KR20210014638A - 유전자 발현을 위한 나노입자 및 이의 용도 - Google Patents
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Abstract
생체 내에서 유전적으로-변형된 선택된 세포 유형에 의한 치료적 단백질의 발현에 기반한 치료 프로토콜을 기재한다. 상기 치료 프로토콜은 세포 유인제를 추가로 이용하여, 선택된 세포 유형을 치료 부위로 및/또는 치료 부위에서 대식세포 활성화 프로토콜로 유인할 수 있다.
Description
관련 출원에 대한 교차-참조
본 출원은 2018년 5월 1일에 출원된 미국 가특허 출원 제62/665,280호에 우선권을 주장하며, 이의 전체 내용은 그 전체가 본원에 참조로 원용된다.
발명의 분야
본 개시내용은 생체 내에서 유전적으로-변형된 선택된 세포 유형에 의한 치료적 단백질의 발현에 기초한 치료 프로토콜을 제공한다. 치료 프로토콜은 세포 유인제를 추가적으로 이용하여 선택된 세포 유형을 치료 부위 및/또는 치료 부위에서 대식세포 활성화 프로토콜로 유인할 수 있다.
많은 새로운 의학적 요법은 질환 또는 감염과 싸우기 위해 환자의 면역 체계의 세포를 유전적으로 변형시키는 것을 포함한다. 예를 들어, 입양 T-세포 요법은 T 세포를 환자로부터 채취하고 암세포를 표적화하고 사멸시키기 위해 유전적으로 변형시키는 강력한 암 요법이다. 그러나, 표준화된 형태로 대량으로 약물을 준비하는 것보다 각각의 환자를 위해 유전적으로-조작된 T 세포 제품을 제조하는 데 관여되는 복잡성 및 높은 비용은 현재의 최전선 요법 옵션, 예컨대, 소분자 약물 또는 모노클로날 항체를 능가하기 어렵게 만든다. 예를 들어, 입양 T-세포 요법을 위해 T 세포를 유전적으로-변형시키는 단계는 다음을 필요로 한다:
(i) 환자로부터 T 세포를 추출하기 위한 백혈구채집술 (즉, 환자는 2 개의 정맥 튜브에 의해 몇 시간 동안 채집 기계에 연결된다; 이는 환자에게 불편하고 상당한 비용을 발생시키며 궁극적으로 대규모 입양 자가유래 T 요법은이용가능성에 의해 비율이 제한될 수 있다);
(ii) T 세포의 활성화 및 유전적 변형;
(iii) 사이토카인-보충된 조직 배양 배지에서 2 주 기간에 걸쳐 유전적으로-변형된 T 세포의 확장;
(iv) 투여 전 T 세포를 세척 및 농축시키는 단계 (및 중앙 시설에서 제조되고 원격 치료 센터로 수송되는 T 세포 제품의 경우, 동결보존); 및
(v) 유전적으로-변형된 T 세포 제품의 각각의 제형화된 배치에 대한 품질 제어 (QC) 방출 검정.
유전적으로-변형된 T 세포 제품을 제조하는 데 드는 비용 및 복잡성에 더하여, 이러한 모든 절차는 유지 및 운영 비용이 많이 드는 환경적으로 제어된 우수 제조관리 기준 (GMP) 조건 하에서 수행되어야 한다. 더욱이, 각각의 유전적으로-변형된 T 세포 제품은 치료될 환자로부터의 출발 재료 (T 세포)로 만들어지기 때문에, 실질적인 규모의 경제가 없다.
많은 유전적으로-변형된 세포 유형과 연관된 또 다른 결점은 세포가 투여 후 환자에서 지속될 수 있으며, 때때로 원치 않는 및/또는 오래 지속되는 부작용을 초래할 수 있다는 것이다. 따라서, 효과적이고 확장 가능하지만 덜 영구적인 요법을 달성하기 위한 메커니즘이 필요하다.
발명의 요약
본 개시내용은 생체 내에서 유전적으로-변형된 선택된 세포 유형에 의한 핵산 및/또는 단백질, 예컨대, 치료적 단백질의 발현에 기초한 치료 프로토콜을 제공한다. 일부 실시양태에 있어서, 치료적 단백질의 발현은 일시적이어서, 부작용이 오래 지속될 가능성에 대한 우려를 감소시킨다. 또한, 치료 프로토콜은 입양 T 세포 요법 (및 유사한 치료 프로토콜)에 의해 요구되는 모든 광범위한 세포 처리 단계에 대한 필요 없이 생체 내에서 선택된 세포 유형의 유전적 변형을 달성할 수 있는 나노입자를 이용한다.
특정 실시양태에 있어서, 치료적 단백질을 발현하기 위해 선택된 세포 유형의 유전적 변형을 초래하는 나노입자를 투여받은 대상체는 치료적 단백질 발현 수준에 대해 모니터링된다. 발현이 역치 미만으로 떨어지는 경우, 치료 의사는 대상체 내에서 치료적 단백질 발현을 연장하기 위해 나노입자의 후속 용량을 투여해야하는지 여부를 결정할 수 있다. 이 공정은 치료적 목적이 달성될 때까지 반복될 수 있으며, 의사는 대상체 내에서 치료적 단백질의 계속적인 발현이 유익한 임상 목적을 제공하지 않을 것이라고 결정한다.
특정 실시양태에 있어서, 본 개시내용은 5-10 일 동안 핵산 또는 단백질, 예컨대, 치료적 단백질을 발현하기 위해 생체 내에서 선택된 세포 유형을 유전적으로 변형시키는 나노입자의 투여를 제공한다. 특정 실시양태에 있어서, 나노입자-프로그래밍된 세포는 기술된 나노입자에 대한 생체 내 노출 후 평균 7 일 동안 이들의 표면 상에서 치료적 단백질을 일시적으로 발현한다.
특정 실시양태에 있어서, 본 개시내용은 선택된 세포 유형을 신체 내의 치료 부위로 유인하기 위해 세포 유인제를 이용하는 것을 제공한다. 치료 부위에 대한 선택된 세포 유형의 유인 후, 치료적 단백질을 일시적으로 발현하기 위해 유인된 세포 유형을 유전적으로 변형시키는 나노입자를 치료 부위에 국소적으로 투여할 수 있다. 특정 실시양태에 있어서, 세포 유인제는 나노입자 전달 24 시간 전에 치료 부위에서 투여된다.
특정 실시양태에 있어서, 세포 유인제는 대상체 내의 원하는 부위에 세포를 동원하기 위해 나노입자의 임상적으로 관련된 시간 윈도우 내에서 대상체에 투여된다. 예를 들어, 종양 부위에 대한 T 세포 동원은 T 세포 유인제를 종양 내로 또는 종양 근처에 투여함으로써 달성될 수 있다. 이어서, T 세포 유인제의 임상적으로 관련된 시간 윈도우 내에 투여된 나노입자 치료는 예를 들어, 종양에 대해 지시된 치료적 단백질의 발현을 위해 유인된 T 세포를 유익하게 표적화할 수 있다.
특정 실시양태는 추가적으로 나노입자를 이용하여 선택된 세포 유형의 활성화 상태를 재프로그래밍한다. 예를 들어, 특정 실시양태는 나노입자를 이용하여 치료 부위에서 대식세포를 활성화시킨다.
개시내용은 치료 프로토콜이 예를 들어, 림프종, 전립선암, B 형 간염 바이러스 (HBV)-유도된 간세포 암종, 난소암, 교모세포종 및 폐암에 대해 치료적으로 효과적인 치료를 제공함을 보여준다.
본원에 기술된 치료 프로토콜은 오래 지속되는 부작용에 대한 우려가 극복되는 악성종양 또는 감염 환자의 치료를 위해 입수가능한 기성품 시약의 사용을 초래한다. 이러한 제품은 진단 당일에 및 의학적으로 필요한 만큼 자주 이용가능할 수 있다.
여기에 제출된 도면 중 하나 이상은 색상으로 보다 잘 이해된다. 출원인은 도면(들)의 색상 버전을 원본 제출의 일부로서 간주하고 이후 절차에서 도면의 색상 이미지를 제시할 권리를 보유한다.
도 1: 대표적인 실시양태의 예시. 나노입자 (100)은 중합체(들) 120와 연관된 패신저 mRNA 핵산(들) 110을 포함하는 코어를 둘러싸는 코팅 105을 포함한다. 코팅 105의 외부에 임베딩되고/되거나 이와 회합된 하나 이상의 세포 표적화 리간드 140이 있다. 나노입자 100은 세포 표적화 리간드(들) 140 및 표적 세포 160의 표면 상의 분자(들) 150 사이의 상호작용을 통해 표적 세포 160(예컨대, T 세포)에 특이적으로 표적화시킨다. 나노입자의 내용물이 (예컨대, 수용체 유도된 내포작용을 통해) 표적 세포 160의 세포질로 방출되면, 패신저 mRNA 핵산 (세포 140 내부에 110'로서 도시됨)이 번역되어 예컨대, 표적 세포 160의 표면 상에서 단백질 170을 발현한다.
도 2: 중합체성 나노입자에 의해 운반되는 인 시튜 전사 (IVT) mRNA를 사용하여 질환-특이적 키메라 항원 수용체 (CAR) 또는 T 세포 수용체 (TCR)를 발현하도록 인 시튜에서 T 세포를 재프로그래밍하기 위한 조성물 및 방법의 실시양태를 예시하는 개요. 이들 나노입자는 세포독성 T 세포로 표적화되는 리간드로 코팅되어 있어, 일단 환자의 순환에 주입되면 이들이 운반하는 핵산(들)을 림프구로 이동시키고 일시적으로 표면 상에 치료적 단백질 (예컨대, 질환-특이적 CAR, TCR 또는 CAR/TCR 하이브리드)을 발현하도록 프로그래밍한다.
도 3a, 3b: 추가 실시양태 및 전달 모드의 예시. 표적화된 mRNA 나노입자를 사용하여 복막 내 (도 3a) 및 두개 내 (도 3b) 종양-연관된 대식세포 (TAM)를 종양파괴성 대식세포로 유전적으로 재프로그래밍하는 도식. 도 3a는 카테터를 통한 전달 (카테터를 통한 주입)을 예시한다; 도 3b는 직접 종양 주사 (종양 내 전달)를 통한 전달을 예시한다. 여기에 예시된 것과 같은 직접 국소 주입 전달을 통해, 환자는 치료에 의해 유도된 염증이 치료 부위에 국한되어 있기 때문에 전신 독성으로부터 모면할 수 있다. 국소적으로 주입된 입자는 종양 환경에서 세포를 표적화하고, (2) (예시된 바와 같이) 대식세포 분극화를 제어하는 시그널링 경로를 선택적으로 재프로그래밍하고, (3) 생리학적 경로에 의해 국소적으로 분해가능한 뉴클레오티드를 전달한다. 도 3a 및 3b에 묘사된 투여 경로는 치료적 단백질, 예컨대, CAR, TCR 또는 하이브리드 CAR/TCR의 발현을 초래하는 핵산을 포함하는 나노입자를 전달하는 데 또한 사용될 수 있다.
도 4a, 4b: 림프구-프로그래밍 나노입자의 설계 및 제조. (도 4a) 대표적인 T 세포-표적화된 IVT mRNA 나노입자의 개략도. 단순히 접촉만에 의해 (비-바이러스 형질주입 방법에 대한 악명높은 불응성인) 일차 T 림프구를 유전적으로 변형시킬 수 있는 시약을 만들기 위해, 중합체성 나노입자를 다음과 같은 4 가지 기능적 구성요소를 포함하여 생체조작하였다:
(i) 나노입자를 T 세포에 선택적으로 결합시키고 이들을 내재화시키기 위해 신속한 수용체-유도된 내포작용을 개시하는 표면-고정된 표적화 리간드. 대표적인 실험에서, 항-CD8 결합 도메인이 사용됨;
(ii) 나노입자의 표면 전하를 감소시킴으로써 표적-외 결합을 최소화하기 위해 나노입자를 차폐하는 음으로-하전된 코팅. 폴리글루탐산 (PGA)은 대표적인 실험에서 이를 달성하기 위해 사용됨;
(iii) 핵산이 엔도솜에 있는 동안 핵산을 응축하고 효소 분해로부터 보호하지만 입자가 세포질로 수송되면 이들을 방출하여, 코딩된 단백질의 전사를 가능하게 하는 담체 매트릭스. 이 표현을 위해, 수성 조건에서 1 내지 7 시간의 반감기를 갖는 생분해가능한 폴리(β-아미노 에스테르) (PBAE) 중합체 제형이 사용됨; 및
(iv) 담체 내에 캡슐화되고 예를 들어, 질환-특이적 CAR 또는 TCR의 발현을 생산하는 핵산 (예컨대, IVT mRNA).
(도 4b) 나노입자가 어떻게 제작되는 지를 기술하는 다이어그램. 동결건조 및 수화 단계는 옵션이다.
도 5a-5j: IVT mRNA 나노입자는 인간 T세포를 CAR- 또는 TCR 코딩 핵산으로 효율적으로 형질주입시킨다. 단리된 인간 CD8+ T 세포를 TCR/CD3 및 공동-자극성 CD28 수용체에 대한 항체로 코팅된 비드로 자극하였다. 24 h 후, 비드를 제거하고 백혈병-특이적 1928z CAR (도 5a-5e) 또는 HB코어18-27 TCR (도 5f-5j)을 코딩하는 mRNA를 함유하는 CD8-표적화된 NP를 3 μg의 mRNA/106 개의 세포의 농도로 세포 현탁액에 혼합하였다. (도 5a) T 세포가 1928z CAR 나노입자에 노출된 후 시간 경과에 따른 상대적 1928z CAR mRNA 발현의 qPCR 측정. (도 5b) mRNA를 코딩하는 1928z CAR을 보유하는 나노입자와 함께 항온처리한 후 표시된 시점에서 T 세포의 유세포 분석. (도 5c) 시험관 내 캡슐화된 핵산 전달 효율의 요약 플롯. (도 5d) Raji 림프종 세포에 대한 나노입자- 대 레트로바이러스-형질주입된 T 세포의 세포독성을 비교하는 시험관 내 검정. IncuCyte 생세포 분석 시스템을 사용하여 시간 경과에 따른 1928z CAR-형질주입된 T 세포에 의한 Raji NucLight Red 세포의 면역 세포 사멸을 정량화하였다. 데이터는 2 개의 독립적인 실험을 나타낸다. 각각의 포인트는 평균 ± s.e.m을 나타낸다. 3 회씩 수행된 2 개의 독립적인 실험으로부터 풀링되었다. (도 5e) 형질주입된 세포에 의한 IL-2 (24 h에서) 및 TNF-α 및 IFN-γ (48 h에서) 분비의 ELISA 측정. (도 5f) T 세포가 HB코어18-27 TCR 나노입자에 노출된 후 시간 경과에 따른 상대적 HB코어18-27 TCR mRNA 발현의 qPCR 측정. (도 5g, 5h) 캡슐화된 핵산 전달 효율 (도 5i) 시간 경과에 따른 HB코어18-27 TCR-형질주입된 T 세포에 의한 HepG2-코어 NucLight Red 세포의 세포 사멸 (도 5j) 형질주입된 세포에 의한 사이토카인 분비의 ELISA 측정.
도 6a-6e: 나노입자-프로그래밍된 CAR 림프구는 입양 T-세포 요법과 유사한 효능으로 백혈병 퇴행을 유발한다. (도 6a) 타임 라인 및 나노입자 투여 양생법. (도 6b) NSG 마우스에 전신 주사된 반딧불이 루시퍼라제-발현 Raji 림프종 세포의 순차적인 바이오이미징. 각각의 코호트 (n = 10)로부터 5 개의 대표적인 마우스가 도시된다. (도 6c) Kaplan-Meier 곡선으로 묘사된 요법 후 동물의 생존. 3 개의 독립적인 실험으로부터 풀링된 처리군 당 10 마리의 마우스가 도시된다. ms, 중앙값 생존. 처리된 실험군과 처리되지 않은 대조군 사이의 통계적 분석은 로그-순위 테스트를 사용하여 수행된다; P < 0.05는 유의한 것으로 간주된다. (도 6d) 1928z CAR을 코딩하는 IVT mRNA를 전달하는 나노입자의 주사 전후의 말초 T 세포의 유세포 분석. 여기에 도시된 각각의 시점에 대한 3 가지 프로파일은 군 당 10 마리의 마우스로 이루어진 2 개의 독립적인 실험을 대표한다. (도 6e) 1928z CAR 나노입자의 반복 주입 후 CAR-형질주입된 CD8+ T 세포의 백분율을 표시하는 개요 그래프. 선 마다 한 마리의 동물을 나타낸다. 2 개의 독립적인 실험으로부터 풀링된 10 마리의 동물이 도시된다.
도 7a-7g: 전립선 종양-특이적 CAR을 코딩하는 IVT-mRNA 나노입자는 확립된 질환을 갖는 마우스의 생존을 개선한다. (도 7a) 항원 발현의 다양성을 보여주는 140 개의 전립선암 전이 패널에 걸친 PSCA, PSMA 및 ROR1 항원 발현의 히트 맵. (도 7b) LNCap C42 전립선 암종 세포에 의한 PSCA, PSMA 및 ROR1 발현의 가변성을 보여주는 유세포 분석 데이터의 히트 맵 표현. 색상은 350 개의 무작위적으로-선택된 세포의 발현 수준을 나타낸다. (도 7c) 이식-3 주 후, LNCap C42 전립선 종양은 생체 내 생체발광 이미징에 의해 시각화된다. 전립선의 등쪽 엽에 확립된 종양 (흰색 화살표)의 대표적인 사진이 오른쪽에 도시된다. (도 7d) NGS 마우스의 전립선에 동소 이식된 반딧불이 루시퍼라제-발현 LNCaP C42 전립선 암종 세포의 순차적인 바이오이미징. 각각의 코호트 (n = 8)로부터 4 개의 대표적인 마우스가 도시된다. (도 7e) 타임 라인 및 나노입자 투여 양생법. (도 7f) Kaplan-Meier 곡선으로 묘사된 요법 후 동물의 생존. 3 개의 독립적인 실험으로부터 풀링된 처리군 당 8 마리의 마우스가 도시된다. ms, 중앙값 생존. 처리된 실험군과 처리되지 않은 대조군 사이의 통계적 분석은 로그-순위 테스트를 사용하여 수행된다; P < 0.05는 유의한 것으로 간주된다. N.s., 유의하지 않음. (도 7g) CAR-T 세포 요법 또는 ROR1 4-1BBz CAR NP 요법 후 LNCaP C42 전립선 종양 세포에서 ROR1 항원 발현의 유세포 분석 정량화. 5 개의 종양으로부터 풀링된 350 개의 무작위적으로-선택된 세포가 도시된다.
도 8: 실시예 2에 기술된 골수성 및 림프성 면역표현형 패널에 사용된 항체 목록.
도 9a-9k: IRF5 및 IKKβ를 코딩하는 mRNA를 운반하는 나노입자는 전-염증성 M1-유사 표현형을 각인할 수 있다. (도 9a) 대식세포 분극화의 주요 조절자를 코딩하는 mRNA로 제형화된 대식세포-표적화된 중합체성 NP의 설계. 입자는 PGA-디-만노스 층으로 코팅된 PbAE-mRNA 폴리플렉스 코어로 이루어지며, 이는 입자를 M2-유사 대식세포에 의해 발현되는 만노스 수용체 (CD206)에 대해 표적화시킨다. 또한 재프로그래밍 전사 인자를 코딩하도록 조작된, NP에 캡슐화된 합성 mRNA가 묘사된다. (도 9b) NP 집단 (스케일 바 200 nm) 및 단일 NP (삽도, 스케일 바 50 nm)의 투과 전자 현미경. (도 9c) NanoSight NS300 기기를 사용하여 측정한 NP의 크기 분포. (도 9d) NP는 1 h 노출 후 골수-유래된 대식세포 (BMDM)의 높은 형질주입 (46%)을 보여주었다. (도 9e) 나노입자 형질주입 24 시간 후 유세포 분석에 의해 측정된 골수 유래된 대식세포 (BMDM)로의 유전자-전달 효율. (도 9f) NP 형질주입된 및 형질주입되지 않은 대식세포의 상대적 생존가능성 (Annexin V 및 PI로 염색함으로써 평가됨). N.s.; 유의하지 않음. (도 9g) qRT-PCR에 의해 측정된 코돈-최적화된 IRF5 mRNA (청색, 왼쪽 Y 축) 및 내인성 IRF5 mRNA (흑색, 오른쪽 Y 축)의 발현 역동학, 각각의 시점에 대해 n=3. (도 9h) 도 9i-9k에 사용된 BMDM에 대한 NP 형질주입 프로토콜 및 배양 조건을 나타내는 타임라인. (도 9i) MPLA에 대한 톨-유사 수용체 6으로 자극된 시그니처 M1 세포와 비교한 IRF5/IKKβ NP-형질주입된 대식세포의 유전자 발현 프로파일. 결과는 유전자 발현의 배수 변화 분포를 보여주는 Volcano 플롯으로서 묘사된다. M1 시그니처 유전자가 표시된다. IRF5/IKKβ NP-형질주입된 대식세포와 M1 시그니처 유전자 세트 사이의 중첩 P 값은 GSEA에 의해 결정된다. (도 9j) IL-4에서 배양된 대식세포 대 IL-4에서 배양되고 IRF5/IKKβ NP로 형질주입된 세포에서의 M1 시그니처 유전자 발현의 히트 맵. (도 9k) 표시된 유전자에 대한 평균 계수 및 S.E.M을 나타내는 상자 플롯.
도 10a-10j: IRF5 및 IKKβ 유전자를 대식세포에 전달하는 mRNA 나노담체의 반복된 복막 내 주사는 파종된 난소암을 갖는 마우스의 평균 생존을 2 배 초과로 증가시켰다. (도 10a) 타임 라인 및 투여 양생법. 화살표는 I.P. 주사의 시간을 표시한다. (도 10b) 대조군 및 처리된 마우스에서 종양 성장의 순차적인 생체발광 이미징. (도 10c) 처리된 마우스 대 대조군 마우스에 대한 Kaplan-Meier 생존 곡선. 로그-순위 테스트를 사용하여 통계적 분석을 수행하였다. (도 10d) 대조군으로서 GFP mRNA를 운반하는 D-만노스-코팅된 NP의 단일 i.p. 용량의 48 시간 후 상이한 면역 세포 하위집단에서 생체 내 형질주입 속도의 유세포 분석 정량화: 대식세포 (CD45+, CD11b+, MHCII+, CD11c, Ly6C-/저, Ly6G-), 단핵구 (CD45+, CD11b+, MHCII+, CD11c-, Ly6C+, Ly6G-), 호중구 (CD45+, CD11b+, MHCII+, CD11c-, Ly6G+), CD4+ T 세포 (CD45+, TCR-β 쇄+, CD4+, CD8), CD8+ T 세포 (CD45+, TCR-β 쇄+, CD4-, CD8+) 및 자연 살해 (NK) 세포 (CD45+, TCR-β 쇄, CD49b+)를 측정하였다. (도 10e) 파종된 ID8 난소암을 갖는 마우스의 복막에서 대식세포 표현형의 유세포 분석. 동물을 IRF5/IKKβ NP 또는 PBS의 4 회 용량으로 처리하였다. (도 10f) Ly6C-, F4/80+ 및 CD206+ (M2-유사) 대식세포의 상대적 백분율 (왼쪽 패널) 및 절대적 수 (오른쪽 패널)를 요약한 상자 플롯. (도 10g) Ly6C-, F4/80+ 및 CD206-(M1-유사) 대식세포에 해당하는 수. (도 10h) PBS 대조군 (상단 패널) 또는 IRF5/IKKβ NP-처리된 동물 (하단 패널; 스케일 바 100 μm)로부터 단리된 난소 종양-침윤된 장간막의 대표적인 헤마톡실린 및 에오신-염색된 섹션. 대표적인 악성 병변의 10-배 배율이 오른쪽에 도시된다 (스케일 바 50 μm). (도 10i) 각각의 처리군으로부터 단리된 복막 대식세포에 의해 생성된 사이토카인을 측정하는 Luminex 검정. CD11b+, F4/80+ 복막 대식세포를 형광 활성화된 세포 분류에 의해 단리하고 생체 외에서 배양하였다. 24 시간 후, 세포 배양 상청액을 수집하였다. 병행 실험에서, FACS-분류된 CD11b+, F4/80+ 복막 대식세포를 pRT-PCR로 직접 분석하여 대식세포 표현형 (SerpinB2, Retnla, Ccl11 및 Ccl5)의 4 가지 마스터 조절자의 발현 수준을 결정하였다. 결과는 도 10j에서 상자 플롯으로서 요약된다.
도 11a-11f: 대식세포-프로그래밍 mRNA 나노담체는 대단히 생체에 적합성이며 반복 투여에 안전하다. (도 11a) i.p. 투여 후 대식세포-표적화된 IRF5/IKKβ NP의 생체 내 생체분포. NP-전달된 (코돈 최적화된) mRNA는 50 μg mRNA를 함유하는 입자의 단일 주사 24 시간 후에 qPCR에 의해 검출되었다. (도 11b) 실험적 타임라인의 도식적 표현. *마지막 용량 24 시간 후, 마우스를 CO2 흡입에 의해 안락사시켰다. 혈청 화학 및 완전한 혈구 계수를 위해 혈액을 헤파린 코팅된 튜브로 안구-뒤 출혈을 통해 수집하였다. 부검은 간, 비장, 췌장, 장간막 및 대망, 위 및 방광의 조직학적 분석을 위해 수행되었다. (도 11c) 대조군 또는 NP-처리된 동물로부터 단리된 다양한 기관의 대표적인 헤마톡실린 및 에오신-염색된 섹션. 스케일 바, 100 μm. NP-처리된 동물에서 발견된 병변은 비교 병리학자의 분석을 기반으로 여기에 도시되고 기술된다. 각각의 번호가 매겨진 이미지에 대한 관련 결과는 다음과 같다: [1] 주로 약간의 과립구와 혼합된 단핵 세포로 구성된 세포 침윤물의 개별 초점; 경미한 골수 외 조혈. [2] 국소적으로 광범위한 약간의 영역에서, 간세포는 경도 내지 중등도로 부어 있다. [3] 적색 속질 내 중등도의 골수성 (우세), 적혈구 및 거핵구 과형성. [4] 백색 속질의 경도의 저세포성. [5] 장간막 내부에는 대식세포, 림프구, 형질 세포 및 과립구의 중등도의 다초점 침윤물이 있다. [6] 림프구, 형질 세포 및 과립구와 혼합된 대식세포의 경도 내지 중등도의 침윤물; 선포 및 선포 손실의 경미한 해리; 선포 세포로부터 자이모겐 과립의 경도의 확산 손실. [7] 지방 조직 주변의 대식세포와 혼합된 림프구의 밀도가 높은 응집체. [8] 위 점막 내의 주세포 및 벽세포의 경도의 다초점 액포 변성. (도 11d) 혈청 화학 및 혈구 계수. (도 11e, 11f) IRF5/IKKβ NP의 단일 i.p. 주사 4 또는 8 일 후 혈청 IL-6 (도 11e) 및 TNF-α (도 11f) 사이토카인의 Luminex 검정 측정.
도 12a-12i: 정맥으로 주입된 IRF5/IKKβ 나노입자는 폐에서 종양 전이를 제어할 수 있다. (도 12a) i.v. 투여 후 대식세포-표적화된 IRF5/IKKβ NP의 생체 내 생체분포. 코돈-최적화된 mRNA는 50 μg mRNA를 함유하는 입자의 단일 i.v. 투여 24 시간 후 qPCR에 의해 측정되었다. (도 12b-12h) C57BL/6 알비노 마우스에 1x106 개의 B16F10 반딧불이 루시퍼라제-발현 흑색종 세포를 꼬리 정맥을 통해 주사하여 폐 전이를 확립하였다. 7 일 후, 동물을 IRF5/IKKβ NP 처리군, 대조군 GFP NP 군 또는 PBS 대조군에 무작위로 할당하였다. (도 12b) 타임 라인 및 투여 양생법. (도 12c) 건강한 폐 (왼쪽 패널) 및 B16F10 종양-침윤된 폐 (오른쪽 패널)의 공초점 현미경. 침윤하는 대식세포 군집은 녹색으로 형광을 발한다. (도 12d) 순차적인 생체발광 종양 이미징. (도 12e) 각각의 처리군에 대한 Kaplan-Meier 생존 곡선. ms는 중앙값 생존을 나타낸다. 통계적 분석은 로그-순위 테스트를 사용하여 수행하였으며, P<0.05는 유의한 것으로 간주하였다. (도 12f) 치료 2 주 후 각각의 군을 나타내는 B16F10 흑색종 전이를 함유하는 폐의 대표적인 사진 (상단 열) 및 현미경사진. (도 12g) 폐 종양 초점 계수. (도 12h) 각각의 처리군의 기관지폐포 세정에서 단핵구/대식세포 집단의 표현형 특성화. (도 12i) 억압하는 대식세포 및 활성화된 대식세포의 상대적 백분율 요약.
도 13a13f: 대식세포 재프로그래밍은 신경교종에서 방사선요법의 결과를 개선한다. (도 13a) 유도 후 21 일에 RCAS-PDGF-B/Nestin-Tv-a; Ink4a/Arf-/-; Pten-/- 트랜스제닉 마우스에서 PDGFβ-구동된 신경교종의 개시 후 T2 MRI 스캔 및 조직학적 염색. (도 13b) 신경교종 마진에 침윤하는 CD68+ TAM의 공초점 현미경. 스케일 바 300μm. (도 13c) 건강한 뇌 조직 대 신경교종에서 대식세포 (F4/80+, CD11b+) 집단의 유세포 분석. (도 13d, 13e) 단일요법 (도 13d)으로서 또는 뇌종양 방사선요법과 병용된 (도 13e) IRF5/IKKβ 치료를 받은 확립된 신경교종이 있는 마우스의 Kaplan-Meier 생존 곡선. 타임 라인 및 투여 양생법이 상단에 도시된다. Ms, 중앙값 생존. 통계적 분석은 로그-순위 테스트를 사용하였으며, P<0.05는 통계적으로 유의한 것으로 간주된다. (도 13f) 종양 진행의 순차적인 생체발광 이미징.
도 14a-14e: 인간 IRF5/IKKβ를 코딩하는 IVT mRNA-운반 나노입자는 인간 대식세포를 효율적으로 재프로그래밍한다. (도 14a) 인간 THP-1 단핵구 세포주를 억압성 M2-유사 대식세포로 분화시키기 위한 타임 라인 및 배양 조건. (도 14b) 24 개의 웰에서 배양되고, 대조군 GFP mRNA에 비해 인간 IRF5/IKKβ mRNA를 운반하는 NP의 표시된 농도로 형질주입된 M2-분화된 THP1-Lucia 세포의 생체발광 이미징. IRF-유도된 Lucia 루시퍼라제의 수준은 Quanti-Luc를 사용하여 형질주입 24 시간 후에 결정되었다. (도 14c) 생체발광 계수 요약. (도 14d, 14e) IL-1β 사이토카인 분비 (도 14d) 및 M1-대식세포 마커 CD80의 표면 발현 (도 14e)의 상이함.
도 15. 예시적인 지지 서열: 서열번호 1: 항-인간 1928z CAR; 서열번호 2: 항-인간 ROR1 CAR; 서열번호 3: HBV-특이적 TCR; 서열번호 4: 항-인간 1928z CAR; 서열번호 5: 항-인간 ROR1 (4-1BBz) CAR; 서열번호 6: 항-HBV-특이적 TCR (HB코어18-27); 서열번호 7: 항-CD19 scFv (VH-VL) FMC63; 서열번호 8: 항-CD19 scFv (VH-VL) FMC63; 서열번호 9: CD28 이펙터 도메인; 서열번호 10: P28z CAR; 서열번호 11: IgG4-Fc; 서열번호 12: 힌지-CH2-CH3; 서열번호 13: 힌지-CH3; 서열번호 14: 힌지만; 서열번호 15: CD28 막관통 도메인; 서열번호 16: CD28 세포질 도메인 (LL에서 GG로); 서열번호 17: 4-1BB 세포질 도메인; 서열번호 18: CD3-ζ 세포질 도메인; 서열번호 19: T2A; 서열번호 20: tEGFR; 서열번호 21: Strep tag II; 서열번호 22: Myc 태그; 서열번호 23: V5 태그; 서열번호 24: FLAG 태그; 서열번호 25: 인간 IRF5 아이소폼 1 (UniProt 수탁 Q13568-1); 서열번호 26: 인간 IRF5 아이소폼 2 (UniProt 수탁 Q13568-2); 서열번호 27: 인간 IRF5 아이소폼 3 (UniProt 수탁 Q13568-3); 서열번호 28: 인간 IRF5 아이소폼 4 (UniProt 수탁 Q13568-4); 서열번호 29: 인간 IRF5 아이소폼 5 (UniProt 수탁 Q13568-5); 서열번호 30: 인간 IRF5 아이소폼 6 (UniProt 수탁 Q13568-6); 서열번호 31: 뮤린 IRF5 단백질 (pI=5.19, Mw = 56005, UniProt 수탁 P56477); 서열번호 32: 인간 IRF1 (UniProt 수탁 P10914); 서열번호 33: 인간 IRF3 아이소폼 1 (UniProt 수탁 Q14653-1); 서열번호 34: 인간 IRF7 아이소폼 A (UniProt 수탁 Q92985-1); 서열번호 35: 인간 IRF8 (UniProt 수탁 Q02556); 서열번호 36: 뮤린 IRF1 (UniProt 수탁 P15314); 서열번호 37: 뮤린 IRF3 (UniProt 수탁 P70671); 서열번호 38: 뮤린 IRF7 (UniProt 수탁 P70434); 서열번호 39: 뮤린 IRF7/IRF3 5(D) 단백질 (pI=4.72, MW = 58456); 서열번호 40: 뮤린 IRF8 (UniProt 수탁 P23611); 서열번호 41: 뮤린 IRF8 (K310R) 단백질 (pI=6.38, MW = 48265); 서열번호 42: 인간 IKKβ 아이소폼 1 (UniProt 수탁 O14920-1); 서열번호 43: 인간 IKKβ 아이소폼 2 (UniProt 수탁 O14920-2); 서열번호 44: 인간 IKKβ 아이소폼 3 (UniProt 수탁 O14920-3); 서열번호 45: 인간 IKKβ 아이소폼 4 (UniProt 수탁 O14920-4); 서열번호 46: 뮤린 IKK β 단백질 (pI=6.20, MW=84387.61, GenBank 수탁 번호 NP_034676.1); 서열번호 47: 인간 IRF5 아이소폼 1 cds; 서열번호 48: 인간 IRF5 아이소폼 2 cds; 서열번호 49: 인간 IRF5 아이소폼 3 cds (GenBank 수탁 U51127); 서열번호 50: 인간 IRF5 아이소폼 4 cds (GenBank 수탁 번호 AY504946 또는 AY504947); 서열번호 51: 인간 IRF5 아이소폼 5 cds; 서열번호 52: 인간 IRF5 아이소폼 6 cds; 서열번호 53: 뮤린 IF5 cds (1494nt); 서열번호 54: 인간 IRF1 cds; 서열번호 55: 인간 IRF3 아이소폼 1 cds (NM_001571.5); 서열번호 56: 인간 IRF7 아이소폼 A cds (NM_001572.3); 서열번호 57: 인간 IRF8 cds; 서열번호 58: 뮤린 IRF1 cds (NM_001159396.1); 서열번호 59: 뮤린 IRF3 cds (NM_016849.4); 서열번호 60: 뮤린 IRF7 cds (NM_016850.3); 서열번호 61: 뮤린 IRF-7/IRF-3 5(D) cds (1578 nt); 서열번호 62: 뮤린 IRF8 cds; 서열번호 63: 뮤린 IRF8 K310R cds (1275 nt); 서열번호 64: 인간 IKKβ 아이소폼 1 cds; 서열번호 65: 인간 IKKβ 아이소폼 2 cds; 서열번호 66: 인간 IKKβ 아이소폼 3 cds; 서열번호 67: 인간 IKKβ 아이소폼 4 cds; 서열번호 68: 뮤린 IKKβ cds (2217 nt).
도 1: 대표적인 실시양태의 예시. 나노입자 (100)은 중합체(들) 120와 연관된 패신저 mRNA 핵산(들) 110을 포함하는 코어를 둘러싸는 코팅 105을 포함한다. 코팅 105의 외부에 임베딩되고/되거나 이와 회합된 하나 이상의 세포 표적화 리간드 140이 있다. 나노입자 100은 세포 표적화 리간드(들) 140 및 표적 세포 160의 표면 상의 분자(들) 150 사이의 상호작용을 통해 표적 세포 160(예컨대, T 세포)에 특이적으로 표적화시킨다. 나노입자의 내용물이 (예컨대, 수용체 유도된 내포작용을 통해) 표적 세포 160의 세포질로 방출되면, 패신저 mRNA 핵산 (세포 140 내부에 110'로서 도시됨)이 번역되어 예컨대, 표적 세포 160의 표면 상에서 단백질 170을 발현한다.
도 2: 중합체성 나노입자에 의해 운반되는 인 시튜 전사 (IVT) mRNA를 사용하여 질환-특이적 키메라 항원 수용체 (CAR) 또는 T 세포 수용체 (TCR)를 발현하도록 인 시튜에서 T 세포를 재프로그래밍하기 위한 조성물 및 방법의 실시양태를 예시하는 개요. 이들 나노입자는 세포독성 T 세포로 표적화되는 리간드로 코팅되어 있어, 일단 환자의 순환에 주입되면 이들이 운반하는 핵산(들)을 림프구로 이동시키고 일시적으로 표면 상에 치료적 단백질 (예컨대, 질환-특이적 CAR, TCR 또는 CAR/TCR 하이브리드)을 발현하도록 프로그래밍한다.
도 3a, 3b: 추가 실시양태 및 전달 모드의 예시. 표적화된 mRNA 나노입자를 사용하여 복막 내 (도 3a) 및 두개 내 (도 3b) 종양-연관된 대식세포 (TAM)를 종양파괴성 대식세포로 유전적으로 재프로그래밍하는 도식. 도 3a는 카테터를 통한 전달 (카테터를 통한 주입)을 예시한다; 도 3b는 직접 종양 주사 (종양 내 전달)를 통한 전달을 예시한다. 여기에 예시된 것과 같은 직접 국소 주입 전달을 통해, 환자는 치료에 의해 유도된 염증이 치료 부위에 국한되어 있기 때문에 전신 독성으로부터 모면할 수 있다. 국소적으로 주입된 입자는 종양 환경에서 세포를 표적화하고, (2) (예시된 바와 같이) 대식세포 분극화를 제어하는 시그널링 경로를 선택적으로 재프로그래밍하고, (3) 생리학적 경로에 의해 국소적으로 분해가능한 뉴클레오티드를 전달한다. 도 3a 및 3b에 묘사된 투여 경로는 치료적 단백질, 예컨대, CAR, TCR 또는 하이브리드 CAR/TCR의 발현을 초래하는 핵산을 포함하는 나노입자를 전달하는 데 또한 사용될 수 있다.
도 4a, 4b: 림프구-프로그래밍 나노입자의 설계 및 제조. (도 4a) 대표적인 T 세포-표적화된 IVT mRNA 나노입자의 개략도. 단순히 접촉만에 의해 (비-바이러스 형질주입 방법에 대한 악명높은 불응성인) 일차 T 림프구를 유전적으로 변형시킬 수 있는 시약을 만들기 위해, 중합체성 나노입자를 다음과 같은 4 가지 기능적 구성요소를 포함하여 생체조작하였다:
(i) 나노입자를 T 세포에 선택적으로 결합시키고 이들을 내재화시키기 위해 신속한 수용체-유도된 내포작용을 개시하는 표면-고정된 표적화 리간드. 대표적인 실험에서, 항-CD8 결합 도메인이 사용됨;
(ii) 나노입자의 표면 전하를 감소시킴으로써 표적-외 결합을 최소화하기 위해 나노입자를 차폐하는 음으로-하전된 코팅. 폴리글루탐산 (PGA)은 대표적인 실험에서 이를 달성하기 위해 사용됨;
(iii) 핵산이 엔도솜에 있는 동안 핵산을 응축하고 효소 분해로부터 보호하지만 입자가 세포질로 수송되면 이들을 방출하여, 코딩된 단백질의 전사를 가능하게 하는 담체 매트릭스. 이 표현을 위해, 수성 조건에서 1 내지 7 시간의 반감기를 갖는 생분해가능한 폴리(β-아미노 에스테르) (PBAE) 중합체 제형이 사용됨; 및
(iv) 담체 내에 캡슐화되고 예를 들어, 질환-특이적 CAR 또는 TCR의 발현을 생산하는 핵산 (예컨대, IVT mRNA).
(도 4b) 나노입자가 어떻게 제작되는 지를 기술하는 다이어그램. 동결건조 및 수화 단계는 옵션이다.
도 5a-5j: IVT mRNA 나노입자는 인간 T세포를 CAR- 또는 TCR 코딩 핵산으로 효율적으로 형질주입시킨다. 단리된 인간 CD8+ T 세포를 TCR/CD3 및 공동-자극성 CD28 수용체에 대한 항체로 코팅된 비드로 자극하였다. 24 h 후, 비드를 제거하고 백혈병-특이적 1928z CAR (도 5a-5e) 또는 HB코어18-27 TCR (도 5f-5j)을 코딩하는 mRNA를 함유하는 CD8-표적화된 NP를 3 μg의 mRNA/106 개의 세포의 농도로 세포 현탁액에 혼합하였다. (도 5a) T 세포가 1928z CAR 나노입자에 노출된 후 시간 경과에 따른 상대적 1928z CAR mRNA 발현의 qPCR 측정. (도 5b) mRNA를 코딩하는 1928z CAR을 보유하는 나노입자와 함께 항온처리한 후 표시된 시점에서 T 세포의 유세포 분석. (도 5c) 시험관 내 캡슐화된 핵산 전달 효율의 요약 플롯. (도 5d) Raji 림프종 세포에 대한 나노입자- 대 레트로바이러스-형질주입된 T 세포의 세포독성을 비교하는 시험관 내 검정. IncuCyte 생세포 분석 시스템을 사용하여 시간 경과에 따른 1928z CAR-형질주입된 T 세포에 의한 Raji NucLight Red 세포의 면역 세포 사멸을 정량화하였다. 데이터는 2 개의 독립적인 실험을 나타낸다. 각각의 포인트는 평균 ± s.e.m을 나타낸다. 3 회씩 수행된 2 개의 독립적인 실험으로부터 풀링되었다. (도 5e) 형질주입된 세포에 의한 IL-2 (24 h에서) 및 TNF-α 및 IFN-γ (48 h에서) 분비의 ELISA 측정. (도 5f) T 세포가 HB코어18-27 TCR 나노입자에 노출된 후 시간 경과에 따른 상대적 HB코어18-27 TCR mRNA 발현의 qPCR 측정. (도 5g, 5h) 캡슐화된 핵산 전달 효율 (도 5i) 시간 경과에 따른 HB코어18-27 TCR-형질주입된 T 세포에 의한 HepG2-코어 NucLight Red 세포의 세포 사멸 (도 5j) 형질주입된 세포에 의한 사이토카인 분비의 ELISA 측정.
도 6a-6e: 나노입자-프로그래밍된 CAR 림프구는 입양 T-세포 요법과 유사한 효능으로 백혈병 퇴행을 유발한다. (도 6a) 타임 라인 및 나노입자 투여 양생법. (도 6b) NSG 마우스에 전신 주사된 반딧불이 루시퍼라제-발현 Raji 림프종 세포의 순차적인 바이오이미징. 각각의 코호트 (n = 10)로부터 5 개의 대표적인 마우스가 도시된다. (도 6c) Kaplan-Meier 곡선으로 묘사된 요법 후 동물의 생존. 3 개의 독립적인 실험으로부터 풀링된 처리군 당 10 마리의 마우스가 도시된다. ms, 중앙값 생존. 처리된 실험군과 처리되지 않은 대조군 사이의 통계적 분석은 로그-순위 테스트를 사용하여 수행된다; P < 0.05는 유의한 것으로 간주된다. (도 6d) 1928z CAR을 코딩하는 IVT mRNA를 전달하는 나노입자의 주사 전후의 말초 T 세포의 유세포 분석. 여기에 도시된 각각의 시점에 대한 3 가지 프로파일은 군 당 10 마리의 마우스로 이루어진 2 개의 독립적인 실험을 대표한다. (도 6e) 1928z CAR 나노입자의 반복 주입 후 CAR-형질주입된 CD8+ T 세포의 백분율을 표시하는 개요 그래프. 선 마다 한 마리의 동물을 나타낸다. 2 개의 독립적인 실험으로부터 풀링된 10 마리의 동물이 도시된다.
도 7a-7g: 전립선 종양-특이적 CAR을 코딩하는 IVT-mRNA 나노입자는 확립된 질환을 갖는 마우스의 생존을 개선한다. (도 7a) 항원 발현의 다양성을 보여주는 140 개의 전립선암 전이 패널에 걸친 PSCA, PSMA 및 ROR1 항원 발현의 히트 맵. (도 7b) LNCap C42 전립선 암종 세포에 의한 PSCA, PSMA 및 ROR1 발현의 가변성을 보여주는 유세포 분석 데이터의 히트 맵 표현. 색상은 350 개의 무작위적으로-선택된 세포의 발현 수준을 나타낸다. (도 7c) 이식-3 주 후, LNCap C42 전립선 종양은 생체 내 생체발광 이미징에 의해 시각화된다. 전립선의 등쪽 엽에 확립된 종양 (흰색 화살표)의 대표적인 사진이 오른쪽에 도시된다. (도 7d) NGS 마우스의 전립선에 동소 이식된 반딧불이 루시퍼라제-발현 LNCaP C42 전립선 암종 세포의 순차적인 바이오이미징. 각각의 코호트 (n = 8)로부터 4 개의 대표적인 마우스가 도시된다. (도 7e) 타임 라인 및 나노입자 투여 양생법. (도 7f) Kaplan-Meier 곡선으로 묘사된 요법 후 동물의 생존. 3 개의 독립적인 실험으로부터 풀링된 처리군 당 8 마리의 마우스가 도시된다. ms, 중앙값 생존. 처리된 실험군과 처리되지 않은 대조군 사이의 통계적 분석은 로그-순위 테스트를 사용하여 수행된다; P < 0.05는 유의한 것으로 간주된다. N.s., 유의하지 않음. (도 7g) CAR-T 세포 요법 또는 ROR1 4-1BBz CAR NP 요법 후 LNCaP C42 전립선 종양 세포에서 ROR1 항원 발현의 유세포 분석 정량화. 5 개의 종양으로부터 풀링된 350 개의 무작위적으로-선택된 세포가 도시된다.
도 8: 실시예 2에 기술된 골수성 및 림프성 면역표현형 패널에 사용된 항체 목록.
도 9a-9k: IRF5 및 IKKβ를 코딩하는 mRNA를 운반하는 나노입자는 전-염증성 M1-유사 표현형을 각인할 수 있다. (도 9a) 대식세포 분극화의 주요 조절자를 코딩하는 mRNA로 제형화된 대식세포-표적화된 중합체성 NP의 설계. 입자는 PGA-디-만노스 층으로 코팅된 PbAE-mRNA 폴리플렉스 코어로 이루어지며, 이는 입자를 M2-유사 대식세포에 의해 발현되는 만노스 수용체 (CD206)에 대해 표적화시킨다. 또한 재프로그래밍 전사 인자를 코딩하도록 조작된, NP에 캡슐화된 합성 mRNA가 묘사된다. (도 9b) NP 집단 (스케일 바 200 nm) 및 단일 NP (삽도, 스케일 바 50 nm)의 투과 전자 현미경. (도 9c) NanoSight NS300 기기를 사용하여 측정한 NP의 크기 분포. (도 9d) NP는 1 h 노출 후 골수-유래된 대식세포 (BMDM)의 높은 형질주입 (46%)을 보여주었다. (도 9e) 나노입자 형질주입 24 시간 후 유세포 분석에 의해 측정된 골수 유래된 대식세포 (BMDM)로의 유전자-전달 효율. (도 9f) NP 형질주입된 및 형질주입되지 않은 대식세포의 상대적 생존가능성 (Annexin V 및 PI로 염색함으로써 평가됨). N.s.; 유의하지 않음. (도 9g) qRT-PCR에 의해 측정된 코돈-최적화된 IRF5 mRNA (청색, 왼쪽 Y 축) 및 내인성 IRF5 mRNA (흑색, 오른쪽 Y 축)의 발현 역동학, 각각의 시점에 대해 n=3. (도 9h) 도 9i-9k에 사용된 BMDM에 대한 NP 형질주입 프로토콜 및 배양 조건을 나타내는 타임라인. (도 9i) MPLA에 대한 톨-유사 수용체 6으로 자극된 시그니처 M1 세포와 비교한 IRF5/IKKβ NP-형질주입된 대식세포의 유전자 발현 프로파일. 결과는 유전자 발현의 배수 변화 분포를 보여주는 Volcano 플롯으로서 묘사된다. M1 시그니처 유전자가 표시된다. IRF5/IKKβ NP-형질주입된 대식세포와 M1 시그니처 유전자 세트 사이의 중첩 P 값은 GSEA에 의해 결정된다. (도 9j) IL-4에서 배양된 대식세포 대 IL-4에서 배양되고 IRF5/IKKβ NP로 형질주입된 세포에서의 M1 시그니처 유전자 발현의 히트 맵. (도 9k) 표시된 유전자에 대한 평균 계수 및 S.E.M을 나타내는 상자 플롯.
도 10a-10j: IRF5 및 IKKβ 유전자를 대식세포에 전달하는 mRNA 나노담체의 반복된 복막 내 주사는 파종된 난소암을 갖는 마우스의 평균 생존을 2 배 초과로 증가시켰다. (도 10a) 타임 라인 및 투여 양생법. 화살표는 I.P. 주사의 시간을 표시한다. (도 10b) 대조군 및 처리된 마우스에서 종양 성장의 순차적인 생체발광 이미징. (도 10c) 처리된 마우스 대 대조군 마우스에 대한 Kaplan-Meier 생존 곡선. 로그-순위 테스트를 사용하여 통계적 분석을 수행하였다. (도 10d) 대조군으로서 GFP mRNA를 운반하는 D-만노스-코팅된 NP의 단일 i.p. 용량의 48 시간 후 상이한 면역 세포 하위집단에서 생체 내 형질주입 속도의 유세포 분석 정량화: 대식세포 (CD45+, CD11b+, MHCII+, CD11c, Ly6C-/저, Ly6G-), 단핵구 (CD45+, CD11b+, MHCII+, CD11c-, Ly6C+, Ly6G-), 호중구 (CD45+, CD11b+, MHCII+, CD11c-, Ly6G+), CD4+ T 세포 (CD45+, TCR-β 쇄+, CD4+, CD8), CD8+ T 세포 (CD45+, TCR-β 쇄+, CD4-, CD8+) 및 자연 살해 (NK) 세포 (CD45+, TCR-β 쇄, CD49b+)를 측정하였다. (도 10e) 파종된 ID8 난소암을 갖는 마우스의 복막에서 대식세포 표현형의 유세포 분석. 동물을 IRF5/IKKβ NP 또는 PBS의 4 회 용량으로 처리하였다. (도 10f) Ly6C-, F4/80+ 및 CD206+ (M2-유사) 대식세포의 상대적 백분율 (왼쪽 패널) 및 절대적 수 (오른쪽 패널)를 요약한 상자 플롯. (도 10g) Ly6C-, F4/80+ 및 CD206-(M1-유사) 대식세포에 해당하는 수. (도 10h) PBS 대조군 (상단 패널) 또는 IRF5/IKKβ NP-처리된 동물 (하단 패널; 스케일 바 100 μm)로부터 단리된 난소 종양-침윤된 장간막의 대표적인 헤마톡실린 및 에오신-염색된 섹션. 대표적인 악성 병변의 10-배 배율이 오른쪽에 도시된다 (스케일 바 50 μm). (도 10i) 각각의 처리군으로부터 단리된 복막 대식세포에 의해 생성된 사이토카인을 측정하는 Luminex 검정. CD11b+, F4/80+ 복막 대식세포를 형광 활성화된 세포 분류에 의해 단리하고 생체 외에서 배양하였다. 24 시간 후, 세포 배양 상청액을 수집하였다. 병행 실험에서, FACS-분류된 CD11b+, F4/80+ 복막 대식세포를 pRT-PCR로 직접 분석하여 대식세포 표현형 (SerpinB2, Retnla, Ccl11 및 Ccl5)의 4 가지 마스터 조절자의 발현 수준을 결정하였다. 결과는 도 10j에서 상자 플롯으로서 요약된다.
도 11a-11f: 대식세포-프로그래밍 mRNA 나노담체는 대단히 생체에 적합성이며 반복 투여에 안전하다. (도 11a) i.p. 투여 후 대식세포-표적화된 IRF5/IKKβ NP의 생체 내 생체분포. NP-전달된 (코돈 최적화된) mRNA는 50 μg mRNA를 함유하는 입자의 단일 주사 24 시간 후에 qPCR에 의해 검출되었다. (도 11b) 실험적 타임라인의 도식적 표현. *마지막 용량 24 시간 후, 마우스를 CO2 흡입에 의해 안락사시켰다. 혈청 화학 및 완전한 혈구 계수를 위해 혈액을 헤파린 코팅된 튜브로 안구-뒤 출혈을 통해 수집하였다. 부검은 간, 비장, 췌장, 장간막 및 대망, 위 및 방광의 조직학적 분석을 위해 수행되었다. (도 11c) 대조군 또는 NP-처리된 동물로부터 단리된 다양한 기관의 대표적인 헤마톡실린 및 에오신-염색된 섹션. 스케일 바, 100 μm. NP-처리된 동물에서 발견된 병변은 비교 병리학자의 분석을 기반으로 여기에 도시되고 기술된다. 각각의 번호가 매겨진 이미지에 대한 관련 결과는 다음과 같다: [1] 주로 약간의 과립구와 혼합된 단핵 세포로 구성된 세포 침윤물의 개별 초점; 경미한 골수 외 조혈. [2] 국소적으로 광범위한 약간의 영역에서, 간세포는 경도 내지 중등도로 부어 있다. [3] 적색 속질 내 중등도의 골수성 (우세), 적혈구 및 거핵구 과형성. [4] 백색 속질의 경도의 저세포성. [5] 장간막 내부에는 대식세포, 림프구, 형질 세포 및 과립구의 중등도의 다초점 침윤물이 있다. [6] 림프구, 형질 세포 및 과립구와 혼합된 대식세포의 경도 내지 중등도의 침윤물; 선포 및 선포 손실의 경미한 해리; 선포 세포로부터 자이모겐 과립의 경도의 확산 손실. [7] 지방 조직 주변의 대식세포와 혼합된 림프구의 밀도가 높은 응집체. [8] 위 점막 내의 주세포 및 벽세포의 경도의 다초점 액포 변성. (도 11d) 혈청 화학 및 혈구 계수. (도 11e, 11f) IRF5/IKKβ NP의 단일 i.p. 주사 4 또는 8 일 후 혈청 IL-6 (도 11e) 및 TNF-α (도 11f) 사이토카인의 Luminex 검정 측정.
도 12a-12i: 정맥으로 주입된 IRF5/IKKβ 나노입자는 폐에서 종양 전이를 제어할 수 있다. (도 12a) i.v. 투여 후 대식세포-표적화된 IRF5/IKKβ NP의 생체 내 생체분포. 코돈-최적화된 mRNA는 50 μg mRNA를 함유하는 입자의 단일 i.v. 투여 24 시간 후 qPCR에 의해 측정되었다. (도 12b-12h) C57BL/6 알비노 마우스에 1x106 개의 B16F10 반딧불이 루시퍼라제-발현 흑색종 세포를 꼬리 정맥을 통해 주사하여 폐 전이를 확립하였다. 7 일 후, 동물을 IRF5/IKKβ NP 처리군, 대조군 GFP NP 군 또는 PBS 대조군에 무작위로 할당하였다. (도 12b) 타임 라인 및 투여 양생법. (도 12c) 건강한 폐 (왼쪽 패널) 및 B16F10 종양-침윤된 폐 (오른쪽 패널)의 공초점 현미경. 침윤하는 대식세포 군집은 녹색으로 형광을 발한다. (도 12d) 순차적인 생체발광 종양 이미징. (도 12e) 각각의 처리군에 대한 Kaplan-Meier 생존 곡선. ms는 중앙값 생존을 나타낸다. 통계적 분석은 로그-순위 테스트를 사용하여 수행하였으며, P<0.05는 유의한 것으로 간주하였다. (도 12f) 치료 2 주 후 각각의 군을 나타내는 B16F10 흑색종 전이를 함유하는 폐의 대표적인 사진 (상단 열) 및 현미경사진. (도 12g) 폐 종양 초점 계수. (도 12h) 각각의 처리군의 기관지폐포 세정에서 단핵구/대식세포 집단의 표현형 특성화. (도 12i) 억압하는 대식세포 및 활성화된 대식세포의 상대적 백분율 요약.
도 13a13f: 대식세포 재프로그래밍은 신경교종에서 방사선요법의 결과를 개선한다. (도 13a) 유도 후 21 일에 RCAS-PDGF-B/Nestin-Tv-a; Ink4a/Arf-/-; Pten-/- 트랜스제닉 마우스에서 PDGFβ-구동된 신경교종의 개시 후 T2 MRI 스캔 및 조직학적 염색. (도 13b) 신경교종 마진에 침윤하는 CD68+ TAM의 공초점 현미경. 스케일 바 300μm. (도 13c) 건강한 뇌 조직 대 신경교종에서 대식세포 (F4/80+, CD11b+) 집단의 유세포 분석. (도 13d, 13e) 단일요법 (도 13d)으로서 또는 뇌종양 방사선요법과 병용된 (도 13e) IRF5/IKKβ 치료를 받은 확립된 신경교종이 있는 마우스의 Kaplan-Meier 생존 곡선. 타임 라인 및 투여 양생법이 상단에 도시된다. Ms, 중앙값 생존. 통계적 분석은 로그-순위 테스트를 사용하였으며, P<0.05는 통계적으로 유의한 것으로 간주된다. (도 13f) 종양 진행의 순차적인 생체발광 이미징.
도 14a-14e: 인간 IRF5/IKKβ를 코딩하는 IVT mRNA-운반 나노입자는 인간 대식세포를 효율적으로 재프로그래밍한다. (도 14a) 인간 THP-1 단핵구 세포주를 억압성 M2-유사 대식세포로 분화시키기 위한 타임 라인 및 배양 조건. (도 14b) 24 개의 웰에서 배양되고, 대조군 GFP mRNA에 비해 인간 IRF5/IKKβ mRNA를 운반하는 NP의 표시된 농도로 형질주입된 M2-분화된 THP1-Lucia 세포의 생체발광 이미징. IRF-유도된 Lucia 루시퍼라제의 수준은 Quanti-Luc를 사용하여 형질주입 24 시간 후에 결정되었다. (도 14c) 생체발광 계수 요약. (도 14d, 14e) IL-1β 사이토카인 분비 (도 14d) 및 M1-대식세포 마커 CD80의 표면 발현 (도 14e)의 상이함.
도 15. 예시적인 지지 서열: 서열번호 1: 항-인간 1928z CAR; 서열번호 2: 항-인간 ROR1 CAR; 서열번호 3: HBV-특이적 TCR; 서열번호 4: 항-인간 1928z CAR; 서열번호 5: 항-인간 ROR1 (4-1BBz) CAR; 서열번호 6: 항-HBV-특이적 TCR (HB코어18-27); 서열번호 7: 항-CD19 scFv (VH-VL) FMC63; 서열번호 8: 항-CD19 scFv (VH-VL) FMC63; 서열번호 9: CD28 이펙터 도메인; 서열번호 10: P28z CAR; 서열번호 11: IgG4-Fc; 서열번호 12: 힌지-CH2-CH3; 서열번호 13: 힌지-CH3; 서열번호 14: 힌지만; 서열번호 15: CD28 막관통 도메인; 서열번호 16: CD28 세포질 도메인 (LL에서 GG로); 서열번호 17: 4-1BB 세포질 도메인; 서열번호 18: CD3-ζ 세포질 도메인; 서열번호 19: T2A; 서열번호 20: tEGFR; 서열번호 21: Strep tag II; 서열번호 22: Myc 태그; 서열번호 23: V5 태그; 서열번호 24: FLAG 태그; 서열번호 25: 인간 IRF5 아이소폼 1 (UniProt 수탁 Q13568-1); 서열번호 26: 인간 IRF5 아이소폼 2 (UniProt 수탁 Q13568-2); 서열번호 27: 인간 IRF5 아이소폼 3 (UniProt 수탁 Q13568-3); 서열번호 28: 인간 IRF5 아이소폼 4 (UniProt 수탁 Q13568-4); 서열번호 29: 인간 IRF5 아이소폼 5 (UniProt 수탁 Q13568-5); 서열번호 30: 인간 IRF5 아이소폼 6 (UniProt 수탁 Q13568-6); 서열번호 31: 뮤린 IRF5 단백질 (pI=5.19, Mw = 56005, UniProt 수탁 P56477); 서열번호 32: 인간 IRF1 (UniProt 수탁 P10914); 서열번호 33: 인간 IRF3 아이소폼 1 (UniProt 수탁 Q14653-1); 서열번호 34: 인간 IRF7 아이소폼 A (UniProt 수탁 Q92985-1); 서열번호 35: 인간 IRF8 (UniProt 수탁 Q02556); 서열번호 36: 뮤린 IRF1 (UniProt 수탁 P15314); 서열번호 37: 뮤린 IRF3 (UniProt 수탁 P70671); 서열번호 38: 뮤린 IRF7 (UniProt 수탁 P70434); 서열번호 39: 뮤린 IRF7/IRF3 5(D) 단백질 (pI=4.72, MW = 58456); 서열번호 40: 뮤린 IRF8 (UniProt 수탁 P23611); 서열번호 41: 뮤린 IRF8 (K310R) 단백질 (pI=6.38, MW = 48265); 서열번호 42: 인간 IKKβ 아이소폼 1 (UniProt 수탁 O14920-1); 서열번호 43: 인간 IKKβ 아이소폼 2 (UniProt 수탁 O14920-2); 서열번호 44: 인간 IKKβ 아이소폼 3 (UniProt 수탁 O14920-3); 서열번호 45: 인간 IKKβ 아이소폼 4 (UniProt 수탁 O14920-4); 서열번호 46: 뮤린 IKK β 단백질 (pI=6.20, MW=84387.61, GenBank 수탁 번호 NP_034676.1); 서열번호 47: 인간 IRF5 아이소폼 1 cds; 서열번호 48: 인간 IRF5 아이소폼 2 cds; 서열번호 49: 인간 IRF5 아이소폼 3 cds (GenBank 수탁 U51127); 서열번호 50: 인간 IRF5 아이소폼 4 cds (GenBank 수탁 번호 AY504946 또는 AY504947); 서열번호 51: 인간 IRF5 아이소폼 5 cds; 서열번호 52: 인간 IRF5 아이소폼 6 cds; 서열번호 53: 뮤린 IF5 cds (1494nt); 서열번호 54: 인간 IRF1 cds; 서열번호 55: 인간 IRF3 아이소폼 1 cds (NM_001571.5); 서열번호 56: 인간 IRF7 아이소폼 A cds (NM_001572.3); 서열번호 57: 인간 IRF8 cds; 서열번호 58: 뮤린 IRF1 cds (NM_001159396.1); 서열번호 59: 뮤린 IRF3 cds (NM_016849.4); 서열번호 60: 뮤린 IRF7 cds (NM_016850.3); 서열번호 61: 뮤린 IRF-7/IRF-3 5(D) cds (1578 nt); 서열번호 62: 뮤린 IRF8 cds; 서열번호 63: 뮤린 IRF8 K310R cds (1275 nt); 서열번호 64: 인간 IKKβ 아이소폼 1 cds; 서열번호 65: 인간 IKKβ 아이소폼 2 cds; 서열번호 66: 인간 IKKβ 아이소폼 3 cds; 서열번호 67: 인간 IKKβ 아이소폼 4 cds; 서열번호 68: 뮤린 IKKβ cds (2217 nt).
성공적인 유전자 요법은 선택된 관심 세포로의 성공적인 유전자 전달 메커니즘에 달려있다.
본 개시내용은 평균적으로 7 일 동안 지속되는 하나 이상의 핵산의 발현을 제공함으로써 치료적 목적을 달성하기 위해 세포를 신속하고 선택적으로 변형시키는 조성물 및 방법을 제공한다. 일부 경우에 있어서, 핵산 또는 단백질의 일시적인 발현이 발생한다. 일시적인 발현은 임의로 조성물의 하나 이상의 반복 적용을 통해 연장될 수 있어, 중첩될 수 있거나 중첩되지 않을 수 있는 반복된 (연속적인) 발현 기간을 제공한다. 원하는 치료적 효과(들)를 달성하기 위해 일시적인 발현만이 필요하기 때문에, 지속적인 부작용 및/또는 시간 경과에 따른 감소된 치료적 단백질 발현에 대한 우려가 극복된다.
일부 실시양태에 있어서, 본원에 개시된 조성물 및 방법은 입양 세포 요법에 의해 투여되는 생체 외 형질도입된 세포만큼 크거나 그 보다 더 큰 생체 내 치료적 효능을 입증한다. 유리하게는, 개시내용의 조성물 및 방법은 나노입자를 대상체에 투여한 후 치료적 단백질을 발현하는 생체 내 T 세포의 적어도 20%, 적어도 30%, 적어도 40%, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80% 또는 적어도 90%을 달성하고/하거나; 대상체의 적어도 20%, 적어도 30%, 적어도 40%, 적어도 50%, 적어도 60% 또는 적어도 70%의 암 박멸을 초래하고/하거나; 재발성 대상체의 생존에서 평균 적어도 10 일, 적어도 15 일, 적어도 20 일, 적어도 25 일, 적어도 30 일, 적어도 35 일 또는 적어도 37 일의 개선을 초래하고/하거나; 생체 외에서 나노담체와 접촉된 T 세포의 이식과 적어도 대략 동일한 효능을 초래하고/하거나; 생체 외에서 형질도입된 CAR+ T 세포의 이식과 적어도 대략 동일한 효능을 초래한다.
본원에서 구체적으로 고려되는 것은 환자에 대한 나노입자 조성물의 반복된 전달을 포함하는 실시양태이며, 여기서 나노입자는 환자 내에서 선택된 세포를 표적화하고 선택된 세포에 의한 치료적 단백질의 일시적 발현을 초래한다. 특정 실시양태에 있어서, 반복된 전달은 5-10 일마다 (예컨대, 7 일마다) 발생한다.
정의
본원에 사용된 바와 같이, "나노입자" 및 "나노담체"는 상호교환적으로 사용되며 일반적으로 "카고"로 칭하는 또 다른 물질, 예컨대, 단백질, 폴리뉴클레오티드 또는 약물의 수송을 위한 모듈을 지칭한다. 보통 사용되는 나노담체는 미셀, 중합체, 탄소-기반 재료, 리포솜 및 기타 물질을 포함한다. 본 개시내용의 나노담체는 일반적으로 적어도 양으로-하전된 담체 매트릭스 및 중성으로 또는 음으로-하전된 코팅을 포함한다. 코팅은 임의로 개재된 중간 층을 포함하거나 포함하지 않고 담체 매트릭스의 외부 표면 상에 있다. 카고는 일반적으로 치료적 단백질 (예컨대, 키메라 항원 수용체 (CAR), T 세포 수용체 (TCR), CAR/TCR 하이브리드, 세포 수용체, 전사 인자, 대식세포 활성화제 또는 시그널링 분자, 또는 치료적 폴리뉴클레오티드 (예컨대, mRNA, shRNA, gRNA 또는 sgRNA)를 코딩하는 폴리뉴클레이티드이다.
본원에 사용된 바와 같이, 나노담체의 "코팅"은 나노담체의 최외각 층을 지칭하지만, 세포 표적화 리간드는 코팅의 일부를 차폐할 수 있다. 코팅은 중성의 또는 음으로-하전된 코팅, 예컨대, 음으로-하전된 폴리글루탐산 (PGA), 폴리(아크릴산), 알긴산 또는 콜레스테릴 헤미석시네이트/1,2-디올레오일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민 또는 중성으로-하전된 쯔비터이온성 중합체를 포함할 수 있다.
본 명세서에서 사용된 바와 같이, "담체 매트릭스"는 코팅 및 임의의 중간 층을 제외하고, 카고의 나노담체로의 혼입을 매개하는 나노담체의 구성성분을 지칭한다. 일반적으로, 카고가 폴리뉴클레오티드인 경우, 담체 매트릭스는 양으로-하전된 담체 매트릭스이며, 이는 폴리뉴클레오티드가 음으로 하전되었기 때문에 폴리뉴클레오티드의 담체로의 혼입에 적합하다. 지질 또는 중합체는 양으로-하전된 폴리(β-아미노 에스테르, 폴리(L-리신), 폴리(에틸렌 이민) (PEI), 폴리-(아미도아민) 덴드리머 (PAMAM), 폴리(아민-코-에스테르), 폴리(디메틸아미노에틸 메타크릴레이트) (PDMAEMA), 키토산, 폴리-(L-락티드-코-L-리신), 폴리[α-(4-아미노부틸)-L-글리콜산] (PAGA) 또는 폴리(4-하이드록시-L-프롤린 에스테르) (PHP), 이들의 조합; 또는 등가물일 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이, "코팅의 표면으로부터 연장"은 리간드가 직접 또는 간접적으로 코팅에 부착되고, 리간드와 이의 표적의 상호작용을 허용하기에 충분한 거리만큼 코팅으로부터 멀리 연장됨을 의미한다. 부착은 화학적 커플링, 지질-결합 구성성분의 리간드로의 혼입 (예컨대, 리간드의 단백질의 막관통 도메인에 대한 유전자-융합), 전하-전하 상호작용 또는 다른 수단에 의해 달성될 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이, "선택된 세포"는 나노담체의 제작자 또는 사용자에 의해 나노담체 조성물의 표적으로서 선택된 세포 또는 세포 유형을 지칭한다. 예를 들어, 선택된 세포는 면역 세포, 예컨대, T 세포, B 세포 또는 NK 세포일 수 있다. 선택된 세포는 또한 전술한 것, 예컨대, CD4+ T 세포, CD8+ T 세포, 또는 T 조절 세포의 서브세트일 수 있다. 일부 실시양태에서 다중 표적화 리간드가 다중 세포 마커에 의해 구별되는 세포에 대한 표적화를 달성하기 위해 사용되기 때문에, 선택된 세포는 전술한 것의 추가 서브세트일 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이, "질환-특이적 수용체"는 질환의 원인 물질 또는 질환의 지표와 관련된 생체분자에 특이적으로 결합하는 단백질을 지칭한다. 예를 들어, 암에 대한 질환-특이적 수용체는 암성 세포를 표지하고 예컨대, 암성 세포 상의 과발현에 의해 비-암성 세포와 구별하는 단백질을 포함한다. 감염성 질환에 대한 질환-특이적 수용체는 예를 들어, 감염원에 직접 특이적으로 결합하는 수용체 또는 감염된 세포 표면에 표시된 생체분자에 특이적으로 결합하는 수용체 (예컨대, 펩티드-MHC 복합체, 여기서 펩타이드는 감염원 특이적 펩티드임)를 포함할 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이, "선택적으로 혼입된"은 나노담체가 다른 세포에 혼입되는 것보다 더 빠른 속도로 또는 더 큰 최대 혼입량으로 선택된 세포에 혼입되는 것을 의미한다. "선택적으로 혼입된"은 나노담체가 선택한 세포 외의 세포로의 혼입보다 2-배, 3-배, 4-배, 5-배, 10-배, 100-배, 1,000-배 또는 그 이상 더 신속하게 또는 효과적으로 선택된 세포에 혼입됨을 의미할 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이, "선택적으로 결합하다"는 참조 분자에 대한 결합보다 적어도 2-배, 3-배, 4-배, 5-배, 10-배, 100-배, 1,000-배 또는 그 이상의 더 높은 친화도로 표적에 결합함을 의미한다.
본원에 사용된 바와 같이, "치료적 단백질을 발현하다"는 선택된 세포가 나노담체와 접촉하거나 나노담체가 대상체에 투여됨을 의미하고, 선택된 세포는 통상적인 방법, 예컨대, 겔 전기영동, 질량-분광법, 형광 현미경, 유세포 분석 및/또는 웨스턴 블롯팅에 의해 검출가능한 양으로 치료적 단백질을 발현함을 의미한다. 치료적 단백질이 선택된 세포에 의해 내인성으로 발현되는 경우, "치료적 단백질을 발현하다"는 접촉 또는 투여 단계가 선택된 세포에서 치료적 단백질 발현의 적어도 5%, 10%, 15%, 20% 또는 그 이상의 더 높은 증가를 초래함을 의미한다.
본원에 사용된 바와 같이, "HBV-유도된 간세포 암종"은 HBV에 의해 유발된 것으로 알려진 간세포 암종 또는 합리적인 판단으로 의료 전문가가 HBV에 의해 유발된 것으로 이해될 수 있는 간세포 암종을 지칭한다.
본원에 사용된 바와 같이, 암의 "박멸"은 완전 반응 (CR)을 지칭한다.
본원에 사용된 바와 같이, "대상체" 또는 "환자"는 상호교환적으로 사용된다. "대상체"는 임의의 포유동물을 포함한다. 포유동물은 예컨대, 인간 또는 적절한 비-인간 포유 동물, 예컨대, 영장류, 마우스, 랫트, 개, 고양이, 소, 말, 염소, 낙타, 양 또는 돼지일 수 있다. 대상체는 또한 조류 또는 가금류일 수 있다. 바람직하게는, 대상체는 인간이다. 대상체는 남성 또는 여성일 수 있다. 이를 필요로 하는 대상체는 병태, 예컨대, 예컨대, 자가면역 질환, 전염성 질환, 암 또는 전암성 병태가 있는 것으로서 이전에 진단되지 않았거나 식별되지 않은 대상체일 수 있다. 이를 필요로 하는 대상체는 암 또는 전암성 병태가 있는 것으로서 이전에 진단되었거나 식별된 대상체일 수 있다. 이를 필요로 하는 대상체는 또한 병태, 예컨대, 자가면역 질환, 전염성 질환, 암 또는 전암성 병태가 있는 (이로 고통받는) 대상체일 수 있다. 대안적으로, 이를 필요로 하는 대상체는 전체 집단에 비해 이러한 장애가 발생할 위험이 있는 대상체(즉, 전체 집단에 비해 이러한 장애가 발생할 성향이 있는 대상체)일 수 있다 .
임의로, 이를 필요로 하는 대상체는 병태에 대한 하나 이상의 치료적 개입을 이미 받았거나, 받고 있거나, 받을 것이다.
이를 필요로 하는 대상체는 가장 최근의 요법에서 불응성 병태, 예컨대, 불응성 암을 가질 수 있다. "불응성 암"은 이전에-투여된 치료에 반응하지 않는 암을 의미한다. 암은 치료 초기에 내성이 있을 수 있거나 치료 중 내성이 될 수 있다. 불응성 암은 또한 내성 암으로 불린다. 일부 실시양태에 있어서, 이를 필요로 하는 대상체는 가장 최근의 요법에서 관해 후 암 재발생을 갖는다. 일부 실시양태에 있어서, 이를 필요로 하는 대상체는 암 치료를 위한 공지된 모든 효과적인 요법을 받았으며 실패하였다. 일부 실시양태에 있어서, 이를 필요로 하는 대상체는 하나 이상의 사전 요법을 받았다.
본원에 사용된 바와 같이, "재발성 대상체"는 CR, 부분 반응 (PR), 관해, 또는 사전 치료 후 암의 재-발생이 뒤따르는 장기적인 관해를 입증한 대상체를 지칭한다.
본원에 사용된 바와 같이, "생체 외"는 대상체 또는 공여자의 신체 외부 세포에 대해 지시된 방법을 지칭한다.
본원에 사용된 바와 같이, "생체 내"는 대상체의 신체 중 세포에 대해 지시된 방법을 지칭한다.
본원에 사용된 바와 같이, "시험관 내"는 일차 세포보다는 배양에서 성장된 세포에 관한 방법을 지칭한다.
본원에 사용된 바와 같이, "세포 표적화 리간드" 또는 "선택된 세포 표적화 리간드"는 상호교환적으로 사용되며 (예컨대, 선택된 세포의 표면 상의 마커 단백질을 통해) 선택된 세포에 선택적으로 결합하는 생체분자 (예컨대, 단백질 또는 폴리뉴클레오티드)를 지칭한다. 일반적으로 세포 표적화 리간드는 생체 내에서 나노담체를 선택 세포에 선택적으로 표적화한다. 예시적인 세포 표적화 리간드는 항체 단편, 예컨대, 단일 쇄 가변 단편 (scFv), 조작된 리간드, 예컨대, 합리적으로 조작된 결합제, 소-분자 리간드 또는 압타머를 포함한다.
실시양태
특정 실시양태에 있어서, 일시적 발현은 12 시간 내지 15 일 동안; 18 시간 내지 12 일 동안; 20 시간 내지 14 일; 24 시간 내지 10 일, 24 시간 내지 8 일, 또는 30 시간 내지 7 일의 발현이다. 다양한 실시양태에서 일시적인 발현이 14 일 이하인 것이 구체적으로 고려된다. 예를 들어, 특정 실시양태에 있어서 일시적 발현은 12 일 이하, 10 일 이하, 9 일 이하, 8 일 이하 또는 7 일 이하로 지속되는 검출가능한 발현이다. 더 긴 발현을 원하는 경우의 실시양태에 있어서, 치료적 단백질의 일시적 발현을 제공하는 나노입자는 반복된 용량으로, 예를 들어, 5-10 일 마다 (예컨대, 7 일 마다) 발생하는 전달로 대상체에 전달될 수 있다.
특정 실시양태에 있어서, 대상체는 치료적 단백질의 발현에 대해 모니터링될 수 있고, 발현이 역치 미만으로 떨어지는 경우, 치료 의사는 치료적 단백질의 추가 발현을 초래하는 추가 나노입자가 정당한지 여부를 결정할 수 있다.
특정 실시양태에 있어서, 나노입자의 전달은 정맥 내 또는 선택된 해부학적 부위 (예컨대, 종양 부위)에서, 이에 또는 근처에 이루어질 수 있다.
특정 실시양태에 있어서, 나노입자의 전달은 치료 부위에서 세포 유인제의 사용으로 조정될 수 있다. 예를 들어, 대상체는 세포 유형을 해부학적 부위로 유인하는 약제를 투여받을 수 있다. 특정 실시양태에 있어서, 유인된 세포 유형은 핵산 또는 단백질, 예컨대, 치료적 단백질을 발현하기 위한 유전적 변형을 위해 표적화된 것과 동일한 세포 유형일 수 있다. 예를 들어, 해부학적 부위가 종양 부위인 경우, T 세포를 종양 부위로 유인한 다음, 유인된 T 세포를 변형시켜, 핵산 또는 단백질, 예컨대, 치료적 단백질, 예컨대, 키메라 항원 수용체 (CAR), T 세포 수용체 (TCR) 또는 CAR/TCR 하이브리드를 발현하는 것이 유익할 수 있다. 특정 실시양태에 있어서, 유인된 세포 유형은 핵산 또는 단백질, 예컨대, 치료적 단백질을 발현하기 위한 유전적 변형을 위해 표적화된 것과 상이한 세포 유형일 수 있다. 예를 들어, 해부학적 부위가 종양 부위인 경우, 종양 부위로, 치료적 단백질을 일시적으로 발현하도록 변형된 선택된 세포의 활성을 지지하는 세포를 유인하는 것이 유익할 수 있다. T 세포의 활성을 지지하는 세포는 T 세포 (예컨대, T 헬퍼), 자연 살해 (NK) 세포 및 대식세포의 서브세트를 포함할 수 있다. 특정 실시양태에 있어서, 하나 초과의 세포 유형을 해부학적 부위로 유인하는 것이 유익할 수 있다. 특정 실시양태에 있어서, 세포는 나노입자의 전달 전에 해부학적 부위로 유인될 수 있다 (예컨대, "사전컨디셔닝").
특정 실시양태에 있어서, 본원에 기재된 치료 프로토콜은 또한 치료 부위에서 대식세포를 활성화시키는 것을 포함할 수 있다. 예를 들어, 치료 부위에서 대식세포를 활성화시키는 것은 치료되는 대상체의 대식세포(들)의 종양 억압을 극복할 수 있다.
특정 실시양태에 있어서, 핵산 또는 단백질, 예컨대, 치료적 단백질을 발현하기 위해 생체 내에서 선택된 세포 유형을 유전적으로 변형시키는 데 이용되는 나노입자는 (1) 선택된 세포 표적화 리간드; (2) 양으로-하전된 담체; (3) 양으로-하전된 담체 내의 핵산; 및 (4) 중성의 또는 음으로-하전된 코팅을 포함한다.
개시된 나노입자가 세포의 비균질 혼합물 (예컨대, 생체 내 환경)에 첨가되는 경우, 조작된 나노입자는 선택된 세포 집단에 결합하고 수용체-매개 내포작용을 자극하고; 이 공정은 이들이 운반하는 핵산 (예컨대, 합성 mRNA)에 대한 진입을 제공하고, 결과적으로 선택된 세포는 코딩된 분자를 발현하기 시작한다 (도 1-3b). DNA보다는 mRNA가 사용되는 경우 핵 수송 및 트랜스진의 전사가 필요하지 않기 때문에, 이 공정은 일부 경우에 있어서 신속하고 효율적이다. 필요한 경우, 원하는 결과를 달성할 때까지 나노입자의 추가적인 적용을 수행할 수 있다. 특정 실시양태에 있어서, 나노입자는 생분해가능하고 생체적합성이다.
특정 실시양태에 있어서, 신속한은 코딩된 핵산의 발현이 본원에 개시된 나노입자에 대한 세포의 비균질 샘플의 노출 24 시간 이내에 또는 12 시간 이내에 선택된 세포 유형 내에서 시작됨을 의미한다. 이 타임라인은 표적된 세포 세포질로 방출되는 거의 즉시 (예컨대, 몇 분 이내에) 전사되기 시작하는 핵산, 예컨대, mRNA를 이용하여 가능하다.
특정 실시양태에 있어서, 효율적은 표적 세포 (예컨대, 일차 인간 T 세포)로의 캡슐화된 핵산 전달이 >80%이고 표현형 변형이 이들 세포의 80% 이상, 이들 세포의 90% 이상 또는 이들 세포의 100%에서 발생함을 의미한다. 특정 실시양태에 있어서, 효율적인 것은 표적 세포로의 캡슐화된 핵산 전달이 >80%이고 표현형 변형이 이들 세포의 25% 이상, 이들 세포의 33% 이상 또는 이들 세포의 50% 이상에서 발생함을 의미한다. 특정 실시양태에 있어서, 표현형 변형은 나노입자를 섭취하는 선택된 세포의 1/3에서 발생할 수 있으며, 여기서 전달된 핵산은 뉴클레아제를 코딩한다.
특정 실시양태에 있어서, 핵산은 치료적 단백질, 예컨대, CAR, TCR, CAR/TCR 하이브리드 또는 대식세포 활성화제를 발현하는 합성 mRNA를 포함한다. 특정 실시양태는 시험관 내 전사된 (IVT) mRNA (예컨대, Grudzien-Nogalska 등, Methods Mol. Biol. 969:55-72, 2013 참고), 자가-증폭 RNA (sa-RNA; Brito 등, Adv Genet. 89:179-233, 2015); 또는 폐쇄된-단부의 DNA (ceDNA; Li 등, PLoS One. 2013 Aug 1 (doi.org/10.1371/journal.pone.0069879)를 이용하여, 예를 들어, 백혈병-특이적 1928z CAR, B 형 간염 바이러스 (HBV) 코어 항원 특이적 HB코어18-27 TCR, 전립선 종양 특이적 항-ROR1 4-1BBz CAR, 또는 대식세포 활성화제를 일시적으로 발현시킨다.
개시내용의 추가적인 옵션 및 실시양태는 이제 다음과 같이 보다 상세하게 기재된다: (i) (a) CAR, TCR 및 CAR/TCR 하이브리드 및 (b) 대식세포 활성화제를 포함하는 치료적 단백질의 발현; (ii) 세포 유인제; (iii) 나노입자; (iv) 조성물; (v) 사용 방법; (vi) 키트; (vii) 예시적인 실시양태; 및 (viii) 실험적인 실시예.
(i) (a) CAR, TCR 및 CAR/TCR 하이브리드 및 (b) 대식세포 활성화제를 포함하는 치료적 단백질의 발현. 특정 실시양태에 있어서, 발현은 전달된 나노입자 내에서 핵산으로서 mRNA의 사용을 기반으로 한다.
특정 실시양태에 있어서, 핵산은 합성 mRNA를 포함한다. 특정 실시양태에 있어서, 합성 mRNA는 5'-캡핑을 사용하여 증가된 세포 내 안정성을 위해 조작된다. 다수 개의 구별되는 5'-캡 구조를 사용하여 합성 mRNA 분자의 5'-캡을 생성할 수 있다. 예를 들어, 항-역전사 캡 유사체 (ARCA) 캡은 5'-5'-트리포스페이트 구아닌-구아닌 연결을 함유하며, 여기서 하나의 구아닌은 N7 메틸기뿐만 아니라 3'-O-메틸기를 함유한다. 합성 mRNA 분자는 또한 5'-캡 구조의 생성을 담당하는 효소를 사용하여 전사-후 캡핑될 수 있다. 예를 들어, 재조합 백시니아 바이러스 캡핑 효소 및 재조합 2'-O-메틸트랜스퍼라제 효소는 mRNA의 5'-가장 많은 뉴클레오티드와 구아닌 뉴클레오티드 사이의 표준 5'-5'-트리포스페이트 연결을 생성할 수 있으며, 여기서 구아닌은 N7 메틸화를 함유하고 궁극적인 5'-뉴클레오티드는 Cap1 구조를 생성하는 2'-O-메틸을 함유한다. 이는 더 높은 번역-역량 및 세포 안정성을 갖는 캡을 초래하고 세포 전-염증성 사이토카인의 활성화를 감소시킨다.
합성 mRNA 또는 다른 핵산은 또한 사이클릭으로 만들어질 수 있다. 합성 mRNA는 사이클릭화되거나 연쇄화되어, 폴리-A 결합 단백질과 5'-단부 결합 단백질 간의 상호작용을 보조하는 번역 컴피턴트 분자를 생성할 수 있다. 사이클릭화 또는 연쇄화의 메커니즘은 다음의 3 개 이상의 상이한 경로를 통해 발생할 수 있다: 1) 화학적, 2) 효소적, 3) 촉매된 리보자임. 새로 형성된 5'-/3'-연결은 분자 내 또는 분자 간일 수 있다.
제1 경로에서, 핵산의 5'-단부 및 3'-단부는 서로 가까이 있는 경우 분자의 5'-단부와 3'-단부 사이에 새로운 공유 연결을 형성하는 화학적 반응성기를 함유할 수 있다. 5'-단부는 NHS-에스테르 반응성기를 함유할 수 있고 3'-단부는 3'-아미노-말단 뉴클레오티드를 함유할 수 있어, 유기 용매에서 합성 mRNA 분자의 3'-단부의 3'-아미노-말단 뉴클레오티드는 5'-NHS-에스테르 모이어티에서 친핵성 공격을 받아 새로운 5'-/3'-아미드 결합을 형성할 것이다.
제2 경로에서, T4 RNA 리가제를 사용하여 5'-인산화된 핵산 분자를 핵산의 3'-하이드록실기에 효소적으로 연결하여 새로운 포스포디에스테르 연결을 형성할 수 있다. 예시적인 반응에서, 핵산 분자의 1 μg은 제조사의 프로토콜에 따라 T4 RNA 리가제 (New England Biolabs, Ipswich, Mass.)의 1-10 유닛과 함께 1 시간 동안 37 ℃에서 항온처리될 수 있다. 결찰 반응은 효소 결찰 반응을 보조하기 위해 5'- 및 3'-영역 둘 모두를 병치하여 염기-쌍을 이룰 수 있는 분할된 올리고뉴클레오티드의 존재 하에 발생할 수 있다.
제3 경로에서, cDNA 주형의 5'- 또는 3'-단부는 리가제 리보자임 서열을 코딩하여, 시험관 내 전사 동안, 생성된 핵산 분자가 핵산 분자의 5'-단부를 핵산 분자의 3'-단부에 결찰시킬 수 있는 활성 리보자임 서열을 함유할 수 있다. 리가제 리보자임은 그룹 I 인트론, 그룹 I 인트론, 델타 간염 바이러스, 헤어핀 리보자임으로부터 유래하거나 SELEX (지수적 농축에 의한 리간드의 체계적 진화)에 의해 선택될 수 있다. 리보자임 리가제 반응은 0 내지 37 ℃의 온도에서 1 내지 24 시간이 소요될 수 있다.
이들 핵산 서열은 특정 실시양태에 있어서, 단백질로 번역되는 RNA 서열을 포함한다. 핵산 서열은 전장 핵산 서열뿐만 아니라 전장 단백질로부터 유래된 비-전장 서열 둘 모두를 포함한다. 서열은 또한 천연 서열의 축퇴성 코돈 또는 특이적 선택된 세포 유형에서 코돈 선호도를 제공하기 위해 도입될 수 있는 서열을 포함할 수 있다. 치료적 단백질을 코딩하는 유전자 서열은 공개적으로 이용가능한 데이터베이스 및 공개물에서 이용가능하다. 본원에 사용된 바와 같이, 용어 "코딩"은 치료적 단백질의 합성을 위한 주형으로서 역할을 하는 핵산, 예컨대, 플라스미드, 유전자, cDNA, mRNA의 서열의 특성을 지칭한다.
지시된 바와 같이, 핵산은 유전적으로 변형된 세포에 의한 치료적 단백질의 발현을 구동하는 데 사용되며, 특정 실시양태에 있어서 치료적 단백질은 CAR, TCR, CAR/TCR 하이브리드 또는 대식세포 활성화제를 포함한다.
(a) CAR, TCR 및 CAR/TCR 하이브리드. CAR은 적어도 결합 도메인 및 이펙터 도메인, 및 임의로 스페이서 도메인 및/또는 막관통 도메인을 포함하는 합성적으로 설계된 수용체를 지칭한다. 특정 실시양태에 있어서, CAR은 하기 정의된 자극 분자로부터 유래된 기능적 시그널링 도메인을 포함하는 scFv, 막관통 도메인 및 세포질 시그널링 도메인 (본원에 "세포 내 시그널링 도메인"으로서 또한 지칭됨) 형태의 세포 외 항원 결합 도메인을 포함하는 재조합 폴리펩티드를 지칭한다. 특정 실시양태에 있어서, CAR의 중심 세포 내 시그널링 도메인은 일반적으로 TCR 복합체와 연관된 것으로 발견되는 CD3 제타 쇄로부터 유래된다. 하기 보다 명세하게 기재되는 바와 같이, CD3 제타 시그널링 도메인은 하나 이상의 공동-자극 분자, 예컨대, 4-1BB (즉, CD137), CD27 및/또는 CD28로부터 유래된 하나 이상의 기능적 시그널링 도메인과 융합될 수 있다. 본 개시내용의 방법 및 조성물에서 유용한 예시적인 CAR 및 CAR 아키텍처는 WO2012138475A1, US9624306B2, US9266960B2, US2017017477, EP2694549B1, US20170283504, US20170281766, US20170283500, US20180086846, US20100105136, US20100105136, WO2012079000, WO2008045437, WO2016139487A1, 및 WO2014039523에 의해 제공된 것들을 포함하며, 이들 각각은 그 전체가 본원에 원용된다.
TCR은 자연 발생 T 세포 수용체를 지칭한다. CAR/TCR 하이브리드는 TCR의 요소 및 CAR의 요소를 갖는 단백질을 지칭한다. 예를 들어, CAR/TCR 하이브리드는 TCR 결합 도메인이 자연적으로 회합되지 않은 이펙터 도메인과 함께 자연 발생 TCR 결합 도메인을 가질 수 있다. CAR/TCR 하이브리드는 돌연변이된 TCR 결합 도메인 및 ITAM 시그널링 도메인을 가질 수 있다. CAR/TCR 하이브리드는 삽입된 비-자연 발생 스페이서 영역 또는 막관통 도메인을 갖는 자연 발생 TCR을 가질 수 있다.
특정 CAR/TCR 하이브리드는 TRuC® (T 세포 수용체 융합 작제물) 하이브리드; TCR2 Therapeutics, Cambridge, MA]. 예로써, TCR 융합 단백질의 생산은 국제 특허 공개공보 WO 2018/026953 및 WO 2018/067993 및 출원 공개공보 US 2017/0166622에 기재되어 있으며, 이들 각각은 그 전체가 본원에 참고로 원용된다.
특정 실시양태에 있어서, CAR/TCR 하이브리드는 "T-세포 수용체 (TCR) 융합 단백질" 또는 "TFP"를 포함한다. TFP는 일반적으로 i) 표적 세포 상의 표면 항원에 결합할 수 있고 ii) 전형적으로 T-세포의 표면에 또는 이의 표면 상에 공동-위치되는 경우 온전한 TCR 복합체의 다른 폴리펩티드 구성요소와 상호작용할 수 있는 TCR을 포함하는 다양한 폴리펩티드로부터 유래된 재조합 폴리펩티드를 포함한다.
특정 실시양태에 있어서, TFP는 암 항원 (예컨대, CD19, ROR1)에 결합하는 항체 단편을 포함하며, 여기서 항체 단편의 서열은 TCR 서브유닛 또는 이의 일부를 코딩하는 핵산 서열과 인접하고 동일한 리딩 프레임 내에 있다. TFP는 기능적 TCR 복합체를 형성하기 위해 하나 이상의 내인성 (또는 대안적으로, 하나 이상의 외인성, 또는 내인성 및 외인성의 조합) TCR 서브유닛과 회합될 수 있다.
결합 도메인은 특히 표적 세포 상의 마커에 특이적으로 결합하는 임의의 펩티드를 포함할 수 있다. 결합 도메인의 공급원은 다양한 종으로부터의 항체 가변 영역 (이는 항체, sFv, scFv, Fab, scFv-기반 그라바바디(grababody) 또는 가용성 VH 도메인 또는 도메인 항체의 형태일 수 있음)을 포함한다. 이러한 항체는 중쇄 가변 영역만을 사용하여 항원-결합 영역을 형성할 수 있다, 즉, 이러한 기능적 항체는 중쇄만의 동종이량체 ("중쇄 항체"로서 지칭됨)이다 (Jespers 등, Nat. Biotechnol. 22:1161, 2004; Cortez-Retamozo 등, Cancer Res. 64:2853, 2004; Baral 등, Nature Med. 12:580, 2006; 및 Barthelemy 등, J. Biol. Chem. 283:3639, 2008).
결합 도메인의 대안적인 공급원은 무작위 펩티드 라이브러리를 코딩하는 서열 또는 대안적인 비-항체 스캐폴드의 루프 영역, 예컨대, scTCR (예컨대, Lake 등, Int. Immunol. 11:745, 1999; Maynard 등, J. Immunol. Methods 306:51, 2005; 미국 특허 번호 8,361,794 참고), 피브리노겐 도메인 (예컨대, Weisel 등, Science 230:1388, 1985 참고), Kunitz 도메인 (예컨대, 미국 특허 번호 6,423,498 참고), 설계된 안키린 반복 단백질 (DARPin) (Binz 등, J. Mol. Biol. 332:489, 2003 및 Binz 등, Nat. Biotechnol. 22:575, 2004), 피브로넥틴 결합 도메인 (아드넥틴 또는 모노바디) (Richards 등, J. Mol. Biol. 326:1475, 2003; Parker 등, Protein Eng. Des. Selec. 18:435, 2005 및 Hackel 등 (2008) J. Mol. Biol. 381:1238-1252), 시스테인-노트 미니단백질 (Vita 등 (1995) Proc. Nat'l. Acad. Sci. (USA) 92:6404-6408; Martin 등 (2002) Nat. Biotechnol. 21:71, 2002 및 Huang 등 (2005) Structure 13:755, 2005), 테트라트리코펩티드 반복 도메인 (Main 등, Structure 11:497, 2003 및 Cortajarena 등, ACS Chem. Biol. 3:161, 2008), 류신-풍부 반복 도메인 (Stumpp 등, J. Mol. Biol. 332:471, 2003), 리포칼린 도메인 (예컨대, WO 2006/095164, Beste 등, Proc. Nat'l. Acad. Sci. (USA) 96:1898, 1999 및 Schnfeld 등, Proc. Nat'l. Acad. Sci. (USA) 106:8198, 2009 참고), V-유사 도메인 (예컨대, 미국 특허 출원 공개공보 번호 2007/0065431 참고), C-타입 렉틴 도메인 (Zelensky and Gready, FEBS J. 272:6179, 2005; Beavil 등, Proc. Nat'l. Acad. Sci. (USA) 89:753, 1992 및 Sato 등, Proc. Nat'l. Acad. Sci. (USA) 100:7779, 2003), mAb2 또는 Fcab (Fc 항원 결합) (예컨대, PCT 특허 출원 공개공보 번호 WO 2007/098934; WO 2006/072620; Wozniak-Knopp 등, Prot. Eng. Des. Select. 23:4, 289-297, 2010 참고), 아르마딜로 반복 단백질 (예컨대, Madhurantakam 등, Protein Sci. 21:1015, 2012; PCT 특허 출원 공개공보 번호 WO 2009/040338 참고), 아필린 (Ebersbach 등, J. Mol. Biol. 372: 172, 2007), 어피바디, 아비머, 노틴, 피노머, 아트리머, 세포독성 T-림프구 연관된 단백질-4 (Weidle 등, Cancer Gen. Proteo. 10:155, 2013) 또는 유사한 것 (Nord 등, Protein Eng. 8:601, 1995; Nord 등, Nat. Biotechnol. 15:772, 1997; Nord 등, Euro. J. Biochem. 268:4269, 2001; Binz 등, Nat. Biotechnol. 23:1257, 2005; Boersma and Plckthun, Curr. Opin. Biotechnol. 22:849, 2011)에서 조작된 다양한 아미노산을 코딩하는 서열을 포함한다.
특정 실시양태에 있어서, 결합 도메인은 Vα/β 및 Cα/β 쇄 (예컨대, Vα-Cα, Vβ-Cβ, Vα-Vβ)을 포함하거나 관심 표적 (예컨대, 펩티드-MHC 복합체)에 특이적인 Vα-Cα, Vβ-Cβ, Vα-Vβ 쌍을 포함하는 단일쇄 TCR (scTCR)이다.
특정 실시양태에 있어서, 조작된 CAR, TCR 및 하이브리드 CAR/TCR은 공지의 또는 식별된 TCR Vα, Vβ, Cα 또는 Cβ의 아미노산 서열과 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5% 또는 100% 동일한 서열을 포함하며, 여기서 각각의 CDR은 관심 표적에 특이적으로 결합하는 TCR 또는 이의 단편 또는 유도체로부터의 0 개의 변화 또는 1, 2 또는 3 개 이하의 변화를 포함한다.
특정 실시양태에 있어서, 나노입자로부터 일시적으로 발현될 수 있는 조작된 CAR, TCR 및 하이브리드 CAR/TCR은 알려지거나 식별된 TCR (예컨대, 고-친화도 TCR)의 Vα, Vβ, Cα 또는 Cβ로부터 유래되거나 이에 기반하여 Vα, Vβ, Cα 또는 Cβ 영역을 포함하며, 알려지거나 식별된 TCR의 Vα, Vβ, Cα 또는 Cβ와 비교하는 경우 하나 이상의 (예컨대, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10) 삽입, 하나 이상의 (예컨대, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10) 결실, 하나 이상의 (예컨대, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10) 아미노산 치환 (예컨대, 보존적 아미노산 치환 또는 비-보존적 아미노산 치환), 또는 상기-언급된 변화의 조합을 포함한다. 삽입, 결실 또는 치환은, 단, 각각의 CDR이 0 개의 변화 또는 1, 2, 또는 3 개 이하의 변화를 포함하고, 변형된 Vα, Vβ, Cα 또는 Cβ 영역을 함유하는 표적 결합 도메인이 야생형과 유사한 친화도 및 작용으로 표적에 여전히 특이적으로 결합할 수 있는 경우, 이러한 영역의 아미노- 또는 카복시-말단 또는 말단 둘 다를 포함하여, Vα, Vβ, Cα 또는 Cβ 영역의 어느 곳에서나 이루어질 수 있다.
특정 실시양태에 있어서, 본 개시내용의 결합 도메인 VH 영역은 알려진 모노클로날 항체의 VH로부터 유래되거나 이에 기반할 수 있고, 알려진 모노클로날 항체의 VH와 비교하는 경우 하나 이상의 (예컨대, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10) 삽입, 하나 이상의 (예컨대, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10) 결실, 하나 이상의 (예컨대, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10) 아미노산 치환 (예컨대, 보존적 아미노산 치환 또는 비-보존적 아미노산 치환), 또는 상기-언급된 변화의 조합을 함유할 수 있다. 삽입, 결실 또는 치환은, 단, 각각의 CDR이 0 개의 변화 또는 1, 2 또는 3 개 이하의 변화를 포함하고, 변형된 VH 영역을 함유하는 결합 도메인이 야생형 결합 도메인과 유사한 친화도로 표적에 여전히 특이적으로 결합할 수 있는 경우, 이 영역의 아미노- 또는 카복시-말단 또는 말단 둘 다를 포함하여 VH 영역의 어느 곳에서나 이루어질 수 있다.
특정 실시양태에 있어서, 본 개시내용의 결합 도메인의 VL 영역은 알려진 모노클로날 항체의 VL로부터 유래되거나 이에 기반하며, 알려진 모노클로날 항체의 VL과 비교하는 경우 하나 이상의 (예컨대, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10) 삽입, 하나 이상의 (예컨대, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10) 결실, 하나 이상의 (예컨대, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10) 아미노산 치환 (예컨대, 보존적 아미노산 치환), 또는 상기-언급된 변화의 조합을 함유한다. 삽입, 결실 또는 치환은, 단, 각각의 CDR이 0 개의 변화 또는 1, 2 또는 3 개 이하의 변화를 포함하며, 변형된 VL 영역을 함유하는 결합 도메인이 야생형 결합 도메인과 유사한 친화도로 표적을 여전히 특이적으로 결합할 수 있는 경우, 이 영역의 아미노- 또는 카복시-말단 또는 말단 둘 다를 포함하여 VL 영역의 어느 곳에나 이루어질 수 있다.
특정 실시양태에 있어서, CAR, TCR 또는 하이브리드 CAR/TCR의 결합 도메인은 경쇄 가변 영역 (VL)의 아미노산 서열 또는 중쇄 가변 영역 (VH), 또는 둘 모두와 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5% 또는 100% 동일한 서열을 포함하거나, 서열이며, 여기서 각각의 CDR은 관심 표적에 특이적으로 결합하는 모노클로날 항체 또는 이의 단편 또는 유도체로부터 0 개의 변화 또는 1, 2 또는 3 개 이하의 변화를 포함한다.
특정 실시양태에 있어서, 결합 도메인은 PSMA에 결합할 수 있다. PSMA에 특이적인 다수의 항체는 당업자에게 공지되어 있으며 서열, 에피토프 결합 및 친화도에 대해 용이하게 특성화될 수 있다. 특정 실시양태에 있어서, 결합 도메인은 항-메소텔린 리간드 (난소암, 췌장암 및 중피종 치료와 연관됨); 항-WT-1 (백혈병 및 난소암 치료와 연관됨); 항-HIV-gag (HIV 감염 치료와 연관됨); 또는 항-거대세포 바이러스 (헤르페스 바이러스와 같은 CMV 질환 치료와 연관됨)를 포함할 수 있다.
특정 실시양태에 있어서, 결합 도메인은 CD19에 결합할 수 있다. 특정 실시양태에 있어서, 결합 도메인은 CD19에 특이적인 VH 및 VL 영역을 포함하는 단일쇄 Fv 단편 (scFv)이다. 특정 실시양태에 있어서, VH 및 VL 영역은 인간이다. 예시적인 VH 및 VL 영역은 항-CD19 특이적 모노클로날 항체 FMC63의 세그먼트를 포함한다. 특정 실시양태에 있어서, scFv는 RASQDISKYLN의 CDRL1 서열, SRLHSGV의 CDRL2 서열, 및 GNTLPYTFG의 CDRL3 서열을 포함하는 가변 경쇄를 포함하는 인간 또는 인간화된 scFv이다. 특정 실시양태에 있어서, scFv는 DYGVS의 CDRHI 서열, VTWGSETTYYNSALKS의 CDRH2 서열) 및 YAMDYWG의 CDRH3 서열을 포함하는 가변 중쇄를 포함하는 인간 또는 인간화된 ScFv이다. 다른 CD19-표적화 항체, 예컨대, SJ25C1 및 HD37이 알려져 있다. (SJ25C1: Bejcek 등 Cancer Res 2005, PMID 7538901; HD37: Pezutto 등 JI 1987, PMID 2437199).
특정 실시양태에 있어서, 인간 CD19에 결합하는 scFV 서열은 다음을 포함한다: MALPVTALLLPLALLLHAEVKLQQSGAELVRPGSSVKISCKASGYAFSSYWMNWVKQRPGQGLEWIGQIYPGDGDTNYNGKFKGQATLTADKSSSTAYMQLSGLTSEDSAVYFCARKTISSVVDFYFDYWGQGTTVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSDIELTQSPKFMSTSVGDRVSVTCKASQNVGTNVAWYQQKPGQSPKPLIYSATYRNSGVPDRFTGSGSGTDFTLTITNVQSKDLADYFCQQYNRYPYTSGGGTKLEIKRAAAIEVMYPPPYLDNEKSNGTIIHVKGKHLCPSPLFPGPSKPFW (서열번호 103).
특정 실시양태에 있어서, 결합 도메인은 ROR1에 결합할 수 있다. 특정 실시양태에 있어서, scFv는 ASGFDFSAYYM (서열번호 104)의 CDRL1 서열, TIYPSSG (서열번호 105)의 CDRL2 서열, 및 ADRATYFCA (서열번호 106)의 CDRL3 서열을 포함하는 가변 경쇄를 포함하는 인간 또는 인간화된 scFv이다. 특정 실시양태에 있어서, scFv는 DTIDWY (서열번호 107)의 CDRH1 서열, VQSDGSYTKRPGVPDR (서열번호 108)의 CDRH2 서열, 및 YIGGYVFG (서열번호 109)의 CDRH3 서열을 포함하는 가변 중쇄를 포함하는 인간 또는 인간화된 scFv이다. ROR1에 특이적인 다수의 항체는 당업자에게 알려져 있으며, 서열, 에피토프 결합 및 친화도에 대해 용이하게 특성화될 수 있다.
특정 실시양태에 있어서, 인간 ROR1에 결합하는 scFV 서열은 다음을 포함한다: MLLLVTSLLLCELPHPAFLLIPQEQLVESGGRLVTPGGSLTLSCKASGFDFSAYYMSWVRQAPGKGLEWIATIYPSSGKTYYATWVNGRFTISSDNAQNTVDLQMNSLTAADRATYFCARDSYADDGALFNIWGPGTLVTISSGGGGSGGGGSGGGGSELVLTQSPSVSAALGSPAKITCTLSSAHKTDTIDWYQQLQGEAPRYLMQVQSDGSYTKRPGVPDRFSGSSSGADRYLIIPSVQADDEADYYCGADYIGGYVFGGGTQLTVTGESKYGPPCPPCPMFWVLVVVGGVLACYSLLV (서열번호 110).
나노입자의 생산에 관한 추가적인 설명은 PCT/US2018/012507에서 찾을 수 있으며, 이는 그 전체가 본원에 참조로 원용된다.
특정 다음의 암은 CAR, TCR 및 하이브리드 CAR/TCR의 세포 외 구성요소 내에 연관된 세포 마커(들)에 결합하는 결합 도메인을 포함함으로써 (예컨대, 다음 마커 중 어느 하나에 특이적인 scFV를 포함하는 CAR에 의해) 표적화될 수 있다:
특정 실시양태에 있어서, 합성 mRNA (예컨대, IVT mRNA)는 세포 마커 또는 이의 단편에 특이적으로 결합하는 CAR, TCR, 또는 CAR/TCR 하이브리드를 코딩한다.
전술한 것을 제한함 없이, 세포 마커는 또한 A33; BAGE; Bcl-2; β-카테닌; BCMA; B7H4; BTLA; CA125; CA19-9; CD3, CD5; CD19; CD20; CD21; CD22; CD25; CD28; CD30; CD33; CD37; CD38; CD40; CD52; CD44v6; CD45; CD56; CD79b; CD80; CD81; CD86; CD123; CD134; CD137; CD151; CD171; CD276; CEA; CEACAM6; c-Met; CS-1; CTLA-4; 사이클린 B1; DAGE; EBNA; EGFR; EGFRvIII, 에프린B2; ErbB2; ErbB3; ErbB4; EphA2; 에스트로겐 수용체; FAP; 페리틴; α-태아단백질 (AFP); FLT1; FLT4; 폴레이트-결합 단백질; 프리즐드; GAGE; G250; GD-2; GHRHR; GHR; GITR; GM2; GPRC5D; gp75; gp100 (Pmel 17); gp130; HLA; HER-2/neu; HPV E6; HPV E7; hTERT; HVEM; IGF1R; IL6R; KDR; Ki-67; 루이스 A; 루이스 Y; LIFRβ; LRP; LRP5; LTβR; MAGE; MART; 메소텔린; MUC; MUC1; MUM-1-B; myc; NYESO-1; O-아세틸 GD-2; O-아세틸 GD3; OSMRβ; p53; PD1; PD-L1; PD-L2; PRAME; 프로게스테론 수용체; PSA; PSMA; PTCH1; RANK; ras; Robo1; RORl; 서바이빈; TCRα; TCRβ; 테나신; TGFBR1; TGFBR2; TLR7; TLR9; TNFR1; TNFR2; TNFRSF4; TWEAK-R; TSTA 티로시나제; VEGF; 및 WT1을 포함한다.
특정 암세포 세포 마커는 다음을 포함한다:
본 개시내용은 암 또는 전암성 병태의 증상을 치료, 예방 또는 완화하는 방법을 제공한다. 방법은 이를 필요로 하는 대상체에 본 개시내용의 나노담체의 치료적 유효량, 또는 이의 약학 조성물을 투여하는 것을 포함한다. 치료될 수 있는 예시적인 암은 전립선암, 유방암, 줄기세포암, 난소암, 중피종, 신장 세포 암종 흑색종, 췌장암, 폐암, HBV-유도된 간세포 암종 및 다발성 골수종을 포함한다. 치료될 수 있는 추가의 예시적인 암은 수모세포종, 희소돌기아교세포종, 난소 투명 세포 선암종, 난소 자궁내막양 선암종, 난소 장액성 선암종, 췌관 선암종, 췌장 내분비 종양, 악성 횡문근 종양, 성상세포종, 비정형 기형 횡문근 종양, 맥락총 암종, 맥락총 유두종, 상의세포종, 교모세포종, 수막종, 신경아교 종양, 희소돌기성상세포종, 희소돌기아교세포종, 송과체모세포종, 암육종, 척색종, 성선외 생식 세포 종양, 신장외 횡문근 종양, 신경초종, 피부 편평 세포 암종, 연골육종, 연조직의 투명 세포 육종, 유잉 육종, 위장관 간질성 종양, 골육종, 횡문근육종, 상피모양 육종, 신장 수질 암종, 미만성 거대 B-세포 림프종, 여포성 림프종 및 달리 명시되지 않은 (NOS) 육종을 포함한다.
본 개시내용은 추가로 암 또는 전암의 치료에서, 또는 이러한 암 또는 전-암의 치료에 유용한 의약의 제조를 위한 본 개시내용의 나노담체, 또는 이의 약학 조성물의 용도를 제공한다. 치료될 수 있는 예시적인 암은 전립선암, 유방암, 줄기세포암, 난소암, 중피종, 신장 세포 암종 흑색종, 췌장암, 폐암, HBV-유도된 간세포 암종 및 다발성 골수종을 포함한다. 치료될 수 있는 추가의 예시적인 암은 수모세포종, 희소돌기아교세포종, 난소 투명 세포 선암종, 난소 자궁내막양 선암종, 난소 장액성 선암종, 췌관 선암종, 췌장 내분비 종양, 악성 횡문근 종양, 성상세포종, 비정형 기형 횡문근 종양, 맥락총 암종, 맥락총 유두종, 상의세포종, 교모세포종, 수막종, 신경아교 종양, 희소돌기성상세포종, 희소돌기아교세포종, 송과체모세포종, 암육종, 척색종, 성선외 생식 세포 종양, 신장외 횡문근 종양, 신경초종, 피부 편평 세포 암종, 연골육종, 연조직의 투명 세포 육종, 유잉 육종, 위장관 간질성 종양, 골육종, 횡문근육종, 상피모양 육종, 신장 수질 암종, 미만성 거대 B-세포 림프종, 여포성 림프종 및 NOS 육종을 포함한다.
본원에 개시된 임의의 방법에 있어서, 암은 뇌 및 중추 신경계 (CNS) 암, 두경부암, 신장암, 난소암, 췌장암, 백혈병, 폐암, 림프종, 다발성 골수종, 육종, 유방암 및 전립선암으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 실시양태에 있어서, 암은 수모세포종, 희소돌기아교세포종, 난소 투명 세포 선암종, 난소 자궁내막양 선암종, 난소 장액성 선암종, 췌관 선암종, 췌장 내분비 종양, 악성 횡문근 종양, 성상세포종, 비정형 기형 횡문근 종양, 맥락총 암종, 맥락총 유두종, 상의세포종, 교모세포종, 수막종, 신경아교 종양, 희소돌기성상세포종, 희소돌기아교세포종, 송과체모세포종, 암육종, 척색종, 성선외 생식 세포 종양, 신장외 횡문근 종양, 신경초종, 피부 편평 세포 암종, 연골육종, 연조직의 투명 세포 육종, 유잉 육종, 위장관 간질성 종양, 골육종, 횡문근육종, 상피모양 육종, 신장 수질 암종, 미만성 거대 B-세포 림프종, 여포성 림프종 및 NOS 육종으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
예를 들어, 감염원 항원에 결합함으로써 감염성 질환원에 특이적인 결합 도메인이 또한 고려된다. 이들은 예를 들어, 바이러스-감염된 세포에 의해 발현되는 바이러스 항원 또는 기타 바이러스 마커를 포함한다. 예시적인 바이러스는 아데노바이러스, 아레나바이러스, 버냐바이러스, 코로나바이러스, 플라비르바이러스, 한타바이러스, 헤파드나바이러스, 헤르페스바이러스, 파필로마바이러스, 파라믹소바이러스, 파보바이러스, 피코르나바이러스, 폭스바이러스, 오르토믹소바이러스, 레트로바이러스, 레오바이러스, 랍도바이러스, 로타바이러스, 해면상 바이러스 또는 토가바이러스를 포함한다. 추가 실시양태에 있어서, 바이러스 항원 마커는 CMV, 감기 바이러스, 엡스타인-바, 독감 바이러스, A 형, B 형 및 C 형 간염 바이러스, 단순 헤르페스, HIV, 인플루엔자, 일본 뇌염, 홍역, 소아마비, 광견병, 호흡기 세포융합, 풍진, 천연두, 바리셀라 조스터 또는 웨스트 나일 바이러스에 의해 발현되는 펩티드를 포함한다.
추가의 특정 예로서, 거대세포 바이러스 항원은 외피 당단백질 B 및 CMV pp65를 포함하며; 엡스타인-바 항원은 EBV EBNAI, EBV P18 및 EBV P23을 포함하며; 간염 항원은 HBV의 S, M 및 L 단백질, HBV의 pre-S 항원, HBCAG DELTA, HBV HBE, C 형 간염 바이러스 RNA, HCV NS3 및 HCV NS4를 포함하며; 단순 헤르페스 바이러스 항원은 즉시 초기 단백질 및 당단백질 D를 포함하며; HIV 항원은 gag, pol 및 env 유전자의 유전자 산물, 예컨대, HIV gp32, HIV gp41, HIV gp120, HIV gp160, HIV P17/24, HIV P24, HIV P55 GAG, HIV P66 POL, HIV TAT, HIV GP36, Nef 단백질 및 역전사 효소를 포함하며; 인플루엔자 항원은 헤마글루티닌 및 뉴라미니다제를 포함하며; 일본 뇌염 바이러스 항원은 단백질 E, M-E, M-E-NS1, NS1, NS1-NS2A 및 80% E를 포함하며; 홍역 항원은 홍역 바이러스 융합 단백질을 포함하며; 광견병 항원은 광견병 당단백질 및 광견병 핵단백질을 포함하며; 호흡기 세포융합 바이러스 항원은 RSV 융합 단백질 및 M2 단백질을 포함하며; 로타바이러스 항원은 VP7sc를 포함하며; 풍진 항원은 단백질 E1 및 E2를 포함하고; 바리셀라 조스터 바이러스 항원은 gpI 및 gpII를 포함한다.
추가적인 특정 예시적인 바이러스 항원 서열은 다음을 포함한다:
바이러스 항원의 추가적인 예는 Fundamental Virology, Second Edition, eds. Fields, B. N. 및 Knipe, D. M. (Raven Press, New York, 1991)을 참고한다.
본원에 개시된 특정 실시양태에 있어서, 변형된 면역계 세포는 바이러스-감염된 세포를 인식하고 파괴한다. 대안적으로 또는 추가로, 변형된 단핵구/대식세포는 바이러스 입자에 의한 세포 감염 전에 말초 조직 또는 (세포 외) 혈류로부터 바이러스를 제거할 수 있다. B 세포는 광범위하게 중화 항체를 일시적으로 발현하도록 변형될 수 있다. 일 예에서, B 세포는 광범위하게 중화시키는 항-HIV 항체를 일시적으로 발현하도록 변형될 수 있다.
특정 실시양태에 있어서, 표적화제는 HIV gag 단백질, gp120 또는 B 형 간염 외피 단백질 (S 도메인)을 표적화한다.
특정 실시양태에 있어서, 마커는 박테리아 감염과 연관된 세포에 의해 발현된다. 예시적인 박테리아는 탄저; 그람-음성 바실러스, 클라미디아, 디프테리아, 헤모필루스 인플루엔자, 헬리코박터 파일로리, 말라리아, 마이코박테리움 터버큘로시스, 백일해 독소, 뉴모코커스, 리케차, 스타필로코커스, 스트렙토코커스 및 파상풍을 포함한다.
박테리아 항원 마커의 특정 예로서, 탄저 항원은 탄저 보호 항원을 포함하며; 그람-음성 바실러스 항원은 지질다당류를 포함하며; 헤모필루스 인플루엔자 항원은 캡슐형 다당류를 포함하며; 디프테리아 항원은 디프테리아 독소를 포함하며; 마이코박테리움 터버큘로시스 항원은 마이콜산, 열 충격 단백질 65 (HSP65), 30 kDa 주요 분비 단백질 및 항원 85A를 포함하며; 백일해 독소 항원은 헤마글루티닌, 퍼탁틴, FIM2, FIM3 및 아데닐레이트 사이클라제를 포함하며; 뉴모코커스 항원은 뉴몰리신 및 뉴모코커스 캡슐형 다당류를 포함하며; 리케차 항원은 rompA를 포함하며; 스트렙토코커스 항원은 M 단백질을 포함하고; 파상풍 항원은 파상풍 독소를 포함한다.
단핵구/대식세포는 치료적 목적이 박테리아 감염의 치료인 경우 변형하는 데 특히 유용하다. 특정 일 실시양태에 있어서, 단핵구/대식세포는 스타필로코커스 아우레우스의 표면 구성요소 리포테이코산 또는 스타필로코커스 아우레우스 응괴 인자 A (ClfA)를 인식하는 리간드로 변형될 수 있다.
특정 실시양태에 있어서, 면역 세포는 다중-약물 내성 "슈퍼버그"를 표적화하기 위해 변형된다. 슈퍼버그의 예는 엔테로코커스 패시움, 클로스트리듐 디피실, 아시네토박터 바우마니, 슈도모나스 아에루기노사 및 엔테로박테리아세아에 (대장균, 클렙시엘라 뉴모니아에, 엔테로박터 속 포함)를 포함한다.
특정 실시양태에 있어서, 마커는 진균 감염과 연관된 세포에 의해 발현된다. 예시적인 진균은 칸디다, 콕시디오드, 크립토코커스, 히스토플라즈마, 리슈마니아, 플라스모듐, 원생동물, 기생충, 주혈흡충, 백선, 톡소플라즈마 및 트리파노소마 크루지를 포함한다.
진균 항원의 추가의 특정 예로서, 콕시디오드 항원은 구상체 항원을 포함하며; 크립토코커스 항원은 캡슐형 다당류를 포함하며; 히스토플라즈마 항원은 열 충격 단백질 60 (HSP60)을 포함하며; 리슈마니아 항원은 gp63 및 리포포스포글리칸을 포함하며; 플라스모듐 팔시파룸 항원은 메로조이트 표면 항원, 스포로조이트 표면 항원, 써컴스포로조이트 항원, 생식모세포/생식세포 표면 항원, 원생동물 및 혈액-단계 항원 pf 155/RESA를 포함하는 다른 기생충 항원을 포함하며; 주혈흡충 항원은 글루타티온-S-트랜스퍼라제 및 파라미오신을 포함하며; 백선 진균 항원은 트리코피틴을 포함하며; 톡소플라즈마 항원은 SAG-1 및 p30을 포함하고; 트리파노소마 크루지 항원은 75-77 kDa 항원 및 56 kDa 항원을 포함한다.
단핵구/대식세포는 치료적 목적이 진균 감염의 치료인 경우 변형시키는 데 특히 유용하다.
특정 실시양태에 있어서, 마커는 자가면역 또는 알레르기 병태와 연관된 세포에 의해 발현된다. 예시적인 자가면역 병태는 급성 괴사성 출혈성 뇌병증, 알레르기성 천식, 원형 탈모증, 빈혈, 아프타성 궤양, 관절염 (류마티스 관절염, 소아 류마티스 관절염, 골관절염, 건선성 관절염 포함), 천식, 자가면역성 갑상선염, 결막염, 크론 질환, 피부 홍반 루푸스, 피부염 (아토피성 피부염 및 습진성 피부염 포함), 당뇨병, 진성 당뇨병, 나성 결절 홍반, 각결막염, 다발성 경화증, 중증 근무력증, 건선, 경피증, 쇼그렌 증후군에 이차적인 건성각결막염을 포함하는 쇼그렌 증후군, 스티븐스-존슨 증후군, 전신성 홍반성 낭창, 궤양성 대장염, 질염 및 베게너 육아종증을 포함한다.
자가면역 항원의 예는 글루탐산 탈탄산효소 65 (GAD 65), 천연 DNA, 미엘린 염기성 단백질, 미엘린 단백지질 단백질, 아세틸콜린 수용체 구성요소, 티로글로불린 및 갑상선 자극 호르몬 (TSH) 수용체를 포함한다. 알레르기 항원의 예는 화분 항원, 예컨대, 일본 삼나무 화분 항원, 돼지풀 화분 항원, 라이 그라스 화분 항원, 동물 유래 항원 (예컨대, 먼지 진드기 항원 및 고양이 항원), 조직적합성 항원, 페니실린 및 기타 치료적 약물을 포함한다.
이펙터 도메인. 이펙터 도메인은 기능적 신호를 세포로 전송할 수 있다. 특정 실시양태에 있어서, 이펙터 도메인은 세포 반응을 직접적으로 촉진하는 하나 이상의 다른 단백질과 회합시킴으로써 세포 반응을 직접 또는 간접적으로 촉진할 것이다. 이펙터 도메인은 표적 세포 상에 발현된 마커에 결합할 때 CAR, TCR 또는 CAR/TCR 하이브리드를 발현하는 형질도입된 림프구의 하나 이상의 기능의 활성화를 제공할 수 있다. 림프구의 활성화는 증식, 분화, 활성화 또는 기타 이펙터 기능 중 하나 이상을 포함할 수 있다. 특정 실시양태에 있어서, 전달된 폴리뉴클레오티드는 이펙터 도메인을 코딩한다.
이펙터 도메인은 1, 2, 3 개 또는 그 이상의 수용체 시그널링 도메인, 세포 내 시그널링 도메인, 공동자극 도메인, 또는 이들의 조합을 포함할 수 있다. 다양한 시그널링 분자 중 임의의 것 (예컨대, 신호 전달 수용체)으로부터의 임의의 세포 내 이펙터 도메인, 공동자극 도메인 또는 둘 모두는 본 개시내용의 CAR, TCR 또는 CAR/TCR 하이브리드에 사용될 수 있다.
예시적인 이펙터 도메인은 4-1BB, CD3ε, CD3δ, CD3ζ, CD27, CD28, CD79A, CD79B, CARD11, DAP10, FcRα, FcRβ, FcRγ, Fyn, HVEM, ICOS, Lck, LAG3, LAT, LRP, NOTCH1, Wnt, NKG2D, OX40, ROR2, Ryk, SLAMF1, Slp76, pTα, TCRα, TCRβ, TRIM, Zap70, PTCH2 또는 이들의 임의의 조합으로부터의 것을 포함한다.
T 세포 활성화는 다음의 2 개의 별개의 부류의 세포질 시그널링 서열에 의해 매개된다고 말할 수 있다: 항원-의존성 일차 활성화를 개시하고 TCR-유사 신호를 제공하는 것 (일차 세포질 시그널링 서열) 및 이차 또는 공동-자극 신호를 제공하는 항원-비의존성 방식으로 작용하는 것 (이차 세포질 시그널링 서열). 자극 방식으로 작용하는 일차 세포질 시그널링 서열은 수용체 티로신-기반 활성화 모티프 또는 iTAM으로서 알려진 시그널링 모티프를 함유할 수 있다. 일차 세포질 시그널링 서열을 함유하는 iTAM의 예는 CD3 제타, FeR 감마, CD3 감마, CD3 델타, CD3 엡실론, CD5, CD22, CD79a, CD79b 및 CD66d로부터 유래된 것들을 포함한다.
특정 실시양태에 있어서, 이펙터 도메인은 세포질 시그널링 단백질과 회합하는 세포질 부분을 포함하며, 여기서 세포질 시그널링 단백질은 림프구 수용체 또는 이의 시그널링 도메인, 복수의 ITAM을 포함하는 단백질, 공동자극 인자, 또는 이들의 임의의 조합이다.
세포 내 시그널링 도메인의 예는 CD3 제타쇄의 세포질 서열, 및/또는 CAR 참여(engagement) 후 신호 전달을 개시하기 위해 협력하여 작용하는 공동-수용체, 뿐만 아니라 이들 서열의 임의의 유도체 또는 변이체 및 동일한 기능적 능력을 가지고 있는 임의의 합성 서열을 포함한다. 특정 실시양태에 있어서, CAR의 세포 내 시그널링 도메인은 임의의 다른 원하는 세포질 도메인(들)과 조합된 세포 내 시그널링 도메인을 포함하도록 설계될 수 있다. 예를 들어, CAR의 세포 내 시그널링 도메인은 세포 내 시그널링 도메인 및 공동자극 시그널링 영역을 포함할 수 있다. 공동자극 시그널링 영역은 공동자극 분자의 세포 내 도메인을 포함하는 CAR의 일부를 지칭한다. 공동자극 분자는 마커에 대한 림프구의 반응에 필요한 발현된 마커 리간드 이외의 세포 표면 분자이다. 이러한 분자의 예는 CD27, CD28, 4-1BB (CD 137), OX40, CD30, CD40, 림프구 기능-연관된 항원-1 (LFA-1), CD2, CD7, LIGHT, NKG2C, B7-H3 및 CD83과 특이적으로 결합하는 리간드를 포함한다.
스페이서 영역. 스페이서 영역은 표적 인식을 최적화하기 위해 표적의 개별 마커에 대해 원하는 대로 바꿀 수 있다. 특정 실시양태에 있어서, 스페이서 길이는 마커 에피토프의 위치, 에피토프에 대한 항체의 친화도, 및/또는 마커 인식에 대한 반응으로 시험관 내 및/또는 생체 내에서 증식하기 위한 CAR, TCR 또는 CAR/TCR 하이브리드를 발현하는 림프구의 능력을 기반으로 선택될 수 있다.
전형적으로, 스페이서 영역은 CAR, TCR 또는 CAR/TCR 하이브리드의 결합 도메인 및 막관통 도메인 사이에서 발견된다. 스페이서 영역은 결합 도메인의 유연성을 제공할 수 있으며 변형된 세포에서 높은 발현 수준을 허용한다. 특정 실시양태에 있어서, 스페이서 영역은 적어도 10 내지 250 개의 아미노산, 적어도 10 내지 200 개의 아미노산, 적어도 10 내지 150 개의 아미노산, 적어도 10 내지 100 개의 아미노산, 적어도 10 내지 50 개의 아미노산, 또는 적어도 10 내지 25 개의 아미노산 및 나열된 범위 중 임의의 것의 엔드포인트들 사이의 임의의 정수를 포함하는 것을 가질 수 있다. 특정 실시양태에 있어서, 스페이서 영역은 250 개 이하의 아미노산; 200 개 이하의 아미노산, 150 개 이하의 아미노산; 100 개 이하의 아미노산; 50 개 이하의 아미노산; 40 개 이하의 아미노산; 30 개 이하의 아미노산; 20 개 이하의 아미노산; 또는 10 개 이하의 아미노산을 가질 수 있다.
특정 실시양태에 있어서, 스페이서 영역은 면역글로불린 유사 분자의 힌지 영역, 예를 들어, 인간 lgG1, 인간 IgG2, 인간 IgG3, 또는 인간 IgG4로부터의 힌지 영역의 전부 또는 일부로부터 유래될 수 있다. 힌지 영역은 원하지 않은 구조적 상호작용, 예컨대, 이량체화를 피하기 위해 변형될 수 있다. 특정 실시양태에 있어서, 힌지 영역의 전부 또는 일부는 면역글로불린의 불변 영역의 하나 이상의 도메인과 조합될 수 있다. 예를 들어, 힌지 영역의 일부는 CH2 또는 CH3 도메인의 전부 또는 일부 또는 이의 변이체와 조합될 수 있다.
막관통 도메인. 본원에 개시된 CAR, TCR 또는 CAR/TCR 하이브리드는 또한 막관통 도메인을 포함할 수 있다. 특정 실시양태에 있어서, 나노입자 내에 투여된 CAR, TCR, 또는 CAR/TCR 하이브리드 폴리뉴클레오티드는 막관통 도메인을 코딩한다. 막관통 도메인은 림프구 막에서 CAR, TCR 또는 CAR/TCR 하이브리드의 고정을 제공한다. 막관통 도메인은 천연 또는 합성 공급원으로부터 유래될 수 있다. 공급원이 천연인 경우, 도메인은 임의의 막결합 또는 막관통 단백질로부터 유래될 수 있다. 막관통 영역은 T-세포 수용체, CD28, CD3, CD45, CD4, CDS, CD9, CDI6, CD22, CD33, CD37, CD64, CD80, CD86, CDI34, CDI37 및 CD154의 알파, 베타 또는 제타 쇄의 적어도 막관통 영역(들)을 포함한다. 특정 실시양태에 있어서, 합성 또는 변이 막관통 도메인은 주로 소수성 잔기, 예컨대, 류신 및 발린을 포함한다.
상이한 리간드 결합 도메인, 상이한 스페이서 영역 길이, 상이한 세포 내 결합 도메인 및/또는 상이한 막관통 도메인을 코딩하는 상이한 잠재적 CAR, TCR 또는 하이브리드 CAR/TCR 핵산은 다른 CAR, TCR 또는 하이브리드 CAR/TCR에 비해 개선된 기능을 갖는 CAR, TCR 또는 하이브리드 CAR/TCR을 식별하기 위해 생체 내 (동물 모델에서) 및/또는 시험관 내에서 테스트될 수 있다.
예시적인 CAR. 특정 실시양태에 있어서, CAR은 CD28 및 CD3ζ 세포질 시그널링 도메인과 조합된 PSMA (J591)의 세포 외 도메인에 특이적인 단일-쇄 항체 (scFv)로 구성된 P28z 융합 수용체를 포함한다. 특정 실시양태에 있어서, CAR은 P28z CAR을 포함한다. 본원에 기재된 P28z CAR의 특정 예는 뮤린 구성요소를 포함한다. 아미노산 위치 1-797은 항-PSMA scFv (J592)를 포함하는 반면, 위치 797-1477은 뮤린 CD8 막관통 도메인, 뮤린 CD28 시그널링 도메인 및 뮤린 CD3제타 시그널링 도메인을 포함한다. 임의의 P28z 도메인은 최적화된 도메인으로 개별적으로 대체될 수 있다. 특정 실시양태에 있어서, 본원에 기재된 P28z CAR의 위치 797-1477 내의 막관통 도메인 및 시그널링 도메인은 특히 인간 또는 다른 동물에서 사용하기 위해 최적화된 도메인으로 대체될 수 있다. 특정 실시양태에 있어서, 결합 도메인의 임의의 전체 또는 일부, 이펙터 도메인의 임의의 전체 또는 일부, 스페이서 도메인의 임의의 전체 또는 일부 및/또는 막관통 도메인의 임의의 전체 또는 일부는 인간 또는 다른 동물에서 사용하기 위해 최적화될 수 있다. 특정 실시양태에 있어서, P28z CAR은 인간에서 사용하기 위해 최적화된다. 인간에 최적화된 경우, P28z CAR은 인간에서 낮아진 면역원성을 가질 수 있으며 비-인간 항체에 비해 비-면역원성 에피토프의 적은 수를 갖는다.
특정 실시양태에 있어서, ROR1-특이적 및 CD19-특이적 CAR은 2A2, R12 및 R11 mAb (ROR1) 및 FMC63 mAb (CD19)의 VL 및 VH 쇄 세그먼트를 사용하여 구축될 수 있다. R11 및 R12에 대한 가변 영역 서열은 Yang 등, Plos One 6(6):e21018, June 15, 2011에서 제공된다. 각각의 scFV는 (Gly4Ser)3 단백질에 의해 '힌지-CH2-CH3' (229 AA), '힌지-CH3' (119 AA) 또는 오직 '힌지'만의 (12 AA) 서열을 포함하는 IgG4-Fc (UniProt 데이터베이스: P01861)로부터 유래된 스페이서 도메인에 연결될 수 있다. 모든 스페이서는 천연 IgG4-Fc 단백질의 위치 108에 위치한 '힌지' 도메인 내에 S→P 치환을 함유할 수 있으며, 인간 CD28 (예시적인 전장 CD28의 경우 UniProt: P10747 참고)의 27 AA 막관통 도메인 및 (i) 천연 CD28 단백질의 위치 186-187에 위치한 LL→GG 치환을 갖는 인간 CD28의 41 AA 세포질 도메인 또는 (ii) 인간 4-1BB (UniProt: Q07011)의 42 AA 세포질 도메인을 포함하는 이펙터 도메인 시그널링 모듈에 연결될 수 있으며, 이들 각각은 인간 CD3ζ (UniProt: P20963)의 아이소폼 3의 112 AA 세포질 도메인에 연결될 수 있다. 작제물은 T2A 리보솜 스킵 요소 및 키메라 수용체의 tEGFR 서열 다운스트림을 코딩한다. tEGFR은 서열에 결합하는 태그 카세트, 예컨대, STREP TAG® II (IBA Gmbh Ltd., Goettingen, DE), Myc 태그, V5 태그, FLAG® 태그 (Sigma-Aldrich Corp., St. Louis, MO), His 태그, 또는 본원에 개시된 다른 펩티드 또는 분자로 대체되거나 보완될 수 있다. 각각의 트랜스진을 코딩하는 코돈-최적화된 유전자 서열은 합성될 수 있으며 (Life Technologies) Nhel 및 Not1 제한 부위를 사용하여 epHIV7 렌티바이러스 벡터로 클로닝될 수 있다. epHIV7 렌티바이러스 벡터는 pHIV7의 거대세포 바이러스 프로모터를 EF-1 프로모터로 대체함으로써 pHIV7 벡터로부터 유래될 수 있다. 항-ROR1 키메라 수용체, 항-CD19 키메라 수용체, tEGFR 또는 태그 카세트-코딩 렌티바이러스는 패키징 벡터 pCHGP-2, pCMV-Rev2 및 pCMV-G 및 CALPHOS™ 형질주입 시약 (Takara Clontech)을 사용하여 293T 세포에서 생산될 수 있다.
HER2-특이적 키메라 수용체는 HER2 상의 막 근위 에피토프를 인식하는 HER2-특이적 mAb의 VL 및 VH 쇄 세그먼트를 사용하여 작제될 수 있으며, scFV는 IgG4 힌지/CH2/CH3, IgG4 힌지/CH3 및 오직 IgG4 힌지 만의 세포 외 스페이서 도메인, 및 CD28 막관통 도메인, 4-1BB 및 CD3ζ 시그널링 도메인에 연결될 수 있다.
항-CD19 키메라 수용체는 CD19-특이적 mAb FMC63의 서열에 상응하는 단일 쇄 가변 단편 (scFV)(scFv: VL-VH), '힌지-CH2-CH3' 도메인 (229 AA, 긴 스페이서) 또는 '힌지' 도메인만 (12 AA, 짧은 스페이서)을 포함하는 IgG4-Fc로부터 유래된 스페이서, 및 막 근위 CD28 또는 4-1BB 공동자극 도메인을 갖는 CD3ζ의 시그널링 모듈을 단독으로 또는 탠덤으로 포함할 수 있다.
(b) 대식세포 활성화제. "대식세포 활성화"는 대식세포의 표현형 또는 기능을 (i) 불활성화된 상태에서 활성화된 상태로; (ii) 비-활성화된 상태에서 활성화된 상태로; (iii) 활성화된 상태에서 보다 활성화된 상태로; 또는 (iv) 불활성화 상태에서 비-활성화 상태로 변경시키는 과정을 지칭한다. 불활성화된 상태는 종양 성장 및 전이를 용이하게 하는 면역억압된 표현형을 의미한다. 비-활성화된 상태는 대식세포가 종양 성장 또는 전이를 용이하게 하지 않고 종양 세포의 사멸을 촉진하지도 않음을 의미한다. 활성화됨은 대식세포가 종양파괴 활성을 나타낸다는 것을 의미한다. 특정 실시양태에 있어서, 활성화된 상태는 하기에 보다 명세하게 설명되는 바와 같이 M1 표현형을 초래한다. 특정 실시양태에 있어서, 불활성화된 상태는 M2 표현형을 초래한다. "대식세포 불활성화"는 대식세포의 표현형 또는 기능을 (i) 활성화된 상태에서 덜 활성화된 상태로; (ii) 활성화된 상태에서 비-활성화된 상태로; (iii) 활성화된 상태에서 불활성화된 상태로; 또는 (iv) 비-활성화된 상태에서 불활성화된 상태로 변경시키는 과정을 지칭한다. 특정 실시양태에 있어서, 불활성화된 상태는 M2이다. 특정 실시양태에 있어서, 활성화된 상태는 M1이다.
대식세포 자극 나노입자 조성물의 투여는 종양에서 면역억압 상태를 변경할 수 있으며, 이는 종양이 본원에 기재된 나노입자 및 이에 의해 코딩된 치료적 단백질(들)을 사용한 동반 치료에 보다 민감하게 만든다.
활성화된 또는 불활성화된 표현형에 대한 대식세포의 분극화는 다수의 상이한 분자 또는 환경과의 대식세포 상호작용에 기인한다. 예를 들어, M1 대식세포 분극화는 톨-유사 수용체 (TLR) 리간드 (예컨대, 지질다당류 (LPS), 무라밀 디펩티드, 리포테이코산, 이미퀴모드, CpG), IFNγ, TNFα 및 대식세포 콜로니-자극 인자 (GM-CSF)를 포함하는 자극제에 의해 유발된다. M2 분극화된 대식세포는 분극화를 개시하는 자극제에 따라 서브세트로 나뉠 수 있다: M2a 서브유형은 IL-4, IL-13 또는 진균 및 연충 감염에 의해 야기되며; M2b는 IL-1 수용체 리간드, 면역 복합체 및 LPS에 의해 야기되며; M2c는 IL-10, TGF-β 및 글루코코르티코이드에 의해 야기되고; M2d는 IL-6과 아데노신에 의해 야기된다. M2 대식세포 분극화는 또한 IL-21, GM-CSF, 보체 구성요소 및 세포자멸사 세포에 의해 유발될 수 있다. 대식세포 분극화는 또한 국소 미세환경 조건, 예컨대, 저산소증에 의해 조정된다.
전술한 분자 및 환경은 전사 인자를 수반하는 상이한 세포 내 시그널링 경로를 유발함으로써 대식세포 분극화에 영향을 미친다. M1 및 M2 분극화 둘 다에 관여된 전사 인자는 IRF, 전사 신호 전달자 및 활성화제 (STAT), SOCS3 단백질 및 활성화된 B 세포의 핵 인자 카파-경-쇄-인핸서 (NFκB)를 포함한다. 미토겐-활성화된 단백질 키나제 (MAPK)는 또한 M1 또는 M2 표현형에 대한 대식세포 기능을 지시하는 역할을 한다.
상기 논의된 바와 같이 IFN 및 TLR 시그널링과 같은 이러한 자극제에 의해 활성화된 IRF/STAT 경로는 STAT1을 통해 대식세포를 M1 활성화 상태로 분극화한다. 반면에, IL-4 및 IL-13과 같은 이러한 자극제는 STAT6 (Sica A & Bronte V (2007) J Clin Invest 117: 1155-1166)을 통해 대식세포를 M2 활성화 상태로 편위시킨다. 따라서 이러한 시그널링 사건은 M1 대식세포 분극화의 경우와 같이 염증성 면역 반응 및 종양파괴 활성의 촉진, 또는 M2 대식세포 분극화의 경우와 같이 면역억압성 전종양 반응의 촉진을 초래한다.
M1 표현형의 유도와 연루된 일부 세포 내 분자는 NOS2를 통해 NO를 유도하는 역할을 하는 G-단백질 커플링된 수용체인 P2Y(2)R (Eun SY 등 (2014) Int Immunopharmacol 18: 270-276); NFκB/PI-3 키나제 경로를 활성화하여 NO를 생성하는 SOCS3 (Arnold CE 등 (2014) Immunology 141: 96-110); 및 M1 마커를 촉진하고 IL-10을 하향-조절하는 성장 및 분화 인자 액티빈 A (Sierra-Filardi E 등 (2011) Blood 117: 5092-5101)를 포함한다.
M1 표현형의 유도에 관여하는 다른 세포 내 분자는 IRF를 포함한다. IRF는 바이러스-매개된 IFN 활성화, 세포 성장의 조정, 분화, 세포자멸사, 면역계 활성을 포함하는 다양한 역할을 하는 전사 인자 군이다. IRF 패밀리의 구성원은 트립토판 (W) 반복을 함유하는 보존된 N-말단 DNA-결합 도메인을 특징으로 한다.
IRF5는 나선-회전-나선 DNA-결합 모티프를 보유하고 바이러스- 및 IFN-유도된 시그널링 경로를 매개하는 전사 인자이다. 이는 대식세포가 염증을 촉진하거나 억제할지 여부를 제어하는 분자 스위치 역할을 한다. IRF5는 I 형 IFN 유전자, TNF, IL-6, IL-12 및 IL-23을 포함한 염증성 사이토카인, 및 종양 억압인자뿐만 아니라 Th1 및 Th17 반응을 활성화한다. 이는 염색체 7q32 (OMIM ID 607218)에 위치한 인간 IRF5 유전자에 의해 코딩된다. IRF5의 여러 아이소폼/전사 변이체가 존재하는 것으로 이해된다. 특정 실시양태에 있어서, 인간 IRF5의 아이소폼은 아이소폼 1 (UniProt 수탁 Q13568-1, 서열번호 25), 아이소폼 2 (UniProt 수탁 Q13568-2, 서열번호 26), 아이소폼 3 (UniProt 수탁 Q13568-3, 서열번호 27), 아이소폼 4 (UniProt 수탁 Q13568-4, 서열번호 28), 아이소폼 5 (UniProt 수탁 Q13568-5, 서열번호 29) 및 아이소폼 6 (UniProt 수탁 Q13568-6, 서열번호 30)을 포함한다. 특정 실시양태에 있어서, 인간 IRF5의 아이소폼은 서열번호 47에 도시된 뉴클레오티드 서열에 의해 코딩된 아이소폼 1, 서열번호 48에 도시된 뉴클레오티드 서열에 의해 코딩된 아이소폼 2, 서열번호 49에 도시된 뉴클레오티드 서열에 의해 코딩된 아이소폼 3, 서열번호 50에 도시된 뉴클레오티드 서열에 의해 코딩된 아이소폼 4, 서열번호 51에 도시된 뉴클레오티드 서열에 의해 코딩된 아이소폼 5 및 서열번호 52에 도시된 뉴클레오티드 서열에 의해 코딩된 아이소폼 6을 포함한다. 특정 실시양태에 있어서, 뮤린 IRF5는 서열번호 31에 도시된 아미노산 서열을 포함한다. 특정 실시양태에 있어서, 뮤린 IRF5는 서열번호 53에 도시된 뉴클레오티드 서열에 의해 코딩된다. M1 대식세포는 IRF5를 상향조절하는 것으로 나타났다.
IRF1 및 IRF8은 또한 전염증성 신호, 예컨대, IFN-γ에 의한 대식세포의 활성화를 포함하여 골수 세포의 발달 및 기능에서 중요한 역할을 한다. Dror N 등 (2007) Mol Immunol. 44(4):338-346. 특정 실시양태에 있어서, 인간 IRF1은 서열번호 32에 도시된 아미노산 서열을 포함한다. 특정 실시양태에 있어서, 인간 IRF1은 서열번호 54에 도시된 뉴클레오티드 서열에 의해 코딩된다. 특정 실시양태에 있어서, 뮤린 IRF1은 서열번호 36에 도시된 아미노산 서열을 포함한다. 특정 실시양태에 있어서, 뮤린 IRF1은 서열번호 58에 도시된 뉴클레오티드 서열에 의해 코딩된다. 특정 실시양태에 있어서, 인간 IRF8은 서열번호 35에 도시된 아미노산 서열을 포함한다. 특정 실시양태에 있어서, 인간 IRF8은 서열번호 57에 도시된 뉴클레오티드 서열에 의해 코딩된다. 특정 실시양태에 있어서, 뮤린 IRF8은 서열번호 40에 도시된 아미노산 서열을 포함한다. 특정 실시양태에 있어서, 뮤린 IRF8은 서열번호 62에 도시된 뉴클레오티드 서열에 의해 코딩된다.
IRF3는 IRF1 및 IRF2의 상동체이다. 이는 NES, DBD, C-말단 IRF 연관 도메인 및 여러 조절 인산화 부위를 포함한 여러 기능 도메인을 함유한다. IRF3는 세린/트레오닌 인산화시 전사 공동활성화제인 CREB 결합 단백질과 복합체를 형성하는 불활성 세포질 형태로 발견된다. 이 복합체는 핵으로 전위되고 IFN-α와 -β의 전사뿐만 아니라 다른 인터페론-유도된 유전자를 활성화시킨다. 특정 실시양태에 있어서, 인간 IRF3의 아이소폼은 아이소폼 1 (UniProt 수탁 Q14653-1), 아이소폼 2 (UniProt 수탁 Q14653-2), 아이소폼 3 (UniProt 수탁 Q14653-3), 아이소폼 4 (UniProt 수탁 Q14653-4), 및 아이소폼 5 (UniProt 수탁 Q14653-5)를 포함한다. 특정 실시양태에 있어서, 인간 IRF3 아이소폼 1은 서열번호 33에 도시된 아미노산 서열을 포함한다. 특정 실시양태에 있어서, 인간 IRF3 아이소폼 1은 서열번호 55에 도시된 뉴클레오티드 서열에 의해 코딩된다. 특정 실시양태에 있어서, 뮤린 IRF3은 서열번호 37에 도시된 아미노산 서열을 포함한다. 특정 실시양태에 있어서, 뮤린 IRF3는 서열번호 59에 도시된 뉴클레오티드 서열에 의해 코딩된다.
IRF7은 I 형 IFN 유전자의 전사 활성화에서 역할을 하는 것으로 나타났다. 특정 실시양태에 있어서, 인간 IRF7의 아이소폼은 아이소폼 A (UniProt 수탁 Q92985-1), 아이소폼 B (UniProt 수탁 Q92985-2), 아이소폼 C (UniProt 수탁 Q92985-3) 및 아이소폼 D (UniProt 수탁 Q92985-4)를 포함한다. 특정 실시양태에 있어서, 인간 IRF7 아이소폼 A는 서열번호 34에 도시된 아미노산 서열을 포함한다. 특정 실시양태에 있어서, 인간 IRF7 아이소폼 A는 서열번호 56에 도시된 뉴클레오티드 서열에 의해 코딩된다. 특정 실시양태에 있어서, 뮤린 IRF7은 서열번호 38에 도시된 아미노산 서열을 포함한다. 특정 실시양태에 있어서, 뮤린 IRF7은 서열번호 60에 도시된 뉴클레오티드 서열에 의해 코딩된다.
IRF 활성화에 기여하는 하나 이상의 IRF 돌연변이체가 또한 사용될 수 있다. 예를 들어: 아미노산 잔기 S425, S427, S430, S436을 인산화를 모방하는 잔기, 예컨대, 아스파르트산 잔기로 대체하는 IRF5 (아이소폼 4, 서열번호 28)의 인간 변이체 3/변이체 4의 인산화모방 돌연변이체 (Chen W 등 (2008) Nat Struct Mol Biol. 15(11): 1213-1220); 아미노산 잔기 T10, S158, S309, S317, S451 및/또는 S462를 인산화를 모방하는 잔기, 예컨대, 아스파르트산 잔기로 대체하는 IRF5의 인간 변이체 5 (아이소폼 2, 서열번호 26)의 인산화모방 돌연변이체 (Chang Foreman H-C 등 infra); IRF5의 구성적 핵 축적을 위한 인간 IRF5 아이소폼 a (변이체 1, 아이소폼 3, 서열번호 27) 및 아이소폼 b (변이체 2, 아이소폼 1, 서열번호 25) 잔기 S156, S158 및 T160의 인산화를 모방하는 잔기, 예컨대, 아스파르트산으로의 돌연변이 (Lin R 등 (2005) J Biol Chem 280(4): 3088-3095); 및 IRF3의 아미노산 잔기 S396을 인산화를 모방하는 잔기, 예컨대, 아스파르트산으로 대체하는 IRF3 인산화모방 돌연변이체 (Chen W 등 infra). 특정 실시양태에 있어서, 뮤린 IRF7/IRF3의 융합 단백질은 IRF3 회합 도메인 (서열번호 39)에서 4 개의 세린 및 1 개의 트레오닌 잔기에서 Asp (D) 돌연변이를 포함하여, 융합 단백질의 구성적 활성화 및 전위를 부여한다. (Lin R 등 (1998) 앞서 언급함; Lin 등 (2000) Molecular and Cellular Biology 20: 6342-6353). 특정 실시양태에 있어서, IRF3 회합 도메인에서 4 개의 세린 및 1 개의 트레오닌 잔기에서 D 돌연변이를 포함하는 뮤린 IRF7/IRF3의 융합 단백질은 서열번호 61에 도시된 뉴클레오티드 서열에 의해 코딩된다. 특정 실시양태에 있어서, 뮤린 IRF8 돌연변이체는 아미노산 잔기 310에서 리신 (K)의 아르기닌 (R)으로의 치환 (서열번호 41)을 포함한다. 특정 실시양태에 있어서, 아미노산 잔기 310에서 K의 R로의 치환을 포함하는 뮤린 IRF8 돌연변이체는 서열번호 63에 도시된 뉴클레오티드 서열에 의해 코딩된다. 주로 K310에서 IRF8에 결합된 작은 유비퀴틴-유사 변형체 (SUMO)는 IRF8 반응성 유전자의 활성화를 억제한다. 센트린-특이적 프로테아제 1 (SENP1)은 SUMO 2/3를 표적화한다. SENP1의 활성은 IRF8 (및 기타 단백질)을 "탈SUMO화"하고 IRF8이 M1 대식세포 분화의 억제인자에서 활성화제로 작동하도록 유발한다 (직접적으로 및 트랜스활성화 활성을 통해). K310 잔기의 돌연변이에 의해 IRF8에 대한 SUMO 결합을 예방하는 것은 IRF8 특이적 유전자 전사를 2-5 배 증가시킨다 (앞서 언급한 Chang T-H 등 (2012) 참고).
본 개시내용의 특정 실시양태는 조작된 IRF 전사 인자를 포함한다. 특정 실시양태에 있어서, 조작된 IRF 전사 인자는 기능성 자가억제 도메인이 결여되어 피드백 불활성화에 민감하지 않은 IRF를 포함한다 (Thompson 등 (2018) Front Immunol 9: 2622). 예를 들어, 활성이 2-3-배 증가한 인간 IRF5는 인간 IRF5 단백질의 aa 489-539를 결실시킴으로써 수득될 수 있다 (Barnes 등 (2002) Mol Cell Biol 22: 5721-5740). 특정 실시양태에 있어서, M2 표현형을 촉진하는 전사 인자인 IRF4의 자가억제 도메인은 자가면역 질환 치료의 맥락에서 보다 활성인 IRF4를 생성하기 위해 결실되거나 돌연변이될 수 있다. 특정 실시양태에 있어서, IRF의 자가억제 도메인은 IRF 단백질의 카복시 말단에서 발견된다. 특정 실시양태에 있어서, 조작된 IRF 전사 인자는 핵에 IRF를 포획하여 전사를 향상시키는 하나 이상의 기능성 핵 방출 신호 (NES)가 결여된 IRF를 포함한다. 예를 들어, 인간 IRF5의 핵 축적은 2 개의 류신 잔기를 알라닌으로 대체하여 (L157A/L159A) 인간 IRF5의 NES를 돌연변이시킴으로써 달성될 수 있다 (Lin 등 (2000) Molecular and Cellular Biology 20: 6342-6353). 특정 실시양태에 있어서, 조작된 IRF 전사 인자는 하나 이상의 IRF의 융합체, 하나 이상의 IRF의 단편의 융합체, 및 돌연변이된 IRF의 융합체를 포함한다.
NFκB는 또한 대식세포 M1 활성화와 관련된 주요 전사 인자이다. NFκB는 TNFα, IL1B, 사이클로옥시게나제 2 (COX-2), IL-6 및 IL12p40을 포함한 많은 염증성 유전자의 발현을 조절한다. NFκB 활성은 카파 B 키나제 (IKK) 삼량체 복합체 (2 개의 키나제, IKKα, IKKβ 및 조절 단백질 IKKγ)의 억제제의 활성화를 통해 조정된다. 업스트림 신호가 IKK 복합체에 수렴하는 경우, 먼저 인산화를 통해 IKKβ 키나제를 활성화시키고, 활성화된 IKKβ는 카파 B의 억제제 (I-κB)인 억제 분자를 추가로 인산화한다. 이는 I-κB의 프로테오좀 분해 및 NFκB/I-κB 복합체로부터 NFκB p65/p50 이종이량체의 방출을 초래한다. 그런 다음 NFκB p65/p50 이종이량체는 핵으로 전위되고 염증성 유전자의 프로모터에 결합한다.
IKKβ는 NFκB뿐만 아니라 다른 전사 인자, 예컨대, IRF5에 대한 활성화 키나제이다. IKKβ는 FOXO3, NCOA3, BCL10, IRS1, NEMO/IKBKG, NFκB 서브유닛 RELA 및 NFKB1뿐만 아니라 IKK-관련된 키나제 TBK1 및 IKBKE를 포함하여 여러 다른 시그널링 경로 구성요소를 유사하게 인산화한다. 특정 실시양태에 있어서, 인간 IKKβ의 아이소폼은 아이소폼 1 (UniProt 수탁 O14920-1, 서열번호 42), 아이소폼 2 (UniProt 수탁 O14920-2 서열번호 43), 아이소폼 3 (UniProt 수탁 O14920-3 서열번호 44) 및 아이소폼 4 (UniProt 수탁 O14920-4 서열번호 45)를 포함한다. 특정 실시양태에 있어서, 인간 IKKβ의 아이소폼은 서열번호 64에 도시된 뉴클레오티드 서열에 의해 코딩된 아이소폼 1, 서열번호 65에 도시된 뉴클레오티드 서열에 의해 코딩된 아이소폼 2, 서열번호 66에 도시된 뉴클레오티드 서열에 의해 코딩된 아이소폼 3, 및 서열번호 67에 도시된 뉴클레오티드 서열에 의해 코딩된 아이소폼 4를 포함한다. 특정 실시양태에 있어서, 뮤린 IKKβ는 서열번호 46에 도시된 아미노산 서열을 포함한다. 특정 실시양태에 있어서, 뮤린 IKKβ는 서열번호 68에 도시된 뉴클레오티드 서열에 의해 코딩된다.
본 개시내용은 종양 사멸을 위해 활성화된 상태로 TAM 재프로그래밍을 수행하기 위해 IRF를 활성화시킬 수 있는 하나 이상의 분자와 IRF 전사 인자의 공동-발현을 제공한다. 특정 실시양태에 있어서, 공동-발현 전략은 다음을 포함한다: IRF5 및 IKKβ의 공동-발현; IRF5 및 TANK-결합 키나제-1 (TBK-1), TNF 수용체-연관된 인자 6 (TRAF6) 어댑터, 수용체 상호작용 단백질 2 (RIP2) 키나제 및/또는 NFκB 키나제-ε (IKKε)의 공동-발현 (Chang Foreman H-C 등 (2012) PLoS One 7(3): e33098); IRF5 및 단백질 키나제 DNA-PK의 공동-발현 (Ryzhakov G 등 (2015) J of Interferon & Cytokine Res 35(2): 71-78); IRF5 및 단백질 키나제 티로신 키나제 BCR-ABL의 공동-발현 (Massimo M 등 (2014) Carcinogenesis 35(5):1132-1143); 및 COP9 시그널로좀의 하나 이상의 구성요소와 IRF5 또는 IRF8의 공동-발현 (Korczeniewska J 등 (2013) Mol Cell Biol 33(6):1124-1138; Cohen H 등 (2000) J Biol Chem 275(50):39081-39089).
표시된 바와 같이, 저산소증은 또한 저산소증 유도성 인자 HIF-1α 및 HIF-2α를 통해 대식세포 분극화에 영향을 미친다. HIF-1α는 NOS2 발현을 조절하고 M1 표현형의 출현을 지지하는 반면 HIF-2α는 Arg1 발현을 조절하고 M2 표현형의 출현을 지지한다 (Takeda N 등 (2010) Genes Dev 24: 491-501).
특정 실시양태에 있어서, IRF를 코딩하는 뉴클레오티드는 다른 IRF를 코딩하는 하나 이상의 추가적인 뉴클레오티드와 조합하여 사용된다. 특정 실시양태에 있어서, IRF를 코딩하는 뉴클레오티드는 다른 IRF를 코딩하는 하나 이상의 추가적인 뉴클레오티드 및 IKKβ를 코딩하는 뉴클레오티드와 조합하여 사용된다. 특정 실시양태에 있어서, IRF를 코딩하는 뉴클레오티드는 0.5:1, 1:1, 2:1, 3:1, 4:1, 또는 5:1의 비율로 IKKβ를 코딩하는 뉴클레오티드와 조합하여 사용된다. 특정 실시양태에 있어서, IRF를 코딩하는 뉴클레오티드는 IKKβ를 3:1의 비율로 코딩하는 뉴클레오티드와 조합하여 사용된다.
표 2는 M1 표현형과 M2 표현형 (M2a, M2b, M2c 및 M2d로 지정된 서브-표현형 포함)을 구별하는 데 사용될 수 있는 특정 기준 조합을 제공한다.
대식세포 표현형을 평가하기 위한 검정은 M1 또는 M2 표현형에 특정한 상이한 분자 시그니처를 이용할 수 있다. M1 대식세포에 대해 일반적으로 허용되는 마커 프로파일은 CD80+인 반면, M2-대식세포는 CD163+로서 특성화될 수 있다. 따라서, 유세포 분석을 수행하여 이러한 마커를 평가할 수 있다. M1 유형을 향하고 M2 유형에서 멀어지게 대식세포를 구동하는 것은 또한 IL-12/IL-10 비율 또는 CD163-/CD163+ 대식세포 비율의 증가를 측정함으로써 평가될 수 있다. 특정 실시양태에 있어서, M1 대 M2 형태는 광학 현미경에 의해 평가될 수 있다. 특정 실시양태에 있어서, 식세포작용 검정은 대식세포가 M1 유형인지 M2 표현형인지 평가하기 위해 다른 검정과 함께 사용될 수 있다. 상이한 대식세포 집단의 식세포작용 검정은 세포 당 정규화된 총 표면적과 일치하는 농도로 대식세포와 식세포작용될 엔티티를 항온처리함으로써 수행될 수 있다. 식세포작용될 엔티티는 대식세포 배양물에 첨가될 수 있다. 식세포작용될 엔티티는 예를 들어, 형광 표지로 표지될 수 있다. 식세포작용 지수는 대식세포 당 측정된 중앙값 총 형광 세기에 의해 결정될 수 있다. 식세포작용의 정량화는 예를 들어, 유세포 분석에 의해 이루어질 수 있다. 종양 세포 사멸 검정은 또한 이용될 수 있다. 특정 실시양태에 있어서, M1 표현형은 SerpinB2 (우로키나제-유형 플라스미노겐 활성화제의 억제제), CCL2 (C-C 모티프 케모카인 리간드 2), CCL11 (C-C 모티프 케모카인 리간드 11) 및 Retnla (레지스틴 유사 알파; Fizz1)를 포함하는 시그니처 M2 대식세포 유전자의 감소된 발현을 포함한다. 특정 실시양태에 있어서, M1 표현형은 CCL5 (C-C 모티프 케모카인 리간드 5)를 포함하는 M1 분화 유전자의 증가된 발현을 포함한다.
유전자 발현 (예컨대, CD80, CD86 및/또는 상기 언급된 다른 유전자의 M1 발현)은 숙련된 기술자에게 잘 알려진 검정에 의해 측정될 수 있다. 유전자 발현을 측정하는 방법은 NanoString nCounter® 발현 검정 (NanoString Technologies, Inc., Seattle, WA), 노던 블롯, 도트 블롯, 마이크로어레이, 유전자 발현의 일련 분석 (SAGE), RNA-seq 및 정량적 RT-PCR을 포함한다. 유전자 발현 산물, 예컨대, 단백질 수준을 측정하는 방법은 ELISA (효소 연결된 면역흡착 검정), 웨스턴 블롯, FACS, 방사성면역 검정 (RIA), 샌드위치 검정, 형광 인 시튜 혼성화 (FISH), 면역조직학적 염색, 면역전기영동, 면역침강, 검출 시약, 예컨대, 항체 또는 단백질 결합제를 사용하는 면역형광을 포함한다.
(ii) 세포 유인제. 특정 실시양태에 있어서, 세포 유인제는 해부학적 부위 (예컨대, 종양 부위)로 세포를 유인하는 데 사용된다. 특정 실시양태에 있어서, 세포 유인제는 선택된 해부학적 부위에서, 이에 또는 그 근처에 투여될 수 있다. 특정 실시양태에 있어서, 세포 유인제는 이들을 선택된 해부학적 부위로 지시하는 화합물과 함께 투여될 수 있다.
특정 실시양태에 있어서, 선택된 해부학적 부위는 종양 부위이고 T 세포는 종양 부위에 유인된다. 특정 실시양태에 있어서, 유인된 T 세포는 치료적 단백질을 일시적으로 발현하도록 변형되었거나 변형될 것인 선택된 T 세포를 포함한다. 특정 실시양태에 있어서, 유인된 세포는 치료적 단백질을 일시적으로 발현하도록 변형된 선택된 세포 유형의 활성을 지지하는 세포를 포함한다. 예를 들어, T 세포가 치료적 단백질을 일시적으로 발현하도록 변형되는 경우, 종양-특이적 T 세포를 지지하기 위해 NK 세포 또는 불변 NK (iNKT) 세포를 동원할 수 있다. 특정 실시양태에 있어서, 하나 초과의 세포 유형은 선택된 해부학적 부위에 유인될 수 있다.
특정 실시양태에 있어서, 선택된 세포는 사전컨디셔닝을 사용하여 해부학적 부위에 유인될 수 있다. 사전컨디셔닝은 해부학적 부위에 투여된 나노입자에 의해 재프로그래밍될 것인 세포를 동원하는 것을 지칭한다. 특정 실시양태에 있어서, 사전컨디셔닝은 T 세포를 종양 부위로 동원하고 동원된 T 세포를 본원에 기재된 나노입자로 재프로그래밍하여 종양-특이적 수용체를 일시적으로 발현시키는 것을 포함한다.
따라서, 임의로, 선택된 세포 유형에 의한 치료적 단백질의 발현을 유도하는 나노입자를 이용한 치료는 치료될 종양에 대한 T 세포 동원을 자극하기 위해 세포 유인제, 예컨대, T 세포 유인제와 협력될 수 있다. 적절한 T 세포 유인제는 CCL21 및 IP10을 포함한다. 추가적인 면역 세포 유인제는 당업계에 알려져 있다. 예로서, 다음의 세포/유인제 쌍이 인식된다:
당업자는 상이한 세포 유형이 상이한 유인제 처리에 의해 유인/동원될 수 있음을 인식할 것이다.
(iii) 나노입자. 이전에 나타낸 바와 같이, 본 개시내용 내에서 이용되는 나노입자는 (a) 선택된 세포 표적화 리간드; (b) 양으로-하전된 담체; (c) 양으로-하전된 담체 내의 핵산; 및 (d) 중성의 또는 음으로-하전된 코팅을 포함할 수 있다.
(a) 선택된 세포 표적화 리간드. 특정 실시양태에 있어서, 선택된 세포 표적화 리간드는 나노입자를 선택된 세포에 선택적으로 결합시키고 이들을 내재화하기 위해 신속한 수용체-유도된 내포작용을 개시하는 나노입자 표면-고정된 표적화 리간드를 포함할 수 있다. 특정 실시양태에 있어서, 선택된 세포 표적화 리간드는 중성의 또는 음으로-하전된 코팅을 만드는 중합체에 공유적으로 커플링된다.
특정 실시양태에 있어서, 선택된 세포 표적화 리간드는 항체 결합 도메인, scFv 단백질, DART 분자, 펩티드 및/또는 압타머를 포함할 수 있다. 특정 실시양태는 인간 T 세포를 형질주입시키기 위해 항-CD8, 항-CD3 및/또는 항-CD45 항체 결합 도메인, 및 조혈 줄기세포 (HSC)를 표적화하기 위해 CD34, CD133 또는 CD46을 인식하는 항체 결합 도메인을 이용한다. 대식세포를 포함한 다른 세포 유형에 대한 결합 도메인의 예는 또한 제공된다.
특정 실시양태에 있어서, 나노입자의 선택된 세포 표적화 리간드는 비균질 세포 집단 내에서 선택된 관심 세포 (예컨대, 면역 세포 또는 감염성 질환 세포, 또는 예를 들어, 바이러스 또는 다른 감염원으로 감염된 세포)에 선택적으로 결합한다. 본원에 개시된 조성물 및 방법에 따른 표적화를 위해, 선택된 세포는 현재 알려져 있거나 나중에 발견되는 마커와 연관된다.
특정 실시양태에 있어서, 마커는 항원이다. 항원은 면역글로불린 분자의 항원 결합 영역에 결합할 수 있거나 면역 반응, 예컨대, 주요 조직적합성 항원 (MHC) 세포 단백질 상의 항원의 제시에 의해 T 세포-매개된 면역 반응을 야기할 수 있는 물질을 지칭한다. "항원"은 항원 결정기, 합텐 및 면역원을 포함하며, 이는 펩티드, 소분자, 탄수화물, 지질, 핵산 또는 이들의 조합일 수 있다. T 세포에 제시하기 위해 처리되는 항원을 참고하는 경우, 용어 "항원"은 MHC에 의해 TCR에 제시된 T 세포 에피토프인 항원의 일부 (예컨대, 펩티드 단편)를 지칭한다. "항원"에 특이적인 항체 형태의 B 세포 매개된 면역 반응의 맥락에서 사용되는 경우, 항체의 가변 도메인 (경질 및 중질)의 상보성 결정 영역에 결합하는 항원 일부가 참고된다. 결합된 부분은 선형 또는 3-차원 에피토프일 수 있다.
특정 실시양태에 있어서, 선택된 관심 면역 세포는 림프구이다. 림프구는 T-세포, B 세포, NK 세포, 단핵구/대식세포 및 HSC를 포함한다.
각각 별개의 기능을 가진 T-세포의 여러 상이한 서브세트가 발견되었다. 특정 실시양태에 있어서, 선택된 세포 표적화 리간드는 수용체-매개된 내포작용을 통해 특정 림프구 집단에 대한 선택적 방향을 달성한다. 예를 들어, 대다수의 T-세포는 여러 단백질의 복합체로서 존재하는 T-세포 수용체 (TCR)를 가지고 있다. 천연 T-세포 수용체는 비의존적인 T-세포 수용체 알파 및 베타 (TCRα 및 TCRβ) 유전자로부터 생산되고 α- 및 β-TCR 쇄로 칭하는 2 개의 분리된 펩티드 쇄로 구성된다. 본원에 개시된 선택된 세포 표적화 리간드는 α- 및/또는 β-TCR 쇄에 결합하여, 이들 T 세포에 대한 핵산의 선택적 전달을 달성할 수 있다.
γδ T-세포는 표면 상에 별개의 T-세포 수용체 (TCR)를 보유하는 T-세포의 작은 서브세트를 나타낸다. γδ T-세포에서, TCR은 하나의 γ-쇄 및 하나의 δ-쇄로 이루어진다. 이 T-세포 군은 αβ T-세포보다 훨씬 덜 일반적이다 (총 T-세포의 2%). 그럼에도 불구하고, 본원에 개시된 선택된 세포 표적화 리간드는 γ- 및/또는 δ TCR 쇄에 결합하여 이들 T 세포에 대한 핵산의 선택적 전달을 달성할 수 있다.
CD3은 모든 성숙한 T 세포 상에 발현된다. 따라서, 본원에 개시된 선택된 세포 표적화 리간드는 CD3에 결합하여 모든 성숙한 T-세포에 대한 핵산의 선택적 전달을 달성할 수 있다. 활성화된 T-세포는 4-1BB (CD137), CD69 및 CD25를 발현한다. 따라서, 본원에 개시된 선택된 세포 표적화 리간드는 4-1BB, CD69 또는 CD25에 결합하여 활성화된 T-세포에 대한 핵산의 선택적 전달을 달성할 수 있다. CD5 및 트랜스페린 수용체는 또한 T-세포에서 발현되며 T-세포에 대한 핵산의 선택적 전달을 달성하기 위해 사용할 수 있다.
T-세포는 헬퍼 세포 (CD4+ T-세포) 및 세포용해성 T-세포를 포함하는 세포독성 T-세포 (CTL, CD8+ T-세포)로 추가로 구분될 수 있다. T 헬퍼 세포는 다른 기능 중에서도 B 세포의 형질 세포로의 성숙 및 세포독성 T-세포 및 대식세포의 활성화를 포함하여 면역학적 과정에서 다른 백혈구 세포를 보조한다. 이들 세포는 또한 표면 상에 CD4 단백질을 발현하기 때문에 CD4+ T-세포로서 알려져 있다. 헬퍼 T-세포는 항원 제시 세포 (APC)의 표면 상에 발현되는 MHC 클래스 II 분자에 의해 펩티드 항원이 제시될 때 활성화된다. 활성화시, 이들은 신속하게 분열하고 활성 면역 반응을 조절하거나 보조하는 사이토카인으로 불리는 작은 단백질을 분비한다. 본원에 개시된 선택된 세포 표적화 리간드는 CD4에 결합하여 T 헬퍼 세포에 대한 핵산의 선택적 전달을 달성할 수 있다.
세포독성 T-세포는 바이러스에 감염된 세포 및 종양 세포를 파괴하고, 또한 이식 거부에 연루된다. 이들 세포는 표면 상에 CD8 당단백질을 발현하기 때문에 CD8+ T-세포로서 또한 알려져 있다. 이들 세포는 신체의 거의 모든 세포의 표면 상에 존재하는 MHC 클래스 I과 연관된 항원에 결합함으로써 이들의 표적을 인식한다. 본원에 개시된 선택된 세포 표적화 리간드는 CD8에 결합하여 CTL에 대한 핵산의 선택적 전달을 달성할 수 있다.
본원에 사용된 "중심 기억" T-세포 (또는 "TCM")는 이들의 표면 상에 CD62L 또는 CCR7 및 CD45RO를 발현하고, 나이브 세포와 비교하여 CD45RA를 발현하지 않거나 감소된 발현을 갖는 항원 경험 CTL을 지칭한다. 특정 실시양태에 있어서, 중심 기억 세포는 CD62L, CCR7, CD25, CD127, CD45RO 및 CD95의 발현에 대해 양성이고, 나이브 세포와 비교하여 CD45RA의 감소된 발현을 갖는다. 본원에 개시된 선택된 세포 표적화 리간드는 CD62L, CCR7, CD25, CD127, CD45RO 및/또는 CD95에 결합하여 TCM에 대한 핵산의 선택적 전달을 달성할 수 있다.
본원에 사용된 "이펙터 기억" T-세포 (또는 "TEM")는 중심 기억 세포와 비교하여 이의 표면 상에 CD62L이 발현되지 않거나 감소된 발현을 갖고, 나이브 세포와 비교하여 CD45RA이 발현되지 않거나 감소된 발현을 갖는 항원 경험 T-세포를 지칭한다. 특정 실시양태에 있어서, 이펙터 기억 세포는 나이브 세포 또는 중심 기억 세포와 비교하여 CD62L 및 CCR7의 발현에 대해 음성이고, CD28 및 CD45RA의 가변 발현을 갖는다. 이펙터 T-세포는 기억 또는 나이브 T-세포와 비교하여 그랜자임 B 및 퍼포린에 대해 양성이다. 본원에 개시된 선택된 세포 표적화 리간드는 그랜자임 B 및/또는 퍼포린에 결합하여 TEM에 대한 핵산의 선택적 전달을 달성할 수 있다.
조절 T 세포 ("TREG")는 면역계를 조정하고, 자가-항원에 대한 내성을 유지하며, 자가면역 질환을 소거하는 T 세포의 서브집단이다. TREG는 CD25, CTLA-4, GITR, GARP 및 LAP을 발현한다. 본원에 개시된 선택된 세포 표적화 리간드는 CD25, CTLA-4, GITR, GARP 및/또는 LAP에 결합하여 나이브 TREG에 대한 핵산의 선택적 전달을 달성할 수 있다.
본원에 사용된 "나이브" T-세포는 CD62L 및 CD45RA를 발현하고 중심 또는 이펙터 기억 세포와 비교하여 CD45RO를 발현하지 않는 비-항원 경험 T 세포를 지칭한다. 특정 실시양태에 있어서, 나이브 CD8+ T 림프구는 CD62L, CCR7, CD28, CD127 및 CD45RA를 포함하는 나이브 T-세포의 표현형 마커의 발현을 특징으로 한다. 본원에 개시된 선택된 세포 표적화 리간드는 CD62L, CCR7, CD28, CD127 및/또는 CD45RA에 결합하여 나이브 T-세포에 대한 핵산의 선택적 전달을 달성할 수 있다.
NK 세포 (또한 K 세포 및 살해 세포로서 알려짐)는 인터페론 또는 대식세포-유래된 사이토카인에 반응하여 활성화된다. 이들은 바이러스 감염을 억제하는 역할을 하는 동안 입양 면역 반응은 감염을 제거할 수 있는 항원-특이적 세포독성 T 세포를 생성한다. NK 세포는 CD8, CD16 및 CD56을 발현하나, CD3은 발현하지 않는다. 본원에 개시된 선택된 세포 표적화 리간드는 CD8, CD16 및/또는 CD56에 결합하여 NK 세포에 대한 핵산의 선택적 전달을 달성할 수 있다.
대식세포 (및 이들의 전구체, 단핵구)는 신체의 모든 조직 (특정 경우에는 미세아교세포, 쿠퍼 세포 및 파골세포)에 존재하며, 여기서 이들은 세포자멸사 세포, 병원체 및 기타 비-자가-구성요소를 에워싼다. 단핵구/대식세포가 비-자가-구성요소를 에워싸기 때문에, 특정 대식세포- 또는 단핵구-지시제는 이들 세포에 의한 선택적 섭취를 위해 본원에 기재된 나노입자에 필요하지 않다. 대안적으로, 본원에 개시된 선택된 세포 표적화 리간드는 CD11b, F4/80; CD68; CD11c; IL-4Rα; 및/또는 CD163에 결합하여 단핵구/대식세포에 대한 핵산의 선택적 전달을 달성할 수 있다. 대식세포는 TCR을 발현하지 않을 것이므로 TCR 단백질 또는 CAR/TCR 하이브리드 단백질을 코딩하는 mRNA를 포함하는 본원에 기재된 나노입자 입자에 대한 원하는 표적이 아니라는 것이 인식된다.
미성숙 수지상 세포 (즉, 사전-활성화)는 주변에서 항원 및 기타 비-자가-구성요소를 섭취하여, 차후에 활성화된 형태로 T-세포에 항원 제시를 제공하는 림프 조직의 T-세포 영역으로 이동한다. 따라서, 대식세포와 같이 수지상 세포의 표적화는 선택된 세포 표적화 리간드에 의존할 필요가 없다. 선택된 세포 표적화 리간드를 사용하여 수지상 세포를 선택적으로 표적화하는 경우, 다음의 CD 항원에 결합할 수 있다: CD1a, CD1b, CD1c, CD1d, CD21, CD35, CD39, CD40, CD86, CD101, CD148, CD209 및 DEC-205.
B 세포는 B 세포 수용체 (BCR)의 존재에 의해 다른 림프구와 구별될 수 있다. B 세포의 주요 기능은 항체를 만드는 것이다. B 세포는 CD5, CD19, CD20, CD21, CD22, CD35, CD40, CD52 및 CD80을 발현한다. 본원에 개시된 선택된 세포 표적화 리간드는 CD5, CD19, CD20, CD21, CD22, CD35, CD40, CD52, 및/또는 CD80에 결합하여 B-세포에 대한 핵산의 선택적 전달을 달성할 수 있다. B-세포 수용체 아이소타입 불변 영역 (IgM, IgG, IgA, IgE)을 표적화하는 항체는 또한 B-세포 서브타입을 표적화하기 위해 사용될 수 있다.
림프구 기능-연관된 항원 1 (LFA-1)은 모든 T-세포, B-세포 및 단핵구/대식세포에 의해 발현된다. 따라서, 본원에 개시된 선택된 세포 표적화 리간드는 LFA-1에 결합하여 T-세포, B-세포 및 단핵구/대식세포에 대한 핵산의 선택적 전달을 달성할 수 있다.
HSC는 또한 본원에 개시된 나노입자의 선택적 전달을 위해 표적화될 수 있다. HSC는 CD34, CD46, CD133, Sca-1 및 CD117을 발현한다. 본원에 개시된 선택된 세포 표적화 리간드는 CD34, CD46, CD133, Sca-1 및/또는 CD117에 결합하여 조혈 줄기세포에 대한 핵산의 선택적 전달을 달성할 수 있다.
"선택적 전달"은 핵산이 하나 이상의 선택된 림프구 집단에 의해 전달되고 발현됨을 의미한다. 특정 실시양태에 있어서, 선택적 전달은 선택된 림프구 집단에 배타적이다. 특정 실시양태에 있어서, 투여된 핵산의 적어도 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 99%은 선택된 림프구 집단에 의해 전달되고/되거나 발현된다. 특정 실시양태에 있어서, 선택적 전달은 비-림프구 세포가 전달된 핵산을 발현하지 않도록 보장한다. 예를 들어, 표적화제가 T-세포 수용체 (TCR) 유전자인 경우, 오직 T 세포만이 TCR 발현에 필요한 제타 쇄을 가지고 있기 때문에 선택성이 보장된다. 선택적 전달은 또한 선택되지 않은 세포로의 핵산 섭취의 결여를 기반으로 할 수 있다.
선택된 세포 표적화 리간드는 림프구 세포에서 발견되는 모티프에 대한 결합 도메인을 포함할 수 있다. 선택된 세포 표적화 리간드는 또한 림프구로의 선택적 섭취를 허용하는 임의의 선택적 결합 메커니즘을 포함할 수 있다. 특정 실시양태에 있어서, 선택된 세포 표적화 리간드는 T-세포 수용체 모티프; T-세포 α 쇄; T-세포 β 쇄; T-세포 γ 쇄; T-세포 δ 쇄; CCR7; CD1a; CD1b; CD1c; CD1d; CD3; CD4; CD5; CD7; CD8; CD11b; CD11c; CD16; CD19; CD20; CD21; CD22; CD25; CD28; CD34; CD35; CD39; CD40; CD45RA; CD45RO; CD46, CD52; CD56; CD62L; CD68; CD80; CD86; CD95; CD101; CD117; CD127; CD133; CD137 (4-1BB); CD148; CD163; F4/80; IL-4Rα; Sca-1; CTLA-4; GITR; GARP; LAP; 그랜자임 B; LFA-1; 트랜스페린 수용체; 및 이들의 조합에 대한 결합 도메인을 포함한다.
특정 실시양태에 있어서, 결합 도메인은 세포 마커 리간드, 수용체 리간드, 항체 결합 도메인, 펩티드, 펩티드 압타머, 핵산, 핵산 압타머, 스피에겔머 또는 이들의 조합을 포함한다. 선택된 세포 표적화 리간드의 맥락에서, 결합 도메인은 내포작용을 매개할 수 있는 복합체를 형성하기 위해 다른 물질에 결합하는 임의의 물질을 포함한다.
항체 결합 도메인은 항체의 결합 단편, 예컨대, Fv, Fab, Fab', F(ab')2 및 단일 쇄 Fv 단편 (scFv) 또는 림프구에 의해 발현된 모티프에 특이적으로 결합하는 면역글로불린의 임의의 생물학적 유효 단편을 포함한다. 항체 또는 항원 결합 단편은 폴리클로날 항체, 모노클로날 항체, 인간 항체, 인간화된 항체, 합성 항체, 키메라 항체, 이중특이적 항체, 미니 바디 및 선형 항체의 전부 또는 일부를 포함한다.
인간 기원의 항체 또는 인간화된 항체는 인간에서 면역원성이 저하되거나 전혀 없으며 비-인간 항체에 비해 더 적은 수의 비-면역원성 에피토프를 갖는다. 항체 및 이들의 단편은 일반적으로 인간 대상체에서 항원성이 감소된 수준을 갖거나 없는 것으로 선택될 것이다.
림프구에 의해 발현된 모티프에 특이적으로 결합하는 항체는 모노클로날 항체를 수득하는 방법, 파지 디스플레이 방법, 인간 또는 인간화된 항체를 생성하는 방법, 또는 당업자에게 알려진 바와 같이 항체를 생산하도록 조작된 트랜스제닉 동물 또는 식물을 사용하는 방법을 사용하여 제조될 수 있다 (예를 들어, 미국 특허 번호 6,291,161 및 6,291,158 참고). 부분적으로 또는 완전히 합성된 항체의 파지 디스플레이 라이브러리가 이용가능하며 림프구 모티프에 결합할 수 있는 항체 또는 이의 단편에 대해 스크리닝될 수 있다. 예를 들어, 결합 도메인은 관심 표적에 특이적으로 결합하는 Fab 단편에 대한 Fab 파지 라이브러리를 스크리닝함으로써 식별될 수 있다 (Hoet 등, Nat. Biotechnol. 23:344, 2005 참고). 인간 항체의 파지 디스플레이 라이브러리가 또한 이용가능하다. 또한, 편리한 시스템 (예컨대, 마우스, HuMAb mouse® (GenPharm Int'l, Inc., Mountain View, CA, TC mouse™ (Kyowa Hakko Kirin Co., Tokyo, JP; 예컨대, Takauchi 등, J. Periodontol. 2005 May 76(5):680-5), KM-mouse® (Medarex, Inc., Princeton, NJ), 라마, 닭, 랫트, 햄스터, 토끼 등)을 사용하여 결합 도메인을 개발할 수 있다. 특정 실시양태에 있어서, 항체는 선택된 림프구에 의해 발현된 모티프에 특이적으로 결합하고 비특이적 구성요소 또는 관련되지 않은 표적과 교차 반응하지 않는다. 일단 식별되면, 항체를 코딩하는 아미노산 서열 또는 핵산 서열이 단리되고/되거나 결정될 수 있다.
특정 실시양태에 있어서, 선택된 세포 표적화 리간드의 결합 도메인은 T-세포 수용체 모티프 항체; T-세포 α 쇄 항체; T-세포 β 쇄 항체; T-세포 γ 쇄 항체; T-세포 δ 쇄 항체; CCR7 항체; CD1a 항체; CD1b 항체; CD1c 항체; CD1d 항체; CD3 항체; CD4 항체; CD5 항체; CD7 항체; CD8 항체; CD11b 항체; CD11c 항체; CD16 항체; CD19 항체; CD20 항체; CD21 항체; CD22 항체; CD25 항체; CD28 항체; CD34 항체; CD35 항체; CD39 항체; CD40 항체; CD45RA 항체; CD45RO 항체; CD46 항체; CD52 항체; CD56 항체; CD62L 항체; CD68 항체; CD80 항체; CD86 항체 CD95 항체; CD101 항체; CD117 항체; CD127 항체; CD133 항체; CD137 (4-1BB) 항체; CD148 항체; CD163 항체; F4/80 항체; IL-4Rα 항체; Sca-1 항체; CTLA-4 항체; GITR 항체; GARP 항체; LAP 항체; 그랜자임 B 항체; LFA-1 항체; 또는 트랜스페린 수용체 항체를 포함한다. 이들 결합 도메인은 또한 전술한 항체의 scFv 단편으로 이루어질 수 있다.
본 개시내용의 방법 및 조성물에 유용한 예시적인 항체 (예컨대, scFvs)는 WO2014164553A1, US20170283504, US7083785B2, US10189906B2, US10174095B2, WO2005102387A2, US20110206701A1, WO2014179759A1, US20180037651A1, US20180118822A1, WO2008047242A2, WO1996016990A1, WO2005103083A2, 및 WO1999062526A2에 제공된 것들을 포함하며, 이들 각각은 본원에 참고로 원용된다.
펩티드 압타머는 단백질 스캐폴드의 단부 둘 다에 부착된 펩티드 루프 (이는 표적 단백질에 특이적임)를 포함한다. 이 이중 구조적 제약은 펩티드 압타머의 결합 친화도를 항체에 필적하는 수준으로 크게 증가시킨다. 가변 루프 길이는 전형적으로 8 내지 20 개의 아미노산 (예컨대, 8 내지 12 개의 아미노산)이며, 스캐폴드는 안정하고 가용성이고 작으며 비-독성인 임의의 단백질 (예컨대, 티오레독신-A, 스테핀 A 삼중 돌연변이체, 녹색 형광 단백질, 에글린 C 및 세포 전사 인자 Spl)일 수 있다. 펩티드 압타머 선택은 상이한 시스템, 예컨대, 효모 이중-하이브리드 시스템 (예컨대, Gal4 효모-이중-하이브리드 시스템) 또는 LexA 상호작용 트랩 시스템을 사용하여 만들 수 있다.
핵산 압타머는 Osborne 등 Curr. Opin. Chem. Biol. 1:5-9, 1997; 및 Cerchia 등, FEBS Letters 528:12-16, 2002에 의해 기재된 바와 같이, 표적 단백질 또는 높은 친화도 및 특이성을 갖는 다른 분자에 대한 결합을 지시하는 특정 구상 구조로 접힘으로써 기능하는 단일-가닥 핵산 (DNA 또는 RNA) 리간드이다. 특정 실시양태에 있어서, 압타머는 작다 (15 KD; 또는 15-80 개 사이의 뉴클레오티드 또는 20-50 개 사이의 뉴클레오티드). 압타머는 일반적으로 SELEX (지수적 농축에 의한 리간드의 체계적인 진화; 예를 들어, Tuerk 등, Science, 249:505-510, 1990; Green 등, Methods Enzymology. 75-86, 1991; 및 Gold 등, Annu. Rev. Biochem., 64:763-797, 1995 참고)로 칭하는 절차에 의해 1014-1015 개의 랜덤 올리고뉴클레오티드 서열을 포함하는 라이브러리로부터 단리된다. 압타머를 생성하는 추가 방법은 예를 들어, 미국 특허 번호 6,344,318; 6,331,398; 6,110,900; 5,817,785; 5,756,291; 5,696,249; 5,670,637; 5,637,461; 5,595,877; 5,527,894; 5,496,938; 5,475,096; 및 5,270,16에 기재된다. 스피에겔머는 하나 이상의 β-리보스 유닛이 β-D-데옥시리보스 또는 예를 들어, β-D-리보스, α-D-리보스, β-L-리보스로부터 선택된 변형된 당 유닛으로 대체된다는 점을 제외하고는 핵산 압타머와 유사하다.
특정 실시양태에 있어서, Egr2는 M2 대식세포에 표적화된다. Egr2에 대해 상업적으로 이용가능한 항체는 Thermo Fisher, Waltham, MA; Abcam, Cambridge, MA; Millipore Sigma, Burlington, MA; Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Germany; LifeSpan Biosciences, Inc., Seattle, WA; 및 Novus Biologicals, Littleton, CO로부터 수득될 수 있다. 항-Egr2 항체의 생성은 예를 들어, Murakami K 등 (1993) Oncogene 8(6): 1559-1566에서 논의된다. 항-Egr2 항체는 다음을 포함한다: 토끼 모노클로날 항-Egr2 항체 클론 EPR4004; 마우스 모노클로날 항-Egr2 항체 클론 1G5; 마우스 모노클로날 항-Egr2 항체 클론 OTI1B12; 인간 Egr2의 AA 잔기 200-300을 인식하는 토끼 폴리클로날 항-Egr2 항체; 인간 Egr2의 AA 잔기 340-420을 인식하는 토끼 폴리클로날 항-Egr2 항체; 및 인간 Egr2의 AA 잔기 370-420을 인식하는 토끼 폴리클로날 항-Egr2 항체. 결합 도메인은 이들 항체 및 본원에 개시된 다른 항체로부터 유래될 수 있다.
CD206에 특이적인 다수의 추가 항체가 당업자에게 공지되어 있으며 서열, 에피토프 결합 및 친화도에 대해 용이하게 특성화될 수 있다. 예를 들어, WO 2014/140376, WO 2013/174537 및 US 7,560,534를 참고한다. CD206에 대해 상업적으로 이용가능한 항체는 Thermo Fisher, Waltham, MA; Proteintech, Rosemont, IL; BioLegend, San Diego, CA; R & D Systems, Minneapolis, MN; LifeSpan Biosciences, Inc., Seattle, WA; Novus Biologicals, Littleton, CO; 및 Bio-Rad, Hercules, CA로부터 수득될 수 있다. 특정 실시양태에 있어서, 항-CD206 항체는 랫트 모노클로날 항-마우스 CD206 모노클로날 항체 클론 C068C2 (Cat # 141732, Biolegend, San Diego, CA)를 포함한다.
특정 실시양태에 있어서, 표적화 리간드는 ASQSVSHDV (서열번호 69)를 포함하는 CDRL1 서열, YTS를 포함하는 CDRL2 서열 및 QDYSSPRT (서열번호 70)를 포함하는 CDRL3 서열을 포함하는 가변 경쇄를 포함하는 인간 또는 인간화된 결합 도메인 (예컨대, scfv)을 포함한다. 특정 실시양태에 있어서, 표적화 리간드는 GYSITSDY (서열번호 71)를 포함하는 CDRH1 서열, YSG를 포함하는 CDRH2 서열, 및 CVSGTYYFDYWG (서열번호 72)를 포함하는 CDRH3 서열을 포함하는 가변 중쇄를 포함하는 인간 또는 인간화된 결합 도메인 (예컨대, scfv)을 포함한다. 이들은 CD163에 결합하는 Mac2-48 항체의 CDR 서열을 반영한다.
특정 실시양태에 있어서, 표적화 리간드는 ASQSVSSDV (서열번호 73)를 포함하는 CDRL1 서열, YAS를 포함하는 CDRL2 서열 및 QDYTSPRT (서열번호 74)를 포함하는 CDRL3 서열을 포함하는 가변 경쇄를 포함하는 인간 또는 인간화된 결합 도메인 (예컨대, scfv)을 포함한다. 특정 실시양태에 있어서, 표적화 리간드는 GYSITSDY (서열번호 75)를 포함하는 CDRH1 서열, YSG를 포함하는 CDRH2 서열, 및 CVSGTYYFDYWG (서열번호 76)를 포함하는 CDRH3 서열을 포함하는 가변 중쇄를 포함하는 인간 또는 인간화된 결합 도메인 (예컨대, scfv)을 포함한다. 이들은 CD163에 결합하는 Mac2-158 항체의 CDR 서열을 반영한다.
CD163에 특이적인 다수의 추가 항체 또는 결합 도메인이 당업자에게 알려져 있으며 서열, 에피토프 결합 및 친화도에 대해 용이하게 특성화될 수 있다. 예를 들어, WO 2011/039510, WO 2002/032941, WO 2002/076501, 및 US 2005/0214871을 참고한다. CD163에 대해 상업적으로 이용가능한 항체는 Thermo Fisher, Waltham, MA; Enzo Life Sciences, Inc., Farmingdale, NY; BioLegend, San Diego, CA; R & D Systems, Minneapolis, MN; LifeSpan Biosciences, Inc., Seattle, WA; 및 RDI Research Diagnostics, Flanders, NJ로부터 수득될 수 있다. 특정 실시양태에 있어서, 항-CD163 항체는 다음을 포함할 수 있다: 마우스 모노클로날 항-CD163 항체 클론 3D4; 마우스 모노클로날 항-CD163 항체 클론 Ber-Mac3; 마우스 모노클로날 항-CD163 항체 클론 EDHu-1; 및 마우스 모노클로날 항-CD163 항체 클론 GHI/61.
특정 실시양태에 있어서, 표적화 리간드는 RSSKSLLYKDGKTYLN (서열번호 77)을 포함하는 CDRL1 서열, LMSTRAS (서열번호 78)를 포함하는 CDRL2 서열, 및 QQLVEYPFT (서열번호 79)를 포함하는 CDRL3 서열을 포함하는 가변 경쇄를 포함하는 인간 또는 인간화된 결합 도메인 (예컨대, scfv)를 포함한다. 특정 실시양태에 있어서, 표적화 리간드는 GYWMS (서열번호 80)를 포함하는 CDRH1 서열, EIRLKSDNYATHYAESVKG (서열번호 81)를 포함하는 CDRH2 서열, 및 FID를 포함하는 CDRH3 서열을 포함하는 가변 중쇄를 포함하는 인간 또는 인간화된 결합 도메인 (예컨대, scfv)을 포함한다. 이들은 CD23에 결합하는 CDR 서열을 반영한다.
CD23에 특이적인 다수의 항체 또는 결합 도메인이 당업자에게 알려져 있으며 서열, 에피토프 결합 및 친화도에 대해 용이하게 특성화될 수 있다. 예를 들어, US 7,008,623, US 6,011,138 A (5E8, 6G5, 2C8, B3B1 및 3G12를 포함하는 항체), US 2009/0252725, Rector 등 (1985) J. Immunol. 55: 481-488; Flores-Rumeo 등 (1993) Science 241: 1038-1046; Sherr 등 (1989) J. Immunol. 142: 481-489; 및 Pene 등, (1988) PNAS 85: 6820-6824를 참고한다. CD23에 대해 상업적으로 이용가능한 항체는 Thermo Fisher, Waltham, MA; Abcam, Cambridge, MA; Bioss Antibodies, Inc., Woburn, MA; Bio-Rad, Hercules, CA; LifeSpan Biosciences, Inc., Seattle, WA; 및 Boster Biological Technology, Pleasanton, CA로부터 수득될 수 있다. 특정 실시양태에 있어서, 항-CD23 항체는 다음을 포함할 수 있다: 마우스 모노클로날 항-CD23 항체 클론 Tu 1; 토끼 모노클로날 항-CD23 항체 클론 SP23; 토끼 모노클로날 항-CD23 항체 클론 EPR3617; 마우스 모노클로날 항-CD23 항체 클론 5B5; 마우스 모노클로날 항-CD23 항체 클론 1B12; 마우스 모노클로날 항-CD23 항체 클론 M-L23.4; 및 마우스 모노클로날 항-CD23 항체 클론 3A2.
M1 결합 도메인. 특정 실시양태에 있어서, 표적화 리간드는 SSNIGDNY (서열번호 82)를 포함하는 CDRL1 서열, RDS를 포함하는 CDRL2 서열, 및 QSYDSSLSGS (서열번호 83)를 포함하는 CDRL3 서열을 포함하는 가변 경쇄를 포함하는 인간 또는 인간화된 결합 도메인 (예컨대, scfv)을 포함한다. 특정 실시양태에 있어서, 표적화 리간드는 GFTFDDYG (서열번호 84)를 포함하는 CDRH1 서열, ISWNGGKT (서열번호 85)를 포함하는 CDRH2 서열, 및 ARGSLFHDSSGFYFGH (서열번호 86)를 포함하는 CDRH3 서열을 포함하는 가변 중쇄를 포함하는 인간 또는 인간화된 결합 도메인 (예컨대, scfv)을 포함한다. 이들은 CD38에 결합하는 Ab79 항체의 CDR 서열을 반영한다.
특정 실시양태에 있어서, 표적화 리간드는 NSNIGSNT (서열번호 87)를 포함하는 CDRL1 서열, SDS를 포함하는 CDRL2 서열, 및 QSYDSSLSGSR (서열번호 88)을 포함하는 CDRL3 서열을 포함하는 가변 경쇄를 포함하는 인간 또는 인간화된 결합 도메인 (예컨대, scfv)을 포함한다. 특정 실시양태에 있어서, 표적화 리간드는 GFTFNNYG (서열번호 89)를 포함하는 CDRH1 서열, ISYDGSDK (서열번호 90)를 포함하는 CDRH2 서열, 및 ARVYYYGFSGPSMDV (서열번호 91)를 포함하는 CDRH3 서열을 포함하는 가변 중쇄를 포함하는 인간 또는 인간화된 결합 도메인 (예컨대, scfv)을 포함한다. 이들은 CD38에 결합하는 Ab19 항체의 CDR 서열을 반영한다.
특정 실시양태에 있어서, 표적화 리간드는 RASQSVSSYLA (서열번호 92)를 포함하는 CDRL1 서열, DASNRAT (서열번호 93)를 포함하는 CDRL2 서열, 및 QQRSNWPPTF (서열번호 94)를 포함하는 CDRL3 서열을 포함하는 가변 경쇄를 포함하는 인간 또는 인간화된 결합 도메인 (예컨대, scfv)을 포함한다. 특정 실시양태에 있어서, 표적화 리간드는 SFAMS (서열번호 95)를 포함하는 CDRH1 서열, AISGSGGGTYYADSVKG (서열번호 96)를 포함하는 CDRH2 서열, 및 DKILWFGEPVFDY (서열번호 97)를 포함하는 CDRH3 서열을 포함하는 가변 중쇄를 포함하는 인간 또는 인간화된 결합 도메인 (예컨대, scfv)을 포함한다. 이들은 US 7,829,693에 기재된 CD38에 결합하는 다라투무맙 항체의 CDR 서열을 반영한다.
CD38에 대해 특이적인 다수의 항체는 당업자에게 알려져 있으며 서열, 에피토프 결합 및 친화도에 대해 용이하게 특성화될 수 있다. 예를 들어, WO 2005/103083, WO 2006/125640, WO 2007/042309, WO 2008/047242, WO 2012/092612, WO 2006/099875, WO 2011/154453, WO 2015/130728, US 7,829,693, 및 US 2016/0200828을 참고한다. CD38에 대해 상업적으로 이용가능한 항체는 Thermo Fisher, Waltham, MA; Abcam, Cambridge, MA; 및 Millipore Sigma, Burlington, MA로부터 수득될 수 있다. 특정 실시양태에 있어서, 항-CD23 항체는 다음을 포함할 수 있다: 토끼 모노클로날 항-CD38 항체 클론 GAD-3; 마우스 모노클로날 항-CD38 항체 클론 HIT2; 마우스 모노클로날 항-CD38 항체 클론 AT1; 마우스 모노클로날 항-CD38 항체 클론 AT13/5; 랫트 모노클로날 항-CD38 항체 클론 NIMR-5; 및 랫트 모노클로날 IgG2a, κ 항-CD38 항체 클론 90/CD38 (Cat # BD Biosciences, San Jose, CA).
특정 실시양태에 있어서, G-단백질 커플링된 수용체 18 (Gpr18)은 M1 대식세포에 표적화된다. Gpr18에 대해 상업적으로 이용가능한 항체는 Assay Biotechnology Company Inc., Sunnyvale, CA; Thermo Fisher, Waltham, MA; Abcam, Cambridge, MA; GeneTex, Inc., Irvine, CA; 및 Novus Biologicals, Littleton, CO로부터 수득될 수 있다. 특정 실시양태에 있어서, 항-Gpr18 항체는 다음을 포함한다: 인간 Gpr18의 아미노산 1-50의 일부를 인식하는 토끼 폴리클로날 항-Gpr18 항체; 인간 Gpr18의 아미노산 160-240을 포함하는 영역을 인식하는 토끼 폴리클로날 항-Gpr18 항체; 인간 Gpr18의 아미노산 100-180을 포함하는 영역을 인식하는 토끼 폴리클로날 항-Gpr18 항체; 토끼 모노클로날 항-Gpr18 항체 클론 EPR12359; 및 인간 Gpr18의 아미노산 140-190을 포함하는 영역을 인식하는 토끼 폴리클로날 항-Gpr18 항체.
특정 실시양태에 있어서, 포르밀 펩티드 수용체 2 (Fpr2)는 M1 대식세포에 표적화된다. Fpr2에 대해 상업적으로 이용가능한 항체는 Atlas Antibodies, Bromma, Sweden; Biorbyt, LLC, San Francisco, CA; Cloud-Clone Corp., Katy, TX; US Biological Life Sciences, Salem, MA; 및 Novus Biologicals, Littleton, CO로부터 수득될 수 있다. 특정 실시양태에 있어서, 항-fpr2 항체는 다음을 포함한다: 마우스 모노클로날 항-fpr2 항체 클론 GM1D6; 마우스 모노클로날 항-fpr2 항체 클론 304405; 재조합 항-fpr2 항체 클론 REA663; 및 fpr2의 아미노산 300-350을 포함하는 영역을 인식하는 토끼 폴리클로날 항-fpr2 항체.
특정 실시양태에 있어서, 표적화 리간드는 RASQSVSSYLA (서열번호 98)를 포함하는 CDRL1 서열, DASSRAT (서열번호 99)를 포함하는 CDRL2 서열, 및 QLRSNWPPYT (서열번호 92)를 포함하는 CDRL3 서열을 포함하는 가변 경쇄를 포함하는 인간 또는 인간화된 결합 도메인 (예컨대, scfv)을 포함한다. 특정 실시양태에 있어서, 표적화 리간드는 GYGMH (서열번호 100)를 포함하는 CDRH1 서열, VIWYDGSNKYYADSVKG (서열번호 101)를 포함하는 CDRH2 서열, 및 DTGDRFFDY (서열번호 102)를 포함하는 CDRH3 서열을 포함하는 가변 중쇄를 포함하는 인간 또는 인간화된 결합 도메인 (예컨대, scfv)을 포함한다. 이들은 CD64에 결합하는 CDR 서열을 반영한다.
CD64에 특이적인 다수의 항체는 당업자에게 알려져 있으며 서열, 에피토프 결합 및 친화도에 대해 용이하게 특성화될 수 있다. 예를 들어, US 7,378,504, WO 2006/131953, 및 WO 2008/074867을 참고한다. CD64에 대해 상업적으로 이용가능한 항체는 Ancell, Bayport, MN; Thermo Fisher, Waltham, MA; Abcam, Cambridge, MA; LifeSpan Biosciences, Inc., Seattle, WA; 및 Novus Biologicals, Littleton, CO로부터 수득될 수 있다. 특정 실시양태에 있어서, 항-CD64 항체는 다음을 포함한다: 마우스 모노클로날 항-CD64 항체 클론 32-2; 마우스 모노클로날 항-CD64 항체 클론 UMAB74; 랫트 모노클로날 항-CD64 항체 클론 290322; 마우스 모노클로날 항-CD64 항체 클론 10.1; 및 마우스 모노클로날 항-CD64 항체 클론 1D3.
특정 실시양태에 있어서, CD86은 M1 대식세포에 표적화된다. CD86에 대해 특이적인 다수의 항체는 당업자에게 알려져 있으며 서열, 에피토프 결합 및 친화도에 대해 용이하게 특성화될 수 있다. 예를 들어, WO 2004/076488, US 8,378,082 (mAb 2D4) 및 US 6,346,248 (IG10H6D10)를 참고한다. CD86에 대해 상업적으로 이용가능한 항체는 Thermo Fisher, Waltham, MA; Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Germany; LifeSpan Biosciences, Inc., Seattle, WA; Bio-Rad, Hercules, CA; 및 Novus Biologicals, Littleton, CO로부터 수득될 수 있다. 특정 실시양태에 있어서, 항-CD86 항체는 다음을 포함한다: 마우스 모노클로날 항-CD86 항체 클론 BU63; 인간 CD86의 His244에 대한 Ala23을 포함하는 영역을 인식하는 폴리클로날 염소 항-CD86 항체; 마우스 모노클로날 항-CD86 항체 클론 IT2.2; 토끼 모노클로날 항-CD86 항체 클론 BFF-3; 및 마우스 모노클로날 항-CD86 항체 클론 C86/1146.
림프구에 의한 내재화 및/또는 이의 형질주입을 용이하게 할 수 있는 다른 약제, 예컨대, 폴리(에틸렌이민)/DNA (PEl/DNA) 복합체가 또한 사용될 수 있다.
(b) 양으로-하전된 담체. 특정 실시양태에 있어서, 담체는 핵산을 응축하고 효소 분해로부터 보호하는 담체 분자를 포함한다. 본원의 다른 곳에서 더 상세히 개시된 바와 같이, 담체는 양으로 하전된 지질 및/또는 중합체를 포함할 수 있다. 특정 실시양태는 폴리(β-아미노 에스테르) (PBAE (예컨대, PBAE 447 및/또는 1-(3-아미노프로필)피롤리딘 단부 캡 포함)를 이용한다. 일부 실시양태에 있어서, PBAE의 분자량은 4 kDa 내지 6 kDa, 5 kDa 내지 7 kDa, 6 kDa 내지 8 kDa, 7 kDa 내지 9 kDa, 8 kDa 내지 10 kDa, 또는 9 kDa 내지 11 kDa이다. 일부 실시양태에 있어서, PBAE의 분자량은 4 kDa, 5 kDa, 6 kDa, 7 kDa, 8 kDa, 9 kDa, 또는 11 kDa이다. 일부 실시양태에 있어서, PBAE의 분자량은 4 kDa 미만 또는 11 kDa 초과이다. 일부 실시양태에 있어서, PBAE는 PBAE 447이다. 일부 실시양태에 있어서, PBAE 447의 분자량은 4 kDa 내지 6 kDa, 5 kDa 내지 7 kDa, 6 kDa 내지 8 kDa, 7 kDa 내지 9 kDa, 8 kDa 내지 10 kDa, 또는 9 kDa 및 11 kDa이다. 일부 실시양태에 있어서, PBAE 447의 분자량은 4 kDa, 5 kDa, 6 kDa, 7 kDa, 8 kDa, 9 kDa, 또는 11 kDa이다. 일부 실시양태에 있어서, PBAE 447의 분자량은 4 kDa 미만 또는 11 kDa 초과이다.
겔 투과 크로마토그래피 (GPC)에 의해 평가되는 경우, 중합체 (예컨대, PBAE)는 예를 들어, 3,000-6,000 또는 4,000-5,000의 Mn 범위; 10,000-20,000 또는 14,500-21,000의 mW 범위; 및/또는 55,000-77,000 또는 60,000-72,000의 Mz 범위를 포함하여 매트릭스 내의 중합체 길이의 범위를 포함할 수 있다. 특정 실시양태에 있어서, 담체 매트릭스 내의 PBAE는 Mn = 4,000-5,000; Mw = 14,500-21,000; 및 Mz = 60,000-72,000의 GPC에 의한 분자량 분포를 가진다.
일부 실시양태에 있어서, PBAE는 하나 이상의 분자에 컨쥬게이션된다. 일부 실시양태에 있어서, PBAE는 (PEG-PBAE를 형성하기 위해) 폴리에틸렌 글리콜에 대한 컨쥬게이트이다. 단부기는 또한 형질주입 효율에 큰 역할을 할 수 있으며, 삼차 아민을 함유하는 단부 캡이 선호된다.
양으로 하전된 지질의 추가적인 예는 포스파티드산과 아미노알콜의 에스테르, 예컨대, 디팔미토일 포스파티드산 또는 디스테아로일 포스파티드산과 하이드록시에틸렌디아민의 에스테르를 포함한다. 양으로 하전된 지질의 보다 특정한 예는 3β-[N--(N',N'-디메틸아미노에틸)카바모일) 콜레스테롤 (DC-chol); N,N'-디메틸-N,N'-디옥타실 암모늄 브로마이드 (DDAB); N,N'-디메틸-N,N'-디옥타실 암모늄 클로라이드 (DDAC); 1,2-디올레오일옥시프로필-3-디메틸-하이드록시에틸 암모늄 클로라이드 (DORI); 1,2-디올레오일옥시-3-[트리메틸암모니오]-프로판 (DOTAP); N-(1-(2,3-디올레일옥시)프로필)-N,N,N-트리메틸암모늄 클로라이드 (DOTMA); 디팔미토일포스파티딜콜린 (DPPC); 1,2-디옥타데실옥시-3-[트리메틸암모니오]-프로판 (DSTAP); 및 예컨대, Martin 등, Curr. Pharma. Design, 11:375-394, 2005에 기재된 양이온성 지질을 포함한다.
본 개시내용 내에서 담체로서 사용될 수 있는 양으로 하전된 중합체의 예는 폴리아민; 폴리오가닉 아민 (예컨대, 폴리에틸렌이민 (PEI), 폴리에틸렌이민 셀룰로스); 폴리(아미도아민) (PAMAM); 폴리아미노산 (예컨대, 폴리리신 (PLL), 폴리아르기닌); 다당류 (예컨대, 셀룰로스, 덱스트란, DEAE 덱스트란, 전분); 스퍼민, 스퍼미딘, 폴리(비닐벤질 트리알킬 암모늄), 폴리(4-비닐-N-알킬-피리디니우미운), 폴리(아크릴로일-트리알킬 암모늄) 및 Tat 단백질을 포함한다.
임의의 농도 및 임의의 비율로 지질 및 중합체의 블렌드가 또한 사용될 수 있다. 다양한 등급을 사용하여 상이한 비율로 상이한 중합체 유형을 블렌딩하는 것은 각각의 기여하는 중합체로부터 차용한 특성을 얻을 수 있다. 다양한 말단 기 화학적 성질이 또한 채택될 수 있다.
전술한 것을 제한함 없이, 본원에 개시된 특정 실시양태는 또한 다공성 네트워크를 형성할 수 있는 임의의 재료로부터 작제된 다공성 나노입자를 이용할 수 있다. 예시적인 재료는 금속, 전이 금속 및 준금속을 포함한다. 예시적인 금속, 전이 금속 및 준 금속은 리튬, 마그네슘, 아연, 알루미늄 및 실리카를 포함한다. 특정 실시양태에 있어서, 다공성 나노입자는 실리카를 포함한다. (1,000 m2/g을 초과하는) 메조포러스 실리카의 월등히 높은 표면적은 통상적인 DNA 담체, 예컨대, 리포솜을 초과하는 수준에서 핵산 로딩을 가능하게 한다.
담체 매트릭스는 회전타원체형, 입방형, 피라미드형, 긴타원형, 원통형, 토로이드형 등을 포함하는 다양한 상이한 형태로 형성될 수 있다. 핵산은 다양한 방식으로 담체의 공극에 포함될 수 있다. 예를 들어, 핵산은 다공성 나노입자에 캡슐화될 수 있다. 다른 양태에서, 핵산은 표면 또는 다공성 나노입자 표면의 가까운 근방에 (예컨대, 공유적으로 및/또는 비-공유적으로) 연관될 수 있다. 특정 실시양태에 있어서, 핵산은 예컨대, 다공성 나노입자의 재료에 통합된 다공성 나노입자에 혼입될 수 있다. 예를 들어, 핵산은 중합체 나노입자의 중합체 매트릭스에 혼입될 수 있다.
(c) 양으로-하전된 담체 내의 핵산. 치료적 단백질의 발현을 초래하는 핵산은 CAR, TCR, CAR/TCR 하이브리드 및 대식세포 활성화제의 발현과 관련하여 상기에 기재되어 있다.
(d) 중성의 또는 음으로-하전된 코팅. 특정 실시양태에 있어서, 본원에 개시된 나노입자는 캡슐화된 핵산을 차폐하고 표적-외 결합을 감소시키거나 예방하는 코팅을 포함한다. 표적-외 결합은 나노입자의 표면 전하를 중성으로 또는 음으로 감소시킴으로써 감소되거나 예방된다. 본원의 다른 곳에서 보다 상세히 개시된 바와 같이, 코팅은 중성의 또는 음의 중합체- 및/또는 리포솜-기반 코팅을 포함할 수 있다. 특정 실시양태는 나노입자 코팅으로서 폴리글루탐산 (PGA)을 이용한다. 사용하는 경우, 코팅은 전체 나노입자를 반드시 코팅할 필요는 없다. 유리하게는, 코팅은 나노입자에 의한 표적-외 결합을 감소시키기에 충분하다. 항체 단편 (예컨대, Fab 또는 scFv)은 PGA 코팅에 직접 또는 간접적으로 연결될 수 있다. 예를 들어, 항체 단편 (예컨대, Fab 또는 scFv)은 예를 들어, Fab 또는 scFv 서열에 첨가된 시스테인과 반응하는 PGA-말레이미드를 사용하여 PGA에 화학적으로 커플링될 수 있다. 일부 실시양태에 있어서, 항체는 링커 (예컨대, 단백질 또는 폴리펩티드 링커, 또는 화학적 링커)를 통해 커플링된다.
특정 실시양태에 있어서, 코팅은 캡슐화된 핵산이 선택된 세포로의 방출 전에 환경에 노출되는 것을 방지하기에 충분한 친수성 및/또는 중성으로 하전된 친수성 중합체의 밀도가 높은 표면 코팅이다. 특정 실시양태에 있어서, 코팅은 나노입자 표면의 80% 이상 또는 90% 이상을 덮는다. 특정 실시양태에 있어서, 코팅은 PGA를 포함한다.
개시내용의 실시양태 내에서 코팅으로서 사용될 수 있는 중성으로 하전된 중합체의 예는 폴리에틸렌 글리콜 (PEG); 폴리(프로필렌 글리콜); 및 폴리알킬렌 옥사이드 공중합체 (PLURONIC®, BASF Corp., Mount Olive, NJ)를 포함한다.
중성으로 하전된 중합체는 또한 쯔비터이온성 중합체를 포함한다. 쯔비터이온은 양전하 및 음전하 둘 다를 가지면서 전체 전하 중성의 특성을 지칭한다. 쯔비터이온성 중합체는 세포 및 단백질 접착에 저항하는 세포막 영역처럼 행동할 수 있다.
쯔비터이온성 중합체는 쯔비터이온기를 갖는 펜던트 기 (즉, 중합체 백본으로부터의 펜던트 기)를 포함하는 쯔비터이온성 구성 단위를 포함한다. 예시적인 쯔비터이온성 펜던트 기는 카복시베타인 기 (예컨대, -Ra-N+(Rb)(Rc)-Rd-CO2-, 여기서 Ra는 중합체 백본을 카복시베타인 기의 양이온성 질소 중심에 공유적으로 커플링시키는 링커 기이며, Rb 및 Rc는 질소 치환기이고, Rd는 양이온성 질소 중심을 카복시베타인 기의 카복시 기에 공유적으로 커플링시키는 링커 기임)를 포함한다.
음으로 하전된 중합체의 예는 알긴산; 카복실산 다당류; 카복시메틸 셀룰로스; 카복시메틸 셀룰로스-시스테인; 카라기난 (예컨대, Gelcarin® (FMC Corp., Wilmington, DE) 209, Gelcarin® 379); 콘드로이틴 설페이트; 글리코사미노글리칸; 점액 다당류; 음으로 하전된 다당류 (예컨대, 덱스트란 설페이트); 폴리(아크릴산); 폴리(D-아스파르트산); 폴리(L-아스파르트산); 폴리(L-아스파르트 산) 소듐 염; 폴리(D-글루탐산); 폴리(L-글루탐산); 폴리(L-글루탐산) 소듐 염; 폴리(메타크릴산); 소듐 알기네이트 (예컨대, PROTANAL® (FMC Biopolymer, Oslo, Norway) LF 120M, PROTANAL® LF 200M, PROTANAL® LF 200D); 소듐 카복시메틸 셀룰로스 (CMC); 설페이트화된 다당류 (헤파린, 아가로펙틴); 펙틴, 젤라틴 및 히알루론산을 포함한다.
특정 실시양태에 있어서, 본원에 개시된 중합체는 2 개 이상의 중합체 분지가 코어로부터 연장되는 분지형 중합체를 지칭하는 "별 모양 중합체"를 포함할 수 있다. 코어는 분지가 중합에 의해 연장될 수 있는 2 개 이상의 기능기를 갖는 원자 기이다.
특정 실시양태에 있어서, 분지는 쯔비터이온성 또는 음으로-하전된 중합체성 분지이다. 별 중합체의 경우, 분지 전구체는 가수분해, 자외선 조사 또는 열을 통해 쯔비터이온성 또는 음으로-하전된 중합체로 전환될 수 있다. 중합체는 또한 원자 이동 라디칼 중합 (ATRP), 가역적 첨가-단편화 쇄 이동 중합 (RAFT), 광-중합, 고리-열림 중합 (ROP), 축합, Michael 첨가, 분지 생성/전파 반응 또는 기타 반응을 포함하여 불포화 단량체의 중합에 효과적인 임의의 중합 방법에 의해 수득될 수 있다.
리포솜은 하나 이상의 동심원 지질 이중층을 포함하는 미세 소포이다. 소포-형성 지질은 최종 복합체의 명시된 정도의 유동성 또는 강성을 달성하기 위해 선택된다. 특정 실시양태에 있어서, 리포솜은 다공성 나노입자를 둘러싸는 외부 층인 지질 조성물을 제공한다.
리포솜은 중성 (콜레스테롤) 또는 양극성일 수 있으며 인지질, 예컨대, 포스파티딜콜린 (PC), 포스파티딜에탄올아민 (PE), 포스파티딜이노시톨 (PI) 및 스핑고미엘린 (SM), 및 14-22 범위의 탄화수소 쇄 길이를 갖고, 포화되거나 하나 이상의 이중 C=C 결합을 갖는, 디올레오일 포스파티딜에탄올아민 (DOPE)을 포함하는 다른 유형의 양극성 지질을 포함할 수 있다. 안정한 리포솜을 단독으로 또는 다른 지질 구성요소와 조합하여 생산할 수 있는 지질의 예는 인지질, 예컨대, 수소화된 대두 포스파티딜콜린 (HSPC), 레시틴, 포스파티딜에탄올아민, 리소레시틴, 리소포스파티딜에탄올아민, 포스파티딜세린, 포스파티딜이노시톨, 스핑고미엘린, 세팔린, 카디오리핀, 포스파티드산, 세레브로시드, 디스테아로일포스파티딜에탄올아민 (DSPE), 디올레오일포스파티딜콜린 (DOPC), 디팔미토일포스파티딜콜린 (DPPC), 팔미토일올레오일포스파티딜콜린 (POPC), 팔미토일올레오일포스파티딜에탄올아민 (POPE) 및 디올레오일포스파티딜에탄올아민 4-(N-말레이미도-메틸)사이클로헥산-1-카복실레이트 (DOPE-mal)이다. 리포솜에 혼입될 수 있는 추가의 비-인 함유 지질은 스테아릴아민, 도데실아민, 헥사데실아민, 이소프로필 미리스테이트, 트리에탄올아민-라우릴 설페이트, 알킬-아릴 설페이트, 아세틸 팔미테이트, 글리세롤 리시놀레이트, 헥사데실 스테아레이트, 양쪽성 아크릴 중합체, 폴리에틸옥실화된 지방산 아미드, DDAB, 디옥타데실 디메틸 암모늄 클로라이드 (DODAC), 1,2-디미리스토일-3-트리메틸암모늄 프로판 (DMTAP), DOTAP, DOTMA, DC-Chol, 포스파티드산 (PA), 디팔미토일포스파티딜글리세롤 (DPPG), 디올레오일포스파티딜글리세롤, DOPG 및 디세틸포스페이트를 포함한다. 특정 실시양태에 있어서, 본원에 개시된 리포솜을 생성하는 데 사용된 지질은 콜레스테롤, 수소화된 대두 포스파티딜콜린 (HSPC) 및 유도체화된 소포-형성 지질 PEG-DSPE를 포함한다.
리포솜을 형성하는 방법은 예를 들어, 미국 특허 번호 4,229,360; 4,224,179; 4,241,046; 4,737,323; 4,078,052; 4,235,871; 4,501,728; 및 4,837,028, 뿐만 아니라 Szoka 등, Ann. Rev. Biophys. Bioeng. 9:467, 1980; 및 Hope 등, Chem. Phys. Lip. 40:89, 1986에 기재되어 있다.
나노입자를 생성하는 추가의 예시적인 방법은 US2018/0030153, US2017/0296676 및 WO2018/129270에 개시되어 있으며, 그 개시내용은 모든 목적을 위해 전체가 본원에 원용된다.
특정 실시양태에 있어서, 코팅은 5-100 kDa의 중합체 크기를 갖는 중합체-기반된 코팅이다. 특정 실시양태에 있어서, 코팅은 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95 또는 100 kDa의 중합체 크기를 갖는 중합체-기반된 코팅이다.
특정 실시양태에 있어서, PbAE 중합체는 20:1, 30:1, 40:1, 50:1, 60:1, 70:1, 80:1, 90:1, 100:1 또는 그 이상의 비율로 뉴클레오티드 (예컨대, IVT mRNA)와 혼합되어, PbAE-뉴클레오티드 폴리플렉스를 생성한다. 특정 실시양태에 있어서, PbAE 중합체는 60:1의 비율로 뉴클레오티드 (예컨대, IVT mRNA)와 혼합되어, PbAE-뉴클레오티드 폴리플렉스를 생성한다. 특정 실시양태에 있어서, PbAE-뉴클레오티드 폴리플렉스는 PGA/디-만노스와 조합되어 나노입자를 형성할 수 있다.
본원에 개시된 나노입자의 크기는 넓은 범위에 걸쳐 다양할 수 있으며, 예를 들어, 동적 광 산란 및/또는 전자 현미경에 의해 상이한 방식으로 측정될 수 있다. 예를 들어, 본 개시내용의 나노입자는 100 nm의 최소 치수를 가질 수 있다. 본 개시내용의 나노입자는 또한 500 nm 이하, 150 nm 미만, 100 nm 미만, 90 nm 미만, 80 nm 미만, 70 nm 미만, 60 nm 미만, 50 nm 미만, 40 nm 미만, 30 nm 미만, 20 nm 미만 또는 10 nm 미만의 최소 치수를 가질 수 있다. 특정 실시양태에 있어서, 나노입자는 5 nm 내지 500 nm, 10 nm 내지 100 nm, 20 nm 내지 90 nm, 30 nm 내지 80 nm, 40 nm 내지 70 nm, 및 40 nm 내지 60 nm 범위의 최소 치수를 가질 수 있다. 특정 실시양태에 있어서, 치수는 나노입자 또는 코팅된 나노입자의 직경이다. 특정 실시양태에 있어서, 본 개시내용의 나노입자 집단은 500 nm 이하, 100 nm 미만, 90 nm 미만, 80 nm 미만, 70 nm 미만, 60 nm 미만, 50 nm 미만, 40 nm 미만, 30 nm 미만, 20 nm 미만 또는 10 nm 미만의 평균 최소 치수를 가질 수 있다. 특정 실시양태에 있어서, 본 개시내용의 조성물 중의 나노입자 집단은 5 nm 내지 500 nm, 10 nm 내지 100 nm, 20 nm 내지 90 nm, 30 nm 내지 80 nm, 40 nm 내지 70 nm, 40 nm 내지 60 nm 범위의 평균 직경을 가질 수 있다.
(iv) 조성물. 본원에 개시된 나노입자는 대상체에 대한 직접 투여를 위한 조성물로 제형화될 수 있으며, 여기서 선택적 표적화는 생체 내에서 발생한다. 임의로, 하나 초과의 나노입자 - 즉, 상이한 치료적 단백질을 코딩하는 상이한 패신저 핵산을 함유하는 나노입자는 - 순차적으로든 동시에든 동일한 대상체에 일제히 투여될 수 있다.
특정 실시양태에 있어서, 나노입자는 적어도 0.1% w/v 또는 w/w의 나노입자; 적어도 1% w/v 또는 w/w의 나노입자; 적어도 10% w/v 또는 w/w의 나노입자; 적어도 20% w/v 또는 w/w의 나노입자; 적어도 30% w/v 또는 w/w의 나노입자; 적어도 40% w/v 또는 w/w의 나노입자; 적어도 50% w/v 또는 w/w의 나노입자; 적어도 60% w/v 또는 w/w의 나노입자; 적어도 70% w/v 또는 w/w의 나노입자; 적어도 80% w/v 또는 w/w의 나노입자; 적어도 90% w/v 또는 w/w의 나노입자; 적어도 95% w/v 또는 w/w의 나노입자; 또는 적어도 99% w/v 또는 w/w의 나노입자를 포함할 수 있는 조성물의 일부로서 제공된다.
본원에 개시된 조성물은 주사, 흡입, 주입, 관류, 세정 또는 섭취에 의한 투여를 위해 제형화될 수 있다. 본원에 개시된 조성물은 카테터, 정맥 내, 근육 내, 종양 내, 피내, 동맥 내, 결절 내, 림프 내, 복막 내, 병변 내, 전립선 내, 질 내, 직장 내, 국소, 척수강 내, 방광 내, 경구 및/또는 피하 투여를 통한 주입, 보다 특히 정맥 내, 피내, 동맥 내, 결절 내, 림프 내, 복막 내, 병변 내, 질 내, 직장 내, 국소, 척수강 내, 종양 내, 근육 내, 방광 내, 경구 및/또는 피하 주사에 의한 주입을 위해 추가로 제형화될 수 있다.
주사 및 주입을 위해, 조성물은 수용액, 예컨대, 행크 용액, 링거 용액 또는 생리 식염수를 포함하는 완충액으로서 제형화될 수 있다. 수용액은 제형제, 예컨대, 현탁제, 안정화제 및/또는 분산제를 함유할 수 있다. 대안적으로, 제형은 사용 전에 적합한 비히클, 예컨대, 발열원이 없는 멸균 수로 구성하기 위한 동결건조된 및/또는 분말 형태일 수 있다.
경구 투여를 위해, 조성물은 정제, 환약, 드라제, 캡슐, 액체, 겔, 시럽, 슬러리, 현탁액 등으로서 제형화될 수 있다. 예를 들어, 경구 고체 제형, 예컨대, 분말, 캡슐 및 정제의 경우, 적합한 부형제는 바인더 (검 트라가칸스, 아카시아, 옥수수전분, 젤라틴), 충전제, 예컨대, 당류, 예컨대, 유당, 수크로스, 만니톨 및 소르비톨; 디칼슘 포스페이트, 전분, 마그네슘 스테아레이트, 소듐 사카린, 셀룰로스, 마그네슘 카보네이트; 셀룰로스 제제, 예컨대, 옥수수 전분, 밀 전분, 쌀 전분, 감자 전분, 젤라틴, 검 트라가칸스, 메틸 셀룰로스, 하이드록시프로필메틸-셀룰로스, 소듐 카복시- 메틸셀룰로스 및/또는 폴리비닐피롤리돈 (PVP); 과립화제; 및 결합제를 포함한다. 원하는 경우, 붕해제, 예컨대, 옥수수 전분, 감자 전분, 알긴산, 가교된 폴리비닐피롤리돈, 한천 또는 알긴산, 또는 이의 염, 예컨대, 소듐 알기네이트를 첨가할 수 있다. 원하는 경우, 고체 투여량 형태는 표준 기술을 사용하여 당-코팅 또는 장용-코팅될 수 있다. 방향제, 예컨대, 페퍼민트, 윈터그린 오일, 체리 향료, 오렌지 향료 등이 또한 사용할 수 있다.
흡입에 의한 투여를 위해, 조성물은 적합한 추진제, 예컨대, 디클로로디플루오로메탄, 트리클로로플루오로메탄, 디클로로테트라플루오로에탄, 이산화탄소 또는 기타 적합한 가스의 사용과 함께 가압 팩 또는 분무기로부터의 에어로졸 스프레이로서 제형화될 수 있다. 가압 에어로졸의 경우, 투여량 유닛은 계량된 양을 전달하기 위한 밸브를 제공함으로써 결정될 수 있다. 흡입기 또는 취입기에서 사용하기 위한 젤라틴 캡슐 및 카트리지는 치료제 및 적합한 분말 베이스, 예컨대, 락토오스 또는 전분의 분말 혼합물을 함유하여 제형화될 수 있다.
본원에 개시된 임의의 조성물 제형은 연구, 예방적 및/또는 치료적 치료를 위해서든지 투여의 이점을 능가하는 유의하게 유해한, 알레르기성 또는 기타 바람직하지 않은 반응을 생산하지 않는 것들을 포함하는 임의의 다른 약학적으로 허용가능한 담체를 유리하게 포함할 수 있다. 약학적으로 허용가능한 예시적인 담체 및 제형은 Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th Ed. Mack Printing Company, 1990에 개시되어 있다. 또한, 제형은 미국 FDA 생물학적 표준 및/또는 기타 관련 외국 규제 기관에 의해 요구되는 무균, 발열원성, 일반 안전성 및 순도 표준을 충족하도록 제조될 수 있다.
일반적으로 사용된 약학적으로 허용가능한 예시적인 담체는 임의의 및 모든 증량제 또는 충전제, 용매 또는 공-용매, 분산 매질, 코팅, 계면활성제, 항산화제 (예컨대, 아스코르브산, 메티오닌, 비타민 E), 보존제, 등장제, 흡수 지연제, 염, 안정제, 완충제, 킬레이팅제 (예컨대, EDTA), 겔, 바인더, 붕해제 및/또는 윤활제를 포함한다.
예시적인 완충제는 시트레이트 완충액, 석시네이트 완충액, 타르트레이트 완충액, 푸마레이트 완충액, 글루코네이트 완충액, 옥살레이트 완충액, 락테이트 완충액, 아세테이트 완충액, 포스페이트 완충액, 히스티딘 완충액 및/또는 트리메틸아민 염을 포함한다.
예시적인 보존제는 페놀, 벤질 알콜, 메타-크레졸, 메틸 파라벤, 프로필 파라벤, 옥타데실디메틸벤질 암모늄 클로라이드, 벤잘코늄 할라이드, 헥사메토늄 클로라이드, 알킬 파라벤, 예컨대, 메틸 또는 프로필 파라벤, 카테콜, 레조르시놀, 사이클로헥산올 및 3-펜탄올을 포함한다.
예시적인 등장제는 3가 이상의 당 알콜을 포함하는 다가 당 알콜, 예컨대, 글리세린, 에리트리톨, 아라비톨, 자일리톨, 소르비톨 또는 만니톨을 포함한다.
예시적인 안정화제는 유기 당, 다가 당 알콜, 폴리에틸렌 글리콜; 황-함유 환원제, 아미노산, 저분자량 폴리펩티드, 단백질, 면역글로불린, 친수성 중합체 또는 다당류를 포함한다.
조성물은 또한 데포 제제로서 제형화될 수 있다. 데포 제제는 적합한 중합체성 또는 소수성 재료 (예를 들어, 허용가능한 오일의 에멀젼으로서) 또는 이온 교환 수지로, 또는 난용성 유도체, 예를 들어, 난용성 염으로서 제형화될 수 있다.
추가적으로, 조성물은 하나 이상의 활성 성분을 함유하는 고체 중합체의 반투과성 매트릭스를 이용하여 서방형 시스템으로서 제형화될 수 있다. 다양한 서방형 재료가 확립되어 있으며 당업자에게 잘 알려져 있다. 서방형 시스템은 화학적 본성에 따라 2 주 내지 1 개월 동안 투여 후 활성 성분을 방출할 수 있다. 특정 실시양태에 있어서, 예를 들어, 인간 환자가 매주 투여를 놓친 경우, 서방형 시스템이 이용될 수 있다. 본원에 기재된 나노입자의 특정 실시양태의 반감기는 4 시간이다. 방출을 유지하기 위해, 나노입자는 시간 경과에 따라 나노입자를 천천히 방출하는 하이드로겔 또는 생분해성 중합체 내에 캡슐화될 수 있다. mRNA 자체는 예를 들어, PBAE 중합체 내에서 응축되는 경우 안정적이다.
(v) 사용 방법. 본원에 개시된 방법은 본원에 개시된 조성물로 대상체 (인간, 수의학 동물, 가축 및 연구 동물 포함)를 치료하는 단계를 포함한다. 지시된 바와 같이, 조성물은 암 내지 감염성 질환의 범위의 다양한 상이한 병태를 치료할 수 있다.
치료적으로 유효한 치료. 대상체를 치료하는 단계는 하나 이상의 조성물(들)의 치료적 유효량을 전달하는 단계를 포함한다. 치료적 유효량은 유효량, 예방적 치료 및/또는 치료적 치료를 제공할 수 있다.
"유효량"은 대상체에서 원하는 생리학적 변화를 야기하는 데 필요한 화합물의 양이다. 유효량은 종종 연구 목적으로 투여된다. 예를 들어, 본원에 개시된 유효량은 대상체에 대한 투여 후 선택된 세포 유형에 의해 핵산 또는 단백질, 예컨대, 치료적 단백질의 발현 (예컨대, 일시적 발현)을 초래한다. 추가 예로서, 대상체에 투여되는 경우 세포 유인제의 유효량은 투여 부위에 특정 세포 유형 (예컨대, T 세포)의 동원을 초래한다.
"예방적 치료"는 질환 또는 병태의 징후 또는 증상을 나타내지 않거나 질환 또는 병태의 초기 징후 또는 증상만을 나타내는 대상체에 투여되는 치료를 포함하여, 치료가 질환 또는 병태를 더욱 발달시킬 위험을 약화, 예방 또는 감소시킬 목적으로 투여된다. 따라서, 예방적 치료는 질환이나 장애에 대한 예방적 치료로서 기능한다. 백신은 예방적 치료의 일 예이다.
특정 실시양태에 있어서, 예방적 치료는 바이러스 감염, 예컨대, HIV를 치료하기 위해 투여된다. 예를 들어, 조성물은 바이러스 감염이 발생할 위험이 있거나 바이러스에 노출된 대상체에서 예방적으로 투여되어, 바이러스 감염 또는 질환의 발달을 예방, 감소 또는 지연시킬 수 있다. 예를 들어, 조성물은 바이러스 (예컨대, HIV)에 노출되었을 가능성이 있는 대상체 또는 바이러스에 노출될 위험이 높은 대상체에 투여될 수 있다.
"치료적 치료"는 질환 또는 병태의 증상 또는 징후를 나타내는 대상체에 투여되고 질환 또는 병태의 징후 또는 증상을 약화 또는 제거할 목적으로 대상체에 투여되는 치료를 포함한다. "치료적 치료"는 대상체에서 원하는 치료적 이점을 초래한다.
예방적 및 치료적 치료는 질환 또는 병태를 완전히 예방하거나 치료할 필요가 있을 뿐만 아니라 또한 부분적인 이점을 제공할 수 있다.
암의 맥락에서, 치료적 유효량은 종양 세포의 수를 감소시키고/시키거나, 전이의 수를 감소시키고/시키거나, 종양 부피를 감소시키고/시키거나, 기대 수명을 증가시키고/시키거나, 암 세포의 세포자멸사를 유도하고/하거나, 암 세포 사멸을 유도하고/하거나, 암 세포에서 화학- 또는 방사선민감성을 유도하고/하거나, 암 세포 근처에서 혈관신생을 억제하고/하거나, 암 세포 증식을 억제하고/하거나, 종양 성장을 억제하고/하거나, 전이를 예방하고/하거나, 대상체의 수명을 연장시키고/시키거나, 암-연관된 통증을 감소시키고/시키거나, 전이 수를 감소시키고/시키거나, 치료 후 암의 재발 또는 재-발생을 감소시킬 수 있다.
바이러스의 맥락에서, 치료적 유효량은 바이러스-감염된 세포의 수를 감소시키고, 바이러스 감염과 연관된 하나 이상의 증상, 예컨대, 발열, 오한, 구토, 관절 통증 등을 감소시킬 수 있다.
HIV의 맥락에서, 치료적 유효량은 HIV-감염된 세포의 수를 감소시키고/시키거나, 대상체의 T 세포 수를 증가시키고/시키거나, 감염의 발생률, 빈도 또는 중증도를 감소시키고/시키거나, 기대 수명을 증가시키고/시키거나, 대상체의 수명을 연장시키고/시키거나, HIV-연관된 통증 또는 인지 장애를 감소시킬 수 있다.
투여를 위해, 치료적 유효량 (본원에서 용량으로서 또한 지칭됨)은 시험관 내 검정 및/또는 동물 모델 연구의 결과에 기반하여 초기에 추정될 수 있다. 이러한 정보는 관심 대상체에서 유용한 용량을 보다 정확하게 결정하는 데 사용될 수 있다.
특정 대상체에 투여되는 실제 용량은 의사, 수의사 또는 연구원이 매개변수, 예컨대, 표적, 체중, 병태의 중증도, 질환 유형, 이전 또는 병행의 치료적 중재, 대상체의 특발증 및 투여 경로를 포함한 물리적 및 생리학적 인자를 고려함으로써 결정될 수 있다.
조성물의 유용한 용량은 0.1 내지 5 μg/kg, 또는 0.5 내지 1 μg/kg, 또는 1-1000 mg/kg 이상을 포함할 수 있다.
치료적 목표 또는 효과를 수득하는 치료적 유효량은 치료 양생법 과정 동안 단일 또는 다중 용량을 투여함으로써 달성될 수 있다. 이러한 용량은 예를 들어, 매일, 격일, 4 일 마다, 2-8 일 마다, 3-10 일 마다, 5-10 일 마다, 6-9 일 마다, 매주 또는 격주 마다 투여될 수 있다. 임의로, 투여량 사이의 시간은 다양할 수 있다. 일부 실시양태에 있어서, 단일 용량은 원하는 치료적 효과를 제공할 것이며; 다른 경우에는, 다중 용량이 요구될 것이다. 특정 실시양태에 있어서, 치료 양생법의 유효성 및 추가 용량(들)의 필요성은 일시적으로 발현된 치료적 단백질 또는 핵산에 의해 매개되는 표현형 효과를 결정, 추적 또는 측정함으로써 모니터링될 수 있다.
특정 실시양태에 있어서, 단백질 또는 핵산 (예컨대, 치료적 단백질)의 발현 수준이 역치 미만으로 떨어지면, 치료 의사는 나노입자를 이용한 추가 치료가 정당한지 여부 또는 치료적 목적이 달성되었는지 및 나노입자를 이용한 추가 치료가 그 당시에 정당하지 않은지 여부를 결정할 수 있다. 특정 실시양태에 있어서, 역치 미만은 정량적 PCR 또는 유세포 분석에 의해 측정된 피크 발현 수준의 50%, 45%, 40%, 35%, 34%, 33%, 32%, 31%, 30%, 29%, 28%, 27%, 26%, 25%, 24%, 23%, 22%, 21%, 20%, 19%, 18%, 17%, 16%, 15%, 14%, 13%, 12%, 11%, 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2% 또는 1% 이하일 수 있다. 특정 실시양태에 있어서, 역치 미만은 정량적 PCR에 의해 측정된 피크 발현 수준의 15%, 14%, 13%, 12%, 11%, 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2% 또는 1% 이하일 수 있다. 특정 실시양태에 있어서, 역치는 유세포 분석에 의해 측정된 단백질 또는 핵산을 발현하는 나노입자-형질주입된 T 세포의 35%, 34%, 33%, 32%, 31%, 30%, 29%, 28%, 27%, 26%, 25%, 24%, 23%, 22%, 21%, 20%, 19%, 18%, 17%, 16%, 15%, 14%, 13%, 12%, 11%, 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2% 또는 1% 이하일 수 있다. 특정 실시양태에 있어서, 역치는 치료적 단백질을 발현하는 말초 혈액에서 CD8+ T 세포의 20%, 19%, 18%, 17%, 16%, 15%, 14%, 13%, 12%, 11%, 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2% 또는 1% 이하일 수 있다. 특정 실시양태에 있어서, 역치는 항원-양성 표적 세포를 선택적으로 용해시키는 IVT mRNA-형질주입된 T 세포의 능력을 측정하기 위한 시험관 내 생 세포 검정에서 수득된 종양 세포 계수일 수 있다.
특정 실시양태에 있어서, 단백질 또는 핵산 (예컨대, 치료적 단백질)의 발현 수준이 검출가능한 한계 미만으로 떨어지면, 치료 의사는 나노입자를 이용한 추가 치료가 정당한지 여부 또는 치료적 목적이 달성되었는지 및 나노입자를 이용한 추가 치료가 그 당시에 정당하지 않은지 여부를 결정할 수 있다.
특정 실시양태에 있어서, 단백질 또는 핵산 (예컨대, 치료적 단백질)의 발현은 발현이 정량적 PCR에 의해 검출되지 않는 경우 검출가능한 한계 미만으로 떨어진다. 특정 실시양태에 있어서, 검출가능한 한계는 유세포 분석에 의해 측정된 단백질 또는 핵산을 발현하는 대상체의 T 세포의 1%, 0.9%, 0.8%, 0.7%, 0.6%, 0.5%, 0.4%, 0.3%, 0.2%, 0.1%, 0.005% 또는 0.001% 이하일 수 있다. 특정 실시양태에 있어서, 검출가능한 한계는 치료적 단백질을 발현하는 말초 혈액 중의 CD8+ T 세포의 백분율일 수 있다. 특정 실시양태에 있어서, 검출가능한 한계는 단백질 또는 핵산을 발현하는 대상체의 말초 혈액 중의 CD8+ T 세포의 2%, 1.5%, 1%, 0.5%, 1%, 0.9%, 0.8%, 0.7%, 0.6%, 0.5%, 0.4%, 0.3%, 0.2%, 0.1%, 0.005% 또는 0.001% 이하일 수 있다.
특정 실시양태에 있어서, 개시내용의 방법은 생체 외에서 나노담체와 접촉된 T 세포의 이식과 적어도 대략 동일한 효능을 초래한다. 특정 실시양태에 있어서, 적어도 대략 동일한 효능은 나노입자-형질주입된 T 세포 (즉, IVT mRNA가 치료적 단백질을 코딩하는 IVT mRNA-형질주입된 T 세포)의 기능을 생체 외에서 동일한 상응하는 치료적 단백질로 조작된 T 세포의 기능과 비교하는 것을 포함한다. 특정 실시양태에 있어서, 생체 외 조작된 T 세포는 바이러스 방법에 의해 형질도입된다. 특정 실시양태에 있어서, 비교할 기능은 시험관 내 검정에서 세포 사멸이다. 특정 실시양태에 있어서, 적어도 대략 동일한 효능은 생체 외에서 동일한 상응하는 치료적 단백질로 조작된 T 세포와 비교하여 나노입자-형질주입된 T 세포에 의한 항원-양성 표적 세포의 사멸에서 통계적으로 유의한 상이함을 포함하지 않는다. 특정 실시양태에 있어서, 비교할 기능은 시험관 내 검정에서 사이토카인 생산이다. 특정 실시양태에 있어서, 적어도 대략 동일한 효능은 생체 외에서 동일한 상응하는 치료적 단백질로 조작된 T 세포와 비교하여 나노입자-형질주입된 T 세포에 의한 IL-2, TNF-α 및 IFN-γ를 포함하는 사이토카인 생산 수준에서 통계적으로 유의한 상이함을 포함하지 않는다. 특정 실시양태에 있어서, 비교는 종양 크기 또는 생체 내 성장을 포함할 수 있다. 특정 실시양태에 있어서, 적어도 대략 동일한 효능은 동일한 상응하는 치료적 단백질로 형질도입된 T 세포를 포함하는 입양 T 세포 요법을 받는 대상체와 비교하여 치료적 단백질을 코딩하는 IVT mRNA로 수혈된 대상체에서 종양 크기 또는 성장의 통계적으로 유의한 상이함을 포함하지 않는다. 특정 실시양태에 있어서, 비교는 대상체의 생존을 포함할 수 있다. 특정 실시양태에 있어서, 적어도 대략 동일한 효능은 동일한 상응하는 치료적 단백질로 형질도입된 T 세포를 포함하는 입양 T 세포 요법을 받는 대상체와 비교하여 치료적 단백질을 코딩하는 IVT mRNA로 수혈된 대상체의 생존에서 통계적으로 유의한 상이함을 포함하지 않는다.
관찰에서의 통계적 유의성은 당업자에게 알려진 통계적 방법에 의해 결정될 수 있다. 특정 실시양태에 있어서, 통계적으로 유의한 상이함이 없음은 p 값 > 0.05 또는 > 0.01을 지칭한다.
선택된 세포 유인제와 협력한 치료적으로 효과적인 치료. 특정 실시양태에 있어서, 선택된 세포 유형에 의한 치료적 단백질의 발현을 제공하기 위해 핵산을 전달하는 나노입자는 세포 유인제와 협력하여 투여될 수 있다. "협력하여"는 나노입자 및 세포 유인제가 임상적으로 관련된 시간 윈도우 내에 투여됨을 의미한다. "임상적으로 관련된 기간 윈도우"는 나노입자 또는 세포 유인제 단독의 투여에 기반하여 보이는 것에 비해 나노입자 및 세포 유인제의 투여에 기반하여 증가된 치료적 효과가 보이는 기간 내를 의미한다. 일반적으로, 세포 유인제는 나노입자 전에 투여되지만, 임상적으로 관련된 시간 윈도우가 나노입자 이후에 세포 유인제의 투여를 허용하는 경우에는 이 타이밍이 필요하지 않다.
특정 실시양태에 있어서, 세포 유인제는 발현 나노입자가 투여되기 1 시간 이상 및 2 주 이하 전에 대상체에 (국소적으로 또는 전신적으로) 투여된다. 예를 들어, 세포 유인제는 나노입자 조성물의 투여 1 시간 이상, 3 시간 이상, 6 시간 이상, 9 시간 이상, 12 시간 이상, 24 시간 이상 또는 24 시간 초과 전에 투여된다. 특정 실시양태에 있어서, 사전컨디셔닝은 나노입자의 투여 1 시간 내지 24 시간 전에, 또는 1 시간 내지 7 일 전에 발생한다. 특정 실시양태에 있어서, 세포 유인제는 T-세포 프로그래밍 나노입자와 함께 공동-전달될 수 있다.
대식세포 자극 조성물과 협력하여 투여되는 치료적으로 효과적인 치료. 특정 실시양태에 있어서, 일시적으로 발현된 mRNA를 함유하는 나노입자의 전달은 또 다른 치료 전략, 예컨대, (DNA 또는 mRNA로부터) 상이한 치료적 단백질을 발현하는 제2 표적화된 나노입자를 이용한 치료와 협력하여 발생할 수 있다. 예로서, 대식세포 자극 (대식세포 활성화) 나노입자 조성물(들)이 예시된 제2 치료적 조성물로서 사용된다. 추가의 비-나노입자 치료제뿐만 아니라 추가의 표적화된 나노입자 유형의 공동-투여가 또한 고려된다는 것이 이해될 것이다.
예를 들어, 본원에 기재된 나노입자 (치료적 단백질, 예컨대, 질환 특이적 수용체를 코딩하는 IVT mRNA 포함)는 대식세포를 자극하거나 치료되는 대상체의 대식세포(들)의 종양 억압을 극복하는 나노입자 조성물과 함께 대상체에 (병행적으로 또는 순차적으로) 투여될 수 있다. 이러한 대식세포 활성화 조성물은 그 자체가 대식세포의 면역억압을 역전시키거나 감소시키는 치료적 단백질, 예를 들어, 전사 인자를 코딩하는 핵산을 포함하는 나노입자일 수 있다. 이러한 대식세포-활성화 나노입자의 예는 본원에 기재된 나노입자와 유사하게 구조화된다 (예컨대, 이들은 양성 코어 및 중성의 또는 음으로-하전된 표면을 가지며 표적 세포에서 발현을 위한 뉴클레오티드(들)를 전달한다). 특정 실시양태는 입자를 이용하여 활성화 조절자, 예컨대, 대식세포 분극화를 조절하는 전사 인자 (예컨대, 인터페론 조절 인자 (IRF)) 및/또는 키나제 (예컨대, IKKβ)를 코딩하는 유전자를 코딩하는 뉴클레오티드를 세포에 제공한다. 대식세포 분극화는 대식세포의 생리학적 활성이 변화하는 매우 동적인 공정이다. 대부분의 종양에서, TAM은 "M2" 표현형이 될 수 있는 면역억압된 표현형을 나타낸다. 대조적으로, 활성화된 대식세포는 종양 세포 사멸을 초래하는 "M1" 표현형을 나타낼 수 있다. 본원에 개시된 특정 실시양태는 종양-촉진 TAM의 종양-사멸 대식세포로의 분극화를 역전시킨다. 이 효과는 염증성 사이토카인을 유도하고 다른 면역 세포를 활성화시키며 종양 세포를 식세포작용함으로써 종양 내 면역억압 환경을 개선시킨다.
예로서, 일부 실시양태에서 대식세포-자극 나노입자 중의 패신저 핵산(들)은 키나제 IKKβ와 조합하여 전사 인자 인터페론-조절 인자 5 (IRF5)를 (DNA 또는 IVT mRNA로서) 코딩한다. 이러한 입자는 TAM에 의한 입자의 보다 선택적인 섭취를 지시하기 위해 종양-연관된 대식세포 (TAM) 표적화 리간드를 포함할 수 있다. 일 예로서, TAM은 입자 표면에 만노스를 포함함으로써 표적화될 수 있는 세포 표면 수용체인 CD206을 발현한다. 표적화될 수 있는 다른 TAM 세포 표면 수용체는 초기 성장 반응 단백질 2 (Egr2), CD163, CD23, 인터루킨 (IL)27RA, CLEC4A, CD1a, CD1b, CD93, CD226, IL13-Ra1, IL-4r, IL-1R 유형 II, 디코이 IL-1R 유형 II, IL-10r, 대식세포 스캐빈징 수용체 A 및 B, Ym-1, Ym-2, 저밀도 수용체-관련된 단백질 1 (LRP1), IL-6r, CXCR1/2 및 PD -L1을 포함한다.
특정 실시양태는 환자 내에서 선택된 세포를 표적화하고 선택된 세포에 의한 치료적 단백질 또는 핵산의 발현을 초래하는 나노입자 조성물의 환자에게로의 반복된 전달을 포함한다. 이러한 맥락에서, 일시적 발현은 핵산이 세포(들)로 이동한 후 단기간에 걸친 치료적 단백질의 발현을 지칭한다. 이러한 발현은 표현형이 발현된 치료적 단백질 또는 핵산에 의해 생성되거나 영향을 받는 세포의 표현형의 검출 및/또는 정량화를 포함하여 당업계에서-인정된 다양한 방식으로 모니터링될 수 있다. 세포의 표현형은 이의 물리적 특성 및/또는 이의 신체 내 위치를 지칭한다. 특정 실시양태에 있어서, 연구자 또는 임상의는 나노입자가 제공하는 일시적 발현 프로파일에 기반하여 전달을 위한 나노입자를 선택한다.
이전에 나타낸 바와 같이, 특정 실시양태에 있어서, 일시적 발현 프로파일은 12 시간 내지 15 일; 18 시간 내지 12 일; 20 시간 내지 14 일; 24 시간 내지 10 일, 24 시간 내지 8 일, 또는 30 시간 내지 7 일 지속한다. 다양한 실시양태에서 일시적인 발현이 14 일 이하인 것이 구체적으로 고려된다. 예를 들어, 특정 실시양태에서 일시적 발현은 12 일 이하, 10 일 이하, 9 일 이하, 8 일 이하 또는 7 일 이하 지속하는 검출가능한 발현이다. 더 긴 발현이 요구되는 실시양태에서, 치료적 단백질의 일시적 발현을 제공하는 나노입자는 반복된 용량으로, 예를 들어, 5-10 일 마다 (예컨대, 7 일 마다) 발생하는 전달로 대상체에 전달될 수 있다.
(vi) 키트. 활성 구성요소의 조합이 또한 키트로서 제공될 수 있다. 키트는 임의로 조합 요법에서 사용하기 위한 하나 이상의 약제와 함께 본원에 기재된 바와 같은 하나 이상의 발현 나노입자를 포함하는 용기를 포함할 수 있다. 예를 들어, 일부 키트는 하나 이상의 대식세포 자극 조성물의 양과 함께 하나 이상의 발현 나노입자를 포함할 것이다 (이는 그 자체가 예를 들어, 하나 이상의 대식세포 자극 단백질의 양을 코딩하는 mRNA 또는 DNA 분자를 함유하는 나노입자일 수 있다). 다른 키트는 하나 이상의 세포 유인제, 예컨대, T 세포 유인제의 양과 함께 하나 이상의 발현 나노입자의 양을 포함할 것이다. 키트 중의 임의의 활성 구성요소는 필수는 아니지만 미리측정된 투여량으로 제공될 수 있으며; 예를 들어, 키트가 원하는 발현 나노입자의 1 회 초과의 용량의 투여를 필요로 하는 방법에 사용되는 경우를 포함하여 특정 키트는 1 회 초과의 용량을 포함할 것으로 예상된다.
일반적으로, 2 개 이상의 활성 구성요소를 포함하는 키트는 본원에 기재된 방법 중 하나와 함께 사용되도록 의도된 구성요소를 포함할 것이다. 예를 들어, 대식세포 활성화 화합물은 활성화된 대식세포의 존재로부터 이익을 얻을 수 있는 종양 또는 다른 부위에서 발현을 제공하도록 설계된 나노입자를 함유하는 키트에 제공될 것이다. 유사하게, 키트에 세포 유인제가 제공되는 경우, 이어서 키트에 포함된 하나 이상의 나노입자는 일부 경우에 그 세포 유인제에 의해 유인되는 세포 유형을 표적화할 것이다.
키트는 또한 의약품 또는 생물학적 제품의 제조, 사용 또는 판매를 규제하는 정부 기관에서 규정한 형태의 통지를 포함할 수 있으며, 이 통지는 인간 투여를 위한 제조, 사용 또는 판매 기관의 승인을 반영한다. 통지는 제공된 활성 성분이 대상체에 투여될 수 있음을 명시할 수 있다. 키트는 키트 사용에 대한 추가 지침서, 예를 들어, 투여를 위한 폴리뉴클레오티드 (PN) 또는 나노입자 (NP)의 제조에 관한 지침서; 관련 폐기물의 적절한 처리; 등을 포함할 수 있다. 지침서는 키트 내에 제공된 인쇄된 지침서의 형태일 수 있거나 지침서는 키트 자체의 일부에 인쇄될 수 있다. 지침서는 시트, 팜플렛, 브로셔, CD-ROM 또는 컴퓨터-판독가능한 장치의 형태일 수 있거나 원격 위치, 예컨대, 웹 사이트에서 지침서에 대한 지시를 제공할 수 있다. 특정 실시양태에 있어서, 키트는 또한 키트를 효과적으로 사용하는 데 필요한 의료 용품, 예컨대, 주사기, 앰플, 튜빙, 안면마스크, 주사 캡, 스폰지, 멸균 접착 스트립, Chloraprep, 장갑 등의 일부 또는 전부를 포함할 수 있다. 본원에 기재된 키트 중의 내용물 중 임의의 것의 변이가 이루어질 수 있다. 키트의 지침서는 활성 성분의 사용을 지시하여 본원에 기재된 새로운 임상적 사용을 실현할 것이다.
(vii) 예시적인 실시양태.
1. 치료를 필요로 하는 대상체를 치료하는 방법으로서:
(i) 양으로 하전된 담체 매트릭스 내에 캡슐화된 폴리뉴클레오티드 (예컨대, 합성 mRNA, 예컨대, 시험관 내 전사된 (IVT) mRNA), 여기서 폴리뉴클레오티드는 단백질 및/또는 핵산을 코딩하는, 폴리뉴클레오티드;
(ii) 중성으로 또는 음으로 하전된 코팅; 및
(iii) 코팅의 표면으로부터 연장되는 하나 이상의 세포 표적화 리간드로서, 이러한 세포 표적화 리간드는 선택된 세포에 대해 특이적인, 세포 표적화 리간드;
을 포함하는 나노입자의 치료적 유효량을 상기 대상체에게 투여하는 단계를 포함하고,
여기서 나노입자는 선택된 세포가 폴리뉴클레오티드로부터 단백질을 일시적으로 발현하도록 대상체 내의 선택된 세포 내로 선택적으로 혼입되어, 이를 필요로 하는 대상체를 치료하는, 방법.
2. 실시양태 1의 방법에 있어서, 세포 유인제의 치료적 유효량을 대상체에 투여하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
3. 실시양태 2의 방법에 있어서, 여기서 세포 유인제는 T 세포 유인제인, 방법.
4. 실시양태 3의 방법에 있어서, 여기서 T 세포 유인제는 CCL21 또는 IP10인, 방법.
5. 실시양태 1-4 중 어느 하나의 방법에 있어서, 여기서 단백질은 세포 표면 수용체를 포함하는 질환 특이적 수용체를 포함하는, 방법.
6. 실시양태 5의 방법에 있어서, 여기서 질환 특이적 수용체는 키메라 항원 수용체 (CAR), T 세포 수용체 (TCR) 또는 이들의 조합을 포함하는, 방법.
7. 실시양태 5 또는 6의 방법에 있어서, 여기서 치료적 단백질은 백혈병-특이적 CAR, B 형 간염 바이러스 (HBV) 코어 항원 특이적 HB코어18-27 TCR, 또는 전립선 종양 특이적 항-ROR1 CAR을 포함하는, 방법.
8. 실시양태 1-7 중 어느 하나의 방법에 있어서, 여기서 세포 표적화 리간드는 림프구에 선택적으로 결합하고 수용체-유도된 내포작용을 개시하는, 방법.
9. 실시양태 1-8 중 어느 하나의 방법에 있어서, 여기서 단백질의 발현은 14 일 이하, 12 일 이하, 10 일 이하, 9 일 이하, 8 일 이하, 7 일 이하, 6 일 이하 또는 5 일 이하 동안의 발현인, 방법.
10. 실시양태 1-9 중 어느 하나의 방법에 있어서, 여기서 나노입자의 치료적 유효량을 대상체에 투여하는 단계는 나노입자의 2 회 이상의 용량을 투여하는 단계를 포함하는, 방법.
11. 실시양태 10의 방법에 있어서, 여기서 2 회 이상의 용량은 5-10 일 마다, 또는 6-8 일 마다, 또는 7 일 마다 투여되는, 방법.
12. 실시양태 1-11 중 어느 하나의 방법에 있어서, 여기서 대상체는 암 또는 감염성 질환에 대한 치료를 필요로 하는, 방법.
13. 실시양태 1-12 중 어느 하나의 방법에 있어서, 여기서 나노입자를 투여하는 단계는 카테터를 통한 (a) 종양으로 또는 그 근위의 (종양 내), (b) 정맥으로 (정맥 내), 또는 (c) 복막으로 (복막 내) 주사 또는 주입을 포함하는, 방법.
14. 실시양태 3-13 중 어느 하나의 방법에 있어서, 여기서 T 세포 유인제를 투여하는 단계는 카테터를 통한 종양으로 또는 그 근위의 주사 또는 주입, 정맥 내 주사 또는 주입, 또는 카테터를 통한 복막 내 주사 또는 주입을 포함하는, 방법.
15. 실시양태 2-14 중 어느 하나의 방법에 있어서, 여기서 세포 유인제는 나노입자가 투여되기 전에 대상체에 투여되는, 방법.
16. 실시양태 2-14 중 어느 하나의 방법에 있어서, 여기서 세포 유인제는 나노입자가 투여되기 1 시간 이하 전, 3 시간 이하 전, 6 시간 이하 전, 12 시간 이하 전, 또는 24 시간 이하 전에 투여되는, 방법.
17. 실시양태 16의 방법에 있어서, 여기서 세포 유인제는 (a) 나노입자의 제1 용량 후에만; (b) 나노입자의 각각의 2 회 이상의 용량 후; 또는 (c) 나노입자의 각각의 용량 후에 투여되는, 방법.
18. 실시양태 1 내지 17 중 어느 하나의 방법에 있어서, 대상체에 대식세포 자극 조성물을 투여하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
19. 실시양태 18의 방법에 있어서, 여기서 대식세포 자극 조성물은 대식세포 세포에 대한 표적화된 나노입자를 포함하고, 키나제 IKKβ와 조합하여 전사 인자 인터페론-조절 인자 5 (IRF5)의 발현을 지시할 수 있는, 방법.
20. 실시양태 1-19 중 어느 하나의 방법에 있어서, 여기서 담체는 양으로 하전된 지질 또는 중합체를 포함하는, 방법.
21. 실시양태 20의 방법에 있어서, 여기서 양으로 하전된 중합체는 폴리(β-아미노에스테르) (PBAE), 폴리(L-리신), 폴리(에틸렌 이민) (PEI), 폴리-(아미도아민) 덴드리머 (PAMAM), 폴리(아민-코-에스테르), 폴리(디메틸아미노에틸 메타크릴레이트) (PDMAEMA), 키토산, 폴리-(L-락티드-코-L-리신), 폴리[α-(4-아미노부틸)-L-글리콜산] (PAGA) 또는 폴리(4-하이드록시-L-프롤린 에스테르) (PHP)를 포함하는, 방법.
22. 실시양태 1-21 중 어느 하나의 방법에 있어서, 여기서 코팅은 중성으로 또는 음으로 하전된 지질 또는 중합체를 포함하는, 방법.
23. 실시양태 22의 방법에 있어서, 여기서 중성으로 또는 음으로 하전된 코팅은 폴리글루탐산 (PGA), 폴리(아크릴산), 알긴산, 또는 콜레스테릴 헤미석시네이트/1,2-디올레오일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민을 포함하는, 방법.
24. 실시양태 22의 방법에 있어서, 여기서 중성으로 또는 음으로 하전된 코팅은 쯔비터이온성 중합체를 포함하는, 방법.
25. 실시양태 22-24 중 어느 하나의 방법에 있어서, 여기서 중성으로 또는 음으로 하전된 코팅은 리포솜을 포함하는, 방법.
26. 실시양태 25의 방법에 있어서, 여기서 리포솜은 1,2-디올레오일-3-트리메틸암모늄-프로판 (DOTAP), 1,2-디-O-옥타데세닐-3-트리메틸암모늄 프로판 (DOTMA), 3ß-[N-(N',N'-디메틸아미노에탄)-카바모일]콜레스테롤 (DC-Chol), 디옥타데실-아미도글리실스퍼민 (DOGS), 콜레스테롤, 1,2-디올레오일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민 (DOPE) 또는 1,2-디올레오일-sn-글리세로-3-포스포콜린 (DOPC)을 포함하는, 방법.
27. 실시양태 1-26 중 어느 하나의 방법에 있어서, 여기서 선택된 세포 표적화 리간드는 CD4 및/또는 CD8에 선택적으로 결합하는, 방법.
28. 실시양태 1-27 중 어느 하나의 방법에 있어서, 여기서 선택된 세포 표적화 리간드는 CD4 항체 및/또는 CD8 항체로부터 선택된 결합 도메인을 포함하는, 방법.
29. 실시양태 1-28 중 어느 하나의 방법에 있어서, 여기서 선택된 세포 표적화 리간드는 CD4 항체 및/또는 CD8 항체의 scFv 단편으로부터 선택된 결합 도메인을 포함하는, 방법.
30. 실시양태 1-29 중 어느 하나의 방법에 있어서, 여기서 담체는 PBAE (예컨대, PBAE 447 및/또는 1-(3-아미노프로필)피롤리딘 말단 캡 포함)를 포함하는, 방법.
31. 실시양태 1-30 중 어느 하나의 방법에 있어서, 여기서 코팅은 PGA를 포함하는, 방법.
32. 실시양태 1-31 중 어느 하나의 방법에 있어서, 여기서 선택된 세포 표적화 리간드는 CD4 항체 및/또는 CD8 항체로부터 선택된 결합 도메인을 포함하고; 담체는 PBAE (예컨대, PBAE 447 및/또는 1-(3-아미노프로필)피롤리딘 말단 캡 포함)를 포함하고; 코팅은 PGA를 포함하는, 방법.
33. 다음을 포함하는 합성 나노입자:
(i) 단백질 또는 핵산을 코딩하고 양으로 하전된 담체 내에 캡슐화된 폴리뉴클레오티드 (예컨대, 합성 mRNA, 예컨대, IVT mRNA);
(ii) 담체의 외부 표면 상의 중성으로 또는 음으로 하전된 코팅; 및
(iii) 코팅의 표면으로부터 연장되는 선택된 세포 표적화 리간드;
여기서 단백질은 HBV 특이적 TCR, 백혈병-특이적 항-CD19 CAR, 또는 전립선 종양-특이적 항-ROR1 CAR로부터 선택될 수 있으며, 여기서 CAR의 세포 내 도메인은 1928z 또는 4-1BBz일 수 있는, 합성 나노입자.
34. 실시양태 33의 합성 나노입자에 있어서, 여기서 담체는 양으로 하전된 지질 또는 중합체를 포함하는, 합성 나노입자.
35. 실시양태 34의 합성 나노입자에 있어서, 여기서 양으로 하전된 지질 또는 중합체는 PBAE, 폴리(L-리신), PEI, PAMAM, 폴리(아민-코-에스테르), PDMAEMA, 키토산, 폴리-(L-락티드-코-L-리신), PAGA 또는 PHP를 포함하는, 합성 나노입자.
36. 실시양태 33 또는 34의 합성 나노입자에 있어서, 여기서 코팅은 중성으로 또는 음으로 하전된 지질 또는 중합체를 포함하는, 합성 나노입자.
37. 실시양태 36의 합성 나노입자에 있어서, 여기서 중성으로 또는 음으로 하전된 코팅은 PGA, 폴리(아크릴산), 알긴산 또는 콜레스테릴 헤미석시네이트/1,2-디올레오일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민을 포함하는, 합성 나노입자.
38. 실시양태 36의 합성 나노입자에 있어서, 여기서 중성으로 또는 음으로 하전된 코팅은 쯔비터이온성 중합체를 포함하는, 합성 나노입자.
39. 실시양태 36-38 중 어느 하나의 합성 나노입자에 있어서, 여기서 중성으로 또는 음으로 하전된 코팅은 리포솜을 포함하는, 합성 나노입자.
40. 실시양태 39의 합성 나노입자에 있어서, 여기서 리포솜은 DOTAP, DOTMA, DC-Chol, DOGS, 콜레스테롤, DOPE 또는 DOPC를 포함하는, 합성 나노입자.
41. 실시양태 33-40 중 어느 하나의 합성 나노입자에 있어서, 여기서 선택된 세포 표적화 리간드는 CD4 및/또는 CD8에 선택적으로 결합하는, 합성 나노입자.
42. 실시양태 33-41 중 어느 하나의 합성 나노입자에 있어서, 여기서 선택된 세포 표적화 리간드는 CD4 항체 및/또는 CD8 항체로부터 선택된 결합 도메인을 포함하는, 합성 나노입자.
43. 실시양태 33-42 중 어느 하나의 합성 나노입자에 있어서, 여기서 선택된 세포 표적화 리간드는 CD4 항체 및/또는 CD8 항체의 scFv 단편으로부터 선택된 결합 도메인을 포함하는, 합성 나노입자.
44. 실시양태 33-43 중 어느 하나의 합성 나노입자에 있어서, 여기서 담체는 PBAE (예컨대, PBAE 447 및/또는 1-(3-아미노프로필)피롤리딘 말단 캡 포함)를 포함하는, 합성 나노입자.
45. 실시양태 33-44 중 어느 하나의 합성 나노입자에 있어서, 여기서 코팅은 PGA를 포함하는, 합성 나노입자.
46. 실시양태 33-45 중 어느 하나의 합성 나노입자에 있어서, 여기서 선택된 세포 표적화 리간드는 CD4 항체 및/또는 CD8 항체로부터 선택된 결합 도메인을 포함하고; 담체는 PBAE (예컨대, PBAE 447 및/또는 1-(3-아미노프로필)피롤리딘 말단 캡 포함)를 포함하고; 코팅은 PGA를 포함하는, 합성 나노입자.
47. 조성물로서, 실시양태 33-46 중 어느 하나의 합성 나노입자를 포함하는 조성물.
48. 이를 필요로 하는 대상체를 치료하는 방법으로서, 실시양태 47의 조성물의 치료적 유효량을 투여하여 이를 필요로 하는 대상체를 치료하는 단계를 포함하는, 방법.
49. 실시양태 48의 방법에 있어서, 나노입자 또는 조성물을 투여하기 전에 T 세포 유인제를 대상체에 투여하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
50. 이를 필요로 하는 대상체를 치료하는 방법으로서:
대상체에 투여한 후 선택된 세포 유형에 의해 단백질 또는 핵산의 발현을 초래하는 나노입자를 선택하는 단계 및
대상체에 선택된 나노입자의 치료적 유효량을 투여하여 이를 필요로 하는 대상체를 치료하는 단계를 포함하며, 여기서 단백질 또는 핵산의 발현은 투여 후 10 일 이내에 검출가능한 한계 미만으로 떨어지는, 방법.
51. 실시양태 50의 방법에 있어서, 여기서 단백질 또는 핵산의 발현은 투여 7 일 이내에 검출가능한 한계 미만으로 떨어지는, 방법.
52. 실시양태 50 또는 51의 방법에 있어서, 대상체에 선택된 나노입자의 제2 치료적 유효량을 투여하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
53. 실시양태 52의 방법에 있어서, 여기서 제2 치료적 유효량의 투여는 단백질 또는 핵산의 발현이 검출가능한 한계 미만으로 떨어진 후에 발생하는, 방법.
54. 실시양태 52의 방법에 있어서, 여기서 제2 치료적 유효량의 투여는 단백질 또는 핵산의 발현이 검출가능한 한계 미만으로 떨어지기 전에 발생하는, 방법.
55. 실시양태 52의 방법에 있어서, 여기서 제1 치료적 유효량 및 제2 치료적 유효량은 5 일 간격, 6 일 간격, 7 일 간격, 8 일 간격, 9 일 간격 또는 10 일 간격으로 투여되는, 방법.
56. 실시양태 50-55 중 어느 하나의 방법에 있어서, 여기서 투여는 전신 또는 국소 투여를 포함하는, 방법.
57. 실시양태 56의 방법에 있어서, 여기서 투여는 종양 부위에서의 국소 투여를 포함하는, 방법.
58. 실시양태 50-57 중 어느 하나의 방법에 있어서, 여기서 투여는 카테터를 통한 (a) 종양으로 또는 그 근위의, (b) 정맥으로, 또는 (c) 복막으로 주사 또는 주입을 포함하는, 방법.
59. 실시양태 50-58 중 어느 하나의 방법에 있어서, 여기서 단백질은 세포 표면 수용체를 포함하는 질환 특이적 수용체를 포함하는, 방법.
60. 실시양태 59의 방법에 있어서, 여기서 질환 특이적 수용체는 CAR, TCR 또는 이들의 하이브리드를 포함하는, 방법.
61. 실시양태 50-60 중 어느 하나의 방법에 있어서, 여기서 치료적 단백질은 HBV 특이적 TCR, 백혈병-특이적 항-CD19 CAR, 또는 전립선 종양-특이적 항-ROR1 CAR을 포함하고, 여기서 CAR의 세포 내 도메인은 1928z 또는 4-1BBz일 수 있는, 방법.
62. 실시양태 50-61 중 어느 하나의 방법에 있어서, 여기서 단백질은 대식세포 자극 단백질을 포함하는, 방법.
63. 실시양태 62의 방법에 있어서, 여기서 대식세포 자극 단백질은 키나제 IKKβ와 조합된 전사 인자 IRF5를 포함하는, 방법.
64. 실시양태 62의 방법에 있어서, 여기서 대식세포 자극 단백질은 IRF5, IRF1, IRF3, IRF7, IRF8 및/또는 IRF7 및 IRF3의 융합으로부터 선택된 하나 이상의 IRF를 포함하는, 방법.
65. 실시양태 64의 방법에 있어서, 여기서 IRF7/IRF3 융합 단백질은 서열번호 39를 포함하는, 방법.
66. 실시양태 63-65 중 어느 하나의 방법에 있어서, 여기서 하나 이상의 IRF는 기능적 자가억제 도메인이 결여된, 방법.
67. 실시양태 63-66 중 어느 하나의 방법에 있어서, 여기서 하나 이상의 IRF는 기능적 핵 방출 신호 (NES)가 결여된, 방법.
68. 실시양태 64의 방법에 있어서, 여기서 하나 이상의 IRF는 서열번호 25-41에 대해 >90%, >95%, 또는 98% 초과의 동일성을 갖는 서열로부터 선택된, 방법.
69. 실시양태 64의 방법에 있어서, 여기서 하나 이상의 IRF는 서열번호 25-31로부터 선택된 IRF5인, 방법.
70. 실시양태 69의 방법에 있어서, 여기서 IRF5는 S156D, S158D 및 T160D로부터 선택된 하나 이상의 돌연변이를 갖는 서열번호 25 또는 서열번호 27을 포함하는, 방법.
71. 실시양태 69의 방법에 있어서, 여기서 IRF5는 T10D, S158D, S309D, S317D, S451D, 및 S462D로부터 선택된 하나 이상의 돌연변이를 갖는 서열번호 26을 포함하는, 방법.
72. 실시양태 69의 방법에 있어서, 여기서 IRF5는 S425D, S427D, S430D 및 S436D로부터 선택된 하나 이상의 돌연변이를 갖는 서열번호 28을 포함하는, 방법.
73. 실시양태 64의 방법에 있어서, 여기서 하나 이상의 IRF는 서열번호 32 및 36으로부터 선택된 IRF1인, 방법.
74. 실시양태 64의 방법에 있어서, 여기서 하나 이상의 IRF는 서열번호 35, 40 및 41로부터 선택된 IRF8인, 방법.
75. 실시양태 74의 방법에 있어서, 여기서 IRF8은 K310R 돌연변이를 갖는 서열번호 35를 포함하는, 방법.
76. 실시양태 63-75 중 어느 하나의 방법에 있어서, 여기서 코딩된 IKKβ는 서열번호 42-46에 대해 >90%, >95%, 또는 98% 초과의 동일성을 갖는 서열로부터 선택된, 방법.
77. 실시양태 63-75 중 어느 하나의 방법에 있어서, 여기서 코딩된 IKKβ는 서열번호 42-46으로부터 선택된, 방법.
78. 실시양태 50-77 중 어느 하나의 방법에 있어서, 여기서 치료적 단백질은 글루코코르티코이드-유도된 류진 지퍼 (GILZ)를 포함하는, 방법.
79. 실시양태 50-78 중 어느 하나의 방법에 있어서, 여기서 선택되고 투여된 나노입자는 <130 nm인, 방법.
80. 실시양태 50-79 중 어느 하나의 방법에 있어서, 여기서 선택되고 투여된 나노입자는 다음을 포함하는, 방법:
(i) 양으로 하전된 담체 매트릭스 내에 캡슐화된 합성 mRNA, 여기서 합성 mRNA는 치료적 단백질을 코딩함;
(ii) 중성으로 또는 음으로 하전된 코팅; 및
(iii) 코팅의 표면으로부터 연장되는 하나 이상의 선택된 세포 표적화 리간드, 이러한 선택된 세포 표적화 리간드는 선택된 세포 유형 상의 마커에 특이적으로 결합한다.
81. 실시양태 80의 방법에 있어서, 여기서 합성 mRNA는 IVT mRNA를 포함하는, 방법.
82. 실시양태 80 또는 81의 방법에 있어서, 여기서 양으로 하전된 담체 매트릭스는 양으로 하전된 지질 또는 중합체를 포함하는, 방법.
83. 실시양태 82의 방법에 있어서, 여기서 양으로 하전된 지질 또는 중합체는 PBAE, 폴리(L-리신), PEI, PAMAM, 폴리(아민-코-에스테르), PDMAEMA, 키토산, 폴리-(L-락티드-코-L-리신), PAGA 또는 PHP를 포함하는, 방법.
84. 실시양태 80-83 중 어느 하나의 방법에 있어서, 여기서 양으로 하전된 중합체는 PBAE (예컨대, PBAE 447 및/또는 1-(3-아미노프로필)피롤리딘 말단 캡 포함)를 포함하는, 방법.
85. 실시양태 80-84 중 어느 하나의 방법에 있어서, 여기서 중성으로 또는 음으로 하전된 코팅은 PGA, 폴리(아크릴산), 알긴산 또는 콜레스테릴 헤미석시네이트/1,2-디올레오일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민을 포함하는, 방법.
86. 실시양태 80-85 중 어느 하나의 방법에 있어서, 여기서 중성으로 또는 음으로 하전된 코팅은 PGA를 포함하는, 방법.
87. 실시양태 80-85 중 어느 하나의 방법에 있어서, 여기서 중성으로 또는 음으로 하전된 코팅은 쯔비터이온성 중합체를 포함하는, 방법.
88. 실시양태 80-85 중 어느 하나의 방법에 있어서, 여기서 중성으로 또는 음으로 하전된 코팅은 리포솜을 포함하는, 방법.
89. 실시양태 88의 방법에 있어서, 여기서 리포솜은 DOTAP, DOTMA, DC-Chol, DOGS, 콜레스테롤, DOPE 또는 DOPC를 포함하는, 방법.
90. 실시양태 80-89 중 어느 하나의 방법에 있어서, 여기서 선택된 세포 표적화 리간드는 림프구에 선택적으로 결합하고 수용체-유도된 내포작용을 개시하는, 방법.
91. 실시양태 80-90 중 어느 하나의 방법에 있어서, 여기서 선택된 세포 표적화 리간드는 CD4 및/또는 CD8에 선택적으로 결합하는, 방법.
92. 실시양태 80-91 중 어느 하나의 방법에 있어서, 여기서 선택된 세포 표적화 리간드는 CD4 항체 및/또는 CD8 항체로부터 선택된 결합 도메인을 포함하는, 방법.
93. 실시양태 80-92 중 어느 하나의 방법에 있어서, 여기서 선택된 세포 표적화 리간드는 CD4 항체 및/또는 CD8 항체의 scFv 단편으로부터 선택된 결합 도메인을 포함하는, 방법.
94. 실시양태 80-93 중 어느 하나의 방법에 있어서, 여기서 선택된 세포 표적화 리간드는 CD4 항체 및/또는 CD8 항체로부터 선택된 결합 도메인을 포함하고; 담체는 PBAE (예컨대, PBAE 447 및/또는 1-(3-아미노프로필)피롤리딘 말단 캡 포함)를 포함하고; 코팅은 PGA를 포함하는, 방법.
95. 실시양태 80-89 중 어느 하나의 방법에 있어서, 여기서 선택된 세포 표적화는 CD206, CD163, 또는 CD23에 결합하는, 방법.
96. 실시양태 80-89 중 어느 하나의 방법에 있어서, 여기서 선택된 세포 표적화 리간드는 디-만노스를 포함하는, 방법.
97. 실시양태 80-89 중 어느 하나의 방법에 있어서, 여기서 선택된 세포 표적화는 CD38, G-단백질 커플링된 수용체 18 (Gpr18), 포르밀 펩티드 수용체 2 (Fpr2), CD64, 또는 CD68에 결합하는, 방법.
98. 실시양태 50-97 중 어느 하나의 방법에 있어서, 세포 유인제의 치료적 유효량을 대상체에 투여하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
99. 실시양태 98의 방법에 있어서, 여기서 세포 유인제는 T 세포 유인제를 포함하는, 방법.
100. 실시양태 99의 방법에 있어서, 여기서 T 세포 유인제는 CCL21 또는 IP10을 포함하는, 방법.
101. 실시양태 99 또는 100의 방법에 있어서, 여기서 T 세포 유인제는 CCL1, CCL2, CCL17, CCL22, CXCL9, CXCL10 또는 CXCL11을 포함하는, 방법.
102. 실시양태 98-101 중 어느 하나의 방법에 있어서, 여기서 세포 유인제는 단핵구/대식세포 유인제를 포함하는, 방법.
103. 실시양태 102의 방법에 있어서, 여기서 단핵구/대식세포 유인제는 CCL2, CCL3, CCL5, CCL7, CCL8, CCL13, CCL17 또는 CCL22를 포함하는, 방법.
104. 실시양태 98-103 중 어느 하나의 방법에 있어서, 여기서 세포 유인제는 비만 세포 유인제를 포함하는, 방법.
105. 실시양태 104의 방법에 있어서, 여기서 비만 세포 유인제는 CCL2 또는 CCL5를 포함하는, 방법.
106. 실시양태 98-105 중 어느 하나의 방법에 있어서, 여기서 세포 유인제는 호산구 유인제를 포함하는, 방법.
107. 실시양태 106의 방법에 있어서, 여기서 호산구 유인제는 CCL3, CCL5, CCL7, CCL11, CCL13, CCL24, 또는 CCL26을 포함하는, 방법.
108. 실시양태 98-107 중 어느 하나의 방법에 있어서, 여기서 세포 유인제는 호중구 유인제를 포함하는, 방법.
109. 실시양태 108의 방법에 있어서, 여기서 호중구 유인제는 IL-8 또는 NAP1을 포함하는, 방법.
110. 실시양태 98-109 중 어느 하나의 방법에 있어서, 여기서 세포 유인제는 나노입자의 제1 치료적 유효량이 투여되기 전에 대상체에 투여되는, 방법.
111. 실시양태 98-109 중 어느 하나의 방법에 있어서, 여기서 세포 유인제는 나노입자의 제1 치료적 유효량이 투여되기 1 시간 이하 전, 3 시간 이하 전, 6 시간 이하 전, 12 시간 이하 전 또는 24 시간 이하 전에 투여되는, 방법.
112. 실시양태 98-109 중 어느 하나의 방법에 있어서, 여기서 세포 유인제는 나노입자의 제1 치료적 유효량이 투여되기 1 시간 이상 전, 3 시간 이상 전, 6 시간 이상 전, 12 시간 이상 전 또는 24 시간 이상 전에 투여되는, 방법.
113. 실시양태 98-112 중 어느 하나의 방법에 있어서, 여기서 세포 유인제는 (a) 나노입자의 제1 치료적 유효량의 제 1 용량이 투여된 후에만 투여되는, 방법.
114. 실시양태 50-113 중 어느 하나의 방법에 있어서, 여기서 대상체는 암 또는 감염성 질환에 대한 치료를 필요로 하는, 방법.
115. 실시양태 114의 방법에 있어서, 여기서 암은 백혈병, 전립선암, 또는 B 형 간염-유도된 간세포 암종, 난소암, 교모세포종 또는 폐암인, 방법.
116. 선행하는 실시양태 중 어느 하나의 방법에 있어서, 여기서 연구자 또는 임상의는 선택된 나노입자의 일시적 발현 특성으로 인해 대상체에 투여하기 위해 선행하는 실시양태 중 어느 하나에 기술된 나노입자를 선택하는, 방법.
117. 실시양태 116의 방법에 있어서, 여기서 연구원 또는 임상의는 대상체에 선택된 나노입자를 투여하는, 방법.
118. 실시양태 116 또는 117의 방법에 있어서, 여기서 일시적 발현 특성은 14 일 이하, 12 일 이하, 10 일 이하, 9 일 이하, 8 일 이하, 7 일 이하, 6 일 이하 또는 5 일 이하 동안 단백질 또는 핵산의 발현을 초래하는, 방법.
(viii) 실험적인 실시예.
실시예 1.
도입.
유전자 요법은 키메라 항원 수용체 (CAR), TCR 또는 CAR/TCR 하이브리드에 의해 질환-특이적 T-세포를 조작하는 것을 가능하게 만든다. 그러나, 생체 외에서 조작된 T 세포를 제조하는 데 현재 필요한 정교하고 값 비싼 프로토콜은 건강 관리 시스템의 요구 사항을 해결할 수 있을만큼 충분히 큰 규모로 이러한 트랜스진을 도입하는 데 실용적이지 않다. 여기에서는 순환 T 세포를 일시적으로 재프로그래밍하여 질환-관련 항원을 인식할 수 있는 시험관 내 전사된 (IVT) mRNA를 전달하는 주사가능한 나노입자가 개시된다. 이러한 중합체 나노입자의 반복된 주입은 종양-특이적 CAR 또는 바이러스-특이적 TCR 트랜스진을 충분한 양의 숙주 T 세포로 전달하여 생체 외에서 조작된 림프구의 볼루스 주입과 유사한 수준으로 백혈병, 전립선암 및 B 형 간염-유도된 간세포 암종에서 질환 퇴행을 유도한다. 제조, 배포 및 관리의 용이함을 감안할 때, 이 새로운 나노기술은 광범위한 질환에 대한 높은 영향을 미치는 치료법으로 해석된다.
환자 또는 공여자로부터 수확된 T 세포가 유전적으로 암 또는 감염원을 표적화하는 강력한 양상인 입양 T-세포 요법의 효능은 이제 논란의 여지가 없으며 인상적인 임상적 이점을 보여주는 수많은 임상 시험에 의해 뒷받침된다. 그러나, 표준화된 형태로 대량으로 약물을 준비하는 것보다 각각의 환자를 위해 T 세포 제품을 제조하는 데 관여되는 복잡성 및 높은 비용은 현재의 최전선 요법 옵션, 예컨대, 소분자 약물 또는 모노클로날 항체를 능가하기 어렵게 만든다. 대부분의 CAR-T 및 TCR-조작된 T 세포는 현재 (i) 2 개의 정맥 내 튜브에 의해 몇 시간 동안 채집 기계에 연결된 환자로부터 T 세포를 추출하는 백혈구채집술. 이는 환자에게 불편하고 상당한 비용을 발생시키며 궁극적으로 대규모 입양 자가유래 T 요법은 채집 능력의 이용가능성에 의해 비율이 제한될 수 있다; (ii) T 세포의 활성화 및 형질도입; (iii) 사이토카인 보충된 조직 배양 배지에서 2-주 기간에 걸쳐 형질도입된 T 세포의 확장; 및 (iv) 투여 전에 T 세포를 세척 및 농축시키는 단계. 중앙 시설에서 제조되어 원격 치료 센터로 수송되는 T 제품의 경우, 세포는 동결보존되어야 한다; 및 (v) CAR-T 제품의 각각의 배치에 대해 품질 관리 (QC) 방출 검정을 수행함을 포함하는 번거롭고 맞춤화된 공정으로 만들어진다. 전체 공정은 유지 및 운영 비용이 많이 드는 환경적으로 제어된 GMP 준수 조건에서 수행되어야 한다. 각각의 CAR-T 제품은 치료될 환자로부터의 출발 재료 (T 세포)로 만들어지기 때문에, 실질적인 규모의 경제가 없다.
IVT mRNA는 최근 유전 정보를 전달하기 위한 잠재적인 새로운 약물 부류로서 주목받고 있다. 이러한 합성 mRNA 의약품은 구조적으로 천연 mRNA를 닮아 일시적으로 단백질을 발현하도록 조작될 수 있다. 이들은 쉽게 개발되고 생산 비용이 저렴하며 제조 목적에 맞게 효율적으로 확장가능하다. 특히 IVT mRNA의 번역 효능 및 면역원성의 제어와 관련된 이 약물 부류의 고유의 문제를 해결하는 발전은 광범위한 잠재적 응용 분야의 기반을 제공한다.
여기서, 주사가능한 약물로서 IVT mRNA의 사용은 순환 T 세포를 유전적으로 프로그래밍하여 질환 특이적 수용체를 일시적으로 발현시켜, 환자로부터 림프구를 추출하고 배양할 필요성을 우회하는 것이 (도 1, 2, 3a, 3b) 탐구되었다. IVT mRNA 페이로드를 응축 및 보호하고 T 세포에 정확하게 표적화하기 위해, 생분해성 중합체성 나노입자가 제형화되었다. 단일 나노입자 적용이 CD19-특이적 1928z CAR (재발된 또는 불응성 거대 B-세포 림프종이 있는 성인 환자의 치료를 위해 FDA 승인을받은 YescartaTM) 또는 B 형 간염 바이러스 (HBV) 코어 항원에 특이적인 HB코어18-27 TCR (현재 HBV-관련된 간세포 암종 환자를 치료하기 위한 I 상 연구 중)로 배양된 T 세포의 > 70%를 일상적으로 형질주입시킬 수 있다는 것이 생체 외에서 처음 입증되었다. 나노입자-형질주입된 T 세포는 평균 7 일 동안 표면에서 이러한 CAR- 또는 TCR-트랜스진을 일시적으로 발현한다.
정교하고 비용이 많이 드는 절차인 개인화된 T-세포 요법과 비교할 때, 나노입자 약물은 저렴하고 대량으로 제조하기 쉽다 (그리고 cGMP 조건 하에서 나노입자의 대규모 제조를 위해 설계된 연속 유동 미세유체 기기가 현재 이용가능하다). 나노담체의 미세유체 조립을 위한 예시적인 방법은 예를 들어, Wilson 등 (2017) J. Biomed. Mat. Res. A. 6(105):183-1825에 제공된다. 일부 실시양태에 있어서, 나노담체는 마이크로믹서 칩을 사용하여 제조된다. 개시내용의 방법과 양립가능한 예시적인 마이크로믹서 칩은 Dolomite® 마이크로믹서 칩 (Dolomite Microfluidics, Royston, UK (Dolomite TELOS™))이다. 이 결과는 생체 외 조작된 T-세포 제품으로부터 악성 또는 만성 감염 환자의 치료를 위한 입수가능한 기성품 시약로 치료 기회를 전환시키고, 이는 진단 당일에 및 의학적으로 필요한 만큼 자주 이용가능하다.
목적.
이 실시예의 목적은 질환 특이적 수용체를 일시적으로 발현하도록 순환 T 세포를 유전적으로 프로그래밍하여 환자로부터 림프구를 추출하고 배양할 필요성을 우회하는 주사가능한 약물로서 IVT mRNA의 사용을 탐구하는 것이었다. 주기적으로 투여되는 경우 CAR- 또는 TCR-코딩 mRNA 입자가 CAR-코딩 바이러스 벡터로 생체 외에서 형질도입된 T 세포의 통상적인 주입과 유사한 효능으로 종양 퇴행을 야기하기에 충분한 양으로 T 세포를 프로그래밍할 수 있음을 입증하는 실험이 수행되었다.
결과.
IVT mRNA 나노입자는 인간 T 세포를 CAR- 또는 TCR 트랜스진으로 효율적으로 형질주입시킨다. 질환-특이적 수용체 유전자를 코딩하는 IVT mRNA를 인간 림프구로 전달하기 위해, 생분해성 폴리(β-아미노 에스테르) (PBAE) 중합체 제형을 담체 매트릭스로서 사용하였다 (도 4a). 양이온성 PBAE는 정전기적 상호작용을 통해 음이온성 핵산과 함께 나노복합체로 자가-조립되었다 (도 4b). 입자는 Fab 서열에 첨가된 시스테인과 반응하는 PGA-말레이미드를 사용하여 항-CD8 결합 도메인을 폴리글루탐산 (PGA)에 커플링하여, 입자에 정전기적으로 흡착된 컨쥬게이트를 형성함으로써 표적화되었다. 생성된 mRNA 나노입자는 장기간 보관을 위해 동결건조될 수 있다. 사용하기 전에, 입자는 멸균수를 첨가한 후 몇 초 내에 수화되어 원래 농도로 복원된다. 2A 링커 서열에 의해 연결된 TCR 알파 및 베타 쇄을 코딩하는 약간 더 큰 TCR 트랜스진에 비해 CAR 트랜스진이 로딩된 나노입자의 물리적 특성에서 유의한 상이함이 관찰되지 않았다. 예시적인 단백질 서열은 도 8에 제공된다.
인간 림프구의 확립된 배양물에 표적화된 IVT mRNA 나노입자를 첨가하는 것이 그들에서 강력한 형질주입을 연출할 수 있는지 여부를 먼저 테스트하였다. 임상적으로-관련된 응용에서 이 접근법을 테스트하기 위해, 백혈병-특이적 19-28z CAR을 코딩하는 IVT mRNA를 나노입자에 혼입시켰다 (도 5a-5e). CD19-표적화된 수용체는 오늘날 가장 많이 조사된 CAR-T 세포 제품으로, 국제적으로 거의 30 건의 임상 시험이 진행 중이며, 이미 FDA 승인된 2 건의 암 요법이 있다 (Sadelain, J Clin Invest 125:3392-3400, 2015).
제2 예로서, 고-친화도 HBV-특이적 TCR을 코딩하는 IVT mRNA (도 5f-5j)가 전달되었다. 만성 B 형 간염의 T-세포 요법은 항바이러스 면역을 회복하고 감염을 치유하는 신규 접근법이다. HBV 코어 항원에 특이적인 HB코어18-27 TCR은 HBV 감염이 해결된 HLA-A 02.01 공여자로부터 단리되었다 (Kah 등, J Clin Invest. 2017 Aug 1; 127(8):3177-3188).
작제물 1928z CAR 및 HB코어18-27 TCR 둘 다에 대해, 실시간 정량 PCR 및 유세포 분석을 사용하여 단일 나노입자 형질주입 후 인간 T 세포에서의 발현 수준을 측정하였다. 트랜스진 발현은 나노입자 노출 24 시간 후 피크에 도달하였고, 이러한 증식 T 세포에서 발현의 점차적인 감소가 뒤따랐다 (도 5a, 5f). 이것은 높은 수준의 CAR- 또는 TCR-표면 발현으로 번역되었으며, 2 일차에 최대 값 (T 세포의 75%±11%는 1928z CAR을 발현하였다; 도 5b, 5c; 그리고 T 세포의 평균 89%±4%는 HB코어18-27TCR을 발현하였다; 도 5g, 5h)을 나타냈다. 예상한 바와 같이, 수용체 발현은 일시적이었으며, 배양 8 일 후 CAR의 경우 28%±6%, TCR의 경우 26%±9%로 감소하였다.
다음으로 나노입자-형질주입된 T 세포의 기능 (사멸 및 사이토카인 생산)은 바이러스 방법을 사용하여 이들 수용체로 조작된 T 세포의 기능과 비교하였다. 실시간 IncuCyte® (Essen Instruments, Inc., Ann Arbor, MI) 생세포 검정을 사용하여, IVT mRNA-형질주입된 T 세포가 항원-양성 표적 세포 (HB코어18-27 TCR에 대해 HBcAg로 안정적으로 형질도입된 1928z CAR 및 HepG2 간암 세포에 대한 Raji 림프종 세포)를 선택적으로 용해시키는 능력에서 유의한 상이함이 측정되지 않았다 (도 5d, 5i). 또한, 유사한 수준의 T-세포 분비된 이펙터 사이토카인을 나노입자-형질주입된 T 세포 대 바이러스로 형질도입된 T 세포에서 측정하였다 (도 5e, 5j).
A. 담체-전달된 mRNA의 주입은 백혈병을 인식하도록 숙주 T 세포를 재프로그래밍한다.
다음으로, 림프구-표적화된 IVT mRNA 나노입자가 통상적인 방법과 유사한 효능으로 종양 퇴행을 야기할 만큼 충분히 많은 양의 순환 T 세포를 재프로그래밍할 수 있는지 여부를 조사하였다. 백혈병에서 효능의 생체 내 증명으로서, 면역결핍 NOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ (NSG) 마우스에 반딧불이 루시퍼라제를 발현하는 1x106 개의 CD19+ Raji 세포를 접종하였다. 5 일 후, 마우스를 10x106 개의 CD3+ 인간 T 세포로 재구성한 다음, 1928z CAR을 코딩하는 mRNA가 로딩된 나노입자 (백혈병 특이성을 생성하기 위해) 또는 GFP를 코딩하는 mRNA가 로딩된 대조군 입자의 주입을 6 주 마다 받았다 (도 6a). 대조군은 처리를 받지 않았다. 주간 나노입자 투여 프로토콜은 IVT mRNA 나노입자로 생체 외에서 측정된 CAR 표면 발현의 동역학을 기반으로 선택되었으며, 이는 8 일 이하 동안 관련 수용체 발현을 나타냈다 (도 5b, 5c).
나노입자 주입의 치료적 효능을 통상적인 입양 T 세포 요법과 비교하기 위해, 마우스의 추가 군을 또한 1928z CAR을 코딩하는 렌티바이러스 벡터로 생체 외에서 형질도입된 5x106 개의 T 세포의 단일 용량으로 처리하였다. 이 양은 환자가 체중 킬로그램 당 1.2x107 개 이하의 CAR T 세포로 처리된 현재 임상 연구에서 사용된 CAR T 세포의 더 많은 용량과 동등하다 (Grupp 등, N Engl J Med 368:1509-1518, 2013). 생체발광 이미징을 사용하여 종양 성장을 연속적으로 정량화하였다. 전체 생존을 또한 모니터링하였다. 생존은 처리되지 않은 대조군에 비해 생체 외에서 조작된 입양 이동된 1928z CAR-T 세포로 처리된 마우스에서 크게 개선되었다. 10 마리의 마우스 중 6 마리에서 종양이 박멸되었고, 나머지는 평균 32 일의 생존 개선과 함께 상당한 종양 퇴행을 보였다 (도 6c). 통상적인 입양 T 세포 요법으로 달성된 이 치료적 이점은 동일한 CAR을 생체 내 림프구로 프로그래밍하는 IVT mRNA 나노입자를 이용한 치료와 유사하였으며, 이는 7/10 마우스에서 종양 박멸 및 재발성 동물의 생존에서 평균 37 일 개선을 달성하였다 (도 6c).
제1 용량 2 일 후 말초 혈액의 유세포 분석은 1928z-운반 나노입자가 백혈병 세포를 인식하도록 말초 T 세포를 신속하고 효율적으로 프로그래밍하였음을 나타냈다 (CD8+ 중 평균 10% CAR+ ± 4.3%, 도 6d, 6e). 이러한 CAR은 1 주 이하 동안 일시적으로 발현되었다 (7 일차에 0.8%±0.4% CAR+ CD8+ T 세포). 나노입자의 반복 용량은 제1 주사만큼 효과적이었으며, 숙주 T 세포로의 평균 10.7%±3.6% 캡슐화된 mRNA 이동을 달성하였다 (도 6e). 이는 종종 이의 일시적인 본성에도 불구하고 IVT mRNA가 숙주 림프구에서 지속적인 인 시튜 CAR 발현을 달성하는 플랫폼으로서 역할을 할 수 있음을 시사한다.
B. 나노입자를 통해 종양-특이적 CAR 유전자를 T 세포에 도입하면 전립선 종양의 퇴행을 초래한다.
고체 종양에서 효능을 입증하기 위하여, 마우스에서 전립선 종양의 퇴행을 유도하기 위해 전립선 종양-특이적 CAR 유전자를 순환 숙주 T 세포에 도입하도록 설계된 나노입자의 능력을 입증하였다. CD19 표적 항원의 높은 수준을 보편적으로 발현하고 순환 T 세포에 쉽게 접근가능한 백혈병 세포와 달리, 고체 암은 비균질하고 보호된다 (Meacham & Morrison, Nature 501:328-337, 2013). 이는 종양 세포의 일부가 표적화하는 CAR에 의해 인식되지 않을 것이며, T 세포를 기능장애로 만들 수 있는 면역-억압 방어로 둘러싸일 것임을 의미한다. 실제로, 전체 게놈/전사 프로파일링을 140 개의 전립선암 전이에서 사용하여, 전립선 종양 병변이 환자 간에 3 개의 주요 세포 표면 단백질 (전립선-특이적 막 항원 (PSMA), 전립선 줄기세포 항원 (PSCA) 및 수용체 티로신 키나제-유사 희귀 수용체 1 (ROR1))의 비균질 발현을 나타냄을 확립하였다 (도 7a).
인간 질환을 재현하기 위해, LNCaP C42 전립선 암종 세포 (주요 세포 표면 단백질의 비균질 발현을 나타냄, 도 7b)를 NSG 마우스의 전립선의 등쪽 엽에 동소 이식하였다 (도 7c). 생체발광 이미징으로 종양 부담을 연속적으로 모니터링하기 위해, 종양 세포에 반딧불이 루시퍼라제 (FLuc)를 유전적으로 태깅하였다. 동소 이식 후, 모든 마우스는 3 주 이내에 재현가능하게 병변을 발생시켰고 (도 7c, 오른쪽 패널) 실험을 위한 다양한 처리군 또는 대조군에 무작위로 배정시켰다 (도 7c).
종양 항원 ROR1에 특이적인 106 개의 생체 외에서 형질도입된 CAR+ T 세포를 종양-보유 마우스에 전신 주사하는 것의 치료적 효능을 측정하였다. 항-ROR1 CAR-T 세포가 종양 클리어런스를 달성하지 못했지만, 처리된 마우스는 두 배 초과의 생존율을 나타냈다 (비 처리 대조군에서 69 일 대 32 일; 도 7d, 7f).
마우스에 항-ROR1 CAR 트랜스진-로딩된 나노입자를 매주 전신 주사하였다 (도 7e). 나노입자-유도된 CAR 프로그래밍은 처리되지 않은 대조군과 비교하여 평균 40 일까지 생존을 연장시켰으며, 이는 통상적인 입양 T-세포 요법으로 달성된 생존 이익과 유사하다 (△ 평균 생존 = 3 d, N.s., P = 0.23; 도 7d, 7f). 이는 나노담체의 생체 내 투여가 대상체에 투여하기 전에 적어도 생체 외에서 나노담체로 형질도입된 T 세포의 투여만큼 큰 치료적 효과를 달성한다는 것을 입증하였다.
재발성 전립선 종양의 항원 프로파일은 유세포 분석에 의해 표현형화되었다. 암에서 볼 수 있는 가장 일반적인 탈출 전략 중 하나는 CAR이 생성하는 선택적 압력으로 인한 표적 항원 발현의 감소이다. 이 현상은 비균질 종양 (예컨대, 전이성 전립선암)을 치료하기 위해 단일 항원에만 특이적인 입양-이동된 T 세포를 사용하는 경우 전임상 및 임상 연구 둘 다에서 실패의 원인으로서 보고되었다. 다양한 수준에서 ROR1 종양 항원을 발현하는 처리되지 않은 LNCaP C42 전립선 종양과 직접 비교하여, 처리군 (입양 이동된 T 세포 또는 나노입자-프로그래밍된 T 세포) 둘 다의 CAR-표적화된 종양은 결국 ROR1 저/음성 면역-탈출 변이체를 개발하였다 (도 7g).
재료 & 방법.
PBAE 447 합성.
이 중합체를 Mangraviti 등 (ACS Nano 9, 1236-1249, 2015)에 의해 기재된 것과 유사한 방법을 사용하여 합성하였다. 1,4-부탄디올 디아크릴레이트는 디아크릴레이트 대 아민 단량체의 1.1:1 몰비로 4-아미노-1-부탄올과 조합하였다. 혼합물을 24 h 동안 교반하면서 90 ℃로 가열하여 아크릴레이트-말단 폴리(4-아미노-1-부탄올-코-1,4-부탄디올 디아크릴레이트)를 생산하였다. 이 중합체의 2.3 g을 테트라하이드로푸란 (THF)의 2 ml에 용해시켰다. 피페라진-캡핑된 447 중합체를 형성하기 위해, 13 ml의 THF 중의 용해된 1-(3-아미노프로필)-4-메틸피페라진의 786 mg을 중합체/THF 용액에 첨가하였다. 생성된 혼합물을 실온에서 2 시간 동안 교반한 다음, 캡핑된 중합체를 5 부피의 디에틸 에테르로 침전시켰다. 용매를 디캔팅한 후, 중합체를 2 부피의 신선한 에테르로 세척한 다음, 잔류물을 사용하기 전에 2 일 동안 진공 하에서 건조시켜, DMSO 중의 100 mg/ml의 스톡을 형성하고, 이를 -20 ℃에서 보관하였다.
PGA-항체 컨쥬게이션.
(Alamanda Polymers로부터의) 15 kD의 폴리-글루탐산을 물에 용해시켜 20 mg/ml를 형성하고 10 분 동안 초음파처리하였다. 4 mg/ml의 동등한 부피의 물 중의 1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필) 카보디이미드 하이드로클로라이드 (Thermo Fisher)를 첨가하고, 용액을 실온에서 5 분 동안 혼합하였다. 이어서, 생성된 활성화된 PGA를 포스페이트 완충된 식염수 (PBS)에서 4:1의 몰비로 항체와 조합하고 실온에서 6 시간 동안 혼합하였다. 연결되지 않은 PGA를 제거하기 위해, 용액을 50,000 NMWCO 막 (Millipore)을 가로질러 PBS와 3 회 교환하였다. 항체 농도는 NanoDrop 2000 분광광도계 (Thermo Scientific)를 사용하여 결정되었다. 항-CD8 (클론 OKT8) 항체를 T 세포 실험에 사용하였다. 클론 C1.18.4를 대조군 항체로서 사용하였다.
mRNA 합성.
항-인간 1928z CAR, 항-ROR1 (4-1BBz) CAR 및 HBV-특이적 TCR (HB코어18-27 TCR)을 코딩하는 코돈-최적화된 mRNA를 사용하였다. 코돈-최적화된 DNA 서열은 도 8에 제공된다. 모든 작제물은 Trilink Biotechnologies에서 주문하였으며, 다음과 같은 변형이 있다: 슈도-U 및 5-메틸-C의 완전한 치환을 갖는; ARCA 캡핑된 (Cap0); 폴리아데닐화된 (120A); Dnase 및 포스파타제 처리; 실리카 막 정제; 1 mM 소듐 시트레이트, pH 6.4의 용액으로서 패키징된, 변형된 mRNA 전사물.
나노입자 준비.
mRNA 스톡을 멸균된 뉴클레아제가 없는 25 mM 소듐 아세테이트 완충액, pH 5.2 (NaOAc) 중의 100 μg/ml로 희석하였다. DMSO 중의 PBAE-447 중합체를 NaOAc에서 6 mg/ml로 희석하고, 60:1 (w:w) 비율로 mRNA에 첨가하였다. 생성된 혼합물을 중간 속도로 15 초 동안 볼텍싱한 후, 나노입자가 형성될 수 있도록 실온에서 5 분 동안 항온처리하였다. 나노입자에 표적 요소를 첨가하기 위해, PGA-연결된 결합 도메인을 NaOAc에서 250 μg/ml로 희석하고 mRNA에 2.5:1 (w:w) 비율로 첨가하였다. 생성된 혼합물을 중간 속도로 15 초 동안 볼텍싱한 다음, 실온에서 5 분 동안 항온처리하여 PGA-결합 도메인이 나노입자에 결합되도록 하였다.
나노입자를 동결방지제인 D-수크로스 60 mg/ml와 혼합함으로써 동결건조시킨 후, FreeZone 2.5 L 동결 건조 시스템 (Labconco)에서 처리하기 전에 액체 질소에서 급속-동결시켰다. 동결건조된 나노입자를 사용할 때까지 -80℃에서 보관하였다. 적용을 위해, 동결건조된 나노입자를 원래 농도를 복원하기 위해 멸균수의 1 부피에 재-현탁하였다.
세포 분류 및 유세포 분석.
FACSDIVA 소프트웨어를 실행하는 BD LSRFortessa 또는 FacsCanto II 세포 분석기를 사용하여 데이터를 획득하고, BD FACS ARIA-II에서 분류하고, FlowJo v10.1로 분석하였다.
CAR T 세포 사멸 검정.
CAR 표적 세포의 특이적 세포용해를 유세포 분석에 의해 검정하였다. 표적 K562-CD19 세포는 저 (0.4 μM) 카복시플루오레세인 석시니미딜 에스테르로, 대조군 K562는 고 (4.0 μM) 카복시플루오레세인 석시니미딜 에스테르 (CFSE)를 사용하여 37℃에서 15 분 동안 표지하였다. 두 샘플 모두를 혈청을 함유하는 완전 배지에서 세척하고, 1:1의 비율로 혼합한 다음, 표시된 이펙터:표적 비율로 19-41BBζ와 공동-배양하였다. 특이적 세포용해를 평가하기 위해, 각각의 조건을 항-CD8 mAb (BioLegend)로 염색하여, T 세포를 식별하고 7AAD로 사멸 세포를 배제하고, 유세포 분석으로 분석하였다. 특이적 세포 사멸은 대조군 CD19-K562 세포 (고 CFSE)에 대한 생존가능한 CD19+ 표적 세포 (저 CFSE)의 비율을 측정함으로써 평가하였다.
현미경검사.
400 μl의 XFSFM 중의 106 개의 T 세포를 표면 결합을 위해 4℃에서 1 h 동안 3 μg cy5-표지된 eGFP mRNA를 함유하는 항-CD3 표적화된 나노입자로 처리한 다음, 내재화를 위해 37℃에서 2-h 동안 항온처리하였다. 이러한 처리 후, 세포를 차가운 PBS로 3 회 세척하고, 4 ℃에서 30 분 동안 폴리-l-리신 (Sigma)-코팅된 슬라이드에 로딩하였다. 샘플을 2% 파라포름알데히드에 고정하고, ProLong Gold Antifade 시약 (Invitrogen)에 장착하고, Zeiss LSM 780 NLO 레이저 스캐닝 공초점 현미경으로 이미지화하였다.
통계적 분석.
달리 명시되지 않는 한, 그래프는 평균 ± 평균의 표준 오차를 나타낸다. 통계 분석은 Prism 소프트웨어 (Graphpad)로 수행하였다.
실시예 2.
재료 및 방법.
PbAE 합성.
중합체 합성에 사용된 방법은 이전에 설명되었다 (Mangraviti A 등 (2015) ACS Nano 9: 1236-1249). 1,4-부탄디올 디아크릴레이트를 디아크릴레이트 대 아민 단량체의 1:1 몰비로 4-아미노-1-부탄올과 조합하였다. 아크릴레이트-말단 폴리(4-아미노-1-부탄올-코-1,4-부탄디올 디아크릴레이트)를 혼합물을 24 시간 동안 교반하면서 90 ℃로 가열함으로써 형성시켰다. 2.3 g의 이 중합체를 2 mL 테트라하이드로푸란 (THF)에 용해시켰다. 피페라진-캡핑된 447 중합체를 형성하기 위해, THF 13 mL 중의 1-(3-아미노프로필)-4-메틸피페라진 786 mg을 중합체/THF 용액에 첨가하고 실온 (RT)에서 2 시간 동안 교반하였다. 캡핑된 중합체를 5 부피의 디 에틸 에테르로 침전시키고, 2 부피의 신선한 에테르로 세척하고, 진공 하에서 1 일 동안 건조시켰다. 순수 중합체를 디메틸 설폭사이드 (DMSO)에 100 mg/mL의 농도로 용해시키고 -20 ℃에서 보관하였다.
디-만노스에 대한 PGA 컨쥬게이션. α-D-만노피라노실-(1→2)-α-D-만노피라노스 (디-만노스, Omicron Biochemicals Inc.)를 PGA에 컨쥬게이션되기 전에 글리코실아민으로 변형시켰다. 먼저, 디-만노스 (157 mg)를 10.5 mL의 포화 수성 암모늄 카보네이트에 용해시킨 후, RT에서 24 시간 동안 교반하였다. 2 일차에, 반응 용액에서 디-만노스가 침전될 때까지 더 많은 고체 암모늄 카보네이트를 첨가하였다. 혼합물을 TLC로 측정하여 완료될 때까지 교반한 다음, 동결건조시켜 과량의 암모늄 카보네이트를 제거하였다. 휘발성 염의 완전한 제거는 고체를 메탄올에 재-용 해시킴으로써 달성하였다. 이러한 절차는 향후 PGA와의 컨쥬게이션을 위해 아노머릭 탄소에 아민을 생성하였다.
아민화된 디-만노스를 PGA에 컨쥬게이션시키기 위해, 기질을 물에 30 mg m/L로 용해시킨 다음, 10 분 동안 초음파처리하였다. 물 중의 에틸-N'-(3-디메틸아미노프로필) 카보디이미드ㆍHCl (4 mg/mL, 30 equiv.)을 RT에서 4 분 동안 혼합하면서 첨가하였다. 물 중의 N-하이드록시설포석신이미드 (30 mg/mL, 35 equiv.)를 PGA/EDC 용액과 함께 1 분 동안 항온처리하였다. 포스페이트-완충된 식염수 (PBS) 중의 아민화된 디만노스를 생성된 활성화된 PGA와 44:1 몰비로 조합하고 RT에서 6 h 동안 혼합하였다. 24 시간 동안 물에 대한 투석을 통해 초과 시약을 제거하였다.
mRNA 합성.
eGFP, IRF5 및 IKK (TriLink Biotechnologies)에 대한 코돈-최적화된 mRNA를 항-역전사 캡 유사체 3'-O-Me-m7G(5')ppp(5')G (ARCA)로 캡핑하였으며, 변형된 리보뉴클레오티드 슈도우리딘 (Ψ) 및 5-메틸시티딘 (m5C)으로 완전히 치환시켰다.
나노입자 제조.
IRF5 및 IKKβ mRNA를 3:1 (w:w) 비율로 조합하고 25 mM 소듐 아세테이트 (NaOAc) 완충액 (pH=5.2)에서 100 μg/mL로 희석하였다. DMSO 중 폴리(β-아미노 에스테르)-447 (PbAE-447) 중합체 (상기 설명한대로 제조됨)를 또한 NaOAc 완충액에서 100 μg/μL 내지 6 μg/μL로 희석하였다. 나노입자를 형성하기 위해, PbAE-447 중합체를 mRNA에 60:1 (w:w)의 비율로 첨가하고 즉시 15 초 동안 중간 속도로 볼텍싱한 다음, 혼합물을 RT에서 5 분 동안 항온처리하여 PbAE-mRNA 폴리플렉스를 형성하도록 하였다. 다음 단계에서, 100 μg/mL의 NaOAc 완충액 중의 PGA/디-만노스를 폴리플렉스 용액에 첨가하고, 중간 속도로 15 초 동안 볼텍싱하고, 실온에서 5 분 동안 항온처리하였다. 이 과정에서, PGA/디-만노스가 PbAE-mRNA 폴리플렉스의 표면을 코팅하여 최종 NP를 형성한다. 장기간 보관을 위해, D-수크로스 (60 mg/mL)를 동결방지제로서 NP 용액에 첨가하였다. 나노입자를 드라이 아이스에서 급속-동결시킨 다음, 동결건조하였다. 건조된 NP를 사용할 때까지 -20 ℃ 또는 -80 ℃에서 보관하였다. 생체 내 실험을 위해, 동결건조된 NP를 1:20 (w:v) 비율로 물에 재-현탁하였다.
나노입자 크기 분포 및 ζ-전위의 특성화.
NP의 물리화학적 특징 (유체역학적 반경, 다분산도, ζ-전위 및 안정성 포함)은 25 ℃에서 Zetapals 기기 (Brookhaven Instrument Corporation)를 사용하여 특성화되었다. 동적 광 산란을 기반으로 유체역학적 반경 및 다분산도를 측정하기 위해, NP를 25 mM NaOAc (pH=5.2)로 5-배 희석하였다. ζ-전위를 측정하기 위해, NP를 10 mM PBS (pH=7.0)에 10-배 희석하였다. NP의 안정성을 평가하기 위해, 새로 제조된 입자를 10 mM PBS 완충액 (pH=7.4)에 희석하였다. NP의 유체역학적 반경 및 다분산도를 5 시간 동안 10 분마다 측정하였으며, 크기 및 입자 농도는 Nanosite 300 기기 (Malvern)를 사용한 입자 추적 분석으로부터 도출하였다. 투과 전자 현미경을 사용하여 NP를 특성화하기 위해, 이전에 설명한 프로토콜을 따랐다 (Smith TT 등 (2017) Nat Nanotechnol 12: 813-820). 새로 제조된 NP (0.83 μg의 mRNA를 함유하는 25 μL)를 글로우 방전-처리된 200 메쉬 탄소/Formvar-코팅된 구리 그리드에 증착시켰다. 30 초 후, 그리드를 50% 카르노브스키의 고정제, 0.1 M 카코딜레이트 완충액, dH2O, 이후에 1% (w/v) 우라닐 아세테이트로 순차적으로 처리하였다. 샘플을 120kV에서 작동하는 JEOL JEM-1400 투과 전자 현미경 (JEOL USA)으로 이미지화시켰다.
골수 유래된 대식세포 (BMDM) 및 기타 세포주. BMDM을 제조하기 위해, 확립된 프로토콜에 따라 마우스 대퇴골로부터 골수 전구 세포를 수확하였다 (Zhang X 등 (2008) Curr Protoc Immunol Chapter 14: Unit 14 11). 이들 세포를 0.5 - 1.0 e6/ml의 씨딩 밀도로 완전 배지 [4.5 g/L D-글루코스, L-글루타민, 10% 열-불활성화된 소 태아 혈청 (FBS), 100 U/mL 페니실린 및 100 μg/mL, Glutamax 50 mL/500 mL로 보충된, 20 ng/mL M-CSF (Peprotech, cat#315-02)로 보충된 DMEM]에서 배양하였다. 세포를 37℃에서 5% CO2 하에서 7 일 동안 생체 외에서 BMDM으로 분화시켰다. 다음으로, 이들은 대식세포-컨디셔닝된 배지 [20 ng/mL MPLA (Sigma, cat#L6895) 또는 20 ng/mL IL4 (eBioscience, cat# 34-8041)가 보충된 대식세포 완전 배지)]로 컨디셔닝되었다. BMDM은 생체 외에서 7-21 일 사이에 사용하였다. 캐서린 로비 박사 (University of Kansas Medical Center, Kansas City, KS)로부터의 선물인 뮤린 난소암 세포주 ID8을 10% FBS, 100 U/mL 페니실린, 5 μg/mL 인슐린, 5 μg/mL 트랜스페린 및 5 ng/mL 소듐 셀레나이트 (모두 Sigma-Aldrich)가 보충된 DMEM에서 배양하였다. 보다 공격적인 혈관 내피 성장 인자 (VEGF)-발현 ID8 균주를 생성하기 위해, ID8 종양 세포를 블라스티시딘-내성 유전자와 함께 뮤린 VEGF를 코딩하는 pUNO1 플라스미드 (Invivogen)로 형질주입시켰다. 안정한 형질주입체를 수득하기 위해, 종양 세포를 10 μg/mL 블라스티시딘 (Invivogen)을 함유하는 완전 배지에서 3 주 동안 배양하였다. B16F10 흑색종 세포주 (American Type Culture Collection)를 10% FBS, 100 U/mL 페니실린, 2 mM/L-글루타민, 1.5 g/L 소듐 바이카보네이트, 4.5 g/L 글루코스, 10 mM HEPES, 1.0 mM 소듐 피루베이트 및 0.05 mM 2-머캅토에탄올이 포함된 완전한 RPMI 1640 배지에서 배양하였다. 생체 내 생체발광 이미징을 위해, ID8-VEGF 및 B16F10 세포주 둘 모두를 반딧불이 루시퍼라제로 레트로바이러스에 의해 형질도입시켰다. RACS-PDGFβ 또는 RCAS-cre 레트로바이러스를 운반하는 DF-1 세포주를 39℃에서 5% CO2 하에서 10% FBS 및 100 U/mL 페니실린이 보충된 완전 배지에서 배양하였다.
BMDM의 mRNA 형질주입.
형질주입 하루 전, BMDM을 250,000개/웰의 농도로 대식세포 완전 배지에서 24-웰 플레이트에 재씨딩하였다. 형질주입 전에, 완전 배지를 보충되지 않은 300 μL DMEM으로 교체하였다. 이들 세포를 형질주입시키기 위해, 2 μg의 mRNA를 함유하는 NP를 염기 배지에 첨가하고 37 ℃에서 BMDM과 공동-배양하였다. 1 시간 후, NP를 함유하는 배지를 제거하고, 추가 24 시간 동안 세포를 배양한 후, 형질주입 효율 및 세포 생존가능성을 평가하였다.
대식세포 시그니처 유전자 분석을 위한 BMDM의 형질주입. BMDM은 형질주입 24 시간 전에 컨디셔닝된 배지 중의 24-웰 플레이트에 재씨딩하여, 세포를 이들의 표현형으로 형질전환할 수 있도록 하였다. 이어서, M2-유사 대식세포를 리포터로서 25% eGFP mRNA를 운반하는 IRF5/IKKβ NP 또는 상기 설명한 형질주입 프로토콜에 따라 2 μg의 mRNA를 함유하는 eGFP NP (대조군)에 노출하였다. 24 시간 후, 고도로 형질주입된 BMDM의 상위 10% 백분율 (eGFP 발현에 의해 측정됨)은 형질주입 24 시간 후에 분류시켰고, RNA 단리 전 추가 48 시간 동안 저-용량 (10 ng/mL) IL4 배지에서 재-검문하였다. 이들 세포로부터 추출된 RNA를 표준 M1- 또는 M2-유사 대식세포의 RNA와 비교하여 IRF5-NP 처리와 연관된 시그니처 유전자를 식별할 수 있었다.
RNA 단리 및 제조. RNA를 수확하기 위해, BMDM을 Trizol 시약 (Ambion)에 용해하고, 제조업체의 지침에 따라 RNeasy® Plus Universal Mini-Kits (QIAGEN)를 사용하여 총 RNA를 추출 및 정제하였다. NanoDrop Microvolume Spectrophotometer (Thermo Fisher)를 사용하여 샘플 RNA를 정량화한 다음, Agilent 4200 TapeStation 분석기 (Agilent)를 사용하여 FHCRC Genomics Shared Resource에 의해 품질 관리를 수행하였다.
NanoString 기술에 의한 대식세포 시그니처 유전자 분석.
자극된 BMDM 배양물로부터의 유전자 발현 값은 19 개의 상이한 경로에서 발생하는 770 개의 유전자를 분석하고 7 개의 상이한 골수성 세포 유형에 걸쳐 이들을 처리하는 nCounter® 골수성 선천 면역 패널 (NanoString Technologies, Seattle, WA)을 사용하여 측정하였다. 샘플을 nCounter 분석 시스템 (NanoString Technologies, Seattle, WA)을 사용하여 테스트되었다. R/Bioconductor NanoStringQCPro 소프트웨어 패키지 (Nickles D, Sandmann T, Ziman R and Bourgon R (2018) NanoStringQCPro: NanoString mRNA 유전자 발현 데이터에 대한 품질 메트릭스 및 데이터 처리 방법. R 패키지 버전 1.10.0.)를 사용하여 원 데이터를 처리하고 품질을 확인하였다. 발현 값을 하우스키핑 유전자의 기하학적 평균으로 정규화시키고 nSolver 4.0 소프트웨어 (NanoString Technologies, Seattle, WA)를 사용하여 log2-형질전환하였다. 비율 데이터에 대한 허위 발견 비율은 Benjamini-Yekutieli 방법을 사용하여 t-테스트에 의해 생긴 p-값으로부터 계산하였다.
유세포 분석 및 세포 분류.
비장, 혈액, 복막 세정 및 기관지폐포 세정으로부터 얻은 세포를 도 8에 열거된 항-마우스 항체 프로브를 사용하여 골수 및 림프성 면역표현형 패널을 사용한 유세포 분석에 의해 분석하였다. FACSDIVA 소프트웨어 (Beckton Dickinson)를 실행하는 BD LSRFortessa 분석기를 사용하여 데이터를 수집하였다. CD11b+ 및 F4/80+ 복막 대식세포를 BD FACS ARIA II를 사용하여 분류하였다. 수집된 모든 데이터를 FlowJo 10.0 소프트웨어를 사용하여 분석하였다.
사이토카인 분석.
FHCRC 면역 모니터링 공유 자원 센터에서 Luminex 200 시스템 (Luminex)을 사용하여 사이토카인 수준을 평가하였다. 생체 외 연구를 위해, IL-6, IL-12p70, INFγ 및 TNFα 농도 측정을 위해 세포 배양 상청액을 수집하였다. 생체 내 연구를 위해, GM-CSF, INFγ, IL-12p70, IL-2, IL-6 및 TNFα의 혈장 농도를 측정하였다.
qRT-PCR 분석.
유전자 발현 수준을 qRT-PCR에 의해 결정하였다. 선택된 대식세포 시그니처 유전자 (SerpinB2, Retnla, Ccl5, Ccl11, 코돈-최적화된 IRF5, 내인성 IRF5 및 하우스키핑 GAPD 유전자 포함)를 측정하기 위해, 제조업체의 지침에 따라 총 RNA를 RNeasy 미니-컬럼 (Qiagen)으로 단리시켰다. cDNA를 qScript cDNA 합성 키트 (Quanta)를 사용하여 합성하였다. 각각의 샘플에 대해, qRT-PCR을 Roche의 Universal Probe Library (UPL)로부터의 유전자-특이적 프로브 및 ProbeFinder (Roche)에 의해 최적화된 PCR 프라이머를 사용하여 PerfeCTa qPCR SuperMix Low ROX (Quanta)를 통해 3 회 반복 수행하였다: SerpinB2, UPL -049, F-ACTGGGGCAGTTATGACAGG (서열번호 103), R-GATGATCGGCCACAAACTG (서열번호 104); Retnla, UPL-078, F-TTGTTCCCTTCTCATCTGCAT (서열번호 105), R-CCTTGACCTTATTCTCCACGA (서열번호 106); Ccl5, UPL-105, F-CCTACTCCCACTCGGTCCT (서열번호 107), R-CTGATTTCTTGGGTTTGCTGT (서열번호 108); Ccl11, UPL-018, F-AGAGCTCCACAGCGCTTC (서열번호 109), R-CAGCACCTGGGAGGTGAA (서열번호 110); 코돈-최적화된 IRF5, UPL- 022, F-TCTTAAAGACCACATGGTAGAACAGT (서열번호 111), R-AGCTGCTGTTGGGATTGC (서열번호 112); 내인성 IRF5, UPL-011, F-GCTGTGCCCTTAACAAAAGC (서열번호 113), R-GGCTGAGGTGGCATGTCT (서열번호 114). 시그너처 유전자 mRNA 수준을 GAPD, UPL-060, F-AGCCACATCGCTCAGACAC (서열번호 115) 및 R-GCCCAATACGACCAAATCC (서열번호 116)의 증폭에 기반하여 정규화하였다. 모든 qRT-PCR 반응을 QuantStudio6 소프트웨어 (Applied Biosystems)를 실행하는 Quant Studio5 RT-PCR 기계를 사용하여 수행하였다. 증폭 플롯이 역치를 넘지 않고 Ct 값이 수득되지 않은 ("결정되지 않은") 경우, 검정에서 가장 높은 주기 수 (40 주기)와 동등한 Ct 값을 상대 발현 비교에 사용하였다.
마우스 및 생체 내 종양 모델.
뇌종양 모델-관련된 실험을 제외하고, 이들 실험에 사용된 마우스는 Jackson Laboratory로부터 수득하였고; 나머지는 FHCRC 동물 시설에서 사육 및 수용하였다. 모든 마우스를 센터의 기관 동물 관리 및 사용위원회에서 승인한 프로토콜의 내용 하에서 사용하였다. 난소 종양을 모델링하기 위해, 5x106 개의 혈관 상피 성장 인자 (VEGFP)-발현 ID8 세포를 4- 내지 6-주령 암컷 알비노 B6 (C57BL/6J-Tyr<c-2J>) 마우스에 복막 내 (ip)로 주사하고, 2 주 동안 확립하도록 허용하였다. 생존 연구를 위해, 동물을 50 μg mRNA를 운반하는 IRF5 NP/eGFP NP로 (9 주 동안 또는 건강 병태가 안락사 요건에 도달할 때까지 주 당 2 회 용량으로) i.p. 처리하였다. 메카니즘 연구를 위해, 1, 2 또는 3 주 동안의 처리를 사용하고 마지막 용량 후 48 시간에 안락사를 하였다. 복막 세포를 수집하기 위해 복막 세정을 수행하였다. IRF5/IKKβ NP와 현상 유지 대식세포 표적화 요법의 효능을 비교하기 위해, 하나의 마우스 군은 주당 2 회 용량으로 3 주 동안 50 μg mRNA를 운반하는 IRF5/IKKβ NP로 처리하였고; 제2 군은 3 주 동안 매일 비히클 (폴리에틸렌 글리콜 400 중의 5% 1-메틸 -2-피롤리디논)에 제형화된 15 mg/kg PI3Kγ 억제제 IPI-594 (MedKoo Biosciences Inc)의 경구 섭식하였고; 제3 군은 3 주 동안 매일 동일한 비히클에 제형화된 30 mg/kg CSF1R 억제제 펙시다티닙 (PLX3397, MedKoo Biosciences Inc)의 i.p. 주사하였다.
전이성 폐암을 모델링하기 위해, F-luc로 형질도입되고 200 μL RPMI 배지에 현탁된 2.5x104 개의 16F10 세포를 4- 내지 6-주령 암컷 알비노 B6 (C57BL/6J-Tyr<c- 2J>) 마우스 (Jackson Laboratories)에 주사하고, 1 주일 동안 확립하도록 허용하였다. 생존 연구를 위해, 마우스에 PBS에 현탁된 30 μg mRNA를 운반하는 IRF5/IKKβ NP 또는 eGFP NP를 포함하여 (또는 포함하지 않고) 안와 후로 처리하였다. 마우스를 3 주 동안 또는 건강 병태가 안락사 요건에 도달할 때까지 3 회 용량/주로 처리하였다. 메커니즘 연구를 위해, 마우스에 2 주 동안 동일한 처리를 하였다. 분석을 위한 폐포 세포를 수집하기 위해 기관지폐포 세정을 수행하였다.
공개된 프로토콜 (Uhrbom L 등 (2004) Nat Med 10: 1257-1260)에 따라 신경교종을 갖는 마우스를 생성하였다. RCAS-PDGFβ 및 RCAS-cre 레트로바이러스를 생산하는 조류 DF-1 세포를 4-6 주령 사이의 Nestin-tv-a/Ink4a-arf-/-; Pten-/- 마우스 (C57BL/6)의 두 뇌 반구 (좌표: 브레그마에서 꼬리 쪽 1 mm, 측면 2 mm, 경막 표면에서 2 mm 깊이)에 두개 내 주사하였다. 2 주 동안 종양이 확립되도록 하였다. 15 일차에, 마우스는 하나의 반구에 10Gy 방사선을 받는 동안, 조사되지 않은 반구는 납으로 차폐하였다. 다음날, 마우스는 30 μg mRNA를 운반하는 IRF5/IKKβ NP의 안와 후 주사 (3 주 동안 3 회 용량/주)를 받거나 PBS 대조군에 배정되었다.
생체 내 생체발광 이미징.
PBS 중의 D-루시페린 (Xenogen) (15 mg/mL)을 반딧불이 루시퍼라제 이미징을 위한 기질로서 사용하였다. 생체발광 이미지를 Xenogen IVIS 스펙트럼 이미징 시스템 (Xenogen)으로 수집하였다. 마우스를 이미징 전 및 도중에 2% 이소플루란 (Forane, Baxter Healthcare)으로 마취하였다. ID8-VEGF 난소 종양의 경우, 각각의 마우스에 300 μg의 D-루시페린으로 i.p. 주사하고, 10 분 후에 이미지를 수집하였다. B16F10 폐 전이성 종양의 경우, 마우스에 3 mg의 D-루시페린을 i.p. 주사하고, 15 분 후에 이미지를 수집하였다. 뇌종양 모델의 경우, 마우스는 75 mg/kg 체중의 D-루시페린의 안와 후 주사를 받았으며, 4 분 후에 이미지를 수집하였다. 획득 시간은 10 s 내지 5 분이었다.
생체분포 분석.
ID8-VEGF 난소 종양 모델에서 IRF5 NP의 생체분포를 결정하기 위해, 7-8 개의 마우스 군은 50 μg mRNA를 운반하는 NP의 i.p. 용량 또는 안와 후 용량을 받았다. 주사 24 시간 후, 전혈을 수집하고, 마우스를 CO2로 안락사시켜 장기 (간, 비장, 폐, 신장, 심장, 장, 췌장 및 횡격막)를 회수하였다. 모든 조직을 RNAlater로 안정화시킨 다음, 드라이 아이스에서 냉동시켰다. 각각의 기관에서 코돈-최적화된 IRF5 mRNA 수준을 RT-qPCR을 사용하여 측정하였다.
독성 분석.
대식세포-표적화 NP를 반복적으로 주입하는 잠재적인 생체 내 독성을 측정하기 위해, 마우스에 3 주 동안에 걸쳐 50 μg mRNA를 운반하는 IRF5/IKKβ NP 또는 eGFP NP의 6 개의 연속 용량을 정맥 주사 (5 회/군)하였다. 대조군은 처리를 받지 않았다. 최종 주입 24 시간 후, 마우스를 마취하고 안와 후 출혈로 혈액을 수집하여 완전 혈구 계수를 결정하였다. 혈청 화학 및 사이토카인 프로파일 분석을 위해 혈액을 또한 수집하였다 (Phoenix Central Laboratories, Mukilteo, WA에서 수행함). 이후, 동물을 CO2로 안락사시켜 기관을 회수하고, 이를 탈이온수로 세척한 후 4% 파라포름알데히드에 고정시켰다. 조직을 일상적으로 처리하였고, 절편을 헤마톡실린 및 에오신으로 염색하였다. 표본을 위원회-인증 직원 병리학자에 의해 맹목적인 방식으로 해석하였다.
사이토카인 검정.
FHCRC 면역 모니터링 공유 자원에서 Luminex 200 시스템 (Luminex)을 사용하여 사이토카인 수준을 평가하였다. 생체 외 연구를 위해, IL-6, IL12p70, INFγ 및 TNFα 농도 측정을 위해 세포 배양 상청액을 수집하였다. 생체 내 연구를 위해, GM-CSF, INFγ, IL-12p70, IL-2, IL-6 및 TNFα의 혈장 농도를 측정하였다.
통계적 분석.
관찰된 상이함의 통계적 유의성은 독립적 양측 일원분산분석 테스트를 사용하여 분석하였다. 각각의 측정에 대한 P 값은 도면 또는 도면 범례에 나열되어 있다. 생존 데이터는 로그-순위 테스트를 사용하여 특성화된다. 모든 통계적 분석은 GraphPad Prism 소프트웨어 버전 6.0 또는 R 소프트웨어를 사용하여 수행하였다.
결과.
TAM의 IVT mRNA 형질주입을 연출하기 위한 NP 설계. 양이온성 PBAE 중합체 및 음이온성 mRNA 사이의 정전기적 상호작용을 이용함으로써 표적화된 세포에 강력한 유전자 발현을 도입할 수 있는 표적화된 mRNA 전달 시스템을 개발하였다 (도 9a). 생성된 나노담체에 캡슐화된 mRNA의 안정성 및 번역을 개선하기 위해, 변형된 리보뉴클레오티드 슈도우리딘 (Ψ) (Kariko K 등 (2008) Mol Ther 16: 1833-1840) 및 5-메틸시티딘 (m5C)을 혼입하고, ARCA (항-역전사 캡 유사체) (Quabius ES 등 (2015) N Biotechnol 32: 229-235)로 캡핑된 메시지의 합성 버전을 사용하였다. mRNA는 PbAE 백본에서 에스테르 결합의 가수분해성 절단에 의해 세포 내에서 mRNA-PbAE 복합체로부터 방출되었다. 효율적인 생체 내 T 세포 형질주입은 이전에 이 시스템을 사용하여 입증되었다 (Smith TT 등 (2017) Nat Nanotechnol). 나노입자를 TAM으로 표적화하고 이들이 함유하는 mRNA-PbAE 복합체를 추가로 안정화시키기 위해, 링커로서 PGA를 사용하여 디-만노스 모이어티를 표면에 조작하였다 (도 9a). NP는 단순한 2-단계인 전하 구동 자가-조립 공정을 이용하여 제조하였다. 첫째, 합성 mRNA는 양으로 하전된 PBAE 중합체와 복합체를 형성하여, mRNA를 나노-크기의 복합체로 응축시켰다. 이 단계 이후에 PBAE-mRNA 입자의 양전하를 차폐하고 대식세포-표적화를 부여하는 디-만노스로 기능화된 PGA를 첨가를 수행하였다. 생성된 mRNA 나노담체는 99.8 ± 24.5 nm의 크기, 0.183의 다분산도 및 중성 표면 전하 (3.40 ± 2.15 mV ζ-전위, 도 9b, 9c)를 가졌다. 형질주입 효율을 녹색 형광 단백질-코딩 mRNA로 제형화된 NP (GFP-NP)를 사용하여 뮤린 골수-유래된 대식세포 (BMDM)에서 처음 테스트하였다. 간략히 말해, 50,000 개의 BMDM을 1 μg mRNA를 함유하는 NP에 1 시간 동안 노출시킨 후, 다음날 GFP 발현의 유세포 분석 측정을 수행하였다. 단일 NP 적용 후, 이들 일차 대식세포의 31.9% (± 8.5%)는 생존가능성을 감소시키지 않고 일상적으로 형질주입되었다 (도 9e, 9f). 디-만노스를 사용한 입자의 표면 변형은 관련성이 있었는데, 이 고유한 식세포의 세포 유형에서 표적화되지 않은 (그러나 PGA-코팅된) 나노담체를 사용한 형질주입 속도가 평균 25% (± 2.1%)로 떨어졌기 때문이다. NP는 CD11b+, F4/80+ 대식세포 집단을 선택적으로 표적화하였으며, 대식세포의 46%가 형질주입되고 높은 수준의 eGFP를 발현하였다 (도 9d). 이러한 높은 형질주입 효율은 TAM에 대한 mRNA의 표적화된 전달에서 개시된 시스템 및 방법의 효능을 입증한다. 대식세포 분극화를 유도하는 전사 인자 후보에 대한 시험관 내 스크리닝 결과를 기반으로, 다음의 2 개의 mRNA가 NP에 포함되도록 선택되었다: 제1 mRNA는 M1 표현형에 대한 대식세포의 분극화를 선호하는 IRF 패밀리의 핵심 구성원인 IRF5를 코딩하고, 제2 mRNA는 IRF5를 인산화하고 활성화하는 키나제인 IKKβ를 코딩한다.
면역억압성 대식세포를 전염증성 표현형으로 프로그래밍.
대식세포 분극화를 유도하기 위해, 다음의 2 개의 mRNA가 NP에 포함되도록 선택되었다: 첫번째 것은 M1 표현형에 대한 대식세포의 분극화를 선호하는 인터페론 조절 인자 패밀리의 핵심 구성원인 IRF5를 코딩하고 (Krausgruber T 등 (2011) Nat Immunol 12: 231-238); 두번째 것은 IRF5를 인산화하고 활성화하는 키나제인 IKKβ를 코딩한다 (Ren J 등 (2014) Proc Natl Acad Sci U S A 111: 17438-17443). 3 개의 IRF5 mRNA 대 1 개의 IKKβ mRNA의 비율을 사용하였다. NP-전달된 (및 코돈-최적화된) IRF5 mRNA에 특이적인 실시간 정량 PCR을 사용하여, 대식세포의 mRNA 발현이 1 일차에 최대였으며, 결과적으로 내인성 인자 수준에 비해 IRF5에서 1,500-배 증가를 초래하였다 (도 9a). 예상한 바와 같이, 유전자 발현은 일시적 이었지만 IRF5 수준은 기준선으로 돌아가기 전 3 일 (581-배 증가) 및 5 일 (87-배 증가)까지 강력하게 상향조절되었다.
IRF5/IKKβ-코딩 NP가 M2 대식세포를 치료적으로 원하는 항-암 M1 표현형으로 재프로그래밍할 수 있는지 결정하기 위해, NanoString 유전자 발현 분석을 사용하였다. BMDM을 억압성 M2 표현형을 유도하기 위해 인터루킨-4 (IL-4)의 존재 하에 먼저 배양하였다 (도 9h). 대조군 GFP-mRNA 나노입자 또는 IRF5/IKKβ mRNA-함유 NP를 사용한 형질주입 후, 유전자 발현 프로파일을 분석하고 염증성 대식세포와 비교하였으며, 이는 BMDM을 TLR4 작용제 모노포스포릴 지질 A에 노출시킴으로써 별도로 생성하였다. 억압성 IL-4-함유 배지에서 배양되었음에도 불구하고, IRF5/IKKβ mRNA NP로 형질주입된 대식세포는 염증성 대식세포와 유사한 유전자 발현 프로파일을 나타낸다 (도 9i). 시그니처 M2 대식세포 유전자, 예컨대, Serpinb2 및 Ccl2 (Jablonski K 등 (2015) Plos One 10: e0145342; Varga T 등 (2016) J Immunol 196: 4771-4782)는, 주요 M1 분화 유전자, 예컨대, Ccl5 (Sica A 등 (2012) J Clin Invest 122: 787-795)가 상향조절되는 동안 강하게 하향조절되었다 (도 9j, 9k). 이러한 데이터는 IRF5 및 이의 키나제의 NP-매개된 발현이 억압성 대식세포를 전염증성 표현형으로 왜곡한다는 것을 입증한다.
실시예 3.
파종된 난소암에 대한 NP-전달된 전-M1 유전자의 치료적 효과.
임상적으로-관련된 생체 내 테스트 시스템에서 이러한 치료 접근법을 평가하기 위해, C57BL/6 마우스에서 후기-단계의 절제불가능한 난소 종양을 재현하는 모델을 사용하였다; 이들 동물에 종양 성장의 연속적인 생체발광 이미징를 가능하게 하기 위해 루시퍼라제로 태깅된 ID8 난소암 세포를 주사한다 (Liao JB 등 (2015) J Immunother Cancer 3: 16; Stephan SB 등 (2015) Nat Biotechnol 33: 97-101). 2 주 동안 종양이 확립되도록 하였다. 이 단계에서, 마우스에 복막 벽과 장 장간막 전체에 걸쳐 결절이 발생하였다. 동물을 9 주 동안 100 μg mRNA/마우스/주의 i.p. 용량으로 PBS (대조군), GFPNP (sham) 또는 IRF5/IKKβ NP 처리를 받은 3 개의 군으로 나누었다 (도 10a). IRF5/IKKβ NP 처리군에서 질환이 퇴행되고 결국 동물의 40%에서 제거된 것으로 관찰되었다 (대조군에서 60 d에 비해 전체 142 d 중앙값 생존; 도 10b, 10c). IRF5/IKKβ NP-매개된 항-종양 효과의 기본 메커니즘을 이해하기 위해, 만노스 수용체-표적화가 식세포에 대한 NP 상호작용을 제한하는 방법을 먼저 조사하였다. 디-만노스로 표적화된 NP의 제1 용량 24 h 후에 수집된 복막 세정액의 유세포 분석은 대식세포 및 단핵구로의 우선적 유전자 전달을 나타냈으며 (각각 평균 37.1% 및 15.3%, 도 10d), 표적-외 세포로의 형질주입은 낮거나 검출할 수 없었다. 3-주 기간에 걸쳐 IRF5/IKKβ 나노입자 또는 PBS로 처리한 (주 2 회 주사) 후 확립된 난소암을 갖는 마우스의 복막에서 대식세포/단핵구 집단에 대한 상세한 표현형 및 기능적 분석을 다음으로 수행하였다. 유세포 분석은 IRF5/IKKβ NP가 면역-억압성 대식세포 (Ly6C-, F4/80+, CD206+) 집단을 평균 대조군의 43% ± 15.6%에 비해 2.6% ± 2.1%로 감소시켰음을 보여주었다 (도 10e, 10f). 반대로, M1-유사 대식세포의 비율은 0.5% ± 0.2%에서 10.2% ± 4.1%로 증가하였다 (도 10e, 10g). IRF5 유전자 요법은 또한 다른 면역 세포의 집단에 영향을 미쳤다. 특히, 염증성 단핵구 (CD11b+, Ly6C+, Ly6G-)가 더 풍부하였다 (처리하지 않은 마우스의 4.5% ± 1.9%에 비해 73.4% ± 3.6%). 모든 IRF5 NP-처리된 동물에서 흥미로운 발견 중 하나는 신생물 내부 또는 주변에 존재하는 림프구의 다초점 밀도가 높은 클러스터였으며 (도 10h), 이는 면역 자극성 대식세포의 유전적 프로그래밍이 림프구 이동 및 고체 종양으로의 침투를 복원할 수 있음을 나타낸다.
복막 대식세포를 형광-활성화된 세포 분류에 의해 단리하여 사이토카인 분비를 분석하고, 전-염증성 (항-종양) 사이토카인 IL-12 (3.4-배 더 높음), IFN-g (8.4-배 더 높음), 및 TNF-α (1.5-배 더 높음)의 방출에서 강력한 증가를 검출하였으며, 반면에 대안적으로 활성화된 (M2-유사) 대식세포로의 분화와 연관된 조절 사이토카인인 IL-6의 수준은 97-배 감소하였다; 도 10i). 게놈 발현 프로파일링은 IRF5/IKKβ 나노입자-처리된 마우스에서 M1-유사 대식세포 표현형에 대한 분화를 확인하였다. MPLA 또는 IL-4에서 생체 외 배양된 대식세포의 유전자 발현 수준을 포함하여 각각 고전적인 M1-유사 또는 M2-유사 대식세포에 대한 참조 값을 제공하였다 (도 10j).
생체분포 및 안전성.
다음으로 나노입자-전달된 (코돈 최적화된) IRF5만을 검출하도록 설계된 RT-qPCR 검정을 사용하여 복막 내 주사 24 h 후 다양한 기관에서의 나노입자 분포를 정량화하였다. 가장 높은 농도의 IVT mRNA는 간, 비장, 장, 췌장 및 횡경막을 포함하여 복막에 위치한 기관에서 발견되었다 (도 11a). 복막 외부에 있는 기관 (심장, 폐, 신장)에서 소량의 입자-전달된 mRNA가 검출되었는데, 이는 i.p. 주사된 나노담체의 분획이 전신 순환으로 들어갔음을 시사한다. 분포 데이터에 따라, 다음으로 이러한 나노시약이 생체적합성이고 반복된 투여에 안전한지 여부를 평가하였다. 총 8 회 용량의 IRF5/IKKβ NP를 마우스에 주사하였다 (4 주 동안 2 회의 50 μg mRNA 용량/주, 도 11b). 이들은 최종 용량 24 h 후 안락사되었고, 체중을 기록하고, 혈청 화학을 위해 안와 후 출혈로 혈액을 수집하고, 완전한 전체 부검(gross necropsy)을 수행하였다. 군들 간에 체중 상이함은 없었다. 다음 조직은 위원회 인증 직원 병리학자에 의해 평가되었다: 간, 비장, 장간막, 췌장, 위, 신장, 심장 및 폐. 조직병리학적 평가는 모든 경우에서 종양 병변 내의 또는 주변의 림프구의 다초점 밀도가 높은 클러스터에서 밝혀졌지만, 신생 세포가 존재하지 않는 조직에서는 염증 또는 노골적인 괴사의 증거가 관찰되지 않았다 (도 11c). 또한, IRF5/IKKβ NP-처리된 마우스의 혈청 화학은 PBS 대조군의 것과 필적할 만하여, 전신 독성이 발생하지 않았음을 나타낸다 (도 11d). 소량의 IRF5-mRNA가 생체분포 연구에서 전신적으로 검출되었기 때문에, 말초 혈액에서 염증성 사이토카인을 정량화하기 위한 병행 실험을 설계하였다. 단일 IRF5/IKKβ NP의 i.p. 주사 이후, 중등도 및 일시적인 증가가 인터루킨-6 (IL-6)의 혈청 수준에서 평균 26.8 pg/mL (도 11e) 및 종양 괴사 인자-a (TNF-a)에서 평균 94.7 pg/mL (도 11f)로 측정되었다. 이전 보고서에 기반하여, 이러한 수준은 병리학적 발견과 연관된 수준보다 500-배 낮으므로 안전한 것으로 간주될 수 있다 (Tarrant J.M. (2010) Toxicol Sci 117: 4-16; Copeland S 등 (2005) Clin Diagn Lab Immunol 12: 60-67).
IRF5/IKKβ 나노입자의 정맥 내 주입으로 전신 종양 전이 제어.
복막 전체에 퍼진 종양 병변을 치료하기 위해 복강에 직접 투여된 IRF5/IKKβ NP로 달성된 치료적 반응에 기반하여, 다음 질문은 정맥 내 주입된 mRNA 나노담체가 파종된 질환을 제어하기 위해 전신적으로 대식세포를 프로그래밍할 수 있는지 여부였다. RT-qPCR 생체분포 연구는 i.v.-주입된 나노담체가 높은 수준의 상주하는 대식세포/식세포를 가진 기관, 주로 비장, 간 및 폐에 mRNA 카고를 우선적으로 전달하는 것으로 나타났다 (도 12a). 임상적으로 관련된 생체 내 테스트 시스템에서 항-종양 반응을 측정하기 위해, IRF5/ IKKβ mRNA를 함유하는 입자를 파종된 폐 흑색종 전이가 있는 마우스에 투여하였다 (도 12b). 최근 연구는 이 질환으로 인한 전이를 확립하는 데 있어 단핵구 및 대식세포의 기본 역할을 설명하며 (Butler KL 등 (2017) Sci Rep 7: 45593; Nielsen SR 등 (2017) Mediators Inflamm 2017: 9624760), 이는 공초점 현미경으로 종양 생착이 폐의 식세포 축적과 대등하다는 것을 확인하였다 (도 12c). 종양 부담은 생체발광 이미징에 의해 결정되었고, 검출가능한 암을 가진 마우스는 매칭하는 수준을 갖는 군으로 분류되었다. 그런 다음, 군을, 요법을 받지 않거나 (PBS), GFP- 또는 IRF5/IKKβ-캡슐화 나노입자를 정맥 주사하는 처리 조건에 무작위로 할당하였다. IRF/IKKβ 나노입자 요법만이 폐의 종양 부담을 실질적으로 감소시켰다; 실제로, 이들은 전체 생존을 평균 1.3-배로 개선시켰다 (도 12d, 12e). 병행 실험에서, 마우스를 종양 접종 22 일 후에 희생시켜, 폐 전이 계수로 생체발광 종양 신호를 검증하고 유세포 분석에 의해 대식세포 분극화를 평가하였다. IRF5/IKK NP-처리된 동물의 폐에서 전이의 총 수는 PBS 대조군 (평균 419 ± 139 개의 전이; 도 12f, 12g)에 비해 8.7-배 감소 (평균 40 ± 16 개의 전이)되었다. 기관지폐포 세정액 세포의 유세포 분석은 면역-억압성 (CD206+, MHCII-, CD11c+, CD11blow) 대식세포에서 활성화된 (CD206-, MHCII+, CD11c-, CD11b+) 식세포로의 강한 전환을 나타냈다 (도 12h, 12i).
신경교종을 치료하기 위한 종양-억압성 식세포 프로그래밍.
제3 생체 내 테스트 시스템의 경우 신경교종을 조사하였으며, 이는 M2-유사 대식세포가 대부분의 비-신생 세포를 나타내고 종양 성장 및 침습을 촉진하는 암 유형의 관리가 어렵다 (Hambardzumyan D 등 (2016) Nat Neurosci 19: 20-27). 현재, 이 질환에 대한 표준 케어는 방사선요법이며, 불행히도 일시적인 안정화 또는 증상 감소만을 제공하고 중앙값 생존 기간을 3 개월 연장한다 (Mann J 등 (2017) Front Neurol 8: 748). 유전적 사건 및 그에 따른 질환의 분자 진화를 재현하기 위해, PDGFβ-구동된 신경교종의 RCAS-PDGF-B/Nestin-Tv-a; Ink4a/Arf-/-; Pten-/- 트랜스제닉 마우스 모델 (PDG 마우스 (Hambardzumyan D 등 (2009) Transl Oncol 2: 89-95; Quail DF 등 (2016) Science 352: aad3018))를 사용하였다. RCAS-PDGFβ 또는 RCAS-cre 레트로바이러스 (1:1 혼합물, 2 μL)로 형질주입된 DF-1 세포의 혼합물을 뇌 조직에 정위 주사하였다. PDGFβ 종양유전자의 과발현 및 신경교종 전구체에서 종양 억압 유전자 Ink4a-arf 및 Pten의 부재로 인해 (이전에 (Hambardzumyan D 등 (2009) Transl Oncol 2: 89-95)에 확립된 바와 같이) 21 일 이내에 거의 완전한 침투를 갖는 4-5 mm 직경의 종양이 형성되었다 (도 13a). 면역형광법을 사용하여, 확립된 신경교종 (도 13b, 왼쪽에서 두 번째 패널에 도시됨)에서 종양-침윤 (CD68+) 대식세포 (왼쪽에서 세 번째 패널에 표시됨)의 존재를 확인하였다. 유세포 분석은 F4/80+, CD11b+ 대식세포 집단이 종양의 전체 세포의 32.8%를 차지하며, 이는 연령-매칭된 건강한 대조군 마우스 (3.7%)에서 볼 수 있는 것보다 9-배 더 높다는 것을 나타낸다 (도 13c). 실험에서 PDG 마우스는 주요 암 유전자 프로모터에 연결된 반딧불이 루시퍼라제 유전자를 발현한다. 이 리포터로부터의 생체발광은 종양 등급 (Uhrbom L 등 (2004) Nat Med 10: 1257-1260)과 양의 상관 관계가 있는 것으로 입증되어, 치료 개시 후 4 일 마다 종양 발생을 모니터링하는 데 사용하였다. 단일요법으로서 IRF/IKKβ NP를 먼저 테스트하였다: PDG 마우스에 IRF5/IKKβ mRNA가 로딩된 NP의 9 회 용량 또는 대조군의 PBS (3 주 동안 3 회 용량/주)를 정맥 내 주입하였다. IRF/IKKβ NP 처리는 종양 진행을 약간만 억압하였다 (처리되지 않은 대조군과 비교하여 평균 5-일만의 생존 이점을 생성함; 도 13d). 그러나, 표준 케어로서 방사선요법을 IRF5/IKKβ NP 주사와 조합하면 종양 성장이 실질적으로 감소하고 PBS 대조군에 비해 처리된 마우스의 생존이 두 배 초과 증가하였다 (각각 52 d 대 25 일; 도 13e, 13f).
결론적으로, 3 개의 전임상 고체 종양 모델로부터의 생체 내 결과는 국소적으로 또는 전신적으로 투여된 나노입자가 면역억압성 대식세포를 종양-제거 표현형으로 재-프로그래밍하기 위해 대식세포 분극화의 마스터 조절자를 코딩하는 유전자를 전달할 수 있음을 입증한다.
뮤린에서 인간 대식세포로의 번역.
마우스에서 획득한 데이터가 인간 질환 치료와 관련이 있음을 확인하기 위해, 인간 IRF5 및 IKKβ를 코딩하는 IVT mRNA를 전달하는 NP (huIRF5 NP)를 제작하였다. 인간 단핵구 세포주 THP-1은 이러한 나노담체를 테스트하기 위해 잘-확립된 M1 및 M2 대식세포 분극화 모델로서 사용하였다 (Li C 등 (2016) Sci Rep 6: 21044; Surdziel E 등 (2017) Plos One 12: e0183679). THP-1 세포를 PMA로 처리하고 IL-4 및 IL-13으로 분극화하여 M2-형 대식세포를 생성하였다 (도 14a). huIRF5 NP가 기능적이고 IRF 경로를 활성화하는지 확인하기 위해, THP1-LuciaTM ISG 세포를 huIRF5/IKKβ 또는 GFP 대조군 mRNA가 로딩된 나노입자로 형질주입시켰다. THP1-LuciaTM ISG 세포는 IRF-유도성 프로모터의 제어 하에 형광 Lucia 리포터를 분비한다. 이 복합 프로모터는 NF-κB 또는 AP-1 경로의 활성화제에 반응하지 않는 ISG54 최소 프로모터에 융합된 5 개의 IFN-자극된 반응 요소 (ISRE)를 포함한다. 결과적으로, THP1-Lucia™ ISG 세포는 Lucia 루시퍼라제의 활성을 결정함으로써 IRF 경로를 모니터링할 수 있게 한다. huIRF5 NP가 M2-분극된 THP-1 세포에서 루시퍼라제 발현을 강하게 상향조절하는 것으로 밝혀졌으며, 이는 mRNA 작제물이 인간 세포에서 기능적임을 나타낸다 (도 14b, 14c). IRF5 경로 활성화가 M2-분극된 THP-1 세포를 M1-유사 표현형으로 재프로그래밍할 수 있는지 여부를 결정하기 위해, NP 형질주입 후 전-염증성 사이토카인 IL-1β의 분비를 측정하였다. IL-1β의 생산은 M1 대식세포 표면 마커 CD80의 강력한 상향조절 (10.9-배 증가된 MFI, P<0.0001)(도 14e)과 상관 관계가 있는 형질주입되지 않은 대조군에 비해 huIRF5 NP로 형질주입된 THP-1 세포에서 유의하게 증가하였다 (평균 21-배; P<0.0001, 도 14d).
예언적 실시예 1: T 세포 유인제로 사전컨디셔닝.
재조합 CCL21 (케모카인 (c-c 모티프) 리간드 21)을 확립된 종양에 피하 주사할 것이고, 하루 후 종양 특이적 CAR, TCR 또는 CAR/TCR 하이브리드로 동원된 T 세포를 재프로그래밍하는 나노입자를 종양에 주사할 것이다. CCL21은 신속한 T-세포 침투를 유도하는 것으로 알려져 있다 (예컨대, Riedl 등, Molecular Cancer 2003).
예언적 실시예 2: 파종된 난소암.
파종된 난소암은 면역적격성 마우스에서 확립될 것이다. 동물에 CCL21을 복막 내 (i.p.) 주사한 후 하루 후 메조텔린 (MSLN) 특이적 TCR을 코딩하는 mRNA를 전달하는 나노입자의 i.p. 주사를 수행할 것이다. 난소암 세포는 높은 수준의 MSLN을 발현한다. (CCL21 사전컨디셔닝 포함하거나 포함하지 않는) 재프로그래밍 효율이 측정될 것이고 종양 진행이 생체발광 이미징을 사용하여 연속적으로 모니터링될 것이다.
예언적 실시예 3: HBV-유도된 간세포 암종의 뮤린 이종이식 모델.
HB코어18-27 항원으로 안정적으로 형질주입된 HepG2 종양 세포는 NSG 마우스의 간에 외과적으로 이식될 것이다. HepG2 종양 세포는 반딧불이 루시퍼라제로 태깅되어, 종양 진행을 비침습적으로 모니터링할 수 있다. 이어서, 마우스는 인간 T 세포로 재구성될 것이고 항-HBV-특이적 TCR (HB코어18-27) 또는 대조군 GFP를 코딩하는 mRNA를 전달하는 T-세포 표적화된 나노입자로 주사된다. 종양 진행은 GFP 나노입자 대조군에 대한 처리된 TCR 나노입자로 비교될 것이다. 말초 혈액에서의 TCR 재프로그래밍은 또한 유세포 분석에 의해 직접 측정될 것이다.
달리 명시되지 않는 한, 본 개시내용의 실시는 면역학, 분자 생물학, 미생물학, 세포 생물학 및 재조합 DNA의 통상적인 기술을 사용할 수 있다. 이러한 방법은 다음 공개물에 설명되어 있다. 예컨대, Sambrook, 등 Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Edition (1989); F. M. Ausubel, 등 eds., Current Protocols in Molecular Biology (1987); the series Methods IN Enzymology (Academic Press, Inc.); M. MacPherson, 등, PCR: A Practical Approach, IRL Press at Oxford University Press (1991); MacPherson 등, eds. PCR 2: Practical Approach (1995); Harlow 및 Lane, eds. Antibodies, A Laboratory Manual (1988); 및 R. I. Freshney, ed. Animal Cell Culture (1987) 참고.
공개 데이터베이스에 의해 제공된 서열 정보는 본원에 개시된 바와 같이 표현형-변경 단백질을 코딩하는 핵산 서열 및 표적화할 유전자 서열을 식별하는데 사용될 수 있다. 예시적인 서열은 도 15에 제공된다.
본원에 개시되고 참조된 서열의 변이체가 또한 포함된다. 단백질의 변이체는 하나 이상의 보존적 아미노산 치환을 갖는 것을 포함할 수 있다. 본원에 사용된 바와 같이, "보존적 치환"은 다음의 보존적 치환기 중 하나에서 발견되는 치환을 포함한다: 그룹 1: 알라닌 (Ala), 글리신 (Gly), 세린 (Ser), 트레오닌 (Thr); 그룹 2: 아스파르트산 (Asp), 글루탐산 (Glu); 그룹 3: 아스파라긴 (Asn), 글루타민 (Gln); 그룹 4: 아르기닌 (Arg), 리신 (Lys), 히스티딘 (His); 그룹 5: 이소류신 (Ile), 류신 (Leu), 메티오닌 (Met), 발린 (Val); 및 그룹 6: 페닐알라닌 (Phe), 티로신 (Tyr), 트립토판 (Trp).
추가로, 아미노산은 유사한 기능 또는 화학 구조 또는 조성 (예컨대, 산성, 염기성, 지방족, 방향족, 황-함유)에 의해 보존적 치환기로 그룹화될 수 있다. 예를 들어, 지방족 그룹은 치환을 위해 Gly, Ala, Val, Leu 및 Ile을 포함할 수 있다. 서로에 대한 보존적 치환으로 간주되는 아미노산을 함유하는 다른 그룹은 다음을 포함한다: 황-함유: Met 및 시스테인 (Cys); 산성: Asp, Glu, Asn 및 Gln; 작은 지방족, 비극성 또는 약간 극성 잔기: Ala, Ser, Thr, Pro 및 Gly; 극성, 음으로 하전된 잔기 및 이들의 아미드: Asp, Asn, Glu 및 Gln; 극성, 양으로 하전된 잔기: His, Arg 및 Lys; 큰 지방족, 비극성 잔기: Met, Leu, Ile, Val 및 Cys; 및 큰 방향족 잔기: Phe, Tyr 및 Trp. 추가 정보는 Creighton (1984) Proteins, W.H. Freeman and Company에서 찾아볼 수 있다.
다른 곳에서 나타낸 바와 같이, 유전자 서열의 변이체는 코돈 최적화된 변이체, 서열 다형성, 스플라이스 변이체, 및/또는 코딩된 생성물의 기능에 통계적으로-유의한 정도로 영향을 미치지 않는 돌연변이를 포함할 수 있다.
본원에 개시된 단백질, 핵산 및 유전자 서열의 변이체는 또한 본원에 개시된 단백질, 핵산 또는 유전자 서열에 대해 70% 이상의 서열 동일성, 80% 서열 동일성, 85% 서열, 90% 서열 동일성, 95% 서열 동일성, 96% 서열 동일성, 97% 서열 동일성, 98% 서열 동일성 또는 99% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함한다.
"% 서열 동일성"은 서열을 비교함으로써 결정된 바와 같이 2 개 이상의 서열 간의 관계를 지칭한다. 당업계에서, "동일성"은 또한 이러한 서열의 스트링 사이의 매치에 의해 결정되는 단백질, 핵산 또는 유전자 서열 사이의 서열 관련성의 정도를 의미한다. "동일성" (종종 "유사성"으로서 지칭됨)은 다음에서 설명된 것을 포함하여 알려진 방법으로 용이하게 계산할 수 있다: Computational Molecular Biology (Lesk, A. M., ed.) Oxford University Press, NY (1988); Biocomputing: Informatics and Genome Projects (Smith, D. W., ed.) Academic Press, NY (1994); Computer Analysis of Sequence Data, Part I (Griffin, A. M., 및 Griffin, H. G., eds.) Humana Press, NJ (1994); Sequence Analysis in Molecular Biology (Von Heijne, G., ed.) Academic Press (1987); 및 Sequence Analysis Primer (Gribskov, M. 및 Devereux, J., eds.) Oxford University Press, NY (1992). 동일성을 결정하기 위한 바람직한 방법은 테스트된 서열 간에 최상의 매치를 제공하도록 설계되었다. 동일성 및 유사성을 결정하는 방법은 공개적으로 이용가능한 컴퓨터 프로그램에 성문화되어 있다. LASERGENE 생물정보학 컴퓨팅 스위트 (DNASTAR, Inc., Madison, Wisconsin)의 Megalign 프로그램을 사용하여 서열 정렬 및 동일성 백분율 계산을 수행할 수 있다. 서열의 다중 정렬은 또한 기본 매개변수 (GAP PENALTY=10, GAP LENGTH PENALTY=10)를 사용하여 Clustal 정렬 방법 (Higgins and Sharp CABIOS, 5, 151-153 (1989)을 사용하여 수행할 수 있다. 관련 프로그램은 또한 GCG 프로그램의 스위트 (Wisconsin Package Version 9.0, Genetics Computer Group (GCG), Madison, Wisconsin); BLASTP, BLASTN, BLASTX (Altschul, 등, J. Mol. Biol. 215:403-410 (1990); DNASTAR (DNASTAR, Inc., Madison, Wisconsin); 및 Smith-Waterman 알고리즘을 통합하는 FASTA 프로그램 (Pearson, Comput. Methods Genome Res., [Proc. Int. Symp.] (1994), Meeting Date 1992, 111-20. Editor(s): Suhai, Sandor. Publisher: Plenum, New York, NY을 포함한다. 본 개시내용의 맥락 내에서, 서열 분석 소프트웨어가 분석을 위해 사용되는 경우, 분석 결과는 참조된 프로그램의 "기본값"에 기반한다는 것이 이해될 것이다. 본원에 사용된 "기본값"은 처음 초기화될 때 소프트웨어와 함께 원래 로딩되는 값 또는 매개변수의 임의의 세트를 의미할 것이다.
당업자에 의해 이해될 바와 같이, 본원에 개시된 각각의 실시양태는 이의 특정 언급된 요소, 단계, 성분 또는 구성요소를 포함하거나, 본질적으로 이로 이루어지거나 또는 이로 이루어질 수 있다. 본원에 사용된 바와 같이, 과도기적 용어 "포함하다" 또는 "포함하다"는 명시되지 않은 요소, 단계, 성분 또는 구성요소를 포함하나 이에 제한되지 않으며, 심지어 다량으로 이의 포함을 허용할 수 있음을 의미한다. 과도기적 어구 "이루어지다"는 명시되지 않은 임의의 요소, 단계, 성분 또는 구성요소를 제외한다. 과도기적 어구 "본질적으로 이로 이루어지다"는 실시양태의 범위를 명시된 요소, 단계, 성분, 또는 구성요소 및 실시양태에 실질적으로 영향을 미치지 않는 것들로 제한한다. 본원에 사용된 바와 같이, 재료 효과는 개시된 나노입자를 대상체에 투여한 후 7 일 이내에 치료적 단백질의 발현의 통계적으로-유의한 감소를 유발할 것이다.
특정 실시양태에 있어서, CDR 서열에 대한 언급은 Kabat 넘버링에 따른다.
달리 지시되지 않는 한, 명세서 및 청구 범위에 사용된 성분의 양, 특성, 예컨대, 분자량, 반응 조건 등을 나타내는 모든 숫자는 모든 경우에 용어 "약"에 의해 변형되는 것으로서 이해되어야 한다. 따라서, 반대로 지시되지 않는 한, 명세서 및 첨부된 청구 범위에 기재된 수치 매개변수는 본 발명에 의해 수득하고자 하는 원하는 특성에 따라 변할 수 있는 근사치이다. 적어도 청구 범위의 범주에 대한 등가 원칙의 적용을 제한하려는 시도가 아니라, 각각의 수치 매개변수는 적어도 보고된 유효 자릿수에 비추어 및 일반적인 반올림 기술을 적용하여 해석되어야한다.
추가 명확성이 요구되는 경우, 용어 "약"은 언급된 수치 또는 범위와 함께 사용될 때 당업자에 의해 합리적으로 부여된 의미를 갖는다. 즉, 언급된 값 또는 범위보다, 언급된 값의 ±20%; 언급된 값의 ±19%; 언급된 값의 ±18%; 언급된 값의 ±17%; 언급된 값의 ±16%; 언급된 값의 ±15%; 언급된 값의 ±14%; 언급된 값의 ±13%; 언급된 값의 ±12%; 언급된 값의 ±11%; 언급된 값의 ±10%; 언급된 값의 ±9%; 언급된 값의 ±8%; 언급된 값의 ±7%; 언급된 값의 ±6%; 언급된 값의 ±5%; 언급된 값의 ±4%; 언급된 값의 ±3%; 언급된 값의 ±2%; 또는 언급된 값의 ±1%의 범위 내에서 다소 더 많거나 다소 적은 것을 나타낸다.
본 발명의 넓은 범주를 기재하는 수치 범위 및 매개변수가 근사치임에도 불구하고, 특정 실시예에 기재된 수치는 가능한 한 정확하게 보고된다. 그러나, 임의의 수치는 본질적으로 각각의 테스트 측정에서 발견된 표준 편차로 인해 발생하는 특정 오류를 함유하고 있다.
본 발명을 설명하는 맥락에서 (특히 다음의 청구 범위의 맥락에서) 사용된 용어 "a", "an", "the" 및 유사한 지시어는 본원에서 달리 지시되지 않거나 문맥 상 명백히 모순되지 않는 한, 단수형 및 복수형을 모두 포함하는 것으로 해석되어야 한다. 본원에서 값의 범위를 인용하는 것은 단지 범위 내에 속하는 각각의 개별 값을 개별적으로 언급하는 속기 방법으로서 사용되도록 의도된다. 본원에서 달리 지시하지 않는 한, 각각의 개별 값은 마치 본원에서 개별적으로 인용된 것처럼 명세서에 포함된다. 본원에 기재된 모든 방법은 본원에서 달리 지시되지 않거나 문맥 상 명백히 모순되지 않는 한 임의의 적절한 순서로 수행될 수 있다. 본원에 제공된 임의의 모든 실시예 또는 예시적인 언어 (예를 들면, "예컨대")의 사용은 단지 본 발명을 더 잘 설명하기 위한 것이며 달리 청구된 본 발명의 범주에 제한을 두지 않는다. 명세서의 어떠한 언어도 본 발명의 실시에 필수적인 임의의 비-청구된 요소를 나타내는 것으로 해석되어서는 안된다.
본원에 개시된 본 발명의 대안적인 요소 또는 실시양태의 그룹화는 제한으로서 해석되어서는 안된다. 각각의 그룹 구성원은 개별적으로 또는 그룹의 다른 구성원 또는 본원에서 발견되는 다른 요소와의 임의의 조합으로 언급되고 청구될 수 있다. 그룹의 하나 이상의 구성원은 편의성 및/또는 특허가능성을 이유로 그룹에 포함되거나 그룹에서 삭제될 수 있을 것으로 예상된다. 이러한 포함 또는 삭제가 발생하면 명세서는 변형된 그룹을 함유하는 것으로 간주되어, 첨부된 청구 범위에 사용된 모든 Markush 그룹의 서면 설명을 충족한다.
본 발명을 수행하기 위해 본 발명자들에게 알려진 최상의 모드를 포함하여 본 발명의 특정 실시양태가 본원에 기재된다. 물론, 이러한 설명된 실시양태에 대한 변이는 전술한 설명을 읽을 때 당업자에게 명백할 것이다. 본 발명자는 당업자가 이러한 변이를 적절하게 사용하기를 기대하고, 본 발명자들은 본 발명이 본원에 구체적으로 설명된 것과 다르게 실시되는 것을 의도한다. 따라서, 본 발명은 적용가능한 법률에 의해 허용되는 바와 같이 본원에 첨부된 청구 범위에 인용된 주제의 모든 변형 및 등가물을 포함한다. 더욱이, 이들의 모든 가능한 변이에서 상기-기재된 요소의 임의의 조합은 본원에 달리 지시되지 않거나 문맥에 의해 달리 명백히 모순되지 않는 한 본 발명에 포함된다.
또한, 본 명세서 전반에 걸쳐 저널 기사, 공개물, 특허 및 특허 출원 (특허 출원 공개공보 포함) (총칭하여 "인용")에 대한 많은 참조가 이루어졌다. 각각의 상기 인용은 특정 인용된 목적 및/또는 교시를 위해 개별적으로 본원에 참고로 원용된다.
본원에 개시된 실시양태는 본 발명의 원리를 예시하는 것임을 이해해야 한다. 이용될 수 있는 다른 변형은 본 발명의 범주 내에 있다. 따라서, 제한이 아닌 예로서, 본 발명의 대안적인 구성이 본원의 교시에 따라 이용될 수 있다. 따라서, 본 발명은 도시되고 기재된 것과 같이 정확하게 그 것에 제한되지 않는다.
본원에 도시된 세부사항은 예로서 및 본 발명의 바람직한 실시양태에 대한 예시적인 논의를 위한 목적으로만 제공되며, 본 발명의 다양한 실시양태의 원리 및 개념적 양태에 대한 가장 유용하고 용이하게 이해되는 설명으로 여겨지는 것을 제공한다는 명분 하에 제시된다. 이와 관련하여, 본 발명의 근본적인 이해에 필요한 것보다 본 발명의 구조적 사항을 보다 상세하게 보여 주려는 시도는 이루어지지 않았으나, 도면 및/또는 실시예와 함께 취해진 설명은 본 발명의 여러 형태가 실제로 구현될 수 있는 방법을 당업자에게 명백하게 한다.
본 개시내용에서 사용된 정의 및 설명은 다음의 실시예에서 명확하고 모호하지 않게 변형되지 않는 한 또는 의미의 적용이 임의의 구성을 무의미하거나 본질적으로 무의미하게 만드는 경우를 제외하고는 임의의 미래의 구성에서도 제어할 수 있음을 의미하고 의도한다. 용어의 구성이 의미가 없거나 본질적으로 의미가 없는 경우, 정의는 Webster's Dictionary, 3rd Edition 또는 당업자에게 알려진 사전, 예컨대, Oxford Dictionary of Biochemistry and Molecular Biology (Ed. Anthony Smith, Oxford University Press, Oxford, 2004)에서 가져와야 한다.
개시내용 전체에 걸쳐, 인용된 모든 참고 및 특허 문헌은 그 전체가 본원에 참고로 원용된다.
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<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Anti-human 1928z CAR
<400> 1
Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu
1 5 10 15
His Ala Glu Val Lys Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val Arg Pro
20 25 30
Gly Ser Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ala Phe Ser
35 40 45
Ser Tyr Trp Met Asn Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu
50 55 60
Trp Ile Gly Gln Ile Tyr Pro Gly Asp Gly Asp Thr Asn Tyr Asn Gly
65 70 75 80
Lys Phe Lys Gly Gln Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Ser Thr
85 90 95
Ala Tyr Met Gln Leu Ser Gly Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr
100 105 110
Phe Cys Ala Arg Lys Thr Ile Ser Ser Val Val Asp Phe Tyr Phe Asp
115 120 125
Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly
130 135 140
Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Glu Leu Thr
145 150 155 160
Gln Ser Pro Lys Phe Met Ser Thr Ser Val Gly Asp Arg Val Ser Val
165 170 175
Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asn Val Gly Thr Asn Val Ala Trp Tyr Gln
180 185 190
Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Pro Leu Ile Tyr Ser Ala Thr Tyr
195 200 205
Arg Asn Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr
210 215 220
Asp Phe Thr Leu Thr Ile Thr Asn Val Gln Ser Lys Asp Leu Ala Asp
225 230 235 240
Tyr Phe Cys Gln Gln Tyr Asn Arg Tyr Pro Tyr Thr Ser Gly Gly Gly
245 250 255
Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Ala Ala Ala Ile Glu Val Met Tyr Pro
260 265 270
Pro Pro Tyr Leu Asp Asn Glu Lys Ser Asn Gly Thr Ile Ile His Val
275 280 285
Lys Gly Lys His Leu Cys Pro Ser Pro Leu Phe Pro Gly Pro Ser Lys
290 295 300
Pro Phe Trp Val Leu Val Val Val Gly Gly Val Leu Ala Cys Tyr Ser
305 310 315 320
Leu Leu Val Thr Val Ala Phe Ile Ile Phe Trp Val Arg Ser Lys Arg
325 330 335
Ser Arg Leu Leu His Ser Asp Tyr Met Asn Met Thr Pro Arg Arg Pro
340 345 350
Gly Pro Thr Arg Lys His Tyr Gln Pro Tyr Ala Pro Pro Arg Asp Phe
355 360 365
Ala Ala Tyr Arg Ser Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Glu Pro Pro
370 375 380
Ala Tyr Gln Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly
385 390 395 400
Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro
405 410 415
Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr
420 425 430
Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly
435 440 445
Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln
450 455 460
Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln
465 470 475 480
Ala Leu Pro Pro Arg
485
<210> 2
<211> 466
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Anti-human ROR1 CAR
<400> 2
Met Leu Leu Leu Val Thr Ser Leu Leu Leu Cys Glu Leu Pro His Pro
1 5 10 15
Ala Phe Leu Leu Ile Pro Gln Glu Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Arg
20 25 30
Leu Val Thr Pro Gly Gly Ser Leu Thr Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly
35 40 45
Phe Asp Phe Ser Ala Tyr Tyr Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly
50 55 60
Lys Gly Leu Glu Trp Ile Ala Thr Ile Tyr Pro Ser Ser Gly Lys Thr
65 70 75 80
Tyr Tyr Ala Thr Trp Val Asn Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ser Asp Asn
85 90 95
Ala Gln Asn Thr Val Asp Leu Gln Met Asn Ser Leu Thr Ala Ala Asp
100 105 110
Arg Ala Thr Tyr Phe Cys Ala Arg Asp Ser Tyr Ala Asp Asp Gly Ala
115 120 125
Leu Phe Asn Ile Trp Gly Pro Gly Thr Leu Val Thr Ile Ser Ser Gly
130 135 140
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Leu
145 150 155 160
Val Leu Thr Gln Ser Pro Ser Val Ser Ala Ala Leu Gly Ser Pro Ala
165 170 175
Lys Ile Thr Cys Thr Leu Ser Ser Ala His Lys Thr Asp Thr Ile Asp
180 185 190
Trp Tyr Gln Gln Leu Gln Gly Glu Ala Pro Arg Tyr Leu Met Gln Val
195 200 205
Gln Ser Asp Gly Ser Tyr Thr Lys Arg Pro Gly Val Pro Asp Arg Phe
210 215 220
Ser Gly Ser Ser Ser Gly Ala Asp Arg Tyr Leu Ile Ile Pro Ser Val
225 230 235 240
Gln Ala Asp Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gly Ala Asp Tyr Ile Gly
245 250 255
Gly Tyr Val Phe Gly Gly Gly Thr Gln Leu Thr Val Thr Gly Glu Ser
260 265 270
Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Met Phe Trp Val Leu Val
275 280 285
Val Val Gly Gly Val Leu Ala Cys Tyr Ser Leu Leu Val Thr Val Ala
290 295 300
Phe Ile Ile Phe Trp Val Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile
305 310 315 320
Phe Lys Gln Pro Phe Met Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp
325 330 335
Gly Cys Ser Cys Arg Phe Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu
340 345 350
Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly
355 360 365
Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr
370 375 380
Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys
385 390 395 400
Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys
405 410 415
Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg
420 425 430
Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala
435 440 445
Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg
450 455 460
Leu Glu
465
<210> 3
<211> 608
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> HBV-specific TCR
<400> 3
Met Glu Thr Leu Leu Gly Val Ser Leu Val Ile Leu Trp Leu Gln Leu
1 5 10 15
Ala Arg Val Asn Ser Gln Gln Gly Glu Glu Asp Pro Gln Ala Leu Ser
20 25 30
Ile Gln Glu Gly Glu Asn Ala Thr Met Asn Cys Ser Tyr Lys Thr Ser
35 40 45
Ile Asn Asn Leu Gln Trp Tyr Arg Gln Asn Ser Gly Arg Gly Leu Val
50 55 60
His Leu Ile Leu Ile Arg Ser Asn Glu Arg Glu Lys His Ser Gly Arg
65 70 75 80
Leu Arg Val Thr Leu Asp Thr Ser Lys Lys Ser Ser Ser Leu Leu Ile
85 90 95
Thr Ala Ser Arg Ala Ala Asp Thr Ala Ser Tyr Phe Cys Ala Thr Trp
100 105 110
Leu Ser Gly Ser Ala Arg Gln Leu Thr Phe Gly Ser Gly Thr Gln Leu
115 120 125
Thr Val Leu Pro Asp Ile Gln Asn Pro Asp Pro Ala Val Tyr Gln Leu
130 135 140
Arg Asp Ser Lys Ser Ser Asp Lys Ser Val Cys Leu Phe Thr Asp Phe
145 150 155 160
Asp Ser Gln Thr Asn Val Ser Gln Ser Lys Asp Ser Asp Val Tyr Ile
165 170 175
Thr Asp Lys Cys Val Leu Asp Met Arg Ser Met Asp Phe Lys Ser Asn
180 185 190
Ser Ala Val Ala Trp Ser Asn Lys Ser Asp Phe Ala Cys Ala Asn Ala
195 200 205
Phe Asn Asn Ser Ile Ile Pro Glu Asp Thr Phe Phe Pro Ser Pro Glu
210 215 220
Ser Ser Cys Asp Val Lys Leu Val Glu Lys Ser Phe Glu Thr Asp Thr
225 230 235 240
Asn Leu Asn Phe Gln Asn Leu Ser Val Ile Gly Phe Arg Ile Leu Leu
245 250 255
Leu Lys Val Ala Gly Phe Asn Leu Leu Met Thr Leu Arg Leu Trp Ser
260 265 270
Ser Gly Ser Gly Ala Thr Asn Phe Ser Leu Leu Lys Gln Ala Gly Asp
275 280 285
Val Glu Glu Asn Pro Gly Pro Met Asp Ser Trp Thr Leu Cys Cys Val
290 295 300
Ser Leu Cys Ile Leu Val Ala Lys His Thr Asp Ala Gly Val Ile Gln
305 310 315 320
Ser Pro Arg His Glu Val Thr Glu Met Gly Gln Glu Val Thr Leu Arg
325 330 335
Cys Lys Pro Ile Ser Gly His Asp Tyr Leu Phe Trp Tyr Arg Gln Thr
340 345 350
Met Met Arg Gly Leu Glu Leu Leu Ile Tyr Phe Asn Asn Asn Val Pro
355 360 365
Ile Asp Asp Ser Gly Met Pro Glu Asp Arg Phe Ser Ala Lys Met Pro
370 375 380
Asn Ala Ser Phe Ser Thr Leu Lys Ile Gln Pro Ser Glu Pro Arg Asp
385 390 395 400
Ser Ala Val Tyr Phe Cys Ala Ser Ser Asn Arg Ala Ser Ser Tyr Asn
405 410 415
Glu Gln Phe Phe Gly Pro Gly Thr Arg Leu Thr Val Leu Glu Asp Leu
420 425 430
Lys Asn Val Phe Pro Pro Glu Val Ala Val Phe Glu Pro Ser Glu Ala
435 440 445
Glu Ile Ser His Thr Gln Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu Ala Thr Gly
450 455 460
Phe Tyr Pro Asp His Val Glu Leu Ser Trp Trp Val Asn Gly Lys Glu
465 470 475 480
Val His Ser Gly Val Cys Thr Asp Pro Gln Pro Leu Lys Glu Gln Pro
485 490 495
Ala Leu Asn Asp Ser Arg Tyr Ser Leu Ser Ser Arg Leu Arg Val Ser
500 505 510
Ala Thr Phe Trp Gln Asn Pro Arg Asn His Phe Arg Cys Gln Val Gln
515 520 525
Phe Tyr Gly Leu Ser Glu Asn Asp Glu Trp Thr Gln Asp Arg Ala Lys
530 535 540
Pro Val Thr Gln Ile Val Ser Ala Glu Ala Trp Gly Arg Ala Asp Cys
545 550 555 560
Gly Phe Thr Ser Glu Ser Tyr Gln Gln Gly Val Leu Ser Ala Thr Ile
565 570 575
Leu Tyr Glu Ile Leu Leu Gly Lys Ala Thr Leu Tyr Ala Val Leu Val
580 585 590
Ser Ala Leu Val Leu Met Ala Met Val Lys Arg Lys Asp Ser Arg Gly
595 600 605
<210> 4
<211> 1458
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Anti-human 1928z CAR
<400> 4
atggctctgc ctgtgacagc tctgctgctg cctctggctc tgcttctgca cgccgaagtg 60
aagctgcagc agtctggcgc cgaactcgtt agacctggca gcagcgtgaa gatcagctgc 120
aaggccagcg gctacgcctt cagcagctac tggatgaact gggtcaagca gaggcctgga 180
cagggcctcg aatggatcgg ccaaatctat cctggcgacg gcgacaccaa ctacaacggc 240
aagttcaaag gccaggccac actgaccgcc gacaagtcta gcagcacagc ctacatgcag 300
ctgagcggcc tgacaagcga agatagcgcc gtgtacttct gcgccagaaa gaccatcagc 360
tccgtggtgg acttctactt cgactactgg ggccagggca ccaccgtgac agtttctagc 420
ggaggcggag gatctggtgg cggaggaagt ggcggaggcg gctctgatat tgagctgaca 480
cagagcccca agttcatgag caccagcgtg ggcgatagag tgtccgtgac ctgtaaagcc 540
agccagaacg tgggcacaaa cgtggcctgg tatcagcaga agcctggcca gtctcctaag 600
cctctgatct acagcgccac ctacagaaac agcggcgtgc ccgatagatt caccggctct 660
ggaagcggca ccgacttcac cctgaccatc accaacgtgc agagcaagga cctggccgac 720
tacttctgcc agcagtacaa cagatacccc tacaccagcg gcggaggcac caagctggaa 780
atcaaaagag ccgccgctat cgaagtgatg taccctcctc cttacctgga caacgagaag 840
tccaacggca ccatcatcca cgtgaagggc aaacacctgt gtccttctcc actgttcccc 900
ggacctagca agcctttctg ggtgctcgtt gttgttggcg gcgtgctggc ctgttactct 960
ctgctggtta ccgtggcctt catcatcttt tgggtccgaa gcaagcggag ccggctgctg 1020
cacagcgact acatgaacat gacccctaga cggcccggac caaccagaaa gcactaccag 1080
ccttacgctc ctcctagaga cttcgccgcc taccggtcca gagtgaagtt cagcagatcc 1140
gccgagcctc ctgcctatca gcagggacag aaccagctgt acaacgagct gaacctgggg 1200
agaagagaag agtacgacgt gctggacaag cggagaggca gagatcctga gatgggcggc 1260
aagcccagac ggaagaatcc tcaagagggc ctgtataatg agctgcagaa agacaagatg 1320
gccgaggcct acagcgagat cggaatgaag ggcgagcgca gaagaggcaa gggacacgat 1380
ggactgtacc agggcctgag caccgccacc aaggatacct atgatgccct gcacatgcag 1440
gccctgcctc caagataa 1458
<210> 5
<211> 1401
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Anti-human ROR1 (4-1BBz) CAR
<400> 5
atgctgctgc tggtgacaag cctgctgctg tgcgagctgc cccaccccgc ctttctgctg 60
atcccccagg aacagctcgt cgaaagcggc ggcagactgg tgacacctgg cggcagcctg 120
accctgagct gcaaggccag cggcttcgac ttcagcgcct actacatgag ctgggtccgc 180
caggcccctg gcaagggact ggaatggatc gccaccatct accccagcag cggcaagacc 240
tactacgcca cctgggtgaa cggacggttc accatctcca gcgacaacgc ccagaacacc 300
gtggacctgc agatgaacag cctgacagcc gccgaccggg ccacctactt ttgcgccaga 360
gacagctacg ccgacgacgg cgccctgttc aacatctggg gccctggcac cctggtgaca 420
atctctagcg gcggaggcgg atctggtggc ggaggaagtg gcggcggagg atctgagctg 480
gtgctgaccc agagcccctc tgtgtctgct gccctgggaa gccctgccaa gatcacctgt 540
accctgagca gcgcccacaa gaccgacacc atcgactggt atcagcagct gcagggcgag 600
gcccccagat acctgatgca ggtgcagagc gacggcagct acaccaagag gccaggcgtg 660
cccgaccggt tcagcggatc tagctctggc gccgaccgct acctgatcat ccccagcgtg 720
caggccgatg acgaggccga ttactactgt ggcgccgact acatcggcgg ctacgtgttc 780
ggcggaggca cccagctgac cgtgaccggc gaatctaagt acggaccgcc ctgcccccct 840
tgccctatgt tctgggtgct ggtggtggtc ggaggcgtgc tggcctgcta cagcctgctg 900
gtcaccgtgg ccttcatcat cttttgggtg aaacggggca gaaagaaact cctgtatata 960
ttcaaacaac catttatgag accagtacaa actactcaag aggaagatgg ctgtagctgc 1020
cgatttccag aagaagaaga aggaggatgt gaactgcggg tgaagttcag cagaagcgcc 1080
gacgcccctg cctaccagca gggccagaat cagctgtaca acgagctgaa cctgggcaga 1140
agggaagagt acgacgtcct ggataagcgg agaggccggg accctgagat gggcggcaag 1200
cctcggcgga agaaccccca ggaaggcctg tataacgaac tgcagaaaga caagatggcc 1260
gaggcctaca gcgagatcgg catgaagggc gagcggaggc ggggcaaggg ccacgacggc 1320
ctgtatcagg gcctgtccac cgccaccaag gatacctacg acgccctgca catgcaggcc 1380
ctgcccccaa ggctcgagtg a 1401
<210> 6
<211> 1827
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Anti-HBV-specific TCR (HBcore18-27)
<400> 6
atggaaactc tgctgggcgt gtcactggtc attctgtggc tgcagctggc aagggtcaat 60
agtcagcagg gcgaagaaga tcctcaggca ctgtccatcc aggagggcga aaatgccacc 120
atgaactgct catacaagac aagcattaac aacctccagt ggtatcggca gaacagcggc 180
cgggggctgg tgcacctgat cctgattcga tcaaacgagc gggaaaagca tagcgggcgg 240
ctgagagtga ctctggacac cagcaagaaa agctcctctc tgctgatcac tgcctccagg 300
gccgctgata ccgcatctta cttttgtgca acatggctga gcggcagcgc acgacagctg 360
accttcggca gcggcacaca gctgactgtg ctgcctgaca ttcagaatcc agatcccgcc 420
gtctaccagc tgcgggacag caagagttca gataaatccg tgtgcctgtt cacagacttt 480
gattctcaga ctaacgtctc tcagagtaag gacagtgatg tgtatatcac agacaaatgt 540
gtcctggata tgcggagcat ggacttcaag tcaaatagcg cagtggcctg gagcaacaaa 600
tccgacttcg cttgcgcaaa tgcctttaac aattcaatca ttccagagga taccttcttt 660
cctagcccag aaagctcctg tgacgtgaag ctggtcgaga aaagtttcga aaccgataca 720
aatctgaact ttcagaatct gtctgtgatc ggattccgga ttctgctgct gaaggtcgcc 780
ggctttaacc tgctgatgac cctgagactg tggtctagtg ggtctggagc tacaaatttc 840
agtctgctga aacaggcagg cgatgtggag gaaaaccccg ggcctatgga cagttggaca 900
ctgtgctgtg tgtcactgtg catcctggtc gctaagcaca ctgacgcagg cgtgattcag 960
agcccaagac atgaagtgac tgaaatgggg caggaggtca ccctgaggtg taaacccatc 1020
agcggacacg attacctgtt ttggtatagg cagactatga tgcgcggact ggagctgctg 1080
atctacttca acaataacgt gcccattgac gatagcggga tgcccgaaga caggttttcc 1140
gccaagatgc caaatgcttc cttctctacc ctgaaaattc agccttccga gccacgagat 1200
agcgccgtgt acttttgcgc ctcaagcaat cgggcttcct cttataacga gcagttcttt 1260
ggaccaggga cccgactgac agtgctggaa gacctgaaga acgtcttccc ccctgaggtg 1320
gccgtctttg aacctagtga ggctgaaatc tcacacactc agaaagctac cctggtgtgc 1380
ctggcaaccg gcttctaccc agatcacgtg gagctgtcct ggtgggtcaa tgggaaggaa 1440
gtgcattctg gagtctgtac agacccacag cccctgaaag agcagcccgc cctgaacgat 1500
tctcggtaca gtctgagttc aaggctgcgc gtgagcgcta cattttggca gaatcctaga 1560
aaccatttca ggtgccaggt gcagttttat gggctgtccg agaacgatga atggacacag 1620
gaccgcgcca agcccgtgac tcagatcgtc tctgctgagg catggggacg agctgactgt 1680
ggcttcacca gtgaatcata tcagcagggc gtgctgagcg ccactatcct gtacgagatt 1740
ctgctgggga aggccaccct gtatgctgtg ctggtcagcg cactggtgct gatggctatg 1800
gtgaagcgca aagatagccg aggctga 1827
<210> 7
<211> 734
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> anti-CD19 scFv (VH-VL) FMC63
<400> 7
cacatccaga tgacccagac cacctccagc ctgagcgcca gcctgggcga ccgggtgacc 60
atcagctgcc gggccagcca ggacatcagc aagtacctga actggtatca gcagaagccc 120
gacggcaccg tcaagctgct gatctaccac accagccggc tgcacagcgg cgtgcccagc 180
cggtttagcg gcagcggctc cggcaccgac tacagcctga ccatctccaa cctggaacag 240
gaagatatcg ccacctactt ttgccagcag ggcaacacac tgccctacac ctttggcggc 300
ggaacaaagc tggaaatcac cggcagcacc tccggcagcg gcaagcctgg cagcggcgag 360
ggcagcacca agggcgaggt gaagctgcag gaaagcggcc ctggcctggt ggcccccagc 420
cagagcctga gcgtgacctg caccgtgagc ggcgtgagcc tgcccgacta cggcgtgagc 480
tggatccggc agccccccag gaagggcctg gaatggctgg gcgtgatctg gggcagcgag 540
accacctact acaacagcgc cctgaagagc cggctgacca tcatcaagga caacagcaag 600
agccaggtgt tcctgaagat gaacagcctg cagaccgacg acaccgccat ctactactgc 660
gccaagcact actactacgg cggcagctac gccatggact actggggcca gggcaccagc 720
gtgaccgtga gcag 734
<210> 8
<211> 245
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> anti-CD19 scFv (VH-VL) FMC63
<400> 8
Asp Ile Gln Met Thr Gln Thr Thr Ser Ser Leu Ser Ala Ser Leu Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Lys Tyr
20 25 30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gly Thr Val Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr His Thr Ser Arg Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Asn Leu Glu Gln
65 70 75 80
Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Phe Cys Gln Gln Gly Asn Thr Leu Pro Tyr
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Thr Gly Ser Thr Ser Gly
100 105 110
Ser Gly Lys Pro Gly Ser Gly Glu Gly Ser Thr Lys Gly Glu Val Lys
115 120 125
Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Ala Pro Ser Gln Ser Leu Ser
130 135 140
Val Thr Cys Thr Val Ser Gly Val Ser Leu Pro Asp Tyr Gly Val Ser
145 150 155 160
Trp Ile Arg Gln Pro Pro Arg Lys Gly Leu Glu Trp Leu Gly Val Ile
165 170 175
Trp Gly Ser Glu Thr Thr Tyr Tyr Asn Ser Ala Leu Lys Ser Arg Leu
180 185 190
Thr Ile Ile Lys Asp Asn Ser Lys Ser Gln Val Phe Leu Lys Met Asn
195 200 205
Ser Leu Gln Thr Asp Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys Ala Lys His Tyr
210 215 220
Tyr Tyr Gly Gly Ser Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Ser
225 230 235 240
Val Thr Val Ser Ser
245
<210> 9
<211> 123
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> CD28 effector domain
<400> 9
cggagcaagc ggagcagagg cggccacagc gactacatga acatgacccc cagacggcct 60
ggccccaccc ggaagcacta ccagccctac gccccaccca gggactttgc cgcctacaga 120
agc 123
<210> 10
<211> 1476
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> P28z CAR
<400> 10
gtggcctcac cgttgacccg ctttctgtcg ctgaacctgc tgctgctggg tgagtcgatt 60
atcctgggga gtggagaagc tgaggtgcag ctgcagcagt caggacctga actggtgaag 120
cctgggactt cagtgaggat atcctgcaag acttctggat acacattcac tgaatatacc 180
atacactggg tgaagcagag ccatggaaag agccttgagt ggattggaaa catcaatcct 240
aacaatggtg gtaccaccta caatcagaag ttcgaggaca aggccacatt gactgtagac 300
aagtcctcca gtacagccta catggagctc cgcagcctaa catctgagga ttctgcagtc 360
tattattgtg cagctggttg gaactttgac tactggggcc aagggaccac ggtcaccgtc 420
tcctcaggtg gaggtggatc aggtggaggt ggatctggtg gaggtggatc tgacattgtg 480
atgacccagt ctcacaaatt catgtccaca tcagtaggag acagggtcag catcatctgt 540
aaggccagtc aagatgtggg tactgctgta gactggtatc aacagaaacc aggacaatct 600
cctaaactac tgatttattg ggcatccact cggcacactg gagtccctga tcgcttcaca 660
ggcagtggat ctgggacaga cttcactctc accattacta atgttcagtc tgaagacttg 720
gcagattatt tctgtcagca atataacagc tatcccctca cgttcggtgc tgggaccatg 780
ctggacctga aacgggcggc cgcatctact actaccaagc cagtgctgcg aactccctca 840
cctgtgcacc ctaccgggac atctcagccc cagagaccag aagattgtcg gccccgtggc 900
tcagtgaagg ggaccggatt ggacttcgcc tgtgatattt acatctgggc acccttggcc 960
ggaatctgcg tggcccttct gctgtccttg atcatcactc tcatctgcta caatagtaga 1020
aggaacagac tccttcaaag tgactacatg aacatgactc cccggaggcc tgggctcact 1080
cgaaagcctt accagcccta cgcccctgcc agagactttg cagcgtaccg ccccagagca 1140
aaattcagca ggagtgcaga gactgctgcc aacctgcagg accccaacca gctctacaat 1200
gagctcaatc tagggcgaag agaggaatat gacgtcttgg agaagaagcg ggctcgggat 1260
ccagagatgg gaggcaaaca gcagaggagg aggaaccccc aggaaggcgt atacaatgca 1320
ctgcagaaag acaagatggc agaagcctac agtgagatcg gcacaaaagg cgagaggcgg 1380
agaggcaagg ggcacgatgg cctttaccag ggtctcagca ctgccaccaa ggacacctat 1440
gatgccctgc atatgcagac cctggcccct cgctaa 1476
<210> 11
<211> 327
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> IgG4-Fc
<400> 11
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg
1 5 10 15
Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
20 25 30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
35 40 45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
50 55 60
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr
65 70 75 80
Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
85 90 95
Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Ser Cys Pro Ala Pro
100 105 110
Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys
115 120 125
Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val
130 135 140
Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp
145 150 155 160
Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe
165 170 175
Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp
180 185 190
Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu
195 200 205
Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg
210 215 220
Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys
225 230 235 240
Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp
245 250 255
Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys
260 265 270
Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser
275 280 285
Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser
290 295 300
Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser
305 310 315 320
Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys
325
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<211> 229
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Hinge-CH2-CH3
<400> 12
Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Phe
1 5 10 15
Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr
20 25 30
Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val
35 40 45
Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val
50 55 60
Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser
65 70 75 80
Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu
85 90 95
Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser
100 105 110
Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro
115 120 125
Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln
130 135 140
Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala
145 150 155 160
Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr
165 170 175
Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu
180 185 190
Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser
195 200 205
Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser
210 215 220
Leu Ser Leu Gly Lys
225
<210> 13
<211> 119
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Hinge-CH3
<400> 13
Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Gly Gln Pro Arg
1 5 10 15
Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys
20 25 30
Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp
35 40 45
Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys
50 55 60
Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser
65 70 75 80
Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser
85 90 95
Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser
100 105 110
Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys
115
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<211> 12
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Hinge
<400> 14
Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro
1 5 10
<210> 15
<211> 28
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> CD28 Transmembrane domain
<400> 15
Met Phe Trp Val Leu Val Val Val Gly Gly Val Leu Ala Cys Tyr Ser
1 5 10 15
Leu Leu Val Thr Val Ala Phe Ile Ile Phe Trp Val
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<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> CD28 Cytoplasmic domain (LL to GG)
<400> 16
Arg Ser Lys Arg Ser Arg Gly Gly His Ser Asp Tyr Met Asn Met Thr
1 5 10 15
Pro Arg Arg Pro Gly Pro Thr Arg Lys His Tyr Gln Pro Tyr Ala Pro
20 25 30
Pro Arg Asp Phe Ala Ala Tyr Arg Ser
35 40
<210> 17
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<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 4-1BB Cytoplasmic domain
<400> 17
Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met
1 5 10 15
Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe
20 25 30
Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu
35 40
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<211> 112
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> CD3-z Cytoplasmic domain
<400> 18
Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly
1 5 10 15
Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr
20 25 30
Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys
35 40 45
Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys
50 55 60
Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg
65 70 75 80
Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala
85 90 95
Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg
100 105 110
<210> 19
<211> 24
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> T2A
<400> 19
Leu Glu Gly Gly Gly Glu Gly Arg Gly Ser Leu Leu Thr Cys Gly Asp
1 5 10 15
Val Glu Glu Asn Pro Gly Pro Arg
20
<210> 20
<211> 356
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> tEGFR
<400> 20
Met Leu Leu Leu Val Thr Ser Leu Leu Leu Cys Glu Leu Pro His Pro
1 5 10 15
Ala Phe Leu Leu Ile Pro Arg Lys Val Cys Asn Gly Ile Gly Ile Gly
20 25 30
Glu Phe Lys Asp Ser Leu Ser Ile Asn Ala Thr Asn Ile Lys His Phe
35 40 45
Lys Asn Cys Thr Ser Ile Ser Gly Asp Leu His Ile Leu Pro Val Ala
50 55 60
Phe Arg Gly Asp Ser Phe Thr His Thr Pro Pro Leu Asp Pro Gln Glu
65 70 75 80
Leu Asp Ile Leu Lys Thr Val Lys Glu Ile Thr Gly Phe Leu Leu Ile
85 90 95
Gln Ala Trp Pro Glu Asn Arg Thr Asp Leu His Ala Phe Glu Asn Leu
100 105 110
Glu Ile Ile Arg Gly Arg Thr Gln His Gly Gln Phe Ser Leu Ala Val
115 120 125
Val Ser Leu Asn Ile Thr Ser Leu Gly Leu Arg Ser Leu Lys Glu Ile
130 135 140
Ser Asp Gly Asp Val Ile Ile Ser Gly Asn Lys Asn Leu Cys Tyr Ala
145 150 155 160
Asn Thr Ile Asn Trp Lys Lys Leu Phe Gly Thr Ser Gly Gln Lys Thr
165 170 175
Lys Ile Ile Ser Asn Arg Gly Glu Asn Ser Cys Lys Ala Thr Gly Gln
180 185 190
Val Cys His Ala Leu Cys Ser Pro Glu Gly Cys Trp Gly Pro Glu Pro
195 200 205
Arg Asp Cys Val Ser Cys Arg Asn Val Ser Arg Gly Arg Glu Cys Val
210 215 220
Asp Lys Cys Asn Leu Leu Glu Gly Glu Pro Arg Glu Phe Val Glu Asn
225 230 235 240
Ser Glu Cys Ile Gln Cys His Pro Glu Cys Leu Pro Gln Ala Met Asn
245 250 255
Ile Thr Cys Thr Gly Arg Gly Pro Asp Asn Cys Ile Gln Cys Ala His
260 265 270
Tyr Ile Asp Gly Pro His Cys Val Lys Thr Cys Pro Ala Gly Val Met
275 280 285
Gly Glu Asn Asn Thr Leu Val Trp Lys Tyr Ala Asp Ala Gly His Val
290 295 300
Cys His Leu Cys His Pro Asn Cys Thr Tyr Gly Cys Thr Gly Pro Gly
305 310 315 320
Leu Glu Gly Cys Pro Thr Asn Gly Pro Lys Ile Pro Ser Ile Ala Thr
325 330 335
Gly Met Val Gly Ala Leu Leu Leu Leu Leu Val Val Ala Leu Gly Ile
340 345 350
Gly Leu Phe Met
355
<210> 21
<211> 8
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Strep tag II
<400> 21
Trp Ser His Pro Gln Phe Glu Lys
1 5
<210> 22
<211> 10
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Myc tag
<400> 22
Glu Gln Lys Leu Ile Ser Glu Glu Asp Leu
1 5 10
<210> 23
<211> 14
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> V5 tag
<400> 23
Gly Lys Pro Ile Pro Asn Pro Leu Leu Gly Leu Asp Ser Thr
1 5 10
<210> 24
<211> 8
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> FLAG tag
<400> 24
Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys
1 5
<210> 25
<211> 498
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 25
Met Asn Gln Ser Ile Pro Val Ala Pro Thr Pro Pro Arg Arg Val Arg
1 5 10 15
Leu Lys Pro Trp Leu Val Ala Gln Val Asn Ser Cys Gln Tyr Pro Gly
20 25 30
Leu Gln Trp Val Asn Gly Glu Lys Lys Leu Phe Cys Ile Pro Trp Arg
35 40 45
His Ala Thr Arg His Gly Pro Ser Gln Asp Gly Asp Asn Thr Ile Phe
50 55 60
Lys Ala Trp Ala Lys Glu Thr Gly Lys Tyr Thr Glu Gly Val Asp Glu
65 70 75 80
Ala Asp Pro Ala Lys Trp Lys Ala Asn Leu Arg Cys Ala Leu Asn Lys
85 90 95
Ser Arg Asp Phe Arg Leu Ile Tyr Asp Gly Pro Arg Asp Met Pro Pro
100 105 110
Gln Pro Tyr Lys Ile Tyr Glu Val Cys Ser Asn Gly Pro Ala Pro Thr
115 120 125
Asp Ser Gln Pro Pro Glu Asp Tyr Ser Phe Gly Ala Gly Glu Glu Glu
130 135 140
Glu Glu Glu Glu Glu Leu Gln Arg Met Leu Pro Ser Leu Ser Leu Thr
145 150 155 160
Glu Asp Val Lys Trp Pro Pro Thr Leu Gln Pro Pro Thr Leu Arg Pro
165 170 175
Pro Thr Leu Gln Pro Pro Thr Leu Gln Pro Pro Val Val Leu Gly Pro
180 185 190
Pro Ala Pro Asp Pro Ser Pro Leu Ala Pro Pro Pro Gly Asn Pro Ala
195 200 205
Gly Phe Arg Glu Leu Leu Ser Glu Val Leu Glu Pro Gly Pro Leu Pro
210 215 220
Ala Ser Leu Pro Pro Ala Gly Glu Gln Leu Leu Pro Asp Leu Leu Ile
225 230 235 240
Ser Pro His Met Leu Pro Leu Thr Asp Leu Glu Ile Lys Phe Gln Tyr
245 250 255
Arg Gly Arg Pro Pro Arg Ala Leu Thr Ile Ser Asn Pro His Gly Cys
260 265 270
Arg Leu Phe Tyr Ser Gln Leu Glu Ala Thr Gln Glu Gln Val Glu Leu
275 280 285
Phe Gly Pro Ile Ser Leu Glu Gln Val Arg Phe Pro Ser Pro Glu Asp
290 295 300
Ile Pro Ser Asp Lys Gln Arg Phe Tyr Thr Asn Gln Leu Leu Asp Val
305 310 315 320
Leu Asp Arg Gly Leu Ile Leu Gln Leu Gln Gly Gln Asp Leu Tyr Ala
325 330 335
Ile Arg Leu Cys Gln Cys Lys Val Phe Trp Ser Gly Pro Cys Ala Ser
340 345 350
Ala His Asp Ser Cys Pro Asn Pro Ile Gln Arg Glu Val Lys Thr Lys
355 360 365
Leu Phe Ser Leu Glu His Phe Leu Asn Glu Leu Ile Leu Phe Gln Lys
370 375 380
Gly Gln Thr Asn Thr Pro Pro Pro Phe Glu Ile Phe Phe Cys Phe Gly
385 390 395 400
Glu Glu Trp Pro Asp Arg Lys Pro Arg Glu Lys Lys Leu Ile Thr Val
405 410 415
Gln Val Val Pro Val Ala Ala Arg Leu Leu Leu Glu Met Phe Ser Gly
420 425 430
Glu Leu Ser Trp Ser Ala Asp Ser Ile Arg Leu Gln Ile Ser Asn Pro
435 440 445
Asp Leu Lys Asp Arg Met Val Glu Gln Phe Lys Glu Leu His His Ile
450 455 460
Trp Gln Ser Gln Gln Arg Leu Gln Pro Val Ala Gln Ala Pro Pro Gly
465 470 475 480
Ala Gly Leu Gly Val Gly Gln Gly Pro Trp Pro Met His Pro Ala Gly
485 490 495
Met Gln
<210> 26
<211> 514
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 26
Met Asn Gln Ser Ile Pro Val Ala Pro Thr Pro Pro Arg Arg Val Arg
1 5 10 15
Leu Lys Pro Trp Leu Val Ala Gln Val Asn Ser Cys Gln Tyr Pro Gly
20 25 30
Leu Gln Trp Val Asn Gly Glu Lys Lys Leu Phe Cys Ile Pro Trp Arg
35 40 45
His Ala Thr Arg His Gly Pro Ser Gln Asp Gly Asp Asn Thr Ile Phe
50 55 60
Lys Ala Trp Ala Lys Glu Thr Gly Lys Tyr Thr Glu Gly Val Asp Glu
65 70 75 80
Ala Asp Pro Ala Lys Trp Lys Ala Asn Leu Arg Cys Ala Leu Asn Lys
85 90 95
Ser Arg Asp Phe Arg Leu Ile Tyr Asp Gly Pro Arg Asp Met Pro Pro
100 105 110
Gln Pro Tyr Lys Ile Tyr Glu Val Cys Ser Asn Gly Pro Ala Pro Thr
115 120 125
Asp Ser Gln Pro Pro Glu Asp Tyr Ser Phe Gly Ala Gly Glu Glu Glu
130 135 140
Glu Glu Glu Glu Glu Leu Gln Arg Met Leu Pro Ser Leu Ser Leu Thr
145 150 155 160
Asp Ala Val Gln Ser Gly Pro His Met Thr Pro Tyr Ser Leu Leu Lys
165 170 175
Glu Asp Val Lys Trp Pro Pro Thr Leu Gln Pro Pro Thr Leu Arg Pro
180 185 190
Pro Thr Leu Gln Pro Pro Thr Leu Gln Pro Pro Val Val Leu Gly Pro
195 200 205
Pro Ala Pro Asp Pro Ser Pro Leu Ala Pro Pro Pro Gly Asn Pro Ala
210 215 220
Gly Phe Arg Glu Leu Leu Ser Glu Val Leu Glu Pro Gly Pro Leu Pro
225 230 235 240
Ala Ser Leu Pro Pro Ala Gly Glu Gln Leu Leu Pro Asp Leu Leu Ile
245 250 255
Ser Pro His Met Leu Pro Leu Thr Asp Leu Glu Ile Lys Phe Gln Tyr
260 265 270
Arg Gly Arg Pro Pro Arg Ala Leu Thr Ile Ser Asn Pro His Gly Cys
275 280 285
Arg Leu Phe Tyr Ser Gln Leu Glu Ala Thr Gln Glu Gln Val Glu Leu
290 295 300
Phe Gly Pro Ile Ser Leu Glu Gln Val Arg Phe Pro Ser Pro Glu Asp
305 310 315 320
Ile Pro Ser Asp Lys Gln Arg Phe Tyr Thr Asn Gln Leu Leu Asp Val
325 330 335
Leu Asp Arg Gly Leu Ile Leu Gln Leu Gln Gly Gln Asp Leu Tyr Ala
340 345 350
Ile Arg Leu Cys Gln Cys Lys Val Phe Trp Ser Gly Pro Cys Ala Ser
355 360 365
Ala His Asp Ser Cys Pro Asn Pro Ile Gln Arg Glu Val Lys Thr Lys
370 375 380
Leu Phe Ser Leu Glu His Phe Leu Asn Glu Leu Ile Leu Phe Gln Lys
385 390 395 400
Gly Gln Thr Asn Thr Pro Pro Pro Phe Glu Ile Phe Phe Cys Phe Gly
405 410 415
Glu Glu Trp Pro Asp Arg Lys Pro Arg Glu Lys Lys Leu Ile Thr Val
420 425 430
Gln Val Val Pro Val Ala Ala Arg Leu Leu Leu Glu Met Phe Ser Gly
435 440 445
Glu Leu Ser Trp Ser Ala Asp Ser Ile Arg Leu Gln Ile Ser Asn Pro
450 455 460
Asp Leu Lys Asp Arg Met Val Glu Gln Phe Lys Glu Leu His His Ile
465 470 475 480
Trp Gln Ser Gln Gln Arg Leu Gln Pro Val Ala Gln Ala Pro Pro Gly
485 490 495
Ala Gly Leu Gly Val Gly Gln Gly Pro Trp Pro Met His Pro Ala Gly
500 505 510
Met Gln
<210> 27
<211> 504
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 27
Met Asn Gln Ser Ile Pro Val Ala Pro Thr Pro Pro Arg Arg Val Arg
1 5 10 15
Leu Lys Pro Trp Leu Val Ala Gln Val Asn Ser Cys Gln Tyr Pro Gly
20 25 30
Leu Gln Trp Val Asn Gly Glu Lys Lys Leu Phe Cys Ile Pro Trp Arg
35 40 45
His Ala Thr Arg His Gly Pro Ser Gln Asp Gly Asp Asn Thr Ile Phe
50 55 60
Lys Ala Trp Ala Lys Glu Thr Gly Lys Tyr Thr Glu Gly Val Asp Glu
65 70 75 80
Ala Asp Pro Ala Lys Trp Lys Ala Asn Leu Arg Cys Ala Leu Asn Lys
85 90 95
Ser Arg Asp Phe Arg Leu Ile Tyr Asp Gly Pro Arg Asp Met Pro Pro
100 105 110
Gln Pro Tyr Lys Ile Tyr Glu Val Cys Ser Asn Gly Pro Ala Pro Thr
115 120 125
Asp Ser Gln Pro Pro Glu Asp Tyr Ser Phe Gly Ala Gly Glu Glu Glu
130 135 140
Glu Glu Glu Glu Glu Leu Gln Arg Met Leu Pro Ser Leu Ser Leu Thr
145 150 155 160
Asp Ala Val Gln Ser Gly Pro His Met Thr Pro Tyr Ser Leu Leu Lys
165 170 175
Glu Asp Val Lys Trp Pro Pro Thr Leu Gln Pro Pro Thr Leu Gln Pro
180 185 190
Pro Val Val Leu Gly Pro Pro Ala Pro Asp Pro Ser Pro Leu Ala Pro
195 200 205
Pro Pro Gly Asn Pro Ala Gly Phe Arg Glu Leu Leu Ser Glu Val Leu
210 215 220
Glu Pro Gly Pro Leu Pro Ala Ser Leu Pro Pro Ala Gly Glu Gln Leu
225 230 235 240
Leu Pro Asp Leu Leu Ile Ser Pro His Met Leu Pro Leu Thr Asp Leu
245 250 255
Glu Ile Lys Phe Gln Tyr Arg Gly Arg Pro Pro Arg Ala Leu Thr Ile
260 265 270
Ser Asn Pro His Gly Cys Arg Leu Phe Tyr Ser Gln Leu Glu Ala Thr
275 280 285
Gln Glu Gln Val Glu Leu Phe Gly Pro Ile Ser Leu Glu Gln Val Arg
290 295 300
Phe Pro Ser Pro Glu Asp Ile Pro Ser Asp Lys Gln Arg Phe Tyr Thr
305 310 315 320
Asn Gln Leu Leu Asp Val Leu Asp Arg Gly Leu Ile Leu Gln Leu Gln
325 330 335
Gly Gln Asp Leu Tyr Ala Ile Arg Leu Cys Gln Cys Lys Val Phe Trp
340 345 350
Ser Gly Pro Cys Ala Ser Ala His Asp Ser Cys Pro Asn Pro Ile Gln
355 360 365
Arg Glu Val Lys Thr Lys Leu Phe Ser Leu Glu His Phe Leu Asn Glu
370 375 380
Leu Ile Leu Phe Gln Lys Gly Gln Thr Asn Thr Pro Pro Pro Phe Glu
385 390 395 400
Ile Phe Phe Cys Phe Gly Glu Glu Trp Pro Asp Arg Lys Pro Arg Glu
405 410 415
Lys Lys Leu Ile Thr Val Gln Val Val Pro Val Ala Ala Arg Leu Leu
420 425 430
Leu Glu Met Phe Ser Gly Glu Leu Ser Trp Ser Ala Asp Ser Ile Arg
435 440 445
Leu Gln Ile Ser Asn Pro Asp Leu Lys Asp Arg Met Val Glu Gln Phe
450 455 460
Lys Glu Leu His His Ile Trp Gln Ser Gln Gln Arg Leu Gln Pro Val
465 470 475 480
Ala Gln Ala Pro Pro Gly Ala Gly Leu Gly Val Gly Gln Gly Pro Trp
485 490 495
Pro Met His Pro Ala Gly Met Gln
500
<210> 28
<211> 488
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 28
Met Asn Gln Ser Ile Pro Val Ala Pro Thr Pro Pro Arg Arg Val Arg
1 5 10 15
Leu Lys Pro Trp Leu Val Ala Gln Val Asn Ser Cys Gln Tyr Pro Gly
20 25 30
Leu Gln Trp Val Asn Gly Glu Lys Lys Leu Phe Cys Ile Pro Trp Arg
35 40 45
His Ala Thr Arg His Gly Pro Ser Gln Asp Gly Asp Asn Thr Ile Phe
50 55 60
Lys Ala Trp Ala Lys Glu Thr Gly Lys Tyr Thr Glu Gly Val Asp Glu
65 70 75 80
Ala Asp Pro Ala Lys Trp Lys Ala Asn Leu Arg Cys Ala Leu Asn Lys
85 90 95
Ser Arg Asp Phe Arg Leu Ile Tyr Asp Gly Pro Arg Asp Met Pro Pro
100 105 110
Gln Pro Tyr Lys Ile Tyr Glu Val Cys Ser Asn Gly Pro Ala Pro Thr
115 120 125
Asp Ser Gln Pro Pro Glu Asp Tyr Ser Phe Gly Ala Gly Glu Glu Glu
130 135 140
Glu Glu Glu Glu Glu Leu Gln Arg Met Leu Pro Ser Leu Ser Leu Thr
145 150 155 160
Glu Asp Val Lys Trp Pro Pro Thr Leu Gln Pro Pro Thr Leu Gln Pro
165 170 175
Pro Val Val Leu Gly Pro Pro Ala Pro Asp Pro Ser Pro Leu Ala Pro
180 185 190
Pro Pro Gly Asn Pro Ala Gly Phe Arg Glu Leu Leu Ser Glu Val Leu
195 200 205
Glu Pro Gly Pro Leu Pro Ala Ser Leu Pro Pro Ala Gly Glu Gln Leu
210 215 220
Leu Pro Asp Leu Leu Ile Ser Pro His Met Leu Pro Leu Thr Asp Leu
225 230 235 240
Glu Ile Lys Phe Gln Tyr Arg Gly Arg Pro Pro Arg Ala Leu Thr Ile
245 250 255
Ser Asn Pro His Gly Cys Arg Leu Phe Tyr Ser Gln Leu Glu Ala Thr
260 265 270
Gln Glu Gln Val Glu Leu Phe Gly Pro Ile Ser Leu Glu Gln Val Arg
275 280 285
Phe Pro Ser Pro Glu Asp Ile Pro Ser Asp Lys Gln Arg Phe Tyr Thr
290 295 300
Asn Gln Leu Leu Asp Val Leu Asp Arg Gly Leu Ile Leu Gln Leu Gln
305 310 315 320
Gly Gln Asp Leu Tyr Ala Ile Arg Leu Cys Gln Cys Lys Val Phe Trp
325 330 335
Ser Gly Pro Cys Ala Ser Ala His Asp Ser Cys Pro Asn Pro Ile Gln
340 345 350
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355 360 365
Leu Ile Leu Phe Gln Lys Gly Gln Thr Asn Thr Pro Pro Pro Phe Glu
370 375 380
Ile Phe Phe Cys Phe Gly Glu Glu Trp Pro Asp Arg Lys Pro Arg Glu
385 390 395 400
Lys Lys Leu Ile Thr Val Gln Val Val Pro Val Ala Ala Arg Leu Leu
405 410 415
Leu Glu Met Phe Ser Gly Glu Leu Ser Trp Ser Ala Asp Ser Ile Arg
420 425 430
Leu Gln Ile Ser Asn Pro Asp Leu Lys Asp Arg Met Val Glu Gln Phe
435 440 445
Lys Glu Leu His His Ile Trp Gln Ser Gln Gln Arg Leu Gln Pro Val
450 455 460
Ala Gln Ala Pro Pro Gly Ala Gly Leu Gly Val Gly Gln Gly Pro Trp
465 470 475 480
Pro Met His Pro Ala Gly Met Gln
485
<210> 29
<211> 412
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 29
Met Asn Gln Ser Ile Pro Val Ala Pro Thr Pro Pro Arg Arg Val Arg
1 5 10 15
Leu Lys Pro Trp Leu Val Ala Gln Val Asn Ser Cys Gln Tyr Pro Gly
20 25 30
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85 90 95
Ser Arg Asp Phe Arg Leu Ile Tyr Asp Gly Pro Arg Asp Met Pro Pro
100 105 110
Gln Pro Tyr Lys Ile Tyr Glu Val Cys Ser Asn Gly Pro Ala Pro Thr
115 120 125
Asp Ser Gln Pro Pro Glu Asp Tyr Ser Phe Gly Ala Gly Glu Glu Glu
130 135 140
Glu Glu Glu Glu Glu Leu Gln Arg Met Leu Pro Ser Leu Ser Leu Thr
145 150 155 160
Val Thr Asp Leu Glu Ile Lys Phe Gln Tyr Arg Gly Arg Pro Pro Arg
165 170 175
Ala Leu Thr Ile Ser Asn Pro His Gly Cys Arg Leu Phe Tyr Ser Gln
180 185 190
Leu Glu Ala Thr Gln Glu Gln Val Glu Leu Phe Gly Pro Ile Ser Leu
195 200 205
Glu Gln Val Arg Phe Pro Ser Pro Glu Asp Ile Pro Ser Asp Lys Gln
210 215 220
Arg Phe Tyr Thr Asn Gln Leu Leu Asp Val Leu Asp Arg Gly Leu Ile
225 230 235 240
Leu Gln Leu Gln Gly Gln Asp Leu Tyr Ala Ile Arg Leu Cys Gln Cys
245 250 255
Lys Val Phe Trp Ser Gly Pro Cys Ala Ser Ala His Asp Ser Cys Pro
260 265 270
Asn Pro Ile Gln Arg Glu Val Lys Thr Lys Leu Phe Ser Leu Glu His
275 280 285
Phe Leu Asn Glu Leu Ile Leu Phe Gln Lys Gly Gln Thr Asn Thr Pro
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305 310 315 320
Lys Pro Arg Glu Lys Lys Leu Ile Thr Val Gln Val Val Pro Val Ala
325 330 335
Ala Arg Leu Leu Leu Glu Met Phe Ser Gly Glu Leu Ser Trp Ser Ala
340 345 350
Asp Ser Ile Arg Leu Gln Ile Ser Asn Pro Asp Leu Lys Asp Arg Met
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Val Glu Gln Phe Lys Glu Leu His His Ile Trp Gln Ser Gln Gln Arg
370 375 380
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Gln Gly Pro Trp Pro Met His Pro Ala Gly Met Gln
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<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 30
Met Asn Gln Ser Ile Pro Val Ala Pro Thr Pro Pro Arg Arg Val Arg
1 5 10 15
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Leu Gln Trp Val Asn Gly Glu Lys Lys Leu Phe Cys Ile Pro Trp Arg
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50 55 60
Lys Ala Trp Ala Lys Glu Thr Gly Lys Tyr Thr Glu Gly Val Asp Glu
65 70 75 80
Ala Asp Pro Ala Lys Trp Lys Ala Asn Leu Arg Cys Ala Leu Asn Lys
85 90 95
Ser Arg Asp Phe Arg Leu Ile Tyr Asp Gly Pro Arg Asp Met Pro Pro
100 105 110
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115 120 125
Leu Val Gln Glu Arg Arg Arg Lys Lys Arg Lys Ser Cys Arg Gly Cys
130 135 140
Cys Gln Ala
145
<210> 31
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<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 31
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1 5 10 15
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Leu Gln Trp Val Asn Gly Glu Lys Lys Leu Phe Tyr Ile Pro Trp Arg
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50 55 60
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Ala Asp Pro Ala Lys Trp Lys Ala Asn Leu Arg Cys Ala Leu Asn Lys
85 90 95
Ser Arg Asp Phe Gln Leu Phe Tyr Asp Gly Pro Arg Asp Met Pro Pro
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115 120 125
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165 170 175
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195 200 205
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210 215 220
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245 250 255
Gly Arg Ala Pro Arg Thr Leu Thr Ile Ser Asn Pro Gln Gly Cys Arg
260 265 270
Leu Phe Tyr Ser Gln Leu Glu Ala Thr Gln Glu Gln Val Glu Leu Phe
275 280 285
Gly Pro Val Thr Leu Glu Gln Val Arg Phe Pro Ser Pro Glu Asp Ile
290 295 300
Pro Ser Asp Lys Gln Arg Phe Tyr Thr Asn Gln Leu Leu Asp Val Leu
305 310 315 320
Asp Arg Gly Leu Ile Leu Gln Leu Gln Gly Gln Asp Leu Tyr Ala Ile
325 330 335
Arg Leu Cys Gln Cys Lys Val Phe Trp Ser Gly Pro Cys Ala Leu Ala
340 345 350
His Gly Ser Cys Pro Asn Pro Ile Gln Arg Glu Val Lys Thr Lys Leu
355 360 365
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370 375 380
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385 390 395 400
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Leu Lys Asp His Met Val Glu Gln Phe Lys Glu Leu His His Leu Trp
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Gln Ser Gln Gln Gln Leu Gln Pro Met Val Gln Ala Pro Pro Val Ala
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Gly Leu Asp Ala Ser Gln Gly Pro Trp Pro Met His Pro Val Gly Met
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Gln
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<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 32
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Ile Pro Cys Ala Pro
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<212> PRT
<213> Homo sapiens
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<213> Homo sapiens
<400> 34
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1 5 10 15
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245 250 255
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260 265 270
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340 345 350
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370 375 380
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Phe Arg Ala Arg Gln Arg Arg Gly Ser Pro Arg Tyr Thr Ile Tyr Leu
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Gly Phe Gly Gln Asp Leu Ser Ala Gly Arg Pro Lys Glu Lys Ser Leu
435 440 445
Val Leu Val Lys Leu Glu Pro Trp Leu Cys Arg Val His Leu Glu Gly
450 455 460
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Cys Leu Ser Ser Ala Asn Ser Leu Tyr Asp Asp Ile Glu Cys Phe Leu
485 490 495
Met Glu Leu Glu Gln Pro Ala
500
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<213> Homo sapiens
<400> 35
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35 40 45
Asn Gln Glu Val Asp Ala Ser Ile Phe Lys Ala Trp Ala Val Phe Lys
50 55 60
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65 70 75 80
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115 120 125
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Glu Leu Ile Lys Glu Pro Ser Val Asp Asp Tyr Met Gly Met Ile Lys
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Leu Tyr Gly Pro Glu Gly Leu Glu Leu Val Arg Phe Pro Pro Ala Asp
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260 265 270
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275 280 285
Val Lys Arg Leu Cys Gln Gly Arg Val Phe Cys Ser Gly Asn Ala Val
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Val Cys Lys Gly Arg Pro Asn Lys Leu Glu Arg Asp Glu Val Val Gln
305 310 315 320
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325 330 335
Ser Gln Gly Arg Leu Pro Asp Gly Arg Val Val Leu Cys Phe Gly Glu
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<213> Mus musculus
<400> 36
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Arg Asp Thr Lys Ser Lys Thr Lys Arg Lys Leu Cys Gly Asp Val Ser
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Glu Arg Asp Ile Thr Pro Ala Leu Ser Pro Cys Val Val Ser Ser Ser
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195 200 205
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Gly Ile Gly Ile Gln His Val Phe Thr Glu Met Lys Asn Met Asp Ser
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Ser Ile Gln Ala Ile Pro Cys Ala Pro
325
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<213> Mus musculus
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275 280 285
Gly Glu Glu Leu Leu Pro Asp Ser Gly Arg Gly Pro Asp Gly Glu Val
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His Lys Asp Lys Asp Gly Ala Val Phe Asp Leu Arg Pro Phe Val Ala
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Asp Leu Ile Ala Phe Met Glu Gly Ser Gly His Ser Pro Arg Tyr Thr
325 330 335
Leu Trp Phe Cys Met Gly Glu Met Trp Pro Gln Asp Gln Pro Trp Val
340 345 350
Lys Arg Leu Val Met Val Lys Val Val Pro Thr Cys Leu Lys Glu Leu
355 360 365
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Lys Ala Tyr Leu Gln Asp Leu Val Glu Asp Met Asp Phe Gln Ala Thr
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Gly Asn Ile
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<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 38
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50 55 60
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65 70 75 80
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85 90 95
Cys Ala Leu His Ser Thr Gly Arg Phe Ile Leu Arg Gln Asp Asn Ser
100 105 110
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115 120 125
Gly Ser Thr Val Gly Pro Ala Thr Glu Asn Arg Glu Glu Val Ser Leu
130 135 140
Ser Asn Ala Leu Pro Thr Gln Gly Val Ser Pro Gly Ser Phe Leu Ala
145 150 155 160
Arg Glu Asn Ala Gly Leu Gln Thr Pro Ser Pro Leu Leu Ser Ser Asp
165 170 175
Ala Gly Asp Leu Leu Leu Gln Val Leu Gln Tyr Ser His Ile Leu Glu
180 185 190
Ser Glu Ser Gly Ala Asp Pro Val Pro Pro Gln Ala Pro Gly Gln Glu
195 200 205
Gln Asp Arg Val Tyr Glu Glu Pro Tyr Ala Ala Trp Gln Val Glu Ala
210 215 220
Val Pro Ser Pro Arg Pro Gln Gln Pro Ala Leu Thr Glu Arg Ser Leu
225 230 235 240
Gly Phe Leu Asp Val Thr Ile Met Tyr Lys Gly Arg Thr Val Leu Gln
245 250 255
Ala Val Val Gly His Pro Arg Cys Val Phe Leu Tyr Ser Pro Met Ala
260 265 270
Pro Ala Val Arg Thr Ser Glu Pro Gln Pro Val Ile Phe Pro Ser Pro
275 280 285
Ala Glu Leu Pro Asp Gln Lys Gln Leu His Tyr Thr Glu Thr Leu Leu
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450 455
<210> 39
<211> 525
<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 39
Met Ala Glu Val Arg Gly Val Gln Arg Val Leu Phe Gly Asp Trp Leu
1 5 10 15
Leu Gly Glu Val Ser Ser Gly Gln Tyr Glu Gly Leu Gln Trp Leu Asn
20 25 30
Glu Ala Arg Thr Val Phe Arg Val Pro Trp Lys His Phe Gly Arg Arg
35 40 45
Asp Leu Asp Glu Glu Asp Ala Gln Ile Phe Lys Ala Trp Ala Val Ala
50 55 60
Arg Gly Arg Trp Pro Pro Ser Gly Val Asn Leu Pro Pro Pro Glu Ala
65 70 75 80
Glu Ala Ala Glu Arg Arg Glu Arg Arg Gly Trp Lys Thr Asn Phe Arg
85 90 95
Cys Ala Leu His Ser Thr Gly Arg Phe Ile Leu Arg Gln Asp Asn Ser
100 105 110
Gly Asp Pro Val Asp Pro His Lys Val Tyr Glu Leu Ser Arg Glu Leu
115 120 125
Gly Ser Thr Val Gly Pro Ala Thr Glu Asn Arg Glu Glu Val Ser Leu
130 135 140
Ser Asn Ala Leu Pro Thr Gln Gly Val Ser Pro Gly Ser Phe Leu Ala
145 150 155 160
Arg Glu Asn Ala Gly Leu Gln Thr Pro Ser Pro Leu Leu Ser Ser Asp
165 170 175
Ala Gly Asp Leu Leu Leu Gln Val Leu Gln Tyr Ser His Ile Leu Glu
180 185 190
Ser Glu Ser Gly Ala Asp Pro Val Pro Pro Gln Ala Pro Gly Gln Glu
195 200 205
Gln Asp Arg Val Tyr Glu Glu Pro Tyr Ala Ala Trp Gln Val Glu Ala
210 215 220
Val Pro Ser Pro Arg Pro Gln Gln Pro Ala Leu Thr Glu Arg Ser Leu
225 230 235 240
Gly Phe Leu Asp Val Thr Lys Leu Phe Asp Gly Leu Ile Leu Gly Pro
245 250 255
Leu Lys Asp Glu Gly Ser Ser Asp Leu Ala Ile Val Ser Asp Pro Ser
260 265 270
Gln Gln Leu Pro Ser Pro Asn Val Asn Asn Phe Leu Asn Pro Ala Pro
275 280 285
Gln Glu Asn Pro Leu Lys Gln Leu Leu Ala Glu Glu Gln Trp Glu Phe
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Phe Cys Pro Gly Gly Leu Arg Leu Val Gly Ser Thr Ala Asp Met Thr
325 330 335
Leu Pro Trp Gln Pro Val Thr Leu Pro Asp Pro Glu Gly Phe Leu Thr
340 345 350
Asp Lys Leu Val Lys Glu Tyr Val Gly Gln Val Leu Lys Gly Leu Gly
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Leu Gly His Ser His Ala Phe Trp Ala Leu Gly Glu Glu Leu Leu Pro
385 390 395 400
Asp Ser Gly Arg Gly Pro Asp Gly Glu Val His Lys Asp Lys Asp Gly
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Ala Val Phe Asp Leu Arg Pro Phe Val Ala Asp Leu Ile Ala Phe Met
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Glu Gly Ser Gly His Ser Pro Arg Tyr Thr Leu Trp Phe Cys Met Gly
435 440 445
Glu Met Trp Pro Gln Asp Gln Pro Trp Val Lys Arg Leu Val Met Val
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Lys Val Val Pro Thr Cys Leu Lys Glu Leu Leu Glu Met Ala Arg Glu
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Gly Gly Ala Ser Ser Leu Lys Thr Val Asp Leu His Ile Asp Asn Asp
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Leu Val Glu Asp Met Asp Phe Gln Ala Thr Gly Asn Ile
515 520 525
<210> 40
<211> 424
<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 40
Met Cys Asp Arg Asn Gly Gly Arg Arg Leu Arg Gln Trp Leu Ile Glu
1 5 10 15
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50 55 60
Gly Lys Phe Lys Glu Gly Asp Lys Ala Glu Pro Ala Thr Trp Lys Thr
65 70 75 80
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100 105 110
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115 120 125
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130 135 140
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Arg Ser Pro Ser Pro Pro Glu Ala Cys Arg Ser Gln Ile Leu Pro Asp
165 170 175
Trp Trp Val Gln Gln Pro Ser Ala Gly Leu Pro Leu Val Thr Gly Tyr
180 185 190
Ala Ala Tyr Asp Thr His His Ser Ala Phe Ser Gln Met Val Ile Ser
195 200 205
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Glu Gly Cys Arg Leu Ser Leu Ser Gln Pro Gly Leu Pro Lys Leu Tyr
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Gly Pro Asp Gly Leu Glu Pro Val Cys Phe Pro Thr Ala Asp Thr Ile
245 250 255
Pro Ser Glu Arg Gln Arg Gln Val Thr Arg Lys Leu Phe Gly His Leu
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Glu Arg Gly Val Leu Leu His Ser Asn Arg Lys Gly Val Phe Val Lys
275 280 285
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325 330 335
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420
<210> 41
<211> 424
<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 41
Met Cys Asp Arg Asn Gly Gly Arg Arg Leu Arg Gln Trp Leu Ile Glu
1 5 10 15
Gln Ile Asp Ser Ser Met Tyr Pro Gly Leu Ile Trp Glu Asn Asp Glu
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Asn Gln Glu Val Asp Ala Ser Ile Phe Lys Ala Trp Ala Val Phe Lys
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Arg Leu Arg Cys Ala Leu Asn Lys Ser Pro Asp Phe Glu Glu Val Thr
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Asp Arg Ser Gln Leu Asp Ile Ser Glu Pro Tyr Lys Val Tyr Arg Ile
100 105 110
Val Pro Glu Glu Glu Gln Lys Cys Lys Leu Gly Val Ala Pro Ala Gly
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Trp Trp Val Gln Gln Pro Ser Ala Gly Leu Pro Leu Val Thr Gly Tyr
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Pro Ser Glu Arg Gln Arg Gln Val Thr Arg Lys Leu Phe Gly His Leu
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420
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<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 42
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1 5 10 15
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Asn Cys Cys Gly Leu Arg Glu Gly Ala Ile Leu Thr Leu Leu Ser Asp
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Ile His Lys Ile Ile Asp Leu Gly Tyr Ala Lys Glu Leu Asp Gln Gly
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Leu Leu Glu Gln Gln Lys Tyr Thr Val Thr Val Asp Tyr Trp Ser Phe
195 200 205
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Val Asp Ile Val Val Ser Glu Asp Leu Asn Gly Thr Val Lys Phe Ser
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275 280 285
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305 310 315 320
Thr Ile His Thr Tyr Pro Val Thr Glu Asp Glu Ser Leu Gln Ser Leu
325 330 335
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355 360 365
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420 425 430
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435 440 445
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450 455 460
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500 505 510
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515 520 525
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530 535 540
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580 585 590
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Pro Asp Ser Met Asn Ala Ser Arg Leu Ser Gln Pro Gly Gln Leu Met
675 680 685
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Ser Glu Glu Leu Val Ala Glu Ala His Asn Leu Cys Thr Leu Leu Glu
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725 730 735
Leu Asp Trp Ser Trp Leu Gln Thr Glu Glu Glu Glu His Ser Cys Leu
740 745 750
Glu Gln Ala Ser
755
<210> 43
<211> 754
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 43
Met Phe Ser Gly Gly Cys His Ser Pro Gly Phe Gly Arg Pro Ser Pro
1 5 10 15
Ala Phe Pro Ala Pro Gly Ser Pro Pro Pro Ala Pro Arg Pro Cys Arg
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Ser Pro Arg Asn Arg Glu Arg Trp Cys Leu Glu Ile Gln Ile Met Arg
50 55 60
Arg Leu Thr His Pro Asn Val Val Ala Ala Arg Asp Val Pro Glu Gly
65 70 75 80
Met Gln Asn Leu Ala Pro Asn Asp Leu Pro Leu Leu Ala Met Glu Tyr
85 90 95
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100 105 110
Cys Gly Leu Arg Glu Gly Ala Ile Leu Thr Leu Leu Ser Asp Ile Ala
115 120 125
Ser Ala Leu Arg Tyr Leu His Glu Asn Arg Ile Ile His Arg Asp Leu
130 135 140
Lys Pro Glu Asn Ile Val Leu Gln Gln Gly Glu Gln Arg Leu Ile His
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Lys Ile Ile Asp Leu Gly Tyr Ala Lys Glu Leu Asp Gln Gly Ser Leu
165 170 175
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195 200 205
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Gln Pro Val Gln Trp His Ser Lys Val Arg Gln Lys Ser Glu Val Asp
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Ile Val Val Ser Glu Asp Leu Asn Gly Thr Val Lys Phe Ser Ser Ser
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Leu Pro Tyr Pro Asn Asn Leu Asn Ser Val Leu Ala Glu Arg Leu Glu
260 265 270
Lys Trp Leu Gln Leu Met Leu Met Trp His Pro Arg Gln Arg Gly Thr
275 280 285
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340 345 350
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355 360 365
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435 440 445
Gln Arg Ala Ala Met Met Asn Leu Leu Arg Asn Asn Ser Cys Leu Ser
450 455 460
Lys Met Lys Asn Ser Met Ala Ser Met Ser Gln Gln Leu Lys Ala Lys
465 470 475 480
Leu Asp Phe Phe Lys Thr Ser Ile Gln Ile Asp Leu Glu Lys Tyr Ser
485 490 495
Glu Gln Thr Glu Phe Gly Ile Thr Ser Asp Lys Leu Leu Leu Ala Trp
500 505 510
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515 520 525
Lys Leu Leu Val Glu Arg Met Met Ala Leu Gln Thr Asp Ile Val Asp
530 535 540
Leu Gln Arg Ser Pro Met Gly Arg Lys Gln Gly Gly Thr Leu Asp Asp
545 550 555 560
Leu Glu Glu Gln Ala Arg Glu Leu Tyr Arg Arg Leu Arg Glu Lys Pro
565 570 575
Arg Asp Gln Arg Thr Glu Gly Asp Ser Gln Glu Met Val Arg Leu Leu
580 585 590
Leu Gln Ala Ile Gln Ser Phe Glu Lys Lys Val Arg Val Ile Tyr Thr
595 600 605
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Pro Lys Val Glu Glu Val Val Ser Leu Met Asn Glu Asp Glu Lys Thr
625 630 635 640
Val Val Arg Leu Gln Glu Lys Arg Gln Lys Glu Leu Trp Asn Leu Leu
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Lys Ile Ala Cys Ser Lys Val Arg Gly Pro Val Ser Gly Ser Pro Asp
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Ser Met Asn Ala Ser Arg Leu Ser Gln Pro Gly Gln Leu Met Ser Gln
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Trp Ser Trp Leu Gln Thr Glu Glu Glu Glu His Ser Cys Leu Glu Gln
740 745 750
Ala Ser
<210> 44
<211> 256
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 44
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<210> 45
<211> 697
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 45
Met Ser Ser Asp Gly Thr Ile Arg Leu Thr His Pro Asn Val Val Ala
1 5 10 15
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35 40 45
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100 105 110
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115 120 125
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130 135 140
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145 150 155 160
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165 170 175
Arg Gln Lys Ser Glu Val Asp Ile Val Val Ser Glu Asp Leu Asn Gly
180 185 190
Thr Val Lys Phe Ser Ser Ser Leu Pro Tyr Pro Asn Asn Leu Asn Ser
195 200 205
Val Leu Ala Glu Arg Leu Glu Lys Trp Leu Gln Leu Met Leu Met Trp
210 215 220
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225 230 235 240
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245 250 255
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Ser Leu Gln Ser Leu Lys Ala Arg Ile Gln Gln Asp Thr Gly Ile Pro
275 280 285
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290 295 300
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305 310 315 320
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325 330 335
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355 360 365
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370 375 380
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385 390 395 400
Arg Asn Asn Ser Cys Leu Ser Lys Met Lys Asn Ser Met Ala Ser Met
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580 585 590
Lys Glu Leu Trp Asn Leu Leu Lys Ile Ala Cys Ser Lys Val Arg Gly
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<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 46
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1 5 10 15
Met Lys Glu Arg Leu Gly Thr Gly Gly Phe Gly Asn Val Ile Arg Trp
20 25 30
His Asn Gln Ala Thr Gly Glu Gln Ile Ala Ile Lys Gln Cys Arg Gln
35 40 45
Glu Leu Ser Pro Lys Asn Arg Asp Arg Trp Cys Leu Glu Ile Gln Ile
50 55 60
Met Arg Arg Leu Asn His Pro Asn Val Val Ala Ala Arg Asp Val Pro
65 70 75 80
Glu Gly Met Gln Asn Leu Ala Pro Asn Asp Leu Pro Leu Leu Ala Met
85 90 95
Glu Tyr Cys Gln Gly Gly Asp Leu Arg Arg Tyr Leu Asn Gln Phe Glu
100 105 110
Asn Cys Cys Gly Leu Arg Glu Gly Ala Val Leu Thr Leu Leu Ser Asp
115 120 125
Ile Ala Ser Ala Leu Arg Tyr Leu His Glu Asn Arg Ile Ile His Arg
130 135 140
Asp Leu Lys Pro Glu Asn Ile Val Leu Gln Gln Gly Glu Lys Arg Leu
145 150 155 160
Ile His Lys Ile Ile Asp Leu Gly Tyr Ala Lys Glu Leu Asp Gln Gly
165 170 175
Ser Leu Cys Thr Ser Phe Val Gly Thr Leu Gln Tyr Leu Ala Pro Glu
180 185 190
Leu Leu Glu Gln Gln Lys Tyr Thr Val Thr Val Asp Tyr Trp Ser Phe
195 200 205
Gly Thr Leu Ala Phe Glu Cys Ile Thr Gly Phe Arg Pro Phe Leu Pro
210 215 220
Asn Trp Gln Pro Val Gln Trp His Ser Lys Val Arg Gln Lys Ser Glu
225 230 235 240
Val Asp Ile Val Val Ser Glu Asp Leu Asn Gly Ala Val Lys Phe Ser
245 250 255
Ser Ser Leu Pro Phe Pro Asn Asn Leu Asn Ser Val Leu Ala Glu Arg
260 265 270
Leu Glu Lys Trp Leu Gln Leu Met Leu Met Trp His Pro Arg Gln Arg
275 280 285
Gly Thr Asp Pro Gln Tyr Gly Pro Asn Gly Cys Phe Arg Ala Leu Asp
290 295 300
Asp Ile Leu Asn Leu Lys Leu Val His Val Leu Asn Met Val Thr Gly
305 310 315 320
Thr Val His Thr Tyr Pro Val Thr Glu Asp Glu Ser Leu Gln Ser Leu
325 330 335
Lys Thr Arg Ile Gln Glu Asp Thr Gly Ile Leu Glu Thr Asp Gln Glu
340 345 350
Leu Leu Gln Glu Ala Gly Leu Val Leu Leu Pro Asp Lys Pro Ala Thr
355 360 365
Gln Cys Ile Ser Asp Ser Lys Thr Asn Glu Gly Leu Thr Leu Asp Met
370 375 380
Asp Leu Val Phe Leu Phe Asp Asn Ser Lys Ile Asn Tyr Glu Thr Gln
385 390 395 400
Ile Thr Pro Arg Pro Gln Pro Glu Ser Val Ser Cys Ile Leu Gln Glu
405 410 415
Pro Lys Arg Asn Leu Ser Phe Phe Gln Leu Arg Lys Val Trp Gly Gln
420 425 430
Val Trp His Ser Ile Gln Thr Leu Lys Glu Asp Cys Asn Arg Leu Gln
435 440 445
Gln Gly Gln Arg Ala Ala Met Met Ser Leu Leu Arg Asn Asn Ser Cys
450 455 460
Leu Ser Lys Met Lys Asn Ala Met Ala Ser Thr Ala Gln Gln Leu Lys
465 470 475 480
Ala Lys Leu Asp Phe Phe Lys Thr Ser Ile Gln Ile Asp Leu Glu Lys
485 490 495
Tyr Lys Glu Gln Thr Glu Phe Gly Ile Thr Ser Asp Lys Leu Leu Leu
500 505 510
Ala Trp Arg Glu Met Glu Gln Ala Val Glu Gln Cys Gly Arg Glu Asn
515 520 525
Asp Val Lys His Leu Val Glu Arg Met Met Ala Leu Gln Thr Asp Ile
530 535 540
Val Asp Leu Gln Arg Ser Pro Met Gly Arg Lys Gln Gly Gly Thr Leu
545 550 555 560
Asp Asp Leu Glu Glu Gln Ala Arg Glu Leu Tyr Arg Arg Leu Arg Glu
565 570 575
Lys Pro Arg Asp Gln Arg Thr Glu Gly Asp Ser Gln Glu Met Val Arg
580 585 590
Leu Leu Leu Gln Ala Ile Gln Ser Phe Glu Lys Lys Val Arg Val Ile
595 600 605
Tyr Thr Gln Leu Ser Lys Thr Val Val Cys Lys Gln Lys Ala Leu Glu
610 615 620
Leu Leu Pro Lys Val Glu Glu Val Val Ser Leu Met Asn Glu Asp Glu
625 630 635 640
Arg Thr Val Val Arg Leu Gln Glu Lys Arg Gln Lys Glu Leu Trp Asn
645 650 655
Leu Leu Lys Ile Ala Cys Ser Lys Val Arg Gly Pro Val Ser Gly Ser
660 665 670
Pro Asp Ser Met Asn Val Ser Arg Leu Ser His Pro Gly Gln Leu Met
675 680 685
Ser Gln Pro Ser Ser Ala Cys Asp Ser Leu Pro Glu Ser Asp Lys Lys
690 695 700
Ser Glu Glu Leu Val Ala Glu Ala His Ala Leu Cys Ser Arg Leu Glu
705 710 715 720
Ser Ala Leu Gln Asp Thr Val Lys Glu Gln Asp Arg Ser Phe Thr Val
725 730 735
Thr Ala
<210> 47
<211> 1497
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 47
atgaaccagt ccatcccagt ggctcccacc ccaccccgcc gcgtgcggct gaagccctgg 60
ctggtggccc aggtgaacag ctgccagtac ccagggcttc aatgggtcaa cggggaaaag 120
aaattattct gcatcccctg gaggcatgcc acaaggcatg gtcccagcca ggacggagat 180
aacaccatct tcaaggcctg ggccaaggag acagggaaat acaccgaagg cgtggatgaa 240
gccgatccgg ccaagtggaa ggccaacctg cgctgtgccc ttaacaagag ccgggacttc 300
cgcctcatct acgacgggcc ccgggacatg ccacctcagc cctacaagat ctacgaggtc 360
tgctccaatg gccctgctcc cacagactcc cagccccctg aggattactc ttttggtgca 420
ggagaggagg aggaagaaga ggaagagctg cagaggatgt tgccaagcct gagcctcaca 480
gaggatgtca agtggccgcc cactctgcag ccgcccactc tgcggccgcc tactctgcag 540
ccgcccactc tgcagccgcc cgtggtgctg ggtccccctg ctccagaccc cagccccctg 600
gctcctcccc ctggcaaccc tgctggcttc agggagcttc tctctgaggt cctggagcct 660
gggcccctgc ctgccagcct gccccctgca ggcgaacagc tcctgccaga cctgctgatc 720
agcccccaca tgctgcctct gaccgacctg gagatcaagt ttcagtaccg ggggcggcca 780
ccccgggccc tcaccatcag caacccccat ggctgccggc tcttctacag ccagctggag 840
gccacccagg agcaggtgga actcttcggc cccataagcc tggagcaagt gcgcttcccc 900
agccctgagg acatccccag tgacaagcag cgcttctaca cgaaccagct gctggatgtc 960
ctggaccgcg ggctcatcct ccagctacag ggccaggacc tttatgccat ccgcctgtgt 1020
cagtgcaagg tgttctggag cgggccttgt gcctcagccc atgactcatg ccccaacccc 1080
atccagcggg aggtcaagac caagcttttc agcctggagc attttctcaa tgagctcatc 1140
ctgttccaaa agggccagac caacacccca ccacccttcg agatcttctt ctgctttggg 1200
gaagaatggc ctgaccgcaa accccgagag aagaagctca ttactgtaca ggtggtgcct 1260
gtagcagctc gactgctgct ggagatgttc tcaggggagc tatcttggtc agctgatagt 1320
atccggctac agatctcaaa cccagacctc aaagaccgca tggtggagca attcaaggag 1380
ctccatcaca tctggcagtc ccagcagcgg ttgcagcctg tggcccaggc ccctcctgga 1440
gcaggccttg gtgttggcca ggggccctgg cctatgcacc cagctggcat gcaataa 1497
<210> 48
<211> 1544
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 48
atgaaccagt ccatcccagt ggctcccacc ccaccccgcc gcgtgcggct gaagccctgg 60
ctggtggccc aggtgaacag ctgccagtac ccagggcttc aatgggtcaa cggggaaaag 120
aaattattct gcatcccctg gaggcatgcc acaaggcatg gtcccagcca ggacggagat 180
aacaccatct tcaaggcctg ggccaaggag acagggaaat acaccgaagg cgtggatgaa 240
gccgatccgg ccaagtggaa ggccaacctg cgctgtgccc ttaacaagag ccgggacttc 300
cgcctcatct acgacgggcc ccgggacatg ccacctcagc cctacaagat ctacgaggtc 360
tgctccaatg gccctgctcc cacagactcc cagccccctg aggattactc ttttggtgca 420
ggagaggagg aggaagaaga ggaagagctg cagaggatgt tgccaagcct gagcctcaca 480
gatgcagtgc agtctggccc ccacatgaca ccctattctt tactcaaaga ggatgtcaag 540
tggccgccca ctctgcagcc gcccactctg cggccgccta ctctgcagcc gcccactctg 600
cagccgcccg tggtgctggg tccccctgct ccagacccca gccccctggc tcctccccct 660
ggcaaccctg ctggcttcag ggagcttctc tctgaggtcc tggagcctgg gcccctgcct 720
gccagcctgc cccctgcagg cgaacagctc ctgccagacc tgctgatcag cccccacatg 780
ctgcctctga ccgacctgga gatcaagttt cagtaccggg ggcggccacc ccgggccctc 840
accatcagca acccccatgg ctgccggctc ttctacagcc agctggaggc cacccaggag 900
caggtggaac tcttcggccc cataagcctg gagcaagtgc gcttccccag ccctgaggac 960
atccccagtg acaagcagcg cttctacacg aaccagctgc tggatgtcct ggaccgcggg 1020
ctcatcctcc agctacaggg ccaggacctt tatgccatcc gcctgtgtca gtgcaaggtg 1080
ttctggagcg ggccttgtgc ctcagcccat gactatgccc caaccccatc cagcgggagg 1140
tcaagaccaa gcttttcagc ctggagcatt ttctcaatga gctcatcctg ttccaaaagg 1200
gccagaccaa caccccacca cccttcgaga tcttcttctg ctttggggaa gaatggcctg 1260
accgcaaacc ccgagagaag aagctcatta ctgtacaggt ggtgcctgta gcagctcgac 1320
tgctgctgga gatgttctca ggggagctat cttggtcagc tgatagtatc cggctacaga 1380
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ttggccaggg gccctggcct atgcacccag ctggcatgca ataa 1544
<210> 49
<211> 1514
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 49
atgaaccagt ccatcccagt ggctcccacc ccaccccgcc gcgtgcggct gaagccctgg 60
ctggtggccc aggtgaacag ctgccagtac ccagggcttc aatgggtcaa cggggaaaag 120
aaattattct gcatcccctg gaggcatgcc acaaggcatg gtcccagcca ggacggagat 180
aacaccatct tcaaggcctg ggccaaggag acagggaaat acaccgaagg cgtggatgaa 240
gccgatccgg ccaagggaag gccaacctgc gctgtgccct taacaagagc cgggacttcc 300
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gagaggagga ggaagaagag gaagagctgc agaggatgtt gccaagcctg agcctcacag 480
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ggccgcccac tctgcagccg cccactctgc agccgcccgt ggtgctgggt ccccctgctc 600
cagaccccag ccccctggct cctccccctg gcaaccctgc tggcttcagg gagcttctct 660
ctgaggtcct ggagcctggg cccctgcctg ccagcctgcc ccctgcaggc gaacagctcc 720
tgccagacct gctgatcagc ccccacatgc tgcctctgac cgacctggag atcaagtttc 780
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accagctgct ggatgtcctg gaccgcgggc tcatcctcca gctacagggc caggaccttt 1020
atgccatccg cctgtgtcag tgcaaggtgt tctggagcgg gccttgtgcc tcagcccatg 1080
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ttctcaatga gctcatcctg ttccaaaagg gccagaccaa caccccacca cccttcgaga 1200
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ctggcatgca ataa 1514
<210> 50
<211> 1466
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 50
atgaaccagt ccatcccagt ggctcccacc ccaccccgcc gcgtgcggct gaagccctgg 60
ctggtggccc aggtgaacag ctgccagtac ccagggcttc aatgggtcaa cggggaaaag 120
aaattattct gcatcccctg gaggcatgcc acaaggcatg gtcccagcca ggacggagat 180
aacaccatct tcaaggcctg ggccaaggag acagggaaat acaccgaagg cgtggatgaa 240
gccgatccgg ccaagtggaa ggccaacctg cgctgtgccc ttaacaagag ccgggacttc 300
cgcctcatct acgacgggcc ccgggacatg ccacctcagc cctacaagat ctacgaggtc 360
tgctccaatg gccctgctcc cacagactcc cagccccctg aggattactc ttttggtgca 420
ggagaggagg aggaagaaga ggaagagctg cagaggatgt tgccaagcct gagcctcaca 480
gaggatgtca agtggcgccc actctgcagc cgcccactct gcagccgccc gtggtgctgg 540
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gcgaacagct cctgccagac ctgctgatca gcccccacat gctgcctctg accgacctgg 720
agatcaagtt tcagtaccgg gggcggccac cccgggccct caccatcagc aacccccatg 780
gctgccggct cttctacagc cagctggagg ccacccagga gcaggtggaa ctcttcggcc 840
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gcttctacac gaaccagctg ctggatgtcc tggaccgcgg gctcatcctc cagctacagg 960
gccaggacct ttatgccatc cgcctgtgtc agtgcaaggt gttctggagc gggccttgtg 1020
cctcagccca tgactcatgc cccaacccca tccagcggga ggtcaagacc aagcttttca 1080
gcctggagca ttttctcaat gagctcatcc tgttccaaaa gggccagacc aacaccccac 1140
cacccttcga gatcttcttc tgctttgggg aagaatggcc tgaccgcaaa ccccgagaga 1200
agaagctcat tactgtacag gtggtgcctg tagcagctcg actgctgctg gagatgttct 1260
caggggagct atcttggtca gctgatagta tccggctaca gatctcaaac ccagacctca 1320
aagaccgcat ggtggagcaa ttcaaggagc tccatcacat ctggcagtcc cagcagcggt 1380
tgcagcctgt ggcccaggcc cctcctggag caggccttgg tgttggccag gggccctggc 1440
ctatgcaccc agctggcatg caataa 1466
<210> 51
<211> 1239
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 51
atgaaccagt ccatcccagt ggctcccacc ccaccccgcc gcgtgcggct gaagccctgg 60
ctggtggccc aggtgaacag ctgccagtac ccagggcttc aatgggtcaa cggggaaaag 120
aaattattct gcatcccctg gaggcatgcc acaaggcatg gtcccagcca ggacggagat 180
aacaccatct tcaaggcctg ggccaaggag acagggaaat acaccgaagg cgtggatgaa 240
gccgatccgg ccaagtggaa ggccaacctg cgctgtgccc ttaacaagag ccgggacttc 300
cgcctcatct acgacgggcc ccgggacatg ccacctcagc cctacaagat ctacgaggtc 360
tgctccaatg gccctgctcc cacagactcc cagccccctg aggattactc ttttggtgca 420
ggagaggagg aggaagaaga ggaagagctg cagaggatgt tgccaagcct gagcctcaca 480
gtgaccgacc tggagatcaa gtttcagtac cgggggcggc caccccgggc cctcaccatc 540
agcaaccccc atggctgccg gctcttctac agccagctgg aggccaccca ggagcaggtg 600
gaactcttcg gccccataag cctggagcaa gtgcgcttcc ccagccctga ggacatcccc 660
agtgacaagc agcgcttcta cacgaaccag ctgctggatg tcctggaccg cgggctcatc 720
ctccagctac agggccagga cctttatgcc atccgcctgt gtcagtgcaa ggtgttctgg 780
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accaacaccc caccaccctt cgagatcttc ttctgctttg gggaagaatg gcctgaccgc 960
aaaccccgag agaagaagct cattactgta caggtggtgc ctgtagcagc tcgactgctg 1020
ctggagatgt tctcagggga gctatcttgg tcagctgata gtatccggct acagatctca 1080
aacccagacc tcaaagaccg catggtggag caattcaagg agctccatca catctggcag 1140
tcccagcagc ggttgcagcc tgtggcccag gcccctcctg gagcaggcct tggtgttggc 1200
caggggccct ggcctatgca cccagctggc atgcaataa 1239
<210> 52
<211> 444
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 52
atgaaccagt ccatcccagt ggctcccacc ccaccccgcc gcgtgcggct gaagccctgg 60
ctggtggccc aggtgaacag ctgccagtac ccagggcttc aatgggtcaa cggggaaaag 120
aaattattct gcatcccctg gaggcatgcc acaaggcatg gtcccagcca ggacggagat 180
aacaccatct tcaaggcctg ggccaaggag acagggaaat acaccgaagg cgtggatgaa 240
gccgatccgg ccaagtggaa ggccaacctg cgctgtgccc ttaacaagag ccgggacttc 300
cgcctcatct acgacgggcc ccgggacatg ccacctcagc cctacaagat ctacgagact 360
cccagccccc tgaggattac tcttttggtg caggagagga ggaggaagaa gaggaagagc 420
tgcagaggat gttgccaagc ctga 444
<210> 53
<211> 1494
<212> DNA
<213> Mus musculus
<400> 53
atgaatcata gtgcacccgg gatccctcct cctccaagac gagtacgcct caagccctgg 60
ttggtagctc aagtcaactc atgccaatac cctgggcttc agtgggtgaa cggtgagaag 120
aaattgtttt atatcccatg gcgacacgca acaagacatg gcccatcaca ggatggagat 180
aacaccatat ttaaggcatg ggcaaaggaa acaggaaagt acactgaggg cgttgatgag 240
gccgatcctg caaaatggaa agcaaatttg cgatgcgctc tcaataaatc acgagatttc 300
caactctttt acgacggccc aagggacatg ccaccacaac cttataaaat ctacgaggta 360
tgttccaacg gtccagcccc aactgaatcc cagcctactg acgactatgt ccttggagaa 420
gaggaggaag aagaagagga ggaacttcag cggatgttgc ctgggttgtc cataactgag 480
cctgccttgc caggaccccc taatgcacca tactcccttc ccaaagaaga tacaaaatgg 540
ccccccgcat tgcaaccccc cgttggtttg ggaccacctg tgcccgaccc aaatctcttg 600
gccccaccaa gcggtaaccc agccggattt cgacaacttc tgcccgaagt ccttgagcca 660
ggtcccttgg cctcttctca gccccctaca gaacctctgc tccccgatct cttgatatct 720
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agaacactga ctatatcaaa tccccaaggt tgccgcctgt tttacagtca gttggaggca 840
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caaagagaag taaagactaa acttttcagc ctggaacaat ttctcaacga actcattctg 1140
tttcaaaaag gtcagaccaa cacaccccct cctttcgaga ttttcttctg cttcggcgaa 1200
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gcagccaggc tccttcttga aatgtttagc ggtgaactct catggtccgc tgacagtatc 1320
cggctccaaa tatcaaaccc tgatcttaaa gaccacatgg tagaacagtt taaagaactc 1380
caccacctgt ggcaatccca acagcagctc cagccaatgg ttcaagctcc tccagtcgct 1440
gggctggacg cctcacaagg accctggccc atgcaccccg tcgggatgca gtaa 1494
<210> 54
<211> 978
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 54
atgcccatca ctcggatgcg catgagaccc tggctagaga tgcagattaa ttccaaccaa 60
atcccggggc tcatctggat taataaagag gagatgatct tccagatccc atggaagcat 120
gctgccaagc atggctggga catcaacaag gatgcctgtt tgttccggag ctgggccatt 180
cacacaggcc gatacaaagc aggggaaaag gagccagatc ccaagacgtg gaaggccaac 240
tttcgctgtg ccatgaactc cctgccagat atcgaggagg tgaaagacca gagcaggaac 300
aagggcagct cagctgtgcg agtgtaccgg atgcttccac ctctcaccaa gaaccagaga 360
aaagaaagaa agtcgaagtc cagccgagat gctaagagca aggccaagag gaagtcatgt 420
ggggattcca gccctgatac cttctctgat ggactcagca gctccactct gcctgatgac 480
cacagcagct acacagttcc aggctacatg caggacttgg aggtggagca ggccctgact 540
ccagcactgt cgccatgtgc tgtcagcagc actctccccg actggcacat cccagtggaa 600
gttgtgccgg acagcaccag tgatctgtac aacttccagg tgtcacccat gccctccacc 660
tctgaagcta caacagatga ggatgaggaa gggaaattac ctgaggacat catgaagctc 720
ttggagcagt cggagtggca gccaacaaac gtggatggga aggggtacct actcaatgaa 780
cctggagtcc agcccacctc tgtctatgga gactttagct gtaaggagga gccagaaatt 840
gacagcccag ggggggatat tgggctgagt ctacagcgtg tcttcacaga tctgaagaac 900
atggatgcca cctggctgga cagcctgctg accccagtcc ggttgccctc catccaggcc 960
attccctgtg caccgtag 978
<210> 55
<211> 1283
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 55
atgggaaccc caaagccacg gatcctgccc tggctggtgt cgcagctgga cctggggcaa 60
ctggagggcg tggcctgggt gaacaagagc cgcacgcgct tccgcatccc ttggaagcac 120
ggcctacggc aggatgcaca gcaggaggat ttcggaatct tccaggcctg ggccgaggcc 180
actggtgcat atgttcccgg gagggataag ccagacctgc caacctggaa gaggaatttc 240
cgctctgccc tcaaccgcaa agaagggttg cgtttagcag aggaccggag caaggaccct 300
cacgacccac ataaaatcta cgagtttgtg aactcaggag ttggggactt ttcccagcca 360
gacacctctc cggacaccaa tggtggaggc agtacttctg atacccagga agacattctg 420
gatgagttac tgggtaacat ggtgttggcc ccactcccag atccgggacc cccaagcctg 480
gctgtagccc ctgagccctg ccctcagccc ctgcggagcc ccagcttgga caatcccact 540
cccttcccaa acctggggcc ctctgagaac ccactgaagc ggctgttggt gccgggggaa 600
gagtgggagt tcgaggtgac agccttctac cggggccgcc aagtcttcca gcagaccatc 660
tcctgcccgg agggcctgcg gctggtgggg tccgaagtgg gagacaggac gctgcctgga 720
tggccagtca cactgccaga ccctggcatg tccctgacag acaggggagt gatgagctac 780
gtgaggcatg tgctgagctg cctgggtggg ggactggctc tctggcgggc cgggcagtgg 840
ctctgggccc agcggctggg gcactgccac acatactggg cagtgagcga ggagctgctc 900
cccaacagcg ggcatgggcc tgatgcgagg tccccaagga caaggaagga ggcgtgtttg 960
acctggggcc cttcattgta gatctgatta ccttcacgga aggaagcgga cgctcaccac 1020
gctatgccct ctggttctgt gtgggggagt catggcccca ggaccagccg tggaccaaga 1080
ggctcgtgat ggtcaaggtt gtgcccacgt gcctcagggc cttggtagaa atggcccggg 1140
tagggggtgc ctcctccctg gagaatactg tggacctgca catttccaac agccacccac 1200
tctccctcac ctccgaccag tacaaggcct acctgcagga cttggtggag ggcatggatt 1260
tccagggccc tggggagagc tga 1283
<210> 56
<211> 1512
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 56
atggccttgg ctcctgagag ggcagcccca cgcgtgctgt tcggagagtg gctccttgga 60
gagatcagca gcggctgcta tgaggggctg cagtggctgg acgaggcccg cacctgtttc 120
cgcgtgccct ggaagcactt cgcgcgcaag gacctgagcg aggccgacgc gcgcatcttc 180
aaggcctggg ctgtggcccg cggcaggtgg ccgcctagca gcaggggagg tggcccgccc 240
cccgaggctg agactgcgga gcgcgccggc tggaaaacca acttccgctg cgcactgcgc 300
agcacgcgtc gcttcgtgat gctgcgggat aactcggggg acccggccga cccgcacaag 360
gtgtacgcgc tcagccggga gctgtgctgg cgagaaggcc caggcacgga ccagactgag 420
gcagaggccc ccgcagctgt cccaccacca cagggtgggc ccccagggcc attcctggca 480
cacacacatg ctggactcca agccccaggc cccctccctg ccccagctgg tgacaagggg 540
gacctcctgc tccaggcagt gcaacagagc tgcctggcag accatctgct gacagcgtca 600
tggggggcag atccagtccc aaccaaggct cctggagagg gacaagaagg gcttcccctg 660
actggggcct gtgctggagg cccagggctc cctgctgggg agctgtacgg gtgggcagta 720
gagacgaccc ccagccccgg gccccagccc gcggcactaa cgacaggcga ggccgcggcc 780
ccagagtccc cgcaccaggc agagccgtac ctgtcaccct ccccaagcgc ctgcaccgcg 840
gtgcaagagc ccagcccagg ggcgctggac gtgaccatca tgtacaaggg ccgcacggtg 900
ctgcagaagg tggtgggaca cccgagctgc acgttcctat acggcccccc agacccagct 960
gtccgggcca cagaccccca gcaggtagca ttccccagcc ctgccgagct cccggaccag 1020
aagcagctgc gctacacgga ggaactgctg cggcacgtgg cccctgggtt gcacctggag 1080
cttcgggggc cacagctgtg ggcccggcgc atgggcaagt gcaaggtgta ctgggaggtg 1140
ggcggacccc caggctccgc cagcccctcc accccagcct gcctgctgcc tcggaactgt 1200
gacaccccca tcttcgactt cagagtcttc ttccaagagc tggtggaatt ccgggcacgg 1260
cagcgccgtg gctccccacg ctataccatc tacctgggct tcgggcagga cctgtcagct 1320
gggaggccca aggagaagag cctggtcctg gtgaagctgg aaccctggct gtgccgagtg 1380
cacctagagg gcacgcagcg tgagggtgtg tcttccctgg atagcagcag cctcagcctc 1440
tgcctgtcca gcgccaacag cctctatgac gacatcgagt gcttccttat ggagctggag 1500
cagcccgcct ag 1512
<210> 57
<211> 1281
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 57
atgtgtgacc ggaatggtgg tcggcggctt cgacagtggc tgatcgagca gattgacagt 60
agcatgtatc caggactgat ttgggagaat gaggagaaga gcatgttccg gatcccttgg 120
aaacacgctg gcaagcaaga ttataatcag gaagtggatg cctccatttt taaggcctgg 180
gcagttttta aagggaagtt taaagaaggg gacaaagctg aaccagccac ttggaagacg 240
aggttacgct gtgctttgaa taagagccca gattttgagg aagtgacgga ccggtcccaa 300
ctggacattt ccgagccata caaagtttac cgaattgttc ctgaggaaga gcaaaaatgc 360
aaactaggcg tggcaactgc tggctgcgtg aatgaagtta cagagatgga gtgcggtcgc 420
tctgaaatcg acgagctgat caaggagcct tctgtggacg attacatggg gatgatcaaa 480
aggagccctt ccccgccgga ggcctgtcgg agtcagctcc ttccagactg gtgggcgcag 540
cagcccagca caggcgtgcc gctggtgacg gggtacacca cctacgacgc gcaccattca 600
gcattctccc agatggtgat cagcttctac tatgggggca agctggtggg ccaggccacc 660
accacctgcc ccgagggctg ccgcctgtcc ctgagccagc ctgggctgcc cggcaccaag 720
ctgtatgggc ccgagggcct ggagctggtg cgcttcccgc cggccgacgc catccccagc 780
gagcgacaga ggcaggtgac gcggaagctg ttcgggcacc tggagcgcgg ggtgctgctg 840
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ggcaacgccg tggtgtgcaa aggcaggccc aacaagctgg agcgtgatga ggtggtccag 960
gtcttcgaca ccagccagtt cttccgagag ctgcagcagt tctataacag ccagggccgg 1020
cttcctgacg gcagggtggt gctgtgcttt ggggaagagt ttccggatat ggcccccttg 1080
cgctccaaac tcattctcgt gcagattgag cagctgtatg tccggcaact ggcagaagag 1140
gctgggaaga gctgtggagc cggctctgtg atgcaggccc ccgaggagcc gccgccagac 1200
caggtcttcc ggatgtttcc agatatttgt gcctcacacc agagatcatt tttcagagaa 1260
aaccaacaga tcaccgtcta a 1281
<210> 58
<211> 990
<212> DNA
<213> Mus musculus
<400> 58
atgccaatca ctcgaatgcg gatgagaccc tggctagaga tgcagattaa ttccaaccaa 60
atcccagggc tgatctggat caataaagaa gagatgatct tccagattcc atggaagcac 120
gctgctaagc acggctggga catcaacaag gatgcctgtc tgttccggag ctgggccatt 180
cacacaggcc gatacaaagc aggagaaaaa gagccagatc ccaagacatg gaaggcaaac 240
ttccgttgtg ccatgaactc cctgccagac atcgaggaag tgaaggatca gagtaggaac 300
aagggcagct ctgctgtgcg ggtgtaccgg atgctgccac ccctcaccag gaaccagagg 360
aaagagagaa agtccaagtc cagccgagac actaagagca aaaccaagag gaagctgtgt 420
ggagatgtta gcccggacac tttctctgat ggactcagca gctctaccct acctgatgac 480
cacagcagtt acaccactca gggctacctg ggtcaggact tggatatgga aagggacata 540
actccagcac tgtcaccgtg tgtcgtcagc agcagtctct ctgagtggca tatgcagatg 600
gacattatac cagatagcac cactgatctg tataacctac aggtgtcacc catgccttcc 660
acctccgaag ccgcaacaga cgaggatgag gaagggaaga tagccgaaga ccttatgaag 720
ctctttgaac agtctgagtg gcagccgaca cacatcgatg gcaagggata cttgctcaat 780
gagccaggga cccagctctc ttctgtctat ggagacttca gctgcaaaga ggaaccagag 840
attgacagcc ctcgagggga cattgggata ggcatacaac atgtcttcac ggagatgaag 900
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<211> 1260
<212> DNA
<213> Mus musculus
<400> 59
atggaaaccc cgaaaccgcg gattttgccc tggctggtgt cacagctgga cctggggcag 60
ctggaaggcg tggcctggct ggacgagagc cgaacgaggt tcaggatccc gtggaagcat 120
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cctgaggggt ttctgacgga caagcttgtg aaggagtacg tggggcaggt gctcaaaggg 780
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<210> 60
<211> 1374
<212> DNA
<213> Mus musculus
<400> 60
atggctgaag tgaggggggt ccagcgagtg ctgtttggag actggctatt gggggaggtc 60
agcagcggcc agtacgaggg gctgcagtgg ctgaacgagg ctcgcacagt cttccgcgta 120
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caggtggaag ctgtccccag tcccaggcct caacagccag ctctcaccga gcgcagcctt 720
gggttcctgg atgtgaccat catgtacaag ggccgcacag tgctacaggc agtggtgggg 780
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<210> 61
<211> 1578
<212> DNA
<213> Mus musculus
<400> 61
atggccgaag ttcgaggagt acagcgcgtg ctgtttgggg actggttgct tggtgaagtc 60
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<210> 62
<211> 1275
<212> DNA
<213> Mus musculus
<400> 62
atgtgtgaca ggaacggcgg tagaagactg agacagtggc tgatcgagca aattgacagc 60
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agatccccat cccccccaga agcctgtcgg agccaaatct tgcctgactg gtgggtacag 540
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tttaggatgt ttcccgacat ttgtacctca caccagaggc cttttttccg cgaaaaccag 1260
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<210> 63
<211> 1274
<212> DNA
<213> Mus musculus
<400> 63
atgtgtgaca ggaacggcgg tagaagactg agacagtggc tgatcgagca aattgacagc 60
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cgcttgaggt gtgcactcaa taagtcaccc gacttcgagg aagtcactga ccgcagtcaa 300
ttggacatat cagaaccata caaagtctac aggatagtcc ccgaagaaga gcagaaatgc 360
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agataaccgt gtaa 1274
<210> 64
<211> 2271
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 64
atgagctggt caccttccct gacaacgcag acatgtgggg cctgggaaat gaaagagcgc 60
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cccttcctcc ccaactggca gcccgtgcag tggcattcaa aagtgcggca gaagagtgag 720
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taccccaata atcttaacag tgtcctggct gagcgactgg agaagtggct gcaactgatg 840
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ttgatccccg ataagcctgc cactcagtgt atttcagacg gcaagttaaa tgagggccac 1140
acattggaca tggatcttgt ttttctcttt gacaacagta aaatcaccta tgagactcag 1200
atctccccac ggccccaacc tgaaagtgtc agctgtatcc ttcaagagcc caagaggaat 1260
ctcgccttct tccagctgag gaaggtgtgg ggccaggtct ggcacagcat ccagaccctg 1320
aaggaagatt gcaaccggct gcagcaggga cagcgagccg ccatgatgaa tctcctccga 1380
aacaacagct gcctctccaa aatgaagaat tccatggctt ccatgtctca gcagctcaag 1440
gccaagttgg atttcttcaa aaccagcatc cagattgacc tggagaagta cagcgagcaa 1500
accgagtttg ggatcacatc agataaactg ctgctggcct ggagggaaat ggagcaggct 1560
gtggagctct gtgggcggga gaacgaagtg aaactcctgg tagaacggat gatggctctg 1620
cagaccgaca ttgtggactt acagaggagc cccatgggcc ggaagcaggg gggaacgctg 1680
gacgacctag aggagcaagc aagggagctg tacaggagac taagggaaaa acctcgagac 1740
cagcgaactg agggtgacag tcaggaaatg gtacggctgc tgcttcaggc aattcagagc 1800
ttcgagaaga aagtgcgagt gatctatacg cagctcagta aaactgtggt ttgcaagcag 1860
aaggcgctgg aactgttgcc caaggtggaa gaggtggtga gcttaatgaa tgaggatgag 1920
aagactgttg tccggctgca ggagaagcgg cagaaggagc tctggaatct cctgaagatt 1980
gcttgtagca aggtccgtgg tcctgtcagt ggaagcccgg atagcatgaa tgcctctcga 2040
cttagccagc ctgggcagct gatgtctcag ccctccacgg cctccaacag cttacctgag 2100
ccagccaaga agagtgaaga actggtggct gaagcacata acctctgcac cctgctagaa 2160
aatgccatac aggacactgt gagggaacaa gaccagagtt tcacggccct agactggagc 2220
tggttacaga cggaagaaga agagcacagc tgcctggagc aggcctcatg a 2271
<210> 65
<211> 2265
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 65
atgttttcag gggggtgtca tagccccggg tttggccgcc ccagccccgc cttccccgcc 60
ccggggagcc cgccccctgc cccgcgtccc tgccgacagg aaacaggtga gcagattgcc 120
atcaagcagt gccggcagga gctcagcccc cggaaccgag agcggtggtg cctggagatc 180
cagatcatga gaaggctgac ccaccccaat gtggtggctg cccgagatgt ccctgagggg 240
atgcagaact tggcgcccaa tgacctgccc ctgctggcca tggagtactg ccaaggagga 300
gatctccgga agtacctgaa ccagtttgag aactgctgtg gtctgcggga aggtgccatc 360
ctcaccttgc tgagtgacat tgcctctgcg cttagatacc ttcatgaaaa cagaatcatc 420
catcgggatc taaagccaga aaacatcgtc ctgcagcaag gagaacagag gttaatacac 480
aaaattattg acctaggata tgccaaggag ctggatcagg gcagtctttg cacatcattc 540
gtggggaccc tgcagtacct ggccccagag ctactggagc agcagaagta cacagtgacc 600
gtcgactact ggagcttcgg caccctggcc tttgagtgca tcacgggctt ccggcccttc 660
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attgttgtta gcgaagactt gaatggaacg gtgaagtttt caagctcttt accctacccc 780
aataatctta acagtgtcct ggctgagcga ctggagaagt ggctgcaact gatgctgatg 840
tggcaccccc gacagagggg cacggatccc acgtatgggc ccaatggctg cttcaaggcc 900
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cacacctacc ctgtgacaga ggatgagagt ctgcagagct tgaaggccag aatccaacag 1020
gacacgggca tcccagagga ggaccaggag ctgctgcagg aagcgggcct ggcgttgatc 1080
cccgataagc ctgccactca gtgtatttca gacggcaagt taaatgaggg ccacacattg 1140
gacatggatc ttgtttttct ctttgacaac agtaaaatca cctatgagac tcagatctcc 1200
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ttggatttct tcaaaaccag catccagatt gacctggaga agtacagcga gcaaaccgag 1500
tttgggatca catcagataa actgctgctg gcctggaggg aaatggagca ggctgtggag 1560
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<210> 66
<211> 771
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 66
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<210> 67
<211> 2094
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 67
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<213> Mus musculus
<400> 68
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130 135 140
Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Glu Leu Thr
145 150 155 160
Gln Ser Pro Lys Phe Met Ser Thr Ser Val Gly Asp Arg Val Ser Val
165 170 175
Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asn Val Gly Thr Asn Val Ala Trp Tyr Gln
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Asp Phe Thr Leu Thr Ile Thr Asn Val Gln Ser Lys Asp Leu Ala Asp
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Tyr Phe Cys Gln Gln Tyr Asn Arg Tyr Pro Tyr Thr Ser Gly Gly Gly
245 250 255
Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Ala Ala Ala Ile Glu Val Met Tyr Pro
260 265 270
Pro Pro Tyr Leu Asp Asn Glu Lys Ser Asn Gly Thr Ile Ile His Val
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<213> Homo sapiens
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<213> Homo sapiens
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<213> Homo sapiens
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<213> Homo sapiens
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Met Thr Lys Leu Gln Leu Ala Leu
165
<210> 118
<211> 347
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 118
Asp Pro Asn Phe Trp Leu Gln Val Gln Glu Ser Val Thr Val Gln Glu
1 5 10 15
Gly Leu Cys Val Leu Val Pro Cys Thr Phe Phe His Pro Ile Pro Tyr
20 25 30
Tyr Asp Lys Asn Ser Pro Val His Gly Tyr Trp Phe Arg Glu Gly Ala
35 40 45
Ile Ile Ser Arg Asp Ser Pro Val Ala Thr Asn Lys Leu Asp Gln Glu
50 55 60
Val Gln Glu Glu Thr Gln Gly Arg Phe Arg Leu Leu Gly Asp Pro Ser
65 70 75 80
Arg Asn Asn Cys Ser Leu Ser Ile Val Asp Ala Arg Arg Arg Asp Asn
85 90 95
Gly Ser Tyr Phe Phe Arg Met Glu Arg Gly Ser Thr Lys Tyr Ser Tyr
100 105 110
Lys Ser Pro Gln Leu Ser Val His Val Thr Asp Leu Thr His Arg Pro
115 120 125
Lys Ile Leu Ile Pro Gly Thr Leu Glu Pro Gly His Ser Lys Asn Leu
130 135 140
Thr Cys Ser Val Ser Trp Ala Cys Glu Gln Gly Thr Pro Pro Ile Phe
145 150 155 160
Ser Trp Leu Ser Ala Ala Pro Thr Ser Leu Gly Pro Arg Thr Thr His
165 170 175
Ser Ser Val Leu Ile Ile Thr Pro Arg Pro Gln Asp His Gly Thr Asn
180 185 190
Leu Thr Cys Gln Val Lys Phe Ala Gly Ala Gly Val Thr Thr Glu Arg
195 200 205
Thr Ile Gln Leu Asn Val Thr Tyr Val Pro Gln Asn Pro Thr Thr Gly
210 215 220
Ile Phe Pro Gly Asp Gly Ser Gly Lys Gln Glu Thr Arg Ala Gly Val
225 230 235 240
Val His Gly Ala Ile Gly Gly Ala Gly Val Thr Ala Leu Leu Ala Leu
245 250 255
Cys Leu Cys Leu Ile Phe Phe Ile Val Lys Thr His Arg Arg Lys Ala
260 265 270
Ala Arg Thr Ala Val Gly Arg Asn Asp Thr His Pro Thr Thr Gly Ser
275 280 285
Ala Ser Pro Lys His Gln Lys Lys Ser Lys Leu His Gly Pro Thr Glu
290 295 300
Thr Ser Ser Cys Ser Gly Ala Ala Pro Thr Val Glu Met Asp Glu Glu
305 310 315 320
Leu His Tyr Ala Ser Leu Asn Phe His Gly Met Asn Pro Ser Lys Asp
325 330 335
Thr Ser Thr Glu Tyr Ser Glu Val Arg Thr Gln
340 345
<210> 119
<211> 32
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Viral Antigen Sequence
<400> 119
Val Gly Phe Pro Val Thr Pro Gln Val Pro Leu Arg Pro Met Thr Tyr
1 5 10 15
Lys Ala Ala Val Asp Leu Ser His Phe Leu Lys Glu Lys Gly Gly Leu
20 25 30
<210> 120
<211> 30
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Viral Antigen Sequence
<400> 120
His Thr Gln Gly Tyr Phe Pro Asp Trp Gln Asn Tyr Thr Pro Gly Pro
1 5 10 15
Gly Val Arg Tyr Pro Leu Thr Phe Gly Trp Leu Tyr Lys Leu
20 25 30
<210> 121
<211> 19
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Viral Antigen Sequence
<400> 121
Glu Lys Ile Arg Leu Arg Pro Gly Gly Lys Lys Lys Tyr Lys Leu Lys
1 5 10 15
His Ile Val
<210> 122
<211> 32
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Viral Antigen Sequence
<400> 122
Asn Pro Pro Ile Pro Val Gly Glu Ile Tyr Lys Arg Trp Ile Ile Leu
1 5 10 15
Gly Leu Asn Lys Ile Val Arg Met Tyr Ser Pro Thr Ser Ile Leu Asp
20 25 30
<210> 123
<211> 31
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Viral Antigen Sequence
<400> 123
Ala Ile Phe Gln Ser Ser Met Thr Lys Ile Leu Glu Pro Phe Arg Lys
1 5 10 15
Gln Asn Pro Asp Ile Val Ile Tyr Gln Tyr Met Asp Asp Leu Tyr
20 25 30
<210> 124
<211> 184
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 124
Met Leu Gln Met Ala Gly Gln Cys Ser Gln Asn Glu Tyr Phe Asp Ser
1 5 10 15
Leu Leu His Ala Cys Ile Pro Cys Gln Leu Arg Cys Ser Ser Asn Thr
20 25 30
Pro Pro Leu Thr Cys Gln Arg Tyr Cys Asn Ala Ser Val Thr Asn Ser
35 40 45
Val Lys Gly Thr Asn Ala Ile Leu Trp Thr Cys Leu Gly Leu Ser Leu
50 55 60
Ile Ile Ser Leu Ala Val Phe Val Leu Met Phe Leu Leu Arg Lys Ile
65 70 75 80
Asn Ser Glu Pro Leu Lys Asp Glu Phe Lys Asn Thr Gly Ser Gly Leu
85 90 95
Leu Gly Met Ala Asn Ile Asp Leu Glu Lys Ser Arg Thr Gly Asp Glu
100 105 110
Ile Ile Leu Pro Arg Gly Leu Glu Tyr Thr Val Glu Glu Cys Thr Cys
115 120 125
Glu Asp Cys Ile Lys Ser Lys Pro Lys Val Asp Ser Asp His Cys Phe
130 135 140
Pro Leu Pro Ala Met Glu Glu Gly Ala Thr Ile Leu Val Thr Thr Lys
145 150 155 160
Thr Asn Asp Tyr Cys Lys Ser Leu Pro Ala Ala Leu Ser Ala Thr Glu
165 170 175
Ile Glu Lys Ser Ile Ser Ala Arg
180
<210> 125
<211> 345
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 125
Met Tyr Lys Asp Cys Ile Glu Ser Thr Gly Asp Tyr Phe Leu Leu Cys
1 5 10 15
Asp Ala Glu Gly Pro Trp Gly Ile Ile Leu Glu Ser Leu Ala Ile Leu
20 25 30
Gly Ile Val Val Thr Ile Leu Leu Leu Leu Ala Phe Leu Phe Leu Met
35 40 45
Arg Lys Ile Gln Asp Cys Ser Gln Trp Asn Val Leu Pro Thr Gln Leu
50 55 60
Leu Phe Leu Leu Ser Val Leu Gly Leu Phe Gly Leu Ala Phe Ala Phe
65 70 75 80
Ile Ile Glu Leu Asn Gln Gln Thr Ala Pro Val Arg Tyr Phe Leu Phe
85 90 95
Gly Val Leu Phe Ala Leu Cys Phe Ser Cys Leu Leu Ala His Ala Ser
100 105 110
Asn Leu Val Lys Leu Val Arg Gly Cys Val Ser Phe Ser Trp Thr Thr
115 120 125
Ile Leu Cys Ile Ala Ile Gly Cys Ser Leu Leu Gln Ile Ile Ile Ala
130 135 140
Thr Glu Tyr Val Thr Leu Ile Met Thr Arg Gly Met Met Phe Val Asn
145 150 155 160
Met Thr Pro Cys Gln Leu Asn Val Asp Phe Val Val Leu Leu Val Tyr
165 170 175
Val Leu Phe Leu Met Ala Leu Thr Phe Phe Val Ser Lys Ala Thr Phe
180 185 190
Cys Gly Pro Cys Glu Asn Trp Lys Gln His Gly Arg Leu Ile Phe Ile
195 200 205
Thr Val Leu Phe Ser Ile Ile Ile Trp Val Val Trp Ile Ser Met Leu
210 215 220
Leu Arg Gly Asn Pro Gln Phe Gln Arg Gln Pro Gln Trp Asp Asp Pro
225 230 235 240
Val Val Cys Ile Ala Leu Val Thr Asn Ala Trp Val Phe Leu Leu Leu
245 250 255
Tyr Ile Val Pro Glu Leu Cys Ile Leu Tyr Arg Ser Cys Arg Gln Glu
260 265 270
Cys Pro Leu Gln Gly Asn Ala Cys Pro Val Thr Ala Tyr Gln His Ser
275 280 285
Phe Gln Val Glu Asn Gln Glu Leu Ser Arg Ala Arg Asp Ser Asp Gly
290 295 300
Ala Glu Glu Asp Val Ala Leu Thr Ser Tyr Gly Thr Pro Ile Gln Pro
305 310 315 320
Gln Thr Val Asp Pro Thr Gln Glu Cys Phe Ile Pro Gln Ala Lys Leu
325 330 335
Ser Pro Gln Gln Asp Ala Gly Gly Val
340 345
<210> 126
<211> 300
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 126
Met Ala Asn Cys Glu Phe Ser Pro Val Ser Gly Asp Lys Pro Cys Cys
1 5 10 15
Arg Leu Ser Arg Arg Ala Gln Leu Cys Leu Gly Val Ser Ile Leu Val
20 25 30
Leu Ile Leu Val Val Val Leu Ala Val Val Val Pro Arg Trp Arg Gln
35 40 45
Gln Trp Ser Gly Pro Gly Thr Thr Lys Arg Phe Pro Glu Thr Val Leu
50 55 60
Ala Arg Cys Val Lys Tyr Thr Glu Ile His Pro Glu Met Arg His Val
65 70 75 80
Asp Cys Gln Ser Val Trp Asp Ala Phe Lys Gly Ala Phe Ile Ser Lys
85 90 95
His Pro Cys Asn Ile Thr Glu Glu Asp Tyr Gln Pro Leu Met Lys Leu
100 105 110
Gly Thr Gln Thr Val Pro Cys Asn Lys Ile Leu Leu Trp Ser Arg Ile
115 120 125
Lys Asp Leu Ala His Gln Phe Thr Gln Val Gln Arg Asp Met Phe Thr
130 135 140
Leu Glu Asp Thr Leu Leu Gly Tyr Leu Ala Asp Asp Leu Thr Trp Cys
145 150 155 160
Gly Glu Phe Asn Thr Ser Lys Ile Asn Tyr Gln Ser Cys Pro Asp Trp
165 170 175
Arg Lys Asp Cys Ser Asn Asn Pro Val Ser Val Phe Trp Lys Thr Val
180 185 190
Ser Arg Arg Phe Ala Glu Ala Ala Cys Asp Val Val His Val Met Leu
195 200 205
Asn Gly Ser Arg Ser Lys Ile Phe Asp Lys Asn Ser Thr Phe Gly Ser
210 215 220
Val Glu Val His Asn Leu Gln Pro Glu Lys Val Gln Thr Leu Glu Ala
225 230 235 240
Trp Val Ile His Gly Gly Arg Glu Asp Ser Arg Asp Leu Cys Gln Asp
245 250 255
Pro Thr Ile Lys Glu Leu Glu Ser Ile Ile Ser Lys Arg Asn Ile Gln
260 265 270
Phe Ser Cys Lys Asn Ile Tyr Arg Pro Asp Lys Phe Leu Gln Cys Val
275 280 285
Lys Asn Pro Glu Asp Ser Ser Cys Thr Ser Glu Ile
290 295 300
<210> 127
<211> 334
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 127
Met Ala Gly Ser Pro Thr Cys Leu Thr Leu Ile Tyr Ile Leu Trp Gln
1 5 10 15
Leu Thr Gly Ser Ala Ala Ser Gly Pro Val Lys Glu Leu Val Gly Ser
20 25 30
Val Gly Gly Ala Val Thr Phe Pro Leu Lys Ser Lys Val Lys Gln Val
35 40 45
Asp Ser Ile Val Trp Thr Phe Asn Thr Thr Pro Leu Val Thr Ile Gln
50 55 60
Pro Glu Gly Gly Thr Ile Ile Val Thr Gln Asn Arg Asn Arg Glu Arg
65 70 75 80
Val Asp Phe Pro Asp Gly Gly Tyr Ser Leu Lys Leu Ser Lys Leu Lys
85 90 95
Lys Asn Asp Ser Gly Ile Tyr Tyr Val Gly Ile Tyr Ser Ser Ser Leu
100 105 110
Gln Gln Pro Ser Thr Gln Glu Tyr Val Leu His Val Tyr Glu His Leu
115 120 125
Ser Lys Pro Lys Val Thr Met Gly Leu Gln Ser Asn Lys Asn Gly Thr
130 135 140
Cys Val Thr Asn Leu Thr Cys Cys Met Glu His Gly Glu Glu Asp Val
145 150 155 160
Ile Tyr Thr Trp Lys Ala Leu Gly Gln Ala Ala Asn Glu Ser His Asn
165 170 175
Gly Ser Ile Leu Pro Ile Ser Trp Arg Trp Gly Glu Ser Asp Met Thr
180 185 190
Phe Ile Cys Val Ala Arg Asn Pro Val Ser Arg Asn Phe Ser Ser Pro
195 200 205
Ile Leu Ala Arg Lys Leu Cys Glu Gly Ala Ala Asp Asp Pro Asp Ser
210 215 220
Ser Met Val Leu Leu Cys Leu Leu Leu Val Pro Leu Leu Leu Ser Leu
225 230 235 240
Phe Val Leu Gly Leu Phe Leu Trp Phe Leu Lys Arg Glu Arg Gln Glu
245 250 255
Glu Tyr Ile Glu Glu Lys Lys Arg Val Asp Ile Cys Arg Glu Thr Pro
260 265 270
Asn Ile Cys Pro His Ser Gly Glu Asn Thr Glu Tyr Asp Thr Ile Pro
275 280 285
His Thr Asn Arg Thr Ile Leu Lys Glu Asp Pro Ala Asn Thr Val Tyr
290 295 300
Ser Thr Val Glu Ile Pro Lys Lys Met Glu Asn Pro His Ser Leu Leu
305 310 315 320
Thr Met Pro Asp Thr Pro Arg Leu Phe Ala Tyr Glu Asn Val
325 330
<210> 128
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer
<400> 128
actggggcag ttatgacagg 20
<210> 129
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer
<400> 129
gatgatcggc cacaaactg 19
<210> 130
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer
<400> 130
ttgttccctt ctcatctgca t 21
<210> 131
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer
<400> 131
ccttgacctt attctccacg a 21
<210> 132
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer
<400> 132
cctactccca ctcggtcct 19
<210> 133
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer
<400> 133
ctgatttctt gggtttgctg t 21
<210> 134
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer
<400> 134
agagctccac agcgcttc 18
<210> 135
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer
<400> 135
cagcacctgg gaggtgaa 18
<210> 136
<211> 26
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer
<400> 136
tcttaaagac cacatggtag aacagt 26
<210> 137
<211> 17
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer
<400> 137
agctgctgtt gggattg 17
<210> 138
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer
<400> 138
gctgtgccct taacaaaagc 20
<210> 139
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer
<400> 139
ggctgaggtg gcatgtct 18
<210> 140
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer
<400> 140
agccacatcg ctcagacac 19
<210> 141
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer
<400> 141
gcccaatacg accaaatcc 19
<210> 142
<211> 11
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> anti-CD19 scFv CDRL1
<400> 142
Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Lys Tyr Leu Asn
1 5 10
<210> 143
<211> 7
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> anti-CD19 scFv CDRL2
<400> 143
Ser Arg Leu His Ser Gly Val
1 5
<210> 144
<211> 9
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> anti-CD19 scFv CDRL3
<400> 144
Gly Asn Thr Leu Pro Tyr Thr Phe Gly
1 5
<210> 145
<211> 5
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> anti-CD19 scFv CDRH1
<400> 145
Asp Tyr Gly Val Ser
1 5
<210> 146
<211> 16
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> anti-CD19 scFv CDRH2
<400> 146
Val Thr Trp Gly Ser Glu Thr Thr Tyr Tyr Asn Ser Ala Leu Lys Ser
1 5 10 15
<210> 147
<211> 7
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> anti-CD19 scFv CDRH3
<400> 147
Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly
1 5
Claims (147)
- 암 치료를 필요로 하는 대상체에서 암을 치료하는 방법으로서,
상기 대상체에 투여한 후 T 세포에 의해 선택적으로 항-ROR1 키메라 항원 수용체 (CAR), 항-CD19 CAR 또는 B 형 간염 항원 특이적 T 세포 수용체 (TCR)의 일시적 발현을 초래하는 나노입자를 선택하는 단계;
선택된 나노입자의 치료적 유효량을 상기 대상체에 투여하는 단계;
상기 항-ROR1 CAR, 항-CD19 CAR, 또는 B 형 간염 항원 특이적 TCR의 발현에 대해 상기 대상체를 모니터링하는 단계; 및
상기 항-ROR1 CAR, 항-CD19 CAR 또는 B 형 간염 항원 특이적 TCR의 발현 수준이 역치 미만으로 떨어지는 경우 선택된 나노입자의 제2 치료적 유효량을 상기 대상체에 투여하여, 암 치료를 필요로 하는 대상체에서 암을 치료하는 단계를 포함하며;
여기서 상기 선택된 나노입자는
(i) 폴리(β-아미노 에스테르) (PBAE) 코어 내에 캡슐화된 항-ROR1 CAR, 항-CD19 CAR, 또는 B 형 간염 항원 특이적 TCR을 코딩하는 시험관 내 전사된 (IVT) mRNA;
(ii) PBAE 코어의 외부 표면 상의 폴리글루탐산 (PGA) 코팅; 및
(iii) PGA에 공유 결합되고 상기 코팅의 표면으로부터 연장되는 CD4 및/또는 CD8 결합 도메인을 포함하는, 방법. - 제1항에 있어서, 상기 일시적 발현이 2 주 이하로 지속되는, 방법.
- 제1항에 있어서, 상기 대상체 내의 암 부위에서 국소적으로 T 세포 유인제 및/또는 단핵구/대식세포 유인제로 상기 대상체를 사전컨디셔닝하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
- 제3항에 있어서, 상기 T 세포 유인제가 CCL21 또는 IP10을 포함하는, 방법.
- 제3항에 있어서, 상기 단핵구/대식세포 유인제가 CCL2, CCL3, CCL5, CCL7, CCL8, CCL13, CCL17 또는 CCL22를 포함하는, 방법.
- 제1항에 있어서,
상기 대상체에 투여한 후 대식세포에 의해 선택적으로 대식세포 활성화제의 발현을 초래하는 제2 나노입자를 선택하는 단계;
상기 대상체에 제2 선택된 나노입자의 치료적 유효량을 투여하는 단계;
상기 대식세포 활성화제의 발현에 대해 상기 대상체를 모니터링하는 단계; 및
상기 대식세포 활성화제의 발현 수준이 역치 미만으로 떨어지는 경우 상기 대상체에 제2 선택된 나노입자의 제2 치료적 유효량을 투여하는 단계를 추가로 포함하며;
여기서 상기 선택된 제2 나노입자는
(i) PBAE 코어 내에 캡슐화된 대식세포 활성화제를 코딩하는 IVT mRNA;
(ii) PBAE 코어의 외부 표면 상의 PGA 코팅; 및
(iii) 상기 코팅의 표면으로부터 연장되는 디-만노스를 포함하는, 방법. - 제6항에 있어서, 상기 대식세포 활성화제가 키나제 IKKβ와 조합된 전사 인자 인터페론-조절 인자 (IRF) 5를 포함하는, 방법.
- 치료를 필요로 하는 대상체를 치료하는 방법으로서,
상기 대상체에 투여한 후 선택된 세포 유형에 의한 치료적 단백질의 발현을 초래하는 나노입자를 선택하는 단계 및
상기 대상체에 선택된 나노입자의 제1 치료적 유효량을 투여하여, 치료를 필요로 하는 대상체를 치료하는 단계를 포함하되, 여기서 상기 치료적 단백질의 발현이 투여 후 10 일 이내에 검출가능한 한계 미만으로 떨어지는, 방법. - 제8항에 있어서, 상기 치료적 단백질의 발현이 투여 후 7 일 이내에 검출가능한 한계 미만으로 떨어지는, 방법.
- 제8항에 있어서, 상기 대상체에 선택된 나노입자의 제2 치료적 유효량을 투여하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
- 제10항에 있어서, 상기 제2 치료적 유효량의 투여가 치료적 단백질의 발현이 검출가능한 한계 미만으로 떨어진 후에 발생하는, 방법.
- 제10항에 있어서, 상기 제2 치료적 유효량의 투여가 치료적 단백질의 발현이 검출가능한 한계 미만으로 떨어지기 전에 발생하는, 방법.
- 제10항에 있어서, 상기 제1 치료적 유효량 및 상기 제2 치료적 유효량이 5 일 간격, 6 일 간격, 7 일 간격, 8 일 간격, 9 일 간격 또는 10 일 간격으로 투여되는, 방법.
- 제8항에 있어서, 상기 투여가 전신 또는 국소 투여를 포함하는, 방법.
- 제14항에 있어서, 상기 투여가 종양 부위에서 국소 투여를 포함하는, 방법.
- 제8항에 있어서, 상기 투여가 카테터를 통한 (a) 종양으로 또는 그 근위의 (종양 내), (b) 정맥으로 (정맥 내), 또는 (c) 복막으로 (복막 내) 주사 또는 주입을 포함하는, 방법.
- 제8항에 있어서, 상기 치료적 단백질이 세포 표면 수용체를 포함하는 질환 특이적 수용체를 포함하는, 방법.
- 제17항에 있어서, 상기 질환 특이적 수용체가 CAR, TCR 또는 이들의 하이브리드를 포함하는, 방법.
- 제8항에 있어서, 상기 치료적 단백질이 1928z 또는 4-1BBz 세포 내 도메인을 갖는 백혈병-특이적 항-CD19 CAR, 1928z 또는 4-1BBz 세포 내 도메인을 갖는 전립선 종양 특이적 항-ROR1 CAR, 또는 B 형 간염 바이러스 (HBV) 코어 항원 특이적 HB코어18-27 TCR을 포함하는, 방법.
- 제8항에 있어서, 상기 치료적 단백질이 대식세포 자극 단백질을 포함하는, 방법.
- 제20항에 있어서, 상기 대식세포 자극 단백질이 키나제 IKKβ와 조합된 전사 인자 IRF5를 포함하는, 방법.
- 제20항에 있어서, 상기 대식세포 자극 단백질이 IRF5, IRF1, IRF3, IRF7, IRF8, 및/또는 IRF7 및 IRF3의 융합으로부터 선택된 하나 이상의 IRF를 포함하는, 방법.
- 제22항에 있어서, 상기 IRF7/IRF3 융합 단백질이 서열번호 39를 포함하는, 방법.
- 제22항에 있어서, 상기 하나 이상의 IRF가 기능적 자가억제 도메인이 결여된, 방법.
- 제22항에 있어서, 상기 하나 이상의 IRF가 기능적 핵 방출 신호 (NES)가 결여된, 방법.
- 제22항에 있어서, 상기 하나 이상의 IRF가 서열번호 25-41에 대해 >90%, >95% 또는 >98% 동일성을 갖는 서열로부터 선택되는, 방법.
- 제22항에 있어서, 상기 하나 이상의 IRF가 서열번호 25-31로부터 선택된 IRF5인, 방법.
- 제27항에 있어서, IRF5는 S156D, S158D 및 T160D로부터 선택된 하나 이상의 돌연변이를 갖는 서열번호 25 또는 서열번호 27을 포함하는, 방법.
- 제27항에 있어서, IRF5가 T10D, S158D, S309D, S317D, S451D 및 S462D로부터 선택된 하나 이상의 돌연변이를 갖는 서열번호 26을 포함하는, 방법.
- 제27항에 있어서, IRF5가 S425D, S427D, S430D 및 S436D로부터 선택된 하나 이상의 돌연변이를 갖는 서열번호 28을 포함하는, 방법.
- 제22항에 있어서, 상기 하나 이상의 IRF가 서열번호 32 및 36으로부터 선택된 IRF1인, 방법.
- 제22항에 있어서, 상기 하나 이상의 IRF가 서열번호 35, 40 및 41로부터 선택된 IRF8인, 방법.
- 제32항에 있어서, IRF8이 K310R 돌연변이를 갖는 서열번호 35를 포함하는, 방법.
- 제21항에 있어서, 상기 코딩된 IKKβ가 서열번호 42-46에 대해 >90%, >95% 또는 >98% 동일성을 갖는 서열로부터 선택되는, 방법.
- 제21항에 있어서, 상기 코딩된 IKKβ가 서열번호 42-46으로부터 선택되는, 방법.
- 제8항에 있어서, 상기 치료적 단백질이 글루코코르티코이드-유도된 류진 지퍼 (GILZ)를 포함하는, 방법.
- 제8항에 있어서, 상기 선택되고 투여된 나노입자가 <130 nm인, 방법.
- 제8항에 있어서, 상기 선택되고 투여된 나노입자가:
(i) 양으로 하전된 담체 매트릭스 내에 캡슐화된 합성 mRNA로서, 여기서 상기 합성 mRNA는 치료적 단백질을 코딩하는 것인 합성 mRNA;
(ii) 상기 담체 매트릭스의 외부 표면 상의 중성으로 또는 음으로 하전된 코팅; 및
(iii) 상기 코팅의 표면으로부터 연장되는 적어도 하나의 선택된 세포 표적화 리간드로서, 이러한 선택된 세포 표적화 리간드는 선택된 세포 유형 상의 마커에 특이적으로 결합하는 것인 세포 표적화 리간드를 포함하는, 방법. - 제38항에 있어서, 상기 합성 mRNA가 IVT mRNA를 포함하는, 방법.
- 제38항에 있어서, 상기 양으로 하전된 담체 매트릭스가 양으로 하전된 지질 또는 중합체를 포함하는, 방법.
- 제40항에 있어서, 상기 양으로 하전된 지질 또는 중합체가 PBAE, 폴리(L-리신), 폴리(에틸렌 이민) (PEI), 폴리-(아미도아민) 덴드리머 (PAMAM), 폴리(아민-코-에스테르), 폴리(디메틸아미노에틸 메타크릴레이트) (PDMAEMA), 키토산, 폴리-(L-락티드-코-L-리신), 폴리[α-(4-아미노부틸)-L-글리콜산] (PAGA) 또는 폴리(4-하이드록시-L-프롤린 에스테르) (PHP)를 포함하는, 방법.
- 제40항에 있어서, 상기 양으로 하전된 중합체가 PBAE를 포함하는, 방법.
- 제38항에 있어서, 상기 중성으로 또는 음으로 하전된 코팅이 PGA, 폴리(아크릴산), 알긴산 또는 콜레스테릴 헤미석시네이트/1,2-디올레오일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민을 포함하는, 방법.
- 제38항에 있어서, 상기 중성으로 또는 음으로 하전된 코팅이 PGA를 포함하는, 방법.
- 제38항에 있어서, 상기 중성으로 또는 음으로 하전된 코팅이 쯔비터이온성 중합체를 포함하는, 방법.
- 제38항에 있어서, 상기 중성으로 또는 음으로 하전된 코팅이 리포솜을 포함하는, 방법.
- 제46항에 있어서, 상기 리포솜이 1,2-디올레오일-3-트리메틸암모늄-프로판 (DOTAP), 1,2-디-O-옥타데세닐-3-트리메틸암모늄 프로판 (DOTMA), 3ß-[N-(N',N'-디메틸아미노에탄)-카바모일]콜레스테롤 (DC-Chol), 디옥타데실-아미도글리실스퍼민 (DOGS), 콜레스테롤, 1,2-디올레오일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민 (DOPE) 또는 1,2-디올레오일-sn-글리세로-3-포스포콜린 (DOPC)를 포함하는, 방법.
- 제38항에 있어서, 상기 적어도 하나의 선택된 세포 표적화 리간드가 림프구에 선택적으로 결합하고 수용체-유도된 내포작용을 개시하는, 방법.
- 제38항에 있어서, 상기 적어도 하나의 선택된 세포 표적화 리간드가 CD4 및/또는 CD8에 선택적으로 결합하는, 방법.
- 제38항에 있어서, 상기 적어도 하나의 선택된 세포 표적화 리간드가 CD4 항체 및/또는 CD8 항체로부터 선택된 결합 도메인을 포함하는, 방법.
- 제38항에 있어서, 상기 적어도 하나의 선택된 세포 표적화 리간드가 CD4 항체 및/또는 CD8 항체의 scFv 단편으로부터 선택된 결합 도메인을 포함하는, 방법.
- 제38항에 있어서, 상기 적어도 하나의 선택된 세포 표적화 리간드가 CD4 항체 및/또는 CD8 항체로부터 선택된 결합 도메인을 포함하고; 담체가 PBAE를 포함하고; 코팅이 PGA를 포함하는, 방법.
- 제38항에 있어서, 상기 적어도 하나의 선택된 세포 표적화가 CD206, CD163 또는 CD23에 결합하는, 방법.
- 제38항에 있어서, 상기 적어도 하나의 선택된 세포 표적화 리간드가 디-만노스를 포함하는, 방법.
- 제38항에 있어서, 상기 적어도 하나의 선택된 세포 표적화가 CD38, G-단백질 커플링된 수용체 18 (Gpr18), 포르밀 펩티드 수용체 2 (Fpr2), CD64 또는 CD68에 결합하는, 방법.
- 제8항에 있어서, 세포 유인제의 치료적 유효량을 상기 대상체에 투여하는 것을 추가로 포함하는, 방법.
- 제56항에 있어서, 상기 세포 유인제가 T 세포 유인제를 포함하는, 방법.
- 제57항에 있어서, 상기 T 세포 유인제가 CCL21 또는 IP10을 포함하는, 방법.
- 제57항에 있어서, 상기 T 세포 유인제가 CCL1, CCL2, CCL17, CCL22, CXCL9, CXCL10 또는 CXCL11을 포함하는, 방법.
- 제56항에 있어서, 상기 세포 유인제가 단핵구/대식세포 유인제를 포함하는, 방법.
- 제60항에 있어서, 상기 단핵구/대식세포 유인제가 CCL2, CCL3, CCL5, CCL7, CCL8, CCL13, CCL17 또는 CCL22를 포함하는, 방법.
- 제56항에 있어서, 상기 세포 유인제가 비만 세포 유인제를 포함하는, 방법.
- 제62항에 있어서, 상기 비만 세포 유인제가 CCL2 또는 CCL5를 포함하는, 방법.
- 제56항에 있어서, 상기 세포 유인제가 호산구 유인제를 포함하는, 방법.
- 제64항에 있어서, 상기 호산구 유인제가 CCL3, CCL5, CCL7, CCL11, CCL13, CCL24, 또는 CCL26을 포함하는, 방법.
- 제56항에 있어서, 상기 세포 유인제가 호중구 유인제를 포함하는, 방법.
- 제66항에 있어서, 상기 호중구 유인제가 IL-8 또는 NAP1을 포함하는, 방법.
- 제56항에 있어서, 상기 세포 유인제가 나노입자의 제1 치료적 유효량이 투여되기 전에 대상체에 투여되는, 방법.
- 제56항에 있어서, 상기 세포 유인제가 선택된 나노입자의 제1 치료적 유효량이 투여되기 1 시간 이하 전, 3 시간 이하 전, 6 시간 이하 전, 12 시간 이하 전 또는 24 시간 이하 전에 투여되는, 방법.
- 제56항에 있어서, 상기 세포 유인제가 선택된 나노입자의 제1 치료적 유효량이 투여되기 적어도 1 시간 전, 적어도 3 시간 전, 적어도 6 시간 전, 적어도 12 시간 전 또는 적어도 24 시간 전에 투여되는, 방법.
- 제56항에 있어서, (a) 선택된 나노입자의 제1 치료적 유효량의 제1 용량이 투여된 후에만 상기 세포 유인제가 투여되는, 방법.
- 제8항에 있어서, 상기 대상체가 암 또는 감염성 질환에 대한 치료를 필요로 하는, 방법.
- 제72항에 있어서, 상기 암이 백혈병, 전립선암, B 형 간염-유도된 간세포 암종, 난소암, 교모세포종 또는 폐암인, 방법.
- 치료를 필요로 하는 대상체를 치료하는 방법으로서,
(i) 양으로 하전된 담체 매트릭스 내에 캡슐화된 합성 mRNA로서, 여기서 상기 합성 mRNA는 치료적 단백질, 폴리뉴클레오티드 또는 이들의 조합을 코딩하는 것인 합성 mRNA;
(ii) 중성으로 또는 음으로 하전된 코팅; 및
(iii) 상기 코팅의 표면으로부터 연장되는 적어도 하나의 세포 표적화 리간드로서, 이러한 세포 표적화 리간드는 선택된 세포에 대해 특이적인, 세포 표적화 리간드
를 포함하는 나노입자의 치료적 유효량을 상기 대상체에 투여하여, 치료를 필요로 하는 대상체를 치료하는 단계를 포함하며;
여기서 선택된 세포가 합성 mRNA로부터 치료적 단백질, 폴리뉴클레오티드 또는 이들의 조합을 발현하도록 상기 나노입자가 대상체 내의 선택된 세포 내로 선택적으로 혼입되는, 방법. - 제74항에 있어서, 세포 유인제의 유효량을 상기 대상체에 투여하는 것을 추가로 포함하는, 방법.
- 제75항에 있어서, 상기 세포 유인제가 T 세포 유인제인, 방법.
- 제76항에 있어서, 상기 T 세포 유인제가 CCL21 또는 IP10인, 방법.
- 제74항에 있어서, 상기 합성 mRNA가 치료적 단백질을 코딩하고, 치료적 단백질이 세포 표면 수용체를 포함하는 적어도 하나의 질환-특이적 수용체를 포함하는, 방법.
- 제78항에 있어서, 상기 적어도 하나의 질환-특이적 수용체가 CAR 또는 TCR을 포함하는, 방법.
- 제78항에 있어서, 상기 치료적 단백질이 1928z 또는 4-1BBz 세포 내 도메인을 갖는 백혈병-특이적 항-CD19 CAR, 1928z 또는 4-1BBz 세포 내 도메인을 갖는 전립선 종양 특이적 항-ROR1 CAR, 또는 HBV 코어 항원 특이적 HB코어18-27 TCR을 포함하는, 방법.
- 제74항에 있어서, 상기 적어도 하나의 세포 표적화 리간드가 림프구에 선택적으로 결합하고 수용체-유도된 내포작용을 개시하는, 방법.
- 제74항에 있어서, 상기 치료적 단백질의 발현이 14 일 이하, 12 일 이하, 10 일 이하, 9 일 이하, 8 일 이하, 7 일 이하, 6 일 이하 또는 5 일 이하인, 방법.
- 제74항에 있어서, 상기 대상체에 나노입자의 치료적 유효량을 투여하는 단계가 나노입자의 2 회 이상의 용량을 투여하는 단계를 포함하는, 방법.
- 제83항에 있어서, 상기 2 회 이상의 용량이 5-10 일 마다, 또는 6-8 일 마다, 또는 7 일 마다 투여되는, 방법.
- 제74항에 있어서, 상기 대상체가 암 또는 감염성 질환에 대한 치료를 필요로 하는, 방법.
- 제74항에 있어서, 상기 나노입자의 치료적 유효량을 투여하는 단계가 카테터를 통한 (a) 종양으로 또는 그 근위의 (종양 내), (b) 정맥으로 (정맥 내), 또는 (c) 복막으로 (복막 내) 주사 또는 주입을 포함하는, 방법.
- 제76항에 있어서, 상기 T 세포 유인제를 투여하는 단계가 카테터를 통한 종양으로 또는 그 근위의 (종양 내) 주사 또는 주입, 정맥 내 주사 또는 주입, 또는 카테터를 통한 복막 내 주사 또는 주입을 포함하는, 방법.
- 제75항에 있어서, 상기 세포 유인제가 나노입자의 치료적 유효량이 투여되기 전에 대상체에 투여되는, 방법.
- 제88항에 있어서, 상기 나노입자의 치료적 유효량이 투여되기 1 시간 이하 전, 3 시간 이하 전, 6 시간 이하 전, 12 시간 이하 전, 또는 24 시간 이하 전에 상기 세포 유인제가 투여되는, 방법.
- 제75항에 있어서, 상기 세포 유인제가 (a) 나노입자의 치료적 유효량의 제1 용량 이후에만; (b) 나노입자의 치료적 유효량의 적어도 2 회의 용량 각각 이후; 또는 (c) 나노입자의 치료적 유효량의 각각의 용량 이후에 투여되는, 방법.
- 제74항에 있어서, 상기 대상체에 대식세포 자극 조성물을 투여하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
- 제91항에 있어서, 상기 대식세포 자극 조성물이 대식세포 세포에 표적화된 나노입자를 포함하고, 키나제 IKKβ와 조합하여 전사 인자 인터페론-조절 인자 5 (IRF5)의 발현을 지시할 수 있는, 방법.
- 제74항에 있어서, 상기 담체 매트릭스가 양으로 하전된 지질 또는 중합체를 포함하는, 방법.
- 제93항에 있어서, 상기 양으로 하전된 중합체가 PBAE, 폴리(L-리신), PEI, PAMAM, 폴리(아민-코-에스테르), PDMAEMA, 키토산, 폴리-(L-락티드-코-L-리신), PAGA 또는 PHP를 포함하는, 방법.
- 제74항에 있어서, 상기 코팅이 중성으로 또는 음으로 하전된 지질 또는 중합체를 포함하는, 방법.
- 제74항에 있어서, 상기 중성으로 또는 음으로 하전된 코팅이 PGA, 폴리(아크릴산), 알긴산 또는 콜레스테릴 헤미석시네이트/1,2-디올레오일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민을 포함하는, 방법.
- 제74항에 있어서, 상기 중성으로 또는 음으로 하전된 코팅이 쯔비터이온성 중합체를 포함하는, 방법.
- 제74항에 있어서, 상기 중성으로 또는 음으로 하전된 코팅이 리포솜을 포함하는, 방법.
- 제98항에 있어서, 상기 리포솜이 DOTAP, DOTMA, DC-Chol, DOGS, 콜레스테롤, DOPE 또는 DOPC를 포함하는, 방법.
- 제74항에 있어서, 상기 적어도 하나의 세포 표적화 리간드가 CD4 및/또는 CD8에 선택적으로 결합하는, 방법.
- 제74항에 있어서, 상기 적어도 하나의 세포 표적화 리간드가 CD4 항체 및/또는 CD8 항체로부터 선택된 결합 도메인을 포함하는, 방법.
- 제74항에 있어서, 상기 적어도 하나의 세포 표적화 리간드가 CD4 항체 및/또는 CD8 항체의 scFv 단편으로부터 선택된 결합 도메인을 포함하는, 방법.
- 제74항에 있어서, 상기 담체 매트릭스가 PBAE를 포함하는, 방법.
- 제74항에 있어서, 상기 코팅이 PGA를 포함하는, 방법.
- 제74항에 있어서, 상기 적어도 하나의 세포 표적화 리간드가 CD4 항체 및/또는 CD8 항체로부터 선택된 결합 도메인을 포함하고; 담체 매트릭스가 PBAE를 포함하고; 코팅이 PGA를 포함하는, 방법.
- 합성 나노입자로서,
(i) 치료적 단백질을 코딩하고 양으로 하전된 담체 내에 캡슐화된 합성 mRNA;
(ii) 중성으로 또는 음으로 하전된 코팅; 및
(iii) 상기 코팅의 표면으로부터 연장되는 선택된 세포 표적화 리간드를 포함하며;
여기서 상기 치료적 단백질은 1928z 또는 4-1BBz 세포 내 도메인을 갖는 백혈병-특이적 항-CD19 CAR, 1928z 또는 4-1BBz 세포 내 도메인을 갖는 전립선 종양 특이적 항-ROR1 CAR, 또는 HBV 코어 항원 특이적 HB코어18-27 TCR인, 합성 나노입자. - 제106항에 있어서, 상기 담체가 양으로 하전된 지질 또는 중합체를 포함하는, 합성 나노입자.
- 제107항에 있어서, 상기 양으로 하전된 지질 또는 중합체가 PBAE, 폴리(L-리신), PEI, PAMAM, 폴리(아민-코-에스테르), PDMAEMA, 키토산, 폴리-(L-락티드-코-L-리신), PAGA 또는 PHP를 포함하는, 합성 나노입자.
- 제106항에 있어서, 상기 코팅이 중성으로 또는 음으로 하전된 지질 또는 중합체를 포함하는, 합성 나노입자.
- 제106항에 있어서, 상기 중성으로 또는 음으로 하전된 코팅이 PGA, 폴리(아크릴산), 알긴산 또는 콜레스테릴 헤미석시네이트/1,2-디올레오일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민을 포함하는, 합성 나노입자.
- 제106항에 있어서, 상기 중성으로 또는 음으로 하전된 코팅이 쯔비터이온성 중합체를 포함하는, 합성 나노입자.
- 제106항에 있어서, 상기 중성으로 또는 음으로 하전된 코팅이 리포솜을 포함하는, 합성 나노입자.
- 제112항에 있어서, 상기 리포솜이 DOTAP, DOTMA, DC-Chol, DOGS, 콜레스테롤, DOPE 또는 DOPC를 포함하는, 합성 나노입자.
- 제106항에 있어서, 상기 선택된 세포 표적화 리간드가 CD4 및/또는 CD8에 선택적으로 결합하는, 합성 나노입자.
- 제106항에 있어서, 상기 선택된 세포 표적화 리간드가 CD4 항체 및/또는 CD8 항체로부터 선택된 결합 도메인을 포함하는, 합성 나노입자.
- 제106항에 있어서, 상기 선택된 세포 표적화 리간드가 CD4 항체 및/또는 CD8 항체의 scFv 단편으로부터 선택된 결합 도메인을 포함하는, 합성 나노입자.
- 제106항에 있어서, 상기 담체가 PBAE를 포함하는, 합성 나노입자.
- 제106항에 있어서, 상기 코팅이 PGA를 포함하는, 합성 나노입자.
- 제106항에 있어서, 상기 선택된 세포 표적화 리간드가 CD4 항체 및/또는 CD8 항체로부터 선택된 결합 도메인을 포함하고; 담체가 PBAE를 포함하고; 코팅이 PGA를 포함하는, 합성 나노입자.
- 제106항의 합성 나노입자를 포함하는 조성물.
- 제106항의 나노입자 또는 제120항의 조성물의 치료적 유효량을 투여하여 치료를 필요로 하는 대상체를 치료하는 단계를 포함하는, 치료를 필요로 하는 대상체를 치료하는 방법.
- 제121항에 있어서, 상기 나노입자 또는 상기 조성물의 치료적 유효량을 투여하기 전에 T 세포 유인제를 상기 대상체에 투여하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
- 제121항에 있어서, 상기 대상체가 감염성 질환에 대한 치료를 필요로 하는, 방법.
- 제123항에 있어서, 상기 감염성 질환이 아데노바이러스, 아레나바이러스, 버냐바이러스, 코로나바이러스, 플라비르바이러스, 한타바이러스, 헤파드나바이러스, 헤르페스바이러스, 파필로마바이러스, 파라믹소바이러스, 파보바이러스, 피코르나바이러스, 폭스바이러스, 오르토믹소바이러스, 레트로바이러스, 레오바이러스, 랍도바이러스, 로타바이러스, 해면상 바이러스 또는 토가바이러스 감염성 질환인, 방법.
- 제123항에 있어서, 상기 감염성 질환이 거대세포바이러스 (CMV), 감기 바이러스, 엡스타인-바, 독감 바이러스, 간염 바이러스, 단순 헤르페스, HIV, 인플루엔자, 일본 뇌염, 홍역, 소아마비, 광견병, 호흡기 세포융합 바이러스, 풍진, 천연두, 바리셀라 조스터 또는 웨스트 나일 바이러스 감염성 질환인 것인, 방법.
- 제121항에 있어서, 상기 대상체가 암에 대한 치료를 필요로 하는, 방법.
- 제126항에 있어서, 상기 암이 백혈병인, 방법.
- 제126항에 있어서, 상기 암이 림프종인, 방법.
- 제126항에 있어서, 상기 암이 줄기세포암 또는 흑색종인, 방법.
- 제126항에 있어서, 상기 암이 고형-기관 종양인, 방법.
- 제130항에 있어서, 상기 고형-기관 종양이 전립선 암인, 방법.
- 제130항에 있어서, 상기 고형 기관 종양이 유방암, 난소암, 중피종, 신장 세포 암종, 췌장암, 폐암 또는 HBV-유도된 간세포 암종인, 방법.
- 제121항에 있어서, 상기 방법이 투여 후 치료적 단백질을 발현하는 생체 내 T 세포의 적어도 20%, 적어도 30%, 적어도 40%, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 또는 적어도 90%을 달성하는, 방법.
- 제126항에 있어서, 상기 방법이 대상체의 적어도 20%, 적어도 30%, 적어도 40%, 적어도 50%, 적어도 60%, 또는 적어도 70%에서 암의 박멸을 초래하는, 방법.
- 제126항에 있어서, 상기 대상체가 재발성 대상체이고, 상기 방법이 재발성 대상체의 생존에서 평균 적어도 10 일, 적어도 15 일, 적어도 20 일, 적어도 25 일, 적어도 30 일, 적어도 35 일 또는 적어도 37 일의 개선을 초래하는 것인, 방법.
- 제121항에 있어서, 상기 방법이 생체 외 나노입자와 접촉된 T 세포의 이식과 적어도 대략 동일한 효능을 초래하는, 방법.
- 제121항에 있어서, 상기 방법이 생체 외 형질도입된 CAR+ T 세포의 이식과 적어도 대략 동일한 효능을 초래하는, 방법.
- 제106항의 합성 나노입자 및 약학적으로 허용가능한 부형제를 포함하는 약학 조성물.
- 동결건조된 형태의 제106항의 합성 나노입자를 포함하는 약학 조성물.
- 제139항의 조성물을 약학적으로 허용가능한 담체로 재구성하여 용액을 형성하는 단계 및 상기 용액을 대상체에 주사하는 단계를 포함하는, 대상체를 치료하는 방법.
- 제106항의 합성 나노입자 및 질환 또는 장애 치료에 사용하기 위한 지침서를 포함하는 키트.
- 제141항에 있어서, 상기 합성 나노입자가 동결건조된, 키트.
- 제141항에 있어서, 상기 합성 나노입자가 용액에 있는, 키트.
- 제141항에 있어서, 약학적으로 허용가능한 담체를 추가로 포함하는, 키트.
- 제141항에 있어서, 주사 장치를 추가로 포함하는, 키트.
- 제141항에 있어서, 세포 유인제를 추가로 포함하는, 키트.
- 양으로 하전된 담체 매트릭스, 중성으로 또는 음으로 하전된 코팅, 적어도 하나의 세포 표적화 리간드 및 합성 mRNA를 포함하는 키트.
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