CN111263640A - 组织因子靶向car-nk和car-t细胞疗法 - Google Patents

Abstract

公开了与识别组织因子(TF)的嵌合抗原受体(CAR)有关的方法和组合物。具体地，公开了包含fVII或其功能片段的CAR。还公开了包含本文公开的CAR的免疫效应细胞。

Description

组织因子靶向CAR-NK和CAR-T细胞疗法

相关申请的交叉引用

本申请要求2017年9月27日提交的美国临时申请号62/564,006的权益，该临时申请通过引用其全部内容并入本文。

背景技术

组织因子("TF")是跨膜糖蛋白，是凝血级联的主要引发剂。在正常的生理条件下，活性TF不与血液接触。在血管损伤期间，暴露于内皮下TF和胶原的血液中会导致凝血因子和血小板的激活，随后导致止血栓子形成。在各种临床环境中不恰当地诱导TF表达可导致危及生命的血栓形成和/或导致病理学并发症。斑块破裂后的TF暴露被认为是导致急性心肌梗死和中风的血栓性闭塞的原因。在这些情况下，由凝血因子激活的促炎信号通路也导致水肿形成和梗死面积增加。与血管成形术相关的血管损伤导致平滑肌细胞(SMC)上的TF上调，这被认为会诱导与再狭窄相关的细胞信号通路。TF在癌症和革兰氏阴性脓毒症中的过度表达导致危及生命的血栓形成和炎性途径的激活。

TF是病理性血管生成的调节剂。体内研究表明，TF在体内也是一种独特的病理性血管生成性血管内皮细胞(VEC)表面受体，因为它在来自患者或动物模型的肿瘤脉管系统(Contrino等人，1996；Folkman等人，1996；Hu等人，1999；Hu等人，2001；Cheng等人，2011；Duanmu等人，2011)、眼睛(Bora等人，2003)和异位(Krikun等人，2010)新血管系统中在体内血管生成VEC上具有选择性表达。血管内皮生长因子(VEGF)在血管生成依赖性癌症和非恶性人类疾病(Ferrara等人，2002)，例如黄斑变性(Klagsbrun等人，1987)，类风湿关节炎(Afuwape等人，2002)和子宫内膜异位(Fujimoto等人，1999)中起关键作用。具体地，在那些血管生成依赖性疾病中，VEGF通过与在病理性新血管系统(通常是微血管或毛细血管)中，VEC上的VEGR受体结合来刺激血管生成(Hu等人，Angiogenesis2016)。使用VEGF诱导的体外血管生成性血管内皮模型，结果表明TF是一种血管生成特异性受体，是因子VII靶向治疗的靶标(Hu等人，Angiogenesis 2016)，表明TF靶向剂可能对治疗癌症(实体癌和白血病)、湿性与年龄有关的黄斑变性(AMD)、子宫内膜异位和类风湿关节炎具有治疗潜力。

TF是癌细胞、癌症干细胞(CSC)(Hu等人，Oncotarget 2016)和实体癌中的肿瘤血管内皮细胞的共同的(至今仍是特定的)生物标志物和治疗靶标。TF在这些癌细胞中高度表达(乳腺癌中80％-100％，肺癌中40％-80％，卵巢癌中84％)。这三种类型的癌症不仅难以控制，而且还是美国和世界范围内死亡的主要原因，并且经常形成基于CSC的对化学疗法和放射疗法的抗药性(Vidal等人，2014；Moncharmont等人，2012；Koch等人，2010)。除乳腺癌、肺癌和卵巢癌外，TF在许多其他人类实体癌、白血病、肉瘤、骨髓瘤和潜在淋巴瘤中也以高百分比表达(表1)，例如，原发性黑素瘤中95％，转移性黑素瘤中100％，胰腺癌中53％-90％，结直肠癌中57％-100％，肝细胞癌中63％-100％，原发性和转移性前列腺癌中60％-78％，神经胶质瘤中47％-75％(Hu.Antibodies 2018)。最近，研究表明，TF在乳腺癌、肺癌、卵巢癌以及潜在的其他实体癌(例如头颈癌)中由癌症干细胞表达，并且TF靶向剂可以根除那些TF表达的癌症干细胞而无耐药性(Hu等人，Oncotarget 2016)。

研究还表明，TF是由脉络膜新血管系统(CNV)表达的，它是AMD在实验动物中的模型(Bora等人，2003)。还已经表明，TF在子宫内膜异位病变中由血管生成性血管内皮细胞表达。

嵌合抗原受体(CAR)表达的免疫效应细胞的过继转移代表新型的癌症免疫治疗方法。CAR的概念基于在T或NK细胞表面上表达新型受体的思想，其能使T和NK细胞识别靶细胞表面上的相应抗原。基本的CAR构建体由细胞外抗原识别结构域，通常是连接到细胞外间隔子结构域的单链抗体可变片段(scFv)、CD28的跨膜结构域和信号胞质结构域，例如4-1BB(CD137)、OX40(CD134)、DAP10、ICOS和CD3ζ链(Cd3ζ)组成。最先进的应用是靶向CD19的CAR-T细胞的使用，CD19是B细胞恶性肿瘤的表面抗原，其已被证明对患者的B细胞恶性肿瘤具有抗肿瘤功效(P.J.Paszkiewicz et al.,Targeted antibody-mediated depletion ofmurine CD19 CAR T cells permanently reverses B cell aplasia.J Clin Invest126,4262-4272(2016))。本领域需要的是TF靶向CAR修饰的免疫效应细胞。

附图说明

并入在本说明书中并且构成本说明书的一部分的附图阐明本公开的若干方面，并且与说明一起用以解释本公开的原理。

图1A-B显示了TF靶向CAR1单体(图1A)和二聚体(图1B)的图。fVIIL：VII因子轻链。铰链：人IgG1的铰链区。GFP：绿色荧光蛋白。Puro：嘌呤霉素。CAR1单体和二聚体之间的唯一区别是，二聚体构建体包含IgG1铰链区，其中两个半胱氨酸残基将形成二硫键以形成同源二聚体。

图2A-C显示了稳定的TF靶向CAR1-NK细胞系的产生。编码CAR1单体和二聚体的慢病毒已成功转染NK92MI/全长CD16(fCD16)细胞系，并且在选择2.5μg/ml嘌呤霉素的情况下已产生稳定的细胞系(图2a和b)。未感染的NK92MI/fCD16细胞用作对照，不表达GFP(图2c)。使用明亮和绿色通道拍摄照片，并在Zeo细胞成像仪(Bio-Rad)下合并。比例尺：100μm。

图3A-F显示了质粒pCDH和编码TF靶向CAR1二聚体和单体的慢病毒可以使用PEG-it纯化病毒(图3c、3d)或上清液中未纯化的载体(SNT)(图3e、3f)转染中国仓鼠卵巢细胞CHO-K1(图3a、3b)和感染人胚胎肾细胞293AD。使用明亮和绿色通道拍摄照片，并在Zeo细胞成像仪(Bio-Rad)下合并。比例尺：100μm。

图4A-D显示了通过RT-PCR，CAR1、CD16和β肌动蛋白在NK92MI/fCD16细胞中的表达。通过Trizol试剂从用CAR1单体(M)或二聚体(D)稳定转染的NK92MI/fCD16细胞中提取总RNA。未用CD16质粒转染的亲本NK92MI细胞用作CAR1和CD16的阴性对照(C)。A.CAR1。B.CD16。C.检验了β肌动蛋白作为总RNA的上样对照。来自两个独立实验的代表性照片。D.使用抗人因子VII HRPO偶联物(Cedarlane Laboratories)进行fVII表达的ELISA检测。D中的数据表示为平均值+/-SEM。

图5A-D显示了在原位NSG小鼠模型中TF-CAR-NK细胞对TNBC细胞的体外细胞毒性、功效和安全性，以及在体内用于TNBC CDX的治疗。A.使用CytoTox均相测定法(Promega)测定NK-CAR1二聚体和单体以及NK对照(效应细胞)对TNBC系(靶细胞，MDA-MB-231)的细胞毒性。CAR1二聚体和单体：NK92MI细胞表达CD16和TF靶向CAR1二聚体或单体。对照细胞：未感染的NK92MI(ATCC)作为NK对照(GFP、CD16和CAR1阴性)。注意：将效应细胞(E)与靶细胞(T)直接温育，以测定TF-CAR-NK对TNBC的直接杀伤。B-D：在第0天，用一次静脉注射2×10⁶CAR1-NK细胞或对照NK细胞治疗的雌性NSG小鼠的肿瘤体积(B)、肿瘤重量(C)和小鼠体重(D)。通过t检验或方差分析(Prism软件)分析数据，并以平均值+/-SEM表示。

图6A-C显示TF-CAR-NK细胞疗法在原位NSG小鼠模型中用于治疗人TNBC PDX的先导研究中是有效且安全的。TNBC PDX(JAX)是在四周大的雌性NSG小鼠体内产生的。当PDX肿瘤达到约100mm³时，通过尾静脉(每只小鼠3×10⁶个细胞，箭头)(每组三只小鼠)静脉注射(i.v.)NK92MI表达的CAR1二聚体和CD16(CAR1二聚体)。向对照小鼠静脉注射不含CAR1的NK92MI细胞。

图7A-D显示TF-CAR-NK细胞疗法在原位NSG小鼠模型中用于治疗人TNBC PDX是有效且安全的。TNBC PDX(JAX)是在四周大的雌性NSG小鼠体内产生的。当PDX肿瘤达到约100mm³时，通过尾静脉(每只小鼠3×10⁶个细胞，箭头)(每组五只小鼠)静脉注射NK92MI表达的CAR1二聚体和CD16(CAR1二聚体)。不含CAR的亲本NK92MI用作对照。a.肿瘤体积。b-c.在处死动物时测量肿瘤重量和小鼠体重。ns：无意义；*，***，****：p<0.05，0.001和0.0001。

具体实施方式

定义

本文使用的冠词“一个(a)”和“一个(an)”用于指该冠词的一个或多于一个(即，至少一个)的语法对象。举例来说，“一种元素”可以指一种或多种元素。

当提及诸如量、持续时间等的可测量值时，如本文所用的“约”意味着包括指定值的+-.20％或.+-.10％、更优选+-.5％、甚至更优选.+-.1％，且仍更优选+-.0.1％的变化，因为这样的变化适用于进行所公开的方法。

“预防性”治疗是施用给受试者的治疗，其不表现出疾病的体征或仅表现出早期体征，以降低发生病理的风险。本发明的化合物可以作为预防性治疗给予，以降低发生病理的可能性或最小化病理的严重性(如果发生的话)。

“治疗性”治疗是为了减轻或消除那些体征或症状而对表现出病理体征或症状的受试者施用的治疗。体征或症状可以是生化的、细胞的、组织学的、功能的、主观的或客观的。

多肽的“片段”是指多肽的小于全长多肽或蛋白质表达产物的任何部分。一方面，片段是全长多肽的缺失类似物，其中一个或多个氨基酸残基已经从全长多肽的氨基末端和/或羧基末端去除。因此，“片段”是下述缺失类似物的子集。

可互换使用的“类似物(analogue)”、“类似物(analog)”或“衍生物(derivative)”是指化合物，例如肽或多肽，其结构基本相似且具有相同的生物活性，尽管在某些情况下程度不同，但是指天然存在的分子。基于一种或多种突变，涉及(i)多肽的一个或多个末端和/或天然存在的多肽序列的一个或多个内部区域的一个或多个氨基酸残基的缺失，(ii)在该多肽的一个或多个末端(通常是“添加”类似物)和/或天然存在的多肽序列的一个或多个内部区域(通常是“插入”类似物)的一个或多个氨基酸的插入或添加，或(iii)用一个或多个氨基酸取代天然存在的多肽序列中的其他氨基酸，与衍生该类似物的天然存在的多肽相比，类似物在其氨基酸序列组成方面有所不同。

当在生物体、组织、细胞或其组分的上下文中使用时，术语“异常”是指那些生物体、组织、细胞或其组分在至少一种可观察或可检测的特征(例如年龄、治疗、当日时间等)方面与显示“正常”(预期的)相应特征的生物体、组织、细胞或其组分不同。对于一种细胞或组织类型而言正常或预期的特征对于不同的细胞或组织类型而言可能是异常的。

如本文所用，“减轻”疾病意指减少疾病或病症的至少一种体征或症状的频率或严重性。

“核酸”是指多核苷酸，并且包括聚核糖核苷酸和聚脱氧核糖核苷酸。根据本发明的核酸可以包括嘧啶和嘌呤碱基的任何聚合物或低聚物，优选分别为胞嘧啶、胸腺嘧啶和尿嘧啶，以及腺嘌呤和鸟嘌呤。(参见Albert L.Lehninger,Principles of Biochemistry,at 793-800(Worth Pub.1982)，出于所有目的将其全部内容并入本文)。实际上，本发明考虑了任何脱氧核糖核苷酸、核糖核苷酸或肽核酸组分，及其任何化学变体，例如这些碱基的甲基化、羟甲基化或糖基化形式等。聚合物或低聚物的组成可以是异质的或均质的，并且可以从天然来源中分离出来，或者可以人工或合成地生产。另外，核酸可以是DNA或RNA或其混合物，并且可以单链或双链形式永久或过渡存在，包括同双链、异双链和杂合态。

如本文所用，术语“肽”、“多肽”和“蛋白质”可互换使用，并且是指由通过肽键共价连接的氨基酸残基组成的化合物。蛋白质或肽必须含有至少两个氨基酸，并且对可包含蛋白质或肽序列的氨基酸的最大数量没有限制。多肽包括通过肽键彼此连接的任何肽或蛋白质，其包含两个或多个氨基酸。如本文所用，该术语是指短链，其在本领域中通常也称为肽、寡肽和低聚物，并且例如是指较长的链，其通常在本领域中称为蛋白质，其中存在有很多种类型的蛋白质。“多肽”包括，例如，生物活性片段，基本上同源的多肽、寡肽、同二聚体、异二聚体、多肽的变体、修饰的多肽、衍生物、类似物、融合蛋白等。多肽包括天然肽、重组肽、合成肽或其组合。

如本文所用，“多核苷酸”包括cDNA、RNA、DNA/RNA杂合体，反义RNA、小发夹RNA(shRNA)、核酶、基因组DNA、合成形式和混合的聚合物、有义链和反义链，并且可以是化学或生物化学修饰的以含有非天然或衍生的、合成的或半合成的核苷酸碱基。此外，还考虑了野生型或合成基因的改变，包括但不限于缺失、插入、一个或多个核苷酸的取代或与其他多核苷酸序列的融合。

如本文所用，术语“诊断”是指确定疾病或病症的存在。在本发明的一些实施例中，提供了进行诊断的方法，其允许确定特定疾病或病症的存在。

“疾病”是受试者的健康状态，其中受试者不能维持体内平衡，并且其中如果疾病没有改善，则受试者的健康继续恶化。相反，受试者中的“病症”是一种健康状态，其中受试者能够维持体内平衡，但其中受试者的健康状况不如没有病症时的健康状态。如果不治疗，病症不一定会导致受试者的健康状况进一步下降。

如本文所用，术语“疗法”或“治疗方案”是指为减轻或改变病症或疾病状态而采取的那些活动，例如旨在使用药理作用、外科、饮食和/或其他技术减少或消除疾病或疾病的至少一种体征或症状的治疗过程。治疗方案可以包括规定剂量的一种或多种药物或手术。疗法通常是有益的，并且可以减少或消除病症或疾病状态的至少一种体征或症状，但是在某些情况下，治疗的效果将具有不期望或副作用。疗法的效果也将受到受试者的生理状态的影响，例如年龄、性别、遗传学、体重、其他疾病状况等。

术语“治疗有效量”是指将引起研究人员、兽医、医生或其他临床医生正在寻求的组织、系统或受试者的生物或医学反应的主题化合物的量。术语“治疗有效量”包括化合物的量，当施用时，其足以预防所治疗的病症或疾病的一种或多种体征或症状的发展或在一定程度上减轻。治疗有效量将根据化合物、疾病及其严重性和待治疗受试者的年龄、体重等而变化。

如本文使用的术语“治疗”疾病是指降低受试者经历的疾病或病症的至少一种体征或症状的频率或严重性。

除非特别指出，否则本文所用的术语“细胞”还指单个细胞、细胞系、原代培养物或衍生自此类细胞的培养物。“培养物”是指包含相同或不同类型的分离的细胞的组合物。细胞系是可以无限期繁殖的特定类型细胞的培养物，因此使细胞系“永生”。细胞培养物可以是在诸如琼脂的培养基上生长的细胞群。原代细胞培养物是来自细胞的培养物或直接取自非永生的活生物体的培养物。

术语“生物样品”是指组织(例如，组织活检)、器官、细胞(包括保持在培养物中的细胞)、细胞裂解物(或裂解物级分)、衍生自细胞或细胞材料的生物分子(例如，多肽或核酸)或受试者的体液。体液的非限制性实例包括血液、尿液、血浆、血清、泪液、淋巴液、胆汁、脑脊液、间质液、房水或玻璃体液、初乳、痰、羊水、唾液、肛门和阴道分泌物、汗液、精液、渗出液、溢出物和滑液。

范围：贯穿本公开内容，本发明的各个方面可以范围形式呈现。应当理解，范围形式的描述仅仅是为了方便和简洁，不应该被解释为对本发明范围的不可改变的限制。因此，应该认为范围的描述已经具体公开了所有可能的子范围以及该范围内的各个数值。例如，应当认为对诸如1至6的范围的描述具有特定公开的子范围，例如1至3、1至4、1至5、2至4、2至6、3至6等，以及在该范围内的单个数字，例如，1、2、2.7、3、4、5、5.3和6。无论范围的宽度如何，这都适用。

根据本文教导的方法，向受试者施用有效量的试剂。术语有效量和有效剂量可互换使用。术语有效量定义为产生期望的生理反应所必需的任何量。可以凭经验确定施用试剂的有效量和时间表，并且进行这种确定在本领域技术范围内。施用的剂量范围是足够大以产生期望效果的那些剂量范围，其中疾病或病症的一种或多种症状受到影响(例如，减少或延迟)。剂量不应太大以致引起严重的不利副作用，例如不希望的交叉反应、过敏反应等。通常，剂量将随年龄、状况、性别、疾病类型、疾病或病症的程度、施用途径或方案中是否包括其他药物而变化，并且可以通过本领域技术人员来确定。如果有任何禁忌症，也可以由个体医生来调整剂量。剂量可以变化，并且可以每天一剂量或多剂量施用，持续一天或几天。对于给定类别的药品，可以在文献中找到针对适当剂量的指南。

如本文所用，术语治疗(treatment)、治疗(treat)或治疗(treating)是指减轻疾病或病况的影响或该疾病或病况的症状的方法。因此，在所公开的方法中，治疗可以指已确定疾病或病况或疾病或病症的症状的严重性降低10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或100％。例如，如果与对照相比，受试者的一种或多种疾病症状减少了10％，则认为该疾病的治疗方法为治疗。因此，与天然或对照水平相比、减少量可以是10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％、或在10％和100％之间的任何百分比减少。应当理解，治疗不一定指治愈，完全消融疾病、病况或疾病或病症的症状。

如本文所用，术语预防(prevent)、预防(preventing)和预防(prevention)疾病或病症是指在受试者开始表现出疾病或病症的一种或多种症状之前或大约同时发生的作用，例如治疗剂的施用，其抑制或延迟该疾病或病症的一种或多种症状的发作或加重。如本文所用，与对照水平相比，所参考的减少、降低或抑制包括变化10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或更大。这样的术语可以包括但不一定包括完全消除。

概述

本文公开的是组织因子(TF)靶向CAR-NK和CAR-T细胞。在TF靶向CAR的设计和开发中，使用因子VII(fVII或fVIIL)的全长(野生型和活性位点突变的)或轻链，TF的天然配体，代替针对TF的抗体或scFv，作为TF的识别结构域。首先，fVII与TF的亲和力大于抗体和TF抗原的亲和力约100-1000倍。其次，fVII可以通过重组DNA技术合成，而无需人源化单克隆抗体或筛选scFv文库。此外，fVII的轻链(前152个氨基酸残基)可以与全长fVII相同或比其更牢固地与TF表达的人和鼠癌细胞结合(Hu等人，Cancer Immunology Research.2018)。因此，本文公开的TF靶向CAR由人因子VII轻链作为TF靶向结构域，不具有或具有连接至CD28跨膜和胞质结构域的人IgG1的铰链区，然后是命名为TF靶向CAR1单体和二聚体(GenBank登录号分别为MF806378和MF806379)的4-1BB和Cd3ζ的胞质结构域(图1)组成。

任何TF-靶向/结合分子可与本文公开的组合物和方法一起用于体内或体外靶向TF。如上所述，fVII可以用于靶向TF。因此，本文公开了能够靶向TF的任何fVII。fVII可以从任何受试者获得，包括但不限于人、灵长类、鼠类、牛、猪、大鼠、犬和猫科动物。可以在SEQID NO:4中找到实例(编码多肽的核酸由SEQ ID NO:3表示)。本文公开的氨基酸序列与SEQID NO:4至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同源。

在某些非限制性实施例中，CAR的跨膜结构域可包含跨越膜的至少一部分的疏水性α螺旋。不同的跨膜结构域导致不同的受体稳定性。抗原识别后，受体聚集，信号传递到细胞。根据本公开的主题，CAR的跨膜结构域可以包含CD8多肽、CD28多肽、CD3ζ多肽、CD4多肽、4-1BB多肽、OX40多肽、ICOS多肽、CTLA-4多肽、PD-1多肽、LAG-3多肽、2B4多肽、BTLA多肽或合成肽(不基于与免疫反应相关的蛋白质)，或其组合。

在某些非限制性实施例中，CAR的细胞内结构域还包含至少一个信号传导区。至少一个信号传导区可以包括CD28多肽、4-1BB多肽、OX40多肽、ICOS多肽、DAP-10多肽、PD-1多肽、CTLA-4多肽，LAG-3多肽、2B4多肽、BTLA多肽、合成肽(不基于与免疫反应相关的蛋白质)，或其组合。在某些实施例中，信号传导区是共刺激信号传导区。在某些实施例中，共刺激区包含至少一种共刺激分子，其可以提供最佳的淋巴细胞激活。

如本文所用，“共刺激分子”是指淋巴细胞对抗原的有效应答所需要的除抗原受体或其配体以外的细胞表面分子。至少一个共刺激信号传导区可以包括CD28多肽、4-1BB多肽、OX40多肽、ICOS多肽、DAP-10多肽或其组合。共刺激分子可以与共刺激配体结合，其是在细胞表面表达的蛋白质，与受体结合后会产生共刺激反应，即细胞内反应，其影响抗原与它的CAR分子结合时所提供的刺激。共刺激配体包括但不限于CD80、CD86、CD70、OX40L、4-1BBL、CD48、TNFRSF14和PD-L1。举一个实例，4-1BB配体(即4-1BBL)可以与4-1BB(也称为“CD137”)结合，以提供一种细胞内信号，该信号与CAR信号结合诱导CAR+T的效应细胞功能。U.S.7,446,190中公开了包含细胞内结构域的CAR，该细胞内结构域包含含4-1BB、ICOS或DAP-10的共刺激信号传导区(例如，在U.S.7,446,190中，编码4-1BB的核苷酸序列示于SEQID NO:15，编码ICOS的核苷酸序列示于SEQ ID NO:16，编码DAP-10的核苷酸序列示于SEQID NO:17)，其全部内容通过引用合并于此。在某些实施例中，CAR的细胞内结构域包含共刺激信号传导区，其包含CD28多肽。在某些实施例中，CAR的细胞内结构域包含共刺激信号传导区，其包含两个共刺激分子：CD28和4-1BB或CD28和OX40。

在某些实施例中，本公开主题的CAR可以进一步包含诱导型启动子，用于在人细胞中表达核酸序列。用于表达CAR基因的启动子可以是组成型启动子，例如泛素蛋白C(UbiC)启动子。

细胞表达TF靶向CAR

如上所述，本公开的主题提供了表达包含TF结合结构域的CAR的免疫应答细胞。可以用本公开的CAR转导免疫应答细胞，从而使细胞表达CAR。本公开的主题还提供了使用这种细胞治疗癌症的方法，例如三阴性乳腺癌(TNBC)。本公开的主题的免疫应答细胞可以是淋巴谱系的细胞，其可以是来自健康供体和/或来自患者的原代细胞或离体激活和扩增的细胞。可以从本领域技术人员已知的任何来源获得细胞。包括B、T和自然杀伤(NK)细胞的淋巴谱系提供抗体的产生、细胞免疫系统的调节、血液中异源试剂的检测、宿主异源细胞的检测等。

淋巴谱系的免疫应答细胞的非限制性实例包括T细胞、自然杀伤(NK)细胞、细胞毒性T淋巴细胞(CTL)、调节性T细胞、胚胎干细胞和多能干细胞(例如，可以从中分化出淋巴样细胞的细胞)。T细胞可以是在胸腺中成熟的淋巴细胞，主要负责细胞介导的免疫力。T细胞参与适应性免疫系统。本公开的主题的T细胞可以是任何类型的T细胞，包括但不限于T辅助细胞、细胞毒性T细胞、记忆T细胞(包括中央记忆T细胞、干细胞样记忆T细胞(或干细胞样记忆T细胞)和两种类型的效应记忆T细胞：例如TEM细胞和TEMRA细胞)，调节性T细胞(也称为抑制性T细胞)、自然杀伤性T细胞，粘膜相关的不变性T细胞和γδT细胞。在某些实施例中，CAR表达的T细胞表达Foxp3以实现并维持T调节表型。自然杀伤(NK)细胞可以是淋巴细胞，它是细胞介导的免疫力的一部分，并在先天免疫反应期间起作用。NK细胞不需要事先激活即可在靶细胞上执行其细胞毒性作用。细胞毒性T细胞(CTL或杀伤性T细胞)是能够诱导感染的体细胞或肿瘤细胞死亡的T淋巴细胞的子集。

本公开的主题的免疫应答细胞可以表达TF结合结构域。可将此类免疫应答细胞施用给需要其的受试者(例如，人类受试者)以治疗TF相关疾病，例如癌症。在某些实施例中，免疫应答细胞是T细胞。T细胞可以是CD4+T细胞或CD8+T细胞。在某些实施例中，T细胞是CD4+T细胞。在另一个实施例中，T细胞是CD8+T细胞。

可以用至少一种共刺激配体进一步转导本公开的免疫应答细胞，使得免疫应答细胞共表达或被诱导共表达TF特异性CAR和至少一种共刺激配体。TF特异性CAR和至少一种共刺激配体之间的相互作用提供了对于完全激活免疫应答细胞(例如，T细胞)重要的非抗原特异性信号。共刺激配体包括但不限于肿瘤坏死因子(TNF)超家族成员和免疫球蛋白(Ig)超家族配体。TNF是一种参与全身性炎症的细胞因子，可刺激急性期反应。它的主要作用是调节免疫细胞。TNF超家族成员具有许多共同特征。TNF超家族的大多数成员被合成为II型跨膜蛋白(胞外C端)，包含短的细胞质节段和相对长的胞外区。TNF超家族成员包括但不限于，神经生长因子(NGF)、CD40L(CD40L)/CD154、CD137L/4-1BBL、TNF-、CD134L/OX40L/CD252、CD27L/CD70、Fas配体(FasL)、CD30L/Cd153、肿瘤坏死因子β(TNFP)/淋巴毒素α(Ltcc)、淋巴毒素β(LTP)、CD257/B细胞激活因子(BAFF)/Blys/THANK/Tall-1、糖皮质激素诱导的TNF受体配体(GITRL)和TNF相关的细胞凋亡诱导配体(TRAIL)、LIGHT(TNFSF14)。免疫球蛋白(Ig)超家族是一大批细胞表面和可溶性蛋白，它们参与细胞的识别、结合或粘附过程。这些蛋白质与免疫球蛋白共享结构特征，因为它们具有免疫球蛋白结构域(折叠)。免疫球蛋白超家族配体包括但不限于CD80和CD86，用于CD28的两个配体，PD-L1/(B7-H1)，其是用于PD-1的配体。

在某些实施例中，至少一种共刺激配体选自4-1BBL、CD80、CD86、CD70、OX40L、CD48、TNFRSF14、PD-L1及其组合。在某些实施例中，用一种为4-1BBL的共刺激配体转导免疫应答细胞。在某些实施例中，用两个共刺激配体4-1-1BBL和CD80转导免疫应答细胞。在美国专利第8,389,282号中描述了用至少一种共刺激配体转导的CAR，该专利全文以引用方式并入本文。

此外，可用至少一种细胞因子进一步转导本公开的免疫应答细胞，以使免疫应答细胞分泌至少一种细胞因子并表达TF特异性CAR。在某些实施例中，至少一种细胞因子选自IL-2、IL-3、IL-6、IL-7、IL-11、IL-12、IL-15、IL-17和IL-21。在某些实施例中，细胞因子是IL-12。

可用于外周供体淋巴细胞的TF特异性或TF靶向人类淋巴细胞，例如，Sadelain,M.等人，2003Nat Rev Cancer 3:35-45中(公开了经过基因修饰以表达CAR的外周供体淋巴细胞)，Morgan,R.A.等人，2006Science 314:126-129中(公开了经基因修饰以表达包括α和β异二聚体的全长肿瘤抗原识别T细胞受体复合物的外周血供体淋巴细胞)，Panelli,M.C.等人，2000J Immunol 164:495-504中；Panelli,M.C.,等人，2000J Immunol 164:4382-4392中(公开了在肿瘤活组织检查中源自肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)的淋巴细胞培养物)，以及在Dupont,J.等人，2005Cancer Res 65:5417-5427中；Papanicolaou,G.A.,等人，2003Blood102:2498-2505中(选择性地公开了使用人工抗原呈递细胞(AAPC)或脉冲树突状细胞的体外扩增的抗原特异性外周血白细胞)中公开的那些。免疫应答细胞(例如，T细胞)可以是自体的、非自体的(例如，同种异体的)，或在体外从工程化的祖细胞或干细胞衍生而来。

在某些实施例中，本公开的免疫应答细胞(例如，T细胞)表达约1至约4，约2至约4，约3至约4，约1至约2，约1至约3，或约2至约3个向量拷贝数/本公开的TF特异性CAR的细胞。

未纯化的CTL来源可以是本领域已知的任何来源，例如骨髓、胎儿、新生儿或成年或其他造血细胞来源，例如，胎儿肝脏、外周血或脐带血。可以采用各种技术来分离细胞。例如，阴性选择方法最初可以去除非CTL。单克隆抗体对于鉴定与特定细胞谱系和/或阳性和阴性选择的分化阶段有关的标记特别有用。

最初可以通过相对粗略的分离除去大部分末端分化的细胞。例如，磁珠分离最初可用于去除大量无关细胞。优选地，在细胞分离之前，将去除全部造血细胞的至少约80％，通常至少70％。

分离的程序包括但不限于，密度梯度离心；重置；与改变细胞密度的颗粒偶联；用抗体包被的磁珠进行磁分离；亲和色谱；与mAb结合或组合使用的细胞毒剂，包括但不限于，补体和细胞毒素；并用附着在固体基质上的抗体淘选，例如板、芯片、淘析或任何其他方便的技术。

分离和分析技术包括但不限于流式细胞术，其可以具有不同程度的复杂性，例如，多个颜色通道、低角度和钝角光散射检测通道、阻抗通道。

通过使用与死细胞相关的染料，例如碘化丙啶(PI)，可以针对死细胞选择细胞。优选地，将细胞收集在包含2％胎牛血清(FCS)或0.2％牛血清白蛋白(BSA)的培养基或任何其他合适的，优选无菌的等渗培养基中。

载体

免疫应答细胞(例如，T细胞，CTL细胞，NK细胞)的遗传修饰可以通过用重组DNA或RNA构建体转导基本上均质的细胞组成来完成。载体可以是逆转录病毒(Liu et al.,Leukemia 2018)或慢病毒(Mehta and Rezvani,Front Immunol 2018；Nowakowska etal.,Cancer Immunol Immunother 2018)载体(例如，γ逆转录病毒)，其用于将DNA或RNA构建体引入宿主细胞基因组。类似于图1-4中描述的慢病毒载体，例如，可以将编码TF特异性CAR的多核苷酸克隆到逆转录病毒载体中，并从其内源启动子、逆转录病毒长末端重复序列或替代内部启动子驱动该表达。

也可以使用非病毒载体或RNA。可以使用随机染色体整合或靶向整合(例如，使用核酸酶、转录激活因子样效应子核酸酶(TALEN)、锌指核酸酶(ZFN)和/或成簇的规则间隔的短回文重复序列(CRISPR)或转基因表达(例如，使用天然或化学修饰的RNA)、非病毒的“睡美人”转座子或mRNA转染(Hu et al.,Acta Pharmacol Sin 2018；Mehta and Rezvani,Front Immunol 2018)。

为了对细胞进行初始遗传修饰以提供表达TF特异性CAR的细胞，通常使用逆转录病毒载体进行转导，然而可以使用任何其他合适的病毒载体或非病毒递送系统。为了随后对细胞进行遗传修饰以提供包含含至少两个共刺激配体的抗原呈递复合物的细胞，逆转录病毒基因转移(转导)同样被证明是有效的。逆转录病毒载体和合适的包装细胞系的组合也是合适的，其中衣壳蛋白将具有感染人细胞的功能。已知各种产生双嗜性病毒的细胞系，包括但不限于PA12(Miller等人，(1985)Mol.Cell.Biol.5:431-437)；PA317(Miller等人，(1986)Mol.Cell.Biol.6:2895-2902)；和CRIP(Danos,等人，(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85:6460-6464)。非双嗜性颗粒也是合适的，例如用VSVG、RD114或GALV包膜假型化的颗粒和本领域已知的任何其他颗粒。

可能的转导方法还包括将细胞与生产细胞直接共培养，例如通过Bregni等人，(1992)Blood 80:1418-1422的方法，或使用单独的病毒上清液或含有或不含有适当生长因子和聚阳离子的浓缩载体原液培养，例如通过Xu,等人，(1994)Exp.Hemat.22:223-230；和Hughes,等人，(1992)J.Clin.Invest.89:1817的方法。

转导病毒载体可用于在免疫应答细胞中表达共刺激配体(例如，4-1BBL和IL-12)。优选地，所选择的载体表现出高感染效率以及稳定的整合和表达(参见例如，Cayouette等人，Human Gene Therapy 8:423-430，1997；Kido等人，Current Eye Research 15:833-844，1996；Bloomer等人，Journal of Virology 71:6641-6649，1997；Naldini等人，Science 272:263 267，1996；和Miyoshi等人，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.94:10319，1997)。可以使用的其他病毒载体包括，例如，腺病毒、慢病毒和与腺相关的病毒载体、牛痘病毒、牛乳头瘤病毒或疱疹病毒，例如爱泼斯坦巴尔病毒(还参见例如，the vectors ofMiller，Human Gene Therapy 15-14，1990；Friedman，Science 244:1275-1281，1989；Eglitis等人，BioTechniques 6:608-614，1988；Tolstoshev等人，Current Opinion inBiotechnology 1:55-61，1990；Sharp，The Lancet337:1277-1278，1991；Cornetta等人，Nucleic Acid Research and Molecular Biology 36:311-322，1987；Anderson，Science226:401-409，1984；Moen，Blood Cells 17:407-416，1991；Miller等人，Biotechnology 7:980-990，1989；Le Gal La Salle等人，Science 259:988-990，1993；和Johnson，Chest107:77S-83S，1995)。逆转录病毒载体特别发达，已用于临床环境(Rosenberg等人，N.Engl.J.Med 323:370，1990；Anderson等人，U.S.Pat.No.5,399,346)。

非病毒方法也可以用于蛋白质在细胞中的表达。例如，可以通过在脂质转染存在下施用核酸分子来将核酸分子引入细胞中(Feigner等人，Proc.Nat'l.Acad.Sci.U.S.A.84:7413，1987；Ono等人，Neuroscience Letters17:259，1990；Brigham等人，Am.J.Med.Sci.298:278，1989；Staubinger等人，Methods in Enzymology 101:512，1983)、脱唾液酸血清类粘蛋白-多赖氨酸结合(Wu等人，Journal of BiologicalChemistry 263:14621，1988；Wu等人，Journal of Biological Chemistry 264:16985，1989)、或通过在手术条件下的显微注射(Wolff等人，Science 247:1465，1990)。用于基因转移的其他非病毒手段包括使用磷酸钙、DEAE葡聚糖，电穿孔和原生质体融合体外转染。脂质体也可能对将DNA递送到细胞中有益。正常基因向受试者的受影响组织的移植也可以通过将正常核酸离体转移到可培养的细胞类型(例如，自体或异体原代细胞或其后代)中来完成，此后将细胞(或其后代)注入目标组织或全身性注入。重组受体也可以使用转座酶或靶向核酸酶(例如，锌指核酸酶，大范围核酸酶或TALE核酸酶)衍生或获得。瞬时表达可通过RNA电穿孔获得。可以从任何合适的启动子(例如，人巨细胞病毒(CMV)、猿猴病毒40(SV40)或金属硫蛋白启动子)指导用于多核苷酸疗法方法的cDNA表达，并由任何合适的哺乳动物调节元件或内含子调节(例如，延伸因子1a增强子/启动子/内含子结构)。例如，如果需要的话，已知优先在特定细胞类型中指导基因表达的增强子可以用于指导核酸的表达。所使用的增强子可以包括但不限于，被表征为组织或细胞特异性增强子的那些。或者，如果将基因组克隆用作治疗性构建体，则可以通过同源调控序列或，如果需要，通过衍生自异源(包括上述任何启动子或调控元件)的调控序列来介导调控。

所得的细胞可以在与未修饰的细胞相似的那些条件下生长，从而可以扩增修饰的细胞并将其用于多种目的。

序列：同源/改变/优化

本公开的主题提供了通过产生序列改变来优化氨基酸序列或核酸序列的方法。这样的改变可以包括某些突变、缺失、插入或转译后修饰。本公开的主题还包括本公开的主题的任何天然存在的多肽的类似物。类似物可以通过氨基酸序列差异，通过转译后修饰或通过两者与本公开的主题的天然存在的多肽不同。本公开的主题的类似物通常可表现出与本公开的主题的全部或部分的天然存在的氨基酸序列的至少约85％、约90％、约91％、约92％、约93％、约94％、约95％、约96％、约97％、约98％、约99％或更多的同一性。序列比较的长度为至少5、10、15、20、25、50、75、100或更多的氨基酸残基。同样，在确定同一性程度的示例性方法中，可以使用BLAST程序，其中e"3与e"100之间的概率得分表示密切相关的序列。修饰包括多肽的体内和体外化学衍生，例如，乙酰化、羧化、磷酸化或糖基化；这样的修饰可以在多肽合成或加工过程中或在用分离的修饰酶处理之后发生。类似物也可以通过一级序列的改变而不同于本公开的主题的天然存在的多肽。这些包括天然的和诱导的遗传变异(例如，如Sambrook，Fritsch和Maniatis，Molecular Cloning:A Laboratory Manual(2ded.)，CSH Press，1989，或Ausubel等人，同上中所述，由于通过辐射或暴露于乙烷甲基硫酸盐引起的随机诱变或通过位点特异性诱变而产生的)。还包括环化的肽、分子和类似物，其含有除L-氨基酸以外的残基，例如D-氨基酸或非天然存在的或合成的氨基酸，例如β或γ氨基酸。

除全长多肽外，本公开的主题还提供本公开的主题的多肽或肽结构域中任一种的片段。片段可以是至少5、10、13或15个氨基酸。在某些实施例中，片段是至少20个连续氨基酸、至少30个连续氨基酸或至少50个连续氨基酸。在某些实施例中，片段是至少60至80、100、200、300或更多个连续氨基酸。本公开的主题的片段可以通过本领域普通技术人员已知的方法产生，或者可以由正常的蛋白质加工产生(例如，从新生多肽中去除生物活性不需要的氨基酸或通过交替的mRNA剪接或交替的蛋白质加工事件去除氨基酸)。

非蛋白质类似物具有设计为模拟本发明的蛋白质的功能活性的化学结构。根据本公开的主题的方法施用这样的类似物。这样的类似物可能超过原始多肽的生理活性。类似物设计的方法在本领域中是众所周知的，并且可以根据这样的方法通过修饰化学结构来进行类似物的合成，使得当在免疫应答细胞中表达时，所得的类似物增加原始多肽的抗肿瘤活性。这些化学修饰包括但不限于，取代替代的R基团和改变参考多肽的特定碳原子处的饱和度。所述蛋白质类似物可以相对地抵抗体内降解，从而在施用后导致更长时间的治疗效果。用于测量功能活性的测定包括但不限于以下实例中描述的那些。

根据本公开的主题，可以通过密码子优化来修饰编码特异性结合TF的抗原结合结构域的多核苷酸。密码子优化可以改变天然存在和重组的基因序列，以在任何给定的表达系统中实现最高可能水平的生产力。蛋白质表达不同阶段中涉及的因素包括密码子适应性、mRNA结构以及转录和转译中的各种ds元素。可以使用本领域技术人员已知的任何合适的密码子优化方法或技术来修饰本公开的主题的多核苷酸，包括但不限于OPTIMUMGENETM、Encor优化和蓝鹭(Blue Heron)。

可以使用其他氨基酸取代用于创建本文公开的CAR的氨基酸，只要它们保留了可被组织因子(TF)识别的功能能力即可。取代或替代变体通常可包含多肽内一个或多个位点的一个氨基酸与另一个氨基酸的交换，可被设计成调节多肽的一个或多个特性，特别是其效应器功能和/或生物利用度。实施例的嵌合多肽中的某些特定的氨基酸交换在上面进行了详细描述。进一步取代可能是保守的，也可能不是保守的，即一个氨基酸被一个形状和电荷相似的氨基酸取代。保守取代在本领域中是众所周知的，包括例如以下方面的变化：丙氨酸变化为丝氨酸；精氨酸变化为赖氨酸；天冬酰胺变化为谷氨酰胺或组氨酸；天门冬氨酸变化为谷氨酸；半胱氨酸变化为丝氨酸；谷氨酰胺变化为天冬酰胺；谷氨酸变化为天门冬氨酸；甘氨酸变化为脯氨酸；组氨酸变化为天冬酰胺或谷氨酰胺；异亮氨酸变化为亮氨酸或缬氨酸；亮氨酸变化为缬氨酸或异亮氨酸；赖氨酸变化为精氨酸；蛋氨酸变化为亮氨酸或异亮氨酸；苯丙氨酸变化为酪氨酸、亮氨酸或蛋氨酸；丝氨酸变化为苏氨酸；苏氨酸变化为丝氨酸；色氨酸变化为酪氨酸；酪氨酸变化为色氨酸或苯丙氨酸；缬氨酸变化为异亮氨酸或亮氨酸。

除了缺失或取代，经修饰的多肽可具有残基的插入，这通常涉及在多肽中添加至少一个残基。这可包括靶向多肽或简单的单一残基的插入。将在下面讨论末端添加物(也称为融合蛋白)。

还可以理解的是，氨基酸序列和核酸序列可包括额外的残基(比如额外的N-或C-末端氨基酸或5'和3'序列)，然而，只要序列符合上述标准规定，包括在蛋白质表达方面维持生物蛋白质活性，这些序列本质上仍然是如前所述的本文公开序列之一。末端序列的添加特别适用于核酸序列，这些核酸序列，例如，可包括编码区域的5'或3'部分侧翼的各种非编码序列，或者可包括已知的在基因中存在的各种内部序列，即，内含子。

治疗/疗法方法

CAR-T和–NK细胞疗法已经在血液恶性肿瘤的临床试验和已获批准的临床应用中进行了评估(Luskin等人，急性淋巴细胞白血病临床实践中的嵌合抗原受体治疗(ChimericAntigen Receptor Therapy in Acute Lymphoblastic Leukemia Clinical Practice)。Curr Hematol Malig Rep，2017)，也正在转化为实体癌(Morello等人，间皮素靶向CAR：将T细胞驱动到实体瘤(Mesothelin-Targeted CARs:Driving T Cells to Solid Tumors)。癌症发现(Cancer Discov)，2016.6(2):p.133-46)。该策略不仅提供有效的癌症免疫治疗所需的全身免疫(Spitzer,M.H.等人，有效的癌症免疫疗法需要全身免疫(SystemicImmunity Is Required for Effective Cancer Immunotherapy)。细胞(Cell)，2017.168(3):p.487-502e15)，但也会增加肿瘤微环境中T和NK细胞的局部浸润。根据这一想法，检查点抑制剂和CAR-T细胞可用于多发性骨髓瘤(Gay,F.等人，免疫肿瘤学方法：CAR-T细胞和检查点抑制剂(Immuno-oncologic Approaches:CAR-T Cells and CheckpointInhibitors)。Clin Lymphoma Myeloma Leuk，2017.17(8):p.471-478)。因此，多发性骨髓瘤可用于检验检查点封锁与CAR-T疗法联合治疗的想法，以增加肿瘤微环境中T细胞的浸润从而克服抗药性，因此优化免疫检查点封锁疗法的疗效。为了增加CAR-T和-NK细胞的局部浸润，可以局部或区域递送CAR-T或–NK细胞，例如脑癌的颅内递送和肝细胞癌的肝内输注以及原发性结直肠癌的肝转移(Sridhar，P.和F.Petrocca，用于癌症治疗的嵌合抗原受体(CAR)T细胞的区域递送(Regional Delivery of Chimeric Antigen Receptor(CAR)T-Cells for Cancer Therapy)。Cancers(Basel)，2017.9(7))。细胞疗法，包括离体扩增和激活的NK细胞，可用于血液癌和实体癌(.Baggio,L.等人，自然杀伤细胞过继免疫治疗：成熟(Natural killer cell adoptive immunotherapy:Coming of age)。Clin Immunol,2017.177:p.3-11)。为了增加全身性注入的NK细胞向肿瘤微环境的归巢，已有报道(Kremer,V.等人，人NK细胞的基因工程表达CXCR2改善了向肾细胞癌的迁移(Geneticengineering of human NK cells to express CXCR2 improves migration to renalcell carcinoma)。J Immunother Cancer，2017.5(1):p.73)人NK细胞表达趋化因子受体CXCR2的基因工程改善了向表达CXCR2配体的肾细胞癌的迁移。

本文所述的fVII-CAR修饰的免疫效应细胞可用于治疗多种疾病和病症。实际上，可以用本文公开的细胞治疗与组织因子(TF)有关的任何疾病或病症。病理性血管生成，新血管系统的形成，涉及许多临床上重要的人类疾病，特别是癌症、与年龄有关的黄斑变性(AMD)、子宫内膜异位和类风湿关节炎(RA)(Hu.Antibodies 2018)。巨噬细胞参与许多人类疾病的进展，例如动脉粥样硬化和病毒感染(HIV和埃博拉病毒)(Hu.Antibodies 2018)。在这些病理性血管生成依赖性人类疾病中，TF可以在血管生成性血管内皮细胞(VEC)和疾病相关的巨噬细胞上选择性表达。在生理条件下，TF不是由静止的VEC和单核细胞表达的，而是仅局限于位于血液循环和血管壁内层之外的某些细胞(例如周细胞)。例如，在癌症中，癌细胞在许多类型的实体癌、白血病(AML和ALL)和肉瘤中也过表达TF。此外，TF还可以通过癌症起始干细胞(CSC)表达，并且可以用作根除CSC且没有耐药性的新型癌症靶标。因此，可以通过本文公开的方法治疗的疾病的实例包括但不限于癌症的病理性新血管系统、与年龄有关的黄斑变性和子宫内膜异位、白血病和淋巴瘤、实体瘤、类风湿性关节炎、动脉粥样硬化和病毒，包括艾滋病毒和埃博拉病毒。表1列出了与TF相关的癌症列表。

施用

可以将本公开的主题的TF特异性CAR及表达其的免疫应答细胞，全身或直接提供给受试者以治疗或预防与TF相关的疾病。在某些实施例中，将TF特异性CAR和表达其的免疫应答细胞直接注射到目的器官(例如，受癌症影响的器官)中。替代地或另外地，例如通过向循环系统(例如，肿瘤脉管系统)中施用，将TF特异性CAR及表达其的免疫应答细胞间接地提供给目的器官。可以在施用细胞和组合物之前、期间或之后提供扩增和分化剂，以增加体外或体内T细胞的产生。

本公开的主题的TF特异性CAR及表达其的免疫应答细胞可以在任何生理上可接受的媒介物中施用。通常，可以施用至少1×10⁵个细胞，最终达到1×10¹⁰或更多。包含表达TF特异性CAR的免疫应答细胞的细胞群可以包含纯化的细胞群。使用各种众所周知的方法，例如荧光激活细胞分选(FACS)，本领域技术人员可以容易地确定细胞群中免疫应答细胞的百分比。包含表达TF特异性CAR的基因修饰的免疫应答细胞的细胞群体中的纯度范围可为约50％至约55％、约55％至约60％、约65％至约70％、约70％至约75％、约75％至约80％、约80％至约85％、约85％至约90％、约90％至约95％或约95％至约100％。剂量可以由本领域技术人员容易地调节(例如，纯度降低可能需要增加剂量)。免疫应答细胞可以通过注射、导管等导入。如果需要，也可以包括因子，包括但不限于白介素，例如IL-2、IL-3、IL 6、IL-11、IL-7、IL-12、IL-15、IL-21、IL-27以及其他白介素；集落刺激因子，例如G-、M-和GM-CSF；干扰素，例如γ-干扰素。

本公开的主题的组合物包括药物组合物，其包含表达TF特异性CAR的免疫应答细胞和药学上可接受的载体。施用可以是自体的，也可以是非自体的。例如，可以从一个受试者获得表达TF特异性CAR的免疫应答细胞及其组合物，并施用给相同受试者或不同的配伍受试者。可以通过局部注射，包括导管施用、全身注射、局部注射、静脉注射或肠胃外施用，来施用本公开的主题的外周血衍生的T细胞或其后代(例如，体内、离体或体外衍生)。当施用本公开的主题的药物组合物(例如，包含表达TF特异性CAR的免疫应答细胞的药物组合物)时，可以将其配制成单位剂量可注射形式(溶液、悬浮液、乳液)。

制剂

可以方便地以无菌液体制剂的形式提供本公开的主题的表达通常为TF特异性的CAR的免疫应答细胞和包含其的组合物，例如等渗溶液、悬浮液、乳液、分散液或粘性组合物，可将其缓冲至选定的pH。液体制剂通常比凝胶、其他粘性组合物和固体组合物更容易制备。另外，液体组合物在某种程度上更方便施用，尤其是通过注射。另一方面，可以在适当的粘度范围内配制粘性组合物以提供与特定组织的更长的接触时间。液体或粘性组合物可包含载体，其可以是溶剂或分散介质，其包含例如水、盐水、磷酸盐缓冲盐水、多元醇(例如甘油、丙二醇、液体聚乙二醇等)及其合适的混合物。

可以通过在所需量的适当溶液中掺入包含表达本公开的主题的通常为TF特异性CAR的免疫应答细胞的组合物和根据需要的多种量的其他成分来制备无菌可注射溶液。这样的组合物可以与合适的载体、稀释剂或赋形剂，例如无菌水、生理盐水、葡萄糖、右旋糖等混合。也可以将组合物冻干。组合物可包含辅助物质，例如润湿剂、分散剂或乳化剂(例如，甲基纤维素)、pH缓冲剂、胶凝剂或增粘剂、防腐剂、矫味剂、颜色等，这取决于施用途径和期望的制备方法。可以查阅标准文本，(例如以引用方式并入本文的“REMINGTON'SPHARMACEUTICAL SCIENCE”，第17版，1985)以制备合适的制剂，而无需进行过多的实验。

可以添加增强组合物的稳定性和无菌性的各种添加剂，包括抗微生物防腐剂、抗氧化剂、螯合剂和缓冲剂。可以通过各种抗细菌剂和抗真菌剂(例如，对羟基苯甲酸酯、氯丁醇、苯酚、山梨酸等)来确保预防微生物的作用。可通过使用延迟吸收的试剂，例如单硬脂酸铝和明胶，来延长可注射药物形式的吸收。然而，根据本发明，所使用的任何媒介物、稀释剂或添加剂将必须与表达本公开的主题的通常为TF特异性CAR的免疫应答细胞相容。

该组合物可以是等渗的，即它们可以具有与血液和泪液相同的渗透压。本公开的主题的组合物的所需等渗性可以使用氯化钠或其他药学上可接受的试剂，例如右旋糖、硼酸、酒石酸钠、丙二醇或其他无机或有机溶质来实现。氯化钠特别优选用于含有钠离子的缓冲剂。

如果需要，可使用药学上可接受的增稠剂将组合物的粘度保持在选定水平。可以使用甲基纤维素，因为它易于经济地获得并且易于使用。其他合适的增稠剂包括，例如，黄原胶、羧甲基纤维素、羟丙基纤维素、卡波姆等。增稠剂的浓度可以取决于选择的试剂。重点是要使用能够达到所选粘度的量。显然，合适的载体和其他添加剂的选择将取决于确切的施用途径和特定剂型的性质，例如液体剂型(例如，是否将组合物配制成溶液、混悬液、凝胶或其他液体剂型，例如定时释放剂型或液体填充剂型)。

本领域技术人员将认识到，应该选择组合物的组分以使其具有化学惰性，并且不会影响如本公开的主题中所述的免疫应答细胞的生存力或功效。对于本领域的技术人员而言，这在化学和制药学原理方面不会带来问题，或者根据本公开和本文引用的文件，通过参考标准文本或通过简单的实验(不涉及过多的实验)，可以很容易地避免这些问题。

技术人员可以容易地确定组合物中的细胞和任选的添加剂、媒介物和/或载体的量，并且可以在本公开的主题的方法中进行施用。通常，任何添加剂(除活性细胞(多种)和/或试剂(多种)外)以约0.001wt％至约50wt％的量存在于磷酸盐缓冲盐水中，并且活性成分为以微克至毫克的量存在，例如约0.0001wt％至约5wt％、约0.0001wt％至约1wt％、约0.0001wt％至约0.05wt％、约0.001wt％至约20wt％、约0.01wt％至约10wt％、或约0.05wt％至约5wt％。对于要施用于动物或人类的任何组合物，以及对于任何特定的施用方法，应确定毒性，例如通过在合适的动物模型，例如啮齿动物如小鼠中确定致死剂量(LD)和LD50；以及组合物(多种)的剂量，其中的组分的浓度和组合物(多种)的施用时间，其引起合适的反应。从技术人员的知识、本公开和本文引用的文献，这种确定不需要过多的实验。并且，可以确定连续施用的时间而无需过多的实验。

总之，可以将fVII-CAR修饰的免疫效应细胞施用给有此需要的受试者。施用可以是局部的或全身的，取决于疗法所涉及的病理状况的类型。施用可以通过本领域已知的任何方法，诸如例如静脉内、腹膜内、肝内、肌肉内、肿瘤内、皮下、滑膜内、眼内、斑块内、颅内或皮内注射fVII-CAR修饰的免疫效应细胞。

进行治疗性治疗所需的fVII-CAR修饰的免疫效应细胞的量本身并不固定，并且必须取决于与药物载体一起施用的组合物中成分的浓度，增强免疫系统反应(将在下面更全面地说明)的所施用组合物中的辅助化合物，以及待治疗患者的年龄、体重和临床状况。优选的组合物以有效量递送修饰的细胞而不会对患者产生不可接受的毒性。

考虑到所讨论的制剂的类型，本发明的药物组合物或制剂还可以包括其他载体、佐剂、稳定剂、防腐剂、分散剂和本领域常规的其他试剂。

试剂盒

本公开的主题提供了用于治疗或预防TF表达的疾病，例如癌症的试剂盒。在某些实施例中，所述试剂盒包含治疗性或预防性组合物，所述组合物包含有效量的免疫应答细胞，所述免疫应答细胞在单位剂型中包含TF特异性CAR。在特定的实施例中，细胞进一步表达至少一种共刺激配体。在某些实施例中，试剂盒包括无菌容器，其含有治疗性或预防性疫苗，这样的容器可以是盒、安瓿、瓶子、小瓶、管、袋、小袋、泡罩包装或本领域已知的其他合适的容器形式。这样的容器可以由塑料、玻璃、层压纸、金属箔或其他适合容纳药物的材料制成。

如果需要的话，提供免疫应答细胞以及将所述细胞施用给患有疾病或处于患有疾病(例如癌症)风险的受试者的说明。说明通常将包括有关组合物用于治疗或预防疾病的用途的信息。在其他实施例中，说明包括以下至少一项：治疗剂的描述；和用于治疗或预防疾病或其症状的剂量表和施用；注意事项；警告；适应症；反适应症；过量信息；不良反应；动物药理学；临床研究；和/或参考。这些说明可以直接打印在容器上(如果有的话)、或者以贴在容器上的标签形式、或者以单独的纸张、小册子、卡片或随附在容器内或与容器一起提供的文件夹的形式。

实例

实例1：TF靶向CAR构建体

为了有效地将CAR构建体转导至NK和T细胞，CAR1二聚体和单体cDNA(SEQ ID NOS:1和2)被亚克隆到pCDH慢病毒载体的多克隆位点(MCS)中，其已成功感染人NK细胞系NK92(X。Chen等人，乳腺癌脑转移的EGFR-CAR NK细胞和溶瘤性单纯疱疹病毒1的联合治疗(Acombinational therapy of EGFR-CAR NK cells and oncolytic herpes simplex virus1for breast cancer brain metastases)。Oncotarget 7，27764-27777(2016)。通过Sanger DNA测序确认了CAR1单体和二聚体的cDNA序列，并已保存在GenBank(登录号MF806378和MF806379，SEQ ID NOS:1和2)。

为确保pCDH质粒和慢病毒可以导致CAR1表达，将编码CAR1的pCDH质粒(带有GFP和Puro)转染到CHO-K1细胞中，该细胞先前已被pcDNA3.1(+)质粒载体转染以产生TF靶向免疫偶联物fVII-IgG1Fc(称为ICON)(20-23)和fVIIL-IgG1Fc(对于轻链ICON，称为L-ICON1，作为第二代ICON)。在上清液和PEG-it纯化的载体中，293AD细胞也被pCDH-衍生的慢病毒感染。图3显示，CHO-K1细胞和293AD细胞在用pCDH或慢病毒在SNT或纯化的载体中转染后均表达GFP，表明哺乳动物细胞(仓鼠和人源)可被慢病毒转染和感染。然后，将Lenti-CAR1二聚体和单体载体用于感染NK92MI/fCD16细胞，其已用编码全长人CD16的质粒pcDNA3.1(+)转染，其是IgG1Fc的Fc受体，可介导抗体依赖性细胞毒性(ADCC)。图2显示在被慢病毒-CAR1二聚体和单体感染后NK92MK/fCD16细胞表达的GFP，而未感染的对照细胞没有GFP，表明慢病毒已成功感染了NK细胞系。使用抗人因子VII抗体在流式细胞术、ELISA和免疫印迹中测试了CAR1的表达。

实例2：组织因子靶向CAR-NK细胞用于三阴性乳腺癌的免疫治疗

引言

已确定组织因子(TF)是三阴性乳腺癌(TNBC)的新型、常见但选择性的表面癌症靶标，由于缺乏靶向免疫治疗，其通常是无法治愈的恶性肿瘤。为了解决未满足的治疗需求，本文公开了表达fVIIL-CD28-4-1BB-CD3ζ的TF靶向CAR-NK细胞，在细胞外靶向结构域(因子VII轻链，fVIIL)和跨膜结构域(CD28)作为TF-CAR1二聚体和TNBC的CAR-NK免疫疗法的单体之间有或没有人IgG1的铰链区(用于潜在的同源二聚化)。结果表明，TF-CAR1-NK细胞可以在体外杀死TNBC细胞，并且在衍生自细胞系和患者肿瘤的异种移植小鼠模型中对TNBC进行治疗是有效且安全的。

三阴性乳腺癌(TNBC)占全球诊断出的乳腺癌的将近15％(A.Jemal等人，Globalcancer statistics.CA:a cancer journal for clinicians 61，69-90(2011)；C.K.Anders、L.A.Carey，生物学、转移模式和三阴性乳腺癌的患者的治疗(Biology,metastatic patterns,and treatment of patients with triple-negative breastcancer)。Clinical breast cancer 9Suppl 2，S73-81(2009)；C.A.Hudis,L.Gianni，三阴性乳腺癌：无法满足的医疗需求(Triple-negative breast cancer:an unmet medicalneed)。The oncologist 16Suppl 1，1-11(2011))。由于缺乏经过验证的治疗靶标分子，TNBC是最难治疗的恶性肿瘤之一，在大多数情况下被认为是不可治愈的恶性肿瘤。目前尚无批准针对TNBC的分子靶向疗法。

TF已被确定为体外和体内子宫内膜异位、与年龄有关的黄斑变性(AMD)和实体癌的病理性新血管系统的血管生成性VEC(内层)中，VEGF刺激的血管生成微血管内皮模型上的血管生成特异性受体。这些实体癌包括来自小鼠的肿瘤异种移植物或患者的乳腺癌组织的人黑素瘤(Z.Hu，Y.Sun，A.Garen，靶向肿瘤脉管系统内皮细胞和用于在小鼠异种移植模型中免疫治疗人黑素瘤的肿瘤细胞(Targeting tumor vasculature endothelial cellsand tumor cells for immunotherapy of human melanoma in a mouse xenograftmodel)。Proceedings of the National Academy of Sciences of the United Statesof America96，8161-8166(1999)；Z.Hu，A.Garen，瘤内注射编码肿瘤靶向免疫偶联物的腺病毒载体用于癌症免疫治疗(Intratumoral injection of adenoviral vectorsencoding tumor-targeted immunoconjugates for cancer immunotherapy)。Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States ofAmerica97,9221-9225(2000))、肺癌(J.Cheng等人，通过以因子VII靶向光动力疗法靶向组织因子来有效治疗人类肺癌(Effective treatment of human lung cancer bytargeting tissue factor with a factor VII-targeted photodynamic therapy)。Current cancer drug targets 11，1069-1081(2011))和乳腺癌(J.Contrino、G.Hair、D.L.Kreutzer、F.R.Rickles，原位检测血管内皮细胞中的组织因子：与人类乳腺疾病的恶性表型相关(In situ detection of tissue factor in vascular endothelial cells:correlation with the malignant phenotype of human breast disease)。Nat Med 2,209-215(1996))。在实体癌和白血病中，TF也经常在多种实体癌细胞和白血病细胞中过表达(Z.Hu，因子VII靶向光动力疗法针对乳腺癌及其对其他实体癌和白血病、乳腺癌的治疗潜力-目前和替代治疗模式(VII-Targeted Photodynamic Therapy for Breast Cancerand Its Therapeutic Potential for Other Solid Cancers and Leukemia,BreastCancer-Current and Alternative Therapeutic Modalities)，Esra Gunduz and MehmetGunduz(编辑)，ISBN:978-953-307-776-5)。TF还是从癌细胞系、肿瘤异种移植物以及乳腺癌、肺癌和卵巢癌的癌症患者分离的癌症干细胞(CSC)的新型癌症靶标(Z.Hu等人，靶向组织因子作为一种根除从肿瘤细胞系、肿瘤异种移植物以及乳腺癌、肺癌和卵巢癌患者中分离出的癌症干细胞的新型治疗性癌症靶标(Targeting tissue factor as a noveltherapeutic oncotarget for eradication of cancer stem cells isolated fromtumor cell lines,tumor xenografts and patients of breast,lung and ovariancancer).Oncotarget 8，1481-1494(2017))。已经发现，CSC对TF靶向疗法不产生抗药性。为了确定用于TNBC治疗的可靶向表面分子，已确定TF是TNBC癌细胞(高达TNBC患者的85％)和肿瘤血管内皮细胞(VEC)上的新型、常见但选择性的癌症靶标(Z.Hu.等人，使用第二代ICON进行三阴性乳腺癌的免疫治疗的靶向组织因子(Targeting Tissue Factor forImmunotherapy of Triple-Negative Breast Cancer Using a Second-GenerationICON)。Cancer Immunol Res 6，671-684(2018))。因此，在包括TNBC的几种类型的实体癌中，TF是三种主要肿瘤区室，即癌细胞、肿瘤血管生成性血管内皮细胞和癌症干细胞的常见但特异性的癌症靶标。

嵌合抗原受体(CAR)表达的T和自然杀伤细胞的过继转移代表新型的癌症免疫治疗方法。CAR的概念基于在T或NK细胞表面上表达新型受体的思想，其能使T和NK细胞识别靶细胞表面上的相应抗原。基本的CAR构建体由细胞外抗原识别结构域，通常是连接到细胞外间隔子结构域的单链抗体可变片段(scFv)、CD28的跨膜结构域和信号胞质结构域，例如4-1BB(CD137)、OX40(CD134)、DAP10、ICOS和CD3ζ链(Cd3ζ)组成。最先进的应用是靶向CD19的CAR-T细胞的使用，CD19是B细胞恶性肿瘤的表面抗原，其已被证明对患者的B细胞恶性肿瘤具有抗肿瘤功效(P.J.Paszkiewicz等人，靶向抗体介导的鼠CD19 CAR T细胞耗竭可永久逆转B细胞发育不良(Targeted antibody-mediated depletion of murine CD19 CAR Tcells permanently reverses B cell aplasia)。J Clin Invest 126，4262-4272(2016))。

结果

在TF靶向CAR的设计和开发中，使用因子VII(TF的天然配体)代替TF的抗体或scFv，作为TF的识别结构域。首先，fVII与TF(E.Waxman等人，组织因子及其细胞外可溶性结构域：与VIIa因子的分子间缔合与复合物的酶活性之间的关系(Tissue factor and itsextracellular soluble domain:the relationship between intermolecularassociation with factor VIIa and enzymatic activity of the complex)。Biochemistry 31，3998-4003(1992))的亲和力大于抗体和TF抗原(L.Presta等人，人源化的高亲和力抗组织因子抗体的生成，用作新型抗血栓形成治疗剂(Generation of ahumanized,high affinity anti-tissue factor antibody for use as a novelantithrombotic therapeutic)。Thrombosis and haemostasis 85，379-389(2001))约100到1000倍。其次，fVII可以通过重组DNA技术合成，而无需人源化单克隆抗体或筛选scFv文库。此外，已经表明fVII的轻链(前152个氨基酸残基)可以与全长fVII同等或更强地结合至TF表达的人和鼠癌细胞(Z.Hu等人，使用第二代ICON的靶向组织因子进行三阴性乳腺癌的免疫治疗(Targeting Tissue Factor for Immunotherapy of Triple-Negative BreastCancer Using a Second-Generation ICON)。Cancer Immunol Res 6，671-684(2018))。因此，TF靶向CAR由人因子VII轻链作为TF靶向结构域，不具有或具有连接至CD28跨膜和胞质结构域的人IgG1的铰链区，然后是命名为TF靶向CAR1单体和二聚体(GenBank登录号分别为MF806378和MF806379，SEQ ID NOS:1和2)的4-1BB和Cd3ζ的胞质结构域(图1)组成。

为了将CAR构建体有效地转导至NK细胞，将CAR1二聚体和单体cDNA亚克隆到pCDH慢病毒载体的多克隆位点(MCS)中，因为它已成功感染了人类NK细胞系NK92(Z.Hu、J.Cheng、J.Xu,W.Ruf、C.J.Lockwood，组织因子是针对因子VII靶向免疫疗法和光动力疗法的血管生成特异性受体(Tissue factor is an angiogenic-specific receptor forfactor VII-targeted immunotherapy and photodynamic therapy)。Angiogenesis 20，85-96(2017))。通过Sanger DNA测序确认了CAR1单体和二聚体的cDNA序列，并已保存在GenBank(登录号MF806378和MF806379，SEQ ID NOS:1和2)。

为了确保pCDH质粒和慢病毒(在上清液中和在PEG-it纯化的载体中)可以导致CAR1表达，将编码CAR1的pCDH质粒(带有GFP和Puro)转染到CHO-K1和293AD细胞中。CHO-K1细胞已成功地用pcDNA3.1(+)质粒载体转染，以生产TF靶向免疫偶联物fVII-IgG1Fc(称为ICON)(Z.Hu等人，靶向组织因子作为一种新型的治疗癌症靶标用于根治从肿瘤细胞系、肿瘤异种移植物以及乳腺癌、肺癌和卵巢癌患者分离的癌症干细胞(Targeting tissuefactor as a novel therapeutic oncotarget for eradication of cancer stem cellsisolated from tumor cell lines,tumor xenografts and patients of breast,lungand ovarian cancer)。Oncotarget 8，1481-1494(2017)；Z.Hu，A.Garen，针对前列腺癌的小鼠模型中肿瘤血管内皮细胞和肿瘤细胞的靶向组织因子进行免疫治疗(Targetingtissue factor on tumor vascular endothelial cells and tumor cells forimmunotherapy in mouse models of prostatic cancer)。Proceedings of theNational Academy of Sciences of the United States of America 98，12180-12185(2001)；Z.Hu、J.Li，天然杀伤细胞对于人舌癌中Icon(因子VII/人IgG1Fc)免疫疗法的功效至关重要(Natural killer cells are crucial for the efficacy of Icon(factorVII/human IgG1 Fc)immunotherapy in human tongue cancer)。BMC immunology 11,49(2010))和fVIIL-IgG1Fc(称为L-ICON1，对于轻链ICON，作为第二代ICON)(Z.Hu等人，使用第二代ICON的三阴性乳腺癌免疫疗法的靶向组织因子(Targeting Tissue Factor forImmunotherapy of Triple-Negative Breast Cancer Using a Second-GenerationICON)。Cancer Immunol Res6，671-684(2018)；Z.Hu、J.Cheng、J.Xu、W.Ruf、C.J.Lockwood，组织因子是因子VII靶向免疫疗法和光动力疗法的血管生成特异性受体(Tissue factoris an angiogenic-specific receptor for factor VII-targeted immunotherapy andphotodynamic therapy).Angiogenesis 20，85-96(2017))。图3显示，CHO-K1细胞和293AD细胞在用pCDH或慢病毒在SNT或纯化的载体中转染后均表达GFP，表明哺乳动物细胞(仓鼠和人源)可被慢病毒转染和感染。为了产生具有介导抗体依赖性细胞毒性(ADCC)能力的CAR1-NK细胞，通过用人IL-2cDNA稳定转染来转染NK92MI(ATCC CRL-2408)，NK92MI(ATCCCRL-2408)是衍生自亲本系NK92的人NK细胞系，并且是IL-2独立的。(K.Tam等人，适用于过继细胞免疫疗法的遗传改变的独立于白介素2的自然杀伤细胞系的表征(Characterization of genetically altered,interleukin 2-independent naturalkiller cell lines suitable for adoptive cellular immunotherapy)。Hum Gene Ther10，1359-1373(1999))。在慢病毒感染之前，还用编码全长人CD16(fCD16)(一种IgG1Fc的Fc受体)的质粒pcDNA3.1(+)转染NK92MI，以生成CD16+NK细胞系作为效应细胞以介导抗体(例如ICON和L-ICON1)依赖性细胞毒性(ADCC)。然后，将命名为NK92MI/fCD16的所得细胞用Lenti-CAR1二聚体和单体载体(也编码GFP)感染。图2显示在嘌呤霉素选择后，稳定的NK92MI/fCD16细胞在感染编码CAR1二聚体和单体的慢病毒载体(图2A)(此后分别缩写为CAR1二聚体和单体)后表达GFP，而未感染的NK92MI或NK92MI/fCD16细胞不表达GFP(作为对照细胞)，表明慢病毒已成功感染了NK细胞系NK92MI及其衍生物NK92MI/fCD16。

建立这些稳定的CAR1-NK细胞系后，使用特定引物(例如，CAR1的fVIIL和Cd3ζ)进行RT-PCR，并使用我们证明可以识别fVII轻链的抗人因子VII抗体通过ELISA在这些细胞中验证CAR1和CD16 cDNA的表达。图4a显示，分别在NK92MI/fCD16/CAR1单体和二聚体细胞中检测到CAR1单体和二聚体的cDNA，如图1所示，它们的分子质量与其序列一致，而对照NK92MI细胞对于CAR1是阴性的。图4b显示CD16 cDNA同时存在于NK92MI/fCD16/CAR1单体和二聚体中，但在NK92MI对照细胞中却不存在。β肌动蛋白在RT-PCR分析中用作等量的管家基因对照(图4c)。

已经验证了CAR1和CD16在NK-CAR1单体和二聚体细胞中的表达，在原位TNBC CDXNSG小鼠模型中测试了它们在体外杀死TNBC细胞的能力(细胞毒性)以及体内治疗效果和安全性。图5A显示，与对照NK细胞相比，NK-CAR1单体和二聚体细胞均对人TNBC系MDA-MB-231细胞表现出显着的直接细胞毒性(p＜0.0001，CAR1单体或二聚体相对于对照)。可能由于亲和力，CAR1二聚体在E:T比为10:1时，对TNBC细胞的细胞毒性(85％)比CAR1单体的细胞毒性(77％)略高。然而，差异没有统计学意义(图5A)。图5B-5D证明，CAR1-NK单体和二聚体细胞在原位CDX NSG小鼠模型中对TNBC的治疗是有效和安全的。一次静脉注射2×10⁶个NK-CAR1单体或二聚体细胞后，与注射非慢病毒CAR1感染的NK92MI/fCD16对照细胞的对照小鼠的TNBC CDX相比，原位小鼠的TNBC CDX的生长被显着抑制。与我们的体外数据相似，如通过测量肿瘤体积(图5B)和肿瘤重量(图5C)证明的，NK-CAR1二聚体细胞比NK-CAR1单体更有效地治疗TNBC CDX，但差异没有统计学意义。对照组和NK-CAR1治疗组之间的小鼠整体体重没有差异(图5D)，这表明以TF靶向CAR1-NK治疗是安全的。由于TF-CAR1二聚体细胞在体外和体内治疗TNBC方面比TF-CAR1单体细胞具有更强的作用，因此在后续研究中使用NK-CAR1二聚体而非单体细胞。

为了更好地将TF-CAR-NK治疗转译到临床，我们在原位TNBC PDX NSG小鼠模型中研究了NK-CAR1细胞的功效和安全性(每组3只小鼠)。图6证明，如通过测量肿瘤体积(图6a)、肿瘤重量(图6b)和小鼠体重(图6c)测定的，可以确定TF-CAR1二聚体细胞免疫治疗在原位PDX NSG小鼠模型中对TNBC PDX的治疗是有效且安全的。

为了验证在初步研究中观察到的发现，重复了TF-CAR1二聚体疗法在原位PDX NSG小鼠(每组5只小鼠)中的功效和安全性研究。图7表明，如通过测量肿瘤体积(图7A)，肿瘤生长百分比(图7B)，肿瘤重量(图7C)和小鼠体重(图7D)确定的，TF靶向CAR1-NK细胞免疫治疗在临床前小鼠模型中对TNBC PDX的治疗是有效且安全的。

讨论

为了靶向TF进行细胞免疫治疗，开发了基于TF靶向CAR的慢病毒载体，并且通过用TF-CAR1慢病毒载体感染人NK系(NK92MI)而产生TF-CAR-NK细胞。结果表明，在原位CDX和PDX小鼠模型中，在每个CAR构建体上具有两个或一个TF靶向结构域(多个)的CAR1-NK细胞在体外和体内均可有效、安全地治疗TNBC。由于这些TF-CAR1 NK细胞也表达Cd16，因此在与L-ICON1和用于治疗TNBC的其他治疗性抗体的联合治疗中，它们可能介导L-ICON1-ADCC。因此，本研究建立了针对TFBC的CAR-NK细胞免疫治疗靶向TF的概念证明。TF不仅在癌症中选择性表达，而且在病理性血管生成依赖性以及巨噬细胞相关的人类疾病中选择性表达(ZWHu，针对组织因子的治疗性抗体样免疫偶联物，具有治疗血管生成依赖性以及与巨噬细胞相关的人类疾病的潜力(Therapeutic Antibody-Like Immunoconjugates againstTissue Factor with the Potential to Treat Angiogenesis-Dependent as Well asMacrophage-Associated Human Diseases)。Antibodies 7，(2018))。病理性血管生成，新血管系统的形成，涉及许多临床上重要的人类疾病，特别是癌症、与年龄有关的黄斑变性(AMD)、子宫内膜异位和类风湿关节炎(RA)。巨噬细胞参与多种人类疾病的进展，例如动脉粥样硬化和病毒感染(人类免疫缺陷病毒，即HIV和埃博拉病毒)。充分证明，在这些病理性血管生成依赖性人类疾病中，在血管生成性VEC上以及与疾病相关的巨噬细胞上选择性表达了TF。CAR-NK和-T疗法提供了新型治疗方法，具有治疗这些血管生成依赖性以及与巨噬细胞相关的人类疾病的能力，因此可以广泛影响这些具有临床意义的人类疾病的治疗方案。

实例2的支持材料和方法

细胞系

中国仓鼠卵巢细胞(CHO-K1)和NK92MI分别于2004年和2007年从美国典型培养物保藏中心(ATCC,Manassas,VA)购买。CHO-K1在F12K完全生长培养基(ATCC)中生长，该培养基中补充有10％热灭活的胎牛血清(HI-FBS)(Sigma)和1×青霉素和链霉素(Invitrogen)。293TN(SBI)、293FT(Invitrogen)和293AD(Cell Biolabs)从商业供应商处购买，并在DMEM完全生长培养基中生长以生产慢病毒载体。人TNBC细胞系MDA-MB-231(BRCA1-wt、BRCA2-突变体)于2009年从ATCC购买，并在补充有10％HI-FBS和1×青霉素和链霉素(Invitrogen)的L-15完全生长培养基中生长。每年对培养物进行支原体污染测试。使用Mycoalert支原体检测试剂盒测试它们的最新日期(Lonza，Cat.No.Lt07-118)是2017年6月26日。通过流式细胞术、免疫印迹和/或细胞ELISA验证TF表达来确定癌细胞系的真实性。

CAR质粒DNA和慢病毒载体的构建

TF靶向CAR1二聚体和单体构建体被设计为编码具有人IgG1铰链区(形成CAR1的同二聚体)或不具有铰链区(作为单体CAR1)的人类因子VII轻链(作为TF识别结构域)，然后CD28跨膜和胞质结构域、4-1BB和CD3ζ。通过System Biosciences(SBI)将cDNA构建体定制合成到慢病毒穿梭载体pCDH(SBI登录号CD713B)。通过Sanger DNA测序验证了TF靶向CAR1单体和二聚体的cDNA序列，并分别以登录号MF806378和MF806379保藏在GenBank中。按照制造商的说明，使用PurFection转染试剂(SBI)将293TN(System Biosciences)与pCDH-CAR1和pPACKH1(SBI)共转染，从而生产出编码CAR1二聚体和单体的慢病毒。在48小时和72小时内收集细胞培养上清液中的慢病毒，用作上清液中未浓缩的病毒颗粒(SNT)或使用PEG-it试剂(SBI)浓缩。

通过慢病毒感染和通过用表达质粒DNA转染，可在贴壁细胞(CHO-K1、293AD)和悬浮细胞(NK92MI/fCD16和Nk)上稳定表达CAR1二聚体、单体或对照GFP。

按照制造商的说明，在反式DUX和MAX增强子(SBI)存在下，用慢病毒感染细胞。简而言之，在细胞培养基中将每孔50,000个细胞的贴壁细胞或悬浮细胞接种到24孔板中。第二天，用500μl感染培养基替换细胞培养基，其中含有2.5μl的反式Dux(SBI)，100μl的MAX增强子和400μl的培养基，然后向每个孔中添加150μl含293TN的慢病毒的上清液(SNT)，并旋转混合。在转导后72小时，病毒基因组将整合到宿主细胞基因组中，并将细胞转移并在补充有5μg/ml的嘌呤霉素和100ng/ml的潮霉素的完全生长培养基中生长，以建立稳定的细胞系或用于以下实验。

按照制造商的说明，通过xTremeGene HP转染试剂(Roche)将CD713B(SBI)衍生的质粒DNA载体表达CAR1单体、二聚体或对照转染到NK92和NK92MI细胞中。简而言之，将100,000个NK92和NK92MI细胞接种在2ml的生长培养基中。在同一天，将质粒DNA(2μg)添加到200μl的Opti-培养基(无血清)中，然后添加6μl的X-tremeGENE HP转染试剂，并在室温下孵育15分钟。将DNA转染混合物以逐滴方式添加到每个孔中。转染后72小时，添加嘌呤霉素至终浓度为5μg/ml，以选择稳定转染的细胞。

通过RT-PCR和免疫印迹的CAR1和CD16在CAR1-NK细胞上的表达

进行RT-PCR和免疫印迹以验证CAR1和CD16在慢病毒感染或质粒转染的细胞上的表达。使用TriZol试剂(Invitrogen)从NK92MI/fCD16对照、CAR1二聚体和单体细胞中提取总RNA。使用一步式RT-PCR试剂盒(New England Biolabs，登录号E5315)和相应的引物进行CAR1、CD16和β肌动蛋白的RT-PCR，并通过琼脂糖凝胶电泳进行分析。

CAR1-NK细胞对人TNBC细胞的细胞毒性

使用CytoTox均相检定试剂盒(Promega)进行细胞毒性检测。在96孔U型底部组织培养处理的微孔板中，将人TNBC MDA-MB-231细胞(靶细胞)以每孔10,000个细胞接种在补充有10％热灭活的FBS的100μl MEMα生长培养基中过夜。第二天早晨，从每个孔中移出50μl的培养基。将NK92MI/fCD16表达的CAR1-二聚体、-单体或未感染的对照(作为效应细胞)重悬于ADCC效应分析培养基(含0.5％超低IgG HI-FBS的DMEM)中，并以10:1和5:1的E:T比添加至孔中。在5％CO₂和37℃下孵育4小时后，将微孔板以300×g离心5分钟，然后将50ul上清液转移至新的96孔平底微孔板中。加入细胞毒性检测溶液(每孔50ul)，并在37℃下孵育30分钟，然后按照制造商的说明添加终止溶液。在酶标仪(Molecular Devices,i3)上读取490nm处的吸光度。

衍生自TNBC细胞的异种移植物(CDX)和衍生自患者的异种移植物(PDX)的原位小鼠模型的生成。简而言之，为了生成衍生自肿瘤系的异种移植的原位小鼠模型，将在50μl的PBS中的5×10⁵个人TNBC MDA-MB-231/Luc+GFP细胞注射到4-6周龄的雌性NSG(TaconicFarms)第四左侧乳腺脂肪垫中。要生成原位TNBC PDX模型，从Jackson实验室(JAXTM00089，乳腺肿瘤标志物：TNBC ER-/PR-/HER2-,BRCA1 V757fs)购买具有BRCA1突变的TNBC PDX供体NSG小鼠(NOD SCIDγ，没有成熟的B、T、NK细胞，没有补体)。根据OSU IACUC啮齿动物手术政策进行手术。用异氟烷麻醉小鼠。对于供体NSG小鼠(JAX，TM00089)，在肿瘤的侧面切开一个切口以提取肿瘤组织，将其在补充有1×青霉素和链霉素的RPMI培养基中洗涤一次，并在无菌PBS中切成约3毫米(mm)直径的块，用于植入受体小鼠。将CB-17SCID小鼠(Taconic Farms)用作受体小鼠。对于受体小鼠，在第四右侧乳腺上切开一个切口，用于将约3mm的PDX肿瘤组织从供体肿瘤组织直接植入其中。用一滴组织粘合剂(Vetbond)和/或1个伤口夹(Sigma)以常规方式闭合切口部位。回到日常饲养之前，对动物进行麻醉恢复的监测。每天检查动物，直到伤口愈合，并在手术后最多72小时内施用止痛药(丁丙诺啡，s.c.0.1mg/kg的100μl的无菌PBS)以减轻疼痛。

TF-CAR-NK细胞疗法的体内研究TNBC CDX和PDX(JAX)是在四周大的雌性NSG小鼠体内产生的。当CDX或PDX肿瘤达到约100-300mm³时，每两周通过尾静脉(每只小鼠2-3×10⁶个细胞)静脉注射(i.v.)NK92MI表达的CD16和CAR1二聚体或单体(CAR1二聚体和单体)。将对照小鼠静脉注射不含CD16也不含CAR1的NK92MI细胞。通过使用卡尺以毫米(mm)为单位测量肿瘤的宽度(W)和长度(L)并使用公式(W)²×L/2(mm³)计算肿瘤体积(mm³)来确定治疗效果。

统计分析。体外和体内数据表示为平均值+/-SEM，并使用Prism软件(GraphPad)通过方差分析和t检验进行统计学意义分析。为了进行统计学意义分析，每组重复两次或重复三次的孔用于组织培养板的体外测定，每组3或5只小鼠用于体内动物研究。统计学意义表示为*：P<0.05；**：P<0.01；***：P<0.001；****：P<0.0001，“ns”表示无(统计学)意义。

除非另有定义，否则本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域的技术人员通常理解相同的含义。本文引用的出版物以及那些出版物所引用的材料以引用方式明确地并入本文。

本领域的技术人员将认识到或者能够使用不超过常规的实验确定本文所述的本发明的具体实施例的许多等同物。此类等同物旨在被以下权利要求书所涵盖。

表格

表1.实体癌、白血病、肉瘤、淋巴瘤和骨髓瘤中组织因子表达

表1的参考文献

1.U.Sturm et al.,Immunohistological detection of tissue factor innormal and abnormal human mammary glands using monoclonal antibodies.VirchowsArchiv 421,79-86(1992).

2.J.Contrino,G.Hair,D.L.Kreutzer,F.R.Rickles,In situ detection oftissue factor in vascular endothelial cells:correlation with the malignantphenotype of human breast disease.Nat Med 2,209-215(1996).

3.T.Ueno,M.Toi,M.Koike,S.Nakamura,T.Tominaga,Tissue factor expressionin breast cancer tissues:its correlation with prognosis and plasmaconcentration.British journal of cancer 83,164-170(2000).

4.J.Duanmu,J.Cheng,J.Xu,C.J.Booth,Z.Hu,Effective treatment ofchemoresistant breast cancer in vitro and in vivo by a factor VII-targetedphotodynamic therapy.British journal of cancer 104,1401-1409(2011).

5.Z.Hu et al.,Targeting Tissue Factor for Immunotherapy of Triple-Negative Breast Cancer Using a Second-Generation ICON.Cancer Immunol Res,(2018).

6.T.Kageshita et al.,Tissue factor expression and serum level inpatients with melanoma does not correlate with disease progression.PigmentCell Res 14,195-200(2001).

7.Z.Hu,Y.Sun,A.Garen,Targeting tumor vasculature endothelial cellsand tumor cells for immunotherapy of human melanoma in a mouse xenograftmodel.Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States ofAmerica 96,8161-8166(1999).

8.M.Shoji et al.,Activation of coagulation and angiogenesis incancer:immunohistochemical localization in situ of clotting proteins andvascular endothelial growth factor in human cancer.The American journal ofpathology 152,399-411(1998).

9.R.Koomagi,M.Volm,Tissue-factor expression in human non-small-celllung carcinoma measured by immunohistochemistry:correlation between tissuefactor and angiogenesis.International journal of cancer 79,19-22(1998).

10.M.Sawada et al.,Expression of tissue factor in non-small-cell lungcancers and its relationship to metastasis.British journal of cancer 79,472-477(1999).

11.B.Wang et al.,Radiotherapy of human xenograft NSCLC tumors in nudemice with a 90Y-labeled anti-tissue factor antibody.Cancer biotherapy&radiopharmaceuticals 20,300-309(2005).

12.P.Goldin-Lang et al.,Tissue factor expression pattern in humannon-small cell lung cancer tissues indicate increased blood thrombogenicityand tumor metastasis.Oncol Rep 20,123-128(2008).

13.R.T.Poon et al.,Tissue factor expression correlates with tumorangiogenesis and invasiveness in human hepatocellular carcinoma.Clin CancerRes 9,5339-5345(2003).

14.T.Kaido et al.,Tissue factor is a useful prognostic factor ofrecurrence in hepatocellular carcinoma in 5-year survivors.Hepato-gastroenterology 52,1383-1387(2005).

15.A.K.Kakkar,N.R.Lemoine,M.F.Scully,S.Tebbutt,R.C.Williamson,Tissuefactor expression correlates with histological grade in human pancreaticcancer.The British journal of surgery 82,1101-1104(1995).

16.N.Nitori et al.,Prognostic significance of tissue factor inpancreatic ductal adenocarcinoma.Clin Cancer Res 11,2531-2539(2005).

17.A.A.Khorana et al.,Tissue factor expression,angiogenesis,andthrombosis in pancreatic cancer.Clin Cancer Res 13,2870-2875(2007).

18.C.Shigemori et al.,Tissue factor expression and metastaticpotential of colorectal cancer.Thromb Haemost 80,894-898(1998).

19.T.Nakasaki et al.,Expression of tissue factor and vascularendothelial growth factor is associated with angiogenesis in colorectalcancer.Am J Hematol 69,247-254(2002).

20.D.F.Altomare et al.,Tissue factor and vascular endothelial growthfactor expression in colorectal cancer:relation with cancerrecurrence.Colorectal Dis 9,133-138(2007).

21.S.A.Abdulkadir et al.,Tissue factor expression and angiogenesis inhuman prostate carcinoma.Hum Pathol 31,443-447(2000).

22.T.Akashi,Y.Furuya,S.Ohta,H.Fuse,Tissue factor expression andprognosis in patients with metastatic prostate cancer.Urology 62,1078-1082(2003).

23.V.Kaushal et al.,Expression of tissue factor in prostate cancercorrelates with malignant phenotype.Appl Immunohistochem Mol Morphol 16,1-6(2008).

24.Z.Hu,A.Garen,Targeting tissue factor on tumor vascular endothelialcells and tumor cells for immunotherapy in mouse models of prostaticcancer.Proceedings of the National Academy of Sciences of the United Statesof America 98,12180-12185(2001).

25.K.Uno et al.,Tissue factor expression as a possible determinant ofthromboembolism in ovarian cancer.British journal of cancer 96,290-295(2007).

26.K.Hamada et al.,Expression of tissue factor correlates with gradeof malignancy in human glioma.Cancer 77,1877-1883(1996).

27.S.Takano,K.Tsuboi,Y.Tomono,Y.Mitsui,T.Nose,Tissue factor,osteopontin,alphavbeta3 integrin expression in microvasculature of gliomasassociated with vascular endothelial growth factor expression.British journalof cancer 82,1967-1973(2000).

28.M.Guan,J.Jin,B.Su,W.W.Liu,Y.Lu,Tissue factor expression andangiogenesis in human glioma.Clin Biochem 35,321-325(2002).

29.J.Thaler et al.,Intratumoral tissue factor expression and risk ofvenous thromboembolism in brain tumor patients.Thromb Res 131,162-165(2013).

30.F.R.Rickles,G.A.Hair,R.A.Zeff,E.Lee,R.D.Bona,Tissue factorexpression in human leukocytes and tumor cells.Thromb Haemost 74,391-395(1995).

31.K.Andoh et al.,Tissue factor activity in leukemia cells.Specialreference to disseminated intravascular coagulation.Cancer 59,748-754(1987).

32.K.A.Bauer et al.,Tissue factor gene expression in acutemyeloblastic leukemia.Thromb Res 56,425-430(1989).

33.H.Tanaka et al.,Studies on leukemic cell tissue factor.Thromb Res53,535-549(1989).

34.M.Tanaka,T.Kishi,Induction of tissue factor by interleukin-2 inacute myelogenous leukemia(AML)cells.Growth Factors 4,1-8(1990).

35.M.Tanaka,H.Yamanishi,The expression of tissue factor antigen andactivity on the surface of leukemic cells.Leuk Res 17,103-111(1993).

36.T.Nakasaki et al.,Elevated tissue factor levels in leukemic cellhomogenate.Clin Appl Thromb Hemost 6,14-17(2000).

37.T.Kubota,K.Andoh,H.Sadakata,H.Tanaka,N.Kobayashi,Tissue factorreleased from leukemic cells.Thromb Haemost 65,59-63(1991).

38.T.Nakasaki et al.,Decreased tissue factor and tissue-plasminogenactivator antigen in relapsed acute promyelocytic leukemia.Am J Hematol 64,145-150(2000).

39.Y.Zhang et al.,Intravenous somatic gene transfer with antisensetissue factor restores blood flow by reducing tumor necrosis factor-inducedtissue factor expression and fibrin deposition in mouse meth-A sarcoma.J ClinInvest 97,2213-2224(1996).

40.J.G.Bledsoe,S.M.Slack,Tissue factor expression by rat osteosarcomacells adherent to tissue culture polystyrene and selected orthopedicbiomaterials.J Biomater Sci Polym Ed 9,1305-1312(1998).

41.Y.M.Zhang et al.,Vascular origin of Kaposi's sarcoma.Expression ofleukocyte adhesion molecule-1,thrombomodulin,and tissue factor.The Americanjournal of pathology 144,51-59(1994).

42.G.Cesarman-Maus,E.Braggio,C.Lome-Maldonado,A.L.Morales-Leyte,R.Fonseca,Absence of tissue factor is characteristic of lymphoid malignanciesof both T-and B-cell origin.Thromb Res 133,606-609(2014).

43.Gupta et al.Tissue Factor Is Frequently Expressed in MultipleMyeloma Cells.Blood 2009 114:2132；Abstract 2132.

序列

序列ID NO 1：TF靶向CAR1单体

GCTAGCGCCACCATGGTCTCCCAGGCCCTCAGGCTCCTCTGCCTTCTGCTTGGGCTTCAGGGCTGCCTGGCTGCAGTCTTCGTAACCCAGGAGGAAGCCCACGGCGTCCTGCACCGGCGCCGGCGCGCCAACGCGTTCCTGGAGGAGCTGCGGCCGGGCTCCCTGGAGAGGGAGTGCAAGGAGGAGCAGTGCTCCTTCGAGGAGGCCCGGGAGATCTTCAAGGACGCGGAGAGGACGAAGCTGTTCTGGATTTCTTACAGTGATGGTGACCAGTGTGCCTCAAGTCCATGCCAGAATGGGGGCTCCTGCAAGGACCAGCTCCAGTCCTATATCTGCTTCTGCCTCCCTGCCTTCGAGGGCCGGAACTGTGAGACGCACAAGGATGACCAGCTGATCTGTGTGAACGAGAACGGCGGCTGTGAGCAGTACTGCAGTGACCACACGGGCACCAAGCGCTCCTGTCGGTGCCACGAGGGGTACTCTCTGCTGGCAGACGGGGTGTCCTGCACACCCACAGTTGAATATCCATGTGGAAAAATACCTATTCTAGAAAAAAGAAATGCCAGCAAGCCCCAAGGGCGAGGATCCTTTTGGGTGCTGGTGGTGGTTGGTGGAGTCCTGGCTTGCTATAGCTTGCTAGTAACAGTGGCCTTTATTATTTTCTGGGTGAGGAGTAAGAGGAGCAGGCTCCTGCACAGTGACTACATGAACATGACTCCCCGCCGCCCCGGGCCCACCCGCAAGCATTACCAGCCCTATGCCCCACCACGCGACTTCGCAGCCTATCGCTCCTTCGAACGTTTCTCTGTTGTTAAACGGGGCAGAAAGAAACTCCTGTATATATTCAAACAACCATTTATGAGACCAGTACAAACTACTCAAGAGGAAGATGGCTGTAGCTGCCGATTTCCAGAAGAAGAAGAAGGAGGATGTGAACTGGAATTCAGAGTGAAGTTCAGCAGGAGCGCAGACGCCCCCGCGTACCAGCAGGGCCAGAACCAGCTCTATAACGAGCTCAATCTAGGACGAAGAGAGGAGTACGATGTTTTGGACAAGAGACGTGGCCGGGACCCTGAGATGGGGGGAAAGCCGAGAAGGAAGAACCCTCAGGAAGGCCTGTACAATGAACTGCAGAAAGATAAGATGGCGGAGGCCTACAGTGAGATTGGGATGAAAGGCGAGCGCCGGAGGGGCAAGGGGCACGATGGCCTTTACCAGGGTCTCAGTACAGCCACCAAGGACACCTACGACGCCCTTCACATGCAGGCCCTGCCCCCTCGCTGAGTTTAAACGCGGCCGC

CAR1单体图(hfVIIL-CD28-4-1BB-CD3ζ)

NheI-Kozak-fVII轻链(起始密码子+信号+成熟的fVII轻链)-

BamHI-CD28(TM+CD)-BstBI-4-1BB-EcoRI-CD3ζCD-终止密码子-

PmeI-NotI

序列ID NO:2：TF靶向CAR1二聚体

GCTAGCGCCACCATGGTCTCCCAGGCCCTCAGGCTCCTCTGCCTTCTGCTTGGGCTTCAGGGCTGCCTGGCTGCAGTCTTCGTAACCCAGGAGGAAGCCCACGGCGTCCTGCACCGGCGCCGGCGCGCCAACGCGTTCCTGGAGGAGCTGCGGCCGGGCTCCCTGGAGAGGGAGTGCAAGGAGGAGCAGTGCTCCTTCGAGGAGGCCCGGGAGATCTTCAAGGACGCGGAGAGGACGAAGCTGTTCTGGATTTCTTACAGTGATGGTGACCAGTGTGCCTCAAGTCCATGCCAGAATGGGGGCTCCTGCAAGGACCAGCTCCAGTCCTATATCTGCTTCTGCCTCCCTGCCTTCGAGGGCCGGAACTGTGAGACGCACAAGGATGACCAGCTGATCTGTGTGAACGAGAACGGCGGCTGTGAGCAGTACTGCAGTGACCACACGGGCACCAAGCGCTCCTGTCGGTGCCACGAGGGGTACTCTCTGCTGGCAGACGGGGTGTCCTGCACACCCACAGTTGAATATCCATGTGGAAAAATACCTATTCTAGAAAAAAGAAATGCCAGCAAGCCCCAAGGGCGAGGATCCGCAGAGCCCAAATCTTGTGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGGATCCTTTTGGGTGCTGGTGGTGGTTGGTGGAGTCCTGGCTTGCTATAGCTTGCTAGTAACAGTGGCCTTTATTATTTTCTGGGTGAGGAGTAAGAGGAGCAGGCTCCTGCACAGTGACTACATGAACATGACTCCCCGCCGCCCCGGGCCCACCCGCAAGCATTACCAGCCCTATGCCCCACCACGCGACTTCGCAGCCTATCGCTCCTTCGAACGTTTCTCTGTTGTTAAACGGGGCAGAAAGAAACTCCTGTATATATTCAAACAACCATTTATGAGACCAGTACAAACTACTCAAGAGGAAGATGGCTGTAGCTGCCGATTTCCAGAAGAAGAAGAAGGAGGATGTGAACTGGAATTCAGAGTGAAGTTCAGCAGGAGCGCAGACGCCCCCGCGTACCAGCAGGGCCAGAACCAGCTCTATAACGAGCTCAATCTAGGACGAAGAGAGGAGTACGATGTTTTGGACAAGAGACGTGGCCGGGACCCTGAGATGGGGGGAAAGCCGAGAAGGAAGAACCCTCAGGAAGGCCTGTACAATGAACTGCAGAAAGATAAGATGGCGGAGGCCTACAGTGAGATTGGGATGAAAGGCGAGCGCCGGAGGGGCAAGGGGCACGATGGCCTTTACCAGGGTCTCAGTACAGCCACCAAGGACACCTACGACGCCCTTCACATGCAGGCCCTGCCCCCTCGCTGAGTTTAAACGCGGCCGC

hfVIIL-铰链-CD28-4-1BB-CD3ζ图

NheI-Kozak-fVII轻链(起始密码子+信号+成熟的fVII轻链)-

BamHI*-hIgG1铰链-BamHI*-CD28(TM+CD)-BstBI-4-1BB-EcoRI-

CD3ζCD-终止密码子-PmeI-NotI

TM：跨膜结构域。CD：细胞质结构域。NheI、BamHI、BstBI、EcoRI、PmeI和NotI：限制性内切酶用于将单个识别和信号片段的分子亚克隆到质粒构建体中，并允许修饰CAR信号片段，例如，用OX40取代4-1BB(TF靶向CAR2)或将OX40添加到CAR1中作为第四代CAR(TF靶向CAR3)。

SEQ ID NO:3：人凝血因子VII轻链的cDNA序列

ATGGTCTCCCAGGCCCTCAGGCTCCTCTGCCTTCTGCTTGGGCTTCAGGGCTGCCTGGCTGCAGTCTTCGTAACCCAGGAGGAAGCCCACGGCGTCCTGCACCGGCGCCGGCGCGCCAACGCGTTCCTGGAGGAGCTGCGGCCGGGCTCCCTGGAGAGGGAGTGCAAGGAGGAGCAGTGCTCCTTCGAGGAGGCCCGGGAGATCTTCAAGGACGCGGAGAGGACGAAGCTGTTCTGGATTTCTTACAGTGATGGTGACCAGTGTGCCTCAAGTCCATGCCAGAATGGGGGCTCCTGCAAGGACCAGCTCCAGTCCTATATCTGCTTCTGCCTCCCTGCCTTCGAGGGCCGGAACTGTGAGACGCACAAGGATGACCAGCTGATCTGTGTGAACGAGAACGGCGGCTGTGAGCAGTACTGCAGTGACCACACGGGCACCAAGCGCTCCTGTCGGTGCCACGAGGGGTACTCTCTGCTGGCAGACGGGGTGTCCTGCACACCCACAGTTGAATATCCATGTGGAAAAATACCTATTCTAGAAAAAAGAAATGCCAGCAAGCCCCAAGGGCGA

SEQ ID NO:4：38个氨基酸的信号肽(带下划线)，然后是152个氨基酸的成熟fVII轻链肽

MVSQALRLLC LLLGLQGCLA AVFVTQEEAH GVLHRRRRAN AFLEELRPGS LERECKEEQCSFEEAREIFK DAERTKLFWI SYSDGDQCAS SPCQNGGSCK DQLQSYICFCLPAFEGRNCE THKDDQLICVNENGGCEQYC SDHTGTKRSC RCHEGYSLLA DGVSCTPTVE YPCGKIPILE KRNASKPQGR//

参考文献

1.Hu,Y.,Tian,Z.G.,and Zhang,C.(2018).Chimeric antigen receptor(CAR)-transduced natural killer cells in tumor immunotherapy.Acta Pharmacol Sin 39,167-176.

2.Liu,E.,Tong,Y.,Dotti,G.,Shaim,H.,Savoldo,B.,Mukherjee,M.,Orange,J.,Wan,X.,Lu,X.,Reynolds,A.,et al.(2018).Cord blood NK cells engineered toexpress IL-15and a CD19-targeted CAR show long-term persistence and potentantitumor activity.Leukemia 32,520-531.

3.Mehta,R.S.,and Rezvani,K.(2018).Chimeric Antigen ReceptorExpressing Natural Killer Cells for the Immunotherapy of Cancer.Front Immunol9,283.

4.Nowakowska,P.,Romanski,A.,Miller,N.,Odendahl,M.,Bonig,H.,Zhang,C.,Seifried,E.,Wels,W.S.,and Tonn,T.(2018).Clinical grade manufacturing ofgenetically modified,CAR-expressing NK-92cells for the treatment of ErbB2-positive malignancies.Cancer Immunol Immunother 67,25-38.

5.Adorno-Cruz et al.,Cancer stem cells:targeting the roots of cancer,seeds of metastasis,and sources of therapy resistance.Cancer research 75,924-929(2015).

6.Afuwape,et al.,The role of the angiogenic molecule VEGF in thepathogenesis of rheumatoid arthritis.Histology and histopathology,17(3):961-972(2002).

7.Anders,et al.,Biology,metastatic patterns,and treatment of patientswith triple-negative breast cancer.Clinical breast cancer 9Suppl 2,S73-81(2009).

8.Bayraktar,et al.,Molecularly targeted therapies for metastatictriple-negative breast cancer.Breast cancer research and treatment 138,21-35(2013).

9.Berrada,et al.,Treatment of triple-negative metastatic breastcancer:toward individualized targeted treatments or chemosensitization？Annalsof oncology:official journal of the European Society for Medical Oncology/ESMO 21 Suppl 7,vii30-35(2010).

10.Bora et al.,Immunotherapy for choroidal neovascularization in alaser-induced mouse model simulating exudative(wet)maculardegeneration.Proceedings of the National Academy of Sciences of the UnitedStates of America 100,2679-2684(2003).

11.Bromberg,et al.,Tissue factor promotes melanoma metastasis by apathway independent of blood coagulation.Proceedings of the National Academyof Sciences of the United States of America 92,8205-8209(1995).

12.Caine,et al.,The hypercoagulable state of malignancy:pathogenesisand current debate.Neoplasia 4,465-473(2002).

13.Callander,et al.,Immunohistochemical identification of tissuefactor in solid tumors.Cancer 70,1194-1201(1992).

14.Chen et al.,A combinational therapy of EGFR-CAR NK cells andoncolytic herpes simplex virus 1 for breast cancer brainmetastases.Oncotarget 7,27764-27777(2016).

15.Cheng et al.,Effective Treatment of Human Lung Cancer by TargetingTissue Factor with a Factor VII-Targeted Photodynamic Therapy.Curr CancerDrug Targets 11,1069-1081(2011).

16.Clarke et al.,Cancer stem cells--perspectives on current statusand future directions:AACR Workshop on cancer stem cells.Cancer research 66,9339-9344(2006).

17.Contrino,et al.,In situ detection of tissue factor in vascularendothelial cells:correlation with the malignant phenotype of human breastdisease.Nature medicine 2(2):209-215(1996).

18.Contrino,et al.,In situ characterization of antigenic andfunctional tissue factor expression in human tumors utilizing monoclonalantibodies and recombinant factor VIIa as probes.Am J Pathol 145,1315-1322(1994).

19.Duanmu,et al.,Effective treatment of chemoresistant breast cancerin vitro and in vivo by a factor VII-targeted photodynamic therapy.Britishjournal of cancer.104(9):1401-1409(2011).

20.El Guerrab et al.,Differential impact of EGFR-targeted therapieson hypoxia responses:implications for treatment sensitivity in triple-negative metastatic breast cancer.PloS one 6,e25080(2011).

21.Ferrandina,et al.,Targeting CD133 antigen in cancer.Expert OpinTher Targets 13,823-837(2009).

22.Ferrara N.VEGF and the quest for tumour angiogenesisfactors.Nature reviews Cancer.2(10):795-803(2002).

23.Folkman,Tumor angiogenesis and tissue factor.Nat Med 2,167-168(1996))。

24.Fujimoto,et al.,Angiogenesis in endometriosis and angiogenicfactors.Gynecologic and obstetric investigation 48 Suppl 1:14-20(1999).

25.Hu et al.,Tissue factor is an angiogenic-specific receptor forfactor VII-targeted immunotherapy and photodynamic therapy.Angiogenesis(2016).

26.Hu,et al.,Factor VII-Targeted Photodynamic Therapy for BreastCancer and Its Therapeutic Potential for Other Solid Cancers and Leukemia,Breast Cancer-Current and Alternative Therapeutic Modalities,Esra Gunduz andMehmet Gunduz(Ed.),ISBN:978-953-307-776-5,InTech,E.Gunduz,Gunduz,M.,Ed.,Breast Cancer-Current and Alternative Therapeutic Modalities(InTech,2011),pp.175-196.

27.Hu,et al.,Intratumoral injection of adenoviral vectors encodingtumor-targeted immunoconjugates for cancer immunotherapy.Proceedings of theNational Academy of Sciences of the United States of America 97,9221-9225(2000).

28.Hu,et al.,Natural killer cells are crucial for the efficacy ofIcon(factor VII/human IgG1 Fc)immunotherapy in human tongue cancer.BMCimmunology 11,49(2010).

29.Hu,et al.,Selective and effective killing of angiogenic vascularendothelial cells and cancer cells by targeting tissue factor using a factorVII-targeted photodynamic therapy for breast cancer.Breast cancer researchand treatment 126(3):589-600(2011).

30.Hu,et al.,Targeting tissue factor as a novel therapeuticoncotarget for eradication of cancer stem cells isolated from tumor celllines,tumor xenografts and patients of breast,lung and ovariancancer.Oncotarget,(2016).

31.Hu,et al.,Targeting Tissue Factor for Immunotherapy of Triple-Negative Breast Cancer Using a Second-Generation ICON.Cancer Immunol Res 6,671-684(2018).

32.Hu,et al.,Targeting tissue factor on tumor vascular endothelialcells and tumor cells for immunotherapy in mouse models of prostaticcancer.Proc Natl Acad Sci U S A 98,12180-12185(2001).

33.Hu,et al.,Targeting tissue factor on tumour cells and angiogenicvascular endothelial cells by factor VII-targeted verteporfin photodynamictherapy for breast cancer in vitro and in vivo in mice.BMC cancer 10:235(2010).

34.Hu,et al.,Targeting tumor vasculature endothelial cells and tumorcells for immunotherapy of human melanoma in a mouse xenograftmodel.Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States ofAmerica 96,8161-8166(1999).

35.Hu,et al.,Therapeutic Antibody-Like Immunoconjugates againstTissue Factor with the Potential to Treat Angiogenesis-Dependent as Well asMacrophage-Associated Human Diseases.Antibodies 7,(2018).

36.Hu,et al.,Tissue factor is an angiogenic-specific receptor forfactor VII-targeted immunotherapy and photodynamic therapy.Angiogenesis 20,85-96(2017).

37.Hudis,et al.,Triple-negative breast cancer:an unmet medicalneed.The oncologist 16 Suppl 1,1-11(2011).

38.Hufnagel et al.,Icon immunoconjugate treatment results inregression of red lesions in a non-human primate(Papio anubis)model ofendometriosis.Reprod Biol 18,109-114(2018).

39.Jemal et al.,Global cancer statistics.CA:a cancer journal forclinicians 61,69-90(2011).

40.Kassam et al.,Survival outcomes for patients with metastatictriple-negative breast cancer:implications for clinical practice and trialdesign.Clinical breast cancer 9,29-33(2009).

41.Kasthuri,M.B.Taubman,N.Mackman,Role of tissue factor in cancer.JClin Oncol 27,4834-4838(2009).

42.Kim,et al.Mapping the site on human IgG for binding of the MHCclass I-related receptor,FcRn.European journal of immunology 29,2819-2825,doi:10.1002/(SICI)1521-4141(199909)29:09&#60；2819::AID-IMMU2819&#62；3.0.CO；2-6(1999).

43.Klagsbrun,et al.,Purification of endothelial cell growth factorsby heparin affinity chromatography.Methods in enzymology 147:95-105(1987).

44.Koch,et al.,Cancer stem cells at the crossroads of current cancertherapy failures--radiation oncology perspective.Seminars in cancer biology20(2):116-124(2010).

45.Konigsberg,et al.,Molecular cloning of the cDNA for human tissuefactor.Cell 52(5):639-640(1988).

46.Krikun et al.,The immunoconjugate"icon"targets aberrantlyexpressed endothelial tissue factor causing regression of endometriosis.Am JPathol176,1050-1056(2010).

47.Liedtke,et al.,Current Issues of Targeted Therapy in MetastaticTriple-Negative Breast Cancer.Breast care 6,234-239(2011).

48.Lopez-Pedrera,et al.,Tissue factor as an effector of angiogenesisand tumor progression in hematological malignancies.Leukemia 20,1331-1340(2006).

49.Lykke,e al.,The role of tissue factor in colorectal cancer.Eur JSurg Oncol 29,417-422(2003).

50.Milsom et al.,Tissue factor and cancer stem cells:is there alinkage？Arterioscler Thromb Vasc Biol 29,2005-2014(2009).

51.Moncharmont,et al.,Targeting a cornerstone of radiationresistance:cancer stem cell.Cancer letters 322(2):139-147(2012).

52.Montero,et al.,Bevacizumab in the treatment of metastatic breastcancer:friend or foe？Current oncology reports 14,1-11(2012).

53.Morrissey,et al.,Molecular cloning of the cDNA for tissue factor,the cellular receptor for the initiation of the coagulation proteasecascade.Cell50,129-135(1987).

54.Mousa,Role of current and emerging antithrombotics in thrombosisand cancer.Timely topics in medicine.Cardiovascular diseases 10,E19(2006).

55.Nemerson,Tissue factor and the initiation of bloodcoagulation.Advances in experimental medicine and biology 214:83-94(1987).

56.Nemerson,Tissue factor and hemostasis.Blood 71,1-8(1988).

57.Osterud,Tissue factor:a complex biological role.Thrombosis andhaemostasis 78,755-758(1997).

58.Paszkiewicz,et al.,Targeted antibody-mediated depletion of murineCD19CAR T cells permanently reverses B cell aplasia.J Clin Invest 126,4262-4272(2016).

59.Peitzsch,Aet al.,Cancer stem cells:The root of tumor recurrenceand metastases.Semin Cancer Biol 44,10-24(2017).

60.Penka,[Activation of blood coagulation in oncology patients].Vnitrni lekarstvi 43,337-339(1997).

61.Phillips,et al.,The response of CD24(-/low)/CD44+breast cancer-initiating cells to radiation.Journal of the National Cancer Institute 98,1777-1785(2006).

62.Presta et al.,Generation of a humanized,high affinity anti-tissuefactor antibody for use as a novel antithrombotic therapeutic.Thrombosis andhaemostasis 85,379-389(2001).

63.Rak,et al.,Tissue factor in cancer and angiogenesis:the molecularlink between genetic tumor progression,tumor neovascularization,and cancercoagulopathy.Seminars in thrombosis and hemostasis 32,54-70(2006).

64.Rakha,et al.,Metastatic triple-negative breast cancer.Clinicaloncology 23,587-600(2011).

65.Rao,et al.,Tissue factor on cells.Blood Coagul Fibrinolysis 9Suppl 1,S27-35(1998).

66.Rickles,et al.,The role of the hemostatic system in tumor growth,metastasis,and angiogenesis:tissue factor is a bifunctional molecule capableof inducing both fibrin deposition and angiogenesis in cancer.Int J Hematol73,145-150(2001).

67.Ruf,et al.,Tissue factor and cell signalling in cancer progressionand thrombosis.J Thromb Haemost 9 Suppl 1,306-315(2011).

68.Semeraro,et al.,Tissue factor in health and disease.Thrombosis andhaemostasis 78,759-764(1997).

69.Sheridan et al.,CD44+/CD24-breast cancer cells exhibit enhancedinvasive properties:an early step necessary for metastasis.Breast Cancer Res8,R59(2006).

70.Spicer,et al.,Isolation of cDNA clones coding for human tissuefactor:primary structure of the protein and cDNA.Proceedings of the NationalAcademy of Sciences of the United States of America 84(15)5148-5152(1987).

71.Stapleton,et al.Competition for FcRn-mediated transport gives riseto short half-life of human IgG3 and offers therapeutic potential.Naturecommunications 2,599,doi:10.1038/ncomms1608(2011).

72.Tam,et al.,Characterization of genetically altered,interleukin 2-independent natural killer cell lines suitable for adoptive cellularimmunotherapy.Hum Gene Ther 10,1359-1373(1999).

73.Tang,et al.,Mapping of angiogenic markers for targeting of vectorsto tumor vascular endothelial cells.Cancer Gene Ther 14,346-353(2007).

74.Tezel,et al.,Targeting tissue factor for immunotherapy ofchoroidal neovascularization by intravitreal delivery of factor VII-Fcchimeric antibody.Ocul Immunol Inflamm 15,3-10(2007).

75.Versteeg,et al.,Tissue factor and cancer metastasis:the role ofintracellular and extracellular signaling pathways.Mol Med 10,6-11(2004).

76.Vidal,et al.,Targeting cancer stem cells to suppress acquiredchemotherapy resistance.Oncogene 33(36),4451-4463(2014).

77.Waxman,et al.,Tissue factor and its extracellular soluble domain:the relationship between intermolecular association with factor VIIa andenzymatic activity of the complex.Biochemistry 31,3998-4003(1992).

78.Yoshida,How to eliminate MYCN-positive hepatic cancer stem cellsto prevent the recurrence？Proceedings of the National Academy of Sciences ofthe United States of America 115,E6388-E6389(2018).

序列表

<110> 俄亥俄州创新基金会

<120> 组织因子靶向CAR-NK和CAR-T细胞疗法

<130> 10336-365WO1

<150> 62564006

<151> 2017-09-27

<160> 4

<170> PatentIn 版本 3.5

<210> 1

<211> 1300

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成构建体

<400> 1

gctagcgcca ccatggtctc ccaggccctc aggctcctct gccttctgct tgggcttcag 60

ggctgcctgg ctgcagtctt cgtaacccag gaggaagccc acggcgtcct gcaccggcgc 120

cggcgcgcca acgcgttcct ggaggagctg cggccgggct ccctggagag ggagtgcaag 180

gaggagcagt gctccttcga ggaggcccgg gagatcttca aggacgcgga gaggacgaag 240

ctgttctgga tttcttacag tgatggtgac cagtgtgcct caagtccatg ccagaatggg 300

ggctcctgca aggaccagct ccagtcctat atctgcttct gcctccctgc cttcgagggc 360

cggaactgtg agacgcacaa ggatgaccag ctgatctgtg tgaacgagaa cggcggctgt 420

gagcagtact gcagtgacca cacgggcacc aagcgctcct gtcggtgcca cgaggggtac 480

tctctgctgg cagacggggt gtcctgcaca cccacagttg aatatccatg tggaaaaata 540

cctattctag aaaaaagaaa tgccagcaag ccccaagggc gaggatcctt ttgggtgctg 600

gtggtggttg gtggagtcct ggcttgctat agcttgctag taacagtggc ctttattatt 660

ttctgggtga ggagtaagag gagcaggctc ctgcacagtg actacatgaa catgactccc 720

cgccgccccg ggcccacccg caagcattac cagccctatg ccccaccacg cgacttcgca 780

gcctatcgct ccttcgaacg tttctctgtt gttaaacggg gcagaaagaa actcctgtat 840

atattcaaac aaccatttat gagaccagta caaactactc aagaggaaga tggctgtagc 900

tgccgatttc cagaagaaga agaaggagga tgtgaactgg aattcagagt gaagttcagc 960

aggagcgcag acgcccccgc gtaccagcag ggccagaacc agctctataa cgagctcaat 1020

ctaggacgaa gagaggagta cgatgttttg gacaagagac gtggccggga ccctgagatg 1080

gggggaaagc cgagaaggaa gaaccctcag gaaggcctgt acaatgaact gcagaaagat 1140

aagatggcgg aggcctacag tgagattggg atgaaaggcg agcgccggag gggcaagggg 1200

cacgatggcc tttaccaggg tctcagtaca gccaccaagg acacctacga cgcccttcac 1260

atgcaggccc tgccccctcg ctgagtttaa acgcggccgc 1300

<210> 2

<211> 1354

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成构建体

<400> 2

gctagcgcca ccatggtctc ccaggccctc aggctcctct gccttctgct tgggcttcag 60

ggctgcctgg ctgcagtctt cgtaacccag gaggaagccc acggcgtcct gcaccggcgc 120

cggcgcgcca acgcgttcct ggaggagctg cggccgggct ccctggagag ggagtgcaag 180

gaggagcagt gctccttcga ggaggcccgg gagatcttca aggacgcgga gaggacgaag 240

ctgttctgga tttcttacag tgatggtgac cagtgtgcct caagtccatg ccagaatggg 300

ggctcctgca aggaccagct ccagtcctat atctgcttct gcctccctgc cttcgagggc 360

cggaactgtg agacgcacaa ggatgaccag ctgatctgtg tgaacgagaa cggcggctgt 420

gagcagtact gcagtgacca cacgggcacc aagcgctcct gtcggtgcca cgaggggtac 480

tctctgctgg cagacggggt gtcctgcaca cccacagttg aatatccatg tggaaaaata 540

cctattctag aaaaaagaaa tgccagcaag ccccaagggc gaggatccgc agagcccaaa 600

tcttgtgaca aaactcacac atgcccaccg tgcccaggat ccttttgggt gctggtggtg 660

gttggtggag tcctggcttg ctatagcttg ctagtaacag tggcctttat tattttctgg 720

gtgaggagta agaggagcag gctcctgcac agtgactaca tgaacatgac tccccgccgc 780

cccgggccca cccgcaagca ttaccagccc tatgccccac cacgcgactt cgcagcctat 840

cgctccttcg aacgtttctc tgttgttaaa cggggcagaa agaaactcct gtatatattc 900

aaacaaccat ttatgagacc agtacaaact actcaagagg aagatggctg tagctgccga 960

tttccagaag aagaagaagg aggatgtgaa ctggaattca gagtgaagtt cagcaggagc 1020

gcagacgccc ccgcgtacca gcagggccag aaccagctct ataacgagct caatctagga 1080

cgaagagagg agtacgatgt tttggacaag agacgtggcc gggaccctga gatgggggga 1140

aagccgagaa ggaagaaccc tcaggaaggc ctgtacaatg aactgcagaa agataagatg 1200

gcggaggcct acagtgagat tgggatgaaa ggcgagcgcc ggaggggcaa ggggcacgat 1260

ggcctttacc agggtctcag tacagccacc aaggacacct acgacgccct tcacatgcag 1320

gccctgcccc ctcgctgagt ttaaacgcgg ccgc 1354

<210> 3

<211> 570

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成构建体

<400> 3

atggtctccc aggccctcag gctcctctgc cttctgcttg ggcttcaggg ctgcctggct 60

gcagtcttcg taacccagga ggaagcccac ggcgtcctgc accggcgccg gcgcgccaac 120

gcgttcctgg aggagctgcg gccgggctcc ctggagaggg agtgcaagga ggagcagtgc 180

tccttcgagg aggcccggga gatcttcaag gacgcggaga ggacgaagct gttctggatt 240

tcttacagtg atggtgacca gtgtgcctca agtccatgcc agaatggggg ctcctgcaag 300

gaccagctcc agtcctatat ctgcttctgc ctccctgcct tcgagggccg gaactgtgag 360

acgcacaagg atgaccagct gatctgtgtg aacgagaacg gcggctgtga gcagtactgc 420

agtgaccaca cgggcaccaa gcgctcctgt cggtgccacg aggggtactc tctgctggca 480

gacggggtgt cctgcacacc cacagttgaa tatccatgtg gaaaaatacc tattctagaa 540

aaaagaaatg ccagcaagcc ccaagggcga 570

<210> 4

<211> 190

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成构建体

<400> 4

Met Val Ser Gln Ala Leu Arg Leu Leu Cys Leu Leu Leu Gly Leu Gln

1 5 10 15

Gly Cys Leu Ala Ala Val Phe Val Thr Gln Glu Glu Ala His Gly Val

20 25 30

Leu His Arg Arg Arg Arg Ala Asn Ala Phe Leu Glu Glu Leu Arg Pro

35 40 45

Gly Ser Leu Glu Arg Glu Cys Lys Glu Glu Gln Cys Ser Phe Glu Glu

50 55 60

Ala Arg Glu Ile Phe Lys Asp Ala Glu Arg Thr Lys Leu Phe Trp Ile

65 70 75 80

Ser Tyr Ser Asp Gly Asp Gln Cys Ala Ser Ser Pro Cys Gln Asn Gly

85 90 95

Gly Ser Cys Lys Asp Gln Leu Gln Ser Tyr Ile Cys Phe Cys Leu Pro

100 105 110

Ala Phe Glu Gly Arg Asn Cys Glu Thr His Lys Asp Asp Gln Leu Ile

115 120 125

Cys Val Asn Glu Asn Gly Gly Cys Glu Gln Tyr Cys Ser Asp His Thr

130 135 140

Gly Thr Lys Arg Ser Cys Arg Cys His Glu Gly Tyr Ser Leu Leu Ala

145 150 155 160

Asp Gly Val Ser Cys Thr Pro Thr Val Glu Tyr Pro Cys Gly Lys Ile

165 170 175

Pro Ile Leu Glu Lys Arg Asn Ala Ser Lys Pro Gln Gly Arg

180 185 190

Claims (23)

1.包含嵌合抗原受体(CAR)的组合物，其中所述CAR包含组织因子(TF)结合结构域。

2.根据权利要求1所述的组合物，其中所述TF结合结构域包含因子VII(fVII)或其片段，其中所述片段具有足以识别TF的长度。

3.根据权利要求1或2所述的组合物，其中所述TF结合结构域包含可变片段，例如重链(VH)、轻链(VL)或单链可变片段(scFv)。

4.根据权利要求1-3中任一项所述的组合物，其中所述CAR进一步包含跨膜结构域。

5.根据权利要求4所述的组合物，其中所述跨膜结构域包含CD28。

6.根据权利要求1-5中任一项所述的组合物，其中所述CAR进一步包含一个或多个胞质结构域。

7.根据权利要求6所述的组合物，其中所述胞质结构域包含4-1BB。

8.根据权利要求6或7所述的组合物，其中胞质结构域包含CD3ζ。

9.根据权利要求1-8中任一项所述的组合物，其中所述CAR进一步包括铰链区。

10.根据权利要求6所述的组合物，其中所述铰链区衍生自人IgG1。

11.根据权利要求1所述的组合物，其中所述组合物靶向组织因子(TF)。

12.根据权利要求1所述的组合物，其中因子VII包括轻链因子VII。

13.根据权利要求12所述的组合物，其中所述轻链fVII包含SEQ ID NO:4。

14.根据权利要求1所述的组合物，其中所述CAR蛋白质由包含SEQ ID NO:1的核酸编码。

15.根据权利要求1所述的组合物，其中所述CAR蛋白质由包含SEQ ID NO:2的核酸编码。

16.根据权利要求1所述的组合物，其中所述CAR在免疫效应细胞中表达。

17.根据权利要求16所述的组合物，其中所述免疫效应细胞是NK细胞、NK-T细胞、细胞因子诱导的杀伤细胞、肿瘤浸润淋巴细胞(TILS)、骨髓浸润淋巴细胞和/或γδT细胞。

18.根据权利要求2所述的组合物，其中所述fVII或其片段衍生自人、小鼠或者是人与小鼠fVII的组合。

19.一种治疗有此需要的受试者的疾病的方法，所述方法包括向所述受试者施用有效量的权利要求16所述的细胞。

20.根据权利要求19所述的方法，其中所述疾病与组织因子(TF)表达有关。

21.根据权利要求19所述的方法，其中所述疾病包括病理性新生血管系统，其包括血管化(或实体)肿瘤、类风湿性关节炎、子宫内膜异位、淋巴瘤、白血病、肉瘤或黄斑变性，或表达TF的患病细胞，如动脉粥样硬化中的巨噬细胞。

22.根据权利要求21所述的方法，其中所述免疫效应细胞衍生自需要治疗的患者。

23.一种治疗有此需要的受试者的方法，所述方法包括：产生嵌合抗原受体(CAR)修饰的免疫细胞，其中所述CAR包含fVII或其片段；和衍生自受试者的免疫细胞；用所述CAR修饰所述免疫细胞，并通过向所述受试者施用所述CAR修饰的免疫细胞来治疗所述受试者。

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