CN103889400A - 用于治疗hpv的组合物和方法 - Google Patents

用于治疗hpv的组合物和方法 Download PDF

Info

Publication number
CN103889400A
CN103889400A CN201280044697.1A CN201280044697A CN103889400A CN 103889400 A CN103889400 A CN 103889400A CN 201280044697 A CN201280044697 A CN 201280044697A CN 103889400 A CN103889400 A CN 103889400A
Authority
CN
China
Prior art keywords
freeze
hpmc
composition
plasticizer
cidofovir
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN201280044697.1A
Other languages
English (en)
Inventor
马里耶·皮耶特
布里吉特·埃夫拉尔
伊莎贝尔·科亚
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Vrije Universiteit Brussel VUB
Universite Libre de Bruxelles ULB
Femalon SPRL
Original Assignee
Universite Libre de Bruxelles ULB
Femalon SPRL
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=45877205&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=CN103889400(A) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Application filed by Universite Libre de Bruxelles ULB, Femalon SPRL filed Critical Universite Libre de Bruxelles ULB
Publication of CN103889400A publication Critical patent/CN103889400A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/30—Macromolecular organic or inorganic compounds, e.g. inorganic polyphosphates
    • A61K47/36—Polysaccharides; Derivatives thereof, e.g. gums, starch, alginate, dextrin, hyaluronic acid, chitosan, inulin, agar or pectin
    • A61K47/38—Cellulose; Derivatives thereof
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/66—Phosphorus compounds
    • A61K31/675—Phosphorus compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. pyridoxal phosphate
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/0012—Galenical forms characterised by the site of application
    • A61K9/0014—Skin, i.e. galenical aspects of topical compositions
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/0012—Galenical forms characterised by the site of application
    • A61K9/0034—Urogenital system, e.g. vagina, uterus, cervix, penis, scrotum, urethra, bladder; Personal lubricants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/0012—Galenical forms characterised by the site of application
    • A61K9/0053—Mouth and digestive tract, i.e. intraoral and peroral administration
    • A61K9/006—Oral mucosa, e.g. mucoadhesive forms, sublingual droplets; Buccal patches or films; Buccal sprays
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/06—Ointments; Bases therefor; Other semi-solid forms, e.g. creams, sticks, gels
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/14—Particulate form, e.g. powders, Processes for size reducing of pure drugs or the resulting products, Pure drug nanoparticles
    • A61K9/19—Particulate form, e.g. powders, Processes for size reducing of pure drugs or the resulting products, Pure drug nanoparticles lyophilised, i.e. freeze-dried, solutions or dispersions
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/70—Web, sheet or filament bases ; Films; Fibres of the matrix type containing drug
    • A61K9/7007—Drug-containing films, membranes or sheets
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/20—Antivirals for DNA viruses
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/20—Antivirals for DNA viruses
    • A61P31/22—Antivirals for DNA viruses for herpes viruses
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents

Abstract

本发明涉及冻干组合物，所述冻干组合物包含西多福韦，羟丙基甲基纤维素(HPMC)或羟乙基纤维素(HEC)和任选的增塑剂。本发明尤其涉及此种组合物，所述组合物形成片状多孔固体基质。本发明还涉及生产此种组合物的方法。本发明进一步涉及此种组合物用于治疗人乳头瘤病毒(HPV)感染和HPV相关的恶性肿瘤，尤其是HPV病变和宫颈癌。

Description

用于治疗HPV的组合物和方法
技术领域
本发明涉及治疗病毒感染。本发明尤其涉及治疗人乳头瘤病毒(HPV)感染和相关恶性肿瘤的制剂。本发明特别涉及用于一般药物递送，局部施用或粘膜递送的固体剂型。
背景技术
DNA病毒如疱疹，痘，乳头瘤病毒，腺病毒，天花病毒等能引起人的很多不同的感染性疾病。一个例子，人乳头瘤病毒(HPV)是能感染人的无包被的DNA病毒的乳头瘤病毒科家族的成员。与所有乳头瘤病毒一样，HPV是严格亲上皮细胞的，并且仅在皮肤的复层上皮或粘膜建立生产性感染。近200个已知类型的HPV中的多数在大多数人中不引起症状，一些类型能够引发疣，另一些能够导致各种各样的癌症，最显著的是宫颈癌。
超过30至40种的HPV典型地通过性接触进行传播并感染肛殖区。一些性传播的HPV类型可以引发生殖器疣。持续感染不同于引起皮肤疣的类型的“高风险”HPV类型，可以发展为癌前病变和侵入性癌症。HPV感染是几乎所有宫颈癌的病因；然而，多数这些类型的感染不会引发疾病。
多数年轻女性中的HPV感染是短暂的，且几乎没有长期影响。70%的感染在1年内消失，90%的在2年内消失。然而，当感染持续(在5%到10%的被感染女性中)时，则有高的发展前期宫颈癌(宫颈上的病变)的风险，其能够发展为侵入性宫颈癌。这一过程通常需要15-20年，这提供了很多检测和治疗癌前病症的机会，通常具有高的治愈率。
虽然疫苗接种是一个预防HPV感染的有效方法，而治疗的选择是受限的，昂贵且经常不是良好耐受的。传统的治疗方法包含细胞破坏性，细胞毒性物质，外科方法，激光，冷冻治疗，可能与免疫治疗联合。近些年，无环核苷磷酸西多福韦(cidofovir)被证明在治疗若干DNA病毒如疱疹，痘，乳头瘤病毒，腺病毒，天花病毒等的多种临床表现方面有效，尤其是，西多福韦已被用于治疗HPV引起的上皮细胞增生。在体外，用西多福韦治疗HPV阳性细胞产生依赖浓度和时间的细胞增殖的抑制。不同的细胞凋亡参数表明用西多福韦治疗后的细胞死亡的机理是基于细胞凋亡。利用静脉内(全身的)西多福韦的治疗已显示导致弥散性乳头状瘤病(papillomatosis)的稳定。具有乳头瘤病变的患者中的西多福韦的局部瘤内注射已显示导致肿瘤完全消退。此外，西多福韦局部凝胶已成功用于治疗严重的，复发的肛门生殖器HPV病变和宫颈上皮内瘤形成。因为西多福韦被证明能够诱导凋亡，因此，乳头状瘤的消退可能至少部分是由于西多福韦诱导的凋亡。
如上所描述的，多种制剂和给药途径目前被用于西多福韦的施用。然而，每种施用都呈现具体的缺陷。通过静脉注射的西多福韦水溶液的全身施用，可能导致全身的副作用。需要增加西多福韦浓度以保证在靶位点的足够的西多福韦的量，其可能导致中毒性肾损害。在另一方面，在靶位点局部注射西多福韦可能需要多次注射以保证对靶位点的足够覆盖。作为注射用西多福韦水溶液的备选方案，乳膏，凝胶和薄膜已被开发用于局部施用，其可以保证局部施用到靶位点。然而，乳膏中西多福韦的稳定性低，并且因此，其活性衰退快。此外，薄膜的制备包括加热步骤，其可能产生热介导的西多福韦降解的风险。
因此本发明的目的是提供新的西多福韦制剂，所述制剂克服现有已知制剂的缺陷。
发明概述
经过广泛的研究，发明人发现：特定制剂提供已有西多福韦制剂的有价值的且有利的备选方案，所述特定制剂包含冻干的组合物，所述冻干组合物包含西多福韦、羟乙基纤维素(HEC)或羟丙基甲基纤维素(HPMC)和任选的增塑剂。
因此，在一个方面，本发明涉及片状的冻干组合物，其包含：
(a)西多福韦，其量为0.1至5.0mg/cm2；
(b)羟乙基纤维素(HEC)或羟丙基甲基纤维素(HPMC)，其量为1.0至17.0mg/cm2；和任选的
(c)增塑剂，其量为0至5.0mg/cm2，
在一个优选的实施方式中，根据本发明的冻干组合物包含：
(a)西多福韦，其量为0.1至5mg/cm2，优选为2.0至5.0mg/cm2；
(b)HEC，其量为1.0至17.0mg/cm2，优选为7.0至10.5mg/cm2；和
(c)增塑剂，其量为0.5至4.0mg/cm2。
优选地，HEC选自由HEC H4000，HEC250M，HEC250HX和HEC250HHX组成的组，最优选为HEC250M或HEC250HX。
在其它优选的实施方式中，根据本发明的冻干组合物包含：
(a)西多福韦，其量为0.1至5mg/cm2；
(b)HPMC，其量为1.0至17.0mg/cm2；和
(c)增塑剂，其量为0.0至5.0mg/cm2。
优选地，HPMC选自由HPMC E5，HPMC E15，HPMC4000和HPMCK15组成的组，最优选为HPMC E5，或HPMC E15。
发明人意外的发现该制剂在冻干后形成干燥的、固体的、易于操作的和有延展性的，多孔的基质，所述基质本身呈现为海绵状结构。
与在前已知的乳膏或凝胶相比，根据本发明的组合物展现出极好的西多福韦稳定性。因此，有利地，相比需要冷冻保存的凝胶和乳膏，根据本发明组合物可以储存在环境(室)温度。
此外，与制备薄膜相比，在制备根据本发明的组合物的过程中不存在加热步骤，借此排除了热介导的西多福韦降解的风险。
向根据本发明的冻干组合物中加入少量水让海绵状结构在不需要搅拌的情况下快速转变为粘附性凝胶。已发现再水化的速度和再水化所需要的水量可以通过改变聚合物的类型和浓度而轻易调节。特别是，已发现再水化的速度随聚合物浓度的增加而降低。取决于是否需要缓慢的再水化(例如用于缓慢释放用途)，在根据本发明的组合物中可以使用更高浓度的聚合物。发明人还发现基于HPMC的海绵体比基于HEC的海绵体需要更少量的水以用于再水化，其可能影响给药的模式。基于HPMC的海绵体可以直接施用，即在施用前不进行再水化。再水化可借助于最少量的阴道液在子宫原位发生。这对于HPMC E5，HPMC E15，HPMC4000和HPMC K15，最优选地对于HPMC E5和HPMC E15尤其是这样。
另一方面，基于HEC的海绵体可以在施用前再水化，形成凝胶状组合物，其可以随后施用于受试者的阴道或宫颈中。本发明的基于HEC的组合物的再水化可以用比基于HPMC的组合物的更大量的水进行。
进一步发现在根据本发明的组合物的再水化后获得的凝胶的粘度由聚合物的类型和浓度决定(不由增塑剂的类型和浓度决定)。这使得易于根据需要通过改变聚合物的类型和浓度来调节粘度。尤其是，发明人发现用同样的条件和组分的量，基于HEC的海绵体在再水化后比基于HPMC的海绵体更粘，并且将其自身呈现为凝胶。这对于HEC H4000，HEC250M，HEC250HX和HEC250HHX，最优选地对于HEC250M和HEC250HX尤其是这样。
粘度的不同对于确定向受试者施用根据本发明的组合物的途径是重要的。粘性较低的基于HPMC的组合物的优点是，在原位形成凝胶状结构需要的水较少。因此，它们可以被容易地适用于受试者内，而不需要加入水以引发再水化。所述再水化在受试者体腔内使用体液原位进行。基于HEC的组合物更粘，并且具有形成凝胶的优点，所述凝胶可以更易于局部施用到例如肛殖区。
本发明因此还提供在根据本发明的冻干组合物(特别是根据本发明的基于HEC的冻干组合物)的再水化后获得的凝胶状组合物。
在一个实施方案中，根据本发明的冻干组合物中的增塑剂(如果有)选自由聚乙二醇400或4000(PEG400或4000)和丙二醇(PG)构成的组。在一个优选的实施例中，根据本发明的组合物中的增塑剂(如果有)是PEG，更优选是PEG400。
在另一个实施方案中，根据本发明的冻干组合物还包含水，其量为1至10重量%，优选为1至8重量%。
在一个实施方案中，根据本发明的冻干组合物还包含NaOH。NaOH通常在冻干前加入到组合物中，以促进西多福韦溶解。在另一个实施方式中，根据本发明的冻干组合物在冻干前和在基质的再水化后具有的pH为6至8，优选为6.5至7.5。
优选地，根据本发明的组合物中的HPMC选自由HPMC E5，HPMCE15，HPMC4000和HPMC K15组成的组，根据本发明的组合物中的HEC选自由HEC H4000，HEC250M，HEC250HX和HEC250HHX组成的组。
发明人证明与冻干的空白对照剂组合物(包含多种纤维素衍生物如HPMC，NaCMC或HEC，其都形成有延展性的海绵体)相比，只有基于HPMC的组合物和基于HEC的组合物能够在加入西多福韦时在冻干后形成具有延展性的海绵体。
意外地，基于其它聚合物如NaCMC、Carbomer(卡波姆)974P或HPC的其它测试组合物，在西多福韦存在时，不能形成具有延展性的海绵体或展现出其它不利的性质，如，非常硬和/或易碎，太粘或根本不具有粘性，显示结构缺陷或显示慢或难的再水化。发明人证明加入西多福韦改变了冻干海绵体的结构和功能特性。此外，发明人证明，相比空白对照剂海绵体，在根据本发明的组合物中加入西多福韦，改变了海绵体的孔结构。尤其是，发现西多福韦似乎削弱孔结构，特别在基于HPMC的组合物的情况下。
在一个方面，本发明涉及如本文描述的冻干组合物，其用于局部药物递送，尤其用于治疗所有与人DNA病毒如疱疹，痘，乳头瘤病毒，腺病毒，天花病毒，优选地HPV，CMV，BK病毒，天花，HSV或VZV的感染相关的病理学或伴随病理学，如选自包含以下的组那些病理学：阴道，宫颈，肛殖区，粘膜，口部范围(oral sphere)的上皮或皮肤的病毒致病变或疣，病毒感染引起的癌前病变和/或肿瘤或癌症，更具体地，所述病理学针对宫颈或宫颈的粘膜表面。尤其是，HPV感染和病理学是预期的。术语“与HPV或DNA病毒感染相关的病理学”包括但不限于：宫颈，子宫，肛殖区或皮肤的HPV或DNA病毒致病变或疣，HPV或DNA病毒感染引起的癌前病变和/或肿瘤或癌症，更具体地，所述病理学针对宫颈或宫颈的粘膜表面。在另一方面，本发明涉及如本文所述的冻干组合物，其用于治疗人乳头瘤病毒(HPV)感染。在另一个方面，本发明涉及如本文所述述的冻干组合物，其用于治疗宫颈癌。本发明还提供使用根据本发明的冻干组合物治疗HPV或DNA病毒感染的方法。所述组合物的施用可以直接进行，通过将冻干组合物插入到宫颈中，例如在阴道插入物上或固定于阴道或子宫帽。备选地，根据本发明的组合物可以在其施用前再水化，并且然后作为凝胶状组合物在宫颈中施用。该治疗可以重复多次以防止、减少或消除如本文所定义的HPV或DNA病毒感染相关病理学，更特别是HPV或DNA病毒感染，或HPV或DNA病毒致病变，癌前病变，或癌，尤其是宫颈癌。
在另一个方面，本发明涉及生产本文所述的冻干组合物的方法，所述方法包括以下步骤：
(a)在水中分散聚合物以获得均质组合物；
(b)任选在步骤(a)中获得的组合物中分散增塑剂，以获得均质组合物；
(c)在步骤(b)中获得的组合物中，或在未加入增塑剂的情况下，备选地在步骤(a)中获得的组合物中，分散西多福韦并任选地加入2M NaOH溶液，以获得均质组合物；
(d)冻干步骤(c)中获得的组合物。
在一个本发明方法的优选的实施方式中，
(a)以0.1至5.0mg/cm2的量加入西多福韦；
(b)以1.0至17.0mg/cm2的量加入羟乙基纤维素(HEC)或羟丙基甲基纤维素(HPMC)；和任选地
(c)以0至5.0mg/cm2的量加入增塑剂，
其中，当使用HEC时，存在0.5至4.0mg/cm2的所述增塑剂。
在根据本发明的方法的一个特别优选的实施例中，
(a)以0.1至5.0mg/cm2，优选2.0至5.0mg/cm2的量加入西多福韦；
(b)以1.0至17.0mg/cm2，优选7.0至10.5mg/cm2的量加入HEC；和
(c)以0.5至4.0mg/cm2的量加入增塑剂。
优选地，根据本发明的组合物中的HEC选自由HEC H4000，HEC250M，HEC250HX和HEC250HHX组成的组，最优选为HEC250M和250HX。
在另一个实施方式中，在冻干前，步骤(c)中获得的均质组合物包含NaOH，其量为0.10至0.30重量%，优选为约0.20或0.21%。
在其他优选的实施方式中，根据本发明的冻干组合物包含：
(a)以0.1至5mg/cm2的量加入西多福韦；
(b)以1.0至17.0mg/cm2的量加入HPMC；和
(c)以0.0至5.0mg/cm2的量加入增塑剂。
优选地，所述HPMC选自由HPMC E5，HPMC E15，HPMC4000和HPMC K15组成的组，最优选为HPMC E5和E15。
在另一个实施方式中，在冻干前，步骤(c)中获得的均质组合物包含NaOH，其量为0.10到0.30重量%，优选为约0.20或0.21%。
优选地，所述增塑剂选自由聚乙二醇400或4000(PEG400或4000)和丙二醇(PG)组成的组。在一个优选的实施方式中，根据本发明的组合物中的增塑剂，如果有，是PEG，更优选是PEG400。
在另一个实施方式中，步骤(c)中获得的均质组合物包含0.35到3.5重量%的HEC或HPMC。在特别的实施方式中，步骤(c)中获得的均质组合物包含1到2.5重量%HEC和0.2到1重量%增塑剂。在其他特别的实施方案中，步骤(c)中获得的均质组合物包含0.35到3.5重量%HPMC和0到1重量%增塑剂。在另一个实施方案中，步骤(c)中获得的均质组合物包含0.10到1.5重量%西多福韦。在一个实施方案中，步骤(c)中获得的均质组合物具有的pH为6到8，优选为6.5到7.5。
在另一个实施方案中，在冻干前，步骤(c)中获得的均质组合物包含NaOH，其量为0.10到0.30重量%，优选为约0.20或0.21%。
在一个实施方案中，用于制备根据本发明的组合物的冻干可以在结晶器，或模具，或任何其他已知的可用于制作本发明的片状冻干组合物的装置或反应器中进行。
本发明的另一个方面涉及通过冻干含水组合物获得的片状固体多孔可延展基质，所述含水组合物包含0.35到3.5重量%HEC或HPMC，0到1重量%增塑剂，和0.10到1.5重量%西多福韦。
在特别的实施方案中，所述基质包含1到2.50重量%HEC，0.2到1重量%增塑剂，和0.10到1.5重量%西多福韦。
在其他特别的实施方案中，所述基质包含0.35到3.50重量%HPMC，0至1重量%增塑剂和0.10到1.5重量%西多福韦。
在一个实施方案中，所述基质包含1到17mg/cm2HEC或HPMC，0到5mg/cm2增塑剂，和0.1到5mg/cm2西多福韦。
在特别的实施方案中，所述基质包含7到10.5mg/cm2HEC，1.5至5mg/cm2增塑剂和0.1到5mg/cm2西多福韦，优选具有HEC250M或HEC250HX作为聚合物。
在其他特别的实施方案中，所述基质包含1至17mg/cm2HPMC，0至5mg/cm2增塑剂，和0.1到5mg/cm2西多福韦，优选具有HPMC E5或E15作为聚合物。
本发明另一个方面涉及一种药物递送施用器，其包含被布置在药物不透性屏障上的如本文所述的根据本发明的片状冻干组合物或可延展基质。
在一个实施方案中，所述药物不透性屏障是被配置成在宫颈的外周上配合的帽。
附图简述
图1：显示作为保留时间(分钟)的函数的吸光度(AU)的西多福韦的HPLC色谱图。(A)校准的西多福韦的色谱图；(B)在T0时，来自根据本发明的一个实施方案的包含HPMC E5的冻干组合物的西多福韦的色谱图；(C、D、E、F和G)分别在T1、T3、T6、T9和T12(即在45℃储藏1、3、6、9和12个月后)时，来自根据本发明一个实施方案的冻干组合物的西多福韦的色谱图。
图2：显示作为保留时间(分钟)的函数的吸光度(AU)的西多福韦的HPLC色谱图。(A)在T0时，来自根据本发明一个实施方案的包含HEC250HX的冻干组合物的西多福韦的色谱图；(B和C)在T1和T3(即在45℃储藏1和3个月后)时，来自根据本发明一个实施方案的冻干组合物的西多福韦的色谱图。
图3：如用Franz扩散池(Franz diffusion cell)测定的西多福韦的扩散动力学，其显示作为时间(小时)的函数的扩散的西多福韦的百分比(%)。(A)与卡波姆凝胶(现有技术)相比的在根据本发明一个实施方案(基于HPMCE5的)的多种冻干组合物中的西多福韦的扩散动力学；(B)与卡波姆凝胶(现有技术)相比的在多种基于NaCMC的组合物中的西多福韦的扩散动力学；(C)与卡波姆凝胶(现有技术)相比的在多种基于HEC250M和250HX的组合物中的西多福韦的扩散动力学。
图4：根据本发明一个实施方案的包含HPMC E5的组合物的外层的25倍放大的扫描电子显微术(SEM)。(左图)根据本发明一个实施方案的包含PEG400作为增塑剂的组合物的SEM；(右图)根据本发明一个实施方案的包含PG作为增塑剂的组合物的SEM。
图5：包含HPMC E5的组合物的100倍放大的扫描电子显微术(SEM)。(A)包含PEG400(左图)或PG(右图)作为增塑剂的空白对照剂组合物的SEM；(B)包含PEG400(左图)或PG(右图)作为增塑剂的根据本发明一个实施方案的组合物的SEM。
图6：包含HPMC E5的组合物的4000倍放大的扫描电子显微术(SEM)。(A)各自包含PEG400作为增塑剂的空白对照剂组合物(左图)或根据本发明一个实施方案的组合物(右图)的SEM；(B)各自包含PG作为增塑剂的空白对照剂组合物(左图)或根据本发明一个实施方案的组合物(右图)的SEM。
图7：包含HPMC E5作为聚合物和PEG400作为增塑剂的空白对照剂组合物的扫描电子显微术(SEM)。(A)包含7,95mg/cm2(左图)或15,91mg/cm2(右图)的聚合物的组合物的外层的25倍放大的SEM；(B)包含7,95mg/cm2(左图)或15,91mg/cm2(右图)的聚合物的组合物的100倍放大的SEM。
图8：包含HPMC E5的空白对照剂组合物的扫描电子显微术(SEM)。(A)包含0mg/cm2(左图)或1,98mg/cm2(中图)或3,97mg/cm2(右图)的PEG400作为增塑剂的组合物的外层的25倍放大的SEM。(B)包含0mg/cm2(左图)或1,98mg/cm2(中图)或3,97mg/cm2(右图)的PEG400作为增塑剂的组合物的100倍放大的SEM。
图9：包含HPMC E5(左图)或HPMC4000(中图)或HPMC K15(右图)作为聚合物的空白对照剂组合物(A)或根据本发明一个实施方案的组合物(B)的100倍放大的扫描电子显微术(SEM)。
图10：包含HEC250HX的组合物的扫描电子显微术(SEM)。(A)包含1.98mg/cm2的PEG400作为增塑剂的空白对照剂组合物(左图)或包含1.98mg/cm2的PEG400作为增塑剂的根据本发明一个实施方案的组合物(右图)的外层的25倍放大的SEM。(B)包含1.98mg/cm2的PEG400作为增塑剂的空白对照剂组合物(左图)或包含1.98mg/cm2的PEG400作为增塑剂的根据本发明一个实施方案的组合物(右图)的外层的100倍放大的SEM。
图11：包含HEC250HX作为聚合物的组合物的扫描电子显微术(SEM)。各自包含PEG400作为增塑剂的空白对照剂组合物(4000倍放大)(左图)或根据本发明一个实施方案的组合物(750倍放大)(中图)或根据本发明一个实施方案的组合物(4000倍放大)(右图)的SEM。
图12：再水化的冻干的包含NaCMC的组合物或根据本发明一个实施方案的包含HPMC的组合物的粘度。粘度(Pa.s)被显示为是旋转速度(s-1)的函数。(上图)概述；(下图)上图中指定部分的细节。参照的顺序遵循图中曲线的顺序，由顶部曲线开始。
图13：作为增塑剂的函数的再水化的冻干的包含NaCMC的组合物或根据本发明一个实施方案的包含HPMC E5的组合物的粘度。粘度(Pa.s)被显示为是旋转速度(s-1)的函数。参照的顺序遵循图中曲线的顺序，由顶部曲线开始。
图14：包含HEC250M4%的凝胶(未冻干)，在用水(加3g)再水化后的包含HEC250M4%的海绵体，以及含有西多福韦的卡波姆凝胶的粘度的比较。粘度(Pa.s)被显示为是旋转速度(s-1)的函数。(上图)概述；(下图)上图中指定部分的细节。参照的顺序遵循图中曲线的顺序，由顶部曲线开始。
图15：包含HEC250HX3%的凝胶(未冻干)，在用水(加3g)再水化后的包含HEC250HX3%的海绵体，以及含有西多福韦的卡波姆凝胶的粘度的比较。粘度(Pa.s)被显示为是旋转速度(s-1)的函数。(上图)概述；(下图)上图中指定部分的细节。参照的顺序遵循图中曲线的顺序，由顶部曲线开始。
图16：根据本发明一个实施方案的包含不同类型的HPMC或HEC的再水化的冻干组合物的粘度。组合物以其粘度的函数分类。粘度(Pa.s)被显示为是旋转速度(s-1)的函数。(上图)概述；(下图)上图中指定部分的细节。参照的顺序遵循图中曲线的顺序，由顶部曲线开始。
图17：与根据本发明一个实施方案的组合物相比的粉末形式的脱水的西多福韦的差示扫描量热法。热流(mW)被显示为是时间(分钟)和温度(℃)的函数。
发明详述
在描述本发明的方法和产品之前，将理解的是本发明不限于所描述的特定的方法、成份、产品或组合，因为，这样的方法、成份、产品和组合当然可以变化。同样将理解的是本文所使用的术语不是意在限制。
如本文使用的，除非上下文明确指示，否则单数形式“一个(a)”、“一个(an)”和“所述(the)”包括单数和复数所指两者。
本文使用的术语“包含(comprising)”、“包含(comprise)”和“包含(comprised of)”与“包括(including)”、“包括(includes)”或“含有(containing)”、“含有(contains)”是同义的，并且是包括的或开放式的，并且不排除另外的，未列举的成员、元素或方法步骤。可以理解，当在本文中使用时，术语“包含(comprising)”、“包含(comprise)”和“包含(comprised of)”包括术语“由……组成(consisting of)”、“由……组成(consists)”和“由……组成(consists of)”。
借助端点的数字范围的列举包括在相应范围内的所有数字和部分，以及列举的端点。
当涉及可测量值如参数，量，持续时间等时，如在本文中所用的术语“约(about)”或“大约(approximately)”，是指包括自特定值的+/-10%以下，优选+/-5%以下，更优选+/-1%以下，并且更优选+/-0.1%以下的变化，在这个范围内的这些改变是适于在所公开的发明实施的。将理解用修饰语“约(about)”或“大约(approximately)”修饰的值本身是特别地，优选地，公开的。
虽然术语“一个或更多个”或“至少一个”，如一组成员中的一个或更多个或至少一个成员，本身是清楚的，但是通过进一步的举例，该术语尤其包括对所述成员中的任一个，或所述成员中的任两个或更多个的所指，如例如所述成员中的任何≥3，≥4，≥5，≥6或≥7个等，并且多达所有所述成员。
本说明书中引用的所有参考文献通过引用完整地结合于此。特别的，本文特别提到的所有参考文献的教导通过引用结合。
除非另外定义，所有用于公开本发明的术语(包括技术术语和科学术语)具有如本发明所属领域的普通技术人员所常规理解的含义。通过进一步指导，包含术语定义以更好领会本发明的教导。
在以下段落中，更详细地限定本发明的不同方面。除非明确地相反地进行指示，否则如此限定的每个方面可以与任何其它一个或多个方面相结合。特别是，被指示为优选的或有利的任何特征可以与任何其它被指示为优选的或有利的一个或多个特征相结合。
在整个本说明书中，所述“一个实施方案(one enbodiment)”或“一个实施方案(an embodiment)”，表示结合实施方案描述的具体特征，结构或特性包含在本发明的至少一个实施方案中。因此，贯穿本说明书出现在各处的“在一个实施方案中(in one embodiment)”或“在一个实施方案中(in anembodiment)”不一定都是指同一个实施例，而是可能是。此外，如由本公开对于本领域技术人员显而易见的，在一个或多个实施例中，具体特征、结构或特性可能以任何合适的方式组合。此外，如本领域技术人员将理解的，虽然本文所述的一些实施方案包括一些特征而不包括在其他实施方案中包括的其他特征，但是不同实施方案的特征的组合意在落入本发明的范围内，并且形成不同的实施方案。例如，在所附的权利要求中，任何要求保护的实施方案可以以任何组合使用。
本发明涉及片状冻干组合物，其包含
(a)西多福韦，其量为0.1至5mg/cm2；
(b)羟乙基纤维素(HEC)或羟丙基甲基纤维素(HPMC)，其量为1.5至17mg/cm2；和任选地
(c)生物相容的增塑剂，其量为0至5mg/cm2。
根据本发明的组合物的特别优选的实施方案列于表A至D中。表A-D列出了赋形剂的浓度，冻干后以mg/cm2计，冻干前以重量%计(表A中以HPMC作为聚合物且没有增塑剂；表B中以HPMC为聚合物且以PEG400为增塑剂；表C中以HPMC为聚合物且以PG为增塑剂；表D中以HEC为聚合物且以PEG400为增塑剂)。表A至D中的值被指示为具有各个特定值的±10%的偏差(例如，3.97mg/cm2HPMC E5±10%的范围在3.97-0.397mg/cm2到3.97+0.397mg/cm2之间；0.42%PEG400±10%的范围在0.42-0.042%到0.42+0.042%之间)。
表A
表B
Figure BDA0000476770130000132
表C
表D
Figure BDA0000476770130000142
在另一个实施方案中，本发明提供一种药物组合物，所述药物组合物包含治疗有效量的如上所述的冻干组合物和进一步药用载体。
在该实施方案的一个方面，所述药物组合物还包含抗病毒剂，该抗病毒剂可以是干扰素(Interferon)，咪喹莫特(imiquimod)，甲醛，戊二醛，甲氰咪胍(cimetidine)，5-氟脲嘧啶(5-fluorouracil)，三氯乙酸，博来霉素(bleomycin)，普达非洛(podofilox)，鬼臼(podophyllum)或任何其它可以用来治疗HPV感染，HPV感染的组织或HPV感染的细胞的抗病毒组合物。
在另一个实施方案中，本发明提供治疗HPV感染，HPV感染的组织或HPV感染的细胞的方法，所述方法包括将感染位点，感染组织或细胞与本文所述的冻干组合物接触。在本发明的一个方面，所述方法还包括将细胞与抗病毒剂接触。抗病毒剂可以是干扰素，咪喹莫特，甲醛，戊二醛，甲氰咪胍，5-氟脲嘧啶，三氯乙酸，博来霉素，普达非洛，鬼臼或任何可以用来治疗HPV感染，HPV感染的组织或HPV感染的细胞的抗病毒组合物。所述另外的抗病毒剂可以包含在本发明的冻干组合物中，或可以在施用根据本发明的冻干组合物的同时或之前或之后施用。
公认存在超过150种HPV。其中，以下被归类为涉及宫颈癌的风险的类型：HPV-1，6，11，16，18，26，31，33，35，39，40，42，43，44，45，51，52，53，54，56，58，59，61，66，68，70，72，73，81，82，和CP6108。类型16和18通常被认为引起约70%的宫颈癌病例。与类型31一起，它们是宫颈癌的主要风险因素。在本文所述的任何实施方案中，所述HPV可以是HPV11，HPV16，HPV18，HPV1，HPV6，以上所列出的任何另外类型的HPV及它们的任何组合。
根据本发明的冻干组合物或如本文所定义的药物组合物的施用可以直接进行，即在不进行冻干基质的再水化的情况下，通过使用例如阴道插入物，棉塞插入物，宫颈帽，覆盖宫颈的子宫托或可以用于将冻干基质放置在HPV感染的组织或细胞处的任何其它工具。在这一方案中，冻干的结构将利用天然存在于施用位点处的体液在原位再水化。
备选地，根据本发明冻干组合物或如本文所定义的药物组合物可在使用前再水化，形成凝胶状组合物，所述凝胶状组合物可以通过使用例如阴道乳膏插入物，棉塞插入物，宫颈帽，覆盖宫颈的子宫托或可以用于将凝胶放置在HPV感染的组织或细胞处的任何其它工具局部施用。
根据本发明，组合物或药物组合物的“有效量”是可以有效治疗或缓解HPV感染的严重性的量。
典型地，HPV感染发生在皮肤，粘膜，肛殖区，阴户，阴道和宫颈(阴道和子宫间的通道)，其中，其可能引起病变，癌前病变，生殖器疣，息肉，囊肿，良性肿瘤并最终导致癌症，其可转移到潜在的组织并循环到血管中。宫颈癌可能伴以阴道出血，但可能没有症状，直到癌症处于其晚期。此外，口腔或口部范围的上皮HPV感染经常发生。口腔或口部范围包括唇，嘴，咽喉(throat)，喉(larynx)等。根据本发明的(药物)组合物的优选的靶点因此是阴户，阴道，和宫颈区域，尤其是经常被HPV感染的这些区域中的粘膜组织。
现在将通过以下实施例来说明本发明，所述实例不以任何方式限制本发明的范围。
实施例
实施例1：冻干条件
根据如下方案进行含水组合物的冻干，所述含水组合物包含生物粘性聚合物，和任选地增塑剂和/或西多福韦以获得多孔的可延展的基质。
聚合物在蒸馏水中在缓慢搅拌下分散直到完全均质。任选地，获得的分散液在加入增塑剂后再次搅拌直到完全均质。分散西多福韦，并且加入2M NaOH储液，以达到pH7。获得的混合物转入结晶器并冻干。冻干条件如下：
冷冻
阶段 温度(℃) 时间(h) 压力(bar)
1 -35(-30至-35) 3.0(2至4) 环境
2 -35(-30至-35) 0.5(0.4至0.6) 环境
一级干燥
阶段 温度(℃) 时间(h) 压力(bar)
1 -15(-10至-20) 3.0(2至4) 0.8(0.7至0.9)
2 -10(-10至-20) 12.0(7至17) 0.1(0.05至0.15)
二级干燥
阶段 温度(℃) 时间(h) 压力(bar)
1 10(5至15) 2.0(1至3) 0.1(0.05至0.15)
2 10(5至15) 3.0(2至4) 0.1(0.05至0.15)
实施例2：冻干组合物的组分
评估以下组分和混合物在冻干后形成所需的“海绵体”结构的能力。
生物粘性聚合物：
-羟丙基甲基纤维素(HPMC)
HPMC E5：粘度：5mPa.s(=5cp)(2%水溶液)
HPMC E15：粘度：12-18mPa.s(2%水溶液)
HPMC4000：粘度：4000-5600mPa.s(2%水溶液)
HPMC K15：粘度：11250-21000mPa.s(2%水溶液)
-羧甲基纤维素钠(NaCMC)
-羟乙基纤维素(HEC)
HEC Natrosol250HX：粘度：1500-2500mPa.s(1%水溶液)
HEC Natrosol250HHX：粘度：3500-5500mPa.s(1%水溶液)
HEC Natrosol250M：粘度：4500-6500mPa.s(2%水溶液)
HEC H4000：粘度：4500-6500mPa.s(2%水溶液)
-Carbomer(卡波姆)974P
-羟丙基纤维素(HPC)
HPC LF：粘度：75-150mPa.s(5%水溶液)
HPC HF：粘度：1500-3000mPa.s(1%水溶液)
HPC GF：粘度：150-400mPa.s(2%水溶液)
增塑剂：
-聚乙二醇400(PEG400)
-聚乙二醇4000(PEG4000)
-丙二醇(PG)
实施例3：不同冻干空白对照剂组合物的评估
测试不同条件和浓度的组分以评估冻干物所需特性。所需特性是海绵质地，其在干燥时是可轻易延展的，并能够容易和/或快速地再水化为具有中等粘度(即，不是太像液体且不是太粘)的凝胶。
保持以下条件恒定以易于比较：结晶器直径(4cm)，用于分散组分的水的量(加6g(ad6g)，意味着向组合物加入水直到冻干前最终组合物的6g)，和冻干循环。
首先评估空白对照剂冻干物(即没有西多福韦)。表1列出聚合物和增塑剂的测试浓度。
表1
聚合物 mg/cm2 增塑剂 mg/cm2 备注
HPMC E5 3.97 - - 可延展海绵体
HPMC E5 7.95 - - 可延展海绵体
HPMC4000 9.54 - - 可延展海绵体
HPMC4000 11.93 - - 可延展海绵体
HPMC E5 3.97 PEG400 1.98 可延展海绵体
HPMC E5 6.36 PEG400 1.98 可延展海绵体
HPMC E5 7.95 PEG400 1.98 可延展海绵体
HPMC E5 11.93 PEG400 1.98 可延展海绵体
HPMC E5 15.91 PEG400 1.98 可延展海绵体
HPMC E5 3.97 PEG400 3.97 可延展海绵体
HPMC E5 6.36 PEG400 3.97 可延展海绵体
HPMC E5 7.95 PEG400 3.97 可延展海绵体
HPMC E5 15.91 PEG400 3.97 可延展海绵体
HPMC E5 31,83 PEG400 7,95 可延展海绵体
HPMC E5 71,62 PEG400 7,95 可延展海绵体
HPMC E15 6.36 PEG400 1.98 可延展海绵体
HPMC E15 7.95 PEG400 1.98 可延展海绵体
HPMC4000 3.97 PEG400 1.98 可延展海绵体
HPMC4000 6.36 PEG400 1.98 可延展海绵体
HPMC4000 7.95 PEG400 1.98 可延展海绵体
HPMC4000 9.54 PEG400 1.98 可延展海绵体
HPMC4000 11.93 PEG400 1.98 可延展海绵体
HPMC K15 1.98 PEG400 0.99 可延展海绵体
HPMC K15 7.95 PEG400 1.98 可延展海绵体
HPMC E5 7.95 PEG4000 0.79 可延展海绵体
HPMC E5 7.95 PEG4000 1.19 可延展海绵体
HPMC E5 7.95 PEG4000 1.98 可延展海绵体
HPMC E5 7.95 PG 1.98 可延展海绵体
HPMC E5 7.95 PG 3.97 可延展海绵体
HPMC E15 6.36 PG 3.97 可延展海绵体
HPMC E15 7.95 PG 1.98 可延展海绵体
HPMC E15 11.93 PG 3.97 可延展海绵体
HPMC4000 1.98 PG 1.98 可延展海绵体
HPMC4000 3.97 PG 1.98 可延展海绵体
HPMC K15 1.98 PG 1.98 可延展海绵体
HPMC K15 3.97 PG 1.98 可延展海绵体
NaCMC 3.18 PEG400 1.98 可延展海绵体
NaCMC 4.77 PEG400 1.98 可延展海绵体
NaCMC 5.57 PEG400 1.98 可延展海绵体
NaCMC 6.36 PEG400 1.98 可延展海绵体
NaCMC 4.77 PEG400 3.97 可延展海绵体
NaCMC 9.55 PEG400 3.97 可延展海绵体
NaCMC 4.77 PG 1.98 可延展海绵体
NaCMC 4.77 PG 3.97 可延展海绵体
HEC H4000 9.54 - - 可延展海绵体
HEC H4000 11.93 - - 可延展海绵体
HEC H4000 9.54 PEG400 1.98 可延展海绵体
HEC H4000 11.93 PEG400 1.98 可延展海绵体
HEC H4000 11.93 PEG400 3.97 可延展海绵体
HEC250M 9.54 - - 可延展海绵体
HEC250M 11.93 - - 可延展海绵体
HEC250M 3.97 PEG400 1.98 可延展海绵体
HEC250M 4.77 PEG400 1.98 可延展海绵体
HEC250M 7.95 PEG400 1.98 可延展海绵体
HEC250M 9.54 PEG400 1.98 可延展海绵体
HEC250M 11.93 PEG400 1.98 可延展海绵体
HEC250M 11.93 PEG400 3.97 可延展海绵体
HEC250HX 7.16 - - 可延展海绵体
HEC250HX 7.95 - - 可延展海绵体
HEC250HX 11.93 - - 可延展海绵体
HEC250HX 3.97 PEG400 1.98 可延展海绵体
HEC250HX 7.95 PEG400 1.98 可延展海绵体
HEC250HX 11.93 PEG400 1.98 可延展海绵体
HEC250HHX 4.77 - - 可延展海绵体
HEC250HHX 11.93 - - 可延展海绵体
HEC250HHX 4.77 PEG400 1.98 可延展海绵体
HEC250HHX 11.93 PEG400 1.98 可延展海绵体
HEC250HHX 11.93 PEG400 3.97 可延展海绵体
卡波姆 3.77 PEG400 1.25 粉末
卡波姆 1.47 PEG400 0.98 粉末
卡波姆 1.93 PEG400 0.99 粉末
卡波姆 1.79 PEG400 0.99 粉末
HPC GF 19.09 - - 可延展海绵体
HPC GF 23.87 - - 可延展海绵体
HPC GF 19.09 PEG400 4.77 无海绵质地
HPC GF 23.87 PEG400 5.96 薄膜
HPC GF 23.87 PEG400 7.95 薄膜
HPC LF 7.95 PEG400 1.98 粘性海绵体
HPC LF 11.93 PEG400 1.98 粘性海绵体
HPC HF 1.98 PEG400 0.99 粘性海绵体
Figure BDA0000476770130000211
Figure BDA0000476770130000212
Figure BDA0000476770130000213
发现不论测试的聚合物的浓度和粘度如何，基于HPMC，HEC和NaCMC的组合物允许形成具有所需特性的海绵体。基于HPMC E5，HPMCE15，HPMC4000和HPMC K15的组合物和基于HEC H4000，HEC250M，HEC250HHX和HEC250HX的组合物允许形成海绵体。基于HPC GF的组合物当在不存在增塑剂的情况下使用时，允许形成具有所需特性的海绵体，而增塑剂的存在导致形成生物粘性薄膜或不呈现出海绵状质地。基于卡波姆和HPC LF和HPC HF的组合物分别导致粉末或非常粘且不是非常可延展的海绵体。用基于HPMC E5和HPC GF的组合和HPMC4000和HPC GF的组合的组合物同样获得具有所需特性的海绵体，都是在存在增塑剂的情况下。
基于PEG的海绵体似乎比基于PG的海绵体更抗断裂。PEG400和PEG4000二者都可以用于获得具有所需特性的海绵体，尽管较高浓度的PEG4000经常导致易碎的海绵体。
不同类型聚合物的残留水量列在表2中。
表2
HPMC 1.5–8重量%
NaCMC 5.5–14重量%
HEC 1-6重量%
HPC 3.5-7重量%
卡波姆 无法回收以用于残留水测定
基于NaCMC的海绵体看来似乎比例如基于HPMC的海绵体保留更多的残留水。发现改变用于制备分散液的水量(4、5和6ml)不会影响冻干后最终的残留水量。
为了评估再水化的速度，直径1.2cm的圆片(disc)用50μl蒸馏水再水化或利用蒸馏水使整个海绵体增加3g。海绵体的再水化导致形成具有不同粘度的凝胶。再水化速度依赖于聚合物的性质和量，并且因此能够容易地调节。例如，发现：与基于HEC250HHX和H4000的海绵体相比，基于HEC250HX和250M的海绵体允许更快的再水化。不管聚合物，再水化的速度随着聚合物浓度的增加而减慢。
实施例4：评估不同的冻干的包含西多福韦的组合物
测试不同条件和浓度的组分以评估冻干物的所需特性。所需特性是海绵体质地，其在干燥时可轻易延展并且可以快速再水化为具有中等粘度的凝胶(即，不是太像液体且不是太粘)。
保持冻干循环恒定以易于比较，并且在大多数情况下，结晶器的直径为4cm，并且添加的用于分散组分的水的量是加6g。
表3-45列出了每个测试组合物的条件和评估。指示的是特定类型的聚合物(HPMC，NaCMC，HEC，卡波姆或HPC)和特定类型的增塑剂(无增塑剂，PEG400或PG)和西多福韦的以mg/cm2冻干海绵体计的浓度和在冻干前在含水组合物中的重量%。另外指示的是NaOH的量(作为2M储液提供)，结晶器的直径，并且因此冻干后海绵体(环形结构)的直径，冻干前含水组合物的重量，冻干后海绵体的重量和冻干后海绵体中残留水的百分比。
可以看到，向组合物加入西多福韦改变了海绵体的性质。然而，基于HPMC，HEC和NaCMC作为聚合物可以获得具有良好品质的空白对照剂海绵体，似乎含有西多福韦的基于NaCMC的海绵体变得非常硬和易碎(不论浓度和条件如何)。基于HPMC的海绵体是可延展的并具有良好品质，尽管它们与其空白对照剂对应物相比具有稍微不同的外观，并且当将海绵体一折为二时展现出微弱的裂缝。与其空白对照剂对应物相比，含有西多福韦的基于HEC250HX的海绵体需要增塑剂以避免海绵体破裂(太易碎)。
似乎与可延展的并具有良好品质的基于PEG400的海绵体相比，基于PG的海绵体仅略有延展性并且易碎。
已发现：不管测试聚合物是何，再水化的速度在聚合物的浓度增高时下降。
表3-45显示在冻干后呈现良好质量的可延展海绵体的组合物的一些具体实例。其再水化能力在一些例子中也被测定。还显示了获得非可延展的海绵体的条件以用于比较。
表3
Figure BDA0000476770130000231
Figure BDA0000476770130000241
表4
Figure BDA0000476770130000242
表5
Figure BDA0000476770130000243
Figure BDA0000476770130000251
表6
Figure BDA0000476770130000252
表7
Figure BDA0000476770130000253
Figure BDA0000476770130000261
表8
Figure BDA0000476770130000262
表9
Figure BDA0000476770130000263
Figure BDA0000476770130000271
表10
表11
Figure BDA0000476770130000273
表12
Figure BDA0000476770130000282
表13
Figure BDA0000476770130000291
表14
Figure BDA0000476770130000292
表15
Figure BDA0000476770130000293
Figure BDA0000476770130000301
表16
Figure BDA0000476770130000302
表17
Figure BDA0000476770130000303
表18
Figure BDA0000476770130000312
表19
Figure BDA0000476770130000321
表20
表21
Figure BDA0000476770130000331
表22
Figure BDA0000476770130000332
表23
Figure BDA0000476770130000341
表24
Figure BDA0000476770130000342
表25
Figure BDA0000476770130000351
表26
Figure BDA0000476770130000352
Figure BDA0000476770130000361
表27
Figure BDA0000476770130000362
表28
Figure BDA0000476770130000371
表29
Figure BDA0000476770130000372
表30
Figure BDA0000476770130000373
表31
Figure BDA0000476770130000382
表32
Figure BDA0000476770130000391
表33
Figure BDA0000476770130000392
表34
Figure BDA0000476770130000393
表35
表36
Figure BDA0000476770130000403
表37
Figure BDA0000476770130000412
表38
Figure BDA0000476770130000413
Figure BDA0000476770130000421
表39
Figure BDA0000476770130000422
表40
Figure BDA0000476770130000431
表41
Figure BDA0000476770130000432
表42
Figure BDA0000476770130000433
Figure BDA0000476770130000441
表43
表44
Figure BDA0000476770130000451
表45
Figure BDA0000476770130000452
再水化后，可以获得凝胶状组合物。优选的凝胶状组合物典型地包含约2%西多福韦和4%HEC250M。所述组合物典型的包含一定量的HCL和NaOH以达到7.2的pH值。凝胶状组合物的剩余成分是水，以达到100%。如果需要，可以加入抗菌剂以进一步提高搁置寿命。一个例子是苯甲醇(约2%)。
实施例5：海绵体中水含量
冻干后海绵体中的残留水通过Karl Fisher法(Metler DL35)测量。从表46可以看出，残留水的百分比根据聚合物而变化并且根据西多福韦的存在而变化。
表46
Figure BDA0000476770130000461
Figure BDA0000476770130000471
残留水含量在基于HPMC和HEC的海绵体中比在基于NaCMC的海绵体中低。
已确定，为了在冻干前获得含水组合物而加入的水的量(测试了4、5或6ml)不影响冻干后的残留水量。
实施例6：西多福韦的均匀性
海绵体内西多福韦存在的均匀性通过将海绵体切成4份并用色谱法(HPLC)测定西多福韦剂量来测定。条件如下：
-固定相：
Figure BDA0000476770130000472
100RP-18e(末端封闭的)(5μm)在250mmx4mm，d.i.的分析型柱中
-流动相：HPLC缓冲液pH6.5/ACN(90/10，m/m)
-流速：1ml/min
-温度：30℃
-检测：分光光度法的吸附(spectrophotometric adsorption)，UV275nm
-注射体积：20μl
HPLC缓冲液的组成是：
-5mM四丁基硫酸氢铵
-5mM磷酸二氢铵
-用铵调节pH到6.5
表47列出基于HPMC E5的海绵体的结果，其为理论预期剂量的百分比。
表47
lot № 位置 理论值的% lot № 位置 理论值的%
10C24-3 侧面 95.67 10C24-4 侧面 101.03
10C24-3 侧面 112.77 10C24-4 侧面 100.57
10C24-3 侧面 87.86 10C24-4 侧面 95.24
10C24-3 中间 92.39 10C24-4 中间 95.83
实施例7：西多福韦的稳定性
冻干的海绵体装袋(PET/Al/EZ)并与湿气、光和氧隔离。将海绵体保持在三个不同的温度：4℃、25℃和45℃。图1显示包含HPMC E5(7.95mg/cm2)，PEG400(1.98mg/cm2)和西多福韦(4.77mg/cm2)的海绵体的色谱图。图1A，1B，1C，1D，1E，1F和1G分别表示在45℃校准(calibration)(100μg/ml)、海绵体在T0和海绵体在T1，T3，T6，T9和T12(即，分别在一、三、六、九和十二个月后)的色谱图。图2A，2B和2C表示包含HEC250HX(7.95mg/cm2)，PEG400(1.98mg/cm2)和西多福韦(4.77mg/cm2)的海绵体在45℃分别在T0、T1和T3(即，在一和三个月后)的色谱图。可以看出，峰面积小(不论在何种温度保持海绵体)，并且峰同样存在于校准色谱图中。因此，海绵体在测试条件下是稳定的。
实施例8：西多福韦的扩散
西多福韦的扩散用Franz扩散池测定。1.2cm直径的冻干物置于池中，并用350μl的磷酸盐缓冲液(pH5，37℃)再水化。扩散动力学通过HPLC以1ml的剂量进行评估。聚合物改变(HPMC E5，NaCMC，HEC250HX和HEC250M)，并且存在或不存在增塑剂(PEG400)。西多福韦的浓度保持恒定。根据图3A，3B和3C，似乎对于基于HPMC的海绵体，1小时后达到稳定水平，对于基于NaCMC和HEC250M的海绵体，2小时后达到稳定水平，并且对于基于HEC250HX的海绵体，3小时后达到稳定水平。尽管如此，西多福韦不论从何种组合物中扩散均很快。
实施例9：显微分析
通过扫描电子显微术评估基于HPMC E5，HPMC4000，HPMC K15和HEC250HX的海绵体的结构。比较具有不同类型的聚合物的海绵体，具有不同浓度的聚合物的海绵体，具有或不具有西多福韦的海绵体，具有或不具有增塑剂的海绵体和具有不同增塑剂(PEG400or PG)和不同浓度的增塑剂的海绵体之间的孔结构。
图4至8是基于HPMC E5的海绵体在不同放大倍数的照片。从图4，明显的是，与基于PEG400的海绵体相比，基于PG的海绵体的外层有更多沟。从图5，明显的是，孔在基于PEG400的海绵体中比在基于PG的海绵体中组织得更好。证实，基于PEG400的海绵体更有耐受性，PG似乎导致孔结构的瓦解，其中孔变得更易碎。向海绵体加入西多福韦同样表现为使得孔结构更易碎。从图6，表现的是，在空白对照剂海绵体中孔表面是平滑的，而在包含西多福韦的海绵体中所述表面呈颗粒状，不论是否使用PEG400或PG作为增塑剂。看上去西多福韦分布均匀。从图7，明显的是，聚合物浓度的增加(从7,95到15.91mg/cm2HPMC E5)导致具有较小孔的更密实的海绵结构。从图8，显示的是，在PEG400增塑剂存在下，孔结构组织得更好。此外，显示的是，通过增大PEG400增塑剂的浓度，在海绵的外层上观察到的沟更少，并且孔更小。图9显示基于HPMC E5，HPMC4000或HPMC K15的不含或含有西多福韦的海绵体的扫描电子显微术照片。HPMC聚合物的分子量似乎影响孔径大小：孔随聚合物分子量而增大。在西多福韦存在下观察到更小的孔。西多福韦的存在还导致缺乏组织的孔，这在基于更高分子量HPMC聚合物的海绵体中甚至更显著。
图10和11显示基于HEC250HX聚合物的海绵体的图。从图10，似乎在西多福韦的存在下孔更小。从图11，表现的是，在空白对照剂海绵体中孔表面是平滑的，而在包含西多福韦的海绵体中表面呈颗粒状。看起来西多福韦以晶体形式均匀分布。
实施例10：多孔性和海绵体厚度
进行实验评估影响海绵体厚度的参数。发现在冻干前增加含水组合物中的聚合物的量，仅略微增加冻干后海绵体的厚度。在另一方面，冻干后海绵体的厚度可以通过增加冻干前加入到混合物中的水量而充分得增加。用至少8g(8，9，12或15g)的混合物得到更厚的海绵体。此外，表现的是，基于PG的组合物允许获得更厚的海绵体，而基于PEG400的组合物在同样条件下液化。可能需要更长的冻干周期。
实施例11：粘度
再水化后海绵体的粘度用流变仪(ARES G2，TA instrument)进行测定。保持以下参数恒定以利于比较：海绵体表面和再水化用水量(900μl，除了图14和15)。在37℃进行测量达240s，以1至100s-1的旋转速度。
从图12，清楚的是，基于NaCMC的海绵体比基于HPMC E5的海绵体更粘。在不同的HPMC E5浓度之间没有观察到的粘度的不同。基于HPMC E15的海绵体表现为比基于HPMC E5的海绵体更粘(接近基于NaCMC的海绵体的粘度)。从图13，清楚的是，粘度不受增塑剂(PEG400或PG)性质的影响。
从图14和15，显示的是，冻干组合物的粘度不受冻干工艺的影响。再水化的基于HEC250M和HEC250HX的海绵体的粘度与HEC250M和HEC250HX凝胶(未冻干)的粘度相当，并且接近含有西多福韦的卡波姆胶凝胶的粘度。
从图16，清楚的是，粘度受到聚合物类型的影响：遵循减小的粘度对HMPC K15，HPMC4000(有或没有HPC GF)，HEC250HX，HEC250M，HPMC E15和HPMC E5分类。此外，粘度随着聚合物浓度的增加而增加。实施例12：通过差示扫描量热法的海绵体测量
冻干物的热转化和聚合物和西多福韦之间最终的相互作用通过差示扫描量热法(DSC25Mettler Toledo，通过TC15TA控制器控制)进行评价。在35到300℃之间，温度以10℃/分钟增加。从图17，清楚的是，粉末形式的脱水的西多福韦在280℃显示吸热峰。该峰在不同海绵体的量热分析中不存在，因为提供制备冻干组合物的方法，西多福韦转变成盐。

Claims (30)

1.片状冻干组合物，包含：
(a)西多福韦，其量为0.1至5mg/cm2；
(b)羟乙基纤维素(HEC)或羟丙基甲基纤维素(HPMC)，其量为1至17mg/cm2；和任选的
(c)增塑剂，其量为0至5mg/cm2。
2.根据权利要求1所述的冻干组合物，其包含：
(a)西多福韦，其量为0.1至5mg/cm2；
(b)羟乙基纤维素(HEC)，其量为1至17mg/cm2；和
(c)增塑剂，其量为0.5至4mg/cm2。
3.根据权利要求1或2所述的冻干组合物，其中HEC以7至10.5mg/cm2，5至10mg/cm2，8至10mg/cm2或10至16mg/cm2的量存在。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的冻干组合物，其中所述HEC选自由以下组成的组：HEC H4000和HEC250HHX，优选为HEC250M，HEC250HX，优选为HEC250M或HX。
5.根据权利要求1至4中任一项所述的冻干组合物，所述冻干组合物本身呈现为高粘度组合物。
6.根据权利要求1所述的冻干组合物，所述冻干组合物包含：
(a)西多福韦，其量为0.1至5mg/cm2；
(b)羟丙基甲基纤维素(HPMC)，其量为1至17mg/cm2；和
(c)增塑剂，其量为0至5mg/cm2。
7.根据权利要求6所述的冻干组合物，其中HPMC以2.5至8mg/cm2，4至8mg/cm2或8至15mg/cm2的量存在。
8.根据权利要求6或7所述的冻干组合物，其中所述HPMC选自由HPMC E5，HPMC E15，HPMC4000和HPMC K15组成的组，优选为HPMCE5或HPMC E15。
9.根据权利要求6至8中任一项所述的冻干组合物，所述冻干组合物本身呈现为低粘度组合物。
10.根据权利要求1至7所述的冻干组合物，其中所述增塑剂选自由聚乙二醇400(PEG400)，聚乙二醇4000(PEG4000)和丙二醇(PG)组成的组，优选为PEG400。
11.根据权利要求1至8中任一项所述的冻干组合物，其中水以1至10重量%的量存在，和/或NaOH以0.15至0.25重量%的量存在。
12.根据权利要求1至11中任一项所述的冻干组合物，其中所述组合物是多孔的可延展基质。
13.根据权利要求1至12中任一项所述的冻干组合物，其用于药物，优选用于药物，优选用于治疗人DNA病毒如疱疹病毒，痘病毒，乳头瘤病毒，腺病毒，天花病毒，或人乳头瘤病毒(HPV)的感染，或伴随的病理学，如选自包含以下的组的那些病理学：阴道，宫颈，肛殖区，粘膜，口部范围的上皮或皮肤的病毒致病变或疣，HPV感染导致的癌前病变和/或肿瘤或癌症，更具体地，所述病理学针对宫颈或宫颈的粘膜表面。
14.在对根据权利要求1至12中任一项所述的冻干组合物进行再水化后获得的凝胶状组合物，其用于药物，优选用于治疗人DNA病毒的感染如疱疹，痘，乳头瘤病毒，腺病毒，天花病毒，或人乳头瘤病毒(HPV)感染，或伴随的病理学，如选自包含以下的组的那些病理学：阴道，宫颈，肛殖区，粘膜，口部范围的上皮或皮肤的病毒致病变或疣，病毒感染导致的癌前病变和/或肿瘤或癌症，更具体地，所述病理学针对宫颈或宫颈的粘膜表面。
15.根据权利要求2至5中任一项所述的冻干组合物，其用于治疗人DNA病毒感染或伴随的病理学，其中所述组合物在施用前进行再水化。
16.根据权利要求6至9中任一项所述的冻干组合物，其用于治疗人DNA病毒感染或伴随的病理学，其中所述组合物在施用前不进行再水化。
17.根据权利要求1至16中任一项所述的冻干组合物或根据权利要求14所述的凝胶状组合物，其用于到阴道，宫颈，肛殖区，粘膜，口部范围的上皮或皮肤的局部药物递送。
18.制备根据权利要求1至12中任一项所述的冻干组合物的方法，所述方法包括以下步骤：
(a)在水中分散HEC或HPMC以获得均质组合物；
(b)任选地在步骤(a)中获得的组合物中分散增塑剂，以获得均质组合物；
(c)在步骤(b)中获得的组合物中，或备选地，在不添加增塑剂的情况下，在步骤(a)中获得的组合物中，分散西多福韦和任选地加入2M NaOH溶液，以获得均质组合物；
(d)冻干步骤(c)中获得的组合物，
其中当在步骤(a)中使用HEC时，在步骤(b)中需要加入增塑剂。
19.根据权利要求18所述的方法，其中步骤(c)的均质组合物包含1至17mg/cm2的HEC或HPMC。
20.根据权利要求17至18中任一项所述的方法，其中，步骤(c)的均质组合物包含7至10.5mg/cm2，5至10mg/cm2，8至10mg/cm2，或10至16mg/cm2HEC和1.5至33mg/cm2增塑剂。
21.根据权利要求17至19中任一项所述的方法，其中步骤(c)的均质组合物包含2.5至8mg/cm2，4至8mg/cm2，或8至15mg/cm2HPMC和0至5mg/cm2增塑剂。
22.根据权利要求17至21中任一项所述的方法，其中步骤(c)的均质组合物包含0.1至5mg/cm2西多福韦。
23.根据权利要求17至22中任一项所述的方法，其中步骤(c)的均质组合物具有的pH为6至8，优选为6.5至7.5。
24.根据权利要求23所述的方法，其中步骤(c)的均质组合物包含NaOH。
25.制备根据权利要求14所述的凝胶状组合物的方法，所述方法包括以下步骤：将根据权利要求1至12中任一项所述的冻干组合物再水化。
26.通过冻干含水组合物获得的片状固体多孔可延展基质，所述含水组合物包含1至17mg/cm2HEC或HPMC，0至5mg/cm2增塑剂，和0.1至5mg/cm2西多福韦，其中当使用HEC时，存在1.5至3mg/cm2的所述增塑剂。
27.根据权利要求25所述的基质，其中所述含水组合物包含：
-7至10.5mg/cm2，5至10mg/cm2，8至10mg/cm2，或10至16mg/cm2HEC，
-1.5至3mg/cm2增塑剂，和
-0.1至5mg/cm2西多福韦。
28.根据权利要求25所述的基质，其中所述含水组合物包含：
-2.5至8mg/cm2，4至8mg/cm2，或8至15mg/cm2HPMC，
-0至5mg/cm2增塑剂，和
-0.1至5mg/cm2西多福韦。
29.药物递送施用器，所述药物递送施用器包含根据权利要求1至12中任一项所述的片状冻干组合物或根据权利要求25至27中任一项所述的基质。
30.根据权利要求28所述的药物递送施用器，其是以宫颈帽或覆盖宫颈的子宫托的形式，(5至15)任选地包含防止活性成分扩散的药物不透性屏障，或是以阴道插入物，阴道乳膏插入物或棉塞插入物的形式。
CN201280044697.1A 2011-07-15 2012-07-13 用于治疗hpv的组合物和方法 Pending CN103889400A (zh)

Applications Claiming Priority (5)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201161508473P 2011-07-15 2011-07-15
US61/508,473 2011-07-15
EP11174193.0 2011-07-15
EP11174193 2011-07-15
PCT/EP2012/063796 WO2013010942A1 (en) 2011-07-15 2012-07-13 Composition and method for treating hpv

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN103889400A true CN103889400A (zh) 2014-06-25

Family

ID=45877205

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201280044697.1A Pending CN103889400A (zh) 2011-07-15 2012-07-13 用于治疗hpv的组合物和方法

Country Status (12)

Country Link
US (1) US9211338B2 (zh)
EP (1) EP2731588B1 (zh)
JP (1) JP2014520834A (zh)
KR (1) KR20140054067A (zh)
CN (1) CN103889400A (zh)
AU (1) AU2012285969A1 (zh)
BR (1) BR112014000877A2 (zh)
CA (1) CA2841851A1 (zh)
CL (1) CL2014000110A1 (zh)
EA (1) EA201490220A1 (zh)
MX (1) MX2014000522A (zh)
WO (1) WO2013010942A1 (zh)

Families Citing this family (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
AU2012285969A1 (en) 2011-07-15 2014-01-30 Femalon S.P.R.L. Composition and method for treating HPV
US20200253994A1 (en) * 2019-02-11 2020-08-13 Chemistryrx Pyrimidine derivative containing compositions

Family Cites Families (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20020039594A1 (en) * 1997-05-13 2002-04-04 Evan C. Unger Solid porous matrices and methods of making and using the same
US8178123B2 (en) * 2001-08-29 2012-05-15 Femina Pharma Incorporated Method for augmentation of intraepithelial and systemic exposure of therapeutic agents having substrate activity for cytochrome P450 enzymes and membrane efflux systems following vaginal and oral cavity administration
US8907153B2 (en) * 2004-06-07 2014-12-09 Nuvo Research Inc. Adhesive peel-forming formulations for dermal delivery of drugs and methods of using the same
CN1698643A (zh) * 2005-05-27 2005-11-23 山东恒瑞医药科技发展有限公司 西多福韦脂质体及其制备方法
WO2007035515A2 (en) * 2005-09-15 2007-03-29 Umd, Inc. A method of intraepithelial and systemic exposure of therapeutic agents following vaginal and oral cavity administration
EP1837020A1 (en) 2006-03-24 2007-09-26 Bioalliance Pharma Mucosal bioadhesive slow release carrier for delivering active principles
AU2012285969A1 (en) 2011-07-15 2014-01-30 Femalon S.P.R.L. Composition and method for treating HPV

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
KENNETH C. CUNDY ET AL.: ""Bioavailability and metabolism of cidofovir following topical administration to rabbits."", 《ANTIVIRAL RESEARCH》 *
谭帼馨等: ""PEG/HEMA水凝胶复合支架的制备及其溶胀性能"", 《功能材料》 *

Also Published As

Publication number Publication date
WO2013010942A1 (en) 2013-01-24
EA201490220A1 (ru) 2014-07-30
MX2014000522A (es) 2014-05-30
CA2841851A1 (en) 2013-01-24
AU2012285969A1 (en) 2014-01-30
KR20140054067A (ko) 2014-05-08
JP2014520834A (ja) 2014-08-25
US9211338B2 (en) 2015-12-15
CL2014000110A1 (es) 2014-10-24
EP2731588A1 (en) 2014-05-21
US20140170219A1 (en) 2014-06-19
BR112014000877A2 (pt) 2017-02-21
NZ620042A (en) 2015-09-25
EP2731588B1 (en) 2016-04-06

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Bilensoy et al. Thermosensitive mucoadhesive gel formulation loaded with 5-Fu: cyclodextrin complex for HPV-induced cervical cancer
Valenta The use of mucoadhesive polymers in vaginal delivery
Baloglu et al. Strategies to prolong the intravaginal residence time of drug delivery systems
Caramella et al. Mucoadhesive and thermogelling systems for vaginal drug delivery
Yoo et al. pH-sensitive Eudragit nanoparticles for mucosal drug delivery
WO2010012131A1 (zh) 含有莪术油的药物组合物的制药用途
CN103118662B (zh) 制备冻干速溶多相剂型的方法
Wang et al. Vaginal drug delivery approaches for localized management of cervical cancer
Tuğcu-Demiröz et al. Preparation and characterization of bioadhesive controlled-release gels of cidofovir for vaginal delivery
AU2004262873A1 (en) Mucoadhesive composition comprising polyacrylate and chemoattractant
WO2017148363A1 (zh) 褐藻酸硫酸酯在制备预防和治疗由人乳头瘤状病毒引起的疾病的药物和保健品中的应用
Giordani et al. Ondansetron buccal administration for paediatric use: A comparison between films and wafers
Gong et al. Nanocrystal formulation improves vaginal delivery of CSIC for HIV prevention
Lalan et al. Polymers in vaginal drug delivery: Recent advancements
CN113633608B (zh) 一种抗hpv病毒多酚缓释脂质纳米粒凝胶及其制备方法
Hani et al. Preparation and optimization of curcumin-hydroxy propyl cyclodextrin bioadhesive vaginal films for human papilloma virus-induced cervical cancer
Valamla et al. Engineering drug delivery systems to overcome the vaginal mucosal barrier: Current understanding and research agenda of mucoadhesive formulations of vaginal delivery
US20200085733A1 (en) Hypotonic hydrogel formulations for enhanced transport of active agents at mucosal surfaces
Thapa et al. Application of sol–gels for treatment of gynaecological conditions—physiological perspectives and emerging concepts in intravaginal drug delivery
CN103889400A (zh) 用于治疗hpv的组合物和方法
CN102899327B (zh) 一种抗病毒的小核酸及其温度敏感型凝胶制剂与应用
Xu et al. Preparation, evaluation, and pharmacokinetics in beagle dogs of a taste-masked flunixin meglumine orally disintegrating tablet prepared using hot-melt extrusion technology and D-optimal mixture design
WO2022037362A1 (zh) 一种治疗带状疱疹的注射剂
NZ620042B2 (en) Composition and method for treating hpv
Chituku et al. The Development of Locoregional Therapies as a Strategy for Reducing Cervical Cancer Mortality in Low to Middle Income Countries.

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
WD01 Invention patent application deemed withdrawn after publication
WD01 Invention patent application deemed withdrawn after publication

Application publication date: 20140625