CN108463469B - 一种与抗可替宁抗体连接的嵌合抗原受体及其用途 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及连接有抗可替宁抗体的嵌合抗原受体及其用途。在表面上呈递嵌合抗原受体的T细胞特异性地分泌针对与其一起添加的可替宁‑偶联的结合分子的靶分子的干扰素γ，并诱导表达靶分子的细胞的细胞死亡。相反，通过施用与可替宁偶联的细胞毒性物质，诱导嵌合抗原受体T细胞的细胞死亡。因此，根据需要，可以施用与可替宁偶联的细胞毒性物质以除去已经施用的嵌合抗原受体T细胞，从而抑制由于T细胞过度活性引起的免疫副作用。因此，与抗可替宁抗体连接的嵌合抗原受体可以有效且安全地用于癌症治疗。

Description

一种与抗可替宁抗体连接的嵌合抗原受体及其用途
技术领域
本发明涉及一种与抗可替宁抗体连接的嵌合抗原受体及其用途。
背景技术
尽管可开发为生物治疗剂的诸如肽、适体、抗体等的物质具有优异的效果，但这些物质容易在体内分解并通过肾脏迅速释放，因此体内半衰期短。为了解决这样的问题，已有研究通过将聚乙二醇(PEG)与其偶联来增加物质的体内半衰期(Veronese F.M.&Pasut G.,Drug Discov.Today,10,1451-1458,2005)。然而，在偶联PEG的过程中，形成各种分子络合物，并且存在限制，即必须根据与PEG偶联的结合分子建立优化条件。此外，当其目标物体是细胞(例如癌细胞等)时，这样的分子没有细胞毒性或者具有弱细胞毒性的缺点。因此，近来正在开发抗体和细胞毒性物质(抗体-药物偶联物)的偶联物。
同时，嵌合抗原受体(chimeric antigen receptor,CAR)由抗体的一部分、铰链域、跨膜域和细胞间信号转导域组成。表达CAR(CAR细胞)的免疫细胞例如T细胞和自然杀伤细胞，通过使用CAR的抗体部分特异识别在靶细胞(例如癌细胞等)上表达的表面分子，并且显示对靶细胞的细胞毒性。因此，CAR细胞被用作基因工程细胞疗法的一种形式，并且据报道，表达CAR的T细胞(CAR T细胞)尤其对表达CD19的恶性血液病显示出高治疗效果。
然而，由于常规CAR细胞仅具有识别单个靶分子的限制，因此研究了针对半抗原的CAR细胞。这些细胞表达的CAR使用CAR的抗体部分识别特定半抗原。然后，将具有对靶分子的结合能力的分子(例如肽、适体、抗体、低分子量化学物质等)与半抗原偶联并与这些抗半抗原CAR细胞复合。因此，可以制备多靶向CAR细胞，其中一种类型的CAR细胞可以结合各种靶分子。
为了防止表达嵌合抗原受体的细胞与非靶细胞结合，半抗原优选是原本不存在于生物体内的物质。另外，半抗原必须具有用于与结合分子有效偶联的化学官能团。
发明内容
技术问题
可替宁是尼古丁的一种主要代谢产物，不能在体内生物合成(从头合成)，也不显示生理活性。此外，可替宁在哺乳类动物中的代谢过程已众所周知，并且还报道了可替宁的血清半衰期短至16小时(Benowits N.L.et al.,3rd Handb.Exp.Pharmacol.,29-60,2009)。因此，即使在吸烟者的情况下，可替宁也可以用作半抗原，因为在吸烟停止几天后可替宁不再存在于体内。此外，由于具有羧基官能团的可替宁容易获得，所以可以促进可替宁与结合分子的偶联。
正因为如此，通过制备表达与抗可替宁抗体部分结合的CAR和可替宁-偶联结合分子的T细胞，本发明人证实了CAR T细胞特异性识别可替宁-偶联的结合分子的靶标，分泌干扰素γ，并诱导靶细胞的细胞死亡(图1)。
另外，近来随着抗肿瘤CAR T细胞疗法的增效作用，由于这种基因工程化T细胞的过度活性而引起的免疫毒性被强调为不良副作用。因此，正在研究通过在不良副作用发生时诱导这些细胞的细胞死亡来解决由这些T细胞引起的严重不良副作用的措施。在抗半抗原CAR的情况下，当注射CAR T细胞的患者体内发生免疫毒性副作用时，注射半抗原-偶联的细胞毒性物质而不是半抗原-偶联的结合分子可以诱导CAR T细胞的细胞死亡，因为半抗原-偶联的细胞毒性物质仅结合抗半抗原CAR T细胞。因此，该系统提供了另一个优点，即半抗原-偶联的细胞毒性物质可以用作安全措施以解决由T细胞引起的不良副作用(图2)。因此，本发明人证实嵌合抗原受体T细胞的细胞死亡是由可替宁-偶联的细胞毒性物质诱导，从而完成了本发明。
因此，本发明的目的是提供一种与抗可替宁抗体连接的CAR。
本发明的另一个目的是提供一种编码CAR的核酸分子，包含其的表达载体和病毒以及用该病毒转导的细胞。
本发明的另一个目的是提供一种在所述细胞中还包含可替宁-偶联的结合分子的CAR细胞。
本发明的另一个目的是提供一种用于预防或治疗特定细胞增殖的病症或疾病的药物组合物，所述药物组合物包含CAR细胞作为有效成分。
本发明的另一个目的是提供一种用于预防或治疗特定细胞增殖的病症或疾病的方法，所述方法包括将CAR细胞施用于对象。
本发明的另一个目的是提供一种用于诱导CAR细胞的细胞死亡的方法。
技术手段
为了实现上述目的，本发明提供了与抗可替宁抗体连接的CAR，该CAR包含抗可替宁抗体或其片段、铰链域、跨膜域和信号转导域。
另外，本发明提供了编码所述CAR的核酸分子。
另外，本发明提供了包含所述核酸分子的表达载体。
另外，本发明提供了包含所述核酸分子的病毒。
另外，本发明提供了用所述病毒转导的细胞。
另外，本发明提供了在所述细胞中含有可替宁-偶联的结合分子的CAR细胞。
另外，本发明提供用于预防或治疗特定细胞增殖的病症或疾病的药物组合物，所述药物组合物包含所述CAR细胞作为有效成分。
另外，本发明提供用于预防或治疗特定细胞增殖的病症或疾病的方法，所述方法包括将所述CAR细胞施用于对象。
此外，本发明提供了用于在对象中制备CAR细胞的方法，所述方法包括将所述细胞施用于对象，并将可替宁-偶联的结合分子施用于对象。
另外，本发明提供了用于诱导CAR细胞的细胞死亡的方法，该方法包括将所述细胞和可替宁-偶联的结合分子施用于对象，并且还将可替宁-偶联的细胞毒性物质施用于所述对象。
此外，本发明提供用于预防或治疗特定细胞增殖的病症或疾病的药物试剂盒，所述药物试剂盒包含以药物和治疗有效量含有所述CAR细胞作为有效成分的第一成分，以及以药物和治疗有效量含有可替宁和细胞毒性物质复合物作为有效成分的第二成分。
有益效果
本发明所述的在其表面上呈递与抗可替宁抗体连接的CAR的T细胞，特异性地识别可替宁-偶联的结合分子的靶标，分泌干扰素γ，并且诱导表达靶分子的细胞的细胞死亡。此外，通过施用可替宁-偶联的细胞毒性物质，诱导CAR T细胞的细胞死亡。因此，当需要时，可以通过施用可替宁-偶联的细胞毒性物质来去除预先施用的CAR T细胞，由此抑制由于T细胞的过度活性而导致的不良免疫副作用。因此，与抗可替宁抗体连接的嵌合抗原受体可以有效地用于治疗特定细胞增殖的病症或疾病。
附图说明
图1是显示通过根据靶细胞改变可替宁-偶联的结合分子来改变嵌合抗原受体T细胞的靶标的图。
图2是显示可替宁-偶联的细胞毒性物质用于诱导嵌合抗原受体T细胞的细胞死亡的图。
图3显示了与根据本发明实施例制备的抗可替宁抗体片段连接的嵌合抗原受体基因(Cot-28Z)和表达其的病毒载体(pMP-Cot-28Z)的结构(A)，以及通过流式细胞仪分析在其表面上呈递嵌合抗原受体的T细胞的结果图表(B)。
图4是显示当本发明实施例制备的连接有抗可替宁抗体片段的嵌合抗原受体T细胞与可替宁-偶联的抗-VEGF适体(Cot-哌加他尼)混合，并与靶分子即VEGF蛋白反应时，由T细胞分泌的干扰素γ的量的图表。
图5是显示当根据本发明实施例制备的嵌合抗原受体T细胞与可替宁-偶联的抗-HER2抗体(抗-HER2-Cot)混合，并添加到HER2阳性或阴性肿瘤细胞时，由T细胞分泌的干扰素γ的量的图表。
图6是(A)显示证实了与根据本发明的实施例制备的可替宁-偶联的抗-HER2抗体(赫赛汀-cot)与嵌合抗原受体T细胞混合后的HER2阳性肿瘤特异性地分泌干扰素γ的图表，以及显示通过流式细胞仪分析在T细胞表面表达的嵌合抗原受体的结果的图表(B)。
图7是显示当嵌合抗原受体T细胞与根据本发明实施例制备的可替宁-偶联的抗-CD20抗体(抗-CD20-cot)混合，并添加到CD20阳性或阴性肿瘤细胞时，由T细胞分泌的干扰素γ的量的图表。
图8是显示当根据本发明实施例制备的嵌合抗原受体T细胞与可替宁-偶联的抗-HLA抗体(抗-HLA-cot)混合，并添加到HLA阳性或阴性肿瘤细胞时，由T细胞分泌的干扰素γ的量的图表。
图9是显示靶细胞被染色以显示具有不同强度的荧光的图表(A)，和显示将根据本发明实施例制备的嵌合抗原受体T细胞和可替宁-偶联的抗-HER2抗体添加到所述靶细胞中，并通过流式细胞仪分析嵌合抗原受体T细胞的靶细胞特异性细胞死亡效果的结果图(B)。
图10是显示可替宁-偶联的细胞毒性物质(A：可替宁-多卡米星单偶联物，B：可替宁-DM1复合偶联物(2×可替宁-4×DM1)，以及C：可替宁-多卡米星复合偶联物(2×可替宁-4×多卡米星))的嵌合抗原受体T细胞的细胞死亡诱导作用的图表。
图11是显示在本发明实施例中使用的细胞毒性物质(A)可替宁-多卡米星单偶联物，(B)可替宁-DM1复合偶联物，以及(C)可替宁-多卡米星复合偶联物的结构的图表组，
具体实施方式
在下文中，将详细描述本发明。
本发明提供了一种与抗可替宁抗体连接的嵌合抗原受体，所述嵌合抗原受体包含抗可替宁抗体或其片段、铰链域、跨膜域和信号转导域。
所述与抗可替宁抗体连接的嵌合抗原受体可以是其中抗可替宁抗体或其片段、铰链域、跨膜域和信号转导域以从N端到C端的方向依次连接的形式。
抗可替宁抗体是与可替宁结合的抗体，所述抗体可以是单克隆抗体、多克隆抗体或重组抗体中的任一种。另外，所述抗体可以是全长形式的抗体或其片段。此时，所述抗体的片段可以包含能够结合可替宁的抗可替宁抗体的一部分。所述抗体的片段可以是Fab、Fab'、F(ab')2、Fv、或scFv。
抗可替宁抗体或其片段可以包括重链可变区，其包含CDR1、CDR2或CDR3，其中CDR1、CDR2和CDR3是分别由SEQ ID NO:23至25的氨基酸序列表示的互补决定区(CDR)，或者包括轻链可变区，其包含CDR1、CDR2或CDR3，其中CDR1、CDR2和CDR3分别由SEQ ID NO：26至28的氨基酸序列表示。具体而言，上述抗可替宁抗体或其片段可以包括重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区包含分别由SEQ ID NO：23至25的氨基酸序列表示的CDR1、CDR2和CDR3，所述轻链可变区包含分别由SEQ ID NO：26至28的氨基酸序列表示的CDR1、CDR2和CDR3。在本发明的一个实施例中，所述抗可替宁抗体可以是具有SEQ ID NO：1的氨基酸序列的scFv片段。另外，所述抗可替宁抗体可以与SEQ ID NO：1的氨基酸序列具有至少80％、85％、90％、95％、97％、98％或99％的同一性。
根据本发明的抗可替宁抗体或其片段可以通过修饰美国专利号8,008,448中描述的方法来制备。
所述铰链域是用于连接抗可替宁抗体或其片段和跨膜域的区域，并且可以包含半胱氨酸残基。所述半胱氨酸残基可能参与铰链域与抗体的结合。例如，所述铰链域可以是CD8铰链域、IgG1铰链域、IgG4铰链域、CD28胞外域、杀伤免疫球蛋白样受体(KIR)胞外域或它们的组合(Mol.Ther.,2015(23):757；J.Immunother.,2006(29):284；CancerImmunol.Res.,3(7):815-26；Blood,2013(122):2965)。所述CD8铰链域可以具有SEQ IDNO：3的氨基酸序列。另外，所述CD8铰链域可以与SEQ ID NO：3的氨基酸序列具有至少80％、85％、90％、95％、97％、98％或99％的同一性。
所述跨膜域可连接嵌合抗原受体的铰链域和信号转导域。所述跨膜域可以穿透细胞的细胞膜，使得嵌合抗原受体的抗可替宁抗体或其片段位于细胞表面，并且所述信号转导域位于细胞内。所述跨膜域可以是CD3ζ、CD4、CD8、CD28或KIR蛋白的跨膜域(Immunol.Rev.,2014(257):107；J.Immunol.,2010(184):6938；Blood,2013(122):2965,J.Immunother.,2006(29):284；Cancer Immunol.Res.,3(7):815-26)。在本发明的一个实施例中，所述跨膜域可以包括CD28的跨膜域和细胞质区，并且所述跨膜域可以具有SEQ IDNO：5或SEQ ID NO：7的氨基酸序列。另外，所述跨膜域可以与SEQ ID NO：5或SEQ ID NO：7的氨基酸序列具有至少80％、85％、90％、95％、97％、98％或99％的同一性。
所述信号转导域接收由抗可替宁抗体或其片段提供的信号，并且在将信号传递到与嵌合抗原受体结合的细胞中起作用。所述信号转导域可以是CD3ζ、CD278(可诱导T细胞共刺激分子，ICOS)、CD28、CD134(OX40)、CD137(4-1BB)、杀伤免疫球蛋白样受体(KIR)或DNAX活化蛋白12(DAP12)(J.Immunol.,2004(172):104；Mol.Ther.,2013(21):2268；Proc.Natl.Acad Sci.USA,2009(106):3360；Cancer Immunol.Res.,3(7):815-26)。具体而言，所述信号转导域可以是CD28和CD3ζ的细胞质区，或CD137(4-1BB)和CD3ζ的细胞质区。
在本发明的一个实施例中，所述信号转导域可以是CD28和CD3ζ的细胞质区。所述CD28的细胞质区可以具有SEQ ID NO：9或SEQ ID NO：11的氨基酸序列，并且所述CD3ζ的细胞质区可以具有SEQ ID NO：13的氨基酸序列。另外，所述信号转导域可以与SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：11或SEQ ID NO：13的氨基酸序列具有至少80％、85％、90％、95％、97％、98％或99％的同一性。
此外，本发明的嵌合抗原受体可以包含如上所述的抗体和域的修饰形式。此时，修饰可以通过取代，缺失或添加野生型抗体和域的氨基酸序列的一个或多个氨基酸来进行，而不改变抗体和域的功能。通常，取代可以是丙氨酸，或者可以通过不影响整个蛋白质的电荷、极性或疏水性的保守氨基酸置换来进行。在本发明的一个实施例中，所述嵌合抗原受体可以具有SEQ ID NO：15或SEQ ID NO：17的氨基酸序列。另外，所述嵌合抗原受体可以与SEQID NO：15或SEQ ID NO：17的氨基酸序列具有至少80％、85％、90％、95％、97％、98％或99％的同一性。
另外，本发明提供了编码嵌合抗原受体的核酸分子。
根据本发明的核酸分子可编码如上所述的抗可替宁抗体或其片段(SEQ ID NO：2)，铰链域(SEQ ID NO：4)，跨膜域(SEQ ID NO：6或8))和信号转导域(SEQ ID NO：10、12或14)。此时，编码本发明嵌合抗原受体的核酸分子可以是SEQ ID NO：16或SEQ ID NO：18的核苷酸序列。在此，所述核苷酸序列可以包括能够表达SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：3、SEQ IDNO：5、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：11或SEQ ID NO：13的抗体或域的另一个取代的核苷酸序列。另外，所述核酸分子可以包括编码如上所述的修饰形式的抗体或域的核酸分子。
另外，本发明提供包含所述核酸分子的表达载体。
所述表达载体可以是腺病毒载体、逆转录病毒载体、慢病毒载体或腺相关病毒载体。在本发明的一个实施例中，所述表达载体可以是逆转录病毒载体。所述表达载体可由本领域技术人员制备，从而使得本发明的嵌合抗原受体被表达和分泌。
所述表达载体还可以包括信号序列或前导序列。在本发明的一个实施例中，所述前导序列可以是免疫球蛋白κ前导序列。所述免疫球蛋白κ前导序列可以具有SEQ ID NO：19的氨基酸序列，并且可以与SEQ ID NO：19的氨基酸序列具有至少80％、85％、90％、95％、97％、98％或99％同一性。
本发明还提供包含所述核酸分子的病毒。
所述病毒可以在其基因组中包括编码根据本发明的嵌合抗原受体的核酸分子。因此，用所述病毒转导的细胞可以表达根据本发明的嵌合抗原受体，其中抗可替宁抗体或其片段位于其表面上。所述病毒可以是腺病毒、逆转录病毒、慢病毒或腺相关病毒。在本发明的一个实施例中，所述病毒可以是逆转录病毒。
可通过用如上所述的表达载体和包含编码病毒包膜蛋白的核酸分子的表达载体一起转染细胞来获得病毒。在此，所述转染可以通过常规方法进行。为了转染，可以使用包膜蛋白，所述包膜蛋白可以是VSV-G、亲嗜性包膜、Mokola、狂犬病毒、MLV-Ampho、MLV-10A1、LCMV-WE、LCMV-Arm53b包膜、猫内源性γ逆转录病毒RD114包膜和其变体、长臂猿白血病病毒(GALV)包膜及其变体、MLV 4070A包膜或gp120/gp41(Mol.Ther.Methods Clin.Dev.,2016(3):16017；J.Virol.Methods,2004:122-131；Molecular Therapy-Methods&ClinicalDevelopment 2016(3):16017)。
另外，本发明提供如上所述的用病毒转导的细胞。
所述细胞可以用包含能够表达本发明的嵌合抗原受体的核酸的病毒转导。所述转导的细胞可以具有位于细胞表面的抗可替宁抗体或其片段，并且当可替宁通过抗原-抗体结合与抗体或其片段结合时，可以通过细胞间信号转导诱导细胞活性。在此，所述细胞可以是T细胞，自然杀伤细胞或巨噬细胞。在本发明的一个实施例中，所述细胞可以是T细胞。
此外，本发明提供还包含可替宁-偶联的结合分子的嵌合抗原受体细胞。
在可替宁-偶联的结合分子中，当结合分子是抗体时，可通过可替宁的羧基与抗体的胺基之间的键形成复合物。
作为半抗原的可替宁可以与特异识别可替宁的抗体结合，而不会改变可替宁-偶联的结合分子的性质。具体而言，所述结合分子可以是肽，核酸，蛋白质或化学物质。所述核酸可以是适体，并且所述蛋白质可以是抗体或激素。在本发明的一个实施例中，所述适体可以是抗-VEGF适体。另外，在本发明的一个实施例中，所述抗体可以是抗-HER2抗体，抗-CD20抗体或抗-HLA抗体。
所述嵌合抗原受体细胞可以携带与细胞连接的抗可替宁抗体或其片段。当可替宁偶联物结合抗可替宁抗体或其片段时，它们可以诱导细胞活性。在此，细胞与可替宁-偶联的结合分子的结合可以是嵌合抗原受体的抗可替宁抗体或其片段与可替宁之间的抗原-抗体结合。另外，所述细胞活性可以是细胞毒性T细胞引起的细胞死亡诱导活性。
所述嵌合抗原受体细胞可以通过将可替宁-偶联的结合分子添加于表达连接有抗可替宁抗体或其片段的嵌合抗原受体的细胞中的步骤，以及选择与结合分子复合的嵌合抗原受体细胞的步骤来制备。
此外，本发明提供用于预防或治疗特定细胞增殖的病症或疾病的药物组合物，所述药物组合物包含所述嵌合抗原受体细胞作为有效成分。
用作药物组合物的有效成分的嵌合抗原受体细胞如上所述。
所述病症或疾病可能是癌症，并且所述癌症可能是实体癌症或恶性血液病。在此，所述实体癌症可以是肺癌、结肠癌、前列腺癌、甲状腺癌、乳腺癌、脑癌、头颈部肿瘤、食道癌、皮肤癌、黑色素瘤、视网膜母细胞瘤、胸腺癌、胃癌、结直肠癌、肝癌、卵巢癌、子宫癌、膀胱癌、直肠癌、胆囊癌、胆管癌或胰腺癌。另外，所述恶性血液病可以是淋巴瘤、白血病或多发性骨髓瘤。
基于药物组合物的总重量，所述药物组合物可以包含10至95wt％的根据本发明的嵌合抗原受体细胞作为有效成分。除了上述的有效成分之外，本发明的药物组合物还可以包含一种或多种类型的显示相同或相似功能的有效成分。
除了上述有效成分之外，根据本发明的药物组合物还可以包含一种或多种类型的用于给药的药学上可接受的载体。
此外，本发明提供用于预防或治疗特定细胞增殖的病症或疾病的方法，所述方法包括将所述嵌合抗原受体细胞施用于对象。
所述嵌合抗原受体细胞如上所述。另外，所述病症或疾病可以是癌症，以及如上所述的特定的癌症。
根据本发明的嵌合抗原受体细胞的剂量可以根据各种因素进行调整，例如疾病的类型、疾病的严重程度、包含在药物组合物中的有效成分和其他成分的类型和含量、剂型的类型和患者的年龄、体重、一般健康状况、性别和饮食、给药时间、给药途径、治疗时间和并用药物。但是，为了期望的效果，本发明药物组合物中包含的嵌合抗原受体细胞的有效量可以是1×105至1×1011个细胞/kg。在此，施用可以每天进行一次，也可以一天分几次进行。
另外，本发明的嵌合抗原受体细胞可以通过本领域已知的各种方法施用于对象。所述对象可以是哺乳动物，特别是人类。考虑到给药方法，体液的体积和粘度等，给药途径可以由本领域技术人员适当选择。
此外，本发明提供用于在对象中产生嵌合抗原受体细胞的方法，所述方法包括将所述细胞施用于对象，以及将可替宁缀合的结合分子施用于对象。
如上所述，用包含能够表达本发明的嵌合抗原受体的核酸的病毒转导细胞。另外，所述可替宁-偶联的结合分子如上所述。
所述对象可以是哺乳动物，特别是人类。如上所述，可以由本领域技术人员适当地进行施用。
另外，本发明提供用于诱导嵌合抗原受体细胞的细胞死亡的方法，所述方法包括将所述细胞和可替宁-偶联的结合分子施用于对象，并且还将可替宁-偶联的细胞毒性物质施用于对象。
所述嵌合抗原受体细胞如上所述。在使用嵌合抗原受体细胞进行抗癌治疗的情况下，由于细胞的过度活性引起的免疫毒性可能作为副作用出现。因此，为了解决这样的副作用，除了可替宁-偶联的结合分子之外，还可以通过额外施用可替宁-偶联的细胞毒性物质来诱导嵌合抗原受体细胞的细胞死亡。
所述细胞毒性物质只要是能够诱导细胞死亡的物质即可。具体而言，所述细胞毒性物质可以是倍癌霉素、SN-38、卡奇霉素、单甲基澳瑞他汀E(MMAE)、单甲基澳瑞他汀F(MMAF)、阿霉素、吡咯并苯并二氮杂卓(pyrrolobenzodiazepine)、DM4或DM1。在本发明的一个实施例中，所述细胞毒性物质可以是倍癌霉素或DM1(ASCO meeting abstracts2014(32):2558；Clin.Cancer Res.,2011(17):3157-69；Leuk.Lymphoma,2015(56):2863-69；J.Clin.Oncol.,2014(32):3619-25；Proc.Am.Soc.Clin.Oncol.,2015(33):2503；J.DrugDeliv.,2013(2013):898146；Sci.Transl.Med.,2015(7):302ra136；Mol,Cancer Ther.,2014(13):1537-48；J.Clin.Oncol.,2008(26):2147-54)。
可替宁-偶联的细胞毒性物质的施用可以根据如上所述的各种因素进行调整。包含在本发明药物组合物中的嵌合抗原受体细胞的有效量可以由本领域技术人员适当地确定。在此，施用可以每天进行一次，也可以一天分几次进行。
此外，本发明提供用于预防或治疗特定细胞增殖的病症或疾病的药物试剂盒，所述药物试剂盒包含以药物和治疗有效量含有嵌合抗原受体细胞作为有效成分的第一成分，和以药物和治疗有效量含有可替宁-偶联的细胞毒性物质作为有效成分的第二成分。
在本发明的药物试剂盒中，所述第一成分和第二成分可以依次施用以预防或治疗病症或疾病。在依次施用所述第一成分和第二成分的情况下，当出现免疫毒性副作用时或者当施用第一成分后嵌合抗原受体细胞永生化时，可以施用第二成分。
所述病症或疾病可以是癌症，以及如上所述的特定的癌症。
实施例
以下，通过下面的实施例详细描述本发明。以下实施例仅用于举例说明本发明，本发明的范围并不限于此。
实施例1.包含编码与抗可替宁抗体片段连接的嵌合抗原受体的核酸的逆转录病毒的制备
1.1制备构建体
首先，通过以下方法制备包含各自编码抗可替宁抗体的scFv片段、铰链域、跨膜域和信号转导域的核酸的质粒。
具体而言，使用包含小鼠Igκ前导序列的引物，通过PCR从模板质粒中以常规方式扩增抗可替宁抗体的scFv片段。所述模板是通过用SfiI限制酶切割的抗可替宁scFv片段连接至pCEP4载体(Invitrogen，美国)而产生的质粒(Clin.Chim.Acta，2010,411-1238)。同时，通过PCR从模板pLxSN-scFv-anti-CEA-CD28-zeta质粒扩增嵌合抗原受体的骨架部分，所述骨架部分包括c-myc标签(SEQ ID NO:21)、人CD8铰链域、小鼠CD28的跨膜域和细胞质区以及人CD3ζ的细胞质区(Dr.Philip Darcy,PeterMac Cancer Center,澳大利亚)。以下表1中显示了用于PCR的引物的具体序列。
[表1]
Figure GDA0001631816410000141
连接两个获得的PCR产物以制备抗可替宁嵌合抗原受体的cDNA。将制备的cDNA和pMSCV-puro载体(K1062-1，Clontech，美国)分别用HindIII/SalI和HindIII/ClaI切割并连接在一起。结果，将编码抗可替宁抗体的scFv片段和嵌合抗原受体的骨架域的cDNA克隆到pMSCV-puro逆转录病毒载体的PGK启动子的下游位置，其中嘌呤霉素抗性基因最初位于此处。通过核苷酸序列分析证实制备的构建体，并命名为pMP-Cot-28Z(图3A)。
1-2.逆转录病毒的制备
将实施例1-1中制备的逆转录病毒构建体与pMD2.G质粒(#12259，Addgene，美国)一起转染到Phoenix GP(ATCC，美国)细胞系中，所述质粒含有cDNA编码水疱性口炎印第安纳病毒G蛋白(VSV-G)作为病毒包膜蛋白。根据制造商的方法使用LipofectamineTM2000(Cat#11668-019，Invitrogen，美国)进行转染。48小时后，收获含有VSV-G假型逆转录病毒的培养物上清液并与Phoenix Eco(ATCC，美国)细胞系一起培养以感染逆转录病毒。感染后三至五天，使用流式细胞仪(BD Bioscience，美国)选择用荧光标记的抗-myc抗体阳性染色的Phoenix Eco细胞以建立产生逆转录病毒的细胞系。使用离心过滤装置(Amicon Ultra-15,100kDa cut-off，Millipore，美国)将由该细胞系产生的逆转录病毒培养物上清液浓缩10倍。
实施例2.在表面上呈递与抗可替宁抗体片段连接的嵌合抗原受体的细胞毒性T细胞的制备
使用实施例1-2中制备的病毒，制备在表面上呈递与抗可替宁抗体片段连接的嵌合抗原受体的细胞毒性T细胞。
首先，从B6小鼠中分离脾细胞并将其分配到涂覆10μg/mL的抗-CD3抗体(145-2C11，BD Bioscience，美国)的细胞培养容器中，使得每孔具有2.5x 106个细胞。向细胞中补充总共1mL的包含2μg/mL的抗-CD28抗体(37.51，BD Bioscience，美国)的RPMI-1640培养基，并在5％CO2和37℃的条件下培养。24小时后，将包含2μL的浓度为6mg/mL的聚凝胺(Sigma-Aldrich，美国)的1mL浓缩的逆转录病毒加入到细胞中，并使用离心机以2,500rpm的离心转速离心90分钟进行转导(Centrifuge 5810R，Eppendorf，美国)。聚凝胺被用于增加逆转录病毒的转导率。之后，除去1mL的培养上清液，并向其中加入1mL浓缩的逆转录病毒和1μL聚凝胺，并在与上述相同的条件下通过离心转导逆转录病毒。然后，取出1mL培养液，加入1mL含有20U/mL白细胞介素-2(Gibco，美国)的RPMI-1640培养基。
在48小时后，将病毒转导的T细胞的培养基换成含有20U/mL白细胞介素-2的培养基，并在5％CO2和37℃的条件下培养72小时。之后，通过使用流式细胞仪测量用荧光标记的抗-c-myc抗体阳性染色的细胞群的百分比来确定与抗可替宁抗体片段连接的嵌合抗原受体的转导率，其约为50至70％(图3B)。同时，导入了绿色荧光蛋白的T细胞作为对照组，显示约80％的转导率。如此制备的其表面上呈递与抗可替宁抗体片段连接的嵌合抗原受体的T细胞在制备后24小时内用于以下实验。
实施例3.可替宁和结合分子复合物的制备
3-1可替宁和结合分子复合物的制备
作为结合分子，使用作为抗-CD20抗体的利妥昔单抗(Genentech，Biogen，美国)，作为抗-HER2抗体的曲妥珠单抗(Genentech，美国)，作为抗流感病毒血凝素抗体的CT302(Celltrion，韩国)，以及抗-HLA抗体的W6/32(eBioscience，美国)制备可替宁偶联物。可替宁偶联通过EDC(1-乙基-3-[3-二甲基氨基丙基]碳化二亚胺)偶联方法进行。
首先，将上述抗体溶解于PBS中至浓度为25μM。同时，将反式-4-可替宁羧酸(Sigma-Aldrich)溶于1mL MES缓冲液[0.1M MES(2-[吗啉代]乙磺酸)和0.5M氯化钠，pH6.0]至浓度为5mM。溶液中加入浓度为50mM的EDC和浓度为125mM的N-羟基磺代琥珀酰亚胺(Sulfo-NHS，Thermo Scientific，美国)，然后在室温下搅拌混合15分钟以制备活性溶液，其中形成可替宁-NHS酯。加入氢氧化钠溶液以将上述活性溶液的pH调节至7以上以便可替宁-NHS酯与蛋白质的胺基团之间的最佳反应，并将1mL的该活性溶液与相同体积的待与可替宁-偶联的抗体以25μM的浓度混合。将混合物在室温下搅拌反应3小时以获得通过EDC偶联反应产生的可替宁抗体偶联物。使用Slide-A-LyzerTM透析盒(Thermo FisherScientific，美国)将由此获得的可替宁抗体偶联物用PBS透析，或者使用
Figure GDA0001631816410000171
超离心过滤器(EMD Millipore，美国)用PBS替换缓冲液。
3-2.可替宁和适体复合物的制备
使用作为可识别血管内皮生长因子(VEGF)的适体的培加尼布通过固相寡肽合成方法制备可替宁-培加尼布偶联物。
具体而言，使用寡肽合成仪从3'末端至5'末端合成培加尼布RNA适体(5'-pCfpGmpGmpArpArpUfpCfpAmpGmpUfpGmpAmpAmpUfpGmpCfpUfpUfpAmpUfpAmpCfpAmpUfpCfpCfpGm-p-dT-3-3',SEQ ID NO:35)，并将氨基C6接头连接到5'末端。对于氨基C6接头使用活性酯交联方法进行与可替宁的化学偶联，然后使用Xbridge Prep C18柱(5μm，10×150mm，WatersCorp.,美国)通过反相高压液相色谱法纯化(>95％纯度)。使用质谱仪(ST Pharm，韩国)测定其质量(Clin.Chim.Acta.,2010(411):1238；Exp.Mol.Med.,2012(44):554)。
将悬浮于含有焦碳酸二乙酯的蒸馏水中的合成的培加尼布可替宁偶联物在95℃下变性5分钟，在室温下冷却30分钟，然后储存在-20℃下。
比较实施例1.制备与抗癌胚抗原scFv片段连接的嵌合抗原受体T细胞
通过使用pLxSN-scFv-抗-CEA-zeta质粒(Dr.Philip Darcy,PeterMac CancerCenter,澳大利亚)作为模板，使用上文表1中列出的引物通过PCR方法获得与抗癌胚抗原(抗-CEA)scFv片段连接的嵌合抗原受体基因。将获得的基因和pMSCV-puro载体(K1062-1，Clontech，美国)分别用HindIII和ClaI切割并连接在一起。将制备的构建体命名为pMP-C28Z。使用该构建体，在实施例1和2的条件和方法下制备逆转录病毒，并制备用逆转录病毒转导的T细胞。
比较实施例3.制备表达绿色荧光蛋白的T细胞
为了制备表达绿色荧光蛋白的T细胞，通过用NcoI和SalI消化质粒获得包含在pMIG-w质粒中的绿色荧光蛋白(GFP)基因(Dr.Yosef Refaeli,National Jewish Medicaland Research Center,美国)。除去包含在该质粒中的抗癌胚嵌合抗原受体基因后，将消化的GFP基因片段插入到比较实施例2中制备的pMP-C28Z质粒的NcoI/SalI位点中。将制备的构建体命名为pMP-GFP。之后，将该构建体用于在实施例1和2的条件和方法下制备逆转录病毒，并且制备了用逆转录病毒转导的T细胞。
试验实施例1.使用可替宁-培加尼布偶联物证实与抗可替宁抗体片段连接的嵌合抗原受体T细胞的活化
使用上述实施例3-2中制备的可替宁-培加尼布偶联物，检测该偶联物是否识别血管内皮生长因子(VEGF)并由此诱导嵌合抗原受体细胞的活化。
首先，将5μg/mL的VEGF蛋白质加入到96孔板中，然后将板在4℃下放置过夜以用VEGF涂覆板。用补充有20％胎牛血清和1％青霉素-链霉素(Gibco，美国)的RPMI-1640培养基(Welgene，韩国)洗涤涂覆的板两次，并加入100-nM可替宁-培加尼布偶联物，并在37℃下培养1小时。反应后，将板用RPMI-1640培养基洗涤3次，然后加入实施例2中制备的嵌合抗原受体T细胞，使得每孔具有1×105个细胞，并将细胞在37℃和5％CO2下培养24小时。然后，使用ELISA试剂盒(Cat#.555138,BD Bioscience,美国)，根据制造商的方法测量培养基中分泌的干扰素γ的量，结果显示在图4中。作为对照组，使用在涂覆VEGF的板中未添加任何物质的组(仅VEGF)，在未涂覆VEGF的板中仅添加T细胞的组(仅T细胞)，在涂覆VEGF的板中仅添加T细胞的组(VEGF+T细胞)，以及在涂覆VEGF的板中添加对照适体(5'-dTTGGTGGTGGTGGTTGTGGTGGTGGTGG-3'，SEQ ID NO：36)和T细胞的组(VEGF+对照适体+T细胞)。
如图4所示，已证实在将可替宁-培加尼布偶联物加入到与抗可替宁抗体片段连接的嵌合抗原受体T细胞的组(VEGF+Cot-培加尼布+T细胞)中，干扰素γ的分泌显著增加。
试验实施例2.使用可替宁-抗-HER2抗体偶联物证实与抗可替宁抗体片段连接的嵌合抗原受体T细胞的活化
使用实施例3-1中制备的可替宁-抗-HER2抗体偶联物，通过识别存在于细胞表面上的HER2确定偶联物是否诱导嵌合抗原受体细胞的活化。
首先，将作为HER2阳性细胞的AU565细胞系和作为HER2阴性细胞的MDA-MB-231细胞系分配到96孔圆底板的孔中，使得每孔具有3×104个细胞，并在5％CO2和37℃的条件下培养过夜。除去培养物上清后，将100μL可替宁-抗-HER2抗体偶联物以10μg/mL浓度加入到补充有10％胎牛血清和1％青霉素-链霉素的DMEM培养基(Gibco，美国)中，并在相同条件下培养1小时。此后，除去培养基，用无血清培养基洗涤细胞两次，然后加入实施例2中制备的嵌合抗原受体T细胞，使得每孔有3×105个细胞，并在5％CO2和37℃的条件下培养24小时。然后，根据制造商的方法，使用ELISA试剂盒测量培养基中分泌的干扰素γ的量，其结果显示在图5中。作为对照组，使用了在未培养肿瘤细胞的板中加入嵌合抗原受体T细胞的组(仅T细胞)，在培养肿瘤细胞的板中未加入任何物质的组(仅肿瘤)，在培养肿瘤细胞的板中加入嵌合抗原受体T细胞的组(肿瘤+T细胞)，在培养细胞的板中加入流感病毒血凝素特异性抗体(CT302)和嵌合抗原受体T细胞的组(CT302)，在培养肿瘤细胞的板中加入可替宁缀合的CT302抗体和嵌合受体T细胞的组(CT302-Cot)，在培养细胞的板中加入游离的抗-HER2抗体和嵌合抗原受体T细胞的组(抗-HER2)。
如图5所示，已证实在将可替宁-抗-HER2抗体偶联物加入到与抗可替宁抗体片段连接的嵌合抗原受体T细胞中的组(抗-HER2-Cot)中，干扰素γ的分泌显著增加。
试验实施例3.确认与抗可替宁抗体片段连接的嵌合抗原受体T细胞的抗原特异性活化
为了确定由与可替宁-抗-HER2抗体偶联物复合的抗可替宁抗体片段连接的嵌合抗原受体T细胞诱导的干扰素γ的分泌是否对与可替宁连接的抗体是特异性的，进行以下实验。
除了使用作为HER2阳性细胞的AU565细胞之外，在与试验实施例2相同的条件和方法下进行实验。将在表面不表达任何物质的T细胞、比较实施例1中制备的T细胞或者实施例2中制备的T细胞分别与在未培养肿瘤细胞的板中仅添加T细胞的组(仅T细胞)，在培养肿瘤细胞的板中添加CT302抗体和T细胞的组(CT302)，在培养肿瘤细胞的板中添加与CT302抗体偶联的可替宁和T细胞的组(CT302-Cot)，在培养细胞的板中添加游离的抗-HER2抗体和T细胞的组(抗-HER2)，以及在培养肿瘤细胞的板中添加与抗-HER2抗体偶联的可替宁和T细胞的组(抗-HER2-Cot)组合而加入。作为结果，通过ELISA方法测量分泌的干扰素γ的量并示于图6A中。
如图6A所示，已证实在将可替宁-抗-HER2抗体偶联物添加到与抗可替宁抗体片段连接的嵌合抗原受体T细胞中的组(抗-HER2-Cot)中，干扰素γ的分泌显著增加。因此，发现由与可替宁-偶联的结合分子特异性诱导干扰素γ的分泌。
试验实施例4.确认T细胞表面上呈递的嵌合抗原受体的表达
嵌合抗原受体的表达通过测量在表面上不表达任何嵌合抗原受体的T细胞和与在实施例2和比较实施例1中制备的抗可替宁抗体片段或者抗-CEA抗体片段连接的嵌合抗原受体T细胞中的c-myc标签染色阳性而确定。
首先，将在表面上不表达任何嵌合抗原受体的T细胞和在实施例2或比较实施例1中制备的嵌合抗原受体T细胞进行分配，使得每孔具有4×105个细胞。将分配的细胞用补充有1％牛血清白蛋白(BSA)和0.02％NaN3的PBS缓冲溶液洗涤两次，并且加入在缓冲溶液中以1:400的比例稀释后的抗c-myc抗体(BD Bioscience，美国)。混合物在冷藏下反应20分钟并用PBS缓冲溶液洗涤3次。向其中添加50μL的以1：1000的比例补充有链霉亲和素-PE(BDBioscience，美国)、以1：500的比例补充有抗-CD8-perCP-Cy5.5(BD Bioscience，美国)以及以1：1000的比例补充有抗-CD4-APC(BD Bioscience,美国)的PBS缓冲溶液，并将混合物在冷藏下反应25分钟。用PBS缓冲溶液洗涤3次后，将细胞重悬于总共300μL的PBS中。使用流式细胞仪(FACS Caliber，BD Bioscience，美国)分析c-myc阳性细胞，并将其结果显示在图6B中。将未用抗体处理的组(未染色)和仅用作为二抗的链霉亲和素-PE处理的组(对照)用作T细胞的对照组。
如图6B所示，已证实在实施例2和比较实施例1中制备的嵌合抗原受体T细胞表达抗可替宁抗体片段或抗-CEA抗体片段。
试验实施例5.使用可替宁-抗-CD20抗体偶联物确认与抗可替宁抗体片段连接的嵌合抗原受体T细胞的活化
使用在实施例3-1中制备的可替宁-抗-CD20抗体偶联物，确定偶联物是否通过识别细胞表面上的CD20来诱导嵌合抗原受体细胞的活化。具体而言，在与试验实施例2相同的条件和方法下进行实验，不同之处在于使用作为CD20阴性细胞的Jurkat E6.1细胞系和作为CD20阳性细胞的Raji细胞系代替了AU565细胞系和MDA-MB-231细胞系，并在补充有10％胎牛血清和1％青霉素-链霉素的RPMI-1640培养基中培养，并且在培养48小时后获得的培养液中测定分泌的干扰素γ的量。作为结果，分泌的干扰素γ的量如图7所示。将在未培养细胞的板中添加嵌合抗原受体T细胞的组(仅T细胞)，在培养肿瘤细胞的板中未添加任何物质的组(仅肿瘤)，以及在培养细胞的板中添加抗-CD20抗体和嵌合抗原受体T细胞的组(抗-CD20)用作对照组。
如图7所示，已证实在可替宁-抗-CD20抗体偶联物加入到与抗可替宁抗体片段连接的嵌合抗原受体T细胞中的组(抗-CD20-Cot)中，干扰素γ的分泌显著增加。
试验实施例6.使用可替宁-抗-HLA抗体偶联物确认与抗可替宁抗体片段连接的嵌合抗原受体T细胞的活化
使用实施例3-1中制备的可替宁-抗-HLA抗体偶联物，确定偶联物是否通过识别细胞表面上的HLA来诱导嵌合抗原受体细胞的活化。具体而言，除了使用作为HLA阴性细胞的NIH3T3细胞系和作为HLA阳性细胞的HLA7或HLA20细胞系代替AU565细胞系和MDA-MB-231细胞系以外，以与试验实施例2相同的条件和方法进行实验，并在补充有20％胎牛血清和1％青霉素-链霉素的IMDM培养基中培养，并且在培养48小时后获得的培养溶液中测定分泌的干扰素γ的量。
同时，通过以下方法制备HLA7和HLA20细胞系。具体地，将10mL外周血和相同量的PBS的混合溶液分配到15mL的Ficoll-Paque PLUS(GE Healthcare Life Science，美国)中，并以400×g离心30分钟，制动器设定为“0”。离心后，除去最上层的血浆，并取5mL外周血单核细胞层。向其中加入30mL RPMI-1640培养基，并在相同条件下离心10分钟。除去上清液，加入相同量的RPMI-1640培养基进行另一次洗涤。将沉淀的细胞重悬于2mL的含有20％胎牛血清的RPMI-1640培养基中，并计数细胞数量。将1×107个细胞分配到T25烧瓶中，并且添加总计6mL的培养基并在5％CO2和37℃的条件下培养。向其中加入2mL爱泼斯坦-巴尔病毒(VR-1492，ATCC，美国)并在相同条件下培养。培养2小时后，加入1μg/mL环孢菌素A(Gibco，美国)并在相同条件下培养4天。在培养第4天加入2mL的培养基，在第7天传代培养。当用爱泼斯坦-巴尔病毒转导的B细胞通过继续传代培养形成集落10至20天时，取两个集落继续传代培养。这样制备的两种永生化B细胞系分别命名为HLA7和HLA20。
作为结果，在图8中显示分泌的干扰素γ的量。将在未培养肿瘤细胞的板中添加嵌合抗原受体T细胞的组(仅T细胞)，在培养肿瘤细胞的板中未添加任何物质的组(仅肿瘤)，以及在培养细胞的板中添加游离的抗-HLA抗体和嵌合抗原受体T细胞的组(抗-HLA)用作对照组。
如图8所示，已证实在将可替宁-抗-HLA抗体偶联物加入到与抗可替宁抗体片段连接的嵌合抗原受体T细胞中的组(抗-HLA-Cot)中，干扰素γ的分泌显著增加。
试验实施例7.通过与可替宁-抗-HER2抗体偶联物和抗可替宁抗体片段连接的嵌合抗原受体T细胞证实靶细胞特异性凋亡效应
使用与实施例3-1中制备的抗可替宁抗体片段和可替宁-抗-HER2抗体偶联物连接的嵌合抗原受体T细胞，确定嵌合抗原受体T细胞是否通过识别细胞表面的HER2来诱导HER阳性肿瘤细胞的细胞死亡。
首先，将作为HER2阳性细胞的AU565细胞系和作为HER2阴性细胞的MDA-MB-231细胞系进行分配，使得2×106个细胞处于100mm细胞培养容器中。将分配的细胞在与试验实施例2相同的培养基和条件下培养。计数培养所得细胞，并且准备细胞使得AU565细胞系为每1mL具有2×107个细胞，MDA-MB-231细胞系为每1mL具有2×107个细胞，并分别向其中加入羧基荧光素二醋酸盐琥珀酰亚胺酯(CFSE，Invitrogen，美国)，浓度分别为1μM和100nM。在室温下反应8分钟以使各细胞系染色至不同的荧光强度后，使用流式细胞仪(BD Bioscience，美国)测定其结果，并显示于图9A中。
如图9A所示，所述AU565细胞系染色成弱荧光强度(CFSE低)，所述MDA-MB-231细胞系染色成强荧光强度(CFSE高)。
将染色的细胞用PBS洗涤两次，并将洗涤过的细胞系以1:1的比例各自以1.5×106个细胞混合并分配到96孔板中。当分配的细胞粘附后，向其中加入1μg/mL可替宁-抗-HER2抗体偶联物，并使其在室温下反应1小时。反应后，用培养基洗涤细胞系，计数，并放入5mL试管中，使得其具有5×104个细胞。在此，加入与抗可替宁抗体片段连接的嵌合抗原受体T细胞，并在5％CO2和37℃的条件下培养4小时或22小时。在此，将嵌合抗原受体T细胞(工作细胞系E)，AU565和MDA-MB-231细胞系(靶细胞系T)的比例设定为0:1，5:1或10:1。培养后，为了区分死细胞，每1×106个细胞中加入0.25μg 7-AAD(BD Bioscience，美国)，并在室温下反应10分钟，然后通过流式细胞仪分析。在此，分馏并分析7-AAD阴性细胞和CFSE阳性细胞。作为分析结果，根据下面的等式1计算靶细胞的细胞死亡率，并将结果显示在图9B中。
[等式1]
Figure GDA0001631816410000241
如图9B所示，已证实作为HER2阳性细胞系的AU565的细胞死亡随所添加的嵌合抗原受体T细胞的量成比例地增加。因此，发现与抗可替宁抗体片段连接的嵌合抗原受体T细胞特异性地诱导与可替宁-偶联的结合分子的细胞死亡。
试验实施例8.通过可替宁-细胞毒性物质的偶联物证实嵌合抗原受体T细胞的细胞死亡-诱导作用
通过Concortis Biotherapeutics制备可替宁-细胞毒性物质的偶联物，并且通过以下方法确定偶联物是否诱导实施例2中制备的嵌合抗原受体T细胞的细胞死亡。
具体而言，将嵌合抗原受体T细胞分配在96孔板中，使得其具有5×105个细胞，并在培养基中培养。向其中加入0、0.1、1、10、100或1000nM可替宁-细胞毒性物质的偶联物，并在5％CO2和37℃的条件下培养48小时。对于添加的可替宁-细胞毒性物质的偶联物，使用可替宁-多卡米星单偶联物，可替宁-DM1复合偶联物(2×可替宁-4×DM1)，或者可替宁-多卡米星复合偶联物(2×可替宁-4×多卡米星)(图11)。培养后，用7-AAD对活细胞进行染色，并使用流式细胞仪分析用7-AAD或c-myc标签染色的细胞。作为分析的结果，使用下面的等式2计算由可替宁-细胞毒性物质的偶联物引起的嵌合抗原受体T细胞的细胞毒性，并将结果示于图10A、图10B和图10C中。使用比较实施例2中制备的T细胞作为对照组。
[等式2]
Figure GDA0001631816410000251
如图10A、图10B和图10C所示，已证实与比较实施例2的T细胞相比，更低剂量的可替宁-细胞毒性物质的偶联物可以诱导与抗可替宁抗体片段连接的嵌合抗原受体T细胞的细胞死亡。
从以上结果可以发现，使用少量的可替宁-细胞毒性物质的偶联物可以诱导与抗可替宁抗体片段连接的嵌合抗原受体T细胞的细胞死亡。
Figure IDA0001631816420000011
Figure IDA0001631816420000021
Figure IDA0001631816420000031
Figure IDA0001631816420000041
Figure IDA0001631816420000051
Figure IDA0001631816420000061
Figure IDA0001631816420000071
Figure IDA0001631816420000081
Figure IDA0001631816420000091
Figure IDA0001631816420000101
Figure IDA0001631816420000111
Figure IDA0001631816420000121
Figure IDA0001631816420000131
Figure IDA0001631816420000141
Figure IDA0001631816420000151
Figure IDA0001631816420000161
Figure IDA0001631816420000171
Figure IDA0001631816420000181
Figure IDA0001631816420000191
Figure IDA0001631816420000201
Figure IDA0001631816420000211
Figure IDA0001631816420000221

Claims (19)

1.一种用于预防或治疗特定细胞增殖的病症或疾病的药物试剂盒，所述药物试剂盒包括嵌合抗原受体细胞以及可替宁-偶联的细胞毒性物质，所述嵌合抗原受体细胞包括与抗可替宁抗体连接的嵌合抗原受体，该嵌合抗原受体包含：
抗可替宁抗体或其片段；
铰链域；
跨膜域；和
信号转导域，并且
所述细胞毒性物质是多卡米星或DM1，且
所述抗可替宁抗体或其片段包括重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区包括氨基酸序列分别由SEQ ID NO：23至25表示的CDR1、CDR2和CDR3，并且所述轻链可变区包括氨基酸序列分别由SEQ ID NO：26至28表示的CDR1、CDR2和CDR3。
2.根据权利要求1所述的药物试剂盒，其特征在于，所述片段是抗可替宁抗体的Fab、Fab'、F(ab')2、Fv、或scFv。
3.根据权利要求1所述的药物试剂盒，其特征在于，所述抗可替宁抗体的片段具有SEQID NO:1的氨基酸序列。
4.根据权利要求1所述的药物试剂盒，其特征在于，所述铰链域选自：CD8铰链域、IgG1铰链域、IgG4铰链域、CD28胞外区、杀伤免疫球蛋白样受体胞外区，及其组合。
5.根据权利要求4所述的药物试剂盒，其特征在于，所述CD8铰链域具有SEQ ID NO:3的氨基酸序列。
6.根据权利要求1所述的药物试剂盒，其特征在于，所述跨膜域是CD3ζ、CD4、CD8、CD28或杀伤免疫球蛋白样受体蛋白的跨膜域。
7.根据权利要求6所述的药物试剂盒，其特征在于，所述跨膜域包括CD28的跨膜域。
8.根据权利要求7所述的药物试剂盒，其特征在于，所述CD28的跨膜域具有SEQ ID NO:5或SEQ ID NO:7的氨基酸序列。
9.根据权利要求1所述的药物试剂盒，其特征在于，所述信号转导域是CD3ζ、CD278、CD28、CD134、CD137、杀伤免疫球蛋白样受体或DNAX活化蛋白12。
10.根据权利要求9所述的药物试剂盒，其特征在于，所述信号转导域是CD28和CD3ζ的细胞质区。
11.根据权利要求9所述的药物试剂盒，其特征在于，所述信号转导域是CD137和CD3ζ的细胞质区。
12.根据权利要求10所述的药物试剂盒，其特征在于，所述CD28的细胞质区具有SEQ IDNO:9或SEQ ID NO:11的氨基酸序列。
13.根据权利要求10或11所述的药物试剂盒，其特征在于，所述CD3ζ的细胞质区具有SEQ ID NO:13的氨基酸序列。
14.根据权利要求1所述的药物试剂盒，其特征在于，所述嵌合抗原受体具有SEQ IDNO:15或SEQ ID NO:17的氨基酸序列。
15.根据权利要求1所述的药物试剂盒，其特征在于，所述嵌合抗原受体细胞是T细胞、自然杀伤细胞或巨噬细胞。
16.根据权利要求1所述的药物试剂盒，其特征在于，所述病症或疾病是癌症。
17.根据权利要求16所述的药物试剂盒，其特征在于，所述癌症是实体癌症或恶性血液病。
18.根据权利要求17所述的药物试剂盒，其特征在于，所述实体癌症选自肺癌、前列腺癌、甲状腺癌、乳腺癌、脑癌、头颈部肿瘤、食道癌、皮肤癌、黑色素瘤、视网膜母细胞瘤、胸腺癌、胃癌、结直肠癌、肝癌、卵巢癌、子宫癌、膀胱癌、胆囊癌、胆管癌和胰腺癌。
19.根据权利要求17所述的药物试剂盒，其特征在于，所述恶性血液病是淋巴瘤、白血病或多发性骨髓瘤。
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