CN116082507B - 人源化bcma抗体和bcma-car-t细胞 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及人源化BCMA抗体或其抗原结合片段，其包含具有SEQ ID NO：3的氨基酸序列的VH和具有SEQ ID NO：5的氨基酸序列的VL。本发明还涉及包含从N端到C端：(i)本发明的单链可变片段(scFv)，(ii)跨膜结构域，(iii)至少一个共刺激结构域，和(iv)激活结构域的BCMA嵌合抗原受体融合蛋白。本发明的人源化BCMA‑CAR‑T细胞对BCMA阳性肿瘤细胞具有特异性杀伤活性。
Description
技术领域
本发明涉及人源化的BCMA抗体或抗原结合片段，以及特异性降低多发性骨髓瘤肿瘤生长的BCMA-CAR-T细胞，在肿瘤过继免疫基因治疗领域具有重要的应用价值。
背景技术
免疫疗法逐渐成为一种很有前景的癌症治疗方法。人体免疫系统的武器T细胞或T淋巴细胞，不断寻找外来抗原，并识别异常细胞(癌细胞或感染细胞)和正常细胞。用嵌合抗原受体(CAR)基因修饰T细胞是设计肿瘤特异性T细胞最常见的方法。将靶向肿瘤相关抗原(TAA)的CAR-T细胞注入患者体内(称为过继性细胞转移或ACT)已成为一种有效的免疫治疗手段[1,2]。与化疗或抗体疗法相比，CAR-T技术的优势在于其重新编程的T细胞可以在患者体内增殖并持续存在(“一种活的药物”)[1,2]。
CAR通常由单克隆抗体N端部分衍生的单链可变片段(scFv)，铰链区，跨膜结构域和若干细胞内共刺激结构域组成：(i)CD28，(ii)CD137(4-1BB)，CD27或其他共刺激结构域，与激活的CD3-ζ结构域串联(图1)。CAR结构从第一代(无共刺激结构域)演化到第二代(有一个共刺激结构域)再演化到第三代(有多个共刺激结构域)。具有两个共刺激结构域的CAR(即第三代CAR)可以增加CAR-T细胞毒活性，提高CAR-T细胞的持久性，从而增强其抗肿瘤活性。
BCMA
B细胞成熟抗原(BCMA)是一种细胞表面受体，又称CD269，由肿瘤坏死因子受体超家族成员17(tumor necrosis factor receptor superfamily member 17，TNFRSF17)基因编码。BCMA主要在成熟B淋巴细胞中表达，大多数情况下在多发性骨髓瘤(MM)中过表达[4]。目前靶向BCMA治疗MM的疗法包括单克隆抗体、双特异性抗体和T细胞免疫疗法、CAR-T疗法[4,5]。
人BCMA蛋白由184个氨基酸组成：1-54胞外结构域；55-77跨膜结构域；78-184胞浆结构域。BCMA的氨基酸序列如图2所示。其序列具体如下(SEQ ID NO：1)：
BCMA缺乏信号肽，类似于其他受体比如BAFF受体、跨膜激活剂、亲环素配体相互作用剂和钙调节剂(TACI)[4]。这些受体在B细胞成熟和分化为浆细胞中起主要作用。其配体包括BAFF和APRIL，在MM患者中表达增高[4]。
发明内容
本发明是以美国专利US 63/365,562号申请为优先权基础，该美国专利的全部内容均引入到本发明中。
定义
如本文所使用，“嵌合抗原受体(CAR)”是一种受体蛋白，经过改造使T细胞具有靶向特定蛋白的新能力。这种受体是嵌合的，因为它们将抗原结合和T细胞激活功能结合到一个受体中。CAR是一种融合蛋白，包含能够与抗原结合的胞外结构域、跨膜结构域和至少一个胞内结构域。“CAR”有时被称为“嵌合受体”、“T体”或“嵌合免疫受体(CIR)”。“能够结合抗原的胞外结构域”是指能够结合某一抗原的任何寡肽或多肽。“胞内结构域”是指已知的可传递信号以引起细胞内生物过程激活或抑制的任何寡肽或多肽。
如本文所使用，“结构域”指在多肽中被折叠成独立于其他区域的特定结构的一个区域。
如本文所使用，“人源化抗体”指衍生自非人类物种的抗体，其蛋白质序列已经过修饰，以增加其与人类自然产生的抗体变体的相似性。例如，在开发出一种小鼠抗体后，可以对该抗体的DNA编码序列进行测序。随后可测定对应于抗体CDRs的DNA序列。CDR序列可以插入到含有人抗体变体DNA的构建物中，以制备人源化抗体。
如本文所使用，“单链可变片段(scFv)”指衍生自保留与抗原结合能力的抗体的单链多肽。scFv的一个示例包括通过重组DNA技术形成的抗体多肽，其中免疫球蛋白重链(H链)和轻链(L链)片段的Fv区域通过间隔序列连接。用于设计scFv的各种方法为本领域技术人员已知。
如本文所使用，“肿瘤抗原”指具有抗原性的生物分子，其表达可引起癌症。
本发明人从小鼠单克隆抗体(克隆4C8A)的重链和轻链可变区开始设计人源化BCMA scFv。小鼠4C8A抗体与人BCMA呈强选择性结合[6]。
本发明提供人源化单克隆抗人BCMA抗体(PM 307)或其抗原结合片段，例如Fab、Fab′、F(ab′)2、Fv片段和单链可变片段scFv，其通过测序和人源化小鼠单克隆抗BCMA抗体(杂交瘤克隆4C8A[6])获得。人源化抗人BCMA抗体由含有SEQ ID NO：3所示氨基酸的人源化VH和含有SEQ ID NO：5所示氨基酸的人源化VL组成。在一个实施例中，本发明系针对人源化抗人BCMA单链可变片段(scFv)。scFv可以是VH-接头-VL或VL-接头-VH。
本发明还涉及一种嵌合抗原受体融合蛋白，其从N端到C端包括：(i)抗BCMA的单链可变片段(scFv)，其中VH具有SEQ ID NO 3所示的氨基酸序列，VL具有SEQ ID NO：5所示的氨基酸序列，(ii)跨膜结构域，(iii)至少一个共刺激结构域，和(iv)激活结构域。
本发明人已生成了基于人源化BCMA抗体的BCMA-CAR-T细胞，用于靶向过表达BCMA肿瘤抗原的癌细胞。本发明BCMA-CAR-T细胞对多种癌细胞系具有高细胞毒活性。
在一个实施例中，CAR结构示于图3中。
在一个实施例中，共刺激结构域从由CD28、4-1BB、GITR、ICOS-1、CD27、OX-40和DAP10组成的组中选择。首选共刺激结构域是CD28。
首选激活结构域是CD3δ(CD3Z或CD3δ)
跨膜结构域可能来自天然多肽，也可能是人为设计的。衍生自天然多肽的跨膜结构域可从任何膜结合蛋白或跨膜蛋白获得。例如，T细胞受体α或β链的跨膜结构域、CD3δ链、CD28、CD3ε、CD45、CD4、CD5、CD8、CD9、CD16、CD22、CD33、CD37、CD64、CD80、CD86、CD134、CD137、ICOS、CD154或GITR。人工设计的跨膜结构域是由亮氨酸和缬氨酸等疏水残基组成的多肽。优选在合成跨膜结构域的每一端发现苯丙氨酸、色氨酸和缬氨酸的三联体。任选地，可将短寡肽接头或多肽接头(例如，具有2到10个氨基酸长度的连接子)安排在跨膜结构域与胞内结构域之间。在一个实施例中，可使用具有甘氨酸-丝氨酸连续序列的接头序列。
本发明提供编码BCMA-CAR的核苷酸序列。可通过常规方法从特定CAR的氨基酸序列制备编码CAR的核酸。对于每个结构域的氨基酸序列，可从NCBI RefSeq id或GenBank的登录号获得编码氨基酸序列的碱基序列，并且可使用标准分子生物学和/或化学程序制备本发明的核酸。例如，基于该碱基序列，可合成核酸，且本发明的核酸可通过组合利用聚合酶链反应(PCR)从cDNA文库获得的DNA片段来制备。
可将编码本发明CAR的核酸插入载体中，并且可将载体引入细胞中。例如，可使用病毒载体，如逆转录病毒载体(包括癌逆转录病毒载体、慢病毒载体和伪型载体)、腺病毒载体、腺相关病毒(AAV)载体、猿猴病毒载体、痘苗病毒载体或仙台病毒载体、EB病毒(EBV)载体和HSV载体。优选使用缺乏复制能力以便不在受感染细胞中自我复制的病毒载体。
例如，当使用逆转录病毒载体时，可选择基于LTR序列的适宜包装细胞和载体所拥有的包装信号序列用于使用包装细胞制备逆转录病毒颗粒。包装单元的示例包括PG13(ATCC CRL-10686)、PA317(ATCC CRL-9078)、GP+E-86和GP+envAm-12以及Psi-Crip。亦可使用具有高转染效率的293细胞或293T细胞来制备逆转录病毒粒子。基于可用于包装逆转录病毒载体的逆转录病毒载体和包装细胞所生产的多种逆转录病毒载体可从许多公司广泛购得。
CAR-T细胞通过CAR与特异性抗原结合，从而将信号传递到细胞内，最终细胞被激活。表达CAR的细胞的激活取决于宿主细胞的种类和CAR的胞内结构域，并可以基于，例如细胞因子的释放，细胞增殖率的提高，细胞表面分子的变化，或诸如此类的指标来确认。例如，活化细胞释放细胞毒性细胞因子(肿瘤坏死因子、淋巴毒素等)导致表达抗原的靶细胞破坏。此外，细胞因子的释放或细胞表面分子的变化会刺激其他免疫细胞，例如B细胞、树突状细胞、NK细胞和巨噬细胞。
表达CAR的细胞可用作疾病的治疗剂。治疗剂包含作为活性成分表达CAR的细胞，并且其可进一步包含适宜的赋形剂。
本发明人基于特异性靶向BCMA的人源化BCMA scFv序列制备了CAR-T细胞。发明人制备了人源化BCMA-CAR-T细胞，用于靶向过表达BCMA肿瘤抗原的癌细胞。本发明的人源化BCMA-CAR-T细胞靶向多发性骨髓瘤癌细胞分泌高水平的细胞因子并杀伤CHO-BCMA阳性靶细胞，但不杀伤对照亲本CHO细胞。
本发明人源化BCMA-scFv相对于相应小鼠scFv的优点包括人源化BCMA scFv序列对人的免疫原性较低。因此，本发明的人源化BCMA抗体作为治疗剂在许多临床应用中具有很强的疗效和优势。
本发明人源化BCMA scFv可用于免疫治疗：毒素/药物偶联抗体、单克隆治疗性抗体和CAR-T细胞免疫治疗。
基于本发明人源化BCMA scFv的人源化BCMA-CAR-T细胞可有效靶向BCMA阳性癌细胞系，如：卵巢癌、结肠癌、胰腺癌、黑色素瘤、宫颈癌和其他BCMA阳性肿瘤细胞系中的BCMA抗原。
人源化BCMA-CAR-T细胞可与不同的化疗联合使用：检查点抑制剂、靶向疗法、小分子抑制剂和抗体。
人源化BCMA-CAR-T细胞可用于临床治疗BCMA阳性癌细胞。
共刺激结构域如CD28、4-1BB等的修饰可用于提高CAR-T细胞的疗效。标签偶联的人源化BCMA scFv可用于CAR的制备。
人源化BCMA-CAR-T细胞可与t-EGFR、RQR(利妥昔单抗-CD34-利妥昔单抗)、可诱导型caspase-9等不同的安全开关一起使用。
第三代CAR-T或其他共激活信号域可与人源化BCMA-scFv同用制备BCMA-CAR-T。
人源化BCMA-CAR可与靶向其他肿瘤抗原或肿瘤微环境的CAR，如VEGFR-1-3、PDL-1等结合。可产生针对BCMA和CD3或其他抗原的双特异性抗体用于治疗。
人源化BCMA-CAR可用于生成其他类型的细胞，如CAR-自然杀伤(NK)细胞、BCMA-CAR-巨噬细胞、同种异体CAR-T细胞、基因编辑T细胞和其他BCMA-CAR造血细胞，这些细胞可靶向BCMA阳性癌症。
本发明提供经修饰以表达BCMA-CAR的T细胞、NK细胞、巨噬细胞或造血细胞。
BCMA-CAR-T细胞可用于治疗对化疗最耐药并形成侵袭性肿瘤的肿瘤干细胞和循环肿瘤干细胞。
BCMA-CAR-T细胞、BCMA-NK细胞、BCMA-巨噬细胞和其他细胞可用于靶向不同类型的癌症。
BCMA-CAR-T细胞可通过瘤内递送给患者，从而提高安全性。
附图说明
图1显示CAR结构示意图[3]，左边是第一代CAR结构(无共刺激结构域)，中间是第二代CAR结构(CD28或4-BB的一个共刺激结构域)，右边是第三代CAR结构(两个或多个共刺激结构域)。
图2显示BCMA蛋白的氨基酸序列(SEQ ID NO：1)，下划线部分是胞外结构域序列。
图3显示人源化BCMA CAR结构。
图4A-4B显示人源化BCMA-CAR-T细胞对CHO-BCMA细胞有杀伤作用，但对CHO细胞无杀伤作用。XCelligence Real-time细胞毒性实验检测人源化BCMA-CAR-T细胞的细胞毒性。Y轴为归一化细胞指数，X轴为时间。图4A显示CHO-BCMA靶细胞。右：从上到下：Mock CAR-T细胞、T细胞、单独靶细胞、人源化CAR-T细胞。图4B显示CHO靶细胞。从上至下：Mock CAR-T细胞、人源化BCMA CAR-T细胞、T细胞和单独靶细胞。
图5显示人源化的BCMA-CAR-T细胞对CHO-BCMA阳性细胞分泌高水平的IFN-γ，而对BCMA阴性的CHO对照细胞不分泌IFN-γ。*P<0.05，BCMA-CAR-T细胞与T细胞和Mock CAR-T细胞相比在CHO-BCMA细胞中IFN-γ的分泌量。
图6显示人源化BCMA-CAR-T细胞对多发性骨髓瘤细胞，而不对BCMA阴性的K562对照细胞分泌高水平的IFN-γ。*P<0.05，BCMA-CAR-T细胞与T细胞和Mock-CAR-T细胞相比在多发性骨髓瘤细胞中IFN-γ的分泌量。
图7A-7B显示利用FACS检测经携带hBCMA-41BB-CD3-CAR的慢病毒转导T细胞后的CAR表达情况。FACS分析图中，Y轴为CD3抗体，X轴分别为小鼠FAB抗体(7A)，以及荧光标记的BCMA抗原蛋白(7B)。
图8显示hBCMA-41BB-CD3-CAR-T细胞对BCMA阳性表达细胞Hela-BCMA靶细胞(8A)和BCMA阴性表达细胞Hela-CS1细胞(8B)的杀伤作用。
图9显示人源化BCMA-41BB-CD3-CAR-T细胞(PMC714)对靶向CHO-BCMA细胞的杀伤作用。
图10显示人源化BCMA-CAR-T细胞(PMC714)对Hela-BCMA靶细胞的IFN-γ分泌水平显著高于Hela-CS1细胞(p<0.05,Student’s t-test)。
图11显示使用CHO-BCMA细胞(BCMA表达阳性)作为靶细胞，人源化BCMA CAR-T细胞(PMC714)分泌IFN-γ的水平显著高于T细胞和Mock-CAR-T细胞(下图)(p<0.05,Student’st-test)。
图12显示响应于骨髓瘤细胞的细胞因子产生。将PMC714抗BCMA CAR-T细胞或对照T细胞与内源性表达BCMA的多发性骨髓瘤细胞(MM1S、RPMI8226)或缺乏BCMA的对照细胞(K562)共培养过夜。收集培养液，离心去细胞，用ELISA法检测IFN-γ和IL-2的水平，取两次重复的平均值。对于与MM1S细胞或RPMI8226细胞共培养的所有3名供者，对于IFN-γ，CAR-T细胞(如左侧所示)相对于T细胞(如右侧所示)的P值均<0.0001。对于IL-2，供者890和999的CAR-T细胞相对于T细胞的P值为<0.0001，供者202+MM1S为0.0002，供者202+RPMI8226为0.0003(采用Sidak事后检验的双向方差分析)。左栏显示T细胞，右栏显示每个供者的CAR-T细胞。
图13是PMC751转导的T细胞的流式细胞术分析。未转导的T细胞和PMC714转导的细胞用生物素化BCMA蛋白和PE结合的链霉亲和素(X轴)依次染色。在染色前加入7-AAD，以排除死细胞。
图14A-14B显示PMC751 CAR-T细胞的实时细胞毒性试验。观察CHO-BCMA靶细胞(14A)和CHO-CS1靶细胞(14B)形成单层的过程。约27小时后(竖条)，以10:1的E:T比例添加PMC751抗BCMA CAR-T细胞或对照T细胞。X轴为时间(小时)，Y轴为靶细胞单层的阻抗，在加入效应细胞时归一化为1.0。每个轨迹显示3个孔的平均值。“靶细胞”指的是没有接收效应细胞的孔。
图15显示PMC751 CAR-T细胞产生IFN-γ。从RTCA孔中收集培养液，离心去除细胞，用ELISA法检测IFN-γ水平。经t检验，PMC751 CAR-T细胞对CHO-BCMA和CHO-CS1靶细胞的IFN-γ表达差异有统计学意义(P<0.05)。
图16显示小鼠中标记的RPMI8226骨髓瘤细胞的生物发光成像。用PBS、mock CAR-T细胞或PMC714抗BCMA CAR-T细胞处理小鼠。
图17显示接种RPMI8226骨髓瘤细胞的小鼠中的肿瘤负荷的定量。小鼠接受PBS(上)、mock CAR-T细胞(中)或PMC714 CAR-T细胞(下)治疗。通过Tukey事后检验的双向方差分析，PMC714 CAR-T细胞与模拟CAR-T细胞的P值<0.0001。
图18显示研究期间的小鼠重量。显示每组小鼠的平均体重。
图19显示小鼠生存的Kaplan-Meier图。通过时序检验，PMC714 CAR-T细胞与MockCAR-T细胞相比，P＝0.0034。
具体实施方式
以下实例进一步阐释本发明。该等实施例仅意欲阐释本发明且不应将其理解为具有限制性。
实施例1、人源化BCMA VH、VL和scFv序列
BCMA单链抗体来源于表达BCMA的杂交瘤克隆4C8A(WO2019/195017)。测定小鼠克隆4C8A重链和轻链可变区序列，构建人源化scFv。
人源化BCMA(PMC307)单链抗体的结构为：VH-接头-VL。接头是G4Sx3。
人源化BCMA PMC307 scFv克隆的核苷酸序列如下。VH是粗体，VL是下划线，中间(斜体)是编码接头的核苷酸序列。
PMC307 VH氨基酸序列：(SEQ ID NO：3)
接头氨基酸序列：(SEQ ID NO：4)
GGGGSGGGGSGGGGS
PMC307 VL氨基酸序列：(SEQ ID NO：5)
EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSISDYLHWYQQKPGQAPRLLIYYASQSITGIPARFSGSGSGT
DFTLTISSLEPEDFAVYYCQNGHSFPPTFGGGTKVEIK
人源化BCMA(PMC307)scFv蛋白：(SEQ ID NO：6)
实施例2、人源化BCMA-CAR序列
例2A、人源化BCMA-CAR序列(CD28作为共刺激结构域)
人源化(PMC307)BCMA-CAR构建方案如图3所示。利用携带EF1a启动子的慢病毒载体克隆人源化scFv CAR序列。
BCMA-CAR结构包括人CD8信号肽、人源化BCMA scFv(VH-接头-VL)、CD8铰链、CD28跨膜、CD28共刺激结构域、激活结构域CD3δ(图3)。
CD8信号通路-BCMA scFv(VH-接头-VL)-CD8铰链-CD28TM-CD28-CD3δ的核苷酸序列和部分氨基酸序列如下所示。
核苷酸序列
ATGGCCTTACCAGTGACCGCCTTGCTCCTGCCGCTGGCCTTGCTGCTCCACGCCGCCAGGCCG(SEQID NO：7)
氨基酸序列
MALPVTALLLPLALLLHAARP(SEQ ID NO：8)
<Nhe I位点>
核苷酸序列
Gctagc
氨基酸序列
AS
<人源化BCMA，PMC307 scFv>
关于核酸序列和氨基酸序列，VH-接头-VL参见实施例1。
<XhoI限制性酶切位点>
核苷酸序列
CTCGAG
氨基酸序列
LE
<CD8铰链>
核苷酸序列
AAGCCCACCACGACGCCAGCGCCGCGACCACCAACACCGGCGCCCACCATCGCGTCGCAGCCCCTGTCCCTGCGCCCAGAGGCGAGCCGGCCAGCGGCGGGGGGCGCAGTGCACACGAGGGGGCTGGACTTCGCCAGTGAT(SEQID NO：9)
氨基酸序列
KTTTPAPPPTPAPTIASQPLSLRPEASSRPAAGGAVHTRGLDFASD(SEQ ID NO：10)
<间隔子>
核苷酸序列
aagccc
氨基酸序列
KP
<CD28跨膜结构域>
核苷酸序列
TTTTGGGTGCTGGTGGTGGTTGGTGGAGTCCTGGCTTGCTATAGCTTGCTAGTAACAGTGGCCTTTATTATTTTCTGGGTG(SEQ ID NO：11)
氨基酸序列
FWVLVVVGGVLACYSLLVTVAFIIFWV(SEQ ID NO：12)
<CD28共刺激结构域>
核苷酸序列
AGGAGTAAGAGGAGCAGGCTCCTGCACAGTGACTACATGAACATGACTCCCCGCCGCCCCGGGCCCACCCGCAAGCATTACCAGCCCTATGCCCCACCACGCGACTTCGCAGCCTATCGCTCC(SEQ ID NO：13)
氨基酸序列
RSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRS(SEQ ID NO：14)
<CD3δ>携带终止密码子(TAAtag)在结尾加粗
核苷酸序列
AGAGTGAAGTTCAGCAGGAGCGCAGACGCCCCCGCGTACCAGCAGGGCCAGAACCAGCTCTATAACGAGCTCAATCTAGGACGAAGAGAGGAGTACGATGTTTTGGACAAGAGACGTGGCCGGGACCCTGAGATGGGGGGAAAGCCGCAGAGAAGGAAGAACCCTCAGGAAGGCCTGTACAATGAACTGCAGAAAGATAAGATGGCGGAGGCCTACAGTGAGATTGGGATGAAAGGCGAGCGCCGGAGGGGCAAGGGGCACGATGGCCTTTACCAGGGTCTCAGTACAGCCACCAAGGACACCTACGACGCCCTTCACATGCAGGCCCTGCCCCCTCGCTAAtag(SEQ ID NO：15)
氨基酸序列
RVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPQRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR(SEQ ID NO：16)
<EcoRI限制性酶切位点>
gaattc
人源化BCMA-CAR蛋白(PMC307)的氨基酸翻译序列
MALPVTALLLPLALLLHAARPASQVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGYTFTSYVMHWVRQAPGQGLEWMGYIIPYNDATKYAQKFQGRVTITADKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARYNYDGYFDVWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSEIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSISDYLHWYQQKPGQAPRLLIYYASQSITGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQNGHSFPPTFGGGTKVEIKLEKPTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEASRPAAGGAVHTRGLDFASDKPFWVLVVVGGVLACYSLLVTVAFIIFWVRSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRSRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPQRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR(SEQ ID NO：17)
例2B、人源化BCMA-CAR序列(4-1BB作为共刺激结构域)
我们还制备了以4-1BB结构域代替CD28作为共刺激结构域的CAR。
<4-1BB结构域>
核苷酸序列
AAACGGGGCAGAAAGAAACTCCTGTATATATTCAAACAACCATTTATGAGACCAGTACAAACTACTCAAGAGGAAGATGGCTGTAGCTGCCGATTTCCAGAAGAAGAAGAAGGAGGATGTGAACTG(SEQ ID NO：18)
氨基酸序列
KRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCEL(SEQ ID NO：19)
<hBCMA scFv-4-1BB-CD3 CAR>(PMC714)
MALPVTALLLPLALLLHAARPASQVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGYTFTSYVMHWVRQAPGQGLEWMGYIIPYNDATKYAQKFQGRVTITADKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARYNYDGYFDVWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSEIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSISDYLHWYQQKPGQAPRLLIYYASQSITGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQNGHSFPPTFGGGTKVEIKLEKPTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEASRPAAGGAVHTRGLDFASDKPFWVLVVVGGVLACYSLLVTVAFIIFWVKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPQRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR(SEQ ID NO：20)
实施例3、CAR慢病毒生产
发明人制备了人源化BCMA-scFv-CAR构建物，并将其克隆到含有(a)启动子EF1和CD28共刺激结构域的慢病毒载体中以获得PMC307，或含有(b)启动子MNDU3和4-1BB共刺激结构域的慢病毒载体中以获得PMC714。慢病毒CAR构建物包含人源化BCMA scFv-CD28/4-1BB-CD3δ插入物。
慢病毒在293T细胞中按照[7]中描述的标准程序生成，该程序包含氨比西林耐药(AmpR)基因或卡那霉素耐药(KanR)基因；利用实时PCR测量滴度。然后用等量的慢病毒转导T细胞。
实施例4、从全血中分离外周血单核细胞(PBMC)
全血(斯坦福医院血液中心，斯坦福，加州)取自个人或混合献血者(取决于所需的血液量)，装在10mL肝素真空采血管(Becton Dickinson)中。取约10ml全抗凝血与无菌磷酸盐缓冲液(PBS)混合，总体积20ml，置于50ml离心管中(PBS，pH 7.4，不含Ca2+和Mg2+)。将血液/PBS(20ml)在锥形离心管中轻轻分层于15ml Ficoll-Paque PLUS(GE Healthcare)上，在室温下以400xg离心30～40min。取稀释血浆/Ficoll界面处含有外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cells,PBMC)的细胞层，洗涤，室温下200xg离心10min。使用血细胞计数仪计数细胞。用含5％ AB血清和1.25μg/mL两性霉素B(GeminiBioproducts,Woodland,CA)、100U/mL青霉素和100μg/mL链霉素的CAR-T培养基(AIM V-AlbuMAX(BSA)(Life Technologies)洗涤1次，用于实验或-80℃冷冻。
实施例5、来自PBMC的T细胞活化
将分离的PBMC细胞重新悬浮在含有300U/mL huIL2的CAR-T培养基中(来自1000倍的原液；Invitrogen)，并以磁珠与细胞为1:1比例与CD3-CD28磁珠混合。在病毒转导之前，在37℃、CO2存在下将细胞孵育24小时。
实施例6、T细胞的转导和扩增
PBMC活化后，细胞在37℃、5％ CO2孵育24小时。在每孔1×106个细胞中加入5×106个慢病毒和2μL/mL的Transplus(Alstem,Richmond,CA)培养基(终稀释1:500)。细胞再孵育24小时，然后重复添加病毒。细胞在含有IL-2的300U/mL新鲜培养基中持续生长12-14天(总孵育时间取决于所需CAR-T细胞的最终数量)。每2～3天检测1次细胞浓度，此时加入培养基稀释细胞悬液至1×106个/mL。
实施例7、人源化BCMA-CAR-T细胞表达BCMA scFv
我们使用实施例2中所示的人源化BCMA-CAR构建设计了人源化BCMA-CAR-T细胞。我们使用Mock scFv和不相关的scFv，并生成Mock-CAR-T细胞作为阴性对照。人源化BCMA-CAR慢病毒转染T细胞后，检测到人源化BCMA-CAR阳性细胞。
利用荧光标记的重组BCMA蛋白进行FACS分析，检测人源化BCMA-CAR构建物。利用慢病毒将人源化BCMA-CAR转导T细胞形成的BCMA-CAR-T阳性细胞也用荧光标记的重组BCMA蛋白开展FACS检测。
实施例8、人源化BCMA-CAR-T细胞杀伤CHO-BCMA细胞，但不杀伤CHO细胞
我们将人源化BCMA-CAR-T细胞与靶细胞CHO-BCMA和CHO(BCMA阴性)对照细胞共孵育。人源化BCMA-CAR-T细胞特异性杀伤CHO-BCMA细胞(图4A)，但不杀伤CHO细胞(图4B)。结果表明人源化BCMA-CAR-T细胞对BCMA抗原具有较高的靶向性和杀伤BCMA阳性细胞的特异性。
实施例9、人源化CAR-T细胞靶向CHO-BCMA细胞有明显的IFN-γ分泌作用，但对CHO细胞无明显作用
人源化BCMA-CAR-T细胞与靶细胞CHO-BCMA或对照CHO细胞共孵育后收集上清液，进行IFN-γ检测。BCMA-CAR-T细胞与CHO-BCMA细胞共孵育会分泌IFN-γ，但与阴性对照CHO细胞共孵育不分泌IFN-γ(图5)。使用慢病毒hBCMA(PMC307 scFv)-CAR和MNDU3启动子产生的CAR-T细胞也获得了类似结果(数据未显示)。结果表明人源化BCMA-CAR-T细胞具有良好的特异性。
实施例10、人源化CAR-T细胞对BCMA阳性的RPMI8226多发性骨髓瘤细胞分泌高水平的IFN-γ，但对BCMA阴性的K562白血病细胞不分泌IFN-γ
我们将BCMA-CAR-T细胞与多发性骨髓瘤癌细胞RPMI8266和BCMA阴性的K562细胞(慢性髓性白血病细胞)孵育，并按照制造商的方案，使用Fisher公司的IFN-γ试剂盒进行ELISA。人源化BCMA-CAR-T细胞对BCMA阳性多发性骨髓瘤癌细胞，但不对BCMA阴性K562细胞分泌高水平的IFN-γ(图6)。BCMA-CAR-T细胞的杀伤水平和IFN-γ分泌水平显著高于T细胞和Mock CAR-T细胞。这证实了人源化BCMA-CAR-T细胞对血液学BCMA阳性细胞的特异性。
实施例11、人源化BCMA-4-1BB-CD3(PMC714)可杀伤BCMA阳性靶细胞
我们制备了具有4-1BB-CD3结构域和MNDU3启动子的hBCMA-307scFv-CAR(实例2B和3，PMC714)。PMC714 CAR-T细胞具有高CAR表达，使用抗小鼠(Fab)2抗体的CAR阳性细胞占80.6％(图7A，右图)，使用荧光标记BCMA蛋白的CAR阳性细胞占73％(图7B，右图)。对照T细胞的两种染色均极少(0.4～1％)(图7A-7B，左图)。
图8显示hBCMA-4-1BB-CD3-CAR-T细胞杀伤的BCMA阳性的Hela-BCMA靶细胞(图8A)多于BCMA阴性的Hela-CS1细胞(图8B)
图9显示了hBCMA-41BB-CD3-CAR-T细胞对CHO-BCMA靶细胞的高杀伤作用。
实施例12、人源化BCMA-4-1BB-CD3(PMA714)对BCMA阳性靶细胞分泌高水平的IFN-γ，但对BCMA阴性靶细胞不分泌高水平的IFN-γ
人源化BCMA-4-1BB-CD3-CAR-T细胞(PMC714)与BCMA阳性的Hela-BCMA靶细胞共孵育分泌的IFN-γ水平显著高于与BCMA阴性的Hela-CS1靶细胞共孵育分泌的IFN-γ水平(图10)。这些CAR-T细胞与CHO-BCMA靶细胞共孵育分泌高水平的IFN-γ(图11)。
图10显示，人源化BCMA-CAR-T细胞(PMC714)与Hela-BCMA靶细胞一起分泌的IFN-γ水平显著高于与Hela-CS1靶细胞一起分泌的IFN-γ水平(p<0.05,Student’s t-test)。
图11显示，人源化BCMA-CAR-T细胞(PMC714)与BCMA阳性CHO-BCMA靶细胞一起分泌的IFN-γ水平显著高于T细胞和Mock-CAR-T细胞(下图)(p<0.05,Student’s t-test)。
实施例13、人源化BCMA-CAR-T细胞(PMC714)与多发性骨髓瘤细胞共培养分泌IFN-γ
为了确定PMC714 CAR-T细胞是否对内源性表达BCMA的肿瘤细胞产生反应，我们将来自3个不同供体(供体202、890和999)的CAR-T细胞或对照T细胞与MM1S或RPMI8226多发性骨髓瘤细胞以1:1的比例培养过夜。将BCMA-CAR-T细胞与BCMA阴性的K562非骨髓瘤细胞共培养作为阴性对照。ELISA法检测培养上清液中IFN-γ、IL-2和IL-6的含量。PMC714 CAR-T细胞对MM1S细胞和RPMI8226细胞产生高水平的IFN-γ和IL-2，但对K562细胞无应答(图12)。对照T细胞产生的IFN-γ和IL-2水平显著降低。CAR-T细胞和T细胞均不能对任何靶细胞产生IL-6。
图12所示。对骨髓瘤细胞反应的细胞因子的产生。将PMC714抗BCMA CAR-T细胞或对照T细胞与内源性表达BCMA的多发性骨髓瘤细胞(MM1S、RPMI8226)或缺乏BCMA的对照细胞(K562)培养过夜。收集培养液，离心去细胞，用ELISA法检测IFN-γ和IL-2的水平，取2个重复的平均值。对于所有3个与MM1S细胞或RPMI8226细胞共培养的供体，CAR-T细胞(左侧)与T细胞(右侧)比较IFN-γ的P值均<0.0001。对于IL-2，供者890和999的CAR-T细胞对T细胞的P值为0.0001，供者202+MM1S为0.0002，供者202+RPMI8226为0.0003(采用Sidak事后检验的双向方差分析)。左栏显示每个供者的T细胞，右栏显示每个供者的CAR-T细胞。
实施例14、PMC714在KanR载体(PMC751)中的活性
在临床中，不建议使用携带氨苄西林耐药(AmpR)基因的载体。因此，我们将PMC714载体中的AmpR改变为卡那霉素耐药(KanR)基因，并将该载体称为PMC751。CAR序列本身与PMC714 CAR相同。
CAR表达
我们制备了PMC751 CAR-T细胞，并通过流式细胞术分析了这些CAR-T细胞的结合频率。87％以上的PMC751 CAR-T细胞与生物素化BCMA蛋白结合，表明这些细胞是BCMA阳性CAR-T细胞(图13)。
细胞毒性试验
用表达BCMA的CHO细胞进行RTCA分析PMC751 CAR-T细胞。当E:T比值为10:1时，PMC751 CAR-T细胞对靶细胞具有强烈的细胞毒性，而对照T细胞无此作用(图14A)。相比之下，PMC751 CAR-T细胞对表达CS1的阴性对照靶细胞CHO细胞无强细胞毒性(图14B)。我们还检测了PMC751 CAR-T细胞对Hela-BCMA靶细胞的强细胞毒性(文中未给出数据)。
IFN-γ的分泌
通过ELISA分析来自RTCA检测的培养基的IFN-γ水平。PMC751 CAR-T细胞对CHO-BCMA靶细胞产生应答时，其分泌的IFN-γ水平显著高于对照T细胞，但对阴性对照CHO-CS1靶细胞则无应答(图15)。
实施例15、肿瘤模型中PMC714 CAR-T细胞的特征
为了测试PMC714 CAR-T细胞在体内阻断骨髓瘤生长的能力，我们将表达荧光素酶的RPMI8226细胞接种给NSG免疫缺陷小鼠，然后静脉注射CAR-T细胞、mock CAR-T细胞(表达缺乏BCMA scFv的CAR的对照T细胞)或PBS。随后连续4周，每周对小鼠进行发光成像。PMC714CAR-T细胞阻断了肿瘤细胞的生长，而对照组T细胞未阻断肿瘤细胞的生长(图16-17)。
小鼠在两个月内被称重。在研究期间，PMC714处理的小鼠体重未减轻，表明CAR-T细胞对小鼠无毒性(图18)。
在总共3个月的时间里分析小鼠的发病率/死亡率。在这一阶段结束时，接受PMC714CAR-T细胞治疗的所有小鼠均存活，而接受PBS治疗的小鼠或模拟CAR-T细胞治疗的小鼠均未存活(图19)。
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Claims (6)
1.一种嵌合抗原受体(CAR)，其特征在于，其具有SEQ ID NO：20所示的氨基酸序列。
2.编码权利要求1所述CAR的核酸。
3.经修饰以表达权利要求1所述CAR的T细胞或自然杀伤细胞。
4.权利要求1所述的CAR、权利要求2所述的核酸或者权利要求3所述的T细胞或自然杀伤细胞在制备靶向CHO-BCMA细胞的杀伤药物中的应用。
5.权利要求1所述的CAR、权利要求2所述的核酸或者权利要求3所述的T细胞或自然杀伤细胞在制备靶向Hela-BCMA细胞的杀伤药物中的应用。
6.权利要求1所述的CAR、权利要求2所述的核酸或者权利要求3所述的T细胞或自然杀伤细胞在制备多发性骨髓瘤治疗药物中的应用。
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