CN105535994B - 一种治疗hpv感染的纳米粒制剂及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种治疗HPV感染的纳米粒制剂以及该治疗HPV感染的纳米粒制剂的制备方法。该治疗HPV感染的纳米粒制剂包括：聚(β氨基酯)聚合物、靶向敲除或敲降HPV的重组质粒DNA。本发明以聚(β氨基酯)聚合物、靶向敲除或敲降HPV的重组质粒DNA作为主要原料，具有特异性好、转染效率高、毒副作用低等优点。

Description

一种治疗HPV感染的纳米粒制剂及其制备方法
技术领域
本发明属于医药领域，涉及一种治疗人乳头瘤病毒(HPV)感染的纳米粒制剂，尤其涉及包括聚(β氨基酯)聚合物和靶向敲除或敲降HPV的重组质粒构成的治疗人乳头瘤病毒(HPV)感染的纳米粒制剂及其制备方法。
背景技术
宫颈癌严重危害妇女健康，占全世界女性恶性肿瘤疾病的第三位。超过85％的宫颈癌新发病例和癌症致死病例出现在发展中国家(Jemal A,Bray F,Center MM,etal.Global cancer statistics.CA Cancer J Clin,2011,61(2):69-90.)。
高危型人乳头瘤病毒(HPV)感染是宫颈癌的主要病因，其中的16和18两种亚型，导致了70％的宫颈癌。HPV致癌的重要原因是它可以表达E6和E7两种病毒癌蛋白，促进细胞的增殖，导致癌症的发生。HPV导致宫颈癌是一个漫长的过程，会经历一个宫颈上皮内瘤变(CIN)时期。HPV通过上皮的微小损伤进入基底层细胞，随着基底细胞向上不断分化表达病毒基因并在表层组装成新的HPV病毒颗粒，在这个过程中促进上皮细胞的瘤样增生并逐渐发展为CIN1(轻度上皮内瘤变)、CIN2(中度上皮内瘤变)和CIN3(重度上皮内瘤变和宫颈原位癌)(Woodman CB,Collins SI,Young LS.The natural history of cervical HPVinfection:unresolved issues.Nat Rev Cancer,2007,7(1):11-22.)。因此，充分利用现有医药学手段阻断HPV的感染是防治宫颈癌的重要途径。
目前医药界已经研发出多种阻断HPV的感染的方法，但仍有很多不足。现有的治疗HPV感染的药物以干扰素为主，原理是提高组织局部的免疫反应来抗病毒，不是针对HPV的特异性治疗，并且疗效欠佳。常用的HPV疫苗对HPV亚型的覆盖能力有限，只能预防两种或四种HPV的感染，能够预防更多种亚型的疫苗还在研发中，但是生产成本也会相应增高。在我国大陆地区，疫苗迄今为止还没有通过国家药监部门的审批，因此没有投入临床使用，我国的大部分女性目前没有疫苗接种的机会。另外一种预防宫颈癌的方法是女性定期做宫颈细胞涂片和HPV筛查。由于健康教育宣传不足和防癌筛查没有纳入医保等原因，经济不发达地区的女性往往不能定期做宫颈细胞涂片和HPV筛查。而且，即使筛查出HPV感染，现有干扰素疗法的原理是提高局部组织的免疫反应，并不是针对HPV的特异性治疗，因此效果不佳，也不能有效地治疗HPV进而预防宫颈癌。
近年来，随着基础医学的不断进展，出现了一系列新的具有靶向敲降或敲除HPV的重组质粒DNA，包括靶向敲降HPV的短发夹RNA(shRNA)重组质粒DNA，靶向敲除HPV的锌指核糖核酸酶(ZFN)(Sander JD,Dahlborg EJ,Goodwin MJ,et al.Selection-free zinc-finger-nuclease engineering by context-dependent assembly(CoDA).Nat Methods,2010),转录激活因子样效应物核酸酶(TALEN)(rmak T,Doyle EL,Christian M,etal.Efficient design and assembly of custom TALEN and other TAL effector-basedconstructs for DNA targeting.Nucleic Acids Res,2011,39(12):e82.)，规律成簇的间隔短回文重复重组质粒DNA(CRISPR)等。但是，由于有组织屏障和细胞屏障的存在，单纯的质粒DNA并不能通过屏障进入细胞发挥作用，因此需要有合适的运载体把质粒DNA带入细胞内部。对质粒DNA运载体的研究，总体分为两大类，即病毒运载体和非病毒运载体，聚(β氨基酯)聚合物(简写为PBAE)是一种非病毒运载体。
病毒运载体虽然具有较高的转染效率，但是仍有很多缺点，比如：可能引起强烈的机体免疫反应和并发症，载体容量有限，制备要求较高，潜在的致癌性，生物安全性较差等。因此，研究应用非病毒运载体进行基因靶向治疗是近年来发展的趋势。
聚(β氨基酯)聚合物是一种分子中含有酯基和可质子化氨基等基团组成的聚合物，由于聚合条件、聚合物的分子量的不同，表现出的性质也会有所不同。目前已知的聚(β氨基酯)聚合物家族中大部分聚合物进入细胞的能力较弱、转染效率不高，还有一些聚合物表现出较高的细胞毒性。因此，对聚(β氨基酯)聚合物本身进行适当选择是很关键的。
在整个转染的过程中，受到影响因素条件的影响较多，例如：细胞外、细胞内的环境因素，例如pH、还原性、酶、外界刺激(例如光照、温度)引起的分子结构、表面电荷或是亲疏水性等变化，聚(β氨基酯)聚合物与质粒组合后的复合物的粒径、电位等。上述列举的部分影响转染的因素均可以影响或改变聚(β氨基酯)聚合物与基因的相互作用。
聚(β氨基酯)聚合物与质粒需要保持合适的结合能力，如果结合力过低，转染效率会受到影响；如果结合的太紧密会阻碍DNA在细胞质的释放，对靶向功能的有效发挥产生影响。因此，并非所有的质粒都可以用于与聚(β氨基酯)组合后进行转染。并不是所有的聚(β氨基酯)聚合物都适合用于阴道上皮细胞的转染。
目前还尚未有存在针对HPV感染的由聚(β氨基酯)聚合物和重组质粒构成的纳米粒制剂。
发明内容
鉴于现有技术所存在的问题，本发明提供一种治疗HPV感染的纳米粒制剂，聚(β氨基酯)聚合物、靶向敲除或敲降HPV的重组质粒DNA以及酸性溶剂作为主要原料，具有特异性好、转染效率高、毒副作用较低等优点。
本发明解决上述技术问题的技术方案如下：
一种治疗HPV感染的纳米粒制剂，包括聚(β氨基酯)聚合物和靶向敲除或敲降HPV的重组质粒DNA。
优选地，所述聚(β氨基酯)聚合物为由1,4-丁二醇二丙烯酸酯、4-氨基-1-丁醇、1-(3-氨丙基)-4-甲基哌嗪三种化合物聚合生成的聚(β氨基酯)聚合物。
本发明的有益效果：
目前尚未有聚(β氨基酯)聚合物与靶向HPV的重组质粒DNA组合的治疗HPV感染的纳米粒制剂，本发明首次提供了该制剂。聚(β氨基酯)聚合物作为体内转染剂，是该制剂的重要组成部分，有利于将靶向敲除或敲降HPV的重组质粒DNA转染到上皮细胞中去。如果只有靶向敲除或敲降HPV的重组质粒DNA的话，转染效果几乎为零，是不能起治疗作用的。
靶向敲除或敲降HPV的重组质粒DNA和聚(β氨基酯)聚合物共同构成基因靶向治疗的主要组成部分。聚(β氨基酯)聚合物能够有效地把DNA转运至细胞内并释放，它能保护DNA不被组织和细胞内各种酶降解，它对宿主细胞没有毒性，不会引起较强的免疫反应、制备价格较低、载体容量多、不具备潜在的致癌性等优点，有利于临床应用转化。带正电荷的聚(β氨基酯)和带负电荷的靶向敲除或敲降HPV的重组质粒DNA作用形成纳米颗粒，通过胞吞作用进入细胞，再通过内涵体逃逸作用把质粒DNA释放入细胞发挥作用。
本发明所述的治疗HPV感染的纳米粒制剂具有较好的HPV靶向性、皮肤黏膜细胞吸收性，达到对HPV感染的针对性治疗，这是目前临床上主要使用的以干扰素为基础的调节机体免疫功能的非特异性治疗所做不到的。
本发明所述的治疗HPV感染的纳米粒制剂不仅可以清除HPV的感染，而且可以清除整合的HPV，现有的以干扰素为基础的治疗方法不能清除整合的HPV，因此这是本发明的一个重要突破。
人乳头瘤病毒(HPV)既可以感染女性又可以感染男性，感染女性可以导致宫颈炎、宫颈上皮内瘤变、宫颈癌，感染男性可以导致尖锐湿疣、口腔癌等。本发明所述的治疗HPV感染的纳米粒制剂可以制成清洁喷剂供男士和女士使用，分别清除男性和女性的HPV感染，切断HPV通过性接触等途径传染，这也是本发明的新颖性。
本发明所述的治疗HPV感染的纳米粒制剂专一性地清除HPV病原体，对阴道菌群生态平衡并无影响。既可以用于平时对HPV感染的预防，也可以用于已受HPV感染的感染者的治疗。目前医药界还没有开发出针对HPV的特异性抗病毒药物，已有的干扰素治疗特异性不好，疗效欠佳；HPV疫苗只对未感染的患者有远期预防作用，对已感染的HPV不能治疗。本发明的相关组合制剂，能够解决目前HPV防治工作中的不足，进而降低HPV相关的宫颈癌等疾病的发病率，具有很好的社会价值。
在上述技术方案的基础上，本发明还可以做如下改进。
进一步，所述聚(β氨基酯)聚合物与靶向敲除或敲降HPV的重组质粒DNA的质量比为20:1至80:1。
采取上述进一步技术方案的有益效果为：采用该比例，有利于提高转染的效果。
进一步，所述靶向敲除或敲降HPV的重组质粒DNA选自靶向敲降或敲除HPV的短发夹RNA重组质粒DNA(shRNA)、靶向敲除或敲降HPV的锌指核糖核酸酶的重组质粒DNA(ZFN)、靶向敲除或敲降HPV的转录激活因子样效应物核酸酶的重组质粒DNA(TALEN)以及靶向敲除或敲降HPV的规律成簇的间隔短回文重复的重组质粒DNA(CRISPR)中任一种或几种的混合。
采取上述进一步技术方案的有益效果为：通过把聚(β氨基酯)聚合物和shRNA、TALEN、ZFN、CRISPR等质粒结合起来，提供了一种可有效治疗HPV感染的新药。现有的治疗HPV感染的药物以干扰素为主，原理是提高组织局部的免疫反应来抗病毒，不是针对HPV的特异性治疗，并且疗效欠佳。本发明提供的这个新的组合制剂可以克服上述缺点，对提高我国宫颈癌的防治工作，提高女性的健康水平有重要意义。
进一步，所述靶向敲除或敲降HPV的重组质粒DNA的核苷酸序列选自SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.7以及SEQ ID NO.8所示的核苷酸序列中任一种或几种的混合。
具体地，在转化SEQ ID NO.3所示的质粒时，同时共转CAS9质粒，具有很好的治疗HPV感染的效果，经实施例的结果表明，SEQ ID NO.3所示的质粒与CAS9质粒的质量比为1:4，具有很好的治疗HPV感染的效果。
在转化SEQ ID NO.4所示的质粒时，同时共转CAS9质粒，具有很好的治疗HPV感染的效果，经实施例的结果表明，SEQ ID NO.3所示的质粒与CAS9质粒的质量比为1:4，具有很好的治疗HPV感染的效果。
在转化SEQ ID NO.5所示的质粒时，同时共转CAS9质粒，具有很好的治疗HPV感染的效果，经实施例的结果表明，SEQ ID NO.3所示的质粒与CAS9质粒的质量比为1:4，可以具有很好的治疗HPV感染的效果。
其他质粒单独转化也可以实现很好的治疗HPV感染的效果。
上述中CAS9质粒购自addgene，编号为42230,具体信息可参见网页链接为http://www.addgene.org/42230/。
采取上述进一步技术方案的有益效果为：通过实验表明上述序列表示的靶向敲除或敲降HPV的重组质粒DNA与聚(β氨基酯)聚合物组合后，可以达到良好的转染率，并且无明显毒副作用。
进一步，所述治疗HPV感染的纳米粒制剂还包括酸性溶剂。
采取上述进一步技术方案的有益效果为：酸性溶剂为聚(β氨基酯)聚合物转染作用的发挥提供有利的环境。
进一步，所述酸性试剂为乙酸钠，浓度为25mmol，pH为5。
采取上述进一步技术方案的有益效果为：由于聚(β氨基酯)聚合物对pH敏感，合适的酸性溶剂的种类、浓度以及pH有利于保证较高的转染效果，有利于形成稳定的纳米颗粒，进一步加强治疗HPV的效果。
进一步，还包括辅料或佐剂。
进一步，所述治疗HPV感染的纳米粒制剂的剂型为为临床可接受的剂型、食品或化妆品。
进一步，所述治疗HPV感染的纳米粒制剂的剂型选自喷雾剂、洗液、凝胶、胶囊、栓剂、阴道膜、片剂、泡腾片、软膏、霜剂、含片、咀嚼片、口香糖中任一种。
采取上述进一步技术方案的有益效果为：通过在聚(β氨基酯)聚合物、靶向敲除或敲降HPV的重组质粒DNA和酸性溶剂的基础上适当添加辅料或佐剂，可以有利于制备不同剂型的药物制剂，使其应用更广泛，使用更方便。
鉴于聚(β氨基酯)聚合物与某种质粒存在双向选择的问题，并非所有的聚(β氨基酯)聚合物都适用于质粒在宫颈阴道细胞的转染。
发明人在研究中意外的发现一种由1,4-丁二醇二丙烯酸酯、4-氨基-1-丁醇、1-(3-氨丙基)-4-甲基哌嗪三种化合物聚合生成的聚(β氨基酯)聚合物，该种聚(β氨基酯)聚合物与靶向敲除或敲降HPV的重组质粒DNA混合后，能够很好地适用于在宫颈阴道细胞的转染，并且毒副作用较低，具有很好的治疗HPV感染的效果。
本发明还提供一种治疗HPV感染的纳米粒制剂的制备方法，包括以下步骤：
1)制备聚(β氨基酯)聚合物；
2)构建靶向敲除或敲降HPV的重组质粒DNA；
3)将步骤1)制备的(β氨基酯)聚合物溶于酸性溶剂后并与步骤2)构建的靶向敲除或敲降HPV的重组质粒DNA混匀。
本发明还提供了一种适于治疗HPV感染的聚(β氨基酯)聚合物的制备方法，包括以下步骤：
a)称取1,4-丁二醇二丙烯酸酯，并溶于二甲基亚砜，混匀，得到混合溶液I；
b)称取4-氨基-1-丁醇溶于二甲基亚砜，混匀，得到混合溶液II，其中4-氨基-1-丁醇与1,4-丁二醇二丙烯酸酯的摩尔比为1:1.1；
c)将步骤1)的混合溶液I和步骤2)的混合溶液II混合在一起，避光条件下，升温至40℃，搅拌反应，得到基础聚合物；
d)以二甲基亚砜为溶剂配制1-(3-氨丙基)-4-甲基哌嗪溶液，将步骤3)得到的基础聚合物与1-(3-氨丙基)-4-甲基哌嗪溶液按照体积比3:2混合，室温搅拌，静置，生成聚(β氨基酯)聚合物。
具体地，上述制备聚(β氨基酯)聚合物的方法，包括以下具体步骤：
a)称取1,4-丁二醇二丙烯酸酯，并溶于二甲基亚砜，混匀，得到混合溶液I；
b)称取4-氨基-1-丁醇溶于二甲基亚砜，混匀，得到混合溶液II，混合溶液的密度为167mg/mL；其中4-氨基-1-丁醇与1,4-丁二醇二丙烯酸酯的摩尔比为1:1.1
c)将步骤1)的混合溶液I和步骤2)的混合溶液II混合在一起，避光条件下，升温至40℃后，搅拌48小时，得到基础聚合物；
d)以二甲基亚砜配制浓度为0.5mol/L的1-(3-氨丙基)-4-甲基哌嗪溶液，将步骤3)得到的基础聚合物与1-(3-氨丙基)-4-甲基哌嗪溶液按照体积比3:2混合或者3:2等体积放大，室温搅拌10min，静置1小时以上，生成浓度为100mg/mL的聚(β氨基酯)聚合物，分装，在-20℃条件下保存。
采取上述进一步技术方案的有益效果为：因为聚(β氨基酯)聚合物的种类很多，包括无数亚型，并不是每一种聚(β氨基酯)聚合物都有转染效果，即使有转染效果，也不一定在宫颈阴道上皮细胞和宫颈癌细胞有转染作用，经试验验证，发明人意外的发现利用上述方法制备的(β氨基酯)在宫颈阴道上皮和宫颈癌细胞系有很好转染作用。
进一步，步骤2)中，所述靶向敲除或敲降HPV的重组质粒DNA选自靶向敲降或敲除HPV的短发夹RNA重组质粒DNA(shRNA)、靶向敲除或敲降HPV的锌指核糖核酸酶的重组质粒DNA(ZFN)、靶向敲除或敲降HPV的转录激活因子样效应物核酸酶的重组质粒DNA(TALEN)以及靶向敲除或敲降HPV的规律成簇的间隔短回文重复的重组质粒DNA(CRISPR)中任一种或几种的混合。
更进一步地，所述靶向敲除或敲降HPV的重组质粒DNA的核苷酸序列选自SEQ IDNO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.7以及SEQ ID NO.8所示的核苷酸序列中任一种或几种的混合。
进一步，步骤3)中，所述聚(β氨基酯)聚合物与靶向敲除或敲降HPV的重组质粒DNA的质量比为20:1至80:1。所述酸性试剂为乙酸钠，浓度为25mmol，pH为5。
在上述制备过程中，还可以根据实际情况适当添加辅料。将本发明所述治疗HPV感染的纳米粒制剂制成不同剂型，所述治疗HPV感染的纳米粒制剂的剂型为为临床可接受的剂型、食品或化妆品，具体地，所述治疗HPV感染的纳米粒制剂的剂型可以选自但不限于喷雾剂、洗液、凝胶、胶囊、栓剂、阴道膜、片剂、泡腾片、软膏、霜剂、含片、咀嚼片、口香糖中任一种。
附图说明
图1为聚(β氨基酯)毒性试验结果，图1中，空白组为不加聚(β氨基酯)的对照组，PEI和lipofectmine均为阳性对照，实验组为纳米颗粒组，聚(β氨基酯)与绿色荧光质粒(名称pEGFP-N1，购自addgene，货号为60360)的质量比分别为20:1、40:1、60:1、80:1，绿色荧光质粒pEGFP-N1只有发光作用，并无其他功能，因此应用到本毒性试验中；
图2为聚(β氨基酯)质粒纳米颗粒保护质粒DNA的结果，图2中，“单纯质粒DNA”指未结合聚(β氨基酯)聚合物的裸绿色荧光质粒(名称pEGFP-N1，购自addgene，货号为60360)DNA，聚(β氨基酯)聚合物与绿色荧光质粒(名称pEGFP-N1，购自addgene，货号为60360)的质量比分别为5:1、10:1、20:1、40:1、60:1、80:1，绿色荧光质粒pEGFP-N1只有发光作用，并无其他功能，因此应用到本试验中；
图3为本发明所述聚(β氨基酯)质粒纳米颗粒的地貌特征，左边的图为低倍镜下地貌特征，右边的图为高倍镜下地貌特征；
图4为本发明(β氨基酯)聚合物和红色荧光蛋白质粒(pCAG-RFP-int,购自addgene，货号19822)纳米粒的宫颈阴道部细胞转染照片，左边的图为红色荧光蛋白图，中间的图为DAPI染核图，右边的图为同一视野下荧光蛋白图与核融合图；
图5为本发明治疗HPV感染的纳米粒制剂对宫颈上皮内瘤变细胞S12的生长的抑制结果，“blank”为空白对照，聚(β氨基酯)聚合物与SEQ ID NO.1质粒的质量比分别为20:1、40:1和60:1；
图6为不同比例条件下在HEK293细胞中转染效率图，从左至右，聚(β氨基酯)聚合物与绿色荧光质粒(名称pEGFP-N1，购自addgene，货号为60360)的质量比从左至右依次分别为20:1、40:1、60:1、80:1，PEI与质粒的质量比分别为1:1、2:1、3:1和4:1。
具体实施方式
以下结合附图对本发明的原理和特征进行描述，所举实例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。
实施例1合成聚(β氨基酯)聚合物
步骤1：用电子天平称取1,4-丁二醇二丙烯酸酯2.18克(11mmol)于烧杯中，加入2mL二甲基亚砜(DMSO)，超声溶解，搅拌至分散均匀。
步骤2：称取4-氨基-1-丁醇0.89克(10mmol)于烧杯中，加入适量的二甲基亚砜(DMSO)，超声溶解，搅拌至分散均匀。得到的溶液与步骤1的溶液混合，补DMSO至总体积18.38mL，使所称取的1,4-丁二醇二丙烯酸酯与4-氨基-1-丁醇的摩尔比为1.1:1，密度为167mg/mL。在研究中意外的发现，该摩尔比可做出较好的效果。
步骤3：将步骤1和步骤2中的溶液一起加入到避光玻璃烧瓶中，烧瓶放入恒温磁力搅拌油浴锅中，烧瓶中的液体放入磁珠，烧瓶上方安装自来水冷凝装置和充满氮气的气球。开始搅拌，从室温缓慢升温至40℃，升温速率为1℃/分钟，连续搅拌48小时(从升温至40℃时开始计时)。制成浓度为167mg/mL基础聚合物。
步骤4.用二甲基亚砜(DMSO)配制0.5M的1-(3-氨丙基)-4-甲基哌嗪溶液。取步骤3合成的基础聚合物(167mg/mL，480uL)与1-(3-氨丙基)-4-甲基哌嗪溶液(0.5M，320uL)混合，或者3:2等体积放大，室温搅拌10min，静置1小时以上(也可以过夜)。生成浓度为100mg/mL聚(β氨基酯)聚合物。分装，在-20℃保存。
实施例2制备靶向敲降或敲除HPV的重组质粒DNA
本发明系统中的质粒既可以使用靶向敲降HPV的短发夹RNA(shRNA)重组质粒DNA，也可以使用靶向敲除HPV的锌指核糖核酸酶(ZFN)重组质粒DNA，转录激活因子样效应物核酸酶(TALEN)重组质粒DNA，规律成簇的间隔短回文重复(CRISPR)重组质粒DNA。
HPV16型是最常见的型别，约占50％。靶向作用于HPV16的重组质粒DNA包括靶向敲除16型HPV的TALEN重组质粒DNA，shRNA重组质粒DNA等。
本发明在构建靶向敲除16型HPV的重组质粒DNA，分别构建6个规律成簇的间隔短回文重复重组质粒DNA(CRISPR)和2个靶向敲降HPV的短发夹RNA(shRNA)重组质粒DNA。
1、靶向敲降HPV的短发夹RNA(shRNA)重组质粒DNA
其中一个靶向敲降HPV的短发夹RNA(shRNA)重组质粒DNA命名为Psilencer2.1-HPV16E6SHRNA，其序列如SEQ ID NO.1所示；
另外一个靶向敲降HPV的短发夹RNA(shRNA)重组质粒DNA，命名为pSIREN_U6-HPV16E7shRNA_FF6-CMV-iRFP，其核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；
上述两个质粒的具体的构建方法参考网址http://www.addgene.org/tools/protocols/plko/，Designing shRNA Oligos。
2、规律成簇的间隔短回文重复(CRISPR)重组质粒DNA
1)质粒名称为：pSpCas9(BB)-2A-GFP-grna-1，核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；
2)质粒名称为：pSpCas9(BB)-2A-GFP-grna-2，核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示；
3)质粒名称为：pSpCas9(BB)-2A-GFP-grna-3，核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示；
4)质粒名称为：HPV16E7 grna-1，核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示；
5)质粒名称为：HPV16E7 grna-2，核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示；
6)质粒名称为：HPV16E7 grna-3，核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示；
上述六个重组质粒构建方法可以参照网址http://www.addgene.org/crispr/reference/#protocols，Protocols里Church方法。
靶向重组质粒构建完成后，分别将上述含有重组成功质粒的菌液扩增，提取去除内毒素的质粒。
为方便描述，下面将“靶向敲降或敲除HPV的重组质粒DNA”简称为靶向重组质粒。
本发明对于提取质粒DNA的提取方法并无特别限制，只要保证提取的质粒DNA样品的完整并去除内毒素即可，可以购买商品化的去内毒素质粒DNA提取试剂盒，本实验采用omega无内毒素质粒大提试剂盒，按照说明书操作来去除内毒素。提取的质粒分装保存在-20℃。
将上述含有重组成功靶向重组质粒的菌液可加10％甘油后置于-80℃冰箱冻存保种，只需将保种的菌液扩增即可。
实施例3聚(β氨基酯)聚合物和靶向重组质粒DNA混合制成纳米颗粒悬液
聚(β氨基酯)聚合物和靶向重组质粒DNA分别用25mM乙酸钠溶液适当稀释，混合后，制成聚(β氨基酯)聚合物和靶向重组质粒DNA的质量比为20:1至80:1的溶液，根据本发明人的试验，意外的发现这个范围的质量比可做出较好的效果，尤其是当质量比为60:1效果更好。例如，质量比为60:1时，把6000μg的聚(β氨基酯)聚合物用25mM乙酸钠溶液稀释至60μL，把100μg的质粒DNA用25mM乙酸钠溶液稀释至60μL，把两个溶液迅速混合震荡，室温孵育15-20分钟，制成治疗HPV感染的纳米颗粒悬液120μL。
按照同样的方法，聚(β氨基酯)聚合物与上述制备的靶向重组质粒分别设定三个不同的质量比，即：聚(β氨基酯)聚合物和靶向重组质粒DNA的质量比为20:1、聚(β氨基酯)聚合物和靶向重组质粒DNA的质量比为80:1、聚(β氨基酯)聚合物和靶向重组质粒DNA的质量比为60:1。
纳米颗粒悬液添加药物辅料或佐剂，进一步制成不同的剂型。
把上述所得的治疗HPV感染的纳米颗粒悬液与各种适宜的辅料如化学药品、中药等配制成临床可接受的剂型，如阴道喷雾剂、阴道洗液、阴道凝胶、阴道软胶囊和硬胶囊、阴道栓剂、阴道膜、阴道片剂、阴道泡腾片、男士喷雾剂、软膏、霜剂等，含片、咀嚼片、口香糖等。含纳米颗粒悬液的洗液可供女性日常清洁阴部，其他各种剂型可直接放入阴道内，消除阴道和宫颈局部的人乳头瘤病毒(HPV)感染。实施例4至实施例6中分别列举了凝胶、洗液、阴道栓剂等剂型，但不限于上述剂型。对于各剂型中的用量也可以适当调整。
实施例4阴道凝胶的制备
1、现以治疗HPV感染的纳米颗粒悬液加入普兰尼克(Pluronic)F127制成阴道凝胶为代表说明如下：
配方如下：
普兰尼克(Pluronic)F127 40g
蒸馏水 60mL
工艺流程：
1)在冰上或在4℃条件下把上述用量的普兰尼克(Pluronic)F127加入蒸馏水中，搅拌，制成凝胶基质。
2)冰上或4℃条件下，把实施例3制备的治疗HPV感染的纳米颗粒悬液加入凝胶基质中，充分搅拌混匀制成均质凝胶。
2、也可以适当调整普兰尼克的用量，例如：按照以下配方制备。
配方如下：
制备方法：
1)在冰上或4℃条件下把40g普兰尼克(Pluronic)F127加入60ml蒸馏水中，搅拌，制成40％普兰尼克(Pluronic)F127凝胶基质。
2)冰上或4℃条件下，把实施例3的治疗HPV感染的纳米颗粒悬液120μL加入凝胶基质80μL中，充分搅拌混匀制成均质凝胶。
实施例5治疗HPV的聚(β氨基酯)质粒纳米颗粒外阴洗液的制备
配方如下：
聚(β氨基酯)质粒纳米颗粒 20mL(换算成质量为1g)
甘油 20g
香精 0.3g
乙醇 10g
蒸馏水 加至1000ml
制备方法：把聚(β氨基酯)质粒纳米颗粒加入蒸馏水，加入甘油混匀。香精加入乙醇溶解，加于上述溶液混匀。补加蒸馏水至全量。分装4℃保存。
实施例6治疗HPV的聚(β氨基酯)质粒纳米颗粒阴道栓生产
配方如下：
聚(β氨基酯)质粒纳米颗粒 2mL(换算成质量为0.1g)
明胶 9g
甘油 7.2g
蒸馏水 加至5.6ml
制备方法：
1.把明胶加热溶解于蒸馏水中，加入甘油，搅拌混匀。
2.待上述甘油明胶温度降至约50℃，加入聚(β氨基酯)质粒纳米颗粒混悬液，混匀，分装4℃保存。
实施例7聚(β氨基酯)聚合物毒性试验
在宫颈癌前病变细胞系S12上进行毒性试验，具体方法：1.将100ng绿色荧光质粒与10ul25mM乙酸钠混合；1.将聚(β氨基酯)按照20:1、40:1、60:1和80:1等不同的的质量比与10uL 25mM乙酸钠溶液混合；PEI分别按照1:1、2:1、3:1和4:1的质量比与10uL的PBS混合；3.将混合好的聚(β氨基酯)、PEI分别与质粒混合，静置15-20min，加入96孔板中。Lipofectmine的转染方法参考说明书。每组试验设置5个副孔。分别24h、48h、72h后测CCK8检测细胞活性。阳性对照为PEI和lipofectmine；PEI，中文名称为聚乙烯亚胺，购自sigma公司，货号为408727；lipofectmine 3000，购自Thermo Fisher Scientific公司，货号为L3000001。
根据图1结果表明，阳性对照转染试剂PEI和lipofectmine的毒性较强，而聚(β氨基酯)聚合物的毒性很小(聚(β氨基酯)聚合物与绿色荧光质粒(购自addgene，货号60360)的质量比为20:1至80:1)。
实施例8聚(β氨基酯)质粒纳米颗粒对质粒DNA的保护作用
对照组以单纯绿色荧光质粒DNA(pEGFP-N1,购自addgene，货号60360)为对照。
聚(β氨基酯)聚合物与绿色荧光质粒(pEGFP-N1,购自addgene，货号60360)的质量比分别为5:1、10:1、20:1、40:1、60:1和80:1。
具体实验方法为：1.取0.1ug质粒DNA稀释于20uL的25mM乙酸钠溶液中；2.按比例分别取0.5ug、1ug、2ug、4ug、6ug、8ug聚(β氨基酯)聚合物稀释于20uL的25mM乙酸钠溶液中；3.将稀释的聚(β氨基酯)聚合物与稀释后的绿色荧光质粒(pEGFP-N1,购自addgene，货号60360)DNA混合，静置15-20min。
根据图2的琼脂糖凝胶阻滞试验显示，随着聚(β氨基酯)聚合物：绿色荧光质粒(pEGFP-N1,购自addgene，货号60360)质量比的增加，聚(β氨基酯)聚合物对质粒的包裹保护能力也在增加。
实施例9聚(β氨基酯)质粒纳米颗粒的地貌特征
利用原子力显微镜显示聚(β氨基酯)质粒颗粒粒径在纳米级别，从图3中可以看出合成了较均一的纳米颗粒。
实施例10
将(β氨基酯)聚合物和红色荧光蛋白质粒纳米(pCAG-RFP-int，购自addgene，货号19822)粒进行体内转染，具体转染方法为:将(β氨基酯)聚合物和红色荧光蛋白质粒混合，室温静置15-20min，注射到小鼠阴道，10ug质粒/只，1次/日，连给三次。
结果如图4所示，(β氨基酯)聚合物和红色荧光蛋白质粒构成的纳米颗粒转染小鼠阴道上皮，可观测到红色荧光，证明聚(β氨基酯)质粒纳米颗粒具有宫颈阴道部位细胞转染的能力。
而二脒基苯基吲哚(DAPI)，出现了核被染成蓝色的实验结果,说明了阴道上皮细胞核的位置被成功定位。
图中的“融合”指的是同一显微镜视野下阴道上皮细胞核与细胞浆的融合，结果是出了细胞核以外的胞浆部分都有红色荧光，说明了(β氨基酯)聚合物与红色荧光蛋白的结合物成功转染进入小鼠阴道上皮细胞内并表达。
实施例11 治疗HPV的聚(β氨基酯)质粒纳米颗粒治疗效果
把聚(β氨基酯)质粒纳米颗粒应用到HPV16阳性的宫颈上皮内瘤变(CIN)的细胞系S12上，从图5中可以观察到，质量比60:1的聚(β氨基酯)质粒纳米颗粒对宫颈上皮内瘤变细胞S12的生长具有明显抑制作用。
实施例12 PBAE转染HEK293效率
实验方法：1.将1ug的绿色荧光质粒稀释于一定量的25mM乙酸钠溶液中；2.将聚(β氨基酯)稀释于一定量的25mM乙酸钠溶液中；3.将稀释后的聚(β氨基酯)按照不同的聚(β氨基酯)：绿色荧光质粒的质量比与稀释的绿色荧光质粒混合，静置15-20min；4.将合成好的纳米颗粒加入种有HEK293的12孔板中，4-6h后终止转染，更换新鲜培养基，72h后观察转染情况。
发明人在实验过程中意外的发现了聚(β氨基酯)聚合物与质粒的合适的质量比。
从图6中可以看出，不同比例条件下的聚(β氨基酯)质粒纳米颗粒在HEK293细胞中都有一定的转染效果，但在60:1的比例条件下转染效率最高，说明在60:1的条件下转染效果最好。
发明人的意外发现得到了进一步的验证。
以不同质量比例的聚(β氨基酯)质粒纳米颗粒为实验组，以PEI为对照组。
操作方法为：PBAE的操作方法如上述。1.将1ug的绿色荧光质粒稀释于一定量的25mM乙酸钠溶液中；2.将将PEI稀释于一定量的PBS中；将稀释后的PEI按照不同比例与稀释后的质粒混合，静置15-20min，加入种有HEK293的12孔板中，72小时后观察转染情况。
从图6中可以看出，不同比例条件下的聚(β氨基酯)质粒纳米颗粒和PEI在HEK293细胞中都有一定的转染效果，但PEI的转染效率明显低于聚(β氨基酯)质粒纳米颗粒的转染效率，说明聚(β氨基酯)质粒纳米颗粒的转染效果明显高于PEI。
实施例3中其他的靶向重组质粒DNA与聚(β氨基酯)聚合物混合制成纳米颗粒悬液经进一步实验验证，也能得到与上述实施例一致的结论。
以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (9)

1.一种治疗HPV感染的纳米粒制剂，其特征在于，包括聚(β氨基酯)聚合物和靶向敲除或敲降HPV的重组质粒DNA；所述靶向敲除或敲降HPV的重组质粒DNA选自靶向敲降或敲除HPV的短发夹RNA重组质粒DNA、靶向敲除或敲降HPV的锌指核糖核酸酶的重组质粒DNA、靶向敲除或敲降HPV的转录激活因子样效应物核酸酶的重组质粒DNA以及靶向敲除或敲降HPV的规律成簇的间隔短回文重复的重组质粒DNA中任一种或几种的混合；所述靶向敲除或敲降HPV的重组质粒DNA的核苷酸序列选自SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3、SEQ IDNO.4、SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.7以及SEQ ID NO.8所示的核苷酸序列中任一种或几种的混合。
2.根据权利要求1所述一种治疗HPV感染的纳米粒制剂，其特征在于，所述聚(β氨基酯)聚合物与靶向敲除或敲降HPV的重组质粒DNA的质量比为20:1至80:1。
3.根据权利要求1所述一种治疗HPV感染的纳米粒制剂，其特征在于，所述治疗HPV感染的纳米粒制剂还包括酸性溶剂。
4.根据权利要求3所述一种治疗HPV感染的纳米粒制剂，其特征在于，所述酸性试剂为乙酸钠，浓度为25mmol，pH为5。
5.根据权利要求1所述一种治疗HPV感染的纳米粒制剂，其特征在于，还包括辅料或佐剂。
6.根据权利要求1至5任一项所述一种治疗HPV感染的纳米粒制剂，其特征在于，所述治疗HPV感染的纳米粒制剂的剂型为临床可接受的剂型、食品或化妆品。
7.根据权利要求6所述一种治疗HPV感染的纳米粒制剂，其特征在于，所述治疗HPV感染的纳米粒制剂的剂型选自喷雾剂、洗液、凝胶、胶囊、栓剂、阴道膜、片剂、泡腾片、软膏、霜剂、含片、咀嚼片、口香糖中任一种。
8.一种如权利要求1-7中任一项所述治疗HPV感染的纳米粒制剂的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)制备聚(β氨基酯)聚合物；
2)构建靶向敲除或敲降HPV的重组质粒DNA；
3)将步骤1)制备的(β氨基酯)聚合物溶于酸性溶剂后并与步骤2)构建的靶向敲除或敲降HPV的重组质粒DNA混匀。
9.一种制备聚(β氨基酯)聚合物的方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)称取1,4-丁二醇二丙烯酸酯，并溶于二甲基亚砜，混匀，得到混合溶液I；
2)称取4-氨基-1-丁醇溶于二甲基亚砜，混匀，得到混合溶液II，其中4-氨基-1-丁醇与1,4-丁二醇二丙烯酸酯的摩尔比为1:1.1；
3)将步骤1)的混合溶液I和步骤2)的混合溶液II混合在一起，避光条件下，升温至40℃，搅拌反应，得到基础聚合物；
4)以二甲基亚砜为溶剂配制1-(3-氨丙基)-4-甲基哌嗪溶液，将步骤3)得到的基础聚合物与1-(3-氨丙基)-4-甲基哌嗪溶液按照体积比3:2混合，室温搅拌，静置，生成聚(β氨基酯)聚合物。
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