CN111568856B - 一种阴道凝胶制剂及其制备方法 - Google Patents

一种阴道凝胶制剂及其制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种阴道凝胶制剂及其制备方法，阴道凝胶制剂包括载体、治疗用基因，所述阴道凝胶制剂还包括亲水高分子材料改性蒙脱土，所述载体包括阳离子聚合物。本发明的阴道凝胶制剂能够很好的稳定的纳米粒子的结构，具有高的转染效率，治疗效果好，安全性高，可以通过阴道局部施用。本发明的阴道凝胶制剂制备过程简单，试剂配方灵活。

Description

一种阴道凝胶制剂及其制备方法
技术领域
本发明属于基因治疗领域，具体涉及一种阴道凝胶制剂及其制备方法。
背景技术
基因组编辑在治疗遗传性疾病方面已显示出可喜的成功。然而，基因治疗成功的关键之一是基因工程的递送工具。由于纳米尺寸，低毒性，长周期时间和良好的可塑性，聚合物纳米粒子(NPs)已经实现了基因治疗的高效传递。
基于特定的治疗目标和药物动力学，基因治疗可以系统地或局部地进行。阴道有几个特点，有利于治疗分子的传递，包括DNA，RNA和蛋白质。阴道路径具有充足的血供、高接触面积和对几种物质的适当渗透性，允许全身和局部给药。它还避免了口服给药时遇到的肝脏首过效应和胃肠道液体。此外，一些局部疾病，如乳头瘤状病毒(HPV)感染引起的病变甚至宫颈癌均可通过阴道局部给药的方式进行治疗。与全身给药相比，阴道局部给药在治疗生殖道感染方面具有独特的优势。例如，局部使用基因组编辑工具治疗HPV感染，可以提高治疗效果，最大限度地减少脱靶引起的副作用。然而，在将该技术转化为临床医学之前，仍有一些重大障碍有待克服。开发阴道基因治疗药物的一个主要困难是外源基因物质容易被局部的微生物降解、通过阴道和宫颈粘液时效率低。因此，保护基因不被降解、提高其粘液穿透能力是开发阴道基因递送体系的重点问题。此外，为了避免流出开放的生殖道，制剂需要配制成栓剂、凝胶、片、阴道环等形式，以达到生殖道保留、长时间释放的目的。但是，在这些制剂中基因递送纳米粒的结构能否保持稳定是一个巨大的挑战。阴道和宫颈粘液成分复杂，如果纳米粒在制剂中不能保持其结构稳定(如分解为阳离子聚合物和基因)，其在释放后很容易受到粘液中蛋白质/酶、细菌分泌物、无机盐等影响而无法再自组装成为具有高转染效率的基因-阳离子聚合物纳米粒结构，进而影响基因的转染及后续的治疗效果。因此，开发能保持能保持纳米粒结构稳定的制剂是阴道基因递送系统的重要环节。
发明内容
本发明的目的是提供一种适合阴道给药，能够有效传递外源基因的阴道凝胶制剂及其制备方法。
为达到上述目的，本发明采用的技术方案是：
本发明一方面提供一种阴道凝胶制剂，包括载体、治疗用基因，所述阴道凝胶制剂还包括亲水高分子材料改性蒙脱土，所述载体包括阳离子聚合物。
优选地，所述亲水高分子材料改性蒙脱土为采用选自壳聚糖、壳寡糖、纤维素衍生物、淀粉衍生物、明胶、虫胶、西黄蓍胶、阿拉伯胶、果胶、黄原胶、聚维酮、聚乙烯醇、聚氧乙烯中的一种或几种改性剂对蒙脱土进行改性得到。
进一步优选地，所述亲水高分子材料改性蒙脱土中所述亲水高分子材料和所述蒙脱土的质量比为0.1～1∶1，优选为0.1～5∶1。
本发明中采用的未改性的蒙脱土原料优选为天然蒙脱土，其含Al2O316.54％、MgO4.65％、SiO250.95％，其结构式为(Al，Mg)2〔SiO10〕(OH)2·n H2O，其为单斜晶系。
优选地，所述亲水高分子材料改性蒙脱土还包括钠盐。
进一步优选地，所述的钠盐为碳酸氢钠、磷酸氢二钠、柠檬酸氢二钠、醋酸钠中的一种或几种。
进一步优选地，所述的钠盐与所述的蒙脱土的质量比为0.001～0.05∶1，优选为0.005～0.05∶1。
优选地，所述阳离子聚合物与所述亲水高分子材料改性蒙脱土的质量比为1∶1～1000，进一步优选为1∶1～100，更优选为1∶1～40。
优选地，所述的阴道凝胶制剂的制备方法包括通过采用所述载体和所述治疗用基因制备纳米粒，以及将所述纳米粒、所述亲水高分子材料改性蒙脱土以及水混合的步骤。
进一步优选地，所述的纳米粒中载体与治疗用基因的质量比为10～150∶1，进一步优选为10～100∶1，更优选为10～80∶1。
进一步优选地，所述的纳米粒的粒径范围是10～1000nm，优选为200～400nm。
进一步优选地，所述的纳米粒表面带电。
优选地，所述的阳离子聚合物为聚β-氨基酯(PBAE)、聚赖氨酸(PLL)、聚乙烯亚胺(PEI)、聚酰胺-胺(PAMAM)中的一种或几种。
进一步优选地，所述的聚β-氨基酯由1，4-丁二醇二丙烯酸酯单体、5-氨基-1-戊醇单体和1-(3-氨基丙基)-4-甲基哌嗪单体制得。
进一步优选地，所述的聚β-氨基酯的结构通式为
Figure BDA0002555450310000021
其中，m为5～200之间的数，优选为15～30之间的数。
进一步优选地，所述的聚β-氨基酯的数均分子量为1500～60000，优选为5000～8000。
进一步优选地，所述的聚β-氨基酯的制备方法为：先将1，4-丁二醇二丙烯酸酯和5-氨基-1-戊醇在80～100℃下反应30～40h，经后处理得到中间体，然后将中间体与1-(3-氨基丙基)-4-甲基哌嗪在10～40℃下反应20～30h，经后处理得到所述的聚β-氨基酯。
更为优选地，所述的1，4-丁二醇二丙烯酸酯和所述的5-氨基-1-戊醇的投料摩尔比为1∶0.8～1.2，所述的中间体与所述的1-(3-氨基丙基)-4-甲基哌嗪的投料摩尔比为1∶4～6。
优选地，所述的治疗用基因为质粒、DNA、RNA中的一种或几种。
进一步优选地，所述的治疗用基因为靶向PERV-Pol基因的可转录为sgRNA的DNA与SpCas9构成的质粒。
更优选为，所述的可转录为sgRNA的DNA的序列如SEQ ID NO.1和/或SEQ ID NO.2所示。
更优选地，所述的SpCas9为SpCas9-HF1和/或eSpCas9。
根据一种具体且优选实施方式，所述的治疗用基因为SpCas9-sgRNA-1和/或SpCas9-sgRNA-3，其中，所述的SpCas9-sgRNA-1的序列如SEQ ID NO.3所示，所述的SpCas9-sgRNA-1的序列如SEQ ID NO.4所示。
优选地，所述阴道凝胶制剂的pH为4～8，进一步优选为4.5～5.5。
本发明中，所述的阴道凝胶制剂中含有纳米粒。
本发明中的阴道凝胶制剂还包括酸性缓冲液，所述的酸性缓冲液为柠檬酸缓冲液、醋酸缓冲液、磷酸缓冲液中的一种或多种。
进一步优选地，所述的酸性缓冲液的pH为4～6。
本发明中，所述酸性缓冲液的浓度以及用量，所述的水的用量可以根据凝胶制剂所需要的粘稠度进行调整。
本发明第二方面提供一种阴道凝胶制剂，包括基质以及纳米粒，所述的基质包括亲水高分子材料改性蒙脱土，所述的纳米粒包括阳离子聚合物和治疗用基因。
该方案中的亲水高分子材料改性蒙脱土、阳离子聚合物和治疗用基因与本发明第一方面提供的阴道凝胶制剂中的原料均相同，此处不再赘述。
根据一种具体且优选实施方式，所述的亲水高分子材料改性蒙脱土为采用选自壳聚糖、壳寡糖、壳聚糖衍生物、纤维素衍生物、淀粉衍生物、明胶、虫胶、西黄蓍胶、阿拉伯胶、果胶、黄原胶、聚维酮、聚乙烯醇、聚氧乙烯中的一种或几种改性剂对蒙脱土进行改性得到；所述的阳离子聚合物为聚β-氨基酯，其结构通式为，其中，m为5～200之间的数；所述的治疗用基因为SpCas9-HF1和/或eSpCas9与可转录为sgRNA-1的DNA和/或可转录为sgRNA-3的DNA所形成的质粒，其中，可转录为sgRNA-1的DNA的序列为TTCGAATGGAGAGATCCAGG，可转录为sgRNA-3的DNA的序列为GGTGACCCTCCTCCAGTACG。
本发明第三方面提供一种所述的阴道凝胶制剂的制备方法，包括如下步骤：
使所述载体和所述治疗用基因在酸性缓冲液中形成纳米粒，获得含纳米粒的混合物；
将所述含纳米粒的混合物与所述的亲水高分子材料改性蒙脱土直接混合制成所述的阴道凝胶制剂，或者，将亲水高分子材料改性蒙脱土分散于水和/或酸性缓冲液之后，再与所述含纳米粒的混合物混合。
优选地，所述制备方法还包括制备亲水高分子材料改性蒙脱土的步骤：将蒙脱土和亲水高分子材料加入水中，选择性地加入钠盐，混合搅拌，然后调节pH至4～6，搅拌、静置后，将上层胶状液体烘干粉碎制得所述的亲水高分子材料改性蒙脱土。
进一步优选地，所述的混合搅拌的温度为50～90℃，时间1～10h。
进一步优选地，调节pH后，在50～90℃下恒温搅拌0.5～2h，然后冷却，加水搅拌均匀，再进行静置。
进一步优选地，采用酸调节所述的pH，所述的酸为磷酸、柠檬酸、醋酸中的一种或几种。
根据一种具体且优选实施方式，所述的亲水高分子材料改性蒙脱土的制备方法为：将所述的蒙脱土和所述的钠盐加入水中，混合均匀后，加入所述的亲水高分子材料，继续搅拌，在密封搅拌下升温至50～90℃，保持1～10h，用酸调节pH至4～6，恒温搅拌0.5～2h，冷却至室温，加水搅拌均匀，静置30～60min后，取上层胶状液体烘干粉碎制得所述的亲水高分子材料改性蒙脱土。
优选地，所述的步骤(3)的具体方法为：将所述的亲水高分子材料改性蒙脱土与水混合，然后加入酸性缓冲液，再加入所述的纳米粒，搅拌均匀即可。
本发明的第四方面是提供一种治疗用基因的阴道递送方法，首先将治疗用基因与载体制成纳米粒，然后将所述的纳米粒与亲水高分子材料改性蒙脱土混合制成凝胶制剂，再将所述的凝胶制剂施用与阴道内即可。
本发明的第五方面是提供一种给药方式，所述的阴道凝胶制剂采用阴道局部给药。
本发明的第六方面是提供一种所述的阴道凝胶制剂在阴道/宫颈疾病基因治疗中的应用。
具体地，所述的疾病包括HPV感染相关的宫颈病变、宫颈癌或单纯疱疹病毒(HSV)感染等。
本发明的阴道凝胶制剂只需要在18～25℃左右进行储存，而且该制剂可以自行使用，为患者和医生提供了方便。
由于上述技术方案运用，本发明与现有技术相比具有下列优点：
本发明的阴道凝胶制剂能够很好的稳定的纳米粒子的结构，具有高的转染效率，治疗效果好，安全性高，可以通过阴道局部施用。
本发明的阴道凝胶制剂制备过程简单，试剂配方灵活。
附图说明
图1为PBAE聚合物和PBAE-质粒多聚体NPs的表征结果；
图2为各基质或凝胶的扫描电镜图；
图3为NPs-mMMT凝胶中NPs的释放情况结果图；
图4为小鼠活体成像图；
图5为不同阳离子聚合物制备的凝胶制剂的转染效率结果对比；
图6为mMMT和HTT制备的凝胶制剂的转染效率结果对比；
图7为阴道涂片中GFP+细胞的阳性比例；
图8为实施例4的实验结果；
图9为实施例5的实验结果；
图10为炎症细胞因子IFN-γ和TNF-α的免疫化学检测结果。
具体实施方式
下面结合附图所示的实施例对本发明作进一步描述。但本发明并不限于以下实施例。实施例中采用的实施条件可以根据具体使用的不同要求做进一步调整，未注明的实施条件为本行业中的常规条件。
下述实施例中使用的主要原材料如下：
1，4-丁二醇二丙烯酸酯(BDD)和5-氨基-1-戊醇(AP)购自TCI(中国上海)。
1-(3-氨基丙基)-4-甲基哌嗪(AMP)购自Alfa Aesar(L04876，美国)。
聚乙烯亚胺25kD(PEI 25kD)(Cat，28968)购自Polyscience(400valley Road，Warrington)。
聚赖氨酸购自阿拉丁试剂。
PAMAM购自山东威海晨源。
pMAX-GFP(CAS：8603168)购自Bio Vector NTCC(北京，中国)。
编码Cas9和sgRNA的质粒(CRISPR/Cas9质粒)购自Addgene(#58778)。
按照Mali等人(Mali P，Yang L，Esvelt KM，Aach J，Guell M，DiCarlo JE，etal.RNA-guided human genome engineering via Cas9.Science.2013；339(6121)：823-6)的方法设计了3条针对/靶向PERV-pol基因(Accession No.AJ279056.1)的sgRNA，由GENEWIZ(中国江苏)合成。双链寡核苷酸标签(Tsai SQ，Zheng Z，Nguyen NT，Liebers M，Topkar VV，Thapar V，et al.GUIDE-seq enables genome-wide profiling of off-target cleavage by CRISPR-Cas nucleases.Nature biotechnology.2015；33(2)：187-97)的具体序列为：正向，5′G*T*TTAATTGAGTTGTCATATGTTAATAACGGT*A*T3′；反向，5′A*T*ACCGTTATTAACATATGACAACTCAATTAA*A*C 3′(*表示磷酸化)。制作″寡核苷酸标签″的方法是：将两条寡核苷酸用STE缓冲液(10mM Tris pH8.0，50mM NaCl，1mM EDTA)溶解，浓度为2OD/100uL，等摩尔混合，94℃孵育5min，冷却至室温。本发明中使用的所有sgRNAs均见表1。
实施例1、凝胶剂的制备
一、PBAE聚合物的合成
将BDD、AP和AMP按以下方法制成PBAE聚合物：首先将BDD(用对羟基苯甲醚MEHQ稳定)和AP按1∶1的摩尔比混合，在磁力搅拌板上于90℃、N2气氛下搅拌36小时，上述反应后，用二甲基甲酰胺(DMF)稀释，沉淀后用冷乙醚洗涤。经真空干燥除去乙醚后，将中间产物(i-PBAE)在室温下干燥。其次，将i-PBAE溶于无水DMF中，与5倍摩尔量的AMP在室温下搅拌反应24小时，然后将反应产物在冷的无水二乙醚中沉淀。最后，将最终聚合物(PBAE)用二乙醚洗涤三次，在真空下干燥48小时，室温下保存备用。
PBAE聚合物的合成方程式见图1A。
通过1H-NMR光谱(Bruker AVANCE III 400MHz NMR光谱仪，溶剂：CDCl3)表征i-PBAE和PBAE的结构，谱图如图1B所示，化学位移值为4.062ppm的峰属于PABE和i-PABE的BDD单元上的-COOCH2-的氢信号峰，1.32-1.53ppm区域是AP上的亚甲基-CH2-的氢信号峰，而2.42、2.65和2.85ppm峰是-N(CH2)2-、-NCH2CH2OCO和-NCH2CH2OCO-的氢信号峰，i-PABE光谱的5.80-6.40ppm区域是烯丙基端基的氢信号峰，其未从合成的PABE光谱中检测到，表明C-C双键和AMP之间的成功反应。
本实施例制得的PBAE的数均分子量(Mn)为6980Da，其通过凝胶渗透色谱(GPC，Waters-2410系统)，Waters 2414折射率检测器(流动相：DMF，标准品：窄色散聚苯乙烯)测定，将样品溶解在浓度为0.3wt％的二甲基甲酰胺(DMF)中，测试结果如图1C所示。
通过傅里叶变换红外光谱(FTIR，PerkinElmer Spectrum Two，32次重复扫描设置)表征i-PBAE和PBAE的结构，谱图如图1D所示，1730cm-1的峰特别来自i-PABE和PBAE的BDD链上的脂肪酯-CH2-COO-CH2-。此外，3200-3500cm-1之间的宽峰证明在主链上存在-OH，而i-PBAE的独特1639和1620cm-1峰是C-C双键的烃拉伸振动峰，其在PBAE谱中也消失。上述结果与1H-NMR的结果一致，表明PBAE成功合成。
二、PBAE-质粒多聚体NPs的制备与表征
为了制备PBAE-质粒多聚体NPs，将PBAE溶于pH值为5.0的柠檬酸缓冲液中，通过超声波溶解得到聚合物溶液(浓度20mg/mL)。将聚合物溶液与质粒按PBAE与质粒的重量比为75∶1均匀混合，涡流振荡，在室温下孵育30min，得到PBAE-质粒多聚体NPs。
PBAE-质粒多聚体NPs的表征采用动态光散射(DLS，Zetaplus，Brookhaven，USA)和透射电子显微镜(Hitachi HT7700，Japan)进行，测试结果见图1E和1F，扫描电镜图(TEM)的检测结果如图1G。
经研究发现，PBAE和pDNA的比例最优为75∶1，此时从图1E和1F可见，平均粒径为317.1±5.3nm，PDI为0.267(图1E)和表面电荷为34.9±6.5mV(图1F)。
载体材料PBAE和pDNA通过静电相互作用被压缩，因此NPs被压缩并密集地带电。通过透射电子显微镜(TEM)，我们观察到复合NPs的形态如图1G所示。电子显微照片表明，由PBAE形成的复合NPs都为球状颗粒，尺寸分布在240nm左右，具有优异的分散性能，这小于DLS试验的结果。这种现象是由于多聚复合物NPs的脱水和收缩引起的。
对于PEI-质粒多聚体NPs、聚赖氨酸-质粒多聚体NPs、PAMAM-质粒多聚体NPs等，只需要采用PEI、聚赖氨酸、PAMAM等代替PBAE与质粒混合，其中，质粒DNA与25kda liner PEI按照质量比为10∶1混合，其余阳离子聚合物与质粒的质量比仍为75∶1。
三、阴道凝胶制剂的制备
NPs-HTT凝胶的制备：将66.65mg锂皂石(HTT)与1mL水在磁力搅拌器中1000-1500rpm下混合，分散20-30min后，加入0.11mL 10×柠檬酸缓冲液(柠檬酸：1mol/L，柠檬酸钠：1mol/L，pH值：4.7)，再加入1mL PBAE-质粒多聚体NPs(含质粒DNA 250μg和寡核苷酸标签100μg)，直至混合均匀，该凝胶的pH为5.0。
NPs-mMMT凝胶的制备：
1、制备改性蒙脱土mMMT
将100mg药用天然蒙脱土与1mg柠檬酸氢二钠盐、20mg水混合后搅拌均匀，加入10mg甲基纤维素改性剂继续搅拌，密封搅拌下缓慢升温至70℃、保持5h，用柠檬酸调节至pH为5，恒温搅拌1h，冷却至室温，加水250mg搅拌均匀、静置40分钟后取上层胶状液体、烘干粉碎制得mMMT。
2、NPs-mMMT凝胶的制备
将60mg mMMT与1mL水以1000-1500rpm在磁搅拌器中混合，分散20-30min。加入0.11mL 10×柠檬酸缓冲液(柠檬酸：1mol/L，柠檬酸钠：1mol/L，pH值：4.7)，加入1mL PBAE-质粒多聚体NPs(含质粒DNA 250微克和寡核苷酸标签100μg)，搅拌均匀，即得，该凝胶的pH为5.0。
NPs-F127凝胶的制备：与上述两种凝胶的制备方法相同，不同之处在于用温敏凝胶普朗尼克F127代替HTT或mMMT，该凝胶的pH为5.0。
其他阳离子聚合物凝胶只需要采用相应的聚合物-质粒复合纳米粒代替PBAE-质粒复合纳米粒即可，例如用PEI-质粒复合纳米粒、聚赖氨酸-质粒复合纳米粒、PAMAM-质粒复合纳米粒等代替PBAE-质粒复合纳米粒，下文简称NPs或复合纳米粒。
用扫描电镜(SEM，日本日立SU8010)在2kV下观察PBAE-质粒复合纳米粒(即图2中的复合纳米粒)、改性蒙脱土凝胶基质(即上述NPs-mMMT凝胶制备时，未加入1mL PBAE-质粒多聚体NPs时制得的基质)、NPs-mMMT凝胶(即图2中的复合纳米粒子-改性蒙脱土凝胶)、锂皂石凝胶基质(即上述NPs-HTT凝胶制备时，未加入1mL PBAE-质粒多聚体NPs时制得的基质)、NPs-HTT凝胶(即图2中的复合纳米粒子-锂皂石凝胶)、F127凝胶基质(即上述NPs-F127凝胶制备时，未加入1mL PBAE-质粒多聚体NPs时制得的基质)、以及NPs-F127凝胶(即图2中的复合纳米粒子-F127凝胶基质)，测试结果如图2所示。试验前，将样品以涂层形式固定在硅片上，然后喷金，为了观察配方的稳定性，将凝胶在室温下保存3天，然后用SEM观察。
NPs-mMMT凝胶用4倍体积的柠檬酸缓冲液稀释凝胶，用0.45μm的过滤器过滤，测试凝胶中NPs的释放情况，该溶液用DLS测试，以测量从凝胶中释放的NPs的直径，在室温下经过不同的储存时间(1天和3天)后，用同样的方法测量NPs的大小，测试结果见图3。
从图2和图3可见，mMMT凝胶中的NPs没有变化，可维持NP结构的稳定性，稀释后可以从凝胶基质中以纳米颗粒的形式直接释放，并且具有很好的储存稳定性，室温下储存三天释放出的纳米粒粒子直径保持不变。而在HTT凝胶及温敏凝胶普朗尼克F127中，NPs受基质影响较大，不能保持纳米粒结构。
实施例2、小鼠活体实验
我们通过活体成像技术评估了NPs-mMMT凝胶在昆明小鼠模型中的阴道滞留能力。将荧光染料Ce-6在制备复合纳米粒时按占复合纳米粒总质量1％质量比混入，得到Ce-6标记的NPs，进而按实施例1的方案制备Ce-6标记的PBAE-质粒复合纳米粒凝胶(NPs-mMMTgel)。然后将游离的荧光染料Ce-6和Ce-6标记的PBAE-质粒复合纳米粒凝胶分别放入小鼠阴道，测试结果如图4所示，游离荧光染料(Ce-6)的信号在一天之内消失了。对于mMMT凝胶，在第3天可以发现强烈的荧光。这些结果表明mMMT凝胶具有良好的阴道滞留能力，可提高基因药物在阴道的作用时间。
实施例3、猪实验
(一)、不同阳离子聚合物转染效果对比
为了评价我们阴道凝胶制剂的转染效率，在实施例1的PBAE-质粒复合纳米粒、PEI-质粒复合纳米粒、PAMAM-质粒复合纳米粒的制备过程中，按照实施例2的方法在制备复合纳米粒时，所述质粒(报告基因)为绿色荧光蛋白质粒(G印)。
我们选择了大型哺乳动物猪作为实验对象，因为猪的基因组与人类非常接近，猪为一月龄普通家猪。
给药时，每头猪分别给与GFP标记的PBAE-质粒复合纳米粒、PEI-质粒复合纳米粒、PAMAM-质粒复合纳米粒中的一种，给药量为2mL，并且将阴道凝胶均匀地铺展在猪的阴道表面、子宫颈表面和阴道后穹隆上。我们在第1天和第4天给药，然后在第7天用刷子(类似于巴图涂片)收集宫颈细胞，将取样的宫颈细胞储存在宫颈细胞保存液中，并通过在715g离心5分钟收集。然后，我们用相同体积的PBS重悬细胞，并用DAPI染色后直接分析，并用细胞计数器计数一定体积中的细胞数，从而计算收集的细胞总数。对于每一组，我们取约2.5×104个细胞用于荧光显微镜和流式细胞术进行检测，然后通过荧光显微镜(Leica DMI8)和流式细胞术(C6，BD，USA)检测每组的转染效率，测试结果见图5。空白组细胞几乎无绿色荧光，不含阳离子聚合物的GFP-mMMT也几乎无GFP表达，而GFP-PBAE mMMT、GFP-PEI mMMT、GFP-PAMAMmMMT组表现出了明显的GFP表达，分别为57.0％、41.5％和24.9％。显然，使用mMMT+阳离子材料PBAE制作阴道凝胶时，可以得到了更高比例的GFP阳性细胞，进而实现有效的阴道内基因递送。
(二)、mMMT和HTT的转染效果对比
在实施例1的PBAE-质粒多聚体NPs的制备过程中，按照实施例2的方法在制备复合纳米粒时按占复合纳米粒总质量1％质量比混入绿色荧光蛋白(GFP)，进而按实施例1的方案分别以mMMT和HTT为基质制备PBAE-GFP NPs-mMMT和PBAE-GFP NPs-HTT。
GFP-HTT和GFP-mMMT的制备基本上与上述PBAE-GFP NPs-mMMT和PBAE-GFP NPs-HTT的制备相同，不同之处仅在于省略PBAE。
然后按照与本实施例第一部分相同的方法测试转染效率，测试结果见图6。
同时，收集子宫颈以及器官(卵巢、尿道、阴道和子宫)，用PBS冲洗以除去任何粘附的脂肪或任何其它额外的组织，然后在4％多聚甲醛中固定，切成3-5μm厚的切片，用于H&E染色和IHC染色，测试结果见图7，同时，进行三组重复并统计阴道涂片中GFP+细胞的比例，结果为空白组中0.30％±0.05％；GFP-HTT组为1.41％±0.28％；GFP-mMMT组中1.80％±0.24％；PBAE-GFP NPs-HTT组为25.79％±1.56％；PBAE-GFP NPs-mMMT组中分别为51.12％±1.23％。
显然，当使用mMMT材料制备阴道凝胶时，获得了高得多的GFP阳性细胞比例(p值＜0.0001)。同时，无PBAE的递送显示低的转染效率，这表明阳离子聚合物PBAE作为基因递送载体是必需的。总之，数据表明我们的PBAE-GFP NPs-mMMT凝胶比PBAE-GFP NP-HTT凝胶更有效地进行体内阴道内DNA递送。
实施例4、凝胶系统的阴道病毒清除
猪内源性逆转录病毒(PERVs)整合在所有猪的基因组中，并以感染性颗粒的形式释放出来。在某些条件下，它们可以感染人类细胞，并与人类性传播病毒具有相似性。因此，本研究选择PERVs作为治疗靶点，测试凝胶系统在大型哺乳动物猪中病毒整合片段清除能力。
PERV是一种逆转录病毒，可以将其DNA整合到猪的基因组中形成原病毒。其基因组主要由三个基因PERV-gag、pol和env组成，可与宿主基因组一起复制。前期研究证实pol基因在组织中的拷贝数高于gag和env基因，因此我们设计了靶向PERV-pol基因的sgRNAs。根据Zhang实验室的网站(Doench JG，Fusi N，Sullender M，Hegde M，Vaimberg EW，DonovanKF，et al.Optimized sgRNA design to maximize activity and minimize off-targeteffects of CRISPR-Cas9.Nature biotechnology.2016；34(2)：184-91)，我们选择了3个评分最高的sgRNA，构建了SpCas9-sgRNA质粒(SpCas9-sgRNA-1、SpCas9-sgRNA-2、SpCas9-sgRNA-3)。然后制备含有相应PBAE质粒NPs的阴道mMMT凝胶(制备方法同实施例1)。因为我们之前的实验表明，如果靶点发生突变，CRISPR/Cas9系统的编辑效率就会受到影响。因此，在动物实验前，我们常规对PERV DNA进行Sanger测序，以确认PERV序列是否有突变(测试结果见图8A)。结果显示，sgRNA-2的靶DNA有一个碱基突变，可能影响CRISPR/Cas9系统的编辑效率(测试结果见图8B)。因此，我们选择sgRNA-1和sgRNA-3进行进一步实验。
给药时，每头猪给予2mL PBAE-CRISPR/Cas9质粒mMMT凝胶(含CRISPR/Cas9基因编辑系统质粒250ug)(即实施例1制备得到的NPs-mMMT凝胶)，均匀分布于1个月大猪阴道表面、宫颈表面和阴道后穹窿。第1天和第4天给药，第7天收集细胞。之后在母猪宫颈口周围旋转刷3次以获取细胞(这与人类患者的巴氏涂片采集方法非常相似)。取宫颈细胞置于宫颈细胞保存液中，715g离心5min。然后用相同体积的PBS重悬细胞，用细胞计数仪计数一定体积的细胞数，计算收集的细胞总数。每组取约2.5×104个细胞进行分析。
DNA提取和PCR
用DNeasy Blood&Tissue Kit 69506，Qiagen，Germany)试剂盒提取DNA。PCR反应采用Q5热启动高保真2×Master Mix(M0494S，NEW ENGLAND BioLabs，USA)进行。所使用的引物见表1。qPCR使用PowerUpSYBRGreen Master Mix(A25742，Applied Biosystems，USA)在Bio-Rad CFX96仪器进行。实验进行3次生物学重复，以猪GAPDH基因为内参基因，采用2-ΔΔCT方法计算PERV拷贝数的相对表达变化。所使用的引物见表1。
表1 PCR和qPCR引物
Figure BDA0002555450310000071
Figure BDA0002555450310000081
我们证明了基于PBAE NPs的mMMT凝胶可以有效地将CRISPR/Cas9系统导入猪阴道上皮，并且靶向该部位的PERV，并显著减少了病毒的拷贝数。将PBAE-SpCas9/sgRNA-1 NPs-mMMT阴道凝胶应用于猪阴道后，成功地减少了PERV的病毒拷贝数(图8E)。
如果SpCas9在体内将阴道内的PERV DNA切割，那么oligo就会插入切割部位。对插入部位基因组和oligo DNA进行PCR反应(一条引物在oligo上，另一条引物在靠近目标的基因组位点上)的可以产生约200bp的正确大小(测试结果见图8C)。与预期的一样，Sanger-Sequencings证明SpCas9-PERV sgRNA质粒在体内有效的切断了猪宫颈上皮细胞的PERVDNA序列，oligo被正确的插入(图8C)。进一步的qPCR也显示了PBAE-SpCas9 NPs凝胶处理组PERV拷贝数的减少。与治疗前相比，sgRNA-1组PERV拷贝数减少34％，sgRNA-3组PERV拷贝数减少17％，说明sgRNA-1的切割效率优于sgRNA-3(图8E)。
为了在不影响基因组编辑效率的前提下减少脱靶位点，SpCas9核酸酶的特异性通过两个变体得到提高：eSpCas9和SpCas9-HF1。因此，在本研究中，我们进一步测试了eSpCas9和SpCas9-HF1以及sgRNA-1在mMMT凝胶中的有效性。与对照组相比，SpCas9-HF1组PERV拷贝数减少了约42％，eSpCas9组减少了34％，说明基于SpCas9-HF1的阴道凝胶更有效(P＜0.05，图8F)。由于质粒传递可引发影响PBAE拷贝数的炎症反应，我们添加实验组PBAE-spcas9-HF1(不带sgRNA)NPs-mMMT凝胶作为另一个对照组观察这一现象。我们发现，未加sgRNA处理的SpCas9-HF1组PERV拷贝数与处理前相比没有变化(图8F)，说明质粒传递没有引起影响PERV拷贝数的免疫应答。
综上所述，这些数据表明我们基于PBAE-Cas9 NPs-mMMT阴道凝胶的体内DNA传递已经实现了有效的局部基因组编辑。
实施例5、凝胶剂的安全性评价
对猪实施安乐死后，将其宫颈、卵巢、尿道、阴道和子宫分离固定(4％多聚甲醛)。石蜡包埋切片(5mm)根据Proteintech协议(http://www.ptgcn.com/support/protocols)进行IHC染色。
我们首先评估了输送系统的生物分布。因为我们系统中的CRISPR/Cas9质粒含有Flag标签，所以当质粒被递送至猪器官的某个位置并成功转染后，Flag就会表达出来。我们采用免疫组化(IHC)方法对Flag标记在阴道、尿道、宫颈、卵巢和子宫等不同器官的表达进行了染色。可见，只有阴道和宫颈组织表现出Flag，其中阴道最强。标记在其他器官组织中没有表达，说明我们的系统在阴道和子宫颈局部工作，不扩散到附近的器官(图9A)。接下来，对NPs-mMMT凝胶处理的猪进行血常规和血液生化测试，以评估其毒性。血液检测反映了全身多个系统的正常代谢，包括造血系统和免疫系统。血液生化指标中谷丙转氨酶(ALT)、谷草转氨酶(AST)和碱性磷酸酶(ALP)与肝脏功能有关，而谷丙转氨酶(BUN)是肾脏的重要指标。在第1天和第4天给予常规mMMT凝胶，采集血液和血清，于治疗前一天和第7天进行血检和血液生化检查。血常规WBC、RBC等指标与给药前比较无显著性差异(P＜0.05，图9B)。血液生化测试也得到了类似的结果(图9C)。进一步对宫颈、卵巢、尿道、阴道和子宫进行苏木精-伊红染色(H&E)，评价药物的毒性，结果显示未见形态异常、病理水肿、炎性坏死和凋亡小体(图9D)。
我们还对PBAE-SpCas9/sgRNA NPs-mMMT治疗组和对照组的阴道、宫颈和尿道腔内的炎症细胞因子IFN-γ和TNF-α进行了免疫化学检测，以证实结果。没有观察到明显的炎症细胞因子染色(图10)。数据表明我们的给药配方相对安全，具有局部阴道生物分布和低毒的特点，这也有利于凝胶系统今后在临床试验中的应用。
上述统计分析的所有定量数据表示为来自至少三次平行测量的平均值±SD。统计分析采用单因素方差分析，并通过GraphPad Prism软件(GraphPad Prism 8)进行事后检验和T检验来计算，其中P＜0.05作为显著差异。
上述实施例只为说明本发明的技术构思及特点，其目的在于让熟悉此项技术的人士能够了解本发明的内容并据以实施，并不能以此限制本发明的保护范围。凡根据本发明精神实质所作的等效变化或修饰，都应涵盖在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 珠海舒桐医疗科技有限公司
<120> 一种阴道凝胶制剂及其制备方法
<160> 4
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(rengongxulie)
<400> 1
ttcgaatgga gagatccagg 20
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(rengongxulie)
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<211> 9429
<212> DNA
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agagatgatc gaggaacggc tgaaaaccta tgcccacctg ttcgacgaca aagtgatgaa 3420
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catccgggac aagcagtccg gcaagacaat cctggatttc ctgaagtccg acggcttcgc 3540
caacagaaac ttcatgcagc tgatccacga cgacagcctg acctttaaag aggacatcca 3600
gaaagcccag gtgtccggcc agggcgatag cctgcacgag cacattgcca atctggccgg 3660
cagccccgcc attaagaagg gcatcctgca gacagtgaag gtggtggacg agctcgtgaa 3720
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cacccagaag ggacagaaga acagccgcga gagaatgaag cggatcgaag agggcatcaa 3840
agagctgggc agccagatcc tgaaagaaca ccccgtggaa aacacccagc tgcagaacga 3900
gaagctgtac ctgtactacc tgcagaatgg gcgggatatg tacgtggacc aggaactgga 3960
catcaaccgg ctgtccgact acgatgtgga ccatatcgtg cctcagagct ttctgaagga 4020
cgactccatc gacaacaagg tgctgaccag aagcgacaag aaccggggca agagcgacaa 4080
cgtgccctcc gaagaggtcg tgaagaagat gaagaactac tggcggcagc tgctgaacgc 4140
caagctgatt acccagagaa agttcgacaa tctgaccaag gccgagagag gcggcctgag 4200
cgaactggat aaggccggct tcatcaagag acagctggtg gaaacccggc agatcacaaa 4260
gcacgtggca cagatcctgg actcccggat gaacactaag tacgacgaga atgacaagct 4320
gatccgggaa gtgaaagtga tcaccctgaa gtccaagctg gtgtccgatt tccggaagga 4380
tttccagttt tacaaagtgc gcgagatcaa caactaccac cacgcccacg acgcctacct 4440
gaacgccgtc gtgggaaccg ccctgatcaa aaagtaccct aagctggaaa gcgagttcgt 4500
gtacggcgac tacaaggtgt acgacgtgcg gaagatgatc gccaagagcg agcaggaaat 4560
cggcaaggct accgccaagt acttcttcta cagcaacatc atgaactttt tcaagaccga 4620
gattaccctg gccaacggcg agatccggaa gcggcctctg atcgagacaa acggcgaaac 4680
cggggagatc gtgtgggata agggccggga ttttgccacc gtgcggaaag tgctgagcat 4740
gccccaagtg aatatcgtga aaaagaccga ggtgcagaca ggcggcttca gcaaagagtc 4800
tatcctgccc aagaggaaca gcgataagct gatcgccaga aagaaggact gggaccctaa 4860
gaagtacggc ggcttcgaca gccccaccgt ggcctattct gtgctggtgg tggccaaagt 4920
ggaaaagggc aagtccaaga aactgaagag tgtgaaagag ctgctgggga tcaccatcat 4980
ggaaagaagc agcttcgaga agaatcccat cgactttctg gaagccaagg gctacaaaga 5040
agtgaaaaag gacctgatca tcaagctgcc taagtactcc ctgttcgagc tggaaaacgg 5100
ccggaagaga atgctggcct ctgccggcga actgcagaag ggaaacgaac tggccctgcc 5160
ctccaaatat gtgaacttcc tgtacctggc cagccactat gagaagctga agggctcccc 5220
cgaggataat gagcagaaac agctgtttgt ggaacagcac aagcactacc tggacgagat 5280
catcgagcag atcagcgagt tctccaagag agtgatcctg gccgacgcta atctggacaa 5340
agtgctgtcc gcctacaaca agcaccggga taagcccatc agagagcagg ccgagaatat 5400
catccacctg tttaccctga ccaatctggg agcccctgcc gccttcaagt actttgacac 5460
caccatcgac cggaagaggt acaccagcac caaagaggtg ctggacgcca ccctgatcca 5520
ccagagcatc accggcctgt acgagacacg gatcgacctg tctcagctgg gaggcgacaa 5580
aaggccggcg gccacgaaaa aggccggcca ggcaaaaaag aaaaagggat ccgagggcag 5640
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gagcggcctg cccgccatgg agatcgagtg ccgcatcacc ggcaccctga acggcgtgga 5760
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cggcttctac cacttcggca cctaccccag cggctacgag aaccccttcc tgcacgccat 5940
caacaacggc ggctacacca acacccgcat cgagaagtac gaggacggcg gcgtgctgca 6000
cgtgagcttc agctaccgct acgaggccgg ccgcgtgatc ggcgacttca aggtggtggg 6060
caccggcttc cccgaggaca gcgtgatctt caccgacaag atcatccgca gcaacgccac 6120
cgtggagcac ctgcacccca tgggcgataa cgtgctggtg ggcagcttcg cccgcacctt 6180
cagcctgcgc gacggcggct actacagctt cgtggtggac agccacatgc acttcaagag 6240
cgccatccac cccagcatcc tgcagaacgg gggccccatg ttcgccttcc gccgcgtgga 6300
ggagctgcac agcaacaccg agctgggcat cgtggagtac cagcacgcct tcaagacccc 6360
catcgccttc gccagatccc gcgctcagtc gtccaattct gccgtggacg gcaccgccgg 6420
acccggctcc accggatctc gctaagaatt cctagagctc gctgatcagc ctcgactgtg 6480
ccttctagtt gccagccatc tgttgtttgc ccctcccccg tgccttcctt gaccctggaa 6540
ggtgccactc ccactgtcct ttcctaataa aatgaggaaa ttgcatcgca ttgtctgagt 6600
aggtgtcatt ctattctggg gggtggggtg gggcaggaca gcaaggggga ggattgggaa 6660
gagaatagca ggcatgctgg ggagcggccg caggaacccc tagtgatgga gttggccact 6720
ccctctctgc gcgctcgctc gctcactgag gccgggcgac caaaggtcgc ccgacgcccg 6780
ggctttgccc gggcggcctc agtgagcgag cgagcgcgca gctgcctgca ggggcgcctg 6840
atgcggtatt ttctccttac gcatctgtgc ggtatttcac accgcatacg tcaaagcaac 6900
catagtacgc gccctgtagc ggcgcattaa gcgcggcggg tgtggtggtt acgcgcagcg 6960
tgaccgctac acttgccagc gccctagcgc ccgctccttt cgctttcttc ccttcctttc 7020
tcgccacgtt cgccggcttt ccccgtcaag ctctaaatcg ggggctccct ttagggttcc 7080
gatttagtgc tttacggcac ctcgacccca aaaaacttga tttgggtgat ggttcacgta 7140
gtgggccatc gccctgatag acggtttttc gccctttgac gttggagtcc acgttcttta 7200
atagtggact cttgttccaa actggaacaa cactcaaccc tatctcgggc tattcttttg 7260
atttataagg gattttgccg atttcggcct attggttaaa aaatgagctg atttaacaaa 7320
aatttaacgc gaattttaac aaaatattaa cgtttacaat tttatggtgc actctcagta 7380
caatctgctc tgatgccgca tagttaagcc agccccgaca cccgccaaca cccgctgacg 7440
cgccctgacg ggcttgtctg ctcccggcat ccgcttacag acaagctgtg accgtctccg 7500
ggagctgcat gtgtcagagg ttttcaccgt catcaccgaa acgcgcgaga cgaaagggcc 7560
tcgtgatacg cctattttta taggttaatg tcatgataat aatggtttct tagacgtcag 7620
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gccttcctgt ttttgctcac ccagaaacgc tggtgaaagt aaaagatgct gaagatcagt 7860
tgggtgcacg agtgggttac atcgaactgg atctcaacag cggtaagatc cttgagagtt 7920
ttcgccccga agaacgtttt ccaatgatga gcacttttaa agttctgcta tgtggcgcgg 7980
tattatcccg tattgacgcc gggcaagagc aactcggtcg ccgcatacac tattctcaga 8040
atgacttggt tgagtactca ccagtcacag aaaagcatct tacggatggc atgacagtaa 8100
gagaattatg cagtgctgcc ataaccatga gtgataacac tgcggccaac ttacttctga 8160
caacgatcgg aggaccgaag gagctaaccg cttttttgca caacatgggg gatcatgtaa 8220
ctcgccttga tcgttgggaa ccggagctga atgaagccat accaaacgac gagcgtgaca 8280
ccacgatgcc tgtagcaatg gcaacaacgt tgcgcaaact attaactggc gaactactta 8340
ctctagcttc ccggcaacaa ttaatagact ggatggaggc ggataaagtt gcaggaccac 8400
ttctgcgctc ggcccttccg gctggctggt ttattgctga taaatctgga gccggtgagc 8460
gtggaagccg cggtatcatt gcagcactgg ggccagatgg taagccctcc cgtatcgtag 8520
ttatctacac gacggggagt caggcaacta tggatgaacg aaatagacag atcgctgaga 8580
taggtgcctc actgattaag cattggtaac tgtcagacca agtttactca tatatacttt 8640
agattgattt aaaacttcat ttttaattta aaaggatcta ggtgaagatc ctttttgata 8700
atctcatgac caaaatccct taacgtgagt tttcgttcca ctgagcgtca gaccccgtag 8760
aaaagatcaa aggatcttct tgagatcctt tttttctgcg cgtaatctgc tgcttgcaaa 8820
caaaaaaacc accgctacca gcggtggttt gtttgccgga tcaagagcta ccaactcttt 8880
ttccgaaggt aactggcttc agcagagcgc agataccaaa tactgtcctt ctagtgtagc 8940
cgtagttagg ccaccacttc aagaactctg tagcaccgcc tacatacctc gctctgctaa 9000
tcctgttacc agtggctgct gccagtggcg ataagtcgtg tcttaccggg ttggactcaa 9060
gacgatagtt accggataag gcgcagcggt cgggctgaac ggggggttcg tgcacacagc 9120
ccagcttgga gcgaacgacc tacaccgaac tgagatacct acagcgtgag ctatgagaaa 9180
gcgccacgct tcccgaaggg agaaaggcgg acaggtatcc ggtaagcggc agggtcggaa 9240
caggagagcg cacgagggag cttccagggg gaaacgcctg gtatctttat agtcctgtcg 9300
ggtttcgcca cctctgactt gagcgtcgat ttttgtgatg ctcgtcaggg gggcggagcc 9360
tatggaaaaa cgccagcaac gcggcctttt tacggttcct ggccttttgc tggccttttg 9420
ctcacatgt 9429
<210> 4
<211> 9429
<212> DNA
<213> 人工序列(rengongxulie)
<400> 4
tgtacaaaaa agcaggcttt aaaggaacca attcagtcga ctggatccgg taccaaggtc 60
gggcaggaag agggcctatt tcccatgatt ccttcatatt tgcatatacg atacaaggct 120
gttagagaga taattggaat taatttgact gtaaacacaa agatattagt acaaaatacg 180
tgacgtagaa agtaataatt tcttgggtag tttgcagttt taaaattatg ttttaaaatg 240
gactatcata tgcttaccgt aacttgaaag tatttcgatt tcttggcttt atatatcttg 300
tggaaaggac gaaacaccgg gtgaccctcc tccagtacgg ttttagagct agaaatagca 360
agttaaaata aggctagtcc gttatcaact tgaaaaagtg gcaccgagtc ggtgcttttt 420
ttctagaccc agctttcttg tacaaagttg gcattagttt tagagctaga aatagcaagt 480
taaaataagg ctagtccgtt tttagcgcgt gcgccaattc tgcagacaaa tggctctaga 540
ggtacccgtt acataactta cggtaaatgg cccgcctggc tgaccgccca acgacccccg 600
cccattgacg tcaatagtaa cgccaatagg gactttccat tgacgtcaat gggtggagta 660
tttacggtaa actgcccact tggcagtaca tcaagtgtat catatgccaa gtacgccccc 720
tattgacgtc aatgacggta aatggcccgc ctggcattgt gcccagtaca tgaccttatg 780
ggactttcct acttggcagt acatctacgt attagtcatc gctattacca tggtcgaggt 840
gagccccacg ttctgcttca ctctccccat ctcccccccc tccccacccc caattttgta 900
tttatttatt ttttaattat tttgtgcagc gatgggggcg gggggggggg gggggcgcgc 960
gccaggcggg gcggggcggg gcgaggggcg gggcggggcg aggcggagag gtgcggcggc 1020
agccaatcag agcggcgcgc tccgaaagtt tccttttatg gcgaggcggc ggcggcggcg 1080
gccctataaa aagcgaagcg cgcggcgggc gggagtcgct gcgacgctgc cttcgccccg 1140
tgccccgctc cgccgccgcc tcgcgccgcc cgccccggct ctgactgacc gcgttactcc 1200
cacaggtgag cgggcgggac ggcccttctc ctccgggctg taattagctg agcaagaggt 1260
aagggtttaa gggatggttg gttggtgggg tattaatgtt taattacctg gagcacctgc 1320
ctgaaatcac tttttttcag gttggaccgg tgccaccatg gactataagg accacgacgg 1380
agactacaag gatcatgata ttgattacaa agacgatgac gataagatgg ccccaaagaa 1440
gaagcggaag gtcggtatcc acggagtccc agcagccgac aagaagtaca gcatcggcct 1500
ggacatcggc accaactctg tgggctgggc cgtgatcacc gacgagtaca aggtgcccag 1560
caagaaattc aaggtgctgg gcaacaccga ccggcacagc atcaagaaga acctgatcgg 1620
agccctgctg ttcgacagcg gcgaaacagc cgaggccacc cggctgaaga gaaccgccag 1680
aagaagatac accagacgga agaaccggat ctgctatctg caagagatct tcagcaacga 1740
gatggccaag gtggacgaca gcttcttcca cagactggaa gagtccttcc tggtggaaga 1800
ggataagaag cacgagcggc accccatctt cggcaacatc gtggacgagg tggcctacca 1860
cgagaagtac cccaccatct accacctgag aaagaaactg gtggacagca ccgacaaggc 1920
cgacctgcgg ctgatctatc tggccctggc ccacatgatc aagttccggg gccacttcct 1980
gatcgagggc gacctgaacc ccgacaacag cgacgtggac aagctgttca tccagctggt 2040
gcagacctac aaccagctgt tcgaggaaaa ccccatcaac gccagcggcg tggacgccaa 2100
ggccatcctg tctgccagac tgagcaagag cagacggctg gaaaatctga tcgcccagct 2160
gcccggcgag aagaagaatg gcctgttcgg aaacctgatt gccctgagcc tgggcctgac 2220
ccccaacttc aagagcaact tcgacctggc cgaggatgcc aaactgcagc tgagcaagga 2280
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gtttctggcc gccaagaacc tgtccgacgc catcctgctg agcgacatcc tgagagtgaa 2400
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ccaggacctg accctgctga aagctctcgt gcggcagcag ctgcctgaga agtacaaaga 2520
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ggaagagttc tacaagttca tcaagcccat cctggaaaag atggacggca ccgaggaact 2640
gctcgtgaag ctgaacagag aggacctgct gcggaagcag cggaccttcg acaacggcag 2700
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ttacccattc ctgaaggaca accgggaaaa gatcgagaag atcctgacct tccgcatccc 2820
ctactacgtg ggccctctgg ccaggggaaa cagcagattc gcctggatga ccagaaagag 2880
cgaggaaacc atcaccccct ggaacttcga ggaagtggtg gacaagggcg cttccgccca 2940
gagcttcatc gagcggatga ccaacttcga taagaacctg cccaacgaga aggtgctgcc 3000
caagcacagc ctgctgtacg agtacttcac cgtgtataac gagctgacca aagtgaaata 3060
cgtgaccgag ggaatgagaa agcccgcctt cctgagcggc gagcagaaaa aggccatcgt 3120
ggacctgctg ttcaagacca accggaaagt gaccgtgaag cagctgaaag aggactactt 3180
caagaaaatc gagtgcttcg actccgtgga aatctccggc gtggaagatc ggttcaacgc 3240
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agagatgatc gaggaacggc tgaaaaccta tgcccacctg ttcgacgaca aagtgatgaa 3420
gcagctgaag cggcggagat acaccggctg gggcaggctg agccggaagc tgatcaacgg 3480
catccgggac aagcagtccg gcaagacaat cctggatttc ctgaagtccg acggcttcgc 3540
caacagaaac ttcatgcagc tgatccacga cgacagcctg acctttaaag aggacatcca 3600
gaaagcccag gtgtccggcc agggcgatag cctgcacgag cacattgcca atctggccgg 3660
cagccccgcc attaagaagg gcatcctgca gacagtgaag gtggtggacg agctcgtgaa 3720
agtgatgggc cggcacaagc ccgagaacat cgtgatcgaa atggccagag agaaccagac 3780
cacccagaag ggacagaaga acagccgcga gagaatgaag cggatcgaag agggcatcaa 3840
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catcaaccgg ctgtccgact acgatgtgga ccatatcgtg cctcagagct ttctgaagga 4020
cgactccatc gacaacaagg tgctgaccag aagcgacaag aaccggggca agagcgacaa 4080
cgtgccctcc gaagaggtcg tgaagaagat gaagaactac tggcggcagc tgctgaacgc 4140
caagctgatt acccagagaa agttcgacaa tctgaccaag gccgagagag gcggcctgag 4200
cgaactggat aaggccggct tcatcaagag acagctggtg gaaacccggc agatcacaaa 4260
gcacgtggca cagatcctgg actcccggat gaacactaag tacgacgaga atgacaagct 4320
gatccgggaa gtgaaagtga tcaccctgaa gtccaagctg gtgtccgatt tccggaagga 4380
tttccagttt tacaaagtgc gcgagatcaa caactaccac cacgcccacg acgcctacct 4440
gaacgccgtc gtgggaaccg ccctgatcaa aaagtaccct aagctggaaa gcgagttcgt 4500
gtacggcgac tacaaggtgt acgacgtgcg gaagatgatc gccaagagcg agcaggaaat 4560
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cggggagatc gtgtgggata agggccggga ttttgccacc gtgcggaaag tgctgagcat 4740
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ggaaagaagc agcttcgaga agaatcccat cgactttctg gaagccaagg gctacaaaga 5040
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ccggaagaga atgctggcct ctgccggcga actgcagaag ggaaacgaac tggccctgcc 5160
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catcgagcag atcagcgagt tctccaagag agtgatcctg gccgacgcta atctggacaa 5340
agtgctgtcc gcctacaaca agcaccggga taagcccatc agagagcagg ccgagaatat 5400
catccacctg tttaccctga ccaatctggg agcccctgcc gccttcaagt actttgacac 5460
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gttcgagctg gtgggcggcg gagagggcac ccccaagcag ggccgcatga ccaacaagat 5820
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cggcttctac cacttcggca cctaccccag cggctacgag aaccccttcc tgcacgccat 5940
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ggagctgcac agcaacaccg agctgggcat cgtggagtac cagcacgcct tcaagacccc 6360
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aggtgtcatt ctattctggg gggtggggtg gggcaggaca gcaaggggga ggattgggaa 6660
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aatttaacgc gaattttaac aaaatattaa cgtttacaat tttatggtgc actctcagta 7380
caatctgctc tgatgccgca tagttaagcc agccccgaca cccgccaaca cccgctgacg 7440
cgccctgacg ggcttgtctg ctcccggcat ccgcttacag acaagctgtg accgtctccg 7500
ggagctgcat gtgtcagagg ttttcaccgt catcaccgaa acgcgcgaga cgaaagggcc 7560
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ttatctacac gacggggagt caggcaacta tggatgaacg aaatagacag atcgctgaga 8580
taggtgcctc actgattaag cattggtaac tgtcagacca agtttactca tatatacttt 8640
agattgattt aaaacttcat ttttaattta aaaggatcta ggtgaagatc ctttttgata 8700
atctcatgac caaaatccct taacgtgagt tttcgttcca ctgagcgtca gaccccgtag 8760
aaaagatcaa aggatcttct tgagatcctt tttttctgcg cgtaatctgc tgcttgcaaa 8820
caaaaaaacc accgctacca gcggtggttt gtttgccgga tcaagagcta ccaactcttt 8880
ttccgaaggt aactggcttc agcagagcgc agataccaaa tactgtcctt ctagtgtagc 8940
cgtagttagg ccaccacttc aagaactctg tagcaccgcc tacatacctc gctctgctaa 9000
tcctgttacc agtggctgct gccagtggcg ataagtcgtg tcttaccggg ttggactcaa 9060
gacgatagtt accggataag gcgcagcggt cgggctgaac ggggggttcg tgcacacagc 9120
ccagcttgga gcgaacgacc tacaccgaac tgagatacct acagcgtgag ctatgagaaa 9180
gcgccacgct tcccgaaggg agaaaggcgg acaggtatcc ggtaagcggc agggtcggaa 9240
caggagagcg cacgagggag cttccagggg gaaacgcctg gtatctttat agtcctgtcg 9300
ggtttcgcca cctctgactt gagcgtcgat ttttgtgatg ctcgtcaggg gggcggagcc 9360
tatggaaaaa cgccagcaac gcggcctttt tacggttcct ggccttttgc tggccttttg 9420
ctcacatgt 9429

Claims (15)

1.一种阴道凝胶制剂，包括载体、治疗用基因，其特征在于：所述阴道凝胶制剂还包括亲水高分子材料改性蒙脱土，所述亲水高分子材料改性蒙脱土为采用纤维素衍生物改性剂对蒙脱土进行改性得到；所述载体包括阳离子聚合物，所述的阳离子聚合物为聚β-氨基酯、聚赖氨酸、聚乙烯亚胺、聚酰胺-胺中的一种或几种；所述的载体与治疗用基因的质量比为10~150:1；所述阳离子聚合物与所述亲水高分子材料改性蒙脱土的质量比为1:1~1000。
2.根据权利要求1所述的阴道凝胶制剂，其特征在于：所述纤维素衍生物为甲基纤维素。
3.根据权利要求1所述的阴道凝胶制剂，其特征在于：所述亲水高分子材料改性蒙脱土中所述亲水高分子材料和所述蒙脱土的质量比为0.1~1:1。
4.根据权利要求1所述的阴道凝胶制剂，其特征在于：所述亲水高分子材料改性蒙脱土还包括钠盐。
5.根据权利要求4所述的阴道凝胶制剂，其特征在于：所述的钠盐为碳酸氢钠、磷酸氢二钠、柠檬酸氢二钠、醋酸钠中的一种或几种。
6.根据权利要求1所述的阴道凝胶制剂，其特征在于：所述的阴道凝胶制剂的制备方法包括通过采用所述阳离子聚合物和所述治疗用基因制备纳米粒，以及将所述纳米粒、所述亲水高分子材料改性蒙脱土以及水混合的步骤。
7.根据权利要求6所述的阴道凝胶制剂，其特征在于：所述的纳米粒表面带电。
8.根据权利要求1或6所述的阴道凝胶制剂，其特征在于：所述的治疗用基因为质粒、DNA、RNA中的一种或几种。
9.根据权利要求1所述的阴道凝胶制剂，其特征在于：所述阴道凝胶制剂的pH为4.0~8.0。
10.根据权利要求1所述的阴道凝胶制剂，其特征在于：所述的阴道凝胶制剂中含有纳米粒。
11.一种阴道凝胶制剂，其特征在于：包括基质以及纳米粒，所述的基质包括亲水高分 子材料改性蒙脱土，所述的纳米粒包括阳离子聚合物和治疗用基因，所述的亲水高分子材 料改性蒙脱土为采用纤维素衍生物改性剂对蒙脱土进行改性得到；所述的阳离子聚合物为 聚β-氨基酯，其结构通式为
Figure DEST_PATH_IMAGE002
，其中，m 为5~200之间的数；所述的治疗用基因为SpCas9-HF1和/或eSpCas9与可转录为sgRNA-1的 DNA和/或可转录为sgRNA-3的DNA所形成的质粒，其中，可转录为sgRNA-1的DNA的序列为 TTCGAATGGAGAGATCCAGG，可转录为sgRNA-3的DNA的序列为GGTGACCCTCCTCCAGTACG；所述的 阳离子聚合物与治疗用基因的质量比为10~150:1；所述阳离子聚合物与所述亲水高分子材 料改性蒙脱土的质量比为1:1~1000。
12.根据权利要求11所述的阴道凝胶制剂，其特征在于：所述纤维素衍生物为甲基纤维素。
13.一种如权利要求1至12中任一项所述的阴道凝胶制剂的制备方法，其特征在于：包括如下步骤：
使所述载体和所述治疗用基因在酸性缓冲液中形成纳米粒，获得含纳米粒的混合物；
将所述含纳米粒的混合物与所述的亲水高分子材料改性蒙脱土直接混合制成所述的阴道凝胶制剂，或者，将亲水高分子材料改性蒙脱土分散于水和/或酸性缓冲液之后，再与所述含纳米粒的混合物混合。
14.根据权利要求13所述的阴道凝胶制剂的制备方法，其特征在于：所述制备方法还包括制备亲水高分子材料改性蒙脱土的步骤：将蒙脱土和亲水高分子材料加入水中，选择性地加入钠盐，混合搅拌，然后调节pH至4~6，搅拌、静置后，将上层胶状液体烘干粉碎制得所述的亲水高分子材料改性蒙脱土。
15.根据权利要求14所述的阴道凝胶制剂的制备方法，其特征在于：所述的混合搅拌的温度为50~90℃，时间1~10h；调节pH后，在50~90℃下恒温搅拌0.5~2h，然后冷却，加水搅拌均匀，再进行静置。
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