CN113633608B - 一种抗hpv病毒多酚缓释脂质纳米粒凝胶及其制备方法 - Google Patents

一种抗hpv病毒多酚缓释脂质纳米粒凝胶及其制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种抗HPV病毒多酚缓释脂质纳米粒凝胶及其制备方法，该制剂主要用于阴道给药、黏膜给药或皮肤给药，用于抑制乳头瘤病毒感染，它属于医药技术领域。一种抗HPV病毒多酚缓释脂质纳米粒凝胶，它是由下述原料按所述重量份数制备而成，多酚1份、脂质成分1‑5份、大豆磷脂1‑3份、泊洛沙姆1‑3份、聚卡波菲2‑6份、卡波姆1‑3份、液体石蜡5‑10份、甘油22‑28份。本发明的优点是能使多酚药物成分缓慢释放、保持药物粘附不流出、保持局部环境和黏膜或皮肤层一定药物浓度、提高抑制HPV病毒及受感染细胞的效果。

Description

一种抗HPV病毒多酚缓释脂质纳米粒凝胶及其制备方法
技术领域
本发明涉及一种用于阴道给药、黏膜或皮肤给药的抗HPV病毒的药物，特别是涉及一种抗HPV病毒多酚缓释脂质纳米粒凝胶，用于局部治疗和预防人乳头瘤病毒HPV引起的疣、宫颈癌疾病，它属于医药技术领域。
背景技术
HPV主要感染人体皮肤上皮和黏膜上皮，HPVE1和E2蛋白对病毒基因组的复制和转录起调节作用，E4蛋白协助病毒成熟，而高危型的HPVE5、E6、E7是致癌的主要因素，对宿主细胞的永生化起决定性作用。HPV病毒的持续感染可导致HPV DNA整合到人体细胞，HPV DNA的整合往往造成宫颈细胞中E1、E2区域的缺失，继而引发E6、E7的持续性高表达，有关研究发现约90％的宫颈癌组织中可发现HPV DNA整合。因此在阴道近宫颈管腔及阴道黏膜层或皮肤层中保持一定的抗HPV病毒以及抑制病毒侵染的药物浓度，可以抑制HPV病毒侵染宫颈细胞复制或表达，是药物成分治疗或预防HPV病毒引起的如宫颈癌等疾病的重要途径。
以往文献研究证实，天然植物多酚类成分具有较强的抗HPV病毒作用，在HPV阳性的宫颈癌细胞系中发挥抑制细胞增殖、促进细胞凋亡和阻滞细胞周期等作用，潜在机制可能与抑制环氧化物酶和脂肪氧合酶的表达、抑制血管生成、抑制端粒酶活性、诱导p53的表达等有关。在以往的文献报道中，原花青素、茶多酚、姜黄素、白藜芦醇都具有上述作用，原花青素、茶多酚与姜黄素及白藜芦醇单体或混合体可在体内外抑制HPV阳性肿瘤细胞的增殖活性，机制可能与降低E6、E7蛋白的表达和增加抑癌蛋白p53的活性有关，也可能与影响p53与Bcl-2基因的表达等有关。根据文献报道，茶多酚与白藜芦醇对人乳头瘤病毒(HPV)具有较强抑制作用，并对HPV病毒感染引起的尖锐湿疣以及宫颈癌具有治疗和预防作用。茶多酚在肿瘤细胞如乳腺癌、结肠癌、肺癌、黑素瘤以及高危型HPV阳性的宫颈癌细胞系中显现出抑制细胞增殖、诱导细胞凋亡及阻滞细胞周期等作用，茶多酚可促进癌前病变H8细胞的周期阻滞，从而抑制细胞增殖活性，并诱导H8细胞凋亡。既往文献报道，茶多酚在HPV阳性的宫颈癌细胞系中发挥抑制细胞增殖、促进细胞凋亡和阻滞细胞周期等作用，潜在机制与抑制环氧化物酶和脂肪氧合酶的表达、抑制血管生成、抑制端粒酶活性、诱导p53的表达等有关。白藜芦醇(3,4,5-三羟基芪)也是一种多酚类化合物，肿瘤相关的流行病学调查统计结果提示白藜芦醇具有良好的抗肿瘤活性，研究显示白藜芦醇对肿瘤的起始、促进、发展3个阶段均有抑制作用，研究发现白藜芦醇可以通过调控表观遗传学机制，增加肿瘤细胞对常规化疗药物的敏感性。在白藜芦醇与妇科肿瘤的相关研究中，发现它对多种妇科肿瘤均有较好疗效，尤其对于HPV感染的宫颈癌细胞具有一定作用，有望成为临床上妇科肿瘤的有效防治药物。原花青素可以抑制多种肿瘤细胞的生长，诱导多种肿瘤细胞的凋亡，还可以拮抗化疗药物对正常细胞的毒性作用。多酚成分原花青素可能通过迅速下调抗凋亡蛋白livin表达，激活caspase-3，导致蛋白酶级联切割放大，最终引起宫颈癌Hela细胞凋亡。姜黄素具有抗肿瘤作用，对多种恶性肿瘤如皮肤癌、淋巴瘤、白血病、鼻咽癌、乳腺癌、卵巢癌、肝癌、胃癌、结肠癌、食管癌、前列腺癌、膀胱癌等均有抑制作用。姜黄素的药理作用还包括抗氧化、抗炎、免疫调节、抗真菌、抗动脉粥样硬化等。有文献报道，原花青素、茶多酚与姜黄素及白藜芦醇混合也可在体内外抑制HPV阳性肿瘤细胞的增殖活性，机制可能与降低E6、E7蛋白的表达和增加抑癌蛋白p53的活性有关，也可能与影响p53与Bcl-2基因的表达等有关。
有关多酚抗HPV药物制剂背景技术包括，美国于2006年批准上市了多酚E(polynonE)软膏，用于治疗HPV病毒引起的皮肤黏膜湿疣或肿瘤疾病，该制剂一般仅用于生殖器外部，不能在阴道内部黏膜粘附使用。文献辽宁医学院学报2011,32(1)“茶多酚的质量标准与阴道载体栓概述”一文报道了茶多酚栓剂的制备方法，该栓剂很容易被阴道体液冲刷，药物停留时间短。中国专利201810027344.X一种茶多酚组合物，公开了一种茶多酚组合物的处方和制备方法，专利涉及了软膏与水凝胶贴剂配方和制备方法，主要用于外部皮肤使用，不具有缓释等作用。文献食品工业科技2016.12“姜黄素与茶多酚联用固体脂质纳米粒制备方法与抗肿瘤活性研究”报道了口服姜黄素复合茶多酚固体脂质纳米粒制备方法。
人体阴道由于体液冲刷等关系，药物往往不宜在阴道环境中驻留，同时由于人体黏膜的特殊结构，药物也很难在粘膜层吸收驻留，而在阴道内以及粘膜层或皮肤层长期持续保持一定药物浓度对治疗和预防HPV病毒引起的疾病是有利的。原花青素与茶多酚为水溶性较强极性成分，遇水很容易快速释放，容易被阴道内体液冲刷，不宜长期保持药物浓度，皮肤或黏膜渗透性差，也不易驻留。而姜黄素与白藜芦醇属于难溶性成分，属于生物药剂学II类成分，不容易释放药物，也将影响阴道内保持一定的药物浓度，也很难进入粘膜层和皮肤层。而多酚由于其分子较大以及其理化性质，也难以透过皮肤而被皮肤吸收。
以上专利、文献及市场已经上市产品均未涉及到多酚缓释固体脂质纳米粒凝胶配方及工艺内容。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是，提供了一种抗HPV病毒多酚缓释脂质纳米粒凝胶，它具有使多酚药物成分缓慢释放、保持药物粘附不流出、保持局部环境和黏膜或皮肤层一定药物浓度、提高抑制HPV病毒及受感染细胞效果的特点。
为解决上述技术问题，本发明是通过下述技术方案实现的：
一种抗HPV病毒多酚缓释脂质纳米粒凝胶，它是由下述原料按所述重量份数制备而成，多酚1份、脂质成分1-5份、大豆磷脂1-3份、泊洛沙姆1-3份、聚卡波菲2-6份、卡波姆1-3份、液体石蜡5-10份、甘油22-28份。
优选的，上述一种抗HPV病毒多酚缓释脂质纳米粒凝胶，它是由下述原料按所述重量份数制备而成，多酚1份、脂质成分2-4份、大豆磷脂1-3份、泊洛沙姆1-3份、聚卡波菲3-5份、卡波姆1-3份、液体石蜡6-8份、甘油24-26份。
优选的，上述多酚是茶多酚、白藜芦醇、原花青素、姜黄素中的一种或几种组合。
优选的，上述卡波姆是卡波姆974或卡波姆974P。
优选的，上述聚卡波菲是聚丙烯酸交联树脂，英文名称为polycarbophil或polycarbophil AA-1或Noveon AA-1。
优选的，上述脂质成分是单硬脂酸甘油酯、混合酸甘油酯中的一种或他们的混合物。
优选的，上述泊洛沙姆是泊洛沙姆188、泊洛沙姆407中一种或他们的混合物。
一种上述抗HPV病毒多酚缓释脂质纳米粒凝胶的制备方法，其步骤如下：a.按所述重量份数取卡波姆和聚卡波菲，加入100-140重量份水，常温搅拌2-3小时，得水合凝胶，用质量百分比浓度为10％的氢氧化钠水溶液调pH至3.3，得凝胶备用；b.按所述重量份数取脂质成分、多酚、大豆磷脂，加入适量无水乙醇，水浴升温至70-80℃条件下混合溶融，真空回收乙醇，得脂质油相，取符合所述重量份数的泊洛沙姆加入到20-40重量份的纯化水中，得水相并升温至与脂质油相相同温度，将两相混合高剪切均质2-10分钟，得脂质纳米粒溶液备用；c.将a得到的凝胶加热至60℃，加入符合所述重量份数的液体石蜡和甘油，边搅拌边加入b得到的脂质纳米粒溶液，搅拌均匀后，剪切均质5分钟，得成品。
由于采用上述技术方案，使得本发明具有如下特点和效果：
本发明采用脂质纳米粒系统及仿生粘蛋白材料聚卡波菲，将含有主药多酚成分溶融在固体脂质中，制备成固体脂质纳米粒(SLN)，并与由聚卡波菲等组成的凝胶混合成一种固体脂质纳米粒凝胶。本发明中多酚成分包括了水溶性和脂溶性成分，且熔点较高，通常难以与脂质成分共同熔融，但经本发明筛选研究惊奇发现，本发明中多酚可以与脂质成分单硬脂酸甘油酯和混合酸甘油三酯或它们的混合物在乙醇溶剂中溶融，即使蒸发乙醇后仍处于一种均匀的熔融状态，并且在大豆卵磷脂与泊洛沙姆乳化剂存在下，可以制备成稳定的固体脂质纳米粒，这种纳米粒通常被认为具有较好的黏膜和皮肤渗透性和容易驻留特点。由于一般脂质纳米粒不稳定，很容易聚集融合，造成分层和大颗粒现象，且不易附着于皮肤或黏膜表面，很难达到本发明的效果。目前脂质纳米粒一般都是通过冻干保存或者制备前体保护，外用纳米粒通常采用软膏或凝胶赋型，但一般公知技术制备的凝胶或软膏技很容易使纳米粒聚集而失去其纳米粒作用，本发明纳米粒采用这些普通凝胶技术很容易发生聚集而失去它应有的效果。因此本发明经研究筛选发现，一种含有聚卡波菲和卡波姆、液体石蜡的凝胶可以与本发明的纳米粒恰好融合而不聚集，经测试发现本发明纳米粒可以悬浮于经筛选的上述凝胶网格中，使固体纳米粒处于悬浮不聚集状态，纳米粒比较完整，提高了纳米粒的稳定性，这种筛选的凝胶还具有较强保湿锁水作用，可以较长时间在皮肤或黏膜表面保持水分，保持给药系统连续性。同时由于该凝胶具有生理酸性PH值，有利于保持人体阴道自然生理酸性环境，提高了多酚抗HPV以及抗菌效果，它所具有强粘附性更有利于将含药凝胶粘附于皮肤或黏膜部位，因此该纳米粒凝胶比以往的多酚制剂更显著的使多酚更容易渗透皮肤或黏膜，保持局部较高较长时间药物浓度，具有更好的抗HPV效果。本发明具有阴道粘蛋白生物粘附类似作用，遇水可以溶胀自身体积多倍以上，它的低PH值可以保持阴道环境处于正常生理酸度，据文献报道这种低PH值环境有利于清除HPV病毒或延缓复制，经筛选的聚卡波菲、液体石蜡与甘油与本发明凝胶组合有利于阻止水分流失，有利于保持制剂中水相和给药系统运转。
本发明凝胶由固体脂质纳米粒和聚卡波菲、卡波姆等共同组成，以脂质纳米粒包裹的主药悬浮在由聚卡波菲、卡波姆、液体石蜡组成的吸水凝胶网格中，包括固体脂质纳米粒(亲脂层)和水相层(亲水层)，并通过粘附和保湿锁水作用贴附在黏膜或皮肤上，固体脂质纳米粒中主药做为贮库，可以向水层释放，形成可长时间持久释放的贮库，即多酚成分从固体脂质纳米粒系统逐渐释放主药，以保持阴道腔药物浓度，本发明固体脂质纳米粒可以较好渗透进皮肤或粘膜层，直接发挥抗HPV病毒及其抗病毒感染细胞作用，最终再通过悬浮的脂质纳米粒主药多酚至水相补充释放，形成持久释放系统。该凝胶系统借助良好的生物粘附作用可粘附在阴道表面，膨胀铺展，使药物系统粘附在阴道粘膜上，不易脱落，使主药通过脂质纳米粒系统向水相逐渐释放药物，并最终通过粘膜为人体吸收或阴道腔体液保持，维持药物逐渐从脂质纳米粒系统中持久释放药物。因此与普通配方制备的凝胶相比，本发明凝胶可使主药多酚渗透进黏膜或皮肤层，并具有缓释作用，减少用药次数，生物粘附性强，不易脱落，同时由于较低PH值属性，可以保持阴道自然酸性环境，有利于对人乳头瘤病毒(HPV)引起的宫颈炎症或宫颈癌或湿疣类疾病的治疗和预防。本发明由于其良好的皮肤粘附作用，可以很好在皮肤上展开铺层，并保持皮肤湿润，其层内含多酚药物纳米粒可被皮肤层吸收，进而发挥其多酚药物抗HPV病毒侵染细胞。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明进行进一步说明。以下实施例仅为本发明的几个具体实施例，但本发明的设计构思并不局限于此，凡利用此构思对本发明进行非实质性的改动，均应属于侵犯本发明保护范围的行为。
下述实施例和试验例中的方法，如无特别说明，均为常规方法。
实施例1
本发明的抗HPV病毒多酚缓释脂质纳米粒凝胶的制备方法如下：a.取1重量份卡波姆974P和2重量份聚卡波菲，加入100重量份水，常温搅拌2小时，得水合凝胶，用质量百分比浓度为10％的氢氧化钠水溶液调pH至3.3，得凝胶备用；b.取1重量份茶多酚、1重量份单硬脂酸甘油酯、1重量份大豆磷脂，加入15重量份无水乙醇，水浴升温至70℃条件下混合溶融，真空加热回收乙醇，得脂质油相，取1重量份泊洛沙姆188，加入35重量份纯化水，得水相并升温至70℃，将两相混合高剪切均质2分钟，得脂质纳米粒溶液备用；c.将a得到的凝胶加热至60℃，加入5重量份液体石蜡和22重量份甘油，边搅拌边加入b得到的脂质纳米粒溶液，搅拌均匀后，剪切均质5分钟，得成品。
实施例2
本发明的抗HPV病毒多酚缓释脂质纳米粒凝胶的制备方法如下：a.取2重量份卡波姆974和3重量份聚卡波菲，加入110重量份水，常温搅拌2.5小时，得水合凝胶，用质量百分比浓度为10％的氢氧化钠水溶液调pH至3.3，得凝胶备用；b.取1重量份白藜芦醇、2重量份混合酸甘油酯、1重量份大豆磷脂，加入18重量份无水乙醇，水浴升温至75℃条件下混合溶融，真空加热回收乙醇，得脂质油相，取1重量份泊洛沙姆407，加入30重量份纯化水，得水相并升温至75℃，将两相混合高剪切均质4分钟，得脂质纳米粒溶液备用；c.将a得到的凝胶加热至60℃，加入6重量份液体石蜡和23重量份甘油，边搅拌边加入b得到的脂质纳米粒溶液，搅拌均匀后，剪切均质5分钟，得成品。
实施例3
本发明的抗HPV病毒多酚缓释脂质纳米粒凝胶的制备方法如下：a.取3重量份卡波姆974P和4重量份聚卡波菲，加入120重量份水，常温搅拌3小时，得水合凝胶，用质量百分比浓度为10％的氢氧化钠水溶液调pH至3.3，得凝胶备用；b.取1重量份原花青素、3重量份单硬脂酸甘油酯、1重量份大豆磷脂，加入20重量份无水乙醇，水浴升温至70℃条件下混合溶融，真空加热回收乙醇，得脂质油相，取1重量份泊洛沙姆188和1重量份泊洛沙姆407，加入40重量份纯化水，得水相并升温至70℃，将两相混合高剪切均质6分钟，得脂质纳米粒溶液备用；c.将a得到的凝胶加热至60℃，加入7重量份液体石蜡和24重量份甘油，边搅拌边加入b得到的脂质纳米粒溶液，搅拌均匀后，剪切均质5分钟，得成品。
实施例4
本发明的抗HPV病毒多酚缓释脂质纳米粒凝胶的制备方法如下：a.取1重量份卡波姆974和5重量份聚卡波菲，加入130重量份水，常温搅拌2小时，得水合凝胶，用质量百分比浓度为10％的氢氧化钠水溶液调pH至3.3，得凝胶备用；b.取1重量份姜黄素、4重量份混合酸甘油酯、2重量份大豆磷脂，加入22重量份无水乙醇，水浴升温至80℃条件下混合溶融，真空加热回收乙醇，得脂质油相，取2重量份泊洛沙姆407，加入25重量份纯化水升温至80℃，将两相混合高剪切均质8分钟，得脂质纳米粒溶液备用；c.将a得到的凝胶加热至60℃，加入8重量份液体石蜡和25重量份甘油，边搅拌边加入b得到的脂质纳米粒溶液，搅拌均匀后，剪切均质5分钟，得成品。
实施例5
本发明的抗HPV病毒多酚缓释脂质纳米粒凝胶的制备方法如下：a.取2重量份卡波姆974P和6重量份聚卡波菲，加入140重量份水，常温搅拌2.5小时，得水合凝胶，用质量百分比浓度为10％的氢氧化钠水溶液调pH至3.3，得凝胶备用；b.取0.5重量份茶多酚、0.5重量份白藜芦醇、5重量份单硬脂酸甘油酯、2重量份大豆磷脂，加入25重量份无水乙醇，水浴升温至70℃条件下混合溶融，真空加热回收乙醇，得脂质油相，取1重量份泊洛沙姆188，加入35重量份纯化水，得水相并升温至70℃，将两相混合高剪切均质10分钟，得脂质纳米粒溶液备用；c.将a得到的凝胶加热至60℃，加入9重量份液体石蜡和26重量份甘油，边搅拌边加入b得到的脂质纳米粒溶液，搅拌均匀后，剪切均质5分钟，得成品。
实施例6
本发明的抗HPV病毒多酚缓释脂质纳米粒凝胶的制备方法如下：a.取3重量份卡波姆974和2重量份聚卡波菲，加入105重量份水，常温搅拌3小时，得水合凝胶，用质量百分比浓度为10％的氢氧化钠水溶液调pH至3.3，得凝胶备用；b.取0.5重量份茶多酚、0.5重量份原花青素、2.5重量份混合酸甘油酯、2重量份大豆磷脂，加入15重量份无水乙醇，水浴升温至75℃条件下混合溶融，真空加热回收乙醇，得脂质油相，取3重量份泊洛沙姆407，加入25重量份纯化水，得水相并升温至75℃，将两相混合高剪切均质3分钟，得脂质纳米粒溶液备用；c.将a得到的凝胶加热至60℃，加入10重量份液体石蜡和27重量份甘油，边搅拌边加入b得到的脂质纳米粒溶液，搅拌均匀后，剪切均质5分钟，得成品。
实施例7
本发明的抗HPV病毒多酚缓释脂质纳米粒凝胶的制备方法如下：a.取1重量份卡波姆974P和3重量份聚卡波菲，加入115重量份水，常温搅拌2小时，得水合凝胶，用质量百分比浓度为10％的氢氧化钠水溶液调pH至3.3，得凝胶备用；b.取0.5重量份茶多酚、0.5重量份姜黄素、1重量份单硬脂酸甘油酯、1重量份混合酸甘油酯、2重量份大豆磷脂，加入18重量份无水乙醇，水浴升温至70℃条件下混合溶融，真空加热回收乙醇，得脂质油相，取3重量份泊洛沙姆188，加入40重量份纯化水，得水相并升温至70℃，将两相混合高剪切均质5分钟，得脂质纳米粒溶液备用；c.将a得到的凝胶加热至60℃，加入5重量份液体石蜡和28重量份甘油，边搅拌边加入b得到的脂质纳米粒溶液，搅拌均匀后，剪切均质5分钟，得成品。
实施例8
本发明的抗HPV病毒多酚缓释脂质纳米粒凝胶的制备方法如下：a.取2重量份卡波姆974和4重量份聚卡波菲，加入125重量份水，常温搅拌2.5小时，得水合凝胶，用质量百分比浓度为10％的氢氧化钠水溶液调pH至3.3，得凝胶备用；b.取0.5重量份白藜芦醇、0.5重量份原花青素、1.5重量份单硬脂酸甘油酯、1.5重量份混合酸甘油酯、3重量份大豆磷脂，加入20重量份无水乙醇，水浴升温至80℃条件下混合溶融，真空加热回收乙醇，得脂质油相，取3重量份泊洛沙姆407，加入35重量份纯化水，得水相并升温至80℃，将两相混合高剪切均质7分钟，得脂质纳米粒溶液备用；c.将a得到的凝胶加热至60℃，加入6重量份液体石蜡和22重量份甘油，边搅拌边加入b得到的脂质纳米粒溶液，搅拌均匀后，剪切均质5分钟，得成品。
实施例9
本发明的抗HPV病毒多酚缓释脂质纳米粒凝胶的制备方法如下：a.取3重量份卡波姆974P和5重量份聚卡波菲，加入140重量份水，常温搅拌3小时，得水合凝胶，用质量百分比浓度为10％的氢氧化钠水溶液调pH至3.3，得凝胶备用；b.取0.5重量份白藜芦醇、0.5重量份姜黄素、2重量份单硬脂酸甘油酯、2重量份混合酸甘油酯、3重量份大豆磷脂，加入22重量份无水乙醇，水浴升温至70℃条件下混合溶融，真空加热回收乙醇，得脂质油相，取2重量份泊洛沙姆188，加入40重量份纯化水，得水相并升温至70℃，将两相混合高剪切均质9分钟，得脂质纳米粒溶液备用；c.将a得到的凝胶加热至60℃，加入7重量份液体石蜡和23重量份甘油，边搅拌边加入b得到的脂质纳米粒溶液，搅拌均匀后，剪切均质5分钟，得成品。
实施例10
本发明的抗HPV病毒多酚缓释脂质纳米粒凝胶的制备方法如下：a.取1重量份卡波姆974和6重量份聚卡波菲，加入100重量份水，常温搅拌2小时，得水合凝胶，用质量百分比浓度为10％的氢氧化钠水溶液调pH至3.3，得凝胶备用；b.取0.5重量份原花青素、0.5重量份姜黄素、2.5重量份单硬脂酸甘油酯、2.5重量份混合酸甘油酯、3重量份大豆磷脂，加入25重量份无水乙醇，水浴升温至75℃条件下混合溶融，真空加热回收乙醇，得脂质油相，取1重量份泊洛沙姆407，加入35重量份纯化水，得水相并升温至75℃，将两相混合高剪切均质5分钟，得脂质纳米粒溶液备用；c.将a得到的凝胶加热至60℃，加入8重量份液体石蜡和24重量份甘油，边搅拌边加入b得到的脂质纳米粒溶液，搅拌均匀后，剪切均质5分钟，得成品。
实施例11
本发明的抗HPV病毒多酚缓释脂质纳米粒凝胶的制备方法如下：a.取2重量份卡波姆974P和2重量份聚卡波菲，加入110重量份水，常温搅拌2.5小时，得水合凝胶，用质量百分比浓度为10％的氢氧化钠水溶液调pH至3.3，得凝胶备用；b.取0.25重量份茶多酚、0.25重量份白藜芦醇、0.5重量份原花青素、0.5重量份单硬脂酸甘油酯、0.5重量份混合酸甘油酯、2重量份大豆磷脂，加入15重量份无水乙醇，水浴升温至70℃条件下混合溶融，真空加热回收乙醇，得脂质油相，取2重量份泊洛沙姆188，加入20重量份纯化水，得水相并升温至70℃，将两相混合高剪切均质2分钟，得脂质纳米粒溶液备用；c.将a得到的凝胶加热至60℃，加入9重量份液体石蜡和25重量份甘油，边搅拌边加入b得到的脂质纳米粒溶液，搅拌均匀后，剪切均质5分钟，得成品。
实施例12
本发明的抗HPV病毒多酚缓释脂质纳米粒凝胶的制备方法如下：a.取3重量份卡波姆974和4重量份聚卡波菲，加入120重量份水，常温搅拌3小时，得水合凝胶，用质量百分比浓度为10％的氢氧化钠水溶液调pH至3.3，得凝胶备用；b.取0.5重量份茶多酚、0.25重量份原花青素、0.25重量份姜黄素、1重量份单硬脂酸甘油酯、2重量份混合酸甘油酯、2重量份大豆磷脂，加入18重量份无水乙醇，水浴升温至80℃条件下混合溶融，真空加热回收乙醇，得脂质油相，取1重量份泊洛沙姆188和1重量份泊洛沙姆407，加入30重量份纯化水，得水相并升温至80℃，将两相混合高剪切均质4分钟，得脂质纳米粒溶液备用；c.将a得到的凝胶加热至60℃，加入10重量份液体石蜡和26重量份甘油，边搅拌边加入b得到的脂质纳米粒溶液，搅拌均匀后，剪切均质5分钟，得成品。
实施例13
本发明的抗HPV病毒多酚缓释脂质纳米粒凝胶的制备方法如下：a.取1重量份卡波姆974P和6重量份聚卡波菲，加入135重量份水，常温搅拌2小时，得水合凝胶，用质量百分比浓度为10％的氢氧化钠水溶液调pH至3.3，得凝胶备用；b.取0.3重量份茶多酚、0.3重量份白藜芦醇、0.4重量份姜黄素、1.5重量份单硬脂酸甘油酯、0.5重量份混合酸甘油酯、3重量份大豆磷脂，加入20重量份无水乙醇，水浴升温至70℃条件下混合溶融，真空加热回收乙醇，得脂质油相，取1重量份泊洛沙姆188，加入35重量份纯化水，得水相并升温至70℃，将两相混合高剪切均质6分钟，得脂质纳米粒溶液备用；c.将a得到的凝胶加热至60℃，加入5重量份液体石蜡和27重量份甘油，边搅拌边加入b得到的脂质纳米粒溶液，搅拌均匀后，剪切均质5分钟，得成品。
实施例14
本发明的抗HPV病毒多酚缓释脂质纳米粒凝胶的制备方法如下：a.取2重量份卡波姆974和5重量份聚卡波菲，加入140重量份水，常温搅拌2.5小时，得水合凝胶，用质量百分比浓度为10％的氢氧化钠水溶液调pH至3.3，得凝胶备用；b.取0.25重量份茶多酚、0.25重量份白藜芦醇、0.25重量份原花青素、0.25重量份姜黄素、1重量份单硬脂酸甘油酯、1.5重量份混合酸甘油酯、1.5重量份大豆磷脂，加入22重量份无水乙醇，水浴升温至75℃条件下混合溶融，真空加热回收乙醇，得脂质油相，取1重量份泊洛沙姆407，加入20重量份纯化水，得水相并升温至75℃，将两相混合高剪切均质8分钟，得脂质纳米粒溶液备用；c.将a得到的凝胶加热至60℃，加入9重量份液体石蜡和28重量份甘油，边搅拌边加入b得到的脂质纳米粒溶液，搅拌均匀后，剪切均质5分钟，得成品。
实施例15
本发明的抗HPV病毒多酚缓释脂质纳米粒凝胶的制备方法如下：a.取3重量份卡波姆974P和3重量份聚卡波菲，加入100重量份水，常温搅拌3小时，得水合凝胶，用质量百分比浓度为10％的氢氧化钠水溶液调pH至3.3，得凝胶备用；b.取0.15重量份茶多酚、0.55重量份白藜芦醇、0.3重量份姜黄素、3.5重量份单硬脂酸甘油酯、1.5重量份大豆磷脂，加入25重量份无水乙醇，水浴升温至70℃条件下混合溶融，真空加热回收乙醇，得脂质油相，取1.5重量份泊洛沙姆188，加入20重量份纯化水，得水相并升温至70℃，将两相混合高剪切均质10分钟，得脂质纳米粒溶液备用；c.将a得到的凝胶加热至60℃，加入6重量份液体石蜡和24重量份甘油，边搅拌边加入b得到的脂质纳米粒溶液，搅拌均匀后，剪切均质5分钟，得成品。
实施例16
本发明的抗HPV病毒多酚缓释脂质纳米粒凝胶的制备方法如下：a.取1重量份卡波姆974和4重量份聚卡波菲，加入120重量份水，常温搅拌2小时，得水合凝胶，用质量百分比浓度为10％的氢氧化钠水溶液调pH至3.3，得凝胶备用；b.取0.2重量份茶多酚、0.6重量份原花青素、0.2重量份姜黄素、2.5重量份混合酸甘油酯、1.5重量份大豆磷脂，加入15重量份无水乙醇，水浴升温至73℃条件下混合溶融，真空加热回收乙醇，得脂质油相，取2.5重量份泊洛沙姆407，加入25重量份纯化水，得水相并升温至73℃，将两相混合高剪切均质3分钟，得脂质纳米粒溶液备用；c.将a得到的凝胶加热至60℃，加入7重量份液体石蜡和25重量份甘油，边搅拌边加入b得到的脂质纳米粒溶液，搅拌均匀后，剪切均质5分钟，得成品。
实施例17
本发明的抗HPV病毒多酚缓释脂质纳米粒凝胶的制备方法如下：a.取2重量份卡波姆974P和5重量份聚卡波菲，加入130重量份水，常温搅拌2.5小时，得水合凝胶，用质量百分比浓度为10％的氢氧化钠水溶液调pH至3.3，得凝胶备用；b.取0.2重量份茶多酚、0.15重量份白藜芦醇、0.3重量份原花青素、0.35重量份姜黄素、4重量份单硬脂酸甘油酯、2.5重量份大豆磷脂，加入18重量份无水乙醇，水浴升温至70℃条件下混合溶融，真空加热回收乙醇，得脂质油相，取1重量份泊洛沙姆188，加入30重量份纯化水，得水相并升温至70℃，将两相混合高剪切均质5分钟，得脂质纳米粒溶液备用；c.将a得到的凝胶加热至60℃，加入8重量份液体石蜡和26重量份甘油，边搅拌边加入b得到的脂质纳米粒溶液，搅拌均匀后，剪切均质5分钟，得成品。
实施例18
本发明的抗HPV病毒多酚缓释脂质纳米粒凝胶的制备方法如下：a.取3重量份卡波姆974和3重量份聚卡波菲，加入110重量份水，常温搅拌3小时，得水合凝胶，用质量百分比浓度为10％的氢氧化钠水溶液调pH至3.3，得凝胶备用；b.取0.15重量份茶多酚、0.55重量份白藜芦醇、0.15重量份原花青素、0.15重量份姜黄素、3重量份混合酸甘油酯、2.5重量份大豆磷脂，加入20重量份无水乙醇，水浴升温至77℃条件下混合溶融，真空加热回收乙醇，得脂质油相，取2重量份泊洛沙姆407，加入35重量份纯化水，得水相并升温至77℃，将两相混合高剪切均质7分钟，得脂质纳米粒溶液备用；c.将a得到的凝胶加热至60℃，加入6重量份液体石蜡和24重量份甘油，边搅拌边加入b得到的脂质纳米粒溶液，搅拌均匀后，剪切均质5分钟，得成品。
实施例19
本发明的抗HPV病毒多酚缓释脂质纳米粒凝胶的制备方法如下：a.取2重量份卡波姆974P和4重量份聚卡波菲，加入120重量份水，常温搅拌2小时，得水合凝胶，用质量百分比浓度为10％的氢氧化钠水溶液调pH至3.3，得凝胶备用；b.取0.3重量份茶多酚、0.1重量份白藜芦醇、0.4重量份原花青素、0.2重量份姜黄素、2重量份单硬脂酸甘油酯、1重量份大豆磷脂，加入22重量份无水乙醇，水浴升温至71℃条件下混合溶融，真空加热回收乙醇，得脂质油相，取2重量份泊洛沙姆188，加入30重量份纯化水，得水相并升温至71℃，将两相混合高剪切均质9分钟，得脂质纳米粒溶液备用；c.将a得到的凝胶加热至60℃，加入7重量份液体石蜡和25重量份甘油，边搅拌边加入b得到的脂质纳米粒溶液，搅拌均匀后，剪切均质5分钟，得成品。
实施例20
本发明的抗HPV病毒多酚缓释脂质纳米粒凝胶的制备方法如下：a.取1重量份卡波姆974和5重量份聚卡波菲，加入130重量份水，常温搅拌3小时，得水合凝胶，用质量百分比浓度为10％的氢氧化钠水溶液调pH至3.3，得凝胶备用；b.取0.4重量份茶多酚、0.3重量份白藜芦醇、0.2重量份原花青素、0.1重量份姜黄素、1重量份混合酸甘油酯、1重量份大豆磷脂，加入25重量份无水乙醇，水浴升温至75℃条件下混合溶融，真空加热回收乙醇，得脂质油相，取2重量份泊洛沙姆407，加入25重量份纯化水，得水相并升温至75℃，将两相混合高剪切均质5分钟，得脂质纳米粒溶液备用；c.将a得到的凝胶加热至60℃，加入8重量份液体石蜡和26重量份甘油，边搅拌边加入b得到的脂质纳米粒溶液，搅拌均匀后，剪切均质5分钟，得成品。
实施例1—实施例20中所述的聚卡波菲是聚丙烯酸交联树脂，英文名称为polycarbophil或polycarbophil AA-1或Noveon AA-1。
以下通过试验数据进一步说明本发明的特点和效果，下述试验例中，未特殊说明的试验方法，均为常规方法。
试验例1
高效液相色谱法测定茶多酚中表没食子儿茶素没食子酸酯(EGCG)含量
取待测样品适量，加50％甲醇超声，放冷定容至规定浓度后，过滤，取续滤液作为供试品溶液，进样，色谱条件：C18柱，流动相为乙腈-1.0％醋酸水溶液(87:13，体积比)，检测波长280nm，外标法定量，即得，以EGCG含量代表茶多酚含量。
试验例2
高效液相色谱法测定白藜芦醇含量
取待测样品适量，加甲醇超声，放冷定容至规定浓度后，过滤，取续滤液作为供试品溶液，进样，色谱条件：C18柱，流动相为乙腈-水(27:73，体积比)，检测波长303nm，外标法定量，即得。
试验例3
高新液相色谱法测定原花青素含量
取待测样品适量，加甲醇超声，放冷定容至规定浓度后，摇匀，作为供试品溶液。取2.0mL供试品溶液，加15.0mL 5％的盐酸-正丁醇溶液(V/V)，再加0.5mL 2％硫酸铁铵溶液(硫酸铁铵用2mol/L盐酸溶解)，沸水浴40分钟，取出在冷水浴冷却20分钟，过滤，取续滤液进样，色谱条件：C18柱，流动相为水-甲醇-异丙醇-甲酸(73:13:6:8)，检测波长525nm，外标法定量，即得。
试验例4
高新液相色谱法测定姜黄素含量
取待测样品适量，加甲醇超声，放冷定容到规定浓度后，过滤，取续滤液作为供试品溶液，进样，色谱条件：C18柱，流动相为4％冰醋酸-乙腈(52:48，体积比)，检测波长430nm，外标法定量，即得。
试验例5
脂质纳米粒的包封率及粒径测定
精密吸取本发明实施例1-20的b步骤所得脂质纳米粒溶液适量上葡聚糖凝胶G50柱，用10mL蒸馏水洗脱于25mL容量瓶中，加甲醇定容，得到样品1。另取适量样品直接加甲醇超声溶解并定容，即得样品2。分别按照茶多酚、白藜芦醇、原花青素、姜黄素含量测定方法，进样，外标法定量，计算样品1和样品2中的含量，分别记为M1和M2。包封率(％)＝M1/M2×100，实施例1-20的脂质纳米粒包封率结果见表1。
取本发明实施例1-20的b步骤所得脂质纳米粒溶液适量分散在水中，通过马尔文粒径分析仪进行测定，测得该脂质纳米粒溶液的粒径结果见表1。
表1脂质纳米粒包封率和粒径
试验例6
扫描电镜试验：
分别取实施例19、20的脂质纳米粒和脂质纳米粒凝胶适量用蒸馏水稀释后，滴于铜网上，用1％的磷钨酸水溶液负染，在扫描电镜下观察样品的形态。扫描电镜观察到的脂质纳米粒和脂质纳米粒凝胶中的纳米粒子形态圆整，粒径均在150-220nm之间。扫描电镜结果说明将脂质纳米粒复合于凝胶中不会改变脂质纳米粒的纳米形态。
试验例7
实施例1-20制备的缓释脂质纳米粒凝胶生物粘附性测定试验：
采用灌流冲洗法测定凝胶粘附性，测定装置为带有冲洗的硅胶管，以及接收器，将内壁均匀涂布有凝胶的软质硅胶管装入37℃水浴玻璃管内，同时将恒速灌流冲洗液分流并不断改变方向沿硅胶管内壁滴入，流出液收集于密封的已知重量的干燥收集瓶内。分别于10min、30min、1h、6h、12h、24h、48h称定收集瓶的重量，灌流冲洗液为生理盐水配制的pH值4.2阴道模拟液。
自制普通凝胶对照组，取卡波姆和水搅拌得水合凝胶，用氢氧化钠水溶液调节pH，形成凝胶基质；按照茶多酚:白藜芦醇:原花青素:姜黄素＝0.3:0.1:0.4:0.2的比例称取多酚类成分，加乙醇溶解后，再与凝胶基质混合均匀，即得。
分别取实施例1-20制得的缓释脂质纳米粒凝胶以及自制普通凝胶对照组适量，用玻璃棒将其均匀涂布于硅胶管内壁上，以灌流介质按照0.5ml/min流速进行冲洗并接收流出液，于不同时间称定收集瓶重量，减去同体积空白冲洗介质及收集瓶本身的重量，计算得冲洗量。灌流冲洗液中药物凝胶冲洗量(％)随时间的变化结果见表2。
表2凝胶冲洗量(％)随时间的变化表
对照组在12小时内基本被冲洗完，实施例组在48小时内未冲洗完，实施例组粘附性较好。
试验例8
体外释放度试验
释放度测定方法：以0.5％十二烷基硫酸钠的磷酸盐缓冲液(pH 4.0)溶液900mL为溶剂，桨法，转速为50转/min。将释放介质加入溶出杯内，预温至37℃±0.5℃，分别取本发明实施例1、2、3、4、5、10、14、19制备的凝胶以及试验例7自制普通凝胶对照组适量置于样品池中，精密称定，在样品表面覆盖微孔滤膜，再依次放置硅橡胶垫圈和聚四氟乙烯垫圈，并用螺栓固定，放入烧杯下部，使释放面与桨底旋转面平行，两者相距25mm±0.5mm，开始搅拌。定时取溶液5mL，用0.45μm微孔滤膜滤过，并及时往溶出杯内补充等体积等温度空白释放介质，取续滤液作为供试品溶液。分别采用试验例1-4的方法进行含量测定。计算出不同时间的释放量，药物累积释放量数据分别用零级、一级和Higuchi方程进行拟合，根据相关系数判断药物释放的动力学过程。凝胶中多酚类释放度测定结果见表3。
表3凝胶中多酚类释放度
数据表明本发明制备的凝胶具有缓释作用，对照组在12小时内很快释放完。
试验例9
凝胶稳定性试验
取适量本发明实施例1-20制备的抗HPV病毒多酚缓释脂质纳米粒凝胶，在4℃的储存条件下，观察8周之内的缓释脂质纳米粒凝胶的性状变化，结果见表4。
表4缓释脂质纳米粒凝胶的稳定性试验
试验例10
体外透皮渗透实验
采用Franz扩散池法进行体外透皮渗透实验，将猪皮肤置于给药池底部，本发明实施例19制备缓释脂质纳米粒凝胶以及试验例7自制普通凝胶对照组适量分别均匀涂于给药池的皮肤表面，以5％吐温80的PBS缓冲液(pH7.4)作为接收液，24h后取下皮肤组织，剪切后用80％乙醇沸水浴萃取30min，取萃取液进行液相色谱分析，测定皮肤中滞留样品含量，计算皮肤滞留量。
表5体外透皮渗透实验的皮肤滞留量
体外透皮渗透实验研究表明本发明实施例凝胶可显著提高药物的皮肤滞留量，达到局部外用抗HPV病毒的效果，有利于延长药物发挥局部治疗作用时间。

Claims (6)

1.一种抗HPV病毒多酚缓释脂质纳米粒凝胶，其特征在于它是由下述原料按所述重量份数制备而成，多酚1份、脂质成分1-5份、大豆磷脂1-3份、泊洛沙姆1-3份、聚卡波菲2-6份、卡波姆1-3份、液体石蜡5-10份、甘油22-28份，所述的多酚是茶多酚、白藜芦醇、原花青素、姜黄素中的一种或几种组合，所述的脂质成分是单硬脂酸甘油酯、混合酸甘油酯中的一种或他们的混合物。
2.根据权利要求1所述的一种抗HPV病毒多酚缓释脂质纳米粒凝胶，其特征在于它是由下述原料按所述重量份数制备而成，多酚1份、脂质成分2-4份、大豆磷脂1-3份、泊洛沙姆1-3份、聚卡波菲3-5份、卡波姆1-3份、液体石蜡6-8份、甘油24-26份。
3.根据权利要求1或2所述的一种抗HPV病毒多酚缓释脂质纳米粒凝胶，其特征在于所述的卡波姆是卡波姆974或卡波姆974P。
4.根据权利要求1或2所述的一种抗HPV病毒多酚缓释脂质纳米粒凝胶，其特征在于所述的聚卡波菲是聚丙烯酸交联树脂，英文名称为polycarbophil或polycarbophil AA-1或Noveon AA-1。
5.根据权利要求1所述的一种抗HPV病毒多酚缓释脂质纳米粒凝胶，其特征在于所述的泊洛沙姆是泊洛沙姆188、泊洛沙姆407中一种或他们的混合物。
6.一种权利要求1所述抗HPV病毒多酚缓释脂质纳米粒凝胶的制备方法，其特征在于步骤如下：a. 按所述重量份数取卡波姆和聚卡波菲，加入100-140重量份水，常温搅拌2-3小时，得水合凝胶，用质量百分比浓度为10%的氢氧化钠水溶液调pH至3.3，得凝胶备用；b. 按所述重量份数取脂质成分、多酚、大豆磷脂，加入适量无水乙醇，水浴升温至70-80℃条件下混合溶融，真空回收乙醇，得脂质油相，取符合所述重量份数的泊洛沙姆加入到20-40重量份的纯化水中，得水相并升温至与脂质油相相同温度，将两相混合高剪切均质2-10分钟，得脂质纳米粒溶液备用；c. 将a得到的凝胶加热至60℃，加入符合所述重量份数的液体石蜡和甘油，边搅拌边加入b得到的脂质纳米粒溶液，搅拌均匀后，剪切均质5分钟，得成品。
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