CN102652778A - 药物组合物 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及药物组合物及其用途。其中,该药物组合物包含苦参提取物和绿茶提取物作为活性成分,其中,该苦参提取物是通过下列步骤制备的:将苦参进行加水提取,以便获得苦参提取液;将苦参提取液进行浓缩,以便获得苦参浓缩液;将苦参浓缩液进行pH调节;以及将经过pH调节的苦参浓缩液进行纯化,以便获得苦参提取物,该绿茶提取物是通过下列步骤制备的:将绿茶进行加醇提取,以便获得绿茶提取液;以及将绿茶提取液进行纯化,以便获得绿茶提取物。本发明的药物组合物,能够用于治疗或预防由HPV感染引起的宫颈癌前病变以及皮肤癌前病变,以及制备治疗或预防宫颈癌前病变以及皮肤癌前病变的药物。
Description
技术领域
本发明涉及中药领域,具体地涉及药物组合物及其用途。更具体地,本发明提供了药物组合物、药物组合物在制备药物中的用途以及制备药物的方法。
背景技术
宫颈病变是女性最常见的疾病之一,宫颈癌是女性生殖系统常见的恶性肿瘤之一。
HPV(人类乳头瘤病毒)感染与湿疣、宫颈癌前病变、宫颈癌、皮肤癌的发病关系密切,几乎99.8%的宫颈癌都可以检出HPV。目前人类还未发明出能够有效治疗HPV感染的药物,因此所谓治疗主要是针对由HPV引起的宫颈或外生殖器或肛周或皮肤的局部病变,包括由HPV感染引起的宫颈疾病如宫颈糜烂、宫颈癌前病变、宫颈癌;由HPV感染引起的女阴上皮内瘤变;以及由HPV感染引起的疣病,如扁平疣、寻常疣、掌跖疣、尖锐湿疣和免疫功能低下引起的传染性软疣;以及由HPV感染引起的皮肤癌前病变如角化棘皮瘤、日光性角化病、溢脂性角化病。
宫颈癌前病变即所谓宫颈上皮内瘤变(CIN),包括宫颈非典型增生及宫颈癌,其反映了宫颈癌发生发展中的连续过程。宫颈非典型增生是指宫颈上皮细胞部分或大部分发生异形和不典型的分化,可以发生于宫颈外口或移行带或宫颈内膜表面。宫颈癌前病变由于病位特殊,目前临床上以局部治疗为主。现代医学治疗主要采用物理治疗和手术治疗,物理疗法包括激光、冷冻、红外线、微波、电灼和聚焦超声等,但治疗后常出现阴道分泌物增多、水样排液及阴道不规则出血,还可能引起宫颈管狭窄、黏连甚至不孕等副作用,而宫颈锥切术、宫颈广泛切除和子宫全切除等手术治疗对人体的创伤重,痛苦大,医疗费用高。
Merck公司生产的针对HPV6/11/16/18亚型的宫颈癌预防性疫苗Gardasil,目前已经在国外上市并投入使用。GSK公司生产的针对HPV16/18亚型的宫颈癌预防性疫苗Cervarix,具有安全、能够耐受,以及免疫源性好等特点。但这两种疫苗都只是预防性疫苗,尚没有资料证实其对现存的宫颈癌及癌前病变有治疗作用,此外,疫苗不仅会导致受试者注射部位疼痛、肿胀发红,而且价格昂贵。
日光性角化病(AK)又名老年性角化病,就是由长期在日光下曝晒损伤皮肤引起的癌前期皮肤损害,通常会让脸部皮肤和头皮变粗糙、发红、成片剥落,或者结痂,日光、紫外 线、放射性热能以及沥青或煤及其提炼物均可诱发此病。AK是一种皮肤癌前期病变,部分AK可自行消退,但若不经治疗,则约20%的患者一个或多个皮损可发展为鳞状细胞癌,研究显示65%的鳞状细胞癌是由AK导致的。因此积极的治疗日光性角化病,可防止鳞状细胞癌的发生。该病现有的疗法包括液氮法、电灼法、激光疗法和局部外用药治疗。在治疗AK的药物中,可局部应用5%5-氟尿嘧啶,连用数周,但该药可引起暂时性皮肤红肿、红斑、水疱和溃疡等;应用2.5%咪喹莫特乳膏治疗的局部皮肤副作用较大,皮损处易引起红斑、水肿及糜烂;双氯芬酸虽然耐受性更好,但疗效不高。
大量实验研究证实,在日光性角化病、皮肤癌前组织及皮肤癌组织中可检测到人乳头瘤病毒DNA。皮肤恶性肿瘤与人乳头瘤病毒感染密切相关,临床上HPV的感染率亦逐年增加,Kiviat等人认为,HPV感染致皮肤癌的作用与紫外线的致癌作用是同等重要的因素。
因此,目前对治疗由HPV感染引起的宫颈癌前病变以及皮肤癌前病变的药物,特别是治疗由HPV感染引起的宫颈糜烂、轻度宫颈非典型增生(CIN I)、中度宫颈非典型增生(CIN II),以及治疗由HPV感染引起的日光性角化病的药物的研究,仍有待加强。
发明内容
本发明是基于发明人的下列发现而完成的:
近年来,运用中医药对宫颈癌前病变的研究日趋深入,但目前尚无治疗宫颈癌前病变的中药应用于临床。苦参中富含生物碱类化合物,而生物碱中以苦参碱、氧化苦参碱为主。中药苦参具有清热燥湿,祛风杀虫的作用,多用于疮、疥、癣疾等疾病,主湿热泻痢、肠风便血、黄疸、小便不利、水肿、带下、阴痒、疥癣、麻风、皮肤瘙痒、湿毒疮疡。绿茶是一种非发酵茶,也是一种人们常用的饮料,其主要活性成分是茶多酚。绿茶中茶多酚约占茶叶干重的20%~30%。茶多酚是一类多羟基酚类化合物的总称,其主要成分是儿茶素类化合物,约占绿茶中茶多酚总量的65%~80%。儿茶素类化合物主要含有4种单体:表没食子儿茶素没食子酸酯(EGCG)、表儿茶素没食子酸酯(ECG)、表儿茶素(EC)及表没食子儿茶素(EGC)。其中,EGCG含量最高,约占儿茶素类化合物的50%。绿茶具有清热解毒,收敛除湿等功效,而且经研究证明,绿茶还具有抗病毒、抗菌、抗氧化、抗增生作用。目前国内外有关苦参绿茶组合物在制备治疗由HPV感染引起的宫颈癌前病变以及皮肤癌前病变药物中的应用未见报道。
本发明旨在至少解决现有技术中存在的技术问题之一。因此,针对现阶段用于治疗宫颈癌前病变以及皮肤癌前病变药物不足的情况,本发明提供了一种药物组合物及其用途。
根据本发明的一个方面,本发明提供了一种药物组合物。根据本发明的实施例,该药物 组合物包含苦参提取物和绿茶提取物作为活性成分。根据本发明的实施例,优选苦参提取物和绿茶提取物的重量比率为1∶1~2,更优选1∶1.2。其中,苦参提取物是通过下列步骤制备的:将苦参进行加水提取,以便获得苦参提取液;将苦参提取液进行浓缩,以便获得苦参浓缩液;将苦参浓缩液进行pH调节;以及将经过pH调节的苦参浓缩液进行纯化,以便获得苦参提取物。绿茶提取物是通过下列步骤制备的:将绿茶进行加醇提取,以便获得绿茶提取液;以及将绿茶提取液进行纯化,以便获得绿茶提取物。根据本发明的实施例,在得到苦参提取物和绿茶提取物之后,可以根据需要,对所得到的提取物进行干燥得到固体物质。
利用该药物组合物,能够有效地治疗或者预防由HPV感染引起的宫颈癌前病变,能够对宫颈癌前病变进行有效地治疗。另外,发明人发现,利用该药物组合物可以有效地抑制HPVE7基因的表达,并且能够用于治疗由HPV感染引起的宫颈糜烂、轻度宫颈非典型增生及中度宫颈非典型增生。并且进一步发现,该药物组合物还能够有效用于使宫颈癌前病变细胞向良性转化。
本发明进一步发现,该药物组合物可预防UVA辐射后的组织损伤,延长光老化进程,在UVA辐射前外用该药物组合物对皮肤有保护效应,表明苦参绿茶组合物可能是防治光老化的有用成分。该药物对HPV的抑制作用,也可将该药物组合物用于由HPV感染引起的日光性角化病的治疗以及由日光性角化病引起的皮肤癌前病变的治疗。
根据本发明的实施例,将苦参进行加水提取,可以进一步包括:将苦参用6-10倍重量的水进行水煮2-3次,每次0.5-2小时,并合并提取液,以便获得苦参提取液。根据本发明的实施例,苦参浓缩液在50摄氏度时的相对密度为1.06~1.08。根据本发明的实施例,利用盐酸将苦参浓缩液进行pH调节,其中,经过pH调节的苦参浓缩液的pH为3-4。根据本发明的实施例,可以利用阳离子交换树脂对苦参浓缩液进行纯化。
具体地,根据本发明实施例的苦参提取物的制备方法可以为如下:
取苦参药材,用6-10倍量的水煮2-3次,每次0.5-2小时,必要时,在水煮之前可以进行粉碎。合并提取液,浓缩至相对密度为1.06~1.08(50℃)的浓缩液,加盐酸调pH值至3-4,滤过,上清液过阳离子交换树脂柱,用8-12倍树脂体积水及5-8倍树脂体积的30%乙醇洗去部分杂质,再用0.5-2倍树脂体积浓氨水碱化树脂,用5-8倍树脂体积的30%乙醇洗脱。洗脱液经减压浓缩,干燥,粉碎,得苦参提取物细粉,其中细粉的粒度为50-100目。需要说明的是,在本文中所使用的单位“目”,指的是颗粒粒度能够通过每平方英寸上具有所限定数目孔的筛子,本领域技术人员可以方便地通过公式:目数×孔径(微米数)=15000,确定筛的孔径,从而可以确定以微米为单位的颗粒粒度。
根据本发明的具体示例,优选苦参提取物的制备方法如下:
苦参药材3.6kg,用8倍量的水煮3次,每次1小时,必要时,在水煮之前可以进行粉碎。合并提取液,浓缩至相对密度为1.06~1.08(50℃)的浓缩液。加盐酸调pH值至3~4,滤过,上清液过732型阳离子交换树脂柱,用10倍树脂体积水及6倍树脂体积的30%乙醇洗去部分杂质,再用1倍树脂体积浓氨水碱化树脂,用6倍树脂体积30%乙醇洗脱。洗脱液经减压浓缩,干燥,粉碎,得苦参提取物细粉100g,其中该细粉的粒度为80目。
根据本发明的实施例,将绿茶进行加醇提取可以进一步包括:将绿茶用8-12倍重量的50-70%乙醇进行加热回流提取1-3次,每次1-3小时,并合并提取液,以便获得绿茶提取液。根据本发明的实施例,将绿茶提取液进行纯化可以进一步包括:将绿茶提取液进行减压处理,以便除去乙醇;将所得的绿茶提取液进行大孔树脂柱处理,以便获得经过纯化的绿茶提取液。
具体地,根据本发明实施例的绿茶提取物的制备方法可以为如下:
绿茶药材加入8-12倍量的50%-70%乙醇加热回流提取1-3次,每次1-3小时,合并提取液。提取液减压回收除去乙醇,提取液离心,弃去残渣,滤液上大孔树脂柱,用水洗脱至无醇味,用5-8个柱体积的水洗脱,再用4-6个柱体积的10%-30%乙醇洗脱,最后用5个柱体积的60%-80%乙醇洗脱,将经乙醇洗脱部分回收,干燥,粉碎,得绿茶提取物细粉,细粉的粒度为50-100目。
根据本发明的具体示例,优选绿茶提取物的制备方法如下:
绿茶药材1.0kg,加入10倍量的60%乙醇加热回流提取两次,每次1.5小时,合并提取液。提取液减压回收除去乙醇,提取液离心,弃去残渣,滤液上大孔树脂(D101型)柱,用水洗脱至无醇味,用6个柱体积的水洗脱,再用5个柱体积的15%乙醇洗脱,最后用5个柱体积的70%的乙醇洗脱,将经乙醇洗脱部分回收,干燥,得干浸膏细粉(绿茶提取物)100g,细粉的粒度为80目。
此外,根据本发明的实施例,制备药物组合物时,苦参与绿茶药材,即用于制备苦参和绿茶提取物的原材料的重量比例为3.6∶1~2,根据本发明的具体示例,优选苦参与绿茶药材的重量比例为3.6∶1,更优选地,苦参与绿茶药材的重量比例为2.25∶1,最优选地,苦参与绿茶药材的重量比例为3∶1。
根据本发明的实施例,本发明的药物组合物可以进一步包括药学上可接受的辅料,从而可以使得药物组合物能够呈现适于给药的形式。优选本发明的药物组合物可以呈选自凝胶剂、洗剂、栓剂、泡腾片、泡腾胶囊、气雾剂以及喷雾剂的至少一种的形式。由此,可以方便使得所述药物组合物适于为对象进行给药。
由此,根据本发明的实施例的药物组合物,可以是以苦参和绿茶为原料,加入药学上可接受的辅料制备而成的中药制剂,并且这些中药制剂可以制成凝胶剂、洗剂、栓剂、泡腾片、 泡腾胶囊、气雾剂或喷雾剂等。
根据本发明的实施例,本发明的药物组合物可以用于治疗或预防宫颈癌前病变。根据本发明的一些具体示例,该药物组合物可以用于使宫颈癌前病变细胞向良性转化。根据本发明的一些实施例,该药物组合物可以用于抑制HPV E7基因的表达。根据本发明的实施例,本发明的药物组合物能够用于治疗由HPV感染引起的宫颈糜烂、轻度宫颈非典型增生及中度宫颈非典型增生。
进一步,本发明的药物组合物能够有效地治疗由HPV感染引起的宫颈癌前病变,使早期宫颈癌前病变的治疗,特别是对宫颈糜烂、轻度宫颈非典型增生及中度宫颈非典型增生的治疗及预防变成现实。
根据本发明的实施例,本发明的药物组合物可以用于治疗或预防皮肤癌前病变。根据本发明的实施例,该药物组合物可预防UVA辐射后的组织损伤,延长光老化进程,在UVA辐射前外用该药物组合物对小鼠皮肤有保护效应,表明苦参绿茶组合物是防治光老化的有用成分,可将该药物组合物用于由HPV感染引起的日光性角化病的治疗。
进一步,本发明的组合物能够有效地治疗或者预防由HPV感染引起的日光性角化病导致的皮肤癌前病变。
此外,发明人还发现,利用本发明实施例的药物组合物进行宫颈癌前病变和宫颈癌治疗时,前者的治疗效果优于后者。因而,优选将根据本发明实施例的药物组合物用于对宫颈癌前病变进行治疗,特别是对宫颈糜烂、轻度宫颈非典型增生及中度宫颈非典型增生的治疗。进一步,根据本发明的实施例,通过将苦参和绿茶这两种中药以不同的比例进行组合,制备药物组合物进行药效学试验,发明人惊奇地发现,本发明的药物组合物对治疗宫颈癌前病变具有有益效果。其中,部分药效学试验设计及其试验结果如下:
发明人建立了HPV(人类乳头瘤病毒)体外筛选模型,选择人宫颈癌细胞HeLa作为体外研究对象,利用苦参提取物和绿茶提取物比例不同的多种药物组合物,作用于HeLa细胞,并通过实时荧光定量PCR法对作用前后细胞内HPV E7基因(在本文中,有时也简单称为E7基因)的相对表达倍数的变化进行检测,考察苦参绿茶比例不同的药物组合物对HeLa细胞E7基因表达的抑制作用。
试验结果显示:当药物组合物中苦参绿茶提取物的比例分别在1∶1~2时,其对E7基因相对表达抑制作用显著,产生了预料不到的技术效果。特别是当药物组合物中苦参绿茶提取物比例在1∶1.2时,在作用于HeLa细胞72h后,其对HeLa细胞的E7基因的抑制作用最显著。具体地,当各种苦参绿茶提取物配比的药物组合物作用于HeLa细胞72h后,细胞内E7基因相对表达倍数与正常对照组相比均有降低的趋势,当药物组合物中的苦参绿茶提取 物比例在1∶1~2时,对E7基因相对表达抑制作用显著,抑制率最高达到87.292%。同时当苦参绿茶提取物比例分别为1∶1、1∶1.2、1∶1.6时,药物组合物对E7基因的相对表达抑制接近。当药物组合物中绿茶提取物的比例继续升高,使得苦参绿茶比例为1∶2时,其对E7基因的相对表达抑制率降低。当药物组合物中苦参绿茶提取物比例在1∶1.2时,作用于HeLa细胞72h后,其对HeLa细胞E7基因的抑制作用最显著。
根据本发明的实施例,通过进行药物组合物对宫颈癌HeLa细胞增殖抑制的实验,发明人惊奇地发现,药物组合物能够显著抑制宫颈癌HeLa细胞的体外增殖,且其作用效应随着对HeLa细胞的培养时间的延长和药物组合物浓度的增加而增加,表明本发明的药物组合物对人宫颈癌HeLa细胞的增殖有抑制作用,并且具有明显的时间和剂量依赖性。当利用相同浓度梯度的药物组合物、苦参、绿茶进行宫颈癌HeLa细胞增殖抑制实验时,药物组合物对宫颈癌HeLa细胞增殖的抑制率明显比单用苦参或单用绿茶对HeLa细胞增殖的抑制率高,并且发明人发现:药物组合物对HeLa细胞凋亡的影响,比仅用苦参提取物或仅用绿茶提取物对HeLa细胞凋亡的影响显著,从而证明了苦参提取物与绿茶提取物进行组合,具有协同效应。
根据本发明的实施例,通过进行药物组合物对宫颈癌HeLa细胞凋亡率影响的试验,发明人发现,不同浓度的药物组合物作用于HeLa细胞24小时、48小时、72小时后,细胞凋亡发生率明显增高,随着药物组合物浓度加大和作用时间延长,凋亡率明显增高。
根据本发明的实施例,利用自制的药物组合物凝胶,进行药物组合物凝胶对宫颈上皮内瘤变(CIN)小鼠宫颈组织PCNA、EGFR和bcl-2表达影响的试验,由试验结果,发明人惊奇地发现,药物组合物凝胶是通过抑制增殖因子、EGFR以及抗凋亡因子的表达,而发挥抑制宫颈上皮异型细胞增生的作用,进而抑制宫颈上皮异型细胞的增殖,促进宫颈上皮异型细胞凋亡,使宫颈癌前病变细胞向良性转化,从而达到阻断宫颈浸润癌发生的目的,进而达到有效治疗宫颈癌前病变的目的。
根据本发明的一些具体示例,通过利用自制的药物组合物栓剂、洗剂、泡腾片、泡腾胶囊,进行对宫颈上皮内瘤变小鼠宫颈组织PCNA、EGFR和bcl-2表达影响的试验,发明人也得到了与上述实验相同的结论。
根据本发明的实施例,利用自制的药物组合物软膏,进行药物组合物软膏对接受紫外线辐射后小鼠的皮肤保护作用的实验。研究结果显示苦参绿茶软膏可预防UVA辐射后的组织损伤,延长光老化进程,在UVA辐射前外用苦参绿茶软膏对小鼠皮肤有保护效应,表明苦参绿茶是防治光老化的有效成分,可将苦参绿茶软膏用于由HPV感染引起的日光性角化病等皮肤癌前病变疾病的治疗。
根据本发明的又一方面,本发明提供了根据本发明实施例的药物组合物在制备药物中的用途,该药物用于治疗或预防由HPV感染引起的宫颈癌前病变。根据本发明实施例,该药物可以用于使宫颈癌前病变细胞向良性转化。根据本发明具体示例,该药物可以用于抑制E7基因的表达。根据本发明的一些实施例,药物组合物用于治疗由HPV感染引起的宫颈糜烂、轻度宫颈非典型增生及中度宫颈非典型增生。根据本发明实施例,该药物可以呈选自凝胶剂、洗剂、栓剂、泡腾片、泡腾胶囊、气雾剂以及喷雾剂的至少一种的形式。
根据本发明的又一方面,本发明提供了根据本发明实施例的药物组合物在制备药物中的用途,该药物用于治疗或预防由HPV感染引起的皮肤癌前病变。根据本发明实施例,该药物可以预防UVA辐射后的组织损伤,延长光老化进程,在UVA辐射前外用该药物对皮肤有保护效应。根据本发明的一些实施例,该药物能够用于治疗由HPV感染引起的日光性角化病等皮肤癌前病变疾病。根据本发明实施例,该药物可以呈选自凝胶剂、软膏、乳膏、气雾剂以及喷雾剂的至少一种的形式。
根据本发明的再一方面,本发明提供了一种制备药物的方法。根据本发明的实施例,该方法包括下列步骤:制备苦参提取物;制备绿茶提取物;以及将苦参提取物与绿茶提取物按照预定的重量比率进行混合,以便得到药物,所述预定的重量比率优选为1∶1~2,更优选为1∶1.2,其中,制备苦参提取物进一步包括:将苦参进行加水提取,以便获得苦参提取液;将所得的苦参提取液进行浓缩,以便获得苦参浓缩液;将苦参浓缩液进行pH调节;将经过pH调节的苦参浓缩液进行纯化,以便获得苦参提取物。制备绿茶提取物进一步包括:将绿茶进行加醇提取,以便获得绿茶提取液;以及将绿茶提取液进行纯化,以便获得绿茶提取物。根据本发明的实施例,在得到苦参提取物和绿茶提取物之后,可以根据需要,对所得到的提取物进行干燥得到固体物质。
利用上述制备药物的方法所得到的药物,能够对由HPV感染引起的宫颈癌前病变进行有效地治疗。另外,发明人发现,利用该药物还能够有效用于使宫颈癌前病变细胞向良性转化。并且进一步发现,该药物可以有效地抑制E7基因的表达,以及用于治疗由HPV感染引起的宫颈糜烂、轻度宫颈非典型增生及中度宫颈非典型增生。
利用上述制备药物的方法所得到的药物,能够对由HPV感染引起的皮肤癌前病变进行有效地治疗。另外,发明人发现,利用该药物还能够预防UVA辐射后的组织损伤,延长光老化进程,在UVA辐射前外用该药物对皮肤有保护效应,可以用于治疗由HPV感染引起的日光性角化病。
根据本发明的实施例,其中将苦参进行加水提取,可以进一步包括:将苦参用6-10倍重量的水进行水煮2-3次,每次0.5-2小时,并合并提取液,以便获得苦参提取液。根据本 发明的实施例,苦参浓缩液在50摄氏度时的相对密度为1.06~1.08。根据本发明的实施例,利用盐酸将苦参浓缩液进行pH调节,其中,经过pH调节的苦参浓缩液的pH为3-4。根据本发明的实施例,可以利用阳离子交换树脂对苦参浓缩液进行纯化。
具体地,根据本发明实施例的苦参提取物的制备方法可以为如下:
取苦参药材,,用6-10倍量的水煮2-3次,每次0.5-2小时,必要时可以在水煮之前进行粉碎。合并提取液,浓缩至相对密度为1.06~1.08(50℃)的浓缩液,加盐酸调pH值至3-4,滤过,上清液过阳离子交换树脂柱,用8-12倍树脂体积水及5-8倍树脂体积的30%乙醇洗去部分杂质,再用0.5-2倍树脂体积浓氨水碱化树脂,用5-8倍树脂体积的30%乙醇洗脱。洗脱液经减压浓缩,干燥,粉碎,得苦参提取物细粉,该细粉的粒度为50-100目。
根据本发明的具体示例,优选苦参提取物的制备方法如下:
苦参药材3.6kg,用8倍量的水煮3次,每次1小时,必要时可以在水煮之前进行粉碎。合并提取液,浓缩至相对密度为1.06~1.08(50℃)的浓缩液。加盐酸调pH值至3~4,滤过,上清液过732型阳离子交换树脂柱,用10倍树脂体积水及6倍树脂体积的30%乙醇洗去部分杂质,再用1倍树脂体积浓氨水碱化树脂,用6倍树脂体积30%乙醇洗脱。洗脱液经减压浓缩,干燥,粉碎,得苦参提取物细粉100g,该细粉的粒度为80目。
根据本发明的实施例,将绿茶进行加醇提取可以进一步包括:将绿茶用8-12倍重量的50-70%乙醇进行加热回流提取1-3次,每次1-3小时,并合并提取液,以便获得绿茶提取液。根据本发明的实施例,将绿茶提取液进行纯化可以进一步包括:将绿茶提取液进行减压处理,以便除去乙醇;将所得的绿茶提取液进行大孔树脂柱处理,以便获得经过纯化的绿茶提取液。
具体地,根据本发明实施例的绿茶提取物的制备方法可以为如下:
绿茶药材加入8-12倍量的50%-70%乙醇加热回流提取1-3次,每次1-3小时,合并提取液。提取液减压回收除去乙醇,提取液离心,弃去残渣,滤液上大孔树脂柱,用水洗脱至无醇味,用5-8个柱体积的水洗脱,再用4-6个柱体积的10%-30%乙醇洗脱,最后用5个柱体积的60%-80%乙醇洗脱,将经乙醇洗脱部分回收,干燥,粉碎,得绿茶提取物细粉。
根据本发明的具体示例,优选绿茶提取物的制备方法如下:
绿茶药材1.0kg,加入10倍量的60%乙醇加热回流提取两次,每次1.5小时,合并提取液。提取液减压回收除去乙醇,提取液离心,弃去残渣,滤液上大孔树脂(D101型)柱,用水洗脱至无醇味,用6个柱体积的水洗脱,再用5个柱体积的15%乙醇洗脱,最后用5个柱体积的70%的乙醇洗脱,将经乙醇洗脱部分回收,干燥,得干浸膏细粉(绿茶提取物)100g。
根据本发明的实施例,本发明的制备药物的方法可以进一步包括添加药学上可接受的辅 料制备而成的中药制剂的步骤。根据本发明的实施例,本发明的制备药物的方法可以进一步包括下列步骤:将药物制成选自凝胶剂、洗剂、栓剂、泡腾片、泡腾胶囊、气雾剂以及喷雾剂的至少一种的形式。
根据本发明的实施例,利用本发明的制备药物的方法制备的药物,可以用于治疗或预防宫颈癌前病变。根据本发明的一些具体示例,该药物可以用于使宫颈癌前病变细胞向良性转化。根据本发明的一些实施例,该药物可以用于抑制E7基因的表达。
根据本发明的实施例,利用本发明的制备药物的方法制备的药物,可以用于治疗或预防皮肤癌前病变。根据本发明的一些具体示例,该药物可以预防UVA辐射后的组织损伤,延长光老化进程,在UVA辐射前外用该药物对皮肤有保护效应。
根据本发明的又一方面,本发明还提出了一种药物,其是通过上述制备药物的方法制备的。如前所述,利用该药物,能够对宫颈癌前病变进行有效地治疗。另外,发明人发现,该药物可以有效地抑制E7基因的表达。并且进一步发现,利用该药物还能够有效用于使宫颈癌前病变细胞向良性转化,以及根据本发明的一些实施例,药物组合物用于治疗由HPV感染引起的宫颈糜烂、轻度宫颈非典型增生及中度宫颈非典型增生。此外,根据本发明的实施例,利用该药物,能够对皮肤癌前病变进行有效地治疗。另外,发明人发现,该药物可以预防UVA辐射后的组织损伤,延长光老化进程,在UVA辐射前外用该药物对皮肤有保护效应,以及,该药物可以用于治疗由HPV感染引起的日光性角化病。
需要说明的是,本发明的药物组合物及其用途是本申请的发明人经过艰苦的创造性劳动和优化工作才完成的。
本发明的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出,部分将从下面的描述中变得明显,或通过本发明的实践了解到。
具体实施方式
下面详细描述本发明的实施例。下面描述的实施例是示例性的,仅用于解释本发明,而不能理解为对本发明的限制。除非特殊说明,在实施例中所进行的操作均为按照《中华人民共和国药典》2010年版以及本领域中公知的方法进行的。
实施例1:苦参提取物的制备
苦参药材3.6kg,加水煮三次,每次1小时,每次加8倍体积的水,合并提取液,减压浓缩至相对密度为1.06~1.08(50℃)的浓缩液。加盐酸调pH值至3~4,滤过,将上清液 过处理合格的732型阳离子交换树脂柱,用10倍树脂体积水及6倍树脂体积的30%乙醇洗去部分杂质,再用1倍树脂体积浓氨水碱化树脂,用6倍树脂体积30%乙醇洗脱。洗脱液经减压浓缩,喷雾干燥,得干浸膏细粉(苦参提取物)100g,其粒度为80目。
实施例2:绿茶提取物的制备
绿茶药材1.0kg,加入10倍量的60%乙醇加热回流提取两次,每次1.5h,合并提取液。提取液减压回收除去乙醇,提取液离心,弃去残渣,将滤液上大孔树脂(D101型)柱,用水洗脱至无醇味,用6个柱体积的水洗脱,再用5个柱体积的15%乙醇洗脱,最后用5个柱体积的70%乙醇洗脱,将经乙醇洗脱部分回收,真空干燥,得干浸膏细粉(绿茶提取物)100g,其粒度为80目。
实施例3:不同配比的苦参绿茶药物组合物体外对人宫颈癌HeLa细胞HPV E7基因相对表达量的影响
一、实验细胞株及试验药物
试验细胞株:人宫颈癌细胞株HeLa细胞(中国医学科学院肿瘤医院惠赠)。
受试物:苦参提取物和绿茶提取物,其分别根据实施例1和2所制备,并且按照下列步骤配置苦参提取物和绿茶提取物的母液:
苦参提取物母液:称取15.6367g苦参提取物(含水量为7.5%)溶于37ml不完全DMEM中,超声助溶,然后利用0.45μm和0.22μm滤膜过滤除菌除杂,终浓度为351mg/ml,于4℃下保存。
绿茶提取物母液:称取80mg绿茶提取物溶于1ml不完全DMEM中,然后利用0.45μm和0.22μm滤膜过滤除菌除杂,终浓度为80mg/ml,于4℃下保存。
二、不同配比的药物组合物对HeLa细胞HPVE7基因相对表达的影响
取对数生长期的HeLa细胞,以1×106个·ml-1的密度接种于六孔板中,每孔1ml,于37℃,5%CO2,饱和湿度条件下培养24h,然后分别添加细胞毒作用低于5%的不同配比的药物组合物继续培养72h,加药浓度如表1所示,然后利用实时荧光定量PCR法对各组的E7基因的表达量进行检测。
表1苦参绿茶提取物最佳配比实验各药物组合物的加药浓度(μg/ml)
A | B | C | D | E | F | G | H | I | |
苦参提取物 | 160 | 80 | 40 | 20 | 10 | 5 | 5 | 5 | 5 |
绿茶提取物 | 5 | 5 | 5 | 5 | 5 | 5 | 6 | 8 | 10 |
比例 | 32∶1 | 16∶1 | 8∶1 | 4∶1 | 2∶1 | 1∶1 | 5∶6 | 5∶8 | 1∶2 |
实验完毕后,受试药对E7基因相对表达量的影响实验数据由IQ5软件自动统计,得均 值和标准差;手算计算公式为2-△△Ct。组间比较采用单因素方差检验。结果如下表所示:手算结果与IQ5统计结果一致。
三、不同配比的药物组合物对HeLa细胞的HPVE7基因相对表达倍数的影响
在上一步的利用实时荧光定量PCR法对各组的E7基因的表达量进行检测后,以β-肌动蛋白(actin)为内参对照基因,应用SYBR荧光探针,采用实时荧光定量PCR法观察不同配比的药物组合物对HeLa细胞内E7基因的影响。实验结果表明不同配比的药物组合物作用于HeLa细胞72h后,细胞内E7基因相对表达倍数与正常对照组相比均有降低的趋势,见下表2。
表2不同配比的药物组合物对E7基因相对表达量的影响
注:*与正常对照组相比,p<0.05;
**与正常对照组相比,p<0.01;
***n=4,代表每组均做了4个数据值出来,举例说明:如E组的值0.576±0.113,0.576是这4个数据的平均值,0.113是由这4个值算出来的S值(标准偏差)。
表2的数据,显示了不同配比的药物组合物作用于HeLa细胞72h后,对细胞内E7基因的相对表达量的影响。
由表2可知见,不同配比的药物组合作用于HeLa细胞72h后,细胞内E7基因的相对表达量与正常对照组相比均有降低的趋势,其中C-I组与正常对照组相比有显著性差异(p<0.05);随着绿茶提取物在药物组合物中比例的升高,E7基因的相对表达量呈逐渐降低的趋势,当苦参绿茶的比例分别在2∶1、1∶1、1∶1.2、1∶1.6时,药物组合物对E7基因的相对表达抑制作用显著,抑制率最高达到87.292%,但1∶1、1∶1.2、1∶1.6三种比例的药 物组合物对E7基因的相对表达抑制率接近。当绿茶提取物的比例继续升高,使得药物组合物中苦参绿茶比例为1∶2时,其对E7基因的相对表达抑制率降低。当苦参绿茶比例在1∶1.2时,作用于HeLa细胞72h后,其对HeLa细胞E7基因的抑制作用最显著。
实施例4:药物组合物对宫颈癌HeLa细胞的增殖抑制作用
一、实验细胞株及试验药物
实验细胞株:人宫颈癌细胞株HeLa细胞(中国医学科学院肿瘤医院惠赠)。其中,苦参提取物、绿茶提取物分别为根据实施例1和2所制备的。
二、方法:
2.1细胞培养:将冻存的宫颈癌HeLa细胞于37℃下快速融化,进行常规复苏和传代:置于含10%胎牛血清的DMEM培养液中,于37℃,5%CO2的培养箱内培养,当细胞贴壁80%时进行传代,1周传代2次。
2.2细胞增殖抑制实验:取对数生长期的HeLa细胞,以1×106个/ml的密度接种于六孔板中,每孔1ml,于37℃,5%CO2,饱和湿度条件下培养24h后给药,即添加不同浓度的苦参提取物(具体见表3)、绿茶提取物(具体见表4),药物组合物(具体见表5),对照组仅加生理盐水。然后分别培养24h、48h、72h后,添加20微升5mg/ml的MTT,于37℃下孵育4h,然后弃上清,每孔添加200微升DMSO,振荡,使结晶溶解,用酶标仪检测其570nm处的吸光度(OD)值,并根据公式计算细胞生长抑制率,该公式为:细胞生长抑制率=(1-各处理组OD均值/空白对照组OD均值)×100%。
2.3流式细胞仪检测细胞凋亡率:将上述利用不同浓度的苦参提取物、绿茶提取物和药物组合物(具体见表6、表7和表8)对HeLa细胞进行不同时间(24h,48h,72h)处理后所得的细胞进行收集,然后用EDTA进行消化,收集1×106个细胞,1000r/min离心5min,弃上清,接着用4℃预冷的PBS洗涤细胞,1000r/min离心5min后弃上清,共2次,接下来用250微升结合缓冲液重新悬浮细胞,再取100微升细胞悬浮于5ml流式管中,添加5微升Annexin V/FITC和10微升20mg/L的PI,混匀后避光孵育15min,然后在反应管中添加400微升PBS,利用流式细胞仪(FCM)对所得的体系进行细胞凋亡分析。
三、实验结果
3.1细胞增殖抑制实验:将各处理组与空白对照组的实验结果进行比较,可知各浓度的药物组(指分别利用苦参提取物、绿茶提取物和药物组合物对HeLa细胞进行的处理)的OD值均明显低于对照组(P<0.01),结果见表3、表4和表5。且随着给药浓度的升高,各浓度的药物组OD值逐渐降低,各组间(指分别利用苦参提取物、绿茶提取物和药物组合物对HeLa细胞进行的处理)比较均有显著性差异(P<0.01)。从表3-表5中可以看出,药物组合物 对宫颈癌HeLa细胞增殖的抑制率明显比单用苦参或单用绿茶对HeLa细胞增殖的抑制率高、效果好,证明本发明的药物组合物具有协同效应。研究表明,药物组合物显著抑制宫颈癌HeLa细胞的体外增殖,且其作用效应随着培养时间的延长和药物浓度的增加而增加,表明本发明的药物组合物对人宫颈癌Hela细胞的增殖有抑制作用,并且具有明显的时间和剂量依赖性。
表3不同浓度的苦参提取物对宫颈癌HeLa细胞增殖的影响
注:*与对照组比较,p<0.01
表4不同浓度的绿茶提取物对宫颈癌HeLa细胞增殖的影响
注:*与对照组比较,p<0.01
表5不同浓度的药物组合物对宫颈癌HeLa细胞增殖的影响
注:*与对照组比较,p<0.01
3.2药物组合物对宫颈癌HeLa细胞凋亡率的影响:
实验表明,相同浓度梯度的药物组合物对HeLa细胞凋亡的影响比单用苦参或单用绿茶对HeLa细胞凋亡的影响显著。苦参绿茶组合物使人宫颈癌HeLa细胞具有明显的药物浓度依赖性,不同浓度的药物组合物作用于HeLa细胞24h、48h、72h后,细胞凋亡发生率明显增高,随着药物绿茶组合物浓度加大和作用时间延长,凋亡率明显增高,与对照组相比具有显著差异性,具体结果表6、表7和表8(P<0.01)。
表6不同浓度的苦参提取物对HeLa细胞凋亡的影响(Mean±S)
苦参提取物(mg/ml) | 24h | 48h | 72h |
0 | 0.015±0.001 | 0.017±0.002 | 0.018±0.001 |
1.10 | 0.017±0.002 | 0.020±0.002 | 0.024±0.002 |
2.19 | 0.027±0.005 | 0.046±0.004 | 0.066±0.001 |
4.38 | 0.042±0.001 | 0.079±0.007 | 0.088±0.004 |
8.75 | 0.104±0.002 | 0.121±0.003 | 0.136±0.009 |
17.5 | 0.168±0.004 | 0.192±0.007 | 0.204±0.004 |
表7不同浓度的绿茶提取物对HeLa细胞凋亡的影响(Mean±S)
绿茶提取物(mg/ml) | 24h | 48h | 72h |
0 | 0.015±0.001 | 0.017±0.002 | 0.018±0.001 |
0.166 | 0.018±0.002 | 0.020±0.001 | 0.023±0.003 |
0.312 | 0.038±0.008 | 0.049±0.005 | 0.073±0.004 |
0.625 | 0.057±0.003 | 0.081±0.007 | 0.101±0.005 |
1.25 | 0.118±0.008 | 0.142±0.006 | 0.154±0.012 |
2.50 | 0.185±0.007 | 0.214±0.006 | 0.222±0.010 |
表8不同浓度的药物组合物对HeLa细胞凋亡的影响(Mean±S)
实施例5:药物组合物凝胶对宫颈上皮内瘤变(CIN)小鼠宫颈组织PCNA、EGFR和bcl-2表达的影响
一、材料
实验药物及试剂:昆明小鼠40只,雌性,体重30±2g,健康状况良好,由武汉大学医学院实验动物中心提供,动物合格证号:19-013。苦参绿茶药物组合物凝胶(根据后面实施例6所示的方法制备);保妇康凝胶(国药准字Z20060455,武汉中联集团四药药业有限公司生产);增殖细胞核抗原(PCNA)免疫组化染色试剂盒、表皮生长因子受体(EGFR)免疫组化染色试剂盒和细胞凋亡抑制基因bcl-2免疫组化染色试剂盒,由北京中山生物技术有限公司提供。
二、方法
2.1动物造模方法
致癌剂棉线的制备:用苯溶剂溶解化学致癌剂二甲基苯并蒽(DMBA)得到DMBA溶液,将棉线浸入该溶液内,置于通风橱内待苯挥发后,计算棉线的含药量为0.5mg/cm。
取雌性小鼠,在动物不麻醉状态下,借助阴道扩张器及小号弯针,将浸药棉线穿入宫颈,经宫颈口由穹隆部穿出,线结固定于宫颈口,以便获得诱发宫颈上皮内瘤变的小鼠。关于该技术的详细内容可以参见:施新猷.现代医学实验动物学[M].北京:人民军医出版社.2000:438,通过参照将其全文并入本文。
2.2动物分组及给药方法
将实验动物小鼠随机分为4组,每组各10只,分别标记为:空白组(不用药物处理的正常小鼠)、模型组(按照2.1动物造模方法所得到、并且没有用药物进行处理的小鼠)、治疗组和对照治疗组。其中治疗组:给予药物组合物凝胶(按20mg/kg),隔日外用1次;对照治疗组:给予保妇康凝胶(按35mg/kg),隔日外用1次。将上述4组小鼠进行5个月的常规喂养后,通过颈椎脱臼将其处死,剖取小鼠宫颈,保存标本以供光镜观察。
2.3免疫组织化学检测方法
将各组小鼠的宫颈组织浸入4%多聚甲醛溶液进行固定,接着依次经过脱水、透明、浸蜡和包埋处理,接下来将所得的每个蜡块进行连续切片,各取3张切片(切片厚度5μm), 然后分别选用PCNA、EGFR和bcl-2三种抗体,利用链霉菌抗生物素蛋白-过氧化物酶连结法(S-P法)将上述各组的切片进行免疫组织化学染色,二氨基联苯胺(DAB)显色和显微镜观察。
三、结果
3.1各组小鼠宫颈组织增殖细胞核抗原(PCNA)表达水平的比较
采用半定量方法对前面所述的切片进行检测,以便比较各组小鼠宫颈组织增殖细胞核抗原(PCNA)的表达水平。其中,细胞核被染成棕黄色定为阳性结果。然后,基于每张切片阳性反应颗粒的颜色深浅和占细胞总数的比例,按照下列标准,对各张切片的进行统计:
阴性(-):无或偶见阳性颗粒,颜色呈浅黄色;
弱阳性(+):阳性颗粒少于1/3,颜色呈淡棕黄色;
中度阳性(++):阳性颗粒介于1/3~2/3之间,颜色介于+~+++之间;
强阳性(+++):阳性颗粒多于2/3,颜色呈棕黄色。
根据统计结果,对各张切片进行评分,其中(-):1分;(+):2分;(++):3分;(+++):4分。每张切片观察3个视野。
结果显示:PCNA主要在细胞核上表达。模型组PCNA表达呈强阳性,与空白组相比有极显著性差异(P<0.01);治疗组与模型组比较有极显著性差异(P<0.01);对照治疗组与模型组比较无显著性差异(P>0.05),结果见表9。如表9可见,治疗组与对照治疗组有极显著性差异(P<0.01)。
表9各组小鼠宫颈组织PCNA表达水平比较
组别 | n** | - | + | ++ | +++ | 阳性评分 |
空白组 | 10 | 8 | 2 | 0 | 0 | 12 |
模型组 | 9 | 0 | 1 | 2 | 6 | 32△ |
治疗组 | 10 | 6 | 3 | 1 | 0 | 15* |
对照治疗组 | 10 | 2 | 1 | 5 | 2 | 27 |
注:△与空白组比较P<0.01;
*与模型组比较P<0.01;
**n为各组受检小鼠的只数。
本研究结果表明,模型组的小鼠宫颈组织PCNA表达较强,颜色较深,而治疗组仅有较少的染色程度相对较弱的切片中PCNA为阳性表达,二者相比有极显著性差异(P<0.01),并且其分布逐渐局限于基底层,说明药物组合物凝胶是通过抑制增殖因子的表达而发挥抑制宫颈上皮异型细胞增生作用的。
3.2小鼠宫颈组织表皮生长因子(EGFR)表达水平比较
采用半定量方法对前面所述的切片进行检测,以便比较各组小鼠宫颈组织表皮生长因子(EGFR)的表达水平。其中,细胞膜/浆被染成棕黄色定为阳性结果。然后,基于每张切片阳性反应颗粒的颜色深浅和占细胞总数的比例,按照与上述PCNA检测中相同的标准,对各张切片进行统计。
结果显示:EGFR主要在细胞膜及细胞浆上表达,且以细胞膜为主。模型组EGFR表达呈强阳性,与空白组相比有极显著性差异(P<0.01);治疗组与模型组比较有极显著性差异(P<0.01);对照治疗组与模型组比较无显著性差异(P>0.05),结果见表10。如表10可见,治疗组与对照治疗组有极显著性差异(P<0.01)。
表10各组小鼠宫颈组织EGFR表达水平比较
组别 | n** | - | + | ++ | +++ | 阳性评分 |
空白组 | 10 | 7 | 3 | 0 | 0 | 13 |
模型组 | 9 | 1 | 0 | 3 | 5 | 30△ |
治疗组 | 10 | 7 | 2 | 1 | 0 | 14* |
对照治疗组 | 10 | 2 | 2 | 3 | 3 | 27 |
注:△与空白组比较P<0.01;
*与模型组比较P<0.01;
**n为各组受检小鼠的只数。
本研究结果表明,治疗组小鼠宫颈组织中的EGFR阳性表达较少,且染色较浅,与模型组EGFR阳性表达相比有极显著性差异(P<0.01),说明药物组合物凝胶能够抑制EGFR的表达,进而抑制宫颈上皮异型细胞的增生。
3.3小鼠宫颈组织细胞凋亡抑制基因bcl-2表达水平比较
采用半定量方法对前面所述的切片进行检测,以便比较各组小鼠宫颈组织细胞凋亡抑制基因bcl-2的表达水平。其中,细胞膜/浆被染成棕黄色定为阳性结果。基于每张切片阳性反应颗粒的颜色深浅和占细胞总数的比例,按照与上述PCNA检测中相同的标准,对各张切片进行统计。
结果显示:bcl-2主要在细胞膜及细胞浆上表达,且以细胞膜为主。模型组bcl-2表达与空白组相比有极显著性差异(P<0.01);治疗组及对照治疗组与模型组比较有显著性差异(P<0.05);对照治疗组与模型组比较,无显著性差异(P>0.05)。结果见表11。
表11各组小鼠宫颈组织bcl-2表达水平比较
组别 | n** | - | + | ++ | +++ | 阳性评分 |
空白组 | 10 | 8 | 2 | 0 | 0 | 12 |
[0154]
模型组 | 9 | 0 | 5 | 2 | 2 | 24△ |
治疗组 | 10 | 6 | 3 | 1 | 0 | 15* |
对照治疗组 | 10 | 2 | 4 | 3 | 1 | 23 |
注:△与空白组比较P<0.01;
*与模型组比较P<0.01;
**n为各组受检小鼠的只数。
本研究结果表明,治疗组小鼠宫颈组织bcl-2的阳性表达程度减弱,数量减少。与模型组比较有显著性差异(P<0.05),且阳性表达以基底层明显,说明药物组合物凝胶是通过抑制抗凋亡因子的表达而起到发挥宫颈上皮异型细胞凋亡的作用的。
实施例6:苦参绿茶凝胶的制备
处方:
制法:以上两味,按实施例1和实施例2操作分别得到苦参提取物和绿茶提取物,备用。取1.5g卡波姆940均匀溶胀于60ml蒸馏水中,静置过夜。将苦参提取物溶于适量上述所得的蒸馏水中,然后缓慢滴加稀盐酸调节pH至pH为5.5-6.0,依次添加5mL甘油、10mL丙二醇搅拌均匀,再添加绿茶提取物,边加边搅拌,并用蒸馏水补至100g,即得棕褐色凝胶。
实施例7:苦参绿茶凝胶的制备
处方:
制法:按实施例1和实施例2的操作分别得到苦参提取物和绿茶提取物,备用。取18g卡波姆940均匀溶胀于600ml蒸馏水中,静置过夜。将苦参提取物溶于适量上述所得的蒸馏水中,然后缓慢滴加稀盐酸调节pH至pH为5.5-6.0,依次添加60mL甘油、100mL丙二醇搅拌均匀,再添加绿茶提取物,边加边搅拌,并用蒸馏水补至1000g,即得棕褐色凝胶。
实施例8:苦参绿茶洗剂的制备
处方:
制法:将苦参药材加水煮三次,每次1小时,每次加8倍体积的水,合并提取液,浓缩至相对密度为1.06~1.08(50℃)的浓缩液。加盐酸调pH值至pH为3-4,滤过,过732型阳离子交换树脂柱,用10倍树脂体积水及6倍树脂体积的30%乙醇洗去部分杂质,再用1倍树脂体积浓氨水碱化树脂,然后用6倍树脂体积30%乙醇洗脱。将洗脱液经减压回收乙醇至无醇味,然后趁热加入已研细的25g明矾、6g苯甲酸钠、30mL吐温80。将绿茶药材加入8倍量的60%乙醇加热回流提取两次,每次1.5h,合并提取液。提取液减压回收,离心,弃去残渣,将滤液上D101型大孔树脂,用水洗脱至无醇味,用6个柱体积的水洗脱,再用5个柱体积的15%乙醇洗脱,最后用5个柱体积的70%的乙醇洗脱,将经乙醇洗脱部分回收至无醇,然后添加1g薄荷脑、10g冰片(加少量乙醇溶解)搅拌均匀。最后将苦参和绿茶的上述浓缩液合并,用蒸馏水补充至1000ml,搅拌均匀,即得深棕色的混悬液洗剂,本品静置后有细微沉淀,气芳香。
实施例9:苦参绿茶栓剂的制备
处方:
制法:将绿茶药材加入8倍量的60%乙醇加热回流提取两次,每次1.5h,合并提取液。提取液减压回收,离心,弃去残渣,将滤液上D101型大孔树脂,用水洗脱至无醇味,用6个柱体积的水洗脱,再用5个柱体积的15%乙醇洗脱,最后用5个柱体积的70%的醇洗脱,将经乙醇洗脱部分回收至干,减压干燥,粉碎,得绿茶粉末,然后添加2.5g冰片、5g硼酸、8g葡萄糖,研细混合均匀,备用。将苦参药材加水煮三次,每次1小时,每次加8倍体积的水,合并提取液,浓缩至相对密度为1.06~1.08(50℃)的浓缩液。加盐酸调pH值至pH为3~4,滤过,过732型阳离子交换树脂柱,用10倍树脂体积水及6倍树脂体积的30%乙醇洗去部分杂质,再用1倍树脂体积浓氨水碱化树脂,然后用6倍树脂体积30%乙醇洗脱。将洗脱液减压浓缩至干,减压干燥,粉碎,得苦参细粉,然后添加120g甘油,充分混合成糊状物。将250g甘油明胶于水浴上加热融化,再添加上述糊状物,充分混合均匀,最后添加上述已混合均匀备用的绿茶提取物,搅拌均匀,共制100粒,倒入已涂过润滑剂的栓模中,冷却起模,得深棕色栓剂。
实施例10:苦参绿茶栓剂的制备
处方:
制法:
a、根据实施例1所述的制备苦参提取物的方法,将3600g苦参制备成苦参提取物。
b、根据实施例2所述的制备绿茶提取物的方法,将1200g绿茶制备成绿茶提取物。
c、将苦参提取物用0.1mol/L的盐酸溶液溶解后,加羊毛脂45g混匀,以便获得苦参提取物混合物;将单硬脂酸丙二醇酯600g、38型混合脂肪酸甘油酯200g于50℃水浴加热熔化,混合均匀,并缓慢滴入上述苦参提取物混合物中,搅拌分散均匀,以便获得苦参提取物组合物;将绿茶提取物用水溶解后,加羊毛脂45g混匀,以便获得绿茶提取物混合物;将单硬脂酸丙二醇酯600g、38型混合脂肪酸甘油酯200g于50℃水浴加热熔化,混合均匀,并 缓慢滴入上述绿茶提取物混合物中,搅拌分散均匀,以便获得绿茶提取物组合物;将上述苦参提取物组合物与绿茶提取物组合物混合,并添加肉豆蔻酸异丙酯10g、苯甲酸钠2.5g和尼泊金乙酯1.5g,充分搅拌均匀,然后倾入已冷却并涂有润滑剂的栓模中,至稍有溢出模口为止。室温冷却30min使完全凝固后,用刀削去溢出部分,开启模型,推出栓剂,以双层低密度聚乙烯膜袋包装,即得苦参绿茶栓剂。
实施例11、苦参绿茶栓剂的制备
处方:
制法:将苦参提取物60g用0.1mol/L的盐酸溶液溶解后,加羊毛脂80g混匀,以便获得苦参提取物混合物;将单硬脂酸丙二醇酯600g、38型混合脂肪酸甘油酯150g于50℃水浴加热熔化,混合均匀,并缓慢滴入上述苦参提取物混合物中,搅拌分散均匀,以便获得苦参提取物组合物;将绿茶提取物80g用水溶解后,加羊毛脂80g混匀,以便获得绿茶提取物混合物;将单硬脂酸丙二醇酯600g、38型混合脂肪酸甘油酯150g于50℃水浴加热熔化,混合均匀,并缓慢滴入上述绿茶提取物混合物中,搅拌分散均匀,以便获得绿茶提取物组合物;将上述苦参提取物组合物与绿茶提取物组合物混合,并添加肉豆蔻酸异丙酯50g、苯甲酸钠5.0g和尼泊金乙酯0.5g,充分搅拌均匀,然后倾入已冷却并涂有润滑剂的栓模中,至稍有溢出模口为止。室温冷却30min使完全凝固后,用刀削去溢出部分,开启模型,推出栓剂,以双层低密度聚乙烯膜袋包装,即得苦参绿茶栓剂。
实施例12:苦参绿茶泡腾片的制备
处方:
制法:a.称取处方量的苦参药材2450g,用8倍量的水煮3次,每次1小时。合并提取液,浓缩至相对密度为1.06~1.08(50℃)的浓缩液。加盐酸调pH值至3~4,滤过,上清液过732型阳离子交换树脂柱,用10倍树脂体积水及6倍树脂体积的30%乙醇洗去部分杂质,再用1倍树脂体积浓氨水碱化树脂,用6倍树脂体积30%乙醇洗脱。洗脱液经减压浓缩,干燥,粉碎,得苦参提取物细粉。
b.称取处方量的绿茶药材,加入10倍量的60%乙醇加热回流提取两次,每次1.5小时,合并提取液。提取液减压回收除去乙醇,提取液离心,弃去残渣,滤液上D101型大孔树脂柱,用水洗脱至无醇味,用6个柱体积的水洗脱,再用5个柱体积的15%乙醇洗脱,最后用5个柱体积的70%的乙醇洗脱,将经乙醇洗脱部分回收,干燥,得绿茶提取物。
c.将苦参提取物、绿茶提取物以及各辅料分别过160目筛,聚维酮K30溶于无水乙醇中制备得5%聚维酮K30无水乙醇液,备用。
d.绿茶提取物与酒石酸160g、硬脂酸棕榈酸甘油酯40g、乳糖140g混匀后,用适量5%聚维酮K30无水乙醇液润湿制软材,20目筛制粒;湿颗粒在45℃下鼓风干燥1.5h,16目筛整粒,备用。
e.将苦参提取物与碳酸钠24g、碳酸氢钠136g及乳糖110g混匀,用适量5%聚维酮K30无水乙醇液润湿制软材,20目筛制粒;湿颗粒在45℃下鼓风干燥1.5h,16目筛整粒,备用。
f.将这两种干颗粒混合,加入乳糖30g、交联聚维酮35g、聚乙二醇600015g,充分混匀搅拌30min,再转移至压片机上,用椭圆形异型冲模压片,压制成椭圆形片剂,铝塑泡罩包装,即得。
实施例13、苦参绿茶泡腾片的制备
处方:
制法:a.苦参提取物和绿茶提取物的制备方法及各原辅料的前处理方法同实施例12;
b.将苦参提取物、绿茶提取物以及各辅料分别过160目筛,聚维酮K30溶于无水乙醇中制备得5%聚维酮K30无水乙醇液,备用。
c.绿茶提取物与酒石酸160g、硬脂酸棕榈酸甘油酯40g、乳糖140g混匀后,用适量5%聚维酮K30无水乙醇液润湿制软材,20目筛制粒;湿颗粒在45℃下鼓风干燥1.5h,16目筛整粒,备用。
d.将苦参提取物与碳酸钠24g、碳酸氢钠136g及乳糖110g混匀,用适量5%聚维酮K30无水乙醇液润湿制软材,20目筛制粒;湿颗粒在45℃下鼓风干燥1.5h,16目筛整粒,备用。
e.将这两种干颗粒混合,加入乳糖30g、交联聚维酮35g、聚乙二醇600015g,充分混匀搅拌30min,再转移至压片机上,用椭圆形异型冲模压片,压制成椭圆形片剂,铝塑泡罩包装,即得。
实施例14:苦参绿茶泡腾胶囊的制备
处方:
制法:苦参提取物和绿茶提取物的制备方法及各原辅料的前处理方法同实施例12。
a.绿茶提取物与酒石酸180g、硬脂酸棕榈酸乙二醇酯25g、硬脂酸棕榈酸甘油酯25g、甘露醇120g混匀后,用适量5%聚维酮K30无水乙醇液润湿制软材,20目筛制粒;湿颗粒在45℃下鼓风干燥1.5h,16目筛整粒,备用。
b.将苦参提取物与碳酸钠27g、碳酸氢钠153g及甘露醇100g混匀,用适量5% 聚维酮K30无水乙醇液润湿制软材,20目筛制粒;湿颗粒在45℃下鼓风干燥1.5h,16目筛整粒,备用。
c.将这两种干颗粒混合,加入甘露醇20g、交联聚维酮80g、硬脂酰富马酸钠25g,充分混合均匀,过100目筛,然后装于商业化的0号空心胶囊(目前生产的规格由大到小分为000,00,0,1,2,3,4,5号共8种,其容积分别为1.42,0.95,0.67,0.48,0.37,0.27,0.20,0.13ml)制成1000粒。
实施例15、苦参绿茶阴道泡腾胶囊的制备
处方:
制备方法:
a.苦参提取物和绿茶提取物的制备方法及各原辅料的前处理方法同实施例2。
b.绿茶提取物与酒石酸160g、硬脂酸棕榈酸乙二醇酯40g、甘露醇150g混匀后,用适量5%聚维酮K30无水乙醇液润湿制软材,20目筛制粒;湿颗粒在45℃下鼓风干燥1.5h,16目筛整粒,备用。
c.将苦参提取物与碳酸钠24g、碳酸氢钠136g及甘露醇120g混匀,用适量5%聚维酮K30无水乙醇液润湿制软材,20目筛制粒;湿颗粒在45℃下鼓风干燥1.5h,16目筛整粒,备用。
d.将这两种干颗粒混合,加入甘露醇30g、微晶纤维素100g、聚乙二醇600030g,充分混合均匀,过100目筛,然后装于商业化的0号空心胶囊,制成1000粒。
实施例16、苦参绿茶软膏的制备
处方:
制备方法:
a.称取苦参药材2700g,用8倍量的水煮3次,每次1小时。合并提取液,浓缩至相对密度为1.06~1.08(50℃)的浓缩液。加盐酸调pH值至3~4,滤过,上清液过732型阳离子交换树脂柱,用10倍树脂体积水及6倍树脂体积的30%乙醇洗去部分杂质,再用1倍树脂体积浓氨水碱化树脂,用6倍树脂体积30%乙醇洗脱。洗脱液经减压浓缩,干燥,粉碎,得苦参提取物细粉,备用。
b.称取绿茶药材900g,加入10倍量的60%乙醇加热回流提取两次,每次1.5小时,合并提取液。提取液减压回收除去乙醇,提取液离心,弃去残渣,滤液上D101型大孔树脂柱,用水洗脱至无醇味,用6个柱体积的水洗脱,再用5个柱体积的15%乙醇洗脱,最后用5个柱体积的70%的乙醇洗脱,将经乙醇洗脱部分回收,干燥,粉碎,得绿茶提取物细粉,备用。
c.将上述苦参提取物细粉与75g聚乙二醇-300在室温下研磨5分钟,得苦参提取物药物分散液;将上述绿茶提取物细粉与75g聚乙二醇-300在室温下研磨5分钟,得绿茶提取物药物分散液。
d.称取十二烷基磺酸钠改性蒙脱土40g溶于液体石蜡450g,置于胶体磨中湿磨分散8分钟,充分分散后,加入甘油20g继续分散5分钟,得十二烷基磺酸钠改性蒙脱土分散形成的液体石蜡凝胶,加热至60摄氏度,然后向其中依次缓慢添加苦参提取物药物分散液和绿茶提取物药物分散液,边添加边搅拌,再添加预热至60摄氏度的肉豆蔻酸异丙酯230g、环甲基硅酮30g和硬脂醇70g,边加边搅拌均匀,待混合均匀后,停止加热,继续搅拌至室温,即得苦参绿茶软膏。
实施例17、苦参绿茶软膏的制备
处方:
制备方法:
a.苦参提取物和绿茶提取物的制备方法及各原辅料的前处理方法同实施例2。
b.将上述苦参提取物细粉与75g聚乙二醇-300在室温下研磨5分钟,得苦参提取物药物分散液;将上述绿茶提取物细粉与75g聚乙二醇-300在室温下研磨5分钟,得绿茶提取物药物分散液。
c.称取十二烷基磺酸钠改性蒙脱土40g溶于液体石蜡450g,置于胶体磨中湿磨分散8分钟,充分分散后,加入甘油20g继续分散5分钟,得十二烷基磺酸钠改性蒙脱土分散形成的液体石蜡凝胶,加热至60摄氏度,然后向其中依次缓慢添加苦参提取物药物分散液和绿茶提取物药物分散液,边添加边搅拌,再添加预热至60摄氏度的肉豆蔻酸异丙酯230g、环甲基硅酮30g和硬脂醇70g,边加边搅拌均匀,待混合均匀后,停止加热,继续搅拌至室温,即得苦参绿茶软膏。
实施例18、苦参绿茶软膏对接受紫外线辐射后小鼠的皮肤保护作用
一、动物及试药试剂:
动物:雌性BALA/c小鼠,15g左右,5-6周龄,共30只,由武汉大学医学院实验动物中心提供,动物合格证号:19-013。
试药试剂:
1、苦参绿茶软膏(根据实施例17制备),以空白软膏(空白软膏为不加苦参提取物和绿茶提取物,只用相同的药用辅料制备得到的软膏)为对照。
2、固定液:将40%甲醛溶液用蒸馏水稀释成10%甲醛溶液,备用。将25%的戊二醛用PBS(含0.05%吐温-20的pH7.4的磷酸盐缓冲液)稀释成2.5%的戊二醛溶液,备用。
3、系列酒精:用蒸馏水将无水乙醇分别配制成75%、80%、90%、95%浓度的乙醇。
二、方法:
1.小鼠分组、处理及给药:小鼠随机分组,共分6组,每组5只,第1组为对照组,第2组为苦参绿茶软膏组,第3组为空白软膏组,第4组为UVA组;第5组为苦参绿茶软膏+UVA组;第6组为空白软膏+UVA组。各组小鼠背部皮肤接受UVA辐射前先进行局部剃毛,苦参绿茶软膏和空白软膏分别为照射前30分钟外涂,UVA剂量是第1周为20分钟,0.5焦耳/分钟,以后每周逐渐递增20分钟,直至辐射时间为2小时时停止增加,共持续12周后处死小鼠,观察不同处理组小鼠背部皮肤损伤情况。
2.UVA辐射:UVA光源(320-400纳米),小鼠照射放在离光源30厘米处。
3.普通病理切片:将取下的小鼠背部皮肤组织切成小块,立即投入10%甲醛中固定,然后送至病理科做成石蜡切片并HE染色,采集病理图像。
4.扫描电镜:
(1)将取下的小鼠皮肤切成小块,用OCT包埋,并放入液氮里冷冻,取出后做冰冻切片,切成60μm厚度左右;
(3)固定:将切好的组织放入2%-3%戊二醛中,固定2h以上;
(4)清洗:利用PBS缓冲液将固定好的组织进行清洗10min×3,其中,×3是指同样的处理进行三次:
(5)梯度乙醇脱水:依次利用50%、70%、80%、90%的乙醇将清洗过的组织进行脱水处理,每次处理15min;然后,再用无水乙醇处理30min×3;
(6)置换:利用叔丁醇将经过脱水处理的组织进行置换处理30min×3(叔丁醇要45℃预热);
(7)冷冻干燥:利用叔丁醇淹没上述处理好的样品,并将其置于冷冻干燥机中进行干燥2-3h;
(8)粘样:将经过冷冻干燥处理的样品以方便观察的体位粘于样品台上;
(9)镀膜:利用离子溅射仪将样品进行镀膜120s,其中膜约10nm:
(10)将经过镀膜处理的样品置于电镜下进行观察并拍照。
三、结果:
1、不同处理组小鼠背部皮肤肉眼观察:
BALB/c小鼠经过不同处理后观察到背部皮肤发生如下变化:UVA照射组小鼠背部皮肤增厚粗糙,并见明显的粗大皮肤沟纹出现;空白软膏+UVA组小鼠皮肤也出现增厚粗糙但无 明显粗大的皮肤沟纹出现。而苦参绿茶软膏组及UVA+苦参绿茶软膏组的小鼠皮肤外观与非光照组相比无显著性变化。
2、6组小鼠在慢性UVA辐射后组织病理变化:
虽然照射UVA时间长达12周,但由于UVA主要作用于真皮,所以在6组小鼠皮肤组织病理切片中,表皮均无明显改变,从真皮厚度上比较起来看,UVA组小鼠皮肤真皮层显著变厚,真皮层内为扭曲的、异常的弹性纤维形成的弹性组织变性。从真皮厚度上来看,UVA组小鼠和其他组小鼠的厚度差异很明显。
3、扫描电镜显示:
UVA组皮肤真皮层增厚,胶原之间排列疏松,扭曲而不规则,而空白对照组真皮胶原纤维致密。苦参绿茶软膏+UVA组和UVA组相比,真皮厚度及胶原纤维的排列方向均明显改善趋于正常。而空白软膏+UVA组在镜下见改善不明显,与单纯UVA组改变类似。
结果表明:第1组、第2组及第3组之间无显著性变化,第4组UVA组在皮肤外观、组织病理及扫描电镜方面与其他组相比有明显病理意义上的变化,而第5组较第4组相比有显著性保护作用,而第6组的变化介于4、5两组之间。
结论:本研究结果显示苦参绿茶软膏可预防UVA辐射后的组织损伤,延长光老化进程,在UVA辐射前外用苦参绿茶软膏对小鼠皮肤有保护效应,表明苦参绿茶是防治光老化的一种有用成分,可将苦参绿茶软膏用于由HPV感染引起的日光性角化病等皮肤癌前病变疾病的治疗。
在本说明书的描述中,参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中,对上述术语的示意性表述不一定指的是相同的实施例或示例。而且,描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任何的一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。
尽管已经示出和描述了本发明的实施例,本领域的普通技术人员可以理解:在不脱离本发明的原理和宗旨的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型,本发明的范围由权利要求及其等同物限定。
Claims (9)
1.一种药物组合物,其特征在于,包含苦参提取物和绿茶提取物作为活性成分,优选所述苦参提取物和绿茶提取物的重量比率为1∶1~2,更优选1∶1.2,
其中,
所述苦参提取物是水提取物;
所述绿茶提取物是醇提取物;
任选地,所述苦参提取物是通过下列步骤制备的:
将苦参进行加水提取,以便获得苦参提取液;
将所述苦参提取液进行浓缩,以便获得苦参浓缩液;
将所述苦参浓缩液进行pH调节;以及
将所述经过pH调节的苦参浓缩液进行纯化,以便获得所述苦参提取物,
任选地,所述将苦参进行加水提取,进一步包括:
将所述苦参用6-10倍重量的水进行水煮2-3次,每次0.5-2小时,并合并提取液,以便获得所述苦参提取液,
任选地,所述苦参浓缩液在50摄氏度时的相对密度为1.06~1.08,
任选地,利用盐酸将所述苦参浓缩液进行pH调节,其中,所述经过pH调节的苦参浓缩液的pH为3-4,
任选地,利用阳离子交换树脂对所述苦参浓缩液进行纯化,
任选地,所述绿茶提取物是通过下列步骤制备的:
将绿茶进行加醇提取,以便获得绿茶提取液;以及
将所述绿茶提取液进行纯化,以便获得所述绿茶提取物,
任选地,将绿茶进行加醇提取进一步包括:
将所述绿茶用8-12倍重量的50-70%乙醇进行加热回流提取1-3次,每次1-3小时,并合并提取液,以便获得所述绿茶提取液,
任选地,将所述绿茶提取液进行纯化进一步包括:
将所述绿茶提取液进行减压处理,以便除去乙醇;
将所述绿茶提取液进行大孔树脂柱处理,以便获得经过纯化的绿茶提取液。
2.根据权利要求1所述的药物组合物,其特征在于,所述药物组合物进一步包括药学上可接受的辅料,
任选地,所述药物组合物呈选自凝胶剂、洗剂、栓剂、泡腾片、泡腾胶囊、气雾剂以及喷雾剂的至少一种的形式。
3.根据权利要求1或2所述的药物组合物,其特征在于,所述药物组合物用于治疗或预防由HPV感染引起的宫颈癌前病变以及皮肤癌前病变,
任选地,所述药物组合物用于使宫颈癌前病变细胞向良性转化,
任选地,所述药物组合物用于抑制E7基因的表达,
任选地,所述药物组合物用于治疗由HPV感染引起的宫颈糜烂、轻度宫颈非典型增生及中度宫颈非典型增生,
任选地,所述药物组合物用于预防UVA辐射后的组织损伤,延长光老化进程,
任选地,在UVA辐射前外用所述药物组合物对皮肤有保护效应,
任选地,所述药物组合物用于治疗由HPV感染引起的日光性角化病。
4.根据权利要求1-3任一项所述的药物组合物在制备药物中的用途,其特征在于,所述药物用于治疗或预防由HPV感染引起的宫颈癌前病变以及皮肤癌前病变。
5.根据权利要求4所述的用途,其特征在于,所述药物用于使宫颈癌前病变细胞向良性转化,
任选地,所述药物用于抑制HPV E7基因的表达,
任选地,所述药物用于治疗由HPV感染引起的宫颈糜烂、轻度宫颈非典型增生及中度宫颈非典型增生,
任选地,所述药物用于预防UVA辐射后的组织损伤,延长光老化进程,
任选地,在UVA辐射前外用所述药物对皮肤有保护效应,
任选地,所述药物用于治疗由HPV感染引起的日光性角化病,
任选地,所述药物呈选自凝胶剂、洗剂、栓剂、泡腾片、泡腾胶囊、气雾剂以及喷雾剂的至少一种的形式。
6.一种制备药物的方法,其特征在于,包括下列步骤:
制备苦参提取物;
制备绿茶提取物;以及
将所述苦参提取物与所述绿茶提取物按照预定的重量比率进行混合,以便得到所述药物,所述预定的重量比率优选为1∶1~2,更优选为1∶1.2,
其中,
所述苦参提取物是水提取物;
所述绿茶提取物是醇提取物;
任选地,所述制备苦参提取物进一步包括下列步骤:
将苦参进行加水提取,以便获得苦参提取液;
将所述苦参提取液进行浓缩,以便获得苦参浓缩液;
将所述苦参浓缩液进行pH调节;以及
将所述经过pH调节的苦参浓缩液进行纯化,以便获得所述苦参提取物,
任选地,所述将苦参进行加水提取,进一步包括:
将所述苦参用6-10倍重量的水进行水煮2-3次,每次0.5-2小时,并合并提取液,以便获得所述苦参提取液,
任选地,所述苦参浓缩液在50摄氏度时的相对密度为1.06~1.08,
任选地,利用盐酸将所述苦参浓缩液进行pH调节,其中,所述经过pH调节的苦参浓缩液的pH为3-4,
任选地,利用阳离子交换树脂对所述苦参浓缩液进行纯化,
任选地,所述制备绿茶提取物进一步包括下列步骤:
将绿茶进行加醇提取,以便获得绿茶提取液;以及
将所述绿茶提取液进行纯化,以便获得所述绿茶提取物,
任选地,将绿茶进行加醇提取进一步包括:
将所述绿茶用8-12倍重量的50-70%乙醇进行加热回流提取1-3次,每次1-3小时,并合并提取液,以便获得所述绿茶提取液,
任选地,将所述绿茶提取液进行纯化进一步包括:
将所述绿茶提取液进行减压处理,以便除去乙醇;
将所述绿茶提取液进行大孔树脂柱处理,以便获得经过纯化的绿茶提取液。
7.根据权利要求6所述的方法,其特征在于,进一步包括下列步骤:
将所述药物制成选自凝胶剂、洗剂、栓剂、泡腾片、泡腾胶囊、气雾剂以及喷雾剂的至少一种的形式。
8.根据权利要求6或7所述的方法,其特征在于,所述药物用于治疗或预防HPV感染引起的宫颈癌前病变以及皮肤癌前病变,
任选地,所述药物用于使宫颈癌前病变细胞向良性转化,
任选地,所述药物用于抑制HPV E7基因的表达,
任选地,所述药物用于治疗由HPV感染引起的宫颈糜烂、轻度宫颈非典型增生及中度宫颈非典型增生,
任选地,所述药物用于预防UVA辐射后的组织损伤,延长光老化进程,
任选地,在UVA辐射前外用所述药物对皮肤有保护效应,
任选地,所述药物用于治疗由HPV感染引起的日光性角化病。
9.一种药物,其是根据权利要求6-8任一项所述的方法制备的。
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