CN102688300B - 药物组合物及其用途 - Google Patents
药物组合物及其用途 Download PDFInfo
- Publication number
- CN102688300B CN102688300B CN201210088202.7A CN201210088202A CN102688300B CN 102688300 B CN102688300 B CN 102688300B CN 201210088202 A CN201210088202 A CN 201210088202A CN 102688300 B CN102688300 B CN 102688300B
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- rhizoma fagopyri
- fagopyri dibotryis
- extract
- cortex fraxini
- pharmaceutical composition
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
Images
Landscapes
- Medicinal Preparation (AREA)
- Medicines Containing Plant Substances (AREA)
Abstract
本发明涉及药物组合物及其用途。其中,该药物组合物包含金荞麦提取物和秦皮提取物,其中,该金荞麦提取物是通过下列步骤制备的:将金荞麦进行加醇提取,以便获得金荞麦提取液;以及将金荞麦提取液进行纯化、干燥,以便获得金荞麦提取物,该秦皮提取物是通过下列步骤制备的:将秦皮进行加醇提取,以便获得秦皮提取液;以及将秦皮提取液进行纯化、干燥,以便获得秦皮提取物。本发明的药物组合物,能够用于治疗或预防包括由HPV感染引起的宫颈疾病、女阴上皮内瘤变、疣病以及皮肤癌前病变。
Description
技术领域
本发明涉及中药领域,具体地涉及药物组合物及其用途。更具体地,本发明提供了药物组合物、药物组合物在制备药物中的用途、制备药物的方法、药物以及对药物组合物或药物进行检测的方法。
背景技术
人乳头瘤病毒(Human papilloma virus,HPV)广泛存在于自然界,具有高度的组织和宿主特异性,是一类可致人类皮肤和粘膜异常增生、引起宿主组织疣状病变以及乳头状瘤的DNA病毒。目前已发现至少120种不同的HPV亚型,其中大约50余种亚型可感染生殖道粘膜,19余种被证实与宫颈癌密切相关。根据HPV亚型与生殖道恶性肿瘤的关系,将HPV分为低危型和高危型。其中HPV 6、11、42、43、44、53、81等属于低危型,HPV16、18、26、31、33、35、39、45、51、52、53、56、58、59、66、68、73、82等属于高危型,上述不同型别的HPV感染能够导致宫颈或外生殖器或肛周或皮肤的局部病变,包括由HPV感染引起的宫颈疾病如宫颈糜烂、宫颈癌前病变(cervical intraepithelial neoplasia,CIN)、宫颈癌;由HPV感染引起的女阴上皮内瘤变;以及由HPV感染引起的疣病,如扁平疣、寻常疣、掌跖疣、尖锐湿疣和免疫功能低下引起的传染性软疣;以及由HPV感染引起的皮肤癌前病变如角化棘皮瘤、日光性角化病、溢脂性角化病。尖锐湿疣(Condylomaacuminatum,CA)是感染HPV引起的增生性疾病。这种疣表现为与众不同的乳头状或鸡冠样肿瘤,在我国,其发病率仅次于非淋菌性尿道炎和淋病,占性传播疾病的第3位。感染尖锐湿疣一般不会立即发病,有较长时间的潜伏期,一般为3周至8个月不等,平均为3个月。尖锐湿疣属于祖国医学“疣”的范畴,俗称“瘊子”。中医并无尖锐湿疣病名,但有相似之症,如“瘙瘊”、“臊瘊”等。中医认为其病因病机主要是气血失和,腠理失密,加之恣情纵欲,房事不洁,湿热内蕴,外感邪毒,湿热淫毒与气血搏结,日久蕴结肌肤,下注前后二阴而发为本病。目前治疗因HPV引起的尖锐湿疣的主要方法有手术切除、电烙、冷冻、激光治疗等。普通的治疗药物有普达菲伦脂、5-氟尿嘧啶、鬼臼毒素、咪喹莫特等。然而,由于尖锐湿疣宿主免疫抑制、正常皮肤潜伏感染以及亚临床感染等原因,目前的治疗手段非100%有效,且治疗后有20%~50%的复发可能性。而且上述手术方法会给患者带来极大的痛苦,而一般药物方法也存在一定局限性及毒副作用,因此治疗效果还不满意。
CIN根据细胞异常的程度分为3级:CIN Ⅰ、CIN Ⅱ、CINⅢ。CIN Ⅰ级相当于轻度非典型增生,异常增生的细胞仅限于上皮层下1/3;CINⅡ级相当于中度非典型增生,异常增生的细胞限于上皮层的下2/3;CINⅢ级相当于重度不典型增生和原位癌,细胞异型性明显,异常增生的细胞占据上皮层的2/3以上或达全层。目前认为,从CIN发展到宫颈癌,是一个较长时间(大约10年)连续发展的过程。这个连续发展的过程的截断至关重要,积极地治疗癌前病变,可以阻断病程,预防宫颈癌的发生。
人类是HPV的唯一宿主,因而无法在体外和动物模型中进行培养扩增实验,这使得预防或治疗HPV感染的药物研发受到极大限制,造成在全世界范围内尚无疗效确切的预防和治疗HPV感染的药物,虽然国外已经研制了能够预防HPV16、18亚型感染的疫苗,但是其存在以下缺陷:仅能用于9-24岁无性生活未感染HPV16、18的女性,并且对16、18亚型之外的其他亚型感染无预防和治疗作用。
目前,对治疗由HPV感染引起的宫颈疾病、女阴上皮内瘤变、疣病以及皮肤癌前病变疾病的药物,仍有待进一步研究和改进。
发明内容
本发明是基于发明人的下列发现而完成的:
近几十年来,利用中医药治疗女性生殖道HPV感染取得了一定的成效,但使用的大多是多味中药组成的复方,成分复杂,目前仍没有成分简单、疗效确切的药物组合物应用于临床来预防或治疗HPV感染以及其诱发的良性或恶性病变,特别是针对致湿疣的低危型HPV感染,以及致宫颈癌前病变及宫颈癌的高危型HPV感染。中药金荞麦微辛、涩、凉,归肺经,主要功效为清热解毒、排脓祛瘀,可用于肺痈吐脓、肺热喘咳、乳蛾肿痛等病症。现代研究表明,金荞麦具有抗菌、抗炎、抗肿瘤、抗突变等药理作用。金荞麦具有抗癌作用的活性成分是一类原花色素缩合性单宁物质的混合物(简称金荞麦c),其主要由表儿茶素及其二聚体组成,包含表儿茶素、原花色素B2、原花色素C1等成分。中药秦皮苦、涩、寒,归肝、胆、大肠经,主要功效为清热燥湿、收涩止痢、止带、明目,可用于湿热泻痢、赤白带下、目赤肿痛、目生翳膜等症。现代研究表明,秦皮具有抗炎、抗病原微生物、抗肿瘤、抗氧化等药理作用。秦皮的主要有效成分为香豆素类化合物,包括秦皮甲素、秦皮乙素、秦皮苷和秦皮素等成分。目前国内外有关中药金荞麦与秦皮药物组合物在制备治疗HPV感染的药物中的应用未见报道。本发明旨在至少解决现有技术中存在的技术问题之一。本发明提供了一种可以有效地用于治疗HPV感染的药物组合物及其用途,该药物组合物可用于制备治疗由HPV感染引起的宫颈疾病如宫颈糜烂、宫颈癌前病变、宫颈癌;由HPV感染引起的女阴上皮内瘤变;以及由HPV感染引起的疣病,如扁平疣、寻常疣、掌跖疣、尖锐湿疣和免疫功能低下引起的传染性软疣;以及由HPV感染引起的皮肤癌前病变如角化棘皮瘤、日光性角化病、溢脂性角化病的药物。
根据本发明的一个方面,本发明提供了一种药物组合物。根据本发明的实施例,该药物组合物包括金荞麦提取物和秦皮提取物,所述金荞麦提取物为金荞麦的醇提取物,所述秦皮提取物是秦皮的醇提取物。利用该药物组合物,能够有效地治疗HPV感染引起的疾病,能够对HPV感染引起的宫颈糜烂、宫颈癌前病变、宫颈癌、女阴上皮内瘤变,扁平疣、寻常疣、掌跖疣、尖锐湿疣和免疫功能低下引起的传染性软疣及皮肤癌前病变如角化棘皮瘤、日光性角化病、溢脂性角化病进行有效地治疗。另外,发明人发现,该药物组合物可以有效地抑制HPVE7基因(在本文中有时也简单称为“E7基因”)的表达。并且进一步发现利用该药物组合物还能够有效用于使宫颈癌前病变细胞向良性转化。此外,发明人惊奇地发现,该药物组合物能够治疗炎症。根据本发明的实施例,炎症的类型并不受特别限制。在本发明的实施例中,采用二甲苯处理的小鼠作为炎症的动物模型,证明了本发明药物组合物能够有效治疗炎症。二甲苯处理的小鼠是医药领域中公知认可的炎症的动物模型,关于其应用的具体实例,可以参见:湖北中医学院学报,2005年第7卷第3期,31-33页(关于接触性皮炎);辽宁中医杂志,2010年第37卷增刊,第227-230页(关于宫颈炎);辽宁中医杂志,2009年第36卷第7期,第1193-1194页(关于肺炎)。广东药学院学报,2009年6月,25(3),第295-298页(关于鼻炎),在此通过参照将这些文献并入本文。
根据本发明的实施例,本发明的药物组合物包含金荞麦提取物和秦皮提取物作为活性成分,其中金荞麦提取物与秦皮提取物的重量比例为0.5~3:1,优选金荞麦提取物与秦皮提取物的重量比例为1~2:1,最优选金荞麦提取物与秦皮提取物的重量比例为1.4:1。根据本发明的实施例,从金荞麦制备金荞麦提取物即金荞麦的醇提取物的方法,并不受特别限制。根据本发明的实施例,金荞麦提取物是通过下列步骤制备的:将金荞麦进行加醇提取,以便获得金荞麦提取液;以及将金荞麦提取液进行纯化、干燥,以便获得金荞麦提取物。根据本发明的实施例,将金荞麦进行加醇提取可以进一步包括:将金荞麦用8-12倍重量的30-60%乙醇,在50-70摄氏度下回流提取2-3次,每次0.5-2小时,并合并提取液,以便获得金荞麦提取液,优选地,将金荞麦用8倍重量的50%乙醇,在50-70摄氏度下回流提取3次,每次1小时,并合并提取液,以便获得金荞麦提取液。
根据本发明的实施例,将金荞麦提取液进行纯化、干燥可以进一步包括:
首先,将金荞麦提取液进行过滤,以便获得金荞麦提取液滤液。
其次,利用非极性大孔吸附树脂对金荞麦提取液滤液进行纯化,以便获得经过纯化的金荞麦提取液。根据本发明的具体示例,利用非极性大孔吸附树脂对金荞麦提取液滤液进行纯化,可以进一步包括将金荞麦提取液滤液上样至D101大孔吸附树脂;使用除杂洗脱剂进行除杂;以及使用洗脱溶剂进行洗脱,以便获得经过纯化的金荞麦提取液。其中,所述金荞麦提取液滤液的上样浓度为0.02-0.20g/ml优选0.08g/ml,所述金荞麦提取滤液的最大上样量为0.2-1.0g/ml优选0.48g/ml,其上样速度为0.5-4柱体积/小时优选2柱体积/小时;除杂洗脱剂为水,其洗脱流速为3-6柱体积/小时优选4柱体积/小时;洗脱溶剂为60-90%乙醇优选70%乙醇,该洗脱溶剂的洗脱速度为1-3柱体积/小时优选2柱体积/小时。
然后,将经过纯化的金荞麦提取液进行减压浓缩和真空干燥,以便获得金荞麦提取物,其中减压浓缩是在50-60摄氏度下进行的。
根据本发明的实施例,从秦皮制备秦皮提取物即秦皮的醇提取物的方法,并不受特别限制。根据本发明的实施例,秦皮提取物是通过下列步骤制备的:将秦皮进行加醇提取,以便获得秦皮提取液;以及将秦皮提取液进行纯化、干燥,以便获得秦皮提取物。根据本发明的实施例,将秦皮进行加醇提取可以进一步包括:将秦皮用8-14倍重量的70-100%乙醇,回流提取2-3次,每次0.5-2小时,并合并提取液,以便获得秦皮提取液,优选地,将秦皮用12倍重量的80%乙醇,在60摄氏度下回流提取3次,每次1小时,并合并提取液,以便获得秦皮提取液。
根据本发明的实施例,将秦皮提取液进行纯化、干燥可以进一步包括:将秦皮提取液在60摄氏度下减压干燥,并用1-5倍重量蒸馏水优选3倍重量蒸馏水进行溶解;过滤除去不溶于水的杂质并回收滤液;以及将该滤液减压浓缩、真空干燥,以便获得秦皮提取物。
根据本发明的实施例,本发明的药物组合物可以进一步包括药学上可接受的辅料,从而可以使得药物组合物能够呈现适于给药的形式。优选本发明的药物组合物可以呈选自胶囊剂、丸剂、片剂、颗粒剂、口服液体、内服膏剂、栓剂、外用膏剂、外用洗剂、搽剂、气雾剂以及喷雾剂的至少一种的形式,根据本发明的具体示例,优选,药物组合物呈泡腾片、软膏、栓剂及凝胶剂的形式。由此,可以方便使得本发明的药物组合物适于为对象进行给药。
进一步,本发明的药物组合物,是以有效量的金荞麦和秦皮为原料,加入药学上可接受的辅料,按照常规工艺,制成临床可接受的中药制剂,如制成胶囊剂、丸剂、片剂、颗粒剂、口服液体、内服膏剂、栓剂、外用膏剂、外用洗剂、搽剂、气雾剂或喷雾剂。
进一步,本发明的药物组合物,是以有效量的金荞麦提取物和秦皮提取物为原料,加入药学上可接受的辅料,按照常规工艺,制成临床可接受的中药制剂,如制成胶囊剂、丸剂、片剂、颗粒剂、口服液体、内服膏剂、栓剂、外用膏剂、外用洗剂、搽剂、气雾剂或喷雾剂。
根据本发明的实施例,优选金荞麦提取物和秦皮提取物的重量比例为0.5~3:1,优选金荞麦提取物与秦皮提取物的重量比例为1~2:1,最优选金荞麦提取物与秦皮提取物的重量比例为1.4:1。
具体地,根据本发明实施例的药物组合物可以由以下方法制备:
取金荞麦药材,利用8-12倍重量的30%-60%乙醇,在50-70℃下回流提取2-3次,每次0.5-2小时,必要时,可以在醇提取前对金荞麦药材进行粉碎。并合并提取液,然后于60℃下减压浓缩至无醇味,再添加0.5-1.5倍药材重量的水充分溶解,然后抽滤获得滤液,备用,接着利用非极性大孔吸附树脂将滤液分离纯化,其中金荞麦提取液滤液的上样浓度为0.02-0.20g/ml优选0.08g/ml,所述金荞麦提取滤液的最大上样量为0.2-1.0g/ml优选0.48g/ml,上样速度为0.5-4柱体积/小时,吸附4小时后,先用4-8个柱体积的水洗脱除杂,其洗脱流速为3-6柱体积/小时,再用6-10个柱体积的60%-90%乙醇洗脱,其洗脱流速为1-3柱体积/小时,然后回收乙醇洗脱部分,于50-60℃下减压浓缩干燥,然后真空干燥、粉碎,得金荞麦提取物;
取秦皮药材,利用8-14倍重量的70%-100%乙醇,在60℃下回流提取2-3次,每次0.5-2小时,必要时,可以在醇提取前对秦皮药材进行粉碎。并合并提取液,然后于60℃下减压回收、干燥,再添加1-5倍药材重量的的蒸馏水充分溶解,然后过滤去除不溶于水的杂质,以便获得滤液,将滤液减压浓缩干燥,然后真空干燥,得秦皮提取物;以及
将金荞麦提取物和秦皮提取物混合,然后添加药学上可接受的辅料,按照常规方法制成胶囊剂、丸剂、片剂、颗粒剂、口服液体、内服膏剂、栓剂、外用膏剂、外用洗剂、搽剂、气雾剂或喷雾剂。
根据本发明的实施例,优选金荞麦提取物和秦皮提取物的重量比例为0.5~3:1,优选金荞麦提取物与秦皮提取物的重量比例为1~2:1,最优选金荞麦提取物与秦皮提取物的重量比例为1.4:1。
由此,发明人通过艰苦的实验,又对上述制备金荞麦提取物和秦皮提取物的方法进行了优化,获得了优化的制备金荞麦提取物和秦皮提取物的方法。根据本发明的一些实施例,发明人以紫外分光光度法测定的金荞麦提取液中金荞麦c的含量为指标,采用正交试验方法,对影响将金荞麦进行加醇提取的因素进行分析,优化了金荞麦提取的工艺。根据本发明的具体示例,发明人以紫外分光光度法测定的金荞麦中金荞麦c的含量为指标,采用单因素试验法,对影响利用非极性大孔吸附树脂对金荞麦提取液滤液进行纯化的步骤的主要因素进行了分析,对金荞麦纯化的工艺进行优化。根据本发明的一些实施例,发明人以高效液相色谱法测定的秦皮中秦皮甲素和秦皮乙素的总含量为指标,采用正交试验方法,对影响将秦皮进行加醇提取的工艺进行分析,对秦皮提取的工艺进行了优化。根据本发明的具体示例,发明人以高效液相色谱法测定的秦皮中秦皮甲素和秦皮乙素的总含量为指标,采用单因素试验法,对用于溶解并除杂的蒸馏水的重量进行分析,对秦皮纯化的工艺进行了优化。
本发明的制备金荞麦提取物和秦皮提取物的方法,即金荞麦、秦皮提取纯化工艺,简便易行,分析速度快,且节省成本。
具体地,根据本发明的实施例,优选地,药物组合物可以由以下方法制备:
取金荞麦药材,利用8倍重量的50%乙醇,在60℃下回流提取3次,每次1小时,必要时,可以在醇提取前对金荞麦药材进行粉碎。并合并提取液,然后于60℃下减压浓缩至无醇味,再添加1倍药材重量的水充分溶解,然后抽滤获得滤液,备用,接着利用D101大孔吸附树脂将滤液分离纯化,其中滤液的上样浓度选择每毫升滤液相当于0.08g金荞麦提取物,最大上样量为树脂吸附的每毫升滤液相当于0.48g金荞麦提取物,上样速度为2柱体积/小时,吸附4小时后,先用6个柱体积的水洗脱除杂,其洗脱流速为4柱体积/小时,再用8个柱体积的70%乙醇洗脱,其洗脱流速为2柱体积/小时,然后回收乙醇洗脱部分,于60℃下减压浓缩干燥,然后真空干燥、粉碎,得金荞麦提取物;
取秦皮药材,利用12倍重量的80%乙醇,在60℃下回流提取3次,每次1小时,必要时,可以在醇提取前对秦皮药材进行粉碎。并合并提取液,然后于60℃下减压回收、干燥,再添加3倍药材重量的的蒸馏水充分溶解,然后过滤去除不溶于水的杂质,以便获得滤液,将滤液减压浓缩干燥,然后真空干燥,得秦皮提取物;以及
将金荞麦提取物和秦皮提取物混合,然后添加药学上可接受的辅料,按照常规方法制成胶囊剂、丸剂、片剂、颗粒剂、口服液体、内服膏剂、栓剂、外用膏剂、外用洗剂、搽剂、气雾剂或喷雾剂。
此外,根据本发明的实施例,制备药物组合物时,金荞麦与秦皮药材,即用于制备金荞麦和秦皮提取物的原材料的组成可以为:金荞麦40-200重量份;秦皮20-100重量份。根据本发明的具体示例,优选金荞麦与秦皮药材的重量配比为金荞麦40重量份;秦皮20重量份,更优选地,金荞麦与秦皮药材的重量配比为金荞麦150重量份;秦皮67重量份,最优选地,金荞麦与秦皮药材的重量配比为金荞麦200重量份;秦皮100重量份。
进一步,根据本发明的实施例,通过将金荞麦和秦皮这两种中药以不同的比例进行组合,制备药物组合物进行药效学试验,发明人惊奇地发现,本发明的药物组合物对HPV感染有较显著的治疗作用,尤其是针对低危型HPV亚型感染引起的尖锐湿疣和高危型HPV亚型感染引起的宫颈癌前病变。此外,发明人惊奇地发现,该药物组合物能够治疗炎症,其中,部分药效学试验的结果如下:
根据本发明的实施例,利用金荞麦提取物、秦皮提取物和本发明的药物组合物分别对因二甲苯导致肿胀的小鼠耳廓进行给药实验,实验结果显示本发明的药物组合物对二甲苯所致的小鼠耳廓肿胀有显著性抑制作用,表明药物组合物具有显著抗炎作用,并且药物组合物的抗炎作用明显高于单独使用金荞麦提取物或者秦皮提取物的效果,从而证明了金荞麦提取物与秦皮提取物进行组合,具有协同效应。
根据本发明的实施例,以100μM的阿昔洛韦为阳性对照,生理盐水为空白对照,利用金荞麦提取物、秦皮提取物和本发明的药物组合物对HPV-DNA进行给药实验,由实验结果,发明人惊奇地发现,本发明的药物组合物对HPV-DNA有明显的破坏作用,并且无论是单独使用金荞麦提取物或者秦皮提取物,还是使用药物组合物,其抗HPV病毒的作用均要强于100μM的阿昔洛韦,但使用药物组合物比单独使用金荞麦提取物或者秦皮提取物对HPV病毒的杀灭作用更强,证明了金荞麦提取物与秦皮提取物进行组合,具有协同效应。
根据本发明的实施例,以阿昔洛韦为阳性对照,利用本发明的药物组合物对HeLa细胞进行给药实验,由实验结果,发明人惊奇地发现,与阳性对照阿昔洛韦相比,药物组合物对HeLa细胞HPV病毒E7基因表达的抑制作用明显,表明本发明的药物组合物能够有效地治疗由HPV感染引起的疾病,如由HPV感染引起的宫颈疾病如宫颈糜烂、宫颈癌前病变、宫颈癌;由HPV感染引起的女阴上皮内瘤变;以及由HPV感染引起的疣病,如扁平疣、寻常疣、掌跖疣、尖锐湿疣和免疫功能低下引起的传染性软疣;以及由HPV感染引起的皮肤癌前病变如角化棘皮瘤、日光性角化病、溢脂性角化病。其中,当药物组合物中金荞麦提取物和秦皮提取物的比例在1.4:1时,其对HPV病毒E7基因的抑制作用最为明显,表明利用该配比的药物组合物对由HPV感染引起的宫颈疾病如宫颈糜烂、宫颈癌前病变、宫颈癌;由HPV感染引起的女阴上皮内瘤变;以及由HPV感染引起的疣病,如扁平疣、寻常疣、掌跖疣、尖锐湿疣和免疫功能低下引起的传染性软疣;以及由HPV感染引起的皮肤癌前病变如角化棘皮瘤、日光性角化病、溢脂性角化病进行治疗,效果会最好。
根据本发明的实施例,通过进行药物组合物对宫颈癌HeLa细胞的增殖抑制和诱导凋亡的试验,发明人发现,本发明的药物组合物能够显著抑制宫颈癌HeLa细胞的体外增殖,并且其对细胞的抑制效应随着培养时间的延长和药物组合物浓度的增加而增加,此外其诱导的细胞凋亡率也明显增高,并且其诱导细胞凋亡率也具有明显的时间和浓度依赖性。
根据本发明的实施例,通过进行药物组合物对宫颈癌前病变(CIN)小鼠宫颈组织PCNA、EGFR和bcl-2表达的影响的试验,由试验结果,发明人惊奇地发现,本发明的药物组合物通过抑制增殖因子PCNA、EGFR和bcl-2的表达而发挥抑制宫颈上皮异型细胞增生的作用,与模型组相比具有显著差异,表明本发明的药物组合物能够用于治疗宫颈癌前病变。
根据本发明的实施例,通过进行药物组合物制剂对家兔皮肤的刺激性作用的试验,发明人发现,低剂量和正常剂量多次连续给药对家兔的完整皮肤和破损皮肤均无刺激性,而高剂量组对家兔破损皮肤有中度刺激性,停药后刺激反应很快消失,表明本发明的药物组合物,在低剂量和正常剂量下对家兔皮肤无刺激性,且在高剂量下对家兔皮肤的刺激反应是轻微的,可逆的。
根据本发明的实施例,为使本发明的药物组合物能够安全有效地用于治疗尖锐湿疣和子宫颈癌前病变,发明人进行了金荞麦提取物、秦皮提取物和药物组合物的动物急性毒性试验,由试验结果,发明人发现,金荞麦提取物的半数致死量(LD50)为7.85g/kg,秦皮提取物和药物组合物的最大口服给药剂量分别为10.2g/kg和11.3g/kg,由此可以推测秦皮提取物和药物组合物可能测不出半数致死量(LD50),表明本发明的药物组合物的急性毒性很小。
由此,根据本发明的实施例,本发明的药物组合物可以用于抑制HPV E7基因的表达。此外,发明人惊奇地发现,本发明的药物组合物能够用于治疗炎症。根据本发明的一些具体示例,本发明的药物组合物能够用于治疗由HPV感染引起的宫颈疾病、女阴上皮内瘤变、疣病以及皮肤癌前病变。根据本发明的一个实施例,本发明的药物组合物能够用于治疗或预防宫颈癌或宫颈癌前病变。根据本发明的另一个实施例,本发明的药物组合物能够用于治疗或预防尖锐湿疣。具体地,本发明的药物组合物能够用于由HPV感染引起的,如宫颈糜烂、宫颈癌前病变、宫颈癌等宫颈疾病;由HPV感染引起的女阴上皮内瘤变;以及由HPV感染引起的如扁平疣、寻常疣、掌跖疣、尖锐湿疣和免疫功能低下引起的传染性软疣等疣病;以及由HPV感染引起的,如角化棘皮瘤、日光性角化病、溢脂性角化病等皮肤癌前病变。
此外,发明人还发现,利用本发明实施例的药物组合物进行癌前病变和宫颈癌治疗时,前者的治疗效果优于后者。因而,优选将根据本发明实施例的药物组合物用于对宫颈癌前病变的治疗。
根据本发明的又一方面,本发明提供了根据本发明实施例的药物组合物在制备药物中的用途,该药物可以用于抑制HPV E7基因的表达。此外,发明人惊奇地发现,本发明的药物能够用于治疗炎症。根据本发明的一些具体示例,本发明的药物能够用于治疗由HPV感染引起的宫颈疾病、女阴上皮内瘤变、疣病以及皮肤癌前病变。根据本发明的一个实施例,本发明的药物能够用于治疗或预防宫颈癌或宫颈癌前病变。根据本发明的另一个实施例,本发明的药物能够用于治疗或预防尖锐湿疣。具体地,本发明的药物能够用于由HPV感染引起的,如宫颈糜烂、宫颈癌前病变、宫颈癌等宫颈疾病;由HPV感染引起的女阴上皮内瘤变;以及由HPV感染引起的如扁平疣、寻常疣、掌跖疣、尖锐湿疣和免疫功能低下引起的传染性软疣等疣病;以及由HPV感染引起的,如角化棘皮瘤、日光性角化病、溢脂性角化病等皮肤癌前病变。
根据本发明的再一方面,本发明提供了一种制备药物的方法。根据本发明的实施例,该方法包括下列步骤:制备金荞麦提取物;制备秦皮提取物;以及将金荞麦提取物和秦皮提取物按照预定的重量比率进行混合,以便得到药物,其中,制备金荞麦提取物进一步包括下列步骤:将金荞麦进行加醇提取,以便获得金荞麦提取液;以及将金荞麦提取液进行纯化、干燥,以便获得金荞麦提取物。制备秦皮提取物进一步包括下列步骤:将秦皮进行加醇提取,以便获得秦皮提取液;以及将秦皮提取液进行纯化、干燥,以便获得秦皮提取物。
利用上述制备药物的方法所得到的药物,能够有效地预防尖锐湿疣、宫颈癌及宫颈癌前病变,能够对尖锐湿疣、宫颈癌以及宫颈癌前病变进行有效地治疗。另外,发明人发现,利用该药物还能够有效用于使宫颈癌前病变细胞向良性转化,并且进一步发现,该药物可以有效地抑制E7基因的表达。此外,发明人惊奇地发现,该药物能够治疗炎症。
根据本发明的实施例,本发明的药物中金荞麦提取物与秦皮提取物的重量比例为0.5~3:1,优选金荞麦提取物与秦皮提取物的重量比例为1~2:1,最优选金荞麦提取物与秦皮提取物的重量比例为1.4:1。
根据本发明的实施例,将金荞麦进行加醇提取可以进一步包括:将金荞麦用8-12倍重量的30-60%乙醇,在50-70摄氏度下回流提取2-3次,每次0.5-2小时,并合并提取液,以便获得金荞麦提取液,优选地,将金荞麦用8倍重量的50%乙醇,在50-70摄氏度下回流提取3次,每次1小时,并合并提取液,以便获得金荞麦提取液。
根据本发明的实施例,将金荞麦提取液进行纯化、干燥可以进一步包括:
首先,将金荞麦提取液进行过滤,以便获得金荞麦提取液滤液。
其次,利用非极性大孔吸附树脂对金荞麦提取液滤液进行纯化,以便获得经过纯化的金荞麦提取液。根据本发明的具体示例,利用非极性大孔吸附树脂对金荞麦提取液滤液进行纯化,可以进一步包括将金荞麦提取液滤液上样至D101大孔吸附树脂;使用除杂洗脱剂进行除杂;以及使用洗脱溶剂进行洗脱,以便获得经过纯化的金荞麦提取液。其中,该所述金荞麦提取液滤液的上样浓度为0.02-0.20g/ml优选0.08g/ml,所述金荞麦提取滤液的最大上样量为0.2-1.0g/ml优选0.48g/ml,其上样速度为0.5-4柱体积/小时优选2柱体积/小时;除杂洗脱剂为水,其洗脱流速为3-6柱体积/小时优选4柱体积/小时;洗脱溶剂为60-90%乙醇优选70%乙醇,该洗脱溶剂的洗脱速度为1-3柱体积/小时优选2柱体积/小时。
然后,将经过纯化的金荞麦提取液进行减压浓缩和真空干燥,以便获得金荞麦提取物,其中减压浓缩是在50-60摄氏度下进行的。
根据本发明的实施例,将秦皮进行加醇提取可以进一步包括:将秦皮用8-14倍重量的70-100%乙醇,回流提取2-3次,每次0.5-2小时,并合并提取液,以便获得秦皮提取液,优选地,将秦皮用12倍重量的80%乙醇,在60摄氏度下回流提取3次,每次1小时,并合并提取液,以便获得秦皮提取液。
根据本发明的实施例,将秦皮提取液进行纯化、干燥可以进一步包括:将秦皮提取液在60摄氏度下减压干燥,并用1-5倍重量蒸馏水优选3倍重量蒸馏水进行溶解;过滤除去不溶于水的杂质并回收滤液;以及将该滤液减压浓缩、真空干燥,以便获得秦皮提取物。
根据本发明的实施例,本发明的药物可以进一步包括药学上可接受的辅料,从而可以使得药物能够呈现适于给药的形式。优选本发明的药物可以呈选自胶囊剂、丸剂、片剂、颗粒剂、口服液体、内服膏剂、栓剂、外用膏剂、外用洗剂、搽剂、气雾剂以及喷雾剂的至少一种的形式,根据本发明的具体示例,优选,使制备获得的药物呈泡腾片、软膏、栓剂及凝胶剂的形式。由此,可以方便使得根据本发明实施例的制备药物的方法制备的药物适于为对象进行给药。
根据本发明的实施例,本发明制备的药物可以用于抑制HPV E7基因的表达。此外,发明人惊奇地发现,本发明的药物能够用于治疗炎症。根据本发明的一些具体示例,本发明的药物能够用于治疗由HPV感染引起的宫颈疾病、女阴上皮内瘤变、疣病以及皮肤癌前病变。根据本发明的一个实施例,本发明的药物能够用于治疗或预防宫颈癌或宫颈癌前病变。根据本发明的另一个实施例,本发明的药物能够用于治疗或预防尖锐湿疣。具体地,本发明的药物能够用于由HPV感染引起的,如宫颈糜烂、宫颈癌前病变、宫颈癌等宫颈疾病;由HPV感染引起的女阴上皮内瘤变;以及由HPV感染引起的如扁平疣、寻常疣、掌跖疣、尖锐湿疣和免疫功能低下引起的传染性软疣等疣病;以及由HPV感染引起的,如角化棘皮瘤、日光性角化病、溢脂性角化病等皮肤癌前病变。
根据本发明的又一方面,本发明还提供了一种药物,其是通过上述制备药物的方法制备的。如前所述,利用该药物,能够有效地预防尖锐湿疣、宫颈癌及宫颈癌前病变,能够对尖锐湿疣、宫颈癌以及宫颈癌前病变进行有效地治疗。另外,发明人发现,该药物还可以有效地抑制E7基因的表达。此外,发明人惊奇地发现,该药物能够治疗炎症。
根据本发明的另一方面,本发明还提供了一种对根据本发明实施例的药物组合物或药物进行检测的方法。根据本发明的实施例,该方法包括:确定药物组合物或药物中的有效成分含量;以及将该有效成分含量与预定的阈值进行比较。在本文中所使用的术语“有效成分”是指这样一种化合物,该化合物的含量可以有效地反映药物组合物或者药物的有效性。根据本发明的一个实施例,有效成分为选自表儿茶素、秦皮甲素和秦皮乙素的至少一种。
利用根据本发明实施例的对本发明的药物组合物或药物进行检测的方法,能够有效地对药物组合物或药物进行检测,并且检测灵敏度、准确性高,稳定性好。
根据本发明的实施例,在该方法中,针对金荞麦提取物,其有效成分为表儿茶素,阈值为至少0.43mg,即针对金荞麦,药物组合物或者药物含金荞麦以表儿茶素计,每1g不得少于0.43mg。
根据本发明的实施例,在该方法中,针对秦皮提取物,其有效成分为秦皮甲素和秦皮乙素,阈值为至少6.5mg,即针对秦皮,药物组合物或者药物含秦皮以秦皮甲素和秦皮乙素计,每1g不得少于6.5mg。
根据本发明的实施例,在该方法中,当特征化合物为表儿茶素时,确定药物组合物或药物中的特征化合物含量可以进一步包括:将药物组合物或药物用由氯仿、甲醇和冰醋酸组成的提取剂进行超声提取;将提取液挥发干燥,并用甲醇溶解残渣,以便获得含有表儿茶素的甲醇溶液;以及通过色谱分析,确定该含有表儿茶素的甲醇溶液中的表儿茶素含量。由此,能够方便有效地确定药物组合物或药物中的表儿茶素含量。
根据本发明的实施例,在该方法中,当有效成分为秦皮甲素和秦皮乙素时,确定药物组合物或药物中的有效成分含量可以进一步包括:将药物组合物或药物用由氯仿和甲醇组成的提取剂进行超声提取;将提取液挥发干燥,并用甲醇溶解残渣,以便获得含有秦皮甲素和秦皮乙素的甲醇溶液;以及通过色谱分析,确定含有秦皮甲素和秦皮乙素的甲醇溶液中秦皮甲素和秦皮乙素的总含量。由此,能够方便有效地确定药物组合物或药物中的秦皮甲素和秦皮乙素的总含量。
根据本发明的具体实施例,对本发明的药物组合物或药物进行检测的方法可以包括如下:
(1)取药物组合物制剂0.2g,添加10ml体积比为1:5的氯仿-甲醇溶液,进行超声提取45分钟,其中功率250W,超声频率33KHz,然后过滤,将滤液蒸干,残渣加1ml甲醇溶解,作为供试品溶液,另取表儿茶素作为对照品,添加甲醇制成每1ml含0.1mg表儿茶素的对照品溶液。采用薄层色谱法进行试验,吸取供试品溶液、对照品溶液各5μl,分别点于同一硅胶G薄层板上,以体积比为13:4:2.5的三氯甲烷-甲醇-乙酸作为展开剂进行展开,然后将硅胶G薄层板取出,晾干,喷以5%的香草醛-浓硫酸显色剂,于105℃下加热显色至斑点清晰,在供试品色谱中,其与对照品色谱相应的位置上,会显现出相同颜色的斑点;
(2)取药物组合制剂0.2g,添加10ml甲醇,进行超声提取45分钟,其中功率250W,超声频率33KHz,然后过滤,然后过滤,将滤液蒸干,残渣加1ml甲醇溶解,作为供试品溶液。另取秦皮甲素和秦皮乙素作为对照品,添加甲醇分别制成每1ml各含1mg秦皮甲素和秦皮乙素的溶液,然后混合,作为对照品溶液。采用薄层色谱法进行试验,吸取供试品溶液、对照品溶液各10μl,分别点于同一硅胶G薄层板上,以体积比为4:1:0.2的石油醚-乙酸乙酯-冰醋酸为展开剂进行展开,然后将硅胶G薄层板取出,晾干,置于紫外灯365nm波长下进行检视,在供试品色谱中,其与对照品色谱相应的位置上,会显现出相同颜色的斑点或荧光斑点;
(3)表儿茶素的含量测定:
首先,以表儿茶素作为对照品,按照下列步骤制备对照品溶液:精密称取适量以五氧化二磷为干燥剂减压干燥24小时的表儿茶素作为对照品,添加甲醇制成每1ml含0.5mg表儿茶素的溶液,作为对照品溶液;按照下列步骤制备供试品溶液:称取药物组合物制剂样品约0.2g,置于具塞锥形瓶中,添加25ml体积比为1:5的氯仿-甲醇溶液和0.5ml冰醋酸,然后用塞将其瓶口密封,称定重量,进行超声提取60min,其中功率250W,超声频率33KHz,然后放至冷却,用甲醇补足至上次称定的重量,然后进行过滤,取5ml滤液,使其挥发干燥,然后将残渣添加适量甲醇溶解,并转移至10ml量瓶中,用甲醇稀释至刻度,摇匀,过0.22μm微孔滤膜,取滤液,作为供试品溶液。
其次,对高效液相色谱仪的色谱条件与系统适用性进行调节:5μm,250mm×4.6mm,Dikma C18色谱柱,以体积比为13:87的乙腈-0.1%柠檬酸水溶液作为流动相,流速为1ml/min,检测波长为279nm,柱温为25℃,以表儿茶素计算理论塔板数,其应不低于5000,其中表儿茶素峰与相近峰的分离度R大于1.5;
然后,采用高效液相色谱法进行表儿茶素的含量测定,分别精密吸取对照品溶液和供试品溶液各10μl,注入高效液相色谱仪,测定,计算,即得出对照品溶液和供试品溶液中表儿茶素的含量,其中,药物组合物每单位制剂含金荞麦量以表儿茶素(C15H14O6)计,不得少于0.43mg,即药物组合物中含金荞麦以表儿茶素(C15H14O6)计,每1g不得少于0.43mg。。
(4)秦皮甲素、秦皮乙素的含量测定:
首先,以秦皮甲素和秦皮乙素作为对照品,按照下列步骤制备对照品溶液:精密称取适量以五氧化二磷为干燥剂减压干燥24小时的秦皮甲素和秦皮乙素作为对照品,添加甲醇制成每1ml含秦皮甲素0.1mg、秦皮乙素60μg的混合溶液,作为对照品溶液;按照下列步骤制备对照品溶液:称取药物组合物制剂样品约0.2g,置于具塞三角锥形瓶中,添加25ml甲醇,然后用塞将其瓶口密封,称定重量,进行超声提取60min,其中功率250W,超声频率33KHz,然后放至冷却,用甲醇补足至上次称定的重量,然后进行过滤,取5ml滤液,使其挥发干燥,然后将残渣添加适量甲醇溶解,并转移至10ml量瓶中,用甲醇稀释至刻度,摇匀,过0.22μm微孔滤膜,取滤液,作为供试品溶液。
其次,对高效液相色谱仪的色谱条件与系统适用性进行调节:5μm,250mm×4.6mm,Dikma C18色谱柱,以体积比为20:80的甲醇-0.1%乙酸水溶液作为流动相,流速为1ml/min,检测波长为334nm,柱温为25℃,以秦皮乙素计算理论塔板数,其应不低于5000;
然后,采用高效液相色谱法进行秦皮甲素和秦皮乙素的含量测定,分别精密吸取对照品溶液和供试品溶液各10μl,注入高效液相色谱仪,测定,计算,即得出对照品溶液和供试品溶液中秦皮甲素和秦皮乙素的含量,其中,药物组合物制剂含秦皮以秦皮甲素(C15H16O9)和秦皮乙素(C9H6O4)的总量计,每1g不得少于6.5mg。
由此,对本发明的药物组合物或药物进行鉴别方法,采用薄层色谱法,以表儿茶素、秦皮甲素和秦皮乙素为对照品,可行性好,简单快捷;根据本发明实施例的对药物组合物或药物进行鉴定和检测的方法,采用高效液相色谱分析方法作为检测手段,以表儿茶素、秦皮甲素、秦皮乙素作为检测指标,能够有效地对本发明的药物组合物或药物进行检测,并且检测灵敏度高,准确性高,稳定性好。
需要说明的是,本发明的药物组合物及其用途是本申请的发明人经过艰苦的创造性劳动和优化工作才完成的。
本发明的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出,部分将从下面的描述中变得明显,或通过本发明的实践了解到。
附图说明
本发明的上述和/或附加的方面和优点从结合下面附图对实施例的描述中将变得明显和容易理解,其中:
图1:显示了根据本发明一个实施例的利用大孔树脂对金荞麦提取液进行纯化时,大孔树脂吸附金荞麦c的样品泄露曲线图。
具体实施方式
下面详细描述本发明的实施例,所述实施例的示例在附图中示出,其中自始至终相同或类似的标号表示相同或类似的元件或具有相同或类似功能的元件。下面通过参考附图描述的实施例是示例性的,仅用于解释本发明,而不能理解为对本发明的限制。
实施例1:金荞麦提取物制备工艺优化
本实施例通过大量的实验,对制备金荞麦提取物的方法,即金荞麦提取物制备工艺中的提取工艺和纯化工艺进行了研究,筛选出优选的提取工艺和纯化工艺,从而完成了对金荞麦提取物制备工艺的优化。
一、金荞麦提取工艺优化
采用正交试验方法,以乙醇浓度(A因素)、料液比(B因素)、提取次数(C因素)和提取时间(D因素)作为金荞麦提取工艺优化试验的试验因素,每个因素取三个水平,编制金荞麦提取工艺优化实验的因素水平表,见表1,然后基于表1,并根据四因素三水平正交试验表进行试验设计,得到实验设计表,见表2,然后根据实验设计表进行实验。
具体地,将各处理均称取50g金荞麦,然后分别根据实验设计进行金荞麦提取实验,实验基本流程为:将金荞麦用B料液比的A浓度的乙醇,在60摄氏度下进行C次的回流提取,每次提取时间为D小时,然后合并提取液,并将提取液过滤,合并滤液,于60℃下浓缩,真空干燥,以便获得初步提取物,然后将其称重;以表儿茶素为对照品,采用紫外分光光度法测定各处理所得的初步提取物中金荞麦c的含量,然后计算金荞麦c的提取率,以金荞麦c的提取率为指标,比较试验设计各处理的实验结果。其中,标准曲线的绘制按以下步骤进行:精密称取5.13mg干燥至恒重的表儿茶素对照品,置于10ml量瓶中,配制成0.513mg/ml的储备液;分别精密吸取0.1、0.2、0.4、1.0、1.5、2.0ml上述储备液,置于6个10ml容量瓶中,并用50%的乙醇稀释至刻度,然后于280nm下测定吸光度;根据吸光度绘制标准曲线。可知,表儿茶素在5.13-102.6mg/L内线性关系良好(y=0.0062x+0.1729,R2=0.9991)。
表1金荞麦提取工艺优化实验的因素水平表
水平 | A乙醇浓度(%) | B料液比 | C提取次数 | D提取时间(h) |
1 | 50 | 1:8 | 1 | 1 |
2 | 60 | 1:10 | 2 | 1.5 |
3 | 70 | 1:12 | 3 | 2 |
表2金荞麦提取工艺优化实验的实验设计表及实验结果
表3金荞麦提取工艺优化实验的实验因素方差分析结果
因素 | 离差平方和 | 自由度 | F值 | F临界值(α=0.05) | 显著性 |
A | 12146.6 | 2 | 49.21 | 19.00 | * |
B | 2136.8 | 2 | 8.66 | 19.00 | |
C | 4779.0 | 2 | 19.36 | 19.00 | * |
D | 246.8 | 2 | 1.00 | 19.00 |
*F值>F临界值(α=0.05),关于数值的计算,可以参见具体可参看刘定远主编《医药数理统计方法》,人民卫生出版社,234页附表8,在此将其通过参照并入此处。
由表2和表3可知,乙醇的浓度和提取次数对金荞麦c的提取率有显著性影响;各因素对金荞麦c的提取率的影响强度依次为A>C>B>D,即乙醇浓度>提取次数>料液比>提取时间。由以上试验结果,并结合实际生产,最终确定优选的金荞麦提取工艺为A1B1C3D1,即利用8倍量50%的乙醇回流提取3次,每次1h,进行金荞麦提取。
二、金荞麦纯化(即对金荞麦提取液进行纯化)工艺优化
利用本实施例中上述优选的金荞麦提取工艺,制备多种浓度的金荞麦提取液,并以表儿茶素为对照品,采用紫外分光光度法,在280nm波长下测定各浓度的金荞麦提取液中金荞麦c的含量,备用。
采用单因素试验法,分别以大孔吸附树脂型号、上样浓度、上样速度、最大上样量、除杂洗脱剂种类及用量、洗脱溶剂浓度和用量以及洗脱溶剂流速作为金荞麦纯化工艺优化试验的试验因素,进行试验设计,并利用制备的金荞麦提取液进行下列实验。
1、大孔树脂型号的选择:
本试验选择了3种树脂纯化酚类常用的树脂:D101(非极性)、DM130(中等极性)和HPD600(极性)大孔树脂,其物理参数如表4所示。
表4 3种不同型号的大孔树脂的物理参数
以分别采用D101、DM130和HPD600大孔树脂进行金荞麦纯化,作为三种处理,按照以下步骤进行大孔树脂型号选择的实验:将各种树脂分别取20ml,每种3份,采用湿法分别装于各规格相同的柱中并分别取20ml上述制备的相同浓度的金荞麦提取液(1ml金荞麦提取液相当于0.05g金荞麦提取物)进行上样,上样速度为1柱体积/小时,然后收集上样流出液,使大孔树脂对金荞麦提取液吸附120min后,用100ml水作为除杂洗脱剂对柱进行洗脱,水的流速为1柱体积/小时,然后收集水洗脱液,再以100ml 95%乙醇洗脱,乙醇流速为1柱体积/小时,收集乙醇洗脱液。以表儿茶素为对照品,采用紫外分光光度法,在280nm波长下测定上样流出液、水洗脱液、乙醇洗脱液中金荞麦c的含量,并根据下列公式计算得出各种型号的大孔树脂对金荞麦c的比吸附量和洗脱率:
比吸附量=(上样金荞麦提取液的金荞麦c量-上样流出液的金荞麦c量-水洗脱液的金荞麦c量)/树脂体积;
洗脱率=乙醇洗脱液的金荞麦c量/饱和吸附量×100%,饱和吸附量=上样金荞麦提取液的金荞麦c量-上样流出液的金荞麦c量-水洗脱液的金荞麦c量
即为大孔树脂型号选择实验结果,见下表5。
表5三种型号树脂对金荞麦c的比吸附量和洗脱率
树脂型号 | 比吸附量(g·L-1) | 洗脱率(%) |
D-101 | 60.38 | 93.62 |
HPD-600 | 58.61 | 89.30 |
DM-130 | 62.99 | 85.69 |
表5显示了三种型号的树脂对金荞麦c的比吸附量和洗脱率。由表5可知,三种型号的树脂对金荞麦c的吸附能力大小依次为DM-130>D-101>HPD-600,洗脱率大小依次为D-101>HPD-600>DM-130,则D101大孔树脂对金荞麦c的吸附能力和洗脱效果较好,能达到好的纯化效果,因此,优选地,采用D-101大孔树脂进行金荞麦纯化。
2、上样浓度的选择
以分别采用三种上样浓度进行金荞麦纯化,作为三种处理,按照以下步骤进行上样浓度选择的实验:分别称取三份D-101大孔树脂,每份25ml,将树脂分别装入各柱中,然后将上述制备的金荞麦提取液,分别取80ml 0.04g/ml的金荞麦提取液、40ml 0.08g/ml的金荞麦提取液和20ml 0.16g/ml的金荞麦提取液,以1柱体积/小时的流速分别上样至层析柱中,收集上样流出液,使大孔树脂对金荞麦提取液吸附120min后,用150ml水作为除杂洗脱剂对层析柱进行洗脱,水的流速为1柱体积/小时,然后收集水洗脱液。以表儿茶素为对照品,采用紫外分光光度法,在280nm波长下测定上样流出液和水洗脱液中金荞麦c的含量,并根据上述公式计算得出D-101大孔树脂对金荞麦c的比吸附量,即为上样浓度选择实验结果,见表6。
表6上样浓度选择实验结果
上样浓度(g提取物/ml) | 金荞麦c比吸附量(mg/g) |
0.04 | 58.66 |
0.08 | 63.36 |
0.16 | 62.56 |
表6显示了采用三种上样浓度进行金荞麦纯化时,各处理的D-101大孔树脂对金荞麦c的比吸附量。由表6可知,上样浓度为0.08g/ml时,D-101大孔树脂对金荞麦c的比吸附量最大,当上样浓度达到0.16g/ml时,比吸附量反而下降,说明该浓度时D-101大孔树脂对金荞麦c的吸附过载,打破了吸附的平衡,吸附量下降,因此,优选地,采用0.08g/ml的上样浓度进行金荞麦纯化。
3、上样速度的选择
以分别采用三种上样速度进行金荞麦纯化,作为三种处理,按照以下步骤进行上样速度选择的实验:取40ml上述制备的0.08g/ml的金荞麦提取液,分别以1柱体积/小时、2柱体积/小时和4柱体积/小时的速度进行上样,收集上样流出液,使大孔树脂对金荞麦提取液吸附120min后,用150ml水作为除杂洗脱剂进行洗脱,水的流速为1柱体积/小时,然后收集水洗脱液。以表儿茶素为对照品,采用紫外分光光度法,在280nm波长下测定上样流出液和水洗脱液中金荞麦c的含量,并根据上述公式计算得出大孔树脂对金荞麦c的比吸附量,即为上样速度选择实验结果,见表7。
表7上样速度选择实验结果
上样速度(柱体积/小时) | 金荞麦c比吸附量(mg/g) |
1 | 62.98 |
2 | 64.56 |
4 | 59.23 |
表7显示了采用三种上样速度进行金荞麦纯化时,各处理的大孔树脂对金荞麦c的比吸附量。由表7可知,上样速度为2柱体积/小时时,大孔树脂对金荞麦c的比吸附量最大,当上样速度达到4柱体积/小时时,比吸附量降低,这可能是由于金荞麦提取液流速过快时,被大孔树脂吸附的物质分子尚未扩散到树脂的内表面,就已经泄露,因此,优选地,采用2柱体积/小时的上样速度进行金荞麦纯化。
4、最大上样量的选择
取250ml上述制备的0.08g/ml的金荞麦提取液,以2柱体积/小时的上样速度上样至25ml D-101树脂柱上,分别依次上样10个柱体积,收集各次上样的上样流出液。以表儿茶素为对照品,采用紫外分光光度法,在280nm波长下测定各上样流出液中金荞麦c的含量,并根据公式计算得出大孔树脂对金荞麦c进行吸附时的样品泄露率,结果见表8。
样品泄漏率=上样流出液的金荞麦c量/上样金荞麦提取液的金荞麦c量
表8最大上样量选择实验结果
序号 | 上样量(ml) | 样品泄露率(%) |
1 | 25 | 0.62 |
2 | 25 | 1.26 |
3 | 25 | 3.29 |
4 | 25 | 5.37 |
5 | 25 | 7.84 |
6 | 25 | 9.56 |
7 | 25 | 11.89 |
8 | 25 | 18.33 |
9 | 25 | 34.28 |
10 | 25 | 57.63 |
根据表8的数据,以上样量为横坐标,以样品泄露百分率为纵坐标,绘制大孔树脂对金荞麦c进行吸附时样品的泄露曲线图,见图1。从图1可知,第7次上样时,金荞麦c的泄露率大于10%,表明上样量大于6个柱体积后,金荞麦c的泄露率过大,因此,优选地,进行金荞麦纯化时,最大上样量为将0.08g/ml的金荞麦提取液上样6个柱体积,即金荞麦样品的最大上样量为0.48g提取物/ml树脂,即每1ml树脂吸附相当于金荞麦提取物0.48克。
5、除杂洗脱剂种类及用量的选择:
以分别采用三种种类及用量的除杂洗脱剂进行金荞麦纯化,作为三种处理,按照以下步骤进行除杂洗脱剂用量选择的实验:分别取三份前述制备的0.08g/ml的金荞麦提取液,每份150ml,以2柱体积/小时的速度分别上样至各25ml的D-101树脂柱上,吸附4h,然后分别用150ml的水、150ml 10%的乙醇、150ml 20%的乙醇作为除杂洗脱剂进行洗脱,洗脱速度为4柱体积/小时,收集洗脱液,然后将各洗脱液与三氯化铁进行反应,以检测各除杂洗脱剂的除杂效果,检测结果表明,当用150ml的水作为除杂洗脱剂进行洗脱时,洗脱液与三氯化铁的反应呈阴性,且在洗脱6个柱体积后,其洗脱液基本无色,表明洗脱完全;当用10%的乙醇和20%的乙醇作为除杂洗脱剂进行洗脱时,洗脱液与三氯化铁的反应均呈阳性,表明有效成分泄露,因此,优选地,进行金荞麦纯化时,选择水作为除杂洗脱剂,且其洗脱速度为4柱体积/小时,洗脱体积为6个柱体积。
6、洗脱溶剂浓度和用量的选择:
以分别采用三种浓度及用量的洗脱溶剂进行金荞麦纯化,作为三种处理,按照以下步骤进行洗脱溶剂浓度和用量选择的实验:分别取六份前述制备的0.08g/ml的金荞麦提取液,每份150ml,以2柱体积/小时的速度分别上样至各25ml的D-101树脂柱上,吸附4h,用150ml的水除杂后,分别用200ml(8个柱体积)的40%、50%、60%、70%、80%、90%的乙醇作为洗脱溶剂进行洗脱,每洗脱50ml(2个柱体积)后,收集各乙醇洗脱液,然后将各乙醇洗脱液稀释100倍。以表儿茶素为对照品,采用紫外分光光度法,在280nm波长下测定各乙醇洗脱液100倍稀释液中金荞麦c的含量,结果见表9。
表9洗脱溶剂浓度和用量选择实验结果
由表9可知,当采用40%、50%、60%的乙醇作为洗脱溶剂进行洗脱时,洗脱速度较慢,且洗脱八个柱体积时仍未洗脱完全,当采用70%、80%和90%的乙醇作为洗脱溶剂进行洗脱时,能达到洗脱目的,洗脱效果较好,而基于对成本的考虑,优选地,进行金荞麦纯化时,选择70%的乙醇作为洗脱溶剂,且洗脱8个柱体积。
7、洗脱溶剂洗脱流速的选择:
以将洗脱溶剂分别采用三种洗脱流速进行金荞麦纯化,作为三种处理,按照以下步骤进行洗脱溶剂洗脱流速选择的实验:分别取3份前述制备的0.08g/ml金荞麦提取液,每份150ml,以2柱体积/小时的速度上样至25ml D-101树脂柱上,吸附4h,分别用150ml的水作为除杂洗脱剂进行洗脱除杂后,以70%的乙醇作为洗脱溶剂,分别采用1柱体积/小时,2柱体积/小时和4柱体积/小时的洗脱流速进行洗脱,洗脱200ml(8柱体积)后,分别收集各乙醇洗脱液,并将其稀释500倍。以表儿茶素为对照品,采用紫外分光光度法,在280nm波长下测定各乙醇洗脱液的500倍稀释液中金荞麦c的含量,结果见表10。
表10不同洗脱流速的洗脱效果
由表10可知,当将洗脱溶剂采用1柱体积/小时和2柱体积/小时的洗脱流速进行洗脱时,均能达到洗脱目的,洗脱效果较好,而当将洗脱溶剂采用4柱体积/小时的洗脱流速进行洗脱时,可能由于流速太快,导致洗脱不完全,因此,基于节省时间的考虑,优选地,进行金荞麦纯化时,选择2柱体积/小时作为洗脱溶剂的洗脱流速。
由此,通过上述采用单因素试验法进行的金荞麦纯化工艺优化试验,发明人优选出最佳的上样和洗脱条件:上样浓度为0.08g/ml,上样速度为2柱体积/小时,最大上样量为每1ml树脂吸附相当于金荞麦提取物0.48克,选择水作为除杂洗脱剂,洗脱6个柱体积,除杂洗脱速度为4柱体积/小时,选择70%乙醇作为洗脱溶剂,洗脱流速为2柱体积/小时,洗脱8个柱体积。
因此,根据本实施例,综合金荞麦提取工艺优化和金荞麦纯化工艺优化的实验结果,优选地,金荞麦提取物制备过程如下:
取金荞麦药材,粉碎,然后利用8倍重量的50%乙醇,在60℃下回流提取3次,每次1小时,并合并提取液,然后于60℃下减压浓缩至无醇味,再添加1倍药材重量的水充分溶解,然后抽滤获得滤液,备用,接着利用D101大孔吸附树脂将滤液分离纯化,其中滤液的上样浓度选择每1毫升滤液相当于0.08克的金荞麦提取物,最大上样量为树脂吸附的每1毫升滤液相当于0.48克的金荞麦提取物,上样速度为2柱体积/小时,吸附4小时后,先用6个柱体积的水洗脱除杂,其洗脱流速为4柱体积/小时,再用8个柱体积的70%乙醇洗脱,其洗脱流速为2柱体积/小时,然后回收乙醇洗脱部分,于60℃下减压浓缩干燥,然后真空干燥、粉碎,得金荞麦提取物。
实施例2:秦皮提取物制备工艺优化
本实施例通过大量的实验,对制备秦皮提取物的方法,即秦皮提取物制备工艺中的提取工艺和纯化工艺进行了研究,筛选出优选的提取工艺和纯化工艺,从而完成了对秦皮提取物制备工艺的优化。
一、提取条件的优选
采用正交试验的方法,以乙醇浓度(A因素)、料液比(B因素)、提取次数(C因素)、提取时间(D因素)作为秦皮提取工艺优化试验的试验因素,每个因素取三个水平,编制秦皮提取工艺优化实验的因素水平表,见表11,然后基于表11,并根据四因素三水平正交试验表进行试验设计,得到实验设计表,见表12,然后根据实验设计表进行实验。
具体地,将各处理均称取50g秦皮,然后分别根据实验设计进行秦皮提取实验,实验基本流程为:将秦皮用B料液比的A浓度的乙醇,在60摄氏度下进行C次的回流提取,每次提取时间为D小时,然后合并提取液,并将提取液过滤,合并滤液,于60℃下浓缩,真空干燥,以便获得初步提取物,然后将其称重;以秦皮甲素和秦皮乙素为对照品,采用正交试验方法,对影响将秦皮进行加醇提取,即秦皮提取工艺的四个因素进行分析,优选出秦皮提取的最佳工艺;采用高效液相色谱法测定各处理从秦皮中所得的初步提取物中秦皮甲素和秦皮乙素的总含量,然后计算秦皮甲素和秦皮乙素的提取率,以其为指标,比较试验设计各处理的实验结果。
表11秦皮提取工艺优化实验的因素水平表
水平 | A乙醇浓度(%) | B料液比 | C提取次数 | D提取时间(h) |
1 | 60 | 1:8 | 1 | 1 |
2 | 70 | 1:10 | 2 | 1.5 |
3 | 80 | 1:12 | 3 | 2 |
表12秦皮提取工艺优化实验的实验设计表及实验结果
表13秦皮提取工艺优化实验的实验因素方差分析结果
注:*F值>F临界值(α=0.05)
由表12可知,4个因素对秦皮中秦皮甲素和秦皮乙素提取率的影响程度依次为A>B>C>D,即乙醇浓度>料液比>提取次数>提取时间;由表13中的方差分析结果可知,A、B、C因素对秦皮有效成分的提取率有显著性影响,其最优组合为A3B3C3D3,即乙醇浓度为80%,提取次数3次,提取时间2h,料液比为1:12(g:ml)。由以上试验结果,并结合实际生产,将最优组合A3B3C3D3中不具有显著性影响的因素D(提取时间),调整为1h,以节约时间,降低成本,因此,最终确定优选的秦皮提取工艺为A3B3C3D1,即利用12倍量80%的乙醇回流提取3次,每次1h,进行秦皮提取。
二、秦皮纯化(即对秦皮提取物进行纯化)工艺优化
采用单因素试验法,以用于溶解并除杂的蒸馏水的重量作为秦皮纯化工艺优化试验的试验因素,取三个水平,进行实验设计,然后按照以下步骤进行实验:利用本实施例中上述优选的秦皮提取工艺,取三份秦皮药材,每份100g,粉碎成粗粉,加12倍量的80%乙醇,于60℃下回流提取三次,每次1h,然后合并滤液,于60℃下减压回收、干燥,以便获得3份秦皮初步提取物,然后分别向3份秦皮初步提取物中添加其重量的2倍量、3倍量、4倍量的水使其溶解,以获得三份浸膏,将浸膏过滤除去水不溶物后,于60℃下减压浓缩、干燥,然后真空干燥,以便获得纯化的秦皮提取物,并称重;以秦皮甲素和秦皮乙素为对照品,采用高效液相色谱法,测定纯化的秦皮提取物中秦皮甲素和秦皮乙素的总含量,并计算纯化的秦皮提取物中秦皮甲素和秦皮乙素的提取率,以其为指标,比较试验设计各处理的实验结果。
表14秦皮提取工艺优化实验的实验设计表及实验结果
除杂水体积(ml) | 秦皮甲素及秦皮乙素提取率(mg/g) |
20ml(2倍量) | 14.145 |
30ml(3倍量) | 17.634 |
40ml(4倍量) | 15.256 |
由表14可知,采用秦皮初步提取物的3倍量的水对秦皮初步提取物进行溶解和除杂,所得的纯化的秦皮提取物中秦皮甲素和秦皮乙素的提取率最高,达到了对秦皮初步提取物进行纯化的目的。因此,优选地,进行秦皮纯化时,采用3倍秦皮初步提取物重量的水进行溶解除杂。
因此,根据本实施例,综合秦皮提取工艺优化和秦皮纯化工艺优化的实验结果,优选地,秦皮提取物制备过程如下:
取秦皮药材,粉碎,然后利用12倍重量的80%乙醇,在60℃下回流提取3次,每次1小时,并合并提取液,然后于60℃下减压回收、干燥,再添加3倍药材重量的的蒸馏水充分溶解,然后过滤去除不溶于水的杂质,以便获得滤液,将滤液减压浓缩干燥,然后真空干燥,得秦皮提取物。
实施例3:金荞麦提取物、秦皮提取物及药物组合物对人宫颈癌HeLa细胞HPV18型E7基因表达的影响
1.材料
取对数生长期HeLa细胞,以1×106个/ml的密度接种于六孔板中,每孔1ml,于37℃下,5%CO2,饱和湿度条件下培养24h,作为实验细胞株。
受试药物:金荞麦提取物(根据实施例1制备)、秦皮提取物(根据实施例2制备)、药物组合物(将金荞麦提取物、秦皮提取物分别配置成母液,然后将母液按比例进行混合制备成药物组合物);阳性药物:阿昔洛韦。
2.实验方法及实验结果
向培养24h的HeLa细胞中分别添加细胞毒作用低于5%的不同浓度的受试药物,然后继续培养72h,加药浓度如下表15所示。其中,本实施例以阿昔洛韦为阳性对照,并另设空白对照组(空白对照组为不加药的Hela细胞)。然后利用实时荧光定量PCR法对各组的E7基因的表达量进行检测,并分别计算金荞麦提取物、秦皮提取物及药物组合物作用于HeLa细胞后,其中的E7基因的相对表达倍数,结果见下表16、表17和表18。
表15各受试药物的加药浓度(mg/ml)
P(μM) | A(mg/ml) | B(mg/ml) | C(mg/ml) | D(mg/ml) | |
金荞麦提取物 | 25 | 0.05 | 0.10 | 0.20 | 0.40 |
P(μM) | E(mg/ml) | F(mg/ml) | G(mg/ml) | H(mg/ml) | |
秦皮提取物 | 25 | 0.10 | 0.20 | 0.40 | 0.80 |
P(μM) | I(mg/ml) | J(mg/ml) | K(mg/ml) | L(mg/ml) | |
药物组合物 | 50 | 0.05+0.10 | 0.10+0.20 | 0.20+0.40 | 0.40+0.80 |
注:P为阳性对照药组,其中阳性对照药为阿昔洛韦。
表16金荞麦提取物对HeLa细胞内E7基因的相对表达倍数的影响
组别 | 空白对照 | 阳性对照 | A | B | C | D |
1 | 1.1371 | 0.4201 | 0.8956 | 0.4236 | 0.2589 | 0.0012 |
2 | 1.2584 | 0.5984 | 0.9521 | 0.4369 | 0.2149 | 0.0024 |
3 | 1.0242 | 0.6214 | 1.1203 | 0.3954 | 0.1784 | 0.0006 |
AVE | 1.1398 | 0.5466** | 0.9893 | 0.4186** | 0.2174** | 0.0014** |
SD | 0.1171 | 0.1101 | 0.1169 | 0.0212 | 0.0403 | 0.0009 |
注:AVE表示重复3次的实验数据的平均值,SD表示这些实验数据的标准偏差,
**与空白对照组相比,P<0.01。
表17秦皮提取物对HeLa细胞内E7基因的相对表达倍数的影响
组别 | 空白对照 | 阳性对照 | E | F | G | H |
1 | 1.2471 | 0.6986 | 0.9562 | 0.3956 | 0.1125 | 0.0005 |
2 | 0.9963 | 0.7542 | 0.6583 | 0.2967 | 0.1389 | 0.0095 |
3 | 1.4856 | 0.5863 | 1.2698 | 0.4856 | 0.1689 | 0.0556 |
AVE | 1.2430 | 0.6797* | 0.9614 | 0.3926** | 0.1401** | 0.0219** |
SD | 0.2447 | 0.0855 | 0.3058 | 0.0944 | 0.0282 | 0.0296 |
注:AVE表示重复3次的实验数据的平均值,SD表示这些实验数据的标准偏差,
*与空白对照组相比,P<0.05;与空白对照组相比,**为P<0.01。
表18药物组合物对HeLa细胞内E7基因的相对表达倍数的影响
组别 | 空白对照 | 阳性对照 | I | J | K | L |
1 | 1.3245 | 0.4269 | 0.4891 | 0.0658 | 3.69E-05 | 6.98E-06 |
2 | 1.5431 | 0.3589 | 0.4251 | 0.0396 | 5.87E-05 | 2.38E-06 |
3 | 1.1256 | 0.5021 | 0.5987 | 0.0196 | 1.69E-06 | 1.47E-06 |
AVE | 1.3311 | 0.4293** | 0.5043** | 0.0417** | 3.75E-05** | 3.61E-06** |
STD | 0.2088 | 0.0716 | 0.0878 | 0.0232 | 2.09E-05 | 2.95E-06 |
注:AVE表示重复3次的实验数据的平均值,SD表示这些实验数据的标准偏差,
**与空白对照组相比,P<0.01。
由表16可知,不同浓度的金荞麦提取物作用于HeLa细胞72h后,细胞内E7基因的相对表达倍数与空白对照组相比有降低的趋势,其中0.10mg/ml、0.20mg/ml、0.40mg/ml浓度组与空白对照组相比有显著性差异(P<0.01),且呈浓度依赖关系;其中0.40mg/ml浓度的金荞麦提取物对E7表达的抑制率已经达到99%。
由表17可知,不同浓度的秦皮提取物作用于HeLa细胞72h后,HeLa细胞内E7基因相对表达倍数与空白对照组相比也有降低的趋势,并呈浓度依赖关系,0.20mg/ml、0.40mg/ml和0.80mg/ml浓度组与空白对照组相比有显著性差异(P<0.01),对HeLa细胞E7基因表达的抑制率分别达到68.4%、88.7%和98.2%。
由表18可知,各浓度的药物组合物对HeLa细胞内E7基因相对表达的抑制率均大于相应浓度的单独给药组,其所有浓度组与空白对照组相比均有显著性差异(P<0.01)。
3.试验结果分析
综合上述实验结果可知,金荞麦提取物和秦皮提取物组方成药物组合物后较单独给药有增效的作用。0.20mg/ml的金荞麦提取物和0.10mg/ml的秦皮提取物组方后对HeLa细胞内HPV E7基因相对表达的抑制作用明显升高,表明本发明的药物组合物对HeLa细胞HPV E7基因表达的抑制作用显著,也从分子水平上证明该药物组合物能够用于治疗由HPV感染引起的,如宫颈糜烂、宫颈癌前病变、宫颈癌等宫颈疾病;由HPV感染引起的女阴上皮内瘤变;以及由HPV感染引起的如扁平疣、寻常疣、掌跖疣、尖锐湿疣和免疫功能低下引起的传染性软疣等疣病;以及由HPV感染引起的,如角化棘皮瘤、日光性角化病、溢脂性角化病等皮肤癌前病变。
实施例4:药物组合物体外抗HPV活性的最佳配比研究
1.材料
取对数生长期HeLa细胞,以1×106个/ml的密度接种于六孔板中,每孔1ml,于37℃下,5%CO2,饱和湿度条件下培养24h,作为实验细胞株。
受试药物:金荞麦、秦皮提取物组成的不同配比的药物组合物药液;阳性药物:阿昔洛韦。
2.实验方法及实验结果
向培养24h的HeLa细胞中分别添加细胞毒作用低于5%的不同浓度的受试药物,然后继续培养72h,各药物组合物中金荞麦、秦皮提取物的比例如下表19所示,然后利用实时荧光定量PCR法对各组的E7基因的表达量进行检测。
表19最佳配比实验中各组的药物组合物的加药浓度(μg/ml)
在上一步的利用实时荧光定量PCR法对各组的E7基因的表达量进行检测后,以β-肌动蛋白(actin)为内参对照基因,应用SYBR荧光探针,采用实时荧光定量PCR法观察不同配比的药物组合物对HeLa细胞内E7基因的影响,实验结果见下表20。
表20不同配比的药物组合物对E7基因相对表达倍数的影响(n=4***)
组别 | 比例 | 基因相对表达倍数(Mean±S) | 抑制率(%) |
空白对照 | - | 1.000±0.000 | - |
A | 5:1 | 0.589±0.267** | 41.147 |
B | 3:1 | 0.398±0.101** | 60.231 |
C | 2:1 | 0.177±0.069** | 82.308 |
D | 1.4:1 | 0.129±0.071** | 87.156 |
E | 1:1 | 0.189±0.095** | 81.124 |
F | 1:1.4 | 0.263±0.149* | 73.711 |
G | 1:2 | 0.399±0.096* | 60.104 |
H | 1:3 | 0.476±0.156 | 52.423 |
I | 1:5 | 0.638±0.418 | 36.206 |
注:*与空白对照组相比,P<0.05;
**与空白对照组相比,P<0.01;
***n=4,代表每组均做了4个数据值出来,举例说明:如D组的值0.129±0.071,
0.129是这4个数据的平均值,0.071是由这4个值算出来的S值(标准偏差)。
3.试验结果评价
实施例3的试验结果表明,药物组合物在抗HPV病毒及抑制E7基因表达方面明显优于单独使用金荞麦或者秦皮提取物,这意味着两味药的组合具有协同效应且0.30mg/ml的药物组合物对HeLa细胞E7基因表达有抑制作用,但该浓度的药物组合物无法完全抑制E7基因的表达。因此,本实施例在实施例3的基础上,将受试药物的总浓度选取为0.30mg/ml,然后在此浓度条件下,通过采用金荞麦提取物和秦皮提取物配比不同的药物组合物对HeLa细胞进行处理,从而进行的最佳配比的药物组合物的筛选。
表20的数据,显示了不同配比的金荞麦和秦皮提取物药物组合物作用于HeLa细胞72h后,对细胞内HPVE7基因的相对表达量的影响。
由表20可见,不同配比的金荞麦提取物和秦皮提取物药物组合作用于HeLa细胞72h后,细胞内E7基因的相对表达量与正常对照组相比均有降低的趋势;随着秦皮提取物在药物组合物中比例的升高,E7基因的相对表达量呈逐渐降低的趋势,当金荞麦提取物和秦皮提取物的比例分别在3:1、2:1、1.4:1、1:1、1:1.4、1:2时,对E7基因的相对表达抑制作用显著,抑制率最高达到87.156%,相比金荞麦提取物和秦皮提取物的配比为1:2的药物组合物,其对E7基因的抑制率提高了20.1%,表明药物组合物中金荞麦提取物和秦皮提取物的配比与药效的发挥具有很明显的相关性,但2:1、1.4:1、1:1这三种比例的药物组合物对E7基因的相对表达抑制率接近。当秦皮提取物的比例继续升高,使得药物组合物中金荞麦秦皮提取物比例为1:5时,其对E7基因的相对表达抑制率降低。当金荞麦秦皮比例在1.4:1时,作用于HeLa细胞72h后,其对HeLa细胞E7基因的抑制作用最显著,即当金荞麦秦皮比例在1.4:1时,能够使该药物组合物发挥最佳疗效。
实施例5:金荞麦提取物、秦皮提取物及药物组合物的抗炎效果
1.动物及材料:
健康昆明种小鼠70只,雌雄各半,体重18-22g,健康状况良好,由武汉大学医学院实验动物中心提供,动物合格证号:19-013。
受试药物:金荞麦提取物(根据实施例1制备);秦皮提取物(根据实施例2制备);将金荞麦提取物(根据实施例1制备)和秦皮提取物(根据实施例2制备)按1.4:1的重量比均匀混合制备成的药物组合物;以阿司匹林为阳性对照药。
2.试验方法
将小鼠随机分为7组,每组10只。其中两组为空白对照组和阳性对照组,另五组为试验组,即药物组合物的低、中、高三个不同剂量组、金荞麦提取物和秦皮提取物的单独给药组。分别对各组小鼠进行灌胃给药实验,其中,对药物组合物的低、中、高三个不同剂量组的小鼠分别采用0.3g/kg、0.6g/kg和1.2g/kg的药物组合物混悬液进行灌胃给药,对金荞麦提取物单独给药组采用0.6g/kg的金荞麦提取物混悬液进行灌胃给药,秦皮提取物单独给药组采用0.6g/kg的秦皮提取物混悬液进行灌胃给药,阳性对照组采用0.1g/kg的阿司匹林混悬液进行灌胃给药,空白对照组采用0.5%的CMC-Na进行灌胃给药,每天1次,连续3d。进行最后一次灌胃给药2h后,利用二甲苯对小鼠进行致炎实验:以每只小鼠50微升的量,将二甲苯涂于小鼠右耳两面致炎,30min后处死动物,沿耳廓基线剪下双耳,分别用直径9mm打孔器在左右耳相对称部位取下耳片称重,观察小鼠耳廓肿胀情况,并计算耳肿胀度(耳肿胀度=左耳廓重-右耳廓重),结果见表21。
注:*与空白对照组比较,P<0.05。
3.试验结果评价
由表21可知,药物组合物的高、中、低剂量组均能明显对抗二甲苯所致的小鼠耳廓肿胀,其与空白对照组比较有显著性差异(P<0.05),表明本发明的药物组合物有较强的抗炎作用,并且该药物组合物的抗炎作用明显高于单独使用金荞麦提取物或秦皮提取物的效果,从而证明了金荞麦提取物与秦皮提取物进行组合,具有协同效应。
实施例6:金荞麦提取物、秦皮提取物及药物组合物对离体尖锐湿疣的HPV-DNA扩增的影响
1.材料
尖锐湿疣混悬液的制备:采集来自于尖锐湿疣患者外阴部位典型新鲜的疣体标本(经鉴定为HPV6/11型),精确称其重量后,加少量生理盐水,匀浆器匀浆,制成疣体混悬液,然后分别提取HPV-DNA,用荧光定量聚合酶链反应(FQ-PCR)仪扩增HPV-DNA,根据扩增结果,选取细胞密度为106个/ml时的尖锐湿疣混悬液,备用。
受试药物:金荞麦提取物(根据实施例1制备);秦皮提取物(根据实施例2制备);将金荞麦提取物(根据实施例1制备)和秦皮提取物(根据实施例2制备)按1.4:1的重量比均匀混合制备成的药物组合物;以阿昔洛韦作为阳性对照药。
2.试验方法
以100μM阿昔洛韦作为阳性对照,生理盐水作为空白对照,以0.5mg/ml、1mg/ml和1.5mg/ml三种浓度的的金荞麦提取物、秦皮提取物和药物组合物作为受试药物组,分别取0.5ml受试药物至于装有0.5ml上述制备的尖锐湿疣混悬液的1.5ml离心管中,震荡混匀,置于37℃的水浴箱培养,然后分别在培养2,4,6d后,采用荧光定量聚合酶链反应(FQ-PCR)技术检测各管尖锐湿疣混悬液中HPV-DNA的扩增情况,结果见表22。
表22各受试药物对尖锐湿疣混悬液中HPV-DNA扩增的影响
其中,表22中的数据表示FQ-PCR检测所得的尖锐湿疣混悬液中的HPV病毒经各受试药物作用后的DNA数值,“—”为检测结果阴性(拷贝指数小于103),表明病毒DNA被破坏而扩增受到抑制;阳性结果以DNA扩增的定量对数的平均值表示(单位为“拷贝/ml”),表明病毒没受到破坏,其DNA仍然能够大量扩增。
3.试验结果评价
本实施例采用FQ-PCR技术从药物组合物、单独药物、药物浓度及作用时间四方面,观察不同情况下受试药物对离体尖锐湿疣组织中HPV-DNA的影响,结果表明金荞麦和秦皮提取物对HPV-DNA有明显的破坏作用,而将金荞麦和秦皮提取物进行组合之后,发现所得的药物组合物对HPV病毒有更强的杀灭作用,证明了金荞麦提取物与秦皮提取物进行组合,具有协同效应。而两种提取物无论是单独使用还是组合使用,其抗HPV病毒作用均要强于100μM的阿昔洛韦。本实施例的研究结果为进一步研究本发明的药物组合物对抗HPV病毒的作用,以便用于制备治疗尖锐湿疣的药物,提供了科学依据。
实施例7:药物组合物对宫颈癌HeLa细胞的增殖抑制作用
1.实验细胞株及试验药物:
实验细胞株:人宫颈癌细胞株HeLa细胞(中国医学科学院肿瘤医院惠赠)。
金荞麦提取物(根据实施例1制备)、秦皮提取物(根据实施例2制备)。
2.方法:
2.1细胞培养:将冻存的宫颈癌HeLa细胞于37℃下快速融解,然后放在含10%胎牛血清的DMEM培养液中,于37℃、5%CO2的培养箱内培养,当细胞贴壁80%时进行传代,1周2次。
2.2细胞增殖抑制实验:取对数生长期的HeLa细胞,以1×106个/ml的密度接种于六孔板中,每孔1ml,于37℃,5%CO2,饱和湿度的条件下培养24h后,分别添加不同浓度的金荞麦、秦皮提取物组成的药物组合物(具体见表23),对照组仅加生理盐水。分别培养24h、48h、72h后,添加20μl 5mg/ml的MTT,于37℃下孵育4h,然后弃上清,每孔添加200μl DMSO,振荡,使结晶溶解,然后用酶标仪检测其在570nm处的吸光度(OD)值,并计算细胞生长抑制率,公式如下:细胞生长抑制率=(1-各药物处理组OD均值/空白对照组OD均值)×l00%。
2.3流式细胞仪检测细胞凋亡率:收集经过不同浓度(具体见表24)和不同时间(24h,48h,72h)的药物组合物处理后的细胞,利用EDTA进行消化,然后收集1×106个细胞,于1000r/min下离心5min,弃上清,然后用经过4℃预冷的PBS洗涤细胞,再于1000r/min下离心5min并弃上清(2次),然后用250μl的结合缓冲液重新悬浮细胞,取100μl细胞悬浮于5ml流式管中,然后添加5μl的AnnexinV/FITC(AnnexinⅤ是一种分子量为35-36kD的钙离子依赖性磷脂结合蛋白,能与细胞凋亡过程中翻转到膜外的PS高亲和力特异性结合,Annexin V常被作为检测细胞早期凋亡的灵敏指标之一,用带有绿色荧光的荧光探针FITC标记的Annexin V,即Annexin V-FITC)和10μl 20mg/L的PI(碘化丙啶),混匀后避光孵育15min,再在反应管中添加400μl PBS,然后利用流式细胞仪(FCM)分析细胞凋亡情况。
3.试验结果
3.1细胞增殖抑制实验:药物处理组与空白对照组比较,各浓度的药物组OD值均明显低于对照组(P<0.01),结果见表23。且随着给药浓度的升高,各浓度的药物组OD值逐渐降低,各组比较均有显著性差异(P<0.01)。研究表明,本发明的药物组合物可显著抑制宫颈癌HeLa细胞的体外增殖,并且其对细胞的抑制效应随着培养时间的延长和药物组合物浓度的增加而增加,表明药物组合物对人宫颈癌He1a细胞的增殖有抑制作用,并且具有明显的时间和剂量依赖性。
注:与对照组比较,*P<0.05,**P<0.01。
3.2药物组合物对宫颈癌HeLa细胞凋亡率的影响:试验表明,药物组合物诱导人宫颈癌HeLa细胞具有明显的药物浓度依赖性,不同浓度的药物组合物作用HeLa细胞24h,48h,72h后,细胞凋亡发生率明显增高,并且随着药物组合物的浓度加大和作用时间延长,细胞凋亡率明显增高,与对照组相比具有显著差异性,具体结果下表24。
注:**P<0.01。
实施例8:药物组合物凝胶对宫颈上皮内瘤变(CIN)小鼠宫颈组织PCNA、EGFR和bcl-2表达的影响
1.动物及材料
实验药物及试剂:昆明小鼠40只,雌性,体重30±2g,健康状况良好,由武汉大学医学院实验动物中心提供,动物合格证号:19-013。药物组合物凝胶(根据后面的实施例13制备);保妇康凝胶,国药准字Z20060455,武汉中联集团四药药业有限公司生产;增殖细胞核抗原(PCNA)免疫组化染色试剂盒、表皮生长因子受体(EGFR)免疫组化染色试剂盒和细胞凋亡抑制基因bcl-2免疫组化染色试剂盒,由北京中山生物技术有限公司提供。
2.方法
2.1动物造模方法致癌剂棉线的制备
用苯溶剂溶解化学致癌剂二甲基苯并蒽(DMBA),得到DMBA溶液,将棉线浸入该溶液内,置于通风橱内待苯挥发后,计算棉线的含药量为0.5mg/cm。
取雌性小鼠,在动物不麻醉状态下,借助阴道扩张器及小号弯针,将浸药棉线穿入宫颈,经宫颈口由穹隆部穿出,线结固定于宫颈口。关于该技术的详细内容可以参见施新猷.现代医学实验动物学[M].北京:人民军医出版社.2000:438,通过参照并入本文。
2.2动物分组及给药方法
将实验动物小鼠随机分为4组,每组各10只,分别标记为:空白组(正常小鼠)、模型组(按照2.1动物造模方法所得到、并且没有用药物进行处理的小鼠)、治疗组和对照治疗组。其中治疗组:给予药物组合物凝胶(按20mg/kg),隔日外用1次;;对照治疗组:给予保妇康凝胶(按35mg/kg),隔日外用1次。将上述4组小鼠进行5个月的常规喂养后,通过颈椎脱臼将其处死,剖取小鼠宫颈,保存标本以供光镜观察。
2.3免疫组织化学检测方法
将各组小鼠的宫颈组织浸入4%多聚甲醛溶液进行固定,接着依次经过脱水、透明、浸蜡和包埋处理,接下来将所得的每个蜡块进行连续切片,各取3张切片(切片厚度5μm),然后分别选用PCNA、EGFR和bcl-2三种抗体,利用链霉菌抗生物素蛋白-过氧化物酶连结法(S-P法)将上述各组的切片进行免疫组织化学染色,二氨基联苯胺(DAB)显色和显微镜观察。
3.结果
3.1各组小鼠宫颈组织增殖细胞核抗原(PCNA)表达水平的比较
采用半定量方法对前面所述的切片进行检测,以便比较各组小鼠宫颈组织增殖细胞核抗原(PCNA)的表达水平。其中,细胞核被染成棕黄色定为阳性结果。然后,基于每张切片阳性反应颗粒的颜色深浅和占细胞总数的比例,按照下列标准,对各张切片的进行统计:
阴性(-):无或偶见阳性颗粒,颜色呈浅黄色;
弱阳性(+):阳性颗粒少于1/3,颜色呈淡棕黄色;
中度阳性(++):阳性颗粒介于1/3~2/3之间,颜色介于+~+++之间;
强阳性(+++):阳性颗粒多于2/3,颜色呈棕黄色。
根据统计结果,对各张切片进行评分,其中(-):1分;(+):2分;(++):3分;(+++):4分。每张切片观察3个视野。
结果显示:PCNA主要在细胞核上表达。模型组PCNA表达呈强阳性,与空白组相比有极显著性差异(P<0.0l);治疗组与模型组比较有极显著性差异(P<0.0l);对照治疗组与模型组比较无显著性差异(P>0.05),结果见表25。如表25可见,治疗组与对照治疗组有极显著性差异(P<0.05)。
表25各组小鼠宫颈组织PCNA表达水平比较
组别 | n | - | + | ++ | +++ | 阳性评分 |
空白组 | 10 | 9 | 1 | 0 | 0 | 11 |
模型组 | 10 | 0 | 1 | 4 | 5 | 34△ |
治疗组 | 10 | 7 | 2 | 0 | 1 | 15* |
对照治疗组 | 10 | 2 | 2 | 2 | 4 | 28 |
注:△与空白组比较,P<0.0l;*与模型组比较,P<0.0l;n为各组受检小鼠的只数。
本研究结果表明,模型组的小鼠宫颈组织PCNA表达较强,颜色较深,而治疗组仅有较少的染色程度相对较弱的切片中PCNA为阳性表达,二者相比有极显著性差异(P<0.01),并且其分布逐渐局限于基底层,说明药物组合物凝胶是通过抑制增殖因子的表达而发挥抑制宫颈上皮异型细胞增生作用的。
3.2小鼠宫颈组织表皮生长因子(EGFR)表达水平比较
采用半定量方法对前面所述的切片进行检测,以便比较各组小鼠宫颈组织表皮生长因子(EGFR)的表达水平。其中,细胞膜/浆被染成棕黄色定为阳性结果。然后,基于每张切片阳性反应颗粒的颜色深浅和占细胞总数的比例,按照与上述PCNA检测中相同的标准,对各张切片进行统计。
结果显示:EGFR主要在细胞膜及细胞浆上表达,且以细胞膜为主。模型组EGFR表达呈强阳性,与空白组相比有极显著性差异(P<0.0l);治疗组与模型组比较有极显著性差异(P<0.0l);对照治疗组与模型组比较无显著性差异(P>0.05),结果见表26。如表26可见,治疗组与对照治疗组有极显著性差异(P<0.05)。
表26各组小鼠宫颈组织EGFR表达水平比较
组别 | n | - | + | ++ | +++ | 阳性评分 |
空白组 | 10 | 8 | 2 | 0 | 0 | 12 |
模型组 | 10 | 1 | 1 | 2 | 6 | 33△ |
治疗组 | 10 | 6 | 2 | 1 | 1 | 17* |
对照治疗组 | 10 | 1 | 3 | 3 | 3 | 28 |
注:△与空白组比较,P<0.0l;*与模型组比较,P<0.0l;
n为各组受检小鼠的只数。
本研究结果表明,治疗组小鼠宫颈组织中的EGFR阳性表达较少,且染色较浅,与模型组EGFR阳性表达相比有极显著性差异(P<0.01),说明药物组合物凝胶能够抑制EGFR的表达,进而抑制宫颈上皮异型细胞的增生。
3.3小鼠宫颈组织细胞凋亡抑制基因bcl-2表达水平比较
采用半定量方法对前面所述的切片进行检测,以便比较各组小鼠宫颈组织细胞凋亡抑制基因bcl-2的表达水平。其中,细胞膜/浆被染成棕黄色定为阳性结果。基于每张切片阳性反应颗粒的颜色深浅和占细胞总数的比例,按照与上述PCNA检测中相同的标准,对各张切片进行统计。
结果显示:bcl-2主要在细胞膜及细胞浆上表达,且以细胞膜为主。模型组bcl-2表达与空白组相比有极显著性差异(P<0.0l);治疗组与模型组比较有显著性差异(P<0.01);对照治疗组与模型组比较,无显著性差异(P>0.05)。结果见表27。
表27各组小鼠宫颈组织bcl-2表达水平比较
组别 | n | - | + | ++ | +++ | 阳性评分 |
空白组 | 10 | 7 | 3 | 0 | 0 | 13 |
模型组 | 9 | 0 | 3 | 3 | 3 | 27△ |
治疗组 | 10 | 5 | 3 | 2 | 0 | 17* |
对照治疗组 | 10 | 2 | 2 | 3 | 3 | 27 |
注:△与空白组比较,P<0.01;*与模型组比较,P<0.01;n为各组受检小鼠的只数。
本研究结果表明,治疗组小鼠宫颈组织bcl-2的阳性表达程度减弱,数量减少。与模型组比较有显著性差异(P<0.01),且阳性表达以基底层明显,说明药物组合物凝胶是通过抑制抗凋亡因子的表达而发挥使宫颈上皮异型细胞凋亡的作用的。
实施例9:药物组合物制剂对家兔皮肤的刺激性作用
1.动物及材料:
新西兰家兔2kg左右,雌雄各半,成年健康。
受试药物:10%、20%载药量的药物组合物软膏剂(根据实施例11制备,载药量为金荞麦提取物和秦皮提取物的重量占软膏总重的百分比),以空白基质(空白基质为不加金荞麦提取物和秦皮提取物,只用相同的药用辅料制备得到的软膏)为对照。
2.试验方法:
2.1动物分组及给药方法
将动物分为2组,每组4只,雌雄各半,于试验前24h,将兔子背部脊柱两侧脱毛,面积约为50cm2,并将该左右两侧的皮肤各分成2块,1块完整皮肤,1块破损皮肤,其中破损皮肤是在脱毛基础上,用砂纸将去毛消毒皮肤擦破,以渗血为度。然后将2组动物左侧的2块皮肤均给予空白基质,右侧的2块皮肤均给予受试药物,其中,将第一试验组给予10%载药量的药物组合物软膏剂,第二试验组给予20%载药量的药物组合物软膏剂,具体给药方法为:将空白基质和药物组合物软膏剂按照上述要求分别均匀涂布于动物两侧的完整皮肤和破损皮肤后,用无刺激性无菌纱布缚盖,并用胶布固定,每日给药1次,连续7d,并且每次给药8h后,用纱布擦拭除去残留的受试药物,并用温和洗面奶去除残留物。
2.2观察时间及指标
从最后一次除去动物两侧皮肤的空白基质和药物组合物软膏剂1h后,开始观察其两侧皮肤的刺激反应情况,每日1次,连续观察14天。观察并记录动物给药部位有无皮肤红斑、水肿、焦痂等刺激反应情况,并根据下表28对给药部位的皮肤刺激反应进行评分,接着依据对给药部位的皮肤刺激反应的评分情况,按照下列公式计算给药部位的皮肤刺激性分值:刺激分值评价:刺激分值=(红斑反应总分+水肿反应总分)/每组动物数,然后基于给药部位的皮肤刺激性分值,根据表29所示的皮肤刺激性强度评价标准,对给药部位的皮肤刺激性强度进行评价。
表28皮肤刺激反应级数
刺激分值 | 红斑反应 | 水肿反应 |
0 | 无红斑 | 无水肿 |
1 | 轻微红斑 | 轻微水肿 |
2 | 中度红斑 | 边缘高出周围皮肤 |
3 | 严重红斑 | 皮肤隆起1mm,轮廓清楚 |
4 | 重度红斑并有焦痂行成 | 水肿隆起超过1mm且范围扩大 |
表29皮肤刺激性强度评价标准
平均分值 | 评价 |
0~<0.5 | 无刺激性 |
0.5~<2 | 轻度刺激性 |
2.0~<6 | 中度刺激性 |
6.0~8.0 | 强刺激性 |
3.试验报告及结果评价:
本试验结果表明,采用空白基质对家兔完整皮肤和破损皮肤进行多次连续给药,其给药部位均无刺激性反应,表明本发明的药物组合物制剂基质完全符合局部给药对基质的要求。采用10%载药量的药物组合物软膏制剂对家兔完整皮肤和破损皮肤进行多次连续给药,其完整皮肤均无刺激性反应,破损皮肤有轻度刺激性反应;采用20%载药量的药物组合物软膏制剂对家兔完整皮肤和破损皮肤进行多次连续给药,其完整皮肤有轻度刺激性反应,破损皮肤有中度刺激性反应。从刺激性表现来看,停药后上述刺激反应均很快消失,不影响药物的治疗作用,表明本发明的药物组合物,在低剂量和正常剂量下对家兔皮肤无刺激性,且在高剂量下对家兔皮肤的刺激反应是轻微的,可逆的。
实施例10:金荞麦提取物、秦皮提取物及药物组合物的急性毒性试验
1.动物及材料:
健康昆明种小鼠,雌雄各半,体重18-22g,实验期间自由饮水、普通饲料喂食。
利用0.5%的CMC-Na,分别将金荞麦提取物(根据实施例1制备)、秦皮提取物(根据实施例2制备)和药物组合物(将金荞麦提取物和秦皮提取物按照1.4:1的重量比混合而成)制备成不同浓度的混悬液。
2.试验方法:
将小鼠按体重、性别均衡分成4组,每组20只,给药前禁食12h,然后于早晨8:00对各组小鼠按照0.04ml/g的剂量进行一次性灌胃给药,对对照组小鼠以0.5%CMC-Na的按照0.04ml/g的剂量进行一次性灌胃给药,然后观察记录给药后各组小鼠的情况。
实验中观察到,给药当天,三个给药组的小鼠自主活动减少,耸毛、蜷缩,进食减少,次日恢复正常;给药后第7d,小鼠进食、大小便、呼吸、体重等均无明显异常变化,无一死亡;给药后第14d,处死受试动物,然后将尸体进行解剖,肉眼未见主要脏器病变。实验结果表明,金荞麦提取物的半数致死量(LD50)为7.85g/kg,秦皮提取物和药物组合物的最大口服给药剂量分别为10.2g/kg和11.3g/kg,由此,可以推测秦皮提取物和药物组合物可能测不出半数致死量(LD50),表明本发明的药物组合物的急性毒性很小。
实施例11:药物组合物软膏的制备
处方:金荞麦1232g 秦皮548g
制备方法:根据实施例1和实施例2,将处方量的金荞麦和秦皮分别制备成金荞麦提取物和秦皮提取物,备用。称取500g白凡士林、130g羊毛脂、60g液体石蜡、160g甘油,于70℃下水浴加热融化,然后边搅拌边添加备用的金荞麦提取物和秦皮提取物,搅拌混匀,即得药物组合物软膏1000g。
实施例12:药物组合物软膏的制备
处方:金荞麦提取物86g 秦皮提取物55g
制备方法:根据实施例1和实施例2,将金荞麦和秦皮药材分别制备成处方量的金荞麦提取物和秦皮提取物,备用。称取500g白凡士林、130g羊毛脂、60g液体石蜡、160g甘油,于70℃下水浴加热融化,然后边搅拌边添加备用的金荞麦提取物和秦皮提取物,搅拌混匀,即得药物组合物软膏1000g。
实施例13:药物组合物乳膏的制备
处方:金荞麦400g 秦皮200g
制备方法:根据实施例1和实施例2,将处方量的金荞麦和秦皮分别制备成金荞麦提取物和秦皮提取物,备用。称取70g白凡士林、70g十八醇、50g液体石蜡、60g单硬脂酸甘油酯,于70℃下缓慢加热至熔融,并于70℃下进行保温,作为油相;另外称取50g甘油、10g十二烷基硫酸钠和620g水,于70℃下缓慢加热溶解,作为水相,当水相的温度与油相的温度相同时,将油相慢慢加入水相中,并不断搅拌,待温度降至60℃时,添加备用的金荞麦提取物和秦皮提取物,搅匀冷却,即得药物组合物乳膏1000g。
实施例14:药物组合物乳膏的制备
处方:金荞麦提取物28g 秦皮提取物20g
制备方法:根据实施例1和实施例2,将金荞麦和秦皮药材分别制备成处方量的金荞麦提取物和秦皮提取物,备用。称取70g白凡士林、70g十八醇、50g液体石蜡、60g单硬脂酸甘油酯,于70℃下缓慢加热至熔融,并于70℃下进行保温,作为油相;另外称取50g甘油、10g十二烷基硫酸钠和620g水,于70℃下缓慢加热溶解,作为水相,当水相的温度与油相的温度相同时,将油相慢慢加入水相中,并不断搅拌,待温度降至60℃时,添加备用的金荞麦提取物和秦皮提取物,搅匀冷却,即得药物组合物乳膏1000g。
实施例15:药物组合物凝胶的制备
处方:金荞麦1643g 秦皮731g
制备方法:根据实施例1和实施例2,将处方量的金荞麦和秦皮分别制备成金荞麦提取物和秦皮提取物,备用。称取17g卡波姆,用680g去离子水将其溶胀后,添加50g甘油、50g乙醇和3g尼泊金乙酯,搅拌混匀后,再添加备用的金荞麦提取物和秦皮提取物,搅匀冷却,即得金荞麦秦皮凝胶1000g。
实施例16:药物组合物凝胶的制备
处方:金荞麦提取物115g 秦皮提取物73g
制备方法:根据实施例1和实施例2,将金荞麦和秦皮药材分别制备成处方量的金荞麦提取物和秦皮提取物,备用。称取17g卡波姆,用680g去离子水将其溶胀后,添加50g甘油、50g乙醇和3g尼泊金乙酯,搅拌混匀后,再添加备用的金荞麦提取物和秦皮提取物,搅匀冷却,即得金荞麦秦皮凝胶1000g。
实施例17:药物组合物栓剂的制备
处方:金荞麦1232g 秦皮548g
制备方法:根据实施例1和实施例2,将处方量的金荞麦和秦皮分别制备成金荞麦提取物和秦皮提取物,备用。用100ml水将备用的金荞麦提取物和秦皮提取物进行搅拌溶解,获得金荞麦和秦皮混合水溶液,然后称取1000g甘油明胶基质,于70℃水浴中加热熔融,再添加相同温度的金荞麦和秦皮混合水溶液,搅拌混匀,待其中的气泡消失即将其浇注于栓模中,冷却后取出,即得药物组合物栓剂1000粒。
实施例18:药物组合物栓剂的制备
处方:金荞麦提取物86g 秦皮提取物55g
制备方法:根据实施例1和实施例2,将金荞麦和秦皮药材分别制备成处方量的金荞麦提取物和秦皮提取物,备用。用100ml水将备用的金荞麦提取物和秦皮提取物进行搅拌溶解,获得金荞麦和秦皮混合水溶液,然后称取1000g甘油明胶基质,于70℃水浴中加热熔融,再添加相同温度的金荞麦和秦皮混合水溶液,搅拌混匀,待其中的气泡消失即将其浇注于栓模中,冷却后取出,即得药物组合物栓剂1000粒。
实施例19:药物组合物胶囊剂的制备
处方:金荞麦1643g 秦皮731g
制备方法:根据实施例1和实施例2,将处方量的金荞麦和秦皮分别制备成金荞麦提取物和秦皮提取物,备用。将备用的金荞麦提取物和秦皮提取物混合,并添加300g淀粉过筛混匀,然后利用30%的乙醇将其制备成颗粒,干燥后装于胶囊,即得药物组合物胶囊剂1000粒(每粒装量为0.5g)。
实施例20:药物组合物胶囊剂的制备
处方:金荞麦提取物115g 秦皮提取物73g
制备方法:根据实施例1和实施例2,将金荞麦和秦皮药材分别制备成处方量的金荞麦提取物和秦皮提取物,备用。将备用的金荞麦提取物和秦皮提取物混合,并添加300g淀粉过筛混匀,然后利用30%的乙醇将其制备成颗粒,干燥后装于胶囊,即得药物组合物胶囊剂1000粒(每粒装量为0.5g)。
实施例21:药物组合物颗粒剂的制备
处方:金荞麦2000g 秦皮1000g
制备方法:根据实施例1和实施例2,将处方量的金荞麦和秦皮分别制备成金荞麦提取物和秦皮提取物,备用。将备用的金荞麦提取物和秦皮提取物混合,并添加适量糖粉,混匀,制粒,然后于60℃以下干燥,即得药物组合物颗粒剂1000g。
实施例22:药物组合物颗粒剂的制备
处方:金荞麦提取物140g 秦皮提取物100g
制备方法:根据实施例1和实施例2,将金荞麦和秦皮药材分别制备成处方量的金荞麦提取物和秦皮提取物,备用。将备用的金荞麦提取物和秦皮提取物混合,并添加适量糖粉,混匀,制粒,然后于60℃以下干燥,即得药物组合物颗粒剂1000g。
实施例23:药物组合物阴道泡腾片的制备
处方:金荞麦2055g 秦皮215g
制备方法:根据实施例1和实施例2,将处方量的金荞麦和秦皮分别制备成金荞麦提取物和秦皮提取物,备用。将碳酸氢钠于60℃下干燥2h,柠檬酸(枸橼酸)于105℃下干燥1h,然后将其分别研细,过100目筛(需要说明的是,在本文中使用的单位“目”,指的是颗粒粒度能够实现通过每平方英寸上具有所限定数目孔的筛子,本领域技术人员可以方便地通过公式:目数×孔径(微米数)=15000,确定筛的孔径,从而可以确定以微米为单位的颗粒粒度。),称取200g枸橼酸、180g碳酸氢钠,备用。将200g枸橼酸、220g乳糖和备用的金荞麦提取物和秦皮提取物混匀,再添加120g乳糖、180g碳酸氢钠,混匀,然后分别用5%PVP无水乙醇溶液作黏合剂制粒,于60℃下干燥后,整粒,添加30g PEG-6000,混匀,用椭圆形异性冲模压片,即得药物组合物阴道泡腾片1000片。
实施例24:药物组合物阴道泡腾片的制备
处方:金荞麦144g 秦皮22g
制备方法:根据实施例1和实施例2,将金荞麦和秦皮药材分别制备成处方量的金荞麦提取物和秦皮提取物,备用。将碳酸氢钠于60℃下干燥2h,柠檬酸(枸橼酸)于105℃下干燥1h,然后将其分别研细,过100目筛,称取200g枸橼酸、180g碳酸氢钠,备用。将200g枸橼酸、220g乳糖和备用的金荞麦提取物和秦皮提取物混匀,再添加120g乳糖、180g碳酸氢钠,混匀,然后分别用5%PVP无水乙醇溶液作黏合剂制粒,于60℃下干燥后,整粒,添加30g PEG-6000,混匀,用椭圆形异性冲模压片,即得药物组合物阴道泡腾片1000片。
实施例25:药物组合物阴道泡腾胶囊的制备
处方:金荞麦2000g 秦皮450g
制备方法:采用非水制粒压片法制备药物组合物阴道泡腾胶囊。根据实施例1和实施例2,将处方量的金荞麦和秦皮分别制备成金荞麦提取物和秦皮提取物,备用。碳酸氢钠及枸橼酸的干燥及前处理方法同实施例17。将金荞麦提取物和秦皮提取物、240g乳糖、200g碳酸氢钠、240g枸橼酸和10g十二烷基硫酸钠混合,再添加5g硬脂酸镁,充分混合均匀后过100目筛,装于然后装于商业化的0号空心胶囊(目前生产的规格由大到小分为000,00,0,1,2,3,4,5号共8种,其容积分别为1.42,0.95,0.67,0.48,0.37,0.27,0.20,0.13ml),即得药物组合物阴道泡腾胶囊1000粒。
实施例26:药物组合物阴道泡腾胶囊的制备
处方:金荞麦提取物140g 秦皮提取物45g
制备方法:采用非水制粒压片法制备药物组合物阴道泡腾胶囊。根据实施例1和实施例2,将金荞麦和秦皮药材分别制备成处方量的金荞麦提取物和秦皮提取物,备用。碳酸氢钠及枸橼酸的干燥及前处理方法同实施例17。将金荞麦提取物和秦皮提取物、240g乳糖、200g碳酸氢钠、240g枸橼酸和10g十二烷基硫酸钠混合,再添加5g硬脂酸镁,充分混合均匀后过100目筛,装于然后装于商业化的0号空心胶囊,即得药物组合物阴道泡腾胶囊1000粒。
实施例27:药物组合物搽剂的制备
处方:金荞麦1232g 秦皮548g
制备方法:根据实施例1和实施例2,将处方量的金荞麦和秦皮分别制备成金荞麦提取物和秦皮提取物,备用。将备用的金荞麦提取物和秦皮提取物混合,添加200ml的50%乙醇、100ml甘油、100g PEG-400和15ml月桂氮酮,最后加水至1000ml,搅匀,过滤,分装,即得药物组合物搽剂。
实施例28:药物组合物搽剂的制备
处方:金荞麦提取物86g 秦皮提取物55g
制备方法:根据实施例1和实施例2,将金荞麦和秦皮药材分别制备成处方量的金荞麦提取物和秦皮提取物,备用。将备用的金荞麦提取物和秦皮提取物混合,添加200ml的50%乙醇、100ml甘油、100g PEG-400和15ml月桂氮酮,最后加水至1000ml,搅匀,过滤,分装,即得药物组合物搽剂。
实施例29:药物组合物气雾剂的制备
处方:金荞麦1232g 秦皮548g
制备方法:根据实施例1和实施例2,将处方量的金荞麦和秦皮分别制备成金荞麦提取物和秦皮提取物,备用。将备用的金荞麦提取物和秦皮提取物混合,然后利用用50%的乙醇将其溶解、稀释至1000ml,混匀,静置,过滤,灌装,封口,再充入适量抛射剂,即得药物组合物气雾剂。
实施例30:药物组合物气雾剂的制备
处方:金荞麦提取物86g 秦皮提取物55g
制备方法:根据实施例1和实施例2,将金荞麦和秦皮药材分别制备成处方量的金荞麦提取物和秦皮提取物,备用。将备用的金荞麦提取物和秦皮提取物混合,然后利用用50%的乙醇将其溶解、稀释至1000ml,混匀,静置,过滤,灌装,封口,再充入适量抛射剂,即得药物组合物气雾剂。
实施例31:药物组合物凝胶的质量检测方法
(1)精密称取0.2g实施例15制备的药物组合物凝胶,添加10ml体积比1:5的氯仿-甲醇溶液,进行超声提取45分钟,其中功率250W,超声频率33KHz,然后过滤,将滤液蒸干,残渣加1ml甲醇溶解,作为供试品溶液,另取表儿茶素作为对照品,添加甲醇制成每1ml含0.1mg表儿茶素的对照品溶液。采用薄层色谱法进行试验,吸取供试品溶液、对照品溶液各5μl,分别点于同一硅胶G薄层板上,以体积比为13:4:2.5的三氯甲烷-甲醇-乙酸作为展开剂进行展开,然后将硅胶G薄层板取出,晾干,喷以5%的香草醛-浓硫酸显色剂,于105℃下加热显色至斑点清晰,在供试品色谱中,其与对照品色谱相应的位置上,会显现出相同颜色的斑点。
结果显示:实施例15制备的药物组合物凝胶的供试品色谱中,其与对照品色谱相同的位置上出现相同颜色的斑点。表明所制备的药物组合物凝胶中含有金荞麦的有效成分表儿茶素。
(2)精密称取0.2g实施例15制备的药物组合物凝胶,添加10ml甲醇,进行超声提取45分钟,其中功率250W,超声频率33KHz,然后过滤,将滤液蒸干,残渣加1ml甲醇溶解,作为供试品溶液。另取秦皮甲素和秦皮乙素作为对照品,添加甲醇分别制成每1ml各含1mg秦皮甲素和秦皮乙素的溶液,然后混合,作为对照品溶液。采用薄层色谱法进行试验,吸取供试品溶液、对照品溶液各10μl,分别点于同一硅胶G薄层板上,以体积比为4:1:0.2的石油醚-乙酸乙酯-冰醋酸为展开剂进行展开,然后将硅胶G薄层板取出,晾干,置于紫外灯365nm波长下进行检视,在供试品色谱中,其与对照品色谱相应的位置上,会显现出相同颜色的斑点或荧光斑点。
结果显示:实施例15制备的药物组合物凝胶的供试品色谱中,其与对照品色谱相同的位置上出现相同颜色的斑点。表明所制备的药物组合物凝胶中含有秦皮的有效成分秦皮甲素和秦皮乙素。
(3)表儿茶素的含量测定:
首先,以表儿茶素作为对照品,按照下列步骤制备对照品溶液:精密称取适量以五氧化二磷为干燥剂减压干燥24小时的表儿茶素作为对照品,添加甲醇制成每1ml含0.5mg表儿茶素的溶液,作为对照品溶液;按照下列步骤制备供试品溶液:称取约0.2g实施例15制备的药物组合物凝胶,置于具塞锥形瓶中,添加25ml体积比为1:5的氯仿-甲醇溶液和0.5ml冰醋酸,然后用塞将其瓶口密封,称定重量,进行超声提取60min,其中功率250W,超声频率33KHz,然后放至冷却,用甲醇补足至上次称定的重量,然后进行过滤,取5ml滤液,使其挥发干燥,然后将残渣添加适量甲醇溶解,并转移至10ml量瓶中,用甲醇稀释至刻度,摇匀,过0.22μm微孔滤膜,取滤液,作为供试品溶液。
其次,对高效液相色谱仪的色谱条件与系统适用性进行调节:5μm,250mm×4.6mm,Dikma C18色谱柱,以体积比为13:87的乙腈-0.1%柠檬酸水溶液作为流动相,流速为1ml/min,检测波长为279nm,柱温为25℃,以表儿茶素计算理论塔板数,其应不低于5000,其中表儿茶素峰与相近峰的分离度R大于1.5;
然后,采用高效液相色谱法进行表儿茶素的含量测定,分别精密吸取对照品溶液和供试品溶液各10μl,注入高效液相色谱仪,测定,计算,即得出对照品溶液和供试品溶液中表儿茶素的含量,其中,凝胶制剂含金荞麦以表儿茶素(C15H14O6)计,每1g不得少于0.43mg。
结果显示:实施例15制备的每克药物组合物凝胶中金荞麦的有效成分表儿茶素的含量为0.51mg。
(4)秦皮甲素、秦皮乙素的含量测定:
首先,以秦皮甲素和秦皮乙素作为对照品,按照下列步骤制备对照品溶液:精密称取适量以五氧化二磷为干燥剂减压干燥24小时的秦皮甲素和秦皮乙素作为对照品,添加甲醇制成每1ml含秦皮甲素0.1mg、秦皮乙素60μg的混合溶液,作为对照品溶液;按照下列步骤制备对照品溶液:称取约0.2g实施例15制备的药物组合物凝胶,置于具塞三角锥形瓶中,添加25ml的甲醇,然后用塞将其瓶口密封,称定重量,进行超声提取60min,其中功率250W,超声频率33KHz,然后放至冷却,用甲醇补足至上次称定的重量,然后进行过滤,取5ml滤液,使其挥发干燥,然后将残渣添加适量甲醇溶解,并转移至10ml量瓶中,用甲醇稀释至刻度,摇匀,过0.22μm微孔滤膜,取滤液,作为供试品溶液。
其次,对高效液相色谱仪的色谱条件与系统适用性进行调节:5μm,250mm×4.6mm,Dikma C18色谱柱,以体积比为20:80的甲醇-0.1%乙酸水溶液作为流动相,流速为1ml/min,检测波长为334nm,柱温为25℃,以秦皮乙素计算理论塔板数,其应不低于5000;
然后,采用高效液相色谱法进行秦皮甲素和秦皮乙素的含量测定,分别精密吸取对照品溶液和供试品溶液各10μl,注入高效液相色谱仪,测定,计算,即得出对照品溶液和供试品溶液中秦皮甲素和秦皮乙素的含量,其中,凝胶制剂含秦皮以秦皮甲素(C15H16O9)和秦皮乙素(C9H6O4)的总量计,每1g不得少于6.5mg。
结果显示:实施例15制备的每克药物组合物凝胶中秦皮的有效成分秦皮甲素和秦皮乙素的总含量为6.6mg。
在本说明书的描述中,参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中,对上述术语的示意性表述不一定指的是相同的实施例或示例。而且,描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任何的一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。
尽管已经示出和描述了本发明的实施例,本领域的普通技术人员可以理解:在不脱离本发明的原理和宗旨的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型,本发明的范围由权利要求及其等同物限定。
Claims (25)
1.一种药物组合物,其特征在于,所述药物组合物的活性成分为金荞麦提取物和秦皮提取物,
其中,所述金荞麦提取物为金荞麦的醇提取物,所述秦皮提取物是秦皮的醇提取物,
所述金荞麦提取物是通过下列步骤制备的:将金荞麦进行加醇提取,以便获得金荞麦提取液;以及将所述金荞麦提取液进行纯化、干燥,以便获得所述金荞麦提取物,
所述秦皮提取物是通过下列步骤制备的:将秦皮进行加醇提取,以便获得秦皮提取液;以及将所述秦皮提取液进行纯化、干燥,以便获得所述秦皮提取物,
所述金荞麦提取物与所述秦皮提取物的重量比例为1-2:1,
将金荞麦进行加醇提取进一步包括:将所述金荞麦用8倍重量的50%乙醇,在50-70摄氏度下回流提取3次,每次1小时,并合并提取液,以便获得所述金荞麦提取液,
将所述金荞麦提取液进行纯化、干燥进一步包括:将所述金荞麦提取液进行过滤,以便获得金荞麦提取液滤液;利用非极性大孔吸附树脂对所述金荞麦提取液滤液进行纯化,以便获得经过纯化的金荞麦提取液;以及将所述经过纯化的金荞麦提取液在60摄氏度进行减压浓缩和真空干燥,
所述利用非极性大孔吸附树脂对所述金荞麦提取液滤液进行纯化进一步包括:
将所述金荞麦提取液滤液上样至D101大孔吸附树脂;
使用除杂洗脱剂进行除杂,所述除杂洗脱剂为水;以及
使用洗脱溶剂进行洗脱,以便获得所述经过纯化的金荞麦提取液,
其中,所述金荞麦提取液滤液的上样浓度为0.08g/ml,
所述金荞麦提取液滤液的最大上样量为0.48g/ml,
所述金荞麦提取液滤液的上样速度为2柱体积/小时,
所述除杂洗脱剂的洗脱流速为4柱体积/小时,
所述洗脱溶剂为70%乙醇,所述洗脱溶剂的洗脱速度为2柱体积/小时;
将秦皮进行加醇提取进一步包括:将所述秦皮用12倍重量的80%乙醇,在60摄氏度下回流提取3次,每次1小时,并合并提取液,以便获得所述秦皮提取液,
将所述秦皮提取液进行纯化、干燥进一步包括:将所述秦皮提取液在60摄氏度下减压干燥,并用3倍重量蒸馏水进行溶解;过滤除去不溶于水的杂质并回收滤液;以及将所述滤液减压浓缩、真空干燥,以便获得所述秦皮提取物。
2.根据权利要求1所述的药物组合物,其特征在于,所述金荞麦提取物与所述秦皮提取物的重量比例为1.4:1。
3.根据权利要求1所述的药物组合物,其特征在于,所述药物组合物进一步包括药学上可接受的辅料。
4.根据权利要求1所述的药物组合物,其特征在于,所述药物组合物呈选自胶囊剂、丸剂、片剂、颗粒剂、口服液、内服膏剂、栓剂、外用膏剂、外用洗剂、搽剂、气雾剂以及喷雾剂的至少一种的形式。
5.根据权利要求4所述的药物组合物,其特征在于,所述片剂为泡腾片。
6.根据权利要求4所述的药物组合物,其特征在于,所述药物组合物呈软膏的形式。
7.根据权利要求4所述的药物组合物,其特征在于,所述药物组合物呈栓剂的形式。
8.根据权利要求4所述的药物组合物,其特征在于,所述药物组合物呈凝胶剂的形式。
9.根据权利要求1所述的药物组合物,其特征在于,所述药物组合物用于治疗炎症。
10.根据权利要求1所述的药物组合物,其特征在于,所述药物组合物用于治疗或预防宫颈癌。
11.根据权利要求1所述的药物组合物,其特征在于,所述药物组合物用于治疗或预防尖锐湿疣。
12.权利要求1-11任一项所述的药物组合物在制备药物中的用途,所述药物用于治疗炎症。
13.权利要求1-11任一项所述的药物组合物在制备药物中的用途,所述药物用于治疗或预防宫颈癌。
14.权利要求1-11任一项所述的药物组合物在制备药物中的用途,所述药物用于治疗或预防尖锐湿疣。
15.一种制备药物的方法,其特征在于,包括下列步骤:
制备金荞麦提取物,所述金荞麦提取物是金荞麦的醇提取物;
制备秦皮提取物,所述秦皮提取物是秦皮的醇提取物;以及
将所述金荞麦提取物和所述秦皮提取物按照预定的重量比例进行混合,以便得到所述药物,
其中,
所述制备金荞麦提取物进一步包括下列步骤:将金荞麦进行加醇提取,以便获得金荞麦提取液;以及将所述金荞麦提取液进行纯化、干燥,以便获得所述金荞麦提取物,
所述制备秦皮提取物进一步包括下列步骤:将秦皮进行加醇提取,以便获得秦皮提取液;以及将所述秦皮提取液进行纯化、干燥,以便获得所述秦皮提取物,
将金荞麦进行加醇提取进一步包括:将所述金荞麦用8倍重量的50%乙醇,在50-70摄氏度下回流提取3次,每次1小时,并合并提取液,以便获得所述金荞麦提取液,
将所述金荞麦提取液进行纯化、干燥进一步包括:将所述金荞麦提取液进行过滤,以便获得金荞麦提取液滤液;利用非极性大孔吸附树脂对所述金荞麦提取液滤液进行纯化,以便获得经过纯化的金荞麦提取液;以及将所述经过纯化的金荞麦提取液在60摄氏度进行减压浓缩和真空干燥,
所述利用非极性大孔吸附树脂对所述金荞麦提取液滤液进行纯化进一步包括:
将所述金荞麦提取液滤液上样至D101大孔吸附树脂;
使用除杂洗脱剂进行除杂,所述除杂洗脱剂为水;以及
使用洗脱溶剂进行洗脱,以便获得所述经过纯化的金荞麦提取液,
其中,所述金荞麦提取液滤液的上样浓度为0.08g/ml,
所述金荞麦提取液滤液的最大上样量为0.48g/ml,
所述金荞麦提取液滤液的上样速度为2柱体积/小时,
所述除杂洗脱剂的洗脱流速为4柱体积/小时,
所述洗脱溶剂为70%乙醇,所述洗脱溶剂的洗脱速度为2柱体积/小时;将秦皮进行加醇提取进一步包括:将所述秦皮用12倍重量的80%乙醇,在60摄氏度下回流提取3次,每次1小时,并合并提取液,以便获得所述秦皮提取液,
将所述秦皮提取液进行纯化、干燥进一步包括:将所述秦皮提取液在60摄氏度下减压干燥,并用3倍重量蒸馏水进行溶解;过滤除去不溶于水的杂质并回收滤液;以及将所述滤液减压浓缩、真空干燥,以便获得所述秦皮提取物,
所述预定的金荞麦提取物与秦皮提取物的重量比例为1-2:1。
16.根据权利要求15所述的方法,其特征在于,所述预定的金荞麦提取物与秦皮提取物的重量比例为1.4:1。
17.根据权利要求15所述的方法,其特征在于,进一步包括将所述药物制成选自胶囊剂、丸剂、片剂、颗粒剂、口服液、内服膏剂、栓剂、外用膏剂、外用洗剂、搽剂、气雾剂以及喷雾剂的至少一种的形式。
18.根据权利要求17所述的方法,其特征在于,所述片剂为泡腾片。
19.根据权利要求17所述的方法,其特征在于,所述药物呈软膏的形式。
20.根据权利要求17所述的方法,其特征在于,所述药物呈栓剂的形式。
21.根据权利要求17所述的方法,其特征在于,所述药物呈凝胶剂的形式。
22.根据权利要求15所述的方法,其特征在于,所述药物用于治疗炎症。
23.根据权利要求15所述的方法,其特征在于,所述药物用于治疗或预防宫颈癌。
24.根据权利要求15所述的方法,其特征在于,所述药物用于治疗或预防尖锐湿疣。
25.一种对权利要求1-11任一项所述的药物组合物进行检测的方法,其特征在于,包括:
确定所述药物组合物中有效成分的含量;以及
将所述有效成分含量与预定的阈值进行比较,
其中,
所述有效成分为选自表儿茶素、秦皮甲素和秦皮乙素的至少一种,
针对金荞麦提取物,所述有效成分为表儿茶素,所述阈值为至少0.43mg,
针对秦皮提取物,所述有效成分为秦皮甲素和秦皮乙素,所述阈值为至少6.5mg,
当所述有效成分为表儿茶素时,确定所述药物组合物中的有效成分含量进一步包括:
将所述药物组合物用由氯仿、甲醇和冰醋酸组成的提取剂进行超声提取;
将提取液挥发干燥,并用甲醇溶解残渣,以便获得含有表儿茶素的甲醇溶液;以及
通过高效液相色谱分析,确定所述含有表儿茶素的甲醇溶液中的表儿茶素含量,
当所述有效成分为秦皮甲素和秦皮乙素时,确定所述药物组合物中的有效成分含量进一步包括:
将所述药物组合物用甲醇进行超声提取;
将提取液挥发干燥,并用甲醇溶解残渣,以便获得含有秦皮甲素和秦皮乙素的甲醇溶液;以及
通过高效液相色谱分析,确定所述含有秦皮甲素和秦皮乙素的甲醇溶液中秦皮甲素和秦皮乙素的总含量。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN201210088202.7A CN102688300B (zh) | 2012-03-29 | 2012-03-29 | 药物组合物及其用途 |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN201210088202.7A CN102688300B (zh) | 2012-03-29 | 2012-03-29 | 药物组合物及其用途 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
CN102688300A CN102688300A (zh) | 2012-09-26 |
CN102688300B true CN102688300B (zh) | 2014-06-25 |
Family
ID=46854145
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
CN201210088202.7A Active CN102688300B (zh) | 2012-03-29 | 2012-03-29 | 药物组合物及其用途 |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
CN (1) | CN102688300B (zh) |
Families Citing this family (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN104872333A (zh) * | 2015-05-28 | 2015-09-02 | 浙江农林大学 | 一种金荞麦籽茶珍的制作方法 |
CN106620260A (zh) * | 2015-10-31 | 2017-05-10 | 马志忠 | 一种宫颈癌特效药 |
Family Cites Families (6)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN1063957C (zh) * | 1997-09-29 | 2001-04-04 | 北京华颐中药制药厂 | 一种金荞麦制剂的制备方法 |
GB0213481D0 (en) * | 2002-06-12 | 2002-07-24 | Medipearl Pte Ltd | Pharmaceutical compositions |
CN1301740C (zh) * | 2004-04-08 | 2007-02-28 | 山东中医药大学 | 一种抗肿瘤的药物及其生产方法 |
CN101632722B (zh) * | 2008-07-23 | 2012-02-08 | 曲靖开发区格力康生物科技发展有限公司 | 金荞麦多酚提取物及其制备方法 |
US20110218241A1 (en) * | 2010-03-06 | 2011-09-08 | Cacao Bio-Technologies, Llc | Antiviral epicatechins, epicatechin oligomers, or thiolated epicatechins from theobroma cacao for treatment of genital warts |
CN102091132B (zh) * | 2011-01-25 | 2013-05-01 | 西南民族大学 | 秦皮药材或其提取物中秦皮甲素、秦皮乙素、秦皮苷和秦皮素的检测方法 |
-
2012
- 2012-03-29 CN CN201210088202.7A patent/CN102688300B/zh active Active
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
CN102688300A (zh) | 2012-09-26 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
CN101366721B (zh) | 一种治疗骨科疾病的原料药及其制备方法 | |
CN103920081B (zh) | 一种药物组合物的用途 | |
WO2016019684A1 (zh) | 连翘苷/连翘脂素组合物在制备缓解或/和治疗病毒性疾病的药物或保健品中的应用 | |
WO2022057360A1 (zh) | 一种用于冬季防治呼吸道疾病的药物组合物 | |
CN104353058B (zh) | 商陆抗病毒蛋白冻干粉复合剂及其制备方法 | |
ES2856969T3 (es) | Uso de extracto de ginseng, ginsenósido y derivado de ginsenósido en la preparación de medicamentos o productos sanitarios para el tratamiento de trastornos de infección por citomegalovirus | |
CN102652778A (zh) | 药物组合物 | |
CN110638893B (zh) | 一种抗hpv感染的药物组合物及其应用 | |
CN102085248B (zh) | 一种治疗宫颈疾病的中药组合物及其制备方法和检测方法 | |
CN102688300B (zh) | 药物组合物及其用途 | |
CN102652773B (zh) | 药物组合物及其制备方法 | |
CN101057895B (zh) | 治疗妇科疾病的妇炎舒制剂及其质量检测方法 | |
CN102626465B (zh) | 一种龙柴方微丸及其制备方法 | |
KR20230061471A (ko) | 포르시티애 프룩투스 성분과 임의적인 파낙스 진셍 성분 및 이의 용도 | |
CN102349935A (zh) | 银杏酚酸在制备治疗性病、妇科病和肛周疾病的外用制剂中的用途 | |
CN108452008A (zh) | 一种包含叶下珠、云芝、丹参和紫草的中药组合物在制备抑制肝癌术后复发的药物中的应用 | |
CN103751105A (zh) | 银杏酚酸纳米脂质体在治疗妇科病和性病中的应用 | |
CN108785383B (zh) | 一种抗菌妇科外用药物组合物及其制备方法与应用 | |
CN102293948A (zh) | 一种治疗小儿食滞内热的制剂及其制备方法和检测方法 | |
CN104337901A (zh) | 一种治疗非特异性膀胱炎的中药制剂及其制备方法 | |
CN115192569B (zh) | Sphaeropsidin A在制备预防或治疗炎症诱发疾病药物中的应用 | |
CN1289110C (zh) | 治疗妇科疾病的胶囊制剂及其制备工艺 | |
CN102670811B (zh) | 治疗细菌性阴道病和霉菌性阴道炎的外用药物 | |
CN107616979A (zh) | 一种靶向治疗乳腺癌的药物及其应用 | |
CN107510700A (zh) | 一种靶向治疗膀胱癌的药物及其应用 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
C06 | Publication | ||
PB01 | Publication | ||
C10 | Entry into substantive examination | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
C14 | Grant of patent or utility model | ||
GR01 | Patent grant |