CN114286691B

CN114286691B - Cs1-抗体和抗cs1-car-t细胞

Info

Publication number: CN114286691B
Application number: CN202180004390.8A
Authority: CN
Inventors: 张连军; 梅恒; 周棠怡; 陈雄波; 熊巍
Original assignee: Wuhan Sian Medical Technology Co ltd
Current assignee: Wuhan Sian Medical Technology Co ltd
Priority date: 2020-08-06
Filing date: 2021-08-02
Publication date: 2024-08-06
Anticipated expiration: 2041-08-02
Also published as: WO2022031602A1; US20230295331A1; CN114286691A

Abstract

本发明涉及单克隆抗人CS1克隆7A8D5抗体或单链可变片段(scFv),其包括具有SEQ ID NO：4的氨基酸的VH和具有SEQ ID NO：5的氨基酸的VL。本发明还涉及一种嵌合抗原受体融合蛋白，其从N‑末端到C‑末端包括：(i)本发明的CS1 scFv，(ii)跨膜结构域，(iii)至少一个共刺激结构域，和(iv)激活结构域。

Description

CS1-抗体和抗CS1-CAR-T细胞

对序列表、表格或计算机程序的引用

序列表与说明书同时通过EFS-Web以ASCII格式的文本文件提交，文件名为SequenceListing.txt，创建日期为2021年7月30日，大小为25.2千字节。通过EFS-Web提交的序列表是说明书的一部分，并通过引用将其整体并入本文。

发明领域

本发明涉及用于肿瘤过继免疫基因治疗领域的CS1特异性抗体(克隆7A8D5)和抗CS1-CAR-T细胞。

发明背景

免疫疗法正逐渐成为一种非常有前途的癌症治疗方法。T细胞或T淋巴细胞是我们免疫系统的武装力量，不断寻找外来抗原并将异常细胞(癌症或感染细胞)与正常细胞区分开来。用嵌合抗原受体(CAR)构建体对T细胞进行基因修饰是设计肿瘤特异性T细胞最常用的方法。靶向肿瘤相关抗原(TAA)的CAR-T细胞可以输注到患者体内(称为过继细胞转移或ACT)，代表了一种有效的免疫治疗方法[1,2]。与化疗或抗体相比，CAR-T技术的优势在于，重编程的工程T细胞可以在患者体内增殖并持续存在(“一种活的药物”)[1,2]。

CAR通常由以下部分组成：位于N末端部分的由单克隆抗体衍生的单链可变片段(scFv)、铰链、跨膜结构域和多个细胞内共刺激结构域：(i)CD28，(ii)CD137(4-1BB)、CD27或其他共刺激结构域，与活化的CD3-zeta结构域串联(图1)[2；3]。CAR的发展经历了从第一代(无共刺激结构域)到第二代(有一个共刺激结构域)再到第三代(有多个共刺激结构域)的过程。产生具有多个共刺激结构域的CAR(所谓的第三代CAR-T细胞)导致细胞溶解性CAR-T细胞活性增加，提高了CAR-T细胞的持久性，从而增强了其抗肿瘤活性。

CS1(SLAM家族成员7，CD319)抗原在多发性骨髓瘤细胞中过表达。CS1蛋白的氨基酸序列如图2所示，下划线部分为细胞胞外结构域。

附图简要说明

图1.CAR的结构。左图显示了第一代的结构(没有共刺激结构域)。中间图显示了第二代的结构(一个共刺激结构域CD28或4-BB)。右图显示了第三代CAR(两个或更多的共刺激结构域)[4]。

图2.CS1蛋白的氨基酸序列(SEQ ID NO：1)

图3.CS1 CAR构建体的结构。第二代CAR与CD28共刺激结构域或41BB结构域一起使用。

图4.双特异性BCMA-CS1 CAR构建体的结构。

图5.ELISA显示抗CS1抗体克隆7A8D5与CS1抗原结合，但与其他阴性对照蛋白不结合。

图6.通过FACS检测多发性骨髓瘤细胞系RPMI8226和MM1S中的CS1。

图7.使用CHO-CS1细胞对CS1抗体进行结合滴定。显示了代表性曲线。结合的Kd为0.8μg/ml或5.3nm。

图8.用小鼠FAB抗体通过FACS检测CAR阳性T细胞。使用CS1-CD28-CD3CAR(PMC418)用于分析。

图9.CS1-CAR-T细胞(PMC418)针对CHO-CS1细胞而非CHO-CD22细胞分泌高水平的IFN-γ。

图10.通过FACS检测CAR阳性细胞。FACS使用抗小鼠F(ab)₂抗体(mFAB)进行，检测ScFv-CAR+阳性细胞。显示了PMC622-CAR-T细胞。

图11A和11B.CS1-CAR-T细胞杀伤CHO-CS1细胞而不杀伤CHO细胞。图11A：CHO-CS1阳性细胞的实时细胞毒性试验(RTCA)。图11B：用CHO(CS1-阴性)细胞进行RTCA试验。CS1-CD28-CD3 CAR-T细胞。

图12A和12B.CS1-CD28-CD3 CAR-T细胞杀伤Hela-CS1细胞而不杀伤Hela细胞。图12A：用Hela-CS1阳性细胞进行实时细胞毒性试验(RTCA)。图12B：用Hela(CS1阴性)细胞进行RTCA试验。PMC622，CS1-CD28-CD3 CAR-T细胞。

图13A和13B.PMC622-CAR-T细胞针对CHO-CS1细胞而非CHO细胞(图13A)分泌IFN-γ，和针对Hela-CS1但不针对Hela细胞(图13B)分泌IFN-γ。*p<0.05-，Student’s t-检验。

图14.通过FACS检测CAR阳性细胞。FACS使用抗小鼠F(ab)₂抗体(mFAB)进行，检测ScFv-CAR+阳性细胞。显示了CS1-41BB-CD3-CAR-T(PMC717)细胞。

图15.CS1-41BB-CD3 CAR-T细胞(PMC717)杀伤Hela-CS1细胞。用Hela-CS1阳性细胞进行实时细胞毒性试验(RTCA)。

图16.CS1-41BB-CD3(PMC717)针对Hela-CS1细胞分泌高水平的IFN-γ。CAR-T细胞分泌的IFN-γ明显高于模拟CAR-T细胞。CS1-41BB-CD3 CAR-T细胞(PMC717)相较于模拟CAR-T细胞，p＝0.0087，Student’s t检验。

图17.CS1-CAR-T细胞(PMC717)治疗小鼠的Kaplan-Myer存活曲线。

发明详述

定义

如本文所用，“嵌合抗原受体(CAR)”是一种受体蛋白，它已经被工程化以赋予T细胞靶向特定蛋白的新能力。这种受体是嵌合的，因为它们将抗原结合和T细胞激活功能结合在一个受体中。CAR是一种融合蛋白，包括能够与抗原结合的胞外结构域、跨膜结构域和至少一个胞内结构域。“嵌合抗原受体(CAR)”有时被称为“嵌合受体”、“T体”或“嵌合免疫受体(CIR)”。“能够与抗原结合的胞外结构域”是指任何能与某种抗原结合的寡肽或多肽。“胞内结构域”是指任何已知的寡肽或多肽，作为传递信号以导致细胞中生物过程的激活或抑制的结构域。

如本文所用，“结构域”是指多肽中独立于其他区域折叠成特定结构的一个区域。

如本文所用，“单链可变片段(scFv)”是指来源于抗体的单链多肽，其保留与抗原结合的能力。scFv的一个例子包括通过重组DNA技术形成的抗体多肽，其中免疫球蛋白重链(H链)和轻链(L链)片段的Fv区通过间隔序列连接。本领域技术人员已知用于工程化scFv的各种方法。

如本文所用，“肿瘤抗原”是指具有抗原性的生物分子，其表达导致癌症。

本发明人已经生成了特异性靶向CS1的鼠抗人单克隆抗体。本发明人已经生产了CS1-CAR-T细胞，以靶向过度表达CS1肿瘤抗原的癌细胞。本发明的CS1-CAR-T细胞对几种癌细胞系具有高细胞毒活性。

本发明涉及小鼠单克隆抗人CS1抗体或其抗原结合片段(例如，Fab、(Fab)₂、scFv),包括具有SEQ ID NO：4的氨基酸V_H和具有SEQ ID NO：5的氨基酸的V_L。所述单克隆抗人CS1抗体是针对人CS1产生的。在一个实施方式中，所述单克隆抗人CS1抗体片段是单链可变片段(scFv)。ScFv可以是VH-接头-VL或VL-接头-VH。

本发明还涉及一种嵌合抗原受体融合蛋白，其从N-末端到C-末端包括：(i)抗CS1抗原(本发明)的单链可变片段(scFv)，(ii)跨膜结构域，(iii)至少一个共刺激结构域，和(iv)激活结构域。

在一些实施方式中，CS1 CAR结构如图3所示。

在一个实施方式中，共刺激结构域选自下组：CD28、4-1BB、GITR、ICOS-1、CD27、OX-40和DAP10结构域。优选的共刺激结构域是CD28或4-1BB。

一个优选的激活结构域是CD3-zeta(CD3Z或CD3ζ)。

跨膜结构域可以来源于天然多肽，也可以是人工设计的。来源于天然多肽的跨膜结构域可以从任何膜结合蛋白或跨膜蛋白中获得。例如，可以使用T细胞受体α或β链、CD3Zeta链、CD28、CD3ε、CD45、CD4、CD5、CD8、CD9、CD16、CD22、CD33、CD37、CD64、CD80、CD86、CD134、CD137、ICOS、CD154或GITR的跨膜结构域。人工设计的跨膜结构域是主要包含疏水性残基如亮氨酸和缬氨酸的多肽。优选在合成的跨膜结构域的每一端设计苯丙氨酸、色氨酸和缬氨酸的三联体。任选地，短的寡肽接头或多肽接头，例如具有2～10个氨基酸长度的接头可以设置在跨膜结构域和胞内结构域之间。在一个实施方式中，可以使用具有甘氨酸-丝氨酸连续序列的接头序列。

本发明提供一种编码BCMA-CAR的核酸。编码CAR的核酸可由特定CAR的氨基酸序列通过常规方法制备。可以从每个结构域的氨基酸序列的NCBI RefSeq ID或GenBank的登录号中获得编码其氨基酸序列的碱基序列，并且可以使用标准的分子生物学和/或化学方法制备本发明的核酸。例如，基于碱基序列，可以合成核酸，并且通过使用聚合酶链反应(PCR)将从cDNA文库中获得的DNA片段组合，可以制备本发明的核酸。

可以将编码本发明CAR的核酸插入载体中，然后将所述载体导入细胞。例如，可以使用逆转录病毒载体(包括致癌逆转录病毒载体、慢病毒载体和伪型载体)、腺病毒载体、腺相关病毒(AAV)载体、猿猴病毒载体、痘苗病毒载体或仙台病毒载体、爱泼斯坦-巴尔病毒(EBV)载体和HSV载体等病毒载体。优选使用缺乏复制能力从而不能在受感染细胞中自我复制的病毒载体。

例如，当使用逆转录病毒载体时，可以基于载体所具有的LTR序列和包装信号序列选择合适的包装细胞，用于使用包装细胞制备逆转录病毒颗粒。包装细胞的实例包括PG13(ATCC CRL-10686)、PA317(ATCC CRL-9078)、GP+E-86和GP+envAm-12以及Psi-Crip。还可以使用具有高转染效率的293细胞或293T细胞制备逆转录病毒颗粒。基于逆转录病毒和可用于包装逆转录病毒载体的包装细胞生产的许多种类的逆转录病毒载体可从许多公司商业获得。

CAR-T细胞通过CAR与特定抗原结合，从而将信号传递到细胞中，结果细胞被激活。表达CAR的细胞的激活取决于宿主细胞的种类和CAR的细胞内结构域，并且可以基于例如细胞因子的释放、细胞增殖速度的提高、细胞表面分子的变化等作为指标来确认。例如，从激活的细胞释放细胞毒性细胞因子(肿瘤坏死因子、淋巴毒素等)导致表达抗原的靶细胞的破坏。此外，细胞因子的释放或细胞表面分子的变化刺激其他免疫细胞，例如B细胞、树突状细胞、NK细胞和巨噬细胞。

表达CAR的细胞可用作疾病的治疗剂。所述治疗剂包含作为活性成分的表达CAR的细胞，并且还可以包含合适的赋形剂。

本发明人已经生成了针对过表达CS1的血液病癌细胞(多发性骨髓瘤)的CS1-ScFv-CD28-CD3-CAR-T(CS1-CAR-T)细胞。本发明人提供了证明CS1在多发性骨髓瘤中有效表达的数据。CS1-CAR-T细胞对CS1阳性靶标癌细胞的杀伤活性高于对非转导T细胞和模拟CAR-T细胞的杀伤活性。

本发明的CS1单克隆抗体或CS1-ScFv相对于其他已知的CS1抗体的优点是，本发明的抗体对CS1阳性癌细胞具有高度特异性。CS1抗体在许多临床应用中作为治疗剂是非常有效的。

本发明的单克隆小鼠抗人CS1抗体检测CS1阳性癌细胞中的CS1。

目前的CS1抗体可用于免疫治疗：毒素/药物结合抗体、单克隆治疗性抗体、CS1抗体人源化、CAR-T细胞免疫治疗。

使用本发明的CS1抗体的CS1-CAR-T细胞在CS1阳性细胞系如多发性骨髓瘤中有效地靶向CS1抗原。

CS1-CAR-T细胞可与不同疗法联合使用：检查点抑制剂；靶向治疗，小分子抑制剂和抗体。

CS1抗体可以通过定点突变进行亲和力调节；可用于人源化和全人抗体的产生。

CS1-CAR-T细胞可用于临床靶向CS1阳性细胞。

共激活结构域的修饰；CD28、4-1BB等可用于提高CAR的功效。标签偶联的CS1 ScFv可用于CAR的生成。

第三代CAR-T或其他共激活信号结构域可与CAR内的CS1-scFv一起使用。

CS1联合其它CAR靶向其它肿瘤抗原或肿瘤微环境(VEGFR-1-3)、PDL-1、CD80或双-scFv-CAR可提高CS1-CAR单药治疗的活性。

CS1-CAR可用于生成其他类型的细胞，如CAR-自然杀伤(NK)细胞、CS1-CAR-巨噬细胞、CS1-CAR-造血细胞和其他细胞。

可产生具有CS1和BCMA(肿瘤坏死因子受体超家族成员17)、CD3或其他抗原的双特异性抗体用于治疗。

在多发性骨髓瘤中，CS1和BCMA蛋白常过度表达。基于它们在多发性骨髓瘤中的高表达率，这两个靶点都被用于CAR-T细胞治疗。其挑战之一是BCMA可能被下调或丢失，导致对BCMA-CAR T细胞的治疗产生耐药性。双特异性BCMA-CS1CAR-T细胞可用于多发性骨髓瘤的更有效治疗。

在一个实施方式中，双特异性BCMA-CS1 CAR-T细胞的构建如图4所示。

以下实施例将进一步说明本发明。这些实施例仅用于说明本发明而不应被解释为限制性的。

实施例

发明人在克隆到慢病毒载体中的慢病毒载体内产生了CS1 CAR构建体。慢病毒CAR构建体包含CS1 ScFv-CD28-CD3zeta插入物——或类似的41BB结构域而非CD28结构域。在EF1或MNDU3启动子下使用所述的CAR。

在293T细胞中产生慢病毒，并用RT-PCR测定其滴度。然后用等剂量的慢病毒转导T细胞，如实施例中所述。

材料和方法

实施例1.细胞系

Raji,RPMI8226,MM1S,K562,CHO细胞系从ATCC(弗吉尼亚州，马纳萨斯)购买，在DMEM(GE保健公司，伊利诺伊州，芝加哥)或含10％FBS(AmCell,加利福尼亚，山景城)的RPMI-1640培养基(赛默飞世尔,马萨诸塞州，沃尔瑟姆)中培养。CHO-CS1细胞购自BPSBioscience(加利福尼亚州，圣地亚哥)，在含10％FBS和1mg/ml遗传霉素(赛默飞世尔)的Ham's F12K培养基中培养。用CS1 cDNA慢病毒转导HeLa细胞产生Hela-CS1细胞。根据IRB批准的协议(#13942)，从斯坦福的斯坦福医院血液中心获得的全血中分离出人外周血单核细胞(PBMC)。PBMC采用Ficoll-Paque(GE保健公司)密度沉降法分离，冷冻保存备用。

实施例2.小鼠抗人CS1抗体

我们用杂交瘤标准技术制备了小鼠抗人CS1单克隆抗体，克隆7A8D5。

通过皮下注射重组融合CS1蛋白胞外结构域(23-226个氨基酸)免疫6～8周龄的BALB/c小鼠。将免疫小鼠脾细胞与SP/0骨髓瘤细胞用PEG(聚乙二醇)和HAT(低氧嘧啶-氨基喋呤-胸苷)培养基进行融合制备杂交瘤。杂交瘤用96孔板稀释获得单克隆，用免疫原通过ELISA筛选阳性克隆。将阳性杂交瘤克隆培养扩增以产生抗CS1抗体。收集这些抗体克隆的上清，用蛋白G柱纯化，并通过蛋白质印迹和FACS分析。选择最佳阳性克隆7A8D5进行VH和VL测序，用于CAR的生成。

实施例3.慢病毒CAR构建体

在IDT中合成了密码子优化序列CS1(7A8D5)ScFv,并将其亚克隆到含有CD28或4-1BB共刺激结构域和CD3激活结构域的第二代CAR序列中。具有细胞外TF标签-CD28-CD3CAR-T细胞的模拟CAR-T细胞用作模拟CAR-T细胞。

实施例4.慢病毒产生

2.5x10⁷个HEK293FT细胞(赛默飞世尔)接种于0.01％明胶包被的15cm平板上，在DMEM、2％FBS、1X青/链霉素中培养过夜。使用NanoFect转染NF100试剂(Alstem)，用10μgCAR慢病毒载体和pPACKH1慢载体包装混合物(系统生物科学，加利福尼亚州，帕洛阿尔托)转染细胞。第二天用新鲜培养基更换培养基，48小时后收集含有慢病毒颗粒的培养基。通过2100g离心30分钟，清除培养基中的细胞碎片。用SW28.1转子在4℃下112000g超速离心浓缩60分钟，在无血清的DMEM培养基中重悬，并在-80℃下冷冻在几个等分小瓶中。

实施例5.CAR-T细胞

PBMC以1×10⁶细胞/ml的密度悬浮于含有10％FBS和10ng/ml IL-2(赛默飞世尔)的AIM V-Albummax培养基(赛默飞世尔)中，并通过在未处理的24孔板(每孔0.5ml)中与等量的CD3/CD28 Dynabeads(赛默飞世尔)混合以激活。在24小时和48小时，将慢病毒以5-10的感染倍数(MOI)加入培养物。T细胞和CAR-T细胞增殖10～12天以上，每3天更换一次培养基，使细胞密度维持在1～2×10⁶细胞/ml。

实施例6.流式细胞术(FACS)

首先，将25万个细胞悬浮在100μL缓冲液(含2mM EDTA pH 8和0.5％BSA的PBS)中，并与1μL人血清一起在冰上孵育10分钟。将稀释的一抗与细胞在4℃下作用30分钟，洗涤后，加入偶联生物素的山羊抗鼠F(ab)'₂与CD3-别藻蓝蛋白(APC)偶联的鼠抗人CD3抗体和1:100稀释的PE偶联的链霉亲和素，在4℃孵育30min。用3毫升洗涤液冲洗细胞，然后用7-AAD染色10分钟，悬浮于FACS缓冲液中，在流式细胞仪(BD生物科学)上进行分析。首先对细胞进行光散射与7-AAD染色的门控，然后将7-AAD-活门控细胞绘制为抗CD3染色与用抗(Fab)₂抗体的CAR+染色。

实施例7.实时细胞毒性测定(RTCA)

使用基于阻抗的实时细胞分析(RTCA)xCELLigence系统(Acea生物科学)，将贴壁靶细胞(CHO-CS1；CHO；Hela-CS1或Hela)(1×10⁴个细胞每孔)接种到96孔E-板(Acea生物科学，加利福尼亚州，圣地亚哥)中。次日，去除培养基并更换为含有10％FBS±1x10⁵效应细胞(CAR-T细胞或非转导T细胞)的AIM V-AlbuMAX培养基，一式三份。使用RTCA系统再监测细胞24-48小时，并绘制阻抗随时间变化的图。细胞溶解以(无效应细胞的靶细胞阻抗减去有效应细胞的靶细胞阻抗)×100/无效应细胞的靶细胞阻抗来计算。

实施例8.IFN-γ分泌试验

非贴壁靶细胞(Raji、MM1S、K562)与效应细胞(CAR-T细胞或非转导T细胞)以1:1(每个1×10⁴细胞)的比例在含有200μl的含10％FBS的AIM V-Albummax培养基的U底96孔板中培养，一式三份。16小时后，将顶部150μl培养基转移到V底96孔板，300g离心5分钟以沉淀任何残留细胞。将顶部120μl上清液转移到新的96孔板中，并根据制造商的方法，使用R&DSystems(明尼苏达州，明尼阿波利斯)的试剂盒，通过ELISA分析人类IFN-γ水平。收集贴壁靶细胞RTCA后的上清，分析方法如上。

实施例9.NSG小鼠肿瘤异种移植模型及成像

6周龄雄性NSG小鼠(杰克逊实验室，缅因州巴尔港)按照机构动物护理和使用委员会(IACUC)的规定饲养。每只小鼠于第0天皮下注射100μL无血清培养基中的1.5×10⁶的MM1S-荧光素酶阳性细胞。第二天静脉注射无血清培养基中的1×10⁷个CAR-T细胞。荧光素注射后用异种Ivis系统进行成像。通过测量光子/秒信号中的生物发光(BLI)来进行定量。基于小鼠生存数据，用GraphPad Prism软件绘制Kaplan-Myer生存曲线。

实施例10.统计分析

数据用Prism软件(GraphPad，加利福尼亚州，圣地亚哥)进行分析。两组之间的比较采用非配对Student'st检验；多组间的比较采用单或双向方差分析，然后进行Sidak或Dunnett检验。P值<0.05被认为具有显著性。

序列

实施例11.小鼠CS1 scFv序列

VH、VL和ScFv序列。通过对CS1阳性杂交瘤克隆之一的7A8D5进行测序，获得CS1scFv。CS1 scFv的结构为：VH-接头-VL。

小鼠CS1 scFv序列(克隆7A8D5)的核苷酸序列如下所示。粗体突出显示了V_H的核苷酸序列；下划线突出显示了V_L的核苷酸序列；中间(斜体字体显示)是编码接头的核苷酸序列。

CS1 scFv蛋白，氨基酸序列(SEQ ID NO:3)。

在所述蛋白中，粗体突出显示了V_H的氨基酸序列；下划线突出显示了V_L的氨基序列；中间(斜体)为3×G4S接头序列的氨基酸序列。

CS1 VH，氨基酸序列(SEQ ID NO:4)：

VQLQQSGPEVVRPGVSVKISCKGSGYTFTDYAIHWVKQSHAKSLEWIGVINTYNGNTNYNQKFKGKATMTVDKSSSTAYMELARLTSEDSAIYYCTRTGYYYGPSHYFDYWGQGTTLTVSS

CS1 VL，氨基酸序列(SEQ ID NO:5)

DIVLTQSPASLTVSLGQRATMSCRASKSVSTSGYSYVHWYQQKPGQPPKLLIYLASNLESGVPARFSAS GSGTDFTLNIHPVEEEDAATYYCQHSRELPWTFGGGTKLEIKR

接头氨基酸序列为3xG4S(SEQ ID NO：6)

GGGGSGGGGSGGGGS

实施例12.CS1-CAR序列(PMC418)

CS1-CAR构建体的方案如图3所示。用带有MNDU3启动子的慢病毒载体克隆了所有scFv CAR序列。

以下核苷酸序列显示了本发明的CS1 ScFv-CD8铰链-TM28-CD28-CD3 zeta。该结构包括人CD8信号肽，CS1 scFv(V_H-接头3x(G4S)-V_L),CD8铰链，CD28跨膜结构域和CD3 Zeta激活结构域。类似的CAR结构也使用了4-1BB结构域而不是CD28结构域(图3)。

CS1 scFv(V_H-接头-VL)-CD8铰链CD28 TM-CD28-CD3-zeta：

<CD8前导>

核苷酸序列，SEQ ID NO:7

ATGGCCTTACCAGTGACCGCCTTGCTCCTGCCGCTGGCCTTGCTGCTCCACGCCGCCAGGCCG

氨基酸序列，SEQ ID NO:8

MALPVTALLLPLALLLHAARP

核苷酸序列

gctagc

氨基酸序列

AS

参见实施例11。

<XhoI限制性位点>

核苷酸序列

CTCGAG

氨基酸序列

LE

<CD8铰链>

核苷酸序列，SEQ ID NO:9

AAGCCCACCACGACGCCAGCGCCGCGACCACCAACACCGGCGCCCACCATCGCGTCGCAGCCCCTGTCCCTGCGCCCAGAGGCGAGCCGGCCAGCGGCGGGGGGCGCAGTGCACACGAGGGGGCTGGACTTCGCCAGTGAT

氨基酸序列，SEQ ID NO:10

KPTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEASRPAAGGAVHTRGLDFASD

<间隔>

核苷酸序列

aagccc

氨基酸序列

KP

核苷酸序列，SEQ ID NO:11

Ttttgggtgctggtggtggttggtggagtcctggcttgctatagcttgctagtaacagtggcctttattattttctgggtg

氨基酸序列，SEQ ID NO:12

FWVLVVVGGVLACYSLLVTVAFIIFWV

<CD28激活>

核苷酸序列，SEQ ID NO:13

aggagtaagaggagcaggctcctgcacagtgactacatgaacatgactccccgccgccccgggcccacccgcaagcattaccagccctatgccccaccacgcgacttcgcagcctatcgctcc

氨基酸序列，SEQ ID NO:14

RSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRS

核苷酸序列，SEQ ID NO:15

AGAGTGAAGTTCAGCAGGAGCGCAGACGCCCCCGCGTACCAGCAGGGCCAGAACCAGCTCTATAACGAGCTCAATCTAGGACGAAGAGAGGAGTACGATGTTTTGGACAAGAGACGTGGCCGGGACCCTGAGATGGGGGGAAAGCCGCAGAGAAGGAAGAACCCTCAGGAAGGCCTGTACAATGAACTGCAGAAAGATAAGATGGCGGAGGCCTACAGTGAGATTGGGATGAAAGGCGAGCGCCGGAGGGGCAAGGGGCACGATGGCCTTTACCAGGGTCTCAGTACAGCCACCAAGGACACCTACGACGCCCTTCACATGCAGGCCCTGCCCCCTCGCTAA

氨基酸序列，SEQ ID NO:16

RVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPQRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR

全长CS1-CAR的核苷酸序列如下所示(CS1 scFV位于下划线标记的Nhe I和Xho I位点之间)。

ATGGCCTTACCAGTGACCGCCTTGCTCCTGCCGCTGGCCTTGCTGCTCCACGCCGCCAGGCCGgctagc

GTC CAA CTT CAG CAG TCC GGG CCG GAA GTC GTA CGA CCG GGA GTC AGC GTCAAG ATA AGC TGT AAA GGCTCT GGC TAT ACT TTC ACC GAC TAT GCT ATA CAC TGG GTCAAG CAA TCT CAT GCC AAA TCA CTG GAG TGGATT GGG GTC ATT AAT ACG TAC AAC GGGAAC ACT AAC TAC AAT CAA AAA TTT AAG GGT AAG GCC ACT ATGACG GTA GAT AAA AGTAGT TCA ACG GCC TAC ATG GAG CTT GCG CGG TTG ACT AGT GAA GAT AGT GCG ATATATTAC TGC ACT AGA ACA GGC TAT TAT TAT GGC CCT TCT CAC TAC TTC GAC TAT TGG GGGCAG GGT ACGACG TTG ACC GTT AGC TCT GGA GGT GGG GGC TCC GGT GGA GGT GGA TCAGGG GGT GGA GGG AGC GAT ATTGTG CTC ACA CAA TCA CCG GCA TCC TTG ACT GTT TCCCTT GGT CAA AGA GCT ACA ATG TCA TGC AGG GCCAGT AAA TCA GTC TCT ACT TCA GGATAT AGC TAC GTG CAC TGG TAT CAA CAA AAA CCG GGG CAG CCA CCTAAG TTG CTG ATATAT CTG GCC AGC AAC TTG GAG TCT GGT GTG CCA GCC CGC TTT TCC GCG TCC GGTTCAGGA ACA GAC TTT ACC CTT AAC ATA CAT CCC GTC GAG GAA GAG GAT GCA GCT ACTTAT TAT TGC CAG CACAGC CGG GAG TTG CCC TGG ACC TTT GGT GGG GGT ACG AAA TTGGAG ATA AAG CGGctcgagAAGCCCACCACGACGCCAGCGCCGCGACCACCAACACCGGCGCCCACCATCGCGTCGCAGCCCCTGTCCCTGCGCCCAGAGGCGAGCCGGCCAGCGGCGGGGGGCGCAGTGCACACGAGGGGGCTGGACTTCGCCAGTGATaagcccttttgggtgctggtggtggttggtggagtcctggcttgctatagcttgctagtaacagtggcctttattattttctgggtgaggagtaagaggagcaggctcctgcacagtgactacatgaacatgactccccgccgccccgggcccacccgcaagcattaccagccctatgccccaccacgcgacttcgcagcctatcgctccAGAGTGAAGTTCAGCAGGAGCGCAGACGCCCCCGCGTACCAGCAGGGCCAGAACCAGCTCTATAACGAGCTCAATCTAGGACGAAGAGAGGAGTACGATGTTTTGGACAAGAGACGTGGCCGGGACCCTGAGATGGGGGGAAAGCCGCAGAGAAGGAAGAACCCTCAGGAAGGCCTGTACAATGAACTGCAGAAAGATAAGATGGCGGAGGCCTACAGTGAGATTGGGATGAAAGGCGAGCGCCGGAGGGGCAAGGGGCACGATGGCCTTTACCAGGGTCTCAGTACAGCCACCAAGGACACCTACGACGCCCTTCACATGCAGGCCCTGCCCCCTCGCTAA(SEQ ID NO:17)

CS1-CD28-CAR蛋白的翻译氨基酸序列如下所示。VH加粗标记，VL加下划线标记。

实施例13.带有41BB的CS1-CAR序列(PMC717)

与实施例12类似，在MNDU3启动子下用41BB替代CD28共刺激结构域制备CAR(PMC717)：

CS1 CAR(PMC717)的核苷酸序列，SEQ ID NO:19

ATGGCCTTACCAGTGACCGCCTTGCTCCTGCCGCTGGCCTTGCTGCTCCACGCCGCCAGGCCGgctagc

GTC CAA CTT CAG CAG TCC GGG CCG GAA GTC GTA CGA CCG GGA GTC AGC GTCAAG ATA AGC TGT AAA GGCTCT GGC TAT ACT TTC ACC GAC TAT GCT ATA CAC TGG GTCAAG CAA TCT CAT GCC AAA TCA CTG GAG TGGATT GGG GTC ATT AAT ACG TAC AAC GGGAAC ACT AAC TAC AAT CAA AAA TTT AAG GGT AAG GCC ACT ATGACG GTA GAT AAA AGTAGT TCA ACG GCC TAC ATG GAG CTT GCG CGG TTG ACT AGT GAA GAT AGT GCG ATATATTAC TGC ACT AGA ACA GGC TAT TAT TAT GGC CCT TCT CAC TAC TTC GAC TAT TGG GGGCAG GGT ACGACG TTG ACC GTT AGC TCT GGA GGT GGG GGC TCC GGT GGA GGT GGA TCAGGG GGT GGA GGG AGC GAT ATTGTG CTC ACA CAA TCA CCG GCA TCC TTG ACT GTT TCCCTT GGT CAA AGA GCT ACA ATG TCA TGC AGG GCCAGT AAA TCA GTC TCT ACT TCA GGATAT AGC TAC GTG CAC TGG TAT CAA CAA AAA CCG GGG CAG CCA CCTAAG TTG CTG ATATAT CTG GCC AGC AAC TTG GAG TCT GGT GTG CCA GCC CGC TTT TCC GCG TCC GGTTCAGGA ACA GAC TTT ACC CTT AAC ATA CAT CCC GTC GAG GAA GAG GAT GCA GCT ACTTAT TAT TGC CAG CACAGC CGG GAG TTG CCC TGG ACC TTT GGT GGG GGT ACG AAA TTGGAG ATA AAGCGGctcgagAAGCCCACCACGACGCCAGCGCCGCGACCACCAACACCGGCGCCCACCATCGCGTCGCAGCCCCTGTCCCTGCGCCCAGAGGCGAGCCGGCCAGCGGCGGGGGGCGCAGTGCACACGAGGGGGCTGGACTTCGCCAGTGATaagcccttttgggtgctggtggtggttggtggagtcctggcttgctatagcttgctagtaacagtggcctttattattttctgggtgAAACGGGGCAGAAAGAAACTCCTGTATATATTCAAACAACCATTTATGAGACCAGTACAAACTACTCAAGAGGAAGATGGCTGTAGCTGCCGATTTCCAGAAGAAGAAGAAGGAGGATGTGAACTGAGAGTGAAGTTCAGCAGGAGCGCAGACGCCCCCGCGTACCAGCAGGGCCAGAACCAGCTCTATAACGAGCTCAATCTAGGACGAAGAGAGGAGTACGATGTTTTGGACAAGAGACGTGGCCGGGACCCTGAGATGGGGGGAAAGCCGCAGAGAAGGAAGAACCCTCAGGAAGGCCTGTACAATGAACTGCAGAAAGATAAGATGGCGGAGGCCTACAGTGAGATTGGGATGAAAGGCGAGCGCCGGAGGGGCAAGGGGCACGATGGCCTTTACCAGGGTCTCAGTACAGCCACCAAGGACACCTACGACGCCCTTCACATGCAGGCCCTGCCCCCTCGCTAA

CS1 CAR(PMC717)的氨基酸序列中，scFv为粗体标记；41BB为粗体加下划线标记。

结果

实施例14.CS1抗体通过FACS检测多发性骨髓瘤细胞和稳定的CHO-CS1细胞中的CS1蛋白

我们建立了针对CS1胞外区的杂交瘤克隆，并筛选出与CS1抗原特异性结合的最佳克隆。蛋白质印迹证明选定的CS1克隆7A8D5与纯化的分子量为55kDa的CS1胞外结构域结合。

ELISA显示CS1抗体(克隆7A8D5)与CS1胞外结构域蛋白有很强的特异性结合，但与阴性对照蛋白没有结合(图5)。FACS染色检测多发性骨髓瘤细胞系RPMI8226和MM1S中CS1抗体与胞外CS1蛋白的结合(图6)。

我们在CHO-CS1细胞上进行了CS1抗体(克隆7A8D5)的结合滴定(图7)。CS1抗体结合的Kd为5.3nM。

免疫组化染色(IHC)显示CS1抗体不染色正常和肿瘤标本，但淋巴腺组织和肝脏除外(数据现已显示)。因此，CS1抗体(克隆7A8D5)以良好的亲和力和特异性与CS1结合。

实施例15.CS1-CD28-CD3 CAR-T细胞表达CS1 ScFv

在EF-1启动子慢病毒载体下插入带有CD28共刺激和CD3 zeta激活结构域的CS1scFv(克隆7A8D5)序列；然后将CAR慢病毒转导入T细胞。CS1-CAR细胞在体外得到有效扩增。使用来自细胞内蛋白质的scFv产生模拟对照，并用作细胞毒性和细胞因子测定中的阴性对照。用鼠FAB抗体通过FACS检测CS1-CAR⁺细胞(21％的CAR阳性细胞用鼠FAB抗体检出)(图8)。

实施例16.CS1-CAR-T细胞对CHO-CS1细胞分泌高水平的干扰素γ

将CS1-CAR-T细胞(PMC418)与CHO-CS1稳定细胞系和CHO-CD22细胞(CS1阴性)共同孵育，进行IFN-γELISA试验(图9)。

实施例17.MNDU3启动子下的CS1克隆7A8D5-CD28-CD3 CAR-T细胞(PMC622)有更高的CAR+细胞表达

文献中已显示MNDU3启动子导致CAR阳性细胞的表达高于EF1启动子。我们将PMC418-CAR重新克隆到MNDU3启动子慢病毒载体中，并检测CAR的表达和CAR-T细胞(PMC622)的活性。转导CS1-CAR-T细胞(PMC622)后，用抗鼠FAB抗体通过FACS检测到>97％的CAR阳性T细胞(图10)。

实施例18.PMC622 CAR-T细胞对CS1阳性靶细胞的细胞毒活性

PMC622 CS1-CD28-CD3 CAR-T细胞特异性杀伤CHO-CS1细胞(图11A)，但不杀伤阴性对照CHO细胞(图11B)。观察到CS1-CAR-T细胞对Hela-CS1细胞具有相同的高杀伤活性(图12A)，但对阴性对照Hela细胞则没有(图12B)。

实施例19.CS1-CD28-CD3-CAR-T(PMC622)细胞分泌IFN-γ

PMC622 CS1-CAR-T细胞针对靶CHO-CS1细胞分泌高水平的IFN-γ，但针对CHO细胞则不分泌(图13A)。针对Hela-CS1细胞观察到相同的高特异性IFN-γ分泌(图13B)。

实施例20.CS1-41BB-CD3 CAR-T细胞(PMC717)杀伤CS1阳性靶细胞

我们还克隆了带有41BB共刺激结构域的CS1-41BB-CD3 CAR，所述CAR在MNDU3启动子下(PMC717)，如图3所示。转导T细胞后，通过FACS显示高比例的CS1-41BB-CD3 CAR阳性细胞(>90％)(图14)。

我们用CS1阳性的Hela-CS1靶细胞进行细胞毒性试验(图15)。

CS1-41BB-CD3杀伤CS1阳性细胞(图15)，但不杀伤Hela-BCMA(CS1阴性细胞)(未显示)。

实施例21.CS1-41BB-CD3 CAR T细胞(PMC717)针对CS1阳性细胞分泌IFN-γ

CS1-41BB-CD3 CAR-T细胞(PMC717)针对CS1阳性细胞分泌高水平的IFN-γ(图16)。

实施例22.用CS1 CAR-T细胞治疗延长了小鼠的存活时间

在注射MM1S细胞后的第二天，我们将CS1-CAR-T细胞(PMC717)注射到NSG小鼠中，并测试CS1-CAR-T处理小鼠相对于模拟对照细胞的存活率(图17)。CS1-CAR-T细胞延长了NSG小鼠相对于对照小鼠的存活时间(图17)。CS1 CAR-T细胞平均存活时间为82.4天，明显长于对照模拟CAR-T细胞的67天和PBS处理组的57.2天(p<0.05)。

参考文献

[1]S.A.Grupp,M.Kalos,D.Barrett,R.Aplenc,D.L.Porter,S.R.Rheingold,D.T.Teachey,A.Chew,B.Hauck,J.F.Wright,M.C.Milone,B.L.Levine,和C.H.June,嵌合抗原受体修饰的T细胞治疗急性淋巴细胞白血病(Chimeric antigen receptor-modified Tcells for acute lymphoid leukemia).N Engl J Med 368(2013)1509-18.

[2]M.V.Maus,A.R.Haas,G.L.Beatty,S.M.Albelda,B.L.Levine,X.Liu,Y.Zhao,M.Kalos,和C.H.June,表达嵌合抗原受体的T细胞可引起人类过敏反应(T cellsexpressing chimeric antigen receptors can cause anaphylaxis in humans).CancerImmunol Res 1(2013)26-31.

[3]M.V.Maus,S.A.Grupp,D.L.Porter,和C.H.June,抗体修饰的T细胞：CAR在血液系统恶性肿瘤中占据领先地位(Antibody-modified T cells:CARs take the front seatfor hematologic malignancies).Blood 123(2014)2625-35.

[4]V.Golubovskaya,和L.Wu,T细胞的不同亚群、记忆、效应子功能和CAR-T免疫疗法(Different Subsets of T Cells,Memory,Effector Functions,and CAR-TImmunotherapy).Cancers(Basel)8(2016).

[5]R.Berahovich,H.Zhou,S.Xu,Y.Wei,J.Guan,J.Guan,H.Harto,S.Fu,K.Yang,S.Zhu,L.Li,L.Wu,和V.Golubovskaya,基于新型BCMA单克隆抗体的CAR-T细胞阻断多发性骨髓瘤细胞生长(CAR-T Cells Based on Novel BCMA Monoclonal Antibody BlockMultiple Myeloma Cell Growth).Cancers(Basel)10(2018).

序列表

<110> 武汉思安医疗技术有限公司

<120> CS1-抗体和抗CS1-CAR-T细胞

<130> P2021-0507

<150> 63/061,912

<151> 2020-08-06

<160> 20

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 335

<212> PRT

<213> 智人(Homo sapiens)

<400> 1

Met Ala Gly Ser Pro Thr Cys Leu Thr Leu Ile Tyr Ile Leu Trp Gln

1 5 10 15

Leu Thr Gly Ser Ala Ala Ser Gly Pro Val Lys Glu Leu Val Gly Ser

20 25 30

Val Gly Gly Ala Val Thr Phe Pro Leu Lys Ser Lys Val Lys Gln Val

35 40 45

Asp Ser Ile Val Trp Thr Phe Asn Thr Thr Pro Leu Val Thr Ile Gln

50 55 60

Pro Glu Gly Gly Thr Ile Ile Val Thr Gln Asn Arg Asn Arg Glu Arg

65 70 75 80

Val Asp Phe Pro Asp Gly Gly Tyr Ser Leu Lys Leu Ser Lys Leu Lys

85 90 95

Lys Asn Asp Ser Gly Ile Tyr Tyr Val Gly Ile Tyr Ser Ser Ser Leu

100 105 110

Gln Gln Pro Ser Thr Gln Glu Tyr Val Leu His Val Tyr Glu His Leu

115 120 125

Ser Lys Pro Lys Val Thr Met Gly Leu Gln Ser Asn Lys Asn Gly Thr

130 135 140

Cys Val Thr Asn Leu Thr Cys Cys Met Glu His Gly Glu Glu Asp Val

145 150 155 160

Ile Tyr Thr Trp Lys Ala Leu Gly Gln Ala Ala Asn Glu Ser His Asn

165 170 175

Gly Ser Ile Leu Pro Ile Ser Trp Arg Trp Gly Glu Ser Asp Met Thr

180 185 190

Phe Ile Cys Val Ala Arg Asn Pro Val Ser Arg Asn Phe Ser Ser Pro

195 200 205

Ile Leu Ala Arg Lys Leu Cys Glu Gly Ala Ala Asp Asp Pro Asp Ser

210 215 220

Ser Met Val Leu Leu Cys Leu Leu Leu Val Pro Leu Leu Leu Ser Leu

225 230 235 240

Phe Val Leu Gly Leu Phe Leu Trp Phe Leu Lys Arg Glu Arg Gln Glu

245 250 255

Glu Tyr Ile Glu Glu Lys Lys Arg Val Asp Ile Cys Arg Glu Thr Pro

260 265 270

Asn Ile Cys Pro His Ser Gly Glu Asn Thr Glu Tyr Asp Thr Ile Pro

275 280 285

His Thr Asn Arg Thr Ile Leu Lys Glu Asp Pro Ala Asn Thr Val Tyr

290 295 300

Ser Thr Val Glu Ile Pro Lys Lys Met Glu Asn Pro His Ser Leu Leu

305 310 315 320

Thr Met Pro Asp Thr Pro Arg Leu Phe Ala Tyr Glu Asn Val Ile

325 330 335

<210> 2

<211> 744

<212> DNA

<213> 小鼠(Mus musculus)

<400> 2

gtccaacttc agcagtccgg gccggaagtc gtacgaccgg gagtcagcgt caagataagc 60

tgtaaaggct ctggctatac tttcaccgac tatgctatac actgggtcaa gcaatctcat 120

gccaaatcac tggagtggat tggggtcatt aatacgtaca acgggaacac taactacaat 180

caaaaattta agggtaaggc cactatgacg gtagataaaa gtagttcaac ggcctacatg 240

gagcttgcgc ggttgactag tgaagatagt gcgatatatt actgcactag aacaggctat 300

tattatggcc cttctcacta cttcgactat tgggggcagg gtacgacgtt gaccgttagc 360

tctggaggtg ggggctccgg tggaggtgga tcagggggtg gagggagcga tattgtgctc 420

acacaatcac cggcatcctt gactgtttcc cttggtcaaa gagctacaat gtcatgcagg 480

gccagtaaat cagtctctac ttcaggatat agctacgtgc actggtatca acaaaaaccg 540

gggcagccac ctaagttgct gatatatctg gccagcaact tggagtctgg tgtgccagcc 600

cgcttttccg cgtccggttc aggaacagac tttaccctta acatacatcc cgtcgaggaa 660

gaggatgcag ctacttatta ttgccagcac agccgggagt tgccctggac ctttggtggg 720

ggtacgaaat tggagataaa gcgg 744

<210> 3

<211> 248

<212> PRT

<213> 小鼠(Mus musculus)

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Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Val Val Arg Pro Gly Val Ser

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Val Lys Ile Ser Cys Lys Gly Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr Ala

20 25 30

Ile His Trp Val Lys Gln Ser His Ala Lys Ser Leu Glu Trp Ile Gly

35 40 45

Val Ile Asn Thr Tyr Asn Gly Asn Thr Asn Tyr Asn Gln Lys Phe Lys

50 55 60

Gly Lys Ala Thr Met Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr Met

65 70 75 80

Glu Leu Ala Arg Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Ile Tyr Tyr Cys Thr

85 90 95

Arg Thr Gly Tyr Tyr Tyr Gly Pro Ser His Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly

100 105 110

Gln Gly Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly

115 120 125

Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro

130 135 140

Ala Ser Leu Thr Val Ser Leu Gly Gln Arg Ala Thr Met Ser Cys Arg

145 150 155 160

Ala Ser Lys Ser Val Ser Thr Ser Gly Tyr Ser Tyr Val His Trp Tyr

165 170 175

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<212> PRT

<213> 小鼠(Mus musculus)

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Ile His Trp Val Lys Gln Ser His Ala Lys Ser Leu Glu Trp Ile Gly

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Val Ile Asn Thr Tyr Asn Gly Asn Thr Asn Tyr Asn Gln Lys Phe Lys

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<212> PRT

<213> 小鼠(Mus musculus)

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Pro Val Glu Glu Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln His Ser Arg

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<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 合成的

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ccg 63

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<212> DNA

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cccctgtccc tgcgcccaga ggcgagccgg ccagcggcgg ggggcgcagt gcacacgagg 120

gggctggact tcgccagtga t 141

<210> 10

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<213> 智人(Homo sapiens)

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Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Ser Arg Pro Ala

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Ala Gly Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Ser Asp

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<210> 11

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<212> DNA

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ttttgggtgc tggtggtggt tggtggagtc ctggcttgct atagcttgct agtaacagtg 60

gcctttatta ttttctgggt g 81

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<213> 智人(Homo sapiens)

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<211> 123

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<400> 13

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gggcccaccc gcaagcatta ccagccctat gccccaccac gcgacttcgc agcctatcgc 120

tcc 123

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<211> 41

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aatgaactgc agaaagataa gatggcggag gcctacagtg agattgggat gaaaggcgag 240

cgccggaggg gcaaggggca cgatggcctt taccagggtc tcagtacagc caccaaggac 300

acctacgacg cccttcacat gcaggccctg ccccctcgct aa 342

<210> 16

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<213> 智人(Homo sapiens)

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ccggctagcg tccaacttca gcagtccggg ccggaagtcg tacgaccggg agtcagcgtc 120

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caatctcatg ccaaatcact ggagtggatt ggggtcatta atacgtacaa cgggaacact 240

aactacaatc aaaaatttaa gggtaaggcc actatgacgg tagataaaag tagttcaacg 300

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agaaggaaga accctcagga aggcctgtac aatgaactgc agaaagataa gatggcggag 1380

gcctacagtg agattgggat gaaaggcgag cgccggaggg gcaaggggca cgatggcctt 1440

taccagggtc tcagtacagc caccaaggac acctacgacg cccttcacat gcaggccctg 1500

ccccctcgct aa 1512

<210> 18

<211> 503

<212> PRT

<213> 小鼠(Mus musculus)

<400> 18

Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu

1 5 10 15

His Ala Ala Arg Pro Ala Ser Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu

20 25 30

Val Val Arg Pro Gly Val Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Gly Ser Gly

35 40 45

Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr Ala Ile His Trp Val Lys Gln Ser His Ala

50 55 60

Lys Ser Leu Glu Trp Ile Gly Val Ile Asn Thr Tyr Asn Gly Asn Thr

65 70 75 80

Asn Tyr Asn Gln Lys Phe Lys Gly Lys Ala Thr Met Thr Val Asp Lys

85 90 95

Ser Ser Ser Thr Ala Tyr Met Glu Leu Ala Arg Leu Thr Ser Glu Asp

100 105 110

Ser Ala Ile Tyr Tyr Cys Thr Arg Thr Gly Tyr Tyr Tyr Gly Pro Ser

115 120 125

His Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser

130 135 140

Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp

145 150 155 160

Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Thr Val Ser Leu Gly Gln

165 170 175

Arg Ala Thr Met Ser Cys Arg Ala Ser Lys Ser Val Ser Thr Ser Gly

180 185 190

Tyr Ser Tyr Val His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro Lys

195 200 205

Leu Leu Ile Tyr Leu Ala Ser Asn Leu Glu Ser Gly Val Pro Ala Arg

210 215 220

Phe Ser Ala Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Asn Ile His Pro

225 230 235 240

Val Glu Glu Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln His Ser Arg Glu

245 250 255

Leu Pro Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Leu

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Glu Lys Pro Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro

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Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Ser Arg Pro

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Ala Ala Gly Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Ser Asp

305 310 315 320

Lys Pro Phe Trp Val Leu Val Val Val Gly Gly Val Leu Ala Cys Tyr

325 330 335

Ser Leu Leu Val Thr Val Ala Phe Ile Ile Phe Trp Val Arg Ser Lys

340 345 350

Arg Ser Arg Leu Leu His Ser Asp Tyr Met Asn Met Thr Pro Arg Arg

355 360 365

Pro Gly Pro Thr Arg Lys His Tyr Gln Pro Tyr Ala Pro Pro Arg Asp

370 375 380

Phe Ala Ala Tyr Arg Ser Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala

385 390 395 400

Pro Ala Tyr Gln Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu

405 410 415

Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp

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Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Gln Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly

435 440 445

Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu

450 455 460

Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu

465 470 475 480

Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His

485 490 495

Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg

500

<210> 19

<211> 1515

<212> DNA

<213> 小鼠(Mus musculus)

<400> 19

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ccggctagcg tccaacttca gcagtccggg ccggaagtcg tacgaccggg agtcagcgtc 120

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caatctcatg ccaaatcact ggagtggatt ggggtcatta atacgtacaa cgggaacact 240

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gcctacatgg agcttgcgcg gttgactagt gaagatagtg cgatatatta ctgcactaga 360

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accgttagct ctggaggtgg gggctccggt ggaggtggat cagggggtgg agggagcgat 480

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aagccctttt gggtgctggt ggtggttggt ggagtcctgg cttgctatag cttgctagta 1020

acagtggcct ttattatttt ctgggtgaaa cggggcagaa agaaactcct gtatatattc 1080

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tttccagaag aagaagaagg aggatgtgaa ctgagagtga agttcagcag gagcgcagac 1200

gcccccgcgt accagcaggg ccagaaccag ctctataacg agctcaatct aggacgaaga 1260

gaggagtacg atgttttgga caagagacgt ggccgggacc ctgagatggg gggaaagccg 1320

cagagaagga agaaccctca ggaaggcctg tacaatgaac tgcagaaaga taagatggcg 1380

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ctttaccagg gtctcagtac agccaccaag gacacctacg acgcccttca catgcaggcc 1500

ctgccccctc gctaa 1515

<210> 20

<211> 504

<212> PRT

<213> 小鼠(Mus musculus)

<400> 20

Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu

1 5 10 15

His Ala Ala Arg Pro Ala Ser Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu

20 25 30

Val Val Arg Pro Gly Val Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Gly Ser Gly

35 40 45

Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr Ala Ile His Trp Val Lys Gln Ser His Ala

50 55 60

Lys Ser Leu Glu Trp Ile Gly Val Ile Asn Thr Tyr Asn Gly Asn Thr

65 70 75 80

Asn Tyr Asn Gln Lys Phe Lys Gly Lys Ala Thr Met Thr Val Asp Lys

85 90 95

Ser Ser Ser Thr Ala Tyr Met Glu Leu Ala Arg Leu Thr Ser Glu Asp

100 105 110

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115 120 125

His Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser

130 135 140

Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp

145 150 155 160

Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Thr Val Ser Leu Gly Gln

165 170 175

Arg Ala Thr Met Ser Cys Arg Ala Ser Lys Ser Val Ser Thr Ser Gly

180 185 190

Tyr Ser Tyr Val His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro Lys

195 200 205

Leu Leu Ile Tyr Leu Ala Ser Asn Leu Glu Ser Gly Val Pro Ala Arg

210 215 220

Phe Ser Ala Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Asn Ile His Pro

225 230 235 240

Val Glu Glu Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln His Ser Arg Glu

245 250 255

Leu Pro Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Leu

260 265 270

Glu Lys Pro Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro

275 280 285

Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Ser Arg Pro

290 295 300

Ala Ala Gly Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Ser Asp

305 310 315 320

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325 330 335

Ser Leu Leu Val Thr Val Ala Phe Ile Ile Phe Trp Val Lys Arg Gly

340 345 350

Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met Arg Pro Val

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Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu

485 490 495

His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg

500

Claims

1.一种抗人CS1单克隆抗体，其包含如SEQ ID NO:4所示氨基酸序列的V_H和如SEQ IDNO:5所示氨基酸序列的V_L。

2.一种抗人CS1的单链可变片段(scFv)，其包含如SEQ ID NO:4所示氨基酸序列的V_H和如SEQ ID NO:5所示氨基酸序列的V_L。

3.如权利要求2所述的scFv，其特征在于，所述scFv还包括在V_H和V_L之间的接头。

4.如权利要求3所述的scFv，其特征在于，所述scFv的结构为V_H-接头-V_L或V_L-接头-V_H。

5.如权利要求3所述的scFv，其氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示。

6.一种嵌合抗原受体融合蛋白，其从N-末端到C-末端包括：

(i)如权利要求2或5所述的scFv，

(ii)跨膜结构域，所述跨膜结构域为CD28跨膜结构域，

(iii)共刺激结构域，其中所述共刺激结构域是CD28或4-1BB共刺激结构域；以及

(iv)激活结构域，其中所述激活结构域为CD3zeta。

7.如权利要求6所述的嵌合抗原受体融合蛋白，其中所述共刺激结构域的氨基酸序列如SEQ ID NO:14所示。

8.如权利要求6所述的嵌合抗原受体融合蛋白，其中所述激活结构域的氨基酸序列如SEQ ID NO:16所示。

9.如权利要求6所述的嵌合抗原受体融合蛋白，其具有SEQ ID NO:18或20所示的氨基酸序列。

10.一种核酸，其编码如权利要求8或9所述的嵌合抗原受体融合蛋白。

11.一种T细胞或自然杀伤细胞，其被修饰以表达权利要求6所述的嵌合抗原受体融合蛋白。

12.一种治疗剂，其特征在于，所述治疗剂包含如权利要求1所述的抗人CS1单克隆抗体，或如权利要求11所述的T细胞或自然杀伤细胞。

13.如权利要求1所述的抗人CS1单克隆抗体在制备用于检测CS1阳性癌细胞的试剂中的用途，其中所述的CS1阳性癌细胞为多发性骨髓瘤细胞。

14.如权利要求1所述的抗人CS1单克隆抗体或如权利要求11所述的T细胞或自然杀伤细胞在制备用于治疗多发性骨髓瘤的治疗剂中的用途。