发明内容
本发明提供一种小核酸及其在制备治疗单纯疱疹病毒(HSV)和人类乳头瘤病毒(HPV)病毒所致病变的药物中的应用。
本发明所提供的小核酸为双链核酸,名称为siB2M,其正义链序列为序列表中序列5(5'GAAUGGAGAGAGAAUUGAA3'),其反义链序列为序列表中序列6(5'UUCAAUUCUCUCUCCAUUC3')。
所述双链核酸经过2′氟代、2′甲氧基、硫代或2′脱氧化学修饰;优选的,所述双链核酸的在U和C碱基上采用2′甲氧基或2′氟代修饰。
也可将所述双链核酸进行胆固醇修饰,方法是只对双链中的正义链进行5’端胆固醇修饰,同时对的正义链所有的C碱基采用2′甲氧基修饰。
上述小核酸可作为主要活性成分用于制备治疗单纯疱疹病毒和/或人类乳头瘤病毒所致疾病的药物,特别是用于制备治疗HSV所致的口腔及生殖器病变和/或人类乳头瘤病毒HPV的感染和HPV所致宫颈癌病变的药物。
上述药物中,还包括选自下述1)-4)中的一种或两种以上的小核酸:
1)双链核酸,名称为siHPV16E7,其正义链序列为序列表中序列1(5'CUACUGUUAUGAGCAAUUATT3'),其反义链序列为序列表中序列2(5'UAAUUGCUCAUAACAGUAGTT3′);
2)双链核酸,名称为siHPV18E7,其正义链序列为序列表中序列3(5'CCUUCUAUGUCACGAGCAATT3'),其反义链序列为序列表中序列4(5'UUGCUCGUGACAUAGAAGGTT3');
3)双链核酸,名称为siHPV58E7,其正义链序列为序列表中序列7(5'CCCAACGCUAAGAGAAUAUTT3'),其反义链序列为序列表中序列8(5'AUAUUCUCUUAGCGUUGGGTT3');
4)双链RNA,名称为HSV-1 siICP27,其正义链序列为序列表中序列9(5'GGACAUUGCAUCCUUCGUGTT3'),其反义链序列为序列表中序列10(5'CACGAAGGAUGCAAUGUCCTT3')。
所述双链核酸为化学合成(苏州吉玛),可以进行2′氟代(2′-F)、2′甲氧基(2′-OMe)、硫代(PS)和2′脱氧(2′-deoxy)化学修饰,优选的修饰方法为2‘-O-Me修饰,即在所有的U和C两个碱基上采用2’-O-Me修饰,A和G用普通未经修饰的。
本发明提供的上述小核酸可以制备成抑制单纯疱疹病毒(HSV)和人类乳头瘤病毒(HPV)病毒的药物,具体可制备成小核酸温度敏感型凝胶制剂,该凝胶制剂包括温度敏感型凝胶和上述小核酸。
所述温度敏感型凝胶为选自泊洛沙姆407、泊洛沙姆188、聚乙二醇-PLGA嵌段共聚物、纤维素衍生物和胶原蛋白中的一种或两种以上任意组合;所述泊洛沙姆188的浓度为50-350mg/ml,所述泊洛沙姆407的浓度为100-500mg/ml,所述聚乙二醇-PLGA嵌段共聚物的浓度为100-350mg/ml,所述纤维素衍生物的浓度为1-300mg/ml。所述的纤维素衍生物选自甲基纤维素、羧甲基纤维素钠和羟丙基甲基纤维素中的一种或两种以上任意组合。所述胶原蛋白的浓度为50-100mg/ml,所述胶原蛋白选用鱼皮和/或猪皮提取的胶原蛋白。所述温度敏感型凝胶以水为溶剂。
所述小核酸温度敏感型凝胶制剂中还包括药学常用的辅料,如增溶剂,、矫味剂;所述小核酸温度敏感型凝胶中包括浓度为30-650mg/ml的增溶剂;所述增溶剂为选自乙醇、丙二醇、聚乙二醇、环糊精类、十二烷基硫酸钠和聚山梨酯类中的一种或两种以上任意组合,其中乙醇的浓度可为50-350mg/ml,丙二醇的浓度可为50-350mg/ml,聚乙二醇的浓度可为100-350mg/ml,环糊精类的浓度可为10-360mg/ml,十二烷基硫酸钠的浓度可为5-50mg/ml,聚山梨酯类的浓度可为5-50mg/ml;所述聚乙二醇为选自PEG300、PEG400和PEG600中的一种或两种以上任意组合;所述环糊精类为选自α-环糊精、β-环糊精、羟丙基-β-环糊精、羟乙基-β-环糊精、二甲基-β-环糊精中的一种或两种以上任意组合;所述聚山梨酯类为选自吐温-80,吐温-60,吐温-85,吐温-40,吐温-20的一种或两种以上任意组合。
为了改善所述温度敏感型凝胶的口味,所述温度敏感型凝胶中包括浓度为0.1-550mg/ml的矫味剂;所述矫味剂为选自蔗糖,山梨醇、甘露醇、木糖醇、丙二醇、甘油、薄荷油、薄荷脑、桔子香精和香蕉香精中一种或一种以上任意组合。
所述小核酸温度敏感型凝胶的pH值为5.0-9.0;pH调节用试剂可为三乙醇胺和/或氢氧化钠和/或氢氧化钾。
上述试剂均可从Sigma等试剂公司购买。
上述小核酸温度敏感型凝胶制剂中,还可以包含其它药学上可接受的载体。本文所用的“药学上可接受的载体”应当与本发明药物组合物中的凝胶和双链核酸分子相容,即能与其共混而不会在通常情况下大幅度降低药物组合物在抑制基因表达方面的效果。可作为药学上可接受的载体或其组分的一些物质的其他例子是糖类,如乳糖、葡萄糖和蔗糖;淀粉,如玉米淀粉和土豆淀粉;西黄蓍胶粉末;麦芽;明胶;滑石;固体润滑剂,如硬脂酸和硬脂酸镁;硫酸钙;植物油,如花生油、棉籽油、芝麻油、橄榄油、玉米油和可可油;多元醇,如甘油、甘露糖醇;海藻酸;乳化剂,如Tween;润湿剂,如月桂基硫酸钠;着色剂;调味剂;压片剂、稳定剂;抗氧化剂;防腐剂;无热原水;等渗盐溶液;和磷酸盐缓冲液等,其中较佳的载体选自生理盐水、甘油和磷酸盐缓冲盐水。
在一个优选实施例中,所述“药学上可接受的载体”是指体内转染试剂,如聚乙二醇单甲醚-聚己内酯-聚磷酸酯三嵌段共聚物(mPEG-b-PCL-b-PPEEA),如聚乙烯亚胺(PEI),jetPEI(线性聚乙烯亚胺),脂质体,转铁蛋白,叶酸等。
所述小核酸温度敏感型凝胶制剂以蒸馏水为溶剂。
所述小核酸温度敏感型凝胶制剂中,所述每种小核酸的含量为2.25-340ug/ml,优选40-340ug/ml,最优选85-340ug/ml或40-95ug/ml或85-95ug/ml;温度敏感型凝胶的体积百分比浓度为75-90%。
本发明筛选获得具有抑制单纯疱疹病毒(HSV)和人类乳头瘤病毒(HPV)病毒活性的双链siRNA,特别可以用于治疗单纯疱疹病毒所致的口腔及生殖器病变或人类乳头瘤病毒(HPV)的感染和HPV所致宫颈癌病变。
本发明将其与温度敏感型凝胶混合制成小核酸温度敏感型凝胶制剂,使本发明的小核酸的具有了如下优点:
1)在体内和体外均能增加转染试剂的转染效果,将更多的小核酸或质粒DNA导入细胞(图1,5)。
2)室温下为液态,能注入(或喷入)阴道或口腔等不规则腔道,或涂抹于皮肤上,接触体温3-5分钟后,在皮肤粘膜表面形成厚度均匀的凝胶膜,该凝胶机械强度大,凝胶体系不易溃塌,生物黏附性强,可牢固黏附于腔道粘膜持续时间长,并保持适当的湿润度,使制剂中的小核酸或质粒DNA能在转染试剂的辅助下进入皮肤粘膜的细胞。通过调节温度敏感型凝胶的配方,可改变凝胶中孔隙的大小,起到分子筛的作用,小分子的小核酸能自由进出,而大分子的蛋白酶难以进入凝胶,从而保护小核酸不被降解,小核酸的化学修饰也进一步增强了小核酸的稳定性。
3)温度敏感型凝胶制剂根据其组方的调整可制备出不同的凝胶温度,通常情况该凝胶在室温为液态,不同的温度状态可满足不同的部位及临床需求,本制剂技术可使临床上达到给药方便,患者使用到病变部位分散效果好,可如水一样渗透到体内指定腔道。
本发明所提供的小核酸温度敏感型凝胶制剂在体外实验中能抑制人的B2M基因和下列一个或多个HPV病毒基因的表达,包括HSV-1ICP27、HPV16、18或58型E7的表达(图2)。人的有核细胞包括肿瘤细胞均表达B2M基因,据报道,B2M有刺激肿瘤生长和转移的作用。
本发明所提供的小核酸温度敏感型凝胶制剂在体外实验中能抑制HSV-1感染所致的细胞病变(图3)。
将宫颈癌细胞Hela、接种于裸鼠,形成肿瘤后用所述小核酸温度敏感型凝胶制剂瘤内注射,能在体内有效抑制肿瘤的生长(图4)。
用所述小核酸温度敏感型凝胶制剂涂抹能治疗HPV相关的宫颈癌移植瘤造成的皮肤粘膜损伤,提示可能对HPV所致的男性生殖器疣以及HPV所致宫颈癌前病变有疗效(图5)。
用所述小核酸温度敏感型凝胶制剂注入(或喷入)阴道或口腔等不规则腔道,能抑制上述腔道和宫颈上皮细胞中宿主B2M基因的表达和或外来的HPV E7的表达,从而能用于抑制HSV-1病毒的人类乳头瘤病毒(HPV)感染和/或治疗HVP所致宫颈癌前病变(图5)。
作为新型小核酸类的抗肿瘤药物,化学合成并修饰的所述寡聚核酸不易被降解,有较长的效应半衰期,能用于体外实验,更能用于体内治疗。另外,小核酸与温度敏感型凝胶混合制成小核酸温度敏感型凝胶制剂时,能大幅度的增加小核酸的转染效率,并且小核酸不容易降解,药效增强。
具体实施方式
发明人在长期的实验中发现小核酸与温度敏感型凝胶混合制成小核酸温度敏感型凝胶制剂时,能大幅度的增加小核酸的转染效率,并且小核酸不容易降解,药效增强。因此,发明人将筛选出的抑制单纯疱疹病毒(HSV)和人类乳头瘤病毒(HPV)病毒的小核酸制成温度敏感型凝胶,并对各组分进行优化筛选。
实施例1、本发明小核酸的制备
本发明的小核酸为人工合成,序列如下:
siHPV16E7:其正义链序列为序列表中序列1(5'CUACUGUUAUGAGCAAUUATT3'),其反义链序列为序列表中序列2(5'UAAUUGCUCAUAACAGUAGTT3');该双链核酸在U和C碱基上采用2′甲氧基修饰。
siHPV18E7:其正义链序列为序列表中序列3(5'CCUUCUAUGUCACGAGCAATT3′),其反义链序列为序列表中序列4(5'UUGCUCGUGACAUAGAAGGTT3');该双链核酸在U和C碱基上采用2′甲氧基修饰。
siB2M:其正义链序列为序列表中序列5(5'GAAUGGAGAGAGAAUUGAA3'),其反义链序列为序列表中序列6(5'UUCAAUUCUCUCUCCAUUC3');该双链核酸在U和C碱基上采用2′甲氧基修饰。
siHPV58E7:其正义链序列为序列表中序列7(5'CCCAACGCUAAGAGAAUAUTT3'),其反义链序列为序列表中序列8(5'AUAUUCUCUUAGCGUUGGGTT3');该双链核酸在U和C碱基上采用2′甲氧基修饰。
HSV-1 siICP27,其正义链序列为序列表中序列9(5'GGACAUUGCAUCCUUCGUGTT3'),其反义链序列为序列表中序列10(5'CACGAAGGAUGCAAUGUCCTT3')。;该双链核酸在U和C碱基上采用2′甲氧基修饰。
下述实施例中为了方便观察结果,可以对上述小核酸进行FAM荧光标记(可从上海吉玛等公司定制)
实施例2、温度敏感型凝胶的制备及其效果检测
一、温敏感型凝胶的制备
温敏感型凝胶的组分及其浓度:
二、按照上述组分浓度配制小核酸温度敏感型凝胶,具体方法如下所述:
1)称取170.0g泊洛沙姆407与2.0g羟丙基甲基纤维素(HPMC E-50lv,上海卡乐康公司,Lot No:TK16012401),加入蒸馏水500ml(4℃左右),搅拌5min,置于4℃条件下使其充分溶胀、分散均匀、溶解,得亲水凝胶的澄明溶液。
2)取5.0g胶原蛋白(购自湖北康宝泰精细化工有限公司)加入蒸馏水50ml,室温,搅拌5min,放置等用。
3)取10.0g HP-β-CD加入100ml蒸馏水溶解,加热至50℃溶胀等待用。
4)取207.5g 1,2-丙二醇加入步骤1)制得的凝胶溶液中搅拌混合均匀,在搅拌状态下,将步骤2)、3)的溶液缓缓加入,搅拌混合均匀,用蒸馏水定容至1L,搅拌混匀,用氢氧化钠调节pH值至6.80,120℃灭菌30min,冷却至4℃,将其分装于灭菌处理容器中(每瓶5ml),即得温度敏感型凝胶。
三、温度敏感型凝胶的效果实验
温度敏感型凝胶的胶凝温度的测定:量取10份按照步骤1制备的温度敏感型凝胶样品5ml,于西林瓶中,将温度计插入凝胶溶液中,置水浴中缓缓加温,升温速率约为每1-2min升高1℃。将西林瓶倾斜90度,观察内容物不流动时的温度,即定义为胶凝温度。每个样品平行测定三次,结果取其平均值。测得其平均胶凝温度为34.7±0.2℃。
实施例3、温度敏感型凝胶的制备及其效果检测
一、温度敏感型凝胶的制备
温度敏感型凝胶的组分及其浓度:
二、配制上述组分浓度温度敏感型凝胶,具体方法如下所述:
1)称取170.0g泊洛沙姆407与5.0g甲基纤维素,加入蒸馏水500ml(4℃左右),搅拌5min,置于4℃条件下使其充分溶胀、分散均匀、溶解,得亲水凝胶的澄明溶液。
2)取5.0g胶原蛋白加入蒸馏水50ml,室温,搅拌5min,放置等用。
3)取20.0g HP-β-CD加入200ml蒸馏水溶解,加热至50℃溶胀等待用。
4)取207.5g 1,2-丙二醇加入步骤1)制得的凝胶溶液中搅拌混合均匀,在搅拌状态下,将步骤2)、3)的溶液缓缓加入,搅拌混合均匀,用蒸馏水定容至1L,用氢氧化钠调节pH值至8.10,120℃灭菌30min,冷却至4℃,将其分装于灭菌处理容器中(每瓶5ml),即得温度敏感型凝胶。
三、温度敏感型凝胶的效果实验
按照实施例1中步骤2的步骤1)的方法测定步骤1制备的温度敏感型凝胶的胶凝温度,结果表明骤1制备的温度敏感型凝胶的胶凝温度胶凝温度为34±1℃。
实施例4、温度敏感型凝胶的制备及其效果检测
温度敏感型凝胶的制备
一、温度敏感型凝胶的组分及其浓度:
二、配制上述组分浓度小核酸温度敏感型凝胶,具体方法如下所述:
1)称取170.0g泊洛沙姆407,加入蒸馏水500ml(4℃左右),搅拌5min,置于4℃条件下使其充分溶胀、分散均匀、溶解,得亲水凝胶的澄明溶液。
2)取25.0g HP-β-CD加入200ml蒸馏水溶解,加热至50℃溶胀等待用。
3)取155.63g 1,2-丙二醇加入步骤1)制得的凝胶溶液中搅拌混合均匀,在搅拌状态下,将步骤2)的溶液缓缓加入,搅拌混合均匀,用蒸馏水定容至1L,搅拌混匀,用氢氧化钠调节pH值至7.90,120℃灭菌30min,冷却至4℃,将其分装于灭菌处理容器中(每瓶5ml),即得温度敏感型凝胶。
三、小核酸温度敏感型凝胶的效果实验
按照实施例1中步骤2的步骤1)的方法测定步骤1制备的小核酸温度敏感型凝胶的胶凝温度,结果表明骤1制备的小核酸温度敏感型凝胶的胶凝温度胶凝温度为34±1℃。
实施例5、温度敏感型凝胶的制备及其效果检测
一、温度敏感型凝胶的组分及其浓度:
处方组成:
二、配制上述组分浓度温度敏感型凝胶,具体方法如下所述:
1)称取160.0g泊洛沙姆407,加入蒸馏水500ml(4℃左右),搅拌5min,置于4℃条件下使其充分溶胀、分散均匀、溶解,得亲水凝胶的澄明溶液。
2)取甲基纤维素(MC)5.0g/L与十二烷基硫酸钠10g/L加入蒸馏水200ml,加热至50℃溶解。
3)取103.75g 1,2-丙二醇、30g甘油加入步骤1)制得的凝胶溶液中搅拌混合均匀,在搅拌状态下,将步骤2)的溶液缓缓加入,搅拌混合均匀,用蒸馏水定容至1L,搅拌混匀,用氢氧化钠调节pH值至6.80,120℃灭菌30min,冷却至4℃,将其分装于灭菌处理容器中(每瓶5ml),即得温度敏感型凝胶。
三、温度敏感型凝胶的效果实验
按照实施例1中步骤2的步骤1)的方法测定步骤1制备的温度敏感型凝胶的胶凝温度,结果表明骤1制备的温敏凝胶的胶凝温度胶凝温度为35±1℃。
实施例6、小核酸温度敏感型凝胶制剂增强转染试剂的转染效率:
本实施例分别用转染试剂或凝胶制剂将FAM荧光标记的siB2M或/和实施例1中所述的其它小核酸导入hela细胞,比较凝胶制剂与转染试剂的转染效果。
将FAM荧光标记的实施例1中所述的小核酸(siHPV16E7、siHPV18E7、siB2M或siHPV58E7、HSV-1ICP27)粉末分别溶解于无RNA酶的无菌水中,分别配成终浓度为5-50μmol/L的FAM荧光标记的小核酸溶液。
按厂商说明配制转染试剂与小核酸的混合溶液。具体如下述步骤1)所示:
1)lipofectamine 2000(Invitrogen)与小核酸混合液的制备:分别将50μlFAM荧光标记的小核酸溶液(0.27ug/ul)和50μl的lipofectamine 2000(Invitrogen)分别稀释于100μl无血清培养液(Opti-MEM,从GIBICO公司购买)中,并在室温下孵育5分钟,然后将上述FAM荧光标记的小核酸溶液与lipofectamine 2000溶液混合,于室温静置20分钟。
2)线性聚乙烯亚胺(Jet-PEI)与小核酸混合液的制备:分别将50μl(20μM/L)FAM荧光标记的小核酸溶液和2μl的Jet-PEI分别稀释于75μl的10%的葡萄糖溶液中,分别用25μl和75μl的无RNA酶的无菌水补充体积到150μl,然后将上述小核酸溶液与jet-PEI溶液混合配制成300ul的FAM荧光标记的小核酸jet-PEI混合液,于室温静置15分钟。
将将1)和2)得到的溶液按适当比例加入上述将实施例2-5中任意一种温度敏感型凝胶,配制比例(体积比)为1:9,1:7,1:5或1:3(即液态状态下,温度敏感型凝胶占制剂的体积百分含量为90%、87.5%、83.3%或75%),充分混匀得到小核酸温度敏感型凝胶制剂。该小核酸温度敏感型凝胶制剂中的核酸为siB2M或siB2M与下列任意一种小核酸混合:siHPV16E7、siHPV18E7、siHPV58E7、HSV-1-siICP27,混合比例为1:1(质量比)。核酸溶液与温度敏感型凝胶比例为1:9时siB2M 4.5ug/ml或siB2M2.25ug/ml,其它核酸2.25ug/ml;1:7时siB2M 5.6ug/ml,或siB2M 2.8ug/ml,其它核酸2.8ug/ml;1:5时siB2M 7.5ug/ml或siB2M 3.75ug/ml,其它核酸3.75ug/ml;1:3时siB2M 11.2ug/ml或siB2M 5.6ug/ml,其它核酸5.6ug/ml。
将制备好的小核酸温度敏感型凝胶制剂加入细胞培养皿中,加入的量由细胞培养皿的大小而定,覆盖孔底即可。然后37度放5分钟,使凝胶凝固。
用胰酶消化处于对数生长期的Hela细胞(购自昆明细胞库,保藏编号为KCB86019YJ),caski细胞(购自中科院细胞库,保藏编号为TCHu137),siha细胞(购自中科院细胞库,保藏编号为TCHu135),添加10%FBS的DMEM培养基培养,用血细胞计数板计数细胞,然后每个24孔板孔的凝胶上加入10万个细胞培养,添加10%FBS的DMEM培养基,GIbico/PPA)6-12小时后在荧光显微镜下观察荧光情况。以上述1)和2)不加温度敏感型凝胶的处理作为对照。
结果表明,加了胶转染的细胞比不加胶的细胞荧光强度要高很多,小核酸温度敏感型凝胶制剂的转染效率大于90%,而不加温度敏感型凝胶的只加转染试剂转染效率为50-60%。结果表明小核酸温度敏感型凝胶制剂增强了转染试剂的转染效率。部分结果附图如图1所示,图1为Hela细胞的转染效果照片,使用的温度敏感型凝胶为实施例2制备的温度敏感型凝胶,小核酸为B2M与转染试剂的混合溶液与温度敏感型凝胶的比例为1:9。
实施例7、小核酸温度敏感型凝胶制剂抑制B2M以及16、18及58型HPV E7的表达。
一、制备高表达58HPV E7的细胞株:
合成58型HPV E7全长基因(自GENBANK号为HM004114的5′端第1-297位核苷酸,苏州吉玛合成),以该序列为模板完成PCR实验,自GENBANK号为HM004114的5′端第1-297位核苷酸,苏州吉玛合成
PCR引物:Sense:5'CACCATGAGAGGAAACAACCCAAC3',Anti-sense:5'ATCCATTGCAGATGGTGTTTATTGC3'
PCR反应条件:94℃,5分钟预变性,94℃ 30秒,55℃退火30秒,72℃延伸30秒,进行30个循环,72℃延伸10分钟。胶回收319bp的PCR产物并对其进行定量。使用pcDNA
TM 3.1 Directional
Expression Kit试剂盒(Invitrogen,USA)按说明书将PCR扩增产物插入质粒构建HPV58E7表达质粒。将质粒导入HEK-293细胞(购自中科院细胞库),用G418筛出高表达58型HPV E7的细胞株(用PCR和测序的方法进行鉴定)。
二、小核酸温度敏感型凝胶制剂的制备
按照下述方法制备小核酸温度敏感型凝胶制剂:
1)将siB2M或siB2M与下列任意一个核酸混合:HSV-1-siIPC27、siHPV16E7、siHPV18E7、siHPV58E7(siB2M与其它核酸的质量比例1:1)溶解于无RNA酶的无菌水中,分别配成含终浓度均为0.27ug/ul的小核酸溶液。
2)分别将50μl步骤1)所述的小核酸溶液和2μl的线性聚乙烯亚胺(Jet-PEI)分别稀释于75μl的10%(质量百分含量)的葡萄糖溶液中,分别用25μl和75μl的无RNA酶的无菌水补充体积到150μl,然后将二者混合配制成300ul的FAM荧光标记的小核酸jet-PEI混合液,于室温静置15分钟。
3)将步骤2)得到的溶液和实施例3的温度敏感型凝胶按1:9的比例充分混匀得到小核酸温度敏感型凝胶制剂。该小核酸温度敏感型凝胶制剂中核酸含量为siB2M4.5ug/ml或siB2M 2.25ug/ml,其它核酸2.25ug/ml。
制备只含随机序列寡聚核酸的凝胶制剂作为阴性对照NC。
三、小核酸温度敏感型凝胶制剂抑制B2M、HSV-1-ICP27以及16、18及58型HPVE7的表达。
将制备好的小核酸温度敏感型凝胶制剂加入细胞培养皿中,37度放5分钟,使凝胶凝固。再将制备好的高表达58型HPV E7的细胞株(图2D)及宫颈癌细胞Hela细胞(购自昆明细胞库,保藏编号为KCB 86019YJ,表达HPV18E7及B2M,图2A、C和E),caski细胞(表达HPV16E7,图2B)接种到凝胶表面,每个6孔板孔加入70万个细胞,用1.5ml DMEM/10%FBS培养,24小时后收集细胞,(提取总RNA,分别进行RT-PCR检测。RT-PCR引物为HPV-16 E7:Forward:AGCTGGACAAGCAGAACCGGACA,Reverse:AGAACAGATGGGGCACACAATTCCT;HPV-18 E7 primer:Forward:ATGCATGGACCTAAGGCAACA,Reverse:TACTGCTGGGATGCACACCAC;HPV-58 E7 primer:Sense:5'CACCATGAGAGGAAACAACCCAAC3',Anti-sense:5'ATCCATTGCAGATGGTGTTTATTGC3';siB2M:human B2M FW:GGTTTCATCCATCCGACAT;human B2M RV:ACGGCAGGCATACTCATCT。
HSV-1-ICP27 primer:Forward TGTTCCAACCACGGTCACGC,ReverseCAGGCCGAGGTCAATTAGCATA.
PCR反应条件:94℃,5分钟预变性,94℃ 30秒,55℃退火30秒,72℃延伸30秒,进行30个循环,72℃延伸10分钟。
其中,图2E所用hela细胞收集细胞前4小时用HSV-1(购自武汉病毒所)感染细胞,4小时后收集细胞,提取总RNA,进行QRT-PCR检测。
结果如图2所示,与只含随机序列寡聚核酸的凝胶制剂相比,本发明所研发的小核酸温度敏感型凝胶制剂能有效的抑制B2M(图2A)、HPV16(图2B)、18(图2C)、58型E7(图2D)及HSV-1-ICP27的表达(图2E)。图2中凝胶制剂为上述实施例3的温度敏感型凝胶与小核酸溶液混合后制备的小核酸温度敏感型凝胶制剂,NC为阴性对照(随机序列小核酸:Sense:UUCUCCGAACGUGUCACGUTT;Antisense:ACGUGACACGUUCGGAGAATT;)空白对照(或空白)为凝胶制剂中未加核酸。
实施例8、小核酸温度敏感型凝胶制剂抑制HSV病毒的繁殖及病毒所致的细胞病变。
按实施例7所描述的方法配制小核酸温度敏感型凝胶制剂,小核酸jet-PEI混合液与温度敏感型凝胶的比例为1:9(体积比),温度敏感型凝胶使用实施例4制备的温度敏感型凝胶。该小核酸温度敏感型凝胶制剂中的为siB2M或siB2M加HSV-1-siICP27(1:1),分别为siB2M 4.5ug/ml或siB2M 2.25ug/ml,HSV-1-siICP27为2.25ug/ml。按照上述方法制备只含随机序列寡聚核酸的凝胶制剂作为阴性对照NC。
将制备好的小核酸温度敏感型凝胶制剂加入细胞培养皿中,37度放5分钟,使凝胶凝固。再将Hela(购自昆明细胞库,保藏编号为KCB 86019YJ)接种到凝胶表面,每个6孔板孔加入70万个细胞,用1.5ml添加终质量百分比10%FBS的DMEM培养基培养,24小时后用HSV-1病毒标准株Sm44(Zhe REN,et al.2010 in vitro Anti—viral Activity of the Total Alkaloids from Tripterygium hypoglaucum againstHerpes Simplex Virus Type 1 V1ROLOG1CASINICA,April 2010,25(2):107.114)感染细胞,24小时后用显微镜下拍照Hela细胞。
结果如图3中A所示,与只含转染随机序列的阴性对照凝胶NC组相比。小核酸温度敏感型凝胶制剂明显抑制HSV病毒所致的细胞病变(A和B)。
空斑实验:将制备好的小核酸温度敏感型凝胶制剂加入6孔细胞培养皿中,37度放5分钟,使凝胶凝固。将Vero细胞(购自中科院细胞库)接种到6孔培养板的凝胶表面,24小时后感染梯度稀释的HSV-1病毒标准株Sm44,孵育1小时后,加入0.6%的琼脂,37℃孵育3天可以肉眼看到小而白的斑点即为空斑。计算单个明显可辨的空斑来检测滴度(见表1)。
结果如图3中B和表1所示,结果表明,小核酸温度敏感型凝胶制剂明显抑制抑制病毒繁殖。
表1.滴度检测结果
实施例9、小核酸温度敏感型凝胶制剂抑制宫颈癌移植瘤的生长:
一、小核酸温度敏感型凝胶制剂的制备
用siB2M和siHPV18E7按下列方法配制小核酸温度敏感型凝胶制剂:1)Jet-PEI与寡聚核酸的混合液的配制:分别将17.5μl(siB2M 8.75μl加siHPV18E7 8.75μl,均为2.29ug/uL,溶剂为无RNA酶的无菌水)小核酸溶液和8.7μl的Jet-PEI分别稀释于17.5μl的质量百分比浓度为10%的葡萄糖溶液中,用无RNA酶的无菌水补充体积到35μl,然后将上述寡聚核酸溶液与jet-PEI溶液混合配制成35ul的小核酸jet-PEI混合液,复合物于室温静置15分钟。
将寡聚核酸jet-PEI混合液按适当比例加入实施例5制备的温度敏感型凝胶,配制比例为比例为1:5(体积比)得到小核酸温度敏感型凝胶制剂,该小核酸温度敏感型凝胶制剂中siB2M和siHPV18E7分别为0.095ug/ul。按照上述方法制备只含随机序列寡聚核酸的凝胶制剂作为阴性对照NC。
二、小核酸温度敏感型凝胶制剂抑制宫颈癌移植瘤的生长
体外培养并收获Hela细胞,用PBS洗涤细胞,并制成密度为107细胞/毫升的细胞悬液,每只裸鼠(Balb/C裸鼠,出售公司名称:广州中医药大学动物实验中心)于左右臀部各接种0.1毫升细胞悬液(106个细胞)。继续饲养动物一周,待肿瘤长至100mm3时将小鼠随机分成为小核酸温度敏感型凝胶制剂治疗组和随机序列阴性对照凝胶组(NC),每组4只。用游标卡尺测量每个肿瘤的长径和短径,并做记录。通过公式:肿瘤体积=长径×短径2/2,计算肿瘤体积。
对肿瘤局部用碘伏消毒,将40-60ul小核酸温度敏感型凝胶制剂注射到对应组别的肿瘤中(小核酸7.6-11.4ug/肿瘤)。隔天测量并注射一次,共给药4次。将每次所得数据依上述公式计算每个肿瘤的体积。
结果如图4所示,小核酸温度敏感型凝胶制剂抑制宫颈癌移植瘤的生长图4为4次给药后的结果。
实施例10、小核酸温度敏感型凝胶制剂治疗HPV相关的皮肤粘膜损伤
一、小核酸温度敏感型凝胶制剂的制备
用siB2M和siHPV18E7按下列方法配制小核酸温度敏感型凝胶制剂:1)Jet-PEI与小核酸的温度敏感型凝胶制剂的配制:分别将17.5μl(siB2M 8.75μl加siHPV18E78.75μl,均为2.29ug/uL,溶剂为无RNA酶的无菌水)小核酸溶液和8.7μl的Jet-PEI分别稀释于17.5μl的质量百分比浓度为10%的葡萄糖中,用无RNA酶的无菌水补充体积到35μl,然后将上述寡聚核酸溶液与jet-PEI溶液混合配制成70ul的小核酸jet-PEI混合液,复合物于室温静置15分钟。
将寡聚核酸jet-PEI混合液按适当比例加入实施例2制备的温度敏感型凝胶,配制比例为比例为1:6(体积比)。每ml小核酸温度敏感型凝胶制剂含81.63ug小核酸(siB2M为40.8ug,siHPV18E7为40.8ug)。按照上述方法制备只含随机序列寡聚核酸的凝胶制剂作为阴性对照NC。
二、小核酸温度敏感型凝胶制剂治疗表达HPV18E7的宫颈癌细胞所致的皮肤粘膜损伤
体外培养并收获Hela细胞,用PBS洗涤细胞,并制成密度为107细胞/毫升的细胞悬液,每只Balb/C裸鼠于左右肋部各接种0.1毫升细胞悬液(106个细胞)。继续饲养裸鼠,待肿瘤长至100mm3时,将荷瘤鼠随机分为小核酸温度敏感型凝胶制剂组、随机序列阴性对照(NC)和PBS(pH 7.4)空白对照三组,每组4只。
用小核酸温度敏感型凝胶制剂涂抹有皮损的肿瘤表面皮肤,每隔一天进行一次涂抹,共涂抹5次。每次涂抹之前都拍照存档,随机序列阴性对照(NC)和PBS(pH 7.4)空白对照也进行相应操作。对比各组的肿瘤部位的皮损情况,涂抹了小核酸温度敏感型凝胶制剂(图5中凝胶制剂)的肿瘤表面的皮损要明显小于阴性对照NC组(图5中NC)和空白对照PBS组(图5中PBS)。图5中A为治疗四天后的皮肤损伤情况,损伤仍然明显,图5中B为治疗9天后的皮肤损伤情况,此时损伤明显改善。
实施例11、小核酸温度敏感型凝胶制剂抑制阴道和宫颈上皮细胞中表达的HPV E7
一、小核酸温度敏感型凝胶制剂的制备
用siB2M、siHPV16E7和siHPV18E7(均为2.29ug/uL)按下列方法配制小核酸温度敏感型凝胶制剂:1)Jet-PEI与小核酸的温度敏感型凝胶制剂的配制:分别将17.5μl的siB2M,或8.75ul的siB2M加8.75ul siHPV16E7,或8.75ul的siB2M加8.75ulsiHPV18E7的小核酸溶液和8.7μl的Jet-PEI分别稀释于17.5μl的质量百分浓度10%的葡萄糖溶液中,用无RNA酶的无菌水补充体积到35μl得到小核酸溶液,然后将该小核酸溶液与jet-PEI溶液混合配制成70ul的小核酸jet-PEI混合液,复合物于室温静置15分钟。将小核酸jet-PEI混合液按适当比例加入实施例1制备的温度敏感型凝胶,配制比例为1:5(体积比)得到小核酸温度敏感型凝胶制剂。该小核酸温度敏感型凝胶制剂中siB2M为0.095ug/ul或siB2M与siHPV16E7/siHPV18E7分别为0.048ug/ul。按照上述方法制备只含随机序列寡聚核酸的凝胶制剂作为阴性对照NC。
含质粒的温度敏感型凝胶的制备:将8.75ug HPV 16 E7-EGFP质粒或者EGFP荧光报告载体(购自BD Bioscience载体名称为pEGFP-N1质粒)和3μl的Jet-PEI分别稀释于8.75μl的质量百分浓度10%的葡萄糖溶液中,用无RNA酶的无菌水补充体积到17.5μl得到质粒溶液,然后将质粒溶液与jet-PEI溶液混合配制成35ul的质粒jet-PEI混合液,于室温静置15分钟。将质粒jet-PEI混合液按适当比例加入实施例1制备的温度敏感型凝胶,配制比例为1:5(体积比)得到HPV 16 E7-EGFP质粒或者EGFP荧光报告载体的温度敏感型凝胶。
HPV 16 E7-EGFP质粒构建:合成16型HPV E7全长基因(苏州吉玛),以该序列为模板完成PCR实验。PCR引物:Forward(含内切酶NheI位点):GCTA
ATGGAGATACACCTACA,Reverse(含内切酶KpnI位点):GGTACCGGTGGTTTCTGAGAACAGATG,PCR反应条件:94℃,5分钟预变性,94℃ 30秒,55℃退火30秒,72℃延伸30秒,进行30个循环,72℃延伸10分钟。胶回收279bp的PCR产物并对其进行定量。将PCR产物从内切酶NheI和KpnI切口插入pEGFP-N1质粒(购自BD Bioscience)。克隆时,在起始密码子ATG前加入一个C,使的在起始密码子前有一个KOZAK序列。去掉终止密码子TAA,替换成CC,使得插入的E7基因在翻译时,能够翻译紧接E7和其后的EGFP,最终形成HPV E7-EGFP的融合蛋白。
二、小核酸温度敏感型凝胶制剂抑制阴道和宫颈上皮细胞中表达的HPV E7
健康雌性SD大鼠(广州中医药大学动物实验中心)麻醉后,将210ul含HPV 16E7-EGFP表达质粒的温度敏感型凝胶、EGFP荧光报告载体温度敏感型凝胶分别注入SD大鼠的阴道内宫颈处。建立阴道及子宫颈上皮表达HPV 16或绿色荧光蛋白的大鼠动物模型。24小时后,再用步骤一制备的小核酸温度敏感型凝胶制剂处理,NC作为阴性对照。将小核酸温度敏感型凝胶制剂(含小核酸40ug)210ul/只分别灌注到SD大鼠阴道内宫颈处,再过24小时处死大鼠,取出阴道及子宫颈,经过固定,冷冻切片,在荧光显微镜下观察。与EGFP+NC(图6A)、16 E7-EGFP+NC(图6B)以及EGFP+小核酸温度敏感型凝胶制剂(图6C)处理组比较,16 E7-EGFP+小核酸温度敏感型凝胶制剂(图6D)处理组样本的荧光强度明显减弱,说明16 E7 siRNA小核酸温度敏感型凝胶制剂抑制阴道和宫颈上皮细胞中表达的HPV 16E7。
健康雌性SD大鼠麻醉后,将210ul含HPV HPV8 E7表达质粒的温度敏感型凝胶、EGFP荧光报告载体温度敏感型凝胶分别注入SD大鼠的阴道内宫颈处。24小时后,再用小核酸温度敏感型凝胶制剂处理(含小核酸40ug),NC作为阴性对照。再过24小时处死大鼠,将210ul Trizol(Invitrogen)注入到大鼠阴道中,裂解上皮组织,5分钟后回收Trizol。提取样品中的总RNA,通过Q-RT-PCR或RT-PCR检测B2M(图7A)或HPV 18 E7(图7B)的表达情况,小核酸温度敏感型凝胶制剂抑制阴道和宫颈上皮细胞内源性B2M和外来的HPV E7的表达。检测B2M的引物为rat_b2M_siRNA:Sense:5'ACACACACAUACACACACA3’;Anti-sense:5’UGUGUGUGUAUGUGUGUGU3’;检测HPV 18E7的引物为HPV-18 E7 primer:Forward:ATGCATGGACCTAAGGCAACA,Reverse:TACTGCTGGGATGCACACCAC。以GAPDH为内参,引物为Forward:ACGGCAAGTTCAACGGCAC,Reverse:CGCCAGTAGACTCCACGACAT。