CN109793746A - 一种改善肾功能不全的组合物、黑参提取物及其制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种改善肾功能不全的组合物，属于人参深加工技术领域，所述组合物包括以下重量份的原料：人参皂苷Rg₃2～6份，人参皂苷Rg₅1～5份，人参皂苷Rk₁1～3份。本发明的组合物通过抑制HK‑2表型分化，参与延缓慢性肾间质纤维化的进程，从而改善慢性肾功能不全。经过验证，本发明产品能显著改善慢性肾功能不全CKD2‑3期患者的肾功能。

Description

一种改善肾功能不全的组合物、黑参提取物及其制备方法和 应用

技术领域

本发明涉及人参深加工技术领域，尤其涉及一种改善肾功能不全的组合物、黑参提取物及其制备方法和应用。

背景技术

人参(Panaxgenseng C.A.Mey)系五加科植物人参的干燥根，是古今著名的滋补良药。性平、味甘、微苦、微温。用于大补元气，生津止渴，安神益智。

黑参，是以传统中药制作方法之一“九蒸九曝”的原理为依托，经过浸润、清洗、分选、蒸制、晾晒、烘干等工序加工而成。黑参在蒸制过程中，由于采用九蒸九晒的工艺，成份上发生微量变化，皂苷含量增加、燥性成分减少，颜色逐渐变成褐色至黑褐色的人参，性温、味微苦。

现有技术中，黑参的炮制工艺尚无统一标准，由于炮制工艺参数的不同，黑参提取物中成分的种类及含量会随工艺参数的不同而有所变化，对应的黑参提取物的功效也就存在差异。目前缺少一种能够有效改善肾功能不全的黑参提取物及其制备方法。

发明内容

本发明的目的在于提供一种改善肾功能不全的组合物，该组合能够用于改善肾功能不全。

为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

本发明提供了一种改善肾功能不全的组合物，包括以下重量份的原料：人参皂苷Rg₃2～6份，人参皂苷Rg₅1～5份，人参皂苷Rk₁1～3份。

本发明还提供了一种包含上述方案所述组合物的黑参提取物，所述黑参提取物中组合物的质量百分含量为0.3％～0.5％。

本发明还提供了上述方案所述黑参提取物的制备方法，步骤如下：

1)将黑参粉和乙醇水溶液混合，进行超声提取，过滤，得到滤液；

2)对步骤1)所述滤液进行浓缩，对浓缩液进行干燥，得到黑参提取物。

优选的，步骤1)中所述黑参粉的粒径为30～60目。

优选的，步骤1)中所述乙醇水溶液中乙醇的体积百分含量为55％～75％。

优选的，步骤1)中所述黑参粉和乙醇水溶液的质量体积比为1g:15～25mL。

优选的，步骤1)中所述超声提取的温度为20～30℃；所述超声提取的超声频率为60～90kHZ；所述超声提取的次数为1～4次；每次超声提取的时间为40～60min。

优选的，步骤2)中所述浓缩为减压浓缩；所述减压浓缩的温度为70～80℃，所述减压浓缩的压力为0.07～0.1MPa；所述减压浓缩得到的浓缩液中固形物的质量浓度为80％～100％。

本发明还提供了上述方案所述的黑参提取物在制备改善肾功能不全的药物中的应用。

优选的，所述肾功能不全为慢性肾功能不全。

本发明的有益效果：本发明提供了一种改善肾功能不全的组合物，包括以下重量份的原料：人参皂苷Rg₃2～6份，人参皂苷Rg₅1～5份，人参皂苷Rk₁1～3份。慢性肾功能不全与肾功能损害直接相关，而肾功能的损害程度又与小管间质病变的程度密切相关。本发明的组合物通过抑制HK-2表型分化，参与延缓慢性肾间质纤维化的进程，从而改善慢性肾功能不全。经过验证，本发明产品能显著改善慢性肾功能不全CKD2-3期患者的肾功能。

附图说明

图1表示本发明的黑参提取物改善慢性肾功能不全的作用机制图；

图2为实施例4中混合对照品溶液HPLC色谱图；

图3为实施例4中供试品溶液HPLC色谱图；

图4表示不同浓度实施例3制备得到的黑参提取物对HK-2(+)细胞存活率的影响；

图5表示不同浓度实施例3制备得到的黑参提取物对细胞增殖的影响。

具体实施方式

本发明提供了一种改善肾功能不全的组合物，包括以下重量份的原料：人参皂苷Rg₃2～6份，人参皂苷Rg₅1～5份，人参皂苷Rk₁1～3份；优选的，所述组合物包括以下重量份的原料：人参皂苷Rg₃4份，人参皂苷Rg₅3份，人参皂苷Rk₁1份。

本发明还提供了一种包含上述方案所述组合物的黑参提取物，所述黑参提取物中组合物的质量百分含量为0.3％～0.5％，优选为0.35％～0.45％，最优选为0.36％～0.4％。

本发明还提供了上述方案所述黑参提取物的制备方法，步骤如下：

1)将黑参粉和乙醇水溶液混合，进行超声提取，过滤，得到滤液；

2)对步骤1)所述滤液进行浓缩、干燥，得到黑参提取物。

本发明首先黑参粉和乙醇水溶液混合，进行超声提取，过滤，得到滤液。

本发明中，所述黑参粉优选为延边黑参粉，更优选为购自于延边黑参保健食品有限责任公司的延边黑参粉；所述黑参粉的粒径优选为30～60目，更优选为40～50目；所述乙醇水溶液中乙醇的体积百分含量优选为55％～75％，更优选为60％～70％，最优选为65％；所述黑参粉和乙醇水溶液的质量体积比优选为1g:15～25mL，更优选为1g:20mL。

本发明中，所述超声提取的温度优选为20～30℃，更优选为22～28℃，最优选为25℃；所述超声提取的超声频率优选为60～90kHZ，更优选为70～80kHz，更优选为75kHz；所述超声提取的次数优选为1～4次，更优选为2～3次；每次超声提取的时间优选为40～60min，更优选为45～55min，最优选为48min；所述超声提取的设备优选为双向多功能超声波萃取机，其厂家为深圳金川成科技，型号为SX-611。

得到滤液后，本发明对滤液进行浓缩，对浓缩液进行干燥，得到黑参提取物。

本发明中，所述浓缩优选为减压浓缩。所述减压浓缩的温度优选为70～80℃，更优选为75℃；所述减压浓缩的压力优选为0.07～0.1MPa，更优选为0.08～0.09MPa；所述减压浓缩得到的浓缩液中固形物的质量浓度优选为80％～100％，更优选为85％～95％，最优选为90％。

本发明中，所述干燥优选为真空冷冻干燥。所述真空冷冻干燥的温度优选为-60℃～-10℃，更优选为-50℃～-40℃；所述真空冷冻干燥的时间优选为48～96h，更优选为60～84h，最优选为72h。所述浓缩液在真空冷冻干燥前优选的经过预冻处理；所述预冻的温度优选为-20～-40℃；所述预冻的时间优选为4～6h，更优选为5h。

本发明还提供了上述方案所述的黑参提取物在制备改善肾功能不全的药物中的应用；所述肾功能不全优选为慢性肾功能不全。

本发明中，所述黑参提取物可通过抑制HK-2表型转化，参与延缓慢性肾间质纤维化的进程，从而改善慢性肾功能不全，作用机制图参见图1。

下面结合实施例对本发明提供的技术方案进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。

实施例1一种改善肾功能的黑参提取物的提取方法

将2g延边黑参粉(购自于延边黑参保健食品有限责任公司，过30目筛)与30mL体积分数为55％的乙醇水溶液混合，在20℃下超声(200W，80kHz)提取2次，每次50min，过滤，滤液减压浓缩至1:1料液比，浓缩液于-20℃条件下预冻4h，-40℃真空冷冻干燥48h，即得黑参提取物。

实施例2一种改善肾功能的黑参提取物的提取方法

将2g延边黑参粉(购自于延边黑参保健食品有限责任公司，过50目筛)与50mL体积分数为75％的乙醇水溶液混合，在30℃下超声(200W，70kHz)提取4次，每次40min，过滤，滤液减压浓缩至1:1料液比，浓缩液于-40℃条件下预冻6h，-50℃℃真空冷冻干燥84h，即得黑参提取物。

实施例3一种改善肾功能的黑参提取物的提取方法

将2g延边黑参粉(购自于延边黑参保健食品有限责任公司，过40目筛)与40mL体积分数为65％的乙醇水溶液混合，在25℃下超声(200W，75kHz)提取3次，每次48min，过滤，滤液减压浓缩至1:1料液比，浓缩液于-35℃条件下预冻4h，-60℃真空冷冻干燥72h，即得黑参提取物。

实施例4比较实施例3制备得到的黑参提取物与延边黑参有效成分含量

1.实验材料与仪器

1.1实验材料与试剂

延边黑参(延边黑参保健食品有限责任公司)、人参皂苷Rg₃(中国食品药品检定研究院，MUST-20171003)、人参皂苷Rg₅(上海源叶生物科技有限公司，186763-78-0)、人参皂苷Rk₁(上海源叶生物科技有限公司，494753-69-4)、色谱甲醇(TEDIA)、色谱乙腈(TEDIA)、超纯水。

1.2实验仪器与设备

1260液相色谱(Agilent OpenLAB)、高速多功能粉碎机(浙江永康市久品工贸有限公司)、KQ5200DE型数控超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)、循环水式多用真空泵(郑州长城仪器厂)、电子天平(诸暨市超泽衡器设备有限公司)。

2.黑参中人参皂苷Rg₃、Rk₁、Rg₅的含量测定方法研究

2.1混合对照品溶液的制备

分别精密称量人参皂苷Rg₃、Rk₁、Rg₅对照品5.2mg、4.7mg、5.1mg，加甲醇制成0.52mg·mL^-1、0.47mg·mL^-1、0.51mg·mL^-1的对照品溶液，各吸上述溶液2mL至同一10mL量瓶中，得到质量浓度分别为0.104mg·mL^-1、0.094mg·mL^-1、0.102mg·mL^-1的混合对照品溶液，过0.22μm微孔滤膜，备用。

2.2色谱条件及系统适应性试验

色谱柱：Thermo C18(250mm×4.6mm，5μm)；流动相：A为乙腈，B为超纯水，梯度洗脱条件：0～5min(25％～45％A)，6～10min(45％～60％A)，11～20min(60％～73％A)，21～25min(73％～75％A)，26～35min(75％～25％A)；流速：0.8mL·min^-1；检测波长：203nm；柱温：30℃；进样量：20μL。以外标法定量，混合对照品及供试品溶液的色谱图如图2和图3所示，其中图2为混合对照品溶液HPLC色谱图；图3为供试品溶液HPLC色谱图；图2和图3中1表示Rg₃，2表示Rk₁，3表示Rg₅。在对照品色谱保留时间相应处，供试品有相应色谱峰。在该色谱条件下，理论塔板数均不低于6000，色谱柱具有良好柱效，待测组分稀有人参皂苷Rg₃、Rg₅、Rk₁与相邻未知峰的分离度大于1.0，可较好分离待测组分。

2.3供试品溶液的制备

黑参供试品：精密称取干燥黑参粉末(过40目筛)2.00g，用40mL体积分数65％乙醇水溶液为溶剂25℃超声提取(200W，80kHz)3次，每次48min，合并提取液，过滤，滤液定容至250mL，摇匀，过0.22μm微孔滤膜，即得。

黑参提取物供试品：精密称取实施例3制备得到的黑参提取物0.10g，溶于体积分数65％乙醇水溶液中，过滤，滤液定容至10mL，摇匀，过0.22μm微孔滤膜，即得。

2.4含量测定

取黑参及提取物分别制备3批样品，按2.2项下测定方法进行含量测定，以外标法计算稀有人参皂苷Rg₃、Rg₅、Rk₁总含量，测定结果见表1。由表1结果可知，与黑参粉相比，提取物中3种组合物含量提高3～3.5倍。

表1样品含量测定结果

实施例5本发明提取物改善慢性肾功能不全患者肾功能的临床研究

1.一般资料所有患者均符合慢性肾脏病(chronic kidney disease，CKD)2～3期脾肾阳虚型，随机分为2组，治疗组30例，对照组30例2组患者一般资料比较差异无统计学意义(P＞0.05)，具有可比性。

2.病例选择

(1)诊断标准西医诊断标准:符合慢性肾病西医诊断标准，肾损害分级为CKD2～3级[肾小球滤过率(GFR)30～89mL/min/1.73m²]。中医辨证分型标准:脾肾阳虚证符合中华中医药学会肾病分会2006年制订的《慢性肾衰竭的诊断、辨证分型及疗效评定(试行方案)》中的有关标准。

(2)纳入标准①符合上述诊断标准。②高血压、血K⁺在正常范围内。③年龄18～70岁。④签署知情同意书。

(3)排除和剔除标准①合并有心、脑、肝和造血系统等严重原发性疾病者。②尿毒症期者；或急性肾功能衰竭患者。③妊娠或哺乳期妇女。④可能对己知试验药物过敏者。⑤正在参加其他药物临床试验者或3个月内参加过其他临床试验者。⑥合并有血管、肝脏(AST、ALT超出正常值上限的1.5倍者)和造血系统(除外肾性贫血)等严重原发性疾病，精神病患者。⑦研究者认为不宜进行临床试验者。

3.治疗方法

(1)对照组根据体质量控制总热量摄入(30～35kcal·kg^-1·d^-1)，给予低盐、低脂、低磷、优质低蛋白饮食(0.5～0.6g·kg^-1)、适当限制饮水量；②控制血压140/90mmHg降压(厄贝沙坦等)、控制尿酸、护肾(复方α酮酸片)；纠正贫血、纠正钙磷代谢、维持水电酸碱平衡等常规治疗。

(2)治疗组在对照组治疗的基础上加用本发明提取物治疗，黑参提取物(每1g相当于黑参2g，延边医药健康产业中试基地按本发明优化工艺参数制备，20181206)每日服用2次，每次1g，饭后温开水送服。

(3)疗程2组均以3个月为1个疗程，1个疗程后进行统计分析。

4.观察指标24h尿蛋白定量(24hUTP)、血尿素氮(BUN)、血肌酐(Scr)、血清胱抑素C(Cys-C)、血清白蛋白(ALB)、电解质(K、Na、CI、Ca、P)及肾小球滤过滤(eGFR)。

5.统计学方法运用SPSS 20.0统计软件处理数据，用t检验处理计量资料，以(均数±标准差)(x±s)表示计数资料，采用χ2检验，不符合参数检验条件则用秩和检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

6.结果见表2。治疗后2组患者血BUN、血Scr、24h尿蛋白较治疗前降低，但治疗后治疗组较对照组下降更加明显(P＜0.05)；治疗组患者eGFR有不同程度提高，对照组则无明显变化，提示本发明产品能显著改善慢性肾功能不全CKD2-3期患者的肾功能。

表2 2组患者治疗前后肾功能指标变化比较(x±s)

注:与本组治疗前比较，*P＜0.05；与对照组治疗后比较，△P＜0.05。

实施例6实施例3制备得到的黑参提取物对TGF-β1诱导的离体人肾小管上皮细胞(HK-2)表型转分化的影响

1.细胞培养

细胞培养于含体积分数为10％胎牛血清的DMEM培养液中常规传代。

2.细胞活力测定

0.25％胰蛋白酶消化后，将5×10⁴个细胞接种到具有完全培养基的96孔板中，并在37℃，5％CO₂中孵育过夜。然后HK-2分为11组：对照组，TGF-β1(5ng/mL)组，氯沙坦组，海昆肾喜组，实施例3制备得到的黑参提取物(100μg/mL，200μg/mL，400μg/mL，500μg/mL，600μg/mL，700μg/mL和800μg/mL)组。将MTT(5mg/mL)溶液20μL加入各孔中，然后在培养箱中孵育4h，加入100μLDMSO，摇动10min以溶解所得的蓝色晶体。使用酶标仪在570nm下测量吸光度。细胞活力表示为对照的百分比。应用24h，48h和72h三个时间点来评估活力，结果表明，实施例3制备得到的黑参提取物以剂量依赖性方式抑制细胞增殖，72h后800μg/mL时这种现象更为突出。最终高剂量为800μg/mL，中剂量为400μg/mL，低剂量为200μg/mL，结果见图4和图5，其中图4表示不同浓度实施例3制备得到的黑参提取物对HK-2(+)细胞存活率的影响；图5表示不同浓度实施例3制备得到的黑参提取物对细胞增殖的影响。

3.蛋白质印迹分析

由于EMT的进展为细胞外基质(ECM)沉积铺平了道路并最终恶化了肾纤维化，通过蛋白印迹分析检测了α-SMA，E-cadherin，Ⅰ型胶原(COL-Ⅰ)的表达。结果显示，TGF-β1刺激后a-SMA，COL-Ⅰ蛋白水平显著升高，E-cadherin水平下调。但是，经不同浓度实施例3制备得到的黑参提取物治疗后，明显下调α-SMA和COL-Ⅰ蛋白表达，而E-cadherin蛋白水平升高，结果表明细胞外基质沉积减少，抑制EMT过程，从而改善肾间质纤维化。

由以上实施例可知，本发明实施例3中制备得到的黑参提取物通过抑制HK-2表型转化，参与延缓慢性肾间质纤维化的进程，改善慢性肾功能不全。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (10)

1.一种改善肾功能不全的组合物，包括以下重量份的原料：人参皂苷Rg₃2～6份，人参皂苷Rg₅1～5份，人参皂苷Rk₁1～3份。

2.一种包含权利要求1所述组合物的黑参提取物，其特征在于，所述黑参提取物中组合物的质量百分含量为0.3％～0.5％。

3.权利要求2所述黑参提取物的制备方法，步骤如下：

1)将黑参粉和乙醇水溶液混合，进行超声提取，过滤，得到滤液；

2)对步骤1)所述滤液进行浓缩、干燥，得到黑参提取物。

4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，步骤1)中所述黑参粉的粒径为30～60目。

5.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，步骤1)中所述乙醇水溶液中乙醇的体积百分含量为55％～75％。

6.根据权利要求3或5所述的制备方法，其特征在于，步骤1)中所述黑参粉和乙醇水溶液的质量体积比为1g:15～25mL。

7.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，步骤1)中所述超声提取的温度为20～30℃；所述超声提取的超声频率为60～90kHZ；所述超声提取的次数为1～4次；每次超声提取的时间为40～60min。

8.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，步骤2)中所述浓缩为减压浓缩；所述减压浓缩的温度为70～80℃；所述减压浓缩的压力为0.07～0.1MPa；所述减压浓缩得到的浓缩液中固形物的质量浓度为80％～100％。

9.权利要求2所述的黑参提取物在制备改善肾功能不全的药物中的应用。

10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，所述肾功能不全为慢性肾功能不全。