KR20200090598A - 메소텔린 특이적인 키메라 항원 수용체 및 이를 발현하는 t 세포 - Google Patents

메소텔린 특이적인 키메라 항원 수용체 및 이를 발현하는 t 세포 Download PDF

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Abstract

본 발명은 키메라 항원 수용체 및 이를 발현하는 면역세포에 관한 것으로, 구체적으로는 항-메소텔린 항체 또는 이의 단편; CD8α의 신호서열(signal peptide), CD28 또는 CD8α의 힌지(hinge); CD28 또는 CD8α의 막관통 도메인(transmembrane domain); 및 CD28, 4-1BB 및 CD3ζ의 세포 내 신호 영역 서열을 포함하는 세포내 신호전달 도메인(intracellular signaling domain)을 포함하는 키메라 항원 수용체, 및 이를 발현하는 면역세포, 바람직하게는 T 세포에 관한 것이다.
본 발명에 따른 키메라 항원 수용체 및 이를 발현하는 T 세포는 면역세포는 우수한 항암 활성 효과를 나타내므로, 암 치료에 효과적으로 이용될 수 있다.

Description

메소텔린 특이적인 키메라 항원 수용체 및 이를 발현하는 T 세포 {Mesothelin-specific chimeric antigen receptor and T lymphocyte expressing this chimeric antigen receptor}
본 발명은 메소텔린 특이적인 키메라 항원 수용체 및 이를 발현하는 T 세포에 관한 것이다.
T 세포(T cells)는 적응성 면역반응(adaptive immunity)을 매개하는 중요한 역할을 하는 세포이다. T 세포는 항원을 인지할 수 있는 수용체(T cell receptor, TCR), 보조자극인자(co-stimulatory molecules), 그리고 사이토카인(cytokines) 자극을 통해서 활성화(activation)된다. 또한, T 세포의 TCR은 항원과 결합된 MHC 분자(major histocompatibility complex, MHC molecules)를 통해 면역반응을 일으키는데, 암세포는 면역반응을 회피하기 위한 기전으로 MHC 분자의 발현을 억제한다. 면역세포 치료제(adoptive immune therapy, adoptive cellular therapy)는 T 세포의 이러한 특성을 이용하여 개발되고 있다.
T 세포가 MHC 분자 없이 직접 항원을 인지할 수 있도록 키메라 항원 수용체(chimeric antigen receptor, CAR)가 개발되고 있다. 키메라 항원 수용체는 항원을 인지하는 scFv(single chain variable fragment) 부분, 막관통 도메인(transmembrane domain), 세포 내로 신호를 전달하는 신호전달 도메인(signaling domain)으로 구성되어 있다. T 세포 내에 키메라 항원 수용체를 인위적으로 도입시켜 T 세포(CAR-T 세포)가 특정 항원을 가진 암에 대해 반응할 수 있도록 한다. 현재 미국의 Novartis, Gilead, Juno Therapeutics, Celgene 등과 같은 다국적 제약사들은 혈액암을 적응증으로 하여 CAR-T 세포를 이용하고 있지만, 고형암에 대한 연구는 아직 미진하다.
메소텔린(Mesothelin, MSLN)은 40 kDa의 크기를 갖는 세포표면에 발현하는 당단백질이다. 일반 조직에서는 낮은 발현을 보이지만 중피암(Mesothelioma), 췌장암(Pancreatic cancer), 난소암(Ovarian cancer)을 비롯한 여러 종류의 고형암에서 과발현이 확인되었고, 항암표적으로 연구가 진행 중이다(Chang K 1996, Raffot H 2004). 이에 기반하여 Novartis와 협업하는 미국 펜실베니아 대학의 Carl H. June 박사그룹은 메소텔린을 표적하는 마우스 유래 항-메소텔린의 scFv을 가진 키메라 항원 수용체(ss1 CAR) 연구를 진행 중이다. ss1 CAR mRNA를 T 세포에 전달하여 일시적으로(transiently) CAR 를 발현시켜 환자에게 투여했을 때, 환자로부터 항-마우스 항체 반응(human anti-mouse antibody response, HAMA response)이 일어났음이 확인되었다(Beatty GL 2014).
본 발명자들은 메소텔린을 발현하는 암 치료 용도로 사용될 수 있으며, 기존의 항-마우스 항체 반응 문제를 해소하기 위해, 메소텔린을 특이적으로 표적하는 인간 유래 scFv를 포함하는 키메라 항원 수용체를 제작하였으며, 상기 인간 유래 메소텔린 특이적인 scFv를 포함하는 키메라 항원 수용체를 발현하는 T 세포가 우수한 항암 효과를 보임을 규명하여 본 발명을 완성하였다.
본 발명은 기존의 메소텔린 결합 도메인을 포함하는 키메라 항원 수용체를 발현하는 T 세포를 이용한 항암 면역세포 치료의 문제점을 해결한, 높은 항암 효과를 나타내는 새로운 메소텔린 결합 도메인을 포함하는 키메라 항원 수용체, 상기 키메라 항원 수용체를 발현하는 T 세포, 및 이를 이용한 암 치료방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 메소텔린(Mesothelin, MSLN)에 특이적으로 결합하는 결합 도메인을 포함하는 키메라 항원 수용체를 제공한다.
본 발명에 따른 메소텔린(Mesothelin, MSLN)에 대한 결합 도메인은 항-메소텔린 항체 또는 그의 단편인 것이 바람직하지만 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 따른 키메라 항원 수용체에 포함된 항-메소텔린 항체 또는 그의 단편은 서열번호 45, 51, 또는 57의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR1; 서열번호 46, 52, 또는 58의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR2; 및 서열번호 47, 53, 또는 59의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR3를 포함하는 중쇄 가변영역, 및 서열번호 48, 54, 또는 60의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR1; 서열번호 49, 55, 또는 61의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR2; 및 서열번호 50, 56, 또는 62의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR3를 포함하는 경쇄 가변영역을 함유하는 것을 특징으로 한다.
바람직하게는 본 발명에 따른 키메라 항원 수용체에 포함된 항-메소텔린 항체 또는 그의 단편은 서열번호 39, 41, 또는 43의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변영역, 및 서열번호 40, 42, 또는 44의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변영역을 함유하는 것을 특징으로 한다.
본 발명은 또한, 메소텔린 특이적인 키메라 항원 수용체를 코딩하는 핵산; 상기 핵산을 함유하는 벡터; 및 상기 키메라 항원 수용체를 발현하는 면역세포 및 이를 이용한 암 치료방법을 제공한다.
본 발명에 따른 키메라 항원 수용체는 메소텔린 특이적인 표적 효율이 우수할 뿐 아니라, 발현지속율이 우수한 장점을 가지고 있으며,
본 발명에 따른 키메라 항원 수용체를 발현하는 T 세포는 암세포에 대한 세포독성이 우수하여, 암 치료를 위한 면역세포 치료에 유용하게 사용될 수 있다.
도 1A는 본 발명의 실시예에 따른 재조합 인간 메소텔린(recombinant human mesothelin, rhMSLN)에 대한 MS501 scFv, MS503 scFv 또는 C2G4 scFv의 결합 정도를 효소 결합 면역 침강 분석법(Enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA)을 통해 나타낸다.
도 1B는 본 발명의 실시예에 따른 MIA PaCa2-MSLN 세포에 대한 MS501 scFv, MS503 scFv 또는 C2G4 scFv의 세포 결합 정도를 유세포 분석을 통해 나타낸다.
도 2A는 본 발명의 실시예에 따른 인비트로 실험에 사용된 CAR 구조의 모식도를 나타낸다.
도 2B는 본 발명의 실시예에 따른 501(28H)28z, 503(28H)28z 또는 C2G4(28H)28z로 형질도입 된 Jurkat 세포에서의 각각의 CAR 발현양을 유세포 분석을 통해 나타낸다.
도 2C는 본 발명의 실시예에 따른 Jurkat 세포로 형질도입 된 501(28H)28z, 503(28H)28z 또는 C2G4(28H)28z의 발현율을 메소텔린 키메라 항원 수용체 발현양과 GFP (green fluorescent protein) 발현양으로 나타낸다.
도 3A는 본 발명의 실시예에 따른 501(28H)28z, 503(28H)28z 또는 C2G4(28H)28z로 형질도입 된 Jurkat 세포의 메소텔린을 발현하는 표적세포인 HeLa(자궁경부암) 세포, OVCAR3(난소암) 세포, CAPAN1(췌장암) 세포에 대한 반응에 따른 세포 활성도를 유세포 분석을 통해 나타낸다.
도 3B는 본 발명의 실시예에 따른 위 도 3A에 있어서, 501(28H)28z, 503(28H)28z 또는 C2G4(28H)28z로 형질도입 된 Jurkat 세포의 메소텔린 특이적인 반응에 따른 사이토카인 분비능을 효소 결합 면역 침강 분석법을 통해 나타낸다.
도 4A는 본 발명의 실시예에 따른 501(28H)28z, 503(28H)28z 또는 C2G4(28H)28z로 형질도입된 Jurkat 세포의 메소텔린 특이적인 반응에 따른 세포 활성도를 유세포 분석을 통해 나타낸다.
도 4B는 본 발명의 실시예에 따른 위 도 4A에 있어서, 501(28H)28z, 503(28H)28z 또는 C2G4(28H)28z로 형질도입 된 Jurkat 세포의 메소텔린 특이적인 반응에 따른 사이토카인 분비능을 효소 결합 면역 침강 분석법을 통해 나타낸다.
도 5A는 본 발명의 실시예에 따른 인간 T 세포로 형질도입 된 501(28H)28z 또는 C2G4(28H)28z의 발현율을 유세포 분석을 통해 나타낸다.
도 5B는 본 발명의 실시예에 따른 위 도 5A에 있어서, 501(28H)28z 또는 C2G4(28H)28z로 형질도입 된 인간 T 세포에서의 메소텔린 특이적인 반응에 따른 살해능을 나타낸다.
도 5C는 본 발명의 실시예에 따른 위 도 5B에 있어서, 501(28H)28z 또는 C2G4(28H)28z로 형질도입된 인간 T 세포에서의 메소텔린 특이적인 반응에 따른 사이토카인 분비능을 효소 결합 면역 침강 분석법을 통해 나타낸다.
도 5D는 본 발명의 실시예에 따른 위 도 A에 있어서, 501(28H)28z 또는 C2G4(28H)28z로 형질도입 된 인간 T 세포에서의 메소텔린을 발현하는 표적 OVCAR3(난소암) 세포, CAPAN1(췌장암) 세포에 대한 살해능을 나타낸다.
도 6A는 본 발명의 실시예에 따른 인비보 실험에 사용된 CAR 구조의 모식도를 나타낸다.
도 6B는 본 발명의 실시예에 따른 위 도 6A에 있어서, NCI-H226 이종이식 한 마우스 모델에 501(8H)Δ, 501(8H)z, 501(8H)BBz, 501(8H)28z 또는 501(28H)28z로 형질도입 된 인간 T 세포를 종양 내 주사(intra-tumoral)한 후 종양 크기의 변화를 나타낸다.
도 6C는 본 발명의 실시예에 따른 위 도 6B에 있어서, 형질도입 된 인간 T 세포를 종양 내 주사한 후 20일째에 마우스의 종양조직을 수확(Harvest)한 뒤, 그 무게를 나타낸다.
도 6D는 본 발명의 실시예에 따른 위 도 6C에 있어서, 종양조직 내 형질도입 된 인간 T 세포의 사이토카인 분비능을 효소 결합 면역 침강 분석법을 통해 나타낸다.
도 6E는 본 발명의 실시예에 따른 위 도 6B에 있어서, 마우스의 무게를 통해 부작용을 확인한다.
도 6F는 본 발명의 실시예에 따른 위 도 6B에 있어서, 실험의 종료점에서의 마우스 생존률을 나타낸다.
본 발명은 메소텔린 특이적으로 결합하는 결합 도메인을 포함하는 키메라 항원 수용체(Chimeric antigen receptor, CAR) 및 이를 발현하는 T 세포에 관한 것이다. 이하 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명은 메소텔린(Mesothelin, MSLN)에 특이적으로 결합하는 결합 도메인을 포함하는 키메라 항원 수용체에 대한 것이다.
본 발명에 따른 메소텔린(Mesothelin, MSLN)에 대한 결합 도메인은 항-메소텔린 항체 또는 그의 단편인 것이 바람직하지만 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에서의 항체의 “단편”은, 항원 결합 기능을 보유하고 있는 단편을 의미하며, scFv, Fab, F(ab')2 및 Fv 단편 등을 포함하는 의미로 사용된다.
"단일쇄 Fv" 또는 "scFv" 항체 단편은 항체의 VH 및 VL 도메인을 포함하는데, 이들 도메인은 단일 폴리펩티드 쇄 내에 존재한다. Fv 폴리펩티드는 scFv가 항원 결합을 위해 목적하는 구조를 형성할 수 있도록 하는 VH 도메인과 VL 도메인 사이에 폴리펩티드 링커를 추가로 포함할 수 있다.
"Fv" 단편은 완전한 항체 인식 및 결합 부위를 함유하는 항체 단편이다. 이러한 영역은 1개의 중쇄 가변 도메인과 1개의 경쇄 가변 도메인이, 예를 들어 scFv로 단단하게 사실상 공유적으로 연합된 이량체로 이루어진다.
"Fab" 단편은 경쇄의 가변 및 불변 도메인과, 중쇄의 가변 및 제1 불변 도메인 (CH1)을 함유한다. F(ab')2 항체 단편은 일반적으로 그들 사이에 힌지 시스테인에 의해 그들의 카복시 말단 근처에 공유적으로 연결되는 한 쌍의 Fab 단편을 포함한다.
본 발명에 따른 키메라 항원 수용체에 포함된 항-메소텔린 항체 또는 그의 단편은 서열번호 45, 51, 또는 57의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR1; 서열번호 46, 52, 또는 58의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR2; 및 서열번호 47, 53, 또는 59의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR3를 포함하는 중쇄 가변영역, 및 서열번호 48, 54, 또는 60의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR1; 서열번호 49, 55, 또는 61의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR2; 및 서열번호 50, 56, 또는 62의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR3를 포함하는 경쇄 가변영역을 함유하는 것을 특징으로 하며,
보다 구체적으로는, 본 발명에 따른 키메라 항원 수용체에 포함된 항-메소텔린 항체 또는 그의 단편은,
서열번호 45의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR1, 서열번호 46의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR2 서열번호 47의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR3, 및 서열번호 48의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR1, 서열번호 49의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR2, 서열번호 50의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR3;
서열번호 51의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR1, 서열번호 52의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR2, 서열번호 53의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR3, 및 서열번호 54의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR1, 서열번호 55의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR2, 서열번호 56의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR3; 또는
서열번호 57의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR1, 서열번호 58의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR2, 서열번호 59의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR3, 및 서열번호 60의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR1, 서열번호 61의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR2, 서열번호 62의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR3을 포함하는 것일 수 있다.
바람직하게는 본 발명에 따른 키메라 항원 수용체에 포함된 항-메소텔린 항체 또는 그의 단편은 서열번호 39, 41, 또는 43의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변영역, 및 서열번호 40, 42, 또는 44의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변영역을 함유하는 것을 특징으로 한다.
보다 구체적으로는 본 발명에 따른 키메라 항원 수용체에 포함된 항-메소텔린 항체 또는 그의 단편은,
서열번호 39의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변영역 및 서열번호 40의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변영역;
서열번호 41의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변영역 및 서열번호 42의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변영역; 또는
서열번호 43의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변영역 및 서열번호 44의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변영역을 포함하는 것일 수 있다.
가장 바람직하게는 본 발명에 따른 키메라 항원 수용체에 포함된 항-메소텔린 항체 또는 그의 단편은 scFv의 형태로서, 바람직하게는 서열번호 2, 4, 또는 6으로 표시되는 아미노산 서열을 포함할 수 있지만, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 따른 키메릭 항원 수용체는 메소텔린에 특이적으로 결합하는 결합 도메인과 함께 추가적으로 신호서열(signal peptide, SP), 힌지, 막관통 도메인 및 세포 내 도메인에서 선택된 하나 이상을 포함하는 것을 특징으로 한다.
본 발명에 따른 키메릭 항원 수용체에 포함될 수 있는 신호서열은 CD8α 신호서열인 것이 바람직하지만, 이에 한정되는 것은 아니며, CD8α 신호서열은 서열번호 8로 표시되는 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
본 발명에 따른 신호서열과, 메소텔린에 특이적으로 결합하는 결합 도메인은 키메라 항원 수용체의 세포 외 도메인을 구성한다. 세포 외 도메인은 주신호가 전달되는 부위로 세포막 외부에 존재하며 메소텔린을 특이적으로 인식하기 위한 도메인이다.
본 발명에 따른 키메라 항원 수용체에 포함될 수 있는 막관통 도메인(transmembrane domain)은 상기 세포 외 도메인과 상기 세포 내 신호전달 도메인을 세포막 사이로 연결 가능하다면 어떠한 것이든 사용가능하다. 바람직하게는 상기 막관통 도메인은 CD28 유래의 막관통 도메인 및/또는 CD8α 유래의 막관통 도메인으로 이루어지며, 상기 CD28 유래의 막관통 도메인 및/또는 CD8α 유래의 막관통 도메인의 전체 또는 일부를 포함하는 것일 수 있다.
바람직하게는 상기 막관통 도메인은 서열번호 12 및/또는 18로 표시되는 아미노산 서열을 포함할 수 있지만, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 일 실시예에 따르면, 상기 세포 외 도메인과 상기 막관통 도메인은 스페이서 도메인으로 연결될 수 있다.
바람직하게는 상기 스페이서 도메인은 힌지 도메인일 수 있다. 본 발명에 따른 키메릭 항원 수용체에 포함될 수 있는 스페이서 도메인은 CD28 유래의 힌지 도메인 및/또는 CD8α 유래의 힌지 도메인을 포함할 수 있으며, 상기 CD28 유래의 힌지 도메인 및/또는 CD8α 유래의 힌지 도메인의 전체 또는 일부를 포함하는 것일 수 있다. CD28 및 CD8α로서 전체 또는 일부를 포함하는 것일 수 있다.
바람직하게는 상기 힌지 도메인은 서열번호 10 및/또는 16으로 표시되는 아미노산 서열이나, 이에 한정되는 것은 아니다.
구체적인 일 실시예에 따르면, MS501 scFv를 포함하는 다양한 조합의 CAR 구조를 이용한 인-비보(in-vivo) 실험에서, MS501 scFv를 CD28 막관통 도메인, CD28 유래 및 CD3ζ 유래의 세포 내 신호 전달 도메인과 연결한 조합들(501(8H)28z 및 501(28H)28z)이 다른 조합들(501(8H)z 및 501(8H)BBz)에 비해 종양의 크기를 감소시키는 예기치 못한 우수한 항암 효과를 나타내었으며, 특히, 힌지 영역을 CD28로 조합(501(28H)28z)하였을 때 CD8α 힌지를 사용(501(8H)28z)하였을 때보다 현저한 항암 효과를 나타내었다.
본 발명의 일 실시예에 따르면, 상기 세포 내 신호전달 도메인은 T 세포의 세포막 안쪽, 즉 세포질에 위치하게 되는 부분으로서, 세포 외 도메인에 결합된 항체가 표적 항원에 결합하였을 때, 면역세포의 면역반응을 활성화시키는 부위를 의미한다.
본 발명에 따른 키메라 항원 수용체는 2개 이상의 세포 내 신호전달 도메인을 포함하는 것일 수 있다. 2개 이상의 세포 내 신호전달 도메인을 포함하는 경우에는 세포 내, 신호전달 도메인들이 서로 직렬로 연결될 수 있다. 본 발명에 따른 키메릭 항원 수용체에 포함될 수 있는 세포 내 신호전달 도메인은 CD28 유래의 세포 내 신호전달 도메인, 또는 4-1BB 유래의 세포 내 신호전달 도메인이 CD3ζ 유래의 세포 내 신호전달 도메인과 연결된 것일 수 있으며, 바람직하게는 서열번호 14. 20 및/또는 22로 표시되는 아미노산 서열을 포함할 수 있지만, 이에 한정되는 것은 아니다.
구체적인 일 실시예에 따르면, 본 발명에 따른 키메라 항원 수용체는 서열번호 24, 26, 28, 30, 32, 34 및 36으로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상의 아미노산 서열, 또는 상기 아미노산 서열과 80% 이상, 바람직하게는 90% 이상, 더욱 바람직하게는 95% 이상, 가장 바람직하게는 99% 이상의 서열 동일성을 갖는 이의 변이체를 포함하는 것일 수 있다.
또한 본 발명은 앞서 기술한 본 발명에 따른 키메라 항원 수용체를 발현하는 면역세포를 제공하며, 상기 면역세포는 T 세포, NK 세포 또는 NKT 세포일 수 있지만, 이에 한정되는 것은 아니며, 바람직하게는 T 세포이다.
본 발명의 면역세포는 메소텔린을 발현하는 종양세포에 대해 독성을 나타내는 것일 수 있다. 일 실시예에 따르면, 본 발명의 면역세포(예컨대, T 세포)가 췌장암(Pancreatic cancer) 세포, 자궁경부암(Cervical cancer) 세포, 중피종(Mesothelioma) 세포 또는 난소암(Ovarian cancer) 세포에 대해 독성을 나타낼 수 있다. 예컨대, 상기 췌장암 세포, 자궁경부암 세포, 중피종 세포 또는 난소암 세포는 메소텔린을 발현하는 것일 수 있다.
또한 본 발명은 본 발명에 따른 키메라 항원 수용체를 발현하는 면역세포(예컨대, T 세포)를 포함하는 종양 또는 종양 전이의 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다. 상기 조성물에는 본 발명에 따른 키메라 항원 수용체를 발현하는 면역세포의 수가 치료 대상 내의 종양 세포(예컨대, 췌장암, 자궁경부암, 중피종 또는 난소암)수의 1배 내지 10배로 포함되는 것이 바람직하지만, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 따른 키메라 항원 수용체를 발현하는 면역세포를 포함하는 약학 조성물에는 약제학적으로 허용되는 부형제가 추가적으로 포함될 수 있다. 그러한 부형제의 예로는, 계면활성제, 바람직하게는 폴리소르베이트 계열의 비이온성 계면활성제; 중성 완충 염수, 인간염 완충 염수 등의 완충제; 글루코스, 만노스, 수크로스 또는 덱스트란, 만니톨 등의 당 또는 당알콜류; 글리신, 히스티딘 등의 아미노산이나 단백질 또는 폴리펩티드; 항산화제; EDTA 또는 글루타티온 등의 킬레이트제 예컨대; 침투제; 보조제; 및 보존제가 포함될 수 있지만, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 일 실시예에 따르면, 본 발명의 약학 조성물은 1회 투여량 내에 상기 면역세포(예컨대, T 세포)의 수가 치료 대상 내의 상기 종양세포, 예를 들어 췌장암 세포, 자궁경부암 세포, 중피종 세포 또는 난소암 세포 수의 1배 내지 10배로 포함된 것일 수 있다.
용어 “종양”은 전형적으로 조절되지 않은 세포 성장/증식을 특징으로 하는 포유동물의 생리학적 상태를 지칭하거나 기재한다. 종양(암)의 예는 암종, 림프종(예를 들어, 호지킨 및 비-호지킨 림프종), 모세포종, 육종 및 백혈병을 포함하나, 이에 한정되지는 않는다. 보다 바람직한 암의 예는 편평세포암, 소세포 폐암, 비소세포 폐암, 폐의 선암종, 폐의 편평세포 암종, 복막암, 간세포성암, 위장암, 췌장암, 신경교종, 자궁경부암, 난소암, 간암, 방광암, 간세포암, 유방암, 결장암, 결장직장암, 자궁내막 또는 자궁 암종, 타액선 암종, 신장암, 간암, 전립선암, 외음부암, 갑상선암, 간 암종, 중피종, 백혈병 및 다른 림프구증식성 장애, 및 다양한 유형의 두경부암을 포함한다. 본 발명에서 상기 종양(암)은 바람직하게는 메소텔린-양성 암이고, 췌장암, 난소암, 폐암, 위암, 자궁내막암 및 중피종으로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 할 수 있다.
또한 본 발명은 위에 기술한 본 발명에 따른 키메라 항원 수용체를 코딩하는 핵산 서열을 제공한다. 본 발명의 항원 수용체를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드(핵산)는 코돈 최적화에 의해 변형될 수 있으며, 이는 코돈의 축퇴성(degeneracy)에서 기인한 것으로, 폴리펩타이드 또는 이의 변이체 단편을 코딩하는 많은 뉴클레오타이드 서열이 존재한다는 것은 통상의 기술자가 잘 이해할 수 있을 것이다. 이들 폴리뉴클레오타이드(핵산)의 일부는 임의의 자연 발생형 유전자의 뉴클레오타이드 서열과 최소 상동성을 보유한다.
특히 코돈 활용법의 차이로 인해 가변적인 폴리뉴클레오타이드(핵산), 예를 들어 인간, 영장류 및/또는 포유동물의 코돈 선택에 최적화된 폴리뉴클레오타이드(핵산)가 바람직하다.
본 발명의 일 실시예에 따르면, 핵산 서열은 서열번호 23, 25, 27, 29, 31, 33 및 35로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상의 뉴클레오타이드 서열, 또는 상기 뉴클레오타이드 서열과 80% 이상, 바람직하게는 90% 이상, 더욱 바람직하게는 95% 이상, 가장 바람직하게는 99% 이상의 서열 동일성을 갖는 이의 변이체를 포함하는 것일 수 있다.
본 발명에 따른 키메라 항원 수용체에 포함되는,
CD8α 신호서열을 코딩하는 핵산 서열은 서열번호 7;
scFv를 코딩하는 핵산 서열은 서열번호 1, 3, 또는 5;
CD28 힌지 및 CD8α 힌지를 코딩하는 핵산 서열은 서열번호 9 또는 15;
CD28 막관통 도메인 및 CD8α 막관통 도메인을 코딩하는 핵산 서열은 서열번호 11 또는 17;
CD28 세포 내 신호 도메인, 4-1BB 세포 내 신호 도메인 및 CD3ζ 세포 내 신호 도메인을 코딩하는 핵산 서열은 서열번호 13, 19 또는 21;
로 표시되는 것을 특징으로 하나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명은 본 발명에 따른 핵산 서열을 포함하는 벡터 및 본 발명에 따른 벡터를 포함하는 바이러스를 제공한다.
또한 본 발명은 본 발명에 따른 키메라 항원 수용체를 발현하는 면역세포를 대상체에 투여하는 단계를 포함하는 종양의 치료방법 및 종양 전이의 예방 및 치료방법을 제공한다. 상기 대상체는 종양을 가진 포유류일 수 있으며, 구체적으로는 인간일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 따른 키메라 항원 수용체를 발현하는 면역세포 또는 이를 포함하는 조성물은 경구투여, 주입(infusion), 정맥내 투여(intravenous injection), 근육내 투여(intramuscular injection), 피하 투여(subcutaneous injection), 복강내 투여(intraperitoneal injectoon), 직장내 투여(Intrarectal administration), 국소 투여(topical administration), 비내 투여(intranasal injection) 등으로 투여될 수 있지만, 이에 한정되는 것은 아니다.
이하, 본 발명을 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 이들 실시예는 본 발명을 상세하게 설명하기 위한 것일 뿐 본 발명의 권리범위가 이들 실시예에 예시한 것들로 한정되는 것은 아니다.
실시예 1: 방법 및 시약
1.1 세포주 및 세포주 배양
인간 T-계열 세포주 Jurkat, 인간 췌장암 세포주 MIA PaCa2, 인간 자궁경부암 세포주 HeLa, 인간 난소암 세포주 OVCAR3, 인간 췌장암 세포주 CAPAN1, 인간 중피종 세포주 NCI-H226은 ATCC(American Type Culture Collection, Manassas, VA, USA)로부터 공급받아 사용하였다. Jurkat 및 형질전환 된 Jurkat 세포는 10% FBS를 포함하는 RPMI-1640(GIBCO, Grand Island, NY, USA)에서 유지되었다. MIA PaCa2는 10% FBS(fetal bovine serum; GIBCO, Grand Island, NY, USA)을 포함하는 DMEM(GIBCO, Grand Island, NY, USA)에서 유지되었다. HeLa는 10% FBS(GIBCO)가 포함된 DMEM(GIBCO)에서 유지되었다. OVCAR3는 20% FBS(GIBCO)가 포함된 RPMI-1640(GIBCO)에서 유지되었다. CAPAN1은 20% FBS(GIBCO)가 포함된 IMDM(ATCC)에서 유지되었다. NCI-H226은 10% FBS(GIBCO)가 포함된 RPMI-1640(GIBCO)에서 유지되었다. 인간 배아 신장 섬유아세포(Human embryonic kidney fibroblast)인 HEK293T 세포주는 ATCC로부터 공급받아 사용하였고 10% FBS(GIBCO, Grand Island, NY, USA)를 포함하는 DMEM(GIBCO)에서 유지되었다. 메소텔린 과발현 인간 췌장암 세포주 MIA PaCa2-MSLN은 목암연구소(GC녹십자, Korea)로 부터 공급받아 사용하였다. MIA PaCa2-MSLN은 10% FBS(GIBCO)와 200ug/ml Hygromycin B(GIBCO)를 포함하는 DMEM(GIBCO)에서 유지되었다.
1.2 인간 T 세포 분리 및 배양
기관생명윤리위원회(Institutional review board, IRB, Korea)의 승인을 받아 공여자를 모집하여 말초혈 단핵세포(Peripheral blood mononuclear cell, PBMC)를 피콜-하이파크(Ficoll-Hypaque, GE healthcare)로 분리하였다. 분리된 PBMC는 바로 동결하였다. 해동한 PBMC는 음성선택(Negative selection)방법으로 Easy sep(Stem cell, Vancouver, BC, CA) 키트(Kit)로 인간 T 세포를 분리하였다. 인간 T 세포는 항-CD3/항-CD28 마그네틱 비드(CD3/CD28 Dynabead, GIBCO)와 1:3으로 섞어 20~24시간 활성화시킨다. 인간 T 세포 및 형질전환 된 인간 T 세포는 5% 인간혈청(Sigma-aldrich, Missouri, St.Louis, USA)과 50 IU/ml IL-2(Proleukin, Novartis)이 포함된 X-VIVO 15(LONZA, Basel, Switzerland)에서 유지되었다.
1.3 재조합 인간 메소텔린에 대한 scFv의 결합 확인
다음의 과정을 거쳐 재조합 인간 메소텔린에 본 발명에 따른 scFv가 결합하는 것을 확인하였다.
(i) MS501 scFv 단백질, MS503 scFv 단백질 및 C2G4 scFv 단백질을 96-well immuno plate에 200 ng/ml로 24시간 코팅한다.
(ⅱ) 세척용액으로 well을 세척한 후, 1% BSA(Bovine serum albumin, Sigma) 용액으로 1시간 블로킹(Blocking)하였다.
(ⅲ) 세척용액으로 well을 세척한 후, 100ng/ml의 재조합 인간 메소텔린 단백질을 2시간 처리하였다.
(ⅳ) 세척용액으로 well을 세척한 후, 재조합 인간 메소텔린 탐지 항체(Detection antibody)를 분석증명서에 따라 희석하여 well에 분주한 후 1시간 처리하였다.
(ⅴ) 세척용액으로 well을 세척한 후, 스트렙타비딘-HRP (Streptavidin-HRP)이 30분간 처리되었다.
(ⅵ) 세척용액으로 well을 세척한 후, 기질 용액(Substrate solution)이 15분간 처리되었다.
(ⅶ) 정지 용액(Stop solution)을 처리하고 450 nm 흡광도에서 측정되었다.
1.4 메소텔린 과발현 세포와의 결합 확인
MS501 scFv 단백질, MS503 scFv 단백질 및 C2G4 scFv 단백질의 메소텔린 과발현 세포주인 MIA PaCa2-MSLN에 대한 결합 정도를 확인한다. MIA PaCa2-MSLN 세포주를 1 x 105 cells/100 μl로 FACS 완충용액에 부유하여 준비한다. MS501 scFv 단백질, MS503 scFv 단백질 및 C2G4 scFv 단백질을 각각 1 μg 처리하였다. 세포들은 FACS 완충액을 이용하여 두 차례 세척되었다. 세포들은 항-6xHis tag 항체(Biolegend)를 사용하여 염색하였다. 양성대조군(positive control)시료는 항-메소텔린 항체(R&D system)로 염색하였다. 염색된 세포들의 발현비율 및 평균 형광강도(Mean fluorescence intensity, MFI)는 BD LSRFortessa 를 사용하여 측정되었고, 플로우조(FlowJo) 소프트웨어에서 분석되었다.
1.5 키메라 항원 수용체 구축
본 발명의 키메라 항원 수용체들을 제작하기 위하여 표 1에 기재한 구성들은 SOE-PCR(Splicing by overlapping extension by polymerase chain reaction)을 통해 인공적으로 합성되었다. 좀 더 상세하게는, (1) 세포 외 도메인(extracellular domain); CD8α의 신호서열(signal peptide), scFv 서열 (MS501 scFv서열, MS503 scFv 서열 또는 C2G4 scFv 서열), CD28의 힌지(hinge) 또는 CD8α의 힌지(hinge),(2) 막관통 도메인(transmembrane domain); CD28, CD8α의 막관통 도메인,(3) 세포 내 도메인(intracellular domain); CD28, 4-1BB, CD3ζ 의 세포 내 신호전달 도메인(intracellular signaling domain)은 SOE-PCR(Splicing by overlapping extension by polymerase chain reaction)을 통해 인공적으로 합성되었다. 유전자 재조합 결과물은 직접 서열분석(direct sequencing)으로 확인되었다. 이들은 Nhe1 및 EcoRI으로 절단된 후 3세대 자가-불활성화 렌티바이러스 발현 벡터(third generation self-inactivating lentiviral expression vector)인 EF1α-MCS 벡터의 Nhe1 및 EcoRI 사이트에 삽입(ligation)되었다.
본 발명의 실시예에 따른 키메라 항원 수용체(chimeric antigen receptor, CAR)를 표 1에 정리하였다. 본 발명의 실시예에 따른 모든 CAR의 도메인들은 서로 직렬로(in tandem) 연결된 것이며, 또한 인프레임(in frame)으로 연결된 것이다. 501(28H)28z는 인간 CD8α의 신호서열 도메인(890-952 뉴클레오타이드, GenBank NM 001768.6); MS501 IgG의 scFv 도메인(출원번호: 10-2015-0135755); 인간 CD28 유래의 힌지, 막관통 도메인, 세포 내 신호전달 도메인(439-759 뉴클레오타이드, GenBank J02988.1); 및 CD3ζ 유래의 세포 내 신호전달 도메인(299-634 뉴클레오타이드, GenBank NM000734.3)과 stop codon TGA 가 연결된 것이다. 503(28H)28z는 인간 CD8α의 신호서열 도메인(890-952 뉴클레오타이드, GenBank NM 001768.6); MS503 IgG 의 scFv 도메인(출원번호: 10-2015-0135755); 인간 CD28 유래의 힌지, 막관통 도메인, 세포 내 신호전달 도메인(439-759 뉴클레오타이드, GenBank J02988.1); 및 CD3ζ 유래의 세포 내 신호전달 도메인(299-634 뉴클레오타이드, GenBank NM000734.3)과 stop codon TGA가 연결된 것이다. C2G4(28H)28z는 인간 CD8α의 신호서열 도메인(890-952 뉴클레오타이드, GenBank NM 001768.6); C2G4 IgG의 scFv 도메인(출원번호: 10-2015-0135755); 인간 CD28 유래의 힌지, 막관통 도메인, 세포 내 신호전달 도메인(439-759 뉴클레오타이드, GenBank J02988.1); 및 인간 CD3ζ 유래의 세포 내 신호전달 도메인(299-634 뉴클레오타이드, GenBank NM000734.3)과 stop codon TGA가 연결된 것이다. 501(8H)Δ는 인간 CD8α의 신호서열 도메인(890-952 뉴클레오타이드, GenBank NM 001768.6); MS501 IgG 의 scFv 도메인(출원번호: 10-2015-0135755); 인간 CD8α의 힌지, 막관통 도메인(1292-1507 뉴클레오타이드, GenBank NM 001768.6)과 stop codon TGA가 연결된 것이다. 501(8H)z 인간 CD8α의 신호서열 도메인(890-952 뉴클레오타이드, GenBank NM 001768.6); MS501 IgG 의 scFv 도메인(출원번호: 10-2015-0135755); 인간 CD8α의 힌지, 막관통 도메인(1292-1507 뉴클레오타이드, GenBank NM 001768.6); 및 CD3ζ 유래의 세포 내 신호전달 도메인(299-634 뉴클레오타이드, GenBank NM000734.3)과 stop codon TGA가 연결된 것이다. 501(8H)BBz는 인간 CD8α의 신호서열 도메인(890-952 뉴클레오타이드, GenBank NM 001768.6); MS501 IgG의 scFv 도메인(출원번호: 10-2015-0135755); 인간 CD8α의 힌지, 막관통 도메인(1292-1507 뉴클레오타이드, GenBank NM 001768.6)과 인간 4-1BB 유래의 세포 내 신호전달 도메인(901-1026 뉴클레오타이드, GenBank NM001561.5); 및 CD3ζ 유래의 세포 내 신호전달 도메인(299-634 뉴클레오타이드, GenBank NM000734.3)과 stop codon TGA가 연결된 것이다. 501(8H)28z 는 인간 CD8α의 신호서열 도메인(890-952 뉴클레오타이드, GenBank NM 001768.6); MS501 IgG 의 scFv 도메인(출원번호: 10-2015-0135755); 인간 CD8α의 힌지(1292-1435 뉴클레오타이드, GenBank NM001768.6); 인간 CD28 막관통 도메인, 세포 내 신호전달 도메인(556-759 뉴클레오타이드, GenBank J02988.1); 및 CD3ζ 유래의 세포 내 신호전달 도메인(299-634 뉴클레오타이드, GenBank NM000734.3)과 stop codon TGA가 연결된 것이다.
일련번호 약칭 신호서열 scFv 힌지 TM 신호-1 신호-2
S1 501(28H)28z CD8α MS501 CD28 CD28 CD28 CD3ζ
S2 503(28H)28z CD8α MS503 CD28 CD28 CD28 CD3ζ
S3 C2G4(28H)28z CD8α C2G4 CD28 CD28 CD28 CD3ζ
S4 501(8H)Δ CD8α MS501 CD8a CD8a - -
S5 501(8H)z CD8α MS501 CD8a CD8a CD3ζ -
S6 501(8H)BBz CD8α MS501 CD8a CD8a 4-1BB CD3ζ
S7 501(8H)28z CD8α MS501 CD8a CD8a CD28 CD3ζ
본 발명의 실시예에 따른 키메라 항원 수용체(chimeric antigen receptor, CAR) 및 그의 제조에 사용된 도메인들의 서열들의 정보를 표 2 및 표 3에 정리하였다.
서열번호 서열이름 서열에 대한 설명
1 MS501 scFv nucleotide 출원번호: 10-2015-0135755
2 MS501 scFv amino acid 서열번호1에 대응하는 아미노산 서열
3 MS503 scFv nucleotide 출원번호: 10-2015-0135755
4 MS503 scFv amino acid 서열번호 3에 대응하는 아미노산 서열
5 C2G4 scFv nucleotide 출원번호: 10-2015-0135755
6 C2G4 scFv amino acid 서열번호 5에 대응하는 아미노산 서열
7 CD8α 신호서열 nucleotide CD8α 의 신호서열 도메인(890-952 뉴클레오타이드, GenBank NM 001768.6)
8 CD8α 신호서열 amino acid 서열번호 7에 대응하는 아미노산 서열
9 CD28 힌지 nucleotide CD28 유래의 힌지(439-555 뉴클레오타이드, GenBank J02988.1)
10 CD28 힌지 amino acid 서열번호 9에 대응하는 아미노산 서열
11 CD28 TM nucleotide CD28 유래의 막관통 도메인(TM)(556-636 뉴클레오타이드, GenBank J02988.1)
12 CD28 TM amino acid 서열번호 11에 대응하는 아미노산 서열
13 CD28 SD nucleotide CD28 유래의 세포 내 신호전달 도메인(SD)(637-759 뉴클레오타이드, GenBank J02988.1
14 CD28 SD amino acid 서열번호13에 대응하는 아미노산 서열
15 CD8α 힌지 nucleotide CD8α 유래의 힌지(1292-1435 뉴클레오타이드, GenBank NM 001768.6)
16 CD8α 힌지 amino acid 서열번호15에 대응하는 아미노산 서열
17 CD8α TM nucleotide CD8α 유래의 힌지(1436-1507 뉴클레오타이드, GenBank NM 001768.6)
18 CD8α TM amino acid 서열번호17에 대응하는 아미노산 서열
19 4-1BB SD nucleotide 4-1BB 유래의 세포 내 신호전달 도메인(SD)(901-1026 뉴클레오타이드, GenBank NM 001561.5)
20 4-1BB SD amino acid 서열번호19에 대응하는 아미노산 서열
21 CD3ζ nucleotide CD3ζ 유래의 세포 내 신호전달 도메인(299-634 뉴클레오타이드, GenBank NM 000734.3)
22 CD3ζ amino acid 서열번호 21에 대응하는 아미노산 서열
23 501(28H)28z nucleotide [표1] S1 순서로 직렬로 연결된 뉴클레오타이드 서열
24 501(28H)28z amino acid 서열번호 23에 대응하는 아미노산 서열
25 503(28H)28z nucleotide [표1] S2 순서로 직렬로 연결된 뉴클레오타이드 서열
26 503(28H)28z amino acid 서열번호 25에 대응하는 아미노산 서열
27 C2G4(28H)28z nucleotide [표1] S3 순서로 직렬로 연결된 뉴클레오타이드 서열
28 C2G4(28H)28z amino acid 서열번호 27에 대응하는 아미노산 서열
29 501(8H)Δ nulceotide [표1] S4 순서로 직렬로 연결된 뉴클레오타이드 서열
30 501(8H)Δ amino acid 서열번호 29에 대응하는 아미노산 서열
31 501(8H)z nucleotide [표1] S5 순서로 직렬로 연결된 뉴클레오타이드 서열
32 501(8H)z amino acid 서열번호 31에 대응하는 아미노산 서열
33 501(8H)BBz nucleotide [표1] S6 순서로 직렬로 연결된 뉴클레오타이드 서열
34 501(8H)BBz amino acid 서열번호 33에 대응하는 아미노산 서열
35 501(8H)28z nucleotide [표1] S7 순서로 직렬로 연결된 뉴클레오타이드 서열
36 501(8H)28z amino acid 서열번호 35에 대응하는 아미노산 서열
37 Linker nucleotide 서열번호 38을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열
38 Linker amino acid GGGGSGGGGSGGGGS
서열번호 서열이름 서열
1 MS501 scFv nucleotide GAGGTGCAGCTGTTGGAGTCCGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGGGGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCACCTTTAGCAATTATGCTATGAGCTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGGCTGGAGTGGGTCTCAGGGATCTATCCCGATAGTGGTAGTACATATTACGCTGATTCTGTAAAAGGTCGGTTCACCATCTCCAGAGACAATTCCAAGAACACGCTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGAGAGCCGAGGACACGGCCGTGTATTACTGTGCGAGAAATATTTATACGTTCGACTACTGGGGCCAGGGTACACTGGTCACCGTGAGCTCAGGTGGAGGCGGTTCAGGCGGAGGTGGATCCGGCGGTGGCGGATCGCAGTCTGTGCTGACTCAGCCACCCTCAGCGTCTGGGACCCCCGGGCAGAGGGTCACCATCTCTTGTAGTGGCTCTTCATCTAATATTGGCAGTAATGCTGTCTCCTGGTACCAGCAGCTCCCAGGAACGGCCCCCAAACTCCTCATCTATTATAATAATCAGCGGCCAAGCGGGGTCCCTGACCGATTCTCTGGCTCCAAGTCTGGCACCTCAGCCTCCCTGGCCATCAGTGGGCTCCGGTCCGAGGATGAGGCTGATTATTACTGTGGTTCTTGGGATTCTAGCCTGAGTGGATATGTCTTCGGCGGAGGCACCAAGCTGACGGTCCTAGGC
2 MS501 scFv amino acid EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSNYAMSWVRQAPGKGLEWVSGIYPDSGSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARNIYTFDYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSQSVLTQPPSASGTPGQRVTISCSGSSSNIGSNAVSWYQQLPGTAPKLLIYYNNQRPSGVPDRFSGSKSGTSASLAISGLRSEDEADYYCGSWDSSLSGYVFGGGTKLTVLG
3 MS503 scFv nucleotide GAGGTGCAGCTGTTGGAGTCCGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGGGGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCACCTTTAGCAATTATGCTATGAGCTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGGCTGGAGTGGGTCTCATCGATCTATCCTGGTGATGGTAGTACATATTACGCTGATTCTGTAAAAGGTCGGTTCACCATCTCCAGAGACAATTCCAAGAACACGCTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGAGAGCCGAGGACACGGCCGTGTATTACTGTGCGAAAAATGCGTTTACGTTCGACTACTGGGGCCAGGGTACACTGGTCACCGTGAGCTCAGGTGGAGGCGGTTCAGGCGGAGGTGGATCCGGCGGTGGCGGATCGCAGTCTGTGCTGACTCAGCCACCCTCAGCGTCTGGGACCCCCGGGCAGAGGGTCACCATCTCTTGTAGTGGCTCTTCATCTAATATTGGCAGTAATGCTGTCTCCTGGTACCAGCAGCTCCCAGGAACGGCCCCCAAACTCCTCATCTATTATAATAGTCATCGGCCAAGCGGGGTCCCTGACCGATTCTCTGGCTCCAAGTCTGGCACCTCAGCCTCCCTGGCCATCAGTGGGCTCCGGTCCGAGGATGAGGCTGATTATTACTGTGGTACTTGGGATTCTAGCCTGAGTGGTTATGTCTTCGGCGGAGGCACCAAGCTGACGGTCCTAGGC
4 MS503 scFv amino acid EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSNYAMSWVRQAPGKGLEWVSSIYPGDGSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKNAFTFDYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSQSVLTQPPSASGTPGQRVTISCSGSSSNIGSNAVSWYQQLPGTAPKLLIYYNSHRPSGVPDRFSGSKSGTSASLAISGLRSEDEADYYCGTWDSSLSGYVFGGGTKLTVLG
5 C2G4 scFv nucleotide GAGGTGCAGCTGTTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGGGGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCGGCCTCTGGATTCACCTTTAGCAATTATGCTATGAGCTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGGCTGGAGTGGGTCTCAGGGATCCCTCCTGATAGTGGTAGTAAATATTACGCTGATTCTGTAAGAGGTCGGTTCACCGTCTCCAGAGACAATTCCAAGAACACGCTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGAGAGCCGAGGACACGGCCGTGTATTACTGTGCGAAAAATATGCTGTCGTTCGACTACTGGGGCCAGGGTACACTGGTCACCGTGAGCTCAGGTGGAGGCGGTTCAGGCGGAGGTGGATCCGGCGGTGGCGGATCGCAGTCTGTGCTGACTCAGCCACCCTCAGCGTCTGGGACCCCCGGGCAGAGGGTCACCATCTCTTGTACTGGCTCTTCATCTAATATTGGCTCCAATGCTGTCTCCTGGTACCAGCAGCTCCCAGGAACGGCCCCCAAACTCCTCATCTATTATAATAGTAAGCGGCCAAGCGGGGTCCCTGACCGATTCTCTGGCTCCAAGTCTGGCACCTCAGCCTCCCTGGCCATCAGTGGGCTCCGGTCCGAGGATGAGGCTGATTATTACTGTGGTTCTTGGGATCCTAGCCTGAATGGTTATGTCTTCGGCGGAGGCACCAAGGTGACCGTCCTAGGT
6 C2G4 scFv amino acid EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSNYAMSWVRQAPGKGLEWVSGIPPDSGSKYYADSVRGRFTVSRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKNMLSFDYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSQSVLTQPPSASGTPGQRVTISCTGSSSNIGSNAVSWYQQLPGTAPKLLIYYNSKRPSGVPDRFSGSKSGTSASLAISGLRSEDEADYYCGSWDPSLNGYVFGGGTKVTVLG
7 CD8α 신호서열 nucleotide ATGGCCTTACCAGTGACCGCCTTGCTCCTGCCGCTGGCCTTGCTGCTCCACGCCGCCAGGCCG
8 CD8α 신호서열 amino acid MALPVTALLLPLALLLHAARP
9 CD28 Hinge nucleotide ATTGAAGTTATGTATCCTCCTCCTTACCTAGACAATGAGAAGAGCAATGGAACCATTATCCATGTGAAAGGGAAACACCTTTGTCCAAGTCCCCTATTTCCCGGACCTTCTAAGCCC
10 CD28 Hinge amino acid IEVMYPPPYLDNEKSNGTIIHVKGKHLCPSPLFPGPSKP
11 CD28 TM nucleotide TTTTGGGTGCTGGTGGTGGTTGGTGGAGTCCTGGCTTGCTATAGCTTGCTAGTAACAGTGGCCTTTATTATTTTCTGGGTG
12 CD28 TM amino acid FWVLVVVGGVLACYSLLVTVAFIIFWV
13 CD28 SD nucleotide AGGAGTAAGAGGAGCAGGCTCCTGCACAGTGACTACATGAACATGACTCCCCGCCGCCCCGGGCCCACCCGCAAGCATTACCAGCCCTATGCCCCACCACGCGACTTCGCAGCCTATCGCTCC
14 CD28 SD amino acid RSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRS
15 CD8α Hinge nucleotide GCGAAGCCCACCACGACGCCAGCGCCGCGACCACCAACACCGGCGCCCACCATCGCGTCGCAGCCCCTGTCCCTGCGCCCAGAGGCGTGCCGGCCAGCGGCGGGGGGCGCAGTGCACACGAGGGGGCTGGACTTCGCCTGTGAT
16 CD8α Hinge amino acid AKPTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACD
17 CD8α TM nucleotide ATCTACATCTGGGCGCCCTTGGCCGGGACTTGTGGGGTCCTTCTCCTGTCACTGGTTATCACCCTTTACTGC
18 CD8α TM amino acid IYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYC
19 4-1BB SD nucleotide AAACGGGGCAGAAAGAAACTCCTGTATATATTCAAACAACCATTTATGAGACCAGTACAAACTACTCAAGAGGAAGATGGCTGTAGCTGCCGATTTCCAGAAGAAGAAGAAGGAGGATGTGAACTG
20 4-1BB SD amino acid KRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCEL
21 CD3ζ nucleotide AGAGTGAAGTTCAGCAGGAGCGCAGACGCCCCCGCGTACCAGCAGGGCCAGAACCAGCTCTATAACGAGCTCAATCTAGGACGAAGAGAGGAGTACGATGTTTTGGACAAGAGACGTGGCCGGGACCCTGAGATGGGGGGAAAGCCGAGAAGGAAGAACCCTCAGGAAGGCCTGTACAATGAACTGCAGAAAGATAAGATGGCGGAGGCCTACAGTGAGATTGGGATGAAAGGCGAGCGCCGGAGGGGCAAGGGGCACGATGGCCTTTACCAGGGTCTCAGTACAGCCACCAAGGACACCTACGACGCCCTTCACATGCAGGCCCTGCCCCCTCGC
22 CD3ζ amino acid RVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR
23 501(28H)28z nucleotide ATGGCCTTACCAGTGACCGCCTTGCTCCTGCCGCTGGCCTTGCTGCTCCACGCCGCCAGGCCGGAGGTGCAGCTGTTGGAGTCCGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGGGGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCACCTTTAGCAATTATGCTATGAGCTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGGCTGGAGTGGGTCTCAGGGATCTATCCCGATAGTGGTAGTACATATTACGCTGATTCTGTAAAAGGTCGGTTCACCATCTCCAGAGACAATTCCAAGAACACGCTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGAGAGCCGAGGACACGGCCGTGTATTACTGTGCGAGAAATATTTATACGTTCGACTACTGGGGCCAGGGTACACTGGTCACCGTGAGCTCAGGTGGAGGCGGTTCAGGCGGAGGTGGATCCGGCGGTGGCGGATCGCAGTCTGTGCTGACTCAGCCACCCTCAGCGTCTGGGACCCCCGGGCAGAGGGTCACCATCTCTTGTAGTGGCTCTTCATCTAATATTGGCAGTAATGCTGTCTCCTGGTACCAGCAGCTCCCAGGAACGGCCCCCAAACTCCTCATCTATTATAATAATCAGCGGCCAAGCGGGGTCCCTGACCGATTCTCTGGCTCCAAGTCTGGCACCTCAGCCTCCCTGGCCATCAGTGGGCTCCGGTCCGAGGATGAGGCTGATTATTACTGTGGTTCTTGGGATTCTAGCCTGAGTGGATATGTCTTCGGCGGAGGCACCAAGCTGACGGTCCTAGGCATTGAAGTTATGTATCCTCCTCCTTACCTAGACAATGAGAAGAGCAATGGAACCATTATCCATGTGAAAGGGAAACACCTTTGTCCAAGTCCCCTATTTCCCGGACCTTCTAAGCCCTTTTGGGTGCTGGTGGTGGTTGGTGGAGTCCTGGCTTGCTATAGCTTGCTAGTAACAGTGGCCTTTATTATTTTCTGGGTGAGGAGTAAGAGGAGCAGGCTCCTGCACAGTGACTACATGAACATGACTCCCCGCCGCCCCGGGCCCACCCGCAAGCATTACCAGCCCTATGCCCCACCACGCGACTTCGCAGCCTATCGCTCCAGAGTGAAGTTCAGCAGGAGCGCAGACGCCCCCGCGTACCAGCAGGGCCAGAACCAGCTCTATAACGAGCTCAATCTAGGACGAAGAGAGGAGTACGATGTTTTGGACAAGAGACGTGGCCGGGACCCTGAGATGGGGGGAAAGCCGAGAAGGAAGAACCCTCAGGAAGGCCTGTACAATGAACTGCAGAAAGATAAGATGGCGGAGGCCTACAGTGAGATTGGGATGAAAGGCGAGCGCCGGAGGGGCAAGGGGCACGATGGCCTTTACCAGGGTCTCAGTACAGCCACCAAGGACACCTACGACGCCCTTCACATGCAGGCCCTGCCCCCTCGCTGA
24 501(28H)28z amino acid MALPVTALLLPLALLLHAARPEVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSNYAMSWVRQAPGKGLEWVSGIYPDSGSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARNIYTFDYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSQSVLTQPPSASGTPGQRVTISCSGSSSNIGSNAVSWYQQLPGTAPKLLIYYNNQRPSGVPDRFSGSKSGTSASLAISGLRSEDEADYYCGSWDSSLSGYVFGGGTKLTVLGIEVMYPPPYLDNEKSNGTIIHVKGKHLCPSPLFPGPSKPFWVLVVVGGVLACYSLLVTVAFIIFWVRSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRSRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR
25 503(28H)28z nucleotide ATGGCCTTACCAGTGACCGCCTTGCTCCTGCCGCTGGCCTTGCTGCTCCACGCCGCCAGGCCGGAGGTGCAGCTGTTGGAGTCCGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGGGGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCACCTTTAGCAATTATGCTATGAGCTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGGCTGGAGTGGGTCTCATCGATCTATCCTGGTGATGGTAGTACATATTACGCTGATTCTGTAAAAGGTCGGTTCACCATCTCCAGAGACAATTCCAAGAACACGCTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGAGAGCCGAGGACACGGCCGTGTATTACTGTGCGAAAAATGCGTTTACGTTCGACTACTGGGGCCAGGGTACACTGGTCACCGTGAGCTCAGGTGGAGGCGGTTCAGGCGGAGGTGGATCCGGCGGTGGCGGATCGCAGTCTGTGCTGACTCAGCCACCCTCAGCGTCTGGGACCCCCGGGCAGAGGGTCACCATCTCTTGTAGTGGCTCTTCATCTAATATTGGCAGTAATGCTGTCTCCTGGTACCAGCAGCTCCCAGGAACGGCCCCCAAACTCCTCATCTATTATAATAGTCATCGGCCAAGCGGGGTCCCTGACCGATTCTCTGGCTCCAAGTCTGGCACCTCAGCCTCCCTGGCCATCAGTGGGCTCCGGTCCGAGGATGAGGCTGATTATTACTGTGGTACTTGGGATTCTAGCCTGAGTGGTTATGTCTTCGGCGGAGGCACCAAGCTGACGGTCCTAGGCATTGAAGTTATGTATCCTCCTCCTTACCTAGACAATGAGAAGAGCAATGGAACCATTATCCATGTGAAAGGGAAACACCTTTGTCCAAGTCCCCTATTTCCCGGACCTTCTAAGCCCTTTTGGGTGCTGGTGGTGGTTGGTGGAGTCCTGGCTTGCTATAGCTTGCTAGTAACAGTGGCCTTTATTATTTTCTGGGTGAGGAGTAAGAGGAGCAGGCTCCTGCACAGTGACTACATGAACATGACTCCCCGCCGCCCCGGGCCCACCCGCAAGCATTACCAGCCCTATGCCCCACCACGCGACTTCGCAGCCTATCGCTCCAGAGTGAAGTTCAGCAGGAGCGCAGACGCCCCCGCGTACCAGCAGGGCCAGAACCAGCTCTATAACGAGCTCAATCTAGGACGAAGAGAGGAGTACGATGTTTTGGACAAGAGACGTGGCCGGGACCCTGAGATGGGGGGAAAGCCGAGAAGGAAGAACCCTCAGGAAGGCCTGTACAATGAACTGCAGAAAGATAAGATGGCGGAGGCCTACAGTGAGATTGGGATGAAAGGCGAGCGCCGGAGGGGCAAGGGGCACGATGGCCTTTACCAGGGTCTCAGTACAGCCACCAAGGACACCTACGACGCCCTTCACATGCAGGCCCTGCCCCCTCGCTGA
26 503(28H)28z amino acid MALPVTALLLPLALLLHAARPEVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSNYAMSWVRQAPGKGLEWVSSIYPGDGSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKNAFTFDYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSQSVLTQPPSASGTPGQRVTISCSGSSSNIGSNAVSWYQQLPGTAPKLLIYYNSHRPSGVPDRFSGSKSGTSASLAISGLRSEDEADYYCGTWDSSLSGYVFGGGTKLTVLGIEVMYPPPYLDNEKSNGTIIHVKGKHLCPSPLFPGPSKPFWVLVVVGGVLACYSLLVTVAFIIFWVRSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRSRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR
27 C2G4(28H)28z nucleotide ATGGCCTTACCAGTGACCGCCTTGCTCCTGCCGCTGGCCTTGCTGCTCCACGCCGCCAGGCCGGAGGTGCAGCTGTTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGGGGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCGGCCTCTGGATTCACCTTTAGCAATTATGCTATGAGCTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGGCTGGAGTGGGTCTCAGGGATCCCTCCTGATAGTGGTAGTAAATATTACGCTGATTCTGTAAGAGGTCGGTTCACCGTCTCCAGAGACAATTCCAAGAACACGCTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGAGAGCCGAGGACACGGCCGTGTATTACTGTGCGAAAAATATGCTGTCGTTCGACTACTGGGGCCAGGGTACACTGGTCACCGTGAGCTCAGGTGGAGGCGGTTCAGGCGGAGGTGGATCCGGCGGTGGCGGATCGCAGTCTGTGCTGACTCAGCCACCCTCAGCGTCTGGGACCCCCGGGCAGAGGGTCACCATCTCTTGTACTGGCTCTTCATCTAATATTGGCTCCAATGCTGTCTCCTGGTACCAGCAGCTCCCAGGAACGGCCCCCAAACTCCTCATCTATTATAATAGTAAGCGGCCAAGCGGGGTCCCTGACCGATTCTCTGGCTCCAAGTCTGGCACCTCAGCCTCCCTGGCCATCAGTGGGCTCCGGTCCGAGGATGAGGCTGATTATTACTGTGGTTCTTGGGATCCTAGCCTGAATGGTTATGTCTTCGGCGGAGGCACCAAGGTGACCGTCCTAGGTATTGAAGTTATGTATCCTCCTCCTTACCTAGACAATGAGAAGAGCAATGGAACCATTATCCATGTGAAAGGGAAACACCTTTGTCCAAGTCCCCTATTTCCCGGACCTTCTAAGCCCTTTTGGGTGCTGGTGGTGGTTGGTGGAGTCCTGGCTTGCTATAGCTTGCTAGTAACAGTGGCCTTTATTATTTTCTGGGTGAGGAGTAAGAGGAGCAGGCTCCTGCACAGTGACTACATGAACATGACTCCCCGCCGCCCCGGGCCCACCCGCAAGCATTACCAGCCCTATGCCCCACCACGCGACTTCGCAGCCTATCGCTCCAGAGTGAAGTTCAGCAGGAGCGCAGACGCCCCCGCGTACCAGCAGGGCCAGAACCAGCTCTATAACGAGCTCAATCTAGGACGAAGAGAGGAGTACGATGTTTTGGACAAGAGACGTGGCCGGGACCCTGAGATGGGGGGAAAGCCGAGAAGGAAGAACCCTCAGGAAGGCCTGTACAATGAACTGCAGAAAGATAAGATGGCGGAGGCCTACAGTGAGATTGGGATGAAAGGCGAGCGCCGGAGGGGCAAGGGGCACGATGGCCTTTACCAGGGTCTCAGTACAGCCACCAAGGACACCTACGACGCCCTTCACATGCAGGCCCTGCCCCCTCGCTGA
28 C2G4(28H)28z amino acid MALPVTALLLPLALLLHAARPEVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSNYAMSWVRQAPGKGLEWVSGIPPDSGSKYYADSVRGRFTVSRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKNMLSFDYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSQSVLTQPPSASGTPGQRVTISCTGSSSNIGSNAVSWYQQLPGTAPKLLIYYNSKRPSGVPDRFSGSKSGTSASLAISGLRSEDEADYYCGSWDPSLNGYVFGGGTKVTVLGIEVMYPPPYLDNEKSNGTIIHVKGKHLCPSPLFPGPSKPFWVLVVVGGVLACYSLLVTVAFIIFWVRSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRSRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR
29 501(8H)Δ nulceotide ATGGCCTTACCAGTGACCGCCTTGCTCCTGCCGCTGGCCTTGCTGCTCCACGCCGCCAGGCCGGAGGTGCAGCTGTTGGAGTCCGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGGGGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCACCTTTAGCAATTATGCTATGAGCTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGGCTGGAGTGGGTCTCAGGGATCTATCCCGATAGTGGTAGTACATATTACGCTGATTCTGTAAAAGGTCGGTTCACCATCTCCAGAGACAATTCCAAGAACACGCTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGAGAGCCGAGGACACGGCCGTGTATTACTGTGCGAGAAATATTTATACGTTCGACTACTGGGGCCAGGGTACACTGGTCACCGTGAGCTCAGGTGGAGGCGGTTCAGGCGGAGGTGGATCCGGCGGTGGCGGATCGCAGTCTGTGCTGACTCAGCCACCCTCAGCGTCTGGGACCCCCGGGCAGAGGGTCACCATCTCTTGTAGTGGCTCTTCATCTAATATTGGCAGTAATGCTGTCTCCTGGTACCAGCAGCTCCCAGGAACGGCCCCCAAACTCCTCATCTATTATAATAATCAGCGGCCAAGCGGGGTCCCTGACCGATTCTCTGGCTCCAAGTCTGGCACCTCAGCCTCCCTGGCCATCAGTGGGCTCCGGTCCGAGGATGAGGCTGATTATTACTGTGGTTCTTGGGATTCTAGCCTGAGTGGATATGTCTTCGGCGGAGGCACCAAGCTGACGGTCCTAGGCGCGAAGCCCACCACGACGCCAGCGCCGCGACCACCAACACCGGCGCCCACCATCGCGTCGCAGCCCCTGTCCCTGCGCCCAGAGGCGTGCCGGCCAGCGGCGGGGGGCGCAGTGCACACGAGGGGGCTGGACTTCGCCTGTGATATCTACATCTGGGCGCCCTTGGCCGGGACTTGTGGGGTCCTTCTCCTGTCACTGGTTATCACCCTTTACTGCTGA
30 501(8H)Δ amino acid MALPVTALLLPLALLLHAARPEVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSNYAMSWVRQAPGKGLEWVSGIYPDSGSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARNIYTFDYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSQSVLTQPPSASGTPGQRVTISCSGSSSNIGSNAVSWYQQLPGTAPKLLIYYNNQRPSGVPDRFSGSKSGTSASLAISGLRSEDEADYYCGSWDSSLSGYVFGGGTKLTVLGAKPTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYC
31 501(8H)z nucleotide ATGGCCTTACCAGTGACCGCCTTGCTCCTGCCGCTGGCCTTGCTGCTCCACGCCGCCAGGCCGGAGGTGCAGCTGTTGGAGTCCGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGGGGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCACCTTTAGCAATTATGCTATGAGCTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGGCTGGAGTGGGTCTCAGGGATCTATCCCGATAGTGGTAGTACATATTACGCTGATTCTGTAAAAGGTCGGTTCACCATCTCCAGAGACAATTCCAAGAACACGCTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGAGAGCCGAGGACACGGCCGTGTATTACTGTGCGAGAAATATTTATACGTTCGACTACTGGGGCCAGGGTACACTGGTCACCGTGAGCTCAGGTGGAGGCGGTTCAGGCGGAGGTGGATCCGGCGGTGGCGGATCGCAGTCTGTGCTGACTCAGCCACCCTCAGCGTCTGGGACCCCCGGGCAGAGGGTCACCATCTCTTGTAGTGGCTCTTCATCTAATATTGGCAGTAATGCTGTCTCCTGGTACCAGCAGCTCCCAGGAACGGCCCCCAAACTCCTCATCTATTATAATAATCAGCGGCCAAGCGGGGTCCCTGACCGATTCTCTGGCTCCAAGTCTGGCACCTCAGCCTCCCTGGCCATCAGTGGGCTCCGGTCCGAGGATGAGGCTGATTATTACTGTGGTTCTTGGGATTCTAGCCTGAGTGGATATGTCTTCGGCGGAGGCACCAAGCTGACGGTCCTAGGCGCGAAGCCCACCACGACGCCAGCGCCGCGACCACCAACACCGGCGCCCACCATCGCGTCGCAGCCCCTGTCCCTGCGCCCAGAGGCGTGCCGGCCAGCGGCGGGGGGCGCAGTGCACACGAGGGGGCTGGACTTCGCCTGTGATATCTACATCTGGGCGCCCTTGGCCGGGACTTGTGGGGTCCTTCTCCTGTCACTGGTTATCACCCTTTACTGCAGAGTGAAGTTCAGCAGGAGCGCAGACGCCCCCGCGTACCAGCAGGGCCAGAACCAGCTCTATAACGAGCTCAATCTAGGACGAAGAGAGGAGTACGATGTTTTGGACAAGAGACGTGGCCGGGACCCTGAGATGGGGGGAAAGCCGAGAAGGAAGAACCCTCAGGAAGGCCTGTACAATGAACTGCAGAAAGATAAGATGGCGGAGGCCTACAGTGAGATTGGGATGAAAGGCGAGCGCCGGAGGGGCAAGGGGCACGATGGCCTTTACCAGGGTCTCAGTACAGCCACCAAGGACACCTACGACGCCCTTCACATGCAGGCCCTGCCCCCTCGCTGA
32 501(8H)z amino acid MALPVTALLLPLALLLHAARPEVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSNYAMSWVRQAPGKGLEWVSGIYPDSGSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARNIYTFDYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSQSVLTQPPSASGTPGQRVTISCSGSSSNIGSNAVSWYQQLPGTAPKLLIYYNNQRPSGVPDRFSGSKSGTSASLAISGLRSEDEADYYCGSWDSSLSGYVFGGGTKLTVLGAKPTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR
33 501(8H)BBz nucleotide ATGGCCTTACCAGTGACCGCCTTGCTCCTGCCGCTGGCCTTGCTGCTCCACGCCGCCAGGCCGGAGGTGCAGCTGTTGGAGTCCGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGGGGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCACCTTTAGCAATTATGCTATGAGCTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGGCTGGAGTGGGTCTCAGGGATCTATCCCGATAGTGGTAGTACATATTACGCTGATTCTGTAAAAGGTCGGTTCACCATCTCCAGAGACAATTCCAAGAACACGCTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGAGAGCCGAGGACACGGCCGTGTATTACTGTGCGAGAAATATTTATACGTTCGACTACTGGGGCCAGGGTACACTGGTCACCGTGAGCTCAGGTGGAGGCGGTTCAGGCGGAGGTGGATCCGGCGGTGGCGGATCGCAGTCTGTGCTGACTCAGCCACCCTCAGCGTCTGGGACCCCCGGGCAGAGGGTCACCATCTCTTGTAGTGGCTCTTCATCTAATATTGGCAGTAATGCTGTCTCCTGGTACCAGCAGCTCCCAGGAACGGCCCCCAAACTCCTCATCTATTATAATAATCAGCGGCCAAGCGGGGTCCCTGACCGATTCTCTGGCTCCAAGTCTGGCACCTCAGCCTCCCTGGCCATCAGTGGGCTCCGGTCCGAGGATGAGGCTGATTATTACTGTGGTTCTTGGGATTCTAGCCTGAGTGGATATGTCTTCGGCGGAGGCACCAAGCTGACGGTCCTAGGCGCGAAGCCCACCACGACGCCAGCGCCGCGACCACCAACACCGGCGCCCACCATCGCGTCGCAGCCCCTGTCCCTGCGCCCAGAGGCGTGCCGGCCAGCGGCGGGGGGCGCAGTGCACACGAGGGGGCTGGACTTCGCCTGTGATATCTACATCTGGGCGCCCTTGGCCGGGACTTGTGGGGTCCTTCTCCTGTCACTGGTTATCACCCTTTACTGCAAACGGGGCAGAAAGAAACTCCTGTATATATTCAAACAACCATTTATGAGACCAGTACAAACTACTCAAGAGGAAGATGGCTGTAGCTGCCGATTTCCAGAAGAAGAAGAAGGAGGATGTGAACTGAGAGTGAAGTTCAGCAGGAGCGCAGACGCCCCCGCGTACCAGCAGGGCCAGAACCAGCTCTATAACGAGCTCAATCTAGGACGAAGAGAGGAGTACGATGTTTTGGACAAGAGACGTGGCCGGGACCCTGAGATGGGGGGAAAGCCGAGAAGGAAGAACCCTCAGGAAGGCCTGTACAATGAACTGCAGAAAGATAAGATGGCGGAGGCCTACAGTGAGATTGGGATGAAAGGCGAGCGCCGGAGGGGCAAGGGGCACGATGGCCTTTACCAGGGTCTCAGTACAGCCACCAAGGACACCTACGACGCCCTTCACATGCAGGCCCTGCCCCCTCGCTGA
34 501(8H)BBz amino acid MALPVTALLLPLALLLHAARPEVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSNYAMSWVRQAPGKGLEWVSGIYPDSGSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARNIYTFDYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSQSVLTQPPSASGTPGQRVTISCSGSSSNIGSNAVSWYQQLPGTAPKLLIYYNNQRPSGVPDRFSGSKSGTSASLAISGLRSEDEADYYCGSWDSSLSGYVFGGGTKLTVLGAKPTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR
35 501(8H)28z nucleotide ATGGCCTTACCAGTGACCGCCTTGCTCCTGCCGCTGGCCTTGCTGCTCCACGCCGCCAGGCCGGAGGTGCAGCTGTTGGAGTCCGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGGGGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCACCTTTAGCAATTATGCTATGAGCTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGGCTGGAGTGGGTCTCAGGGATCTATCCCGATAGTGGTAGTACATATTACGCTGATTCTGTAAAAGGTCGGTTCACCATCTCCAGAGACAATTCCAAGAACACGCTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGAGAGCCGAGGACACGGCCGTGTATTACTGTGCGAGAAATATTTATACGTTCGACTACTGGGGCCAGGGTACACTGGTCACCGTGAGCTCAGGTGGAGGCGGTTCAGGCGGAGGTGGATCCGGCGGTGGCGGATCGCAGTCTGTGCTGACTCAGCCACCCTCAGCGTCTGGGACCCCCGGGCAGAGGGTCACCATCTCTTGTAGTGGCTCTTCATCTAATATTGGCAGTAATGCTGTCTCCTGGTACCAGCAGCTCCCAGGAACGGCCCCCAAACTCCTCATCTATTATAATAATCAGCGGCCAAGCGGGGTCCCTGACCGATTCTCTGGCTCCAAGTCTGGCACCTCAGCCTCCCTGGCCATCAGTGGGCTCCGGTCCGAGGATGAGGCTGATTATTACTGTGGTTCTTGGGATTCTAGCCTGAGTGGATATGTCTTCGGCGGAGGCACCAAGCTGACGGTCCTAGGCGCGAAGCCCACCACGACGCCAGCGCCGCGACCACCAACACCGGCGCCCACCATCGCGTCGCAGCCCCTGTCCCTGCGCCCAGAGGCGTGCCGGCCAGCGGCGGGGGGCGCAGTGCACACGAGGGGGCTGGACTTCGCCTGTGATTTTTGGGTGCTGGTGGTGGTTGGTGGAGTCCTGGCTTGCTATAGCTTGCTAGTAACAGTGGCCTTTATTATTTTCTGGGTGAGGAGTAAGAGGAGCAGGCTCCTGCACAGTGACTACATGAACATGACTCCCCGCCGCCCCGGGCCCACCCGCAAGCATTACCAGCCCTATGCCCCACCACGCGACTTCGCAGCCTATCGCTCCAGAGTGAAGTTCAGCAGGAGCGCAGACGCCCCCGCGTACCAGCAGGGCCAGAACCAGCTCTATAACGAGCTCAATCTAGGACGAAGAGAGGAGTACGATGTTTTGGACAAGAGACGTGGCCGGGACCCTGAGATGGGGGGAAAGCCGAGAAGGAAGAACCCTCAGGAAGGCCTGTACAATGAACTGCAGAAAGATAAGATGGCGGAGGCCTACAGTGAGATTGGGATGAAAGGCGAGCGCCGGAGGGGCAAGGGGCACGATGGCCTTTACCAGGGTCTCAGTACAGCCACCAAGGACACCTACGACGCCCTTCACATGCAGGCCCTGCCCCCTCGCTGA
36 501(8H)28z amino acid MALPVTALLLPLALLLHAARPEVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSNYAMSWVRQAPGKGLEWVSGIYPDSGSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARNIYTFDYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSQSVLTQPPSASGTPGQRVTISCSGSSSNIGSNAVSWYQQLPGTAPKLLIYYNNQRPSGVPDRFSGSKSGTSASLAISGLRSEDEADYYCGSWDSSLSGYVFGGGTKLTVLGAKPTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDFWVLVVVGGVLACYSLLVTVAFIIFWVRSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRSRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR
37 Linker nucleotide GGTGGAGGCGGTTCAGGCGGAGGTGGATCCGGCGGTGGCGGATCG
38 Linker amino acid GGGGSGGGGSGGGGS
본 발명의 실시예에 따른 키메라 항원 수용체(chimeric antigen receptor, CAR)의 제조에 사용된 scFv 가변영역의 중쇄, 경쇄, 및 CDRs의 서열목록을 표 4 내지 표 5에 정리하였다.
서열번호 클론 가변영역 아미노산 서열
39 MS501 중쇄 EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSNYAMSWVRQAPGKGLEWVSGIYPDSGSTYYADSVKGRFTISRD
NSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARNIYTFDYWGQGTLVTVSS
40 경쇄 QSVLTQPPSASGTPGQRVTISCSGSSSNIGSNAVSWYQQLPGTAPKLLIYYNNQRPSGVPDRFSGSKSGTSASLAISGLRSEDEADYYCGSWDSSLSGYVFGGGTKLTVLG
41 MS503 중쇄 EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSNYAMSWVRQAPGKGLEWVSSIYPGDGSTYYADSVKGRFTISRD
NSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKNAFTFDYWGQGTLVTVSS
42 경쇄 QSVLTQPPSASGTPGQRVTISCSGSSSNIGSNAVSWYQQLPGTAPKLLIYYNSHRPSGVPDRFSGSKSGTSASL
AISGLRSEDEADYYCGTWDSSLSGYVFGGGTKLTVLG
43 C2G4 중쇄 EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSNYAMSWVRQAPGKGLEWVSGIPPDSGSKYYADSVRGRFTVSR
DNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKNMLSFDYWGQGTLVTVSS
44 경쇄 QSVLTQPPSASGTPGQRVTISCTGSSSNIGSNAVSWYQQLPGTAPKLLIYYNSKRPSGVPDRFSGSKSGTSASL
AISGLRSEDEADYYCGSWDPSLNGYVFGGGTKVTVLG
클론 가변영역 서열번호 CDR1 서열번호 CDR2 서열번호 CDR3
MS501 중쇄 45 NYAMS 46 GIYPDSGSTYYADSVKG 47 NIYTFDY
경쇄 48 SGSSSNIGSNAVS 49 YNNQRPS 50 GSWDSSLSGYV
MS503 중쇄 51 NYAMS 52 SIYPGDGSTYYADSVKG 53 NAFTFDY
경쇄 54 SGSSSNIGSNAVS 55 YNSHRPS 56 GTWDSSLSGYV
C2G4 중쇄 57 NYAMS 58 GIPPDSGSKYYADSVRG 59 NMLSFDY
경쇄 60 TGSSSNIGSNAVS 61 YNSKRPS 62 GSWDPSLNGYV
1.6 바이러스 생산 및 유전자 전달
유전자 전달을 위해 293T 세포를 사용하여 위형-VSVG 렌티바이러스(pseudotype-VSVG Lentivirus)를 제조하였다. HEK293T 세포는 10% FBS(GIBCO)가 포함된 DMEM(GIBCO) 배지에서 배양하였다. HEK293T 세포는 pCDH1-MSCV-MSLN CAR construct-EF1α-copGFP 벡터, EF1α-MSLN CAR construct 벡터 또는 pCDH1-MSCV-EF1α-copGFP 대조군 벡터; 및 HIV 기반 pPACKH1 렌티바이러스 패키지 키트(System Biosciences)와 공-형질감염(co-transfected)되었다. Vector 전달을 위해 리포펙타민 2000(Invitrogen, Carlsbad, CA)이 사용되었다. MSLN CAR construct 는 다음과 같다; 501(28H)28z, 503(28H)28z, C2G4(28H)28z, 501(8H)Δ, 501(8H)z, 501(8H)BBz 또는 501(8H)28z. 형질전환 48시간 후, 렌티바이러스를 포함하는 세포 상층액(Supernatant)을 수확하였다. 상층액은 0.45㎛ 필터 유닛(Millipore, Billerica, MA, USA)으로 세포 조각(cell debris)를 제거하였다. 10,600 rpm에서 90분간 ultracentrifugation 하여 바이러스를 1,500배 농축하였다. 농축된 바이러스는 -80℃에서 보관되었다.
Jurkat 세포는 10%를 포함하는 RPMI-1640 배지(GIBCO)를 사용하여 5 x 105 cells/ml 농도로 조절하였고, 5 MOI(Multiplicity of infection) 또는 10 MOI 렌티바이러스를 첨가하였다. 1,800 g 및 32℃에서 90분간 원심분리 되었다. 원심분리 후에, 상층액을 걷어내고 새로운 배지(fresh media)로 교체하였다. 세포들은 이후 37℃ 및 5% CO2 조건의 가습 인큐베이터에서 보관하였다. 대조군 세포들은 벡터만을 사용하여 형질도입 되었다.
인간 T 세포는 5% 인간 혈청(Sigma)과 50 IU/ml IL-2(Novartis)가 포함된 X-VIVO15(LONZA) 배지에서 5 x 105 cells/ml 농도로 부유하였다. 5 MOI 또는 10 MOI 렌티바이러스를 8 μg/ml 폴리브렌(Polybrene, Santa Cruz)와 함께 첨가하였다. 1,800 g 및 32℃에서 90분간 원심분리 되었다. 원심분리 후에, 상층액을 걷어내고 새로운 배지(fresh media)로 교체하였다. 세포들은 이후 37℃ 및 5% CO2 조건의 가습 인큐베이터에서 방치되었다. 대조군 세포들은 벡터만을 사용하여 형질도입 되었다.
1.7 MSLN CAR를 포함하는 수용체 발현 및 T 세포 활성마커 분석
501(28H)28z 형질도입 된 Jurkat 세포, 503(28H)28z 형질도입 된 Jurkat 세포, C2G4(28H)28z 형질도입 된 Jurkat 세포, 대조군 벡터 형질도입 된 Jurkat 세포 및 Jurkat 세포는 FACS 완충액을 사용하여 두 차례 세척하였다. 세포들은 항-CD3(BD Biosciences), 항-F(ab)2(Jackson Immuno research), 항-CD69(BD)hAbs를 사용하여 염색하였다. 염색된 세포들의 발현비율 및 평균 형광강도(Mean fluorescence intensity, MFI)는 BD LSRFortessa 를 사용하여 측정되었고, 플로우조(FlowJo) 소프트웨어에서 분석되었다.
501(28H)28z 형질도입 된 인간 T 세포, C2G4(28H)28z 형질도입된 인간 T 세포 및 대조군 벡터 형질도입 된 인간 T 세포는 FACS 완충액을 사용하여 두 차례 세척하였다. 세포들은 항-CD3(BD Biosciences), 항-F(ab)2(Jackson Immuno research)를 사용하여 염색하였다. 염색된 세포들의 발현비율 및 평균 형광강도(Mean fluorescence intensity, MFI)는 BD LSRFortessa 를 사용하여 측정되었고, 플로우조(FlowJo) 소프트웨어에서 분석되었다.
1.8 MSLN CAR 발현 T 세포의 표적세포 활성능 확인
다음 과정을 거쳐서, MSLN CAR 발현 T 세포의 표적세포, 즉 메소텔린을 발현하는 암세포에 대한 활성능을 확인하였다.
(ⅰ) 표적 세포들은 96-well 플레이트에 1 x 104 cells/well로 분배하였다.
(ⅱ) 효과세포들 (501(28H)28z 형질도입 된 Jurkat 세포, 503(28H)28z 형질도입 된 Jurkat 세포, C2G4(28H)28z 형질도입 된 Jurkat 세포, 대조군 벡터 형질도입 된 Jurkat 세포 및 Jurkat 세포)은 수확(harvest)되고, RPMI-1640 배지로 세척된 후 다양한 E/T(effector-to-target) 비율 조건으로 첨가되었다.
(ⅲ) 24 시간 후에, 플레이트들은 2,000 rpm에서 3분간 원심분리 되었으며, 100 μL의 상층액이 수집되었고, 원심분리 된 세포들은 FACS 완충액을 사용하여 두 차례 세척한 후, 활성마커를 분석하였다. 세포독성 에세이가 완료된 시료들은 -20℃에서 보관되었다.
1.9 칼세인 방출 세포독성 에세이
다음 과정을 거쳐서, MSLN CAR 발현 T 세포의 세포 독성을 확인하였다.
(ⅰ) 표적 세포들은 10 μM 칼세인아세톡시메틸에스터(Calcein-acetoxymethyl ester, Calcein-AM; cell-permeant dye, Invitrogen)를 사용하여 37℃에서 30분 동안 표지(label)되었다.
(ⅱ) 세척 후에, 표지된 표적 세포들은 96-well 플레이트에 1 x 104 cells/well로 분배되었다.
(ⅲ) 효과세포들 (501(28H)28z 형질도입 된 인간 T 세포, C2G4(28H)28z 형질도입 된 인간 T 세포 및 대조군 벡터 형질도입 된 인간 T 세포)은 수확(harvest)되고, RPMI-1640 배지로 세척된 후 다양한 E/T(effector-to-target) 비율 조건으로 첨가되었다.
(ⅳ) 4시간 후에, 플레이트들은 2,000 rpm에서 3분간 원심분리 되었으며, 100 μL의 상층액이 수집되었고, 형광 마이크로 플레이트 리더(Victor3, PerkinElmer)로 자극파장 485 nm 및 발광파장 535 nm에서 칼세인 방출을 측정하였다. 세포독성 에세이가 완료된 시료들은 -20℃에서 보관되었다.
1.10 사이토카인 측정을 위한 효소 결합 면역 침강 분석
-20℃에서 보관된 상층액에서 사이토카인 측정을 위한 효소 결합 면역 침강 분석(Enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA, R&D systems)을 진행하였다.
(ⅰ) 포획 항체(Capture antibody)를 분석증명서(Certificate of Analysis, CoA)에 따라 희석하여 96-well plate에 24시간 코팅한다.
(ⅱ) 세척용액으로 well을 세척한 후, 1% BSA(Bovine serum albumin, Sigma) 용액으로 1시간 블로킹(Blocking)하였다.
(ⅲ) 세척용액으로 well을 세척한 후, 시료를 2시간 처리하였다.
(ⅳ) 세척용액으로 well을 세척한 후, 탐지 항체(Detection antibody)를 분석증명서에 따라 희석하여 well에 분주한 후 2시간 처리하였다.
(ⅴ) 세척용액으로 well을 세척한 후, 스트렙타비딘-HRP (Streptavidin-HRP)이 20분간 처리되었다.
(ⅵ) 세척용액으로 well을 세척한 후, 기질 용액(Substrate solution)이 20분간 처리되었다.
(ⅶ) 정지 용액(Stop solution)을 처리하고 450 nm에서 흡광도를 측정하였다.
1.11 이종이식 마우스 모델 확립 및 MSLN CAR 발현 T 세포의 항종양 능력 평가
생명윤리위원회(Institutional animal care and use committee, IACUC, GC녹십자, Korea)의 승인을 받아 인비보(in vivo)를 진행하였다. 6 주령 암컷 NSG(NOD scid gamma) 마우스는 The Jackson laboratory(Bar Harbor, Maine, United States)에서 공급받아 사용하였다. NCI-H226 세포는 PBS(Phosphate-buffered saline, GIBCO)에 5 x 106 cells/100㎕ 농도로 부유되었다. 부유 된 세포와 같은 용량의 Matrigel basement membrane matrix(Corning, NY, United States)가 첨가되었다. 마우스의 오른쪽 옆구리에 NCI-H226 5 x 106 cells를 피하주사하였다.
종양의 크기가 200 ~ 250 mm3에 도달하였을 때, 준비된 501(8H)Δ, 501(8H)z, 501(8H)BBz, 501(8H)28z 또는 501(28H)28z로 형질도입 된 인간 T 세포를 종양 내 5일 간격으로 2회 주사하였다. 마우스는 그룹별 10마리가 사용되었다. CAR-T 세포가 주사된 후, 2일 내지 3일 마다 종양의 크기와 몸무게를 측정하였다. 각 그룹별 4마리는 첫 종양 내 주사 후 20일 째에 IACUC 규정에 따른 처치방법을 통해 종양 조직을 수확(Harvest)하였다. 수확한 종양 조직은 전자저울로 무게가 측정되었다. 종양조직은 잘게 잘라 PBS로 세척하여 상층액은 IFN-γ 사이토카인 ELISA에 사용되었다. 마우스들은 첫 종양 내 CAR-T 세포를 주사 후 60일간 추적관찰 하였고, 종양의 장축 길이가 15mm이상일 경우나 몸무게가 20% 이상 줄었을 경우 죽은 것으로 간주하였다.
실시예 2: 메소텔린 특이적인 CAR를 발현하는 Jurkat 세포 및 인간 T 세포의 암 면역치료제로서의 평가
2.1 메소텔린을 특이적으로 표적하는 scFv 평가
MS501 IgG, MS503 IgG 및 C2G4 IgG는 기존의 특허(목암연구소, GC녹십자, KOREA)에서 발명되어 메소텔린 특이적인 결합을 할 수 있다고 알려져 있다. 본 발명자들은 MS501 IgG, MS503 IgG 및 C2G4 IgG를 scFv 형태로 제작하고 scFv 형태에서도 재조합 인간 메소텔린에 결합함을 면역 침강 분석으로 확인하였다(도 1A). 메소텔린을 과발현하는 세포주에 위 scFv 단백질을 결합하고, 유세포 분석을 통해 메소텔린 과발현 세포주에 68% 이상 결합함을 확인하였다(도 1B).
2.2 메소텔린 특이적인 CAR의 발현 확인과 발현 유지능 평가
MS501 scFv, MS503 scFv 및 C2G4 scFv는 CD8α의 신호서열; CD28 의 힌지, 막관통 도메인, 세포 내 신호전달 도메인; CD3ζ의 세포 내 신호전달 도메인과 결합시켰다[표 1](도 2A). 재조합된 키메라 항원 수용체(501(28H)28z, 503(28H)28z, C2G4(28H)28z)유전자는 MSCV 프로모터를 가지는 렌티바이러스 벡터를 이용하여 Jurkat 세포에서 발현되었다. 사용된 렌티바이러스 양은 10 감염 배수(Multiplicity of infection, MOI)가 사용되었다. 각각의 CAR는 항-F(ab)2 항체를 사용하여 검출되었다. 유세포 분석을 통해 Jurkat 세포에서 CAR가 55% 이상의 효율로 형질도입된 것이 확인되었다(도 2B). 2~3일에 한번 유세포 분석으로 50일 이상 CAR 발현이 유지되는 것을 확인하여 세포 밖 증식에도 형질도입 된 CAR 유전자의 발현을 지속할 수 있다는 것을 입증한다(도 2C).
2.3 메소텔린 특이적인 CAR를 발현하는 Jurkat 세포의 활성 증가
메소텔린(Mesothelin)은 중피암, 자궁암, 췌장암 등의 암종에서 과발현하며 암의 진행과 관련이 있다고 알려져 있음을 고려하여, 본 발명자들은 메소텔린을 표적하는 키메라 항원 수용체를 발현하는 Jurkat 세포의 항암효과 활성 여부를 시험하였다. 시험에 앞서, 형질도입 되지 않은 Jurkat 세포(Untransduced)와 벡터만으로 형질도입 된 Jurkat 세포(Mock)에서 T 세포를 활성화시킨다고 알려진 PMA 와 PHA 를 이용하여 Jurkat 세포의 활성을 확인하였다. PMA 와 PHA 를 처리하였을 때, Jurkat 세포의 활성이 증가되었다(도 3A).
메소텔린 특이적인 키메라 항원 수용체를 코딩하는 유전자를 재조합하고 렌티바이러스를 사용하여 유전자를 Jurkat 세포에 전달하였다. 501(28H)28z 또는 C2G4(28H)28z 메소텔린 수용체가 형질도입 된 Jurkat 세포에서 키메라 항원 수용체 발현율이 503(28H)28z이 형질도입 된 Jurkat 세포에 비교하여 우수하였다(도 2C). 메소텔린의 발현이 높다고 알려진 HeLa, OVCAR3 및 CAPAN1 세포와 키메라 항원 수용체가 형질도입 된 Jurkat 세포를 공배양하여 본 발명의 메소텔린 수용체가 형질도입 된 Jurkat 세포의 활성을 평가하였다. 메소텔린 수용체가 형질도입된 Jurkat 세포에서 T 세포 활성마커인 CD69가 발현되는 것을 확인하였으며, 특히 MS501 과 MS503 메소텔린 수용체가 형질도입 된 Jurkat 세포에서 CD69가 높은 수준으로 발현하였다(도 3A). 또한, 표적세포 반응에 따른 사이토카인도 분비하는 것을 확인하였으며, 이 경우 501(28H)28z가 형질도입 된 Jurkat 세포가 가장 많은 양의 사이토카인을 분비하였다(도 3B). 이를 통해 본 발명의 메소텔린 특이적인 키메라 항원 수용체를 발현하는 Jurkat 세포 중 MS501 메소텔린 수용체가 형질도입 Jurkat 세포가 된 501(28H)28z가 MS503(28H)28z 또는 C2G4(28H)28z 형질도입 된 Jurkat 세포보다 더 높은 활성을 나타냄을 확인하였다.
본 발명에 따른 세 가지 메소텔린 수용체 501(28H)28z, 503(28H)28z 또는 C2G4(28H)28z)를 발현하는 Jurkat 세포의 메소텔린 특이적인 활성을 확인하기 위하여, MIA PaCa2 세포 또는 MIA PaCa2-MSLN 세포를 각각 메소텔린 수용체가 형질도입된 Jurkat 세포와 공배양한 후 활성을 평가하였다. 메소텔린을 과발현시킨 세포인 MIA PaCa2-MSLN 세포와 메소텔린 수용체가 형질도입 된 Jurkat 세포를 공배양 후, 501(28H)28z, 503(28H)28z 또는 C2G4(28H)28z가 형질도입 된 Jurkat 세포에서 높은 수준으로 CD69가 발현되었다. 그 중 특히, 501(28H)28z와 503(28H)28z가 형질도입 된 Jurkat 세포가 C2G4(28H)28z가 형질도입 된 Jurkat 세포와 비교하여 더 높은 수준으로 CD69를 발현하였다(도 4A). 또한, 사이토카인 분비능을 통해 Jurkat 세포의 활성을 확인하기 위하여 IL-2의 양을 ELISA를 이용하여 평가하였다. 501(28H)28z, 503(28H)28z 또는 C2G4(28H)28z가 형질도입 된 Jurkat 세포에서 IL-2 사이토카인이 분비되는 것을 확인하였으며, 특히 501(28H)28z가 형질도입 된 Jurkat 세포에서 더 많은 양의 IL-2가 분비되었다(도 4B). 이를 통해 본 발명의 메소텔린 수용체를 발현하는 Jurkat 세포가 메소텔린에 특이적으로 활성을 나타냄을 확인하였다.
2.4 인간 T 세포에서 메소텔린 특이적인 CAR의 발현 확인 평가
503(28H)28z 형질전환 된 Jurkat 세포를 501(28H)28z 또는 C2G4(28H)28z Jurkat 세포와 비교하였을 때, MSLN CAR 발현 유지능이 뒤떨어지고(도 2C), 표적세포와 공배양 했을 때 활성마커의 발현 대비 사이토카인 분비능이 부족한 것을 확인하였다(도 3A, 3B). 본 발명자들은 이후 실험에서 503(28H)28z는 제외하였다. 재조합 된 키메라 항원 수용체(501(28H)28z 또는 C2G4(28H)28z) 유전자는 MSCV 프로모터를 가지는 렌티바이러스 벡터를 이용하여 인간 T 세포에서 발현되었다. 사용된 렌티바이러스 양은 5~10 감염 배수(Multiplicity of infection, MOI)가 사용되었다. 각각의 CAR는 항-F(ab)2 항체를 사용하여 검출되었다. 유세포 분석을 통해 인간 T 세포에서 CAR가 80% 이상의 효율로 형질도입된 것이 확인되었다(도 5A).
2.5 메소텔린 특이적인 CAR를 발현하는 인간 T 세포의 항암 능력 평가
본 발명에 따른 두 가지 메소텔린 키메라 항원 수용체(501(28H)28z 또는 C2G4(28H)28z)를 발현하는 인간 T세포의 메소텔린 특이적인 항암능력을 평가하기 위하여, MIA PaCa2 세포 또는 MIA PaCa2-MSLN 세포를 각각 메소텔린 수용체가 형질도입 된 인간 T 세포와 공배양 후 표적세포 살해능을 평가하였다. 메소텔린 수용체를 발현하는 인간 T 세포가 MIA PaCa2 세포에 대해 살해능을 보이지 않았지만, 메소텔린을 발현하는 MIA PaCa2-MSLN 세포에서는 살해능이 확인되었다(도 5B). 또한, IFN-γ 사이토카인 분비능을 통해 메소텔린 CAR가 형질전환 된 인간 T 세포의 활성을 확인하였다(도 5C). 이를 통해 본 발명의 메소텔린 수용체를 발현하는 인간 T 세포가 메소텔린 특이적으로 항암능을 나타냄을 확인하였다.
메소텔린의 발현이 높다고 알려진 OVCAR3 및 CAPAN1 세포와 본 발명에 따른 두 가지 메소텔린 키메라 항원 수용체(501(28H)28z 또는 C2G4(28H)28z)가 형질도입 된 인간 T 세포를 공배양하여 표적세포 살해능을 평가하였다. 메소텔린 키메라 항원 수용체를 발현하는 인간 T 세포가 OVCAR3 및 CAPAN1 세포에 대한 살해능이 확인되었다(도 5B).
2.6 다양한 조합을 가지는 메소텔린 특이적인 CAR의 스크리닝과 마우스 모델에서의 암 면역치료제로서의 평가
C2G4(28H)28z 형질전환 된 인간 T 세포를 501(28H)28z 인간 T 세포와 비교하였을 때, 메소텔린을 발현하는 표적세포에 대한 살해능이 부족한 것을 확인하였다(도 5D). 본 발명자들은 이후 실험에서 C2G4(28H)28z는 제외하였다. 다양한 조합을 가지는 메소텔린 특이적인 CAR 후보군들의 스크리닝을 위해 추가로 MS501 scFv를 바탕으로 키메라 항원 수용체 501(8H)Δ, 501(8H)z, 501(8H)BBz, 501(8H)28z 또는 501(28H)28z 유전자를 재조합하였다. [표 1](도 6A). 재조합된 CAR 유전자는 EF1α 프로모터를 가지는 렌티바이러스 벡터를 이용하여 인간 T 세포에서 발현되었다. 사용된 렌티바이러스 양은 5~10 감염 배수(Multiplicity of infection, MOI)가 사용되었다. 각각의 CAR는 항-F(ab)2 항체를 사용하여 검출되었다. 유세포 분석을 통해 CAR 양성 비율을 확인하여 CAR 양성 세포수를 계산하였다.
NCI-H226 세포가 이종이식(Xenograft)된 마우스의 종양크기가 200 ~ 250 mm3에 도달하였을 때 다양한 조합을 가지는 메소텔린 특이적인 CAR 로 형질전환 된 인간 T 세포를 종양 내 주사하여 마우스모델에서의 항암능력을 두 달간 평가하였고, 종양 내 주사를 받기 전 종양 크기 대비 크기의 증가 및 감소를 비율로서 나타내었다(도 6B). 다양한 조합을 가진 메소텔린 특이적인 키메라 항원 수용체로 형질전환 된 인간 T 세포 중 501(28H)28z 구조의 메소텔린 특이적인 키메라 항원 수용체가 형질전환 된 인간 T 세포를 종양 내 주사되었을 때, 종료시점에서 종양의 크기가 PBS 대조군 대비 270% 감소함을 확인하였다. 501(8H)28z 그룹과 비교하였을 때, 501(28H)28z 그룹에서 종양크기가 150% 감소함을 확인하였다. CAR-T 세포 첫 종양 내 주사 후 20일 째에 각 그룹별 4마리로부터 종양조직을 분리하여 그룹별 상대적인 종양조직 무게를 비교하였다(도 6C). 501(28H)28z 그룹에서 종양의 무게가 다른 그룹과 비교하여 제일 가벼움을 확인하였고, 항암효과가 뛰어남을 보여주었다. 또한, 종양 내 IFN-γ 사이토카인 분비능을 통해 501(28H)28z로 형질전환 된 인간 T 세포의 활성에 따른 항암효과임을 확인하였다(도 6D). 메소텔린 특이적인 CAR로 형질전환 된 인간 T 세포를 종양 내 주사하고 이에 따른 부작용을 몸무게 변화로 나타내었다(도 6E). CAR-T 세포 주사 후 부작용이 없음을 확인하였다. 종료시점에서 마우스모델의 생존율을 확인하여 나타내었다(도 6F). PBS 그룹 29% 생존율; Mock 그룹 11% 생존율; 501(8H)Δ 그룹 17% 생존율; 501(8H)z 그룹은 0% 생존율; 501(8H)BBz 그룹은 33% 생존율; 501(8H)28z 그룹은 50% 생존율을 보이는 반면, 501(28H)28z 그룹에서 100% 생존율을 보였다.
위의 실험 결과들은 본 발명이 메소텔린 특이적인 암 면역세포치료제로 사용될 수 있으며 본 발명의 메소텔린 키메라 항원 수용체 중 MS501 메소텔린 수용체를 이용한 T 세포가 보다 우수한 항암 효과를 나타낼 수 있고, 특히 501(28H)28z 구조를 가질 때 뛰어난 항암 효과를 나타낼 수 있다는 사실을 보여준다.
이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 한정되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.
<110> Green Cross Cell <120> Mesothelin-specific chimeric antigen receptor and T lymphocyte expressing this chimeric antigen receptor <130> P19-B174 <160> 62 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 727 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> MS501 scFv nucleotide <400> 1 gaggtgcagc tgttggagtc cgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgagactc 60 tcctgtgcag cctctggatt cacctttagc aattatgcta tgagctgggt ccgccaggct 120 ccagggaagg ggctggagtg ggtctcaggg atctatcccg atagtggtag tacatattac 180 gctgattctg taaaaggtcg gttcaccatc tccagagaca attccaagaa cacgctgtat 240 ctgcaaatga acagcctgag agccgaggac acggccgtgt attactgtgc gagaaatatt 300 tatacgttcg actactgggg ccagggtaca ctggtcaccg tgagctcagg tggaggcggt 360 tcaggcggag gtggatccgg cggtggcgga tcgcagtctg tgctgactca gccaccctca 420 gcgtctggga cccccgggca gagggtcacc atctcttgta gtggctcttc atctaatatt 480 ggcagtaatg ctgtctcctg gtaccagcag ctcccaggaa cggcccccaa actcctcatc 540 tattataata atcagcggcc aagcggggtc cctgaccgat tctctggctc caagtctggc 600 acctcagcct ccctggccat cagtgggctc cggtccgagg atgaggctga ttattactgt 660 ggttcttggg attctagcct gagtggatat gtcttcggcg gaggcaccaa gctgacggtc 720 ctaggca 727 <210> 2 <211> 242 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> MS501 scFv amino acid <400> 2 Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Tyr 20 25 30 Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Gly Ile Tyr Pro Asp Ser Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Asn Ile Tyr Thr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val 100 105 110 Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly 115 120 125 Gly Gly Ser Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Ala Ser Gly Thr 130 135 140 Pro Gly Gln Arg Val Thr Ile Ser Cys Ser Gly Ser Ser Ser Asn Ile 145 150 155 160 Gly Ser Asn Ala Val Ser 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gtggctcttc atctaatatt 480 ggcagtaatg ctgtctcctg gtaccagcag ctcccaggaa cggcccccaa actcctcatc 540 tattataata gtcatcggcc aagcggggtc cctgaccgat tctctggctc caagtctggc 600 acctcagcct ccctggccat cagtgggctc cggtccgagg atgaggctga ttattactgt 660 ggtacttggg attctagcct gagtggttat gtcttcggcg gaggcaccaa gctgacggtc 720 ctaggc 726 <210> 4 <211> 242 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> MS503 scFv amino acid <400> 4 Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Tyr 20 25 30 Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Ser Ile Tyr Pro Gly Asp Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Lys Asn Ala Phe Thr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val 100 105 110 Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly 115 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tatgtcttcg gcggaggcac caagctgacg 780 gtcctaggcg cgaagcccac cacgacgcca gcgccgcgac caccaacacc ggcgcccacc 840 atcgcgtcgc agcccctgtc cctgcgccca gaggcgtgcc ggccagcggc ggggggcgca 900 gtgcacacga gggggctgga cttcgcctgt gatatctaca tctgggcgcc cttggccggg 960 acttgtgggg tccttctcct gtcactggtt atcacccttt actgcaaacg gggcagaaag 1020 aaactcctgt atatattcaa acaaccattt atgagaccag tacaaactac tcaagaggaa 1080 gatggctgta gctgccgatt tccagaagaa gaagaaggag gatgtgaact gagagtgaag 1140 ttcagcagga gcgcagacgc ccccgcgtac cagcagggcc agaaccagct ctataacgag 1200 ctcaatctag gacgaagaga ggagtacgat gttttggaca agagacgtgg ccgggaccct 1260 gagatggggg gaaagccgag aaggaagaac cctcaggaag gcctgtacaa tgaactgcag 1320 aaagataaga tggcggaggc ctacagtgag attgggatga aaggcgagcg ccggaggggc 1380 aaggggcacg atggccttta ccagggtctc agtacagcca ccaaggacac ctacgacgcc 1440 cttcacatgc aggccctgcc ccctcgctga 1470 <210> 34 <211> 489 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 501(8H)BBz amino acid <400> 34 Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu 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ttcatctaat 540 attggcagta atgctgtctc ctggtaccag cagctcccag gaacggcccc caaactcctc 600 atctattata ataatcagcg gccaagcggg gtccctgacc gattctctgg ctccaagtct 660 ggcacctcag cctccctggc catcagtggg ctccggtccg aggatgaggc tgattattac 720 tgtggttctt gggattctag cctgagtgga tatgtcttcg gcggaggcac caagctgacg 780 gtcctaggcg cgaagcccac cacgacgcca gcgccgcgac caccaacacc ggcgcccacc 840 atcgcgtcgc agcccctgtc cctgcgccca gaggcgtgcc ggccagcggc ggggggcgca 900 gtgcacacga gggggctgga cttcgcctgt gatttttggg tgctggtggt ggttggtgga 960 gtcctggctt gctatagctt gctagtaaca gtggccttta ttattttctg ggtgaggagt 1020 aagaggagca ggctcctgca cagtgactac atgaacatga ctccccgccg ccccgggccc 1080 acccgcaagc attaccagcc ctatgcccca ccacgcgact tcgcagccta tcgctccaga 1140 gtgaagttca gcaggagcgc agacgccccc gcgtaccagc agggccagaa ccagctctat 1200 aacgagctca atctaggacg aagagaggag tacgatgttt tggacaagag acgtggccgg 1260 gaccctgaga tggggggaaa gccgagaagg aagaaccctc aggaaggcct gtacaatgaa 1320 ctgcagaaag ataagatggc ggaggcctac agtgagattg ggatgaaagg cgagcgccgg 1380 aggggcaagg ggcacgatgg cctttaccag ggtctcagta cagccaccaa ggacacctac 1440 gacgcccttc acatgcaggc cctgccccct cgctga 1476 <210> 36 <211> 491 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 501(8H)28z amino acid <400> 36 Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu 1 5 10 15 His Ala Ala Arg Pro Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu 20 25 30 Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe 35 40 45 Thr Phe Ser Asn Tyr Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys 50 55 60 Gly Leu Glu Trp Val Ser Gly Ile Tyr Pro Asp Ser Gly Ser Thr Tyr 65 70 75 80 Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser 85 90 95 Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr 100 105 110 Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Asn Ile Tyr Thr Phe Asp Tyr Trp Gly 115 120 125 Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly 130 135 140 Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Pro 145 150 155 160 Ser Ala Ser Gly Thr Pro Gly Gln 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Claims (26)

  1. 메소텔린(Mesothelin, MSLN)에 특이적으로 결합하는 결합 도메인을 포함하는, 키메라 항원 수용체(Chimeric antigen receptor; CAR).
  2. 제1항에 있어서, 추가적으로 신호서열, 힌지(hinge), 막관통 도메인(TM) 및 세포 내 도메인으로 구성된 군에서 선택된 하나 이상을 포함하는 것을 특징으로 하는 키메라 항원 수용체.
  3. 제1항에 있어서, 상기 메소텔린에 특이적으로 결합하는 결합 도메인은 다음의 중쇄 CDR을 포함하는 중쇄 가변영역 및 경쇄 CDR을 포함하는 경쇄 가변영역을 함유하는 항-메소텔린 항체, 또는 이의 단편인 것을 특징으로 하는 키메라 항원 수용체:
    서열번호 45의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR1, 서열번호 46의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR2 서열번호 47의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR3, 및 서열번호 48의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR1, 서열번호 49의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR2, 서열번호 50의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR3;
    서열번호 51의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR1, 서열번호 52의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR2, 서열번호 53의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR3, 및 서열번호 54의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR1, 서열번호 55의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR2, 서열번호 56의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR3; 또는
    서열번호 57의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR1, 서열번호 58의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR2, 서열번호 59의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR3, 및 서열번호 60의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR1, 서열번호 61의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR2, 서열번호 62의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR3.
  4. 제1항에 있어서, 상기 메소텔린에 특이적으로 결합하는 결합 도메인은 다음의 중쇄 가변영역 및 경쇄 가변영역을 함유하는 항-메소텔린 항체, 또는 이의 단편인 것을 특징으로 하는 키메라 항원 수용체:
    서열번호 39의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변영역 및 서열번호 40의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변영역;
    서열번호 41의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변영역 및 서열번호 42의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변영역; 또는
    서열번호 43의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변영역 및 서열번호 44의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변영역.
  5. 제1항에 있어서, 상기 메소텔린에 특이적으로 결합하는 결합 도메인은 항-메소텔린 항체의 단일-사슬 가변 단편(scFv)인 것을 특징으로 하는 키메라 항원 수용체.
  6. 제5항에 있어서, 상기 항-메소텔린 항체의 단일-사슬 가변 단편(scFv)은 서열번호 2, 서열번호 4 또는 서열번호 6으로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 키메라 항원 수용체.
  7. 제2항에 있어서, 상기 신호서열은 CD8α의 신호서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 키메라 항원 수용체.
  8. 제7항에 있어서, 상기 CD8α의 신호서열은 서열번호 8로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 키메라 항원 수용체.
  9. 제2항에 있어서, 상기 힌지는 CD28 또는 CD8α의 힌지를 포함하는 것을 특징으로 하는 키메라 항원 수용체.
  10. 제9항에 있어서, 상기 CD28 또는 CD8α의 힌지 서열은 서열번호 10 또는 서열번호 16으로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 키메라 항원 수용체.
  11. 제2항에 있어서, 상기 막관통 도메인은 CD28 또는 CD8α의 막관통 도메인을 포함하는 것을 특징으로 하는 키메라 항원 수용체.
  12. 제11항에 있어서, 상기 CD28 또는 CD8α의 막관통 도메인은 서열번호 12 또는 서열번호 18로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 키메라 항원 수용체.
  13. 제2항에 있어서, 상기 세포 내 도메인은 CD28, 4-1BB 및 CD3ζ의 세포 내 신호 영역 서열, 또는 이들의 조합으로 구성된 군에서 선택되는 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 키메라 항원 수용체.
  14. 제13항에 있어서, 상기 CD28, 4-1BB 또는 CD3ζ의 세포 내 신호 영역 서열은 서열번호 14, 서열번호 20 또는 서열번호 22로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 키메라 항원 수용체.
  15. 제1항의 키메라 항원 수용체를 코딩하는 핵산.
  16. 제15항에 있어서, 상기 핵산은 서열번호 7로 표시되는 것을 특징으로 하는 CD8α 신호서열을 코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 키메라 항원 수용체를 코딩하는 핵산.
  17. 제15항에 있어서, 상기 핵산은 서열번호 1, 서열번호 3, 또는 서열번호 5로 표시되는 것을 특징으로 하는 항-메소텔린 항체의 단일-사슬 가변 단편(scFv)을 코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 키메라 항원 수용체를 코딩하는 핵산.
  18. 제15항에 있어서, 상기 핵산은 서열번호 9 또는 서열번호 15로 표시되는 것을 특징으로 하는 CD28 또는 CD8α 힌지를 코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 키메라 항원 수용체를 코딩하는 핵산.
  19. 제15항에 있어서, 상기 핵산은 서열번호 11 또는 서열번호 17로 표시되는 것을 특징으로 하는 CD28 또는 CD8α 막관통 도메인을 코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 키메라 항원 수용체를 코딩하는 핵산.
  20. 제15항에 있어서, 상기 핵산은 서열번호 13, 서열번호 19, 또는 서열번호 21로 표시되는 것을 특징으로 하는 CD28, 4-1BB 또는 CD3ζ 세포 내 신호 영역을 코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 키메라 항원 수용체를 코딩하는 핵산.
  21. 제15항의 핵산을 포함하는 발현 벡터.
  22. 제21항의 발현 벡터를 포함하는 바이러스.
  23. 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항의 키메라 항원 수용체를 표면에 발현하는 면역세포.
  24. 제23항에 있어서, 상기 면역세포는 T 세포, NK 세포, 또는 NKT 세포인, 면역세포.
  25. 제23항의 면역세포를 포함하는 암 또는 종양 치료용 조성물.
  26. 제25항에 있어서, 상기 암은 편평세포암, 소세포 폐암, 비소세포 폐암, 폐의 선암종, 폐의 편평세포 암종, 복막암, 간세포성암, 위장암, 췌장암, 신경교종, 자궁경부암, 난소암, 간암, 방광암, 간세포암, 유방암, 결장암, 결장직장암, 자궁내막 또는 자궁 암종, 타액선 암종, 신장암, 간암, 전립선암, 외음부암, 갑상선암, 간 암종, 백혈병 및 다른 림프구증식성 장애, 및 다양한 유형의 두경부암으로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는, 암 또는 종양 치료용 조성물.
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