CN102652773B - 药物组合物及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及金荞麦与吴茱萸的药物组合物及其制备方法和质量检测方法。其中，药物组合物包括金荞麦提取物和吴茱萸提取物，金荞麦提取物是醇提取物，吴茱萸提取物是醇提取物。本发明的药物组合物可用来制备治疗HPV感染的药物。
Description
技术领域
本发明涉及中药领域，具体地涉及药物组合物及其用途。更具体地，本发明提供了药物组合物、药物组合物在制备药物中的用途、制备药物的方法、药物以及对药物组合物或药物进行检测的方法。
背景技术
尖锐湿疣(CA)又称为性病疣、生殖器疣或肛门生殖器疣，是一种人乳头瘤病毒(HPV)感染引起的主要发生在男女性外生殖器和肛门部位皮肤粘膜的疾病。这种疣表现为与众不同的乳头状或鸡冠样肿瘤，而且有积累和多发的倾向。尖锐湿疣的发病率高，患者人数也在迅速增加，此病发病率现居我国性传播疾病的第二位。
目前，CA的治疗主要有两种方式：物理治疗和药物治疗。物理治疗方案主要为CO2激光治疗、液氮冷冻治疗、高频电治疗或液氮冷冻微波治疗。对于大体积尖锐湿疣或对药物或CO2激光的治疗表现较为顽固且短期内反复发作的疣体可考虑外科手术切除，再进行药物治疗。对于小体积疣体患者自己用药治疗方案主要药物为0.5％足叶草毒素酊(或0.15％足叶草毒素霜)和5％咪喹莫特(imiquimod)霜。
但事实上，0.5％足叶草毒素酊(或0.15％足叶草毒素霜)临床用药的复发率高，对受损皮肤刺激性强，常伴有灼痛、红肿、糜烂及坏死等副作用，进而有导致局部感染的风险，另外此药有致畸作用。5％咪喹莫特霜治疗尖锐湿疣的疣体清除率平均仅为56％，同时伴有较强局部刺激作用。物理疗法优点为去疣效果快速明显，但缺点是复发率高，疼痛明显，皮下组织疏松部位治疗后可至明显水肿。
作为女性生殖系统最常见的恶性肿瘤，宫颈癌的发生与人类乳头瘤病毒(HPV)感染密切相关。HPV感染生殖道是一个长期的过程，可潜伏在细胞内若干年，一旦机体免疫力降低，潜伏的病毒可恢复活力。HPV感染过程通常分为潜伏感染期、亚临床感染期、临床症状期和HPV相关的肿瘤期。宫颈感染高危HPV(HR HPV)， 各亚型产生E6、E7两种癌蛋白，可与宿主细胞的细胞周期调节蛋白(抑癌蛋白如P53、RB等)相结合，导致细胞周期控制失常，造成细胞增殖异常，异形性变，发展为CIN(宫颈癌前病变或宫颈上皮内瘤变的简称)。根据严重程度CIN分成三级：宫颈上皮内轻、中、高度瘤变，即CINI、CINII、CINIII，由这些癌前病变进一步发展为原位癌和浸润癌。目前认为，从CIN发展到宫颈癌，是一个较长时间(大约10年)连续发展的过程。对CIN的早期筛查和合理干预，清除女性生殖道HPV持续感染，阻断CIN的形成，是有效降低宫颈癌发病率的关键。
人类是HPV的唯一宿主，因而无法在体外和动物模型中进行培养扩增实验，这使得预防或治疗HPV感染的药物研发受到极大限制，造成在全世界范围内尚无疗效确切的预防和治疗HPV感染的药物，因此所谓治疗主要是针对由HPV引起的宫颈或外生殖器的局部病变。宫颈癌前病变由于病位特殊，目前临床上以局部治疗为主。现代医学治疗主要采用物理治疗和手术治疗，物理疗法包括激光、冷冻、红外线、微波、电灼和聚焦超声等，但治疗后常出现阴道分泌物增多、水样排液及阴道不规则出血，还可能引起宫颈管狭窄、黏连甚至不孕等副作用，宫颈锥切术、宫颈广泛切除、子宫全切除等手术治疗病灶消除快，但手术切除对人体的创伤重，痛苦大，治疗费用高，且存在易感染，易复发，对病变时间较长的患者治愈率偏低，CIN复发在治疗后平均2.5年之内。
另外HPV感染还能引起的疾病有宫颈糜烂，女阴上皮内瘤变，疣病，如扁平疣、寻常疣、掌跖疣、尖锐湿疣和免疫功能低下引起的传染性软疣，以及皮肤癌前病变如角化棘皮瘤、日光性角化病、溢脂性角化病等。
目前对治疗由HPV感染引起的宫颈疾病、女阴上皮内瘤变、疣病及皮肤癌前病变的药物，仍有待进一步研究和改进。
发明内容
本发明是基于发明人的下列发现而完成的：
近几十年来，利用中医药治疗女性生殖道HPV感染取得了一定的成效，但使用的大多是多味中药组成的复方，成分复杂，目前仍没有成分简单、疗效确切的药物组合物应用于临床来预防或治疗HPV感染以及其诱发的良性或恶性病变，特别是针对 致湿疣的低危型HPV感染，以及致宫颈癌前病变及宫颈癌的高危型HPV感染。中药金荞麦微辛、涩、凉，归肺经，主要功效为清热解毒、排脓祛瘀，可用于肺痈吐脓、肺热喘咳、乳蛾肿痛等病症。现代研究表明，金荞麦具有抗菌、抗炎、抗肿瘤、抗突变等药理作用。金荞麦具有抗癌作用的活性成分是一类原花色素缩合性单宁物质的混合物(简称金荞麦c)，其主要由表儿茶素及其二聚体组成，包含表儿茶素、原花色素B2、原花色素C1等成分。文献报道对金荞麦中该类成分的提取指标多以其中表儿茶素和原花色素B2的含量为指标，方法比较繁琐，成本较高。吴茱萸辛、苦、热；有小毒。归肝、脾、胃、肾经。具有散寒、止痛、燥湿助阳等功效，近年来在丰富传统用药的基础上对吴茱萸现代药理作用有了深入研究，发现其具有杀虫、抗菌、抗病毒、抗炎镇痛等作用，对其抗肿瘤研究开展较晚，但已有研究发现吴茱萸碱具有很强的抗肿瘤活性，并能诱导人宫颈癌Hela细胞凋亡。吴茱萸主要有效成分为吴茱萸碱、吴茱萸次碱、羟基吴茱萸碱、柠檬苦素、辛弗林、吴茱萸烯等。
发明人在前期对大量药材及不同药物组合初步药效筛选及综合评价的基础上，对上述两种药材的组合物治疗尖锐湿疣和宫颈癌前病变的药效进行了深入研究。发明人在药理药效学实验研究中惊奇的发现，将金荞麦吴茱萸这两味中药组合而制成的药物组合物，对HPV-DNA有明显的破坏作用，对HPVE7基因有明显的抑制作用，可显著抑制宫颈癌Hela细胞的体外增殖，抑制宫颈上皮异型细胞增生，金荞麦吴茱萸药物组合物可用于对感染人乳头瘤病毒(HPV)的治疗，目前国内外有关中药金荞麦与吴茱萸药物组合物在制备治疗HPV感染的药物中的应用未见报道。
本发明旨在至少解决现有技术中存在的技术问题之一。本发明提供了一种可以有效地用于治疗HPV感染的药物组合物及其用途，该药物组合物可用于制备治疗由HPV感染引起的宫颈疾病如宫颈糜烂、宫颈癌前病变、宫颈癌；由HPV感染引起的女阴上皮内瘤变；以及由HPV感染引起的疣病，如扁平疣、寻常疣、掌跖疣、尖锐湿疣和免疫功能低下引起的传染性软疣；以及由HPV感染引起的皮肤癌前病变如角化棘皮瘤、日光性角化病、溢脂性角化病的药物。
根据本发明的一个方面，本发明提供了一种药物组合物。根据本发明的实施例，该药物组合物包含金荞麦提取物和吴茱萸提取物作为活性成分。根据本发明的实施例，优选金荞麦提取物和吴茱萸提取物的重量比例为1～6∶1，更优选金荞麦提取物 与吴茱萸提取物的重量比例为1.5～4∶1，最优选金荞麦提取物与吴茱萸提取物的重量比例为2.5∶1。
根据本发明的一个方面，本发明提供了一种药物组合物。根据本发明的实施例，该药物组合物包含金荞麦和吴茱萸。根据本发明的实施例，按提取物是药材经提取纯化得到的换算，优选金荞麦和吴茱萸的重量比例为0.28～1.67∶1，更优选金荞麦提取物与吴茱萸提取物的重量比例为0.42～1.12∶1，最优选金荞麦与吴茱萸的重量比例为0.69∶1。
本发明的一个方面，提供了一种药物组合物，根据本发明的实施例，该药物组合物包括金荞麦提取物和吴茱萸提取物，其中，所述金荞麦提取物是醇提取物；所述吴茱萸提取物是醇提取物。利用该药物组合物，能够有效地治疗HPV感染引起的疾病，能够对HPV感染引起的宫颈糜烂、宫颈癌前病变、宫颈癌、女阴上皮内瘤变，扁平疣、寻常疣、掌跖疣、尖锐湿疣和免疫功能低下引起的传染性软疣及皮肤癌前病变如角化棘皮瘤、日光性角化病、溢脂性角化病进行有效地治疗。另外，发明人发现，该药物组合物可以有效地抑制HPV E7基因(在本文中有时也简单称为“E7基因”)的表达。并且进一步发现利用该药物组合物还能够有效用于使宫颈癌前病变细胞向良性转化。此外，发明人惊奇地发现，该药物组合物能够治疗炎症。根据本发明的实施例，炎症的类型并不受特别限制。在本发明的实施例中，采用二甲苯处理的小鼠作为炎症的动物模型，证明了本发明药物组合物能够有效治疗炎症。二甲苯处理的小鼠是医药领域中公知认可的炎症的动物模型，关于其应用的具体实例，可以参见：湖北中医学院学报，2005年第7卷第3期，31-33页(关于接触性皮炎)；辽宁中医杂志，2010年第37卷增刊，第227-230页(关于宫颈炎)；辽宁中医杂志，2009年第36卷第7期，第1193-1194页(关于肺炎)。广东药学院学报，2009年6月，25(3)，第295-298页(关于鼻炎)，在此通过参照将这些文献并入本文。
根据本发明的实施例，本发明的药物组合物中金荞麦提取物与吴茱萸提取物优选的重量比例为1-6∶1，优选重量比例为1.5～4∶1，最优选重量比例为2.5∶1。
根据本发明的实施例，从金荞麦制备金荞麦提取物即金荞麦的醇提取物的方法，并不受特别限制。根据本发明的实施例，金荞麦提取物是通过下列步骤制备的：将金荞麦进行加醇提取，以便获得金荞麦提取液；以及将金荞麦提取液进行纯化、干燥， 以便获得金荞麦提取物。根据本发明的实施例，将金荞麦进行加醇提取可以进一步包括：将金荞麦用8-12倍重量的30-60％乙醇，在50-70摄氏度下回流提取2-3次，每次0.5-2小时，并合并提取液，以便获得金荞麦提取液，优选地，将金荞麦用8倍重量的50％乙醇，在60摄氏度下回流提取3次，每次1小时，并合并提取液，以便获得金荞麦提取液。
根据本发明的实施例，将金荞麦提取液进行纯化、干燥可以进一步包括：
首先，将金荞麦提取液进行过滤，以便获得金荞麦提取液滤液。
其次，利用大孔吸附树脂对金荞麦提取液滤液进行纯化，以便获得经过纯化的金荞麦提取液。根据本发明的实施例，大孔树脂的类型不受特别限制，根据本发明的一些示例，大孔树脂可以采用例如D101、DM-130、或者HPD-600大孔树脂。根据本发明的具体示例，利用非极性大孔吸附树脂对金荞麦提取液滤液进行纯化，可以进一步包括将金荞麦提取液滤液上样至D101大孔吸附树脂；使用除杂洗脱剂进行除杂；以及使用洗脱溶剂进行洗脱，以便获得经过纯化的金荞麦提取液。其中，所述金荞麦提取液滤液的上样浓度为0.02-0.20g/ml优选0.08g/ml，其上样速度为0.5-4树脂柱体积/小时优选2树脂柱体积/小时；除杂洗脱剂为水，其洗脱流速为3-6树脂柱体积/小时优选4树脂柱体积/小时；洗脱溶剂为60-90％乙醇优选70％乙醇，该洗脱溶剂的洗脱速度为1-3树脂柱体积/小时优选2树脂柱体积/小时。
然后，将经过纯化的金荞麦提取液进行减压浓缩和真空干燥，以便获得金荞麦提取物，其中减压浓缩是在50-60摄氏度下进行的。根据本发明的实施例，减压浓缩采用60摄氏度减压浓缩。
根据本发明的实施例，从吴茱萸制备吴茱萸提取物即吴茱萸的醇提取物的方法，并不受特别限制。根据本发明的实施例，吴茱萸提取物是通过下列步骤制备的：将所述吴茱萸用8-12倍重量的pH值为2-4的盐酸乙醇，加热回流提取2-3次，每次1-2小时，合并提取液，获得吴茱萸提取液。根据本发明的实施例，将吴茱萸进行加醇提取可以进一步包括：将吴茱萸用10倍重量的pH值为3的盐酸乙醇，加热回流提取3次，每次1.5小时，合并提取液，获得吴茱萸提取液。
根据本发明的实施例，将吴茱萸提取液进行纯化、干燥可以进一步包括：首先，将吴茱萸提取液进行过滤，获得吴茱萸提取液滤液。接下来，利用强酸性阳离子交换 树脂对吴茱萸提取液滤液进行纯化，获得纯化后的吴茱萸提取液。最后，将纯化后的吴茱萸提取液进行干燥。根据本发明的实施例，利用强酸性阳离子交换树脂对吴茱萸提取液滤液进行纯化进一步包括：首先，将吴茱萸提取物滤液减压浓缩，浓缩至50℃测相对密度为1.15-1.25，优选为1.20，调整浓缩液pH值至2-3，静置，离心，上清液用强酸性阳离子交换树脂进行纯化。接着，使用除杂洗脱剂进行除杂。接下来，使用洗脱溶剂进行洗脱，以便获得经过纯化的吴茱萸提取液。根据本发明的实施例，所采用的强酸性阳离子交换树脂的类型并不受特别限制。根据本发明的实施例，可以采用的强酸性阳离子交换树脂为D001、732型、0011型、或D072，其中优选采用732型。根据本发明的具体示例，吴茱萸提取液滤液的上样流速可以为0.5-1.5树脂柱体积/小时，优选1树脂柱体积/小时。根据本发明的具体示例，可以采用的除杂洗脱剂为水，该洗脱剂的洗脱流速可以为1-3树脂柱体积/小时，优选2树脂柱体积/小时。根据本发明的具体示例，可以采用的洗脱溶剂为70％-90％乙醇，该洗脱溶剂的洗脱速度可以为1-3树脂柱体积/小时，优选采用80％乙醇作为洗脱溶剂并且洗脱速度为2树脂柱体积/小时。
根据本发明的实施例，本发明的药物组合物可以进一步包括药学上可接受的辅料，从而可以使得药物组合物能够呈现适于给药的形式。优选本发明的药物组合物可以呈选自软膏剂、凝胶剂、栓剂、外用洗剂、片剂、颗粒剂、口服溶液、胶囊剂、内服膏剂、气雾剂或喷雾剂的至少一种的形式，根据本发明的具体示例，其中临床剂型优选为泡腾片、软膏、栓剂、凝胶剂。由此，可以方便使得本发明的药物组合物适于为对象进行给药。
进一步，本发明的药物组合物，是以有效量的金荞麦和吴茱萸为原料，加入药学上可接受的辅料，按照常规工艺，制成临床可接受的中药制剂，如软膏剂、凝胶剂、栓剂、外用洗剂、片剂、颗粒剂、口服溶液、胶囊剂、内服膏剂、气雾剂或喷雾剂。
根据本发明的实施例，优选金荞麦和吴茱萸的重量比例为0.28～1.67∶1，更优选金荞麦与吴茱萸的重量比例为0.42～1.12∶1，最优选金荞麦与吴茱萸的重量比例为0.69∶1。
进一步，本发明的药物组合物，是以有效量的金荞麦提取物和吴茱萸提取物为原料，加入药学上可接受的辅料，按照常规工艺，制成临床可接受的中药制剂，如软膏 剂、凝胶剂、栓剂、外用洗剂、片剂、颗粒剂、口服溶液、胶囊剂、内服膏剂、气雾剂或喷雾剂。
根据本发明的实施例，优选金荞麦提取物和吴茱萸提取物的重量比例为1～6∶1，更优选金荞麦提取物与吴茱萸提取物的重量比例为1.5～4∶1，最优选金荞麦提取物与吴茱萸提取物的重量比例为2.5∶1。
具体地，根据本发明实施例的药物组合物中的金荞麦提取物和吴茱萸提取物可以分别由以下方法制备。
需要说明的是，在本文中使用的单位“目”，指的是颗粒粒度能够实现通过每平方英寸上具有所限定数目孔的筛子，本领域技术人员可以方便地通过公式：目数×孔径(微米数)＝15000，确定筛的孔径，从而可以确定以微米为单位的颗粒粒度。
其中，金荞麦提取物的制备方法，步骤如下：
(1)备料：将检测合格的金荞麦生药过40-60目筛粉碎，得金荞麦粉；
(2)提取：金荞麦粉用8-12倍量30％-60％的乙醇，50-70℃回流提取2-3次，每次0.5-2小时。提取液合并过滤，60℃减压浓缩至无醇味，加药材重量0.5-1.5倍量的水溶解后，抽滤，备用；
(3)纯化：滤液用已处理合格的大孔吸附树脂分离纯化，上样浓度选择0.02-0.20g/ml，上样流速为0.5-4树脂柱体积/小时，吸附4小时后，先用4-8树脂柱体积的水洗脱除杂，洗脱流速为3-6柱体积/小时，再用60％-90％的乙醇洗脱6-10个柱体积，洗脱流速为1-3柱体积/小时，回收乙醇洗脱部分，50-60℃减压浓缩至干，真空干燥，粉碎，得红棕色粉末即金荞麦提取物。
其中，在步骤(3)中，大孔树脂吸附能力的大小除取决于比表面积外，还与吸附质的分子量和构型有关，只有当孔径对于吸附质足够大时，比表面积才能充分发挥作用。因此，需要综合考虑比表面积和孔径大小不同的大孔树脂分离效果。有大量不同类型的大孔树脂可以从市售获得，从中可以优选出适合金荞麦多酚类物质提取纯化的特定类型。本发明人进行了艰苦的研究，进行对多种不同型号大孔树脂的研究，其中D101、DM-130、HPD-600可以获得显著良好的纯化效果。
吴茱萸提取物的制备方法，步骤如下：
(1)备料：将检测合格的吴茱萸生药粉碎，过40-60目筛，得吴茱萸粉碎料；
(2)提取：加入吴茱萸粉碎料总量8-12倍量的pH值为2-4的盐酸乙醇作为提取溶剂，加热回流提取2-3次，每次1-2小时，过滤，合并滤液，浓缩至50℃测相对密度为1.15-1.25，放冷，得浓缩液，调整浓缩液pH值至2-3，静置，过滤，备用。
(3)纯化：取与药液等体积量的树脂装柱，径高比为1∶10，药液pH值1-3，上样流速0.5-1.5树脂柱体积/小时；上样完毕，吸附1-3小时，用6-9倍体积水，洗至流出液无颜色，洗脱流速为1-3倍树脂体积/小时；收集70％-90％乙醇洗出液至生物碱检查呈阴性(流出液滴加10％硅钨酸无沉淀)，洗脱流速为1-3倍树脂体积/小时，回收乙醇，减压浓缩，真空干燥后，粉碎，得棕色粉末。
其中，在步骤(3)中，吴茱萸的主要成分是吲哚类生物碱，碱性较弱，可以采用强酸性阳离子交换树脂。交联度大的离子交换树脂，交换容量大，但交联网孔小，不利于大离子的进入；交联度小的树脂，交换容量小，但交联网孔大，易于离子的扩散和交换，因此，需要综合考虑交联度不同的强酸性阳离子交换树脂的交换能力。有大量不同类型的阳离子交换树脂可以从市售获得，从中可以优选出适合吴茱萸总生物碱纯化的特定类型。本发明人进行了多种强酸性阳离子交换树脂的研究，型号为D001、732型、0011型、D072的树脂均获得良好的纯化效果。
将金荞麦提取物和吴茱萸提取物混合，并加入药学上可接受的辅料，按照常规工艺，制成临床可接受的中药制剂，如制成软膏剂、凝胶剂、栓剂、泡腾片、外用洗剂、片剂、颗粒剂、口服溶液、胶囊剂、内服膏剂、气雾剂或喷雾剂。
本发明所述组合物优选的制备工艺如下：
金荞麦提取物的制备方法，优选步骤如下：
(1)备料：将检测合格的金荞麦生药过50目筛粉碎，得金荞麦粉；
(2)提取：金荞麦粉用8倍量50％的乙醇，60℃回流提取3次，每次1小时。提取液合并过滤，60℃减压浓缩至无醇味，加药材重量1倍量的水溶解后，抽滤，备用；
(3)纯化：滤液用已处理合格的D101大孔树脂分离纯化，上样浓度选择0.08g/ml，上样流速为2树脂柱体积/小时，吸附4小时后，先用6树脂柱体积的水洗脱除杂，洗脱流速为4树脂柱体积/小时，再用70％的乙醇洗脱8树脂柱体积，洗脱流速为2树脂柱体积/小时，回收乙醇洗脱部分，60℃减压浓缩至干，真空干燥，粉 碎，得红棕色粉末。
吴茱萸提取物的制备方法，优选步骤如下：
(1)备料：将检测合格的吴茱萸生药粉碎，过50目筛，得吴茱萸粉碎料；
(2)提取：加入吴茱萸粉碎料总量10倍量的pH值为3的盐酸乙醇作为提取溶剂，加热回流提取3次，每次1.5小时，过滤，合并滤液，浓缩至50℃测相对密度为1.20，放冷，得浓缩液，调整浓缩液pH值至3，静置，过滤，滤液作为样品纯化备用溶液；
(3)纯化：取与药液等体积量的732型强酸性阳离子交换树脂装柱，径高比为1∶10，药液pH值2，上样流速1树脂体积/小时；上样完毕，吸附2小时，用8倍体积水，洗至流出液无颜色，洗脱流速为2倍树脂体积/小时；收集80％乙醇洗出液至生物碱检查呈阴性(流出液滴加10％硅钨酸无沉淀)，洗脱流速为2倍树脂体积/小时，回收乙醇，减压浓缩，真空干燥后，粉碎，得棕色粉末。
将金荞麦提取物和吴茱萸提取物混合，并且加入药学上可接受的辅料，按照常规工艺，制成临床可接受的中药制剂，如制成软膏剂、凝胶剂、栓剂、泡腾片、外用洗剂、片剂、颗粒剂、口服溶液、胶囊剂、内服膏剂、气雾剂或喷雾剂。
根据本发明的实施例，优选金荞麦提取物和吴茱萸提取物的重量比例为1～6∶1，更优选金荞麦提取物与吴茱萸提取物的重量比例为1.5～4∶1，最优选金荞麦提取物与吴茱萸提取物的重量比例为2.5∶1。
针对不同的剂型及适应症，本发明制剂优选的剂型为软膏剂、栓剂、凝胶剂、泡腾片。
本发明的技术方案所优选的剂型之一为软膏剂，由金荞麦提取物和吴茱萸提取物作为活性成分，其他成分为药用软膏基质辅料。其中辅料可为凡士林、羊毛脂、液体石蜡、石蜡、硬脂酸镁、蜂蜡、肉豆蔻酸异丙酯等软膏基质。
金荞麦吴茱萸软膏的制备方法可以如下：
取白凡士林、蜂蜡、十八醇、单硬脂酸丙二醇酯置于70℃水浴中熔化，将处方量的金荞麦提取物和吴茱萸提取物(过100目筛)和肉豆蔻酸异丙酯混合，搅拌均匀，必要时可置于研钵中研磨均匀，然后缓慢加入其他已熔化好的基质中，边加边搅拌，待完全均匀后，停止加热，继续搅拌至室温，即得。
在上述金荞麦吴茱萸组合物制备方法中，以总重量为100g计，优选的制备方法包括：取白凡士林10～40g、蜂蜡5～20g、十八醇0.5～10g、单硬脂酸丙二醇酯1～5g置于70℃水浴中熔化，将处方量的金荞麦提取物3.5～14g(过100目筛)、吴茱萸提取物1.5g～6g(过100目筛)和肉豆蔻酸异丙酯20～40g混合，搅拌均匀，必要时可置于研钵中研磨均匀，然后缓慢加入其他已熔化好的基质中，边加边搅拌，待完全均匀后，停止加热，继续搅拌至室温，即得。
在上述金荞麦吴茱萸组合物制备方法中，以总重量为100g计，优选的制备方法包括：取白凡士林30g、蜂蜡10g、十八醇5g、单硬脂酸丙二醇酯5g置于70℃水浴中熔化，将处方量的金荞麦提取物9g(过100目筛)、吴茱萸提取物4.5g(过100目筛)和肉豆蔻酸异丙酯35g混合，搅拌均匀，必要时可置于研钵中研磨均匀，然后缓慢加入其他已熔化好的基质中，边加边搅拌，待完全均匀后，停止加热，继续搅拌至室温，即得。
以有效量的金荞麦和吴茱萸提取物作为原料，通过加入药学上可接受的辅料，按照常规工艺，还可以制成其他临床可接受的中药制剂，如制成凝胶剂、栓剂、泡腾片、外用洗剂、片剂、颗粒剂、口服溶液、胶囊剂、内服膏剂、气雾剂或喷雾剂。.
发明人发现，与现有技术相比，根据本发明实施例的由药材提取得到的药物复方制剂，采用了两味中药的新型提取方法，得到的提取物有效成分含量高，使得本发明的制剂易于制备并使制剂质量显著得到提高。根据本发明实施例的药物组合物具有易于实施、实施效果好、提取物纯度高、制剂制备容易、质量可控的特点。
药效学试验表明：根据本发明的实施例的药物组合物对抗二甲苯所致小鼠耳廓肿胀有显著性抑制作用，表明其具有显著抗炎作用，并且组合物的抗炎作用明显高于单独使用其中一种的效果。
根据本发明的实施例的药物组合物对HPV-DNA有明显的破坏作用，无论是单独还是组合其抗HPV病毒作用均要强于200μM阿昔洛韦，其组合相比单独一种药物对于HPV病毒有更强的杀灭作用。
与阳性对照药阿昔洛韦相比，根据本发明的实施例的药物组合物对HPVE7癌基因表达的抑制作用非常明显，进一步表明该组合物可用于治疗HPV感染引起的疾病，如宫颈糜烂、宫颈癌前病变、宫颈癌等宫颈疾病；女阴上皮内瘤变；如扁平疣、寻常 疣、掌跖疣、尖锐湿疣和免疫功能低下引起的传染性软疣等疣病；以及如角化棘皮瘤、日光性角化病、溢脂性角化病等皮肤癌前病变的药物。
金荞麦吴茱萸提取物的组合配比试验显示，当金荞麦提取物和吴茱萸提取物比例在7∶3时，对HPVE7基因的抑制作用最为明显，表明在此配比下对于治疗HPV感染引起的疾病具有最佳疗效。
根据本发明的实施例的药物组合物对宫颈癌HeLa细胞的增殖抑制凋亡作用结果表明，金荞麦吴茱萸组合物可显著抑制宫颈癌Hela细胞的体外增殖，且药物对细胞的抑制效应随着培养时间的延长和药物浓度的增加而增加。流式细胞仪检测表明，根据本发明的实施例的药物组合物处理后人宫颈癌HeLa细胞凋亡率明显增高，并且具有明显的时间和药物浓度依赖。
根据本发明的实施例的药物组合物对宫颈癌前病变(CIN)小鼠宫颈组织PCNA、EGFR和bcl-2表达的影响试验表明，根据本发明的实施例的药物组合物通过抑制增殖因子PCNA、EGFR和bcl-2的表达而起到抑制宫颈上皮异型细胞增生作用，与模型组相比具有显著差异，提示根据本发明的实施例的药物组合物对于治疗宫颈癌前病变的极大潜力。
组合物刺激性试验表明，低剂量和正常剂量多次连续给药对家兔完整皮肤和破损皮肤无刺激性，高剂量组对家兔破损皮肤有轻微刺激性，停药后刺激反应很快消失，表明根据本发明的实施例的药物组合物不会对药物制剂的正常使用造成影响，即使在高剂量下对家兔皮肤的刺激反应是轻微的，可逆的。
本发明进行的急性毒性试验表明金荞麦提取物、吴茱萸提取物及其二者组合物的小鼠灌胃给药剂量相当于成人日正常给药剂量500倍的条件下，仅出现轻微体征反应，而且只持续了短短两天后即恢复正常，解剖主要脏器未见病变，表明该组合药物使用安全，可以安全有效地治疗HPV感染引起的疾病。
发明人进一步发现，应用本发明方法制备得到的药物组合物对于同是由于HPV感染引起的宫颈疾病如宫颈糜烂、宫颈癌前病变、宫颈癌；由HPV感染引起的女阴上皮内瘤变；以及由HPV感染引起的疣病，如扁平疣、寻常疣、掌跖疣、尖锐湿疣和免疫功能低下引起的传染性软疣；以及由HPV感染引起的皮肤癌前病变如角化棘皮瘤、日光性角化病、溢脂性角化病均具有非常好的疗效，安全性高。同时采用本发 明制备方法得到的药物有效成分含量高，使得本发明的制剂易于制备并使制剂的工艺、质量可控性大大提高，同时工艺简单，无污染，工业化可操作性强。本发明所述的药物或药物组合物可单独应用于患者，还可以与手术、物理治疗联合使用。给药的剂量一般由医师根据患者的具体情况(如年龄、性别、患病时间、患处病变程度、身体状况等)确定。
需要说明的是，根据本发明实施例的金荞麦提取物和吴茱萸提取物的提取纯化工艺是经过大量试验摸索得出，尤其是对可能影响吴茱萸生物碱提取的关键点进行了控制，根据吴茱萸所含化学成分，吴茱萸所含生物碱为吲哚类弱碱性生物碱，用酸性醇溶液提高生物碱类物质的提取得率，并在酸性水溶条件下除去大部分杂质，减少后续去杂工序，732型强酸性阳离子交换树脂进一步去杂。工艺简单易操作，所提取生物碱含量高。
由此，根据本发明的又一方面，本发明提供了根据本发明实施例的药物组合物在制备药物中的用途，该药物可以用于抑制HPV E7基因的表达。此外，发明人惊奇地发现，本发明的药物能够用于治疗炎症。根据本发明的一些具体示例，本发明的药物能够用于治疗由HPV感染引起的宫颈疾病、女阴上皮内瘤变、疣病以及皮肤癌前病变。根据本发明的一个实施例，本发明的药物能够用于治疗或预防宫颈癌或宫颈癌前病变。根据本发明的另一个实施例，本发明的药物能够用于治疗或预防尖锐湿疣。具体地，本发明的药物能够用于由HPV感染引起的，如宫颈糜烂、宫颈癌前病变、宫颈癌等宫颈疾病；由HPV感染引起的女阴上皮内瘤变；以及由HPV感染引起的如扁平疣、寻常疣、掌跖疣、尖锐湿疣和免疫功能低下引起的传染性软疣等疣病；以及由HPV感染引起的，如角化棘皮瘤、日光性角化病、溢脂性角化病等皮肤癌前病变。
根据本发明的再一方面，本发明提供了一种制备药物的方法。根据本发明的实施例，该方法包括下列步骤：制备金荞麦提取物；制备吴茱萸提取物；以及将金荞麦提取物和吴茱萸提取物按照预定的重量比率进行混合，以便得到药物，其中，制备金荞麦提取物进一步包括下列步骤：将金荞麦进行加醇提取，以便获得金荞麦提取液；以及将金荞麦提取液进行纯化、干燥，以便获得金荞麦提取物。制备吴茱萸提取物进一步包括下列步骤：将吴茱萸进行加醇提取，以便获得吴茱萸提取液；以及将吴茱萸提取液进行纯化、干燥，以便获得吴茱萸提取物。关于金荞麦提取物和吴茱萸提取物的 制备方法，前面已经进行了详细描述，不再赘述。利用上述制备药物的方法所得到的药物，能够有效地治疗和预防HPV感染引起的疾病，能够对感染HPV的患者进行有效地治疗。
根据本发明的实施例，本发明制备的药物可以用于抑制HPV E7基因的表达。此外，发明人惊奇地发现，本发明的药物能够用于治疗炎症。根据本发明的一些具体示例，本发明的药物能够用于治疗由HPV感染引起的宫颈疾病、女阴上皮内瘤变、疣病以及皮肤癌前病变。根据本发明的一个实施例，本发明的药物能够用于治疗或预防宫颈癌或宫颈癌前病变。根据本发明的另一个实施例，本发明的药物能够用于治疗或预防尖锐湿疣。具体地，本发明的药物能够用于由HPV感染引起的，如宫颈糜烂、宫颈癌前病变、宫颈癌等宫颈疾病；由HPV感染引起的女阴上皮内瘤变；以及由HPV感染引起的如扁平疣、寻常疣、掌跖疣、尖锐湿疣和免疫功能低下引起的传染性软疣等疣病；以及由HPV感染引起的，如角化棘皮瘤、日光性角化病、溢脂性角化病等皮肤癌前病变。
根据本发明的又一方面，本发明还提供了一种药物，其是通过上述制备药物的方法制备的。如前所述，利用该药物，能够有效地治疗和预防HPV感染引起的疾病，能够对感染HPV的患者进行有效地治疗。另外，发明人发现，该药物还可以有效地抑制E7基因的表达。此外，发明人惊奇地发现，该药物能够治疗炎症。
根据本发明的另一方面，本发明还提供了一种对根据本发明实施例的药物组合物或药物进行检测的方法。根据本发明的实施例，该方法包括：确定药物组合物或药物中的有效成分含量；以及将该有效成分含量与预定的阈值进行比较。在本文中所使用的术语“有效成分”是指这样一种化合物，该化合物的含量可以有效地反映药物组合物或者药物的有效性。根据本发明的一个实施例，有效成分为选自表儿茶素、吴茱萸碱和吴茱萸次碱的至少一种。
利用根据本发明实施例的对本发明的药物组合物或药物进行检测的方法，能够有效地对药物组合物或药物进行检测，并且检测灵敏度、准确性高，稳定性好。
根据本发明的实施例，在该方法中，针对金荞麦提取物，其有效成分为表儿茶素，阈值为至少0.57mg。根据本发明的实施例，在该方法中，针对吴茱萸提取物，其有效成分为吴茱萸碱和吴茱萸次碱，阈值为至少4.7mg。
根据本发明的实施例，在该方法中，当有效成分为表儿茶素时，确定药物组合物或药物中的有效成分含量可以进一步包括：将药物组合物或药物用由氯仿、甲醇和冰醋酸组成的提取剂进行超声提取；将提取液挥发干燥，并用甲醇溶解残渣，以便获得含有表儿茶素的甲醇溶液；以及通过高效液相色谱分析，确定该含有表儿茶素的甲醇溶液中的表儿茶素含量。由此，能够方便有效地确定药物组合物或药物中的表儿茶素含量。
根据本发明的实施例，在该方法中，当有效成分为吴茱萸碱和吴茱萸次碱时，确定药物组合物或药物中的有效成分含量进一步包括：将药物组合物或药物用由氯仿、甲醇和氨水组成的提取剂进行超声提取；将提取液挥发干燥，并用甲醇溶解残渣，以便获得含有吴茱萸碱和吴茱萸次碱的甲醇溶液；以及通过高效液相色谱分析，确定所述含有吴茱萸碱和吴茱萸次碱的甲醇溶液中吴茱萸碱和吴茱萸次碱的总含量。
根据本发明的具体实施例，对本发明的药物组合物或药物进行检测的方法可以包括如下：
(1)取本药物组合物制剂0.5g，加无水乙醇10ml，水浴加热至熔化，超声处理30分钟，滤过，取滤液作为供试品溶液。另取金荞麦对照品2g，加无水乙醇20ml，超声提取60分钟，过滤，滤液浓缩至5ml，作为对照品溶液。吸取供试品滤液20μl点于硅胶G薄层板上，吸取10μl对照品溶液点于同一硅胶G薄层板上，经展开，取出，晾干。
展开剂：三氯甲烷-甲醇-乙酸(13∶4∶2.5)
显色剂：喷以5％的香草醛-浓硫酸显色剂，105℃加热显色至斑点清晰
结论：在供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显示相同颜色的斑点。
(2)取本药物组合物制剂0.5g，加无水乙醇10ml，水浴加热至熔化，超声处理30分钟，滤过，取滤液作为供试品溶液。另取吴茱萸碱对照品、吴茱萸次碱对照品，加无水乙醇分别制成每1ml含0.2mg和1.5mg的溶液，作为对照品溶液。吸取供试品滤液20μl点于硅胶G薄层板上，吸取10μl对照品点于同一硅胶G薄层板上，经展开，取出，晾干。
展开剂：以氯仿∶甲醇∶氨水饱和(10∶1∶0.5)
显色剂：置紫外光灯(365nm)下检视。
结论：在供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显示相同颜色的荧光斑点。
(3)表儿茶素的含量测定：
分别制备供试品溶液和对照品溶液，用高效液相色谱法测定；对照品为表儿茶素；色谱条件与系统适用性试验：5μm，250mm×4.6mm，Dikma C18色谱柱，流动相：乙腈-0.1％柠檬酸水溶液(13∶87)，流速：1ml/min，检测波长：279nm，柱温：25℃，理论塔板数按表儿茶素计算不低于5000，表儿茶素峰与相近峰的分离度R大于1.5。
其中对照品溶液的制备：精密称取以五氧化二磷为干燥剂减压干燥24小时的表儿茶素对照品适量，加甲醇制成每1ml含241.8μg的对照品溶液。
其中供试品溶液制备：称取本药物组合物制剂约0.2g，精密称定，置于具塞锥形瓶中，加入25ml(氯仿-甲醇：1∶5.5)和0.5ml冰乙酸，密塞，称定重量，超声提取45min，放冷，摇匀，再称定重量，甲醇补足减失的重量，过滤，取滤液5ml，挥干，残渣加适量甲醇超声溶解，转溶至10ml量瓶中，甲醇稀释至刻度，摇匀，过0.22μm滤膜，取续滤液，即得。
测定法：分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10μl，注入液相色谱仪，测定，即得。药物组合物含金荞麦以表儿茶素(C15H14O6)计，每1克不得少于0.57mg。
(4)吴茱萸碱、吴茱萸次碱的含量测定：
分别制备供试品溶液和对照品溶液，用高效液相色谱法测定；对照品为吴茱萸碱、吴茱萸次碱；色谱条件与系统适用性试验：以Nucleosil 5C18柱(250mm×4.6mm，5μm，Phenamenex，USA)为色谱柱，流动相：乙腈-甲醇-磷酸(73∶27∶0.3)，流速：1ml/min，检测波长：225nm，柱温为室温，理论板数按吴茱萸碱峰计算，应不低于3000。
其中对照品溶液制备：精密称取以五氧化二磷为干燥剂减压干燥24小时的吴茱萸碱、吴茱萸次碱对照品适量，加甲醇制成每1ml含吴茱萸碱129μg、吴茱萸次碱145μg的对照品溶液。
其中供试品溶液制备：称取本药物组合物制剂约0.2g，精密称定，置于具塞锥形瓶中，加入25ml氯仿-甲醇(4∶1)和0.5ml氨水，密塞，称定重量，超声提取45min，放冷，摇匀，再称定重量，氯仿补足减失的重量，过滤，取滤液5ml，挥干，残渣加适量甲醇超声溶解，转溶至10ml量瓶中，甲醇稀释至刻度，摇匀，过0.22μm滤膜， 取续滤液，即得。
测定法：分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10μl，注入液相色谱仪，测定，即得。药物组合物含吴茱萸以吴茱萸碱(C19H17N3O)和吴茱萸次碱(C18H13N3O)的总量计，每1克不得少于4.7mg。
根据本发明的实施例，HPLC(高效液相色谱)方法灵敏度高，准确性高，稳定性好，优于其他测定方法，也不同于绝大多数中药只对有效部位群进行控制而实际可控性差的现状。
为了便于理解，以下将通过具体实施例对本发明进行描述。需要特别指出的是，这些描述仅仅是示例性的描述，并不构成对本发明范围的限制。
具体实施方式
下面详细描述本发明的实施例。下面描述的实施例是示例性的，仅用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。
实施例1金荞麦提取工艺过程
将金荞麦生药粉碎，过50目筛，得金荞麦粗粉料；取2kg金荞麦粗粉料加入10倍量(重量比，下同)的50％的乙醇溶液中，60℃加热回流2次，每次1.5h，合并滤液，过滤，滤液60℃减压浓缩至无醇味后，加适量2.1kg水溶解后，抽滤，备用。取预处理过的D-101大孔树脂装柱，药液上样流速为2树脂柱体积/小时，吸附4小时，先用6个柱体积的水洗脱除杂，除杂流速为4树脂柱体积/小时，再用70％乙醇洗脱8个柱体积，洗脱流速为2树脂柱体积/小时，回收乙醇洗脱部分，60℃减压浓缩至干，真空干燥，粉碎，得180g金荞麦提取物。
实施例2吴茱萸提取工艺过程
将吴茱萸生药粉碎，过50目筛，得吴茱萸粗粉料；将6kg吴茱萸粗粉加入10倍量的pH值为3的盐酸乙醇(醇浓度为80％)溶液，加热回流3次，每次1.5h，过滤，合并滤液，浓缩至50℃测相对密度为1.20，放冷，得浓缩液，调整浓缩液pH值至2，静置，离心，得上清液4000ml，备用。取4000ml的732强酸型阳离子交换树 脂，装柱，径高比约为1∶10，药液上柱吸附流速1树脂柱体积/小时，上样完毕，吸附2小时，用8倍体积水，洗至流出液无颜色，洗脱流速为2树脂柱体积/小时；收集80％乙醇洗出液至生物碱检查呈阴性(流出液滴加10％硅钨酸无沉淀)，洗脱流速为2树脂柱体积/小时，回收乙醇，减压浓缩，真空干燥后，得吴茱萸提取物150g。以下是具体试验证明本发明药物组合物效果的实施例：
实施例3比较本发明药物组合物与两种药物成分单独使用时的抗炎效果
一、动物及材料
(一)动物
1、种属：昆明小鼠，由武汉大学医学院实验动物中心提供，动物合格证号：19-013；
2、体重：18-22g；
3、性别：雌雄各半；
4、年龄：成年健康；
5、动物数：60只。
(二)受试物
1、受试物：金荞麦提取物(根据实施例1制备)、吴茱萸提取物(根据实施例2制备)、将金荞麦提取物(根据实施例1制备)和吴茱萸提取物(根据实施例2制备)按1∶1的重量比均匀混合制备成的药物组合物；以阿司匹林为阳性对照药。
2、含量：低、中、高三个提取物组合物含量分别为25mg/ml、50mg/ml、100mg/ml，单独药物组(即仅金荞麦体提取物或者仅吴茱萸提取物)含量为50mg/ml。
(三)给药途径
将用0.5％CMC-Na溶解的药物直接涂抹于受试小鼠的耳朵。
二、试验方法
将动物分为6组，每组昆明小鼠10只，共60只。一组为空白对照组(给不含药物的0.5％CMC-Na)，五组为试验组(三个高中低不同剂量组、两个单独药物组)。用二甲苯50微升/只，涂于小鼠左耳处致炎，30分钟后右耳再分别涂以不含药物的空白基质，高中低3个剂量本发明制剂、以及2个单独药物制剂，给药量为0.2ml/10g。隔2小时后脱颈椎处死，剪下每只小鼠左右两耳廓，用直径8mm打孔器在双耳对称处取下两耳片，用分析天平称重，以右耳减去左耳片重为右耳肿胀度，分别计算肿胀 抑制率，各药物组与对照组比较，结果见表1：
表1各组药物对二甲苯诱致鼠耳廓的肿胀作用结果
*与空白对照组比较P＜0.05
三、试验结果评价
结果表明，本发明的高、中、低剂量组均能明显对抗二甲苯所致小鼠耳廓肿胀，与对照组比较差异有显著性(P＜0.05)，有较强抗炎作用，并且组合物的抗炎作用明显高于单独使用其中一种的效果。
为了说明本发明的金荞麦提取物和吴茱萸提取物抗HPV作用，及将二者组合之后对抗HPV具有增强作用，本发明提供了以下试验：
实施例4金荞麦、吴茱萸提取物及其组合对HeLa细胞HPV18型E7基因表达的影响
一、材料
试验细胞株：取对数生长期HeLa细胞，以1×106个/ml的密度接种于六孔板中，每孔1ml，于37℃下，5％CO2，饱和湿度条件下培养24h，作为实验细胞株。
受试药物：金荞麦提取物(根据实施例1制备)、吴茱萸提取物(根据实施例2制备)、药物组合物(将金荞麦提取物、吴茱萸提取物分别配置成母液，然后将母液按7∶3比例进行混合制备成药物组合物)；
阳性药物：注射用阿昔洛韦(湖北潜江制药有限公司，批号110106)。
二、实验方法
实验分为5组，分别为金荞麦提取物、吴茱萸提取物、金荞麦吴茱萸组合物，每 组实验设4个浓度梯度，还有两组为阿昔洛韦作阳性对照、空白对照(为不给药的Hela细胞)。向培养24h的Hela细胞中分别加入细胞毒作用低于5％的不同浓度的受试物继续培养72h，加药浓度如表2所示，然后应用实时荧光定量PCR法对各组E7基因相对表达量进行检测。
表2受试物加药浓度(mg/ml)
| P | A | B | C | D | |
| 金荞麦提取物 | 25μM | 0.05 | 0.1 | 0.2 | 0.4 |
| 吴茱萸提取物 | 25μM | 0.05 | 0.1 | 0.2 | 0.4 |
| 组合物 | 50μM | 0.05+0.05 | 0.1+0.1 | 0.2+0.2 | 0.4+0.4 |
注：P为阳性对照药组
三、试验结果评价
各组分别加入不同浓度的受试物，培养72h，然后应用实时荧光定量PCR法对各组E7基因相对表达量进行检测，结果如下表。
表3受试药HeLa细胞各组E7基因相对表达量(n＝3)
注：与正常对照组相比，*为p＜0.05，**为p＜0.01。
不同浓度的金荞麦、吴茱萸提取物作用于HeLa细胞72h后，细胞内E7基因相对表达量与正常对照组相比有降低的趋势，其中B、C、D三组浓度组与正常对照组相比有显著性差异，且呈浓度依赖关系。同时试验结果表明，相同浓度梯度的金荞麦吴茱萸组合物作用细胞72h后，细胞内E7基因的相对表达量明显低于单独给药作用72h后的E7基因的相对表达量，表明将金荞麦和吴茱萸提取物进行组合具有显著的 协同效应。HPV的E7基因表达的蛋白有多种重要功能与病毒的致病机制密切相关，包括结合和降解P53蛋白及pRb蛋白，从而导致细胞周期的紊乱。众多药物已经用于治疗由HPV引起的疾病，如CA和CIN等，但疗效不一，而疗效不一的分子基础尚未确定。有研究已经发现在某些药物治疗无效者中，病毒转化基因的表达尤其是E7基因的表达明显高于药物治疗有效者。本试验的研究结果表明与阳性对照药相比，本发明金荞麦和吴茱萸进行组合以后对E7基因表达的抑制作用非常明显，也进一步表明了该组合物可用于治疗HPV感染引起的疾病。
实施例5金荞麦、吴茱萸提取物体外抗HPV活性最佳配比
一、材料
试验细胞株：取对数生长期HeLa细胞，以1×106个/ml的密度接种于六孔板中，每孔1ml，于37℃下，5％CO2，饱和湿度条件下培养24h，作为实验细胞株。
受试药物：金荞麦提取物(根据实施例1制备)、吴茱萸提取物(根据实施例2制备)组成的不同配比的药物组合物药液；阳性药物：注射用阿昔洛韦(湖北潜江制药有限公司，批号110106)。
二、实验方法
向培养24h的Hela细胞中分别加入细胞毒作用低于5％的不同浓度的受试药物继续培养72h，药物比例如下表所示，以β-actin(肌动蛋白)比例为内参对照基因，应用SYBR荧光探针，应用实时荧光定量PCR法对各组E7基因相对表达量进行检测。设阿昔洛韦作阳性对照，空白对照，实验各组加药浓度如表4所示。
表4最佳配比实验各组加药浓度(μg/ml)
| A | B | C | D | E | F | G | H | I | |
| 金荞麦 | 90 | 80 | 75 | 60 | 50 | 40 | 20 | 20 | 15 |
| 吴茱萸 | 15 | 20 | 20 | 40 | 50 | 60 | 75 | 80 | 90 |
| 比例 | 6∶1 | 4∶1 | 2.5∶1 | 1.5∶1 | 1∶1 | 1∶1.5 | 1∶2.5 | 1∶4 | 1∶6 |
三、实验结果评价
各组分别加入不同比例的受试药物，培养72h，然后应用实时荧光定量PCR法对各组E7基因相对表达量进行检测，结果如下表5。
表5不同配比金荞麦吴茱萸提取物对E7基因相对表达量的影响(n＝3***)
| 组别 | 比例 | 基因表达(Mean±S) | 抑制率(％) |
| 空白 | - | 1.735±0.864 | - |
| A | 6∶1 | 0.434±0.092** | 74.985 |
| B | 4∶1 | 0.301±0.118** | 82.651 |
| C | 2.5∶1 | 0.273±0.169** | 84.265 |
| D | 1.5∶1 | 0.315±0.026** | 81.844 |
| E | 1∶1 | 0.641±0.138** | 63.055 |
| F | 1∶1.5 | 0.869±0.106* | 49.914 |
| G | 1∶2.5 | 0.890±0.214* | 48.703 |
| H | 1∶4 | 1.192±0.069 | 31.297 |
| I | 1∶6 | 1.257±0.377 | 27.550 |
注：*与正常对照组相比，p＜0.05；
**与正常对照组相比，p＜0.01；
***n＝3，代表每组均做了3个数据值出来，举例说明：如E组的值0.641±0.138，0.641是这3个数据的平均值，0.138是由这3个值算出来的S值(标准偏差)。
表5的数据，显示了不同配比的金荞麦和吴茱萸提取物药物组合物作用于HeLa细胞72h后，对细胞内HPV E7基因的相对表达量的影响。
由表5可见，不同配比的金荞麦和吴茱萸提取物药物组合作用于HeLa细胞72h后，细胞内E7基因的相对表达量与正常对照组相比均有降低的趋势；随着吴茱萸提取物在药物组合物中比例的升高，E7基因的相对表达量呈逐渐降低的趋势，当金荞麦和吴茱萸提取物的比例分别在6∶1、 4∶1、2.5∶1、1.5∶1、1∶1时，对E7基因的相对表达抑制作用显著，抑制率最高达到84.265％，但4∶1、2.5∶1、1.5∶1这三种比例的药物组合物对E7基因的相对表达抑制率接近。当吴茱萸提取物的比例继续升高，使得药物组合物中金荞麦吴茱萸提取物比例为1∶1.5时，其对E7基因的相对表达抑制率降低。当金荞麦和吴茱萸比例在2.5∶1时，作用于HeLa细胞72h后，其对HeLa细胞E7基因的抑制作用最显著。
实施例6组合物与两种药物成分单独使用时对体尖锐湿疣皮损的HPV-DNA的影响
一、材料
尖锐湿疣混悬液的制备：采集来自于尖锐湿疣患者外阴部位典型新鲜的疣体标本(经鉴定为HPV6/11型)，精确称其重量后，加少量生理盐水，匀浆器匀浆，制成疣体混悬液，然后分别提取HPV-DNA，用荧光定量聚合酶链反应(FQ-PCR)仪扩增HPV-DNA，根据扩增结果，选取细胞密度为106个/ml时的尖锐湿疣混悬液，备用。
受试药物：金荞麦提取物(根据实施例1制备)、吴茱萸提取物(根据实施例2制备)、将金荞麦提取物(根据实施例1制备)和吴茱萸提取物(根据实施例2制备)按2.5∶1的重量比均匀混合制备成的药物组合物。
二、试验方法
样品作用疣体的方法：取本发明组合物、两种单独药物提取物(组合物设置三个药物浓度组1mg/ml、2mg/ml、4mg/ml)分别和CA混悬液各50ul至96孔板，轻摇均匀，置于37℃水浴箱培养。实验组共设置5组，设200μM阿昔洛韦作阳性对照，生理盐水为空白对照，分别在样品作用疣体2，4，6d后检测。检测方法我们采用荧光定量聚合酶链反应(FQ-PCR)技术。
三、试验结果评价
实验结果见表6。
表6受试药物对离体尖锐湿疣皮损的HPV-DNA的影响
表中数据表示HPV病毒经各样品作用后，FQ-PCR检测所测得的DNA数值，“-”为检测结果阴性，病毒DNA被破坏而扩增受到抑制；阳性结果以DNA扩增的定量对数平均值表示(单位为“拷贝/ml定)，病毒没受到破坏，其DNA大量扩增。
本研究采用FQ-PCR技术从组合物、单独药物、药物浓度及作用时间四方面观察不同样品对离体尖锐湿疣组织中HPV-DNA的影响，结果显示金荞麦和吴茱萸提取物成分对HPV-DNA有明显的破坏作用，而对金荞麦和吴茱萸提取物进行组合之后，发现其组合对于HPV病毒有更强的杀灭作用，两种提取物无论是单独还是组合其抗HPV病毒作用均要强于200μM阿昔洛韦。该试验研究结果为进一步研究金荞麦吴茱萸组合物抗HPV病毒作用提供了科学依据。
实施例7金荞麦吴茱萸组合物对宫颈癌HeLa细胞的增殖抑制作用
一、材料
试验细胞株：人宫颈癌细胞株HeLa细胞(中国医学科学院肿瘤医院惠赠)。
受试药物：金荞麦提取物(根据实施例1制备)、吴茱萸提取物(根据实施例2制备)
二、实验方法
细胞增殖抑制实验：取对数生长期HeLa细胞，以1X106个细胞/ml的密度接种于六孔板中，每孔1ml，37ml，5％CO2，饱和湿度条件下培养24h。加入不同浓度的金荞麦吴茱萸提取物(具体见表7)，对照组仅加生理盐水。分别培养24h、48h、72h后，加入5mg/ml的MTT 20微升，37℃孵育4h，弃上清，每孔加入200微升DMSO，振荡，使结晶溶解，用酶标仪检测570nm处吸光度(OD)值，并计算细胞生长抑制率，公式如下：细胞生长抑制率＝(1-药物处理组OD均值/空白对照组OD均值)×100％。
流式细胞仪检测细胞凋亡率：收集不同浓度(具体见表8)金荞麦吴茱萸提取物处理不同时间(24h，48h，72h)后的细胞，EDTA消化，收集1×106个细胞，1000r/min离心5min，弃上清，用4℃预冷的PBS洗细胞，1000r/min离心5min弃上清，共2次。用250μl结合缓冲液重新悬浮细胞。取100μl细胞悬浮于5ml流式管中，加入5μlAnnexin V/FITC(AnnexinV是一种分子量为35-36kD的钙离子依赖性磷脂结合蛋白，能与细胞凋亡过程中翻转到膜外的PS高亲和力特异性结合，Annexin V常被作为检 测细胞早期凋亡的灵敏指标之一，用带有绿色荧光的荧光探针FITC标记的Annexin V，即Annexin V-FITC)和10μl 20mg/L的PI(碘化丙啶)，混匀后避光孵育15min，在反应管中加400μlPBS，流式细胞仪(FCM)分析凋亡。
三、试验结果
细胞增殖抑制实验：试验结果表明不同浓度的金荞麦和吴茱萸组合物作用于HeLa细胞，从24h到72h，药物处理组与空白对照组比较，宫颈癌Hela细胞的体外增殖抑制率均有降低的趋势。在试验设计的浓度范围内，72h处理最高抑制率到达了82.7％，与阳性药物阿昔洛韦(200μM)相比，其抑制率介于本发明组合物5mg/ml-10mg/ml二者之间，72h抑制率为67.7％。研究表明，金荞麦和吴茱萸组合物可显著抑制宫颈癌Hela细胞的体外增殖，且药物对细胞的抑制效应随着培养时间的延长和药物浓度的增加而增加，表明金荞麦和吴茱萸组合物对人宫颈癌Hela细胞的增殖有抑制作用，并且具有明显的时间和剂量依赖性。
表7不同浓度的金荞麦吴茱萸组合物对宫颈癌HeLa细胞增殖的影响
与对照组比较，*p＜0.05，**p＜0.01
对宫颈癌Hela细胞凋亡率的影响：流式细胞仪检测表明，金荞麦和吴茱萸组合物诱导人宫颈癌HeLa细胞凋亡作用24、48、72h后，凋亡率明显增高，并且具有明显的药物浓度依赖性，随着金荞麦和吴茱萸组合物作用时间延长，凋亡率明显增高。与对照组相比具有显著差异性(P＜0.01)，第4组浓度组合对HeLa细胞凋亡的影响已经与阳性药物阿昔洛韦相当，具体结果表8。
表8不同浓度的金荞麦吴茱萸组合物对HeLa细胞凋亡的影响
与对照组比较，*p＜0.05，**p＜0.01
实施例8金荞麦吴茱萸组合物对宫颈癌前病变(CIN)小鼠宫颈组织PCNA、EGFR和bcl-2表达的影响
一、材料
(一)动物
1、种属：昆明小鼠，由武汉大学医学院实验动物中心提供，动物合格证号：19-013；
2、体重：30±2g；
3、性别：雌性；
4、年龄：成年健康；
5、动物数：40只。
(二)受试物
1、受试物：金荞麦吴茱萸凝胶(根据实施例13制备)、保妇康凝胶，国药准字Z20060455，武汉中联集团四药药业有限公司生产。
2、含量：15％载药量(载药量为金荞麦提取物与吴茱萸提取物的重量占凝胶总重的百分比)。
二、方法
动物造模方法致癌剂棉线的制备：用苯溶剂溶解化学致癌剂二甲基苯并蒽(DMBA)，得到DMBA溶液，将棉线浸入该溶液内，置于通风橱内待苯挥发后，计算棉线的含药量为0.5mg/cm。
取雌性小鼠，在动物不麻醉状态下，借助阴道扩张器及小号弯针，将浸药棉线穿入宫颈，经宫颈口由穹隆部穿出，线结固定于宫颈口。关于该技术的详细内容可以参见施新猷.现代医学实验动物学[M].北京：人民军医出版社.2000：438，通过参照并入本文。
将实验动物小鼠随机分为4组，每组各10只，分别标记为：空白组(正常小鼠)、模型组(按照2.1动物造模方法所得到、并且没有用药物进行处理的小鼠)、治疗组和对照治疗组。其中治疗组：给予金荞麦吴茱萸凝胶(按20mg/kg)，隔日外用1次；对照治疗组：给予保妇康凝胶(按35mg/kg)，隔日外用1次。将上述4组小鼠进行5个月的常规喂养后，通过颈椎脱臼将其处死，剖取小鼠宫颈，保存标本以供光镜观察。
免疫组织化学检测方法：
将各组小鼠的宫颈组织浸入4％多聚甲醛溶液进行固定，接着依次经过脱水、透明、浸蜡和包埋处理，接下来将所得的每个蜡块进行连续切片，各取3张切片(切片厚度5μm)，然后分别选用PCNA、EGFR和bcl-2三种抗体，利用链霉菌抗生物素蛋白-过氧化物酶连结法(S-P法)将上述各组的切片进行免疫组织化学染色，二氨基联苯胺(DAB)显色和显微镜观察。
三、试验结果
3.1小鼠宫颈组织增殖细胞核抗原(PCNA)表达水平比较
采用半定量方法对前面所述的切片进行检测，以便比较各组小鼠宫颈组织增殖细胞核抗原(PCNA)的表达水平。其中，细胞核被染成棕黄色定为阳性结果。然后，基于每张切片阳性反应颗粒的颜色深浅和占细胞总数的比例，按照下列标准，对各张切片的进行统计：
阴性(-)：无或偶见阳性颗粒，颜色呈浅黄色；
弱阳性(+)：阳性颗粒少于1/3，颜色呈淡棕黄色；
中度阳性(++)：阳性颗粒介于1/3～2/3之间，颜色介于+～+++之间；
强阳性(+++)：阳性颗粒多于2/3，颜色呈棕黄色。
根据统计结果，对各张切片进行评分，其中(-)：1分；(+)：2分；(++)：3分；(+++)：4分。每张切片观察3个视野。
结果显示：PCNA主要在细胞核上表达。模型组PCNA表达呈强阳性，与空白组相比有极显著性差异(P＜0.01)；治疗组与模型组比较有极显著性差异(P＜0.01)；对照治疗组与模型组比较无显著性差异(P＞0.05)，结果见表9。
表9各组小鼠宫颈组织PCNA表达水平比较
| 组别 | n | - | + | ++ | +++ | 阳性评分 |
| 空白组 | 10 | 10 | 0 | 0 | 0 | 10 |
| 模型组 | 8 | 0 | 0 | 2 | 6 | 30△ |
| 治疗组 | 10 | 5 | 4 | 1 | 0 | 16* |
| 对照治疗组 | 9 | 1 | 2 | 3 | 3 | 26 |
与空白组比较ΔP＜0.01；与模型组比较*P＜0.01
本研究结果表明，模型组小鼠宫颈组织PCNA表达强烈，颜色很深，试验过程中有2只动物出现死亡，余下动物定量评分为30分，而治疗组仅有较少例数染色程度相对较弱的PCNA阳性表达，定量评分为16分，二者相比有极显著性差异(P＜0.01)，表明金荞麦吴茱萸凝胶是通过抑制增殖因子的表达而起到抑制宫颈上皮异型细胞增生作用。
3.2小鼠宫颈组织表皮生长因子(EGFR)表达水平比较
采用半定量方法对前面所述的切片进行检测，以便比较各组小鼠宫颈组织表皮生长因子(EGFR)的表达水平。其中，细胞膜/浆被染成棕黄色定为阳性结果。然后，基于每张切片阳性反应颗粒的颜色深浅和占细胞总数的比例，按照与上述PCNA检测中相同的标准，对各张切片进行统计。
结果显示：EGFR主要在细胞膜及细胞浆上表达，且以细胞膜为主。模型组EGFR表达呈强阳性，与空白组相比有极显著性差异(P＜0.01)；治疗组与模型组比较有极显著性差异(P＜0.01)；对照治疗组与模型组比较无显著性差异(P＞0.05)，结果见表10。
表10各组小鼠宫颈组织EGFR表达水平比较
| 组别 | n | - | + | ++ | +++ | 阳性评分 |
| 空白组 | 10 | 8 | 2 | 0 | 0 | 12 |
| 模型组 | 10 | 1 | 0 | 4 | 5 | 33△ |
| 治疗组 | 10 | 8 | 1 | 1 | 0 | 13* |
| 对照治疗组 | 9 | 2 | 1 | 3 | 3 | 25 |
注：△与空白组比较，P＜0.01；
*与模型组比较，P＜0.01。
本研究结果表明，模型组小鼠宫颈组织EGFR表达强烈，颜色很深，动物定量评分为30分，而治疗组仅有较少例数染色程度相对较弱的EGFR阳性表达，定量评分为13分，二者相比有极显著性差异(P＜0.01)，说明金荞麦吴茱萸凝胶能够抑制EGFR的表达，进而抑制宫颈上皮异型细胞的增生。
3.3小鼠宫颈组织细胞凋亡抑制基因bcl-2表达水平比较
采用半定量方法对前面所述的切片进行检测，以便比较各组小鼠宫颈组织细胞凋亡抑制基因bcl-2的表达水平。其中，细胞膜/浆被染成棕黄色定为阳性结果。基于每张切片阳性反应颗粒的颜色深浅和占细胞总数的比例，按照与上述PCNA检测中相同的标准，对各张切片进行统计。
结果显示：bcl-2主要在细胞膜及细胞浆上表达，且以细胞膜为主。模型组bcl-2表达与空白组相比有极显著性差异(P＜0.01)；治疗组与模型组比较有显著性差异(P＜0.01)；对照治疗组与模型组比较，无显著性差异(P＞0.05)。结果见表11。
表11各组小鼠宫颈组织bcl-2表达水平比较
| 组别 | n | - | + | ++ | +++ | 阳性评分 |
| 空白组 | 10 | 8 | 2 | 0 | 0 | 12 |
| 模型组 | 8 | 1 | 1 | 1 | 5 | 26△ |
| 治疗组 | 10 | 7 | 3 | 0 | 0 | 13* |
| 对照治疗组 | 10 | 3 | 3 | 1 | 3 | 24 |
注：△与空白组比较，P＜0.01；
*与模型组比较，P＜0.01。
本研究结果表明，模型组小鼠宫颈组织bcl-2表达强烈，颜色很深，试验过程中有2只动物出现死亡，余下动物定量评分为26分，而治疗组仅有较少例数染色程度相对较弱的bcl-2阳性表达，定量评分为13分，二者相比有极显著性差异(P＜0.01)，且阳性表达以基底层明显，说明金荞麦吴茱萸凝胶能够通过抑制抗凋亡因子的表达而起到促进宫颈上皮异型细胞凋亡的作用。
为使本发明药物可以安全有效地治疗尖锐湿疣和宫颈癌前病变，本发明进行了相关的动物试验研究，以下是本发明组合物制剂皮肤用药刺激性试验、急性毒性试验报告摘要：
实施例9考察金荞麦吴茱萸组合物对家兔皮肤的刺激性作用
一、动物及材料：
(一)动物
1、种属：新西兰白兔；
2、体重：2kg左右；
3、性别：雌雄各半；
4、年龄：成年健康；
5、动物数：8只。
(二)受试物
1、受试物：金荞麦吴茱萸组合物软膏剂(根据实施例11制备)。
2、含量：10％、20％载药量(载药量为金荞麦提取物与吴茱萸提取物的重量占软膏总重的百分比)。
二、试验方法
1、将动物分为2组，每组新西兰白兔4只，雌雄各半，共8只。于试验前24h，将兔子背部脊柱两侧脱毛，面积约为6.0cm×18cm，并将该左右两侧的皮肤各分成2块，1块完整皮肤，1块破损皮肤，其中破损皮肤是在脱毛基础上，用砂纸将去毛消毒皮肤擦破，以渗血为度。然后将2组动物左侧的2块皮肤均给予空白基质(空白基质为不加提取物，只用相同的药用辅料制备得到的软膏，下同)，右侧的2块皮肤均给予受试药物，其中，将第一试验组给予10％载药量的药物组合物软膏剂，第二试验组给予20％载药量的药物组合物软膏剂，具体给药方法为：将空白基质和药物组合物软膏剂按照上述要求分别均匀涂布于动物两侧的完整皮肤和破损皮肤后，用无刺激性无菌纱布缚盖，并用胶布固定，每日给药1次，连续7d，并且每次给药8h后，用纱布擦拭除去残留的受试药物，并用温和洗面奶去除残留物。
2、观察时间及指标
从最后一次除去动物两侧皮肤的空白基质和药物组合物软膏剂1h后，开始观察 其两侧皮肤的刺激反应情况，每日1次，连续观察14天。观察并记录动物给药部位有无皮肤红斑、水肿、焦痂等刺激反应情况，并按新药毒理学研究指导原则将红斑、水肿程度定为0～4级并进行刺激性评价。将无红斑、勉强可见红斑、中度红斑、严重红斑、紫红色红斑并有焦痂形成等分别记分为0.00，1.00，2.00，3.00，4.00。无水肿、勉强可见水肿、皮肤隆起轮廓清楚、水肿隆起约1mm并范围扩大等分别记分为0.00，1.00，2.00，4.00。动物红斑形成总分与水肿形成总分之和除以动物数为反应平均值，反应平均值＜0.50为无刺激，0.50～2.00为轻度刺激性，2.00～6.00为中度刺激性，＞6.00为强刺激性。
三、试验报告及结果评价
表12受试药物对家兔皮肤的刺激性作用结果
本试验结果表明，采用空白基质对家兔完整皮肤和破损皮肤进行多次连续给药，其给药部位均无刺激性反应，表明本发明的药物组合物(在本文中药物组合物也称为“金荞麦吴茱萸组合物”)制剂基质完全符合局部给药对基质的要求。采用10％载药量的药物组合物软膏制剂对家兔完整皮肤和破损皮肤进行多次连续给药，其完整皮肤均无刺激性反应，破损皮肤有轻度刺激性反应；采用20％载药量制剂多次给药对家兔完整皮肤和破损皮肤有轻度刺激反应，从刺激性表现来看，都是暂时性的症状，不影 响药物对疾病的治疗，实际临床用药载药量可能并不会达到20％这么高，停药后上述刺激反应很快消失，表明金荞麦吴茱萸组合物制剂即使在高剂量下对家兔皮肤的刺激反应是轻微的，可逆的。
实施例10金荞麦提取物、吴茱萸提取物及二者组合物的急性毒性
一、动物及材料：
(一)动物
1、种属：昆明小鼠，由武汉大学医学院实验动物中心提供，动物合格证号：19-013；
2、体重：30±2g；
3、性别：雌性；
4、年龄：成年健康；
5、动物数：40只。
(二)受试物
1、受试物：金荞麦提取物(根据实施例1制备)、吴茱萸提取物(根据实施例2制备)、二者组合物(金荞麦提取物∶吴茱萸提取物＝2.5∶1)用0.5％的CMC-Na制成不同浓度的混悬液。
2、来源：自制，武汉华大药业有限公司提供。
3、含量：20％。
三、试验方法
将小鼠按体重、性别均衡分成4组：金荞麦提取物组、吴茱萸提取物组、组合物组、水对照组，每组10只，给药前禁食12h，在前期预试验的基础上，按0.01mL/g(按成年人外用日最大给药剂量1g计算，相当于成年人500倍的日给药剂量)剂量一次性于早晨8:00灌胃给药，对照组小鼠按0.01mL/g灌胃给0.5％CMC-Na，给药当天三个给药组小鼠自主活动减少，耸毛、蜷缩，进食减少，次日多数恢复正常，给药后观察7d，小鼠进食、大小便、呼吸、体重等均无明显异常变化，无一死亡，14d后，处死受试动物，尸体解剖肉眼未见主要脏器病变。结果表明金荞麦提取物给药组、吴茱萸提取物给药组、二者组合给药组在本试验给药剂量范围内基本无毒性。
实施例11金荞麦吴茱萸组合物软膏剂的制备
处方：金荞麦110g 吴茱萸160g
制法：以上两味，按实施例1和实施例2制备，备用。取白凡士林30g、蜂蜡10g、十八醇5g、单硬脂酸丙二醇酯5g置于70℃水浴中熔化，将金荞麦提取物(过100目筛)、吴茱萸提取物(过100目筛)和肉豆蔻酸异丙酯35g混合，搅拌均匀，必要时可置于研钵中研磨均匀，然后缓慢加入其他已熔化好的基质中，边加边搅拌，待完全均匀后，停止加热，继续搅拌至室温，即得。
实施例12金荞麦吴茱萸组合物软膏剂的制备
处方：金荞麦提取物10g 吴茱萸提取物4g
制法：金荞麦提取物按实施例1制备，备用；吴茱萸提取物按实施例2操作，备用。取白凡士林30g、蜂蜡10g、十八醇5g、单硬脂酸丙二醇酯5g置于70℃水浴中熔化，将金荞麦提取物(过100目筛)、吴茱萸提取物(过100目筛)和肉豆蔻酸异丙酯35g混合，搅拌均匀，必要时可置于研钵中研磨均匀，然后缓慢加入其他已熔化好的基质中，边加边搅拌，待完全均匀后，停止加热，继续搅拌至室温，即得。
实施例13金荞麦吴茱萸乳膏的制备
处方：金荞麦1500g 吴茱萸1500g
制法：以上两味，按实施例1和实施例2制备，备用。称取白凡士林70g、十八醇70g、液体石蜡50g、单硬脂酸甘油酯60g、70℃缓慢加热至熔融，并在70℃保温做油相，另外称取甘油50g、十二烷基硫酸钠10g和水620g，70℃缓慢加热溶解做水相，当温度升至与油相相同时，将油相慢慢加入水相中，并不断搅拌。将吴茱萸提取物溶于适量蒸馏水中，缓慢滴加稀盐酸调节pH5.5-6.0，待混合均匀的两相温度降至60℃时，将金荞麦提取物和吴茱萸提取物加入，搅匀冷却，即得金荞麦吴茱萸乳膏1000g。
实施例14金荞麦吴茱萸乳膏的制备
处方：金荞麦提取物100g 吴茱萸提取物40g
制法：金荞麦提取物按实施例1制备，备用；吴茱萸提取物按实施例2制备，备用。称取白凡士林70g、十八醇70g、液体石蜡50g、单硬脂酸甘油酯60g、70℃缓慢加热至熔融，并在70℃保温做油相，另外称取甘油50g、十二烷基硫酸钠10g和水620g，70℃缓慢加热溶解做水相，当温度升至与油相相同时，将油相慢慢加入水相中，并不断搅拌。将吴茱萸提取物溶于适量蒸馏水中，缓慢滴加稀盐酸调节pH5.5-6.0，待混合均匀的两相温度降至60℃时，将金荞麦提取物和吴茱萸提取物加入，搅匀冷却， 即得金荞麦吴茱萸乳膏1000g。
实施例15金荞麦吴茱萸凝胶的制备
处方：金荞麦120g 吴茱萸180g
制法：以上两味，分别按实施例1和实施例2制备，备用。取卡波姆9401.5g均匀溶胀于60ml蒸馏水中，静置过夜。将吴茱萸提取物溶于适量蒸馏水中，缓慢滴加稀盐酸调节pH5.5-6.0，加入甘油5mL、丙二醇10mL搅拌均匀，再加入金荞麦提取物，边加边搅拌，补加蒸馏水至100g，即得金荞麦吴茱萸凝胶。
实施例16金荞麦吴茱萸凝胶的制备
处方：金荞麦提取物12g 吴茱萸提取物5g
制法：金荞麦提取物按实施例1制备，备用；吴茱萸提取物按实施例2制备，备用。取卡波姆9401.5g均匀溶胀于60ml蒸馏水中，静置过夜。将吴茱萸提取物溶于适量蒸馏水中，缓慢滴加稀盐酸调节pH5.5-6.0，加入甘油5mL、丙二醇10mL搅拌均匀，再加入金荞麦提取物，边加边搅拌，补加蒸馏水至100g，即得金荞麦吴茱萸凝胶。
实施例17金荞麦吴茱萸栓剂的制备
处方：金荞麦2200g 吴茱萸3200g
制法：以上两味，分别按实施例1和实施例2制备，得提取物粉末用100ml水搅拌溶解。称取甘油明胶基质1000g，置70℃水浴中加热熔融，加入相同温度的金荞麦和吴茱萸混合水溶液(pH5.5-6.0)，搅拌混匀，待气泡消失即浇注栓模中，冷却后取出，制成1000粒(每粒1.25g)，即得。
实施例18金荞麦吴茱萸栓剂的制备
处方：金荞麦提取物200g 吴茱萸提取物80g
制法：金荞麦提取物按实施例1制备，备用；吴茱萸提取物按实施例2制备，备用。提取物粉末用100ml水搅拌溶解。称取甘油明胶基质1000g，置70℃水浴中加热熔融，加入相同温度的金荞麦和吴茱萸混合水溶液(pH5.5-6.0)，搅拌混匀，待气泡消失即浇注栓模中，冷却后取出，制成1000粒(每粒1.25g)，即得。
实施例19金荞麦吴茱萸阴道泡腾片的制备
处方：金荞麦2200g 吴茱萸3200g
制法：采用非水制粒压片法制备金荞麦吴茱萸阴道泡腾片。金荞麦细粉、吴茱萸细粉 的制备方法同实施例1和2。将碳酸氢钠在60℃下干燥2h，柠檬酸(枸橼酸)在105℃下干燥1h，分别研细，过100目筛，精密量取处方量备用。将吴茱萸细粉与乳糖100g、微晶纤维素150g、碳酸氢钠100g混合均匀，金荞麦细粉与乳糖150g、枸橼酸120g混合均匀，再混合，加入无水乙醇为润滑剂制软材，20目筛制粒，所得颗粒置于40～45℃恒温干燥箱中鼓风干燥，16目筛整粒，加入PEG-600030g、冰片细粉10g、硬脂酸镁4g，充分混合均匀，用椭圆形异性冲模压片，压制成1000片。
实施例20金荞麦吴茱萸阴道泡腾片的制备
处方：金荞麦提取物200g 吴茱萸提取物80g
制法：金荞麦提取物按实施例1制备，备用；吴茱萸提取物按实施例2操作，备用。将碳酸氢钠在60℃下干燥2h，柠檬酸(枸橼酸)在105℃下干燥1h，分别研细，过100目筛，精密量取处方量备用。将吴茱萸细粉与乳糖100g、微晶纤维素150g、碳酸氢钠100g混合均匀，金荞麦细粉与乳糖150g、枸橼酸120g混合均匀，再混合，加入无水乙醇为润滑剂制软材，20目筛制粒，所得颗粒置于40～45℃恒温干燥箱中鼓风干燥，16目筛整粒，加入PEG-600030g、冰片细粉10g、硬脂酸镁4g，充分混合均匀，用椭圆形异性冲模压片，压制成1000片。
实施例21金荞麦吴茱萸搽剂的制备
处方：金荞麦900g 吴茱萸1500g
制备方法：以上两味，分别按照实施例1和实施例2制备，提取纯化后，加50％乙醇200ml，甘油100ml，PEG-400100g、月桂氮酮15ml，最后加水至1000ml，搅匀，滤过，分装，即得。
实施例22金荞麦吴茱萸搽剂的制备
处方：金荞麦提取物100g 吴茱萸提取物40g
制备方法：金荞麦提取物按实施例1制备，备用；吴茱萸提取物按实施例2制备，备用。提取纯化后，加50％乙醇200ml，甘油100ml，PEG-400100g、月桂氮酮15ml，最后加水至1000ml，搅匀，滤过，分装，即得。
实施例23金荞麦吴茱萸气雾剂的制备
处方金荞麦1600g 吴茱萸2400g
制备方法：以上两味，分别按照实施例1和实施例2制备，提取纯化后，用50％的乙 醇溶解，并用50％的乙醇稀释至1000ml，混匀，静置，滤过，灌装，封口，充入适量抛射剂，即得。
实施例24金荞麦吴茱萸气雾剂的制备方法
处方金荞麦提取物150g 吴茱萸提取物60g
制备方法：金荞麦提取物按实施例1制备，备用；吴茱萸提取物按实施例2制备，备用。提取纯化后，用50％的乙醇溶解，并用50％的乙醇稀释至1000ml，混匀，静置，滤过，灌装，封口，充入适量抛射剂，即得。
实施例25金荞麦吴茱萸胶囊剂的制备
处方：金荞麦1500g 吴茱萸2000g
制备方法：以上两味，分别按照实施例1和实施例2制备，提取纯化后，加300g淀粉过筛混匀，用30％乙醇制颗粒，干燥，装入胶囊，制成1000粒(每粒装量为0.5g)，即得。
实施例26金荞麦吴茱萸胶囊剂的制备
处方：金荞麦提取物85g 吴茱萸提取物34g
制备方法：金荞麦提取物按实施例1制备，备用；吴茱萸提取物按实施例2制备，备用。提取纯化后，加300g淀粉过筛混匀，用30％乙醇制颗粒，干燥，装入胶囊，制成1000粒(每粒装量为0.5g)，即得。
实施例27金荞麦吴茱萸颗粒剂的制备
处方：金荞麦3300g 吴茱萸4800g
制备方法：以上两味按照实施例1和实施例2提取纯化后，加适量糖粉，混匀，制粒，于60℃以下干燥，制成1000g，即得。
实施例28金荞麦吴茱萸颗粒剂的制备
处方：金荞麦提取物300g 吴茱萸提取物120g
制备方法：金荞麦提取物按实施例1制备，备用；吴茱萸提取物按实施例2制备，备用。提取纯化后，加适量糖粉，混匀，制粒，于60℃以下干燥，制成1000g，即得。
实施例29金荞麦吴茱萸霜剂的制备
处方：金荞麦600g 吴茱萸800g
制法：以上两味，分别按实施例1和实施例2制备，备用。称取硬脂酸甘油酯30g、 硬脂酸40g、白凡士林25g、液体石蜡85g，70℃缓慢加热至熔融，并在70℃保温做油相，另外称取十二烷基硫酸钠4g、甘油55g、三乙醇胺3ml和水610g，70℃缓慢加热溶解做水相，当温度升至与油相相同时，将油相慢慢加入水相中，并不断搅拌。将吴茱萸提取物溶于适量蒸馏水中，缓慢滴加稀盐酸调节至pH5.5-6.0后，将金荞麦提取物和吴茱萸提取物加入到两相混合液中，搅匀冷却，即得。
实施例30金荞麦吴茱萸霜剂的制备
处方：金荞麦提取物50g 吴茱萸提取物20g
制法：金荞麦提取物按实施例1制备，备用；吴茱萸提取物按实施例2制备，备用。称取硬脂酸甘油酯30g、硬脂酸40g、白凡士林25g、液体石蜡85g，70℃缓慢加热至熔融，并在70℃保温做油相，另外称取十二烷基硫酸钠4g、甘油55g、三乙醇胺3ml和水610g，70℃缓慢加热溶解做水相，当温度升至与油相相同时，将油相慢慢加入水相中，并不断搅拌。将吴茱萸提取物溶于适量蒸馏水中，缓慢滴加稀盐酸调节至pH5.5-6.0后，将金荞麦提取物和吴茱萸提取物加入到两相混合液中，搅匀冷却，即得。
在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不一定指的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任何的一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。
尽管已经示出和描述了本发明的实施例，本领域的普通技术人员可以理解：在不脱离本发明的原理和宗旨的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由权利要求及其等同物限定。
Claims (33)
1.一种用于治疗HPV感染的药物组合物，其特征在于，所述药物组合物由金荞麦提取物和吴茱萸提取物组成，
所述金荞麦提取物是通过下列步骤制备的：将金荞麦进行加醇提取，以便获得金荞麦提取液；以及将所述金荞麦提取液进行纯化、干燥，以便获得所述金荞麦提取物，
其中，将金荞麦进行加醇提取进一步包括：将所述金荞麦用10倍重量的50%的乙醇，在60摄氏度下回流提取2次，每次1.5小时，合并提取液，获得所述金荞麦提取液，
将所述金荞麦提取液进行纯化、干燥进一步包括：将所述金荞麦提取液进行过滤，获得金荞麦提取液滤液；利用大孔吸附树脂对所述金荞麦提取液滤液进行纯化，获得纯化后的金荞麦提取液；以及将所述纯化后的金荞麦提取液进行在60摄氏度减压浓缩和真空干燥，
其中，利用大孔吸附树脂对所述金荞麦提取液滤液进行纯化进一步包括：
将所述金荞麦提取物滤液在60摄氏度减压浓缩至无醇味后，用D-101大孔吸附树脂洗脱，其中所述金荞麦提取液滤液的上样浓度为0.08g/mL，所述金荞麦提取液滤液的上样流速为2树脂柱体积/小时，吸附4小时；
使用除杂洗脱剂进行除杂，其中所述除杂洗脱剂为6个柱体积的水，所述除杂洗脱剂的洗脱流速为4树脂柱体积/小时；以及
使用洗脱溶剂进行洗脱，以便获得所述经过纯化的金荞麦提取液，其中所述洗脱溶剂为8个柱体积的70%乙醇，所述洗脱溶剂的洗脱速度为2柱体积/小时，
所述吴茱萸提取物是通过下列步骤制备的：将吴茱萸进行加醇提取，以便获得吴茱萸提取液；以及将所述吴茱萸提取液进行纯化、干燥，以便获得所述吴茱萸提取物，
其中，将吴茱萸进行加醇提取进一步包括：将所述吴茱萸用10倍重量的pH值为3的醇浓度为80%的盐酸乙醇，加热回流提取3次，每次1.5小时，合并提取液，获得所述吴茱萸提取液，
将所述吴茱萸提取液进行纯化、干燥进一步包括：将所述吴茱萸提取液进行过滤，获得吴茱萸提取液滤液；利用强酸性阳离子交换树脂对所述吴茱萸提取液滤液进行纯化，获得纯化后的吴茱萸提取液；以及将所述纯化后的吴茱萸提取液进行减压浓缩和真空干燥，
其中，所述利用强酸性阳离子交换树脂对所述吴茱萸提取液滤液进行纯化进一步包括：
将所述吴茱萸提取物滤液减压浓缩至50摄氏度下相对密度为1.2，调整浓缩液pH值至2，静置，离心，上清液用732型强酸性阳离子交换树脂纯化，其中，所述吴茱萸提取液滤液的上样流速为1树脂柱体积/小时，吸附2小时；
使用除杂洗脱剂进行除杂，其中所述除杂洗脱剂为8倍体积水，所述除杂洗脱剂的洗脱流速为2树脂柱体积/小时；以及
使用洗脱溶剂进行洗脱，以便获得所述经过纯化的吴茱萸提取液，其中所述洗脱溶剂为80%乙醇，所述洗脱溶剂的洗脱速度为2树脂柱体积/小时，
所述金荞麦提取物与所述吴茱萸提取物的重量比例为1-6:1。
2.根据权利要求1所述的药物组合物，其特征在于，所述金荞麦提取物与所述吴茱萸提取物的重量比例为1.5-4:1。
3.根据权利要求2所述的药物组合物，其特征在于，所述金荞麦提取物与所述吴茱萸提取物的重量比率为2.5:1。
4.根据权利要求1所述的药物组合物，其特征在于，所述药物组合物进一步包括药学上可接受的辅料。
5.根据权利要求1所述的药物组合物，其特征在于，所述药物组合物呈选自软膏剂、凝胶剂、栓剂、外用洗剂、片剂、颗粒剂、口服溶液、胶囊剂、内服膏剂、气雾剂或喷雾剂的至少一种的形式。
6.根据权利要求5所述的药物组合物，其特征在于，所述片剂为泡腾片。
7.根据权利要求5所述的药物组合物，其特征在于，所述药物组合物呈软膏剂的形式。
8.根据权利要求5所述的药物组合物，其特征在于，所述药物组合物呈栓剂的形式。
9.根据权利要求5所述的药物组合物，其特征在于，所述药物组合物呈凝胶剂的形式。
10.根据权利要求1所述的药物组合物，其特征在于，所述药物组合物用于抑制HPV E7基因的表达。
11.根据权利要求1所述的药物组合物，其特征在于，所述药物组合物用于治疗炎症。
12.根据权利要求1所述的药物组合物，其特征在于，所述药物组合物用于治疗由HPV感染引起的宫颈疾病、女阴上皮内瘤变、疣病以及皮肤癌前病变。
13.根据权利要求1所述的药物组合物，其特征在于，所述药物组合物用于治疗或预防宫颈癌或宫颈癌前病变。
14.根据权利要求1所述的药物组合物，其特征在于，所述药物组合物用于治疗或预防尖锐湿疣。
15.权利要求1-14任一项所述的药物组合物在制备药物中的用途，所述药物用于抑制HPV E7基因的表达。
16.根据权利要求15所述的用途，其特征在于，所述药物用于治疗炎症。
17.根据权利要求15所述的用途，其特征在于，所述药物用于治疗由HPV感染引起的宫颈疾病、女阴上皮内瘤变、疣病以及皮肤癌前病变。
18.根据权利要求15所述的用途，其特征在于，所述药物用于治疗或预防宫颈癌或宫颈癌前病变。
19.根据权利要求15所述的用途，其特征在于，所述药物用于治疗或预防尖锐湿疣。
20.一种制备用于治疗HPV感染的药物的方法，其特征在于，所述用于治疗HPV感染的药物由金荞麦提取物和吴茱萸提取物组成，其中，
所述金荞麦提取物是通过下列步骤制备的：将金荞麦进行加醇提取，以便获得金荞麦提取液；以及将所述金荞麦提取液进行纯化、干燥，以便获得所述金荞麦提取物，
其中，将金荞麦进行加醇提取进一步包括：将所述金荞麦用10倍重量的50%的乙醇，在60摄氏度下回流提取2次，每次1.5小时，合并提取液，获得所述金荞麦提取液，
将所述金荞麦提取液进行纯化、干燥进一步包括：将所述金荞麦提取液进行过滤，获得金荞麦提取液滤液；利用大孔吸附树脂对所述金荞麦提取液滤液进行纯化，获得纯化后的金荞麦提取液；以及将所述纯化后的金荞麦提取液进行在60摄氏度减压浓缩和真空干燥，
其中，利用大孔吸附树脂对所述金荞麦提取液滤液进行纯化进一步包括：
将所述金荞麦提取物滤液在60摄氏度减压浓缩至无醇味后，用D-101大孔吸附树脂洗脱，其中所述金荞麦提取液滤液的上样浓度为0.08g/mL，所述金荞麦提取液滤液的上样流速为2树脂柱体积/小时，吸附4小时；
使用除杂洗脱剂进行除杂，其中所述除杂洗脱剂为6个柱体积的水，所述除杂洗脱剂的洗脱流速为4树脂柱体积/小时；以及
使用洗脱溶剂进行洗脱，以便获得所述经过纯化的金荞麦提取液，其中所述洗脱溶剂为8个柱体积的70%乙醇，所述洗脱溶剂的洗脱速度为2柱体积/小时，
所述吴茱萸提取物是通过下列步骤制备的：将吴茱萸进行加醇提取，以便获得吴茱萸提取液；以及将所述吴茱萸提取液进行纯化、干燥，以便获得所述吴茱萸提取物，
其中，将吴茱萸进行加醇提取进一步包括：将所述吴茱萸用10倍重量的pH值为3的醇浓度为80%的盐酸乙醇，加热回流提取3次，每次1.5小时，合并提取液，获得所述吴茱萸提取液，
将所述吴茱萸提取液进行纯化、干燥进一步包括：将所述吴茱萸提取液进行过滤，获得吴茱萸提取液滤液；利用强酸性阳离子交换树脂对所述吴茱萸提取液滤液进行纯化，获得纯化后的吴茱萸提取液；以及将所述纯化后的吴茱萸提取液进行减压浓缩和真空干燥，
其中，所述利用强酸性阳离子交换树脂对所述吴茱萸提取液滤液进行纯化进一步包括：
将所述吴茱萸提取物滤液减压浓缩至50摄氏度下相对密度为1.2，调整浓缩液pH值至2，静置，离心，上清液用732型强酸性阳离子交换树脂纯化，其中，所述吴茱萸提取液滤液的上样流速为1树脂柱体积/小时，吸附2小时；
使用除杂洗脱剂进行除杂，其中所述除杂洗脱剂为8倍体积水，所述除杂洗脱剂的洗脱流速为2树脂柱体积/小时；以及
使用洗脱溶剂进行洗脱，以便获得所述经过纯化的吴茱萸提取液，其中所述洗脱溶剂为80%乙醇，所述洗脱溶剂的洗脱速度为2树脂柱体积/小时，
将所述金荞麦提取物和所述吴茱萸提取物按照预定的重量比例进行混合，以便得到所述用于治疗HPV感染的药物，
所述金荞麦提取物与所述吴茱萸提取物的重量比例为1-6:1。
21.根据权利要求20所述的方法，其特征在于，所述金荞麦提取物与所述吴茱萸提取物的重量比例为1.5-4:1。
22.根据权利要求21所述的方法，其特征在于，所述金荞麦提取物与所述吴茱萸提取物的重量比例为2.5:1。
23.根据权利要求20所述的方法，其特征在于，进一步包括将该方法制备的药物制成选自软膏剂、凝胶剂、栓剂、外用洗剂、片剂、颗粒剂、口服溶液、胶囊剂、内服膏剂、气雾剂或喷雾剂的至少一种的形式。
24.根据权利要求23所述的方法，其特征在于，所述片剂为泡腾片。
25.根据权利要求23所述的方法，其特征在于，所述药物呈软膏剂的形式。
26.根据权利要求23所述的方法，其特征在于，所述药物呈栓剂的形式。
27.根据权利要求23所述的方法，其特征在于，所述药物呈凝胶剂的形式。
28.根据权利要求20所述的方法，其特征在于，所述药物用于抑制HPV E7基因的表达。
29.根据权利要求20所述的方法，其特征在于，所述药物用于治疗炎症。
30.根据权利要求20所述的方法，其特征在于，所述药物用于治疗由HPV感染引起的宫颈疾病、女阴上皮内瘤变、疣病以及皮肤癌前病变。
31.根据权利要求20所述的方法，其特征在于，所述药物用于治疗或预防宫颈癌或宫颈癌前病变。
32.根据权利要求20所述的方法，其特征在于，所述药物用于治疗或预防尖锐湿疣。
33.一种药物，其是根据权利要求20-32任一项所述的方法制备的。
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