CN108392530B - 黄芩汤及其等效成分群用于增强结肠癌对伊立替康化疗敏感性的用途 - Google Patents
黄芩汤及其等效成分群用于增强结肠癌对伊立替康化疗敏感性的用途 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了黄芩汤及其等效成分群用于增强结肠癌对伊立替康化疗敏感性的用途。本发明发现,黄芩汤可以显著增强结肠癌对伊立替康的化疗敏感性,包括增强伊立替康对结肠癌的杀伤力、对结肠癌细胞增殖的抑制作用和对结肠癌细胞凋亡的促进作用;该发现有助于在不明显降低伊立替康化疗疗效的前提下降低伊立替康给药剂量,从而缓解伊立替康化疗副作用。本发明发现,黄芩汤中的没食子酸、野黄芩苷、黄芩素、汉黄芩素、甘草酸和千层纸素A组合物可以显著增强结肠癌对伊立替康化疗敏感性,且药效与等剂量黄芩汤基本一致;该发现有助于开发成分明确、质量可控的组合物药物替代黄芩汤辅助用于结肠癌化疗,还有助于以该组合物为质控指标控制黄芩汤质量。
Description
技术领域
本发明属于医药领域,涉及中药经典名方的二次开发,具体涉及黄芩汤及其等效成分群 用于增强结肠癌对伊立替康化疗敏感性的用途。
背景技术
结肠癌是一种常见恶性肿瘤,随着人们生活水平的提高,饮食结构等各个方面的变化, 我国结直肠癌发病率逐年上升。据统计我国的结直肠癌每年新发病例33.1万人,每年死于该 病的患者有15.9万人。在美国每年有超过10.6万人被诊断患结直肠癌。目前化疗是结直肠癌 治疗的主要手段。
伊立替康(Irinotecan,CPT-11)是DNA拓扑异构酶Ⅰ抑制剂,为晚期结直肠癌的一线用 药,也可用于术后的辅助化疗,对肺癌、乳腺癌、胰腺癌等也有一定疗效。但CPT-11临床应 用极易引发系列副反应包括中性粒细胞减少,恶心呕吐,骨髓抑制,迟发性腹泻等,其中严 重的迟发性腹泻是导致其剂量限制的主要原因。寻找合适的方法来保护正常组织细胞免受化 疗损伤,提高肿瘤组织细胞对化疗的敏感性成为恶性肿瘤防治研究中的一大热点和难点。近 几年的研究显示,中西药联用治疗恶性肿瘤是一种行之有效的减毒增效方法。
黄芩汤出自汉代张仲景的《伤寒论》,由黄芩、芍药、甘草、大枣四味药材组成,是中医治疗下痢的经典方剂。已有研究证实黄芩汤能显著回调伊立替康引起的迟发性腹泻、缓解 体重减轻,有效降低伊立替康暴露引起的回肠和盲肠的损害程度,显著降低伊立替康腹泻引 起的大鼠靶组织中IL-10和TNF-α异常表达。目前,尚未有研究证实黄芩汤是否能增强伊立 替康抗结肠癌活性,亦未揭示黄芩汤中能起到增效作用的有效成分组合。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的不足,提供黄芩汤及其等效成分群用于增强结肠癌对 伊立替康化疗敏感性的用途。
本发明的上述目的是通过下面的技术方案得以实现的:
黄芩汤在制备增强结肠癌对伊立替康化疗敏感性的药物中的应用。
一种用于体现黄芩汤增强结肠癌对伊立替康化疗敏感性药效的等效成分群,包括没食子 酸、野黄芩苷、黄芩素、汉黄芩素、甘草酸和千层纸素A。
一种用于增强结肠癌对伊立替康化疗敏感性的药物组合物,包括没食子酸、野黄芩苷、 黄芩素、汉黄芩素、甘草酸和千层纸素A。
一种用于增强结肠癌对伊立替康化疗敏感性的药物制剂,含有上述药物组合物,还含有 药学上可以接受的载体或赋形剂,制成药学上可以接受的剂型。
进一步地,药学上可以接受的载体或赋形剂包括一种或多种固体、半固体或液体辅料。
进一步地,所述药学上可以接受的剂型包括片剂、胶囊剂、颗粒剂、注射剂、丸剂、糖 浆剂、散剂、膏剂。
有益效果:
1、本发明发现,黄芩汤可以显著增强结肠癌对伊立替康的化疗敏感性,具体包括增强伊 立替康对结肠癌细胞的杀伤力、增强伊立替康对结肠癌细胞增殖的抑制作用和增强伊立替康 对结肠癌细胞凋亡的促进作用;该发现有助于在不明显降低伊立替康对结肠癌化疗疗效的前 提下降低伊立替康给药剂量,从而缓解伊立替康化疗副作用。
2、本发明发现,黄芩汤中的没食子酸、野黄芩苷、黄芩素、汉黄芩素、甘草酸和千层纸 素A组合物可以显著增强结肠癌对伊立替康化疗敏感性,且药效与等剂量黄芩汤基本一致; 该发现有助于开发成分明确、质量可控的组合物药物替代黄芩汤辅助用于结肠癌化疗,还有 助于以该组合物为质控指标控制黄芩汤质量。
附图说明
图1为黄芩汤联用伊立替康对细胞活性的影响;
图2为黄芩汤联用伊立替康对细胞活性的影响;
图3为黄芩汤联用伊立替康对细胞增殖的影响;
图4为黄芩汤联用伊立替康对细胞增殖的影响;
图5为黄芩汤联用伊立替康对细胞凋亡的影响;
图6为活性物质群联用伊立替康对细胞凋亡的影响。
具体实施方式
下面结合附图和实施例具体介绍本发明实质性内容,但并不以此限定本发明的保护范围。
下述试验的统计学分析为:采用GraphPad Prism 5.0统计软件(GraphPadSoftware,USA) 进行统计分析和图表处理。各组之间均数比较采用单因素方差分析(ANOVA),以Dunnett’s post-hot检验进一步检测组间显著性差异。以P<0.05作为具有显著性差异。
实施例1:黄芩汤增强结肠癌对伊立替康化疗敏感性
一、试验材料
1、仪器与试剂
RIPM1640(Gibco-Thermo Fisher Scientific,USA);0.25%胰蛋白酶、胎牛血清、青霉 素-链霉素溶液(Biological Industries,Israel);DMSO(美国Sigma公司);6孔板、96孔 板(美国Corning公司);多功能酶标仪(Infinite M200PRO);生物安全柜、CO2细胞培养箱(Thermo Fisher Scientific,USA)
2、细胞株
人源结肠癌细胞株HCT-116培养于含10%胎牛血清的RIPM1640的完全培养基中。
3、黄芩汤样品制备
黄芩汤的制备:黄芩、芍药、甘草、大枣(9g:6g:6g:6g),400mL双蒸水冷浸30 min,调节平板加热器显示温度为330℃,加热20min(约17min后沸腾),调节温度至285℃, 加热80min。四层纱布过滤,取滤液。滤渣加270mL双蒸水,调节温度至330℃,加热15min, 然后调节温度至285℃,加热60min。再四层纱布过滤,合并两次的滤液为黄芩汤水煎液。 放置室温,4℃储存,-80℃冻2-4小时,冷冻干燥。
用于细胞实验的黄芩汤制备过程如下,将一剂汤药获得的冻干粉末称重为6770mg,取 677mg(1/10)置于50ml无菌离心管中,粉末中加入2.16mL培养基和0.54mL二甲基亚砜 (v/v,20%),涡旋2min,4℃储存。临用前涡旋2min,充分混匀,取适量样品用培养基稀 释到所需浓度,用0.22μm滤膜过滤后用于细胞实验。
二、试验方法和结果
1、MTT实验评价黄芩汤联用伊立替康对细胞活性的影响
本实验称取伊立替康(恒瑞,江苏)适量,溶于二甲基亚砜,用培养基稀释得到系列浓 度2.5、5、10、20、40μΜ,黄芩汤浓度为500、1000μg/ml(以原材料质量计)。取对数生 长期的HCT-116细胞,0.25%胰蛋白酶消化后收集细胞,接种于96孔细胞培养板,每孔约3000个细胞,设对照组、药物单用组和联用组,每组3个复孔。待细胞完全贴壁后,吸弃上清, 每孔加入各自对应的培养液(正常培养基或含药培养基)。48h后,吸弃上清,加入MTT 溶液,于培养箱中避光孵育约4h后在酶标仪上测定吸光度,计算抑制率
抑制率=[1-(药物组吸光度-空白对照组吸光度)/对照组吸光度]×100%。
结果如表1和图1、2所示(*代表伊立替康单用组与联用组比较,P<0.05以*表示,P<0.005以**表示)。
表1黄芩汤(HQD)增强CPT-11对结肠癌细胞的杀伤力
由表1和图1、2可见,黄芩汤可以显著增强伊立替康对结肠癌细胞的杀伤力,且呈明显 的剂量依赖性。对结肠癌细胞发挥同等杀伤力的前提下,黄芩汤联合给药可以显著降低伊立 替康的给药剂量,从而有助于缓解伊立替康引起的化疗不良反应。
2、克隆形成实验评价黄芩汤联用伊立替康对细胞增殖的影响
取对数生长期HCT-116细胞,0.25%胰蛋白酶消化后收集细胞,接种于6孔细胞培养板, 每孔约250个细胞,设定对照组,药物单用组和联用组。伊立替康浓度为1.8μM,黄芩汤浓 度为50、75μg/mL。待细胞贴壁完全后,每孔加入20μL含药培养基,轻轻摇晃混匀,置于培养箱中培养,第五天吸弃上清,换上新鲜培养基或者含药培养基继续培养至第十天,吸弃上清,每孔加入PBS洗两遍后加入冷甲醇固定15min,吸弃甲醇,加入1mL结晶紫染液避 光孵育15min,回收结晶紫,用双蒸水清洗残留染液,晾干,拍照,于IPP软件上对每孔细 胞克隆数进行计数。结果如表2和图3、4所示。图3中,A:空白对照组;B:CPT-11组; C:HQD 50μg/ml组;D:HQD 75μg/ml组;E:CPT+HQD 50μg/ml组;F:CPT+HQD 75 μg/ml组。*代表给药组与对照组比较,P<0.05以*表示,P<0.005以**表示;#代表伊立替 康单用组与联用组比较,P<0.05以#表示,P<0.005以##表示。
表2黄芩汤(HQD)增强CPT-11对结肠癌细胞增殖的抑制作用
HQD/μg/mL | CPT-11/μM | 克隆数 | SD |
0 | 0 | 238 | 11.23981 |
50 | 0 | 220 | 3.511885 |
75 | 0 | 167** | 8.185353 |
0 | 1.8 | 173** | 12.76715 |
50 | 1.8 | 109<sup>##</sup> | 3.21455 |
75 | 1.8 | 87<sup>##</sup> | 7 |
由表2和图3、4可见,黄芩汤可以显著增强伊立替康对结肠癌细胞增殖的抑制作用,且 呈明显的剂量依赖性。对结肠癌细胞发挥同等增殖抑制的前提下,黄芩汤联合给药可以显著 降低伊立替康的给药剂量,从而有助于缓解伊立替康引起的化疗不良反应。
3、流式细胞术测定黄芩汤联用伊立替康对细胞凋亡的影响
取对数生长期HCT-116细胞,0.25%胰蛋白酶消化后收集细胞,接种于6孔细胞培养板, 每孔约1.0×105个细胞。待细胞贴壁完全后,吸弃上清,加入培养基或者含药培养基。伊立替 康终浓度为18μM,黄芩汤终浓度为250μg/mL。药物处理48h后,收集细胞上清液,合并 至收集细胞的重悬液,取约1~5×105个细胞依次加入PI,FITC/Annexin V染料,避光孵育20 min后于流式细胞仪(BD Biosciences,San Jose,CA,USA)上进行检测。
结果如表3和图5所示。*代表给药组与对照组比较,P<0.05以*表示,P<0.005以** 表示;#代表伊立替康单用组与联用组比较,P<0.05以#表示,P<0.005以##表示。
表3黄芩汤(HQD)增强CPT-11对结肠癌细胞凋亡的促进作用
HQD/μg/mL | CPT-11/μM | 凋亡率(%) | SD |
0 | 0 | 5.966666667 | 1.101514109 |
0 | 18 | 29.633333** | 2.7501515 |
250 | 0 | 9.12* | 1.045322917 |
250 | 18 | 49.26667<sup>##</sup> | 3.507611 |
由表3和图5可见,黄芩汤组结肠癌细胞凋亡不明显,但黄芩汤可以显著增强伊立替康 对结肠癌细胞凋亡的促进作用。
实施例2:黄芩汤中等效成分群含量的测定(标准品外标法)
黄芩汤样品处理过程同实施例1。
高效液相系统Agilent 1100HPLC system(Agilent Technologies,USA)
色谱条件
色谱柱为Agilent Zorbax SB-C18柱(250mm×4.6mm ID,5μm)
检测波长:没食子酸、黄芩素、汉黄芩、千层纸素A280nm;甘草酸铵254nm;野黄芩苷335nm。
色谱条件:流动相甲醇(A)-0.1%磷酸水溶液(B)
洗脱梯度:0-8min,5%A→25%A;8-10min,25%A→38%A;10-20min,38%A→55%A; 20-35min,55%A→100%A;
柱温:43℃,流速:1.0mL/min。
按照上述色谱条件,测定黄芩汤中6个活性物质的的含量(按药材计)如下:没食子酸 0.05%,野黄芩苷0.06%,黄芩素0.21%,汉黄芩素0.07%,千层纸素A0.03%,甘草酸0.2%。
实施例3:黄芩汤等效成分群增强结肠癌对伊立替康化疗敏感性
本实验称取各化学成分单体(没食子酸、野黄芩苷、黄芩素、汉黄芩素、甘草酸和千层 纸素A)溶于二甲基亚砜中,使用时根据各单体成分在黄芩汤(HQD)中的含量比例进行混合。活性物质群(HB)的终浓度经换算后分别相当于黄芩汤终浓度1000μg/mL(MTT实验)、1000μg/mL(流式细胞凋亡实验)。试验方法同实施例1。
1、MTT实验评价HB、HQ联用伊立替康对细胞活性的影响
结果如表4、5所示。其中,*代表伊立替康单用组与联用组比较,P<0.05以*表示,P<0.005以**表示。
表4 HQD增强CPT-11对结肠癌细胞的杀伤力
CPT/μM | HQD(μg/mL) | 细胞抑制率(%) | SD |
10 | \ | 48.38 | 2.6062233 |
10 | 1000 | 72.89** | 0.017643979 |
表5 HB增强CPT-11对结肠癌细胞的杀伤力
CPT-11(μM) | 活性物质群(HB,μg/mL) | 细胞抑制率(%) | SD |
10 | \ | 49.62666667 | 2.93925728 |
10 | 1000 | 76.37** | 3.14272175 |
结果表明,由没食子酸、野黄芩苷、黄芩素、汉黄芩素、甘草酸和千层纸素A组成的化 合物群与黄芩汤基本等效,可以用于增强CPT-11对结肠癌细胞的杀伤力。
2、流式细胞术测定HB、HQ联用伊立替康对细胞凋亡的影响
结果如表6和图6所示。*代表给药组与对照组比较,P<0.05以*表示,P<0.005以** 表示;#代表伊立替康单用组与联用组比较,P<0.05以#表示,P<0.005以##表示。
表6 HB、HQ增强CPT-11对结肠癌细胞凋亡的促进作用
CPT-11(μM) | HQD(μg/mL) | 活性物质群(HB,μg/mL) | 凋亡率(%) | SD |
/ | / | / | 5.7 | 0.916515139 |
18 | / | / | 39.83333* | 9.033456 |
/ | 1000 | / | 16.3 | 4.563989 |
/ | / | 1000 | 12.6** | 0.9539392 |
18 | 1000 | / | 61.53333# | 7.710599 |
18 | / | 1000 | 60.26667# | 3.008876 |
结果表明,由没食子酸、野黄芩苷、黄芩素、汉黄芩素、甘草酸和千层纸素A组成的化 合物群与黄芩汤基本等效,可以用于增强CPT-11对结肠癌细胞凋亡的促进作用。
上述实施例的作用在于具体介绍本发明的实质性内容,但本领域技术人员应当知道,不 应将本发明的保护范围局限于该具体实施例。
Claims (1)
1.一种用于体现黄芩汤增强结肠癌对伊立替康化疗敏感性药效的等效成分群,所述黄芩汤由重量份之比为9:6:6:6的黄芩、芍药、甘草和大枣配伍而成,其特征在于:该等效成分群由没食子酸、野黄芩苷、黄芩素、汉黄芩素、甘草酸和千层纸素A组成,且各成分的含量比例与其在黄芩汤中的含量比例相同。
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Identification of chemicals and their metabolites from PHY906, a Chinese medicine formulation, in the plasma of a patient treated with irinotecan and PHY906 using liquid chromatography/tandem mass spectrometry (LC/MS/MS);Wei Zhang等;《Journal of Chromatography A》;20100721;第5785-5793页 * |
Systems Pharmacology Based Strategy for Q-Markers Discovery of HuangQin Decoction to Attenuate Intestinal Damage;Xiao-min Dai等;《Frontiers in Pharmacology》;20180320;第1-8页 * |
The number of intestinal bacteria is not critical for the enhancement of antitumor activity and reduction of intestinal toxicity of irinotecan by;Wing Lam等;《Complementary & Alternative Medicine》;20141231;第1-10页 * |
Also Published As
Publication number | Publication date |
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CN108392530A (zh) | 2018-08-14 |
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