacientes humanos, as moléculas de anticorpo- MRD descritas aqui são particularmente bem adequadas para o uso in vivo como um reagente terapêutico. O método compreende a administração ao paciente de uma quantidade terapeuticamente eficiente de uma composição fisiologicamente tolerável que contém um anticorpo compreendendo um MRD da invenção.

[000125] As faixas de dosagem para a administração do anticorpo compreendendo um MRD da invenção são aquelas grandes o suficiente para produzir o efeito desejado em que os sintomas da doença mediados pela molécula-alvo são melhorados. A dosagem não deve ser tão grande de forma a causar efeitos colaterais adversos, tais como síndromes de hiperviscosidade, edema pulmonar, falência cardíaca congestiva e similares. Geralmente, a dosagem variará com a idade, o estado de saúde, o sexo e a extensão da doença no paciente e pode ser determinada por um versado na técnica. A dosagem pode ser ajustada pelo médico do indivíduo no caso de qualquer complicação.

[000126] Uma quantidade terapeuticamente eficiente de um anticorpo compreendendo um MRD desta invenção é tipicamente uma quantidade de anticorpo tal que quando administrada em uma composição fisiologicamente tolerável é suficiente para atingir uma concentração no plasma de aproximadamente 0,1 micrograma (μg) por mililitro (mL) até aproximadamente 100 μg/mL, preferencialmente de aproximadamente 1 μg/mL até aproximadamente 5 μg/mL e geralmente aproximadamente 5 μg/mL. Determinada diferentemente, a dosagem pode variar de aproximadamente 0,1 mg/kg até aproximadamente 300 mg/kg, preferencialmente de aproximadamente 0,2 mg/kg até aproximadamente 200 mg/kg, mais preferencialmente de aproximadamente 0,5 mg/kg até aproximadamente 20 mg/kg, em uma ou mais administrações de doses ao dia, durante um ou vários dias.

[000127] O anticorpo compreendendo um MRD da invenção pode ser administrado de forma parenteral através de injeção ou através de infusão gradual ao longo do tempo. Embora a molécula-alvo possa tipicamente ser acessada no corpo através da administração sistêmica e, portanto, mais frequentemente tratada por administração intravenosa de composições terapêuticas, são considerados outros tecidos e meios de fornecimento em que há uma probabilidade de que o tecido-alvo contenha a molécula-alvo. Assim, os anticorpos compreendendo um MRD da invenção podem ser administrados de forma intravenosa, intraperitoneal, intramuscular, subcutânea, intracavidade, transdermal e podem ser fornecidos através de meios peristálticos.

[000128] As composições terapêuticas que contêm um anticorpo monoclonal humano ou um polipeptídeo desta invenção são convencionalmente administradas de forma intravenosa, como através de injeção de uma dose unitária, por exemplo. O termo "dose unitária" quando utilizado em referência a uma composição terapêutica da presente invenção se refere a unidades fisicamente distintas adequadas como dosagem unitária para o indivíduo, cada unidade contendo uma quantidade predeterminada de material ativo calculado para produzir o efeito terapêutico desejado em associação com o diluente requerido; isto é, carreador ou veículo.

[000129] As composições são administradas de uma maneira compatível com uma formulação de dosagem e em uma quantidade terapeuticamente eficiente. A quantidade que será administrada depende do indivíduo que será tratado, da capacidade do sistema do indivíduo de utilizar o ingrediente ativo e do grau de efeito terapêutico desejado. As quantidades precisas de ingrediente ativo necessárias para serem administradas dependem do julgamento do clínico e são peculiares para cada indivíduo. Entretanto, as faixas de dosagem adequadas para a aplicação sistêmica são divulgadas aqui e dependem da rota de administração. Os regimes adequados para a administração também são variáveis, mas são exemplificados por uma administração inicial seguida por doses repetidas em intervalos de uma ou mais horas por uma injeção subsequente ou outra administração. Alternativamente, é considerada uma infusão intravenosa contínua suficiente para manter concentrações no sangue nas faixas especificadas para terapias in vivo.

[000130] É pretendido que os exemplos a seguir ilustrem, mas não limitem a invenção.

EXEMPLOS Exemplo 1. Moléculas de Anticorpo-MRD que se Direcionam à Integrina

[000131] Novas moléculas de fusão de anticorpo-MRD foram preparadas através da fusão de peptídeos que se direcionam a uma integrina αvβ3 com o anticorpo catalítico 38C2. As fusões nos terminais N e nos terminais C da cadeia leve e nos terminais C da cadeia pesada eram as mais eficientes. Utilizando citometria de fluxo, foi mostrado que os conjugados de anticorpo se ligam eficientemente às células de câncer de mama humano que expressam a integrina αvβ3. Os conjugados de anticorpo também mantinham a atividade de retro-aldol de seu anticorpo catalítico 38C2 original, que é medida por metodol e pela ativação do profármaco doxorrubicina. Isto demonstra que o direcionamento para as células e a capacidade do anticorpo catalítico podem ser eficientemente combinados para quimioterapia seletiva.

Exemplo 2. Moléculas de Anticorpo-MRD que se Direcionam à Citocina Angiogênica

[000132] Foram construídas as moléculas de fusão de anticorpo - MRD que se direcionam à citocina angiogênica. O anticorpo utilizado foi 38C2, que foi fundido com um MRD contendo o peptídeo 2xCon4 (AQQEECEWDPWTCEHMGSGSATGGSGSTASSGSGSATHQEECE WDPWTCEHMLE (SEQ ID. NO: 10)). O peptídeo do MRD estava fundido com o terminal N ou C da cadeia leve e o terminal C da cadeia pesada. Resultados similares foram observados com outros peptídeos Ang-2 MRD. Os peptídeos Ang-2 MRD adicionais incluem: LM-2x-32 MGAQTNFMPMDNDELLLYEQFILQQGLEGGSGSTASSGS GSSLGAQTNFMPMDNDELLLY (SEQ ID NO:20) AQQEECEWDPWTCEHMGSGSATGGSGSTASSGSGSAT HQEECEWDPWTCEHMLE (2xCon4) (SEQ ID. NO: 10) AQQEECEFAPWTCEHM ConFA (SEQ ID NO:21) XnEFAPWTXn central em que n possui de aproximadamente 0 até 50 resíduos de aminoácidos (SEQ ID NO:22) AQQEECEFAPWTCEHMGSGSATGGSGSTASSGSGSAT HQEECEFAPWTCEHMLE 2xConFA (SEQ ID NO:23) AQQEECELAPWTCEHM ConLA (SEQ ID NO:24) XnELAPWTXn em que n possui de aproximadamente 0 até 50 resíduos de aminoácidos (SEQ ID NO:25) AQQEECELAPWTCEHMGSGSATGGSGSTASSGSGSATH QEECELAPWTCEHMLE 2xConLA (SEQ ID NO:26) AQQEECEFSPWTCEHM ConFS (SEQ ID NO:27) XnEFSPWTXn em que n possui de aproximadamente 0 até 50 resíduos de aminoácidos (SEQ ID NO:28) AQQEECEFSPWTCEHMGSGSATGGSGSTASSGSGSAT HQEECEFSPWTCEHMLE 2xConFS (SEQ ID NO:29) AQQEECELEPWTCEHM ConLE (SEQ ID NO:30) XnELEPWTXn em que n possui de aproximadamente 0 até 50 resíduos de aminoácidos (SEQ ID NO:31) AQQEECELEPWTCEHMGSGSATGGSGSTASSGSGSATH QEECELEPWTCEHMLE 2xConLE (SEQ ID NO:32).

[000133] Deve ser entendido que tais peptídeos podem estar presentes em dímeros, trímeros ou outros multímeros de natureza homóloga ou heteróloga. Por exemplo, pode-se dimerizar sequências baseadas em Con idênticas tal como em 2xConFA para fornecer um dímero homólogo ou os peptídeos Con podem ser misturados de forma que ConFA é combinado com ConLA para criar o heterodímero ConFA-LA com a sequência: AQQEECEFAPWTCEHMGSGSATGGSGSTASSGSGSAT HQEECELAPWTCEHMLE (SEQ ID NO:33).

[000134] Outro heterodímero ilustrativo é ConFA combinado com ConFS para criar ConFA-FS com a sequência: AQQEECEFAPWTCEHMGSGSATGGSGSTASSGSGSAT HQEECEFSPWTCEHMLE (SEQ ID NO:34).

[000135] Um versado na técnica, fornecidos os ensinamentos contidos aqui, considerará que outras tais combinações criarão MRDs de ligação à Ang2 funcionais com descrito aqui.

Exemplo 3. Fusões de anticorpo-MRD com Anticorpos não Catalíticos

[000136] Um anticorpo monoclonal de camundongo humanizado, LM609, direcionado para a integrina αvβ3 humana foi descrito anteriormente. (Rader, C. e outros, 1998. Rader C, Cheresh DA, Barbas CF 3rd. Proc Natl Acad Sci U S A. 1998 Jul 21;95(15):8910-5).

[000137] Um Ab monoclonal não catalítico humano, JC7U foi fundido com um MRD anti-Ang2 contendo 2xCon4 (AQQEECEWDPWTCEHMGSGSATGGSGSTASSGSGSATHQEECE WDPWTCEHMLE (SEQ ID. NO: 10)) no terminal N ou C da cadeia leve. O 2xCon4 (AQQEECEWDPWTCEHMGSGSATGGSGSTASSGSGSATHQEECE WDPWTCEHMLE (SEQ ID. NO: 10)) foi estudado como uma fusão terminal N à cadeia Kappa do anticorpo (2xCon4-JC7U) e como uma fusão terminal C (JC7U-2xCon4). Ambas as fusões mantinham a ligação de integrina e Ang2. Como mostrado no painel à esquerda da figura 3, ambas as construções de anticorpo (2xCon4-JC7U e JC7U- 2xCon4) se ligavam especificamente à Ang2 recombinante como demonstrado por estudos de ELISA. A ligação à Ang2, entretanto, é significativamente maior com JC7U-2xCon4, que possui a fusão 2xCon4 (SEQ ID. NO: 10) no terminal C da cadeia leve do anticorpo. O painel à direita da figura 3 representa a ligação de Ang2-JC7U e JC7U-Ang2 com a integrina αvβ3. Os resultados mostram que a fusão de 2xCon4 (SEQ ID. NO: 10) com o terminal N ou C da cadeia leve não afeta a ligação de mAb JC7U com a integrina αvβ3. A figura 4 representa outro estudo de ELISA utilizando as mesmas construções de fusão de anticorpo-MRD.

Exemplo 4. Moléculas de Fusão Herceptina - MRD

[000138] Outro exemplo de fusões de MRD com um anticorpo não catalítico são as construções de fusão Herceptina - MRD. As fusões Herceptina-MRD são multifuncionais, ambos antagonistas de integrina αv de molécula pequena e o anticorpo que se direciona à integrina programado quimicamente exibe eficácia notável na prevenção da metástase de câncer de mama através da interferência com a adesão e a proliferação celular mediada por αv. As fusões de MRD contendo Herceptina-2xCon4 (que se direcionam a ErbB2 e ang2) e Herceptina- V114 (que se direcionam a ErbB2 e VEGF) e Herceptina-RGD-4C- 2xCon4 (que se direcionam a ErbB2, ang2 e integrina) são eficientes.

Exemplo 5. Moléculas de Anticorpo-MRD que se Direcionam ao VEGF

[000139] Foi construído um anticorpo que contém um MRD que se direciona ao VEGF. Um MRD que se direciona a v114 (SEQ ID. NO. 13) foi fundido no terminal N da cadeia kappa de 38C2 e Herceptina utilizando a sequência do ligante longo (SEQ ID. NO. 2). A expressão e o teste das construções de fusão de anticorpo-MRD resultantes demonstraram forte ligação ao VEGF,

Exemplo 6. Moléculas de Anticorpo-MRD que se Direcionam ao IGF- 1R

[000140] Foi estudada a fusão de um MRD que se direciona ao IGF- 1R (SFYSCLESLVNGPAEKSRGQWDGCRKK (SEQ ID. NO: 14)) com o terminal N da cadeia kappa de 38C2 e Herceptina utilizando a sequência do ligante longo como um conector. A expressão e o teste das construções de fusão de anticorpo-MRD resultantes demonstraram forte ligação ao IGF-1R. Clones adicionais exibindo alta ligação ao IGR-1R também foram indentificados após várias rodadas de mutagênese e verificação. As sequências preferidas listadas a seguir não exibem afinidade significativa ou de ligação ao receptor da insulina. (vide a Tabela 2). Tabela 1: Molde para mutagênese adicional:

Exemplo 7. Moléculas de Anticorpo-MRD que se Direcionam à Ang-2 que se Ligam a ErbB2

[000141] Foi construído um anticorpo que contém um MRD que se direciona à Ang-2 (L17) fundido com a cadeia leve de um anticorpo que se liga a ErbB2. Qualquer uma da sequência do ligante curto, da sequência do ligante longo ou da 4a alça na região constante de cadeia leve foi utilizada como um ligante. A figura 5 representa os resultados de um ELISA utilizando construções contendo uma fusão de terminal N de MRD que se direciona à Ang-2 com o anticorpo para ErbB2 com o peptídeo ligante curto (GGGS (SEQ ID NO: 1)) (L17-sL- Her), uma fusão de terminal C de MRD que se direciona à Ang-2 com o anticorpo para ErbB2 com o peptídeo ligante curto (Her-sL-L17), uma fusão de terminal C de MRD que se direciona à Ang-2 com o anticorpo para ErbB2 com a 4a alça na região constante de cadeia leve (Her-lo-L17) ou uma fusão de terminal N de MRD que se direciona à Ang-2 com o anticorpo para ErbB2 com o peptídeo ligante longo (SSGGGGSGGGGGGSSRSS (SEQ ID NO: 19)) (L17-IL-Her). O ErbB2 foi ligado com graus variáveis por todas as construções. Entretanto, Ang-2 foi ligada apenas por Her-sL-L17 e L17-IL-Her.

Exemplo 8. Moléculas de Anticorpo-MRD que se Direcionam à Ang-2 que se Ligam ao Receptor de Fator de Crescimento de Hepatócitos

[000142] Foi feita uma fusão de um MRD que se direciona à Ang-2 (L17) com o terminal N ou o terminal C da cadeia leve do anticorpo Met, que se liga ao receptor de fator de crescimento de hepatócitos. A sequência do ligante curto ou a sequência do ligante longo foi utilizada como um conector. A figura 6 representa os resultados de um ELISA utilizando construções contendo fusão de terminal N de MRD que se direciona à Ang-2 com o anticorpo Met com o peptídeo de ligante curto (GGGS (SEQ ID NO: 1)) (L17-sL-Met), fusão de terminal N de MRD que se direciona à Ang-2 com o anticorpo Met com o peptídeo ligante longo (SSGGGGSGGGGGGSSRSS (SEQ ID NO: 19)) (L17-lL-Met) e fusão de terminal C de MRD que se direciona à Ang-2 com o anticorpo Met com o peptídeo ligante longo (Met-iL-L17). A expressão e o teste das construções de fusão de anticorpo-MRD resultantes demonstraram forte inibição de Ang-2 quando o peptídeo ligante longo foi utilizado. A fusão do MRD que se direciona à Ang-2 com o terminal C da cadeia leve do anticorpo resultou em uma ligação ligeiramente maior com a Ang-2 que a fusão da Ang-2 que se direciona ao terminal N da cadeia leve do anticorpo.

Exemplo 9. Moléculas de Anticorpo-MRD que se Direcionam à Integrina que se Ligam a ErbB2

[000143] Foi construído um anticorpo que contém um MRD que se direciona à integrina αvβ3 (RGD4C) fundido com a cadeia leve de um anticorpo Herceptina que se liga a ErbB2 (Her). Qualquer uma da sequência do ligante curto, da sequência do ligante longo ou da 4a alça na região constante de cadeia leve foi utilizada como um ligante. A figura 7 representa os resultados de um ELISA utilizando construções contendo uma fusão de terminal N de MRD que se direciona à integrina αvβ3 com o anticorpo para ErbB2 com o peptídeo ligante curto (GGGS (SEQ ID NO: 1)) (RGD4C-sL-Her), uma fusão de terminal C de MRD que se direciona à integrina αvβ3 com o anticorpo para ErbB2 com o peptídeo ligante curto (Her-sL-RGD4C), uma fusão de terminal C de MRD que se direciona à integrina αvβ3 com o anticorpo para ErbB2 com a 4a alça na região constante de cadeia leve (Her-lo- RGD4C) ou uma fusão de terminal N de MRD que se direciona à integrina αvβ3 com o anticorpo para ErbB2 com o peptídeo ligante longo (SSGGGGSGGGGGGSSRSS (SEQ ID NO: 19)) (RGD4C-IL- Her). O ErbB2 foi ligado com graus variáveis por todas as construções. Entretanto, a integrina αvβ3 foi ligada apenas por RGD4C-IL-Her.

Exemplo 10. Moléculas de Anticorpo-MRD que se Direcionam à Integrina que se Ligam ao Receptor de Fator de Crescimento de Hepatócitos

[000144] Foi construído um anticorpo que contém um MRD que se direciona à integrina αvβ3 (RGD4C) fundido com a cadeia leve de um anticorpo que se liga ao receptor de fator de crescimento de hepatócitos (Met). Foram utilizadas as construções de anticorpo-MRD contendo a sequência do ligante longo. A figura 8 representa os resultados de um ELISA utilizando construções contendo uma fusão de terminal N de MRD que se direciona à integrina αvβ3 com o anticorpo do receptor de fator de crescimento de hepatócitos (RGD4C- IL-Met) ou uma fusão de terminal C de MRD que se direciona à integrina αvβ3 com o anticorpo do receptor de fator de crescimento de hepatócitos (Met-IL-RGD4C). O RGD4C-IL-Met demonstrou forte ligação à integrina αvβ3.

Exemplo 11. Moléculas de Anticorpo-MRD que se Direcionam ao Receptor do Fator I de Crescimento Similar à Insulina que se Ligam a ErbB2

[000145] Foram construídos os anticorpos que contêm um MRD que se direciona ao receptor do fator I de crescimento similar à insulina (RP) fundido com a cadeia leve de um anticorpo que se liga a ErbB2 (Her). Qualquer um do peptídeo ligante curto, do peptídeo ligante longo ou da 4a alça na região constante de cadeia leve foi utilizado como um ligante. (Carter e outros, Proc Natl Acad Sci U S A. 1992 May 15;89(10):4285-9.

[000146] PMID: 1350088 [PubMed - indexado em MEDLINE]; Patente U.S. No 5.677.171; Depósito na ATCC 10463, todos incorporados aqui como referência). A figura 9 representa os resultados de um ELISA utilizando construções contendo uma fusão de terminal N do MRD que se direciona ao receptor do fator I de crescimento similar à insulina com o anticorpo para ErbB2 com o peptídeo ligante curto (RP-sL-Her), uma fusão de terminal C do MRD que se direciona ao receptor do fator I de crescimento similar à insulina com o anticorpo para ErbB2 e o peptídeo ligante curto (Her-sL-RP), uma fusão de terminal C do MRD que se direciona ao receptor do fator I de crescimento similar à insulina com o anticorpo para ErbB2 com a 4a alça na região constante de cadeia leve (Her-lo-RP), uma fusão de terminal N do MRD que se direciona ao receptor do fator I de crescimento similar à insulina com o anticorpo para ErbB2 com o peptídeo ligante longo (RP-IL-Her) ou uma fusão de terminal C do MRD que se direciona ao receptor do fator I de crescimento similar à insulina com o anticorpo para ErbB2 com o peptídeo ligante longo (Her-IL-RP). O ErbB2 foi ligado com graus variáveis por todas as construções. O receptor do fator I de crescimento similar à insulina foi ligado por RP-IL-Her.

Exemplo 12. Moléculas de Anticorpo-MRD que se Direcionam ao VEGF que se Ligam a ErbB2

[000147] Foi feita uma fusão de um MRD que se direciona ao VEGF (V114) com o terminal N da cadeia leve de um anticorpo que se liga a ErbB2 (Her). Um peptídeo ligante médio (SSGGGGSGGGGGGSS (SEQ ID NO: 2)) foi utilizado como um conector. A figura 10 representa os resultados de um ELISA utilizando uma construção contendo uma fusão determinal N de MRD que se direciona ao VEGF com o anticorpo que se liga a ErbB2 com o peptídeo ligante médio (V114-mL- Her). A expressão e o teste da construção de fusão de anticorpo-MRD resultante demonstraram forte ligação com VEGF e ErbB2.

Exemplo 13. Moléculas de Anticorpo-MRD que se Direcionam à Integrina

[000148] Foi estudada a fusão de um MRD que se direciona à integrina αvβ3 (RGD) com o terminal N da cadeia leve de 38C2 utilizando o peptídeo ligante médio como um conector. A figura 11 demonstra que a expressão e o teste da construção de fusão de anticorpo-MRD resultante tinha forte ligação com a integrina αvβ3.

Exemplo 14. Moléculas de Anticorpo-MRD que se Direcionam à Ang-2

[000149] Foi estudada a fusão de um MRD que se direciona à Ang-2 (L17) com o terminal C da cadeia leve de 38C2 utilizando a sequência do ligante curto como um conector. A figura 12 demonstra que a expressão e o teste da construção de fusão de anticorpo-MRD resultante tinham forte inibição de Ang-2. Exemplo 15. Moléculas de Anticorpo-MRD que se Ligam a ErbB2 e que se Direcionam à Integrina e à Ang-2

[000150] Um MRD que se direciona à integrina αvβ3 (RGD4C) foi conectado ao terminal N da cadeia leve de um anticorpo que se direciona a ErbB2 (Her) com um ligante médio e um MRD que se direciona à Ang-2 (L17) foi conectado por um ligante curto com o terminal C do mesmo anticorpo que se direciona a ErbB2 (RGD4C-mL- Her-sL-L17). A figura 13 demonstra que a construção de fusão de anticorpo-MRD resultante se liga a integrina, Ang-2 e ErbB2.

Exemplo 16. Moléculas de Anticorpo-MRD que se Direcionam à Integrina que se Ligam a ErbB2

[000151] Foi construído um anticorpo que contém um MRD que se direciona à integrina αvβ3 (RGD4C) fundido com o terminal N da cadeia pesada de um anticorpo que se liga a ErbB2 (Her) utilizando o ligante médio como um conector (RGD4C-mL-her-longo). A figura 14 representa os resultados de um ELISA utilizando a construção. Tanto a integrina quanto o ErbB2 foram ligados pela construção.

Exemplo 17. Moléculas de Anticorpo-MRD que se Ligam a ErbB2 ou ao Receptor de Fator de Crescimento de Hepatócitos e à Integrina que se Direcionam à Ang-2 e ao Receptor do Fator I de Crescimento Similar à Insulina com o Peptídeo Ligante Curto

[000152] Foram construídas moléculas de anticorpo-MRD que contêm anticorpos de ligação a ErbB2 ou ao receptor de fator de crescimento de hepatócitos e as regiões de MRD que se direcionam à integrina αvβ3, à Ang-2 ou ao receptor do fator I de crescimento similar à insulina foram ligadas com o peptídeo ligante curto à cadeia leve do anticorpo. A figura 15 representa os resultados de um ELISA utilizando construções contendo uma fusão determinal N de MRD que se direciona à Ang-2 fundida com o anticorpo para ErbB2 (L17-sL-Her), uma fusão determinal N de MRD que se direciona à integrina com o anticorpo para ErbB2 (RGD4C-sL-Her), uma fusão determinal N do MRD que se direciona ao receptor do fator I de crescimento similar à insulina com o anticorpo de ligação a ErbB2 (RP-sL-Her), uma fusão determinal C de MRD que se direciona à Ang-2 com o anticorpo que se liga ao receptor de fator de crescimento de hepatócitos (L17-sL- Met), uma fusão determinal C de MRD que se direciona à Ang-2 com o anticorpo que se liga a ErbB2 (Her-sL-L17), uma fusão determinal C de MRD que se direciona à integrina com o anticorpo que se liga a ErbB2 (Her-sL-RGD4C) ou uma fusão determinal C do MRD que se direciona ao receptor do fator I de crescimento similar à insulina com o anticorpo que se liga a ErbB2 (Her-sL-RP). O ErbB2 foi ligado com graus variáveis pelas construções de anticorpo-MRD, com a exceção da construção que contém o anticorpo que se liga ao receptor de fator de crescimento de hepatócitos. O antígeno foi ligado apenas pela construção Her-sL-L17.

Exemplo 18. Moléculas de Anticorpo-MRD que se Ligam a ErbB2 ou ao Receptor de Fator de Crescimento de Hepatócitos e à Integrina que se Direcionam à Ang-2 ou ao Receptor do Fator I de Crescimento Similar à Insulina com o Peptídeo Ligante Longo

[000153] Foram construídas moléculas de anticorpo-MRD que contêm anticorpos que se ligam a ErbB2 ou ao receptor de fator de crescimento de hepatócitos e regiões de MRD que se direcionam à integrina αvβ3, à Ang-2 ou ao receptor do fator I de crescimento similar à insulina ligadas com o peptídeo ligante longo à cadeia leve do anticorpo. A figura 16 representa os resultados de um ELISA utilizando construções contendo uma fusão determinal N de MRD que se direciona à Ang-2 fundida com o anticorpo para ErbB2 (L17-lL-Her), uma fusão determinal N de MRD que se direciona à integrina com o anticorpo para ErbB2 (RGD4C-IL-Her), uma fusão determinal N do MRD que se direciona ao receptor do fator I de crescimento similar à insulina com o anticorpo que se liga a ErbB2 (RP-IL-Her), uma fusão determinal C de MRD que se direciona à Ang-2 com o anticorpo que se liga ao receptor de fator de crescimento de hepatócitos (L17-IL- Met), uma fusão determinal C de MRD que se direciona à integrina com o anticorpo que se liga ao receptor de fator de crescimento de hepatócitos (RGD4C-IL-Met), uma fusão determinal C de MRD que se direciona à Ang-2 com o anticorpo que se liga ao receptor do fator I de crescimento similar à insulina (Her-lL-RP), uma fusão determinal C de MRD que se direciona à Ang-2 com o anticorpo que se liga ao receptor de fator de crescimento de hepatócitos (Met-lL-L17) ou uma fusão determinal C de MRD que se direciona à integrina com o anticorpo que se liga ao receptor de fator de crescimento de hepatócitos (Met-IL- RGD4C). Como mostrado na figura 16, as fusões de anticorpo-MRD são eficientes para se ligarem ao antígeno e a ErbB2. Lu e outros J Biol Chem. 2005 May 20;280(20):19665-72. Epub 2005 Mar 9;.; Lu e outros J Biol Chem. 2004 Jan 23;279(4):2856-65. Epub 2003 Oct 23.

[000154] Embora a invenção tenha sido descrita com referência aos exemplos anteriores, será entendido que as modificações e variações são abrangidas dentro do espírito e do âmbito da invenção. Consequentemente, a invenção é limitada apenas pelas reivindicações a seguir.

Claims

1. Anticorpo isolado de comprimento total, caracterizado pelo fato de que compreende pelo menos um domínio de reconhecimento modular (MRD), sendo que o MRD é de 2 a 60 aminoácidos e o alvo do MRD é Angiopoietina-2 (Ang-2), sendo que o alvo do sítio de combinação do anticorpo é um antígeno tumoral, sendo que o MRD está operacionalmente ligado à extremidade C-terminal da cadeia pesada do anticorpo, à extremidade N-terminal da cadeia pesada do anticorpo, à extremidade C-terminal da cadeia leve do anticorpo ou à extremidade N-terminal da cadeia leve do anticorpo, e sendo que o MRD compreende uma sequência selecionada a partir do grupo que consiste em: MGAQTNFMPMDDLEQRLYEQFILQQGLE (SEQ ID NO: 7), MGAQTNFMPMDNDELLLYEQFILQQGLE (SEQ ID NO: 8), MGAQTNFMPMDATETRLYEQFILQQGLE (SEQ ID NO: 9) , AQQEECEWDPWTCEHMGSGSATGGSGSTASSGSGSAT HQEECEWDPWTCEHMLE (SEQ ID NO: 10), AQQEECEFAPWTCEHM (SEQ ID NO: 21) AQQEECEFAPWTCEHMGSGSATGGSGSTASSGSGSAT HQEECEFAPWTCEHMLE (SEQ ID NO: 23), AQQEECELAPWTCEHM (SEQ ID NO: 24), AQQEECELAPWTCEHMGSGSATGGSGSTASSGSGSATH QEECELAPWTCEHMLE (SEQ ID NO: 26), AQQEECEFSPWTCEHM (SEQ ID NO: 27), AQQEECEFSPWTCEHMGSGSATGGSGSTASSGSGSAT HQEECEFSPWTCEHMLE2xConFS (SEQ ID NO: 29), AQQEECELEPWTCEHM (SEQ ID NO: 30), AQQEECELEPWTCEHMGSGSATGGSGSTASSGSGSATH QEECELEPWTCEHMLE (SEQ ID NO: 32), AQQEECEFAPWTCEHMGSGSATGGSGSTASSGSGSAT HQEECELAPWTCEHMLE (SEQ ID NO: 33); AQQEECEFAPWTCEHMGSGSATGGSGSTASSGSGSAT HQEECEFSPWTCEHMLE (SEQ ID NO: 34), MGAQTNFMPMDNDELLNYEQFILQQGLE (SEQ ID NO: 11) e PXDNDXLLNY (SEQ ID NO: 12), sendo que X é selecionado dentre os 20 aminoácidos de ocorrência natural.

2. Anticorpo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o anticorpo e o MRD estão operacionalmente ligados através de um peptídeo ligante.

3. Anticorpo, de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo fato de que o peptídeo ligante é de 2 a 20 peptídeos ou de 4 a 15 peptídeos.

4. Anticorpo, de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo fato de que o peptídeo ligante compreende uma sequência selecionada do grupo que consiste em: GGGS (SEQ ID. NO: 1), SSGGGGSGGGGGGSS (SEQ ID. NO: 2) e SSGGGGSGGGGGGSSRSS (SEQ ID NO: 19).

5. Anticorpo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizado pelo fato de que o MRD está operacionalmente ligado à extremidade C-terminal da cadeia leve do anticorpo ou à extremidade N-terminal da cadeia leve do anticorpo.

6. Anticorpo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, caracterizado pelo fato de que dois ou mais MRDs estão operacionalmente ligados com qualquer extremidade terminal do anticorpo ou em que dois ou mais MRDs estão operacionalmente ligados com duas ou mais extremidades terminais do anticorpo.

7. Anticorpo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, caracterizado pelo fato de que o sítio de combinação do anticorpo se liga a um antígeno de superfície celular selecionado a partir do grupo que consiste em: EGFR, ErbB2, ErbB3, ErbB4, CD20, receptor do fator de crescimento semelhante à insulina-I e antígeno membrana específico de próstata.

8. Anticorpo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7, caracterizado pelo fato de que o anticorpo é Trastuzumabe.

9. Polinucleotídeo isolado, caracterizado pelo fato de que compreende uma sequência de nucleotídeos que codifica o anticorpo, como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 8.

10. Vetor, caracterizado pelo fato de que compreende o polinucleotídeo, como definido na reivindicação 9.

11. Célula hospedeira, caracterizada pelo fato de que compreende o vetor, como definido na reivindicação 10, ou a progênie da célula.

12. Anticorpo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 8, caracterizado pelo fato de que é para uso no tratamento de doenças.

13. Anticorpo, de acordo com a reivindicação 12, caracterizado pelo fato de que a doença é câncer.

14. Anticorpo, de acordo com a reivindicação 12 ou 13, caracterizado pelo fato de que o anticorpo ou proteína inibe a angiogênese, modula a angiogênese ou inibe o crescimento de tumor.

15. Uso de um anticorpo, como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 8, caracterizado pelo fato de que é para preparação de uma composição para o tratamento de uma doença.