KR102157701B1 - 항-코티닌 항체가 연결된 키메라 항체 수용체 및 이의 용도 - Google Patents

항-코티닌 항체가 연결된 키메라 항체 수용체 및 이의 용도 Download PDF

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Abstract

본 발명은 항-코티닌 항체가 연결된 키메라 항체 수용체 및 이의 용도에 관한 것이다. 상기 키메라 항체 수용체를 표면에 제시하는 T 세포는 함께 첨가하는 코티닌이 표지된 접합물질의 표적분자 특이적으로 인터페론 감마를 분비하고 표적분자를 발현하는 세포의 세포사멸을 유도한다. 또한, 코티닌이 표지된 세포독성물질을 투여함으로써 상기 키메라 항원 수용체 T 세포의 세포사멸이 유도되고, 그에 따라 필요시 코티닌이 표지된 세포독성물질을 투여하여 기투여된 키메라 항원 수용체 T 세포를 제거함으로써 T 세포의 과활성에 의한 면역 부작용을 억제할 수 있다. 따라서, 상기 항-코티닌 항체가 연결된 키메라 항원 수용체는 암의 치료에 유용하게 사용될 수 있다.

Description

항-코티닌 항체가 연결된 키메라 항체 수용체 및 이의 용도
본 발명은 항-코티닌 항체가 연결된 키메라 항체 수용체 및 이의 용도에 관한 것이다.
바이오 의약품으로 개발 가능한 펩타이드, 앱타머(aptamer) 또는 항체 등의 물질은 그 효과가 좋으나, 체내에서 분해되기 쉬우며 신장을 통해 빠르게 배출되기 때문에 체내 반감기가 짧다. 이와 같은 문제점을 해결하기 위해 폴리에틸렌글리콜(PEG)을 접합시켜, 이들의 체내 반감기를 증가시키기 위한 연구가 진행되고 있다(Veronese F.M. & Pasut G., Drug Discov. Today, 10, 1451-1458, 2005). 그러나, PEG를 접합시키는 과정에서 다양한 분자 결합체가 생성되고, PEG와 접합하는 접합물질에 따라 최적화 조건을 확립해야 하는 문제점이 있다. 또한, 이들 분자들은 대상표적이 세포(암세포 등)인 경우, 세포독성이 없거나 약한 단점이 있다. 따라서, 최근에 항체와 세포독성물질의 접합체(antibody-drug conjugates)가 개발되고 있다.
한편, 키메라 항원 수용체(chimeric antigen receptor, CAR)는 항체의 단편, 힌지 영역, 막통과 도메인 및 세포 내 신호전달 도메인으로 구성된다. 상기 키메라 항원 수용체가 발현된 T 세포 및 자연살해세포 등과 같은 면역세포는, 항체의 단편이 표적분자를 발현하는 세포(암세포 등)를 특이적으로 인지하여 면역세포의 세포독성을 활성화시킴으로써 표적세포의 세포사멸을 유도한다. 따라서, 상기 세포는 유전자이입 세포 치료요법(genetically engineered cell therapy)에 활용되고 있으며, 특히, 키메라 항원 수용체 T 세포는 CD19가 발현된 혈액암에 대해 높은 치료 효과를 나타냄이 보고되었다.
그러나, 통상의 키메라 항원 수용체 세포는 하나의 표적분자를 인지한다는 한계점이 있어, 합텐(hapten)을 사용한 키메라 항원 수용체 세포가 연구되고 있다. 이는 합텐을 인지하는 항체 부위를 갖는 키메라 항원 수용체 세포와 표적을 인지하는 접합물질(예를 들어, 펩티드, 앱타머, 항체, 저분자 화학물질 등)이 결합된 합텐을 포함한다. 이를 통해 한 종류의 키메라 항원 수용체 T 세포가 다양한 표적분자에 결합할 수 있는 다표적형(multi-targeting) 키메라 항원 수용체 T 세포를 제작할 수 있다.
상기 합텐은 키메라 항원 수용체를 표면에 제시하는 세포가 표적 이외의 세포와 결합하는 것을 방지하기 위하여 생체 내에 본래 존재하지 않는 물질일수록 좋다. 또한, 접합물질과의 효과적인 결합을 위하여 화학작용기(chemical functional group)를 가져야 한다.
코티닌은 니코틴의 주요 대사 산물로서 체내에서 생합성(de novo biosynthesis)되지 않고, 생리적 활성도 유발하지 않는다. 또한, 포유동물에서 코티닌의 대사과정이 잘 알려져 있을뿐만 아니라, 혈청 반감기가 16시간이라는 점도 보고되어 있다(Benowits N.L. et al., 3rd Handb. Exp. Pharmacol., 29-60, 2009). 따라서, 코티닌은 흡연자의 경우에도 수일간 금연한 이후에는 체내에 존재하지 않아 합텐으로서 사용 가능하다. 또한, 상기 코티닌은 카르복실기가 결합된 형태로 제조가 용이하여 접합물질과의 결합이 가능하다.
이에, 본 발명자들은 항-코티닌 항체가 연결된 키메라 항원 수용체 T 세포 및 코티닌이 표지된 접합물질을 제조하여, 상기 키메라 항원 수용체 T 세포가 코티닌이 표지된 접합물질의 표적분자 특이적으로 인터페론 감마를 분비하고, 표적 세포의 세포 사멸을 유도하며, 코티닌이 표지된 세포독성물질에 의해 상기 키메라 항원 수용체 T 세포의 세포사멸이 유도됨을 확인하였다(도 1).
또한, 최근 키메라 항원 수용체 T 세포 요법의 항암 치료제로서의 효능이 강화됨에 따라 이들 유전자이입 T 세포의 과활성에 의한 면역독성이 부작용으로 부각되고 있다. 따라서, 이들 T 세포에 의한 심각한 부작용(serious adverse side effect)이 출현 시, 이들 세포의 세포사멸을 유도함으로써 부작용을 해소하려는 방안들이 강구되고 있다. 상기 항-합텐 키메라 항원 수용체의 경우, 이를 발현하는 T 세포가 주입된 환자 체내에서 면역독성 부작용이 생기는 경우, 합텐이 표지된 접합물질 대신 합텐이 표지된 세포독성물질을 주입하게 되면, 합텐이 표지된 세포독성물질이 항-합텐 키메라 항원 수용체 T 세포에만 결합하여 세포사멸을 유도할 수 있으므로, 이들 T 세포에 의한 부작용을 해소할 수 있는 안전장치로도 이용될 수 있는 추가적인 장점을 가진다(도 2). 이에, 본 발명자들은 코티닌이 표지된 세포독성물질에 의해 상기 키메라 항원 수용체 T 세포의 세포사멸이 유도됨을 확인함으로써, 본 발명을 완성하였다.
따라서, 본 발명의 목적은 항-코티닌 항체가 연결된 키메라 항원 수용체를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기 키메라 항원 수용체를 코딩하는 핵산분자, 이를 포함하는 발현벡터 및 바이러스, 및 상기 바이러스가 형질도입된 세포를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 세포에 코티닌이 표지된 접합물질을 더 포함하는 키메라 항원 수용체 세포를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 키메라 항원 수용체 세포를 유효성분으로 함유하는 특정 세포가 증식되는 질환 또는 질병의 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 키메라 항원 수용체 세포를 개체에 투여하는 것을 포함하는 특정 세포가 증식되는 질환 또는 질병의 예방 또는 치료 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 키메라 항원 수용체 세포의 세포사멸 유도 방법을 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 항-코티닌 항체 또는 이의 단편, 힌지 도메인, 막관통 도메인 및 신호전달 도메인을 포함하는 항-코티닌 항체가 연결된 키메라 항원 수용체를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 키메라 항원 수용체를 코딩하는 핵산 분자를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 핵산 분자를 포함하는 발현벡터를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 핵산 분자를 포함하는 바이러스를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 바이러스가 형질도입된 세포를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 세포에 코티닌이 표지된 접합물질을 포함하는 키메라 항원 수용체 세포를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 키메라 항원 수용체 세포를 유효성분으로 함유하는 특정 세포가 증식되는 질환 또는 질병의 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 키메라 항원 수용체 세포를 개체에 투여하는 것을 포함하는 특정 세포가 증식되는 질환 또는 질병의 예방 또는 치료 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 세포를 개체에 투여하는 단계; 및 코티닌이 표지된 접합물질을 개체에 투여하는 단계를 포함하는, 개체 내에서 키메라 항원 수용체 세포를 제조하는 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 세포 및 코티닌이 표지된 접합물질을 개체에 투여하는 단계; 및 상기 개체에 코티닌이 표지된 세포독성물질을 더 투여하는 단계를 포함하는, 키메라 항원 수용체 세포의 세포사멸 유도 방법을 제공한다.
나아가, 본 발명은 약학적으로 치료가능한 양의 상기 키메라 항원 수용체 세포를 유효성분으로 함유하는 제1성분; 및 약학적으로 치료가능한 양의 코티닌과 세포독성물질의 복합체를 유효성분으로 함유하는 제2성분을 포함하는, 특정 세포가 증식되는 질환 또는 질병의 예방 또는 치료용 약학적 키트를 제공한다.
본 발명의 항-코티닌 항체가 연결된 키메라 항원 수용체를 표면에 제시하는 T 세포는 함께 첨가하는 코티닌이 표지된 접합물질의 표적분자 특이적으로 인터페론 감마를 분비하고 표적분자를 발현하는 세포의 세포사멸을 유도한다. 또한, 코티닌이 표지된 세포독성물질을 투여함으로써 상기 키메라 항원 수용체 T 세포의 세포사멸이 유도되고, 그에 따라 필요시 코티닌이 표지된 세포독성물질을 투여하여 기투여된 키메라 항원 수용체 T 세포를 제거함으로써 T 세포의 과활성에 의한 면역 부작용을 억제할 수 있다. 따라서, 상기 항-코티닌 항체가 연결된 키메라 항원 수용체는 특정 세포가 증식되는 질환 또는 질병의 치료에 유용하게 사용될 수 있다.
도 1은 표적 세포에 따라 코티닌이 표지된 접합물질을 달리하여 키메라 항원 수용체 T 세포의 표적을 변경할 수 있음을 보여주는 도면이다.
도 2는 코티닌이 표지된 세포독성물질을 사용하여 키메라 항원 수용체 T 세포의 세포사멸을 유도하는 것을 보여주는 도면이다.
도 3은 본 발명의 일실시예에서 제작된 항-코티닌 항체 단편이 연결된 키메라 항원 수용체 유전자와 이를 발현하는 바이러스 벡터의 구조(A) 및 상기 키메라 항원 수용체를 표면에 제시하는 T 세포를 유세포분석기로 분석한 결과(B) 그래프이다.
도 4는 본 발명의 일실시예에서 제작된 항-코티닌 항체 단편이 연결된 키메라 항원 수용체 T 세포를 코티닌이 표지된 항-VEGF 앱타머와 함께 표적분자인 VEGF 단백질과 반응시켰을 때, T 세포에서 분비된 인터페론 감마의 양을 확인한 그래프이다.
도 5는 본 발명의 일실시예에서 제작된 키메라 항원 수용체 T 세포를 코티닌이 표지된 항-HER2 항체와 함께 HER2 양성 또는 음성인 세포에 첨가하여 상기 T 세포에서 분비된 인터페론 감마의 양을 확인한 그래프이다.
도 6은 본 발명의 일실시예에서 제작된 키메라 항원 수용체 T 세포가 함께 첨가되는 코티닌이 표지된 항-HER2 항체 특이적으로 인터페론 감마를 분비함을 확인하고(A), T 세포 표면에 발현된 키메라 항원 수용체를 유세포분석기로 분석한 결과(B) 그래프이다.
도 7은 본 발명의 일실시예에서 제작된 키메라 항원 수용체 T 세포를 코티닌이 표지된 항-CD20 항체와 함께 CD20 양성 또는 음성인 세포에 첨가하여 상기 T 세포에서 분비된 인터페론 감마의 양을 확인한 그래프이다.
도 8은 본 발명의 일실시예에서 제작된 키메라 항원 수용체 T 세포를 코티닌이 표지된 항-HLA 항체와 함께 HLA 양성 또는 음성인 세포에 첨가하여 상기 T 세포에서 분비된 인터페론 감마의 양을 확인한 그래프이다.
도 9는 표적 세포를 다른 세기의 형광강도를 나타내도록 염색하고(A), 여기에 본 발명의 일실시예에서 제작된 키메라 항원 수용체 T 세포와 코티닌이 표지된 항-HER2 항체를 첨가하여, 상기 키메라 항원 수용체 T 세포의 표적 세포 특이적 세포사멸 효과를 유세포분석기로 분석한 결과(B) 그래프이다.
도 10은 접합물질로서 세포독성물질을 사용하여, 코티닌이 표지된 세포독성물질(A: 코티닌-듀오카마이신 단일 접합체, B: 코티닌-DM1 복합 접합체(2x코티닌-4xDM1) 및 C: 코티닌-듀오카마이신 복합 접합체(2x코티닌-4x듀오카마이신)에 의한 키메라 항원 수용체 T 세포의 세포사멸 유도 효과를 확인한 그래프이다.
도 11은 본 발명의 일실시예에서 사용된 세포독성물질인 코티닌-듀오카마이신의 단일 접합체(A), 코티닌-DM1의 복합 접합체(B) 및 코티닌-듀오카마이신의 복합 접합체(C)의 구조를 나타낸 도면이다.
발명의 실시를 위한 최선의 형태
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명은 항-코티닌 항체 또는 이의 단편, 힌지 도메인, 막관통 도메인 및 신호전달 도메인을 포함하는 항-코티닌 항체가 연결된 키메라 항원 수용체를 제공한다.
상기 항-코티닌 항체가 연결된 키메라 항원 수용체는 이의 N-말단에서부터 C-말단 방향으로 항-코티닌 항체 또는 이의 단편, 힌지 도메인, 막관통 도메인 및 신호전달 도메인의 순서로 결합된 형태일 수 있다.
상기 항-코티닌 항체는 코티닌에 결합하는 항체로서, 상기 항체는 단일클론항체, 다클론항체 또는 재조합 항체 중 어느 하나일 수 있다. 또한, 상기 항체는 전장 형태의 항체 및 항체의 단편일 수 있다. 이때, 항체의 단편은 코티닌과 결합 능력이 있는 항-코티닌 항체의 일부분을 포함할 수 있다. 상기 항체의 단편은 Fab, Fab', F(ab')2, Fv 또는 scFv일 수 있다.
상기 항-코티닌 항체 또는 이의 단편은 서열번호 23 내지 25의 아미노산 서열로 각각 표시되는 상보성 결정 영역(complementarity determining region, CDR)인 CDR1, CDR2 또는 CDR3을 포함하는 중쇄 가변 영역, 또는 서열번호 26 내지 28의 아미노산 서열로 각각 표시되는 CDR1, CDR2 또는 CDR3을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함할 수 있다. 구체적으로, 상기 항-코티닌 항체 또는 이의 단편은 서열번호 23 내지 25의 아미노산 서열로 각각 표시되는 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하는 중쇄 가변 영역, 및 서열번호 26 내지 28의 아미노산 서열로 각각 표시되는 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함할 수 있다. 본 발명의 일실시예에서, 상기 항-코티닌 항체는 서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 scFv 단편일 수 있다. 또한, 상기 항-코티닌 항체는 서열번호 1의 아미노산 서열과 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98% 또는 99% 이상 동일할 수 있다.
본 발명에 따른 항-코티닌 항체 또는 이의 단편은 미국 특허 제8,008,448호에 기재된 방법을 변형하여 제조할 수 있다.
상기 힌지 도메인은 항-코티닌 항체 또는 이의 단편과 막관통 도메인을 연결하는 도메인으로서, 시스테인 잔기를 포함할 수 있다. 상기 시스테인 잔기는 힌지 도메인이 항체와 결합하는데 관여할 수 있다. 예를 들어, 상기 힌지 도메인은 CD8 힌지 도메인, IgG1 힌지 도메인, Ig4 힌지 도메인, CD28 세포외 영역, KIR(killer immunoglobulin-like receptor) 세포외 영역 및 이의 조합일 수 있다(Mol. Ther., 2015(23):757; J. Immunother., 2006(29):284; Cancer immunol. Res., 3(7):815-26; Blood, 2013(122):2965). 상기 CD8 힌지 도메인은 서열번호 3의 아미노산 서열을 가질 수 있다. 또한, 상기 CD8 힌지 도메인은 서열번호 3의 아미노산 서열과 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98% 또는 99% 이상 동일할 수 있다.
상기 막관통 도메인은 키메라 항원 수용체의 힌지 도메인과 신호전달 도메인을 연결할 수 있다. 막관통 도메인은, 키메라 항원 수용체의 항-코티닌 항체 또는 이의 단편이 세포 표면에 위치하고, 신호전달 도메인이 세포 내에 위치하도록 세포의 세포막을 관통할 수 있다. 상기 막관통 도메인은 CD3제타, CD4, CD8, CD28 또는 KIR 단백질의 막관통 영역일 수 있다(Immunol. Rev., 2014(257):107; J. Immunol., 2010(184):6938; Blood, 2013(122):2965, J. Immunother., 2006(29):284; Cancer Immunol. Res., 3(7):815-26). 본 발명의 일실시예에서, 상기 막관통 도메인은 CD28의 막관통 영역 및 세포질 영역을 포함할 수 있고, 상기 도메인은 서열번호 5 또는 서열번호 7의 아미노산 서열을 가질 수 있다. 또한, 상기 막관통 도메인은 서열번호 5 또는 서열번호 7의 아미노산 서열과 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98% 또는 99% 이상 동일할 수 있다.
상기 신호전달 도메인은 항-코티닌 항체 또는 이의 단편에 의해 전달된 신호를 받아, 키메라 항원 수용체가 결합된 세포 내로 이를 전달하는 역할을 한다. 상기 신호전달 도메인은 CD3제타, CD278(inducible T-cell costimulator, ICOS), CD28, CD134(OX40), CD137(4-1BB), KIR(killer immunoglobulin-like receptor) 또는 DAP12(DNAX activation protein 12)일 수 있다(J. Immunol., 2004(172):104; Mol. Ther., 2013(21):2268; Proc. Natl. Acad Sci. USA, 2009(106):3360; Cancer Immunol. Res., 3(7):815-26). 구체적으로, 상기 신호전달 도메인은 CD28 및 CD3제타의 세포질 영역이거나, CD137(4-1BB) 및 CD3제타의 세포질 영역일 수 있다.
본 발명의 일실시예에서, 상기 신호전달 도메인은 CD28 및 CD3제타의 세포질 영역일 수 있다. 상기 CD28의 세포질 영역은 서열번호 9 또는 서열번호 11의 아미노산 서열을 가질 수 있고, 상기 CD3제타의 세포질 영역은 서열번호 13의 아미노산 서열을 가질 수 있다. 또한, 상기 신호전달 도메인은 서열번호 9, 서열번호 11 또는 서열번호 13의 아미노산 서열과 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98% 또는 99% 이상 동일할 수 있다.
나아가, 본 발명의 키메라 항원 수용체는 상기 서술한 바와 같은 항체 및 도메인들의 변형된 형태를 포함할 수 있다. 이때, 상기 변형은 상기 항체 및 도메인들의 기능을 변형시키지 않고, 야생형의 항체 및 도메인의 아미노산 서열에서 하나 이상의 아미노산을 치환, 결실 또는 추가하여 수행될 수 있다. 통상적으로, 상기 치환은 알라닌이거나, 전체 단백질의 전하, 극성 또는 소수성에 영향을 주지 않는 보존적 아미노산 치환(conservative amino acid substitution)에 의해 수행될 수 있다. 본 발명의 일실시예에서, 상기 키메라 항원 수용체는 서열번호 15 또는 서열번호 17의 아미노산 서열을 가질 수 있다. 또한, 상기 키메라 항원 수용체는 서열번호 15 또는 서열번호 17의 아미노산 서열과 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98% 또는 99% 이상 동일할 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 키메라 항원 수용체를 코딩하는 핵산 분자를 제공한다.
본 발명에 따른 핵산 분자는 상술한 항-코티닌 항체 또는 이의 단편(서열번호 2), 힌지 도메인(서열번호 4), 막관통 도메인(서열번호 6 또는 8), 및 신호전달 도메인(서열번호 10, 12 또는 14)을 코딩할 수 있다. 이때, 본 발명에 따른 키메라 항원 수용체를 코딩하는 핵산 분자는 서열번호 16 또는 서열번호 18의 염기서열일 수 있다. 이때, 상기 염기서열은 서열번호 1, 서열번호 3, 서열번호 5, 서열번호 7, 서열번호 9, 서열번호 11, 서열번호 13의 항체 또는 도메인을 발현시킬 수 있는 다른 염기서열로 치환된 것을 포함할 수 있다. 또한, 상기 핵산 분자는 상기 서술한 바와 같이 변형된 형태의 항체 및 도메인을 코딩하는 핵산 분자를 포함할 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 핵산 분자를 포함하는 발현벡터를 제공한다.
상기 발현벡터는 아데노바이러스 벡터, 레트로바이러스 벡터, 렌티바이러스 벡터 또는 아데노-연관 바이러스 벡터일 수 있고, 본 발명의 일실시예에서 상기 발현벡터는 레트로바이러스 벡터일 수 있다. 상기 발현벡터는 본 발명에 따른 키메라 항원 수용체가 발현 및 분비될 수 있도록 통상의 기술자에 의해 제작될 수 있다.
상기 발현벡터는 신호서열 또는 리더서열을 더 포함할 수 있다. 본 발명의 일실시예에서, 상기 리더서열은 면역글로불린 카파 리더서열일 수 있다. 상기 면역글로불린 카파 리더서열은 서열번호 19의 아미노산 서열을 가질 수 있고, 상기 서열번호 19의 아미노산 서열과 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98% 또는 99% 이상 동일할 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 핵산 분자를 포함하는 바이러스를 제공한다.
상기 바이러스는 본 발명에 따른 키메라 항체 수용체를 코딩하는 핵산 분자를 게놈에 포함할 수 있다. 따라서, 상기 바이러스가 형질도입된 세포는 이의 표면에 항-코티닌 항체 또는 이의 단편이 위치하는, 본 발명에 따른 키메라 항체 수용체가 발현될 수 있다. 상기 바이러스는 아데노바이러스, 레트로바이러스, 렌티바이러스 또는 아데노-연관 바이러스일 수 있다. 본 발명의 일실시예에서, 상기 바이러스는 레트로바이러스일 수 있다.
상기 바이러스는 상기 서술한 바와 같은 발현벡터를 바이러스의 외피 단백질(envelope protein)을 코딩하는 핵산 분자를 포함하는 발현벡터와 함께 세포에 형질전환시켜 수득될 수 있다. 이때, 형질전환은 통상적인 방법으로 수행될 수 있다. 형질전환 시, 사용 가능한 외피 단백질은 VSV-G, Ecotropic envelope, Mokola, Rabies, MLV-Ampho, MLV-10A1, LCMV-WE, LCMV-Arm53b envelope, feline endogenous gamma retrovirus RD114 envelope 및 이의 변이체, gibbon ape leukemia virus(GALV) envelope 및 이의 변이체, MLV 4070A envelope, 또는 gp120/gp41일 수 있다(Mol. Ther. Methods Clin. Dev., 2016(3):16017; J. Virol. Methods, 2004:122-131; Molecular Therapy-Methods & Clinical Development 2016(3):16017).
또한, 본 발명은 상술한 바이러스가 형질도입된 세포를 제공한다.
상기 세포는 본 발명에 따른 키메라 항원 수용체를 발현시킬 수 있는 핵산을 포함하는 바이러스에 형질도입된 것일 수 있다. 상기 형질도입된 세포는 세포의 표면에 항-코티닌 항체 또는 이의 단편이 위치할 수 있고, 상기 항체 또는 단편에 항원-항체 결합을 통해 코티닌이 결합하면 세포 내로 신호전달을 통해 세포의 활성을 유도할 수 있다. 이때, 상기 세포는 T 세포, 자연살해세포 또는 대식세포일 수 있다. 본 발명의 일실시예에서, 상기 세포는 T 세포일 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 세포에 코티닌이 표지된 접합물질을 더 포함하는 키메라 항원 수용체 세포를 제공한다.
상기 코티닌이 표지된 접합물질에서, 접합물질이 항체일 때, 상기 복합체는 코티닌의 카르복실기와 항체의 아민기 사이의 결합을 통해 형성될 수 있다.
상기 코티닌은 합텐으로서, 코티닌이 표지된 접합물질의 특성을 변화시키지 않으면서, 자신을 특이적으로 인지하는 항체와 결합할 수 있다. 구체적으로, 상기 접합물질은 펩타이드, 핵산, 단백질 또는 화학물질일 수 있다. 상기 핵산은 앱타머일 수 있고, 상기 단백질은 항체 또는 호르몬일 수 있다. 본 발명의 일실시예에서, 상기 앱타머는 항-VEGF 앱타머일 수 있다. 또한, 본 발명의 일실시예에서, 상기 항체는 항-HER2 항체, 항-CD20 항체 또는 항-HLA 항체일 수 있다.
상기 키메라 항원 수용체 세포는 항-코티닌 항체 또는 이의 단편이 연결된 형태로, 복합체의 코티닌이 상기 항-코티닌 항체 또는 이의 단편과 결합하면 세포의 활성을 유도할 수 있다. 이때, 세포와 코티닌이 표지된 접합물질의 결합은 키메라 항원 수용체의 항-코티닌 항체 또는 이의 단편과 코티닌 사이의 항원-항체 결합일 수 있다. 또한, 상기 활성은 세포독성 T 세포에 의한 세포사멸 유도 활성일 수 있다.
상기 키메라 항원 수용체 세포는, 항-코티닌 항체 또는 이의 단편이 연결된 키메라 항원 수용체가 발현된 세포에 코티닌이 표지된 접합물질을 첨가하는 단계, 및 상기 세포와 복합체가 연결된 키메라 항원 수용체 세포를 선별하는 단계를 통해 제조될 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 키메라 항원 수용체 세포를 유효성분으로 함유하는 특정 세포가 증식되는 질환 또는 질병의 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다.
상기 약학 조성물의 유효성분으로 사용되는 키메라 항원 수용체 세포는 상기 서술한 바와 같다.
상기 질환 또는 질병은 암일 수 있고, 상기 암은 고형암 또는 혈액암일 수 있다. 이때, 상기 고형암은 폐암, 대장암, 전립선암, 갑상선암, 유방암, 뇌암, 두경부암, 식도암, 피부암, 흑색종, 망막모세포종, 흉선암, 위암, 결장암, 간암, 난소암, 자궁암, 방광암, 직장암, 담낭암, 담도암 또는 췌장암일 수 있다. 또한, 상기 혈액암은 림프종, 백혈병 또는 다발성 골수종일 수 있다.
상기 약학 조성물은 약학 조성물 전체 중량에 대하여 유효성분인 본 발명에 따른 키메라 항원 수용체 세포를 10 내지 95 중량%로 포함할 수 있다. 또한, 본 발명의 약학 조성물은 상기 유효성분 외에 추가로 동일 또는 유사한 기능을 나타내는 유효성분을 1종 이상 추가로 함유할 수 있다.
본 발명에 다른 약학 조성물은 투여를 위해 상기 기재한 유효성분 이외에 추가적으로 약학적으로 허용가능한 담체를 1종 이상 포함할 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 키메라 항원 수용체 세포를 개체에 투여하는 것을 포함하는 특정 세포가 증식되는 질환 또는 질병의 예방 또는 치료 방법을 제공한다.
상기 키메라 항원 수용체 세포는 상기 서술한 바와 같다. 또한, 상기 질환 또는 질병은 암일 수 있고, 구체적인 암은 상기 서술한 바와 같다.
본 발명에 따른 키메라 항원 수용체 세포의 투여량은 질환의 종류, 질환의 중증도, 약학 조성물에 함유된 유효성분 및 다른 성분의 종류 및 함량, 제형의 종류 및 환자의 연령, 체중, 일반 건강 상태, 성별 및 식이, 투여 시간, 투여 경로, 치료기간 및 동시에 사용되는 약물을 비롯한 다양한 인자에 따라 조절될 수 있다. 그러나, 바람직한 효과를 위해서, 본 발명에 따른 약학 조성물에 포함되는 키메라 항원 수용체 세포의 유효량은 1x105 내지 1x1011 cells/㎏일 수 있다. 이때, 투여는 하루에 한번 투여할 수 있고, 수회에 나누어 투여할 수도 있다.
또한, 본 발명의 키메라 항원 수용체 세포는 당업계에 공지된 다양한 방법으로 개체에 투여될 수 있다. 상기 개체는 포유동물, 구체적으로 인간일 수 있다. 상기 투여 경로는 투여 방법, 체액의 부피, 점성도 등을 고려하여 통상의 기술자가 적절히 선택할 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 세포를 개체에 투여하는 단계; 및 코티닌이 표지된 접합물질을 개체에 투여하는 단계를 포함하는, 개체 내에서 키메라 항원 수용체 세포를 제조하는 방법을 제공한다.
상기 세포는 본 발명에 따른 키메라 항원 수용체를 발현시킬 수 있는 핵산을 포함하는 바이러스에 형질도입된 것으로서, 상술한 바와 같다. 또한, 코티닌이 표지된 접합물질은 상술한 바와 같다.
상기 개체는 포유동물, 구체적으로 인간일 수 있고, 투여는 상술한 바와 같이 통상의 기술자에 의해 적절히 수행될 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 세포 및 코티닌이 표지된 접합물질을 개체에 투여하는 단계; 및 상기 개체에 코티닌이 표지된 세포독성물질을 더 투여하는 단계를 포함하는, 키메라 항원 수용체 세포의 세포사멸 유도 방법을 제공한다.
상기 키메라 항원 수용체 세포는 상기 서술한 바와 같다. 키메라 항원 수용체 세포를 이용하여 항암치료를 하는 경우, 상기 세포의 과활성에 의한 면역독성이 부작용으로 발생될 수 있다. 따라서, 이와 같은 부작용을 해결하기 위해, 코티닌이 표지된 접합물질 대신 코티닌이 표지된 세포독성물질을 추가로 투여하여 키메라 항원 수용체 세포의 세포사멸을 유도할 수 있다.
상기 세포독성물질은 세포의 사멸을 유도할 수 있는 물질이면 모두 사용할 수 있다. 구체적으로, 상기 세포독성물질은 듀오카마이신, SN-38, 칼리캐미신(calicheamicin), MMAE(monomethyl auristatin E), MMAF(monomethyl auristatin F), 독소루비신, 피롤로벤조디아제핀(pyrrolobenzodiazepine), DM4 또는 DM1일 수 있다. 본 발명의 일실시예에서, 상기 세포독성물질은 듀오카마이신 또는 DM1일 수 있다(ASCO meeting abstracts 2014(32):2558; Clin. Cancer Res., 2011(17):3157-69; Leuk. Lymphoma, 2015(56):2863-69; J. Clin. Oncol., 2014(32):3619-25; Proc. Am. Soc. Clin. Oncol., 2015(33):2503; J. Drug Deliv., 2013(2013):898146; Sci. Transl. Med., 2015(7):302ra136; Mol, Cancer Ther., 2014(13):1537-48; J. Clin. Oncol., 2008(26):2147-54).
상기 코티닌이 표지된 세포독성물질의 투여는 상기 서술한 바와 같이 다양한 인자에 의해서 조절될 수 있다. 본 발명에 따른 약학 조성물에 포함되는 키메라 항원 수용체 세포의 유효량은 통상에 기술자에 의해 적절히 선택될 수 있다. 이때, 투여는 하루에 한번 투여할 수 있고, 수회에 나누어 투여할 수도 있다.
나아가, 본 발명은 약학적으로 치료가능한 양의 상기 키메라 항원 수용체 세포를 유효성분으로 함유하는 제1성분; 및 약학적으로 치료가능한 양의 코티닌이 표지된 세포독성물질을 유효성분으로 함유하는 제2성분을 포함하는, 특정 세포가 증식되는 질환 또는 질병의 예방 또는 치료용 약학적 키트를 제공한다.
본 발명의 약학적 키트는 질환 또는 질병의 예방 또는 치료를 위하여 제1성분 및 제2성분이 순차적으로 투여될 수 있다. 상기 제1성분 및 제2성분이 순차적으로 투여되는 경우, 제1성분의 투여 후 면역독성 부작용이 나타나거나, 키메라 항원 수용체 세포가 불멸화되었을 때 제2성분을 투여할 수 있다.
상기 질환 또는 질병은 암일 수 있고, 구체적인 암은 상기 서술한 바와 같다.
발명의 실시를 위한 형태
이하, 본 발명을 하기 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐, 본 발명이 이들로 제한되는 것은 아니다.
실시예 1. 항-코티닌 항체 단편이 연결된 키메라 항원 수용체를 코딩하는 핵산을 포함하는 레트로바이러스의 제작
1-1. 컨스트럭트의 제작
먼저, 항-코티닌 항체의 scFv 단편, 힌지 도메인, 막관통 도메인 및 신호전달 도메인을 각각 코딩하는 핵산을 탑재한 플라스미드를 다음과 같은 방법으로 제조하였다.
구체적으로, 항-코티닌 항체의 scFv 단편은 마우스 Ig 카파 리더 서열이 삽입된 프라이머와 항-코티닌 scFv 서열을 SfiI 제한효소로 절단한 뒤, pCEP4(Invitrogen, 미국) 벡터에 결찰시킨 플라스미드(Clin. Chim. Acta., 2010, 411-1238)를 주형으로 사용하여 통상적인 방법으로 PCR을 하였다. 한편, 키메라 항원 수용체의 골격(skeleton) 부위인 c-myc 표지자, 인간 CD8 힌지 영역, 마우스 CD28 막관통 영역 및 세포질 영역, 및 인간 CD3제타의 세포질 영역은 pLxSN-scFv-anti-CEA-CD28-zeta 플라스미드(Dr. Philip Darcy, PeterMac Cancer Center, 호주)를 주형으로 사용하여 PCR을 하였다. PCR에 사용된 프라이머의 구체적인 서열은 하기 표 1에 나타내었다.
명칭 서열(5'→3') 서열번호
항-코티닌 scFv 정방향 gatatcaagcttgccaccatggattttcaggtgcagattttcagcttcctgctaatcagtgcctcagtcataatgtctagagagctcgatctgacccag 서열번호 29
항-코티닌 scFv 역방향 tgaagagatggtgaccag 서열번호 30
CAR 골격 정방향 gcggccgcagaacaaaaa 서열번호 31
CAR 골격역방향 actagtgtcgacttagcgagggggcagggc 서열번호 32
CEA CAR정방향 gatatcaagcttccatgggccaccatggattttcaggtgcag 서열번호 33
CEA CAR역방향 gaattcatcgatgtcgacgcggccgcttagcgagggggcagggc 서열번호 34
상기 수득된 두 PCR 산물을 결찰시켜 항-코티닌 키메릭 항원 수용체의 cDNA를 제조하였다. 제조된 cDNA 및 pMSCV-puro 벡터(K1062-1, clontech, 미국)를 각각 HindIII/SalI 및 HindIII/ClaI으로 절단 및 결찰시켰다. 그 결과, pMSCV-puro 레트로바이러스 벡터의 PGK 프로모터 하부에 퓨로마이신 저항성 유전자의 위치에 항-코티닌 항체의 scFv 단편 및 각 도메인들을 코딩하는 핵산이 클로닝되었다. 제조된 컨스트럭트는 그 염기서열 분석을 통해 확인하였고, 이를 pMP-Cot-28Z라고 명명하였다(도 3A).
1-2. 레트로바이러스의 생산
실시예 1-1에서 제조된 레트로바이러스 컨스트럭트를 바이러스 외피 단백질인 VSV-G(vesicular stomatitis indiana virus G protein)를 코딩하는 핵산과 상보적인 서열을 갖는 플라스미드인 pMD2.G(#12259, Addgene, 미국)와 함께 Phoenix GP(ATCC, 미국) 세포주에 형질도입시켰다. 형질도입은 리포펙타민 2000(Cat.#11668-019, invitrogen, 미국)을 사용하여 제조사의 프로토콜대로 수행하였다. 48시간 후, VSV-G 위형(pseudotype)의 레트로바이러스가 함유된 배양액을 취하여 이를 다시 Phoenix Eco(ATCC, 미국) 세포주에 감염시켰다. 감염 3 내지 5일 후, 유세포분석기(BD Bioscience, 미국)를 사용하여 myc 표지 양성을 나타내는 Phoenix Eco 세포를 선별하여 세포주를 확립하였다. 생산된 레트로바이러스는 배양액을 원심분리형 필터장치(Amicon Ultra-15, 100 kDa cut-off, Millipore, 미국)를 사용하여 10배 농축하여 보관하였다.
실시예 2. 항-코티닌 항체 단편이 연결된 키메라 항원 수용체가 표면에 제시된 세포독성 T 세포의 제조
실시예 1-2에서 제조된 바이러스를 이용하여, 항-코티닌 항체 단편이 연결된 키메라 항원 수용체가 표면에 제시된 세포독성 T 세포를 제조하였다.
먼저, B6 마우스로부터 비장세포를 분리하여, 10 ㎍/㎖의 항-CD3 항체(145-2C11, BD Bioscience, 미국)가 코팅된 세포 배양용기에 웰 당 2.5x106개가 되도록 분주하였다. 이때, 세포는 2 ㎍/㎖의 항-CD28 항체(37.51, BD Bioscience, 미국)가 포함된 RPMI-1640 배지를 총 1 ㎖가 되도록 첨가하고, 5% CO2, 37℃의 조건에서 배양하여 준비하였다. 24시간 후, 6 ㎎/㎖의 폴리브렌(Sigma-Aldrich, 미국)이 2 ㎕ 포함된 농축된 레트로바이러스 1 ㎖을 상기 세포에 첨가하고, 이를 원심분리기(Centrifuge 5810R, Eppendorf, 미국)를 사용하여 2,500 rpm의 조건으로 90분 동안 원심분리 형질도입으로 형질도입시켰다. 이때, 폴리브렌은 레트로바이러스의 형질도입율을 증가시키기 위해 사용되었다. 이후, 배양 상등액 1 ㎖를 제거하고, 여기에 1 ㎖의 농축된 레트로바이러스와 1 ㎕의 폴리브렌을 다시 첨가하여 상기와 동일한 조건으로 원심분리함으로써 레트로바이러스를 형질도입시켰다. 이후, 배양액 1 ㎖을 제거하고, 20 U/㎖의 인터루킨-2(Gibco, 미국)가 포함된 RPMI-1640 배지를 1 ㎖ 첨가하였다.
48시간 후, 바이러스가 형질도입된 T 세포의 배지를 20 U/㎖의 인터루킨-2가 함유된 배지로 교체하고, 이를 5% CO2, 37℃의 조건에서 72시간 동안 배양하였다. 그 후, 염색된 c-myc 표지를 유세포분석기로 측정하여 확인한 항-코티닌 항체 단편이 연결된 키메라 항원 수용체의 형질 도입율은 약 50 내지 70%였다(도 3B). 한편, 대조군으로서 녹색 형광 단백질이 도입된 T 세포는 약 80%의 형질 도입율을 나타내었다. 이렇게 제조된 항-코티닌 항체 단편이 연결된 키메라 항원 수용체가 표면에 제시된 T 세포는, 제조 후 24시간 이내로 이후의 실험에 사용하였다.
실시예 3. 코티닌과 접합 물질의 복합체 제조
3-1. 코티닌과 항체의 복합체 제조
접합 물질로서, 항-CD20 항체인 리툭시맙(Genentech, Biogen, 미국), 항-HER2 항체인 트라스트주맙(Genentech, 미국), 항-인플루엔자 바이러스 헤마글루티닌(hemagglutinin) 항체인 CT302(셀트리온, 한국) 및 항-HLA 항체인 W6/32(eBioscience, 미국)를 사용하여, 코티닌과 접합된 복합체를 제조하였다. 이때, 상기 복합체는 EDC(1-ethyl-3-[3 dimethylaminopropyl]carbodiimide) 연결방법으로 접합시켰다.
먼저, 상기 항체들을 PBS에 25 μM 농도가 되도록 용해시켜 준비하였다. 한편, 1 ㎖의 MES 완충액[0.1M의 MES(2-[morpholino]ethaneusulfonic acid) 및 0.5 M의 염화나트륨, pH 6.0]에 트랜트-4-코티닌카복실산(trans-4-cotininecarboxylic acid, Sigma-Aldrich)이 5 mM의 농도가 되도록 용해시켜 준비하였다. 여기에 50 mM 농도의 EDC 및 125 mM 농도의 N-하이드록시설포숙시니마이드(N-hydroxysulfosuccinimide, Sulfo-NHS, Thermo Scientific, 미국)를 첨가한 뒤, 이를 상온에서 15분 동안 교반하며 용해시켜 코티닌-NHS 에스터가 생성된 활성용액을 제조하였다. 코티닌-NHS 에스터와 단백질의 아민기 사이의 반응을 유도하기 위해 수산화 나트륨 용액을 첨가하여, 상기 활성용액의 pH를 7 이상으로 조절하고 1 ㎖을 취하여, 여기에 코티닌과 접합시킬 항체를 25 μM의 농도로 활성용액과 동량으로 첨가하였다. 혼합물을 상온에서 3시간 동안 교반하면서 반응시켜 EDC 연결반응을 통해 생성된 코티닌-항체 복합체를 수득하였다. 수득된 코티닌-항체 복합체는 Slide-A-lyzer™ 투석카세트(Thermo Fisher Scientific, 미국)을 이용하여 PBS로 투석하거나, Amicon® Ultra Centrifugal Filter(EMD Millipore, 미국)을 이용하여 완충액을 PBS로 교환하여 사용하였다.
3-2. 코티닌과 앱타머의 복합체 제조
혈관내피성장인자(VEGF)를 인식하는 앱타머인 페갑타닙(pegaptanib)을 사용하여, 고체상 올리고펩타이드 합성 방법으로 코티닌-페갑타닙 복합체를 제조하였다.
구체적으로, 페갑타닙 RNA 앱타머(5'-pCfpGmpGmpArpArpUfpCfpAmpGmpUfpGmpAmpAmpUfpGmpCfpUfpUfpAmpUfpAmpCfpAmpUfpCfpCfpGm-p-dT-3-3', 서열번호 34)는 올리고 펩타이드 합성기를 이용하여 3'-말단에서 5'-말단으로 합성한 뒤, 5'-말단에 아미노 C6 링커를 붙였다. 상기 아미노 C6 링커에 활성 에스터 결합방법(active ester cross-linking)을 이용하여 코티닌이 부착된 구조를 제조하였다. 이후 Xbridge Prep C18 컬럼(5 μm, 10x150 ㎜, Waters Corp., 미국)을 이용하여 역상 고압 액체 크로마토그래피로 정제(>95% 순도)하고, 질량분석기를 이용하여 이의 크기를 확인하였다(ST Pharm, 한국)(Clin. Chim. Acta., 2010(411):1238; Exp. Mol. Med., 2012(44):554).
상기 합성된 코티닌 및 페갑타닙의 복합체는 디에틸피로카보네이트(diethylpyrocarbonate)를 첨가한 증류수에 현탁하고, 95℃에서 5분 동안 반응시킨 뒤, 상온에서 30분 동안 식혀 -20℃에 보관하였다.
비교예 1. 항-암배아성 항원 scFv 단편이 연결된 키메라 항원 수용체 T 세포의 제조
항-암배아성 항원(anti-carcinoembryonic antigen, anti-CEA) scFv 단편이 연결된 키메라 항원 수용체 유전자는 pLxSN-scFv-anti-CEA-zeta 플라스미드(Dr. Philip Darcy, PeterMac Cancer Center, 호주)를 주형으로 상기 표 1에 기재된 프라이머를 사용하여 PCR 방법으로 수득하였다. 상기 수득된 유전자 및 pMSCV-puro 벡터(K1062-1, clontech, 미국)를 각각 HindIII 및 ClaI으로 절단 및 결찰시켰다. 상기 제조된 컨스트럭트를 pMP-C28Z로 명명하였다. 상기 컨스트럭트를 사용하여 실시예 1 및 2의 조건 및 방법으로 레트로바이러스를 생산하고, 상기 레트로바이러스가 형질도입된 T 세포를 제조하였다.
비교예 3. 녹생형광단백질을 발현하는 T 세포의 제조
녹생형광단백질을 발현하는 T 세포를 제조하기 위하여, pMIG-w 플라스미드(Dr. Yosef Refaeli, National Jewish Medical and Research Center, 미국)에 포함되어 있는 녹색형광단백질의 유전자를 NcoI 및 SalI을 사용하여 수득하였다. 상기 유전자를 비교예 2에서 제조된 pMP-C28Z 플라스미드에서 상기와 동일한 효소로 항-암배아항원 키메라 항원 수용체 유전자를 제거한 뒤, 상기 부위에 삽입하였다. 제조된 컨스트럭트를 pMP-GFP로 명명하였다. 이후, 상기 컨스트럭트를 사용하여 실시예 1 및 2의 조건 및 방법으로 레트로바이러스를 생산하고, 상기 레트로바이러스가 형질도입된 T 세포를 제조하였다.
시험예 1. 코티닌-페갑타닙 복합체를 이용한 항-코티닌 항체 단편이 연결된 키메라 항원 수용체 T 세포의 활성화 확인
상기 실시예 3-2에서 제조한 코티닌과 페갑타닙의 복합체를 사용하여, 상기 복합체가 VEGF(vascular endothelial growth factor)를 인식함으로써, 키메라 항원 수용체 세포의 활성화를 유도하는지 여부를 확인하기 위하여 ELISA를 수행하였다.
먼저, 96-웰 플레이트에 5 ㎍/㎖의 VEGF를 첨가하고, 이를 4℃에서 하룻밤 두어 VEGF로 코팅하였다. 코팅된 플레이트를 20% 소태아혈청 및 1% 페니실린-스트렙토마이신(Gibco, 미국)이 첨가된 RPMI-1640 배지(Welgene, 한국)로 2회 세척하고, 100 nM의 코티닌-페갑타닙 복합체를 첨가하여 37℃에서 한시간 동안 반응시켰다. 반응 후, 이를 상기 RPMI-1640 배지로 3회 세척 후, 웰 당 1x105개가 되도록 실시예 2에서 제조한 키메라 항원 수용체 T 세포를 첨가하고, 5% CO2 및 37℃의 조건으로 24시간 동안 배양하였다. 그 결과, 배지에 분비된 인터페론 감마의 양을 ELISA 키트(Cat#. 555138, BD Bioscience, 미국)를 사용하여 제조사의 프로토콜대로 측정하였고, 그 결과를 도 4에 나타내었다. 이때, 대조군으로서 VEGF가 코팅된 플레이트에 아무것도 첨가하지 않은 군(VEGF only), VEGF가 코팅되지 않은 플레이트에 T 세포만 첨가한 군(T cell only), VEGF가 코팅된 플레이트에 T 세포만 첨가한 군(VEGF+T cell), 및 VEGF가 코팅된 플레이트에 대조군 앱타머(5'-dTTGGTGGTGGTGGTTGTGGTGGTGGTGG-3', 서열번호 36)와 T 세포를 첨가한 군(VEGF+Control Aptamer+T cell)을 사용하였다.
도 4에 나타난 바와 같이, 코티닌-페갑타닙 복합체를 항-코티닌 항체 단편이 연결된 키메라 항원 수용체 T 세포와 첨가한 군(VEGF+Cot-pegaptanib+T cell)에서 인터페론 감마의 분비가 유의적으로 증가함을 확인하였다.
시험예 2. 코티닌-항-HER2 항체 복합체를 이용한 항-코티닌 항체 단편이 연결된 키메라 항원 수용체 T 세포의 활성화 확인
실시예 3-1에서 제조한 코티닌-항-HER2 항체 복합체를 사용하여, 상기 복합체가 세포 표면의 HER2를 인식함으로써, 키메라 항원 수용체 세포의 활성화를 유도하는지 여부를 확인하였다.
먼저, HER2 양성 세포인 AU565 세포주 및 HER2 음성 세포인 MDA-MB-231 세포주를 바닥이 둥근 형태의 96-웰 플레이트에 웰 당 3x104개가 되도록 분주하여, 5% CO2 및 37℃의 조건으로 하룻밤 동안 배양하였다. 배양 상등액을 제거한 뒤, 10% 소태아혈청 및 1% 페니실린-스트렙토마이신이 첨가된 DMEM(Gibco, 미국) 배지에 10 ㎍/㎖의 농도로 첨가된 코티닌-항-HER2 항체 복합체를 100 ㎕ 첨가하고, 이를 동일한 조건에서 1시간 동안 배양하였다. 이후, 배지를 제거하고, 무혈청배지로 세포를 2회 세척한 뒤, 웰 당 3x105개가 되도록 실시예 2에서 제조한 키메라 항원 수용체 T 세포를 첨가하고, 5% CO2 및 37℃의 조건으로 24시간 동안 배양하였다. 그 결과, 배지에 분비된 인터페론 감마의 양을 ELISA 키트를 사용하여 제조사의 프로토콜대로 측정하였고, 그 결과를 도 5에 나타내었다. 이때, 대조군으로서 세포를 배양하지 않은 플레이트에 키메라 항원 수용체 T 세포를 첨가한 군(T cell only), 세포를 배양한 플레이트에 아무것도 첨가하지 않은 군(tumor only), 세포를 배양한 플레이트에 키메라 항원 수용체 T 세포를 첨가한 군(tumor+T cell), 세포를 배양한 플레이트에 인플루엔자 바이러스 헤마글루티닌 특이적 항체(CT302)를 키메라 항원 수용체 T 세포와 첨가한 군(CT302), 세포를 배양한 플레이트에 CT302 항체가 연결된 코티닌을 키메라 항원 수용체 T 세포와 첨가한 군(CT302-Cot), 세포를 배양한 플레이트에 항-HER2 항체를 키메라 항원 수용체 T 세포와 첨가한 군(anti-HER2)을 사용하였다.
도 5에 나타난 바와 같이, 코티닌-항-HER2 항체 복합체를 항-코티닌 항체 단편이 연결된 키메라 항원 수용체 T 세포와 첨가한 군(anti-HER2-Cot)에서 인터페론 감마의 분비가 유의적으로 증가함을 확인하였다.
시험예 3. 항-코티닌 항체 단편이 연결된 키메라 항원 수용체 T 세포의 항원 특이적 활성화 확인
코티닌-항-HER2 항체 복합체 및 항-코티닌 항체 단편이 연결된 키메라 항원 수용체 T 세포에 의해 유도되는 인터페론 감마의 분비가, 코티닌과 연결된 항체 특이적인지 확인하기 위하여 다음과 같은 실험을 수행하였다.
실험은, HER2 양성 세포인 AU565 세포만을 사용한 것을 제외하고는 상기 시험예 2와 동일한 조건 및 방법으로 수행되었다. 이때, 아무것도 표면에 발현하지 않는 T 세포, 비교예 1에서 제조된 T 세포 또는 실시예 2에서 제조된 T 세포를 각각, 세포를 배양하지 않은 플레이트에 T 세포만 첨가한 군(T cell only), 세포를 배양한 플레이트에 CT302 항체와 T 세포를 첨가한 군(CT302), 세포를 배양한 플레이트에 CT302 항체가 연결된 코티닌과 T 세포를 첨가한 군(CT302-Cot), 세포를 배양한 플레이트에 항-HER2 항체와 T 세포를 첨가한 군(anti-HER2) 및 세포를 배양한 플레이트에 항-HER2 항체가 연결된 코티닌과 T 세포를 첨가한 군(anti-HER2-Cot)과의 조합으로 첨가하였다. 그 결과, 분비되는 인터페론 감마의 양을 ELISA의 방법으로 측정하여 도 6A에 나타내었다.
도 6A에 나타난 바와 같이, 코티닌-항-HER2 항체 복합체를 항-코티닌 항체 단편이 연결된 키메라 항원 수용체 T 세포와 첨가한 군(anti-HER2-Cot)에서 인터페론 감마의 분비가 유의적으로 증가함을 확인하였다. 따라서, 인터페론 감마의 분비는 코티닌에 연결된 결합 물질에 의해서 유도되는 것을 알 수 있었다.
시험예 4. T 세포의 표면에 제시된 키메라 항원 수용체의 발현율 확인
아무것도 표면에 발현하지 않는 T 세포와 실시예 2 및 비교예 1에서 제조된 항-코티닌 항체 단편 또는 CEA가 연결된 키메라 항원 수용체 T 세포에서 c-myc의 발현을 측정하여, 상기 키메라 항원 수용체 각각의 발현율을 확인하였다.
먼저, 아무것도 표면에 발현하지 않는 T 세포, 및 실시예 2 또는 비교예 1에서 제조한 키메라 항원 수용체 T 세포를 웰 당 4x105개의 세포가 되도록 각각 분주하였다. 분주된 세포를 1% 소혈청알부민(BSA) 및 0.02% NaN3가 첨가된 PBS 완충액으로 2회 세척하고, 상기 완충액에 1:400의 비율로 항-myc 항체(BD Bioscience, 미국)를 희석하여 첨가하였다. 이를 냉장에서 20분 동안 반응시키고, 상기 PBS 완충액으로 3회 세척하였다. 여기에, 1:1000의 비율로 스트렙타비딘-PE(BD Bioscience, 미국), 1:500의 비율로 CD8-perCP-cy5.5(BD Bioscience, 미국) 및 1:1000의 비율로 CD4-APC(BD Bioscience, 미국)가 첨가된 PBS 완충액을 50 ㎕ 넣고, 냉장에서 25분 동안 반응시켰다. 이를 PBS 완충액으로 3회 세척한 뒤, 세포를 총 300 ㎕의 PBS에 재현탁하여 유세포분석기(FACS Caliber, BD Bioscience, 미국)를 사용하여 c-myc 표지 양성 세포를 분석하여, 그 결과를 도 6B에 나타내었다. 이때, 각각의 T 세포에 대한 대조군으로서, 항체를 처리하지 않은 군(Unstained), 2차 항체인 스트렙타비딘-PE만을 처리한 군(Control)을 사용하였다.
도 6B에 나타낸 바와 같이, 실시예 2 및 비교예 1에서 제조된 키메라 항원 수용체 T 세포는 항-코티닌 항체 단편 또는 CEA를 발현하고 있음을 확인하였다.
시험예 5. 코티닌-항-CD20 항체 복합체를 이용한 항-코티닌 항체 단편이 연결된 키메라 항원 수용체 T 세포의 활성화 확인
실시예 3-1에서 제조한 코티닌-항-CD20 항체 복합체를 사용하여, 상기 복합체가 세포 표면의 CD20을 인식함으로써, 키메라 항원 수용체 세포의 활성화를 유도하는지 여부를 확인하였다. 구체적으로, 실험은 AU565 세포주 및 MDA-MB-231 세포주 대신, CD20 음성 세포인 Jurkat E6.1 세포주 및 CD20 양성 세포인 Raji 세포주를 10% 소태아혈청 및 1% 페니실린-스트렙토마이신이 첨가된 RPMI-1640 배지에 배양하여 사용하고, 분비된 인터페론 감마의 양을 배양 48시간 후 수득한 배양액에서 확인한 것을 제외하고는, 상기 시험예 2와 동일한 조건 및 방법으로 수행하였다. 그 결과 분비된 인터페론 감마의 양은 도 7에 나타내었다. 이때, 대조군으로서 세포를 배양하지 않은 플레이트에 키메라 항원 수용체 T 세포를 첨가한 군(T cell only), 세포를 배양한 플레이트에 아무것도 첨가하지 않은 군(tumor only), 세포를 배양한 플레이트에 항-CD20 항체를 키메라 항원 수용체 T 세포와 첨가한 군(anti-CD20)을 사용하였다.
도 7에 나타난 바와 같이, 코티닌-항-CD20 항체 복합체를 항-코티닌 항체 단편이 연결된 키메라 항원 수용체 T 세포와 첨가한 군(anti-CD20-Cot)에서 인터페론 감마의 분비가 유의적으로 증가함을 확인하였다.
시험예 6. 코티닌-항-HLA 항체 복합체를 이용한 항-코티닌 항체 단편이 연결된 키메라 항원 수용체 T 세포의 활성화 확인
실시예 3-1에서 제조한 코티닌-항-HLA 항체 복합체를 사용하여, 상기 복합체가 세포 표면의 HLA을 인식함으로써, 키메라 항원 수용체 세포의 활성화를 유도하는지 여부를 확인하였다. 구체적으로, 실험은 AU565 세포주 및 MDA-MB-231 세포주 대신, HLA 음성 세포인 NIH3T3 세포주 및 HLA 양성 세포인 HLA7 또는 HLA20 세포주를 20% 소태아혈청 및 1% 페니실린-스트렙토마이신이 첨가된 IMDM 배지에 배양하여 사용하고, 분비된 인터페론 감마의 양을 배양 48시간 후 수득한 배양액에서 확인한 것을 제외하고는, 상기 시험예 2와 동일한 조건 및 방법으로 수행하였다.
한편, HLA7 및 HLA20 세포주는 다음과 같은 방법으로 제조되었다. 구체적으로, 10 ㎖의 말초혈액과 동량 PBS를 혼합한 혼합액을 15 ㎖의 Ficoll-Paque PLUS(GE Healthcare Life Science, 미국)에 분주하였다. 이를 400 xg에서 30분 동안 원심분리하고, 이때 브레이크는 '0'으로 설정하였다. 원심분리 후, 가장 상층의 혈장을 제거하고, 5 ㎖의 말초혈액 단핵구 층을 취하였다. 여기에 RPMI-1640 배지를 30 ㎖ 첨가하고, 동일한 조건으로 10분 동안 원심분리하였다. 상층액을 제거하고, 동량의 RPMI-1640 배지를 첨가하여 한번 더 세척하였다. 침전된 세포를 20% 소태아혈청이 포함된 RPMI-1640 배지 2 ㎖로 재현탁하고 세포 수를 계수하였다. T25 플라스크에 1x107개의 세포를 분주하고, 총 6 ㎖의 배양 배지를 넣어 5% CO2, 37℃의 조건에서 배양하였다. 여기에 2 ㎖의 엡스타인바 바이러스(VR-1492, ATCC, 미국)를 첨가하고, 동일한 조건에서 배양하였다. 배양 2시간 후, 1 ㎍/㎖의 사이클로스포린 A(Gibco, 미국)을 첨가하고, 동일한 조건에서 4일 동안 배양하였다. 배양 4일째에 2 ㎖의 배양 배지를 첨가하고, 7일째에 이를 계대배양하였다. 계대배양을 지속하여 10 내지 20일 동안 엡스타인바 바이러스가 형질도입된 B 세포가 콜로니를 형성하면, 상기 콜로니를 2개 취하여 계대배양을 지속하였다. 이렇게 제조된 불멸성 B 세포주 2개를 각각 HLA7 및 HLA20으로 명명하였다.
그 결과 분비된 인터페론 감마의 양은 도 8에 나타내었다. 이때, 대조군으로서 세포를 배양하지 않은 플레이트에 키메라 항원 수용체 T 세포를 첨가한 군(T cell only), 세포를 배양한 플레이트에 아무것도 첨가하지 않은 군(tumor only), 세포를 배양한 플레이트에 항-HLA 항체를 키메라 항원 수용체 T 세포와 첨가한 군(anti-HLA)을 사용하였다.
도 8에 나타난 바와 같이, 코티닌-항-HLA 항체 복합체를 항-코티닌 항체 단편이 연결된 키메라 항원 수용체 T 세포와 첨가한 군(anti-HLA-Cot)에서 인터페론 감마의 분비가 유의적으로 증가함을 확인하였다.
시험예 7. 코티닌-항-HER2 항체 복합체 및 항-코티닌 항체 단편이 연결된 키메라 항원 수용체 T 세포에 의한 표적세포 특이적 세포사멸 효과 확인
실시예 3-1에서 제조한 코티닌-항-HER2 항체 복합체 및 항-코티닌 항체 단편이 연결된 키메라 항원 수용체 T 세포를 사용하여, 상기 복합체가 세포 표면의 HER2를 인식함으로써, 키메라 항원 수용체 T 세포에 의한 세포사멸을 유도하는지 여부를 확인하였다.
먼저, HER2 양성 세포인 AU565 세포주 및 HER2 음성 세포인 MDA-MB-231 세포를 100 ㎜의 세포 배양용기에 2x106개가 되도록 분주하였다. 분주된 세포를 시험예 2와 동일한 배지 및 조건으로 배양하였다. 배양된 세포를 계수하여 AU565 세포주는 1 ㎖당 2x107개, MDA-MB-231 세포주는 1 ㎖당 2x107개가 되도록 세포를 준비하고, 여기에 CFSE(carboxyfluorescein succinimidyl ester, Invitrogen, 미국)를 각각 1 μM 및 100 nM의 농도로 첨가하였다. 이를 상온에서 8분 동안 반응시켜 각각의 세포주가 다른 형광세기로 염색되게 한 뒤, 이를 유세포분석기(BD Bioscience, 미국)를 사용하여 확인한 결과를 도 9A에 나타내었다.
도 9A에 나타난 바와 같이, AU565 세포주는 형광 세기가 약하게 염색되었고(CFSElow), MDA-MB-231 세포주는 형광 세기가 강하게 염색되었다(CFSEhigh).
염색된 세포를 PBS로 2회 세척하고, 세척된 세포주를 각각 1.5x106개 씩 1:1의 비율이 되도록 혼합하여 96-웰 플레이트에 분주하였다. 분주된 세포가 부착되면, 여기에 1 ㎍/㎖의 코티닌-항-HER2 항체 복합체를 첨가하여, 상온에서 1시간 동안 반응시켰다. 반응 후, 세포주를 배양 배지로 세척하고, 계수하여 5x104개의 세포가 되도록 5 ㎖ 튜브에 넣었다. 여기에 항-코티닌 항체 단편이 연결된 키메라 항원 수용체 T 세포를 첨가하고, 이를 5% CO2, 37℃의 조건에서 4시간 또는 22시간 동안 배양하였다. 이때, 키메라 항원 수용체 T 세포(작용세포주, E), 및 AU565 및 MDA-MB-231 세포주(표적세포주, T)의 비율이 0:1, 5:1, 10:1이 되도록 하였다. 배양 후, 사멸된 세포를 구분하기 위해 7-AAD(BD Bioscience, 미국)를 1x106개의 세포 당, 0.25 ㎍ 첨가하여 상온에서 10분 동안 반응시킨 뒤, 이를 유세포분석기로 분석하였다. 이때, 7-AAD 음성인 세포와 CFSE 양성인 세포를 분획하여 분석하였다. 분석 결과, 표적 세포의 세포 사멸율을 하기 수학식 1에 따라 계산하여, 그 결과를 도 9B에 나타내었다.
Figure 112018017629266-pct00001
도 9B에 나타난 바와 같이, 첨가된 키메라 항원 수용체 T 세포의 양에 비례하여 HER2 양성 세포주인 AU565의 세포 사멸이 증가함을 확인하였다. 이로부터, 항-코티닌 항체 단편이 연결된 키메라 항원 수용체 T 세포가 이와 복합체를 이루는 코티닌에 연결된 결합물질 특이적으로 세포사멸을 유도함을 알 수 있었다.
시험예 8. 코티닌-독성물질 복합체에 의한 키메라 항원 수용체 T 세포의 세포사멸 유도 효과 확인
코티닌-독성물질의 복합체를 Concortitis사에 의뢰하여 제조하고, 상기 복합체가 실시예 2에서 제조된 키메라 항원 수용체 T 세포의 세포사멸을 유도하는지 여부를 다음과 같은 방법으로 확인하였다.
구체적으로, 키메라 항원 수용체 T 세포를 96-웰 플레이트에 5x105개가 되도록 분주하여 상기 배양배지로 배양하였다. 여기에 0, 0.1, 1, 10, 100 또는 1,000 nM의 코티닌-독성물질의 복합체를 첨가하고, 5% CO2, 37℃의 조건으로 48시간 동안 배양하였다. 첨가된 코티닌-독성물질의 복합체는, 코티닌-듀오카마이신 단일 접합체, 코티닌-DM1 복합 접합체(2x코티닌-4xDM1) 또는 코티닌-듀오카마이신 복합 접합체(2x코티닌-4x듀오카마이신)를 사용하였다(도 11). 배양 후, 7-AAD로 살아있는 세포를 염색하고, 7-AAD로 염색되거나, myc 표지에 의해 염색된 세포를 유세포분석기로 분석하였다. 분석 결과, 코티닌-독성물질 접합체에 의한 키메라 항원 수용체 T 세포의 세포독성은 하기 수학식 2를 이용하여 계산하였고, 그 결과는 도 10A 및 10B에 나타내었다. 이때, 대조군으로서 비교예 2에서 제조한 T 세포를 사용하였다.
Figure 112018017629266-pct00002
도 10A 및 10B에 나타난 바와 같이, 항-코티닌 항체 단편이 연결된 키메라 항원 수용체 T 세포가 비교예 2의 T 세포에 비해 세포 사멸율이 높음을 확인하였고, 세포 사멸율은 첨가된 코티닌-독성물질의 복합체 농도에 비례하였다.
상기 결과로부터 코티닌-독성물질의 복합체를 사용하면 항-코티닌 항체 단편이 연결된 키메라 항원 수용체 T 세포의 세포사멸을 유도할 수 있음을 알 수 있었다.
<110> Seoul National University R&DB Foundation <120> CHIMERIC ANTIGEN RECEPTOR CONJUGATED ANTI-COTININE ANTIBODY AND <130> PCB508053SNU <150> KR 62/205,844 <151> 2015-08-17 <160> 36 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 245 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> amino acid sequence of Anti-cotinine scFv <400> 1 Glu Leu Asp Leu Thr Gln Thr Pro Ala Ser Val Ser Ala Ala Val Gly 1 5 10 15 Gly Thr Val Thr Ile Asn Cys Gln Ser Ser Gln Ser Pro Tyr Ser Asn 20 25 30 Glu Trp Leu Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Lys Val 35 40 45 Leu Ile Ser Arg Ile Ser Thr Leu Ala Ser Gly Val Ser Ser Arg Phe 50 55 60 Lys Gly Ser Gly Ser Gly Thr Gln Phe Thr Leu Thr Ile Ser Asp Leu 65 70 75 80 Glu Cys Gly Asp Ala Ala Thr Tyr Phe Cys Ala Gly Gly Tyr Asn Phe 85 90 95 Gly Leu Phe Pro Phe Gly Gly Gly Thr Glu Leu Glu Ile Leu Ser Ser 100 105 110 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Gly Gly Ser Ser Arg Ser Ser 115 120 125 Gln Ser Val Lys Glu Ser Glu Gly Arg Leu Val Thr Pro Gly Gly Ser 130 135 140 Leu Thr 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gggcggtggt 360 gggggtggtt cctctagatc ttcccagtcg gtgaaggagt ccgagggtcg cctggtcacg 420 cctggaggat ccctgacact cacctgcaca gtctctggaa tcgacctcag tagggactgg 480 atgaactggg tccgccaggc tccaggggag gggctggaat ggatcggagc cattggtaga 540 agtggagaca catactacgc gacctgggcg aaaggccgat tcaccatctc caaaacctcg 600 tcgaggacgg tgactctaac agtcaccgat ctgcagcgct cagacacggc cacctatttc 660 tgtgccagaa ttccttattt tggttggaat aatggtgaca tctggggccc aggcaccctg 720 gtcaccatct cttca 735 <210> 3 <211> 63 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> amino acid sequence of Human CD8 hinge <400> 3 Ser Ala Leu Ser Asn Ser Ile Met Tyr Phe Ser His Phe Val Pro Val 1 5 10 15 Phe Leu Pro Ala Lys Pro Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr 20 25 30 Pro Ala Pro Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala 35 40 45 Cys Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp 50 55 60 <210> 4 <211> 189 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> nucleotide sequence of Human CD8 hinge <400> 4 tcagcgctga gcaactccat 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Gly Leu Thr Arg Lys Pro Tyr Gln Pro Tyr Ala Pro 20 25 30 Ala Arg Asp Phe Ala Ala Tyr Arg Pro 35 40 <210> 12 <211> 123 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> nucleotide sequence of Mouse CD28 cytoplasmic region <400> 12 aatagtagaa ggaacagact ccttcaaagt gactacatga acatgactcc ccggaggcct 60 gggctcactc gaaagcctta ccagccctac gcccctgcca gagactttgc agcgtaccgc 120 ccc 123 <210> 13 <211> 112 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> amino acid sequence of Human CD3 zeta cytoplasmic region <400> 13 Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly 1 5 10 15 Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr 20 25 30 Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys 35 40 45 Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys 50 55 60 Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg 65 70 75 80 Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala 85 90 95 Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala 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Leu Ile Ser Arg Ile Ser Thr Leu Ala Ser Gly 65 70 75 80 Val Ser Ser Arg Phe Lys Gly Ser Gly Ser Gly Thr Gln Phe Thr Leu 85 90 95 Thr Ile Ser Asp Leu Glu Cys Gly Asp Ala Ala Thr Tyr Phe Cys Ala 100 105 110 Gly Gly Tyr Asn Phe Gly Leu Phe Pro Phe Gly Gly Gly Thr Glu Leu 115 120 125 Glu Ile Leu Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Gly Gly 130 135 140 Ser Ser Arg Ser Ser Gln Ser Val Lys Glu Ser Glu Gly Arg Leu Val 145 150 155 160 Thr Pro Gly Gly Ser Leu Thr Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Ile Asp 165 170 175 Leu Ser Arg Asp Trp Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Glu Gly 180 185 190 Leu Glu Trp Ile Gly Ala Ile Gly Arg Ser Gly Asp Thr Tyr Tyr Ala 195 200 205 Thr Trp Ala Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Lys Thr Ser Ser Arg Thr 210 215 220 Val Thr Leu Thr Val Thr Asp Leu Gln Arg Ser Asp Thr Ala Thr Tyr 225 230 235 240 Phe Cys Ala Arg Ile Pro Tyr Phe Gly Trp Asn Asn Gly Asp Ile Trp 245 250 255 Gly Pro Gly Thr Leu Val Thr Ile Ser Ser Ala Ala Ala Glu Gln Lys 260 265 270 Leu Ile Ser Glu Glu Asp Leu Asn Gly Val Thr Val Ser Ser Ala Leu 275 280 285 Ser Asn Ser Ile Met Tyr Phe Ser His Phe Val Pro Val Phe Leu Pro 290 295 300 Ala Lys Pro Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro 305 310 315 320 Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro 325 330 335 Ala Ala Gly Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp Pro Phe Trp Val 340 345 350 Leu Val Val Val Gly Gly Val Leu Ala Cys Tyr Ser Leu Leu Val Thr 355 360 365 Val Ala Phe Ile Ile Phe Trp Val Arg Ser Lys Arg Ser Arg Leu Leu 370 375 380 His Ser Asp Tyr Met Asn Met Thr Pro Arg Arg Pro Gly Pro Thr Arg 385 390 395 400 Lys His Tyr Gln Pro Tyr Ala Pro Pro Arg Asp Phe Ala Ala Tyr Arg 405 410 415 Ser Leu Glu Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr 420 425 430 Gln Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg 435 440 445 Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met 450 455 460 Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu 465 470 475 480 Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys 485 490 495 Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu 500 505 510 Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu 515 520 525 Pro Pro Arg 530 <210> 16 <211> 1596 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> nucleotide sequence of chimeric antigen receptor_Human <400> 16 atggattttc aggtgcagat tttcagcttc ctgctaatca gtgcctcagt cataatgtct 60 agagagctcg atctgaccca gactccagcc tccgtgtctg cagctgtggg aggcacagtc 120 accatcaatt gccagtccag tcagagtcct tatagtaacg agtggttatc ctggtatcag 180 cagaaaccag ggcaggctcc caaagtccta atttctagga tatccactct ggcatctggg 240 gtctcatcgc ggttcaaagg cagtggatct gggacacagt tcactctcac cataagcgac 300 ctggagtgtg gcgacgctgc cacttatttc tgtgcaggcg gttataattt tggtttgttt 360 cctttcggcg gagggaccga gctggagatc ctatcctctg gtggcggtgg ctcgggcggt 420 ggtgggggtg gttcctctag atcttcccag tcggtgaagg agtccgaggg tcgcctggtc 480 acgcctggag gatccctgac actcacctgc acagtctctg gaatcgacct cagtagggac 540 tggatgaact gggtccgcca ggctccaggg gaggggctgg aatggatcgg agccattggt 600 agaagtggag acacatacta cgcgacctgg gcgaaaggcc gattcaccat ctccaaaacc 660 tcgtcgagga cggtgactct aacagtcacc gatctgcagc gctcagacac ggccacctat 720 ttctgtgcca gaattcctta ttttggttgg aataatggtg acatctgggg cccaggcacc 780 ctggtcacca tctcttcagc ggccgcagaa caaaaactca tctcagaaga ggatctgaat 840 ggggtcaccg tctcttcagc gctgagcaac tccatcatgt acttcagcca cttcgtgccg 900 gtcttcctgc cagcgaagcc caccacgacg ccagcgccgc gaccaccaac accggcgccc 960 accatcgcgt cgcagcccct gtccctgcgc ccagaggcat gccggccagc ggcggggggc 1020 gcagtgcaca cgagggggct ggatcccttt tgggtgctgg tggtggttgg tggagtcctg 1080 gcttgctata gcttgctagt aacagtggcc tttattattt tctgggtgag gagtaagagg 1140 agcaggctcc tgcacagtga ctacatgaac atgactcccc gccgccccgg gcccacccgc 1200 aagcattacc agccctatgc cccaccacgc gacttcgcag cctatcgctc cctcgagaga 1260 gtgaagttca gcaggagcgc agacgccccc gcgtaccagc agggccagaa ccagctctat 1320 aacgagctca atctaggacg aagagaggag tacgatgttt tggacaagag acgtggccgg 1380 gaccctgaga tggggggaaa gccgagaagg aagaaccctc aggaaggcct gtacaatgaa 1440 ctgcagaaag ataagatggc ggaggcctac agtgagattg ggatgaaagg cgagcgccgg 1500 aggggcaagg ggcacgatgg cctttaccag ggtctcagta cagccaccaa ggacacctac 1560 gacgcccttc acatgcaggc cctgccccct cgctaa 1596 <210> 17 <211> 533 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> amino acid sequence of chimeric antigen receptor_Mouse <400> 17 Met Asp Phe Gln Val Gln Ile Phe Ser Phe Leu Leu Ile Ser Ala Ser 1 5 10 15 Val Ile Met Ser Arg Glu Leu Asp Leu Thr Gln Thr Pro Ala Ser Val 20 25 30 Ser Ala Ala Val Gly Gly Thr Val Thr Ile Asn Cys Gln Ser Ser Gln 35 40 45 Ser Pro Tyr Ser Asn Glu Trp Leu Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly 50 55 60 Gln Ala Pro Lys Val Leu Ile Ser Arg Ile Ser Thr Leu Ala Ser Gly 65 70 75 80 Val Ser Ser Arg Phe Lys Gly Ser Gly Ser Gly Thr Gln Phe Thr Leu 85 90 95 Thr Ile Ser Asp Leu Glu Cys Gly Asp Ala Ala Thr Tyr Phe Cys Ala 100 105 110 Gly Gly Tyr Asn Phe Gly Leu Phe Pro Phe Gly Gly Gly Thr Glu Leu 115 120 125 Glu Ile Leu Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Gly Gly 130 135 140 Ser Ser Arg Ser Ser Gln Ser Val Lys Glu Ser Glu Gly Arg Leu Val 145 150 155 160 Thr Pro Gly Gly Ser Leu Thr Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Ile Asp 165 170 175 Leu Ser Arg Asp Trp Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Glu Gly 180 185 190 Leu Glu Trp Ile Gly Ala Ile Gly Arg Ser Gly Asp Thr Tyr Tyr Ala 195 200 205 Thr Trp Ala Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Lys Thr Ser Ser Arg Thr 210 215 220 Val Thr Leu Thr Val Thr Asp Leu Gln Arg Ser Asp Thr Ala Thr Tyr 225 230 235 240 Phe Cys Ala Arg Ile Pro Tyr Phe Gly Trp Asn Asn Gly Asp Ile Trp 245 250 255 Gly Pro Gly Thr Leu Val Thr Ile Ser Ser Ala Ala Ala Glu Gln Lys 260 265 270 Leu Ile Ser Glu Glu Asp Leu Asn Gly Val Thr Val Ser Ser Ala Leu 275 280 285 Ser Asn Ser Ile Met Tyr Phe Ser His Phe Val Pro Val Phe Leu Pro 290 295 300 Ala Lys Pro Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro 305 310 315 320 Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro 325 330 335 Ala Ala Gly Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp Pro Lys Leu Phe 340 345 350 Trp Ala Leu Val Val Val Ala Gly Val Leu Phe Cys Tyr Gly Leu Leu 355 360 365 Val Thr Val Ala Leu Cys Val Ile Trp Thr Asn Ser Arg Arg Asn Arg 370 375 380 Leu Leu Gln Ser Asp Tyr Met Asn Met Thr Pro Arg Arg Pro Gly Leu 385 390 395 400 Thr Arg Lys Pro Tyr Gln Pro Tyr Ala Pro Ala Arg Asp Phe Ala Ala 405 410 415 Tyr Arg Pro Leu Glu Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro 420 425 430 Ala Tyr Gln Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly 435 440 445 Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro 450 455 460 Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr 465 470 475 480 Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly 485 490 495 Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln 500 505 510 Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln 515 520 525 Ala Leu Pro Pro Arg 530 <210> 18 <211> 1602 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> nucleotide sequence of chimeric antigen receptor_Mouse <400> 18 atggattttc aggtgcagat tttcagcttc ctgctaatca gtgcctcagt cataatgtct 60 agagagctcg atctgaccca gactccagcc tccgtgtctg cagctgtggg aggcacagtc 120 accatcaatt gccagtccag tcagagtcct tatagtaacg agtggttatc ctggtatcag 180 cagaaaccag ggcaggctcc caaagtccta atttctagga tatccactct ggcatctggg 240 gtctcatcgc ggttcaaagg cagtggatct gggacacagt tcactctcac cataagcgac 300 ctggagtgtg gcgacgctgc cacttatttc tgtgcaggcg gttataattt tggtttgttt 360 cctttcggcg gagggaccga gctggagatc ctatcctctg gtggcggtgg ctcgggcggt 420 ggtgggggtg gttcctctag atcttcccag tcggtgaagg agtccgaggg tcgcctggtc 480 acgcctggag gatccctgac actcacctgc acagtctctg gaatcgacct cagtagggac 540 tggatgaact gggtccgcca ggctccaggg gaggggctgg aatggatcgg agccattggt 600 agaagtggag acacatacta cgcgacctgg gcgaaaggcc gattcaccat ctccaaaacc 660 tcgtcgagga cggtgactct aacagtcacc gatctgcagc gctcagacac ggccacctat 720 ttctgtgcca gaattcctta ttttggttgg aataatggtg acatctgggg cccaggcacc 780 ctggtcacca tctcttcagc ggccgcagaa caaaaactca tctcagaaga ggatctgaat 840 ggggtcaccg tctcttcagc gctgagcaac tccatcatgt acttcagcca cttcgtgccg 900 gtcttcctgc cagcgaagcc caccacgacg ccagcgccgc gaccaccaac accggcgccc 960 accatcgcgt cgcagcccct gtccctgcgc ccagaggcat gccggccagc ggcggggggc 1020 gcagtgcaca cgagggggct ggatcctaag ctgttttggg cactggtcgt ggttgctgga 1080 gtcctgtttt gttatggctt gctagtgaca gtggctcttt gtgttatctg gacaaatagt 1140 agaaggaaca gactccttca aagtgactac atgaacatga ctccccggag gcctgggctc 1200 actcgaaagc cttaccagcc ctacgcccct gccagagact ttgcagcgta ccgccccctc 1260 gagagagtga agttcagcag gagcgcagac gcccccgcgt accagcaggg ccagaaccag 1320 ctctataacg agctcaatct aggacgaaga gaggagtacg atgttttgga caagagacgt 1380 ggccgggacc ctgagatggg gggaaagccg agaaggaaga accctcagga aggcctgtac 1440 aatgaactgc agaaagataa gatggcggag gcctacagtg agattgggat gaaaggcgag 1500 cgccggaggg gcaaggggca cgatggcctt taccagggtc tcagtacagc caccaaggac 1560 acctacgacg cccttcacat gcaggccctg ccccctcgct aa 1602 <210> 19 <211> 21 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> amino acid sequence of Mouse Ig kappa leader <400> 19 Met Asp Phe Gln Val Gln Ile Phe Ser Phe Leu Leu Ile Ser Ala Ser 1 5 10 15 Val Ile Met Ser Arg 20 <210> 20 <211> 63 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> nucleotide sequence of Mouse Ig kappa leader <400> 20 atggattttc aggtgcagat tttcagcttc ctgctaatca gtgcctcagt cataatgtct 60 aga 63 <210> 21 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> amino acid sequence of C-myc tag epitope <400> 21 Glu Gln Lys Leu Ile Ser Glu Glu Asp Leu 1 5 10 <210> 22 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> nucleotide sequence of C-myc tag epitope <400> 22 gaacaaaaac tcatctcaga agaggatctg 30 <210> 23 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> amino acid sequence of CDR1 at heavy chain variable region of Anti-cotinine scFv <400> 23 Arg Asp Trp Met Asn 1 5 <210> 24 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> amino acid sequence of CDR2 at heavy chain variable region of Anti-cotinine scFv <400> 24 Ala Ile Gly Arg Ser Gly Asp Thr Tyr Tyr Ala Thr Trp Ala Lys 1 5 10 15 <210> 25 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> amino acid sequence of CDR3 at heavy chain variable region of Anti-cotinine scFv <400> 25 Ile Pro Tyr Phe Gly Trp Asn Asn Gly Asp Ile 1 5 10 <210> 26 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> amino acid sequence of CDR1 at light chain variable region of Anti-cotinine scFv <400> 26 Gln Ser Ser Gln Ser Pro Tyr Ser Asn Glu Trp Leu Ser 1 5 10 <210> 27 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> amino acid sequence of CDR2 at light chain variable region of Anti-cotinine scFv <400> 27 Arg Ile Ser Thr Leu Ala Ser 1 5 <210> 28 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> amino acid sequence of CDR3 at light chain variable region of Anti-cotinine scFv <400> 28 Ala Gly Gly Tyr Asn Phe Gly Leu Phe Pro Phe Gly 1 5 10 <210> 29 <211> 99 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> anti-cotinine scFv forward primer <400> 29 gatatcaagc ttgccaccat ggattttcag gtgcagattt tcagcttcct gctaatcagt 60 gcctcagtca taatgtctag agagctcgat ctgacccag 99 <210> 30 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> anti-cotinine scFv reverse primer <400> 30 tgaagagatg gtgaccag 18 <210> 31 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CAR skeleton forward primer <400> 31 gcggccgcag aacaaaaa 18 <210> 32 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CAR skeleton reverse primer <400> 32 actagtgtcg acttagcgag ggggcagggc 30 <210> 33 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CEA CAR forward primer <400> 33 gatatcaagc ttccatgggc caccatggat tttcaggtgc ag 42 <210> 34 <211> 44 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CEA CAR reverse primer <400> 34 gaattcatcg atgtcgacgc ggccgcttag cgagggggca gggc 44 <210> 35 <211> 27 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> pegaptanib RNA aptamer <400> 35 cggaaucagu gaaugcuuau acauccg 27 <210> 36 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> control aptamer <400> 36 ttggtggtgg tggttgtggt ggtggtgg 28

Claims (40)

  1. 항-코티닌 항체 또는 이의 단편, 힌지 도메인, 막관통 도메인 및 신호전달 도메인을 포함하는 항-코티닌 항체가 연결된 키메라 항원 수용체.
  2. 제1항에 있어서, 상기 단편이 항-코티닌 항체의 Fab, Fab', F(ab')2, Fv 또는 scFv인, 키메라 항원 수용체.
  3. 제1항에 있어서, 상기 항-코티닌 항체 또는 이의 단편이 서열번호 23 내지 25의 아미노산 서열로 각각 표시되는 CDR1, CDR2 또는 CDR3을 포함하는 중쇄 가변 영역, 또는 서열번호 26 내지 28의 아미노산 서열로 각각 표시되는 CDR1, CDR2 또는 CDR3을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는, 키메라 항원 수용체.
  4. 제3항에 있어서, 상기 항-코티닌 항체의 단편이 서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는, 키메라 항원 수용체.
  5. 제1항에 있어서, 상기 힌지 도메인이 CD8 힌지 도메인, IgG1 힌지 도메인, Ig4 힌지 도메인, CD28 세포외 영역, KIR(killer immunoglobulin-like receptor) 세포외 영역 및 이의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된, 키메라 항원 수용체.
  6. 제5항에 있어서, 상기 CD8 힌지 도메인이 서열번호 3의 아미노산 서열을 갖는, 키메라 항원 수용체.
  7. 제1항에 있어서, 상기 막관통 도메인이 CD3제타, CD4, CD8, CD28 또는 KIR(killer immunoglobulin-like receptor) 단백질의 막관통 영역인, 키메라 항원 수용체.
  8. 제7항에 있어서, 상기 막관통 도메인이 CD28의 막관통 영역을 포함하는, 키메라 항원 수용체.
  9. 제8항에 있어서, 상기 CD28의 막관통 영역이 서열번호 5 또는 서열번호 7의 아미노산 서열을 갖는, 키메라 항원 수용체.
  10. 제1항에 있어서, 상기 신호전달 도메인이 CD3제타, CD278(inducible T-cell costimulator, ICOS), CD28, CD134(OX40), CD137(4-1BB), KIR(killer immunoglobulin-like receptor) 또는 DAP12(DNAX activation protein 12)인, 키메라 항원 수용체.
  11. 제10항에 있어서, 상기 신호전달 도메인이 CD28 및 CD3제타의 세포질 영역인, 키메라 항원 수용체.
  12. 제10항에 있어서, 상기 신호전달 도메인이 CD137(4-1BB) 및 CD3제타의 세포질 영역인, 키메라 항원 수용체.
  13. 제11항에 있어서, 상기 CD28의 세포질 영역이 서열번호 9 또는 서열번호 11의 아미노산 서열을 갖는, 키메라 항원 수용체.
  14. 제11항 또는 제12항에 있어서, 상기 CD3제타의 세포질 영역이 서열번호 13의 아미노산 서열을 갖는, 키메라 항원 수용체.
  15. 제1항에 있어서, 상기 키메라 항원 수용체가 서열번호 15 또는 서열번호 17의 아미노산 서열을 갖는, 키메라 항원 수용체.
  16. 제1항의 키메라 항원 수용체를 코딩하는 핵산 분자.
  17. 제16항의 핵산 분자를 포함하는 발현벡터.
  18. 제17항에 있어서, 상기 발현벡터가 바이러스 벡터인, 발현벡터.
  19. 제18항에 있어서, 상기 바이러스 벡터가 아데노바이러스 벡터, 레트로바이러스 벡터, 렌티바이러스 벡터 또는 아데노-연관 바이러스 벡터인, 발현벡터.
  20. 제16항의 핵산 분자를 포함하는 바이러스.
  21. 제20항의 바이러스가 형질도입된 세포.
  22. 제21항에 있어서, 상기 세포가 T 세포, 자연살해세포 또는 대식세포인, 세포.
  23. 제21항의 세포 및 코티닌이 표지된 접합물질을 포함하는 키메라 항원 수용체 세포.
  24. 제23항에 있어서, 상기 접합물질이 펩타이드, 핵산, 단백질 또는 화학물질인, 키메라 항원 수용체 세포.
  25. 제24항에 있어서, 상기 핵산이 앱타머인, 키메라 항원 수용체 세포.
  26. 제24항에 있어서, 상기 단백질이 항체 또는 호르몬인, 키메라 항원 수용체 세포.
  27. 제23항에 있어서, 상기 키메라 항원 수용체 세포가 키메라 항원 수용체의 항-코티닌 항체 부위와 코티닌 사이의 항원-항체 결합에 의해 형성되는, 키메라 항원 수용체 세포.
  28. 제23항에 있어서, 상기 키메라 항원 수용체 세포의 제조는,
    1) 제21항의 세포에 코티닌과 접합물질의 복합체를 첨가하는 단계; 및
    2) 상기 세포와 복합체가 결합된 키메라 항원 수용체 세포를 선별하는 단계를 포함하는, 키메라 항원 수용체 세포.
  29. 제23항의 키메라 항원 수용체 세포를 유효성분으로 함유하는 암의 예방 또는 치료용 약학 조성물.
  30. 삭제
  31. 제29항에 있어서, 상기 암이 고형암 또는 혈액암인, 약학 조성물.
  32. 제31항에 있어서, 상기 고형암이 폐암, 대장암, 전립선암, 갑상선암, 유방암, 뇌암, 두경부암, 식도암, 피부암, 흑색종, 망막모세포종, 흉선암, 위암, 결장암, 간암, 난소암, 자궁암, 방광암, 직장암, 담낭암, 담도암 또는 췌장암인, 약학 조성물.
  33. 제31항에 있어서, 상기 혈액암이 림프종, 백혈병 또는 다발성 골수종인, 약학 조성물.
  34. 삭제
  35. 삭제
  36. 1) 제21항의 세포를 인간을 제외한 개체에 투여하는 단계; 및
    2) 코티닌이 표지된 접합물질을 인간을 제외한 개체에 투여하는 단계를 포함하는, 개체 내에서 키메라 항원 수용체 세포를 제조하는 방법.
  37. 1) 제21항의 세포 및 코티닌이 표지된 접합물질을 인간을 제외한 개체에 투여하는 단계; 및
    2) 상기 인간을 제외한 개체에 코티닌이 표지된 세포독성물질을 더 투여하는 단계를 포함하는, 키메라 항원 수용체 세포의 세포사멸 유도 방법.
  38. 제37항에 있어서, 상기 세포독성물질이 듀오카마이신, SN-38, 칼리캐미신(calicheamicin), MMAE(monomethyl auristatin E), MMAF(monomethyl auristatin F), 독소루비신, 피롤로벤조디아제핀(pyrrolobenzodiazepine), DM4 또는 DM1인, 세포사멸 유도 방법.
  39. 약학적으로 치료가능한 양의 제23항의 키메라 항원 수용체 세포를 유효성분으로 함유하는 제1성분; 및
    약학적으로 치료가능한 양의 코티닌이 표지된 세포독성물질을 유효성분으로 함유하는 제2성분을 포함하는, 암의 예방 또는 치료용 약학적 키트.
  40. 삭제
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