JP2021523110A - 遺伝子発現のためのナノ粒子及びその使用 - Google Patents

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Abstract

インビボで遺伝子改変された選択された細胞型による治療タンパク質の発現に基づく処置プロトコールが記載される。処置プロトコールは、選択された細胞型を処置部位に引き付ける細胞誘引物質及び／又は処置部位でマクロファージ活性化プロトコールをさらに利用することができる。

Description

関連出願の相互参照
本出願は２０１８年５月１日に提出された米国特許仮出願第６２／６６５，２８０号の優先権を主張するものであり、前記特許文献の全内容は参照によりその全体を本明細書に組み込む。
本開示は、インビボで遺伝子改変された選択された細胞型による治療タンパク質の発現に基づく処置プロトコールを提供する。処置プロトコールは、選択された細胞型を処置部位に引き付ける細胞誘引物質を、及び／又は処置部位におけるマクロファージ活性化プロトコールを、さらに利用することができる。
多くの新しい医学療法は、患者の免疫系の細胞を遺伝子改変して疾患又は感染と闘うことを含む。例えば、養子Ｔ細胞療法は、Ｔ細胞が患者から収穫されがん細胞を標的にして殺傷するように遺伝子改変される、強力ながん療法である。しかし、薬物を標準化された形で大量に調製するよりはむしろ、患者ごとに遺伝子操作されたＴ細胞製品を製造するために関する複雑さ及び高コストのせいで、小分子薬物又はモノクローナル抗体などの現在の最前線療法の選択肢を打ち負かすのは困難になっている。例えば、養子Ｔ細胞療法のためにＴ細胞を遺伝子改変するには一般的に：
（ｉ）患者からＴ細胞を抽出する白血球アフェレーシス（すなわち、患者は２本の静脈チューブによりアフェレーシス装置に数時間繋がれる；これは患者には快適ではなく、かなりの費用を招き、最終的には自家性Ｔ療法の大規模採用がアフェレーシス能力の有効性により制限される速度になる可能性がある）；
（ｉｉ）Ｔ細胞の活性化及び遺伝子改変；
（ｉｉｉ）サイトカイン補充組織培養培地での２週間にわたる遺伝子改変されたＴ細胞の増殖；
（ｉｖ）投与に先立ってＴ細胞を洗浄し濃縮する（中央施設で作成され遠隔処置センターまで輸送されるＴ細胞製品には、凍結保存）；及び
（ｖ）遺伝子改変されたＴ細胞製品の配合バッチごとの品質管理（ＱＣ）リリースアッセイ
を必要とする。遺伝子改変されたＴ細胞製品を製造する費用及び複雑さにさらに上乗せして、これらの手順はすべて、維持し実行するのが高価である環境制御された優良医薬品製造基準（ＧＭＰ）条件下で行わなければならない。さらに、遺伝子改変されたＴ細胞製品は処置されることになっている患者由来の出発物質（Ｔ細胞）から作成されるので、実質的なスケールメリットはない。
多くの遺伝子改変細胞型に関連するもう１つの欠点は、細胞が投与後に患者の中にいつまでも残り、望ましくない及び／又は長引く副作用をもたらすこともあることである。
したがって、効果的でスケーラブルであるが、それほど永続的ではない療法を達成する機構が必要である。
（開示の要旨）
本開示は、インビボで遺伝子改変された選択された細胞型による核酸及び／又は治療タンパク質などのタンパク質の発現に基づく処置プロトコールを提供する。一部の実施形態において、治療タンパク質の発現は一過性であり、長引く副作用の可能性に関する懸念が克服される。さらに、処置プロトコールは、養子Ｔ細胞療法（及び類似する処置プロトコール）が必要とするすべての高価な細胞処理ステップを必要とせずに、インビボで選択された細胞型の遺伝子改変を達成できるナノ粒子を利用する。
特定の実施形態において、選択された細胞型を遺伝子改変して治療タンパク質を発現させるナノ粒子が投与される対象は、治療タンパク質発現のレベルについてモニターされる。発現が閾値より下に低下したら、処置担当医師は、ナノ粒子のそれに続く用量を投与して対象内での治療タンパク質発現を延長するべきかどうかを決めることができる。この手順は治療目的が達成され、医師が、対象内で治療タンパク質を連続して発現させても何ら有益な臨床目的を果たさないと判定するまで繰り返すことができる。
特定の実施形態において、本開示は、選択された細胞型をインビボで遺伝子改変して、核酸又は治療タンパク質などのタンパク質を５〜１０日間発現させるナノ粒子の投与を提供する。特定の実施形態において、ナノ粒子プログラムされた細胞は、記載されたナノ粒子へのインビボ曝露に続いて平均で７日間この表面で治療タンパク質を一過性に発現する。
特定の実施形態において、本開示は、選択された細胞型を身体内の処置部位に引き付ける細胞誘引物質を利用することを提供する。選択された細胞型を処置部位に引き付けることに続いて、引き付けられた細胞型を遺伝子改変して治療タンパク質を一過性に発現させるナノ粒子は処置部位に局所的に投与することができる。特定の実施形態において、細胞誘引物質は、ナノ粒子送達２４時間前に処置部位に投与される。
特定の実施形態において、細胞誘引物質は、対象内の所望の部位へ細胞を動員するために、ナノ粒子の臨床的に適切な時間窓内に対象に投与される。例えば、腫瘍部位へのＴ細胞の動員は、Ｔ細胞誘引物質を腫瘍中に又は近傍に投与することにより成し遂げられる。次に、Ｔ細胞誘引物質の臨床的に適切な時間窓内で施されるナノ粒子処置は、例えば、腫瘍に向けられる治療タンパク質の発現のために引き付けられたＴ細胞を有利に標的にすることができる。
特定の実施形態は、選択された細胞型の活性化状態を再プログラムするナノ粒子をさらに利用する。例えば、特定の実施形態は、処置部位でマクロファージを活性化するナノ粒子を利用する。
本開示は、処置プロトコールが、例えば、リンパ腫、前立腺がん、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）誘発肝細胞癌、卵巣がん、神経膠芽腫及び肺がんに対する治療的に効果的な処置を提供する。
本明細書に記載される処置プロトコールは、悪性腫瘍又は感染症を抱えた患者の処置のために、長引く副作用に関する懸念が克服されている入手可能な既製の試薬を使用する結果をもたらす。そのような製品は、診断の日に、及び医学的に必要なだけ何回でも、利用可能となり得る。
これに添えて提出される図の少なくとも１つはカラーでのほうがよく理解される。出願者は図（複数可）のカラーバージョンを最初の提出物の一部と見なしており、図のカラー画像を後の手続きで提出する権利を留保する。
代表的な実施形態の図解。ナノ粒子１００は、ポリマー（複数可）１２０と共にパッセンジャーｍＲＮＡ核酸（複数可）１１０を含むコアを取り囲むコーティング１０５を含む。コーティング１０５の外側に包埋している及び／又は会合しているのは、１つ以上の細胞ターゲティングリガンド１４０である。ナノ粒子１００は、標的細胞１６０の表面上で細胞ターゲティングリガンド（複数可）１４０と分子（複数可）１５０の間の相互作用を通じて標的細胞１６０（例えば、Ｔ細胞）を特異的に標的にする。ナノ粒子の内容物が標的細胞１６０の細胞質中に放出されると（例えば、受容体誘導エンドサイトーシスを通じて）、パッセンジャーｍＲＮＡ核酸（細胞１４０内部の１１０’として示されている）は翻訳されて、例えば、標的細胞１６０の表面上でタンパク質１７０を発現する。 ポリマーナノ粒子が担持するインビトロ転写（ＩＶＴ）ｍＲＮＡを使用して、疾患特異的キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）又はＴ細胞受容体（ＴＣＲ）を発現するようにＴ細胞をインサイツで再プログラムするための組成物及び方法の実施形態を図解する全体像。これらのナノ粒子は、ナノ粒子を標的としての細胞傷害性Ｔ細胞に向けるリガンドで被覆されているので、ナノ粒子は、患者の循環中に注入された後は、ナノ粒子が担持している核酸（複数可）をリンパ球中に移行させ、リンパ球をこの表面上で治療タンパク質（例えば、疾患特異的ＣＡＲ、ＴＣＲ又はＣＡＲ／ＴＣＲハイブリッド）を発現するように一過性にプログラムする。 追加の実施形態及び送達様式の図解。標的化されたｍＲＮＡナノ粒子を使用して、腹腔内腫瘍関連マクロファージ（ＴＡＭ）を殺腫瘍性マクロファージに遺伝子学的に再プログラムする模式図。図３Ａは、カテーテルを経た送達（カテーテルを経た注入）を図解している。ここに図解されるなどの、方向付けられ局所的に注入される送達を通じて、患者は、処置に誘導される炎症が処置部位に局所化されたままであるため、全身毒性を免れることができる。局所的に注入される粒子は、腫瘍環境中の細胞を標的にし、（２）マクロファージ極性化を制御するシグナル伝達経路を（図解される通りに）選択的に再プログラムするヌクレオチドを送達し、（３）局所的に生理的経路により分解可能である。図３Ａに描かれている投与経路を使用すれば、ＣＡＲ、ＴＣＲ又はハイブリッドＣＡＲ／ＴＣＲなどの治療タンパク質を発現させる核酸を含むナノ粒子の送達も可能になる。 追加の実施形態及び送達様式の図解。標的化されたｍＲＮＡナノ粒子を使用して、頭蓋内腫瘍関連マクロファージ（ＴＡＭ）を殺腫瘍性マクロファージに遺伝子学的に再プログラムする模式図。図３Ｂは、直接腫瘍注射を経た送達（腫瘍内送達）を図解している。ここに図解されるなどの、方向付けられ局所的に注入される送達を通じて、患者は、処置に誘発される炎症が処置部位に局所化されたままであるため、全身毒性を免れることができる。局所的に注入される粒子は、腫瘍環境中の細胞を標的にし、（２）マクロファージ極性化を制御するシグナル伝達経路を（図解される通りに）選択的に再プログラムするヌクレオチドを送達し、（３）局所的に生理的経路により分解可能である。図３Ｂに描かれている投与経路を使用すれば、ＣＡＲ、ＴＣＲ又はハイブリッドＣＡＲ／ＴＣＲなどの治療タンパク質の発現をもたらす核酸を含むナノ粒子の送達も可能になる。 リンパ球プログラミングナノ粒子の設計及び製造。図４Ａは、代表的なＴ細胞標的化ＩＶＴ ｍＲＮＡナノ粒子の模式図。接触させるだけで初代Ｔリンパ球（非ウイルストランスフェクション法で処理しにくいことで知られている）を遺伝子改変することができる試薬を創造するため、４種の機能的構成成分： （ｉ）ナノ粒子をＴ細胞に選択的に結合させて、迅速な受容体誘導エンドサイトーシスを開始させてナノ粒子を内部移行させる表面固定ターゲティングリガンド。代表的な実験では、抗ＣＤ８結合ドメインを使用した； （ｉｉ）ナノ粒子の表面電荷を減少させることによりオフターゲット結合を最小限に抑えるためにナノ粒子を遮蔽する負電荷コーティング。代表的な実験では、ポリグルタミン酸（ＰＧＡ）を使用してこれを達成した； （ｉｉｉ）核酸を濃縮しこれがエンドソーム中にある間は酵素的分解から保護するが、粒子が細胞質中に輸送された後は核酸を放出して、それによってコードされたタンパク質の転写を可能にするキャリアーマトリックス。この表示では、水溶液条件では１〜７時間の半減期を有する生分解性ポリ（βアミノエステル）（ＰＢＡＥ）ポリマー製剤を使用した；及び （ｉｖ）キャリアー内にカプセル化されており、例えば、疾患特異的ＣＡＲ又はＴＣＲの発現を生じる核酸（例えば、ＩＶＴ ｍＲＮＡ）を含むポリマーナノ粒子が生物工学的に操作された。 リンパ球プログラミングナノ粒子の設計及び製造。図４Ｂは、ナノ粒子の製作方法を描く。凍結乾燥及び水和ステップは任意選択的である。 ＩＶＴ ｍＲＮＡナノ粒子は、ＣＡＲ−又はＴＣＲコード核酸をヒトＴ細胞に効率的にトランスフェクトする。単離されたヒトＣＤ８＋Ｔ細胞は、ＴＣＲ／ＣＤ３及び同時刺激ＣＤ２８受容体に対する抗体で被覆されたビーズを用いて刺激された。２４時間後、ビーズを取り除き、白血病特異的１９２８ｚＣＡＲをコードするｍＲＮＡを含有するＣＤ８標的化ＮＰを、濃度３μｇのｍＲＮＡ／１０６細胞の細胞懸濁液に混ぜ合わせた。Ｔ細胞が１９２８ｚ ＣＡＲナノ粒子に曝露された後の経時的な相対的１９２８ｚ ＣＡＲ ｍＲＮＡ発現のｑＰＣＲ測定。 ＩＶＴ ｍＲＮＡナノ粒子は、ＣＡＲ−又はＴＣＲコード核酸をヒトＴ細胞に効率的にトランスフェクトする。単離されたヒトＣＤ８＋Ｔ細胞は、ＴＣＲ／ＣＤ３及び同時刺激ＣＤ２８受容体に対する抗体で被覆されたビーズを用いて刺激された。２４時間後、ビーズを取り除き、白血病特異的１９２８ｚＣＡＲをコードするｍＲＮＡを含有するＣＤ８標的化ＮＰを、濃度３μｇのｍＲＮＡ／１０６細胞の細胞懸濁液に混ぜ合わせた。１９２８ｚ ＣＡＲコードｍＲＮＡを担持するナノ粒子と一緒のインキュベーション後の指示された時点でのＴ細胞のフローサイトメトリー。 ＩＶＴ ｍＲＮＡナノ粒子は、ＣＡＲ−又はＴＣＲコード核酸をヒトＴ細胞に効率的にトランスフェクトする。単離されたヒトＣＤ８＋Ｔ細胞は、ＴＣＲ／ＣＤ３及び同時刺激ＣＤ２８受容体に対する抗体で被覆されたビーズを用いて刺激された。２４時間後、ビーズを取り除き、白血病特異的１９２８ｚＣＡＲをコードするｍＲＮＡを含有するＣＤ８標的化ＮＰを、濃度３μｇのｍＲＮＡ／１０６細胞の細胞懸濁液に混ぜ合わせた。インビトロカプセル化核酸移行効率の概要プロット。 ＩＶＴ ｍＲＮＡナノ粒子は、ＣＡＲ−又はＴＣＲコード核酸をヒトＴ細胞に効率的にトランスフェクトする。単離されたヒトＣＤ８＋Ｔ細胞は、ＴＣＲ／ＣＤ３及び同時刺激ＣＤ２８受容体に対する抗体で被覆されたビーズを用いて刺激された。２４時間後、ビーズを取り除き、白血病特異的１９２８ｚＣＡＲをコードするｍＲＮＡを含有するＣＤ８標的化ＮＰを、濃度３μｇのｍＲＮＡ／１０６細胞の細胞懸濁液に混ぜ合わせた。Ｒａｊｉリンパ腫細胞に対するナノ粒子でトランスフェクトされたＴ細胞対レトロウイルスでトランスフェクトされたＴ細胞の細胞傷害性を比較するインビトロアッセイ。ＩｎｃｕＣｙｔｅ生細胞分析システムを使用して、１９２８ｚ ＣＡＲでトランスフェクトされたＴ細胞によるＲａｊｉ ＮｕｃＬｉｇｈｔ Ｒｅｄ細胞の免疫細胞殺傷を経時的に定量化した。データは２つの独立した実験を表している。それぞれのポイントは３通り行われた２つの独立した実験からプールされた平均±ｓ．ｅ．ｍ．を表している。 ＩＶＴ ｍＲＮＡナノ粒子は、ＣＡＲ−又はＴＣＲコード核酸をヒトＴ細胞に効率的にトランスフェクトする。単離されたヒトＣＤ８＋Ｔ細胞は、ＴＣＲ／ＣＤ３及び同時刺激ＣＤ２８受容体に対する抗体で被覆されたビーズを用いて刺激された。２４時間後、ビーズを取り除き、白血病特異的１９２８ｚＣＡＲをコードするｍＲＮＡを含有するＣＤ８標的化ＮＰを、濃度３μｇのｍＲＮＡ／１０６細胞の細胞懸濁液に混ぜ合わせた。トランスフェクトされた細胞によるＩＬ−２（２４時間目）並びにＴＮＦ−α及びＩＦＮ−γ（４８時間目）分泌のＥＬＩＳＡ測定。 ＩＶＴ ｍＲＮＡナノ粒子は、ＣＡＲ−又はＴＣＲコード核酸をヒトＴ細胞に効率的にトランスフェクトする。単離されたヒトＣＤ８＋Ｔ細胞は、ＴＣＲ／ＣＤ３及び同時刺激ＣＤ２８受容体に対する抗体で被覆されたビーズを用いて刺激された。２４時間後、ビーズを取り除き、ＨＢｃｏｒｅ１８−２７ＴＣＲをコードするｍＲＮＡを含有するＣＤ８標的化ＮＰを、濃度３μｇのｍＲＮＡ／１０６細胞の細胞懸濁液に混ぜ合わせた。Ｔ細胞をＨＢｃｏｒｅ１８−２７ＴＣＲナノ粒子に曝露した後の相対的ＨＢｃｏｒｅ１８−２７ＴＣＲ ｍＲＮＡ発現の経時的なｑＰＣＲ測定。 ＩＶＴ ｍＲＮＡナノ粒子は、ＣＡＲ−又はＴＣＲコード核酸をヒトＴ細胞に効率的にトランスフェクトする。単離されたヒトＣＤ８＋Ｔ細胞は、ＴＣＲ／ＣＤ３及び同時刺激ＣＤ２８受容体に対する抗体で被覆されたビーズを用いて刺激された。２４時間後、ビーズを取り除き、ＨＢｃｏｒｅ１８−２７ＴＣＲをコードするｍＲＮＡを含有するＣＤ８標的化ＮＰを、濃度３μｇのｍＲＮＡ／１０６細胞の細胞懸濁液に混ぜ合わせた。カプセル化された核酸移行効率。 ＩＶＴ ｍＲＮＡナノ粒子は、ＣＡＲ−又はＴＣＲコード核酸をヒトＴ細胞に効率的にトランスフェクトする。単離されたヒトＣＤ８＋Ｔ細胞は、ＴＣＲ／ＣＤ３及び同時刺激ＣＤ２８受容体に対する抗体で被覆されたビーズを用いて刺激された。２４時間後、ビーズを取り除き、ＨＢｃｏｒｅ１８−２７ＴＣＲをコードするｍＲＮＡを含有するＣＤ８標的化ＮＰを、濃度３μｇのｍＲＮＡ／１０６細胞の細胞懸濁液に混ぜ合わせた。カプセル化された核酸移行効率。 ＩＶＴ ｍＲＮＡナノ粒子は、ＣＡＲ−又はＴＣＲコード核酸をヒトＴ細胞に効率的にトランスフェクトする。単離されたヒトＣＤ８＋Ｔ細胞は、ＴＣＲ／ＣＤ３及び同時刺激ＣＤ２８受容体に対する抗体で被覆されたビーズを用いて刺激された。２４時間後、ビーズを取り除き、ＨＢｃｏｒｅ１８−２７ＴＣＲをコードするｍＲＮＡを含有するＣＤ８標的化ＮＰを、濃度３μｇのｍＲＮＡ／１０６細胞の細胞懸濁液に混ぜ合わせた。ＨＢｃｏｒｅ１８−２７ＴＣＲでトランスフェクトされたＴ細胞による経時的なＨｅｐＧ２−ｃｏｒｅ ＮｕｃＬｉｇｈｔ Ｒｅｄ細胞の細胞殺傷。 ＩＶＴ ｍＲＮＡナノ粒子は、ＣＡＲ−又はＴＣＲコード核酸をヒトＴ細胞に効率的にトランスフェクトする。単離されたヒトＣＤ８＋Ｔ細胞は、ＴＣＲ／ＣＤ３及び同時刺激ＣＤ２８受容体に対する抗体で被覆されたビーズを用いて刺激された。２４時間後、ビーズを取り除き、ＨＢｃｏｒｅ１８−２７ＴＣＲをコードするｍＲＮＡを含有するＣＤ８標的化ＮＰを、濃度３μｇのｍＲＮＡ／１０６細胞の細胞懸濁液に混ぜ合わせた。トランスフェクトされた細胞によるサイトカイン分泌のＥＬＩＳＡ測定。 ナノ粒子プログラムされたＣＡＲリンパ球は、養子Ｔ細胞療法に類似する効率で白血病後退を引き起こす。タイムライン及びナノ粒子投与計画。 ナノ粒子プログラムされたＣＡＲリンパ球は、養子Ｔ細胞療法に類似する効率で白血病後退を引き起こす。ＮＳＧマウスに全身的に注射されたホタルルシフェラーゼ発現Ｒａｊｉリンパ腫細胞の逐次的バイオイメージング。それぞれのコホート（ｎ＝１０）由来の５匹の代表的マウスが示されている。 ナノ粒子プログラムされたＣＡＲリンパ球は、養子Ｔ細胞療法に類似する効率で白血病後退を引き起こす。カプラン・マイヤー曲線として描かれた、治療に続く動物の生存。３つの独立した実験からプールされた処置群あたり１０匹のマウスが示されている。ｍｓ、生存期間中央値。処置された実験群と非処置の対照群の間の統計分析は、ログランク検定を使用して実施され；Ｐ＜０．０５は有意であると見なされた。 ナノ粒子プログラムされたＣＡＲリンパ球は、養子Ｔ細胞療法に類似する効率で白血病後退を引き起こす。１９２８ｚ ＣＡＲをコードするナノ粒子送達ＩＶＴ ｍＲＮＡの注射の前と後の末梢Ｔ細胞のフローサイトメトリー。ここに示される時点ごとの３つのプロファイルは、群あたり１０匹のマウスからなる２つの独立した実験を表している。 ナノ粒子プログラムされたＣＡＲリンパ球は、養子Ｔ細胞療法に類似する効率で白血病後退を引き起こす。１９２８ｚ ＣＡＲナノ粒子の繰り返し注入に続くＣＡＲでトランスフェクトされたＣＤ８＋Ｔ細胞のパーセンテージを表示する概要グラフ。すべてのラインは１匹の動物を表す。２つの独立した実験からプールされた１０匹の動物が示されている。 前立腺腫瘍特異的ＣＡＲをコードするＩＶＴ−ｍＲＮＡナノ粒子は、確立した疾患を持つマウスの生存を改善する。抗原発現の多様性を示す１４０の前立腺がん転移のパネルにまたがるＰＳＣＡ、ＰＳＭＡ及びＲＯＲ１抗原発現のヒートマップ。 前立腺腫瘍特異的ＣＡＲをコードするＩＶＴ−ｍＲＮＡナノ粒子は、確立した疾患を持つマウスの生存を改善する。ＬＮＣａｐ Ｃ４２前立腺癌細胞によるＰＳＣＡ、ＰＳＭＡ及びＲＯＲ１発現の変異性を示すフローサイトメトリーデータのヒートマップ表示。色は、３５０の無作為に選択された細胞での発現レベルを示している。 前立腺腫瘍特異的ＣＡＲをコードするＩＶＴ−ｍＲＮＡナノ粒子は、確立した疾患を持つマウスの生存を改善する。移植３週間後、ＬＮＣａｐ Ｃ４２前立腺腫瘍は、インビボ生物発光イメージングにより可視化される。前立腺の背葉における確立した腫瘍（白色矢）の代表的な写真は右側に示されている。 前立腺腫瘍特異的ＣＡＲをコードするＩＶＴ−ｍＲＮＡナノ粒子は、確立した疾患を持つマウスの生存を改善する。ＮＧＳマウスの前立腺に同所性に移植されたホタルルシフェラーゼ発現ＬＮＣａｐ Ｃ４２前立腺癌細胞の逐次的バイオイメージング。それぞれのコホート（ｎ＝８）由来の４匹の代表的マウスが示されている。 前立腺腫瘍特異的ＣＡＲをコードするＩＶＴ−ｍＲＮＡナノ粒子は、確立した疾患を持つマウスの生存を改善する。タイムライン及びナノ粒子投与計画。 前立腺腫瘍特異的ＣＡＲをコードするＩＶＴ−ｍＲＮＡナノ粒子は、確立した疾患を持つマウスの生存を改善する。カプラン・マイヤー曲線として描かれた、治療に続く動物の生存。３つの独立した実験からプールされた処置群あたり８匹のマウスが示されている。ｍｓ、生存期間中央値。処置された実験群と非処置の対照群の間の統計分析は、ログランク検定を使用して実施され；Ｐ＜０．０５は有意であると見なされた。Ｎ．ｓ、非有意。 前立腺腫瘍特異的ＣＡＲをコードするＩＶＴ−ｍＲＮＡナノ粒子は、確立した疾患を持つマウスの生存を改善する。ＣＡＲ−Ｔ細胞療法又はＲＯＲ１ ４−１ＢＢｚ ＣＡＲ ＮＰ療法に続くＬＮＣａｐ Ｃ４２前立腺腫瘍細胞上でのＲＯＲ１抗原発現のフローサイトメトリー定量化。５つの腫瘍からプールされた３５０の無作為に選択された細胞が示されている。 実施例２に記載されるミエロイド及びリンパ球免疫表現型検査パネルにおいて使用される抗体の一覧表。 ＩＲＦ５及びＩＫＫβをコードするｍＲＮＡを担持するナノ粒子は、炎症性Ｍ１様表現型を刷り込むことができる。（図９Ａ）マクロファージ極性化の重要な制御因子をコードするｍＲＮＡを用いて組み立てられたマクロファージ標的化ポリマーＮＰの設計。粒子は、ＰＧＡ−ジマンノースの層で被覆されたＰｂＡＥ−ｍＲＮＡポリプレックスコアからなり、ＰＧＡ−ジマンノースは粒子をＭ２様マクロファージにより発現される標的マンノース受容体（ＣＤ２０６）に向ける。ＮＰにカプセル化された合成ｍＲＮＡも描かれており、この合成ｍＲＮＡは再プログラミング転写因子をコードするように操作されている。 ＩＲＦ５及びＩＫＫβをコードするｍＲＮＡを担持するナノ粒子は、炎症性Ｍ１様表現型を刷り込むことができる。（図９Ｂ）ＮＰの集団（スケールバー２００ｎｍ）及び単一ＮＰ（挿入図、スケールバー５０ｎｍ）の透過型電子顕微鏡。 ＩＲＦ５及びＩＫＫβをコードするｍＲＮＡを担持するナノ粒子は、炎症性Ｍ１様表現型を刷り込むことができる。（図９Ｃ）ＮＰのサイズ分布、ＮａｎｏＳｉｇｈｔ ＮＳ３００装置を使用して測定。 ＩＲＦ５及びＩＫＫβをコードするｍＲＮＡを担持するナノ粒子は、炎症性Ｍ１様表現型を刷り込むことができる。（図９Ｄ）ＮＰは、１時間曝露後骨髄由来マクロファージ（ＢＭＤＭ）の高トランスフェクション（４６％）を示した。 ＩＲＦ５及びＩＫＫβをコードするｍＲＮＡを担持するナノ粒子は、炎症性Ｍ１様表現型を刷り込むことができる。（図９Ｅ）ノ粒子トランスフェクションの２４時間後フローサイトメトリーにより測定された骨髄由来マクロファージ（ＢＭＤＭ）中への遺伝子移入効率。 ＩＲＦ５及びＩＫＫβをコードするｍＲＮＡを担持するナノ粒子は、炎症性Ｍ１様表現型を刷り込むことができる。（図９Ｆ）ＮＰトランスフェクトされた及び非トラスフェクトマクロファージの相対的生存率（Ａｎｎｅｘｉｎ Ｖ及びＰＩを用いて染色することにより評価した）。Ｎ．ｓ．；有意でない。 ＩＲＦ５及びＩＫＫβをコードするｍＲＮＡを担持するナノ粒子は、炎症性Ｍ１様表現型を刷り込むことができる。（図９Ｇ）ｑＲＴ−ＰＣＲにより測定したコドン最適化ＩＲＦ５ ｍＲＮＡ（青色、左Ｙ軸）及び内在性ＩＲＦ５ ｍＲＮＡ（黒色、右Ｙ軸）の発現動態。時点ごとにｎ＝３。 ＩＲＦ５及びＩＫＫβをコードするｍＲＮＡを担持するナノ粒子は、炎症性Ｍ１様表現型を刷り込むことができる。（図９Ｈ）ＮＰトランスフェクションプロトコール及び図９Ｉ〜９Ｋで使用されるＢＭＤＭの培養条件を描くタイムライン。 ＩＲＦ５及びＩＫＫβをコードするｍＲＮＡを担持するナノ粒子は、炎症性Ｍ１様表現型を刷り込むことができる。（図９Ｉ）Ｔｏｌｌ様受容体６アゴニストＭＰＬＡで刺激されたシグネチャーＭ１細胞と比べたＩＲＦ５／ＩＫＫβ ＮＰ−トランスフェクトされたマクロファージの遺伝子発現プロファイル。結果は、遺伝子発現における倍率変化の分布を示す火山プロットとして描かれている。Ｍ１シグネチャー遺伝子が示されている。ＩＲＦ５／ＩＫＫβ ＮＰ−トランスフェクトされたマクロファージとＭ１シグネチャー遺伝子セットの間の重複のＰ値はＧＳＥＡにより決定した。 ＩＲＦ５及びＩＫＫβをコードするｍＲＮＡを担持するナノ粒子は、炎症性Ｍ１様表現型を刷り込むことができる。（図９Ｊ）ＩＬ−４において培養されたマクロファージ対ＩＬ−４において培養されＩＲＦ５／ＩＫＫβ ＮＰをトランスフェクトされた細胞でのＭ１シグネチャー遺伝子発現のヒートマップ。 ＩＲＦ５及びＩＫＫβをコードするｍＲＮＡを担持するナノ粒子は、炎症性Ｍ１様表現型を刷り込むことができる。（図９Ｋ）指示された遺伝子についての平均カウント及びＳ．Ｅ．Ｍを示す箱ひげ図。 ＩＲＦ５及びＩＫＫβ遺伝子をマクロファージ中に送達するｍＲＮＡナノ担体を繰り返し腹腔内に注入すると、播種性卵巣がんを抱えたマウスの平均生存期間が２倍を超える。（図１０Ａ）タイムライン及び投与計画。矢印は、Ｉ．Ｐ．注射の時間を示している。 ＩＲＦ５及びＩＫＫβ遺伝子をマクロファージ中に送達するｍＲＮＡナノ担体を繰り返し腹腔内に注入すると、播種性卵巣がんを抱えたマウスの平均生存期間が２倍を超える。（図１０Ｂ）対照及び処置マウスにおける腫瘍成長の連続生物発光イメージング。 ＩＲＦ５及びＩＫＫβ遺伝子をマクロファージ中に送達するｍＲＮＡナノ担体を繰り返し腹腔内に注入すると、播種性卵巣がんを抱えたマウスの平均生存期間が２倍を超える。（図１０Ｃ）処置対対照マウスについてのカプラン・マイヤー生存曲線。統計解析は対数順位検定を使用して実施した。 ＩＲＦ５及びＩＫＫβ遺伝子をマクロファージ中に送達するｍＲＮＡナノ担体を繰り返し腹腔内に注入すると、播種性卵巣がんを抱えたマウスの平均生存期間が２倍を超える。（図１０Ｄ）対照としてＧＦＰ ｍＲＮＡを担持するＤ−マンノース被覆ＮＰの単回ｉ．ｐ．投与の４８時間後、異なる免疫細胞亜集団におけるインビボトランスフェクション率のフローサイトメトリー定量化：マクロファージ（ＣＤ４５＋、ＣＤ１１ｂ＋、ＭＨＣＩＩ＋、ＣＤ１１ｃ、Ｌｙ６Ｃ−／ｌｏｗ、Ｌｙ６Ｇ−）、単球（ＣＤ４５＋、ＣＤ１１ｂ＋、ＭＨＣＩＩ＋、ＣＤ１１ｃ−、Ｌｙ６Ｃ＋、Ｌｙ６Ｇ−）、好中球（ＣＤ４５＋、ＣＤ１１ｂ＋、ＭＨＣＩＩ＋、ＣＤ１１ｃ−、Ｌｙ６Ｇ＋）、ＣＤ４＋Ｔ細胞（ＣＤ４５＋、ＴＣＲ−β鎖＋、ＣＤ４＋、ＣＤ８）、ＣＤ８＋Ｔ細胞（ＣＤ４５＋、ＴＣＲ−β鎖＋、ＣＤ４−、ＣＤ８＋）、及びナチュラルキラー（ＮＫ）細胞（ＣＤ４５＋、ＴＣＲ−β鎖、ＣＤ４９ｂ＋）を測定した。 ＩＲＦ５及びＩＫＫβ遺伝子をマクロファージ中に送達するｍＲＮＡナノ担体を繰り返し腹腔内に注入すると、播種性卵巣がんを抱えたマウスの平均生存期間が２倍を超える。（図１０Ｅ）播種性ＩＤ８卵巣がんを抱えたマウスの腹膜におけるマクロファージ表現型のフローサイトメトリー分析。動物は、ＩＲＦ５／ＩＫＫβ ＮＰの４回投与又はＰＢＳで処置した。 ＩＲＦ５及びＩＫＫβ遺伝子をマクロファージ中に送達するｍＲＮＡナノ担体を繰り返し腹腔内に注入すると、播種性卵巣がんを抱えたマウスの平均生存期間が２倍を超える。（図１０Ｆ）Ｌｙ６Ｃ−、Ｆ４／８０＋、及びＣＤ２０６＋（Ｍ２様）マクロファージの相対的パーセント（左パネル）及び絶対数（右パネル）をまとめる箱ひげ図。 ＩＲＦ５及びＩＫＫβ遺伝子をマクロファージ中に送達するｍＲＮＡナノ担体を繰り返し腹腔内に注入すると、播種性卵巣がんを抱えたマウスの平均生存期間が２倍を超える。（図１０Ｇ）Ｌｙ６Ｃ−、Ｆ４／８０＋、及びＣＤ２０６−（Ｍ１様）マクロファージについての対応する数。 ＩＲＦ５及びＩＫＫβ遺伝子をマクロファージ中に送達するｍＲＮＡナノ担体を繰り返し腹腔内に注入すると、播種性卵巣がんを抱えたマウスの平均生存期間が２倍を超える。（図１０Ｈ）ＰＢＳ対照（上パネル）又はＩＲＦ５／ＩＫＫβ ＮＰ処置動物（下パネル；スケールバー１００μｍ）から単離した卵巣腫瘍浸潤腸間膜の代表的ヘマトキシリン及びエオシン染色切片。代表的悪性病変の１０倍拡大図が右側に示されている（スケールバー５０μｍ）。 ＩＲＦ５及びＩＫＫβ遺伝子をマクロファージ中に送達するｍＲＮＡナノ担体を繰り返し腹腔内に注入すると、播種性卵巣がんを抱えたマウスの平均生存期間が２倍を超える。（図１０Ｉ）それぞれの処置群から単離した腹膜マクロファージにより産生されたサイトカインを測定するＬｕｍｉｎｅｘアッセイ。ＣＤ１１ｂ＋、Ｆ４／８０＋腹膜マクロファージは蛍光活性化細胞選別により単離し、エクスビボで培養した。２４時間後、細胞培養上澄みを収集した。パラレル実験において、ＦＡＣＳ選別ＣＤ１１ｂ＋、Ｆ４／８０＋腹膜マクロファージはｐＲＴ−ＰＣＲにより直接分析して、マクロファージ表現型の４つの主要制御因子（セルピンＢ２、Ｒｅｔｎｌａ、Ｃｃｌ１１、及びＣｃｌ５）の発現レベルを決定した。 ＩＲＦ５及びＩＫＫβ遺伝子をマクロファージ中に送達するｍＲＮＡナノ担体を繰り返し腹腔内に注入すると、播種性卵巣がんを抱えたマウスの平均生存期間が２倍を超える。（図１０Ｉ）それぞれの処置群から単離した腹膜マクロファージにより産生されたサイトカインを測定するＬｕｍｉｎｅｘアッセイ。ＣＤ１１ｂ＋、Ｆ４／８０＋腹膜マクロファージは蛍光活性化細胞選別により単離し、エクスビボで培養した。２４時間後、細胞培養上澄みを収集した。パラレル実験において、ＦＡＣＳ選別ＣＤ１１ｂ＋、Ｆ４／８０＋腹膜マクロファージはｐＲＴ−ＰＣＲにより直接分析して、マクロファージ表現型の４つの主要制御因子（セルピンＢ２、Ｒｅｔｎｌａ、Ｃｃｌ１１、及びＣｃｌ５）の発現レベルを決定した。その結果を、図１０Ｊに箱ひげ図としてまとめている。 マクロファージプログラミングｍＲＮＡナノ担体は高度に生体適合性であり繰り返し投与が安全である。（図１１Ａ）ｉ．ｐ．投与に続くマクロファージ標的化ＩＲＦ５／ＩＫＫβ ＮＰのインビボ生体内分布。ＮＰ−送達された（コドン最適化）ｍＲＮＡは、５０μｇのｍＲＮＡを含有する粒子の単回注射の２４時間後ｑＰＣＲにより検出した。 マクロファージプログラミングｍＲＮＡナノ担体は高度に生体適合性であり繰り返し投与が安全である。（図１１Ｂ）実験タイムラインの模式図。最後の投与の＊２４時間後、マウスはＣＯ２吸入により安楽死させた。血液は、血清化学及び全血球計算のために後眼窩出血を通じてヘパリン被覆チューブ中に収集した。死体解剖は、肝臓、脾臓、膵臓、腸間膜及び網、胃、並びに膀胱の組織学的分析のために実施した。 マクロファージプログラミングｍＲＮＡナノ担体は高度に生体適合性であり繰り返し投与が安全である。（図１１Ｃ）対照又はＮＰ処置動物から単離された種々の臓器の代表的なヘマトキシリン及びエオシン染色切片。スケールバー、１００μｍ。ＮＰ処置動物において見出された病変は比較病理医による分析に基づいて示されここに記載されている。番号が付いた画像ごとに関連する所見は、［１］少数の顆粒球と混ざり合った単核細胞で大部分構成された細胞浸潤物の別々の病巣；軽い骨髄外造血発生。［２］少数の局所的広い領域において、肝細胞は軽度から中等度に腫大している。［３］赤色髄内の中等度の骨髄性（優勢な）、赤血球及び巨大核細胞過形成。［４］白色髄の軽い低細胞性。［５］腸間膜内において、マクロファージ、リンパ球、血漿細胞及び顆粒球の中等度の多巣性浸潤物が存在する。［６］リンパ球、血漿細胞及び顆粒球と混ざり合ったマクロファージの軽度から中等度浸潤物；腺房の軽度の解離及び腺房消失；腺房細胞からのチモーゲン顆粒の軽度のびまん性消失。［７］脂肪組織周辺のマクロファージと混ざり合ったリンパ球の濃い凝集体。［８］胃粘膜内の主及び壁細胞の軽度の多巣性空胞変性。 マクロファージプログラミングｍＲＮＡナノ担体は高度に生体適合性であり繰り返し投与が安全である。（図１１Ｄ）血清化学及び血球数。 マクロファージプログラミングｍＲＮＡナノ担体は高度に生体適合性であり繰り返し投与が安全である。（図１１Ｅ）ＩＲＦ５／ＩＫＫβ ＮＰの単回ｉ．ｐ．注射の４又は８日後の血清ＩＬ−６サイトカインのＬｕｍｉｎｅｘアッセイ測定。 マクロファージプログラミングｍＲＮＡナノ担体は高度に生体適合性であり繰り返し投与が安全である。（図１１Ｆ）ＩＲＦ５／ＩＫＫβ ＮＰの単回ｉ．ｐ．注射の４又は８日後の血清ＴＮＦ−αサイトカインのＬｕｍｉｎｅｘアッセイ測定。 静脈内注入されたＩＲＦ５／ＩＫＫβナノ粒子は、肺において腫瘍転移を制御することができる。（図１２Ａ）ｉ．ｖ．投与に続くマクロファージ標的化ＩＲＦ５／ＩＫＫβ ＮＰのインビボ生体内分布。コドン最適化ｍＲＮＡは、５０μｇのｍＲＮＡを含有する粒子の単回ｉ．ｖ．注射の２４時間後にｑＰＣＲにより測定した。 静脈内注入されたＩＲＦ５／ＩＫＫβナノ粒子は、肺において腫瘍転移を制御することができる。Ｃ５７ＢＬ／６アルビノマウスに尾部静脈を経て１×１０６のＢ１６Ｆ１０ホタルルシフェラーゼ発現メラノーマ細胞を注射して、肺転移を確立した。７日後、動物は、ＩＲＦ５／ＩＫＫβ ＮＰ処置群、対照ＧＦＰ ＮＰ群、又はＰＢＳ対照に無作為に割り当てた。（図１２Ｂ）タイムライン及び投与計画。 静脈内注入されたＩＲＦ５／ＩＫＫβナノ粒子は、肺において腫瘍転移を制御することができる。Ｃ５７ＢＬ／６アルビノマウスに尾部静脈を経て１×１０６のＢ１６Ｆ１０ホタルルシフェラーゼ発現メラノーマ細胞を注射して、肺転移を確立した。７日後、動物は、ＩＲＦ５／ＩＫＫβ ＮＰ処置群、対照ＧＦＰ ＮＰ群、又はＰＢＳ対照に無作為に割り当てた。（図１２Ｃ）健康な肺（左パネル）及びＢ１６Ｆ１０腫瘍浸潤肺（右パネル）の共焦点顕微鏡。浸潤性マクロファージ集団は緑色の蛍光を発する。 静脈内注入されたＩＲＦ５／ＩＫＫβナノ粒子は、肺において腫瘍転移を制御することができる。Ｃ５７ＢＬ／６アルビノマウスに尾部静脈を経て１×１０６のＢ１６Ｆ１０ホタルルシフェラーゼ発現メラノーマ細胞を注射して、肺転移を確立した。７日後、動物は、ＩＲＦ５／ＩＫＫβ ＮＰ処置群、対照ＧＦＰ ＮＰ群、又はＰＢＳ対照に無作為に割り当てた。（図１２Ｄ）連続生物発光腫瘍イメージング。 静脈内注入されたＩＲＦ５／ＩＫＫβナノ粒子は、肺において腫瘍転移を制御することができる。Ｃ５７ＢＬ／６アルビノマウスに尾部静脈を経て１×１０６のＢ１６Ｆ１０ホタルルシフェラーゼ発現メラノーマ細胞を注射して、肺転移を確立した。７日後、動物は、ＩＲＦ５／ＩＫＫβ ＮＰ処置群、対照ＧＦＰ ＮＰ群、又はＰＢＳ対照に無作為に割り当てた。（図１２Ｅ）処置群ごとのカプラン・マイヤー生存曲線。ｍｓは生存期間中央値を示す。統計解析は対数順位検定を使用して実施し、Ｐ＜０．０５は有意と見なした。 静脈内注入されたＩＲＦ５／ＩＫＫβナノ粒子は、肺において腫瘍転移を制御することができる。Ｃ５７ＢＬ／６アルビノマウスに尾部静脈を経て１×１０６のＢ１６Ｆ１０ホタルルシフェラーゼ発現メラノーマ細胞を注射して、肺転移を確立した。７日後、動物は、ＩＲＦ５／ＩＫＫβ ＮＰ処置群、対照ＧＦＰ ＮＰ群、又はＰＢＳ対照に無作為に割り当てた。（図１２Ｆ）２週間の処置に続くそれぞれの群を表すＢ１６Ｆ１０メラノーマ転移を含有する肺の代表的写真（上の列）及び顕微鏡写真。 静脈内注入されたＩＲＦ５／ＩＫＫβナノ粒子は、肺において腫瘍転移を制御することができる。Ｃ５７ＢＬ／６アルビノマウスに尾部静脈を経て１×１０６のＢ１６Ｆ１０ホタルルシフェラーゼ発現メラノーマ細胞を注射して、肺転移を確立した。７日後、動物は、ＩＲＦ５／ＩＫＫβ ＮＰ処置群、対照ＧＦＰ ＮＰ群、又はＰＢＳ対照に無作為に割り当てた。（図１２Ｇ）肺腫瘍病巣の数。 静脈内注入されたＩＲＦ５／ＩＫＫβナノ粒子は、肺において腫瘍転移を制御することができる。Ｃ５７ＢＬ／６アルビノマウスに尾部静脈を経て１×１０６のＢ１６Ｆ１０ホタルルシフェラーゼ発現メラノーマ細胞を注射して、肺転移を確立した。７日後、動物は、ＩＲＦ５／ＩＫＫβ ＮＰ処置群、対照ＧＦＰ ＮＰ群、又はＰＢＳ対照に無作為に割り当てた。（図１２Ｈ）それぞれの処置群由来の気管支肺胞洗浄中の単球／マクロファージ集団の表現型特徴付け。 静脈内注入されたＩＲＦ５／ＩＫＫβナノ粒子は、肺において腫瘍転移を制御することができる。（図１２Ｉ）抑制性及び活性化されたマクロファージの相対的パーセンテージのまとめ。 マクロファージ再プログラミングは神経膠腫において放射線療法の結果を改善する。（図１３Ａ）誘導後２１日目のＲＣＡＳ−ＰＤＧＦ−Ｂ／Ｎｅｓｔｉｎ−Ｔｖ−ａ；Ｉｎｋ４ａ／Ａｒｆ−／−；Ｐｔｅｎ−／−トランスジェニックマウスにおけるＰＤＧＦβ駆動神経膠腫の開始に続くＴ２ ＭＲＩスキャン、及び組織学的染色。 マクロファージ再プログラミングは神経膠腫において放射線療法の結果を改善する。（図１３Ｂ）神経膠腫縁を浸潤するＣＤ６８＋ＴＡＭの共焦点顕微鏡。スケールバー、３００μｍ。 マクロファージ再プログラミングは神経膠腫において放射線療法の結果を改善する。（図１３Ｃ）健康な脳組織対神経膠腫におけるマクロファージ（Ｆ４／８０＋、ＣＤ１１ｂ＋）集団のフローサイトメトリー分析。 マクロファージ再プログラミングは神経膠腫において放射線療法の結果を改善する。（図１３Ｄ）単独療法としてＩＲＦ５／ＩＫＫβ処置を受けた、確立した神経膠腫を抱えたマウスのカプラン・マイヤー生存曲線。タイムライン及び投与計画は上に示されている。ｍｓ、生存期間中央値。統計解析は対数順位検定を使用して実施し、Ｐ＜０．０５は統計的に有意と見なした。 マクロファージ再プログラミングは神経膠腫において放射線療法の結果を改善する。（図１３Ｅ）脳腫瘍放射線療法と組み合わせたＩＲＦ５／ＩＫＫβ処置を受けた、確立した神経膠腫を抱えたマウスのカプラン・マイヤー生存曲線。タイムライン及び投与計画は上に示されている。ｍｓ、生存期間中央値。統計解析は対数順位検定を使用して実施し、Ｐ＜０．０５は統計的に有意と見なした。 マクロファージ再プログラミングは神経膠腫において放射線療法の結果を改善する。（図１３Ｆ）腫瘍進行の連続生物発光イメージング。 ヒトＩＲＦ５／ＩＫＫβをコードするＩＶＴ ｍＲＮＡ担持ナノ粒子はヒトマクロファージを効率的に再プログラムする。（図１４Ａ）ヒトＴＨＰ−１単核球細胞株を抑制性Ｍ２様マクロファージに分化させるタイムライン及び培養条件。 ヒトＩＲＦ５／ＩＫＫβをコードするＩＶＴ ｍＲＮＡ担持ナノ粒子はヒトマクロファージを効率的に再プログラムする。（図１４Ｂ）２４ウェルにおいて培養され、ヒトＩＲＦ５／ＩＫＫβ ｍＲＮＡ対対照ＧＦＰ ｍＲＮＡを担持するＮＰの指示された濃度をトランスフェクトされたＭ２−分化ＴＨＰ１−Ｌｕｃｉａ細胞の生物発光イメージング。ＩＲＦ誘導Ｌｕｃｉａルシフェラーゼのレベルは、Ｑｕａｎｔｉ−Ｌｕｃを使用してトランスフェクション２４時間後に決定した。 ヒトＩＲＦ５／ＩＫＫβをコードするＩＶＴ ｍＲＮＡ担持ナノ粒子はヒトマクロファージを効率的に再プログラムする。（図１４Ｃ）生物発光数のまとめ。 ヒトＩＲＦ５／ＩＫＫβをコードするＩＶＴ ｍＲＮＡ担持ナノ粒子はヒトマクロファージを効率的に再プログラムする。（図１４Ｄ）ＩＬ−１βサイトカイン分泌におけるＭ１−マクロファージマーカーＣＤ８０の差。 ヒトＩＲＦ５／ＩＫＫβをコードするＩＶＴ ｍＲＮＡ担持ナノ粒子はヒトマクロファージを効率的に再プログラムする。（図１４Ｅ）表面発現におけるＭ１−マクロファージマーカーＣＤ８０の差。 例示的支持配列：配列番号１：抗ヒト１９２８ｚ ＣＡＲ；配列番号２：抗ヒトＲＯＲ１ ＣＡＲ；配列番号３：ＨＢＶ特異的ＴＣＲ；配列番号４：抗ヒト１９２８ｚ ＣＡＲ；配列番号５：抗ヒトＲＯＲ１（４−１ＢＢｚ）ＣＡＲ；配列番号６：抗ＨＢＶ特異的ＴＣＲ（ＨＢｃｏｒｅ１８−２７）；配列番号７：抗ＣＤ１９ ｓｃＦｖ（ＶＨ−ＶＬ）ＦＭＣ６３；配列番号８：抗ＣＤ１９ ｓｃＦｖ（ＶＨ−ＶＬ）ＦＭＣ６３；配列番号９：ＣＤ２８エフェクタードメイン；配列番号１０：Ｐ２８ｚ ＣＡＲ；配列番号１１：ＩｇＧ４−Ｆｃ；配列番号１２：ヒンジ−ＣＨ２−ＣＨ３；配列番号１３：ヒンジ−ＣＨ３；配列番号１４：ヒンジのみ；配列番号１５：ＣＤ２８膜貫通ドメイン；配列番号１６：ＣＤ２８細胞質ドメイン（ＬＬ〜ＧＧ）；配列番号１７：４−１ＢＢ細胞質ドメイン；配列番号１８：ＣＤ３−ζ細胞質ドメイン；配列番号１９：Ｔ２Ａ；配列番号２０：ｔＥＧＦＲ；配列番号２１：ＳｔｒｅｐタグＩＩ；配列番号２２：Ｍｙｃタグ；配列番号２３：Ｖ５タグ；配列番号２４：ＦＬＡＧタグ；配列番号２５：ヒトＩＲＦ５アイソフォーム１（ＵｎｉＰｒｏｔ目録Ｑ１３５６８−１）；配列番号２６：ヒトＩＲＦ５アイソフォーム２（ＵｎｉＰｒｏｔ目録Ｑ１３５６８−２）；配列番号２７：ヒトＩＲＦ５アイソフォーム３（ＵｎｉＰｒｏｔ目録Ｑ１３５６８−３）；配列番号２８：ヒトＩＲＦ５アイソフォーム４（ＵｎｉＰｒｏｔ目録Ｑ１３５６８−４）；配列番号２９：ヒトＩＲＦ５アイソフォーム５（ＵｎｉＰｒｏｔ目録Ｑ１３５６８−５）；配列番号３０：ヒトＩＲＦ５アイソフォーム６（ＵｎｉＰｒｏｔ目録Ｑ１３５６８−６）；配列番号３１：マウスＩＲＦ５タンパク質（ｐＩ＝５．１９、Ｍｗ＝５６００５、ＵｎｉＰｒｏｔ目録Ｐ５６４７７）；配列番号３２：ヒトＩＲＦ１（ＵｎｉＰｒｏｔ目録Ｐ１０９１４）；配列番号３３：ヒトＩＲＦ３アイソフォーム１（ＵｎｉＰｒｏｔ目録Ｑ１４６５３−１）；配列番号３４：ヒトＩＲＦ７アイソフォームＡ（ＵｎｉＰｒｏｔ目録Ｑ９２９８５−１）；配列番号３５：ヒトＩＲＦ８（ＵｎｉＰｒｏｔ目録Ｑ０２５５６）；配列番号３６：マウスＩＲＦ１（ＵｎｉＰｒｏｔ目録Ｐ１５３１４）；配列番号３７：マウスＩＲＦ３（ＵｎｉＰｒｏｔ目録Ｐ７０６７１）；配列番号３８：マウスＩＲＦ７ （ＵｎｉＰｒｏｔ目録Ｐ７０４３４）；配列番号３９：マウスＩＲＦ７／ＩＲＦ３ ５（Ｄ）タンパク質（ｐＩ＝４．７２、ＭＷ＝５８４５６）；配列番号４０：マウスＩＲＦ８（ＵｎｉＰｒｏｔ目録Ｐ２３６１１）；配列番号４１：マウスＩＲＦ８（Ｋ３１０Ｒ）タンパク質（ｐＩ＝６．３８、ＭＷ＝４８２６５）；配列番号４２：ヒトＩＫＫβアイソフォーム１（ＵｎｉＰｒｏｔ目録Ｏ１４９２０−１）；配列番号４３：ヒトＩＫＫβアイソフォーム２（ＵｎｉＰｒｏｔ目録Ｏ１４９２０−２）；配列番号４４：ヒトＩＫＫβアイソフォーム３（ＵｎｉＰｒｏｔ目録Ｏ１４９２０−３）；配列番号４５：ヒトＩＫＫβアイソフォーム４（ＵｎｉＰｒｏｔ目録Ｏ１４９２０−４）；配列番号４６：マウスＩＫＫβタンパク質（ｐＩ＝６．２０、ＭＷ＝８４３８７．６１、ジェンバンク受託番号ＮＰ＿０３４６７６．１）；配列番号４７：ヒトＩＲＦ５アイソフォーム１ ｃｄｓ；配列番号４８：ヒトＩＲＦ５アイソフォーム２ ｃｄｓ；配列番号４９：ヒトＩＲＦ５アイソフォーム３ ｃｄｓ（ジェンバンク受託番号Ｕ５１１２７）；配列番号５０：ヒトＩＲＦ５アイソフォーム４ ｃｄｓ（ジェンバンク受託番号ＡＹ５０４９４６又はＡＹ５０４９４７）；配列番号５１：ヒトＩＲＦ５アイソフォーム５ ｃｄｓ；配列番号５２：ヒトＩＲＦ５アイソフォーム６ ｃｄｓ；配列番号５３：マウスＩＦ５ ｃｄｓ（１４９４ｎｔ）；配列番号５４：ヒトＩＲＦ１ ｃｄｓ；配列番号５５：ヒトＩＲＦ３アイソフォーム１ ｃｄｓ（ＮＭ＿００１５７１．５）；配列番号５６：ヒトＩＲＦ７アイソフォームＡ ｃｄｓ（ＮＭ＿００１５７２．３）；配列番号５７：ヒトＩＲＦ８ ｃｄｓ；配列番号５８：マウスＩＲＦ１ ｃｄｓ（ＮＭ＿００１１５９３９６．１）；配列番号５９：マウスＩＲＦ３ ｃｄｓ（ＮＭ＿０１６８４９．４）；配列番号６０：マウスＩＲＦ７ ｃｄｓ（ＮＭ＿０１６８５０．３）；配列番号６１：マウスＩＲＦ−７／ＩＲＦ−３ ５（Ｄ） ｃｄｓ（１５７８ｎｔ）；配列番号６２：マウスＩＲＦ８ ｃｄｓ；配列番号６３：マウスＩＲＦ８ Ｋ３１０Ｒ ｃｄｓ（１２７５ｎｔ）；配列番号６４：ヒトＩＫＫβアイソフォーム１ ｃｄｓ；配列番号６５：ヒトＩＫＫβアイソフォーム２ ｃｄｓ；配列番号６６：ヒトＩＫＫβアイソフォーム３ ｃｄｓ；配列番号６７：ヒトＩＫＫβアイソフォーム４ ｃｄｓ；配列番号６８：マウスＩＫＫβ ｃｄｓ（２２１７ｎｔ）。 例示的支持配列：配列番号１：抗ヒト１９２８ｚ ＣＡＲ；配列番号２：抗ヒトＲＯＲ１ ＣＡＲ；配列番号３：ＨＢＶ特異的ＴＣＲ；配列番号４：抗ヒト１９２８ｚ ＣＡＲ；配列番号５：抗ヒトＲＯＲ１（４−１ＢＢｚ）ＣＡＲ；配列番号６：抗ＨＢＶ特異的ＴＣＲ（ＨＢｃｏｒｅ１８−２７）；配列番号７：抗ＣＤ１９ ｓｃＦｖ（ＶＨ−ＶＬ）ＦＭＣ６３；配列番号８：抗ＣＤ１９ ｓｃＦｖ（ＶＨ−ＶＬ）ＦＭＣ６３；配列番号９：ＣＤ２８エフェクタードメイン；配列番号１０：Ｐ２８ｚ ＣＡＲ；配列番号１１：ＩｇＧ４−Ｆｃ；配列番号１２：ヒンジ−ＣＨ２−ＣＨ３；配列番号１３：ヒンジ−ＣＨ３；配列番号１４：ヒンジのみ；配列番号１５：ＣＤ２８膜貫通ドメイン；配列番号１６：ＣＤ２８細胞質ドメイン（ＬＬ〜ＧＧ）；配列番号１７：４−１ＢＢ細胞質ドメイン；配列番号１８：ＣＤ３−ζ細胞質ドメイン；配列番号１９：Ｔ２Ａ；配列番号２０：ｔＥＧＦＲ；配列番号２１：ＳｔｒｅｐタグＩＩ；配列番号２２：Ｍｙｃタグ；配列番号２３：Ｖ５タグ；配列番号２４：ＦＬＡＧタグ；配列番号２５：ヒトＩＲＦ５アイソフォーム１（ＵｎｉＰｒｏｔ目録Ｑ１３５６８−１）；配列番号２６：ヒトＩＲＦ５アイソフォーム２（ＵｎｉＰｒｏｔ目録Ｑ１３５６８−２）；配列番号２７：ヒトＩＲＦ５アイソフォーム３（ＵｎｉＰｒｏｔ目録Ｑ１３５６８−３）；配列番号２８：ヒトＩＲＦ５アイソフォーム４（ＵｎｉＰｒｏｔ目録Ｑ１３５６８−４）；配列番号２９：ヒトＩＲＦ５アイソフォーム５（ＵｎｉＰｒｏｔ目録Ｑ１３５６８−５）；配列番号３０：ヒトＩＲＦ５アイソフォーム６（ＵｎｉＰｒｏｔ目録Ｑ１３５６８−６）；配列番号３１：マウスＩＲＦ５タンパク質（ｐＩ＝５．１９、Ｍｗ＝５６００５、ＵｎｉＰｒｏｔ目録Ｐ５６４７７）；配列番号３２：ヒトＩＲＦ１（ＵｎｉＰｒｏｔ目録Ｐ１０９１４）；配列番号３３：ヒトＩＲＦ３アイソフォーム１（ＵｎｉＰｒｏｔ目録Ｑ１４６５３−１）；配列番号３４：ヒトＩＲＦ７アイソフォームＡ（ＵｎｉＰｒｏｔ目録Ｑ９２９８５−１）；配列番号３５：ヒトＩＲＦ８（ＵｎｉＰｒｏｔ目録Ｑ０２５５６）；配列番号３６：マウスＩＲＦ１（ＵｎｉＰｒｏｔ目録Ｐ１５３１４）；配列番号３７：マウスＩＲＦ３（ＵｎｉＰｒｏｔ目録Ｐ７０６７１）；配列番号３８：マウスＩＲＦ７ （ＵｎｉＰｒｏｔ目録Ｐ７０４３４）；配列番号３９：マウスＩＲＦ７／ＩＲＦ３ ５（Ｄ）タンパク質（ｐＩ＝４．７２、ＭＷ＝５８４５６）；配列番号４０：マウスＩＲＦ８（ＵｎｉＰｒｏｔ目録Ｐ２３６１１）；配列番号４１：マウスＩＲＦ８（Ｋ３１０Ｒ）タンパク質（ｐＩ＝６．３８、ＭＷ＝４８２６５）；配列番号４２：ヒトＩＫＫβアイソフォーム１（ＵｎｉＰｒｏｔ目録Ｏ１４９２０−１）；配列番号４３：ヒトＩＫＫβアイソフォーム２（ＵｎｉＰｒｏｔ目録Ｏ１４９２０−２）；配列番号４４：ヒトＩＫＫβアイソフォーム３（ＵｎｉＰｒｏｔ目録Ｏ１４９２０−３）；配列番号４５：ヒトＩＫＫβアイソフォーム４（ＵｎｉＰｒｏｔ目録Ｏ１４９２０−４）；配列番号４６：マウスＩＫＫβタンパク質（ｐＩ＝６．２０、ＭＷ＝８４３８７．６１、ジェンバンク受託番号ＮＰ＿０３４６７６．１）；配列番号４７：ヒトＩＲＦ５アイソフォーム１ ｃｄｓ；配列番号４８：ヒトＩＲＦ５アイソフォーム２ ｃｄｓ；配列番号４９：ヒトＩＲＦ５アイソフォーム３ ｃｄｓ（ジェンバンク受託番号Ｕ５１１２７）；配列番号５０：ヒトＩＲＦ５アイソフォーム４ ｃｄｓ（ジェンバンク受託番号ＡＹ５０４９４６又はＡＹ５０４９４７）；配列番号５１：ヒトＩＲＦ５アイソフォーム５ ｃｄｓ；配列番号５２：ヒトＩＲＦ５アイソフォーム６ ｃｄｓ；配列番号５３：マウスＩＦ５ ｃｄｓ（１４９４ｎｔ）；配列番号５４：ヒトＩＲＦ１ ｃｄｓ；配列番号５５：ヒトＩＲＦ３アイソフォーム１ ｃｄｓ（ＮＭ＿００１５７１．５）；配列番号５６：ヒトＩＲＦ７アイソフォームＡ ｃｄｓ（ＮＭ＿００１５７２．３）；配列番号５７：ヒトＩＲＦ８ ｃｄｓ；配列番号５８：マウスＩＲＦ１ ｃｄｓ（ＮＭ＿００１１５９３９６．１）；配列番号５９：マウスＩＲＦ３ ｃｄｓ（ＮＭ＿０１６８４９．４）；配列番号６０：マウスＩＲＦ７ ｃｄｓ（ＮＭ＿０１６８５０．３）；配列番号６１：マウスＩＲＦ−７／ＩＲＦ−３ ５（Ｄ） ｃｄｓ（１５７８ｎｔ）；配列番号６２：マウスＩＲＦ８ ｃｄｓ；配列番号６３：マウスＩＲＦ８ Ｋ３１０Ｒ ｃｄｓ（１２７５ｎｔ）；配列番号６４：ヒトＩＫＫβアイソフォーム１ ｃｄｓ；配列番号６５：ヒトＩＫＫβアイソフォーム２ ｃｄｓ；配列番号６６：ヒトＩＫＫβアイソフォーム３ ｃｄｓ；配列番号６７：ヒトＩＫＫβアイソフォーム４ ｃｄｓ；配列番号６８：マウスＩＫＫβ ｃｄｓ（２２１７ｎｔ）。 例示的支持配列：配列番号１：抗ヒト１９２８ｚ ＣＡＲ；配列番号２：抗ヒトＲＯＲ１ ＣＡＲ；配列番号３：ＨＢＶ特異的ＴＣＲ；配列番号４：抗ヒト１９２８ｚ ＣＡＲ；配列番号５：抗ヒトＲＯＲ１（４−１ＢＢｚ）ＣＡＲ；配列番号６：抗ＨＢＶ特異的ＴＣＲ（ＨＢｃｏｒｅ１８−２７）；配列番号７：抗ＣＤ１９ ｓｃＦｖ（ＶＨ−ＶＬ）ＦＭＣ６３；配列番号８：抗ＣＤ１９ ｓｃＦｖ（ＶＨ−ＶＬ）ＦＭＣ６３；配列番号９：ＣＤ２８エフェクタードメイン；配列番号１０：Ｐ２８ｚ ＣＡＲ；配列番号１１：ＩｇＧ４−Ｆｃ；配列番号１２：ヒンジ−ＣＨ２−ＣＨ３；配列番号１３：ヒンジ−ＣＨ３；配列番号１４：ヒンジのみ；配列番号１５：ＣＤ２８膜貫通ドメイン；配列番号１６：ＣＤ２８細胞質ドメイン（ＬＬ〜ＧＧ）；配列番号１７：４−１ＢＢ細胞質ドメイン；配列番号１８：ＣＤ３−ζ細胞質ドメイン；配列番号１９：Ｔ２Ａ；配列番号２０：ｔＥＧＦＲ；配列番号２１：ＳｔｒｅｐタグＩＩ；配列番号２２：Ｍｙｃタグ；配列番号２３：Ｖ５タグ；配列番号２４：ＦＬＡＧタグ；配列番号２５：ヒトＩＲＦ５アイソフォーム１（ＵｎｉＰｒｏｔ目録Ｑ１３５６８−１）；配列番号２６：ヒトＩＲＦ５アイソフォーム２（ＵｎｉＰｒｏｔ目録Ｑ１３５６８−２）；配列番号２７：ヒトＩＲＦ５アイソフォーム３（ＵｎｉＰｒｏｔ目録Ｑ１３５６８−３）；配列番号２８：ヒトＩＲＦ５アイソフォーム４（ＵｎｉＰｒｏｔ目録Ｑ１３５６８−４）；配列番号２９：ヒトＩＲＦ５アイソフォーム５（ＵｎｉＰｒｏｔ目録Ｑ１３５６８−５）；配列番号３０：ヒトＩＲＦ５アイソフォーム６（ＵｎｉＰｒｏｔ目録Ｑ１３５６８−６）；配列番号３１：マウスＩＲＦ５タンパク質（ｐＩ＝５．１９、Ｍｗ＝５６００５、ＵｎｉＰｒｏｔ目録Ｐ５６４７７）；配列番号３２：ヒトＩＲＦ１（ＵｎｉＰｒｏｔ目録Ｐ１０９１４）；配列番号３３：ヒトＩＲＦ３アイソフォーム１（ＵｎｉＰｒｏｔ目録Ｑ１４６５３−１）；配列番号３４：ヒトＩＲＦ７アイソフォームＡ（ＵｎｉＰｒｏｔ目録Ｑ９２９８５−１）；配列番号３５：ヒトＩＲＦ８（ＵｎｉＰｒｏｔ目録Ｑ０２５５６）；配列番号３６：マウスＩＲＦ１（ＵｎｉＰｒｏｔ目録Ｐ１５３１４）；配列番号３７：マウスＩＲＦ３（ＵｎｉＰｒｏｔ目録Ｐ７０６７１）；配列番号３８：マウスＩＲＦ７ （ＵｎｉＰｒｏｔ目録Ｐ７０４３４）；配列番号３９：マウスＩＲＦ７／ＩＲＦ３ ５（Ｄ）タンパク質（ｐＩ＝４．７２、ＭＷ＝５８４５６）；配列番号４０：マウスＩＲＦ８（ＵｎｉＰｒｏｔ目録Ｐ２３６１１）；配列番号４１：マウスＩＲＦ８（Ｋ３１０Ｒ）タンパク質（ｐＩ＝６．３８、ＭＷ＝４８２６５）；配列番号４２：ヒトＩＫＫβアイソフォーム１（ＵｎｉＰｒｏｔ目録Ｏ１４９２０−１）；配列番号４３：ヒトＩＫＫβアイソフォーム２（ＵｎｉＰｒｏｔ目録Ｏ１４９２０−２）；配列番号４４：ヒトＩＫＫβアイソフォーム３（ＵｎｉＰｒｏｔ目録Ｏ１４９２０−３）；配列番号４５：ヒトＩＫＫβアイソフォーム４（ＵｎｉＰｒｏｔ目録Ｏ１４９２０−４）；配列番号４６：マウスＩＫＫβタンパク質（ｐＩ＝６．２０、ＭＷ＝８４３８７．６１、ジェンバンク受託番号ＮＰ＿０３４６７６．１）；配列番号４７：ヒトＩＲＦ５アイソフォーム１ ｃｄｓ；配列番号４８：ヒトＩＲＦ５アイソフォーム２ ｃｄｓ；配列番号４９：ヒトＩＲＦ５アイソフォーム３ ｃｄｓ（ジェンバンク受託番号Ｕ５１１２７）；配列番号５０：ヒトＩＲＦ５アイソフォーム４ ｃｄｓ（ジェンバンク受託番号ＡＹ５０４９４６又はＡＹ５０４９４７）；配列番号５１：ヒトＩＲＦ５アイソフォーム５ ｃｄｓ；配列番号５２：ヒトＩＲＦ５アイソフォーム６ ｃｄｓ；配列番号５３：マウスＩＦ５ ｃｄｓ（１４９４ｎｔ）；配列番号５４：ヒトＩＲＦ１ ｃｄｓ；配列番号５５：ヒトＩＲＦ３アイソフォーム１ ｃｄｓ（ＮＭ＿００１５７１．５）；配列番号５６：ヒトＩＲＦ７アイソフォームＡ ｃｄｓ（ＮＭ＿００１５７２．３）；配列番号５７：ヒトＩＲＦ８ ｃｄｓ；配列番号５８：マウスＩＲＦ１ ｃｄｓ（ＮＭ＿００１１５９３９６．１）；配列番号５９：マウスＩＲＦ３ ｃｄｓ（ＮＭ＿０１６８４９．４）；配列番号６０：マウスＩＲＦ７ ｃｄｓ（ＮＭ＿０１６８５０．３）；配列番号６１：マウスＩＲＦ−７／ＩＲＦ−３ ５（Ｄ） ｃｄｓ（１５７８ｎｔ）；配列番号６２：マウスＩＲＦ８ ｃｄｓ；配列番号６３：マウスＩＲＦ８ Ｋ３１０Ｒ ｃｄｓ（１２７５ｎｔ）；配列番号６４：ヒトＩＫＫβアイソフォーム１ ｃｄｓ；配列番号６５：ヒトＩＫＫβアイソフォーム２ ｃｄｓ；配列番号６６：ヒトＩＫＫβアイソフォーム３ ｃｄｓ；配列番号６７：ヒトＩＫＫβアイソフォーム４ ｃｄｓ；配列番号６８：マウスＩＫＫβ ｃｄｓ（２２１７ｎｔ）。 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例示的支持配列：配列番号１：抗ヒト１９２８ｚ ＣＡＲ；配列番号２：抗ヒトＲＯＲ１ ＣＡＲ；配列番号３：ＨＢＶ特異的ＴＣＲ；配列番号４：抗ヒト１９２８ｚ ＣＡＲ；配列番号５：抗ヒトＲＯＲ１（４−１ＢＢｚ）ＣＡＲ；配列番号６：抗ＨＢＶ特異的ＴＣＲ（ＨＢｃｏｒｅ１８−２７）；配列番号７：抗ＣＤ１９ ｓｃＦｖ（ＶＨ−ＶＬ）ＦＭＣ６３；配列番号８：抗ＣＤ１９ ｓｃＦｖ（ＶＨ−ＶＬ）ＦＭＣ６３；配列番号９：ＣＤ２８エフェクタードメイン；配列番号１０：Ｐ２８ｚ ＣＡＲ；配列番号１１：ＩｇＧ４−Ｆｃ；配列番号１２：ヒンジ−ＣＨ２−ＣＨ３；配列番号１３：ヒンジ−ＣＨ３；配列番号１４：ヒンジのみ；配列番号１５：ＣＤ２８膜貫通ドメイン；配列番号１６：ＣＤ２８細胞質ドメイン（ＬＬ〜ＧＧ）；配列番号１７：４−１ＢＢ細胞質ドメイン；配列番号１８：ＣＤ３−ζ細胞質ドメイン；配列番号１９：Ｔ２Ａ；配列番号２０：ｔＥＧＦＲ；配列番号２１：ＳｔｒｅｐタグＩＩ；配列番号２２：Ｍｙｃタグ；配列番号２３：Ｖ５タグ；配列番号２４：ＦＬＡＧタグ；配列番号２５：ヒトＩＲＦ５アイソフォーム１（ＵｎｉＰｒｏｔ目録Ｑ１３５６８−１）；配列番号２６：ヒトＩＲＦ５アイソフォーム２（ＵｎｉＰｒｏｔ目録Ｑ１３５６８−２）；配列番号２７：ヒトＩＲＦ５アイソフォーム３（ＵｎｉＰｒｏｔ目録Ｑ１３５６８−３）；配列番号２８：ヒトＩＲＦ５アイソフォーム４（ＵｎｉＰｒｏｔ目録Ｑ１３５６８−４）；配列番号２９：ヒトＩＲＦ５アイソフォーム５（ＵｎｉＰｒｏｔ目録Ｑ１３５６８−５）；配列番号３０：ヒトＩＲＦ５アイソフォーム６（ＵｎｉＰｒｏｔ目録Ｑ１３５６８−６）；配列番号３１：マウスＩＲＦ５タンパク質（ｐＩ＝５．１９、Ｍｗ＝５６００５、ＵｎｉＰｒｏｔ目録Ｐ５６４７７）；配列番号３２：ヒトＩＲＦ１（ＵｎｉＰｒｏｔ目録Ｐ１０９１４）；配列番号３３：ヒトＩＲＦ３アイソフォーム１（ＵｎｉＰｒｏｔ目録Ｑ１４６５３−１）；配列番号３４：ヒトＩＲＦ７アイソフォームＡ（ＵｎｉＰｒｏｔ目録Ｑ９２９８５−１）；配列番号３５：ヒトＩＲＦ８（ＵｎｉＰｒｏｔ目録Ｑ０２５５６）；配列番号３６：マウスＩＲＦ１（ＵｎｉＰｒｏｔ目録Ｐ１５３１４）；配列番号３７：マウスＩＲＦ３（ＵｎｉＰｒｏｔ目録Ｐ７０６７１）；配列番号３８：マウスＩＲＦ７ 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例示的支持配列：配列番号１：抗ヒト１９２８ｚ ＣＡＲ；配列番号２：抗ヒトＲＯＲ１ ＣＡＲ；配列番号３：ＨＢＶ特異的ＴＣＲ；配列番号４：抗ヒト１９２８ｚ ＣＡＲ；配列番号５：抗ヒトＲＯＲ１（４−１ＢＢｚ）ＣＡＲ；配列番号６：抗ＨＢＶ特異的ＴＣＲ（ＨＢｃｏｒｅ１８−２７）；配列番号７：抗ＣＤ１９ ｓｃＦｖ（ＶＨ−ＶＬ）ＦＭＣ６３；配列番号８：抗ＣＤ１９ ｓｃＦｖ（ＶＨ−ＶＬ）ＦＭＣ６３；配列番号９：ＣＤ２８エフェクタードメイン；配列番号１０：Ｐ２８ｚ ＣＡＲ；配列番号１１：ＩｇＧ４−Ｆｃ；配列番号１２：ヒンジ−ＣＨ２−ＣＨ３；配列番号１３：ヒンジ−ＣＨ３；配列番号１４：ヒンジのみ；配列番号１５：ＣＤ２８膜貫通ドメイン；配列番号１６：ＣＤ２８細胞質ドメイン（ＬＬ〜ＧＧ）；配列番号１７：４−１ＢＢ細胞質ドメイン；配列番号１８：ＣＤ３−ζ細胞質ドメイン；配列番号１９：Ｔ２Ａ；配列番号２０：ｔＥＧＦＲ；配列番号２１：ＳｔｒｅｐタグＩＩ；配列番号２２：Ｍｙｃタグ；配列番号２３：Ｖ５タグ；配列番号２４：ＦＬＡＧタグ；配列番号２５：ヒトＩＲＦ５アイソフォーム１（ＵｎｉＰｒｏｔ目録Ｑ１３５６８−１）；配列番号２６：ヒトＩＲＦ５アイソフォーム２（ＵｎｉＰｒｏｔ目録Ｑ１３５６８−２）；配列番号２７：ヒトＩＲＦ５アイソフォーム３（ＵｎｉＰｒｏｔ目録Ｑ１３５６８−３）；配列番号２８：ヒトＩＲＦ５アイソフォーム４（ＵｎｉＰｒｏｔ目録Ｑ１３５６８−４）；配列番号２９：ヒトＩＲＦ５アイソフォーム５（ＵｎｉＰｒｏｔ目録Ｑ１３５６８−５）；配列番号３０：ヒトＩＲＦ５アイソフォーム６（ＵｎｉＰｒｏｔ目録Ｑ１３５６８−６）；配列番号３１：マウスＩＲＦ５タンパク質（ｐＩ＝５．１９、Ｍｗ＝５６００５、ＵｎｉＰｒｏｔ目録Ｐ５６４７７）；配列番号３２：ヒトＩＲＦ１（ＵｎｉＰｒｏｔ目録Ｐ１０９１４）；配列番号３３：ヒトＩＲＦ３アイソフォーム１（ＵｎｉＰｒｏｔ目録Ｑ１４６５３−１）；配列番号３４：ヒトＩＲＦ７アイソフォームＡ（ＵｎｉＰｒｏｔ目録Ｑ９２９８５−１）；配列番号３５：ヒトＩＲＦ８（ＵｎｉＰｒｏｔ目録Ｑ０２５５６）；配列番号３６：マウスＩＲＦ１（ＵｎｉＰｒｏｔ目録Ｐ１５３１４）；配列番号３７：マウスＩＲＦ３（ＵｎｉＰｒｏｔ目録Ｐ７０６７１）；配列番号３８：マウスＩＲＦ７ 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例示的支持配列：配列番号１：抗ヒト１９２８ｚ ＣＡＲ；配列番号２：抗ヒトＲＯＲ１ ＣＡＲ；配列番号３：ＨＢＶ特異的ＴＣＲ；配列番号４：抗ヒト１９２８ｚ ＣＡＲ；配列番号５：抗ヒトＲＯＲ１（４−１ＢＢｚ）ＣＡＲ；配列番号６：抗ＨＢＶ特異的ＴＣＲ（ＨＢｃｏｒｅ１８−２７）；配列番号７：抗ＣＤ１９ ｓｃＦｖ（ＶＨ−ＶＬ）ＦＭＣ６３；配列番号８：抗ＣＤ１９ ｓｃＦｖ（ＶＨ−ＶＬ）ＦＭＣ６３；配列番号９：ＣＤ２８エフェクタードメイン；配列番号１０：Ｐ２８ｚ ＣＡＲ；配列番号１１：ＩｇＧ４−Ｆｃ；配列番号１２：ヒンジ−ＣＨ２−ＣＨ３；配列番号１３：ヒンジ−ＣＨ３；配列番号１４：ヒンジのみ；配列番号１５：ＣＤ２８膜貫通ドメイン；配列番号１６：ＣＤ２８細胞質ドメイン（ＬＬ〜ＧＧ）；配列番号１７：４−１ＢＢ細胞質ドメイン；配列番号１８：ＣＤ３−ζ細胞質ドメイン；配列番号１９：Ｔ２Ａ；配列番号２０：ｔＥＧＦＲ；配列番号２１：ＳｔｒｅｐタグＩＩ；配列番号２２：Ｍｙｃタグ；配列番号２３：Ｖ５タグ；配列番号２４：ＦＬＡＧタグ；配列番号２５：ヒトＩＲＦ５アイソフォーム１（ＵｎｉＰｒｏｔ目録Ｑ１３５６８−１）；配列番号２６：ヒトＩＲＦ５アイソフォーム２（ＵｎｉＰｒｏｔ目録Ｑ１３５６８−２）；配列番号２７：ヒトＩＲＦ５アイソフォーム３（ＵｎｉＰｒｏｔ目録Ｑ１３５６８−３）；配列番号２８：ヒトＩＲＦ５アイソフォーム４（ＵｎｉＰｒｏｔ目録Ｑ１３５６８−４）；配列番号２９：ヒトＩＲＦ５アイソフォーム５（ＵｎｉＰｒｏｔ目録Ｑ１３５６８−５）；配列番号３０：ヒトＩＲＦ５アイソフォーム６（ＵｎｉＰｒｏｔ目録Ｑ１３５６８−６）；配列番号３１：マウスＩＲＦ５タンパク質（ｐＩ＝５．１９、Ｍｗ＝５６００５、ＵｎｉＰｒｏｔ目録Ｐ５６４７７）；配列番号３２：ヒトＩＲＦ１（ＵｎｉＰｒｏｔ目録Ｐ１０９１４）；配列番号３３：ヒトＩＲＦ３アイソフォーム１（ＵｎｉＰｒｏｔ目録Ｑ１４６５３−１）；配列番号３４：ヒトＩＲＦ７アイソフォームＡ（ＵｎｉＰｒｏｔ目録Ｑ９２９８５−１）；配列番号３５：ヒトＩＲＦ８（ＵｎｉＰｒｏｔ目録Ｑ０２５５６）；配列番号３６：マウスＩＲＦ１（ＵｎｉＰｒｏｔ目録Ｐ１５３１４）；配列番号３７：マウスＩＲＦ３（ＵｎｉＰｒｏｔ目録Ｐ７０６７１）；配列番号３８：マウスＩＲＦ７ 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例示的支持配列：配列番号１：抗ヒト１９２８ｚ ＣＡＲ；配列番号２：抗ヒトＲＯＲ１ ＣＡＲ；配列番号３：ＨＢＶ特異的ＴＣＲ；配列番号４：抗ヒト１９２８ｚ ＣＡＲ；配列番号５：抗ヒトＲＯＲ１（４−１ＢＢｚ）ＣＡＲ；配列番号６：抗ＨＢＶ特異的ＴＣＲ（ＨＢｃｏｒｅ１８−２７）；配列番号７：抗ＣＤ１９ ｓｃＦｖ（ＶＨ−ＶＬ）ＦＭＣ６３；配列番号８：抗ＣＤ１９ ｓｃＦｖ（ＶＨ−ＶＬ）ＦＭＣ６３；配列番号９：ＣＤ２８エフェクタードメイン；配列番号１０：Ｐ２８ｚ ＣＡＲ；配列番号１１：ＩｇＧ４−Ｆｃ；配列番号１２：ヒンジ−ＣＨ２−ＣＨ３；配列番号１３：ヒンジ−ＣＨ３；配列番号１４：ヒンジのみ；配列番号１５：ＣＤ２８膜貫通ドメイン；配列番号１６：ＣＤ２８細胞質ドメイン（ＬＬ〜ＧＧ）；配列番号１７：４−１ＢＢ細胞質ドメイン；配列番号１８：ＣＤ３−ζ細胞質ドメイン；配列番号１９：Ｔ２Ａ；配列番号２０：ｔＥＧＦＲ；配列番号２１：ＳｔｒｅｐタグＩＩ；配列番号２２：Ｍｙｃタグ；配列番号２３：Ｖ５タグ；配列番号２４：ＦＬＡＧタグ；配列番号２５：ヒトＩＲＦ５アイソフォーム１（ＵｎｉＰｒｏｔ目録Ｑ１３５６８−１）；配列番号２６：ヒトＩＲＦ５アイソフォーム２（ＵｎｉＰｒｏｔ目録Ｑ１３５６８−２）；配列番号２７：ヒトＩＲＦ５アイソフォーム３（ＵｎｉＰｒｏｔ目録Ｑ１３５６８−３）；配列番号２８：ヒトＩＲＦ５アイソフォーム４（ＵｎｉＰｒｏｔ目録Ｑ１３５６８−４）；配列番号２９：ヒトＩＲＦ５アイソフォーム５（ＵｎｉＰｒｏｔ目録Ｑ１３５６８−５）；配列番号３０：ヒトＩＲＦ５アイソフォーム６（ＵｎｉＰｒｏｔ目録Ｑ１３５６８−６）；配列番号３１：マウスＩＲＦ５タンパク質（ｐＩ＝５．１９、Ｍｗ＝５６００５、ＵｎｉＰｒｏｔ目録Ｐ５６４７７）；配列番号３２：ヒトＩＲＦ１（ＵｎｉＰｒｏｔ目録Ｐ１０９１４）；配列番号３３：ヒトＩＲＦ３アイソフォーム１（ＵｎｉＰｒｏｔ目録Ｑ１４６５３−１）；配列番号３４：ヒトＩＲＦ７アイソフォームＡ（ＵｎｉＰｒｏｔ目録Ｑ９２９８５−１）；配列番号３５：ヒトＩＲＦ８（ＵｎｉＰｒｏｔ目録Ｑ０２５５６）；配列番号３６：マウスＩＲＦ１（ＵｎｉＰｒｏｔ目録Ｐ１５３１４）；配列番号３７：マウスＩＲＦ３（ＵｎｉＰｒｏｔ目録Ｐ７０６７１）；配列番号３８：マウスＩＲＦ７ 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例示的支持配列：配列番号１：抗ヒト１９２８ｚ ＣＡＲ；配列番号２：抗ヒトＲＯＲ１ ＣＡＲ；配列番号３：ＨＢＶ特異的ＴＣＲ；配列番号４：抗ヒト１９２８ｚ ＣＡＲ；配列番号５：抗ヒトＲＯＲ１（４−１ＢＢｚ）ＣＡＲ；配列番号６：抗ＨＢＶ特異的ＴＣＲ（ＨＢｃｏｒｅ１８−２７）；配列番号７：抗ＣＤ１９ ｓｃＦｖ（ＶＨ−ＶＬ）ＦＭＣ６３；配列番号８：抗ＣＤ１９ ｓｃＦｖ（ＶＨ−ＶＬ）ＦＭＣ６３；配列番号９：ＣＤ２８エフェクタードメイン；配列番号１０：Ｐ２８ｚ ＣＡＲ；配列番号１１：ＩｇＧ４−Ｆｃ；配列番号１２：ヒンジ−ＣＨ２−ＣＨ３；配列番号１３：ヒンジ−ＣＨ３；配列番号１４：ヒンジのみ；配列番号１５：ＣＤ２８膜貫通ドメイン；配列番号１６：ＣＤ２８細胞質ドメイン（ＬＬ〜ＧＧ）；配列番号１７：４−１ＢＢ細胞質ドメイン；配列番号１８：ＣＤ３−ζ細胞質ドメイン；配列番号１９：Ｔ２Ａ；配列番号２０：ｔＥＧＦＲ；配列番号２１：ＳｔｒｅｐタグＩＩ；配列番号２２：Ｍｙｃタグ；配列番号２３：Ｖ５タグ；配列番号２４：ＦＬＡＧタグ；配列番号２５：ヒトＩＲＦ５アイソフォーム１（ＵｎｉＰｒｏｔ目録Ｑ１３５６８−１）；配列番号２６：ヒトＩＲＦ５アイソフォーム２（ＵｎｉＰｒｏｔ目録Ｑ１３５６８−２）；配列番号２７：ヒトＩＲＦ５アイソフォーム３（ＵｎｉＰｒｏｔ目録Ｑ１３５６８−３）；配列番号２８：ヒトＩＲＦ５アイソフォーム４（ＵｎｉＰｒｏｔ目録Ｑ１３５６８−４）；配列番号２９：ヒトＩＲＦ５アイソフォーム５（ＵｎｉＰｒｏｔ目録Ｑ１３５６８−５）；配列番号３０：ヒトＩＲＦ５アイソフォーム６（ＵｎｉＰｒｏｔ目録Ｑ１３５６８−６）；配列番号３１：マウスＩＲＦ５タンパク質（ｐＩ＝５．１９、Ｍｗ＝５６００５、ＵｎｉＰｒｏｔ目録Ｐ５６４７７）；配列番号３２：ヒトＩＲＦ１（ＵｎｉＰｒｏｔ目録Ｐ１０９１４）；配列番号３３：ヒトＩＲＦ３アイソフォーム１（ＵｎｉＰｒｏｔ目録Ｑ１４６５３−１）；配列番号３４：ヒトＩＲＦ７アイソフォームＡ（ＵｎｉＰｒｏｔ目録Ｑ９２９８５−１）；配列番号３５：ヒトＩＲＦ８（ＵｎｉＰｒｏｔ目録Ｑ０２５５６）；配列番号３６：マウスＩＲＦ１（ＵｎｉＰｒｏｔ目録Ｐ１５３１４）；配列番号３７：マウスＩＲＦ３（ＵｎｉＰｒｏｔ目録Ｐ７０６７１）；配列番号３８：マウスＩＲＦ７ 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例示的支持配列：配列番号１：抗ヒト１９２８ｚ ＣＡＲ；配列番号２：抗ヒトＲＯＲ１ ＣＡＲ；配列番号３：ＨＢＶ特異的ＴＣＲ；配列番号４：抗ヒト１９２８ｚ ＣＡＲ；配列番号５：抗ヒトＲＯＲ１（４−１ＢＢｚ）ＣＡＲ；配列番号６：抗ＨＢＶ特異的ＴＣＲ（ＨＢｃｏｒｅ１８−２７）；配列番号７：抗ＣＤ１９ ｓｃＦｖ（ＶＨ−ＶＬ）ＦＭＣ６３；配列番号８：抗ＣＤ１９ ｓｃＦｖ（ＶＨ−ＶＬ）ＦＭＣ６３；配列番号９：ＣＤ２８エフェクタードメイン；配列番号１０：Ｐ２８ｚ ＣＡＲ；配列番号１１：ＩｇＧ４−Ｆｃ；配列番号１２：ヒンジ−ＣＨ２−ＣＨ３；配列番号１３：ヒンジ−ＣＨ３；配列番号１４：ヒンジのみ；配列番号１５：ＣＤ２８膜貫通ドメイン；配列番号１６：ＣＤ２８細胞質ドメイン（ＬＬ〜ＧＧ）；配列番号１７：４−１ＢＢ細胞質ドメイン；配列番号１８：ＣＤ３−ζ細胞質ドメイン；配列番号１９：Ｔ２Ａ；配列番号２０：ｔＥＧＦＲ；配列番号２１：ＳｔｒｅｐタグＩＩ；配列番号２２：Ｍｙｃタグ；配列番号２３：Ｖ５タグ；配列番号２４：ＦＬＡＧタグ；配列番号２５：ヒトＩＲＦ５アイソフォーム１（ＵｎｉＰｒｏｔ目録Ｑ１３５６８−１）；配列番号２６：ヒトＩＲＦ５アイソフォーム２（ＵｎｉＰｒｏｔ目録Ｑ１３５６８−２）；配列番号２７：ヒトＩＲＦ５アイソフォーム３（ＵｎｉＰｒｏｔ目録Ｑ１３５６８−３）；配列番号２８：ヒトＩＲＦ５アイソフォーム４（ＵｎｉＰｒｏｔ目録Ｑ１３５６８−４）；配列番号２９：ヒトＩＲＦ５アイソフォーム５（ＵｎｉＰｒｏｔ目録Ｑ１３５６８−５）；配列番号３０：ヒトＩＲＦ５アイソフォーム６（ＵｎｉＰｒｏｔ目録Ｑ１３５６８−６）；配列番号３１：マウスＩＲＦ５タンパク質（ｐＩ＝５．１９、Ｍｗ＝５６００５、ＵｎｉＰｒｏｔ目録Ｐ５６４７７）；配列番号３２：ヒトＩＲＦ１（ＵｎｉＰｒｏｔ目録Ｐ１０９１４）；配列番号３３：ヒトＩＲＦ３アイソフォーム１（ＵｎｉＰｒｏｔ目録Ｑ１４６５３−１）；配列番号３４：ヒトＩＲＦ７アイソフォームＡ（ＵｎｉＰｒｏｔ目録Ｑ９２９８５−１）；配列番号３５：ヒトＩＲＦ８（ＵｎｉＰｒｏｔ目録Ｑ０２５５６）；配列番号３６：マウスＩＲＦ１（ＵｎｉＰｒｏｔ目録Ｐ１５３１４）；配列番号３７：マウスＩＲＦ３（ＵｎｉＰｒｏｔ目録Ｐ７０６７１）；配列番号３８：マウスＩＲＦ７ 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例示的支持配列：配列番号１：抗ヒト１９２８ｚ ＣＡＲ；配列番号２：抗ヒトＲＯＲ１ ＣＡＲ；配列番号３：ＨＢＶ特異的ＴＣＲ；配列番号４：抗ヒト１９２８ｚ ＣＡＲ；配列番号５：抗ヒトＲＯＲ１（４−１ＢＢｚ）ＣＡＲ；配列番号６：抗ＨＢＶ特異的ＴＣＲ（ＨＢｃｏｒｅ１８−２７）；配列番号７：抗ＣＤ１９ ｓｃＦｖ（ＶＨ−ＶＬ）ＦＭＣ６３；配列番号８：抗ＣＤ１９ ｓｃＦｖ（ＶＨ−ＶＬ）ＦＭＣ６３；配列番号９：ＣＤ２８エフェクタードメイン；配列番号１０：Ｐ２８ｚ ＣＡＲ；配列番号１１：ＩｇＧ４−Ｆｃ；配列番号１２：ヒンジ−ＣＨ２−ＣＨ３；配列番号１３：ヒンジ−ＣＨ３；配列番号１４：ヒンジのみ；配列番号１５：ＣＤ２８膜貫通ドメイン；配列番号１６：ＣＤ２８細胞質ドメイン（ＬＬ〜ＧＧ）；配列番号１７：４−１ＢＢ細胞質ドメイン；配列番号１８：ＣＤ３−ζ細胞質ドメイン；配列番号１９：Ｔ２Ａ；配列番号２０：ｔＥＧＦＲ；配列番号２１：ＳｔｒｅｐタグＩＩ；配列番号２２：Ｍｙｃタグ；配列番号２３：Ｖ５タグ；配列番号２４：ＦＬＡＧタグ；配列番号２５：ヒトＩＲＦ５アイソフォーム１（ＵｎｉＰｒｏｔ目録Ｑ１３５６８−１）；配列番号２６：ヒトＩＲＦ５アイソフォーム２（ＵｎｉＰｒｏｔ目録Ｑ１３５６８−２）；配列番号２７：ヒトＩＲＦ５アイソフォーム３（ＵｎｉＰｒｏｔ目録Ｑ１３５６８−３）；配列番号２８：ヒトＩＲＦ５アイソフォーム４（ＵｎｉＰｒｏｔ目録Ｑ１３５６８−４）；配列番号２９：ヒトＩＲＦ５アイソフォーム５（ＵｎｉＰｒｏｔ目録Ｑ１３５６８−５）；配列番号３０：ヒトＩＲＦ５アイソフォーム６（ＵｎｉＰｒｏｔ目録Ｑ１３５６８−６）；配列番号３１：マウスＩＲＦ５タンパク質（ｐＩ＝５．１９、Ｍｗ＝５６００５、ＵｎｉＰｒｏｔ目録Ｐ５６４７７）；配列番号３２：ヒトＩＲＦ１（ＵｎｉＰｒｏｔ目録Ｐ１０９１４）；配列番号３３：ヒトＩＲＦ３アイソフォーム１（ＵｎｉＰｒｏｔ目録Ｑ１４６５３−１）；配列番号３４：ヒトＩＲＦ７アイソフォームＡ（ＵｎｉＰｒｏｔ目録Ｑ９２９８５−１）；配列番号３５：ヒトＩＲＦ８（ＵｎｉＰｒｏｔ目録Ｑ０２５５６）；配列番号３６：マウスＩＲＦ１（ＵｎｉＰｒｏｔ目録Ｐ１５３１４）；配列番号３７：マウスＩＲＦ３（ＵｎｉＰｒｏｔ目録Ｐ７０６７１）；配列番号３８：マウスＩＲＦ７ 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例示的支持配列：配列番号１：抗ヒト１９２８ｚ ＣＡＲ；配列番号２：抗ヒトＲＯＲ１ ＣＡＲ；配列番号３：ＨＢＶ特異的ＴＣＲ；配列番号４：抗ヒト１９２８ｚ ＣＡＲ；配列番号５：抗ヒトＲＯＲ１（４−１ＢＢｚ）ＣＡＲ；配列番号６：抗ＨＢＶ特異的ＴＣＲ（ＨＢｃｏｒｅ１８−２７）；配列番号７：抗ＣＤ１９ ｓｃＦｖ（ＶＨ−ＶＬ）ＦＭＣ６３；配列番号８：抗ＣＤ１９ ｓｃＦｖ（ＶＨ−ＶＬ）ＦＭＣ６３；配列番号９：ＣＤ２８エフェクタードメイン；配列番号１０：Ｐ２８ｚ ＣＡＲ；配列番号１１：ＩｇＧ４−Ｆｃ；配列番号１２：ヒンジ−ＣＨ２−ＣＨ３；配列番号１３：ヒンジ−ＣＨ３；配列番号１４：ヒンジのみ；配列番号１５：ＣＤ２８膜貫通ドメイン；配列番号１６：ＣＤ２８細胞質ドメイン（ＬＬ〜ＧＧ）；配列番号１７：４−１ＢＢ細胞質ドメイン；配列番号１８：ＣＤ３−ζ細胞質ドメイン；配列番号１９：Ｔ２Ａ；配列番号２０：ｔＥＧＦＲ；配列番号２１：ＳｔｒｅｐタグＩＩ；配列番号２２：Ｍｙｃタグ；配列番号２３：Ｖ５タグ；配列番号２４：ＦＬＡＧタグ；配列番号２５：ヒトＩＲＦ５アイソフォーム１（ＵｎｉＰｒｏｔ目録Ｑ１３５６８−１）；配列番号２６：ヒトＩＲＦ５アイソフォーム２（ＵｎｉＰｒｏｔ目録Ｑ１３５６８−２）；配列番号２７：ヒトＩＲＦ５アイソフォーム３（ＵｎｉＰｒｏｔ目録Ｑ１３５６８−３）；配列番号２８：ヒトＩＲＦ５アイソフォーム４（ＵｎｉＰｒｏｔ目録Ｑ１３５６８−４）；配列番号２９：ヒトＩＲＦ５アイソフォーム５（ＵｎｉＰｒｏｔ目録Ｑ１３５６８−５）；配列番号３０：ヒトＩＲＦ５アイソフォーム６（ＵｎｉＰｒｏｔ目録Ｑ１３５６８−６）；配列番号３１：マウスＩＲＦ５タンパク質（ｐＩ＝５．１９、Ｍｗ＝５６００５、ＵｎｉＰｒｏｔ目録Ｐ５６４７７）；配列番号３２：ヒトＩＲＦ１（ＵｎｉＰｒｏｔ目録Ｐ１０９１４）；配列番号３３：ヒトＩＲＦ３アイソフォーム１（ＵｎｉＰｒｏｔ目録Ｑ１４６５３−１）；配列番号３４：ヒトＩＲＦ７アイソフォームＡ（ＵｎｉＰｒｏｔ目録Ｑ９２９８５−１）；配列番号３５：ヒトＩＲＦ８（ＵｎｉＰｒｏｔ目録Ｑ０２５５６）；配列番号３６：マウスＩＲＦ１（ＵｎｉＰｒｏｔ目録Ｐ１５３１４）；配列番号３７：マウスＩＲＦ３（ＵｎｉＰｒｏｔ目録Ｐ７０６７１）；配列番号３８：マウスＩＲＦ７ 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ｃｄｓ；配列番号６７：ヒトＩＫＫβアイソフォーム４ ｃｄｓ；配列番号６８：マウスＩＫＫβ ｃｄｓ（２２１７ｎｔ）。 例示的支持配列：配列番号１：抗ヒト１９２８ｚ ＣＡＲ；配列番号２：抗ヒトＲＯＲ１ ＣＡＲ；配列番号３：ＨＢＶ特異的ＴＣＲ；配列番号４：抗ヒト１９２８ｚ ＣＡＲ；配列番号５：抗ヒトＲＯＲ１（４−１ＢＢｚ）ＣＡＲ；配列番号６：抗ＨＢＶ特異的ＴＣＲ（ＨＢｃｏｒｅ１８−２７）；配列番号７：抗ＣＤ１９ ｓｃＦｖ（ＶＨ−ＶＬ）ＦＭＣ６３；配列番号８：抗ＣＤ１９ ｓｃＦｖ（ＶＨ−ＶＬ）ＦＭＣ６３；配列番号９：ＣＤ２８エフェクタードメイン；配列番号１０：Ｐ２８ｚ ＣＡＲ；配列番号１１：ＩｇＧ４−Ｆｃ；配列番号１２：ヒンジ−ＣＨ２−ＣＨ３；配列番号１３：ヒンジ−ＣＨ３；配列番号１４：ヒンジのみ；配列番号１５：ＣＤ２８膜貫通ドメイン；配列番号１６：ＣＤ２８細胞質ドメイン（ＬＬ〜ＧＧ）；配列番号１７：４−１ＢＢ細胞質ドメイン；配列番号１８：ＣＤ３−ζ細胞質ドメイン；配列番号１９：Ｔ２Ａ；配列番号２０：ｔＥＧＦＲ；配列番号２１：ＳｔｒｅｐタグＩＩ；配列番号２２：Ｍｙｃタグ；配列番号２３：Ｖ５タグ；配列番号２４：ＦＬＡＧタグ；配列番号２５：ヒトＩＲＦ５アイソフォーム１（ＵｎｉＰｒｏｔ目録Ｑ１３５６８−１）；配列番号２６：ヒトＩＲＦ５アイソフォーム２（ＵｎｉＰｒｏｔ目録Ｑ１３５６８−２）；配列番号２７：ヒトＩＲＦ５アイソフォーム３（ＵｎｉＰｒｏｔ目録Ｑ１３５６８−３）；配列番号２８：ヒトＩＲＦ５アイソフォーム４（ＵｎｉＰｒｏｔ目録Ｑ１３５６８−４）；配列番号２９：ヒトＩＲＦ５アイソフォーム５（ＵｎｉＰｒｏｔ目録Ｑ１３５６８−５）；配列番号３０：ヒトＩＲＦ５アイソフォーム６（ＵｎｉＰｒｏｔ目録Ｑ１３５６８−６）；配列番号３１：マウスＩＲＦ５タンパク質（ｐＩ＝５．１９、Ｍｗ＝５６００５、ＵｎｉＰｒｏｔ目録Ｐ５６４７７）；配列番号３２：ヒトＩＲＦ１（ＵｎｉＰｒｏｔ目録Ｐ１０９１４）；配列番号３３：ヒトＩＲＦ３アイソフォーム１（ＵｎｉＰｒｏｔ目録Ｑ１４６５３−１）；配列番号３４：ヒトＩＲＦ７アイソフォームＡ（ＵｎｉＰｒｏｔ目録Ｑ９２９８５−１）；配列番号３５：ヒトＩＲＦ８（ＵｎｉＰｒｏｔ目録Ｑ０２５５６）；配列番号３６：マウスＩＲＦ１（ＵｎｉＰｒｏｔ目録Ｐ１５３１４）；配列番号３７：マウスＩＲＦ３（ＵｎｉＰｒｏｔ目録Ｐ７０６７１）；配列番号３８：マウスＩＲＦ７ （ＵｎｉＰｒｏｔ目録Ｐ７０４３４）；配列番号３９：マウスＩＲＦ７／ＩＲＦ３ ５（Ｄ）タンパク質（ｐＩ＝４．７２、ＭＷ＝５８４５６）；配列番号４０：マウスＩＲＦ８（ＵｎｉＰｒｏｔ目録Ｐ２３６１１）；配列番号４１：マウスＩＲＦ８（Ｋ３１０Ｒ）タンパク質（ｐＩ＝６．３８、ＭＷ＝４８２６５）；配列番号４２：ヒトＩＫＫβアイソフォーム１（ＵｎｉＰｒｏｔ目録Ｏ１４９２０−１）；配列番号４３：ヒトＩＫＫβアイソフォーム２（ＵｎｉＰｒｏｔ目録Ｏ１４９２０−２）；配列番号４４：ヒトＩＫＫβアイソフォーム３（ＵｎｉＰｒｏｔ目録Ｏ１４９２０−３）；配列番号４５：ヒトＩＫＫβアイソフォーム４（ＵｎｉＰｒｏｔ目録Ｏ１４９２０−４）；配列番号４６：マウスＩＫＫβタンパク質（ｐＩ＝６．２０、ＭＷ＝８４３８７．６１、ジェンバンク受託番号ＮＰ＿０３４６７６．１）；配列番号４７：ヒトＩＲＦ５アイソフォーム１ ｃｄｓ；配列番号４８：ヒトＩＲＦ５アイソフォーム２ ｃｄｓ；配列番号４９：ヒトＩＲＦ５アイソフォーム３ ｃｄｓ（ジェンバンク受託番号Ｕ５１１２７）；配列番号５０：ヒトＩＲＦ５アイソフォーム４ ｃｄｓ（ジェンバンク受託番号ＡＹ５０４９４６又はＡＹ５０４９４７）；配列番号５１：ヒトＩＲＦ５アイソフォーム５ ｃｄｓ；配列番号５２：ヒトＩＲＦ５アイソフォーム６ ｃｄｓ；配列番号５３：マウスＩＦ５ ｃｄｓ（１４９４ｎｔ）；配列番号５４：ヒトＩＲＦ１ ｃｄｓ；配列番号５５：ヒトＩＲＦ３アイソフォーム１ ｃｄｓ（ＮＭ＿００１５７１．５）；配列番号５６：ヒトＩＲＦ７アイソフォームＡ ｃｄｓ（ＮＭ＿００１５７２．３）；配列番号５７：ヒトＩＲＦ８ ｃｄｓ；配列番号５８：マウスＩＲＦ１ ｃｄｓ（ＮＭ＿００１１５９３９６．１）；配列番号５９：マウスＩＲＦ３ ｃｄｓ（ＮＭ＿０１６８４９．４）；配列番号６０：マウスＩＲＦ７ ｃｄｓ（ＮＭ＿０１６８５０．３）；配列番号６１：マウスＩＲＦ−７／ＩＲＦ−３ ５（Ｄ） ｃｄｓ（１５７８ｎｔ）；配列番号６２：マウスＩＲＦ８ ｃｄｓ；配列番号６３：マウスＩＲＦ８ Ｋ３１０Ｒ ｃｄｓ（１２７５ｎｔ）；配列番号６４：ヒトＩＫＫβアイソフォーム１ ｃｄｓ；配列番号６５：ヒトＩＫＫβアイソフォーム２ ｃｄｓ；配列番号６６：ヒトＩＫＫβアイソフォーム３ ｃｄｓ；配列番号６７：ヒトＩＫＫβアイソフォーム４ ｃｄｓ；配列番号６８：マウスＩＫＫβ ｃｄｓ（２２１７ｎｔ）。
遺伝子治療が成功するかどうかは、目的の選択された細胞中への遺伝子送達機構がうまくいくかどうか次第である。
本開示は、平均で７日間持続する１つ以上の核酸の発現を提供することにより、治療目的を達成するように細胞を迅速で選択的に改変する組成物及び方法を提供する。一部の場合、核酸又はタンパク質の一過性発現が生じる。一過性発現は任意選択的に、組成物の１つ以上の繰り返し適用を通じて延ばされ、したがって、重複することもありしないこともある、繰り返される（連続）発現期間を提供できる。所望の治療効果（複数可）を達成するには一過性発現のみが必要になるので、進行中の副作用及び／又は経時的な治療タンパク質発現の減少に関する懸念は克服される。
一部の実施形態において、本明細書に開示される組成物及び方法は、養子細胞療法により投与されるエクスビボで形質導入された細胞と同じくらいの、又はこれよりも大きなインビボ治療効果を示す。好都合なことに、本開示の組成物及び方法は、対象へのナノ粒子の投与後に、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、若しくは少なくとも９０％のインビボＴ細胞が、治療タンパク質を発現することを達成する；対象の少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、若しくは少なくとも７０％においてがんを根絶させ；再発対象の生存の、平均で少なくとも１０日、少なくとも１５日、少なくとも２０日、少なくとも２５日、少なくとも３０日、少なくとも３５日、若しくは少なくとも３７日の改善を生じ；エクスビボでナノキャリアーと接触させたＴ細胞の移植と少なくともおよそ同じ効能を生じ；及び／又はエクスビボで形質導入されたＣＡＲ＋ Ｔ細胞の移植と少なくともおよそ同じ効能を生じる。
患者へのナノ粒子組成物の繰り返し送達を含む実施形態が本明細書では特に想定されており、ナノ粒子は患者内で選択された細胞を標的にし、この選択された細胞による治療タンパク質の一過性発現を生じる。特定の実施形態において、繰り返し送達は５〜１０日ごとに（例えば、７日ごとに）行われる。
定義
本明細書で使用される場合、「ナノ粒子」と「ナノキャリアー」は互換的に使用され、一般には、タンパク質、ポリヌクレオチド又は薬物などの「カーゴ」と呼ばれる別の物質を輸送するためのモジュールのことである。一般に使用されるナノキャリアーは、ミセル、ポリマー、炭素系材料、リポソーム及び他の物質を含む。本開示のナノキャリアーは一般には、少なくとも正電荷キャリアーマトリックス及び中性の又は負電荷コーティングを含む。コーティングは、任意選択的に、挿入された中間層ありの又はなしのキャリアーマトリックスの外表面上にある。カーゴは一般に、治療タンパク質（例えば、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）、ＣＡＲ／ＴＣＲハイブリッド、細胞受容体、転写因子、マクロファージ活性化因子若しくはシグナル伝達分子）をコードする、又は治療ポリヌクレオチド（例えば、ｍＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｇＲＮＡ又はｓｇＲＮＡ）をコードするポリヌクレオチドである。
本明細書で使用される場合、ナノキャリアーの「コーティング」とは、ナノキャリアーの最外層のことであるが、細胞ターゲティングリガンドはコーティングの部分を遮蔽することがある。コーティングは、負電荷ポリグルタミン酸（ＰＧＡ）、ポリ（アクリル酸）、アルギン酸若しくはコレステリルヘミスクシナート／１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン、又は中性電荷両性イオンポリマーなどの中性の又は負電荷コーティングを含みうる。
本明細書で使用される場合、「キャリアーマトリックス」とは、コーティング及びいかなる中間層も除いて、ナノキャリアー中へのカーゴの組込みを媒介するナノキャリアーの成分のことである。一般に、カーゴがポリヌクレオチドである場合、キャリアーマトリックスは正電荷キャリアーマトリックスであり、これはポリヌクレオチドが負電荷なのでキャリアー中にポリヌクレオチドを組み込むのに適している。脂質又はポリマーは、正電荷ポリ（βアミノエステル）、ポリ（Ｌ−リジン）、ポリ（エチレンイミン）（ＰＥＩ）、ポリ（アミドアミン）デンドリマー（ＰＡＭＡＭ）、ポリ（アミン−コ−エステル）、ポリ（ジメチルアミノエチルメタクリレート）（ＰＤＭＡＥＭＡ）、キトサン、ポリ（Ｌ−ラクチド−コ−Ｌ−リジン）、ポリ［α−（４−アミノブチル）−Ｌ−グリコール酸］（ＰＡＧＡ）、又はポリ（４−ヒドロキシ−Ｌ−プロリンエステル）（ＰＨＰ）；前述のものの組合せ；又は等価物でもよい。
本明細書で使用される場合、「コーティングの表面から伸びる」とは、リガンドがコーティングに直接的に又は間接的に結合されて、コーティングからリガンドとこの標的を相互作用させるのに十分な距離伸びていることを意味する。結合は、化学的結合により、脂質結合成分のリガンド中への組込み（例えば、タンパク質の膜貫通ドメインへのリガンドの遺伝子融合）により、電荷−電荷相互作用により、又は他の手段により達成しうる。
本明細書で使用される場合、「選択された細胞」とは、ナノキャリアーの製作者又は使用者によりナノキャリアー組成物の標的として選択される細胞又は細胞型のことである。例えば、選択された細胞は、Ｔ細胞、Ｂ細胞又はＮＫ細胞などの免疫細胞でよい。選択された細胞は、ＣＤ４＋Ｔ細胞、ＣＤ８＋Ｔ細胞又は制御性Ｔ細胞などの、前述の免疫細胞のサブセットでもよい。選択された細胞は、一部の実施形態において、複数の細胞マーカーにより区別される細胞へのターゲティングを達成するために複数のターゲティングリガンドが用いられるので、前述の免疫細胞のさらなるサブセットでもよい。
本明細書で使用される場合、「疾患特異的受容体」とは、疾患についての原因物質に関係する又は疾患を示す生体分子に特異的に結合するタンパク質のことである。例えば、がんについての疾患特異的受容体は、がん細胞上での過剰発現によりなどの、がん細胞を特徴付け、がん細胞を非がん細胞と区別するタンパク質を含むと考えられる。感染症についての疾患特異的受容体は、例えば、感染病原体に直接、特異的に結合する受容体又は感染した細胞の表面に表示される生体分子に特異的に結合する受容体（例えば、ペプチドが感染病原体特異的ペプチドであるペプチド−ＭＨＣ複合体）を含みうる。
本明細書で使用される場合、「選択的に組み込まれた」とは、ナノキャリアーが、他の細胞中に組み込まれるよりも高い割合で又はこれよりも大きな最大組込み量まで選択された細胞中に組み込まれることを意味する。「選択的に組み込まれた」とは、選択された細胞以外の細胞中への２倍、３倍、４倍、５倍、１０倍、１００倍、１０００倍又はこれよりも迅速に又は効果的に選択された細胞中に組み込まれることを意味してよい。
本明細書で使用される場合、「選択的に結合する」とは、参照分子へよりも少なくとも２倍、３倍、４倍、５倍、１０倍、１００倍、１０００倍又はこれよりも高い親和性で標的に結合することを意味する。
本明細書で使用される場合、「治療タンパク質を発現する」とは、選択された細胞をナノキャリアーに接触させる又はナノキャリアーが対象に投与され、選択された細胞が、ゲル電気泳動、質量分析、蛍光顕微鏡、フローサイトメトリー及び／又はウェスタンブロッティングなどの従来法により検出可能な量で治療タンパク質を発現することを意味する。治療タンパク質が選択された細胞により内因的に発現される場合、「治療タンパク質を発現する」とは、接触又は投与ステップにより、選択された細胞での治療タンパク質の発現が少なくとも５％、１０％、１５％、２０％又はこれよりも多く増加することを意味する。
本明細書で使用される場合、「ＨＢＶ誘導肝細胞癌」とは、ＨＢＶにより引き起こされたことが分かっている肝細胞癌、又は医療従事者ならば妥当な判断力を使用してＨＢＶにより引き起こされたと理解する肝細胞癌のことである。
本明細書で使用される場合、がんの「根絶」とは、完全寛解（ＣＲ）のことである。
本明細書で使用される場合、「対象」又は「患者」は互換的に使用される。「対象」は任意の哺乳動物を含む。哺乳動物は、例えば、ヒト又は霊長類、マウス、ラット、イヌ、ネコ、ウシ、ウマ、ヤギ、ラクダ、ヒツジ若しくはブタなどの適切な非ヒト哺乳動物が可能である。対象はトリ又は家禽も可能である。好ましくは、対象はヒトである。対象は、雄又は雌が可能である。これを必要とする対象とは、状態、例えば、自己免疫疾患、感染症、がん又は前がん状態を有すると以前診断された又は確認されたことがないヒトが可能である。これを必要とする対象とは、がん又は前がん状態を有すると以前診断された又は確認されたことがあるヒトが可能である。これを必要とする対象とは、状態、例えば、自己免疫疾患、感染症、がん又は前がん状態を有している（罹っている）ヒトも可能である。あるいは、これを必要とする対象とは、人口全般と比べてそのような障害を発症するリスクがあるヒト（すなわち、人口全般と比べてそのような障害を発症しやすい対象）が可能である。
任意選択的に、これを必要とする対象は、状態のために少なくとも１つの治療介入をすでに受けたことがある、受けている最中である又は受けることになっている。
これを必要とする対象は、ごく最近の治療に難治性状態、例えば、難治性がんを有していてよい。「難治性がん」とは、前もって施された処置に応答しないがんを意味する。がんは、処置の開始時に抵抗性でもよく、又は処置中に抵抗性になってもよい。難治性がんは耐性がんとも呼ばれる。一部の実施形態において、これを必要とする対象は、ごく最近の治療での緩解に続くがん再発がある。一部の実施形態において、これを必要とする対象は、がん処置のためのあらゆる既知の効果的治療を受けてうまくいかなかった。一部の実施形態において、これを必要とする対象は、少なくとも１つの以前の治療を受けた。
本明細書で使用される場合、「再発性対象」とは、以前の処置後、ＣＲ、部分応答（ＰＲ）、緩解又は長期の緩解を示したことがあり、続いてがんが再発した対象のことである。
本明細書で使用される場合、「エクスビボ」とは、対象又はドナーの身体の外側で細胞に向けられる方法のことである。
本明細書で使用される場合、「インビボ」とは、対象の身体において細胞に向けられる方法のことである。
本明細書で使用される場合、「インビトロ」とは、一次細胞にではなく培養により成長させる細胞に向けられる方法のことである。
本明細書で使用される場合、「細胞ターゲティングリガンド」又は「選択された細胞ターゲティングリガンド」は互換的に使用され、選択された細胞に（例えば、選択された細胞の表面上のマーカータンパク質を通じて）選択的に結合する生体分子（例えば、タンパク質又はポリヌクレオチド）のことである。一般的に、細胞ターゲティングリガンドは、インビボでナノキャリアーを標的の選択された細胞に選択的に向ける。例示的細胞ターゲティングリガンドは、一本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）などの抗体断片、合理的に操作された結合剤などの操作されたリガンド、小分子リガンド又はアプタマーを含む。
実施形態
特定の実施形態において、一過性発現は、１２時間〜１５日間；１８時間〜１２日間；２０時間〜１４日間；２４時間〜１０日間、２４時間〜８日間、又は３０時間〜７日間の発現である。種々の実施形態での一過性発現は１４日間以下であることが特に想定されている。例えば、特定の実施形態において、一過性発現は、１２日間以下、１０日間以下、９日間以下、８日間以下、又は７日間以下持続する検出可能な発現である。より長い発現が望まれる実施形態において、治療タンパク質の一過性発現を提供するナノ粒子は、繰り返し投与、例えば、５〜１０日間ごとに（例えば、７日ごとに）行われる送達で対象に送達することができる。
特定の実施形態において、対象は治療タンパク質の発現についてモニターすることができ、発現が閾値より下に低下したら、処置している医師は、ナノ粒子を追加すれば治療タンパク質が追加で発現されることが保証されるかどうかを決定することができる。
特定の実施形態において、ナノ粒子の送達は、静脈内に、又は選択された解剖学的部位（例えば、腫瘍部位）で、その部位に向かって、若しくはその近くでなされ得る。
特定の実施形態において、ナノ粒子の送達は、処置部位での細胞誘引物質の使用と協調させることができる。例えば、対象に、解剖学的部位に細胞型を引き付ける作用薬を投与することができる。特定の実施形態において、引き付けられた細胞型は、核酸又は治療タンパク質などのタンパク質を発現するために遺伝子改変用に標的にされる細胞型と同じ細胞型が可能である。例えば、解剖学的部位が腫瘍部位である場合、Ｔ細胞を腫瘍部位に引き付けて、次に引き付けられたＴ細胞を改変して、核酸又は治療タンパク質、例えば、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）若しくはＣＡＲ／ＴＣＲハイブリッドなどのタンパク質を発現させれば有益になることができる。特定の実施形態において、引き付けられた細胞型は、核酸又は治療タンパク質などのタンパク質を発現するために遺伝子改変用に標的にされる細胞型と異なる細胞型が可能である。例えば、解剖学的部位が腫瘍部位である場合、治療タンパク質を一過性発現するよう改変された選択された細胞の活性を支持する細胞を腫瘍部位に引き付ければ有益になることができる。Ｔ細胞の活性を支持する細胞は、Ｔ細胞のサブセット（例えば、ヘルパーＴ細胞）、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞及びマクロファージを含むことができる。特定の実施形態において、１種よりも多い細胞型を解剖学的部位に引き付ければ有益になることができる。特定の実施形態において、細胞を、ナノ粒子の送達前に解剖学的部位に引き付けることができる（例えば、「事前調整（ｐｒｅｃｏｎｄｉｔｉｏｎｉｎｇ）」）。
特定の実施形態において、本明細書に記載される処置プロトコールは処置部位でマクロファージを活性化することも含むことができる。処置部位でマクロファージを活性化すれば、例えば、処置を受けている対象のマクロファージ（複数可）の腫瘍抑制を克服できる。
特定の実施形態において、選択された細胞型をインビボで遺伝子改変して核酸又は治療タンパク質などのタンパク質を発現させるために利用されるナノ粒子は、（１）選択された細胞ターゲティングリガンド；（２）正電荷キャリアー；（３）正電荷キャリアー内の核酸；及び（４）中性又は負電荷コーティングを含む。
開示されたナノ粒子を細胞の不均一混合物（例えば、インビボ環境）に添加すると、操作されたナノ粒子は選択された細胞集団に結合し受容体媒介エンドサイトーシスを刺激する；この過程はナノ粒子が担持している核酸（例えば、合成ｍＲＮＡ）を進入させ、その結果選択された細胞はコードされた分子を発現し始める（図１〜３Ｂ）。ＤＮＡではなくｍＲＮＡが使用される場合はトランス遺伝子の核内輸送及び転写は必要ないので、この過程は、一部の場合、迅速で効率的である。必要ならば、所望の結果が達成されるまでナノ粒子の追加の適用を実施することができる。特定の実施形態において、ナノ粒子は生分解性及び生体適合性である。
特定の実施形態において、迅速とは、コードされた核酸の発現が、本明細書に開示されるナノ粒子への細胞の不均一試料の曝露から２４時間以内又は１２時間以内に選択された細胞型内で始まることを意味する。このタイムラインは、標的化細胞の細胞質中への放出とほぼ同時に（例えば、数分以内に）転写され始めるｍＲＮＡなどの核酸を利用して可能になる。
特定の実施形態において、効率的なとは、標的化細胞（例えば、一次ヒトＴ細胞）中へのカプセル化核酸移入が＞８０％であり、表現型改変がこれらの細胞の少なくとも８０％、これらの細胞の少なくとも９０％、又はこれらの細胞の１００％で起こることを意味する。特定の実施形態において、効率的なとは、標的化細胞中へのカプセル化核酸移入が＞８０％であり、表現型改変がこれらの細胞の少なくとも２５％、これらの細胞の少なくとも３３％、又はこれらの細胞の少なくとも５０％で起こることを意味する。特定の実施形態において、表現型改変は、送達される核酸がヌクレアーゼをコードするナノ粒子を取り込む選択された細胞の１／３で起こることができる。
特定の実施形態において、核酸は、ＣＡＲ、ＴＣＲ、ＣＡＲ／ＴＣＲハイブリッド又はマクロファージ活性化因子などの治療タンパク質を発現する合成ｍＲＮＡを含む。特定の実施形態は、インビトロ転写（ＩＶＴ）ｍＲＮＡ（例えば、Ｇｒｕｄｚｉｅｎ−Ｎｏｇａｌｓｋａら、Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．９６９：５５〜７２頁、２０１３年参照）、自己増殖型ＲＮＡ（ｓａ−ＲＮＡ；Ｂｒｉｔｏら、Ａｄｖ Ｇｅｎｅｔ．８９：１７９〜２３３頁、２０１５年）；又は閉端型ＤＮＡ（ｃｅＤＮＡ；Ｌｉら、ＰＬｏＳ Ｏｎｅ．２０１３年 Ａｕｇ １（ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１３７１／ｊｏｕｒｎａｌ．ｐｏｎｅ．００６９８７９））を利用して、例えば、白血病特異的１９２８ｚ ＣＡＲ、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）コア抗原特異的ＨＢｃｏｒｅ１８−２７ ＴＣＲ、前立腺腫瘍特異的抗ＲＯＲ１ ４−１ＢＢｚ ＣＡＲ又はマクロファージ活性化因子を一過性に発現する。
本開示の追加の選択肢及び実施形態は今や以下の通りにより詳細に説明される：（ｉ）（ａ）ＣＡＲ、ＴＣＲ及びＣＡＲ／ＴＣＲハイブリッド並びに（ｂ）マクロファージ活性化因子を含む治療タンパク質の発現；（ｉｉ）細胞誘引物質；（ｉｉｉ）ナノ粒子；（ｉｖ）組成物；（ｖ）使用方法；（ｖｉ）キット；（ｖｉｉ）例示的実施形態；及び（ｖｉｉｉ）実験例。
（ｉ）（ａ）ＣＡＲ、ＴＣＲ及びＣＡＲ／ＴＣＲハイブリッド並びに（ｂ）マクロファージ活性化因子を含む治療タンパク質の発現。特定の実施形態において、発現は送達されるナノ粒子内の核酸としてのｍＲＮＡの使用に基づいている。
特定の実施形態において、核酸は合成ｍＲＮＡを含む。特定の実施形態において、合成ｍＲＮＡは、５’−キャッピングを使用して細胞内安定性を増やすように操作される。複数の異なる５’−キャップ構造を使用すれば、合成ｍＲＮＡ分子の５’−キャップを作成することができる。例えば、アンチリバースキャップアナログ（ＡＲＣＡ）キャップは５’−５’−三リン酸グアニン−グアニン結合を含有し、そこでは１つのグアニンがＮ７メチル基並びに３’−Ｏ−メチル基を含有する。合成ｍＲＮＡ分子は、５’−キャップ構造を作成する原因となる酵素を使用して転写後にキャップしてもよい。例えば、組換えワクシニアウイルスキャッピング酵素及び組換え２’−Ｏ−メチルトランスフェラーゼ酵素は、ｍＲＮＡの最も５’側の末端ヌクレオチドとグアニンヌクレオチドの間に標準的な５’−５’−三リン酸結合を生み出すことができ、そこにおいてグアニンはＮ７メチル化を含有し最後の５’−ヌクレオチドはＣａｐ１構造を生み出す２’−Ｏ−メチルを含有する。これにより、さらに高い翻訳能力及び細胞安定性を有するキャップが生じ、並びに細胞炎症性サイトカインの活性化が低下する。
合成ｍＲＮＡ又は他の核酸は環状にしてもよい。合成ｍＲＮＡは環状化される、又はコンカテマー化されて、翻訳能力のある分子を作成しポリＡ結合タンパク質と５’末端結合タンパク質の間の相互作用を支援しうる。環状化又はコンカテマー化の機構は、少なくとも３つの異なる経路：１）化学的、２）酵素的、及び３）リボザイム触媒された、を通じて起こりうる。新たに形成された５’−／３’−結合は、分子内でも分子間でもよい。
第１の経路において、核酸の５’−末端及び３’−末端は、互いに接近すると分子の５’−末端と３’−末端の間に新たな共有結合を形成する化学反応性基を含有してよい。有機溶媒中で、合成ｍＲＮＡ分子の３’末端の３’アミノ末端ヌクレオチドが５’−ＮＨＳ−エステル部分に求核攻撃を受けて新しい５’−／３’−アミド結合を形成するように、５’末端はＮＨＳ−エステル反応基を含有してよく、３’末端は３’アミノ末端ヌクレオチドを含有してよい。
第２の経路では、Ｔ４ ＲＮＡリガーゼを使用して、５’−リン酸化核酸分子を核酸の３’−ヒドロキシル基に酵素的に連結させて新しいリン酸ジエステル結合を形成してよい。実施例の反応では、１μｇの核酸分子を、１〜１０ユニットのＴ４ ＲＮＡリガーゼ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ、Ｉｐｓｗｉｃｈ、Ｍａｓｓ．）と一緒に製造業者のプロトコールに従って３７℃で１時間インキュベートすることができる。ライゲーション反応は、並置した５’−と３’−領域の両方と塩基対合して酵素的ライゲーション反応を支援することができるスプリットオリゴヌクレオチドの存在下で起こりうる。
第３の経路において、ｃＤＮＡ鋳型の５’−又は３’−末端は、インビトロ転写中に、得られる核酸分子が、核酸分子の５’−末端を核酸分子の３’−末端にライゲートすることができる活性なリボザイム配列を含有できるように、リガーゼリボザイム配列をコードする。リガーゼリボザイムは、グループＩイントロン、グループＩイントロン、Ｄ型肝炎ウイルス、ヘアピンリボザイム由来でもよく又はＳＥＬＥＸ（指数関数的濃縮によるリガンドの体系的進化）により選択してもよい。リボザイムリガーゼ反応は、０〜３７℃の間の温度で１〜２４時間かかってよい。
これらの核酸配列は、特定の実施形態において、タンパク質に翻訳されるＲＮＡ配列を含む。核酸配列は完全長核酸配列並びに完全長タンパク質に由来する非完全長配列の両方を含む。配列は、天然の配列の縮重コドン又は特定の選択された細胞型においてコドン選択を提供するように導入してよい配列の縮重コドンも含むことができる。治療タンパク質をコードする遺伝子配列は、一般に公開されているデータベース及び出版物において入手可能である。本明細書で使用される場合、用語「コードする」とは、治療タンパク質の合成のための鋳型としての役目を果たす、プラスミド、遺伝子、ｃＤＮＡ、ｍＲＮＡなどの核酸の配列の特性のことである。
示されているように、核酸を使用して遺伝子改変された細胞による治療タンパク質の発現を推進し、特定の実施形態において、治療タンパク質はＣＡＲ、ＴＣＲ、ＣＡＲ／ＴＣＲハイブリッド又はマクロファージ活性化因子を含む。
（ａ）ＣＡＲ、ＴＣＲ及びＣＡＲ／ＴＣＲハイブリッド。ＣＡＲとは、少なくとも結合ドメイン及びエフェクタードメイン、並びに任意選択的に、スペーサードメイン及び／又は膜貫通ドメインを含む合成的に設計された受容体のことである。特定の実施形態において、ＣＡＲとは、ｓｃＦｖの形態での細胞外抗原結合ドメイン、膜貫通ドメイン及び下に定義される刺激性分子由来の機能的シグナル伝達ドメインを含む細胞質シグナル伝達ドメイン（本明細書では「細胞内シグナル伝達ドメイン」とも呼ばれる）を含む組換えポリペプチドのことである。特定の実施形態において、ＣＡＲの中心的細胞内シグナル伝達ドメインは、通常はＴＣＲ複合体と会合しているのが見出されるＣＤ３ゼータ鎖由来である。下により完全に記載されているように、ＣＤ３ゼータシグナル伝達ドメインは、４−１ＢＢ（すなわち、ＣＤ１３７）、ＣＤ２７及び／又はＣＤ２８などの少なくとも１つの同時刺激性分子に由来する１つ以上の機能的シグナル伝達ドメインと融合させることができる。本開示の方法及び組成物において有用である例示的ＣＡＲ及びＣＡＲ構造物は、ＷＯ２０１２１３８４７５Ａ１、ＵＳ９６２４３０６Ｂ２、ＵＳ９２６６９６０Ｂ２、ＵＳ２０１７０１７４７７、ＥＰ２６９４５４９Ｂ１、ＵＳ２０１７０２８３５０４、ＵＳ２０１７０２８１７６６、ＵＳ２０１７０２８３５００、ＵＳ２０１８００８６８４６、ＵＳ２０１００１０５１３６、ＵＳ２０１００１０５１３６、ＷＯ２０１２０７９０００、ＷＯ２００８０４５４３７、ＷＯ２０１６１３９４８７Ａ１及びＷＯ２０１４０３９５２３により提供されるＣＡＲ及びＣＡＲ構造物であり、前記特許文献のそれぞれはその全体を本明細書に組み込む。
ＴＣＲとは、天然に存在するＴ細胞受容体のことである。ＣＡＲ／ＴＣＲハイブリッドとは、ＴＣＲのエレメントとＣＡＲのエレメントを有するタンパク質のことである。例えば、ＣＡＲ／ＴＣＲハイブリッドは、天然に存在するＴＣＲ結合ドメインを、ＴＣＲ結合ドメインが天然には会合していないエフェクタードメインと一緒に有することができると考えられる。ＣＡＲ／ＴＣＲハイブリッドは、突然変異したＴＣＲ結合ドメイン及びＩＴＡＭシグナル伝達ドメインを有することができると考えられる。ＣＡＲ／ＴＣＲハイブリッドは、天然に存在するＴＣＲを、挿入された天然には存在しないスペーサー領域又は膜貫通ドメインと一緒に有することができると考えられる。
特定のＣＡＲ／ＴＣＲハイブリッドは、ＴＲｕＣ（登録商標）（Ｔ細胞受容体融合構築物）ハイブリッド；ＴＣＲ２ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、ＭＡ］を含む。例として、ＴＣＲ融合タンパク質の生産は、国際特許公開ＷＯ２０１８／０２６９５３及びＷＯ２０１８／０６７９９３に、並びに米国特許出願公開第２０１７／０１６６６２２号に記載されており、前記特許文献のそれぞれは参照によりその全体を本明細書に組み込む。
特定の実施形態において、ＣＡＲ／ＴＣＲハイブリッドは、「Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）融合タンパク質」又は「ＴＦＰ」を含む。ＴＦＰは、ｉ）標的細胞上で表面抗原に結合する、及びｉｉ）典型的にはＴ細胞に又はＴ細胞表面上に同時に位置する場合、無傷のＴＣＲ複合体の他のポリペプチド成分と相互作用することが一般的にできるＴＣＲを含めて、種々のポリペプチド由来の組換えポリペプチドを含む。
特定の実施形態において、ＴＦＰは、がん抗原（例えば、ＣＤ１９、ＲＯＲ１）に結合する抗体断片を含み、抗体断片の配列は、ＴＣＲサブユニット又はこの部分をコードする核酸配列に近接しておりこの核酸配列と同じリーディングフレームにある。ＴＦＰは、機能的ＴＣＲ複合体を形成するために、１つ以上の内在性（又は、代わりに、１つ以上の外因性、若しくは内因性と外因性の組合せ）ＴＣＲサブユニットと会合することができる。
結合ドメインは、標的化細胞上のマーカーに特異的に結合するいかなるペプチドでも特に含むことができる。結合ドメインの供給源は、種々の種由来の抗体可変領域（抗体、ｓＦｖ、ｓｃＦｖ、Ｆａｂ、ｓｃＦｖベースのグラバボディー、又は可溶性ＶＨドメイン若しくはドメイン抗体の形態が可能である）を含む。これらの抗体は、重鎖可変領域だけを使用して抗原結合領域を形成することができ、すなわち、これらの機能的抗体は、重鎖のみのホモダイマーである（「重鎖抗体」と呼ばれる）（Ｊｅｓｐｅｒｓら、Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２２：１１６１頁、２００４年；Ｃｏｒｔｅｚ−Ｒｅｔａｍｏｚｏら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．６４：２８５３頁、２００４年；Ｂａｒａｌら、Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄ．１２：５８０頁、２００６年；及びＢａｒｔｈｅｌｅｍｙら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２８３：３６３９頁、２００８年）。
結合ドメインの別の供給源は、ランダムペプチドライブラリーをコードする配列又はｓｃＴＣＲ（Ｌａｋｅら、Ｉｎｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１１：７４５頁、１９９９年；Ｍａｙｎａｒｄら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ ３０６：５１頁、２００５年；米国特許第８，３６１，７９４号）、フィブリノーゲンドメイン（Ｗｅｉｓｅｌら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３０：１３８８頁、１９８５年）、クニッツドメイン（米国特許第６，４２３，４９８号）、デザインドアンキリン反復タンパク質（ＤＡＲＰｉｎ）（Ｂｉｎｚら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３３２：４８９頁、２００３年及びＢｉｎｚら、Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２２：５７５頁、２００４年）、フィブロネクチン結合ドメイン（アドネクチン又はモノボディ）（Ｒｉｃｈａｒｄｓら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３２６：１４７５頁、２００３年；Ｐａｒｋｅｒら、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ．Ｄｅｓ．Ｓｅｌｅｃ．１８：４３５頁、２００５年及びＨａｃｋｅｌら、（２００８）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３８１：１２３８〜１２５２頁）、システインノットミニタンパク質（Ｖｉｔａら、（１９９５）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（ＵＳＡ）９２：６４０４〜６４０８頁；Ｍａｒｔｉｎら、（２００２）Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２１：７１頁、２００２年及びＨｕａｎｇら、（２００５）Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ １３：７５５頁、２００５年）、テトラトリコペプチド反復ドメイン（Ｍａｉｎら、Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ １１：４９７頁、２００３年及びＣｏｒｔａｊａｒｅｎａら、ＡＣＳ Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．３：１６１頁、２００８年）、ロイシンリッチ反復ドメイン（Ｓｔｕｍｐｐら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３３２：４７１頁、２００３年）、リポカリンドメイン（ＷＯ２００６／０９５１６４、Ｂｅｓｔｅら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（ＵＳＡ）９６：１８９８頁、１９９９年及びＳｃｈｏｎｆｅｌｄら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（ＵＳＡ）１０６：８１９８頁、２００９年）、Ｖ様ドメイン（米国特許出願公開第２００７／００６５４３１号）、Ｃ型レクチンドメイン（Ｚｅｌｅｎｓｋｙ及びＧｒｅａｄｙ、ＦＥＢＳ Ｊ．２７２：６１７９頁、２００５年；Ｂｅａｖｉｌら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（ＵＳＡ）８９：７５３頁、１９９２年及びＳａｔｏら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（ＵＳＡ）１００：７７７９頁、２００３年）、ｍＡｂ２又はＦｃａｂ（Ｆｃ抗原結合）（ＰＣＴ特許出願公開ＷＯ２００７／０９８９３４；ＷＯ２００６／０７２６２０；Ｗｏｚｎｉａｋ−Ｋｎｏｐｐら、Ｐｒｏｔ．Ｅｎｇ．Ｄｅｓ．Ｓｅｌｅｃｔ．２３：４、２８９〜２９７頁、２０１０年）、アルマジロ反復ドメイン（Ｍａｄｈｕｒａｎｔａｋａｍら、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉ．２１：１０１５頁、２０１２年；ＰＣＴ特許出願公開ＷＯ２００９／０４０３３８）、アフィリン（Ｅｂｅｒｓｂａｃｈら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３７２：１７２頁、２００７年）、アフィボディ、アビマー、ノッチン（ｋｎｏｔｔｉｎ）、フィノマー（ｆｙｎｏｍｅｒ）、アトリマー（ａｔｒｉｍｅｒ）、細胞傷害性Ｔリンパ球関連タンパク質４（Ｗｅｉｄｌｅら、Ｃａｎｃｅｒ Ｇｅｎ．Ｐｒｏｔｅｏ．１０：１５５頁、２０１３年）、又は同類の物（Ｎｏｒｄら、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ．８：６０１頁、１９９５年；Ｎｏｒｄら、Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１５：７７２頁、１９９７年；Ｎｏｒｄら、Ｅｕｒｏ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２６８：４２６９頁、２００１年；Ｂｉｎｚら、Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２３：１２５７頁、２００５年；Ｂｏｅｒｓｍａ ａｎｄ Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２２：８４９頁、２０１１年）などの別の非抗体スキャフォールドのループ領域におけるアミノ酸の操作された多様性をコードする配列を含む。
特定の実施形態において、結合ドメインは、目的の標的（例えば、ペプチド−ＭＨＣ複合体）に特異的なＶα／β及びＣα／β鎖（例えば、Ｖα−Ｃα、Ｖβ−Ｃβ、Ｖα−Ｖβ）を含む又はＶα−Ｃα、Ｖβ−Ｃβ、Ｖα−Ｖβ対を含む一本鎖ＴＣＲ（ｓｃＴＣＲ）である。
特定の実施形態において、操作されたＣＡＲ、ＴＣＲ及びハイブリッドＣＡＲ／ＴＣＲは、既知の又は同定されたＴＣＲ Ｖα、Ｖβ、Ｃα又はＣβのアミノ酸配列に少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、少なくとも９９．５％、又は１００％同一である配列を含み、それぞれのＣＤＲは、目的の標的に特異的に結合するＴＣＲ又はこの断片若しくは誘導体からゼロ変化、又は１つ、２つ若しくは３つ以下の変化を含む。
特定の実施形態において、ナノ粒子から一過性に発現させることができる操作されたＣＡＲ、ＴＣＲ及びハイブリッドＣＡＲ／ＴＣＲは、既知の又は同定されたＴＣＲ（例えば、高親和性ＴＣＲ）のＶα、Ｖβ、Ｃα又はＣβに由来する又はこれらに基づくＶα、Ｖβ、Ｃα又はＣβ領域を含み、既知の又は同定されたＴＣＲのＶα、Ｖβ、Ｃα又はＣβと比べた場合、１つ以上（例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、１０）の挿入、１つ以上（例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、１０）の欠失、１つ以上（例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、１０）のアミノ酸置換（例えば、保存的アミノ酸置換又は非保存的アミノ酸置換）、又は上記変化の組合せを含む。挿入、欠失又は置換は、それぞれのＣＤＲがゼロ変化、又は１つ、２つ若しくは３つ以下の変化を含むという条件で、並びに改変Ｖα、Ｖβ、Ｃα又はＣβ領域を含有する標的結合ドメインが、それでも野生型に類似する親和性及び作用でこの標的に特異的に結合することができるという条件で、これらの領域のアミノ−若しくはカルボキシ終端又は両方の末端でを含めて、Ｖα、Ｖβ、Ｃα又はＣβ領域のいずれの場所にあってもよい。
特定の実施形態において、本開示の結合ドメインＶＨ領域は、既知のモノクローナル抗体のＶＨに由来する又はこれに基づくことができ、既知のモノクローナル抗体のＶＨと比べた場合、１つ以上（例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、１０）の挿入、１つ以上（例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、１０）の欠失、１つ以上（例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、１０）のアミノ酸置換（例えば、保存的アミノ酸置換又は非保存的アミノ酸置換）、又は上記変化の組合せを含有することができる。挿入、欠失又は置換は、それぞれのＣＤＲがゼロ変化、又は１つ、２つ若しくは３つ以下の変化を含むという条件で、並びに改変ＶＨ領域を含有する結合ドメインが、それでも野生型結合ドメインに類似する親和性でこの標的に特異的に結合することができるという条件で、この領域のアミノ−若しくはカルボキシ終端又は両方の末端を含めて、ＶＨ領域のいずれの場所にあってもよい。
特定の実施形態において、本開示の結合ドメインでのＶＬ領域は、既知のモノクローナル抗体のＶＬに由来する又はこれに基づいており、既知のモノクローナル抗体のＶＬと比べた場合、１つ以上（例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、１０）の挿入、１つ以上（例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、１０）の欠失、１つ以上（例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、１０）のアミノ酸置換（例えば、保存的アミノ酸置換）、又は上記変化の組合せを含有する。挿入、欠失又は置換は、それぞれのＣＤＲがゼロ変化、又は１つ、２つ若しくは３つ以下の変化を含むという条件で、並びに改変ＶＬ領域を含有する結合ドメインが、それでも野生型結合ドメインに類似する親和性でこの標的に特異的に結合することができるという条件で、この領域のアミノ−若しくはカルボキシ終端又は両方の末端を含めて、ＶＬ領域のいずれの場所にあってもよい。
特定の実施形態において、ＣＡＲ、ＴＣＲ又はハイブリッドＣＡＲ／ＴＣＲの結合ドメインは、軽鎖可変領域（ＶＬ）の又は重鎖可変領域（ＶＨ）の、又は両方のアミノ酸配列に少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、少なくとも９９．５％、又は１００％同一である配列を含む又はこの配列であり、それぞれのＣＤＲは、目的の標的に特異的に結合するモノクローナル抗体又はこの断片若しくは誘導体から、ゼロ変化、又は１つ、２つ若しくは３つ以下の変化を含む。
特定の実施形態において、結合ドメインはＰＳＭＡに結合することができる。ＰＳＭＡに特異的であるいくつかの抗体は当業者には公知であり、配列、エピトープ結合及び親和性について容易に特徴付けることができる。特定の実施形態において、結合ドメインは、抗メソセリンリガンド（卵巣がん、膵臓がん及び中皮腫を処置することに関連している）；抗ＷＴ−１（白血病及び卵巣がんを処置することに関連している）；抗ＨＩＶ−ｇａｇ（ＨＩＶ感染を処置することに関連している）；又は抗サイトメガロウイルス（ヘルペスウイルスなどのＣＭＶ疾患を処置することに関連している）を含むことができる。
特定の実施形態において、結合ドメインはＣＤ１９に結合することができる。特定の実施形態において、結合ドメインは、ＣＤ１９に特異的なＶＨ及びＶＬ領域を含む一本鎖Ｆｖ断片（ｓｃＦｖ）である。特定の実施形態において、ＶＨ及びＶＬ領域はヒトである。例示的ＶＨ及びＶＬ領域は、抗ＣＤ１９特異的モノクローナル抗体ＦＭＣ６３のセグメントを含む。特定の実施形態において、ｓｃＦｖは、ＲＡＳＱＤＩＳＫＹＬＮのＣＤＲＬ１配列、ＳＲＬＨＳＧＶのＣＤＲＬ２配列及びＧＮＴＬＰＹＴＦＧのＣＤＲＬ３配列を含む可変軽鎖を含むヒト又はヒト化ｓｃＦｖである。特定の実施形態において、ｓｃＦｖは、ＤＹＧＶＳのＣＤＲＨ１配列、ＶＴＷＧＳＥＴＴＹＹＮＳＡＬＫＳのＣＤＲＨ２配列及びＹＡＭＤＹＷＧのＣＤＲＨ３配列を含む可変重鎖を含むヒト又はヒト化ｓｃＦｖである。ＳＪ２５Ｃ１及びＨＤ３７などの他のＣＤ１９ターゲティング抗体が知られている（ＳＪ２５Ｃ１：Ｂｅｊｃｅｋら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ２００５年、ＰＭＩＤ ７５３８９０１；ＨＤ３７：Ｐｅｚｕｔｔｏら、ＪＩ １９８７年、ＰＭＩＤ ２４３７１９９）。
特定の実施形態において、ヒトＣＤ１９に結合するｓｃＦｖ配列は、
Figure 2021523110
 を含む。
特定の実施形態において、結合ドメインはＲＯＲ１に結合することができる。特定の実施形態において、ｓｃＦｖは、ＡＳＧＦＤＦＳＡＹＹＭのＣＤＲＬ１配列（配列番号１０４）、ＴＩＹＰＳＳＧのＣＤＲＬ２配列（配列番号１０５）及びＡＤＲＡＴＹＦＣＡのＣＤＲＬ３配列（配列番号１０６）を含む可変軽鎖を含むヒト又はヒト化ｓｃＦｖである。特定の実施形態において、ｓｃＦｖは、ＤＴＩＤＷＹのＣＤＲＨ１配列（配列番号１０７）、ＶＱＳＤＧＳＹＴＫＲＰＧＶＰＤＲのＣＤＲＨ２配列（配列番号１０８）及びＹＩＧＧＹＶＦＧのＣＤＲＨ３配列（配列番号１０９）を含む可変重鎖を含むヒト又はヒト化ｓｃＦｖである。ＲＯＲ１に特異的であるいくつかの抗体は当業者には公知であり、配列、エピトープ結合及び親和性について容易に特徴付けることができる。
特定の実施形態において、ヒトＲＯＲ１に結合するｓｃＦｖ配列は、
Figure 2021523110
 を含む。
ナノ粒子の生産に関する追加の記述はＰＣＴ／ＵＳ２０１８／０１２５０７に見出すことができ、前記特許文献は参照によりその全体を本明細書に組み込む。
特定の以下のがんは、ＣＡＲ、ＴＣＲ及びハイブリッドＣＡＲ／ＴＣＲの細胞外成分内に、関連細胞マーカー（複数可）（例えば、以下のマーカーのいずれか１つに特異的であるｓｃＦｖを含むＣＡＲ）に結合する結合ドメインを含むことにより標的にすることができる：
Figure 2021523110
特定の実施形態において、合成ｍＲＮＡ（例えば、ＩＶＴ ｍＲＮＡ）は、細胞マーカー又はこの断片に特異的に結合するＣＡＲ、ＴＣＲ又はＣＡＲ／ＴＣＲハイブリッドをコードする。
前述のものに限定せずに、細胞マーカーは、Ａ３３；ＢＡＧＥ；Ｂｃｌ−２；βカテニン；ＢＣＭＡ；Ｂ７Ｈ４；ＢＴＬＡ；ＣＡ１２５；ＣＡ１９−９；ＣＤ３、ＣＤ５；ＣＤ１９；ＣＤ２０；ＣＤ２１；ＣＤ２２；ＣＤ２５；ＣＤ２８；ＣＤ３０；ＣＤ３３；ＣＤ３７；ＣＤ３８；ＣＤ４０；ＣＤ５２；ＣＤ４４ｖ６；ＣＤ４５；ＣＤ５６；ＣＤ７９ｂ；ＣＤ８０；ＣＤ８１；ＣＤ８６；ＣＤ１２３；ＣＤ１３４；ＣＤ１３７；ＣＤ１５１；ＣＤ１７１；ＣＤ２７６；ＣＥＡ；ＣＥＡＣＡＭ６；ｃ−Ｍｅｔ；ＣＳ−１；ＣＴＬＡ−４；サイクリンＢ１；ＤＡＧＥ；ＥＢＮＡ；ＥＧＦＲ；ＥＧＦＲｖＩＩＩ、エフリンＢ２；ＥｒｂＢ２；ＥｒｂＢ３；ＥｒｂＢ４；ＥｐｈＡ２；エストロゲン受容体；ＦＡＰ；フェリチン；α−フェトプロテイン（ＡＦＰ）；ＦＬＴ１；ＦＬＴ４；葉酸結合タンパク質；Ｆｒｉｚｚｌｅｄ；ＧＡＧＥ；Ｇ２５０；ＧＤ−２；ＧＨＲＨＲ；ＧＨＲ；ＧＩＴＲ；ＧＭ２；ＧＰＲＣ５Ｄ；ｇｐ７５；ｇｐ１００（Ｐｍｅｌ １７）；ｇｐ１３０；ＨＬＡ；ＨＥＲ−２／ｎｅｕ；ＨＰＶ Ｅ６；ＨＰＶ Ｅ７；ｈＴＥＲＴ；ＨＶＥＭ；ＩＧＦ１Ｒ；ＩＬ６Ｒ；ＫＤＲ；Ｋｉ−６７；ルイスＡ；ルイスＹ；ＬＩＦＲβ；ＬＲＰ；ＬＲＰ５；ＬＴβＲ；ＭＡＧＥ；ＭＡＲＴ；メソセリン；ＭＵＣ；ＭＵＣ１；ＭＵＭ−１−Ｂ；ｍｙｃ；ＮＹＥＳＯ−１；Ｏ−アセチルＧＤ−２；Ｏ−アセチルＧＤ３；ＯＳＭＲβ；ｐ５３；ＰＤ１；ＰＤ−Ｌ１；ＰＤ−Ｌ２；ＰＲＡＭＥ；プロゲステロン受容体；ＰＳＡ；ＰＳＭＡ；ＰＴＣＨ１；ＲＡＮＫ；ｒａｓ；Ｒｏｂｏ１；ＲＯＲｌ；サバイビン；ＴＣＲα；ＴＣＲβ；テネイシン；ＴＧＦＢＲ１；ＴＧＦＢＲ２；ＴＬＲ７；ＴＬＲ９；ＴＮＦＲ１；ＴＮＦＲ２；ＴＮＦＲＳＦ４；ＴＷＥＡＫ−Ｒ；ＴＳＴＡチロシナーゼ；ＶＥＧＦ；及びＷＴ１も含む。
特定のがん細胞の細胞マーカーは、
Figure 2021523110
Figure 2021523110
Figure 2021523110
を含む。
本開示は、がんの症状又は前がん状態を処置する、予防する又は軽減するための方法を提供する。方法は、本開示の治療有効量のナノキャリアー、又はこの医薬組成物を、これを必要とする対象に投与することを含む。処置しうる例示的がんは、前立腺がん、乳がん、幹細胞がん、卵巣がん、中皮腫、腎細胞癌、メラノーマ、膵臓がん、肺がん、ＨＢＶ誘導肝細胞癌及び多発性骨髄腫を含む。処置しうるさらなる例示的がんは、髄芽腫、乏突起神経膠腫、卵巣明細胞癌、卵巣類内膜癌（ｏｖａｒｉａｎ ｅｎｄｏｍｅｔｈｒｉｏｉｄ ａｄｅｎｏｃａｒｃｉｎｏｍａ）、卵巣漿液性腺癌、膵管腺癌、膵内分泌腫瘍、悪性横紋筋様腫瘍、星状細胞腫、非定型奇形腫様／横紋筋肉腫様腫瘍、脈絡叢癌、脈絡叢乳頭腫、上衣腫、神経膠芽腫、髄膜腫、神経膠腫瘍、乏突起星細胞腫、乏突起神経膠腫、松果体芽腫、癌肉腫、脊索腫、性腺外胚細胞腫瘍、腎外性横紋筋様腫瘍（ｅｘｔｒａｒｅｎａｌ ｒｈａｂｄｏｉｄ ｔｕｍｏｒ）、シュワン腫、皮膚扁平上皮癌、軟骨肉腫、軟組織の明細胞肉腫、ユーイング肉腫、消化管間質肉腫、骨肉腫、横紋筋肉腫、類上皮肉腫、腎髄質癌（ｒｅｎａｌ ｍｅｄｕｌｌｏ ｃａｒｃｉｎｏｍａ）、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、濾胞性リンパ腫及び別段指定されていない（ＮＯＳ）肉腫を含む。
本開示は、がん若しくは前がんの処置における、又はそのようながん若しくは前がんの処置に有用である薬品の調製のための本開示のナノ粒子又はこの医薬組成物の使用をさらに提供する。処置しうる例示的がんは、前立腺がん、乳がん、幹細胞がん、卵巣がん、中皮腫、腎細胞癌、メラノーマ、膵臓がん、肺がん、ＨＢＶ誘導肝細胞癌及び多発性骨髄腫を含む。処置しうるさらなる例示的がんは、髄芽腫、乏突起神経膠腫、卵巣明細胞癌、卵巣類内膜癌、卵巣漿液性腺癌、膵管腺癌、膵内分泌腫瘍、悪性横紋筋様腫瘍、星状細胞腫、非定型奇形腫様／横紋筋肉腫様腫瘍、脈絡叢癌、脈絡叢乳頭腫、上衣腫、神経膠芽腫、髄膜腫、神経膠腫瘍、乏突起星細胞腫、乏突起神経膠腫、松果体芽腫、癌肉腫、脊索腫、性腺外胚細胞腫瘍、腎外性横紋筋様腫瘍、シュワン腫、皮膚扁平上皮癌、軟骨肉腫、軟組織の明細胞肉腫、ユーイング肉腫、消化管間質肉腫、骨肉腫、横紋筋肉腫、類上皮肉腫、腎髄質癌、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、濾胞性リンパ腫及びＮＯＳ肉腫を含む。
本明細書で開示されるいかなる方法でも、がんは、脳及び中枢神経系（ＣＮＳ）がん、頭頚部がん、腎臓がん、卵巣がん、膵臓がん、白血病、肺がん、リンパ腫、多発性骨髄腫、肉腫、乳がん並びに前立腺がんからなる群から選択される。一部の実施形態において、がんは、髄芽腫、乏突起神経膠腫、卵巣明細胞癌、卵巣類内膜癌、卵巣漿液性腺癌、膵管腺癌、膵内分泌腫瘍、悪性横紋筋様腫瘍、星状細胞腫、非定型奇形腫様／横紋筋肉腫様腫瘍、脈絡叢癌、脈絡叢乳頭腫、上衣腫、神経膠芽腫、髄膜腫、神経膠腫瘍、乏突起星細胞腫、乏突起神経膠腫、松果体芽腫、癌肉腫、脊索腫、性腺外胚細胞腫瘍、腎外性横紋筋様腫瘍、シュワン腫、皮膚扁平上皮癌、軟骨肉腫、軟組織の明細胞肉腫、ユーイング肉腫、消化管間質肉腫、骨肉腫、横紋筋肉腫、類上皮肉腫、腎髄質癌、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、濾胞性リンパ腫及びＮＯＳ肉腫からなる群から選択される。
例えば、感染病原体抗原に結合することにより、感染症病原体に特異的な結合ドメインも想定されている。例えば、これらの抗原は、例えば、ウイルス感染細胞により発現されるウイルス抗原又は他のウイルスマーカーを含む。例示的ウイルスは、アデノウイルス、アレナウイルス、ブニヤウイルス、コロナウイルス、フラビウイルス、ハンタウイルス、ヘパドナウイルス、ヘルペスウイルス、パピローマウイルス、パラミクソウイルス、パルボウイルス、ピコルナウイルス、ポックスウイルス、オルソミクソウイルス、レトロウイルス、レオウイルス、ラブドウイルス、ロタウイルス、海綿状ウイルス（ｓｐｏｎｇｉｆｏｒｍ ｖｉｒｕｓｅｓ）又はトガウイルスを含む。追加の実施形態において、ウイルス抗原マーカーは、ＣＭＶ、かぜウイルス、エプスタインバーウイルス、流感ウイルス（ｆｌｕ ｖｉｒｕｓ）、Ａ型、Ｂ型及びＣ型肝炎ウイルス、単純ヘルペスウイルス、ＨＩＶ、インフルエンザウイルス、日本脳炎ウイルス、麻疹ウイルス、ポリオウイルス、狂犬病ウイルス、呼吸器合胞体ウイルス、風疹ウイルス、天然痘ウイルス、水痘帯状疱疹ウイルス又は西ナイルウイルスにより発現されるペプチドを含む。
さらなる特定の例として、サイトメガロウイルス抗原は、外被糖タンパク質Ｂ及びＣＭＶ ｐｐ６５を含み；エプスタインバー抗原は、ＥＢＶ ＥＢＮＡＩ、ＥＢＶ Ｐ１８及びＥＢＶ Ｐ２３を含み；肝炎抗原は、ＨＢＶのＳ、Ｍ及びＬタンパク質、ＨＢＶのプレＳ抗原、ＨＢＣＡＧ ＤＥＬＴＡ、ＨＢＶ ＨＢＥ、Ｃ型肝炎ウイルスＲＮＡ、ＨＣＶ ＮＳ３及びＨＣＶ ＮＳ４を含み；単純ヘルペスウイルス抗原は、最初期タンパク質及び糖タンパク質Ｄを含み；ＨＩＶ抗原は、ＨＩＶ ｇｐ３２、ＨＩＶ ｇｐ４１、ＨＩＶ ｇｐ１２０、ＨＩＶ ｇｐ１６０、ＨＩＶ Ｐ１７／２４、ＨＩＶ Ｐ２４、ＨＩＶ Ｐ５５ ＧＡＧ、ＨＩＶ Ｐ６６ ＰＯＬ、ＨＩＶ ＴＡＴ、ＨＩＶ ＧＰ３６などのｇａｇ、ｐｏｌ及びｅｎｖ遺伝子の遺伝子産物、Ｎｅｆタンパク質並びに逆転写酵素を含み；インフルエンザ抗原は、赤血球凝集素及びノイラミニダーゼを含み；日本脳炎ウイルス抗原は、タンパク質Ｅ、Ｍ−Ｅ、Ｍ−Ｅ−ＮＳ１、ＮＳ１、ＮＳ１−ＮＳ２Ａ及び８０％Ｅを含み；麻疹抗原は、麻疹ウイルス融合タンパク質を含み；狂犬病抗原は、狂犬病糖タンパク質及び狂犬病核タンパク質を含み；呼吸器合胞体ウイルス抗原は、ＲＳＶ融合タンパク質及びＭ２タンパク質を含み；ロタウイルス抗原はＶＰ７ｓｃを含み；風疹抗原はタンパク質Ｅ１及びＥ２を含み；並びに水痘帯状疱疹ウイルス抗原はｇｐＩ及びｇｐＩＩを含む。
追加の特定の例示的ウイルス抗原配列は、
Figure 2021523110
 を含む。ウイルス抗原の追加の例についてはＦｕｎｄａｍｅｎｔａｌ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、第２版、Ｆｉｅｌｄｓ、Ｂ．Ｎ．及びＫｎｉｐｅ、Ｄ．Ｍ．編（Ｒａｖｅｎ Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、１９９１年）を参照されたい。
本明細書で開示される特定の実施形態において、改変された免疫系細胞はウイルス感染細胞を認識し破壊する。代わりに、又はさらに、改変単球／マクロファージは、ウイルス粒子による細胞感染の前に末梢組織又は血流（細胞外）からウイルスを除去することができる。Ｂ細胞を改変すれば広域中和抗体（ｂｒｏａｄｌｙ ｎｅｕｔｒａｌｉｚｉｎｇ ａｎｔｉｂｏｄｙ）を一過性に発現することができる。一例では、Ｂ細胞を改変すれば、広域中和抗ＨＩＶ抗体を一過性に発現することができる。
特定の実施形態において、ターゲティング剤は、ＨＩＶ ｇａｇタンパク質、ｇｐ１２０又はＢ型肝炎外被タンパク質（Ｓドメイン）を標的にする。
特定の実施形態において、マーカーは細菌感染に関連する細胞により発現される。例示的細菌は、アンスラックス（ａｎｔｈｒａｘ）；グラム陰性バチルス（ｇｒａｍ−ｎｅｇａｔｉｖｅ ｂａｃｉｌｌｉ）、クラミジア（ｃｈｌａｍｙｄｉａ）、ジフテリア（ｄｉｐｈｔｈｅｒｉａ）、ヘモフィリス・インフルエンザ（ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａ）、ヘリコバクター・ピロリ（Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ ｐｙｌｏｒｉ）、マラリア（ｍａｌａｒｉａ）、マイコバクテリウム・ツベルクローシス（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）、ペルツシス・トキシン（ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ ｔｏｘｉｎ）、ニューモコッカス（ｐｎｅｕｍｏｃｏｃｃｕｓ）、リケッチア（ｒｉｃｋｅｔｔｓｉａｅ）、スタフィロコッカス（ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）、ストレプトコッカス（ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）及びテタナス（ｔｅｔａｎｕｓ）を含む。
細菌抗原マーカーの特定の例として、アンスラックス抗原は、アンスラックス防御抗原を含み；グラム陰性バチルス抗原はリポ多糖を含み；ヘモフィリス・インフルエンザ抗原は莢膜多糖を含み；ジフテリア抗原はジフテリア毒素を含み；マイコバクテリウム・ツベルクローシス抗原は、ミコール酸、熱ショックタンパク質６５（ＨＳＰ６５）、３０ｋＤａ主要分泌タンパク質及び抗原８５Ａを含み；ペルツシス・トキシン抗原は、赤血球凝集素、パータクチン、ＦＩＭ２、ＦＩＭ３及びアデニル酸シクラーゼを含み；ニューモコッカス抗原は、ニューモリシン及び肺炎球菌莢膜多糖を含み；リケッチア抗原はｒｏｍｐＡを含み；ストレプトコッカス抗原はＭタンパク質を含み；並びにテタナス抗原はテタナス毒素を含む。
単球／マクロファージは、治療目的が細菌感染の処置である場合は、改変するのが特に有用である。１つの特定の実施形態において、単球／マクロファージは、スタフィロコッカス・アウレウス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ）の表面成分リポテイコ酸又はスタフィロコッカス・アウレウスクランピング因子Ａ（ＣｌｆＡ）を認識するリガンドで改変することができる。
特定の実施形態において、免疫細胞は、多剤耐性「スーパバグ」を標的にするように改変される。スーパバグの例は、エンテロコッカス・フェシウム（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃｉｕｍ）、クロストリジウム・ディフィシル（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）、アシネトバクター・バウマンニ（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｂａｕｍａｎｎｉｉ）、シュードモナス・エルジノーサ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）及びエンテロバクテリアセエ（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ）（例えば、エシェリキア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）、クレブシエラ・ニューモニエ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）、エンテロバクター属種（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ ｓｐｐ．））を含む。
特定の実施形態において、マーカーは真菌感染と関連のある細胞により発現される。例示的真菌は、カンジダ菌（ｃａｎｄｉｄａ）、コクシジオイデス（ｃｏｃｃｉｄｉｏｄｅｓ）、クリプトコッカス（ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）、ヒストプラズマ（ｈｉｓｔｏｐｌａｓｍａ）、リーシュマニア（ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ）、プラスモジウム（ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ）、プロトゾア（ｐｒｏｔｏｚｏａ）、パラサイト（ｐａｒａｓｉｔｅｓ）、シストソーマ（ｓｃｈｉｓｔｏｓｏｍａｅ）、チネア（ｔｉｎｅａ）、トキソプラズマ（ｔｏｘｏｐｌａｓｍａ）及びトリパノソーマ・クルージ（ｔｒｙｐａｎｏｓｏｍａ ｃｒｕｚｉ）を含む。
真菌抗原のさらなる特定の例として、コクシジオイデス抗原は小球抗原を含み；クリプトコッカス抗原は莢膜多糖を含み；ヒストプラズマ抗原は熱ショックタンパク質６０（ＨＳＰ６０）を含み；リーシュマニア抗原は、ｇｐ６３及びリポホスホグリカンを含み；プラスモジウム・ファルシパルム（ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ）抗原は、メロゾイト（ｍｅｒｏｚｏｉｔｅ）表面抗原、スポロゾイト（ｓｐｏｒｏｚｏｉｔｅ）表面抗原、スポロゾイト周囲抗原、生殖母細胞／配偶子表面抗原、プロトゾア抗原及びブラッドステージ抗原（ｂｌｏｏｄ−ｓｔａｇｅ ａｎｔｉｇｅｎ）ｐｆ１５５／ＲＥＳＡを含む他のパラサイト抗原を含み；シストソーマ抗原はグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ及びパラミオシンを含み；チネア真菌抗原はトリコフィチンを含み；トキソプラズマ抗原はＳＡＧ−１及びｐ３０を含み；並びにトリパノソーマ・クルージ抗原は７５〜７７ｋＤａ抗原及び５６ｋＤａ抗原を含む。
単球／マクロファージは、治療目的が真菌感染の処置である場合は、改変するのが特に有用である。
特定の実施形態において、マーカーは自己免疫又はアレルギー状態に関連する細胞により発現される。例示的自己免疫状態は、急性壊死性出血性脳疾患、アレルギー性喘息、円形脱毛症、貧血症、アフタ性潰瘍、関節炎（関節リウマチ、若年性関節リウマチ、骨関節炎、乾癬性関節炎を含む）、喘息、自己免疫性甲状腺炎、結膜炎、クローン病、皮膚エリテマトーデス、皮膚炎（アトピー性皮膚炎及び湿疹性皮膚炎を含む）、糖尿病、真性糖尿病、らい性結節性紅斑、角結膜炎、多発性硬化症、重症筋無力症、乾癬、強皮症、シェーグレン症候群に続発する乾性角結膜炎を含むシェーグレン症候群、スティーブンスジョンソン症候群、全身性エリテマトーデス、潰瘍性大腸炎、膣炎及びウェゲナー肉芽腫症を含む。
自己免疫抗原の例は、グルタミン酸デカルボキシラーゼ６５（ＧＡＤ６５）、天然ＤＮＡ、ミエリン塩基性タンパク質、ミエリンプロテオリビドタンパク質、アセチルコリン受容体成分、サイログロブリン及び甲状腺刺激ホルモン（ＴＳＨ）受容体を含む。アレルギー抗原の例は、スギ花粉抗原、ブタクサ花粉抗原、ドクムギ花粉抗原などの花粉抗原、動物由来抗原（例えば、イエダニ抗原及びネコ抗原（ｆｅｌｉｎｅ ａｎｔｉｇｅｎ））、組織適合性抗原並びにペニシリン及び他の治療薬を含む。
エフェクタードメイン エフェクタードメインは機能的シグナルを細胞に送ることができる。特定の実施形態において、エフェクタードメインは、細胞応答を直接的に促進する又は細胞応答を直接促進する１つ以上の他のタンパク質と会合することにより間接的に促進する。エフェクタードメインは、標的化細胞上で発現されるマーカーに結合するとＣＡＲ、ＴＣＲ又はＣＡＲ／ＴＣＲハイブリッドを発現する形質導入されたリンパ球の少なくとも１つの機能の活性化を与えることができる。リンパ球の活性化は、増殖、分化、活性化又は他のエフェクター機能のうちの１つ以上を含むことができる。特定の実施形態において、送達されるポリヌクレオチドはエフェクタードメインをコードする。
エフェクタードメインは、１つ、２つ、３つ以上の受容体シグナル伝達ドメイン、細胞内シグナル伝達ドメイン、同時刺激ドメイン又はこれらの組合せを含んでよい。種々のシグナル伝達分子（例えば、シグナル伝達受容体）のいずれか由来のいかなる細胞内エフェクタードメイン、同時刺激ドメイン又は両方でも、本開示のＣＡＲ、ＴＣＲ又はＣＡＲ／ＴＣＲハイブリッドにおいて使用しうる。
例示的エフェクタードメインは、４−１ＢＢ、ＣＤ３ε、ＣＤ３δ、ＣＤ３ζ、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ７９Ａ、ＣＤ７９Ｂ、ＣＡＲＤ１１、ＤＡＰ１０、ＦｃＲα、ＦｃＲβ、ＦｃＲγ、Ｆｙｎ、ＨＶＥＭ、ＩＣＯＳ、Ｌｃｋ、ＬＡＧ３、ＬＡＴ、ＬＲＰ、ＮＯＴＣＨ１、Ｗｎｔ、ＮＫＧ２Ｄ、ＯＸ４０、ＲＯＲ２、Ｒｙｋ、ＳＬＡＭＦ１、Ｓｌｐ７６、ｐＴα、ＴＣＲα、ＴＣＲβ、ＴＲＩＭ、Ｚａｐ７０、ＰＴＣＨ２又はこれらの任意の組合せ由来のドメインを含む。
Ｔ細胞活性化は、２つのはっきり異なるクラスの細胞質シグナル伝達配列：抗原依存性一次活性化を開始してＴＣＲ様シグナルを与えるクラス（一次細胞質シグナル伝達配列）及び抗原非依存的様式で作用して二次又は同時刺激シグナルを与えるクラス（二次細胞質シグナル伝達配列）により媒介されると言える。刺激性様式で作用する一次細胞質シグナル伝達配列は、受容体チロシンベースの活性化モチーフ又はｉＴＡＭとして知られるシグナル伝達モチーフを含有してよい。一次細胞質シグナル伝達配列を含有するｉＴＡＭの例は、ＣＤ３ゼータ、ＦｅＲガンマ、ＣＤ３ガンマ、ＣＤ３デルタ、ＣＤ３エプシロン、ＣＤ５、ＣＤ２２、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ及びＣＤ６６ｄ由来の配列を含む。
特定の実施形態において、エフェクタードメインは、細胞質シグナル伝達タンパク質と会合する細胞質部分を含み、細胞質シグナル伝達タンパク質は、リンパ球受容体若しくはこのシグナル伝達ドメイン、複数のＩＴＡＭを含むタンパク質、同時刺激因子又はこれらの任意の組合せである。
細胞内シグナル伝達ドメインの例は、ＣＤ３ゼータ鎖及び／又は協調して作用しＣＡＲ結合に続いてシグナル伝達を開始する共受容体の細胞質配列、並びにこれらの配列の任意の誘導体又は変異体及び同じ機能的能力を有する任意の合成配列を含む。特定の実施形態において、ＣＡＲの細胞内シグナル伝達ドメインは、任意の他の所望の細胞質ドメイン（複数可）と組み合わされた細胞内シグナル伝達ドメインを含むように設計することができる。例えば、ＣＡＲの細胞内シグナル伝達ドメインは、細胞内シグナル伝達ドメイン及び同時刺激シグナル伝達領域を含むことができる。同時刺激シグナル伝達領域とは、ＣＡＲのうちの同時刺激分子の細胞内ドメインを含む部分のことである。同時刺激分子は、マーカーに対するリンパ球の応答に必要である発現されたマーカーリガンド以外の細胞表面分子である。そのような分子の例は、ＣＤ２７、ＣＤ２８、４−１ＢＢ（ＣＤ １３７）、ＯＸ４０、ＣＤ３０、ＣＤ４０、リンパ球機能関連抗原−１（ＬＦＡ−１）、ＣＤ２、ＣＤ７、ＬＩＧＨＴ、ＮＫＧ２Ｃ、Ｂ７−Ｈ３及びＣＤ８３に特異的に結合するリガンドを含む。
スペーサー領域 標的認識を最適化するために、標的上の個々のマーカーについてスペーサー領域をカスタマイズすることができる。特定の実施形態において、スペーサー長は、マーカーエピトープの位置、エピトープに対する抗体の親和性並びに／又はマーカー認識に応答して、ＣＡＲ、ＴＣＲ若しくはＣＡＲ／ＴＣＲハイブリッドを発現するリンパ球がインビトロ及び／若しくはインビボで増殖する能力に基づいて選択することができる。
典型的には、スペーサー領域は、ＣＡＲ、ＴＣＲ又はＣＡＲ／ＴＣＲハイブリッドの結合ドメインと膜貫通ドメインの間で見出される。スペーサー領域は、結合ドメインの柔軟性を与えることができ、改変細胞において高発現レベルを可能にする。特定の実施形態において、スペーサー領域は、少なくとも１０〜２５０アミノ酸、少なくとも１０〜２００アミノ酸、少なくとも１０〜１５０アミノ酸、少なくとも１０〜１００アミノ酸、少なくとも１０〜５０アミノ酸又は少なくとも１０〜２５アミノ酸を持つことができ、収載された範囲のいずれかの終点間のいかなる整数も含む。特定の実施形態において、スペーサー領域は２５０アミノ酸以下；２００アミノ酸以下；１５０アミノ酸以下；１００アミノ酸以下；５０アミノ酸以下；４０アミノ酸以下；３０アミノ酸以下；２０アミノ酸以下；又は１０アミノ酸以下を有する。
特定の実施形態において、スペーサー領域は、免疫グロブリン様分子のヒンジ領域、例えば、ヒトＩｇＧ１、ヒトＩｇＧ２、ヒトＩｇＧ３又はヒトＩｇＧ４由来のヒンジ領域のすべて又は一部に由来することができる。ヒンジ領域は、二量体化などの望ましくない構造上の相互作用を避けるように改変することができる。特定の実施形態において、ヒンジ領域のすべて又は一部は、免疫グロブリンの定常領域の１つ以上のドメインと組み合わせることができる。例えば、ヒンジ領域の一部は、ＣＨ２又はＣＨ３ドメイン又はこれらの変異体のすべて又は一部と組み合わせることができる。
膜貫通ドメイン 本明細書に開示されるＣＡＲ、ＴＣＲ又はＣＡＲ／ＴＣＲハイブリッドは膜貫通ドメインも含むことができる。特定の実施形態において、ナノ粒子内において投与されるＣＡＲ、ＴＣＲ又はＣＡＲ／ＴＣＲハイブリッドポリヌクレオチドは、膜貫通ドメインをコードする。膜貫通ドメインは、リンパ球膜でのＣＡＲ、ＴＣＲ又はＣＡＲ／ＴＣＲハイブリッドの固定を提供する。膜貫通ドメインは、天然の又は合成の供給源に由来してもよい。供給源が天然である場合、ドメインはいかなる膜結合又は膜貫通タンパク質に由来してもよい。膜貫通領域は、Ｔ細胞受容体、ＣＤ２８、ＣＤ３、ＣＤ４５、ＣＤ４、ＣＤＳ、ＣＤ９、ＣＤＩ６、ＣＤ２２；ＣＤ３３、ＣＤ３７、ＣＤ６４、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤＩ３４、ＣＤＩ３７及びＣＤ１５４のアルファ、ベータ又はゼータ鎖の少なくとも膜貫通領域（複数可）を含む。特定の実施形態において、合成又は変異膜貫通ドメインは、ロイシン及ぶバリンなどの主に疎水性の残基を含む。
異なるリガンド結合ドメイン、異なるスペーサー領域長、異なる細胞内結合ドメイン及び／又は異なる膜貫通ドメインをコードする異なる潜在的なＣＡＲ、ＴＣＲ又はＣＡＲ／ＴＣＲ核酸は、インビボで（動物モデルにおいて）及び／又はインビトロで試験すれば、他のＣＡＲ、ＴＣＲ又はハイブリッドＣＡＲ／ＴＣＲよりも改善された機能を持つＣＡＲ、ＴＣＲ又はハイブリッドＣＡＲ／ＴＣＲを同定することができる。
例示的ＣＡＲ 特定の実施形態において、ＣＡＲはＣＤ２８及びＣＤ３ζ細胞質シグナル伝達ドメインと組み合わされたＰＳＭＡ（Ｊ５９１）の細胞外ドメインに特異的な一本鎖抗体（ｓｃＦｖ）で構成されたＰ２８ｚ融合受容体を含む。特定の実施形態において、ＣＡＲはＰ２８ｚ ＣＡＲを含む。本明細書に記載されるＰ２８ｚ ＣＡＲの特定の例は、マウス成分を含む。アミノ酸１〜７９７位は抗ＰＳＭＡ ｓｃＦｖ（Ｊ５９２）を含み、７９７〜１４７７位は、マウスＣＤ８膜貫通ドメイン、マウスＣＤ２８シグナル伝達ドメイン及びマウスＣＤ３ゼータシグナル伝達ドメインを含む。いかなるＰ２８ｚドメインも最適化されたドメインで個々に置き換えることができる。特定の実施形態において、本明細書に記載されるＰ２８ｚ ＣＡＲの７９７〜１４７７位内の膜貫通ドメイン及びシグナル伝達ドメインは、特にヒト又は他の動物での使用のために最適化されたドメインで置き換えることができる。特定の実施形態において、結合ドメインのいかなる全体又は部分も、エフェクタードメインのいかなる全体又は部分も、スペーサードメインのいかなる全体又は部分も及び／又は膜貫通ドメインのいかなる全体又は部分も、ヒト又は他の動物での使用のために最適化することができる。特定の実施形態において、Ｐ２８ｚ ＣＡＲはヒトでの使用のために最適化される。ヒト用に最適化される場合、Ｐ２８ｚ ＣＡＲは、ヒトでは免疫原性が低下し、非ヒト抗体と比べて非免疫原性エピトープの数が少なくなることができる。
特定の実施形態において、ＲＯＲ１特異的及びＣＤ１９特異的ＣＡＲは、２Ａ２、Ｒ１２及びＲ１１ ｍＡｂ（ＲＯＲ１）並びにＦＭＣ６３ ｍＡｂ（ＣＤ１９）のＶＬ及びＶＨ鎖セグメントを使用して構築することができる。Ｒ１１及びＲ１２についての可変領域配列は、Ｙａｎｇら、Ｐｌｏｓ Ｏｎｅ ６（６）：ｅ２１０１８、２０１１年６月１５日に提供されている。それぞれのｓｃＦｖは、‘ヒンジ−ＣＨ２−ＣＨ３’（２２９ ＡＡ）、‘ヒンジ−ＣＨ３’（１１９ ＡＡ）又は‘ヒンジ’のみ（１２ ＡＡ）配列のいずれかを含むＩｇＧ４−Ｆｃ（ＵｎｉＰｒｏｔデータベース：Ｐ０１８６１）由来のスペーサードメインに（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）３タンパク質により連結することができる。すべてのスペーサーは、天然のＩｇＧ４−Ｆｃタンパク質の１０８位に位置する「ヒンジ」ドメイン内にＳ→Ｐ置換を含有することができ、ヒトＣＤ２８の２７ＡＡ膜貫通ドメイン（例示的完全長ＣＤ２８については、ＵｎｉＰｒｏｔ：Ｐ１０７４７を参照されたい）に並びに、（ｉ）天然ＣＤ２８タンパク質の１８６〜１８７位に位置するＬＬ→ＧＧ置換のあるヒトＣＤ２８の４１ＡＡ細胞質ドメイン又は（ｉｉ）ヒト４−１ＢＢの４２ＡＡ細胞質ドメイン（ＵｎｉＰｒｏｔ：Ｑ０７０１１）のどちらかを含むエフェクタードメインシグナル伝達モジュールに連結することができ、これらのドメインのそれぞれはヒトＣＤ３ζのアイソフォーム３の１１２ＡＡ細胞質ドメイン（ＵｎｉＰｒｏｔ：Ｐ２０９６３）に連結することができる。構築物は、キメラ受容体の下流にＴ２Ａリボソームスキップエレメント及びｔＥＧＦＲ配列をコードする。ｔＥＧＦＲは、ＳＴＲＥＰ ＴＡＧ（登録商標）ＩＩ（ＩＢＡ Ｇｍｂｈ Ｌｔｄ．、Ｇｏｅｔｔｉｎｇｅｎ、ＤＥ）、Ｍｙｃタグ、Ｖ５タグ、ＦＬＡＧ（登録商標）タグ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ Ｃｏｒｐ．、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）、Ｈｉｓタグ、又は本明細書で開示される他のペプチド若しくは分子などの配列に結合するタグカセットで置き換える又は補充することができる。それぞれのトランス遺伝子をコードするコドン最適化遺伝子配列を合成して（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、Ｎｈｅｌ及びＮｏｔ１制限部位を使用してｅｐＨＩＶ７レンチウイルスベクター中にクローニングすることができる。ｅｐＨＩＶ７レンチウイルスベクターは、ｐＨＩＶ７のサイトメガロウイルスプロモーターをＥＦ−１プロモーターで置き換えることによりｐＨＩＶ７ベクターに由来することができる。抗ＲＯＲ１キメラ受容体、抗ＣＤ１９キメラ受容体、ｔＥＧＦＲ又はタグカセットコードレンチウイルスは、パッケージングベクターｐＣＨＧＰ−２、ｐＣＭＶ−Ｒｅｖ２及びｐＣＭＶ−Ｇ、並びにＣＡＬＰＨＯＳ（商標）トランスフェクション試薬（Ｔａｋａｒａ Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）を使用して２９３Ｔ細胞において産生することができる。
ＨＥＲ２特異的キメラ受容体は、ＨＥＲ２上の膜近位エピトープを認識するＨＥＲ２特異的ｍＡｂのＶＬ及びＶＨ鎖セグメントを使用して構築することができ、ｓｃＦｖは、ＩｇＧ４ヒンジ／ＣＨ２／ＣＨ３、ＩｇＧ４ヒンジ／ＣＨ３及びＩｇＧ４ヒンジのみ細胞外スペーサードメインに並びにＣＤ２８膜貫通ドメイン、４−１ＢＢ及びＣＤ３ζシグナル伝達ドメインに連結させることができる。
抗ＣＤ１９キメラ受容体は、ＣＤ１９特異的ｍＡｂ ＦＭＣ６３の配列（ｓｃＦｖ：ＶＬ−ＶＨ）に対応する一本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）、「ヒンジ−ＣＨ２−ＣＨ３」ドメイン（２２９ＡＡ、長スペーサー）又は「ヒンジ」ドメインのみ（１２ＡＡ、短スペーサー）のどちらかを含むＩｇＧ４−Ｆｃに由来するスペーサー及び膜近位ＣＤ２８又は４−１ＢＢ同時刺激ドメインのあるＣＤ３ζのシグナル伝達モジュールを、単独で又は縦一列で含むことができる。
（ｂ）マクロファージ活性化因子。「マクロファージ活性化（ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ）」とは、マクロファージの表現型又は機能を（ｉ）不活性化状態（ｉｎａｃｔｉｖａｔｅｄ ｓｔａｔｅ）から活性化状態（ａｃｔｉｖａｔｅｄ ｓｔａｔｅ）へ；（ｉｉ）非活性化状態から活性化状態へ；（ｉｉｉ）活性化状態からさらに活性化された状態へ；又は（ｉｖ）不活性化状態から非活性化状態へ変更するプロセスのことである。不活性化状態とは、腫瘍成長及び転移を促進する免疫抑制された表現型を意味する。非活性化状態とは、マクロファージが腫瘍成長又は転移を促進せず、腫瘍細胞の殺滅を促進もしないことを意味する。活性化状態は、マクロファージが殺腫瘍活性を示すことを意味する。特定の実施形態において、活性化状態により、下でより完全に説明されるＭ１表現型が生じる。特定の実施形態において、不活性化状態によりＭ２表現型が生じる。「マクロファージ活性化」とは、マクロファージの表現型又は機能を（ｉ）活性化状態から活性化が低い状態へ；（ｉｉ）活性化状態から非活性化状態へ；（ｉｉｉ）活性化状態から不活性化状態へ；又は（ｉｖ）非活性化状態から不活性化状態へ変更する過程のことである。特定の実施形態において、不活性化状態はＭ２である。特定の実施形態において、活性化状態はＭ１である。
マクロファージ刺激ナノ粒子組成物を投与すれば、腫瘍での免疫抑制状態を変更することができ、これにより腫瘍は、本明細書に記載されるナノ粒子とそれによりコードされる治療タンパク質（複数可）とのコンパニオン処置に対してより感受性になる。
活性化又は不活性化表現型に向かうマクロファージの極性化は、マクロファージといくつかの異なる分子又は環境との相互作用から生じる。例えば、Ｍ１マクロファージ極性化は、トール様受容体（ＴＬＲ）リガンド（例えば、リポ多糖（ＬＰＳ）、ムラミルジペプチド、リポテイコ酸、イミキモド、ＣｐＧ）、ＩＦＮγ、ＴＮＦα、及びマクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）を含む刺激によりトリガーされる。Ｍ２極性化マクロファージは、極性化を惹起する刺激に応じて、サブセットに分割することができ：Ｍ２ａサブセットはＩＬ−４、ＩＬ−１３又は真菌及び蠕虫感染により誘発され；Ｍ２ｂはＩＬ−１受容体リガンド、免疫複合体及びＬＰＳにより誘発され；Ｍ２ｃはＩＬ−１０、ＴＧＦ−β及びグルココルチコイドにより誘発され；Ｍ２ｄはＩＬ−６及びアデノシンにより誘発される。Ｍ２マクロファージ極性化は、ＩＬ−２１、ＧＭ−ＣＳＦ、補体成分、及びアポトーシス細胞によりトリガーされる場合もある。マクロファージ極性化は、低酸素などの局所的微小環境状態によっても調節される。
前述の分子及び環境は、転写因子を含む異なる細胞内シグナル伝達経路をトリガーさせることによりマクロファージ極性化に影響を及ぼす。Ｍ１とＭ２極性化の両方に関与している転写因子は、ＩＲＦ、シグナル伝達兼転写活性化因子（ＳＴＡＴ）、ＳＯＣＳ３タンパク質、及び活性化Ｂ細胞の核内因子カッパ軽鎖エンハンサー（ＮＦκＢ）を含む。マイトジェン活性化プロテインキナーゼ（ＭＡＰＫ）も、マクロファージ機能をＭ１又はＭ２表現型の方に向けるのに役割を果たしている。
ＩＲＦ／ＳＴＡＴ経路は、上で考察したＩＦＮ及びＴＬＲシグナル伝達などの刺激により活性化されるが、マクロファージを、ＳＴＡＴ１を経てＭ１活性状態に極性化する。一方、ＩＬ−４及びＩＬ−１３などの刺激は、マクロファージを、ＳＴＡＴ６を経てＭ２活性状態の方にそらす（Ｓｉｃａ Ａ＆Ｂｒｏｎｔｅ Ｖ（２００７）Ｊ Ｃｌｉｎ Ｉｎｖｅｓｔ １１７：１１５５〜１１６６頁）。したがって、これらのシグナル伝達イベントは、Ｍ１マクロファージ極性化の場合、炎症性免疫応答及び殺腫瘍活性を促進する、又はＭ２マクロファージ極性化の場合、免疫抑制性腫瘍促進応答を促進する。
Ｍ１表現型の誘導に関係するいくつかの細胞内分子は、Ｇタンパク質共役型受容体、Ｐ２Ｙ（２）Ｒ、これはＮＯＳ２を経てＮＯを誘導するのに役割を果たし（Ｅｕｎ ＳＹら、（２０１４）Ｉｎｔ Ｉｍｍｕｎｏｐｈａｒｍａｃｏｌ １８：２７０〜２７６頁）；ＳＯＣＳ３、これはＮＦκＢ／ＰＩ−３キナーゼ経路を活性化してＮＯを生成し（Ａｒｎｏｌｄ ＣＥら、（２０１４）Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ １４１：９６〜１１０頁）；並びに成長及び分化因子アクチビンＡ、これはＭ１マーカーを促進しＩＬ−１０を下方調節する（Ｓｉｅｒｒａ−Ｆｉｌａｒｄｉ Ｅら、（２０１１）Ｂｌｏｏｄ １１７：５０９２〜５１０１頁）、を含む。
Ｍ１表現型の誘導に関与する他の細胞内分子はＩＲＦを含む。ＩＲＦは、ＩＦＮのウイルス媒介活性化、並びに細胞成長、分化、アポトーシス、及び免疫系活性の調節を含む、多様な役割を有する転写因子のグループである。ＩＲＦファミリーのメンバーは、トリプトファン（Ｗ）リピートを含有する保存されたＮ末端ＤＮＡ結合ドメインを特徴とする。
ＩＲＦ５は、ヘリックスターンヘリックスＤＮＡ結合モチーフを有しウイルス−及びＩＦＮ誘導シグナル伝達経路を媒介する転写因子である。ＩＲＦ５は、マクロファージが炎症を促進する又は阻害するかを制御する分子スイッチとして作用する。ＩＲＦ５は、Ｉ型ＩＦＮ遺伝子、ＴＮＦ、ＩＬ−６、ＩＬ−１２及びＩＬ−２を含む炎症性サイトカイン、及び腫瘍抑制因子、並びにＴｈ１及びＴｈ１７応答を活性化する。ＩＲＦ５は、染色体７ｑ３２に位置するヒトＩＲＦ５遺伝子（ＯＭＩＭ ＩＤ ６０７２１８）によりコードされている。ＩＲＦ５のいくつかのアイソフォーム／転写変異体が存在することが認識されている。特定の実施形態において、ヒトＩＲＦ５のアイソフォームは、アイソフォーム１（ＵｎｉＰｒｏｔ目録Ｑ１３５６８−１、配列番号２５）、アイソフォーム２（ＵｎｉＰｒｏｔ目録Ｑ１３５６８−２、配列番号２６）、アイソフォーム３（ＵｎｉＰｒｏｔ目録Ｑ１３５６８−３、配列番号２７）、アイソフォーム４（ＵｎｉＰｒｏｔ目録Ｑ１３５６８−４、配列番号２８）、アイソフォーム５（ＵｎｉＰｒｏｔ目録Ｑ１３５６８−５、配列番号２９）、アイソフォーム６（ＵｎｉＰｒｏｔ目録Ｑ１３５６８−６、配列番号３０）を含む。特定の実施形態において、ヒトＩＲＦ５のアイソフォームは、配列番号４７に示されるヌクレオチド配列によりコードされるアイソフォーム１、配列番号４８に示されるヌクレオチド配列によりコードされるアイソフォーム２、配列番号４９に示されるヌクレオチド配列によりコードされるアイソフォーム３、配列番号５０に示されるヌクレオチド配列によりコードされるアイソフォーム４、配列番号５１に示されるヌクレオチド配列によりコードされるアイソフォーム５及び配列番号５２に示されるヌクレオチド配列によりコードされるアイソフォーム６を含む。特定の実施形態において、マウスＩＲＦ５は配列番号３１に示されるアミノ酸配列を含む。特定の実施形態において、マウスＩＲＦ５は、配列番号５３に示されるヌクレオチド配列によりコードされる。Ｍ１マクロファージはＩＲＦ５を上方調節することが明らかにされている。
ＩＲＦ１及びＩＲＦ８も、ＩＦＮγなどの炎症誘発性シグナルによるマクロファージの活性化を含む、骨髄系細胞の発生及び機能に極めて重要な役割を果たす、Ｄｒｏｒ Ｎら、（２００７）Ｍｏｌ Ｉｍｍｕｎｏｌ．４４（４）：３３８〜３４６頁。特定の実施形態において、ヒトＩＲＦ１は、配列番号３２に示されるアミノ酸配列を含む。特定の実施形態において、ヒトＩＲＦ１は、配列番号５４に示されるヌクレオチド配列によりコードされる。特定の実施形態において、マウスＩＲＦ１は、配列番号３６に示されるアミノ酸配列を含む。特定の実施形態において、マウスＩＲＦ１は、配列番号５８に示されるヌクレオチド配列によりコードされる。特定の実施形態において、ヒトＩＲＦ８は、配列番号３５に示されるアミノ酸配列を含む。特定の実施形態において、ヒトＩＲＦ８は、配列番号５７に示されるヌクレオチド配列によりコードされる。特定の実施形態において、マウスＩＲＦ８は、配列番号４０に示されるアミノ酸配列を含む。特定の実施形態において、マウスＩＲＦ８は、配列番号６２に示されるヌクレオチド配列によりコードされる。
ＩＲＦ３はＩＲＦ１及びＩＲＦ２の相同体である。ＩＲＦ３は、ＮＥＳ、ＤＢＤ、Ｃ末端ＩＲＦ会合ドメイン及びいくつかの調節リン酸化部位を含む、いくつかの機能的ドメインを含有する。ＩＲＦ３は、セリン／スレオニンリン酸化すると、転写共役因子であるＣＲＥＢ結合タンパク質と複合体を形成する不活性細胞質形態で見出される。この複合体は核に移動し、ＩＦＮ−α及び−β、並びに他のインターフェロン誘導遺伝子の転写を活性化する。特定の実施形態において、ヒトＩＲＦ３のアイソフォームは、アイソフォーム１（ＵｎｉＰｒｏｔ受託Ｑ１４６５３−１）、アイソフォーム２（ＵｎｉＰｒｏｔ受託Ｑ１４６５３−２）、アイソフォーム３（ＵｎｉＰｒｏｔ受託Ｑ１４６５３−３）、アイソフォーム４（ＵｎｉＰｒｏｔ受託Ｑ１４６５３−４）、及びアイソフォーム５（ＵｎｉＰｒｏｔ受託Ｑ１４６５３−５）を含む。特定の実施形態において、ヒトＩＲＦ３アイソフォーム１は、配列番号３３に示されるアミノ酸配列を含む。特定の実施形態において、ヒトＩＲＦ３アイソフォーム１は、配列番号５５に示されるヌクレオチド配列によりコードされる。特定の実施形態において、マウスＩＲＦ３は、配列番号３７に示されるアミノ酸配列を含む。特定の実施形態において、マウスＩＲＦ３は、配列番号５９に示されるヌクレオチド配列によりコードされる。
ＩＲＦ７は、Ｉ型ＩＦＮ遺伝子の転写活性化において役割を果たすことが明らかにされている。特定の実施形態において、ヒトＩＲＦ７のアイソフォーム１は、アイソフォームＡ（ＵｎｉＰｒｏｔ受託Ｑ９２９８５−１）、アイソフォームＢ（ＵｎｉＰｒｏｔ受託Ｑ９２９８５−２）、アイソフォームＣ（ＵｎｉＰｒｏｔ受託Ｑ９２９８５−３）、及びアイソフォームＤ（ＵｎｉＰｒｏｔ受託Ｑ９２９８５−４）を含む。特定の実施形態において、ヒトＩＲＦ７アイソフォームＡは、配列番号３４に示されるアミノ酸配列を含む。特定の実施形態において、ヒトＩＲＦ７アイソフォームＡは、配列番号５６に示されるヌクレオチド配列によりコードされる。特定の実施形態において、マウスＩＲＦ７は、配列番号３８に示されるアミノ酸配列を含む。特定の実施形態において、マウスＩＲＦ７は、配列番号６０に示されるヌクレオチド配列によりコードされる。
ＩＲＦ活性化に寄与する１つ以上のＩＲＦ変異体も使用してよい。例えば、アミノ酸残基Ｓ４２５、Ｓ４２７、Ｓ４３０、Ｓ４３６を、アスパラギン酸残基などのリン酸化を模倣する残基で置換するＩＲＦ５（アイソフォーム４、配列番号２８）のヒト変異体３／変異体４のリン酸化模倣突然変異体（Ｃｈｅｎ Ｗら、（２００８）Ｎａｔ Ｓｔｒｕｃｔ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ．１５（１１）：１２１３〜１２２０頁）；アミノ酸残基Ｔ１０、Ｓ１５８、Ｓ３０９、Ｓ３１７、Ｓ４５１及び／又はＳ４６２を、アスパラギン酸残基などのリン酸化を模倣する残基で置換するＩＲＦ５（アイソフォーム２、配列番号２６）のヒト変異体５のリン酸化模倣突然変異体（Ｃｈａｎｇ Ｆｏｒｅｍａｎ Ｈ−Ｃら、下記に）；ＩＲＦ５の構成的核蓄積のための、ヒトＩＲＦ５アイソフォームａ（変異体１、アイソフォーム３、配列番号２７）及びアイソフォームｂ（変異体２、アイソフォーム１、配列番号２５）残基Ｓ１５６、Ｓ１５８及びＴ１６０からアスパラギン酸残基などのリン酸化を模倣する残基への突然変異（Ｌｉｎ Ｒら、（２００５）Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２８０（４）：３０８８〜３０９５頁）；並びにＩＲＦ３のアミノ酸残基Ｓ３９６をアスパラギン酸などのリン酸化を模倣する残基で置換するＩＲＦ３リン酸化模倣突然変異体（Ｃｈｅｎ Ｗら、下記に）。特定の実施形態において、マウスＩＲＦ７／ＩＲＦ３の融合タンパク質は、ＩＲＦ３アソシエーションドメイン（配列番号３９）の４つのセリン及び１つのスレオニン残基にＡｓｐ（Ｄ）突然変異を含み、融合タンパク質の構成的活性化及び転位を与える（Ｌｉｎ Ｒら、（１９９８）上記；Ｌｉｎら、（２０００）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ａｎｄ Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ２０：６３４２〜６３５３頁）。特定の実施形態において、ＩＲＦ３アソシエーションドメインの４つのセリン及び１つのスレオニン残基にＤ突然変異を含むマウスＩＲＦ７／ＩＲＦ３の融合タンパク質は、配列番号６１に示されるヌクレオチド配列によりコードされる。特定の実施形態において、マウスＩＲＦ８突然変異体は、アミノ酸残基３１０のリジン（Ｋ）のアルギニン（Ｒ）による置換を含む（配列番号４１）。特定の実施形態において、アミノ酸残基３１０のＫのＲによる置換を含むマウスＩＲＦ８突然変異体は、配列番号６３に示されるヌクレオチド配列によりコードされる。主にＫ３１０でＩＲＦ８に結合している低分子ユビキチン様修飾因子（ＳＵＭＯ）は、ＩＲＦ８応答性遺伝子の活性化を阻害する。セントリン特異的プロテアーゼ１（ＳＥＮＰ１）はＳＵＭＯ２／３を標的にする。ＳＥＮＰ１の活性は、ＩＲＦ８（及び他のタンパク質）を「脱ＳＵＭＯ化し」、ＩＲＦ８にＭ１マクロファージ分化の抑制因子から活性化因子に（直接的に及びトランスアクチベーション活性を通じて）進ませる。Ｋ３１０残基の突然変異によりＳＵＭＯがＩＲＦ８に結合するのを妨げると、ＩＲＦ８特異的遺伝子転写が２〜５倍増加する（Ｃｈａｎｇ Ｔ−Ｈら、（２０１２）上記参照）。
本開示の特定の実施形態は、操作されたＩＲＦ転写因子を含む。特定の実施形態において、操作されたＩＲＦ転写因子は、機能する自己抑制的ドメインを欠き、したがって、フィードバック不活性化に非感受性であるＩＲＦを含む（Ｔｈｏｍｐｓｏｎら、（２０１８）Ｆｒｏｎｔ Ｉｍｍｕｎｏｌ ９：２６２２頁）。例えば、活性の増加が２〜３倍であるヒトＩＲＦ５は、ヒトＩＲＦ５タンパク質のアミノ酸４８９〜５３９を欠失させることにより得ることができる（Ｂａｒｎｅｓら、（２００２）Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ ２２：５７２１〜５７４０頁）。特定の実施形態において、Ｍ２表現型を促進する転写因子である、ＩＲＦ４の自己抑制的ドメインを欠失させる又は突然変異させると、自己免疫疾患を処置するという文脈においてさらに活性なＩＲＦ４を作成することができる。特定の実施形態において、ＩＲＦの自己抑制的ドメインは、ＩＲＦタンパク質のカルボキシ末端で見出せる。特定の実施形態において、操作されたＩＲＦ転写因子は、核においてＩＲＦを捕捉し、したがって、転写を増強する１つ以上の機能する核外移行シグナル（ＮＥＳ）を欠くＩＲＦを含む。例えば、ヒトＩＲＦ５の核集積は、２つのロイシン残基をアラニンで置き換える（Ｌ１５７Ａ／Ｌ１５９Ａ）ことによってヒトＩＲＦ５のＮＥＳを突然変異することにより達成可能である（Ｌｉｎら、（２０００）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ａｎｄ Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ２０：６３４２〜６３５３頁）。特定の実施形態において、操作されたＩＲＦ転写因子は、１つ以上のＩＲＦの融合体、１つ以上のＩＲＦの断片の融合体、及び突然変異したＩＲＦの融合体を含む。
ＮＦκＢも、マクロファージＭ１活性化に関係する重要な転写因子である。ＮＦκＢは、ＴＮＦα、ＩＬ１Ｂ、シクロオキシゲナーゼ２（ＣＯＸ−２）、ＩＬ−６、及びＩＬ１２ｐ４０を含む多数の炎症性遺伝子の発現を調節する。ＮＦκＢ活性は、カッパＢキナーゼ（ＩＫＫ）三量体複合体（２つのキナーゼ、ＩＫＫα、ＩＫＫβ、及び調節タンパク質、ＩＫＫγ）の阻害因子の活性化を経て調節される。上流シグナルがＩＫＫ複合体で収束すると、これらのシグナルは先ずリン酸化を経てＩＫＫβキナーゼを活性化し、活性化されたＩＫＫβはカッパＢの阻害因子（Ｉ−κＢ）である、阻害性分子をさらにリン酸化する。これにより、Ｉ−κＢがプロテアソーム分解され、ＮＦκＢ／Ｉ−κＢ複合体からＮＦκＢ ｐ６５／ｐ５０ヘテロ二量体が放出される。次に、ＮＦκＢ ｐ６５／ｐ５０ヘテロ二量体は核に移動されて、炎症性遺伝子のプロモーターに結合する。
ＩＫＫβは、ＮＦκＢ並びにＩＲＦ５などの他の転写因子についての活性化キナーゼである。ＩＫＫβは、ＦＯＸＯ３、ＮＣＯＡ３、ＢＣＬ１０、ＩＲＳ１、ＮＥＭＯ／ＩＫＢＫＧ、ＮＦκＢサブユニットＲＥＬＡ及びＮＦＫＢ１、並びにＩＫＫ関連キナーゼＴＢＫ１及びＩＫＢＫＥを含む他のいくつかのシグナル伝達経路成分を同様にリン酸化する。特定の実施形態において、ヒトＩＫＫβのアイソフォームは、アイソフォーム１（ＵｎｉＰｒｏｔ目録Ｏ１４９２０−１、配列番号４２）、アイソフォーム２（ＵｎｉＰｒｏｔ目録Ｏ１４９２０−２、配列番号４３）、アイソフォーム３（ＵｎｉＰｒｏｔ目録Ｏ１４９２０−３、配列番号４４）及びアイソフォーム４（ＵｎｉＰｒｏｔ目録Ｏ１４９２０−４、配列番号４５）を含む。特定の実施形態において、ヒトＩＫＫβのアイソフォームは、配列番号６４に示されるヌクレオチド配列によりコードされるアイソフォーム１、配列番号６５に示されるヌクレオチド配列によりコードされるアイソフォーム２、配列番号６６に示されるヌクレオチド配列によりコードされるアイソフォーム３及び配列番号６７に示されるヌクレオチド配列によりコードされるアイソフォーム４を含む。特定の実施形態において、マウスＩＫＫβは、配列番号４６に示されるアミノ酸配列を含む。特定の実施形態において、マウスＩＫＫβは、配列番号６８に示されるヌクレオチド配列によりコードされる。
本開示は、ＩＲＦを活性化して、腫瘍殺滅のための活性化状態へのＴＡＭ再プログラミングをもたらすことができる１種以上の分子と一緒のＩＲＦ転写因子の共発現を提供する。特定の実施形態において、共発現戦略は、ＩＲＦ５とＩＫＫβの共発現；ＩＲＦ５とＴＡＮＫ結合キナーゼ１（ＴＢＫ−１）、ＴＮＦ受容体会合因子６（ＴＲＡＦ６）アダプター、受容体相互作用タンパク質２（ＲＩＰ２）キナーゼ、及び／又はＮＦκＢキナーゼε（ＩＫＫε）の共発現（Ｃｈａｎｇ Ｆｏｒｅｍａｎ Ｈ−Ｃら、（２０１２）ＰＬｏＳ Ｏｎｅ ７（３）：ｅ３３０９８）；ＩＲＦ５とタンパク質キナーゼＤＮＡ−ＰＫの共発現（Ｒｙｚｈａｋｏｖ Ｇら、（２０１５）Ｊ ｏｆ Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ＆Ｃｙｔｏｋｉｎｅ Ｒｅｓ ３５（２）：７１〜７８頁）；ＩＲＦ５とタンパク質キナーゼチロシンキナーゼＢＣＲ−ＡＢＬの共発現（Ｍａｓｓｉｍｏ Ｍら、（２０１４）Ｃａｒｃｉｎｏｇｅｎｅｓｉｓ ３５（５）：１１３２〜１１４３頁）；並びにＩＲＦ５又はＩＲＦ８とＣＯＰ９シグナロソームの１つ以上の成分の共発現（Ｋｏｒｃｚｅｎｉｅｗｓｋａ Ｊら、（２０１３）Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ ３３（６）：１１２４〜１１３８頁；Ｃｏｈｅｎ Ｈら、（２０００）Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２７５（５０）：３９０８１〜３９０８９頁）を含む。
示されるように、低酸素も、低酸素誘導性因子ＨＩＦ−１α及びＨＩＦ−２αを通じてマクロファージ極性化に影響を及ぼす。ＨＩＦ−１αは、ＮＯＳ２発現を調節しＭ１表現型の出現を支援し、ＨＩＦ−２αはＡｒｇ１発現を調節してＭ２表現型の出現を支援する（Ｔａｋｅｄａ Ｎら、（２０１０）Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ ２４：４９１〜５０１頁）。
Figure 2021523110
特定の実施形態において、ＩＲＦをコードするヌクレオチドは、他のＩＲＦをコードする１つ以上の追加のヌクレオチドと組み合わせて使用される。特定の実施形態において、ＩＲＦをコードするヌクレオチドは、他のＩＲＦをコードする１つ以上の追加のヌクレオチドと及びＩＫＫβをコードするヌクレオチドと組み合わせて使用される。特定の実施形態において、ＩＲＦをコードするヌクレオチドは、ＩＫＫβをコードするヌクレオチドと、０．５対１、１対１、２対１、３対１、４対１、５対１の比で組み合わせて使用される。特定の実施形態において、ＩＲＦをコードするヌクレオチドは、ＩＫＫβをコードするヌクレオチドと、３対１の比で組み合わせて使用される。
表２は、使用すればＭ１表現型とＭ２表現型（Ｍ２ａ、Ｍ２ｂ、Ｍ２ｃ及びＭ２ｄと呼ばれるサブ表現型を含む）を区別することができる基準の特定の組合せを提供する。
Figure 2021523110
マクロファージ表現型を評価するためのアッセイは、Ｍ１又はＭ２表現型に特有の異なる分子シグネチャーを利用することができる。Ｍ１マクロファージについて一般的に認められたマーカープロファイルはＣＤ８０＋であり、Ｍ２−マクロファージはＣＤ１６３＋と見なすことができる。したがって、フローサイトメトリーを実施すれば、これらのマーカーについて評価することができる。マクロファージをＭ１タイプの方に近づけＭ２タイプから遠ざけることは、ＩＬ−１２／ＩＬ−１０比又はＣＤ１６３−／ＣＤ１６３＋マクロファージ比の増加を測定することにより、評価することもできる。特定の実施形態において、Ｍ１対Ｍ２形態は、光学顕微鏡により評価することができる。特定の実施形態において、食作用アッセイは、マクロファージがＭ１タイプなのかＭ２表現型なのかを評価する他のアッセイと併せて使用してもよい。異なるマクロファージ集団の食作用アッセイは、貪食される実体をマクロファージと一緒に細胞あたりの正規化された全表面積と一致する濃度でインキュベートすることにより実施してもよい。貪食される実体をマクロファージ培養物に添加してもよい。貪食される実体は、例えば、蛍光ラベルで標識してもよい。食作用インデックスは、マクロファージあたり測定された全蛍光強度中央値により決定してもよい。食作用の定量化は、例えば、フローサイトメトリーによって行ってもよい。腫瘍細胞殺滅アッセイを利用してもよい。特定の実施形態において、Ｍ１表現型は、セルピンＢ２（ウロキナーゼ型プラスミノーゲン活性化因子の阻害剤）、ＣＣＬ２（Ｃ−Ｃモチーフケモカインリガンド２）、ＣＣＬ１１（Ｃ−Ｃモチーフケモカインリガンド１１）、及びＲｅｔｎｌａ（レジスチン様アルファ；Ｆｉｚｚ１）を含むシグネチャーＭ２マクロファージ遺伝子の発現の減少を含む。特定の実施形態において、Ｍ１表現型は、ＣＣＬ５（Ｃ−Ｃモチーフケモカインリガンド５）を含むＭ１分化遺伝子の発現の増加を含む。
遺伝子発現（例えば、ＣＤ８０、ＣＤ８６及び／又は上記の他の遺伝子のＭ１発現）は当業者には周知であるアッセイによって測定することができる。遺伝子発現を測定する方法は、ＮａｎｏＳｔｒｉｎｇ ｎＣｏｕｎｔｅｒ（登録商標）発現アッセイ（ＮａｎｏＳｔｒｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｉｎｃ．、Ｓｅａｔｔｌｅ、ＷＡ）、ノーザンブロット、ドットブロット、マイクロアレイ、遺伝子発現の連続分析（ＳＡＧＥ）、ＲＮＡ−ｓｅｑ、及び定量的ＲＴ−ＰＣＲを含む。遺伝子発現産物、例えば、タンパク質レベルを測定する方法は、ＥＬＩＳＡ（酵素結合免疫吸着アッセイ）、ウェスタンブロット、ＦＡＣＳ、放射性免疫アッセイ（ＲＩＡ）、サンドイッチアッセイ、蛍光インサイツハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）、免疫組織染色、免疫電気泳動、免疫沈澱、及び抗体又はタンパク質結合剤などの検出試薬を使用する免疫蛍光を含む。
（ｉｉ）細胞誘引物質 特定の実施形態において、細胞誘引物質を使用して細胞を解剖学的部位（例えば、腫瘍部位）に引き付ける。特定の実施形態において、細胞誘引物質は選択された解剖学的部位で、ここに又はこの近くに投与することができる。特定の実施形態において、細胞誘引物質は、これを選択された解剖学的部位に向ける化合物と一緒に投与することができる。
特定の実施形態において、選択された解剖学的部位は腫瘍部位であり、Ｔ細胞は腫瘍部位に引き付けられる。特定の実施形態において、引き付けられたＴ細胞は、治療タンパク質を一過性に発現するように改変されている又は改変されることになる選択されたＴ細胞を含む。特定の実施形態において、引き付けられた細胞は、治療タンパク質を一過性に発現するように改変されている選択された細胞型の活性を支援する細胞を含む。例えば、Ｔ細胞が治療タンパク質を一過性に発現するように改変されている場合、ＮＫ細胞又はインバリアントＮＫ（ｉＮＫＴ）細胞を動員して腫瘍特異的Ｔ細胞を支援させることができると考えられる。特定の実施形態において、１種よりも多い細胞型を選択された解剖学的部位に引き付けることができる。
特定の実施形態において、選択された細胞は、事前調整を使用して解剖学的部位に引き付けることができる。事前調整とは、投与されたナノ粒子により再プログラムされることになる細胞を解剖学的部位に動員することである。特定の実施形態において、事前調整は、Ｔ細胞を腫瘍部位に動員し、動員されたＴ細胞を本明細書に記載されるナノ粒子を用いて再プログラムして腫瘍特異的受容体を一過性に発現させることを含む。
したがって、任意選択的に、選択された細胞型による治療タンパク質の発現をもたらすナノ粒子を用いた処置は、処置される腫瘍へのＴ細胞の動員を刺激するＴ細胞誘引物質などの細胞誘引物質と協調することができる。適切なＴ細胞誘引物質はＣＣＬ２１及びＩＰ１０を含む。追加の免疫細胞誘引物質は当技術分野では公知である。例として、以下の細胞／誘引物質対が認識されている。
Figure 2021523110
当業者であれば、細胞型が異なれば、異なる誘引物質処置により引き付ける／動員することができることを認識する。
（ｉｉｉ）ナノ粒子 以前示したように、本開示内で利用されるナノ粒子は、（ａ）選択された細胞ターゲティングリガンド；（ｂ）正電荷キャリアー；（ｃ）正電荷キャリアー内の核酸；及び（ｄ）中性又は負電荷コーティングを含むことができる。
（ａ）選択された細胞ターゲティングリガンド 特定の実施形態において、選択された細胞ターゲティングリガンドは、ナノ粒子表面固定ターゲティングリガンドを含み、このリガンドが、ナノ粒子を選択された細胞に選択的に結合させて迅速な受容体誘導エンドサイトーシスを開始させ、ナノ粒子を内部移行する。特定の実施形態において、選択された細胞ターゲティングリガンドは、中性又は負電荷コーティングを構成するポリマーに共有結合している。
特定の実施形態において、選択された細胞ターゲティングリガンドは、抗体結合ドメイン、ｓｃＦｖタンパク質、ＤＡＲＴ分子、ペプチド及び／又はアプタマーを含むことができる。特定の実施形態は、抗ＣＤ８、抗ＣＤ３及び／又は抗ＣＤ４５抗体結合ドメインを利用してヒトＴ細胞をトランスフェクトする、並びにＣＤ３４、ＣＤ１３３又はＣＤ４６を認識する抗体結合ドメインを利用して造血幹細胞（ＨＳＣ）を標的にする。マクロファージを含む他の細胞型についての結合ドメインの例も提供される。
特定の実施形態において、ナノ粒子の選択された細胞ターゲティングリガンドは、不均一細胞集団内で目的の選択された細胞（例えば、免疫細胞又は感染性疾患細胞又は、例えば、ウイルス若しくは他の感染病原体に感染した細胞）に選択的に結合する。本明細書で開示される組成物及び方法に従ったターゲティングでは、選択された細胞は、現在分かっている又は後に発見されるマーカーと関連している。
特定の実施形態において、マーカーは抗原である。抗原とは、免疫グロブリン分子の抗原結合領域に結合する、又は免疫応答、例えば、主要組織適合抗原（ＭＨＣ）細胞タンパク質上での抗原の提示によるＴ細胞媒介免疫応答を誘発することができる物質のことである。「抗原」は、抗原決定基、ハプテン及び免疫原を含み、これはペプチド、小分子、炭水化物、脂質、核酸又はこれらの組合せでもよい。Ｔ細胞への提示のために処理される抗原に言及する場合、用語「抗原」とは、抗原のうち、ＭＨＣによりＴＣＲに提示されるＴ細胞エピトープである部分（例えば、ペプチド断片）のことである。「抗原」に特異的である抗体の形態でＢ細胞媒介免疫応答の文脈において使用される場合、抗原のうち、抗体の可変ドメイン（軽及び重）の相補性決定領域に結合する部分のことである。結合している部分は直線状又は三次元エピトープでもよい。
特定の実施形態において、目的の選択された免疫細胞はリンパ球である。リンパ球は、Ｔ細胞、Ｂ細胞、ＮＫ細胞、単球／マクロファージ及びＨＳＣを含む。
Ｔ細胞のいくつかの異なるサブセットが発見されており、それぞれが他の全く別な機能を有する。特定の実施形態において、選択された細胞ターゲティングリガンドは、受容体媒介エンドサイトーシスを通じて特定のリンパ球集団への選択的方向付けを達成する。例えば、大多数のＴ細胞は、いくつかのタンパク質の複合体として存在するＴ細胞受容体（ＴＣＲ）を有する。天然のＴ細胞受容体は、２つの分離したペプチド鎖で構成されており、このペプチド鎖は独立したＴ細胞受容体アルファ及びベータ（ＴＣＲα及びＴＣＲβ）遺伝子から産生され、αＴＣＲ鎖及びβＴＣＲ鎖と呼ばれる。本明細書で開示される選択された細胞ターゲティングリガンドは、αＴＣＲ鎖及び／又はβＴＣＲ鎖に結合すれば、これらのＴ細胞への核酸の選択的送達を達成することができる。
γδＴ細胞は、この表面上に他の全く別なＴ細胞受容体（ＴＣＲ）を有するＴ細胞の小サブセットを表す。γδＴ細胞では、ＴＣＲは１つのγ鎖と１つのδ鎖で構成されている。Ｔ細胞のこのグループはαβ Ｔ細胞よりははるかに一般的ではない（全Ｔ細胞の２％）。にもかかわらず、本明細書で開示される選択された細胞ターゲティングリガンドは、γＴＣＲ鎖及び／又はδＴＣＲ鎖に結合すれば、これらのＴ細胞への核酸の選択的送達を達成することができる。
ＣＤ３はすべての成熟Ｔ細胞上で発現される。したがって、本明細書で開示される選択された細胞ターゲティングリガンドは、ＣＤ３に結合すれば、すべての成熟Ｔ細胞への核酸の選択的送達を達成することができる。活性化Ｔ細胞は、４−１ＢＢ（ＣＤ１３７）、ＣＤ６９及びＣＤ２５を発現する。したがって、本明細書で開示される選択された細胞ターゲティングリガンドは、４−１ＢＢ、ＣＤ６９又はＣＤ２５に結合すれば、活性化Ｔ細胞への核酸の選択的送達を達成することができる。ＣＤ５及びトランスフェリン受容体もＴ細胞上で発現され、これらを使用すればＴ細胞への核酸の選択的送達を達成することができる。
Ｔ細胞は、ヘルパー細胞（ＣＤ４＋Ｔ細胞）と細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＴＬ、ＣＤ８＋Ｔ細胞）にさらに分類することができ、細胞傷害性Ｔ細胞は細胞溶解性Ｔ細胞を含む。Ｔヘルパー細胞は、数ある機能の中でも、プラズマ細胞へのＢ細胞の成熟並びに細胞傷害性Ｔ細胞及びマクロファージの活性化を含む、免疫過程において他の白血球を支援する。これらの細胞は、これらの表面にＣＤ４タンパク質を発現するので、ＣＤ４＋Ｔ細胞としても知られる。ヘルパーＴ細胞は、抗原提示細胞（ＡＰＣ）の表面に発現されるＭＨＣクラスＩＩ分子によりペプチド抗原を提示されると活性化する。活性化した後は、ヘルパーＴ細胞は急速に分裂して、能動免疫応答を調節する又は支援するサイトカインと呼ばれる小タンパク質を分泌する。本明細書で開示される選択された細胞ターゲティングリガンドは、ＣＤ４に結合すればＴヘルパー細胞への核酸の選択的送達を達成することができる。
細胞傷害性Ｔ細胞はウイルス感染した細胞及び腫瘍細胞を破壊し、移植片拒絶にも関係づけられる。これらの細胞は、これらの表面上にＣＤ８糖タンパク質を発現するのでＣＤ８＋Ｔ細胞としても知られる。これらの細胞は、ＭＨＣクラスＩに会合している抗原に結合することによりこの標的を認識し、このＭＨＣクラスＩは身体のほぼすべての細胞の表面に存在する。本明細書で開示される選択された細胞ターゲティングリガンドは、ＣＤ８に結合すればＣＴＬへの核酸の選択的送達を達成することができる。
本明細書で使用される「セントラルメモリー」Ｔ細胞（又は「ＴＣＭ」）とは、この表面でＣＤ６２Ｌ又はＣＣＲ７及びＣＤ４５ＲＯを発現し、ナイーブ細胞と比べてＣＤ４５ＲＡを発現しない又は発現が減少した、抗原感作を受けたＣＴＬのことである。特定の実施形態において、セントラルメモリー細胞は、ＣＤ６２Ｌ、ＣＣＲ７、ＣＤ２５、ＣＤ１２７、ＣＤ４５ＲＯ及びＣＤ９５の発現については陽性であり、ナイーブ細胞と比べてＣＤ４５ＲＡは発現しても減少している。本明細書で開示される選択された細胞ターゲティングリガンドは、ＣＤ６２Ｌ、ＣＣＲ７、ＣＤ２５、ＣＤ１２７、ＣＤ４５ＲＯ及び／又はＣＤ９５に結合すればＴＣＭへの核酸の選択的送達を達成することができる。
本明細書で使用される「エフェクターメモリー」Ｔ細胞（又は「ＴＥＭ」）とは、セントラルメモリー細胞と比べてこの表面でＣＤ６２Ｌを発現しない又は発現が減少した、ナイーブ細胞と比べてＣＤ４５ＲＡは発現しない又は発現が減少した、抗原感作を受けたＴ細胞のことである。特定の実施形態において、エフェクターメモリー細胞は、ナイーブ細胞又はセントラルメモリー細胞と比べてＣＤ６２Ｌ及びＣＣＲ７の発現について陰性であり、ＣＤ２８及びＣＤ４５ＲＡを発現するが変化しやすい。エフェクターＴ細胞は、メモリー又は天然Ｔ細胞と比べて、グランザイムＢ及びパーフォリンについて陽性である。本明細書で開示される選択された細胞ターゲティングリガンドは、グランザイムＢ及び／又はパーフォリンに結合すればＴＥＭへの核酸の選択的送達を達成することができる。
制御性Ｔ細胞（「ＴＲＥＧ」）はＴ細胞の亜集団であり、免疫系を調節し、自己抗原に対する耐性を維持し、自己免疫疾患を抑制する。ＴＲＥＧは、ＣＤ２５、ＣＴＬＡ−４、ＧＩＴＲ、ＧＡＲＰ及びＬＡＰを発現する。本明細書で開示される選択された細胞ターゲティングリガンドは、ＣＤ２５、ＣＴＬＡ−４、ＧＩＴＲ、ＧＡＲＰ及び／又はＬＡＰに結合すればナイーブＴＲＥＧへの核酸の選択的送達を達成することができる。
本明細書で使用される「ナイーブ」Ｔ細胞は、セントラル又はエフェクターメモリー細胞と比べて、ＣＤ６２Ｌ及びＣＤ４５ＲＡを発現し、ＣＤ４５ＲＯは発現しない抗原経験がないＴ細胞のことである。特定の実施形態において、ナイーブＣＤ８＋Ｔリンパ球は、ＣＤ６２Ｌ、ＣＣＲ７、ＣＤ２８、ＣＤ１２７及びＣＤ４５ＲＡを含むナイーブＴ細胞の表現型マーカーの発現を特徴とする。本明細書で開示される選択された細胞ターゲティングリガンドは、ＣＤ６２Ｌ、ＣＣＲ７、ＣＤ２８、ＣＤ１２７及び／又はＣＤ４５ＲＡに結合すればナイーブＴ細胞への核酸の選択的送達を達成することができる。
ＮＫ細胞（Ｋ細胞及びキラー細胞としても知られている）は、インターフェロン又はマクロファージ由来サイトカインに応答して活性化される。ＮＫ細胞は、感染を取り除くことができる抗原特異的細胞傷害性Ｔ細胞を適応免疫応答が生み出している間、ウイルス感染を封じ込める働きをする。ＮＫ細胞は、ＣＤ８、ＣＤ１６及びＣＤ５６を発現するが、ＣＤ３は発現しない。本明細書で開示される選択された細胞ターゲティングリガンドは、ＣＤ８、ＣＤ１６及び／又はＣＤ５６に結合すればＮＫ細胞への核酸の選択的送達を達成することができる。
マクロファージ（及びこの前駆体、単球）は身体のすべての組織に属しており（ある特定の例では、ミクログリア、クッパー細胞及び破骨細胞として）、そこでアポトーシス細胞、病原体及び他の非自己成分を貪食する。単球／マクロファージは非自己成分を貪食するので、これらの細胞による選択的取込みのため本明細書に記載されるナノ粒子上に特定のマクロファージ指向剤又は単球指向剤は必要ではない。代わりに、本明細書で開示される選択された細胞ターゲティングリガンドは、ＣＤ１１ｂ、Ｆ４／８０；ＣＤ６８；ＣＤ１１ｃ；ＩＬ−４Ｒα；及び／又はＣＤ１６３に結合すれば単球／マクロファージへの核酸の選択的送達を達成することができる。マクロファージはＴＣＲを発現せず、したがって、マクロファージは、ＴＣＲタンパク質又はＣＡＲ／ＴＣＲハイブリッドタンパク質をコードするｍＲＮＡを含む本明細書に記載されるナノ粒子の粒子についての所望の標的ではないことが認識されている。
未成熟な樹状細胞（すなわち、予備活性化）は末端において抗原及び他の非自己成分を貪食し、それに続いて、活性化形態で、リンパ組織のＴ細胞領域に遊走し、そこで樹状細胞はＴ細胞に抗原提示する。したがって、マクロファージ同様に、樹状細胞のターゲティングは選択された細胞ターゲティングリガンドに頼る必要がない。選択された細胞ターゲティングリガンドを使用して樹状細胞を選択的に標的にする場合、選択された細胞ターゲティングリガンドは以下のＣＤ抗原：ＣＤ１ａ、ＣＤ１ｂ、ＣＤ１ｃ、ＣＤ１ｄ、ＣＤ２１、ＣＤ３５、ＣＤ３９、ＣＤ４０、ＣＤ８６、ＣＤ１０１、ＣＤ１４８、ＣＤ２０９及びＤＥＣ−２０５に結合することができる。
Ｂ細胞は、Ｂ細胞受容体（ＢＣＲ）の存在により他のリンパ球と区別することができる。Ｂ細胞の主要な機能は抗体を作成することである。Ｂ細胞は、ＣＤ５、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２１、ＣＤ２２、ＣＤ３５、ＣＤ４０、ＣＤ５２及びＣＤ８０を発現する。本明細書で開示される選択された細胞ターゲティングリガンドは、ＣＤ５、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２１、ＣＤ２２、ＣＤ３５、ＣＤ４０、ＣＤ５２及び／又はＣＤ８０に結合すればＢ細胞への核酸の選択的送達を達成することができる。Ｂ細胞受容体アイソタイプ定常領域を標的にする抗体（ＩｇＭ、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＥ）を使用すればＢ細胞サブタイプを標的にすることができる。
リンパ球機能関連抗原１（ＬＦＡ−１）は、Ｔ細胞、Ｂ細胞及び単球／マクロファージすべてにより発現される。したがって、本明細書で開示される選択された細胞ターゲティングリガンドは、ＬＦＡ−１に結合すればＴ細胞、Ｂ細胞及び単球／マクロファージへの核酸の選択的送達を達成することができる。
本明細書で開示されるナノ粒子の選択的送達のためにＨＳＣも標的にすることができる。ＨＳＣは、ＣＤ３４、ＣＤ４６、ＣＤ１３３、Ｓｃａ−１及びＣＤ１１７を発現する。本明細書で開示される選択された細胞ターゲティングリガンドは、ＣＤ３４、ＣＤ４６、ＣＤ１３３、Ｓｃａ−１及び／又はＣＤ１１７に結合すれば造血幹細胞への核酸の選択的送達を達成することができる。
「選択的送達」とは、核酸が１つ以上の選択されたリンパ球集団により送達され発現されることを意味する。特定の実施形態において、選択的送達は選択されたリンパ球集団だけに限定される。特定の実施形態において、投与された核酸の少なくとも６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％又は９９％は選択されたリンパ球集団により送達される及び／又は発現される。特定の実施形態において、選択的送達は、非リンパ球細胞が送達された核酸を発現しないことを保証する。例えば、ターゲティング剤がＴ細胞受容体（ＴＣＲ）遺伝子である場合、Ｔ細胞だけがＴＣＲ発現に必要なゼータ鎖を有するので選択性が保証される。選択的送達は、選択されていない細胞中への核酸取込みがないことにも基づくことができる。
選択された細胞ターゲティングリガンドは、リンパ球上に見出されるモチーフに対する結合ドメインを含むことができる。選択された細胞ターゲティングリガンドは、リンパ球中への選択的取り込みを可能にするいかなる選択的結合機構でも含むことができる。特定の実施形態において、選択された細胞ターゲティングリガンドは、Ｔ細胞受容体モチーフ；Ｔ細胞α鎖；Ｔ細胞β鎖；Ｔ細胞γ鎖；Ｔ細胞δ鎖；ＣＣＲ７；ＣＤ１ａ；ＣＤ１ｂ；ＣＤ１ｃ；ＣＤ１ｄ；ＣＤ３；ＣＤ４；ＣＤ５；ＣＤ７；ＣＤ８；ＣＤ１１ｂ；ＣＤ１１ｃ；ＣＤ１６；ＣＤ１９；ＣＤ２０；ＣＤ２１；ＣＤ２２；ＣＤ２５；ＣＤ２８；ＣＤ３４；ＣＤ３５；ＣＤ３９；ＣＤ４０；ＣＤ４５ＲＡ；ＣＤ４５ＲＯ；ＣＤ４６，ＣＤ５２；ＣＤ５６；ＣＤ６２Ｌ；ＣＤ６８；ＣＤ８０；ＣＤ８６；ＣＤ９５；ＣＤ１０１；ＣＤ１１７；ＣＤ１２７；ＣＤ１３３；ＣＤ１３７（４−１ＢＢ）；ＣＤ１４８；ＣＤ１６３；Ｆ４／８０；ＩＬ−４Ｒα；Ｓｃａ−１；ＣＴＬＡ−４；ＧＩＴＲ；ＧＡＲＰ；ＬＡＰ；グランザイムＢ；ＬＦＡ−１；トランスフェリン受容体；及びこれらの組合せに対する結合ドメインを含む。
特定の実施形態において、結合ドメインは、細胞マーカーリガンド、受容体リガンド、抗体結合ドメイン、ペプチド、ペプチドアプタマー、核酸、核酸アプタマー、スピーゲルマー（ｓｐｉｅｇｅｌｍｅｒ）又はこれらの組合せを含む。選択された細胞ターゲティングリガンドの文脈内では、結合ドメインは、別の物質に結合してエンドサイトーシスを媒介することができる複合体を形成するいかなる物質でも含む。
抗体結合ドメインは、抗体の結合断片、例えば、Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２及び一本鎖Ｆｖ断片（ｓｃＦｖ）又はリンパ球により発現されるモチーフに特異的に結合する免疫グロブリンの任意の生物学的に効果的な断片を含む。抗体又は抗原結合断片は、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体、合成抗体、キメラ抗体、二重特異性抗体、ミニ抗体、及び線形抗体のすべて又は一部を含む。
ヒト起源由来の抗体又はヒト化抗体はヒトでの免疫原性が低くなっている又はなく、非ヒト抗体と比べて非免疫原性エピトープの数が少ない。抗体及びこれらの断片は一般に、ヒト対象において抗原性のレベルが低下する又はないように選択される。
リンパ球により発現されるモチーフに特異的に結合する抗体は、モノクローナル抗体を得る方法、ファージディスプレイの方法、ヒト若しくはヒト化抗体を作成する方法、又は当業者には公知である抗体を産生するように操作されたトランスジェニック動物若しくは植物を使用する方法（例えば、米国特許第６，２９１，１６１号及び米国特許第６，２９１，１５８号参照）を使用して調製することができる。部分的に又は完全に合成抗体のファージディスプレイライブラリーは入手可能であり、リンパ球モチーフに結合することができる抗体又はこの断片を求めてスクリーニングすることができる。例えば、結合ドメインは、目的の標的に特異的に結合するＦａｂ断片を求めてＦａｂファージライブラリーをスクリーニングすることにより同定しうる（Ｈｏｅｔら、Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２３：３４４頁、２００５年参照）。ヒト抗体のファージディスプレイライブラリーも利用可能である。さらに、便利な系での免疫原として目的の標的を使用するハイブリドーマ開発のための伝統的戦略（例えば、マウス、ＨｕＭＡｂマウス（登録商標）（ＧｅｎＰｈａｒｍ Ｉｎｔ’ｌ、Ｉｎｃ．、Ｍｏｕｎｔａｉｎ Ｖｉｅｗ、ＣＡ）、ＴＣマウス（商標）（Ｋｙｏｗａ Ｈａｋｋｏ Ｋｉｒｉｎ Ｃｏ．、Ｔｏｋｙｏ、ＪＰ；例えば、Ｔａｋａｕｃｈｉら、Ｊ．Ｐｅｒｉｏｄｏｎｔｏｌ．２００５年５月 ７６（５）：６８０〜５頁参照）、ＫＭマウス（登録商標）（Ｍｅｄａｒｅｘ、Ｉｎｃ．、Ｐｒｉｎｃｅｔｏｎ、ＮＪ）、ラマ、ニワトリ、ラット、ハムスター、ウサギ、等）を使用すれば、結合ドメインを開発することができる。特定の実施形態において、抗体は、選択されたリンパ球により発現されるモチーフに特異的に結合し、非特異的成分とも無関係な標的とも交差反応しない。同定された後は、抗体をコードするアミノ酸配列又は核酸配列を単離する及び／又は決定することができる。
特定の実施形態において、選択された細胞ターゲティングリガンドの結合ドメインは、Ｔ細胞受容体モチーフ抗体；Ｔ細胞α鎖抗体；Ｔ細胞β鎖抗体；Ｔ細胞γ鎖抗体；Ｔ細胞δ鎖抗体；ＣＣＲ７抗体；ＣＤ１ａ抗体；ＣＤ１ｂ抗体；ＣＤ１ｃ抗体；ＣＤ１ｄ抗体；ＣＤ３抗体；ＣＤ４抗体；ＣＤ５抗体；ＣＤ７抗体；ＣＤ８抗体；ＣＤ１１ｂ抗体；ＣＤ１１ｃ抗体；ＣＤ１６抗体；ＣＤ１９抗体；ＣＤ２０抗体；ＣＤ２１抗体；ＣＤ２２抗体；ＣＤ２５抗体；ＣＤ２８抗体；ＣＤ３４抗体；ＣＤ３５抗体；ＣＤ３９抗体；ＣＤ４０抗体；ＣＤ４５ＲＡ抗体；ＣＤ４５ＲＯ抗体；ＣＤ４６抗体，ＣＤ５２抗体；ＣＤ５６抗体；ＣＤ６２Ｌ抗体；ＣＤ６８抗体；ＣＤ８０抗体；ＣＤ８６抗体；ＣＤ９５抗体；ＣＤ１０１抗体；ＣＤ１１７抗体；ＣＤ１２７抗体；ＣＤ１３３抗体；ＣＤ１３７（４−１ＢＢ）抗体；ＣＤ１４８抗体；ＣＤ１６３抗体；Ｆ４／８０抗体；ＩＬ−４Ｒα抗体；Ｓｃａ−１抗体；ＣＴＬＡ−４抗体；ＧＩＴＲ抗体；ＧＡＲＰ抗体；ＬＡＰ抗体；グランザイムＢ抗体；ＬＦＡ−１抗体；又はトランスフェリン受容体抗体を含む。これらの結合ドメインは、前述の抗体のｓｃＦｖ断片からなることもできる。
本開示の方法及び組成物において有用である例示的抗体（例えば、ｓｃＦｖ）は、ＷＯ２０１４１６４５５３Ａ１、ＵＳ２０１７０２８３５０４、ＵＳ７０８３７８５Ｂ２、ＵＳ１０１８９９０６Ｂ２、ＵＳ１０１７４０９５Ｂ２、ＷＯ２００５１０２３８７Ａ２、ＵＳ２０１１０２０６７０１Ａ１、ＷＯ２０１４１７９７５９Ａ１、ＵＳ２０１８００３７６５１Ａ１、ＵＳ２０１８０１１８８２２Ａ１、ＷＯ２００８０４７２４２Ａ２、ＷＯ１９９６０１６９９０Ａ１、ＷＯ２００５１０３０８３Ａ２及びＷＯ１９９９０６２５２６Ａ２に提供される抗体を含み、前記特許文献のそれぞれは参照により本明細書に組み込む。
ペプチドアプタマーは、両末端でタンパク質スキャフォールドに結合しているペプチドループ（標的タンパク質に特異的である）を含む。この二重の構造上の制約は、ペプチドアプタマーの結合親和性を抗体に匹敵するレベルにまで大いに増やす。可変性のループ長は典型的には、８〜２０アミノ酸（例えば、８〜１２アミノ酸）であり、スキャフォールドは、安定で、可溶性で、小型で、非毒性のいかなるタンパク質（例えば、チオレドキシン−Ａ、ステフィンＡ三重変異体、緑色蛍光タンパク質、エグリンＣ、及び細胞転写因子Ｓｐｌ）でもよい。ペプチドアプタマー選択は、酵母ツーハイブリッド法（例えば、Ｇａｌ４酵母ツーハイブリッド法）又はＬｅｘＡインターラクショントラップシステムなどの異なるシステムを使用して行うことができる。
核酸アプタマーは、Ｏｓｂｏｒｎｅら、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．１：５〜９頁、１９９７年；及びＣｅｒｃｈｉａら、ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔｅｒｓ ５２８：１２〜１６頁、２００２年により記載されるように、標的タンパク質又は他の分子への高親和性で及び特異性での結合を指示する特定の球状構造に折り畳まることにより機能する一本鎖核酸（ＤＮＡ又はＲＮＡ）である。特定の実施形態において、アプタマーは小さい（１５ｋＤ；又は１５〜８０ヌクレオチド若しくは２０〜５０ヌクレオチド）。アプタマーは一般には、ＳＥＬＥＸ（指数関数的濃縮によるリガンドの体系的進化；例えば、Ｔｕｅｒｋら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２４９：５０５〜５１０頁、１９９０年；Ｇｒｅｅｎら、Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ．７５〜８６頁、１９９１年；及びＧｏｌｄら、Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．、６４：７６３〜７９７頁、１９９５年参照）と呼ばれる手順により１０１４〜１０１５ランダムオリゴヌクレオチド配列を含むライブラリーから単離される。アプタマーを作成するさらなる方法は、例えば、米国特許第６，３４４，３１８号、米国特許第６，３３１，３９８号、米国特許第６，１１０，９００号、米国特許第５，８１７，７８５号、米国特許第５，７５６，２９１号、米国特許第５，６９６，２４９号、米国特許第５，６７０，６３７号、米国特許第５，６３７，４６１号、米国特許第５，５９５，８７７号、米国特許第５，５２７，８９４号、米国特許第５，４９６，９３８号、米国特許第５，４７５，０９６号、及び米国特許第５，２７０，１６号に記載されている。スピーゲルマーは、少なくとも１つのβ−リボースユニットがβ−Ｄ−デオキシリボース、又は、例えば、β−Ｄ−リボース、α−Ｄ−リボース、β−Ｌ−リボースから選択される改変糖ユニットにより置き換えられていることを除いて、核酸アプタマーに類似している。
特定の実施形態において、Ｅｇｒ２はＭ２マクロファージ上で標的にされる。Ｅｇｒ２についての市販の抗体は、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ；Ａｂｃａｍ、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、ＭＡ；Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｓｉｇｍａ、Ｂｕｒｌｉｎｇｔｏｎ、ＭＡ；Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ、Ｂｅｒｇｉｓｃｈ Ｇｌａｄｂａｃｈ、Ｇｅｒｍａｎｙ；ＬｉｆｅＳｐａｎ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｉｎｃ．、Ｓｅａｔｔｌｅ、ＷＡ；ａｎｄ Ｎｏｖｕｓ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ、Ｌｉｔｔｌｅｔｏｎ、ＣＯから入手可能である。抗Ｅｇｒ２抗体の産生は、例えば、Ｍｕｒａｋａｍｉ Ｋら、（１９９３）Ｏｎｃｏｇｅｎｅ ８（６）：１５５９〜１５６６頁で考察されている。抗Ｅｇｒ２抗体は：ウサギモノクローナル抗Ｅｇｒ２抗体クローンＥＰＲ４００４；マウスモノクローナル抗Ｅｇｒ２抗体クローン１Ｇ５；マウスモノクローナル抗Ｅｇｒ２抗体クローンＯＴＩ１Ｂ１２；ヒトＥｇｒ２のＡＡ残基２００〜３００を認識するウサギポリクローナル抗Ｅｇｒ２抗体；ヒトＥｇｒ２のＡＡ残基３４０〜４２０を認識するウサギポリクローナル抗Ｅｇｒ２抗体；及びヒトＥｇｒ２のＡＡ残基３７０〜４２０を認識するウサギポリクローナル抗Ｅｇｒ２抗体を含む。結合ドメインはこれらの抗体及び本明細書に開示される他の抗体由来が可能である。
ＣＤ２０６に特異的ないくつかの追加の抗体は当業者には公知であり、配列、エピトープ結合、及び親和性について容易に特徴付けることができる。例えば、国際特許第２０１４／１４０３７６号パンフレット、国際特許第２０１３／１７４５３７号パンフレット、米国特許第７，５６０，５３４号を参照されたい。ＣＤ２０６についての市販の抗体は、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ；Ｐｒｏｔｅｉｎｔｅｃｈ、Ｒｏｓｅｍｏｎｔ、ＩＬ；ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ；Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ、ＭＮ；ＬｉｆｅＳｐａｎ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｉｎｃ．、Ｓｅａｔｔｌｅ、ＷＡ；Ｎｏｖｕｓ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ、Ｌｉｔｔｌｅｔｏｎ、ＣＯ；及びＢｉｏ−Ｒａｄ、Ｈｅｒｃｕｌｅｓ、ＣＡから入手可能である。特定の実施形態において、抗ＣＤ２０６抗体は、ラットモノクローナル抗マウスＣＤ２０６モノクローナル抗体クローンＣ０６８Ｃ２（カタログ＃１４１７３２、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）を含む。
特定の実施形態において、ターゲティングリガンドは、ＡＳＱＳＶＳＨＤＶ（配列番号６９）を含むＣＤＲＬ１配列、ＹＴＳを含むＣＤＲＬ２配列、及びＱＤＹＳＳＰＲＴ（配列番号７０）を含むＣＤＲＬ３配列を含む可変軽鎖を含むヒト又はヒト化結合ドメイン（例えば、ｓｃＦｖ）を含む。特定の実施形態において、ターゲティングリガンドは、ＧＹＳＩＴＳＤＹ（配列番号７１）を含むＣＤＲＨ１配列、ＹＳＧを含むＣＤＲＨ２配列、及びＣＶＳＧＴＹＹＦＤＹＷＧ（配列番号７２）を含むＣＤＲＨ３配列を含む可変重鎖を含むヒト又はヒト化結合ドメイン（例えば、ｓｃＦｖ）を含む。これらは、ＣＤ１６３に結合するＭａｃ２−４８抗体のＣＤＲ配列を反映している。
特定の実施形態において、ターゲティングリガンドは、ＡＳＱＳＶＳＳＤＶ（配列番号７３）を含むＣＤＲＬ１配列、ＹＡＳを含むＣＤＲＬ２配列、及びＱＤＹＴＳＰＲＴ（配列番号７４）を含むＣＤＲＬ３配列を含む可変軽鎖を含むヒト又はヒト化結合ドメイン（例えば、ｓｃＦｖ）を含む。特定の実施形態において、ターゲティングリガンドは、ＧＹＳＩＴＳＤＹ（配列番号７５）を含むＣＤＲＨ１配列、ＹＳＧを含むＣＤＲＨ２配列、及びＣＶＳＧＴＹＹＦＤＹＷＧ（配列番号７６）を含むＣＤＲＨ３配列を含む可変重鎖を含むヒト又はヒト化結合ドメイン（例えば、ｓｃＦｖ）を含む。これらは、ＣＤ１６３に結合するＭａｃ２−１５８抗体のＣＤＲ配列を反映している。
ＣＤ１６３に特異的ないくつかの追加の抗体又は結合ドメインは当業者には公知であり、配列、エピトープ結合、及び親和性について容易に特徴付けることができる。例えば、国際特許第２０１１／０３９５１０号パンフレット、国際特許第２００２／０３２９４１号パンフレット、国際特許第２００２／０７６５０１号パンフレット、及び米国特許出願公開第２００５／０２１４８７１号参照を参照されたい。ＣＤ１６３についての市販の抗体は、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ；Ｅｎｚｏ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｉｎｃ．、Ｆａｒｍｉｎｇｄａｌｅ、ＮＹ；ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ；Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ、ＭＮ；ＬｉｆｅＳｐａｎ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｉｎｃ．、Ｓｅａｔｔｌｅ、ＷＡ；及びＲＤＩ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ、Ｆｌａｎｄｅｒｓ、ＮＪから入手可能である。特定の実施形態において、抗ＣＤ１６３抗体は、マウスモノクローナル抗ＣＤ１６３抗体クローン３Ｄ４；マウスモノクローナル抗ＣＤ１６３抗体クローンＢｅｒ−Ｍａｃ３；マウスモノクローナル抗ＣＤ１６３抗体クローンＥＤＨｕ−１；及びマウスモノクローナル抗ＣＤ１６３抗体クローンＧＨＩ／６１を含むことができる。
特定の実施形態において、ターゲティングリガンドは、ＲＳＳＫＳＬＬＹＫＤＧＫＴＹＬＮ（配列番号７７）を含むＣＤＲＬ１配列、ＬＭＳＴＲＡＳ（配列番号７８）を含むＣＤＲＬ２配列、及びＱＱＬＶＥＹＰＦＴ（配列番号７９）を含むＣＤＲＬ３配列を含む可変軽鎖を含むヒト又はヒト化結合ドメイン（例えば、ｓｃＦｖ）を含む。特定の実施形態において、ターゲティングリガンドは、ＧＹＷＭＳ（配列番号８０）を含むＣＤＲＨ１配列、ＥＩＲＬＫＳＤＮＹＡＴＨＹＡＥＳＶＫＧ（配列番号８１）を含むＣＤＲＨ２配列、及びＦＩＤを含むＣＤＲＨ３配列を含む可変重鎖を含むヒト又はヒト化結合ドメイン（例えば、ｓｃＦｖ）を含む。これらは、ＣＤ２３に結合するＣＤＲ配列を反映している。
ＣＤ２３に特異的ないくつかの追加の抗体又は結合ドメインは当業者には公知であり、配列、エピトープ結合、及び親和性について容易に特徴付けることができる。例えば、米国特許第７，００８，６２３号、米国特許第６，０１１，１３８号（５Ｅ８、６Ｇ５、２Ｃ８、Ｂ３Ｂ１及び３Ｇ１２を含む抗体）、及び米国特許出願公開第２００９／０２５２７２５号、Ｒｅｃｔｏｒら、（１９８５）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．５５：４８１〜４８８頁；Ｆｌｏｒｅｓ−Ｒｕｍｅｏら、（１９９３）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４１：１０３８〜１０４６頁；Ｓｈｅｒｒら、（１９８９）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４２：４８１〜４８９頁；及びＰｅｎｅら、（１９８８）ＰＮＡＳ ８５：６８２０〜６８２４頁を参照されたい。ＣＤ２３についての市販の抗体は、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ；Ａｂｃａｍ、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、ＭＡ；Ｂｉｏｓｓ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ、Ｉｎｃ．、Ｗｏｂｕｒｎ、ＭＡ；Ｂｉｏ−Ｒａｄ、Ｈｅｒｃｕｌｅｓ、ＣＡ；ＬｉｆｅＳｐａｎ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｉｎｃ．、Ｓｅａｔｔｌｅ、ＷＡ；及びＢｏｓｔｅｒ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｐｌｅａｓａｎｔｏｎ、ＣＡから入手可能である。特定の実施形態において、抗ＣＤ２３抗体は、マウスモノクローナル抗ＣＤ２３抗体クローンＴｕ１；ウサギモノクローナル抗ＣＤ２３抗体クローンＳＰ２３；ウサギモノクローナル抗ＣＤ２３抗体クローンＥＰＲ３６１７；マウスモノクローナル抗ＣＤ２３抗体クローン５Ｂ５；マウスモノクローナル抗ＣＤ２３抗体クローン１Ｂ１２；マウスモノクローナル抗ＣＤ２３抗体クローンＭ−Ｌ２３．４；及びマウスモノクローナル抗ＣＤ２３抗体クローン３Ａ２を含むことができる。
Ｍ１結合ドメイン 特定の実施形態において、ターゲティングリガンドは、ＳＳＮＩＧＤＮＹ（配列番号８２）を含むＣＤＲＬ１配列、ＲＤＳを含むＣＤＲＬ２配列、及びＱＳＹＤＳＳＬＳＧＳ（配列番号８３）を含むＣＤＲＬ３配列を含む可変軽鎖を含むヒト又はヒト化結合ドメイン（例えば、ｓｃＦｖ）を含む。特定の実施形態において、ターゲティングリガンドは、ＧＦＴＦＤＤＹＧ（配列番号８４）を含むＣＤＲＨ１配列、ＩＳＷＮＧＧＫＴ（配列番号８５）を含むＣＤＲＨ２配列、及びＡＲＧＳＬＦＨＤＳＳＧＦＹＦＧＨ（配列番号８６）を含むＣＤＲＨ３配列を含む可変重鎖を含むヒト又はヒト化結合ドメイン（例えば、ｓｃＦｖ）を含む。これらは、ＣＤ３８に結合するＡｂ７９抗体のＣＤＲ配列を反映している。
特定の実施形態において、ターゲティングリガンドは、ＮＳＮＩＧＳＮＴ（配列番号８７）を含むＣＤＲＬ１配列、ＳＤＳを含むＣＤＲＬ２配列、及びＱＳＹＤＳＳＬＳＧＳＲ（配列番号８８）を含むＣＤＲＬ３配列を含む可変軽鎖を含むヒト又はヒト化結合ドメイン（例えば、ｓｃＦｖ）を含む。特定の実施形態において、ターゲティングリガンドは、ＧＦＴＦＮＮＹＧ（配列番号８９）を含むＣＤＲＨ１配列、ＩＳＹＤＧＳＤＫ（配列番号９０）を含むＣＤＲＨ２配列、及びＡＲＶＹＹＹＧＦＳＧＰＳＭＤＶ（配列番号９１）を含むＣＤＲＨ３配列を含む可変重鎖を含むヒト又はヒト化結合ドメイン（例えば、ｓｃＦｖ）を含む。これらは、ＣＤ３８に結合するＡｂ１９抗体のＣＤＲ配列を反映している。
特定の実施形態において、ターゲティングリガンドは、ＲＡＳＱＳＶＳＳＹＬＡ（配列番号９２）を含むＣＤＲＬ１配列、ＤＡＳＮＲＡＴ（配列番号９３）を含むＣＤＲＬ２配列、及びＱＱＲＳＮＷＰＰＴＦ（配列番号９４）を含むＣＤＲＬ３配列を含む可変軽鎖を含むヒト又はヒト化結合ドメイン（例えば、ｓｃＦｖ）を含む。特定の実施形態において、ターゲティングリガンドは、ＳＦＡＭＳ（配列番号９５）を含むＣＤＲＨ１配列、ＡＩＳＧＳＧＧＧＴＹＹＡＤＳＶＫＧ（配列番号９６）を含むＣＤＲＨ２配列、及びＤＫＩＬＷＦＧＥＰＶＦＤＹ（配列番号９７）を含むＣＤＲＨ３配列を含む可変重鎖を含むヒト又はヒト化結合ドメイン（例えば、ｓｃＦｖ）を含む。これらは、米国特許第７，８２９，６９３号に記載されるＣＤ３８に結合するダラツムマブ抗体のＣＤＲ配列を反映している。
ＣＤ３８に特異的ないくつかの抗体は当業者には公知であり、配列、エピトープ結合、及び親和性について容易に特徴付けることができる。例えば、国際公開第２００５／１０３０８３号パンフレット、国際公開第２００６／１２５６４０号パンフレット、国際公開第２００７／０４２３０９号パンフレット、国際公開第２００８／０４７２４２号パンフレット、国際公開第２０１２／０９２６１２号パンフレット、国際公開第２００６／０９９８７５号パンフレット、国際公開第２０１１／１５４４５３号パンフレット、国際公開第２０１５／１３０７２８号パンフレット、米国特許第７，８２９，６９３号、及び米国特許出願公開第２０１６／０２００８２８号を参照されたい。ＣＤ３８についての市販の抗体は、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ；Ａｂｃａｍ、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、ＭＡ；及びＭｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｓｉｇｍａ、Ｂｕｒｌｉｎｇｔｏｎ、ＭＡから入手可能である。特定の実施形態において、抗ＣＤ２３抗体は、ウサギモノクローナル抗ＣＤ３８抗体クローンＧＡＤ−３；マウスモノクローナル抗ＣＤ３８抗体クローンＨＩＴ２；マウスモノクローナル抗ＣＤ３８抗体クローンＡＴ１；マウスモノクローナル抗ＣＤ３８抗体クローンＡＴ１３／５；ラットモノクローナル抗ＣＤ３８抗体クローンＮＩＭＲ−５；及びラットモノクローナルＩｇＧ２ａ、κ抗ＣＤ３８抗体クローン９０／ＣＤ３８（カタログ＃ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｓａｎ Ｊｏｓｅ、ＣＡ）を含むことができる。
特定の実施形態において、Ｇタンパク質共役受容体１８（Ｇｐｒ１８）はＭ１マクロファージ上で標的にされる。Ｇｐｒ１８についての市販の抗体は、Ａｓｓａｙ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｃｏｍｐａｎｙ Ｉｎｃ．、Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ、ＣＡ；Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ；Ａｂｃａｍ、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、ＭＡ；ＧｅｎｅＴｅｘ、Ｉｎｃ．、Ｉｒｖｉｎｅ、ＣＡ；及びＮｏｖｕｓ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ、Ｌｉｔｔｌｅｔｏｎ、ＣＯから入手可能である。特定の実施形態において、抗Ｇｐｒ１８抗体は、ヒトＧｐｒ１８のアミノ酸１〜５０の一部を認識するウサギポリクローナル抗Ｇｐｒ１８抗体；ヒトＧｐｒ１８のアミノ酸１６０〜２４０を含む領域を認識するウサギポリクローナル抗Ｇｐｒ１８抗体；ヒトＧｐｒ１８のアミノ酸１００〜１８０を含む領域を認識するウサギポリクローナル抗Ｇｐｒ１８抗体；ウサギモノクローナル抗Ｇｐｒ１８抗体クローンＥＰＲ１２３５９；及びヒトＧｐｒ１８のアミノ酸１４０〜１９０を含む領域を認識するウサギポリクローナル抗Ｇｐｒ１８抗体を含む。
特定の実施形態において、ホルミルペプチド受容体２（Ｆｐｒ２）はＭ１マクロファージ上で標的にされる。Ｆｐｒ２についての市販の抗体は、Ａｔｌａｓ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ、Ｂｒｏｍｍａ、Ｓｗｅｄｅｎ；Ｂｉｏｒｂｙｔ、ＬＬＣ、Ｓａｎ Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ、ＣＡ；Ｃｌｏｕｄ−Ｃｌｏｎｅ Ｃｏｒｐ．、Ｋａｔｙ、ＴＸ；ＵＳ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｓａｌｅｍ、ＭＡ；及びＮｏｖｕｓ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ、Ｌｉｔｔｌｅｔｏｎ、ＣＯから入手可能である。特定の実施形態において、抗ｆｐｒ２抗体は、マウスモノクローナル抗ｆｐｒ２抗体クローンＧＭ１Ｄ６；マウスモノクローナル抗ｆｐｒ２抗体クローン３０４４０５；組換え抗ｆｐｒ２抗体クローンＲＥＡ６６３；及びｆｐｒ２のアミノ酸３００〜３５０を含む領域を認識するウサギポリクローナル抗ｆｐｒ２抗体を含む。
特定の実施形態において、ターゲティングリガンドは、ＲＡＳＱＳＶＳＳＹＬＡ（配列番号９８）を含むＣＤＲＬ１配列、ＤＡＳＳＲＡＴ（配列番号９９）を含むＣＤＲＬ２配列、及びＱＬＲＳＮＷＰＰＹＴ（配列番号９２）を含むＣＤＲＬ３配列を含む可変軽鎖を含むヒト又はヒト化結合ドメイン（例えば、ｓｃＦｖ）を含む。特定の実施形態において、ターゲティングリガンドは、ＧＹＧＭＨ（配列番号１００）を含むＣＤＲＨ１配列、ＶＩＷＹＤＧＳＮＫＹＹＡＤＳＶＫＧ（配列番号１０１）を含むＣＤＲＨ２配列、及びＤＴＧＤＲＦＦＤＹ（配列番号１０２）を含むＣＤＲＨ３配列を含む可変重鎖を含むヒト又はヒト化結合ドメイン（例えば、ｓｃＦｖ）を含む。これらは、ＣＤ６４に結合するＣＤＲ配列を反映している。
ＣＤ６４に特異的ないくつかの抗体は当業者には公知であり、配列、エピトープ結合、及び親和性について容易に特徴付けることができる。例えば、米国特許第７，３７８，５０４号、国際公開第２００６／１３１９５３号パンフレット、及び国際公開第２００８／０７４８６７号パンフレットを参照されたい。ＣＤ６４についての市販の抗体は、Ａｎｃｅｌｌ、Ｂａｙｐｏｒｔ、ＭＮ；Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ；Ａｂｃａｍ、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、ＭＡ；ＬｉｆｅＳｐａｎ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｉｎｃ．、Ｓｅａｔｔｌｅ、ＷＡ；及びＮｏｖｕｓ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ、Ｌｉｔｔｌｅｔｏｎ、ＣＯから入手可能である。特定の実施形態において、抗ＣＤ６４抗体は、マウスモノクローナル抗ＣＤ６４抗体クローン３２−２；マウスモノクローナル抗ＣＤ６４抗体クローンＵＭＡＢ７４；ラットモノクローナル抗ＣＤ６４抗体クローン２９０３２２；マウスモノクローナル抗ＣＤ６４抗体クローン１０．１；及びマウスモノクローナル抗ＣＤ６４抗体クローン１Ｄ３を含む。
特定の実施形態において、ＣＤ８６はＭ１マクロファージ上で標的にされる。ＣＤ８６に特異的ないくつかの抗体は当業者には公知であり、配列、エピトープ結合、及び親和性について容易に特徴付けることができる。例えば、国際公開第２００４／０７６４８８号パンフレット、米国特許第８，３７８，０８２号（ｍＡｂ ２Ｄ４）、及び米国特許第６，３４６，２４８号（ＩＧ１０Ｈ６Ｄ１０）を参照されたい。ＣＤ８６についての市販の抗体は、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ；Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ、Ｂｅｒｇｉｓｃｈ Ｇｌａｄｂａｃｈ、Ｇｅｒｍａｎｙ；ＬｉｆｅＳｐａｎ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｉｎｃ．、Ｓｅａｔｔｌｅ、ＷＡ；Ｂｉｏ−Ｒａｄ、Ｈｅｒｃｕｌｅｓ、ＣＡ；及びＮｏｖｕｓ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ、Ｌｉｔｔｌｅｔｏｎ、ＣＯから入手可能である。特定の実施形態において、抗ＣＤ８６抗体は、マウスモノクローナル抗ＣＤ８６抗体クローンＢＵ６３；ヒトＣＤ８６のＡｌａ２３〜Ｈｉｓ２４４を含む領域を認識するポリクローナルヤギ抗ＣＤ８６抗体；マウスモノクローナル抗ＣＤ８６抗体クローンＩＴ２．２；ウサギモノクローナル抗ＣＤ８６抗体クローンＢＦＦ−３；及びマウスモノクローナル抗ＣＤ８６抗体クローンＣ８６／１１４６を含む。
ポリ（エチレンイミン）／ＤＮＡ（ＰＥＩ／ＤＮＡ）複合体などの、リンパ球及び／又はリンパ球のトランスフェクションによる内部移行を促進することができる他の薬剤も使用することができる。
（ｂ）正電荷キャリアー 特定の実施形態において、キャリアーは、濃縮し酵素的分解から核酸を防御するキャリアー分子を含む。本明細書の別の場所でさらに詳細に開示されているように、キャリアーは正電荷脂質及び／又はポリマーを含むことができる。特定の実施形態は、ポリ（βアミノエステル）（ＰＢＡＥ（例えば、ＰＢＡＥ４４７及び／又は１−（３−アミノプロピル）ピロリジン末端キャップ付きの）を利用する。一部の実施形態において、ＰＢＡＥの分子量は、４ｋＤａ〜６ｋＤａ、５ｋＤａ〜７ｋＤａ、６ｋＤａ〜８ｋＤａ、７ｋＤａ〜９ｋＤａ、８ｋＤａ〜１０ｋＤａ、又は９ｋＤａ〜１１ｋＤａである。一部の実施形態において、ＰＢＡＥの分子量は、４ｋＤａ、５ｋＤａ、６ｋＤａ、７ｋＤａ、８ｋＤａ、９ｋＤａ又は１１ｋＤａである。一部の実施形態において、ＰＢＡＥの分子量は、４ｋＤａ未満又は１１ｋＤａよりも大きい。一部の実施形態において、ＰＢＡＥはＰＢＡＥ４４７である。一部の実施形態において、ＰＢＡＥ４４７の分子量は、４ｋＤａ〜６ｋＤａ、５ｋＤａ〜７ｋＤａ、６ｋＤａ〜８ｋＤａ、７ｋＤａ〜９ｋＤａ、８ｋＤａ〜１０ｋＤａ、又は９ｋＤａ〜１１ｋＤａである。一部の実施形態において、ＰＢＡＥ４４７の分子量は、４ｋＤａ、５ｋＤａ、６ｋＤａ、７ｋＤａ、８ｋＤａ、９ｋＤａ又は１１ｋＤａである。一部の実施形態において、ＰＢＡＥ４４７の分子量は、４ｋＤａ未満又は１１ｋＤａよりも大きい。
ゲル浸透クロマトグラフィー（ＧＰＣ）により評価する場合、ポリマー（例えば、ＰＢＡＥ）は、例えば、３，０００〜６，０００若しくは４，０００〜５，０００のＭｎ範囲；１０，０００〜２０，０００若しくは１４，５００〜２１，０００のＭｗ範囲；及び／又は５５，０００〜７７，０００若しくは６０，０００〜７２，０００のＭｚ範囲を含む、マトリックス内に一定範囲のポリマー長を含むことができる。特定の実施形態において、キャリアーマトリックス内のＰＢＡＥは、Ｍｎ＝４，０００〜５，０００；Ｍｗ＝１４，５００〜２１，０００；及びＭｚ＝６０，０００〜７２，０００のＧＰＣによる分子量分布を有する。
一部の実施形態において、ＰＢＡＥは１つ以上の分子にコンジュゲートされている。一部の実施形態において、ＰＢＡＥはポリエチレングリコールにコンジュゲートされて（ＰＥＧ−ＰＢＡＥを形成する）。末端基は、トランスフェクション効率にも大きな役割を果たすことができ、三級アミンを含有する末端キャップが好まれる。
正電荷脂質の追加の例は、ジパルミトイルホスファチジン酸又はジステアロイルホスファチジン酸とヒドロキシエチレンジアミンのエステルなどのホスファチジン酸とアミノアルコールのエステルを含む。正電荷脂質のさらに具体的な例は、３β−［Ｎ−（Ｎ’，Ｎ’−ジメチルアミノエチル）カルバモイル］コレステロール（ＤＣ−ｃｈｏｌ）；Ｎ，Ｎ’−ジメチル−Ｎ，Ｎ’−ジオクタシル臭化アンモニウム（ＤＤＡＢ）；Ｎ，Ｎ’−ジメチル−Ｎ，Ｎ’−ジオクタシル塩化アンモニウム（ＤＤＡＣ）；１，２−ジオレオイルオキシプロピル−３−ジメチル−ヒドロキシエチル塩化アンモニウム（ＤＯＲＩ）；１，２−ジオレオイルオキシ−３−［トリメチルアンモニオ］プロパン（ＤＯＴＡＰ）；Ｎ−（１−（２，３−ジオレイルオキシ）プロピル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニウム塩化物（ＤＯＴＭＡ）；ジパルミトイルホスファチジルコリン（ＤＰＰＣ）；１，２−ジオクタデシルオキシ−３−［トリメチルアンモニオ］−プロパン（ＤＳＴＡＰ）；及び、例えば、Ｍａｒｔｉｎら、Ｃｕｒｒ．Ｐｈａｒｍａ．Ｄｅｓｉｇｎ、１１：３７５〜３９４、２００５年に記載されているカチオン性脂質を含む。
本開示内でキャリアーとして使用することができる正電荷ポリマーの例は、ポリアミン；ポリオーガニックアミン（例えば、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）、ポリエチレンイミンセルロース）；ポリ（アミドアミン）（ＰＡＭＡＭ）；ポリアミノ酸（例えば、ポリリジン（ＰＬＬ）、ポリアルギニン）；多糖（例えば、セルロース、デキストラン、ＤＥＡＥデキストラン、デンプン）；スペルミン、スペルミジン、ポリ（ビニルベンジルトリアルキルアンモニウム）、ポリ（４−ビニル−Ｎ−アルキル−ピリジニウム）、ポリ（アクリロイル−トリアルキルアンモニウム）及びＴａｔタンパク質を含む。
脂質とポリマーの混合物も、いかなる濃度でも及びいかなる比でも使用可能である。種々の等級を使用して異なるポリマータイプを異なる比で混合すると、寄与ポリマーのそれぞれから借りてくる特徴をもたらすことができる。種々の末端基化学も採用することができる。
前述のことを制限せずに、本明細書で開示される特定の実施形態は、多孔質ネットワークを形成することができるいかなる材料からでも構築される多孔質ナノ粒子も利用することができる。例示的材料は、金属、遷移金属及びメタロイドを含む。例示的金属、遷移金属及びメタロイドは、リチウム、マグネシウム、亜鉛、アルミニウム及びシリカを含む。特定の実施形態において、多孔質ナノ粒子はシリカを含む。メソ多孔性シリカの並外れて大きな表面積（１，０００ｍ２／ｇを超える）のために、リポソームなどの従来のＤＮＡキャリアーを超えるレベルでの核酸負荷が可能になる。
キャリアーマトリックスは、楕円体、立方状、ピラミッド形、長方形、円柱形、ドーナツ形及び同類の物を含む種々の異なる形状で形成することができる。核酸は、種々のやり方でキャリアーの気孔中に含めることができる。例えば、核酸は多孔質ナノ粒子にカプセル化することができる。他の態様では、核酸は、多孔質ナノ粒子の表面又は表面のすぐ下付近に会合している（例えば、共有結合的に及び／又は非共有結合的に）ことができる。特定の実施形態において、核酸は、多孔質ナノ粒子に組み込まれる、例えば、多孔質ナノ粒子の材料に組み込まれることができる。例えば、核酸は、ポリマーナノ粒子のポリマーマトリックス中に組み込まれることができる。
（ｃ）正電荷キャリアー内の核酸 治療タンパク質を発現させる核酸は、ＣＡＲ、ＴＣＲ、ＣＡＲ／ＴＣＲハイブリッド及びマクロファージ活性化因子との関係で上に記載されている。
（ｄ）中性又は負電荷コーティング 特定の実施形態において、本明細書に開示されるナノ粒子は、カプセル化された核酸を遮蔽しオフターゲット結合を減らす又は防止するコーティングを含む。オフターゲット結合は、ナノ粒子の表面電荷を中性又は負に還元することにより減らされる又は防止される。本明細書の別の場所でさらに詳細に開示されるように、コーティングは、中性若しくは負のポリマー及び／又はリポソームベースのコーティングを含むことができる。特定の実施形態は、ナノ粒子コーティングとしてポリグルタミン酸（ＰＧＡ）を利用する。使用された場合、コーティングは必ずしも全ナノ粒子を被覆する必要はない。有利なことに、コーティングは、ナノ粒子によるオフターゲット結合を減らすのに十分である。抗体断片（例えば、Ｆａｂ又はｓｃＦｖ）は、ＰＧＡコーティングに直接的に又は間接的に結合させることができる。例えば、抗体断片（例えば、Ｆａｂ又はｓｃＦｖ）は、例えば、Ｆａｂ又はｓｃＦｖ配列に付加されたシステインと反応するＰＧＡ−マレイミドを使用してＰＧＡに化学的に結合させることができる。一部の実施形態において、抗体はリンカー（例えば、タンパク質リンカー若しくはポリペプチドリンカー、又は化学的リンカー）を通じて結合される。
特定の実施形態において、コーティングは、カプセル化された核酸が選択された細胞中への放出前に環境に曝露されるのを防ぐのに十分な親水性及び／又は中性電荷親水性ポリマーの密な表面コーティングである。特定の実施形態において、コーティングはナノ粒子の表面の少なくとも８０％又は少なくとも９０％を覆う。特定の実施形態において、コーティングはＰＧＡを含む。
本開示の実施形態内でコーティングとして使用することができる中性電荷ポリマーの例は、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）；ポリ（プロピレングリコール）；及びポリアルキレンオキシドコポリマー（ＰＬＵＲＯＮＩＣ（登録商標）、ＢＡＳＦ Ｃｏｒｐ．、Ｍｏｕｎｔ Ｏｌｉｖｅ、ＮＪ）を含む。
中性電荷ポリマーは双性イオンポリマーも含む。双性イオンとは、正電荷と負電荷の両方を有しつつ全体的な電荷的中性という特性のことである。双性イオンポリマーは、細胞及びタンパク質接着に抵抗する細胞膜の領域のような振る舞いができる。
双性イオンポリマーは、ペンダント基（すなわち、ポリマー骨格から垂れ下がった基）を双性イオン基と一緒に含む双性イオン構成単位を含む。例示的な双性イオンペンダント基は、カルボキシベタイン基（例えば、−Ｒａ−Ｎ＋（Ｒｂ）（Ｒｃ）−Ｒｄ−ＣＯ２−、Ｒａはポリマー骨格をカルボキシベタイン基のカチオン窒素中心に共有結合的に連結させるリンカー基であり、Ｒｂ及びＲｃは窒素置換基であり、Ｒｄはカチオン窒素中心をカルボキシベタイン基のカルボキシ基に共有結合的に連結させるリンカー基である）。
負電荷ポリマーの例は、アルギン酸；カルボン酸多糖；カルボキシメチルセルロース；カルボキシメチルセルロース−システイン；カラゲナン（例えば、Ｇｅｌｃａｒｉｎ（登録商標）（ＦＭＣ Ｃｏｒｐ．、Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ、ＤＥ）２０９、Ｇｅｌｃａｒｉｎ（登録商標）３７９）；コンドロイチン硫酸；グルコサミノグリカン；ムコ多糖；負電荷多糖（例えば、デキストラン硫酸）；ポリ（アクリル酸）；ポリ（Ｄ−アスパラギン酸）；ポリ（Ｌ−アスパラギン酸）；ポリ（Ｌ−アスパラギン酸）ナトリウム塩；ポリ（Ｄ−グルタミン酸）；ポリ（Ｌ−グルタミン酸）；ポリ（Ｌ−グルタミン酸）ナトリウム塩；ポリ（メタクリル酸）；アルギン酸ナトリウム（例えば、ＰＲＯＴＡＮＡＬ（登録商標）（ＦＭＣ ＢＩＯＰＯＬＹＭＥＲ、ＯＳＬＯ、ＮＯＲＷＡＹ）ＬＦ １２０Ｍ、ＰＲＯＴＡＮＡＬ（登録商標）ＬＦ ２００Ｍ、ＰＲＯＴＡＮＡＬ（登録商標）ＬＦ ２００Ｄ）；カルボキシメチルセルロースナトリウム（ＣＭＣ）；硫酸化多糖（ヘパリン、アガロペクチン）；ペクチン、ゼラチン及びヒアルロン酸を含む。
特定の実施形態において、本明細書で開示されるポリマーは、「星形ポリマー」を含むことができ、これは２つ以上のポリマー分岐がコアから伸びている分岐ポリマーのことである。コアは、２つ以上の官能基を有する原子団であり、そこから分岐鎖を重合により伸ばすことができる。
特定の実施形態において、分岐鎖は双性イオン又は負電荷ポリマー分岐鎖である。星型ポリマーは、分岐鎖前駆体を、加水分解、紫外線照射、又は熱により双性イオン又は負電荷ポリマーに変換することができる。ポリマーも、原子移動ラジカル重合（ＡＴＲＰ）、可逆的付加開裂連鎖移動重合（ＲＡＦＴ）、光重合、開環重合（ＲＯＰ）、濃縮、マイケル付加、分岐生成／成長反応、又は他の反応を含む、不飽和単量体の重合に効果的ないかなる重合法によって得てもよい。
リポソームは、少なくとも１つの同心脂質二重層を含む微細小嚢である。小嚢形成脂質は、最終複合体の流動性又は強剛性の指定度を達成するように選択される。特定の実施形態において、リポソームは、多孔質ナノ粒子を取り囲む外層である脂質組成物を提供する。
リポソームは中性（コレステロール）又は双極性であることが可能であり、ホスファチジルコリン（ＰＣ）、ホスファチジルエタノールアミン（ＰＥ）、ホスファチジルイノシトール（ＰＩ）及びスフィンゴミエリン（ＳＭ）並びにジオレオイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）を含む他のタイプの双極性脂質を含み、炭化水素鎖長は１４〜２２の範囲にあり、飽和している又は１つ以上の二重Ｃ＝Ｃ結合がある。単独で又は他の脂質成分と組み合わせて安定なリポソームを作成することができる脂質の例は、水素付加されたダイズホスファチジルコリン（ＨＳＰＣ）、レシチン、ホスファチジルエタノールアミン、リゾレシチン、リゾホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルセリン、ホスファチジルイノシトール、スフィンゴミエリン、セファリン、カルジオリピン、ホスファチジン酸、セレブロシド、ジステアロイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＳＰＥ）、ジオレオイルホスファチジルコリン（ＤＯＰＣ）、ジパルミトイルホスファチジルコリン（ＤＰＰＣ）、パルミトイルオレオイルホスファチジルコリン（ＰＯＰＣ）、パルミトイルオレオイルホスファチジルエタノールアミン（ＰＯＰＥ）及びジオレオイルホスファチジルエタノールアミン４−（Ｎ−マレイミド−メチル）シクロヘキサン−１−カルボキシレート（ＤＯＰＥ−ｍａｌ）などのリン脂質である。リポソーム中に組み込むことができる追加のリンを含有しない脂質は、ステアリルアミン、ドデシルアミン、ヘキサデシルアミン、ミリスチン酸イソプロピル、トリエタノールアミンラウリル硫酸、アルキルアリール硫酸、アセチルパルミテート、グリセロールリシノレート、ヘキサデシルステアレート、両性アクリルポリマー、ポリエチルオキシル化脂肪酸アミド、ＤＤＡＢ、ジオクタデシルジメチルアンモニウムクロライド（ＤＯＤＡＣ）、１，２−ジミリストイル−３−トリメチルアンモニウムプロパン（ＤＭＴＡＰ）、ＤＯＴＡＰ、ＤＯＴＭＡ、ＤＣ−Ｃｈｏｌ、ホスファチジン酸（ＰＡ）、ジパルミトイルホスファチジルグリセロール（ＤＰＰＧ）、ジオレオイルホスファチジルグリセロール、ＤＯＰＧ、及びリン酸ジセチルを含む。特定の実施形態において、本明細書に開示されるリポソームを作り出すのに使用される脂質は、コレステロール、水素化ダイズホスファチジルコリン（ＨＳＰＣ）及び誘導体化小嚢形成脂質ＰＥＧ−ＤＳＰＥを含む。
リポソームを形成する方法は、例えば、米国特許第４，２２９，３６０号、米国特許第４，２２４，１７９号、米国特許第４，２４１，０４６号、米国特許第４，７３７，３２３号、米国特許第４，０７８，０５２号、米国特許第４，２３５，８７１号、米国特許第４，５０１，７２８号、及び米国特許第４，８３７，０２８号に、並びにＳｚｏｋａら、Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｂｉｏｅｎｇ．９：４６７頁（１９８０）及びＨｏｐｅら、Ｃｈｅｍ．Ｐｈｙｓ．Ｌｉｐ．４０：８９頁（１９８６）に記載されている。
ナノ粒子を作成するさらなる例示的方法は、ＵＳ２０１８／００３０１５３、ＵＳ２０１７／０２９６６７６及びＷＯ２０１８／１２９２７０に開示されており、前記特許文献の開示はその全体をあらゆる目的のために本明細書に組み込む。
特定の実施形態において、コーティングが、５〜１００ｋＤａのポリマーサイズを有するポリマーベースとする。特定の実施形態において、コーティングが、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５又は１００ｋＤａのポリマーサイズを有するポリマーベースとする。
特定の実施形態において、ＰｂＡＥポリマーは、２０対１、３０対１、４０対１、５０対１、６０対１、７０対１、８０対１、９０対１、１００対１又はそれよりも多い比でヌクレオチド（例えば、ＩＶＴ ｍＲＮＡ）と混ぜ合わされてＰｂＡＥ−ヌクレオチドポリプレックスを生み出す。特定の実施形態において、ＰｂＡＥポリマーは、６０対１の比でヌクレオチド（例えば、ＩＶＴ ｍＲＮＡ）と混ぜ合わされてＰｂＡＥ−ヌクレオチドポリプレックスを生み出す。特定の実施形態において、ＰｂＡＥ−ヌクレオチドポリプレックスは、ＰＧＡ／Ｄｉ−マンノースと組み合わせてナノ粒子を形成することができる。
本明細書で開示されるナノ粒子のサイズは、広範囲にわたり変動することができ、異なるやり方で、例えば、動的光散乱及び／又は電子顕微鏡により測定可能である。例えば、本開示のナノ粒子は、１００ｎｍの最小寸法を有することができる。本開示のナノ粒子は、５００ｎｍに等しい若しくはこれ未満、１５０ｎｍ未満、１００ｎｍ未満、９０ｎｍ未満、８０ｎｍ未満、７０ｎｍ未満、６０ｎｍ未満、５０ｎｍ未満、４０ｎｍ未満、３０ｎｍ未満、２０ｎｍ未満又は１０ｎｍ未満の最小寸法を有することもできる。特定の実施形態において、ナノ粒子は、５ｎｍ〜５００ｎｍ、１０ｎｍ〜１００ｎｍ、２０ｎｍ〜９０ｎｍ、３０ｎｍ〜８０ｎｍ、４０ｎｍ〜７０ｎｍ及び４０ｎｍ〜６０ｎｍの範囲にわたる最小寸法を有することができる。特定の実施形態において、寸法はナノ粒子又は被覆ナノ粒子の直径である。特定の実施形態において、本開示のナノ粒子の集団は、５００ｎｍに等しい若しくはこれ未満、１００ｎｍ未満、９０ｎｍ未満、８０ｎｍ未満、７０ｎｍ未満、６０ｎｍ未満、５０ｎｍ未満、４０ｎｍ未満、３０ｎｍ未満、２０ｎｍ未満又は１０ｎｍ未満の平均最小寸法を有することができる。特定の実施形態において、本開示の組成物中のナノ粒子の集団は、５ｎｍ〜５００ｎｍ、１０ｎｍ〜１００ｎｍ、２０ｎｍ〜９０ｎｍ、３０ｎｍ〜８０ｎｍ、４０ｎｍ〜７０ｎｍ及び４０ｎｍ〜６０ｎｍの範囲にわたる平均径を有することができる。
（ｉｖ）組成物 本明細書で開示されるナノ粒子は、対象への直接投与のために組成物中に処方することができ、そこでは選択的ターゲティングがインビボで行われる。任意選択的に、１種よりも多いナノ粒子、すなわち、異なる治療タンパク質をコードする異なるパッセンジャー核酸を含有するナノ粒子は、順次にであれ同時にであれ、同じ対象に協調して投与することができる。
特定の実施形態において、ナノ粒子は、少なくとも０．１％ｗ／ｖ若しくはｗ／ｗのナノ粒子；少なくとも１％ｗ／ｖ若しくはｗ／ｗのナノ粒子；少なくとも１０％ｗ／ｖ若しくはｗ／ｗのナノ粒子；少なくとも２０％ｗ／ｖ若しくはｗ／ｗのナノ粒子；少なくとも３０％ｗ／ｖ若しくはｗ／ｗのナノ粒子；少なくとも４０％ｗ／ｖ若しくはｗ／ｗのナノ粒子；少なくとも５０％ｗ／ｖ若しくはｗ／ｗのナノ粒子；少なくとも６０％ｗ／ｖ若しくはｗ／ｗのナノ粒子；少なくとも７０％ｗ／ｖ若しくはｗ／ｗのナノ粒子；少なくとも８０％ｗ／ｖ若しくはｗ／ｗのナノ粒子；少なくとも９０％ｗ／ｖ若しくはｗ／ｗのナノ粒子；少なくとも９５％ｗ／ｖ若しくはｗ／ｗのナノ粒子；又は少なくとも９９％ｗ／ｖ若しくはｗ／ｗのナノ粒子を含むことができる組成物の一部として提供される。
本明細書で開示される組成物は、注射、吸入、注入、灌流、洗浄又は摂取による投与用に処方することができる。本明細書で開示される組成物は、カテーテル、静脈内、筋肉内、腫瘍内、皮内、動脈内、結節内（ｉｎｔｒａｎｏｄａｌ）、リンパ内（ｉｎｔｒａｌｙｍｐｈａｔｉｃ）、腹腔内、病巣内、前立腺内、膣内、直腸内、局所的、くも膜下腔内、小胞内、経口及び／又は皮下投与を経て、さらに詳しくは、静脈内、皮内、動脈内、結節内、リンパ内、腹腔内、病巣内、膣内、直腸内、局所的、くも膜下腔内、腫瘍内、筋肉内、小胞内、経口及び／又は皮下注射による注入用にさらに処方することができる。
注射及び注入では、組成物は、ハンクス液、リンゲル液又は生理食塩水を含むバッファー中などの水溶液として処方することができる。水溶液は、懸濁剤、安定化剤及び／又は分散剤などの調合剤を含有することができる。あるいは、製剤は、使用前に、適切な溶媒、例えば、減菌発熱性物質除去水で構成するための凍結乾燥及び／又は粉末形態が可能である。
経口投与では、組成物は、錠剤、ピル、糖衣錠、カプセル、液体、ジェル、シロップ、スラリー、懸濁液及び同類の物として処方することができる。例えば、粉末、カプセル及び錠剤などの経口固体製剤では、適切な賦形剤は、結合剤（トラガントガム、アカシアゴム、コーンスターチ、ゼラチン）、糖、例えば、ラクトース、スクロース、マンニトール及びソルビトールなどの充填剤；リン酸二カルシウム、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、サッカリンナトリウム、セルロース、炭酸マグネシウム；トウモロコシデンプン、小麦デンプン、米デンプン、ジャガイモデンプン、ゼラチン、トラガントガム、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウム及び／又はポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）などのセルロース調合剤；造粒剤；並びに結合剤を含む。必要に応じて、トウモロコシデンプン、ジャガイモデンプン、アルギン酸、架橋ポリビニルピロリドン、寒天又はアルギン酸若しくはアルギン酸ナトリウムなどのこの塩などの崩壊剤を添加することができる。必要に応じて、固形剤形は、標準技法を使用して糖衣をかける又は腸溶性が可能である。ペパーミント、冬緑油、チェリー調味料、オレンジ調味料、などの香味料も使用することができる。
吸入による投与では、組成物は、適切な噴霧剤、例えば、ジクロロジフルオロメタン、トリクロロフルオロメタン、ジクロロテトラフルオロエタン、二酸化炭素又は他の適切な気体を使用して、加圧パック又はネブライザーからエアゾールスプレイとして処方することができる。加圧エアゾールの場合には、投薬単位は、計った量を送達するバルブを与えることにより決定してもよい。吸入器又は注入器で使用するためのゼラチンのカプセル及びカートリッジは、治療薬とラクトース又はデンプンなどの適切な粉末ベースの粉末混合物を含有して処方してよい。
本明細書に開示されるいかなる組成物製剤も、研究のためであれ、予防的処置であれ、及び／又は治療的処置であれ、投与の効果を凌ぐ著しく有害な、アレルギー性の又は他の都合の悪い反応を生じない担体を含む他のいかなる薬学的に許容される担体でも有利に含むことができる。例示的な薬学的に許容される担体及び製剤は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、１８ｔｈ Ｅｄ．Ｍａｃｋ Ｐｒｉｎｔｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ、１９９０年に開示されている。さらに、製剤は、米国食品医薬品局生物製剤基準局（Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ ＦＤＡ Ｏｆｆｉｃｅ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｓｔａｎｄａｒｄｓ）及び／又は他の関連する外国規制当局により要求される無菌性、発熱性、一般的安全性及び純度基準を満たすように調製することができる。
例示的な一般に使用される薬学的に許容される担体は、ありとあらゆる充填剤若しくはフィラー、溶媒若しくは共溶媒、分散媒、被覆剤、界面活性剤、抗酸化剤（例えば、アスコルビン酸、メチオニン、ビタミンＥ）、保存剤、等張化剤、吸収遅延剤、塩、安定化剤、緩衝剤、キレート剤（例えば、ＥＤＴＡ）、ゲル、結合剤、崩壊剤、及び／又は潤滑剤を含む。
例示的緩衝剤は、クエン酸塩緩衝剤、コハク酸塩緩衝剤、酒石酸塩緩衝剤、フマル酸塩緩衝剤、グルコン酸塩緩衝剤、シュウ酸塩緩衝剤、乳酸塩緩衝剤、酢酸緩衝剤、リン酸緩衝剤、ヒスチジン緩衝剤及び／又はトリメチルアミン塩を含む。
例示的保存剤は、フェノール、ベンジルアルコール、メタクレゾール、メチルパラベン、プロピルパラベン、オクタデシルジメチルベンジルアンモニウムクロリド、ベンザルコニウムハロゲン化物、塩化ヘキサメトニウム、メチル又はプロピルパラベンなどのアルキルパラベン、カテコール、レゾルシノール、クロロヘキサノール及び３−ペンタノールを含む。
例示的等張剤は、グリセリン、エリスリトール、アラビトール、キシリトール、ソルビトール又はマンニトールなどの三水素化合物又は高級糖アルコールを含む多価糖アルコールを含む。
例示的安定化剤は、有機糖、多価糖アルコール、ポリエチレングリコール；硫黄含有還元剤、アミノ酸、低分子量ポリペプチド、タンパク質、免疫グロブリン、親水性ポリマー又は多糖を含む。
組成物は、デポ製剤として処方することもできる。デポ製剤は、適切なポリマー若しくは疎水性材料（例えば、許容される油中の乳剤として）又はイオン交換樹脂を用いて、又はやや難溶の誘導体として、例えば、やや難溶性塩として処方することができる。
さらに、組成物は、少なくとも１つの活性成分を含有する固体ポリマーの半透性マトリックスを利用する徐放性系として処方することができる。種々の徐放性材料が確立されており、当業者には周知である。徐放性系は、その化学的性質に応じて、２週間〜１ヶ月間の投与後に活性成分を放出してよい。特定の実施形態において、例えば、ヒト患者が毎週の投与を取り損ねた場合には、徐放性系を利用することができる。本明細書に記載されるナノ粒子の特定の実施形態の半減期は４時間である。放出を維持するため、ナノ粒子は、時間をかけてゆっくりナノ粒子を放出するハイドロゲル又は生分解性ポリマー内にカプセル化することができる。ｍＲＮＡそれ自体は、例えば、ＰＢＡＥポリマー内に濃縮された場合は、安定である。
（ｖ）使用方法 本明細書で開示される方法は、本明細書で開示される組成物を用いて対象（ヒト、獣医動物、家畜及び研究動物を含む）を処置することを含む。示されているように、組成物は、がんから感染性疾患の範囲に及ぶ種々の異なる状態を処置することができる。
治療的に有効な処置 対象を処置することは、治療有効量の１種以上の組成物（複数可）を送達することを含む。治療有効量は、有効量、予防的処置及び／又は治療的処置を提供することができる。
「有効量」は、対象において所望の生理的変化を生じるのに必要な化合物の量である。有効量は、研究目的で投与されることも多い。例えば、本明細書で開示される有効量は、対象への投与後に、選択された細胞型によって治療タンパク質などの核酸又はタンパク質の発現（例えば、一過性発現）をもたらす。さらなる例として、有効量の細胞誘引物質は、対象に投与された場合、特定の細胞型（例えば、Ｔ細胞）を投与部位に動員するという結果をもたらす。
「予防的処置」は、疾患又は状態をさらに発症するリスクを縮小する、予防する、又は減少する目的で処置が施されるように、疾患若しくは状態の徴候若しくは症状を示さない又は疾患若しくは状態の初期徴候若しくは症状のみを示す対象に施される処置を含む。したがって、予防的処置は、疾患又は障害に対する予防処置として機能する。ワクチンは予防処置の一例である。
特定の実施形態において、予防処置は、ＨＩＶなどのウイルス感染を処置するために施される。例えば、組成物は、ウイルス感染を発症するリスクのある、又はウイルスに曝露されたことがある対象において予防的に投与すれば、ウイルス感染又は疾患の発症を予防する、低減する又は遅らせることができる。例えば、組成物は、ウイルス（例えば、ＨＩＶ）に曝露された可能性がある対象に又はウイルスに曝露される高いリスクのある対象に投与することができる。
「治療処置」は、疾患又は状態の症状又は徴候を示す対象に施される処置を含み、疾患又は状態のこれらの徴候又は症状を減らす又は取り除く目的で対象に施される。「治療処置」は、対象において所望の治療効果をもたらす。
予防及び治療処置は、疾患又は状態を完全に予防する又は治癒する必要はなく、部分的効果も提供できる。
がんの文脈では、治療有効量は、腫瘍細胞の数を減らす、転移の数を減らす、腫瘍量を減らす、平均寿命を上昇する、がん細胞のアポトーシスを誘導する、がん細胞死を誘導する、がん細胞における化学又は放射線感受性を誘導する、がん細胞近くの血管新生を阻害する、がん細胞増殖を阻害する、腫瘍成長を阻害する、転移を予防する、対象の寿命を延ばす、がん関連疼痛を低減する、転移の数を低減する及び／又は処置に続くがんのぶり返し若しくは再発を低減することができる。
ウイルスの文脈では、治療有効量は、ウイルス感染細胞の数を減らし、発熱、悪寒、嘔吐、関節痛、などのウイルス感染に伴う１種以上の症状を低減することができる。
ＨＩＶの文脈では、治療有効量は、ＨＩＶ感染細胞の数を減らし、対象のＴ細胞の数を増やし、感染症の発生、頻度若しくは重症度を低減し、平均寿命を上昇し、対象の寿命を延ばし、及び／又はＨＩＶ関連疼痛若しくは認知障害を低減することができる。
投与に関して、治療有効量（本明細書において用量とも呼ばれる）は、インビトロアッセイ及び／又は動物モデル研究からの結果に基づいて最初に評価することができる。そのような情報を使用すれば、目的の対象における有用な用量をより的確に決定することができる。
特定の対象に投与される実際の服用量は、医師、獣医師又は研究者により、標的、体重、状態の重症度、疾患の種類、以前の又は同時の治療介入、対象の特発性及び投与経路を含む身体的及び生理的要因などのパラメータを考慮に入れて決定することができる。
組成物の有用な用量は、０．１〜５μｇ／ｋｇ又は０．５〜１μｇ／ｋｇ又は１〜１０００ｍｇ／ｋｇ又はそれよりも多くを含むことができる。
治療有効量は、治療目標又は効果を得るが、処置レジメンの過程で単回又は複数回用量を投与することにより達成することができる。そのような用量は、例えば、毎日、１日おき、４日ごとに、２〜８日ごとに、３〜１０日ごとに、５〜１０日ごとに、６〜９日ごとに、毎週、又は２週間ごとに投与してよい。任意選択的に、投与間の時間は変動してよい。一部の実施形態において、単回用量で所望の治療効果を与え；他の実施形態において、複数回用量が必要になる。特定の実施形態において、処置レジメンの有効性、及び追加の用量（複数可）の必要性は、一過性に発現される治療タンパク質又は核酸により媒介される表現型効果を判定する、追跡する、又は測定することによりモニターすることができる。
特定の実施形態において、タンパク質又は核酸（例えば、治療タンパク質）の発現レベルが閾値より下に低下したら、処置医師は、ナノ粒子を用いた追加の処置が保証されるのかどうか、又は治療目的が達成されたかどうか、及びナノ粒子を用いた追加の処置がその時点で保証されないことを判定することができる。特定の実施形態において、閾値の下は、定量的ＰＣＲ又はフローサイトメトリーにより測定される場合、ピーク発現レベルの５０％、４５％、４０％、３５％、３４％、３３％、３２％、３１％、３０％、２９％、２８％、２７％、２６％、２５％、２４％、２３％、２２％、２１％、２０％、１９％、１８％、１７％、１６％、１５％、１４％、１３％、１２％、１１％、１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％、１％又はそれよりも下が可能である。特定の実施形態において、閾値の下は、定量的ＰＣＲにより測定される場合、ピーク発現レベルの１５％、１４％、１３％、１２％、１１％、１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％、１％又はそれよりも下が可能である。特定の実施形態において、閾値は、フローサイトメトリーにより測定した場合、タンパク質又は核酸を発現するナノ粒子トランスフェクトＴ細胞の３５％、３４％、３３％、３２％、３１％、３０％、２９％、２８％、２７％、２６％、２５％、２４％、２３％、２２％、２１％、２０％、１９％、１８％、１７％、１６％、１５％、１４％、１３％、１２％、１１％、１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％、１％又はそれよりも下が可能である。特定の実施形態において、閾値は、治療タンパク質を発現する末梢血中のＣＤ８＋Ｔ細胞の２０％、１９％、１８％、１７％、１６％、１５％、１４％、１３％、１２％、１１％、１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％、１％又はそれよりも下が可能である。特定の実施形態において、閾値は、抗原陽性標的細胞を選択的に溶解するＩＶＴ ｍＲＮＡトランスフェクトＴ細胞の能力を測定するインビトロ生細胞アッセイにおいて得られる腫瘍細胞数が可能である。
特定の実施形態において、タンパク質又は核酸（例えば、治療タンパク質）の発現レベルが検出可能限界より下に低下した後、処置医師は、ナノ粒子を用いた追加の処置が保証されるのかどうか、又は治療目的が達成されたかどうか、及びナノ粒子を用いた追加の処置がその時点で保証されないことを判定することができる。
特定の実施形態において、タンパク質又は核酸（例えば、治療タンパク質）の発現は、この発現が定量的ＰＣＲにより検出されない場合は、検出可能限界よりも下に下がる。特定の実施形態において、検出可能限界は、フローサイトメトリーにより測定される場合、タンパク質又は核酸を発現する対象のＴ細胞の１％、０．９％、０．８％、０．７％、０．６％、０．５％、０．４％、０．３％、０．２％、０．１％、０．００５％、０．００１％又はそれよりも下が可能である。特定の実施形態において、検出可能限界は、治療タンパク質を発現する末梢血中のＣＤ８＋Ｔ細胞のパーセンテージが可能である。特定の実施形態において、検出可能限界は、タンパク質又は核酸を発現する対象の末梢血中のＣＤ８＋Ｔ細胞の２％、１．５％、１％、０．５％、１％、０．９％、０．８％、０．７％、０．６％、０．５％、０．４％、０．３％、０．２％、０．１％、０．００５％、０．００１％又はそれよりも下が可能である。
特定の実施形態において、本開示の方法は、エクスビボでナノキャリアーと接触させたＴ細胞の移植と少なくともおおよそ同じ有効性をもたらす。特定の実施形態において、少なくともおおよそ同じ有効性は、ナノ粒子でトランスフェクトされたＴ細胞（すなわち、ＩＶＴ ｍＲＮＡでトランスフェクトされたＴ細胞、そこではＩＶＴ ｍＲＮＡは治療タンパク質をコードする）の機能を同じ対応する治療タンパク質を用いてエクスビボで操作したＴ細胞の機能と比較することを含む。特定の実施形態において、エクスビボで操作されたＴ細胞はウイルス方法により形質導入させる。特定の実施形態において、比較する機能は、インビトロアッセイにおける細胞殺傷である。特定の実施形態において、少なくともおおよそ同じ有効性は、同じ対応する治療タンパク質を用いてエクスビボで操作したＴ細胞と比べた場合、ナノ粒子でトランスフェクトされたＴ細胞による抗原陽性標的細胞の殺傷に統計的有意差がないことを含む。特定の実施形態において、比較する機能は、インビトロアッセイにおけるサイトカイン産生である。特定の実施形態において、少なくともおおよそ同じ有効性は、同じ対応する治療タンパク質を用いてエクスビボで操作したＴ細胞と比べた場合、ナノ粒子でトランスフェクトされたＴ細胞によるＩＬ−２、ＴＮＦ−α及びＩＦＮ−γを含むサイトカイン産生のレベルに統計的有意差がないことを含む。特定の実施形態において、比較は、インビボでの腫瘍サイズ又は成長を含むことができる。特定の実施形態において、少なくともおおよそ同じ有効性は、同じ対応する治療タンパク質を形質導入させたＴ細胞を含む養子Ｔ細胞療法を受ける対象と比べた場合、治療タンパク質をコードするＩＶＴ ｍＲＮＡを注入した対象において腫瘍サイズ又は成長に統計的有意差がないことを含む。特定の実施形態において、比較は対象の生存を含むことができる。特定の実施形態において、少なくともおおよそ同じ有効性は、同じ対応する治療タンパク質を形質導入させたＴ細胞を含む養子Ｔ細胞療法を受ける対象と比べた場合、治療タンパク質をコードするＩＶＴ ｍＲＮＡを注入した対象の生存に統計的有意差がないことを含む。
所見における統計的有意性は、当業者に公知である統計的方法により決定することができる。特定の実施形態において、統計的有意差がないとは、＞０．０５又は＞０．０１のｐ値のことである。
選択された細胞誘引物質と協調した治療的に有効な処置 特定の実施形態において、核酸を送達して選択された細胞型による治療タンパク質の発現を与えるナノ粒子は、細胞誘引物質と協調し投与することができる。「協調して」とは、ナノ粒子と細胞誘引物質が臨床的に適切な時間窓内に投与されることを意味する。「臨床的に適切な時間窓」とは、ナノ粒子又は細胞誘引物質単独での投与に基づいてみられる治療効果よりも、ナノ粒子と細胞誘引物質の投与に基づいてみられる治療効果のほうが増加している期間を意味する。通常、細胞誘引物質はナノ粒子の前に投与されるが、このタイミングは、臨床的に適切な時間窓がナノ粒子の後の細胞誘引物質の投与を許す場合は必要ではない。
特定の実施形態において、細胞誘引物質は、発現ナノ粒子が投与される少なくとも１時間〜最大２週間前に対象に投与される（局所的に又は全身的に）。例えば、細胞誘引物質は、ナノ粒子組成物の投与の少なくとも１時間、少なくとも３時間、少なくとも６時間、少なくとも９時間、少なくとも１２時間、少なくとも２４時間、又は２４時間よりも多い前に投与される。ある特定の実施形態において、事前調整は、ナノ粒子の投与前の１〜２４時間、又は１〜７日前に行われる。特定の実施形態において、細胞誘引物質はＴ細胞プログラミングナノ粒子と同時送達することができる。
マクロファージ刺激組成物と協調して投与される治療的に有効な処置 特定の実施形態において、一過性に発現されるｍＲＮＡを含有するナノ粒子の送達は、異なる治療タンパク質を発現する（ＤＮＡ又はｍＲＮＡから）第２の標的化ナノ粒子を用いた処置などの、別の処置戦略と協調して行われてもよい。例として、マクロファージ刺激（マクロファージ活性化）ナノ粒子組成物（複数可）は、例示される第２の治療組成物として使用される。標的化ナノ粒子の追加のタイプ並びに追加の非ナノ粒子治療薬の同時投与も想定されていることは認識される。
例えば、本明細書に記載されるナノ粒子（疾患特異的受容体などの治療タンパク質をコードするＩＶＴ ｍＲＮＡを含む）は、処置を受けている対象のマクロファージを刺激する又はマクロファージ（複数可）の腫瘍抑制を克服するナノ粒子組成物と一緒に対象に投与することができる（同時に又は順番に）。そのようなマクロファージ活性化組成物はこれ自体、マクロファージの免疫抑制を逆転させる又は低減する治療タンパク質、例えば、転写因子をコードする核酸を含むナノ粒子であってよい。そのようなマクロファージ活性化ナノ粒子の例は、本明細書に記載されるナノ粒子に類似して構造化される（例えば、マクロファージ活性化ナノ粒子は正電荷コア及び中性又は負電荷表面を有し、標的化細胞における発現のためにヌクレオチド（複数可）を送達する）。特定の実施形態は、転写因子（例えば、Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ Ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ Ｆａｃｔｏｒｓ（ＩＲＦ））及び／又はマクロファージ極性化を調節するキナーゼ（例えば、ＩＫＫβ）などの活性化制御因子をコードする遺伝子をコードするヌクレオチドを細胞に提供する粒子を利用する。マクロファージ極性化は高度に動的な過程であり、それを通じてマクロファージの生理活性は変化する。大半の腫瘍では、ＴＡＭは、「Ｍ２」表現型であることが可能である免疫抑制された表現型を示す。これとは対照的に、活性化されたマクロファージは、腫瘍細胞の殺滅をもたらす「Ｍ１」表現型を示すことができる。本明細書で開示される特定の実施形態は、腫瘍促進ＴＡＭの極性化を、腫瘍を殺滅するマクロファージへと逆転する。この効果は、炎症性サイトカインを誘導し、他の免疫細胞を活性化し、腫瘍細胞を貪食することにより腫瘍内の免疫抑制性環境を寛解する。
例として、マクロファージ刺激ナノ粒子中のパッセンジャー核酸（複数可）は一部の実施形態において、転写因子インターフェロン制御因子５（ＩＲＦ５）をキナーゼＩＫＫβと組み合わせてコードする（ＤＮＡ又はＩＶＴ ｍＲＮＡとして）。そのような粒子は、腫瘍関連マクロファージ（ＴＡＭ）による粒子のより選択的な取込みを指示するＴＡＭターゲティングリガンドを含む。一例として、ＴＡＭは、粒子の表面上にマンノースを含むことにより標的にすることができる細胞表面受容体であるＣＤ２０６を発現する。標的にすることができる他のＴＡＭ細胞表面受容体は、初期成長応答タンパク質２（Ｅｇｒ２）、ＣＤ１６３、ＣＤ２３、インターロイキン（ＩＬ）２７ＲＡ、ＣＬＥＣ４Ａ、ＣＤ１ａ、ＣＤ１ｂ、ＣＤ９３、ＣＤ２２６、ＩＬ１３−Ｒａ１、ＩＬ−４ｒ、ＩＬ−１ＲタイプＩＩ、デコイＩＬ−１ＲタイプＩＩ、ＩＬ−１０ｒ、マクロファージスキャベンジング受容体Ａ及びＢ、Ｙｍ−１、Ｙｍ−２、低密度受容体関連タンパク質１（ＬＲＰ１）、ＩＬ−６ｒ、ＣＸＣＲ１／２並びにＰＤ−Ｌ１を含む。
特定の実施形態は、患者内の選択された細胞を標的にし、選択された細胞による治療タンパク質又は核酸の発現をもたらすナノ粒子組成物の患者への繰り返し送達を含む。この文脈では、一過性発現とは、細胞（複数可）中への核酸移入に続く短期間の治療タンパク質の発現のことである。そのような発現は、細胞の表現型の検出及び／又は定量化によりを含む種々の当技術分野で承認されたやり方でモニターすることができ、この表現型は発現された治療タンパク質又は核酸により生み出される又は影響される。細胞の表現型とは、細胞の物理的特徴及び／又は身体内でのこの位置のことである。特定の実施形態において、研究者又は臨床医は、ナノ粒子が提供する一過性発現プロファイルに基づいて送達のためのナノ粒子を選択する。
以前示されたように、特定の実施形態において、一過性発現プロファイルは、１２時間〜１５日間；１８時間〜１２日間；２０時間〜１４日間；２４時間〜１０日間；２４時間〜８日間；又は３０時間〜７日間持続する。種々の実施形態における一過性発現は１４日間を超えないことが特に想定されている。例えば、特定の実施形態において、一過性発現は、１２日間を越えずに、１０日間を越えずに、９日間を越えずに、８日間を越えずに又は７日間を超えずに持続する検出可能な発現である。もっと長い発現が望まれる実施形態において、治療タンパク質の一過性発現を提供するナノ粒子は、繰り返し投与、例えば、５〜１０日ごとに（例えば、７日ごとに）行われる送達で対象に送達することができる。
（ｖｉ）キット 活性成分の組合せもキットとして提供することができる。キットは、任意選択的に、組合せ療法において使用するための１種以上の作用薬と一緒に、本明細書に記載される１つ以上の発現ナノ粒子を含む容器を含むことができる。例えば、一部のキットは、一定量の少なくとも１つのマクロファージ刺激組成物（これ自体、例えば、一定量の少なくとも１つのマクロファージ刺激タンパク質をコードするｍＲＮＡ又はＤＮＡ分子を含有するナノ粒子でもよい）と一緒に、少なくとも１つの発現ナノ粒子を含む。他のキットは、Ｔ細胞誘引物質などの一定量の少なくとも１つの細胞誘引物質と一緒に一定量の少なくとも１つの発現ナノ粒子を含む。キット中のいかなる活性成分も予め測定した投与量で提供してもよいが、これは必要というわけではなく、ある特定のキットは、例えば、キットが、所望の発現ナノ粒子の１つよりも多い用量の投与を必要とする方法のために使用される場合を含む、１つよりも多い用量を含むことが予想されている。
一般には、２つ以上の活性成分を含むキットは、本明細書に記載される方法のうちの１つと併せて使用することが意図されている成分を含む。例えば、マクロファージ活性化化合物であれば、活性化されたマクロファージの存在から利益を得ると考えられる腫瘍又は別の部位において発現を提供するように設計されているナノ粒子を含有するキットで提供される。同様に、キットが細胞誘引物質と一緒に提供される場合、キットに含まれる少なくとも１つのナノ粒子は一部の場合、この細胞誘引物質により引き付けられる細胞型を標的にする。
キットは、医薬品又は生物学的製剤の製造、使用又は販売を規制する政府機関が定めた形式の通知も含むことができ、この通知は機関によるヒト投与のための製造、使用又は販売の承認を反映している。この通知は、提供される活性成分を対象に投与できることを明言する場合がある。キットは、キットを使用するための使用説明書、例えば、投与のためのポリヌクレオチド（ＰＮ）又はナノ粒子（ＮＰ）の調製；関連廃棄物の適正処理；及び同類の物に関する使用説明書をさらに含むことができる。使用説明書は、キット内に提供される印刷された使用説明書の形態が可能であり、又は使用説明書はキット自体の一部に印刷されることが可能である。使用説明書は、用紙、パンフレット、小冊子、ＣＤ−ＲＯＭ若しくはコンピュータ可読媒体の形態でもよく、又はウェブサイトなどの遠隔位置にある使用説明書への指図書きを提供することができる。特定の実施形態において、キットは、注射器、アンプル、チューブ、フェイスマスク、注射キャップ、スポンジ、無菌付着ストリップ、消毒薬（Ｃｈｌｏｒａｐｒｅｐ）、手袋、及び同類の物などの、キットを効果的に使用するのに必要とされる、なくてはならない医療材料の一部又は全ても含むことができる。本明細書に記載されるキットのいずれかの内容物を変えることは可能である。キットの使用説明書は、本明細書に記載される新たな臨床使用を実施するための活性成分の使用を指示する。
（ｖｉｉ）例示的実施形態
１．処置を必要とする対象を処置する方法であって、
（ｉ）ポリヌクレオチドはタンパク質及び／又は核酸をコードする、正電荷キャリアーマトリックス内にカプセル化されたポリヌクレオチド（例えば、インビトロ転写（ＩＶＴ）ｍＲＮＡなどの合成ｍＲＮＡ）；
（ｉｉ）中性又は負電荷コーティング；並びに
（ｉｉｉ）選択された細胞に特異的な、コーティングの表面から伸びる少なくとも１つの細胞ターゲティングリガンド
を含む治療有効量のナノ粒子を対象に投与すること
を含み、
ナノ粒子は、選択された細胞がポリヌクレオチドからタンパク質を一過性に発現するように、対象内の選択された細胞中に選択的に取り込まれ、それによって処置を必要とする対象が処置される、方法。
２．治療有効量の細胞誘引物質を対象に投与することをさらに含む、実施形態１の方法。
３．細胞誘引物質がＴ細胞誘引物質である、実施形態２の方法。
４．Ｔ細胞誘引物質がＣＣＬ２１又はＩＰ１０である、実施形態３の方法。
５．タンパク質が細胞表面受容体を含む疾患特異的受容体を含む、実施形態１〜４のいずれかの方法。
６．疾患特異的受容体が、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）又はこれらの組合せを含む、実施形態５の方法。
７．治療タンパク質が、白血病特異的ＣＡＲ、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）コア抗原特異的ＨＢｃｏｒｅ１８−２７ ＴＣＲ、又は前立腺腫瘍特異的抗ＲＯＲ１ ＣＡＲを含む、実施形態５又は６の方法。
８．細胞ターゲティングリガンドが、リンパ球に選択的に結合し受容体誘導エンドサイトーシスを開始させる、実施形態１〜７のいずれかの方法。
９．タンパク質の発現が１４日間を超えない、１２日間を超えない、１０日間を超えない、９日間を超えない、８日間を超えない、７日間を超えない、６日間を超えない、又は５日間を超えない発現である、実施形態１〜８のいずれかの方法。
１０．治療有効量のナノ粒子を対象に投与することが、２つ以上の用量のナノ粒子を投与することを含む、実施形態１〜９のいずれかの方法。
１１．２つ以上の用量が、５〜１０日ごとに、又は６〜８日ごとに、又は７日ごとに投与される、実施形態１０の方法。
１２．対象が、がん又は感染性疾患に対する処置を必要とする、実施形態１〜１１のいずれかの方法。
１３．ナノ粒子を投与することが、（ａ）腫瘍中への若しくはその近位への（腫瘍内への）、（ｂ）静脈中への（静脈内への）、又は（ｃ）腹膜中への（腹腔内への）カテーテルを介した注射又は注入を含む、実施形態１〜１２のいずれかの方法。
１４．Ｔ細胞誘引物質を投与することが、腫瘍中への若しくはその近位への（腫瘍内への）カテーテルを介した注射若しくは注入、静脈内注射若しくは注入、又は腹腔内へのカテーテルを介した注射若しくは注入を含む、実施形態３〜１３のいずれかの方法。
１５．細胞誘引物質が、ナノ粒子が投与される前に対象に投与される、実施形態２〜１４のいずれかの方法。
１６．細胞誘引物質が、ナノ粒子が投与される前の１時間以内に、３時間以内に、６時間以内に、１２時間以内に、又は２４時間以内に投与される、実施形態２〜１４のいずれかの方法。
１７．細胞誘引物質が、（ａ）ナノ粒子の最初の用量の後にのみ；（ｂ）ナノ粒子の少なくとも２回の用量のぞれぞれの後に；又は（ｃ）ナノ粒子のそれぞれの用量の後で投与される、実施形態１６の方法。
１８．対象にマクロファージ刺激組成物を投与することをさらに含む、実施形態１〜１７のいずれかの方法。
１９．マクロファージ刺激組成物が、マクロファージ細胞に標的化され、キナーゼＩＫＫβと組み合わせた転写因子インターフェロン制御因子５（ＩＲＦ５）の発現を指示することができるナノ粒子を含む、実施形態１８の方法。
２０．キャリアーが正電荷脂質又はポリマーを含む、実施形態１〜１９のいずれかの方法。
２１．正電荷ポリマーが、ポリ（β−アミノエステル）（ＰＢＡＥ）、ポリ（Ｌ−リジン）、ポリ（エチレンイミン）（ＰＥＩ）、ポリ（アミドアミン）デンドリマー（ＰＡＭＡＭ）、ポリ（アミノ−コ−エステル）、ポリ（ジメチルアミノエチルメタクリレート）（ＰＤＭＡＥＭＡ）、キトサン、ポリ（Ｌ−ラクチド−コ−Ｌ−リジン）、ポリ［α−（４−アミノブチル）−Ｌ−グリコール酸］（ＰＡＧＡ）、又はポリ（４−ヒドロキシ−Ｌ−プロリンエステル）（ＰＨＰ）を含む、実施形態２０の方法。
２２．コーティングが中性又は負電荷脂質又はポリマーを含む、実施形態１〜２１のいずれかの方法。
２３．中性又は負電荷コーティングが、ポリグルタミン酸（ＰＧＡ）、ポリ（アクリル酸）、アルギン酸又はコレステリルヘミスクシナート／１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミンを含む、実施形態２２の方法。
２４．中性又は負電荷コーティングが双性イオンポリマーを含む、実施形態２２の方法。
２５．中性又は負電荷コーティングがリポソームを含む、実施形態２２〜２４のいずれかの方法。
２６．リポソームが、１，２−ジオレオイル−３−トリメチルアンモニウムプロパン（ＤＯＴＡＰ）；１，２−ジ−Ｏ−オクタデセニル−３−トリメチルアンモニウムプロパン（ＤＯＴＭＡ）；３β−［Ｎ−（Ｎ’，Ｎ’−ジメチルアミノエタン）−カルバモイル］コレステロール（ＤＣ−Ｃｈｏｌ）、ジオクタデシルアミドグリシルスペルミン（ＤＯＧＳ）、コレステロール、１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン（ＤＯＰＥ）又は１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＤＯＰＣ）を含む、実施形態２５の方法。
２７．選択された細胞ターゲティングリガンドが、ＣＤ４及び／又はＣＤ８に選択的に結合する、実施形態１〜２６のいずれかの方法。
２８．選択された細胞ターゲティングリガンドが、ＣＤ４抗体及び／又はＣＤ８抗体から選択される結合ドメインを含む、実施形態１〜２７のいずれかの方法。
２９．選択された細胞ターゲティングリガンドが、ＣＤ４抗体及び／又はＣＤ８抗体のｓｃＦｖ断片から選択される結合ドメインを含む、実施形態１〜２８のいずれかの方法。
３０．キャリアーが、ＰＢＡＥ（例えば、ＰＢＡＥ４４７及び／又は１−（３−アミノプロピル）ピロリジン末端キャップを有する）を含む、実施形態１〜２９のいずれかの方法。
３１．コーティングがＰＧＡを含む、実施形態１〜３０のいずれかの方法。
３２．選択された細胞ターゲティングリガンドが、ＣＤ４抗体及び／又はＣＤ８抗体から選択される結合ドメインを含み；キャリアーがＰＢＡＥ（例えば、ＰＢＡＥ４４７及び／又は１−（３−アミノプロピル）ピロリジン末端キャップを有する）を含み；コーティングがＰＧＡを含む、実施形態１〜３１のいずれかの方法。
３３．（ｉ）タンパク質又は核酸をコードし正電荷キャリアー内にカプセル化されているポリヌクレオチド（例えば、ＩＶＴ ｍＲＮＡなどの合成ｍＲＮＡ）；
（ｉｉ）キャリアーの外表面上の中性又は負電荷コーティング；及び
（ｉｉｉ）コーティングの表面から伸びている選択された細胞ターゲティングリガンド
を含む合成ナノ粒子であって、
タンパク質が、ＨＢＶ特異的ＴＣＲ、白血病特異的抗ＣＤ１９ ＣＡＲ又は前立腺腫瘍特異的抗ＲＯＲ１ ＣＡＲから選択することができ、ＣＡＲの細胞内ドメインが１９２８ｚ又は４−１ＢＢｚが可能である、合成ナノ粒子。
３４．キャリアーが正電荷脂質又はポリマーを含む、実施形態３３の合成ナノ粒子。
３５．正電荷脂質又はポリマーが、ＰＢＡＥ、ポリ（Ｌ−リジン）、ＰＥＩ、ＰＡＭＡＭ、ポリ（アミン−コ−エステル）、ＰＤＭＡＥＭＡ、キトサン、ポリ（Ｌ−ラクチド−コ−Ｌ−リジン）、ＰＡＧＡ、又はＰＨＰを含む、実施形態３４の合成ナノ粒子。
３６．コーティングが中性又は負電荷脂質又はポリマーを含む、実施形態３３又は３４の合成ナノ粒子。
３７．中性又は負電荷コーティングが、ＰＧＡ、ポリ（アクリル酸）、アルギン酸又はコレステリルヘミスクシナート／１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミンを含む、実施形態３６の合成ナノ粒子。
３８．中性又は負電荷コーティングが双性イオンポリマーを含む、実施形態３６の合成ナノ粒子。
３９．中性又は負電荷コーティングがリポソームを含む、実施形態３６〜３８のいずれかの合成ナノ粒子。
４０．リポソームが、ＤＯＴＡＰ、ＤＯＴＭＡ、ＤＣ−Ｃｈｏｌ、ＤＯＧＳ、コレステロール、ＤＯＰＥ又はＤＯＰＣを含む、実施形態３９の合成ナノ粒子。
４１．選択された細胞ターゲティングリガンドが、ＣＤ４及び／又はＣＤ８に選択的に結合する、実施形態３３〜４０のいずれかの合成ナノ粒子。
４２．選択された細胞ターゲティングリガンドが、ＣＤ４抗体及び／又はＣＤ８抗体から選択される結合ドメインを含む、実施形態３３〜４１のいずれかの合成ナノ粒子。
４３．選択された細胞ターゲティングリガンドが、ＣＤ４抗体及び／又はＣＤ８抗体のｓｃＦｖ断片から選択される結合ドメインを含む、実施形態３３〜４２のいずれかの合成ナノ粒子。
４４．キャリアーが、ＰＢＡＥ（例えば、ＰＢＡＥ４４７及び／又は１−（３−アミノプロピル）ピロリジン末端キャップを有する）を含む、実施形態３３〜４３のいずれかの合成ナノ粒子。
４５．コーティングがＰＧＡを含む、実施形態３３〜４４のいずれかの合成ナノ粒子。
４６．選択された細胞ターゲティングリガンドが、ＣＤ４抗体及び／又はＣＤ８抗体から選択される結合ドメインを含み；キャリアーがＰＢＡＥ（例えば、ＰＢＡＥ４４７及び／又は１−（３−アミノプロピル）ピロリジン末端キャップを有する）を含み；コーティングがＰＧＡを含む、実施形態３３〜４５のいずれかの合成ナノ粒子。
４７．実施形態３３〜４６のいずれかの合成ナノ粒子を含む組成物。
４８．処置を必要とする対象を処置する方法であって、実施形態４７の治療有効量の組成物を投与し、それによって処置を必要とする対象を処置することを含む、方法。
４９．ナノ粒子又は組成物を投与する前にＴ細胞誘引物質を対象に投与することをさらに含む、実施形態４８の方法。
５０．処置を必要とする対象を処置する方法であって、対象への投与後に、選択された細胞型によってタンパク質又は核酸の発現をもたらすナノ粒子を選択すること、及び
治療有効量の選択されたナノ粒子を対象に投与すること、それによって処置を必要とする対象を処置すること
を含み、タンパク質又は核酸の発現は、投与の１０日以内に検出可能限界より下に低下する、方法。
５１．タンパク質又は核酸の発現が投与の７日以内に検出可能限界より下に低下する、実施形態５０の方法。
５２．第２の治療有効量の選択されたナノ粒子を対象に投与することをさらに含む、実施形態５０又は５１の方法。
５３．タンパク質又は核酸の発現が検出可能限界より下に低下した後に、第２の治療有効量の投与が行われる、実施形態５２の方法。
５４．タンパク質又は核酸の発現が検出可能限界より下に低下する前に、第２の治療有効量の投与が行われる、実施形態５２の方法。
５５．第１の治療有効量と第２の治療有効量が、５日離して、６日離して、７日離して、８日離して、９日離して又は１０日離して投与される、実施形態５２の方法。
５６．投与が全身的投与又は局所的投与を含む、実施形態５０〜５５のいずれかの方法。
５７．投与が腫瘍部位での局所的投与を含む、実施形態５６の方法。
５８．投与が、（ａ）腫瘍中への若しくはその近位への、（ｂ）静脈中への、又は（ｃ）腹膜中へのカテーテルを介した注射又は注入を含む、実施形態５０〜５７のいずれかの方法。
５９．タンパク質が、細胞表面受容体を含む疾患特異的受容体を含む、実施形態５０〜５８のいずれかの方法。
６０．疾患特異的受容体が、ＣＡＲ、ＴＣＲ又はこれらのハイブリッドを含む、実施形態５９の方法。
６１．治療タンパク質が、ＨＢＶ特異的ＴＣＲ、白血病特異的抗ＣＤ１９ ＣＡＲ、又は前立腺腫瘍特異的抗ＲＯＲ１ ＣＡＲを含み、ＣＡＲの細胞内ドメインが１９２８ｚ又は４−１ＢＢｚが可能である、実施形態５０〜６０のいずれかの方法。
６２．タンパク質が、マクロファージ刺激タンパク質を含む、実施形態５０〜６１のいずれかの方法。
６３．マクロファージ刺激タンパク質が、転写因子ＩＲＦ５をキナーゼＩＫＫβと組み合わせて含む、実施形態６２の方法。
６４．マクロファージ刺激タンパク質が、ＩＲＦ５、ＩＲＦ１、ＩＲＦ３、ＩＲＦ７、ＩＲＦ８及び／又はＩＲＦ７とＩＲＦ３の融合物から選択される１種以上のＩＲＦを含む、実施形態６２の方法。
６５．ＩＲＦ７／ＩＲＦ３融合タンパク質が配列番号３９を含む、実施形態６４の方法。
６６．１つ以上のＩＲＦが機能的自己抑制ドメインを欠く、実施形態６３〜６５のいずれかの方法。
６７．１つ以上のＩＲＦが機能的核外移行シグナル（ＮＥＳ）を欠く、実施形態６３〜６６のいずれかの方法。
６８．１つ以上のＩＲＦが、配列番号２５〜４１に対し＞９０％、＞９５％又は９８％よりも大きな同一性を有する配列から選択される、実施形態６４の方法。
６９．１つ以上のＩＲＦが、配列番号２５〜３１から選択されるＩＲＦ５である、実施形態６４の方法。
７０．ＩＲＦ５が、Ｓ１５６Ｄ、Ｓ１５８Ｄ及びＴ１６０Ｄから選択される１つ以上の突然変異を有する配列番号２５又は配列番号２７を含む、実施形態６９の方法。
７１．ＩＲＦ５が、Ｔ１０Ｄ、Ｓ１５８Ｄ、Ｓ３０９Ｄ、Ｓ３１７Ｄ、Ｓ４５１Ｄ及びＳ４６２Ｄから選択される１つ以上の突然変異を有する配列番号２６を含む、実施形態６９の方法。
７２．ＩＲＦ５が、Ｓ４２５Ｄ、Ｓ４２７Ｄ、Ｓ４３０Ｄ及びＳ４３６Ｄから選択される１つ以上の突然変異を有する配列番号２８を含む、実施形態６９の方法。
７３．１つ以上のＩＲＦが、配列番号３２及び３６から選択されるＩＲＦ１である、実施形態６４の方法。
７４．１つ以上のＩＲＦが、配列番号３５、４０及び４１から選択されるＩＲＦ８である、実施形態６４の方法。
７５．ＩＲＦ８がＫ３１０Ｒ突然変異を有する配列番号３５を含む、実施形態７４の方法。
７６．コードされたＩＫＫβが、配列番号４２〜４６に対し＞９０％、＞９５％又は９８％よりも大きな同一性を有する配列から選択される、実施形態６３〜７５のいずれかの方法。
７７．コードされたＩＫＫβが、配列番号４２〜４６から選択される、実施形態６３〜７５のいずれかの方法。
７８．治療タンパク質が、グルココルチコイド誘導性ロイシンジッパー（ＧＩＬＺ）を含む、実施形態５０〜７７のいずれかの方法。
７９．選択され投与されるナノ粒子が＜１３０ｎｍである、実施形態５０〜７８のいずれかの方法。
８０．選択され投与されるナノ粒子が、
（ｉ）治療タンパク質をコードする、正電荷キャリアーマトリックス内にカプセル化された合成ｍＲＮＡ；
（ｉｉ）中性又は負電荷コーティング；及び
（ｉｉｉ）選択された細胞型上のマーカーに特異的に結合する、コーティングの表面から伸びる少なくとも１つの選択された細胞ターゲティングリガンド
を含む、実施形態５０〜７９のいずれかの方法。
８１．合成ｍＲＮＡがＩＶＴ ｍＲＮＡを含む、実施形態８０の方法。
８２．正電荷キャリアーマトリックスが正電荷脂質又はポリマーを含む、実施形態８０又は８１の方法。
８３．正電荷脂質又はポリマーが、ＰＢＡＥ、ポリ（Ｌ−リジン）、ＰＥＩ、ＰＡＭＡＭ、ポリ（アミン−コ−エステル）、ＰＤＭＡＥＭＡ、キトサン、ポリ（Ｌ−ラクチド−コ−Ｌ−リジン）、ＰＡＧＡ、又はＰＨＰを含む、実施形態８２の方法。
８４．正電荷ポリマーが、ＰＢＡＥ（例えば、ＰＢＡＥ４４７及び／又は１−（３−アミノプロピル）ピロリジン末端キャップを有する）を含む、実施形態８０〜８３のいずれかの方法。
８５．中性又は負電荷コーティングが、ＰＧＡ、ポリ（アクリル酸）、アルギン酸又はコレステリルヘミスクシナート／１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミンを含む、実施形態８０〜８４のいずれかの方法。
８６．中性又は負電荷コーティングがＰＧＡを含む、実施形態８０〜８５のいずれかの方法。
８７．中性又は負電荷コーティングが双性イオンポリマーを含む、実施形態８０〜８５のいずれかの方法。
８８．中性又は負電荷コーティングがリポソームを含む、実施形態８０〜８５のいずれかの方法。
８９．リポソームが、ＤＯＴＡＰ、ＤＯＴＭＡ、ＤＣ−Ｃｈｏｌ、ＤＯＧＳ、コレステロール、ＤＯＰＥ又はＤＯＰＣを含む、実施形態８８の方法。
９０．選択された細胞ターゲティングリガンドが、リンパ球に選択的に結合し受容体誘導エンドサイトーシスを開始させる、実施形態８０〜８９のいずれかの方法。
９１．選択された細胞ターゲティングリガンドが、ＣＤ４及び／又はＣＤ８に選択的に結合する、実施形態８０〜９０のいずれかの方法。
９２．選択された細胞ターゲティングリガンドが、ＣＤ４抗体及び／又はＣＤ８抗体から選択される結合ドメインを含む、実施形態８０〜９１のいずれかの方法。
９３．選択された細胞ターゲティングリガンドが、ＣＤ４抗体及び／又はＣＤ８抗体のｓｃＦｖ断片から選択される結合ドメインを含む、実施形態８０〜９２のいずれかの方法。
９４．選択された細胞ターゲティングリガンドが、ＣＤ４抗体及び／又はＣＤ８抗体から選択される結合ドメインを含み；キャリアーがＰＢＡＥ（例えば、ＰＢＡＥ４４７及び／又は１−（３−アミノプロピル）ピロリジン末端キャップを有する）を含み；コーティングがＰＧＡを含む、実施形態８０〜９３のいずれかの方法。
９５．選択された細胞ターゲティングが、ＣＤ２０６、ＣＤ１６３又はＣＤ２３に結合する、実施形態８０〜８９のいずれかの方法。
９６．選択された細胞ターゲティングリガンドがジマンノースを含む、実施形態８０〜８９のいずれかの方法。
９７．選択された細胞ターゲティングが、ＣＤ３８、Ｇタンパク質共役型受容体１８（Ｇｐｒ１８）、ホルミルペプチド受容体２（Ｆｐｒ２）、ＣＤ６４又はＣＤ６８に結合する、実施形態８０〜８９のいずれかの方法。
９８．治療有効量の細胞誘引物質を対象に投与することをさらに含む、実施形態５０〜９７のいずれかの方法。
９９．細胞誘引物質がＴ細胞誘引物質を含む、実施形態９８の方法。
１００．Ｔ細胞誘引物質がＣＣＬ２１又はＩＰ１０を含む、実施形態９９の方法。
１０１．Ｔ細胞誘引物質が、ＣＣＬ１、ＣＣＬ２、ＣＣＬ１７、ＣＣＬ２２、ＣＸＣＬ９、ＣＸＣＬ１０又はＣＸＣＬ１１を含む、実施形態９９又は１００の方法。
１０２．細胞誘引物質が単球／マクロファージ誘引物質を含む、実施形態９８〜１０１のいずれかの方法。
１０３．単球／マクロファージ誘引物質が、ＣＣＬ２、ＣＣＬ３、ＣＣＬ５、ＣＣＬ７、ＣＣＬ８、ＣＣＬ１３、ＣＣＬ１７又はＣＣＬ２２を含む、実施形態１０２の方法。
１０４．細胞誘引物質がマスト細胞誘引物質を含む、実施形態９８〜１０３のいずれかの方法。
１０５．マスト細胞誘引物質がＣＣＬ２又はＣＣＬ５を含む、実施形態１０４の方法。
１０６．細胞誘引物質が好酸球誘引物質を含む、実施形態９８〜１０５のいずれかの方法。
１０７．好酸球誘引物質が、ＣＣＬ３、ＣＣＬ５、ＣＣＬ７、ＣＣＬ１１、ＣＣＬ１３、ＣＣＬ２４又はＣＣＬ２６を含む、実施形態１０６の方法。
１０８．細胞誘引物質が好中球誘引物質を含む、実施形態９８〜１０７のいずれかの方法。
１０９．好中球誘引物質がＩＬ−８又はＮＡＰ１を含む、実施形態１０８の方法。
１１０．細胞誘引物質が、第１の治療有効量のナノ粒子が投与される前に対象に投与される、実施形態９８〜１０９のいずれかの方法。
１１１．細胞誘引物質が、第１の治療有効量のナノ粒子が投与される前の１時間以内に、３時間以内に、６時間以内に、１２時間以内に、又は２４時間以内に投与される、実施形態９８〜１０９のいずれかの方法。
１１２．細胞誘引物質が、第１の治療有効量のナノ粒子が投与される少なくとも１時間前に、少なくとも３時間前に、少なくとも６時間前に、少なくとも１２時間前に、又は少なくとも２４時間前に投与される、実施形態９８〜１０９のいずれかの方法。
１１３．細胞誘引物質が、（ａ）第１の治療有効量のナノ粒子の最初の用量が投与された後にのみ投与される、実施形態９８〜１１２のいずれかの方法。
１１４．対象が、がん又は感染性疾患に対する処置を必要とする、実施形態５０〜１１３のいずれかの方法。
１１５．がんが、白血病、前立腺がん又はＢ型肝炎誘導肝細胞癌、卵巣がん、神経膠芽腫又は肺がんである、実施形態１１４の方法。
１１６．研究者又は臨床医が、選択されたナノ粒子の一過性発現特性が原因で、対象への投与のための先行する実施形態のいずれかに記載されているナノ粒子を選択する、実施形態１〜１１６のいずれかの方法。
１１７．研究者又は臨床医が、対象に選択されたナノ粒子を投与する、実施形態１１６の方法。
１１８．一過性発現特性が、１４日間を超えない、１２日間を超えない、１０日間を超えない、９日間を超えない、８日間を超えない、７日間を超えない、６日間を超えない、又は５日間を超えない間タンパク質又は核酸の発現をもたらす、実施形態１１６又は１１７の方法。
（ｖｉｉｉ）実験例
［実施例１］
序論
遺伝子治療のために、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）、ＴＣＲ又はＣＡＲ／ＴＣＲハイブリッドにより疾患特異的Ｔ細胞を操作することが可能になる。しかし、操作されたＴ細胞をエクスビボで製造するのに現在必要な手の込んだ高価なプロトコールでは、健康管理システムの要求事項に取り組むのに十分大きな規模でこれらのトランス遺伝子を導入するには明らかに実用的ではない。ここでは、循環Ｔ細胞を一過性に再プログラムして疾患関連抗原を認識させることができるインビトロ転写（ＩＶＴ）ｍＲＮＡを送達する注射可能なナノ粒子が開示される。これらのポリマーナノ粒子の繰り返し注入により、エクスビボで操作されたリンパ球のボーラス注入と類似するレベルで、白血病、前立腺がん及びＢ型肝炎誘導性幹細胞癌の疾患後退を誘導するのに十分な量の宿主Ｔ細胞中に腫瘍特異的ＣＡＲ又はウイルス特異的ＴＣＲトランス遺伝子が送達される。製造、流通及び投与の容易さを考慮すると、この新しいナノテクノロジーは広範囲の疾患に対する影響力の大きい治療薬につながる。
患者又はドナーから収集されるＴ細胞が標的としてのがん又は感染病原体に遺伝子学的に向けられる強力な様式である、養子Ｔ細胞療法の有効性は、現在では、異議の余地がなく、強い印象を与える臨床効果を示す数多くの臨床試験により支持されている。しかし、薬物を標準化された形態で大量に調製するのではなく、患者ごとにＴ細胞産物を製造することに関与する複雑さ及び高コストのせいで、小分子薬物又はモノクローナル抗体などの現在の最前線療法選択肢を打ち負かすのは困難である。大半のＣＡＲ−Ｔ及びＴＣＲ操作Ｔ細胞は、現在、（ｉ）２本の静脈チューブによりアファレーシス装置に数時間接続された患者からＴ細胞を抽出する白血球アファレーシスを必要とする扱いにくいオーダーメイドの工程により作成されている。これは患者には快適ではなく、かなりの費用を招き、最終的には自家性Ｔ療法の大規模採用がアフェレーシス能力の有効性により制限される速度になる可能性がある；（ｉｉ）Ｔ細胞の活性化及び形質導入；（ｉｉｉ）サイトカイン補充組織培養培地での２週間にわたる形質導入されたＴ細胞の増殖；及び（ｉｖ）投与に先立ってＴ細胞を洗浄し濃縮する。中央施設で作成され遠隔処置センターまで輸送されるＴ製品では、細胞は凍結保存しなければならない；及び（ｖ）ＣＡＲ−Ｔ製品のバッチごとに品質管理（ＱＣ）リリースアッセイが行われる。全工程は、維持し実行するのが高価である環境制御されたＧＭＰ準拠条件下で行わなければならない。それぞれのＣＡＲ−Ｔ製品は処置されることになっている患者由来の出発物質（Ｔ細胞）から作成されるので、実質的なスケールメリットはない。
ＩＶＴ ｍＲＮＡは、遺伝子情報を送達する潜在的に新しい薬物クラスとして最近スポットが当てられるようになっている。そのような合成ｍＲＮＡ医薬品を操作すれば、天然のｍＲＮＡに構造的に似ていることによりタンパク質を一過性に発現することができる。このような合成ｍＲＮＡは開発が容易であり、生産に費用が掛からず、製造目的には効率的にスケーラブルである。特にＩＶＴ ｍＲＮＡの翻訳効力及び免疫原性を制御することに関係しているこの薬物クラスの本来備わっている難問への取組みが前進すれば、広い範囲の潜在的応用のための基盤を提供する。
ここで、循環Ｔ細胞を遺伝子学的にプログラムして疾患特異性受容体を一過性に発現させ、それによって患者由来のリンパ球を抽出して培養する必要性を迂回するための注射可能な薬物としてのＩＶＴ ｍＲＮＡの使用（図１、２、３Ａ、３Ｂ）を調べた。ＩＶＴ ｍＲＮＡペイロードを濃縮して保護するため及びＩＶＴ ｍＲＮＡを標的のＴ細胞に正確に向けるため、生分解性ポリマーナノ粒子を処方した。単一ナノ粒子の適用が、培養されたＴ細胞の＞７０％に、ＣＤ１９特異的１９２８ｚ ＣＡＲ（Ｙｅｓｃａｒｔａ（商標）、再発性又は難治性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫を抱えた成人患者の処置についてＦＤＡから承認されている）を、又はＢ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）コア抗原（現在、ＨＢＶ関連肝細胞癌を抱えた患者を処置するため第Ｉ相試験中である）に特異的なＨＢｃｏｒｅ１８−２７ ＴＣＲをルーチン的にトランスフェクトできることが最初にエクスビボで実証された。ナノ粒子トランスフェクトＴ細胞は、平均７日間でこれらの表面においてこれらのＣＡＲトランス遺伝子又はＴＣＲトランス遺伝子を一過性に発現する。
手の込んだ費用の掛かる手順である個別化されたＴ細胞療法と比べると、ナノ粒子薬物は費用が掛からず大量製造が簡単である（さらに、ｃＧＭＰ条件下でのナノ粒子のスケールアップ製造のために設計された連続フローマイクロ流体装置が現在入手可能である）。ナノキャリアーのマイクロ流体組立のための例示的方法は、例えば、Ｗｉｌｓｏｎら、（２０１７）Ｊ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｍａｔ．Ｒｅｓ．Ａ．６（１０５）：１８３〜１８２５頁に提供されている。一部の実施形態において、ナノ粒子はマイクロミキサーチップを使用して製造される。本開示の方法と適合する例示的マイクロミキサーチップは、Ｄｏｌｏｍｉｔｅ（登録商標）ｍｉｃｒｏｍｉｘｅｒ ｃｈｉｐ（Ｄｏｌｏｍｉｔｅ Ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃｓ、Ｒｏｙｓｔｏｎ、ＵＫ（Ｄｏｌｏｍｉｔｅ ＴＥＬＯＳ（商標）））である。結果は、処置の機会を、悪性腫瘍又は慢性感染症を抱えた患者の処置のために、エクスビボで操作されたＴ細胞製品から手ごろな値段の市販の試薬に変え、この試薬は診断の日に及び医学的に必要なだけ何度でも入手可能である。
目的
この実施例の目的は、循環Ｔ細胞を遺伝子学的にプログラムして疾患特異性受容体を一過性に発現させ、それによって患者由来のリンパ球を抽出して培養する必要性を迂回するための注射可能な薬物としてのＩＶＴ ｍＲＮＡの使用を調べることであった。定期的に投与された場合、ＣＡＲ又はＴＣＲコードｍＲＮＡ粒子が、ＣＡＲコードウイルスベクターをエクスビボで形質導入されたＴ細胞の従来の注入に類似する有効性で腫瘍後退を引き起こすのに十分な量でＴ細胞をプログラムすることができることを立証する実験を実施した。
結果
ＩＶＴ ｍＲＮＡナノ粒子はヒトＴ細胞にＣＡＲ又はＴＣＲトランス遺伝子を効率的にトランスフェクトする。ＩＶＴ ｍＲＮＡコード疾患特異的受容体遺伝子をヒトリンパ球中に送達するため、生分解性ポリ（βアミノエステル）（ＰＢＡＥ）ポリマー製剤をキャリアーマトリックスとして使用した（図４Ａ）。カチオン性ＰＢＡＥは、静電相互作用を介してアニオン性核酸とのナノ複合体に自己組織化する（図４Ｂ）。粒子は、Ｆａｂ配列に付加されたシステインと反応するＰＧＡ−マレイミドを使用して、抗ＣＤ８結合ドメインをポリグルタミン酸（ＰＧＡ）に結合させ、粒子に静電気的に吸着されるコンジュゲートを形成することにより、標的にした。得られたｍＲＮＡナノ粒子は長期保存のために凍結乾燥することができる。使用に先立って、粒子は無菌水の添加に続く数秒以内に水和してこのはじめの濃度を取り戻す。ＣＡＲトランス遺伝子対それよりもわずかに大きなＴＣＲトランス遺伝子を負荷されたナノ粒子の物理的特性には有意差は観察されず、ＴＣＲトランス遺伝子は２Ａリンカー配列により連結されるＴＣＲアルファ及びベータ鎖をコードする。例示的なタンパク質配列は図８に提供されている。
標的化ＩＶＴ ｍＲＮＡナノ粒子をヒトリンパ球の確立した培養物に添加するとこの中で頑強なトランスフェクションを演出することができるかどうかを先ず試験した。臨床的に関連する応用においてこのアプローチを試験するため、白血病特異的１９−２８ｚ ＣＡＲをコードするＩＶＴ ｍＲＮＡをナノ粒子中に組み込んだ（図５Ａ〜５Ｅ）。ＣＤ１９標的化受容体は今日もっとも調査されているＣＡＲ−Ｔ細胞産物であり、３０件近くの臨床試験が国際的に進行中であり、２つががん療法としてＦＤＡにより既に承認されている（Ｓａｄｅｌａｉｎ、Ｊ Ｃｌｉｎ Ｉｎｖｅｓｔ １２５：３３９２〜３４００頁、２０１５年）。
第２の実施例として、高親和性ＨＢＶ特異的ＴＣＲをコードするＩＶＴ ｍＲＮＡ（図５Ｆ〜５Ｊ）が送達された。慢性Ｂ型肝炎のＴ細胞療法は、抗ウイルス免疫を回復し感染症を治癒する新規のアプローチである。ＨＢＶコア抗原に特異的なＨＢｃｏｒｅ１８−２７ ＴＣＲは、ＨＢＶ感染症が回復したＨＬＡ−Ａ０２．０１ドナーから単離された（Ｋａｈら、Ｊ Ｃｌｉｎ Ｉｎｖｅｓｔ．２０１７年８月１日；１２７（８）：３１７７〜３１８８頁）。
両方の構築物１９２８ｚ ＣＡＲとＨＢｃｏｒｅ１８−２７ ＴＣＲでは、リアルタイム定量的ＰＣＲ及びフローサイトメトリーを使用して、単一ナノ粒子トランスフェクションに続いてヒトＴ細胞においてこの発現レベルを測定した。トランス遺伝子発現はナノ粒子曝露の２４時間後にピークを迎え、続いてこれらの増殖Ｔ細胞の発現は徐々に減少していった（図５Ａ、５Ｆ）。これは高レベルのＣＡＲ又はＴＣＲ表面発現に変わり、２日目に最大となった（Ｔ細胞の７５％±１１％が１９２８ｚ ＣＡＲを発現し；図５Ｂ、５Ｃ；Ｔ細胞の平均で８９％±４％がＨＢｃｏｒｅ１８−２７ ＴＣＲを発現した；図５Ｇ、５Ｈ）。予想通り、受容体発現は一過性であり、培養の８日後にはＣＡＲでは２８％±６％、ＴＣＲでは２６％±９％まで下がった。
ナノ粒子でトランスフェクトされたＴ細胞の機能（殺傷及びサイトカイン産生）は次に、ウイルス法を使用してこれらの受容体で操作されたＴ細胞の機能と比較された。リアルタイムＩｎｃｕＣｙｔｅ（登録商標）（Ｅｓｓｅｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ、Ｉｎｃ．、Ａｎｎ Ａｒｂｏｒ、ＭＩ）生細胞アッセイを使用した場合、抗原陽性標的細胞（１９２８ｚ ＣＡＲではＲａｊｉリンパ腫細胞及びＨＢｃｏｒｅ１８−２７ ＴＣＲではＨＢｃＡｇを安定的に形質導入されたＨｅｐＧ２肝臓がん細胞）を選択的に溶解するＩＶＴ ｍＲＮＡトランスフェクトＴ細胞の能力に有意差は測定されなかった（図５Ｄ、５Ｉ）。その上、ナノ粒子でトランスフェクトされたＴ細胞対ウイルスにより形質導入されたＴ細胞においては、Ｔ細胞分泌エフェクターサイトカインの類似するレベルが測定された（図５Ｅ、５Ｊ）。
Ａ．キャリアー送達されるｍＲＮＡの注入は白血病を認識するように宿主Ｔ細胞を再プログラムする
次に、リンパ球標的化ＩＶＴ ｍＲＮＡナノ粒子が、従来の方法に類似する有効性で腫瘍後退を引き起こすのに十分な量で循環Ｔ細胞を再プログラムすることができるかどうかを調べた。白血病における有効性のインビボ実証として、免疫不全ＮＯＤ．Ｃｇ−Ｐｒｋｄｃｓｃｉｄ Ｉｌ２ｒｇｔｍ１Ｗｊｌ／ＳｚＪ（ＮＳＧ）マウスに、ホタルルシフェラーゼを発現する１×１０６のＣＤ１９＋Ｒａｊｉ細胞を接種した。５日後、マウスは１０×１０６のＣＤ３＋ヒトＴ細胞で再構成され、次に、１９２８ｚ ＣＡＲをコードするｍＲＮＡを負荷したナノ粒子（白血病特異性を生み出すため）又はＧＦＰをコードするｍＲＮＡを負荷した対照粒子の６週間注入を受けた（図６Ａ）。対照は処置を受けなかった。毎週ナノ粒子投与プロトコールは、ＩＶＴ ｍＲＮＡナノ粒子を用いてエクスビボで測定したＣＡＲ表面発現の動態に基づいて選ばれ、このナノ粒子は８日間まで適切な受容体発現を示した（図５Ｂ、５Ｃ）。
ナノ粒子注入と従来の養子Ｔ細胞療法の治療有効性を比較するため、マウスの追加の群を、１９２８ｚ ＣＡＲをコードするレンチウイルスベクターをエクスビボで形質導入した５×１０６のＴ細胞の単一用量でも処置した。この量は現在の臨床試験において使用されているもっと高用量のＣＡＲ Ｔ細胞と等価であり、現在の臨床試験において患者は体重１キログラム当たり最大１．２×１０７のＣＡＲ Ｔ細胞で処置されてきている（Ｇｒｕｐｐら、Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ ３６８：１５０９〜１５１８頁、２０１３年）。生物発光イメージングを使用して、腫瘍成長を連続的に数量化した。全生存もモニターした。生存は、未処置の対照と比べて、エクスビボで操作され養子性に移入された１９２８ｚ ＣＡＲ−Ｔ細胞で処置されたマウスで大いに改善された。腫瘍は１０匹のマウスのうち６匹で根絶され、その他は、生存の平均３２日の改善と共にかなりの腫瘍後退を示した（図６Ｃ）。従来の養子Ｔ細胞療法を用いて達成されたこの治療効果は、同じＣＡＲをリンパ球中にインビボでプログラムするＩＶＴ ｍＲＮＡナノ粒子を用いた処置に類似しており、ＩＶＴ ｍＲＮＡナノ粒子を用いた処置では１０匹のマウス中７匹での腫瘍根絶及び再発動物の生存における平均３７日の改善を達成した（図６Ｃ）。
最初の用量の２日後の末梢血のフローサイトメトリーにより、１９２８ｚ担持ナノ粒子が、白血病細胞を認識するように末梢Ｔ細胞を急速に効率的にプログラムすることが明らかにされた（ＣＤ８＋の中で平均１０％ＣＡＲ＋±４．３％、図６Ｄ、６Ｅ）。これらのＣＡＲは１週間まで一過性に発現された（７日目に０．８％±０．４％ＣＡＲ＋ＣＤ８＋Ｔ細胞）。ナノ粒子の繰り返し投与は最初の注射と同じ程度に効果的であり、宿主Ｔ細胞中への平均１０．７％±３．６％カプセル化ｍＲＮＡ移行を達成した（図６Ｅ）。これにより、この頻繁な一過性の性質にもかかわらず、ＩＶＴ ｍＲＮＡが、宿主リンパ球における持続的インサイツＣＡＲ発現を達成するためのプラットホームとしての役割を果たせることが示唆される。
Ｂ．ナノ粒子を介したＴ細胞中への腫瘍特異的ＣＡＲ遺伝子の導入により前立腺腫瘍は後退する
固形腫瘍における有効性を立証するため、前立腺腫瘍特異的ＣＡＲ遺伝子を循環宿主Ｔ細胞中に導入するように設計されたナノ粒子がマウスにおいて前立腺腫瘍の後退を誘導する能力を立証した。高レベルのＣＤ１９標的抗原を普遍的に発現し循環Ｔ細胞に容易に近づける白血病細胞と違って、固形がんは不均一であり保護されている（Ｍｅａｃｈａｍ＆Ｍｏｒｒｉｓｏｎ、Ｎａｔｕｒｅ ５０１：３２８〜３３７頁、２０１３年）。これは、腫瘍細胞の一部はターゲティングＣＡＲにより認識されず、Ｔ細胞を機能不全にすることができる免疫抑制防御に取り囲まれていることを意味する。事実、全ゲノム／転写プロファイリングが１４０の前立腺がん転移において使用されて、前立腺腫瘍病変が患者間で３つのキーとなる細胞表面タンパク質（前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）、前立腺幹細胞抗原（ＰＳＣＡ）及び受容体チロシンキナーゼ様オーファン受容体１（ＲＯＲ１））の不均一発現を示すことを確証した（図７Ａ）。
ヒト疾患を再現するため、ＬＮＣａＰ Ｃ４２前立腺癌細胞（キーとなる細胞表面タンパク質の不均一発現を示す、図７Ｂ）をＮＳＧマウスの前立腺の背葉中に同所的に移植した（図７Ｃ）。生物発光イメージングにより腫瘍負荷を連続的にモニターするため、腫瘍細胞にホタルルシフェラーゼ（ＦＬｕｃ）を遺伝子学的にタグ付けした。同所的移植に続いて、すべてのマウスは３週間以内に病変を再現性よく発症し（図７Ｃ、右パネル）、実験のために種々の処置群又は対照群に無作為に割り当てた（図７Ｃ）。
腫瘍抗原ＲＯＲ１に特異的な１０６のエクスビボで形質導入されたＣＡＲ＋Ｔ細胞を担腫瘍マウスに全身的に注射する治療有効性を測定した。抗ＲＯＲ１ ＣＡＲ−Ｔ細胞は腫瘍クリアランスを達成しなかったとはいえ、処置されたマウスは２倍を超える生存率を示した（６９日対非処置対照群の３２日；図７Ｄ、７Ｆ）。
マウスは抗ＲＯＲ１ ＣＡＲトランス遺伝子負荷ナノ粒子を毎週全身的に注射された（図７Ｅ）。ナノ粒子で誘導されたＣＡＲプログラミングは、非処置対照と比べて生存を平均で４０日延ばし、この数字は従来の養子Ｔ細胞療法を用いて達成された延命効果に類似している（△平均生存＝３ｄ、Ｎ．ｓ．、Ｐ＝０．２３、図７Ｄ、７Ｆ）。これにより、ナノキャリアーのインビボ投与が、対象への投与前にナノキャリアーをエクスビボで形質導入したＴ細胞の投与と少なくとも同じ程度に治療効果を達成することが立証されている。
フローサイトメトリーにより、再発性前立腺腫瘍の抗原プロファイルの表現型を決定した。がんにおいて見られる最も一般的な逃避戦略の１つは、ＣＡＲが作り出す選択圧のせいで標的抗原発現を減少させることである。この現象は、単一の抗原のみに特異的な養子性移入Ｔ細胞を使用して不均一な腫瘍（例えば、転移性前立腺がん）を処置した場合の前臨床試験と臨床試験の両方の失敗の原因として報告されてきた。ＲＯＲ１腫瘍抗原を種々のレベルで発現する非処置ＬＮＣａＰ Ｃ４２前立腺腫瘍との直接比較では、両方の処置群（養子性移入Ｔ細胞又はナノ粒子プログラムされたＴ細胞）のＣＡＲ標的化腫瘍は最終的に、ＲＯＲ１低／ネガティブ免疫逃避変異体を発生するようになった（図７Ｇ）。
材料及び方法
ＰＢＡＥ４４７合成
このポリマーはＭａｎｇｒａｖｉｔｉら、（ＡＣＳ Ｎａｎｏ ９、１２３６〜１２４９頁、２０１５年）により記載された方法に類似する方法を使用して合成した。１，４−ブタンジオールジアクリレートを４−アミノ−１−ブタノールと、ジアクリレートがアミンモノマーに対して１．１対１のモル比で組み合わせた。混合物は、２４時間攪拌しながら９０℃まで加熱してアクリレート終端ポリ（４−アミノ−１−ブタノール−コ−１，４−ブタンジオールジアクリレート）を生成した。２．３ｇのこのポリマーを２ｍｌのテトラハイドロフラン（ＴＨＦ）中に溶解させた。ピペラジンキャップ４４７ポリマーを形成するため、１３ｍｌのＴＨＦ中に溶解させた７８６ｍｇの１−（３−アミノプロピル）−４−メチルピペラジンをポリマー／ＴＨＦ溶液に添加した。得られた混合物は室温で２時間攪拌し、次に、キャップポリマーを５容積のジエチルエーテルで沈殿させた。溶媒をデカントした後、ポリマーを２容積の新鮮なエーテルで洗浄し、次に、残留物は使用前に２日間真空下で乾燥させ、ＤＭＳＯ中１００ｍｇ／ｍｌのストックを形成し、これを−２０℃で保存した。
ＰＧＡ−抗体コンジュゲーション
１５ｋＤのポリグルタミン酸（Ａｌａｍａｎｄａ Ｐｏｌｙｍｅｒｓから）を水に溶解して２０ｍｇ／ｍｌを形成し、１０分間超音波処理した。水中４ｍｇ／ｍｌの１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）の等容積を添加し、溶液は室温で５分間混ぜ合わせた。次に、得られた活性化ＰＡＧをリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）中に抗体と４対１のモル比で組合せ、室温で６時間混ぜ合わせた。非連結ＰＧＡを取り除くため、溶液はＰＢＳに対して５０，０００ＮＭＷＣＯ膜（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を通して３回取り替えた。抗体濃度は、ＮａｎｏＤｒｏｐ２０００分光光度計（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して決定した。Ｔ細胞実験には抗ＣＤ８（クローンＯＫＴ８）抗体を使用した。クローンＣ１．１８．４を対照抗体として使用した。
ｍＲＮＡ合成
抗ヒト１９２８ｚ ＣＡＲ、抗ＲＯＲ１（４−１ＢＢｚ）ＣＡＲ及びＨＢＶ特異的ＴＣＲ（ＨＢｃｏｒｅ１８−２７ ＴＣＲ）をコードするコドン最適化ｍＲＮＡを使用した。コドン最適化ＤＮＡ配列は図８に提供されている。すべての構築物は、以下の修飾内容；シュードＵ及び５−メチル−Ｃを完全置換した、修飾されたｍＲＮＡ転写物；ＡＲＣＡキャップする（Ｃａｐ０）；ポリアデニル化する（１２０Ａ）；デオキシリボヌクレアーゼ及びホスファターゼ処理；シリカ膜精製；並びに１ｍＭのクエン酸ナトリウム、ｐＨ６．４中の溶液としてパッケージを付けて、Ｔｒｉｌｉｎｋ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社に注文した
ナノ粒子調製
ｍＲＮＡストックは、無菌無ヌクレアーゼ２５ｍＭの酢酸ナトリウムバッファー、ｐＨ５．２（ＮａＯＡｃ）中１００μｇ／ｍｌまで希釈した。ＤＭＳＯ中のＰＢＡＥ−４４７ポリマーはＮａＯＡｃ中６ｍｇ／ｍｌまで希釈し、６０対１（ｗ：ｗ）比でｍＲＮＡに添加した。得られた混合物は、中程度の速度で１５秒間ボルテックスした後、ナノ粒子が形成されるように室温で５分間インキュベートした。ナノ粒子にターゲティングエレメントを付加するため、ＰＧＡ連結結合ドメインをＮａＯＡｃ中２５０μｇ／ｍｌまで希釈し、２．５対１（ｗ：ｗ）比でｍＲＮＡに添加した。得られた混合物は、中程度の速度で１５秒間ボルテックスし、次に室温で５分間インキュベートし、ＰＧＡ結合ドメインをナノ粒子に結合させた。
ナノ粒子は、凍結保護物質として６０ｍｇ／ｍｌのＤ−スクロースと混合することにより凍結乾燥させ、それをＦｒｅｅＺｏｎｅ２．５Ｌ Ｆｒｅｅｚｅ Ｄｒｙ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｌａｂｃｏｎｃｏ）で加工する前に、液体窒素中で急速冷凍した。凍結乾燥ナノ粒子は、使用するまで−８０℃で保存した。適用では、凍結乾燥ナノ粒子は一定容積の無菌水に再懸濁し、その最初の濃度を回復した。
細胞選別及びフローサイトメトリー
データは、ＦＡＣＳＤＩＶＡソフトウェアを実行するＢＤ ＬＳＲＦｏｒｔｅｓｓａ又はＦａｃｓＣａｎｔｏＩＩセルアナライザーを使用して入手し、ＢＤ ＦＡＣＳ ＡＲＩＡ−ＩＩで選別して、ＦｌｏｗＪｏ ｖ１０．１．で分析した。
ＣＡＲ Ｔ細胞殺傷アッセイ
ＣＡＲ標的細胞の特異的細胞溶解はフローサイトメトリーによりアッセイされた。標的Ｋ５６２−ＣＤ１９細胞は低い（０．４μＭ）、及び対照Ｋ５６２は高い（４．０μＭ）カルボキシフルオレセインスクシンイミジルエステル（ＣＦＳＥ）を３７℃で１５分間標識された。両方の試料は血清を含有する完全培地で洗浄され、１対１の比で混合され、次に指示されたエフェクター対標的比で１９−４１ＢＢζと共培養された。特異的な細胞溶解を評価するため、それぞれの条件を抗ＣＤ８ｍＡｂ（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）で染色してＴ細胞を同定し、７ＡＡＤで染色して死細胞を排除し、フローサイトメトリーで分析した。特異的細胞殺傷は、対照ＣＤ１９−Ｋ５６２細胞（高ＣＦＳＥ）に対する生存ＣＤ１９＋標的細胞（低ＣＦＳＥ）の比を測定することにより評価した。
顕微鏡検査
４００μｌのＸＦＳＦＭ中１０６のＴ細胞を、表面結合のために、３μｇのｃｙ５−標識ｅＧＦＰ ｍＲＮＡを含有する抗ＣＤ３標的化ナノ粒子を用いて４℃で１時間処置し、続いて内部移行のために３７℃で２時間インキュベートした。これらの処置に続いて、細胞は冷ＰＢＳで３回洗浄し、４℃で３０分間ポリ−ｌ−リジン（Ｓｉｇｍａ）被覆スライド上に充填した。試料は２％パラホルムアルデヒドに固定し、ＰｒｏＬｏｎｇ Ｇｏｌｄ Ａｎｔｉｆａｄｅ試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に乗せ、Ｚｅｉｓｓ ＬＳＭ ７８０ ＮＬＯレーザースキャニング共焦点顕微鏡で撮像した。
統計解析
別段述べられなければ、グラフは平均±平均の標準偏差を示す。統計解析はＰｒｉｓｍソフトウェア（Ｇｒａｐｈｐａｄ）を用いて行った。
［実施例２］
材料及び方法
ＰｂＡＥ合成。
ポリマーを合成するのに使用する方法はすでに記載されていた（Ｍａｎｇｒａｖｉｔｉ Ａら、（２０１５）ＡＣＳ Ｎａｎｏ ９：１２３６〜１２４９頁）。１，４−ブタンジオールジアクリレートは、ジアクリレート対アミン単量体の１対１モル比で４−アミノ−１−ブタノールと組み合わせた。アクリレート端末ポリ（４−アミノ−１−ブタノール−１，４−ブタンジオールジアクリレート共重合体）は、混合物を２４時間攪拌しながら９０℃まで加熱することにより形成した。このポリマーの２．３ｇを２ｍＬのテトラヒドロフラン（ＴＨＦ）に溶解した。ピペラジンキャップド４４７ポリマーを形成するため、１３ｍＬのＴＨＦ中７８６ｇの１−（３−アミノプロピル）−４−メチルピペラジンをポリマー／ＴＨＦ溶液に添加し、室温（ＲＴ）で２時間攪拌した。キャップドポリマーは５容積のジエチルエーテルで沈澱させ、２容積の新しいエーテルで洗浄し、１日真空下で乾燥させた。純ポリマーはジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）に１００ｍｇ／ｍＬの濃度まで溶解し、−２０℃で保存した。
ジマンノースへのＰＧＡコンジュゲーション．α−Ｄ−マンノピラノシル−（１→２）−α−Ｄ−マンノピラノース（Ｄｉ−ｍａｎｎｏｓｅ、Ｏｍｉｃｒｏｎ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ Ｉｎｃ．）をＰＧＡにコンジュゲートする前にグルコシルアミンに改変した。先ず、ジマンノース（１５７ｍｇ）を１０．５ｍＬの飽和水性炭酸アンモニウムに溶解し、室温で２４時間攪拌した。２日目、さらに多くの固体炭酸アンモニウムを、ジマンノースが反応液から沈澱するまで添加した。混合物はＴＬＣにより測定した場合、完了するまで攪拌し、続いて凍結乾燥して過剰な炭酸アンモニウムを取り除いた。揮発性塩の完全な除去は、固体をメタノールに再溶解することにより達成した。これらの手順により、今後のＰＧＡとのコンジュゲーションのためにアノマー炭素上にアミンが作り出された。
アミノ化ジマンノースをＰＧＡにコンジュゲートするため、基質を３０ｍｇ／ｍＬまで水に溶解し、次に１０分間超音波処理した。水中エチル−Ｎ’−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド・ＨＣＬ（４ｍｇ／ｍＬ、３０当量）を、室温で４分間混合しながら添加した。水中Ｎ−ヒドロキシスルホスクシンイミド（３０ｍｇ／ｍＬ、３５当量）を、ＰＧＡ／ＥＤＣ液と一緒に１分間インキュベートした。リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）中アミノ化ジマンノースは、得られた活性化ＰＧＡと４４対１のモル比で組み合わせ、室温で６時間混合した。過剰な試薬は、２４時間水に対して透析することにより取り除いた。
ｍＲＮＡ合成。
ｅＧＦＰ、ＩＲＦ５、及びＩＫＫ（ＴｒｉＬｉｎｋ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）についてのコドン最適化ｍＲＮＡは、アンチリバースキャップアナログ３’−Ｏ−Ｍｅ−ｍ７Ｇ（５’）ｐｐｐ（５’）Ｇ（ＡＲＣＡ）でキャップし、修飾リボヌクレオチドプソイドウリジン（ψ）及び５−メチルシチジン（ｍ５Ｃ）で完全に置換した。
ナノ粒子調製。
ＩＲＦ５及びＩＫＫβ ｍＲＮＡは３対１（ｗ対ｗ）比で組み合わせ、２５ｍＭの酢酸ナトリウム（ＮａＯＡｃ）バッファー（ｐＨ＝５．２）中１００μｇ／ｍＬまで希釈した。ＤＭＳＯ（上記の通り調製）中ポリ（β−アミノアステル）−４４７（ＰｂＡＥ−４４７）ポリマーを、やはりＮａＯＡｃバッファー中１００μｇ／μＬから６μｇ／μＬまで希釈した。ナノ粒子を形成するため、ＰｂＡＥ−４４７ポリマーを６０対１（ｗ対ｗ）の比でｍＲＮＡに添加し、直ちに中速度で１５秒間ボルテックスし、次に混合物は室温で５分間インキュベートして、ＰｂＡＥ−ｍＲＮＡポリプレックスを形成させた。次のステップにおいて、ＮａＯＡｃバッファー中１００μｇ／ｍＬのＰＧＡ／ジマンノースをポリプレックス溶液に添加し、中速度で１５秒間ボルテックスし、室温で５分間インキュベートした。この工程において、ＰＧＡ／ジマンノースがＰｂＡＥ−ｍＲＮＡポリプレックスの表面を被覆して最終ＮＰを形成した。長期貯蔵のため、Ｄ−スクロース（６０ｍｇ／ｍＬ）を凍結保護物質としてＮＰ溶液に添加した。ナノ粒子はドライアイスで瞬間凍結し、次に凍結乾燥した。乾燥ＮＰは使用するまで−２０℃又は−８０℃で貯蔵した。インビボ実験において、凍結乾燥したＮＰは１対２０（ｗ対ｖ）比で水に再懸濁した。
ナノ粒子サイズ分布及びζ電位の特徴付け。
ＮＰの物理化学的特性（流体力学半径、多分散、ζ電位及び安定性を含む）は、２５℃でＺｅｔａｐａｌｓ器具（Ｂｒｏｏｋｈａｖｅｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）を使用して特徴付けた。動的光散乱に基づいて流体力学半径及び多分散を測定するため、ＮＰを２５ｍＭのＮａＯＡｃ（ｐＨ＝５．２）中に５倍希釈した。ζ電位を測定するため、ＮＰを１０ｍＭのＰＢＳ（ｐＨ＝７．０）に１０倍希釈した。ＮＰの安定性を評価するため、新たに調製した粒子を１０ｍＭのＰＢＳバッファー（ｐＨ＝７．４）に希釈した。ＮＰの流体力学半径及び多分散は１０分ごとに５時間測定し、そのサイズ及び粒子濃度は、Ｎａｎｏｓｉｔｅ ３００ ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ（Ｍａｌｖｅｒｎ）を使用して粒子トラッキング解析から導き出した。透過型電子顕微鏡を使用してＮＰを特徴付けるため、以前記載されたプロトコールに従った（Ｓｍｉｔｈ ＴＴら、（２０１７）Ｎａｔ Ｎａｎｏｔｅｃｈｎｏｌ １２：８１３〜８２０頁）。新たに作成したＮＰ（０．８３μｇのｍＲＮＡを含有する２５μＬ）を、グロー放電処理２００メッシュ炭素／Ｆｏｒｍｖａｒ被覆銅グリッド上に沈着させた。３０秒後、グリッドは、５０％のＫａｒｎｏｖｓｋｙ定着液、０．１Ｍのカコジル酸バッファー、ｄＨ２Ｏ、次に１％（ｗ／ｖ）酢酸ウラニルで順次処理した。試料は、１２０ｋＶで作動するＪＥＯＬ ＪＥＭ−１４００透過型電子顕微鏡（ＪＥＯＬ ＵＳＡ）で撮像した。
骨髄由来マクロファージ（ＢＭＤＭ）及び他の細胞株。ＢＭＤＭを調製するため、確立したプロトコール（Ｚｈａｎｇ Ｘら、（２００８）Ｃｕｒｒ Ｐｒｏｔｏｃ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｃｈａｐｔｅｒ １４：Ｕｎｉｔ １４ １１）に従って骨髄前駆細胞をマウス大腿骨から収集した。これらの細胞は完全培地［４．５ｇ／ＬのＤ−グルコース、Ｌ−グルタミン、１０％の熱失活ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）、１００Ｕ／ｍＬのペニシリンを補充したＤＭＥＭ、及び２０ｎｇ／ｍＬのＭ−ＣＳＦ（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ、カタログ＃３１５−０２）を補充した、１００μｇ／ｍＬ、Ｇｌｕｔａｍａｘ５０ｍＬ／５００ｍＬ］において播種密度０．５〜１．０ ｅ６／ｍｌで培養した。細胞は、エクスビボで７日間、５％ＣＯ２下、３７℃でＢＭＤＭ中に分化させておいた。次に、細胞は、マクロファージ条件付け培地［２０ｎｇ／ｍＬのＭＰＬＡ（Ｓｉｇｍａ、カタログ＃Ｌ６８９５）又は２０ｎｇ／ｍＬのＩＬ４（ｅＢｉｏｓｉｅｎｃｅ、カタログ＃３４−８０４１）を補充したマクロファージ完全培地］で条件付けした。ＢＭＤＭはエクスビボで７〜２１日間使用した。マウス卵巣がん細胞株ＩＤ８は、Ｄｒ．Ｋａｔｈｅｒｉｎｅ Ｒｏｂｙ（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｋａｎｓａｓ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｃｅｎｔｅｒ、Ｋａｎｓａｓ Ｃｉｔｙ、ＫＳ）からの寄贈であるが、１０％ ＦＢＳ、１００Ｕ／ｍＬのペニシリン、５μｇ／ｍＬのインスリン、５μｇ／ｍＬのトランスフェリン、及び５ｎｇ／ｍＬの亜セレン酸ナトリウム（すべてＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）を補充したＤＭＥＭにおいて培養した。より侵襲性の血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）発現ＩＤ８株を作成するため、ＩＤ８腫瘍細胞に、マウスＶＥＧＦをブラストサイジン耐性遺伝子と一緒にコードするｐＵＮＯ１プラスミド（Ｉｎｖｉｖｏｇｅｎ）をトランスフェクトした。安定なトランスフェクタントを得るため、腫瘍細胞は、１０μｇ／ｍＬのブラストサイジン（Ｉｎｖｉｖｏｇｅｎ）を含有する完全培地において３週間培養した。Ｂ１６Ｆ１０黒色腫細胞株（アメリカ合衆国培養細胞系統保存機関）を、１０％のＦＢＳ、１００Ｕ／ｍＬのペニシリン、２ｍＭ／Ｌ−グルタミン、１．５ｇ／Ｌ炭酸水素ナトリウム、４．５ｇ／Ｌグルコース、１０ｍＭのＨＥＰＥＳ、１．０ｍＭのピルビン酸ナトリウム、及び０．０５ｍＭの２−メルカプトエタノールを有する完全ＲＰＭＩ １６４０培地において培養した。インビボ生物発光イメージングにおいて、ＩＤ８−ＶＥＧＦとＢ１６Ｆ１０細胞株の両方にホタルルシフェラーゼをレトロウイルス性に形質導入した。ＲＡＣＳ−ＰＤＧＦβ又はＲＣＡＳ−ｃｒｅレトロウイルスを担持するＤＦ−１細胞株は、１０％のＦＢＳ及び１００Ｕ／ｍＬのペニシリンを補充した完全培地において５％のＣＯ２下、３９℃で培養した。
ＢＭＤＭのｍＲＮＡトランスフェクション。
トランスフェクションに１日先立って、ＢＭＤＭは、マクロファージ完全培地において２４ウェルプレート上に２５０，０００／ウェルの濃度で再播種した。トランスフェクション前、完全培地は３００μＬの非補充ＤＭＥＭで置き換えた。これらの細胞にトランスフェクトするため、２μｇのｍＲＮＡを含有するＮＰを基本培地中に添加し、３７℃でＢＭＤＭと共培養した。１時間後、ＮＰを含有する培地は取り除き、細胞は、トランスフェクション効率及び細胞生存率を評価する前にさらに２４時間培養した。
マクロファージシグネチャー遺伝子分析のためのＢＭＤＭのトランスフェクション。ＢＭＤＭはトランスフェクション２４時間前に条件付け培地で２４ウェルプレート上に再播種し、細胞をその表現型に形質転換させておいた。次に、上記のトランスフェクションプロトコールに従って、Ｍ２様マクロファージを、レポーターとして２５％のｅＧＦＰ ｍＲＮＡを担持するＩＲＦ５／ＩＫＫβ ＮＰ又は２μｇのｍＲＮＡを担持するｅＧＦＰ ＮＰ（対照）に曝露した。２４時間後、高度にトランスフェクトしたＢＭＤＭの上から１０％（ｅＧＦＰ発現により測定した）をトランスフェクション後２４時間で選別し、ＲＮＡ単離前さらに４８時間、低用量（１０ｎｇ／ｍＬ）ＩＬ４培地において再チャレンジした。これらの細胞から抽出されたＲＮＡは、ＩＲＦ５−ＮＰ処置に関連するシグネチャー遺伝子を同定できるように、標準Ｍ１又はＭ２様マクロファージ由来のＲＮＡと比較した。
ＲＮＡ単離及び調製。ＲＮＡを収集するため、ＢＭＤＭはＴｒｉｚｏｌ試薬（Ａｍｂｉｏｎ）に溶解し、全ＲＮＡを抽出して、ＲＮｅａｓｙ（登録商標）Ｐｌｕｓ Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ Ｍｉｎｉ−Ｋｉｔｓ（ＱＩＡＧＥＮ）を製造業者の使用説明書に従って使用して精製した。試料ＲＮＡは、ＮａｎｏＤｒｏｐ Ｍｉｃｒｏｖｏｌｕｍｅ分光光度計（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）を使用して定量化し、次にＡｇｉｌｅｎｔ ４２００ ＴａｐｅＳｔａｔｉｏｎ分析器（Ａｇｉｌｅｎｔ）でＦＨＣＲＣゲノム共用資源により実施される品質管理を受けさせた。
ナノストリング技術によるマクロファージシグネチャー遺伝子分析。
刺激を受けたＢＭＤＭ培養物からの遺伝子発現値は、ｎＣｏｕｎｔｅｒ（登録商標）骨髄自然免疫パネル（ＮａｎｏＳｔｒｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｓｅａｔｔｌｅ、ＷＡ）を使用して測定し、この装置は１９の異なる経路に存在する７７０の遺伝子を分析し、７つの異なる骨髄細胞型にわたり遺伝子を処理する。試料は、ｎＣｏｕｎｔｅｒ分析システム（ＮａｎｏＳｔｒｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｓｅａｔｔｌｅ、ＷＡ）を使用して試験した。生データは、Ｒ／Ｂｉｏｃｏｎｄｕｃｔｏｒ ＮａｎｏＳｔｒｉｎｇＱＣＰｒｏソフトウェアパッケージ（Ｎｉｃｋｌｅｓ Ｄ、Ｓａｎｄｍａｎｎ Ｔ、Ｚｉｍａｎ Ｒ ａｎｄ Ｂｏｕｒｇｏｎ Ｒ（２０１８）ＮａｎｏＳｔｒｉｎｇＱＣＰｒｏ：Ｑｕａｌｉｔｙ ｍｅｔｒｉｃｓ ａｎｄ ｄａｔａ ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ ＮａｎｏＳｔｒｉｎｇ ｍＲＮＡ ｇｅｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｄａｔａ．Ｒ ｐａｃｋａｇｅ ｖｅｒｓｉｏｎ １．１０．０．）を使用して処理し、品質について点検した。発現値は、ハウスキーピング遺伝子の幾何平均に正規化され、ｎＳｏｌｖｅｒ ４．０ソフトウェア（ＮａｎｏＳｔｒｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｓｅａｔｔｌｅ、ＷＡ）を使用してｌｏｇ２変換した。比例データについての偽陽性率は、Ｂｅｎｊａｍｉｎｉ−Ｙｅｋｕｔｉｅｌｉ法を使用するｔ−検定により戻されたｐ値から計算した。
フローサイトメトリー及び細胞選別。
脾臓、血液、腹膜灌流、及び気管支肺胞洗浄から得た細胞は、図８に収載されている抗マウス抗体プローブを使用して骨髄及びリンパ系免疫表現型検査パネルでフローサイトメトリーにより分析した。データは、ＦＡＣＳＤＩＶＡソフトウェア（Ｂｅｃｋｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）を実行するＢＤ ＬＳＲＦｏｒｔｅｓｓａ分析器を使用して収集した。ＣＤ１１ｂ＋及びＦ４／８０＋腹腔マクロファージは、ＢＤ ＦＡＣＳ ＡＲＩＡ ＩＩを使用して選別した。収集したデータはすべてＦｌｏｗＪｏ １０．０ソフトウェアを使用して解析した。
サイトカイン分析。
サイトカインレベルは、ＦＨＣＲＣ免疫モニタリング共用資源センターでＬｕｍｉｎｅｘ ２００システム（Ｌｕｍｉｎｅｘ）を使用して評価した。エクスビボ研究において、細胞培養上澄みを、ＩＬ−６、ＩＬ−１２ｐ７０、ＩＮＦγ、及びＴＮＦα濃度の測定のために収集した。インビボ研究において、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＮＦγ、ＩＬ−１２ｐ７０、ＩＬ−２、ＩＬ−６、及びＴＮＦαの血漿濃度を測定した。
ｑＲＴ−ＰＣＲ分析。
遺伝子発現レベルはｑＲＴ−ＰＣＲにより決定した。選択されたマクロファージシグネチャー遺伝子（セルピンＢ２、Ｒｅｔｎｌａ、Ｃｃｌ５、Ｃｃｌ１１、コドン最適化ＩＲＦ５、内在性ＩＲＦ５、及びハウスキーピングＧＡＰＤ遺伝子）を測定するため、全ＲＮＡはＲＮｅａｓｙ ｍｉｎｉ−ｃｏｌｕｍｎｓ（Ｑｉａｇｅｎ）を製造業者の使用説明書に従って用いて単離した。ｃＤＮＡは、ｑＳｃｒｉｐｔ ｃＤＮＡ合成キット（Ｑｕａｎｔａ）を使用して合成した。試料ごとに、ＲｏｃｈｅのＵｎｉｖｅｒｓａｌ Ｐｒｏｂｅ Ｌｉｂｒａｒｙ（ＵＰＬ）由来の遺伝子特異的プローブ及びＰｒｏｂｅＦｉｎｄｅｒ（Ｒｏｃｈｅ）により最適化されたＰＣＲプライマーを使用するＰｅｒｆｅＣＴａ ｑＰＣＲ ＳｕｐｅｒＭｉｘ Ｌｏｗ ＲＯＸ（Ｑｕａｎｔａ）を経て３通りに実施した：セルピンＢ２、ＵＰＬ−０４９、Ｆ−ＡＣＴＧＧＧＧＣＡＧＴＴＡＴＧＡＣＡＧＧ（配列番号１０３）、Ｒ−ＧＡＴＧＡＴＣＧＧＣＣＡＣＡＡＡＣＴＧ（配列番号１０４）；Ｒｅｔｎｌａ、ＵＰＬ−０７８、Ｆ−ＴＴＧＴＴＣＣＣＴＴＣＴＣＡＴＣＴＧＣＡＴ（配列番号１０５）、Ｒ−ＣＣＴＴＧＡＣＣＴＴＡＴＴＣＴＣＣＡＣＧＡ（配列番号１０６）；Ｃｃｌ５、ＵＰＬ−１０５、Ｆ−ＣＣＴＡＣＴＣＣＣＡＣＴＣＧＧＴＣＣＴ（配列番号１０７）、Ｒ−ＣＴＧＡＴＴＴＣＴＴＧＧＧＴＴＴＧＣＴＧＴ（配列番号１０８）；Ｃｃｌ１１、ＵＰＬ−０１８、Ｆ−ＡＧＡＧＣＴＣＣＡＣＡＧＣＧＣＴＴＣ（配列番号１０９）、Ｒ−ＣＡＧＣＡＣＣＴＧＧＧＡＧＧＴＧＡＡ（配列番号１１０）；コドン最適化ＩＲＦ５、ＵＰＬ−０２２、Ｆ−ＴＣＴＴＡＡＡＧＡＣＣＡＣＡＴＧＧＴＡＧＡＡＣＡＧＴ（配列番号１１１）、Ｒ−ＡＧＣＴＧＣＴＧＴＴＧＧＧＡＴＴＧＣ（配列番号１１２）；内在性ＩＲＦ５、ＵＰＬ−０１１、Ｆ−ＧＣＴＧＴＧＣＣＣＴＴＡＡＣＡＡＡＡＧＣ（配列番号１１３）、Ｒ−ＧＧＣＴＧＡＧＧＴＧＧＣＡＴＧＴＣＴ（配列番号１１４）。シグネチャー遺伝子ｍＲＮＡレベルは、ＧＡＰＤ、ＵＰＬ−０６０、Ｆ−ＡＧＣＣＡＣＡＴＣＧＣＴＣＡＧＡＣＡＣ（配列番号１１５）及びＲ−ＧＣＣＣＡＡＴＡＣＧＡＣＣＡＡＡＴＣＣ（配列番号１１６）の増幅に基づいて正規化した。ｑＲＴ−ＰＣＲ反応はすべて、ＱｕａｎｔＳｔｕｄｉｏ６ソフトウェア（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を実行するＱｕａｎｔ Ｓｔｕｄｉｏ５ ＲＴ−ＰＣＲ装置を使用して実施した。増幅プロットが閾値を通過せずＣｔ値が得られない（「未決定の」）場合、アッセイでの最高のサイクル数（４０サイクル）に等しいＣｔ値を相対的発現の比較のために使用した。
マウス及びインビボ腫瘍モデル。
脳腫瘍モデル関連の実験を除いて、これらの実験で使用するマウスはＪａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙから入手し、その他のマウスはＦＨＣＲＣ動物施設で繁殖させ収容した。マウスはすべて、センターの動物実験委員会が承認したプロトコールに照らして使用した。卵巣腫瘍をモデル化するため、５×１０６の血管内皮細胞成長因子（ＶＥＧＦＰ）発現ＩＤ８細胞を、生後４〜６週間のメスのアルビノＢ６（Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ−Ｔｙｒ＜ｃ−２Ｊ＞）マウスの腹腔内（ｉ．ｐ．）に注射し、２週間確立させておいた。生存研究に関して、動物は、５０μｇのｍＲＮＡを担持するＩＲＦ５ ＮＰ／ｅＧＦＰ ＮＰでｉ．ｐ．処置した（９週間の間、週当たり２用量で、又は健康な状態が安楽死要件に達するまで）。機序研究に関して、１、２、又は３週間の処置を使用し、続いて、最後の用量に続く４８時間で安楽死させた。腹膜灌流を実施して腹腔細胞を収集した。ＩＲＦ５／ＩＫＫβ ＮＰと現状のマクロファージターゲティング療法の効率を比べるため、マウスの１つの群は、週当たり２用量で３週間の間、５０μｇのｍＲＮＡを担持するＩＲＦ５／ＩＫＫβ ＮＰでの処置を受け、第２の群は、３週間毎日、溶媒（ポリエチレングリコール４００中５％の１−メチル−２−ピロリジノン）で処方した１５ｍｇ／ｋｇのＰＩ３Ｋγ阻害剤ＩＰＩ−５９４（ＭｅｄＫｏｏ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｉｎｃ）の経口投与を受け；第３の群は、３週間毎日、同じ溶媒で処方した３０ｍｇ／ｋｇのＣＳＦ１Ｒ阻害剤ペキシダルチニブ（ＰＬＸ３３９７、ＭｅｄＫｏｏ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｉｎｃ）のｉ．ｐ．注射を受けた。
転移性肺がんをモデル化するため、Ｆ−ｌｕｃを形質導入し２００μＬのＲＰＭＩ培養液に懸濁された２．５×１０４の１６Ｆ１０細胞を、生後４〜６週間のメスのアルビノＢ６（Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ−Ｔｙｒ＜ｃ−２Ｊ＞）マウス（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）に注射し、１週間確立させておいた。生存研究に関して、マウスは、ＰＢＳ中に懸濁された３０μｇのｍＲＮＡを担持するＩＲＦ５／ＩＫＫβ又はｅＧＦＰ ＮＰで（又はなしで）後眼窩に処置した。マウスは、３週間の間、週当たり３用量で、又は健康な状態が安楽死要件に達するまで処置した。機序研究に関して、マウスは２週間、同じ処置を受けた。気管支肺胞洗浄を実施して分析のために肺胞細胞を収集した。
神経膠腫を抱えたマウスを、公表されているプロトコール（Ｕｈｒｂｏｍ Ｌら、（２００４）Ｎａｔ Ｍｅｄ １０：１２５７〜１２６０頁）に従って作成した。ＲＣＡＳ−ＰＤＧＦβ及びＲＣＡＳ−ｃｒｅレトロウイルスを産出しているトリＤＦ−１細胞を、生後４〜６週間でＮｅｓｔｉｎ−ｔｖ−ａ／Ｉｎｋ４ａ−ａｒｆ−／−；Ｐｔｅｎ−／−マウス（Ｃ５７ＢＬ／６）の両方の脳半球（座標：前頂から１ｍｍ尾側、２ｍｍ側部、硬膜表面から２ｍｍの深さ）の頭蓋内に注射した。腫瘍は２週間確立させておいた。１５日目、マウスは１つの半球に１０Ｇｙの放射線を受け、その間未照射半球は鉛で遮蔽した。次の日、マウスは、３０μｇのｍＲＮＡを担持するＩＲＦ５／ＩＫＫβ ＮＰの後眼窩注射を受ける（３週間の間、週当たり３用量）、又はＰＢＳ対照群に割り当てられた。
インビボ生物発光イメージング。
ＰＢＳ中Ｄ−ルシフェリン（Ｘｅｎｏｇｅｎ）（１５ｍｇ／ｍＬ）を、ホタルルシフェラーゼイメージングのための基質として使用した。生物発光画像は、Ｘｅｎｏｇｅｎ ＩＶＩＳ Ｓｐｅｃｔｒｕｍイメージングシステム（Ｘｅｎｏｇｅｎ）で収集した。マウスは、イメージング前及び最中に２％のイソフルラン（Ｆｏｒａｎｅ、Ｂａｘｔｅｒ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）で麻酔にかけた。ＩＤ８−ＶＥＧＦ卵巣腫瘍に関して、それぞれのマウスは、３００μｇのＤ−ルシフェリンをｉ．ｐ．注射し、画像は１０分後に収集した。Ｂ１６Ｆ１０肺転移性腫瘍に関して、マウスは、３ｍｇのＤ−ルシフェリンをｉ．ｐ．注射し、画像は１５分後に収集した。脳腫瘍モデルに関して、マウスは、７５ｍｇ／体重ｋｇのＤ−ルシフェリンの後眼窩注射を受け、画像は４分後に収集した。捕捉時間は１０秒〜５分の範囲に及んだ。
体内分布分析。
ＩＤ８−ＶＥＧＦ卵巣腫瘍モデルにおけるＩＲＦ５ ＮＰの体内分布を決定するため、７〜８群のマウスが、５０μｇのｍＲＮＡを担持するＮＰのｉ．ｐ．又は後眼窩用量を受けた。注射２４時間後、全血を収集し、マウスはＣＯ２で安楽死させ、臓器（肝臓、脾臓、肺、腎臓、心臓、腸、膵臓、及び横隔膜）を回収した。すべての組織はＲＮＡｌａｔｅｒで安定化し、次に、ドライアイス上で凍結した。それぞれの臓器におけるコドン最適化ＩＲＦ５ ｍＲＮＡレベルはＲＴ−ｑＰＣＲを使用して測定した。
毒性分析。
マクロファージターゲティングＮＰを繰り返し注入することの潜在的なインビボ毒性を測定するため、マウス（５／群）に５０μｇのｍＲＮＡを担持するＩＲＦ５／ＩＫＫβ又はｅＧＦＰ ＮＰの６連続用量を３週間の間に静脈内注射した。対照は処置を受けなかった。最終注入の２４時間後、マウスに麻酔をかけ、血液を後眼窩出血により収集し、全血球数を決定した。血液は、血清化学及びサイトカインプロファイル分析のためにも収集した（Ｐｈｏｅｎｉｘ Ｃｅｎｔｒａｌ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｍｕｋｉｌｔｅｏ、ＷＡにより実施した）。次に、動物はＣＯ２で安楽死させ、臓器を回収し、４％のパラホルムアルデヒドに固定する前に脱イオン水で洗浄した。組織はルーチン処理し、切片はヘマトキシリン−エオジンで染色した。検体は、委員会認定の局員病理学者により、盲検様式で解釈された。
サイトカインアッセイ。
サイトカインレベルは、ＦＨＣＲＣ Ｉｍｍｕｎｅ Ｍｏｎｉｔｏｒｉｎｇ Ｓｈａｒｅｄ Ｒｅｓｏｕｒｃｅｓにおいてルミネックス２００システム（Ｌｕｍｉｎｅｘ）を使用して評価した。エクスビボ研究に関して、細胞培養上澄みを、ＩＬ−６、ＩＬ１２ｐ７０、ＩＮＦγ、及びＴＮＦαの濃度の測定のために収集した。インビトロ研究では、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＮＦγ、ＩＬ−１２ｐ７０、ＩＬ−２、ＩＬ−６及びＴＮＦαの血漿濃度を測定した。
統計解析。
観察された相違の統計的有意は、独立両側一元配置分散分析検定を使用して分析した。測定ごとのＰ値は、図又は図説明文に収載されている。生存データは、対数順位検定を使用して特徴付けた。統計解析はすべて、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍソフトウェアバージョン６．０又はＲソフトウェアを使用して実施した。
結果。
ＴＡＭのＩＶＴ ｍＲＮＡトランスフェクションを構成するためにＮＰを設計する。陽イオンＰＢＡＥポリマーと陰イオンｍＲＮＡの間の静電相互作用を利用することにより、標的化細胞における頑強な遺伝子発現を導入することができる標的化ｍＲＮＡ送達システムを開発した（図９Ａ）。得られたナノ担体にカプセル化されたｍＲＮＡの安定性及び翻訳を改善するため、改変リボヌクレオチドプソイドウリジン（ψ）（Ｋａｒｉｋｏ Ｋら、（２００８）Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ １６：１８３３〜１８４０頁）及び５−メチルシチジン（ｍ５Ｃ）を組み込み、ＡＲＣＡ（アンチリバースキャップアナログ）（Ｑｕａｂｉｕｓ ＥＳら、（２０１５）Ｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ ３２：２２９〜２３５頁）でキャップされたメッセージの合成バージョンを使用した。ｍＲＮＡは、ＰｂＡＥ骨格においてエステル結合の加水切断により細胞内でｍＲＮＡ−ＰｂＡＥ複合体から放出される。効率的なインビボＴ細胞トランスフェクションは、このシステムを使用して以前実証されていた（Ｓｍｉｔｈ ＴＴら、（２０１７）Ｎａｔ Ｎａｎｏｔｅｃｈｎｏｌ）。ナノ粒子を標的のＴＡＭに向け並びにナノ粒子が含有するｍＲＮＡ−ＰｂＡＥ複合体をさらに安定化するため、ジマンノース部分は、リンカーとしてＰＧＡを使用してその表面上に操作した（図９Ａ）。ＮＰは、単純な２ステップ電荷駆動自己組織化工程を利用して製造した。第１に、合成ｍＲＮＡは正電荷ＰｂＡＥポリマーと複合体化し、これによりｍＲＮＡはナノサイズ複合体中に凝縮される。このステップに続いて、ジマンノース官能基を持たされたＰＧＡを添加し、これは正電荷のＰｂＡＥ−ｍＲＮＡ粒子を遮蔽して、マクロファージ−ターゲティングを与える。得られたｍＲＮＡナノ担体は、９９．８±２４．５ｎｍのサイズ、０．１８３の多分散性、及び中性表面電荷（３．４０±２．１５ｍＶのζ電位、図９Ｂ、９Ｃ）有していた。トランスフェクション効率は、先ず、緑色蛍光タンパク質コードｍＲＮＡで処方されたＮＰ（ＧＦＰ−ＮＰ）を使用してマウス骨髄由来マクロファージ（ＢＭＤＭ）において試験した。手短に言えば、５０，０００のＢＭＤＭを１μｇのｍＲＮＡを含有するＮＰに１時間曝露し、続いて次の日、ＧＦＰ発現のフローサイトメトリー測定を行った。単一ＮＰ適用に続いて、これらの一次マクロファージの３１．９％（±８．５％）は、その生存率を低下させずにルーチン的にトランスフェクトされた（図９Ｅ、９Ｆ）。ジマンノースを用いた粒子の表面修飾は適切であった。なぜならば、非標的化（しかし、ＰＧＡ被覆された）ナノ担体でのトランスフェクション率はこの固有の食作用性細胞型において平均で２５％（±２．１％）まで低下したからであった。ＮＰは、ＣＤ１１ｂ＋、Ｆ４／８０＋マクロファージ集団を選択的に標的にし、マクロファージの４６％がトランスフェクトされ高レベルのｅＧＦＰを発現した（図９Ｄ）。この高度なトランスフェクション効率は、ＴＡＭへのｍＲＮＡの標的化送達において開示されたシステム及び方法の効力を実証している。マクロファージ極性化を誘導する転写因子候補を求めてのインビトロスクリーニングの結果に基づいて、ＮＰに包含するための２つのｍＲＮＡを選択し：第１のｍＲＮＡは、Ｍ１表現型に向かうマクロファージの極性化に有利に働くＩＲＦファミリーのキーとなるメンバーである、ＩＲＦ５をコードし、第２のｍＲＮＡはＩＲＦ５をリン酸化し活性化するキナーゼである、ＩＫＫβをコードする。
免疫抑制性マクロファージを炎症促進性表現型にプログラムする。
マクロファージ極性化を誘導するため、ＮＰに包含するための２つのｍＲＮＡを選択し：第１のｍＲＮＡは、Ｍ１表現型に向かうマクロファージの極性化に有利に働くインターフェロン制御因子ファミリーのキーとなるメンバーである、ＩＲＦ５をコードし（Ｋｒａｕｓｇｒｕｂｅｒ Ｔら、（２０１１）Ｎａｔ Ｉｍｍｕｎｏｌ １２：２３１〜２３８頁）；第２のｍＲＮＡは、ＩＲＦ５をリン酸化し活性化するキナーゼである、ＩＫＫβをコードする（Ｒｅｎ Ｊら、（２０１４）Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ １１１：１７４３８〜１７４４３頁）。３ ＩＲＦ５ ｍＲＮＡ対１ ＩＫＫβ ｍＲＮＡの比を使用した。ＮＰ送達（及びコドン最適化）ＩＲＦ５ ｍＲＮＡに特異的なリアルタイム定量的ＰＣＲを使用して、マクロファージにおけるｍＲＮＡ発現は１日目が最大であり、内在性因子レベルと比べてＩＲＦ５の１５００倍の増加がもたらされることが見出された（図９Ａ）。予想通り、遺伝子発現は一過性であるが、ＩＲＦ５レベルは、ベースラインに戻る前、３日目（５８１倍の増加）から５日目（８７倍の増加）を通じて強く上方調節されたままであった。
ＩＲＦ５／ＩＫＫβコードＮＰがＭ２マクロファージを治療的に望ましい抗がんＭ１表現型に再プログラムできるかどうかを判定するため、ナノストリング遺伝子発現分析を使用した。ＢＭＤＭは、先ず、インターロイキン−４（ＩＬ−４）の存在下で培養して、抑制性Ｍ２表現型を誘導した（図９Ｈ）。対照ＧＦＰ−ｍＲＮＡナノ粒子又はＩＲＦ５／ＩＫＫβ ｍＲＮＡ含有ＮＰでのトランスフェクションに続いて、遺伝子発現プロファイルを分析し炎症性マクロファージと比較した。この炎症性マクロファージは、ＢＭＤＭをＴＬＲ４アゴニストモノホスホリスリピドＡに曝露することにより別々に作成した。抑制性ＩＬ−４含有培地で培養されたが、ＩＲＦ５／ＩＫＫβ ｍＲＮＡ ＮＰをトランスフェクトされたマクロファージは、炎症性マクロファージに類似する遺伝子発現プロファイルを示す（図９Ｉ）。セルピンｂ２及びＣｃｌ２などのシグネチャーＭ２マクロファージ遺伝子（Ｊａｂｌｏｎｓｋｉ Ｋら、（２０１５）Ｐｌｏｓ Ｏｎｅ １０：ｅ０１４５３４２；Ｖａｒｇａ Ｔら、（２０１６）Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ １９６：４７７１〜４７８２頁）は、強く下方調節されており、Ｃｃｌ５などのキーとなるＭ１分化遺伝子（Ｓｉｃａ Ａら、（２０１２）Ｊ Ｃｌｉｎ Ｉｎｖｅｓｔ １２２：７８７〜７９５頁）は上方調節されていた（図９Ｊ、９Ｋ）。これらのデータにより、ＩＲＦ５及びそのキナーゼのＮＰ媒介発現は抑制性マクロファージを炎症促進性表現型の方に歪めることが立証される。
［実施例３］
播種性卵巣がんに対するＮＰ送達ｐｒｏ−Ｍ１遺伝子の治療効果。
臨床関連インビボ試験システムにおいてこの処置アプローチを評価するため、Ｃ５７ＢＬ／６マウスにおいて後期切除不能卵巣腫瘍を再現するモデルを使用し；これらの動物には、腫瘍成長の連続生物発光イメージングを可能にするようにルシフェラーゼでタグ付けされたＩＤ８卵巣がん細胞を注射する（Ｌｉａｏ ＪＢら、（２０１５）Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ Ｃａｎｃｅｒ ３：１６頁；Ｓｔｅｐｈａｎ ＳＢら、（２０１５）Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ ３３：９７〜１０１頁）。腫瘍は２週間確立させておいた。この段階まで、マウスは腹膜壁全体に及び腸の腸間膜に小結節を発症していた。動物は、９週間の間１００μｇのｍＲＮＡ／マウス／週のｉ．ｐ．用量での、ＰＢＳ（対照）、ＧＦＰＮＰ（ニセ）、又はＩＲＦ５／ＩＫＫβ ＮＰ処置を受ける３つの群に分けた（図１０Ａ）。ＩＲＦ５／ＩＫＫβ ＮＰ処置群において、疾患が退行しており、最後には動物の４０％で除去されていることが観察された（全体で１４２日生存期間中央値対６０日対照；図１０Ｂ、１０Ｃ）。ＩＲＦ５／ＩＫＫβ ＮＰ媒介抗腫瘍効果の下にある機序を理解するため、マンノース受容体ターゲティングがＮＰ相互作用をどのようにして排他的に食細胞に限定するのかを先ず調べた。ジマンノースで標的化されたＮＰの最初の投与の２４時間後に収集された腹膜灌流液のフローサイトメトリーにより、マクロファージ及び単球中への優先的遺伝子移入（それぞれ、平均３７．１％及び１５．３％、図１０Ｄ）が明らかにされ、オフターゲット細胞中へのトランスフェクションは低い又は検出されなかった。３週間にわたる（毎週２回注射）ＩＲＦ５／ＩＫＫβナノ粒子又はＰＢＳを用いた処置に続く確立した卵巣がんを抱えたマウスの腹膜におけるマクロファージ／単球集団の詳細な表現型及び機能分析を次に行った。フローサイトメトリー分析によれば、ＩＲＦ５／ＩＫＫβ ＮＰは免疫抑制性マクロファージの集団（Ｌｙ６Ｃ−、Ｆ４／８０＋、ＣＤ２０６＋）を平均２．６％±２．１％対対照においては４３％±１５．６％まで減少させることが明らかになった（図１０Ｅ、１０Ｆ）。反対に、Ｍ１様マクロファージの割合は０．５％±０．２％から１０．２％±４．１％まで増えた（図１０Ｅ、１０Ｇ）。ＩＲＦ５遺伝子療法は他の免疫細胞の集団にも影響を及ぼした。特に、炎症性単球（ＣＤ１１ｂ＋、Ｌｙ６Ｃ＋、Ｌｙ６Ｇ−）がより豊富であった（非処置マウスでの４．５％±１．９％と比べて７３．４％±３．６％）。すべてのＩＲＦ５ ＮＰ処置マウスにおける１つの興味深い所見は、新生物内又は周辺に存在するリンパ球の多巣性密集クラスターであり（図１０Ｈ）、免疫刺激性マクロファージの遺伝的プログラミングが固体腫瘍中へのリンパ球遊走及び浸潤を復活させる可能性があることを示している。
腹膜マクロファージは蛍光活性化細胞選別により単離して、それらのサイトカイン分泌を分析し、炎症促進性（抗腫瘍）サイトカインＩＬ−１２（３．４倍高い）、ＩＦＮ−ｇ（８．４倍高い）、及びＴＮＦ−α（１．５倍高い）の放出の頑強な増加を検出し、一方、選択的に活性化される（Ｍ２様）マクロファージへの分化に関連する制御サイトカインであるＩＬ−６のレベルは９７倍減少した；図１０Ｉ）。ゲノム発現プロファイリングにより、ＩＲＦ５／ＩＫＫβナノ粒子処置マウスにおいてＭ１様マクロファージ表現型の方に向かう分化が確認された。ＭＰＬＡ又はＩＬ−４においてエクスビボで培養されたマクロファージの遺伝子発現レベルは、それぞれ古典的Ｍ１様又はＭ２様マクロファージについての参照値を提供するために含まれた（図１０Ｊ）。
生体分布及び安全性。
ナノ粒子送達（コドン最適化）ＩＲＦ５のみを検出するように設計されたＲＴ−ｑＰＣＲアッセイを使用して腹腔内注射の２４時間後に種々の臓器におけるナノ粒子の分布を次に定量化した。ＩＶＴ ｍＲＮＡの最高濃度は、肝臓、脾臓、腸、膵臓、及び横隔膜を含む、腹膜に位置する臓器において見出された（図１１Ａ）。腹膜の外側に位置する臓器（心臓、肺、腎臓）における粒子送達ｍＲＮＡは少量が検出され、ｉ．ｐ．注射されたナノ担体の一部が全身循環に入ったことが示唆される。分配データに導かれて、これらのナノ試薬が生体適合性であり繰り返し投与について安全であるかどうかを次に評価した。マウスに、全部で８用量のＩＲＦ５／ＩＫＫβ ＮＰを注射した（４週間の間、２回の５０μｇのｍＲＮＡ用量／週、図１１Ｂ）。マウスは最終用量の２４時間後に安楽死させ、体重を記録し、血清化学のために血液を後眼窩出血により収集し、完全肉眼部検を実施した。群間には体重差はなかった。以下の組織：肝臓、脾臓、腸間膜、膵臓、胃、腎臓、心臓、及び肺は、委員会認定の局員病理学者により評価された。病理組織学的評価により、すべての症例で、腫瘍病変内又は周辺に存在するリンパ球の多巣性密集クラスターが明らかにされたが、炎症又は明らかな壊死の証拠は、新生物細胞が存在しない組織において観察されなかった（図１１Ｃ）。その上、ＩＲＦ５／ＩＫＫβ ＮＰ処置マウスの血清化学は、ＰＢＳ対照の血清化学と匹敵しており、全身的な毒性は起きていないことを示していた（図１１Ｄ）。生体分布研究において少量のＩＲＦ５−ｍＲＮＡが全身的に検出されたので、末梢血中の炎症性サイトカインを定量化するための並列実験を設計した。ＩＲＦ５／ＩＫＫβ ＮＰの単回ｉ．ｐ．注射に続いて、インターロイキン−６（ＩＬ−６）の平均２６．８ｐｇ／ｍＬまでの（図１１Ｅ）及び腫瘍壊死因子−α（ＴＮＦ−α）の平均９４．７ｐｇ／ｍＬまでの（図１１Ｆ）血清レベルの中程度で一過性の増加が測定された。以前の報告に基づいて、これらのレベルは、病理学的所見に関連するレベルの５００分の１であり、したがって安全と見なすことができる（Ｔａｒｒａｎｔ Ｊ．Ｍ．（２０１０）Ｔｏｘｉｃｏｌ Ｓｃｉ １１７：４〜１６頁；Ｃｏｐｅｌａｎｄ Ｓら、（２００５）Ｃｌｉｎ Ｄｉａｇｎ Ｌａｂ Ｉｍｍｕｎｏｌ １２：６０〜６７頁）。
ＩＲＦ５／ＩＫＫβナノ粒子の静脈内注入で全身性腫瘍転移を制御する。
腹膜全体に広がった腫瘍病変を処置するために腹膜腔中に直接投与されたＩＲＦ５／ＩＫＫβ ＮＰにより達成された治療応答に基づいて、問われた次の問題は、静脈内注入ｍＲＮＡナノ担体が伝播した疾患を制御するようにマクロファージを全身的にプログラムすることができるかどうかであった。ＲＴ−ｑＰＣＲ生体分布研究によれば、ｉ．ｖ．注入ナノ担体はそれらのｍＲＮＡカーゴを高レベルの常在性マクロファージ／食細胞のある臓器、大部分が脾臓、肝臓、及び肺に優先的に送達することが明らかにされた（図１２Ａ）。臨床関連インビボ試験システムにおいて抗腫瘍応答を測定するため、ＩＲＦ５／ＩＫＫβ ｍＲＮＡを含有する粒子を、播種性肺黒色腫転移のあるマウス中に投与した（図１２Ｂ）。最近の研究は、この疾患により引き起こされる転移を確立する際の単球及びマクロファージの基本的役割を記載しており（Ｂｕｔｌｅｒ ＫＬら、（２０１７）Ｓｃｉ Ｒｅｐ ７：４５５９３頁；Ｎｉｅｌｓｅｎ ＳＲら、（２０１７）Ｍｅｄｉａｔｏｒｓ Ｉｎｆｌａｍｍ ２０１７年：９６２４７６０頁）、腫瘍移植は肺における食細胞蓄積と同調していることが共焦点顕微鏡により確かめられた（図１２Ｃ）。腫瘍量は生物発光イメージングにより決定し、検出可能な腫瘍のあるマウスは適合するレベルを有する群に選別された。次に、群は無作為に、治療を受けない（ＰＢＳ）、又はＧＦＰ−若しくはＩＲＦ５／ＩＫＫβカプセル化ナノ粒子の静脈内注射を受ける処置条件を割り当てられた。ＩＲＦ５／ＩＫＫβナノ粒子療法のみが肺において腫瘍量を実質的に減らし；実際、ＩＲＦ５／ＩＫＫβナノ粒子療法は全生存を平均で１．３倍改善した（図１２Ｄ、１２Ｅ）。並列実験において、マウスは腫瘍接種２２日後に屠殺されて、肺転移のカウントで生物発光腫瘍シグナルを確認し、フローサイトメトリーによりマクロファージ極性化を評価した。ＩＲＦ５／ＩＫＫβ ＮＰ処置動物の肺における全転移数は、ＰＢＳ対照（平均４１９±１３９転移；図１２Ｆ、１２Ｇ）と比べて８．７倍減少した（平均４０±１６転移）。気管支肺胞洗浄液細胞のフローサイトメトリーにより、免疫抑制性（ＣＤ２０６＋、ＭＨＣＩＩ−、ＣＤ１１ｃ＋、ＣＤ１１ｂｌｏｗ）マクロファージから活性化（ＣＤ２０６−、ＭＨＣＩＩ＋、ＣＤ１１ｃ−、ＣＤ１１ｂ＋）食細胞への強い移行が明らかにされた（図１２Ｈ、１２Ｉ）。
神経膠腫を処置するために腫瘍抑制食細胞をプログラムする。
第３のインビボ試験システムに関して、神経膠腫を調べたが、これは、Ｍ２様マクロファージが非新生物細胞の大多数を表し腫瘍成長及び侵襲を促進する管理するのが困難ながんタイプである（Ｈａｍｂａｒｄｚｕｍｙａｎ Ｄら、（２０１６）Ｎａｔ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ １９：２０〜２７頁）。現在、この疾患の標準治療は放射線療法であり、この療法は不運なことに、症状の一時的な安定化及び減少のみを提供し、生存期間中央値を３カ月延ばす（Ｍａｎｎ Ｊら、（２０１７）Ｆｒｏｎｔ Ｎｅｕｒｏｌ ８：７４８頁）。この疾患の遺伝的事象及びそれに続く分子進化を再現するため、ＰＤＧＦβ駆動神経膠腫のＲＣＡＳ−ＰＤＧＦ−Ｂ／Ｎｅｓｔｉｎ−Ｔｖ−ａ；Ｉｎｋ４ａ／Ａｒｆ−／−；Ｐｔｅｎ−／−トランスジェニックマウスモデル（ＰＤＧマウス（Ｈａｍｂａｒｄｚｕｍｙａｎ Ｄら、（２００９）Ｔｒａｎｓｌ Ｏｎｃｏｌ ２：８９〜９５頁；Ｑｕａｉｌ ＤＦら、（２０１６）Ｓｃｉｅｎｃｅ ３５２：ａａｄ３０１８））を使用した。脳組織は、ＲＣＡＳ−ＰＤＧＦβ又はＲＣＡＳ−ｃｒｅレトロウイルスをトランスフェクトしたＤＦ−１細胞の混合物（１対１混合物、２μＬ）を定位的に注射した。神経膠腫前駆細胞におけるＰＤＧＦβがん遺伝子の過剰発現及び腫瘍抑制遺伝子Ｉｎｋ４ａ−ａｒｆ及びＰｔｅｎの非存在のせいで、２１日以内にほぼ完全な浸透率を有する４〜５ｍｍ直径の腫瘍が形成された（図１３Ａ）（以前確立された通りに（Ｈａｍｂａｒｄｚｕｍｙａｎ Ｄら、（２００９）Ｔｒａｎｓｌ Ｏｎｃｏｌ ２：８９〜９５）。免疫蛍光を使用して、腫瘍浸潤（ＣＤ６８＋）マクロファージの存在（図１３Ｂ、左から３番目のパネルに示されている）が確立した神経膠腫（左から２番目のパネルに示されている）において確かめられた。フローサイトメトリーにより、Ｆ４／８０＋、ＣＤ１１ｂ＋マクロファージ集団が腫瘍中の全細胞の３２．８％を占めており、この数字は同年齢の健康な対照マウス（３．７％）に見られる９倍高いことが明らかにされている（図１３Ｃ）。実験におけるＰＤＧマウスは、キーとなるがん遺伝子プロモーターに連結されたホタルルシフェラーゼを発現する。このレポーター由来の生物発光は、腫瘍悪性度と正の相関関係があることが実証されており（Ｕｈｒｂｏｍ Ｌら、（２００４）Ｎａｔ Ｍｅｄ １０：１２５７〜１２６０頁）、したがって、この生物発光を使用して、処置開始後４日ごとに腫瘍成長をモニターした。単独療法としてのＩＲＦ５／ＩＫＫβ ＮＰを先ず試験し：ＰＤＧマウスは、ＩＲＦ５／ＩＫＫβ ｍＲＮＡを積載したＮＰ、又は対照群においてＰＢＳの９用量の静脈内注入を受けた（３週間の間、３用量／週）。ＩＲＦ５／ＩＫＫβ ＮＰ処置は腫瘍進行をわずかに抑制した（非処置の対照と比べて平均で５日の生存優位性を生じただけであった；図１３Ｄ）。しかし、標準治療としての放射線療法とＩＲＦ５／ＩＫＫβ ＮＰ注射を組み合わせると、ＰＢＳ対照群と比べて処置マウスの腫瘍成長を実質的に減らし生存期間を２倍以上にした（それぞれ、５２日対２５日、図１３Ｅ、１３Ｆ）。
結論として、３つの前臨床固体腫瘍モデルからのインビボ結果によれば、ナノ粒子は、局所的に又は全身的に投与されるが、マクロファージ極性化のマスター制御因子をコードする遺伝子を送達して免疫抑制性マクロファージを腫瘍除去表現型に再プログラムすることができることが実証されている。
マウスからヒトマクロファージへの置き換え。
マウスで得られたデータがヒト疾患を処置することに適用可能性があることを確かめるため、ヒトＩＲＦ５及びＩＫＫβをコードするＩＶＴ ｍＲＮＡを送達するＮＰ（ｈｕＩＲＦ５ ＮＰ）を製作した。ヒト単球細胞株ＴＨＰ−１を確立したＭ１及びＭ２マクロファージ極性化モデルとして使用して、これらのナノ担体を試験した（Ｌｉ Ｃら、（２０１６）Ｓｃｉ Ｒｅｐ ６：２１０４４頁；Ｓｕｒｄｚｉｅｌ Ｅら、（２０１７）Ｐｌｏｓ Ｏｎｅ １２：ｅ０１８３６７９）。Ｍ２タイプのマクロファージは、ＴＨＰ−１細胞をＰＭＡで処置し、ＩＬ−４及びＩＬ−１３で極性化することにより作成した（図１４Ａ）。ｈｕＩＲＥ５ ＮＰが機能的でありＩＲＦ経路を活性化することを確かめるため、ＴＨＰ１−Ｌｕｃｉａ（商標）ＩＳＧ細胞に、ｈｕＩＲＦ５／ＩＫＫβ又はＧＦＰ対照ｍＲＮＡを積載したナノ粒子をトランスフェクトした。ＴＨＰ１−Ｌｕｃｉａ（商標）ＩＳＧ細胞は、ＩＲＦ誘導性プロモーターの制御下で蛍光Ｌｕｃｉａレポーターを分泌する。この複合プロモーターは、ＩＳＧ５４ミニマルプロモーターに融合された５つのＩＦＮ刺激応答エレメント（ＩＳＲＥ）を含み、このミニマルプロモーターはＮＦ−κＢ又はＡＰ−１経路の活性化因子に無応答性である。その結果、ＴＨＰ１−Ｌｕｃｉａ（商標）ＩＳＧ細胞は、Ｌｕｃｉａルシフェラーゼの活性を決定することによりＩＲＦ経路のモニタリングを可能にする。ｈｕＩＲＦ５ ＮＰは、Ｍ２極性化ＴＨＰ−１細胞においてルシフェラーゼ発現を強く上方調節することが見出され、ｍＲＮＡ構築物がヒト細胞において機能的であることが示される（図１４Ｂ、１４Ｃ）。ＩＲＦ５経路活性化がＭ２極性化ＴＨＰ−１細胞をＭ１様表現型の方に再プログラムできるかどうかを判定するため、ＮＰトランスフェクションに続く炎症促進性サイトカインＩＬ−１βの分泌を測定した。ＩＬ−１βの産生は、ｈｕＩＲＦ５ ＮＰをトランスフェクトしたＴＨＰ−１細胞対非トランスフェクト対照において有意に増加しており（平均２１倍；Ｐ＜０．０００１、図１４Ｄ）、Ｍ１マクロファージ細胞表面マーカーＣＤ８０の頑強な上方調節（１０．９倍に増加したＭＦＩ、Ｐ＜０．０００１）と相関していた（図１４Ｅ）。
予言的実施例１：Ｔ細胞誘引物質を用いた事前調整
組換えＣＣＬ２１（ケモカイン（ｃ−ｃモチーフ）リガンド２１）を確立した腫瘍に皮下注射し、１日後、腫瘍には、腫瘍特異的ＣＡＲ、ＴＣＲ又はＣＡＲ／ＴＣＲハイブリッドを有する動員されたＴ細胞を再プログラムするナノ粒子を注射する。ＣＣＬ２１は急速なＴ細胞侵入を誘導することが知られている（例えば、Ｒｉｅｄｌら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃａｎｃｅｒ ２００３年）。
予言的実施例２：播種性卵巣がん
播種性卵巣がんは、免疫適格性マウスにおいて確立される。動物は、ＣＣＬ２１を腹腔内（ｉ．ｐ．）に注射され、続いて１日後メソセリン（ＭＳＬＮ）特異的ＴＣＲをコードするｍＲＮＡを送達するナノ粒子をｉ．ｐ．注射された。卵巣がん細胞は高レベルのＭＳＬＮを発現する。再プログラム効率（ＣＣＬ２１での事前調整あり又はなしで）は測定され、腫瘍進行は生物発光イメージングを使用して連続してモニターされる。
予言的実施例３：ＨＢＶ誘導肝細胞癌のマウス異種移植片モデル
ＨＢｃｏｒｅ１８−２７抗原を安定的にトランスフェクトされるＨｅｐＧ２腫瘍細胞をＮＳＧマウスの肝臓に外科的に移植する。ＨｅｐＧ２腫瘍細胞は、腫瘍進行を非侵襲的にモニターできるようにホタルルシフェラーゼをタグ付けする。次に、マウスは、ヒトＴ細胞で再構成し、抗ＨＢＶ特異的ＴＣＲ（ＨＢｃｏｒｅ１８−２７）又は対照ＧＦＰをコードするｍＲＮＡを送達するＴ細胞標的化ナノ粒子を注射する。腫瘍進行は、ＴＣＲナノ粒子処置対ＧＦＰナノ粒子対照で比較される。末梢血中でのＴＣＲ再プログラミングもフローサイトメトリーにより直接測定される。
別段示されなければ、本開示の実行は、免疫学、分子生物学、微生物学、細胞生物学及び組換えＤＮＡの従来の技法を用いることができる。これらの方法は以下の出版物に記載されている。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、第２版（１９８９）；Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌら、編、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（１９８７）；ｔｈｅ ｓｅｒｉｅｓ Ｍｅｔｈｏｄｓ ＩＮ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、Ｉｎｃ．）；Ｍ．ＭａｃＰｈｅｒｓｏｎら、ＰＣＲ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ、ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ ａｔ Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ（１９９１）；ＭａｃＰｈｅｒｓｏｎら、編、ＰＣＲ ２：Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ （１９９５）；Ｈａｒｌｏｗ ａｎｄ Ｌａｎｅ、編．Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ、Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（１９８８）；及びＲ．Ｉ．Ｆｒｅｓｈｎｅｙ、編．Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ（１９８７）を参照されたい。
公開されているデータベースにより提供される配列情報を使用すれば、標的にする遺伝子配列及び本明細書に開示される表現型変更タンパク質をコードする核酸配列を確認することができる。例示的配列は図１５に提供されている。
本明細書で開示され参照される配列の変異体も含まれている。タンパク質の変異体は、１つ以上の保存的アミノ酸置換を有する変異体を含むことができる。本明細書で使用される場合、「保存的置換」は、以下の保存的置換群：群１：アラニン（Ａｌａ）、グリシン（Ｇｌｙ）、セリン（Ｓｅｒ）、スレオニン（Ｔｈｒ）；群２：アスパラギン酸（Ａｓｐ）、グルタミン酸（Ｇｌｕ）；群３：アスパラギン（Ａｓｎ）、グルタミン（Ｇｌｎ）；群４：アルギニン（Ａｒｇ）、リジン（Ｌｙｓ）、ヒスチジン（Ｈｉｓ）；群５：イソロイシン（Ｉｌｅ）、ロイシン（Ｌｅｕ）、メチオニン（Ｍｅｔ）、バリン（Ｖａｌ）；及び群６：フェニルアラニン（Ｐｈｅ）、チロシン（Ｔｙｒ）、トリプトファン（Ｔｒｐ）の１つに見出される置換を含む。
さらに、アミノ酸は、類似する機能又は化学構造若しくは組成（例えば、酸性、塩基性、脂肪族、芳香族、硫黄含有）により保存的置換グループに分類することができる。例えば、脂肪族分類は、置換目的で、Ｇｌｙ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、及びＩｌｅを含みうる。互いに保存的置換と見なされるアミノ酸を含有する他のグループは、硫黄含有：Ｍｅｔ及びシステイン（Ｃｙｓ）；酸性：Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ａｓｎ、及びＧｌｎ；小さな脂肪族、非極性又はわずかに極性残基：Ａｌａ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｐｒｏ、及びＧｌｙ；極性、負電荷残基及びそれらのアミド：Ａｓｐ、Ａｓｎ、Ｇｌｕ、及びＧｌｎ；極性、正電荷残基：Ｈｉｓ、Ａｒｇ、及びＬｙｓ；大きな脂肪族、非極性残基：Ｍｅｔ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｖａｌ、及びＣｙｓ；並びに大きな芳香族残基：Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、及びＴｒｐを含む。追加の情報は、Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ（１９８４） Ｐｒｏｔｅｉｎｓ、Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ ａｎｄ Ｃｏｍｐａｎｙに見られる。
他の場所に示されているように、遺伝子配列の変異体は、コドン最適化変異体、配列多型、スプライス変異体及び／又は統計的に有意な程度にコード産物の機能に影響を与えない突然変異を含むことができる。
本明細書に開示されるタンパク質、核酸及び遺伝子配列の変異体は、本明細書に開示されるタンパク質、核酸又は遺伝子配列に少なくとも７０％配列同一性、８０％配列同一性、８５％配列同一性、９０％配列同一性、９５％配列同一性、９６％配列同一性、９７％配列同一性、９８％配列同一性、又は９９％配列同一性を有する配列も含む。
「％配列同一性」とは、配列を比較することにより決定される場合、２つ以上の配列間の関係のことである。当技術分野では、「同一性」とは、そのような配列のストリング間の適合により決定されるタンパク質、核酸又は遺伝子配列の間の配列関連性の程度も意味する。「同一性」（「類似性」と呼ばれることも多い）は、Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｌｅｓｋ、Ａ．Ｍ．編）Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ、ＮＹ（１９８８）；Ｂｉｏｃｏｍｐｕｔｉｎｇ：Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ ａｎｄ Ｇｅｎｏｍｅ Ｐｒｏｊｅｃｔｓ （Ｓｍｉｔｈ、Ｄ．Ｗ．編）Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、ＮＹ（１９９４）；Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｅｑｕｅｎｃｅ Ｄａｔａ、Ｐａｒｔ Ｉ（Ｇｒｉｆｆｉｎ、Ａ．Ｍ．、及びＧｒｉｆｆｉｎ、Ｈ．Ｇ．編）Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ、ＮＪ（１９９４）；Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｖｏｎ Ｈｅｉｊｎｅ、Ｇ．編）Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ （１９８７）；及びＳｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｐｒｉｍｅｒ（Ｇｒｉｂｓｋｏｖ、Ｍ．及びＤｅｖｅｒｅｕｘ、Ｊ．編）Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ、ＮＹ（１９９２）に記載される方法を含む、公知の方法により容易に計算することができる。同一性を決定する好ましい方法は、試験されている配列間に最善の適合を与えるように設計される。同一性及び類似性を決定する方法は、一般公開されているコンピュータプログラムに成文化されている。配列アライメント及びパーセント同一性計算は、ＬＡＳＥＲＧＥＮＥ生命情報科学コンピューティングスイーツ（ＤＮＡＳＴＡＲ、Ｉｎｃ．、Ｍａｄｉｓｏｎ、Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ）のＭｅｇａｌｉｇｎプログラムを使用して実行しうる。配列のマルチプルアライメントも、Ｃｌｕｓｔａｌアライメント法（Ｈｉｇｇｉｎｓ ａｎｄ Ｓｈａｒｐ ＣＡＢＩＯＳ、５、１５１〜１５３頁（１９８９））を、デフォルトパラメータ（ギャップペナルティ＝１０、ギャップ長ペナルティ＝１０）を用いて実施できる。関連プログラムは、プログラムのＧＣＧスイーツ（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｐａｃｋａｇｅ Ｖｅｒｓｉｏｎ ９．０、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ （ＧＣＧ）、Ｍａｄｉｓｏｎ、Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ）；ＢＬＡＳＴＰ、ＢＬＡＳＴＮ、ＢＬＡＳＴＸ（Ａｌｔｓｃｈｕｌら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３〜４１０頁（１９９０）；ＤＮＡＳＴＡＲ（ＤＮＡＳＴＡＲ、Ｉｎｃ．、Ｍａｄｉｓｏｎ、Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ）；及びｔｈｅ ＦＡＳＴＡ ｐｒｏｇｒａｍ ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｉｎｇ ｔｈｅ Ｓｍｉｔｈ−Ｗａｔｅｒｍａｎ ａｌｇｏｒｉｔｈｍ（Ｐｅａｒｓｏｎ、Ｃｏｍｐｕｔ．Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓ．、［Ｐｒｏｃ．Ｉｎｔ．Ｓｙｍｐ．］（１９９４）、Ｍｅｅｔｉｎｇ Ｄａｔｅ １９９２年、１１１〜２０頁．編者：Ｓｕｈａｉ、Ｓａｎｄｏｒ．出版社：Ｐｌｅｎｕｍ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、ＮＹも含む。本開示の文脈内では、配列分析ソフトウェアが分析のために使用される場合、分析の結果は参照されるプログラムの「デフォルト値」に基づいていることは理解される。本明細書で使用される場合、「デフォルト値」は、値又はパラメータの任意のセットを意味し、これらは元々最初に初期化されるときにソフトウェアにロードされる。
当業者であれば理解するように、本明細書で開示されるそれぞれの実施形態は、この特定の明記される要素、ステップ、構成要素又は成分を含む、本質的にからなる又はからなることができる。本明細書で使用される場合、転換語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」又は「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」は、特に明示されていない要素、ステップ、構成要素又は成分を含むがこれらに限定されず、これらの包含を多量でさえも許す。移行句「からなる」は、明記されていないいかなる要素、ステップ、成分、又は構成要素も排除する。移行句「本質的にからなる」は、実施形態の範囲を明記された要素、ステップ、成分、又は構成要素に、及び実施形態に物理的に影響を及ぼさない要素、ステップ、成分、又は構成要素に限定する。本明細書で使用される場合、物質的効果は、対象への開示されたナノ粒子の投与後に７日以内に治療タンパク質の発現の統計的に有意な減少を引き起こすと考えられる。
特定の実施形態において、ＣＤＲ配列への参照はＫａｂａｔ番号付けに従っている。
別段指示されなければ、明細書及び特許請求の範囲において使用される分子量、反応条件、等などの構成要素の量、特性を表すすべての数字は、あらゆる場合に用語「約（ａｂｏｕｔ）」により修飾されていると理解するべきである。したがって、逆の指示がなければ、明細書及び添付の特許請求の範囲において明記される数値パラメータは、本発明が獲得しようとする所望の特性に応じて変化することがある近似値である。最低でも、及び特許請求の範囲の等価物の学説の適用を限定しようとする試みとしてではなく、それぞれの数のパラメータは、少なくとも、報告された有効数字の数に照らして、及び普通の四捨五入法を適用することにより解釈するべきである。さらなる明快さが求められる場合、用語「約」は、記述されている数値又は範囲と併せて使用される場合に当業者がその用語が持つと合理的に考える意味を有し、すなわち、記述されている値又は範囲よりもいくぶん多い又はいくぶん少ない、記述されている値の±２０％；記述されている値の±１９％；記述されている値の±１８％；記述されている値の±１７％；記述されている値の±１６％；記述されている値の±１５％；記述されている値の±１４％；記述されている値の±１３％；記述されている値の±１２％；記述されている値の±１１％；記述されている値の±１０％；記述されている値の±％９；記述されている値の±８％；記述されている値の±７％；記述されている値の±６％；記述されている値の±５％；記述されている値の±４％；記述されている値の±３％；記述されている値の±２％；又は記述されている値の±１％の範囲内までを表す。
本発明の広い範囲を示している数の範囲及びパラメータは近似値であるが、特定の実施例で示されている数値はできる限り正確に報告されている。しかし、いかなる数値も、それぞれの試験測定値に見出される標準偏差から必然的に生じるある特定の誤差を本質的に含有する。
本発明を記載する文脈で（特に以下の特許請求の範囲の文脈で）使用される用語「１つ（ａ）」、「１つ（ａｎ）」、「これ（ｔｈｅ）」及び類似の指示対象は、本明細書で別段指示されなければ又は文脈が明らかに矛盾しているのでなければ、単数と複数の両方に及ぶと解釈するべきである。本明細書での値の範囲の列挙は、その範囲内に収まるそれぞれ別々の値に個別に言及するという簡単な方法としての働きをすることだけを意図されている。本明細書において別段指示されなければ、それぞれ個々の値は、あたかもそれが本明細書において個別に列挙されているかのように明細書に組み込まれる。本明細書に記載されるすべての方法は、本明細書で別段指示されなければ又は別段文脈とはっきり矛盾しなければ、任意の適切な順番で実施することができる。ありとあらゆる実施例の使用、又は本明細書で提供される例示的言語（例えば、「などの」）は、本発明をよりよく明らかにすることだけを意図されており、別の方法で請求される本発明の範囲を限定しない。明細書のいかなる言語も、本発明の実行に不可欠な任意の請求されていない要素も指示していると解釈されるべきである。
本明細書に開示される本発明の別の要素又は実施形態のグループ分けは限定と解釈されるべきではない。それぞれのグループのメンバーは、個別に又はそのグループの他のメンバー若しくは本明細書に見出される他の要素との任意の組合せで言及され請求されてもよい。グループの１つ以上のメンバーは、都合上及び／又は特許性という理由でグループに含まれる又はグループから削除される場合があることは予想されている。いかなるそのような包含又は削除が起きた場合でも、明細書は、修正され、したがって、添付の特許請求の範囲において使用されるすべてのマーカッシュグループの書面による記述を満たすグループを含有すると見なされる。
本発明を実行するために発明者らに知られている最良の態様を含む、本発明のある特定の実施形態は本明細書に記載されている。当然のことながら、これらの記載されている実施形態の変形は、前の記述を読めば当業者には明らかになる。本発明者は、当業者がそのような変形を必要に応じて用いると予想しており、本発明者らは、本発明が本明細書に具体的に記載される以外の方法で実行されることを意図している。したがって、本発明は、準拠法によって許されるように、ここに添付される特許請求の範囲に列挙される主題のすべての修正物及び等価物を含む。さらに、この考えられるあらゆる変形における上記要素のいかなる組合せも、本明細書で別段指示されなければ又は別段文脈とはっきり矛盾しなければ、本発明に包含される。
さらに、本明細書全体を通じて、雑誌論文、出版物、特許及び特許出願（特許出願公開を含む）（まとめて「引用」）を数多く参照してきた。上記の引用のそれぞれが個別に、参照によりその特定の引用された目的及び／又は教唆のために本明細書に組み込む。
本明細書で開示される実施形態は本発明の原理を例証していることは理解されるべきである。用いることができる他の修正物は本発明の範囲内である。したがって、例として、しかし限定ではなく、本発明の別の構成を本明細書の教えに従って利用してもよい。したがって、本発明は示され記載されている通りの発明に限定されない。
本明細書に示される特色は、例としてであり、本発明の好ましい実施形態を実証的に考察することのみを目的とするものであり、本発明の種々の実施形態の原理及び概念面の最も有用ですぐに理解される記述であると考えられるものを提供するために示されている。これに関して、本発明の構造的詳細を本発明の基本的理解に必要である以上に詳細に示そうとは試みておらず、説明は、本発明のいくつかの形態を実際にどのようにして用いればよいのかを当業者が明らかにする図面及び／又は実施例と一緒に行われている。
以下の実施例において明白に明確に修正されていなければ将来のいかなる解釈においても、又は意味の適用がいかなる解釈も無意味にする若しくは本質的に無意味にする場合、本開示において使用される定義及び説明が支配的であることが意味され意図されている。用語の解釈がその用語を無意味にする若しくは本質的に無意味にすると考えられる場合、定義は、ウェブスター辞典第３版又は生化学及び分子生物学のオックスフォード辞典（Ｅｄ．Ａｎｔｈｏｎｙ Ｓｍｉｔｈ、Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ、Ｏｘｆｏｒｄ、２００４年）などの当業者には公知である辞書から採用するべきである。
本開示全体を通じて、引用されるすべての参考文献及び特許文書は参照によりこれらの全体を本明細書に組み込む。
特定の実施形態において、結合ドメインはＣＤ１９に結合することができる。特定の実施形態において、結合ドメインは、ＣＤ１９に特異的なＶＨ及びＶＬ領域を含む一本鎖Ｆｖ断片（ｓｃＦｖ）である。特定の実施形態において、ＶＨ及びＶＬ領域はヒトである。例示的ＶＨ及びＶＬ領域は、抗ＣＤ１９特異的モノクローナル抗体ＦＭＣ６３のセグメントを含む。特定の実施形態において、ｓｃＦｖは、ＲＡＳＱＤＩＳＫＹＬＮ（配列番号１４２）のＣＤＲＬ１配列、ＳＲＬＨＳＧＶ（配列番号１４３）のＣＤＲＬ２配列及びＧＮＴＬＰＹＴＦＧ（配列番号１４４）のＣＤＲＬ３配列を含む可変軽鎖を含むヒト又はヒト化ｓｃＦｖである。特定の実施形態において、ｓｃＦｖは、ＤＹＧＶＳ（配列番号１４５）のＣＤＲＨ１配列、ＶＴＷＧＳＥＴＴＹＹＮＳＡＬＫＳ（配列番号１４６）のＣＤＲＨ２配列及びＹＡＭＤＹＷＧ（配列番号１４７）のＣＤＲＨ３配列を含む可変重鎖を含むヒト又はヒト化ｓｃＦｖである。ＳＪ２５Ｃ１及びＨＤ３７などの他のＣＤ１９ターゲティング抗体が知られている（ＳＪ２５Ｃ１：Ｂｅｊｃｅｋら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ２００５年、ＰＭＩＤ ７５３８９０１；ＨＤ３７：Ｐｅｚｕｔｔｏら、ＪＩ １９８７年、ＰＭＩＤ ２４３７１９９）。
Figure 2021523110
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を含む。
特定の実施形態において、ターゲティングリガンドは、ＲＡＳＱＳＶＳＳＹＬＡ（配列番号９８）を含むＣＤＲＬ１配列、ＤＡＳＮＲＡＴ（配列番号９３）を含むＣＤＲＬ２配列、及びＱＱＲＳＮＷＰＰＴＦ（配列番号９４）を含むＣＤＲＬ３配列を含む可変軽鎖を含むヒト又はヒト化結合ドメイン（例えば、ｓｃＦｖ）を含む。特定の実施形態において、ターゲティングリガンドは、ＳＦＡＭＳ（配列番号９５）を含むＣＤＲＨ１配列、ＡＩＳＧＳＧＧＧＴＹＹＡＤＳＶＫＧ（配列番号９６）を含むＣＤＲＨ２配列、及びＤＫＩＬＷＦＧＥＰＶＦＤＹ（配列番号９７）を含むＣＤＲＨ３配列を含む可変重鎖を含むヒト又はヒト化結合ドメイン（例えば、ｓｃＦｖ）を含む。これらは、米国特許第７，８２９，６９３号に記載されるＣＤ３８に結合するダラツムマブ抗体のＣＤＲ配列を反映している。
遺伝子発現レベルはｑＲＴ−ＰＣＲにより決定した。選択されたマクロファージシグネチャー遺伝子（セルピンＢ２、Ｒｅｔｎｌａ、Ｃｃｌ５、Ｃｃｌ１１、コドン最適化ＩＲＦ５、内在性ＩＲＦ５、及びハウスキーピングＧＡＰＤ遺伝子）を測定するため、全ＲＮＡはＲＮｅａｓｙ ｍｉｎｉ−ｃｏｌｕｍｎｓ（Ｑｉａｇｅｎ）を製造業者の使用説明書に従って用いて単離した。ｃＤＮＡは、ｑＳｃｒｉｐｔ ｃＤＮＡ合成キット（Ｑｕａｎｔａ）を使用して合成した。試料ごとに、ＲｏｃｈｅのＵｎｉｖｅｒｓａｌ Ｐｒｏｂｅ Ｌｉｂｒａｒｙ（ＵＰＬ）由来の遺伝子特異的プローブ及びＰｒｏｂｅＦｉｎｄｅｒ（Ｒｏｃｈｅ）により最適化されたＰＣＲプライマーを使用するＰｅｒｆｅＣＴａ ｑＰＣＲ ＳｕｐｅｒＭｉｘ Ｌｏｗ ＲＯＸ（Ｑｕａｎｔａ）を経て３通りに実施した：セルピンＢ２、ＵＰＬ−０４９、Ｆ−ＡＣＴＧＧＧＧＣＡＧＴＴＡＴＧＡＣＡＧＧ（配列番号１２８）、Ｒ−ＧＡＴＧＡＴＣＧＧＣＣＡＣＡＡＡＣＴＧ（配列番号１２９）；Ｒｅｔｎｌａ、ＵＰＬ−０７８、Ｆ−ＴＴＧＴＴＣＣＣＴＴＣＴＣＡＴＣＴＧＣＡＴ（配列番号１３０）、Ｒ−ＣＣＴＴＧＡＣＣＴＴＡＴＴＣＴＣＣＡＣＧＡ（配列番号１３１）；Ｃｃｌ５、ＵＰＬ−１０５、Ｆ−ＣＣＴＡＣＴＣＣＣＡＣＴＣＧＧＴＣＣＴ（配列番号１３２）、Ｒ−ＣＴＧＡＴＴＴＣＴＴＧＧＧＴＴＴＧＣＴＧＴ（配列番号１３３）；Ｃｃｌ１１、ＵＰＬ−０１８、Ｆ−ＡＧＡＧＣＴＣＣＡＣＡＧＣＧＣＴＴＣ（配列番号１３４）、Ｒ−ＣＡＧＣＡＣＣＴＧＧＧＡＧＧＴＧＡＡ（配列番号１３５）；コドン最適化ＩＲＦ５、ＵＰＬ−０２２、Ｆ−ＴＣＴＴＡＡＡＧＡＣＣＡＣＡＴＧＧＴＡＧＡＡＣＡＧＴ（配列番号１３６）、Ｒ−ＡＧＣＴＧＣＴＧＴＴＧＧＧＡＴＴＧＣ（配列番号１３７）；内在性ＩＲＦ５、ＵＰＬ−０１１、Ｆ−ＧＣＴＧＴＧＣＣＣＴＴＡＡＣＡＡＡＡＧＣ（配列番号１３８）、Ｒ−ＧＧＣＴＧＡＧＧＴＧＧＣＡＴＧＴＣＴ（配列番号１３９）。シグネチャー遺伝子ｍＲＮＡレベルは、ＧＡＰＤ、ＵＰＬ−０６０、Ｆ−ＡＧＣＣＡＣＡＴＣＧＣＴＣＡＧＡＣＡＣ（配列番号１４０）及びＲ−ＧＣＣＣＡＡＴＡＣＧＡＣＣＡＡＡＴＣＣ（配列番号１４１）の増幅に基づいて正規化した。ｑＲＴ−ＰＣＲ反応はすべて、ＱｕａｎｔＳｔｕｄｉｏ６ソフトウェア（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を実行するＱｕａｎｔ Ｓｔｕｄｉｏ５ ＲＴ−ＰＣＲ装置を使用して実施した。増幅プロットが閾値を通過せずＣｔ値が得られない（「未決定の」）場合、アッセイでの最高のサイクル数（４０サイクル）に等しいＣｔ値を相対的発現の比較のために使用した。
（ｖｉｉ）例示的実施形態
１．処置を必要とする対象を処置する方法であって、
（ｉ）ポリヌクレオチドはタンパク質及び／又は核酸をコードする、正電荷キャリアーマトリックス内にカプセル化されたポリヌクレオチド（例えば、インビトロ転写（ＩＶＴ）ｍＲＮＡなどの合成ｍＲＮＡ）；
（ｉｉ）中性又は負電荷コーティング；並びに
（ｉｉｉ）選択された細胞に特異的な、コーティングの表面から伸びる少なくとも１つの細胞ターゲティングリガンド
を含む治療有効量のナノ粒子を対象に投与すること
を含み、
ナノ粒子は、選択された細胞がポリヌクレオチドからタンパク質を一過性に発現するように、対象内の選択された細胞中に選択的に取り込まれ、それによって処置を必要とする対象が処置される、方法。
２．治療有効量の細胞誘引物質を対象に投与することをさらに含む、実施形態１の方法。
３．細胞誘引物質がＴ細胞誘引物質である、実施形態２の方法。
４．Ｔ細胞誘引物質がＣＣＬ２１又はＩＰ１０である、実施形態３の方法。
５．タンパク質が細胞表面受容体を含む疾患特異的受容体を含む、実施形態１〜４のいずれかの方法。
６．疾患特異的受容体が、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）又はこれらの組合せを含む、実施形態５の方法。
７．治療タンパク質が、白血病特異的ＣＡＲ、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）コア抗原特異的ＨＢｃｏｒｅ１８−２７ ＴＣＲ、又は前立腺腫瘍特異的抗ＲＯＲ１ ＣＡＲを含む、実施形態５又は６の方法。
８．細胞ターゲティングリガンドが、リンパ球に選択的に結合し受容体誘導エンドサイトーシスを開始させる、実施形態１〜７のいずれかの方法。
９．タンパク質の発現が１４日間を超えない、１２日間を超えない、１０日間を超えない、９日間を超えない、８日間を超えない、７日間を超えない、６日間を超えない、又は５日間を超えない発現である、実施形態１〜８のいずれかの方法。
１０．治療有効量のナノ粒子を対象に投与することが、２つ以上の用量のナノ粒子を投与することを含む、実施形態１〜９のいずれかの方法。
１１．２つ以上の用量が、５〜１０日ごとに、又は６〜８日ごとに、又は７日ごとに投与される、実施形態１０の方法。
１２．対象が、がん又は感染性疾患に対する処置を必要とする、実施形態１〜１１のいずれかの方法。
１３．ナノ粒子を投与することが、（ａ）腫瘍中への若しくはその近位への（腫瘍内への）、（ｂ）静脈中への（静脈内への）、又は（ｃ）腹膜中への（腹腔内への）カテーテルを介した注射又は注入を含む、実施形態１〜１２のいずれかの方法。
１４．Ｔ細胞誘引物質を投与することが、腫瘍中への若しくはその近位への（腫瘍内への）カテーテルを介した注射若しくは注入、静脈内注射若しくは注入、又は腹腔内へのカテーテルを介した注射若しくは注入を含む、実施形態３〜１３のいずれかの方法。
１５．細胞誘引物質が、ナノ粒子が投与される前に対象に投与される、実施形態２〜１４のいずれかの方法。
１６．細胞誘引物質が、ナノ粒子が投与される前の１時間以内に、３時間以内に、６時間以内に、１２時間以内に、又は２４時間以内に投与される、実施形態２〜１４のいずれかの方法。
１７．細胞誘引物質が、（ａ）ナノ粒子の最初の用量の後にのみ；（ｂ）ナノ粒子の少なくとも２回の用量のぞれぞれの後に；又は（ｃ）ナノ粒子のそれぞれの用量の後で投与される、実施形態１６の方法。
１８．対象にマクロファージ刺激組成物を投与することをさらに含む、実施形態１〜１７のいずれかの方法。
１９．マクロファージ刺激組成物が、マクロファージ細胞に標的化され、キナーゼＩＫＫβと組み合わせた転写因子インターフェロン制御因子５（ＩＲＦ５）の発現を指示することができるナノ粒子を含む、実施形態１８の方法。
２０．キャリアーが正電荷脂質又はポリマーを含む、実施形態１〜１９のいずれかの方法。
２１．正電荷ポリマーが、ポリ（β−アミノエステル）（ＰＢＡＥ）、ポリ（Ｌ−リジン）、ポリ（エチレンイミン）（ＰＥＩ）、ポリ（アミドアミン）デンドリマー（ＰＡＭＡＭ）、ポリ（アミノ−コ−エステル）、ポリ（ジメチルアミノエチルメタクリレート）（ＰＤＭＡＥＭＡ）、キトサン、ポリ（Ｌ−ラクチド−コ−Ｌ−リジン）、ポリ［α−（４−アミノブチル）−Ｌ−グリコール酸］（ＰＡＧＡ）、又はポリ（４−ヒドロキシ−Ｌ−プロリンエステル）（ＰＨＰ）を含む、実施形態２０の方法。
２２．コーティングが中性又は負電荷脂質又はポリマーを含む、実施形態１〜２１のいずれかの方法。
２３．中性又は負電荷コーティングが、ポリグルタミン酸（ＰＧＡ）、ポリ（アクリル酸）、アルギン酸又はコレステリルヘミスクシナート／１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミンを含む、実施形態２２の方法。
２４．中性又は負電荷コーティングが双性イオンポリマーを含む、実施形態２２の方法。
２５．中性又は負電荷コーティングがリポソームを含む、実施形態２２〜２４のいずれかの方法。
２６．リポソームが、１，２−ジオレオイル−３−トリメチルアンモニウムプロパン（ＤＯＴＡＰ）；１，２−ジ−Ｏ−オクタデセニル−３−トリメチルアンモニウムプロパン（ＤＯＴＭＡ）；３β−［Ｎ−（Ｎ’，Ｎ’−ジメチルアミノエタン）−カルバモイル］コレステロール（ＤＣ−Ｃｈｏｌ）、ジオクタデシルアミドグリシルスペルミン（ＤＯＧＳ）、コレステロール、１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン（ＤＯＰＥ）又は１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＤＯＰＣ）を含む、実施形態２５の方法。
２７．選択された細胞ターゲティングリガンドが、ＣＤ４及び／又はＣＤ８に選択的に結合する、実施形態１〜２６のいずれかの方法。
２８．選択された細胞ターゲティングリガンドが、ＣＤ４抗体及び／又はＣＤ８抗体から選択される結合ドメインを含む、実施形態１〜２７のいずれかの方法。
２９．選択された細胞ターゲティングリガンドが、ＣＤ４抗体及び／又はＣＤ８抗体のｓｃＦｖ断片から選択される結合ドメインを含む、実施形態１〜２８のいずれかの方法。
３０．キャリアーが、ＰＢＡＥ（例えば、ＰＢＡＥ４４７及び／又は１−（３−アミノプロピル）ピロリジン末端キャップを有する）を含む、実施形態１〜２９のいずれかの方法。
３１．コーティングがＰＧＡを含む、実施形態１〜３０のいずれかの方法。
３２．選択された細胞ターゲティングリガンドが、ＣＤ４抗体及び／又はＣＤ８抗体から選択される結合ドメインを含み；キャリアーがＰＢＡＥ（例えば、ＰＢＡＥ４４７及び／又は１−（３−アミノプロピル）ピロリジン末端キャップを有する）を含み；コーティングがＰＧＡを含む、実施形態１〜３１のいずれかの方法。
３３．（ｉ）タンパク質又は核酸をコードし正電荷キャリアー内にカプセル化されているポリヌクレオチド（例えば、ＩＶＴ ｍＲＮＡなどの合成ｍＲＮＡ）；
（ｉｉ）キャリアーの外表面上の中性又は負電荷コーティング；及び
（ｉｉｉ）コーティングの表面から伸びている選択された細胞ターゲティングリガンド
を含む合成ナノ粒子であって、
タンパク質が、ＨＢＶ特異的ＴＣＲ、白血病特異的抗ＣＤ１９ ＣＡＲ又は前立腺腫瘍特異的抗ＲＯＲ１ ＣＡＲから選択することができ、ＣＡＲの細胞内ドメインが１９２８ｚ又は４−１ＢＢｚが可能である、合成ナノ粒子。
３４．キャリアーが正電荷脂質又はポリマーを含む、実施形態３３の合成ナノ粒子。
３５．正電荷脂質又はポリマーが、ＰＢＡＥ、ポリ（Ｌ−リジン）、ＰＥＩ、ＰＡＭＡＭ、ポリ（アミン−コ−エステル）、ＰＤＭＡＥＭＡ、キトサン、ポリ（Ｌ−ラクチド−コ−Ｌ−リジン）、ＰＡＧＡ、又はＰＨＰを含む、実施形態３４の合成ナノ粒子。
３６．コーティングが中性又は負電荷脂質又はポリマーを含む、実施形態３３又は３４の合成ナノ粒子。
３７．中性又は負電荷コーティングが、ＰＧＡ、ポリ（アクリル酸）、アルギン酸又はコレステリルヘミスクシナート／１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミンを含む、実施形態３６の合成ナノ粒子。
３８．中性又は負電荷コーティングが双性イオンポリマーを含む、実施形態３６の合成ナノ粒子。
３９．中性又は負電荷コーティングがリポソームを含む、実施形態３６〜３８のいずれかの合成ナノ粒子。
４０．リポソームが、ＤＯＴＡＰ、ＤＯＴＭＡ、ＤＣ−Ｃｈｏｌ、ＤＯＧＳ、コレステロール、ＤＯＰＥ又はＤＯＰＣを含む、実施形態３９の合成ナノ粒子。
４１．選択された細胞ターゲティングリガンドが、ＣＤ４及び／又はＣＤ８に選択的に結合する、実施形態３３〜４０のいずれかの合成ナノ粒子。
４２．選択された細胞ターゲティングリガンドが、ＣＤ４抗体及び／又はＣＤ８抗体から選択される結合ドメインを含む、実施形態３３〜４１のいずれかの合成ナノ粒子。
４３．選択された細胞ターゲティングリガンドが、ＣＤ４抗体及び／又はＣＤ８抗体のｓｃＦｖ断片から選択される結合ドメインを含む、実施形態３３〜４２のいずれかの合成ナノ粒子。
４４．キャリアーが、ＰＢＡＥ（例えば、ＰＢＡＥ４４７及び／又は１−（３−アミノプロピル）ピロリジン末端キャップを有する）を含む、実施形態３３〜４３のいずれかの合成ナノ粒子。
４５．コーティングがＰＧＡを含む、実施形態３３〜４４のいずれかの合成ナノ粒子。
４６．選択された細胞ターゲティングリガンドが、ＣＤ４抗体及び／又はＣＤ８抗体から選択される結合ドメインを含み；キャリアーがＰＢＡＥ（例えば、ＰＢＡＥ４４７及び／又は１−（３−アミノプロピル）ピロリジン末端キャップを有する）を含み；コーティングがＰＧＡを含む、実施形態３３〜４５のいずれかの合成ナノ粒子。
４７．実施形態３３〜４６のいずれかの合成ナノ粒子を含む組成物。
４８．処置を必要とする対象を処置する方法であって、実施形態４７の治療有効量の組成物を投与し、それによって処置を必要とする対象を処置することを含む、方法。
４９．ナノ粒子又は組成物を投与する前にＴ細胞誘引物質を対象に投与することをさらに含む、実施形態４８の方法。
５０．処置を必要とする対象を処置する方法であって、対象への投与後に、選択された細胞型によってタンパク質又は核酸の発現をもたらすナノ粒子を選択すること、及び
治療有効量の選択されたナノ粒子を対象に投与すること、それによって処置を必要とする対象を処置すること
を含み、タンパク質又は核酸の発現は、投与の１０日以内に検出可能限界より下に低下する、方法。
５１．タンパク質又は核酸の発現が投与の７日以内に検出可能限界より下に低下する、実施形態５０の方法。
５２．第２の治療有効量の選択されたナノ粒子を対象に投与することをさらに含む、実施形態５０又は５１の方法。
５３．タンパク質又は核酸の発現が検出可能限界より下に低下した後に、第２の治療有効量の投与が行われる、実施形態５２の方法。
５４．タンパク質又は核酸の発現が検出可能限界より下に低下する前に、第２の治療有効量の投与が行われる、実施形態５２の方法。
５５．第１の治療有効量と第２の治療有効量が、５日離して、６日離して、７日離して、８日離して、９日離して又は１０日離して投与される、実施形態５２の方法。
５６．投与が全身的投与又は局所的投与を含む、実施形態５０〜５５のいずれかの方法。
５７．投与が腫瘍部位での局所的投与を含む、実施形態５６の方法。
５８．投与が、（ａ）腫瘍中への若しくはその近位への、（ｂ）静脈中への、又は（ｃ）腹膜中へのカテーテルを介した注射又は注入を含む、実施形態５０〜５７のいずれかの方法。
５９．タンパク質が、細胞表面受容体を含む疾患特異的受容体を含む、実施形態５０〜５８のいずれかの方法。
６０．疾患特異的受容体が、ＣＡＲ、ＴＣＲ又はこれらのハイブリッドを含む、実施形態５９の方法。
６１．治療タンパク質が、ＨＢＶ特異的ＴＣＲ、白血病特異的抗ＣＤ１９ ＣＡＲ、又は前立腺腫瘍特異的抗ＲＯＲ１ ＣＡＲを含み、ＣＡＲの細胞内ドメインが１９２８ｚ又は４−１ＢＢｚが可能である、実施形態５０〜６０のいずれかの方法。
６２．タンパク質が、マクロファージ刺激タンパク質を含む、実施形態５０〜６１のいずれかの方法。
６３．マクロファージ刺激タンパク質が、転写因子ＩＲＦ５をキナーゼＩＫＫβと組み合わせて含む、実施形態６２の方法。
６４．マクロファージ刺激タンパク質が、ＩＲＦ５、ＩＲＦ１、ＩＲＦ３、ＩＲＦ７、ＩＲＦ８及び／又はＩＲＦ７とＩＲＦ３の融合物から選択される１種以上のＩＲＦを含む、実施形態６２の方法。
６５．ＩＲＦ７／ＩＲＦ３融合タンパク質が配列番号３９を含む、実施形態６４の方法。
６６．１つ以上のＩＲＦが機能的自己抑制ドメインを欠く、実施形態６３〜６５のいずれかの方法。
６７．１つ以上のＩＲＦが機能的核外移行シグナル（ＮＥＳ）を欠く、実施形態６３〜６６のいずれかの方法。
６８．１つ以上のＩＲＦが、配列番号２５〜４１に対し＞９０％、＞９５％又は９８％よりも大きな同一性を有する配列から選択される、実施形態６４の方法。
６９．１つ以上のＩＲＦが、配列番号２５〜３１から選択されるＩＲＦ５である、実施形態６４の方法。
７０．ＩＲＦ５が、Ｓ１５６Ｄ、Ｓ１５８Ｄ及びＴ１６０Ｄから選択される１つ以上の突然変異を有する配列番号２５又は配列番号２７を含む、実施形態６９の方法。
７１．ＩＲＦ５が、Ｔ１０Ｄ、Ｓ１５８Ｄ、Ｓ３０９Ｄ、Ｓ３１７Ｄ、Ｓ４５１Ｄ及びＳ４６２Ｄから選択される１つ以上の突然変異を有する配列番号２６を含む、実施形態６９の方法。
７２．ＩＲＦ５が、Ｓ４２５Ｄ、Ｓ４２７Ｄ、Ｓ４３０Ｄ及びＳ４３６Ｄから選択される１つ以上の突然変異を有する配列番号２８を含む、実施形態６９の方法。
７３．１つ以上のＩＲＦが、配列番号３２及び３６から選択されるＩＲＦ１である、実施形態６４の方法。
７４．１つ以上のＩＲＦが、配列番号３５、４０及び４１から選択されるＩＲＦ８である、実施形態６４の方法。
７５．ＩＲＦ８がＫ３１０Ｒ突然変異を有する配列番号３５を含む、実施形態７４の方法。
７６．コードされたＩＫＫβが、配列番号４２〜４６に対し＞９０％、＞９５％又は９８％よりも大きな同一性を有する配列から選択される、実施形態６３〜７５のいずれかの方法。
７７．コードされたＩＫＫβが、配列番号４２〜４６から選択される、実施形態６３〜７５のいずれかの方法。
７８．治療タンパク質が、グルココルチコイド誘導性ロイシンジッパー（ＧＩＬＺ）を含む、実施形態５０〜７７のいずれかの方法。
７９．選択され投与されるナノ粒子が＜１３０ｎｍである、実施形態５０〜７８のいずれかの方法。
８０．選択され投与されるナノ粒子が、
（ｉ）治療タンパク質をコードする、正電荷キャリアーマトリックス内にカプセル化された合成ｍＲＮＡ；
（ｉｉ）中性又は負電荷コーティング；及び
（ｉｉｉ）選択された細胞型上のマーカーに特異的に結合する、コーティングの表面から伸びる少なくとも１つの選択された細胞ターゲティングリガンド
を含む、実施形態５０〜７９のいずれかの方法。
８１．合成ｍＲＮＡがＩＶＴ ｍＲＮＡを含む、実施形態８０の方法。
８２．正電荷キャリアーマトリックスが正電荷脂質又はポリマーを含む、実施形態８０又は８１の方法。
８３．正電荷脂質又はポリマーが、ＰＢＡＥ、ポリ（Ｌ−リジン）、ＰＥＩ、ＰＡＭＡＭ、ポリ（アミン−コ−エステル）、ＰＤＭＡＥＭＡ、キトサン、ポリ（Ｌ−ラクチド−コ−Ｌ−リジン）、ＰＡＧＡ、又はＰＨＰを含む、実施形態８２の方法。
８４．正電荷ポリマーが、ＰＢＡＥ（例えば、ＰＢＡＥ４４７及び／又は１−（３−アミノプロピル）ピロリジン末端キャップを有する）を含む、実施形態８０〜８３のいずれかの方法。
８５．中性又は負電荷コーティングが、ＰＧＡ、ポリ（アクリル酸）、アルギン酸又はコレステリルヘミスクシナート／１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミンを含む、実施形態８０〜８４のいずれかの方法。
８６．中性又は負電荷コーティングがＰＧＡを含む、実施形態８０〜８５のいずれかの方法。
８７．中性又は負電荷コーティングが双性イオンポリマーを含む、実施形態８０〜８５のいずれかの方法。
８８．中性又は負電荷コーティングがリポソームを含む、実施形態８０〜８５のいずれかの方法。
８９．リポソームが、ＤＯＴＡＰ、ＤＯＴＭＡ、ＤＣ−Ｃｈｏｌ、ＤＯＧＳ、コレステロール、ＤＯＰＥ又はＤＯＰＣを含む、実施形態８８の方法。
９０．選択された細胞ターゲティングリガンドが、リンパ球に選択的に結合し受容体誘導エンドサイトーシスを開始させる、実施形態８０〜８９のいずれかの方法。
９１．選択された細胞ターゲティングリガンドが、ＣＤ４及び／又はＣＤ８に選択的に結合する、実施形態８０〜９０のいずれかの方法。
９２．選択された細胞ターゲティングリガンドが、ＣＤ４抗体及び／又はＣＤ８抗体から選択される結合ドメインを含む、実施形態８０〜９１のいずれかの方法。
９３．選択された細胞ターゲティングリガンドが、ＣＤ４抗体及び／又はＣＤ８抗体のｓｃＦｖ断片から選択される結合ドメインを含む、実施形態８０〜９２のいずれかの方法。
９４．選択された細胞ターゲティングリガンドが、ＣＤ４抗体及び／又はＣＤ８抗体から選択される結合ドメインを含み；キャリアーがＰＢＡＥ（例えば、ＰＢＡＥ４４７及び／又は１−（３−アミノプロピル）ピロリジン末端キャップを有する）を含み；コーティングがＰＧＡを含む、実施形態８０〜９３のいずれかの方法。
９５．選択された細胞ターゲティングリガンドが、ＣＤ２０６、ＣＤ１６３又はＣＤ２３に結合する、実施形態８０〜８９のいずれかの方法。
９６．選択された細胞ターゲティングリガンドがジマンノースを含む、実施形態８０〜８９のいずれかの方法。
９７．選択された細胞ターゲティングリガンドが、ＣＤ３８、Ｇタンパク質共役型受容体１８（Ｇｐｒ１８）、ホルミルペプチド受容体２（Ｆｐｒ２）、ＣＤ６４又はＣＤ６８に結合する、実施形態８０〜８９のいずれかの方法。
９８．治療有効量の細胞誘引物質を対象に投与することをさらに含む、実施形態５０〜９７のいずれかの方法。
９９．細胞誘引物質がＴ細胞誘引物質を含む、実施形態９８の方法。
１００．Ｔ細胞誘引物質がＣＣＬ２１又はＩＰ１０を含む、実施形態９９の方法。
１０１．Ｔ細胞誘引物質が、ＣＣＬ１、ＣＣＬ２、ＣＣＬ１７、ＣＣＬ２２、ＣＸＣＬ９、ＣＸＣＬ１０又はＣＸＣＬ１１を含む、実施形態９９又は１００の方法。
１０２．細胞誘引物質が単球／マクロファージ誘引物質を含む、実施形態９８〜１０１のいずれかの方法。
１０３．単球／マクロファージ誘引物質が、ＣＣＬ２、ＣＣＬ３、ＣＣＬ５、ＣＣＬ７、ＣＣＬ８、ＣＣＬ１３、ＣＣＬ１７又はＣＣＬ２２を含む、実施形態１０２の方法。
１０４．細胞誘引物質がマスト細胞誘引物質を含む、実施形態９８〜１０３のいずれかの方法。
１０５．マスト細胞誘引物質がＣＣＬ２又はＣＣＬ５を含む、実施形態１０４の方法。
１０６．細胞誘引物質が好酸球誘引物質を含む、実施形態９８〜１０５のいずれかの方法。
１０７．好酸球誘引物質が、ＣＣＬ３、ＣＣＬ５、ＣＣＬ７、ＣＣＬ１１、ＣＣＬ１３、ＣＣＬ２４又はＣＣＬ２６を含む、実施形態１０６の方法。
１０８．細胞誘引物質が好中球誘引物質を含む、実施形態９８〜１０７のいずれかの方法。
１０９．好中球誘引物質がＩＬ−８又はＮＡＰ１を含む、実施形態１０８の方法。
１１０．細胞誘引物質が、第１の治療有効量のナノ粒子が投与される前に対象に投与される、実施形態９８〜１０９のいずれかの方法。
１１１．細胞誘引物質が、第１の治療有効量のナノ粒子が投与される前の１時間以内に、３時間以内に、６時間以内に、１２時間以内に、又は２４時間以内に投与される、実施形態９８〜１０９のいずれかの方法。
１１２．細胞誘引物質が、第１の治療有効量のナノ粒子が投与される少なくとも１時間前に、少なくとも３時間前に、少なくとも６時間前に、少なくとも１２時間前に、又は少なくとも２４時間前に投与される、実施形態９８〜１０９のいずれかの方法。
１１３．細胞誘引物質が、（ａ）第１の治療有効量のナノ粒子の最初の用量が投与された後にのみ投与される、実施形態９８〜１１２のいずれかの方法。
１１４．対象が、がん又は感染性疾患に対する処置を必要とする、実施形態５０〜１１３のいずれかの方法。
１１５．がんが、白血病、前立腺がん又はＢ型肝炎誘導肝細胞癌、卵巣がん、神経膠芽腫又は肺がんである、実施形態１１４の方法。
１１６．研究者又は臨床医が、選択されたナノ粒子の一過性発現特性が原因で、対象への投与のための先行する実施形態のいずれかに記載されているナノ粒子を選択する、実施形態１〜１１６のいずれかの方法。
１１７．研究者又は臨床医が、対象に選択されたナノ粒子を投与する、実施形態１１６の方法。
１１８．一過性発現特性が、１４日間を超えない、１２日間を超えない、１０日間を超えない、９日間を超えない、８日間を超えない、７日間を超えない、６日間を超えない、又は５日間を超えない間タンパク質又は核酸の発現をもたらす、実施形態１１６又は１１７の方法。
腹膜マクロファージは蛍光活性化細胞選別により単離して、それらのサイトカイン分泌を分析し、炎症促進性（抗腫瘍）サイトカインＩＬ−１２（３．４倍高い）、ＩＦＮ−ｇ（８．４倍高い）、及びＴＮＦ−α（１．５倍高い）の放出の頑強な増加を検出し、一方、選択的に活性化される（Ｍ２様）マクロファージへの分化に関連する制御サイトカインであるＩＬ−６のレベルは９７倍減少した（図１０Ｉ）。ゲノム発現プロファイリングにより、ＩＲＦ５／ＩＫＫβナノ粒子処置マウスにおいてＭ１様マクロファージ表現型の方に向かう分化が確認された。ＭＰＬＡ又はＩＬ−４においてエクスビボで培養されたマクロファージの遺伝子発現レベルは、それぞれ古典的Ｍ１様又はＭ２様マクロファージについての参照値を提供するために含まれた（図１０Ｊ）。

Claims (147)

  1. がんの処置を必要とする対象においてがんを処置する方法であって、
    対象への投与後に、Ｔ細胞によって選択的に、抗ＲＯＲ１キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）、抗ＣＤ１９ ＣＡＲ又はＢ型肝炎抗原特異的Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）の一過性発現をもたらすナノ粒子を選択すること；
    治療有効量の選択されたナノ粒子を対象に投与すること；
    抗ＲＯＲ１ ＣＡＲ、抗ＣＤ１９ ＣＡＲ又はＢ型肝炎抗原特異的ＴＣＲの発現について対象をモニターすること；及び
    抗ＲＯＲ１ ＣＡＲ、抗ＣＤ１９ ＣＡＲ又はＢ型肝炎抗原特異的ＴＣＲの発現レベルが閾値より下に低下したら、第２の治療有効量の選択されたナノ粒子を対象に投与すること
    を含み、
    選択されたナノ粒子が、
    （ｉ）ポリ（β−アミノエステル）（ＰＢＡＥ）コア内にカプセル化された抗ＲＯＲ１ ＣＡＲ、抗ＣＤ１９ ＣＡＲ又はＢ型肝炎抗原特異的ＴＣＲをコードするインビトロ転写（ＩＶＴ）ｍＲＮＡ；
    （ｉｉ）ＰＢＡＥコアの外表面上のポリグルタミン酸（ＰＧＡ）コーティング；並びに
    （ｉｉｉ）ＰＧＡに共有結合され、コーティングの表面から伸びるＣＤ４及び／又はＣＤ８結合ドメイン
    を含み、
    それによってがんの処置を必要とする対象においてがんが処置される、方法。
  2. 一過性発現が、２週間を超えずに持続する、請求項１に記載の方法。
  3. 対象内のがん部位でＴ細胞誘引物質及び／又は単球／マクロファージ誘引物質を用いて対象を局所的に事前調整することをさらに含む、請求項１に記載の方法。
  4. Ｔ細胞誘引物質が、ＣＣＬ２１又はＩＰ１０を含む、請求項３に記載の方法。
  5. 単球／マクロファージ誘引物質が、ＣＣＬ２、ＣＣＬ３、ＣＣＬ５、ＣＣＬ７、ＣＣＬ８、ＣＣＬ１３、ＣＣＬ１７又はＣＣＬ２２を含む、請求項３に記載の方法。
  6. 対象への投与後に、マクロファージによって選択的にマクロファージ活性化因子の発現をもたらす第２のナノ粒子を選択すること；
    治療有効量の第２の選択されたナノ粒子を対象に投与すること；
    マクロファージ活性化因子の発現について対象をモニターすること；及び
    マクロファージ活性化因子の発現レベルが閾値より下に低下したら、第２の治療有効量の第２の選択されたナノ粒子を対象に投与すること
    をさらに含み、
    選択された第２のナノ粒子が、
    （ｉ）ＰＢＡＥコア内にカプセル化されたマクロファージ活性化因子をコードするＩＶＴ ｍＲＮＡ；
    （ｉｉ）ＰＢＡＥコアの外表面上のＰＧＡコーティング；及び
    （ｉｉｉ）コーティングの表面から伸びるジマンノース
    を含む、請求項１に記載の方法。
  7. マクロファージ活性化因子が、キナーゼＩＫＫβと組み合わせた転写因子インターフェロン制御因子（ＩＲＦ）５を含む、請求項６に記載の方法。
  8. 処置を必要とする対象を処置するための方法であって、
    対象への投与後に、選択された細胞型によって治療タンパク質の発現をもたらすナノ粒子を選択すること、
    第１の治療有効量の選択されたナノ粒子を対象に投与すること
    を含み、それによって処置を必要とする対象が処置され、治療タンパク質の発現は、投与の１０日以内に検出可能限界より下に低下する、方法。
  9. 治療タンパク質の発現が、投与の７日以内に検出可能限界より下に低下する、請求項８に記載の方法。
  10. 第２の治療有効量の選択されたナノ粒子を対象に投与することをさらに含む、請求項８に記載の方法。
  11. 治療タンパク質の発現が検出可能限界より下に低下した後に、第２の治療有効量の投与が行われる、請求項１０に記載の方法。
  12. 治療タンパク質の発現が検出可能限界より下に低下する前に、第２の治療有効量の投与が行われる、請求項１０に記載の方法。
  13. 第１の治療有効量と第２の治療有効量が、５日離して、６日離して、７日離して、８日離して、９日離して又は１０日離して投与される、請求項１０に記載の方法。
  14. 投与が、全身的又は局所的投与を含む、請求項８に記載の方法。
  15. 投与が、腫瘍部位での局所的投与を含む、請求項１４に記載の方法。
  16. 投与が、（ａ）腫瘍中への若しくはその近位への（腫瘍内への）、（ｂ）静脈中への（静脈内への）、又は（ｃ）腹膜中への（腹腔内への）カテーテルを介した注射又は注入を含む、請求項８に記載の方法。
  17. 治療タンパク質が、細胞表面受容体を含む疾患特異的受容体を含む、請求項８に記載の方法。
  18. 疾患特異的受容体が、ＣＡＲ、ＴＣＲ又はこれらのハイブリッドを含む、請求項１７に記載の方法。
  19. 治療タンパク質が、１９２８ｚ若しくは４−１ＢＢｚ細胞内ドメインを有する白血病特異的抗ＣＤ１９ ＣＡＲ、１９２８ｚ若しくは４−１ＢＢｚ細胞内ドメインを有する前立腺腫瘍特異的抗ＲＯＲ１ ＣＡＲ、又はＢ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）コア抗原特異的ＨＢｃｏｒｅ１８−２７ ＴＣＲを含む、請求項８に記載の方法。
  20. 治療タンパク質が、マクロファージ刺激タンパク質を含む、請求項８に記載の方法。
  21. マクロファージ刺激タンパク質が、転写因子ＩＲＦ５をキナーゼＩＫＫβと組み合わせて含む、請求項２０に記載の方法。
  22. マクロファージ刺激タンパク質が、ＩＲＦ５、ＩＲＦ１、ＩＲＦ３、ＩＲＦ７、ＩＲＦ８及び／又はＩＲＦ７とＩＲＦ３の融合物から選択される１種以上のＩＲＦを含む、請求項２０に記載の方法。
  23. ＩＲＦ７／ＩＲＦ３融合タンパク質が、配列番号３９を含む、請求項２２に記載の方法。
  24. １つ以上のＩＲＦが、機能的自己抑制ドメインを欠く、請求項２２に記載の方法。
  25. １つ以上のＩＲＦが、機能的核外移行シグナル（ＮＥＳ）を欠く、請求項２２に記載の方法。
  26. １つ以上のＩＲＦが、配列番号２５〜４１に対し＞９０％、＞９５％又は＞９８％の同一性を有する配列から選択される、請求項２２に記載の方法。
  27. １つ以上のＩＲＦが、配列番号２５〜３１から選択されるＩＲＦ５である、請求項２２に記載の方法。
  28. ＩＲＦ５が、Ｓ１５６Ｄ、Ｓ１５８Ｄ及びＴ１６０Ｄから選択される１つ以上の突然変異を有する配列番号２５又は配列番号２７を含む、請求項２７に記載の方法。
  29. ＩＲＦ５が、Ｔ１０Ｄ、Ｓ１５８Ｄ、Ｓ３０９Ｄ、Ｓ３１７Ｄ、Ｓ４５１Ｄ及びＳ４６２Ｄから選択される１つ以上の突然変異を有する配列番号２６を含む、請求項２７に記載の方法。
  30. ＩＲＦ５が、Ｓ４２５Ｄ、Ｓ４２７Ｄ、Ｓ４３０Ｄ及びＳ４３６Ｄから選択される１つ以上の突然変異を有する配列番号２８を含む、請求項２７に記載の方法。
  31. １つ以上のＩＲＦが、配列番号３２及び３６から選択されるＩＲＦ１である、請求項２２に記載の方法。
  32. １つ以上のＩＲＦが、配列番号３５、４０及び４１から選択されるＩＲＦ８である、請求項２２に記載の方法。
  33. ＩＲＦ８が、Ｋ３１０Ｒ突然変異を有する配列番号３５を含む、請求項３２に記載の方法。
  34. コードされたＩＫＫβが、配列番号４２〜４６に対し＞９０％、＞９５％又は＞９８％の同一性を有する配列から選択される、請求項２１に記載の方法。
  35. コードされたＩＫＫβが、配列番号４２〜４６から選択される、請求項２１に記載の方法。
  36. 治療タンパク質が、グルココルチコイド誘導性ロイシンジッパー（ＧＩＬＺ）を含む、請求項８に記載の方法。
  37. 選択され投与されるナノ粒子が、＜１３０ｎｍである、請求項８に記載の方法。
  38. 選択され投与されるナノ粒子が、
    （ｉ）治療タンパク質をコードする、正電荷キャリアーマトリックス内にカプセル化された合成ｍＲＮＡ；
    （ｉｉ）キャリアーマトリックスの外表面上の中性又は負電荷コーティング；及び
    （ｉｉｉ）選択された細胞型上のマーカーに特異的に結合する、コーティングの表面から伸びる少なくとも１つの選択された細胞ターゲティングリガンド
    を含む、請求項８に記載の方法。
  39. 合成ｍＲＮＡが、ＩＶＴ ｍＲＮＡを含む、請求項３８に記載の方法。
  40. 正電荷キャリアーマトリックスが、正電荷脂質又はポリマーを含む、請求項３８に記載の方法。
  41. 正電荷脂質又はポリマーが、ＰＢＡＥ、ポリ（Ｌ−リジン）、ポリ（エチレンイミン）（ＰＥＩ）、ポリ（アミドアミン）デンドリマー（ＰＡＭＡＭ）、ポリ（アミン−コ−エステル）、ポリ（ジメチルアミノエチルメタクリレート）（ＰＤＭＡＥＭＡ）、キトサン、ポリ（Ｌ−ラクチド−コ−Ｌ−リジン）、ポリ［α−（４−アミノブチル）−Ｌ−グリコール酸］（ＰＡＧＡ）、又はポリ（４−ヒドロキシ−Ｌ−プロリンエステル）（ＰＨＰ）を含む、請求項４０に記載の方法。
  42. 正電荷ポリマーが、ＰＢＡＥを含む、請求項４０に記載の方法。
  43. 中性又は負電荷コーティングが、ＰＧＡ、ポリ（アクリル酸）、アルギン酸又はコレステリルヘミスクシナート／１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミンを含む、請求項３８に記載の方法。
  44. 中性又は負電荷コーティングが、ＰＧＡを含む、請求項３８に記載の方法。
  45. 中性又は負電荷コーティングが、双性イオンポリマーを含む、請求項３８に記載の方法。
  46. 中性又は負電荷コーティングが、リポソームを含む、請求項３８に記載の方法。
  47. リポソームが、１，２−ジオレオイル−３−トリメチルアンモニウムプロパン（ＤＯＴＡＰ）；１，２−ジ−Ｏ−オクタデセニル−３−トリメチルアンモニウムプロパン（ＤＯＴＭＡ）；３β−［Ｎ−（Ｎ’，Ｎ’−ジメチルアミノエタン）−カルバモイル］コレステロール（ＤＣ−Ｃｈｏｌ）、ジオクタデシルアミドグリシルスペルミン（ＤＯＧＳ）、コレステロール、１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン（ＤＯＰＥ）又は１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＤＯＰＣ）を含む、請求項４６に記載の方法。
  48. 少なくとも１つの選択された細胞ターゲティングリガンドが、リンパ球に選択的に結合し受容体誘導エンドサイトーシスを開始させる、請求項３８に記載の方法。
  49. 少なくとも１つの選択された細胞ターゲティングリガンドが、ＣＤ４及び／又はＣＤ８に選択的に結合する、請求項３８に記載の方法。
  50. 少なくとも１つの選択された細胞ターゲティングリガンドが、ＣＤ４抗体及び／又はＣＤ８抗体から選択される結合ドメインを含む、請求項３８に記載の方法。
  51. 少なくとも１つの選択された細胞ターゲティングリガンドが、ＣＤ４抗体及び／又はＣＤ８抗体のｓｃＦｖ断片から選択される結合ドメインを含む、請求項３８に記載の方法。
  52. 少なくとも１つの選択された細胞ターゲティングリガンドが、ＣＤ４抗体及び／又はＣＤ８抗体から選択される結合ドメインを含み；キャリアーが、ＰＢＡＥを含み；コーティングが、ＰＧＡを含む、請求項３８に記載の方法。
  53. 少なくとも１つの選択された細胞ターゲティングが、ＣＤ２０６、ＣＤ１６３又はＣＤ２３に結合する、請求項３８に記載の方法。
  54. 少なくとも１つの選択された細胞ターゲティングリガンドが、ジマンノースを含む、請求項３８に記載の方法。
  55. 少なくとも１つの選択された細胞ターゲティングが、ＣＤ３８、Ｇタンパク質共役型受容体１８（Ｇｐｒ１８）、ホルミルペプチド受容体２（Ｆｐｒ２）、ＣＤ６４又はＣＤ６８に結合する、請求項３８に記載の方法。
  56. 治療有効量の細胞誘引物質を対象に投与することをさらに含む、請求項８に記載の方法。
  57. 細胞誘引物質が、Ｔ細胞誘引物質を含む、請求項５６に記載の方法。
  58. Ｔ細胞誘引物質が、ＣＣＬ２１又はＩＰ１０を含む、請求項５７に記載の方法。
  59. Ｔ細胞誘引物質が、ＣＣＬ１、ＣＣＬ２、ＣＣＬ１７、ＣＣＬ２２、ＣＸＣＬ９、ＣＸＣＬ１０又はＣＸＣＬ１１を含む、請求項５７に記載の方法。
  60. 細胞誘引物質が、単球／マクロファージ誘引物質を含む、請求項５６に記載の方法。
  61. 単球／マクロファージ誘引物質が、ＣＣＬ２、ＣＣＬ３、ＣＣＬ５、ＣＣＬ７、ＣＣＬ８、ＣＣＬ１３、ＣＣＬ１７又はＣＣＬ２２を含む、請求項６０に記載の方法。
  62. 細胞誘引物質が、マスト細胞誘引物質を含む、請求項５６に記載の方法。
  63. マスト細胞誘引物質が、ＣＣＬ２又はＣＣＬ５を含む、請求項６２に記載の方法。
  64. 細胞誘引物質が、好酸球誘引物質を含む、請求項５６に記載の方法。
  65. 好酸球誘引物質が、ＣＣＬ３、ＣＣＬ５、ＣＣＬ７、ＣＣＬ１１、ＣＣＬ１３、ＣＣＬ２４又はＣＣＬ２６を含む、請求項６４に記載の方法。
  66. 細胞誘引物質が、好中球誘引物質を含む、請求項５６に記載の方法。
  67. 好中球誘引物質が、ＩＬ−８又はＮＡＰ１を含む、請求項６６に記載の方法。
  68. 細胞誘引物質が、第１の治療有効量のナノ粒子が投与される前に対象に投与される、請求項５６に記載の方法。
  69. 細胞誘引物質が、第１の治療有効量の選択されたナノ粒子が投与される前の１時間以内に、３時間以内に、６時間以内に、１２時間以内に、又は２４時間以内に投与される、請求項５６に記載の方法。
  70. 細胞誘引物質が、第１の治療有効量の選択されたナノ粒子が投与される少なくとも１時間前に、少なくとも３時間前に、少なくとも６時間前に、少なくとも１２時間前に、又は少なくとも２４時間前に投与される、請求項５６に記載の方法。
  71. 細胞誘引物質が、（ａ）第１の治療有効量の選択されたナノ粒子の最初の用量が投与された後にのみ投与される、請求項５６に記載の方法。
  72. 対象が、がん又は感染性疾患に対する処置を必要とする、請求項８に記載の方法。
  73. がんが、白血病、前立腺がん、Ｂ型肝炎誘導肝細胞癌、卵巣がん、神経膠芽腫又は肺がんである、請求項７２に記載の方法。
  74. 処置を必要とする対象を処置する方法であって、
    （ｉ）治療タンパク質、ポリヌクレオチド又はこれらの組合せをコードする、正電荷キャリアーマトリックス内にカプセル化された合成ｍＲＮＡ；
    （ｉｉ）中性又は負電荷コーティング；並びに
    （ｉｉｉ）選択された細胞に特異的な、コーティングの表面から伸びる少なくとも１つの細胞ターゲティングリガンド；
    を含む治療有効量のナノ粒子
    を対象に投与すること
    を含み、ナノ粒子は、選択された細胞が合成ｍＲＮＡから治療タンパク質、ポリヌクレオチド又はこれらの組合せを発現するように、対象内の選択された細胞中に選択的に取り込まれ、それによって処置を必要とする対象が処置される、方法。
  75. 有効量の細胞誘引物質を対象に投与することをさらに含む、請求項７４に記載の方法。
  76. 細胞誘引物質が、Ｔ細胞誘引物質である、請求項７５に記載の方法。
  77. Ｔ細胞誘引物質が、ＣＣＬ２１又はＩＰ１０である、請求項７６に記載の方法。
  78. 合成ｍＲＮＡが、治療タンパク質をコードし、治療タンパク質が、細胞表面受容体を含む少なくとも１つの疾患特異的受容体を含む、請求項７４に記載の方法。
  79. 少なくとも１つの疾患特異的受容体が、ＣＡＲ又はＴＣＲを含む、請求項７８に記載の方法。
  80. 治療タンパク質が、１９２８ｚ若しくは４−１ＢＢｚ細胞内ドメインを有する白血病特異的抗ＣＤ１９ ＣＡＲ、１９２８ｚ若しくは４−１ＢＢｚ細胞内ドメインを有する前立腺腫瘍特異的抗ＲＯＲ１ ＣＡＲ、又はＨＢＶコア抗原特異的ＨＢｃｏｒｅ１８−２７ ＴＣＲを含む、請求項７８に記載の方法。
  81. 少なくとも１つの細胞ターゲティングリガンドが、リンパ球に選択的に結合し受容体誘導エンドサイトーシスを開始させる、請求項７４に記載の方法。
  82. 治療タンパク質の発現が、１４日を超えない、１２日を超えない、１０日を超えない、９日を超えない、８日を超えない、７日を超えない、６日を超えない、又は５日を超えない、請求項７４に記載の方法。
  83. 治療有効量のナノ粒子を対象に投与することが、２つ以上の用量のナノ粒子を投与することを含む、請求項７４に記載の方法。
  84. ２つ以上の用量が、５〜１０日ごとに、又は６〜８日ごとに、又は７日ごとに投与される、請求項８３に記載の方法。
  85. 対象が、がん又は感染性疾患に対する処置を必要とする、請求項７４に記載の方法。
  86. 治療有効量のナノ粒子を投与することが、（ａ）腫瘍中への若しくはその近位への（腫瘍内への）、（ｂ）静脈中への（静脈内への）、又は（ｃ）腹膜中への（腹腔内への）カテーテルを介した注射又は注入を含む、請求項７４に記載の方法。
  87. Ｔ細胞誘引物質を投与することが、腫瘍中への若しくはその近位への（腫瘍内への）カテーテルを介した注射若しくは注入、静脈内注射若しくは注入、又は腹腔内へのカテーテルを介した注射若しくは注入を含む、請求項７６に記載の方法。
  88. 細胞誘引物質が、治療有効量のナノ粒子が投与される前に対象に投与される、請求項７５に記載の方法。
  89. 細胞誘引物質が、治療有効量のナノ粒子が投与される前の１時間以内に、３時間以内に、６時間以内に、１２時間以内に、又は２４時間以内に投与される、請求項８８に記載の方法。
  90. 細胞誘引物質が、（ａ）治療有効量のナノ粒子の最初の用量の後にのみ；（ｂ）治療有効量のナノ粒子の少なくとも２回の用量のぞれぞれの後に；又は（ｃ）治療有効量のナノ粒子のそれぞれの用量の後で投与される、請求項７５に記載の方法。
  91. 対象にマクロファージ刺激組成物を投与することをさらに含む、請求項７４に記載の方法。
  92. マクロファージ刺激組成物が、マクロファージ細胞に標的化され、キナーゼＩＫＫβと組み合わせた転写因子インターフェロン制御因子５（ＩＲＦ５）の発現を指示することができるナノ粒子を含む、請求項９１に記載の方法。
  93. キャリアーマトリックスが、正電荷脂質又はポリマーを含む、請求項７４に記載の方法。
  94. 正電荷ポリマーが、ＰＢＡＥ、ポリ（Ｌ−リジン）、ＰＥＩ、ＰＡＭＡＭ、ポリ（アミノ−コ−エステル）、ＰＤＭＡＥＭＡ、キトサン、ポリ（Ｌ−ラクチド−コ−Ｌ−リジン）、ＰＡＧＡ、又はＰＨＰを含む、請求項９３に記載の方法。
  95. コーティングが、中性又は負電荷脂質又はポリマーを含む、請求項７４に記載の方法。
  96. 中性又は負電荷コーティングが、ＰＧＡ、ポリ（アクリル酸）、アルギン酸又はコレステリルヘミスクシナート／１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミンを含む、請求項７４に記載の方法。
  97. 中性又は負電荷コーティングが、双性イオンポリマーを含む、請求項７４に記載の方法。
  98. 中性又は負電荷コーティングが、リポソームを含む、請求項７４に記載の方法。
  99. リポソームが、ＤＯＴＡＰ、ＤＯＴＭＡ、ＤＣ−Ｃｈｏｌ、ＤＯＧＳ、コレステロール、ＤＯＰＥ又はＤＯＰＣを含む、請求項９８に記載の方法。
  100. 少なくとも１つの細胞ターゲティングリガンドが、ＣＤ４及び／又はＣＤ８に選択的に結合する、請求項７４に記載の方法。
  101. 少なくとも１つの細胞ターゲティングリガンドが、ＣＤ４抗体及び／又はＣＤ８抗体から選択される結合ドメインを含む、請求項７４に記載の方法。
  102. 少なくとも１つの細胞ターゲティングリガンドが、ＣＤ４抗体及び／又はＣＤ８抗体のｓｃＦｖ断片から選択される結合ドメインを含む、請求項７４に記載の方法。
  103. キャリアーマトリックスが、ＰＢＡＥを含む、請求項７４に記載の方法。
  104. コーティングが、ＰＧＡを含む、請求項７４に記載の方法。
  105. 少なくとも１つの細胞ターゲティングリガンドが、ＣＤ４抗体及び／又はＣＤ８抗体から選択される結合ドメインを含み；キャリアーマトリックスがＰＢＡＥを含み；コーティングがＰＧＡを含む、請求項７４に記載の方法。
  106. （ｉ）治療タンパク質をコードし正電荷キャリアー内にカプセル化されている合成ｍＲＮＡ；
    （ｉｉ）中性又は負電荷コーティング；及び
    （ｉｉｉ）コーティングの表面から伸びている選択された細胞ターゲティングリガンド
    を含み、
    治療タンパク質が、１９２８ｚ又は４−１ＢＢｚ細胞内ドメインを有する白血病特異的抗ＣＤ１９ ＣＡＲ、１９２８ｚ又は４−１ＢＢｚ細胞内ドメインを有する前立腺腫瘍特異的抗ＲＯＲ１ ＣＡＲ又はＨＢＶコア抗原特異的ＨＢｃｏｒｅ１８−２７ ＴＣＲである、合成ナノ粒子。
  107. キャリアーが、正電荷脂質又はポリマーを含む、請求項１０６に記載の合成ナノ粒子。
  108. 正電荷脂質又はポリマーが、ＰＢＡＥ、ポリ（Ｌ−リジン）、ＰＥＩ、ＰＡＭＡＭ、ポリ（アミン−コ−エステル）、ＰＤＭＡＥＭＡ、キトサン、ポリ（Ｌ−ラクチド−コ−Ｌ−リジン）、ＰＡＧＡ又はＰＨＰを含む、請求項１０７に記載の合成ナノ粒子。
  109. コーティングが、中性又は負電荷脂質又はポリマーを含む、請求項１０６に記載の合成ナノ粒子。
  110. 中性又は負電荷コーティングが、ＰＧＡ、ポリ（アクリル酸）、アルギン酸又はコレステリルヘミスクシナート／１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミンを含む、請求項１０６に記載の合成ナノ粒子。
  111. 中性又は負電荷コーティングが、双性イオンポリマーを含む、請求項１０６に記載の合成ナノ粒子。
  112. 中性又は負電荷コーティングが、リポソームを含む、請求項１０６に記載の合成ナノ粒子。
  113. リポソームが、ＤＯＴＡＰ、ＤＯＴＭＡ、ＤＣ−Ｃｈｏｌ、ＤＯＧＳ、コレステロール、ＤＯＰＥ又はＤＯＰＣを含む、請求項１１２に記載の合成ナノ粒子。
  114. 選択された細胞ターゲティングリガンドが、ＣＤ４及び／又はＣＤ８に選択的に結合する、請求項１０６に記載の合成ナノ粒子。
  115. 選択された細胞ターゲティングリガンドが、ＣＤ４抗体及び／又はＣＤ８抗体から選択される結合ドメインを含む、請求項１０６に記載の合成ナノ粒子。
  116. 選択された細胞ターゲティングリガンドが、ＣＤ４抗体及び／又はＣＤ８抗体のｓｃＦｖ断片から選択される結合ドメインを含む、請求項１０６に記載の合成ナノ粒子。
  117. キャリアーが、ＰＢＡＥを含む、請求項１０６に記載の合成ナノ粒子。
  118. コーティングが、ＰＧＡを含む、請求項１０６に記載の合成ナノ粒子。
  119. 選択された細胞ターゲティングリガンドが、ＣＤ４抗体及び／又はＣＤ８抗体から選択される結合ドメインを含み；キャリアーが、ＰＢＡＥを含み；コーティングが、ＰＧＡを含む、請求項１０６に記載の合成ナノ粒子。
  120. 請求項１０６に記載の合成ナノ粒子を含む組成物。
  121. 処置を必要とする対象を処置する方法であって、治療有効量の請求項１０６に記載のナノ粒子又は請求項１２０に記載の組成物を投与し、それによって処置を必要とする対象を処置することを含む、方法。
  122. 治療有効量のナノ粒子又は組成物を投与する前にＴ細胞誘引物質を対象に投与することをさらに含む、請求項１２１に記載の方法。
  123. 対象が、感染性疾患に対する処置を必要とする、請求項１２１に記載の方法。
  124. 感染性疾患が、アデノウイルス、アレナウイルス、ブニヤウイルス、コロナウイルス、フラビウイルス、ハンタウイルス、ヘパドナウイルス、ヘルペスウイルス、パピローマウイルス、パラミクソウイルス、パルボウイルス、ピコルナウイルス、ポックスウイルス、オルソミクソウイルス、レトロウイルス、レオウイルス、ラブドウイルス、ロタウイルス、海綿状ウイルス又はトガウイルス感染性疾患である、請求項１２３に記載の方法。
  125. 感染性疾患が、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、かぜウイルス、エプスタインバーウイルス、流感ウイルス、肝炎ウイルス、単純ヘルペス、ＨＩＶ、インフルエンザ、日本脳炎、麻疹、ポリオ、狂犬病、呼吸器合胞体ウイルス、風疹、天然痘、水痘帯状疱疹又は西ナイルウイルス感染性疾患である、請求項１２３に記載の方法。
  126. 対象が、がんに対する処置を必要とする、請求項１２１に記載の方法。
  127. がんが、白血病である、請求項１２６に記載の方法。
  128. がんが、リンパ腫である、請求項１２６に記載の方法。
  129. がんが、幹細胞がん又はメラノーマである、請求項１２６に記載の方法。
  130. がんが、実質臓器腫瘍である、請求項１２６に記載の方法。
  131. 実質臓器腫瘍が、前立腺がんである、請求項１３０に記載の方法。
  132. 実質臓器腫瘍が、乳がん、卵巣がん、中皮腫、腎細胞癌、膵臓がん、肺がん又はＨＢＶ誘導肝細胞癌である、請求項１３０に記載の方法。
  133. 投与後に、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、又は少なくとも９０％のインビボＴ細胞が、治療タンパク質を発現することを達成する、請求項１２１に記載の方法。
  134. 対象の少なくとも２０％において、少なくとも３０％において、少なくとも４０％において、少なくとも５０％において、少なくとも６０％において、又は少なくとも７０％においてがんの根絶をもたらす、請求項１２６に記載の方法。
  135. 対象が、再発対象であり、方法が、再発対象の生存の、平均で少なくとも１０日、少なくとも１５日、少なくとも２０日、少なくとも２５日、少なくとも３０日、少なくとも３５日、又は少なくとも３７日の改善をもたらす、請求項１２６に記載の方法。
  136. エクスビボでナノ粒子に接触させたＴ細胞の移植と少なくともおよそ同じ効能を生じる、請求項１２１に記載の方法。
  137. エクスビボで形質導入されたＣＡＲ＋Ｔ細胞の移植と少なくともおよそ同じ効能を生じる、請求項１２１に記載の方法。
  138. 請求項１０６に記載の合成ナノ粒子及び薬学的に許容される賦形剤を含む医薬組成物。
  139. 請求項１０６に記載の合成ナノ粒子を凍結乾燥された形態で含む医薬組成物。
  140. 対象を処置する方法であって、請求項１３９に記載の組成物を薬学的に許容されるキャリアー中に再構成して溶液を形成し、溶液を対象中に注射することを含む方法。
  141. 請求項１０６に記載の合成ナノ粒子及び疾患又は障害を処置するのに使用するための使用説明書を含むキット。
  142. 合成ナノ粒子が、凍結乾燥されている、請求項１４１に記載のキット。
  143. 合成ナノ粒子が、溶液の形態である、請求項１４１に記載のキット。
  144. 薬学的に許容されるキャリアーをさらに含む、請求項１４１に記載のキット。
  145. 注射デバイスをさらに含む、請求項１４１に記載のキット。
  146. 細胞誘引物質をさらに含む、請求項１４１に記載のキット。
  147. 正電荷キャリアーマトリックス、中性又は負電荷コーティング、少なくとも１つの細胞ターゲティングリガンド及び合成ｍＲＮＡを含むキット。
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