TW201446269A - 用於藥物傳遞的經改質聚（β－胺基酯） - Google Patents

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Abstract

本發明揭示經至少一個寡肽改質的聚(β-胺基酯)(PBAEs)的聚合物。該等聚合物可用於已發現聚合物有用的任何領域，包括用於醫藥領域，特別是用於藥物傳遞。該等聚合物尤其可用於傳遞多核苷酸，諸如DNA、RNA及siRNA，小分子或蛋白質。本發明亦揭示包括該等聚合物及活性劑之組合物、封裝藥劑於該等聚合物基質中的方法、及該等聚合物及組合物用於醫藥的用途。

Description

用於藥物傳遞的經改質聚( β -胺基酯)
本發明係關於適用於傳遞活性劑之聚合物。本發明亦係關於包括該等聚合物之奈米顆粒及其製造方法。
缺乏用於傳遞多核苷酸諸如DNA及RNA之安全有效的載體成為基因療法成功的主要障礙(Luo、D.& Saltzman、W.M.Synthetic DNA delivery systems.Nature Biotech.18、33-37(2000)；Kamimura K.等人，Advances in Gene Delivery Systems.Pharmaceut.Med.25、293-306(2011)；Miele E.等人，Nanoparticle-based delivery of small interfering RNA：challenges for cancer therapy.Int.J.Nanomedicine 7、3637-3657(2012))。用於傳遞多核苷酸之主要的方案使用病毒載體，其為高效的傳遞系統。然而，病毒載體具有某些劣勢，包括安全風險、攜帶多核苷酸之有限的能力及大規模製造的高成本。非病毒載體提供潛在的優勢，包括高填充性、製造便利、低毒性及免疫原性，但效率比病毒載體低(Mintzer、M.A.& Simanek、E.E.Nonviral vectors for gene delivery.Chem.Rev.109、259-302(2009))。
已經敘述生物可降解之聚(β-胺基酯)(PBAEs)作為能夠壓縮DNA及RNA成分散型奈米顆粒的潛在的非病毒多核苷酸傳遞載體(Green,J.J.等人，Acc.Chem Res.41,749-759(2008))。利用一級胺在PBAE之末端的化學改質(參見流程圖1)已經表現相比商業轉染劑諸如脂質轉染胺2000、Fugene及聚伸乙亞胺(PEI)產生更高的轉染功效(Zugates, G.T.等人，Bioconjugate Chem.18,1887-1896(2007)；Green,J.J.等人，Nano letters 8,3126-3130(2008)；WO02/31025A2)。
仍需要可用於有效地轉染多核苷酸且可經濟地製備之改進的無毒的、生物可降解的、生物可相容的聚合物。該等聚合物可在基因療法中用於填充及傳遞DNA及RNA及用於填充及傳遞其他診斷劑、治療劑及預防劑。
特定言之，需要可用於有效轉染在循環中具有弱穩定性之短多核苷酸(尤其siRNA及微型RNA(miRNA))的聚合物。現有聚合物多核苷酸傳遞載體無法高負載封裝siRNA及miRNA，因為該等序列具有相對短的長度。此外，許多用於siRNA及miRNA之現有的聚合物傳遞載體具有細胞毒性。
本發明提供新穎的末端經改質的PBAE，其可用於包括藥物傳遞(尤其用於多核苷酸之傳遞)、組織工程設計及生物物質的多種醫學應用中。本發明尤其關於PBAE之醫學應用。本發明亦提供本發明之末端經改質的聚合物與多核苷酸之錯合物、包括本發明之聚合物的藥物傳遞裝置(例如，微米顆粒、奈米顆粒)、製備末端經改質的聚合物的方法及利用本發明之末端經改質的聚合物的方法。
由於此等系統之高生物可降解性及低毒性，此等系統之聚酯性產生有吸引力的生物可相容的分佈。因此，此等聚合物在治療許多疾病諸如癌症、單基因病、血管病及傳染病中用作非病毒多核苷酸傳遞 載體。該等多核苷酸傳遞載體之另一應用為作為體外研究的一種工具，以調查在細胞及生理範圍內的基因功能或調控。
在第一態樣中，本發明提供式I聚合物：
其中L1及L2係獨立地選自由如下組成之群： 、O、S、NRx及鍵結；其中Rx係獨立地選自由如下組成之群：氫、鹵素、烷基、環烷基、烯基、環烯基、雜烷基、雜環烷基、醯基、芳基或雜芳基；L3係獨立地選自由如下組成之群：伸烷基、伸烯基、伸雜烷基、伸雜烯基、伸芳基或伸雜芳基；L4係獨立地選自由如下組成之群： 及； L5係獨立地選自由如下組成之群：伸烷基、伸烯基、伸雜烷基、伸雜烯基、伸芳基或伸雜芳基；R1及R2係獨立地選自寡肽及Ry；其中R1及R2中之至少一者為寡肽；且其中Ry係獨立地選自由如下組成之群：氫、鹵素、烷基、環烷基、烯基、環烯基、雜烷基、雜環烷基、醯基、芳基或雜芳基；各R3係獨立地選自由如下組成之群：氫、鹵素、烷基、環烷基、 烯基、環烯基、雜烷基、雜環烷基、醯基、芳基或雜芳基；及n為5至10,000之整數；或其醫藥上可接受的鹽。
在第二態樣中，本發明提供式I聚合物，其中：L1及L2係獨立地選自由如下組成之群： 、O、S、NRx及鍵結；其中Rx係獨立地選自由如下組成之群：氫、鹵素、烷基、環烷基、烯基、環烯基、雜烷基、雜環烷基、醯基、芳基或雜芳基； 至少有一次出現之L3為，其中T1為 及T2選自 H、烷基或 其中LT係獨立地選自由如下組成之群： 、O、S、NRx及鍵結；其中Rx係獨立地選自由如下組成之群：氫、鹵素、烷基、環烷基、烯 基、環烯基、雜烷基、雜環烷基、醯基、芳基或雜芳基；餘下的L3基團在每次出現中獨立地選自由如下組成之群：伸烷基、伸烯基、伸雜烷基、伸雜烯基、伸芳基或伸雜芳基，其中L4係獨立地選自由如下組成之群： 及；L5係獨立地選自由如下組成之群：伸烷基、伸烯基、伸雜烷基、伸雜烯基、伸芳基或伸雜芳基；R1、R2及RT係獨立地選自寡肽及Ry；其中R1、R2及RT中之至少一者為寡肽；且其中Ry係獨立地選自由如下組成之群：氫、鹵素、烷基、環烷基、烯基、環烯基、雜烷基、雜環烷基、醯基、芳基或雜芳基；各R3係獨立地選自由如下組成之群：氫、鹵素、烷基、環烷基、烯基、環烯基、雜烷基、雜環烷基、醯基、芳基或雜芳基；及n為5至10,000之整數；或其醫藥上可接受的鹽。
因此，本發明提供末端經至少一個寡肽改質的PBAE。該等PBAE充當多核苷酸之一流的縮合劑及/或靶向配體以提高細胞攝取及轉染效率。此等聚合物具有能夠改進多核苷酸至細胞之傳遞的生物可降解基團及已顯示比已知的PBAE及商業的轉染劑在體外具有高轉染效率及低細胞毒性。
式I聚合物可藉由使式II二丙烯酸酯單體與式L4H2之經取代之胺反應以形成經丙烯酸酯基封端的中間產物式III。
式II
接著可藉由與末端丙烯酸酯基團反應來添加基團R1L1及R2L2以形成式I聚合物。
在本發明之聚合物中，各L1及L2(及，在第二態樣中，LT)係經選擇以促進末端改質基團R1及R2與PBAE聚合物的偶聯。各L1及L2(及，在第二態樣中，LT)可為鍵結，例如其中該末端改質基團為包括末端半胱胺酸殘基的寡肽。
在本發明之第二態樣中，LT係經選擇以促進末端改質基團RT與PBAE聚合物的偶聯。LT可為鍵結，例如其中該末端改質基團為包括末端半胱胺酸殘基的寡肽。
在本發明之聚合物中，Rx可獨立地選自由氫、烷基、環烷基、烯基、環烯基、雜烷基及雜環烷基組成之群，例如，選自由氫、烷基及環烷基組成之群。
根據本發明，「寡肽」包括藉由肽鍵連接在一起的至少三個胺基酸的鏈。該等肽較佳僅包含天然胺基酸，然而或者可使用技術中已知的非天然胺基酸(即，自然中不存在但可併入多肽鏈中之化合物)及/或 胺基酸類似物。可例如藉由添加化學實體諸如烴基、磷酸酯基、法呢基、異法呢基、脂肪酸基團或用於共軛、官能化或其他改質之連接子而改質在該等肽中之一或多個胺基酸。本發明之聚合物中之寡肽一般包括3至20個胺基酸殘基，更佳3至10個胺基酸殘基，更佳3至6個胺基酸殘基。或者，本發明之聚合物中之寡肽可包括4至20個胺基酸殘基，更佳4至10個胺基酸殘基，更佳4至6個胺基酸殘基。
本發明進一步提供其中該或各寡肽在pH 7下具有凈正電荷的式I化合物。該或各寡肽可包括在pH 7下具有正電荷的天然存在的胺基酸，亦即離胺酸、精胺酸及組胺酸。例如，該或各寡肽可選自由聚離胺酸、聚精胺酸或聚組胺酸組成之群，其各者可由半胱胺酸封端。
在一個實施例中，該或各寡肽較佳係式IV化合物：
其中p為2至19之整數，一般而言3至9或3至5，且其中Ra在每次出現時選自由如下組成之群：H2NC(=NH)-NH(CH2)3-、H2N(CH2)4-或(1H-咪唑-4-基)-CH2-。
在該或各寡肽係式IV化合物的情形下，連接該或各寡肽至聚合物之L1及/或L2(及/或，在第二態樣中，LT)為鍵結及末端半胱胺酸殘基提供一種將該或各寡肽偶聯至式III丙烯酸酯基封端的中間產物的方式。氫硫基官能團提供與雙鍵之更快速、更有效及更容易控制的加成。相比之下，在該或各寡肽係以用於偶聯之胺官能團封端的情形下，偶聯步驟需要過量的該化合物。
本發明進一步提供其中該或各寡肽在pH 7下具有凈負電荷的式I化合物。該或各寡肽可包括在pH 7下具有負電荷的天然存在的胺基酸，亦即天冬胺酸及麩胺酸。例如，該或各寡肽可選自由聚天冬胺酸及聚麩胺酸組成之群，其各者可由半胱胺酸封端。在該實施例中，該或各寡肽可為式IV化合物，其中p為2至19之整數，一般而言3至9或3至5，且其中Ra為HO2C(CH2)2-或HO2C-CH2-。在該情形下，由於末端半胱胺酸殘基提供一種將該或各寡肽偶聯至式IV丙烯酸酯基封端的中間產物的方式，連接該或各寡肽至聚合物之L1及/或L2為鍵結。
或者，該或各寡肽可包括在pH 7下具有負電荷的天然存在的胺基酸及在pH 7下具有正電荷的天然存在的胺基酸的混合物。
本發明進一步提供其中該或各寡肽為疏水的式I化合物。該或各寡肽可包括疏水的天然存在的胺基酸諸如纈胺酸、白胺酸、異亮胺酸、甲硫胺酸、色胺酸、苯基丙胺酸、半胱胺酸、酪胺酸及丙胺酸；特定言之，該或各寡肽可包括纈胺酸、白胺酸、異亮胺酸、甲硫胺酸、色胺酸及苯基丙胺酸。
本發明進一步提供其中該或各寡肽為親水的式I化合物。該或各寡肽可包括親水的天然存在的胺基酸諸如絲胺酸、蘇胺酸、半胱胺酸、天門冬醯胺及麩胺醯胺，及可進一步包括在pH 7下具有電荷的天然存在的胺基酸。
根據本發明之第一態樣，提供其中R1及R2均為寡肽的式I之化合物及其中R1及R2中之一者為寡肽及R1及R2中之一者為Ry的式I化合物。
根據本發明之第一態樣，其中R1及R2中之一者為Ry，則Ry較佳選自由氫、-(CH2)mNH2、-(CH2)mNHMe、-(CH2)mOH、-(CH2)mCH3、-(CH2)2(OCH2CH2)mNH2、-(CH2)2(OCH2CH2)mOH及-(CH2)2(OCH2CH2)mCH3組成之群，其中m為1至20之整數，例如1至5。 較佳地，Ry獨立地選自由-(CH2)mNH2、-(CH2)mNHMe及-(CH2)2(OCH2CH2)mNH2組成之群。較佳地，當L1為NH或NRx，及R1及R2之一者為Ry時，則Ry不同於R3。
本發明之聚合物可為不對稱的。例如，在根據本發明之第一態樣的聚合物中，R1及R2中之一者可為寡肽及另一者可為Ry。或者，R1及R2可為不同的寡肽。在根據本發明之第二態樣的聚合物中，選自R1、R2之至少一者及出現一次或兩次之R5可為寡肽及選自R1、R2之餘下的基團及出現一次或兩次之RT可為Ry。或者，R1、R2及出現一次或兩次之RT可分別為不同的寡肽。
本發明者已經發現不對稱的聚合物具有更高的多核苷酸傳遞效率。例如，根據本發明之第一態樣的聚合物(其中R1及R2中之一者為CysArgArgArg及另一者來源於H2N(CH2)3CH(CH3)CH2NH2)相比R1及R2均為CysArgArgArg之聚合物，及R1及R2均來源於H2N(CH2)3CH(CH3)CH2NH2之聚合物具有更高的多核苷酸傳遞效率。
在根據本發明之聚合物中，L3及L5可獨立地選自伸烷基、伸烯基、伸雜烷基或伸雜烯基及聚乙二醇連接子。該等伸烷基、伸烯基、伸雜烷基或伸雜烯基可具有1-20個碳原子，較佳1-12個碳原子，更佳1-6個碳原子。該聚乙二醇連接子可為3至25個原子長度，較佳3至18個原子長度。
視需要地，L3及/或L5中之一或多個碳原子可由-S-S-替代。在主聚合物鏈中併入至少一個二硫鍵可在目標細胞內部有效地分開治療性多核苷酸。
在根據本發明之聚合物中，各R3可獨立地選自由氫、-(CH2)pNH2、-(CH2)pNHMe、-(CH2)pOH、-(CH2)pCH3、-(CH2)2(OCH2CH2)qNH2、-(CH2)2(OCH2CH2)qOH及-(CH2)2(OCH2CH2)qCH3組成之群，其中p為1至20之整數，例如1至5， 及q為1至10之整數，例如1至5。
在上式I或II中，n較佳係5至1000，更佳20至500。式I或式II聚合物的分子量較佳係1,000至100,000g/mol，更佳2,000及50,000g/mol，更佳5,000及40,000g/mol。
本發明之某些化合物可呈特定的幾何或對映異構體形式存在。本發明包括所有該等化合物，包括順式及反式異構體、R-及S-對映體、非對映體、(D)-異構體、(L)-異構體、其外消旋混合物及其其他混合物，其均位於本發明之範圍內。其他不對稱的碳原子可以取代基諸如烷基存在。所有該等異構體以及其混合物欲併入本發明中。
可根據本發明使用包含各種異構體比之異構體混合物。例如，在組合僅兩種異構體的情形下，本發明包括所有包含50：50、60：40、70：30、80：20、90：10、95：5、96：4、97：3、98：2或99：1異構體比的混合物。一般技術者將容易理解包括針對更多複雜的異構體混合物之類似的比。
化學基團
術語「鹵素」(或「鹵基」)包括氟、氯、溴及碘。
術語「烷基」包括單價、直鏈或分支鏈、飽和、非環狀烴基。在一個實施例中，烷基為C1-10烷基，在另一實施例中，為C1-6烷基，在另一實施例中，為C1-4烷基，諸如甲基、乙基、正丙基、異丙基或第三丁基。烷基可為經取代的。
術語「環烷基」包括單價、飽和、環狀烴基。在一個實施例中，環烷基為C3-10環烷基，在另一實施例中，為C3-6環烷基諸如環戊基及環己基。烷基可為經取代的。
術語「烷氧基」意指烷基-O-。
術語「烷基胺基」意指烷基-NH-。
術語「烷基硫」意指烷基-S(O)t-，其中t係如下所定義。
術語「烯基」包括具有至少一個碳碳雙鍵及在一個實施例中，無碳碳三鍵之單價、直鏈或分支鏈、不飽和、非環狀烴基。在一個實施例中，烯基為C2-10烯基，在另一實施例中，為C2-6烯基，在另一實施例中，為C2-4烯基。烯基可為經取代的。
術語「環烯基」包括具有至少一個碳碳雙鍵及在一個實施例中，無碳碳三鍵之單價、部分不飽和、環狀烴基。在一個實施例中，環烯基為C3-10環烯基，在另一實施例中，為C5-10環烯基，例如環己烯基或苯并環己基。環烯基可為經取代的。
術語「炔基」包括具有至少一個碳碳三鍵及在一個實施例中，無碳碳雙鍵之單價、直鏈或分支鏈、不飽和非環狀烴基。在一個實施例中，炔基為C2-10炔基，在另一實施例中，為C2-6炔基，在另一實施例中，為C2-4炔基。炔基可為經取代的。
術語「伸烷基」包括二價、直鏈或分支鏈、飽和、非環狀烴基。在一個實施例中，伸烷基為C1-10伸烷基，在另一實施例中，為C1-6伸烷基，在另一實施例中，為C1-4伸烷基，諸如伸甲基、伸乙基、正伸丙基、異伸丙基或第三伸丁基。伸烷基可為經取代的。
術語「伸烯基」包括具有至少一個碳碳雙鍵及在一個實施例中無碳碳三鍵之二價、直鏈或分支鏈、不飽和、非環狀烴基。在一個實施例中，伸烯基為C2-10伸烯基，在另一實施例中為C2-6伸烯基，在另一實施例中為C2-4伸烯基。伸烯基可經取代。
術語「雜烷基」包括烷基，例如C1-65烷基、C1-17烷基或C1-10烷基，其中多達20個碳原子、在一個實施例中多達10個碳原子、在一個實施例中多達2個碳原子、在另一實施例中1個碳原子各獨立地由O、S(O)t或N替代，限制條件為保留至少一個烷基碳原子。雜烷基可為C-鍵連或雜鍵連，即其可經由碳原子或經由O、S(O)t或N(其中t係如下文定義)連接至分子的剩餘部分。雜烷基可經取代。
術語「雜環烷基」包括環烷基，其中多達10個碳原子、在一個實施例中多達2個碳原子、在另一實施例中1個碳原子各獨立地由O、S(O)t或N替代，限制條件為保留至少一個環烷基碳原子。雜環烷基之實例包括環氧乙基、硫雜環丙基(thiaranyl)、氮雜環丙基、氧雜環丁基、硫雜環丁烷基(thiatanyl)、氮雜環丁烷基、四氫呋喃基、四氫噻吩基、吡咯啶基、四氫吡喃基、四氫硫吡喃基、哌啶基、1,4-二噁烷基、1,4-氧硫雜環己烷基(oxathianyl)、嗎啉基、1,4-二噻烷基(dithianyl)、哌嗪基、1,4-氮雜噻烷基(azathianyl)、氧雜環庚烷基(oxepanyl)、硫雜環庚烷基(thiepanyl)、氮雜環庚烷基(azepanyl)、1,4-二氧雜環庚烷基、1,4-氧雜硫雜環庚烷基、1,4-氧雜氮雜環庚烷基、1,4-二硫雜環庚烷基、1,4-硫雜氮雜環庚烷基(thieazepanyl)及1,4-二氮雜環庚烷基。雜環烷基可為C-鍵連或N-鍵連，即其可經由碳原子或經由氮原子連接至分子的剩餘部分。雜環烷基可經取代。
術語「雜烯基」包括烯基，例如C1-65烯基、C1-17烯基或C1-10烯基，其中多達20個碳原子、在一個實施例中多達10個碳原子、在一個實施例中多達2個碳原子、在另一實施例中1個碳原子各獨立地由O、S(O)t或N替代，限制條件為保留至少一個烯基碳原子。雜烯基可為C-鍵連或雜鍵連，即其可經由碳原子或經由O、S(O)t或N連接至分子的剩餘部分。雜烯基可經取代。
術語「雜環烯基」包括環烯基，其中多達3個碳原子、在一個實施例中多達2個碳原子、在另一實施例中1個碳原子各獨立地由O、S(O)t或N替代，限制條件為保留至少一個環烯基碳原子。雜環烯基之實例包括3,4-二氫-2H-吡喃基、5-6-二氫-2H-吡喃基、2H-吡喃基、1,2,3,4-四氫吡啶基及1,2,5,6-四氫吡啶基。雜環烯基可為C-鍵連或N-鍵連，即其可經由碳原子或經由氮原子連接至分子的剩餘部分。雜環烯基可經取代。
術語「雜炔基」包括炔基，例如，C1-65炔基、C1-17炔基或C1-10炔基，其中高達20個碳原子，在一個實施例中高達10個碳原子，在一個實施例中高達2個碳原子，在另一實施例中1個碳原子各獨立地由O、S(O)t或N替代，限制條件為保留至少一個炔基碳原子。雜炔基可為C-鍵連或雜鍵連的，即，其可通過碳原子或通過O、S(O)t或N連接至分子的剩餘部分。雜炔基可為經取代的。
術語「伸雜烷基」包括伸烷基，例如，C1-65伸烷基、C1-17伸烷基或C1-10伸烷基，其中高達20個碳原子，在一個實施例中高達10個碳原子，在一個實施例中高達2個碳原子，在另一實施例中1個碳原子各獨立地由O、S(O)t或N替代，限制條件為保留至少一個伸烷基碳原子。伸雜烷基可為經取代的。
術語「伸雜烯基」包括伸烯基，例如，C1-65伸烯基、C1-17伸烯基或C1-10伸烯基，其中高達20個碳原子，在一個實施例中高達10個碳原子，在一個實施例中高達2個碳原子，在另一實施例中1個碳原子各獨立地由O、S(O)t或N替代，限制條件為保留至少一個伸烯基碳原子。伸雜烯基可為經取代的。
術語「芳基」包括單價、芳族、環狀烴基，諸如苯基或萘基(例如1-萘基或2-萘基)。一般而言，該等芳基可為單環或多環稠環芳基。較佳的芳基為C6-C14芳基。芳基可為經取代的。
芳基之其他實例為醋蒽烯、苊烯、醋菲烯、蒽、甘菊環、屈(chrysene)、六苯並苯、熒蒽、茀、不對稱引達省(as-indacene)、對稱引達省(s-indacene)、茚、萘、卵烯、二萘嵌苯、萉、菲、二萘品苯、七曜烯、芘、吡蒽及玉紅省(rubicene)的單價衍生物。
術語「芳烷基」意指經芳基取代的烷基，例如苯甲基。
術語「雜芳基」包括一或多個碳原子各由獨立地選自O、S、N及NRN之雜原子替代的芳基，其中RN係如下文所定義(及在一個實施例 中，為H或烷基(例如C1-6烷基))。雜芳基可為經取代的。
一般而言，該等雜芳基可為單環或多環(例如，雙環)稠環雜芳基。雜芳基一般包含5-14個環成員(較佳5-10個環成員)，其中1、2、3或4個環成員係獨立地選自O、S、N及NRN。在一個實施例中，雜芳基可為5、6、9或10員，例如5員單環、6員單環、9員稠環雙環或10員稠環雙環。
單環雜芳基包括含有5-6個環成員的雜芳基，其中1、2、3或4個環成員係獨立地選自O、S、N或NRN。
在一個實施例中，5員單環雜芳基包含為-NRN-基團、-O-原子或-S-原子的1個環成員，及視需要地為=N-原子的1-3個環成員(例如1或2個環成員)(其中5個環成員之餘下部分為碳原子)。
5員單環雜芳基之實例包括吡咯基、呋喃基、噻吩基、吡唑基、咪唑基、異噁唑基、噁唑基、異噻唑基、噻唑基、1,2,3-三唑基、1,2,4-三唑基、1,2,3-噁二唑基、1,2,4-噁二唑基、1,2,5-噁二唑基、1,3,4-噁二唑基、1,3,4-噻二唑基、吡啶基、嘧啶基、噠嗪基、吡嗪基、1,3,5-三嗪基、1,2,4-三嗪基、1,2,3-三嗪基及四唑基。
6員單環雜芳基之實例包括吡啶基、噠嗪基、嘧啶基及吡嗪基。
在一個實施例中，6員單環雜芳基包含為=N-原子的1或2個環成員(其中6個環成員之餘下部分為碳原子)。
雙環雜芳基包括含有9-14個環成員之稠環雜芳基，其中1、2、3、4或更多個環成員係獨立地選自O、S、N或NRN。
在一個實施例中，9員雙環雜芳基包含為-NRN-基團、-O-原子或-S-原子的1個環成員，及視需要地為=N-原子的1-3個環成員(例如1或2個環成員)(其中9個環成員之餘下部分為碳原子)。
9員稠合雙環雜芳基之實例為苯并呋喃基、苯并噻吩基、吲哚基、苯并咪唑基、吲唑基、苯并三唑基、吡咯并[2,3-b]吡啶基、吡咯 并[2,3-c]吡啶基、吡咯并[3,2-c]吡啶基、吡咯并[3,2-b]吡啶基、咪唑并[4,5-b]吡啶基、咪唑并[4,5-c]吡啶基、吡唑并[4,3-d]吡啶基、吡唑并[4,3-c]吡啶基、吡唑并[3,4-c]吡啶基、吡唑并[3,4-b]吡啶基、異吲哚基、噠唑基、嘌呤基、吲哚啉基、咪唑并[1,2-a]吡啶基、咪唑并[1,5-a]吡啶基、吡唑并[1,2-a]吡啶基、吡咯并[1,2-b]噠嗪基及咪唑并[1,2-c]嘧啶基。
在一個實施例中，10員雙環雜芳基包含為=N-原子的1-3個環成員(其中10個環成員之餘下部分為碳原子)。
10員稠合雙環雜芳基之實例為喹啉基、異喹啉基、噌啉基、喹唑啉基、喹噁啉基、酞嗪基、1,6-萘啶基、1,7-萘啶基、1,8-萘啶基、1,5-萘啶基、2,6-萘啶基、2,7-萘啶基、吡啶并[3,2-d]嘧啶基、吡啶并[4,3-d]嘧啶基、吡啶并[3,4-d]嘧啶基、吡啶并[2,3-d]嘧啶基、吡啶并[2,3-b]吡嗪基、吡啶并[3,4-b]吡嗪基、嘧啶并[5,4-d]嘧啶基、吡嗪并[2,3-b]吡嗪基及嘧啶并[4,5-d]嘧啶基。
術語「雜芳烷基」意指經雜芳基取代的烷基。
醯基之實例包括烷基-C(=O)-、環烷基-C(=O)-、烯基-C(=O)-、環烯基-C(=O)-、雜烷基-C(=O)-、雜環烷基-C(=O)-、芳基-C(=O)-或雜芳基-C(=O)-，特定言之，烷基-C(=O)-及芳基-C(=O)-。
除非另有明確闡明，否則在基團組合在文中稱為一個官能基的情形下，例如芳烷基，最後提及之基團包含該官能基附接至分子之剩餘部分所憑藉的原子。
在提到烷基或其他基團之碳原子由O、S(O)t或N替代的情形下，預計： 係藉由替代
-CH=係藉由-N=替代；≡C-H係藉由≡N替代；或 -CH2-係藉由-O-、-S(O)t-或-NRN-替代。
藉由簡明的方式，就上述含雜原子的基團(諸如雜烷基等)而言，在給出某一數值的碳原子的情形下，例如C3-6雜烷基，其意欲指基於C3-6烷基之其中3-6個鏈碳原子中之一或多個係由O、S(O)t或N替代的基團。因此，例如，C3-6雜烷基將包含少於3-6個鏈碳原子。
在以上提及處，RN為H、烷基、環烷基、芳基、雜芳基、-C(O)-烷基、-C(O)-芳基、-C(O)-雜芳基、-S(O)t-烷基、-S(O)t-芳基或-S(O)t-雜芳基。RN特定言之可為H、烷基(例如C1-6烷基)或環烷基(例如C3-6環烷基)。
在以上提及處，t獨立地為0、1或2，例如2。一般而言，t為0。
在一個基團具有至少2個可經取代的位置的情形下，該基團可由伸烷基或伸雜烷基鏈之兩端取代以形成環狀官能基。
本發明之化合物之視需要經取代之基團(例如烷基、環烷基、烷氧基、烯基、環烯基、炔基、伸烷基、伸烯基、雜烷基、雜環烷基、雜烯基、雜環烯基、雜炔基、伸雜烷基、伸雜烯基、芳基、芳基烷基、芳基雜烷基、雜芳基、雜芳基烷基或雜芳基雜烷基等)可為經取代或未經取代的，在一個實施例中為未經取代的。一般而言，取代涉及一個氫原子經一個取代基之假想替代，或在經=O取代的情形下涉及兩個氫原子。
在經取代的情形中，一般存在1至3個取代基，在一個實施例中，1或2個取代基，在一個實施例中1個取代基。
該(等)可選取代基獨立地為鹵素、三鹵代甲基、三鹵代乙基、-OH、-NH2、-NO2、-CN、-N+(C1-6烷基)2O-、-CO2H、-CO2C1-6烷基、-SO3H、-SOC1-6烷基、-SO2C1-6烷基、-SO3C1-6烷基、-OC(=O)OC1-6烷基、-C(=O)H、-C(=O)C1-6烷基、-OC(=O)C1-6烷基、=O、-NH(C1-6烷基)、-N(C1-6烷基)2、-C(=O)NH2、-C(=O)N(C1-6烷基)2、-N(C1-6烷 基)C(=O)O(C1-6烷基)、-N(C1-6烷基)C(=O)N(C1-6烷基)2、-OC(=O)N(C1-6烷基)2、-N(C1-6烷基)C(=O)C1-6烷基、-C(=S)N(C1-6烷基)2、-N(C1-6烷基)C(=S)C1-6烷基、-SO2N(C1-6烷基)2、-N(C1-6烷基)SO2C1-6烷基、-N(C1-6烷基)C(=S)N(C1-6烷基)2、-N(C1-6烷基)SO2N(C1-6烷基)2、-C1-6烷基、-C1-6雜烷基、-C3-6環烷基、-C3-6雜環烷基、-C2-6烯基、-C2-6雜烯基、-C3-6環烯基、-C3-6雜環烯基、-C2-6炔基、-C2-6雜炔基、-Zu-C1-6烷基、-Zu-C3-6環烷基、-Zu-C2-6烯基、-Zu-C3-6環烯基或-Zu-C2-6炔基，其中Zu獨立地為O、S、NH或N(C1-6烷基)。
在另一實施例中，該(等)可選取代基獨立地為鹵素、三鹵代甲基、三鹵代乙基、-NO2、-CN、-N+(C1-6烷基)2O-、-CO2H、-SO3H、-SOC1-6烷基、-SO2C1-6烷基、-C(=O)H、-C(=O)C1-6烷基、=O、-N(C1-6烷基)2、-C(=O)NH2、-C1-6烷基、-C3-6環烷基、-C3-6雜環烷基、-ZuC1-6烷基或-Zu-C3-6環烷基，其中Zu係如上所定義。
在另一實施例中，該(等)可選取代基獨立地為鹵素、三鹵代甲基、-NO2、-CN、-CO2H、-C(=O)C1-6烷基、=O、-N(C1-6烷基)2、-C(=O)NH2、-C1-6烷基、-C3-6環烷基、-C3-6雜環烷基、-ZuC1-6烷基或-Zu-C3-6環烷基，其中Zu係如上所定義。
在另一實施例中，該(等)可選取代基獨立地為鹵素、-NO2、-CN、-CO2H、=O、-N(C1-6烷基)2、-C1-6烷基、-C3-6環烷基或-C3-6雜環烷基。
在另一實施例中，該(等)可選取代基獨立地為鹵素、-OH、NH2、-NH(C1-6烷基)、-N(C1-6烷基)2、-C1-6烷基、-C3-6環烷基或-C3-6雜環烷基。
如文中所用，術語「本發明之聚合物」及「式I聚合物」等包括 其醫藥上可接受的衍生物及其多晶型物、異構體及同位素標記的變式。
術語「醫藥上可接受的衍生物」包括式I化合物之任何醫藥上可接受的鹽、溶劑化物、水合物或前藥。在一個實施例中，該等醫藥上可接受的衍生物為式I化合物之醫藥上可接受的鹽、溶劑化物或水合物。
術語「醫藥上可接受的鹽」包括由包括無機或有機酸及鹼之醫藥上可接受的無毒酸或鹼製備的鹽。
包含鹼性基團(例如胺基)之式I化合物可與酸形成醫藥上可接受的鹽。在一個實施例中，式I化合物之醫藥上可接受的酸加成鹽包括但不限於無機酸諸如氫鹵酸(例如氫氯酸、氫溴酸及氫碘酸)、硫酸、硝酸及磷酸之彼等。在一個實施例中，式I化合物之醫藥上可接受的酸加成鹽包括但不限於有機酸諸如脂族、芳族、羧酸及磺酸類別的有機酸的彼等，其實例包括：脂族單羧酸諸如甲酸、乙酸、丙酸或丁酸；脂族羥基酸諸如乳酸、檸檬酸、酒石酸或蘋果酸；二羧酸諸如馬來酸或琥珀酸；芳族羧酸諸如苯甲酸、對氯苯甲酸、苯基乙酸、二苯基乙酸或三苯基乙酸；芳族羥基酸諸如鄰羥基苯甲酸、對羥基苯甲酸、1-羥基萘-2-羧酸或3-羥基萘-2-羧酸；及磺酸諸如甲磺酸、乙磺酸或苯磺酸。式I化合物之其他醫藥上可接受的酸加成鹽包括但不限於羥基乙酸、葡糖醛酸、糠酸、麩胺酸、鄰胺基苯甲酸、水楊酸、扁桃酸、恩貝(雙羥萘酸)酸、泛酸、硬脂酸、磺胺酸、海藻酸及半乳糖醛酸之彼等。其中式I化合物包括複數個鹼性基團，複數個中心可經質子化以提供複數種鹽，例如式I化合物之二或三鹽。例如，文中所述之式I化合物的氫鹵酸鹽可為單氫鹵化物、二氫鹵化物或三氫鹵化物等。在一個實施例中，該等鹽包括但不限於彼等來自上文所揭示之酸之任何一者的加成者。在式I化合物的一個實施例中，兩個鹼性基 團形成酸加成鹽。在另一實施例中，兩種加成鹽反離子為相同的種類，例如二氫氯化物、二氫硫化物等。醫藥上可接受的鹽一般為氫氯化物鹽，諸如二氫氯化物鹽。
包含酸性基團(例如羧基)之式I化合物可與鹼形成醫藥上可接受的鹽。在一個實施例中，式I化合物之醫藥上可接受的鹼性鹽包括但不限於金屬鹽諸如鹼金屬或鹼土金屬鹽(例如鈉、鉀、鎂或鈣鹽)及鋅或鋁鹽。在一個實施例中，式I化合物之醫藥上可接受的鹼性鹽包括但不限於與氨水或醫藥上可接受的有機胺或雜環鹼諸如乙醇胺(例如二乙醇胺)、苯甲基胺、N-甲基-葡糖胺、胺基酸(例如離胺酸)或吡啶形成的鹽。
亦可形成酸及鹼的半鹽，例如半硫酸鹽。
可藉由技術中熟知的方法製備式I化合物之醫藥上可接受的鹽。
對於醫藥上可接受的載劑的綜述，參見Stahl及Wermuth,Handbook of Pharmaceutical Salts：Properties,Selection and Use(Wiley-VCH,Weinheim,Germany,2002)。
本發明之化合物可以非溶劑化物及溶劑化物形式存在。術語「溶劑化物」包括含有本發明之化合物與一或多種醫藥上可接受的溶劑分子諸如水或C1-6醇(例如乙醇)的分子錯合物。術語「水合物」意指溶劑為水的「溶劑化物」。
本發明之化合物可以非晶型至晶型形式的固態存在。本發明包括所有該等固體形式。
本發明之化合物可以一或多種幾何、光學、對映體、非對映體及互變異構形式存在，包括但不限於順式及反式形式、E-及Z-形式、R-、S-及內消旋體形式、酮-及烯醇-形式。本發明包括所有該等異構體形式。該等異構體形式可呈異構體純淨或富含的形式以及呈異構體之混合物(例如，外消旋或非對映體混合物)。
本發明包括醫藥上可接受的經同位素標記的式I化合物，其中一或多個原子係藉由具有相同原子序數、但原子質量或質量數不同於在自然中常見的原子質量或質量數的原子替代。
適合併入本發明之化合物中的同位素的實例包括如下之同位素：氫，諸如2H及3H；碳，諸如11C、13C及14C；氯，諸如36Cl；氟，諸如18F；碘，諸如123I及125I；氮，諸如13N及15N；氧，諸如15O、17O及18O；磷，諸如32P；及硫，諸如35S。某些經同位素標記的式I化合物(例如彼等併入放射性同位素者)可用於藥物及或底物組織分佈研究。鑒於併入便利及偵測之現有的方式，放射性同位素3H及14C尤其可用於該目的。
經正電子發射之同位素，諸如11C、18F、15O及13N之替代可用於正電子發射斷層攝影術(PET)研究以檢驗底物受體佔有率。
可藉由熟習此項技術者知曉的常規技術或藉由類似於文中所述之彼等的方法，利用適宜的經同位素標記的試劑替代之前使用的未經標記的試劑，一般可製備經同位素標記的式I化合物。
應理解，文中所述之聚合物可經任何數目的取代基或功能官能基取代。不論術語之前是否有「視需要的」，文中所用之術語經取代的及取代基係指如熟習此項技術者所理解之將一種官能團變成另一種官能團的能力，限制條件為保留所有原子的價數。當在任何指定結構中之一個以上的位置可經多於一個的選自指定基團的取代基取代時，該取代基在每一位置中可相同或不同。該等取代基亦可進一步經取代(例如，芳基取代基上可具有另一取代基，諸如在一或多個位置經氟進一步取代的另一芳基)。
文中所用之術語硫羥基或氫硫基係指式-SH基團。
本發明進一步提供一種包括活性劑及式I聚合物的組合物。該組合物可包括包含該活性劑及該聚合物之奈米顆粒及或微米顆粒。該組 合物可包括兩或更多種如式I中所定義之聚合物。例如，該組合物可包括其中R1及R2均為CysLysLysLys之式I聚合物及R1及R2均為CysHisHisHis之式I聚合物。
該活性劑可為多核苷酸、蛋白質或小分子。該活性劑一般為多核苷酸。該多核苷酸可選自由DNA、RNA、siRNA及miRNA組成之群，較佳地選自由siRNA及miRNA組成之群。在一個實施例中，該多核苷酸可選自由DNA、RNA及siRNA組成之群。
多核苷酸一般包括至少三個核苷酸。較佳地，該多核苷酸較佳係20-30個核苷酸長度，更佳係20-25個核苷酸長度，例如22個核苷酸長度。
該多核苷酸可來源於天然的核苷酸(即，腺苷、胸腺嘧啶去氧核苷、鳥嘌呤核苷、胞啶、尿嘧啶核苷、次黃嘌呤核苷、黃嘌呤核苷、去氧腺苷、去氧胸腺嘧啶核苷、去氧鳥苷、脫氧肌苷及去氧胞苷)、核苷類似物(例如，2-胺基腺苷、2-硫胸苷、次黃嘌呤核苷、吡咯并-嘧啶、3-甲基腺苷、C5-丙炔基胞嘧啶核苷、C5-丙炔基尿嘧啶核苷、C5-溴尿嘧啶核苷、C5-氟尿嘧啶核苷、C5-碘尿嘧啶核苷、C5-甲基胞嘧啶核苷、7-去氮腺苷、7-去氮鳥苷、8-氧腺苷、8-氧鳥苷、O(6)-甲基烏嘌呤及2-硫胞嘧啶核苷)或其混合物。該等核苷酸可來源於化學改質的鹼基、生物改質的鹼基(例如，甲基化鹼基)、插入的鹼基、未經改質或改質的糖(例如，2'-氟核糖、核糖、2'-去氧核糖、阿拉伯糖及己糖)及/或未經改質或改質的磷酸酯基團(例如，硫代磷酸酯及5'-N-胺基亞磷酸酯鍵)。
如文中所用，術語「小分子」係指不論自然存在或人工產生的(例如，經由化學合成)具有相對低的分子量及非蛋白質、多肽或多核苷酸的有機化合物。小分子一般具有小於約1500g/mol的分子量。
以下進一步論述本發明之奈米顆粒。應理解，論述同樣適用於 微米顆粒。
奈米顆粒可包括多核苷酸及式I聚合物，其中該或各寡肽在pH 7下具有凈正電荷。帶正電的寡肽與帶負電的多核苷酸在奈米顆粒形成的處理期間相互作用及促進多核苷酸在奈米顆粒中之封裝。
奈米顆粒可包括式I或II聚合物，其中該或各寡肽在pH 7下具有凈負電荷，及在pH 7下具有凈正電荷的活性劑。帶正電的寡肽與帶負電的活性劑在奈米顆粒形成的處理期間相互作用及促進活性劑在奈米顆粒中之封裝。
奈米顆粒可視需要包括本發明之不同的聚合物的混合物。例如，奈米顆粒可包括(a)其中該或各寡肽在pH 7下具有凈正電荷的式I或式II聚合物；及(b)其中該或各寡肽在pH 7下具有凈負電荷的式I或式II聚合物。
因此，本發明提供具有可藉由改變以上聚合物(a)及(b)之比例而變化的凈表面電荷的奈米顆粒。(a)及(b)之比按重量計算可為1：99、5：95、10：90、25：75、50：50、75：25、90：10、95：5或99：1。
該等奈米顆粒適合藥物及多核苷酸封裝及表現改進的藥理性質。
併入一群經在pH 7具有凈負電荷之寡肽改質的聚合物可促進藉由奈米沉澱較短DNA及RNA序列的封裝。當與此技藝中已知的PBAEs用於奈米沉澱步驟中時，較短DNA及RNA序列比較長序列顯示較低的封裝效率及/或較低的絕對負載。本發明者已經發現其他多陰離子物質(諸如文中所述之帶負電聚合物)的添加有助於所得含有聚合物及多核苷酸之奈米顆粒在奈米沉澱處理期間的組裝。
此對具有約20至30個鹼基對長度且在體內循環期間不穩定的短多核苷酸(諸如siRNA及miRNA序列)之封裝尤其有用。因其較低的電 荷，短多核苷酸(諸如siRNA及miRNA)併入奈米顆粒在以前已存在困難。
本發明者已發現使用該或各寡肽在pH 7具有凈正電荷之式I或式II聚合物合併該或各寡肽在pH 7具有凈負電荷之式I或式II聚合物可以高封裝效率及高負載載入短多核苷酸(諸如siRNA或miRNA)。另外，使用上述兩類聚合物可預防短多核苷酸的降解及容許更有效的轉染。吾人認為帶正電的寡核苷酸「包圍」帶負電的多核苷酸，及帶負電的寡核苷酸「包圍」帶正電的多核苷酸以中和過量的電荷(本發明者稱為「斗篷效應(mantle effect)」)。
另外，經在pH 7具有凈負電荷之寡肽改質之聚合物的併入可促進奈米顆粒傳遞通過複雜身體障壁(諸如腸及肺黏膜)，因為在與該等障壁相互作用期間凈表面電荷變化可改變。
可以高活性劑含量及高封裝效率形成本發明之奈米顆粒。
在此，活性劑封裝效率係指併入奈米顆粒中的活性劑相對於製備含活性劑之奈米顆粒之方法中所用總活性劑的重量百分比。其一般高達及包括95%，更一般由70%至95%。
在此，活性劑包覆量係指載入活性劑之奈米顆粒中之活性劑的重量百分比。活性劑包覆量較佳至少2重量%，更佳至少5重量%，更佳至少10重量%及一般在2重量%至20重量%的範圍內，更佳5重量%至20重量%，更佳10重量%至20重量%。
當該組合物包括奈米顆粒時，較佳地，奈米顆粒構成組合物之約1重量%至約90重量%。更佳地，奈米顆粒構成組合物之約5重量%至約50重量%，更佳地，約10%至約30%。該組合物可進一步包括媒劑。該媒劑可為任何醫藥上可接受的技術中已知的稀釋劑或賦形劑。該媒劑一般在藥學上失活的。該媒劑較佳係極性液體。尤其較佳的媒劑包括水及包含鹽及/或緩衝劑之生理上可接受的水溶液，例如鹽水 或經磷酸鹽緩衝之鹽水。視需要地，該媒劑為生物流體。可藉由(例如)凍乾、蒸發或離心除去液體媒劑以供儲存或提供用於經肺或鼻投與的粉末、用於供輸注之懸浮液的粉末或經口投與之錠劑或膠囊。
該(等)活性劑可存在於奈米顆粒內或奈米顆粒的表面上。該(等)活性劑一般存在於奈米顆粒內。介於該(等)活性劑與奈米顆粒之間的相互作用一般為非共價的，例如，氫鍵鍵合、電子靜態相互作用或物理封裝。相互作用一般為電子靜態的。
奈米顆粒為生物可相容的及足以抵抗其使用的環境，足量的奈米顆粒在進入哺乳動物體內後基本上保持完整以到達所需目標及實現所需生理效果。文中所述之聚合物為生物可相容的及較佳而言生物可降解的。
文中之術語「生物可相容的」敘述物質可插入或注入活的個體中而不引起有害反應。例如，其不會由免疫系統引起無法充分控制的炎症或急性排斥。應認識到「生物可相容的」為相對的術語，及即使對於與活組織高度相容的物質可預期某些程度的免疫反應。一種用於評估物質的生物可相容的體外測試為將其曝露至細胞；生物可相容的物質在適中的濃度(例如，29μg/104細胞)下一般不產生顯著的細胞死亡(例如，>20%)。
文中之術語「生物可降解的」敘述聚合物在生理環境中可降解以形成可經細胞再次利用或處理的單體及/或其他非聚合物基團而無顯著的毒性效果。降解可為生物的，例如藉由酶活性或細胞機製，或可為化學的，一般為在生理條件下發生的化學方法。聚合物之降解可以不同的速率發生，約數天、數週、數月或數年的半衰期，此取決於所用聚合物或共聚物。較佳地，該等組分在體內不誘發炎症或其他副作用。在某些較佳的實施例中，未催化分解生物可降解的化合物所依賴的化學反應。
文中之術語「奈米顆粒」係指具有約1至約1000nm之直徑的固體顆粒。文中之術語「微米顆粒」係指具有約1μm至約100μm之直徑的固體顆粒。可藉由技術中已知的方法，較佳藉由動態光散射測定本發明之奈米顆粒的平均直徑。特定而言，本發明係關於為具有約1至約1000nm之直徑的固體顆粒的奈米顆粒，該直徑係根據標準測試法ISO 22412：2008(累差法A.1.3.2)，利用經過濾水適宜地稀釋之樣品及合適的儀器諸如來自Malvern Instruments(UK)之ZetasizerTM儀器，藉由在90°之散射角及在25℃之溫度下的動態光散射來分析。在一種顆粒據稱具有x nm的直徑的情形下，顆粒分佈一般為約該平均值，但至少50數量%(例如>60%、>70%、>80%、>90%或更多)的顆粒將具有在x±20%之範圍內的直徑。
較佳地，奈米顆粒之直徑係約10至約1000nm，更佳約5至約500nm，更佳約50至約400nm，更佳約50至約150nm。或者，奈米顆粒之直徑為約1至約100nm。在一個實施例中，奈米顆粒表現小於10%，較佳小於5%，較佳小於1%的凝聚度，及如藉由穿透式電子顯微鏡法測定，較佳地，奈米顆粒實質上不凝聚。
本發明進一步提供一種將試劑封裝在式I或式II聚合物的基質中以形成奈米顆粒的方法，該方法包括以下步驟：提供試劑；提供聚合物；及在適宜的條件下使該試劑及該聚合物接觸以形成奈米顆粒。特定而言，可使該試劑及該聚合物以適宜獲得所需比例之濃度混合於溶液中，激烈地混合且接著在約37℃的爐子中培養30分鐘。
本發明進一步提供一種合成式I聚合物的方法，其包括以下步驟：其中L3係如上所定義之式II化合物與其中L4係如上所定義之式L4H2的一級胺反應，從而產生如流程圖2所示之式III聚合物。
式II
式III化合物進一步與式IV化合物反應以形成式V化合物： 其中p及Ra在每次出現時獨立地選自以上定義之列表。在一些情形中，每次出現之p係相同及該等Ra基團係經選擇使得由硫鍵開始之Ra基團的順序在化合物之每一端相同，即，p及Ra係經選擇使得聚合物具有繞L4之二重對稱。
在以上步驟之替代中，式III化合物進一步與其中Ry係如上所定義之式H2NRy化合物反應，及分離式IV化合物及所得混合物以獲得式VI化合物： 其中Ra在每次出現時獨立地選自以上定義之列表及p係如上所定義。
應認識到，熟習此項技術者將知曉使寡肽附接至式III化合物的其他方法，技術者將意識到用於在式III之末端丙烯酸酯基團反應的適宜的親核試劑。
實例
物質
試劑及溶劑係獲自Sigma-Aldrich及Panreac及除非另有說明，否則按原樣使用。質體pmaxGFP(3486bp)係獲自Amaxa。細胞系係獲自ATCC(Manassas,VA)及維持於37℃、5% CO2氛圍、完全的DMEM中，該DMEM包含10%胎牛血清、100單位/ml青黴素、100ug/mL鏈黴素、0.1mM MEM非必需胺基酸(NEAA)、2mM L-麩胺醯胺及獲自 Gibco。
實例1：PBAE聚合物之合成
遵循文獻(例如Montserrat,N.等人，J.Biol.Chem.286,12417-12428(2011))中所述之兩步程序合成聚(β-胺基酯)。首先，藉由一級胺與二丙烯酸酯(以1：1.2莫耳比之胺：二丙烯酸酯)之加成反應合成經丙烯酸酯基封端的聚合物。最後，藉由利用不同種類的攜帶胺及氫硫基的官能基對所得經丙烯酸酯基封端的聚合物封端改質而獲得PBAE。藉由1H-NMR及FT-IR分析確認合成結構。在400MHz Varian(Varian NMR Instruments,Claredon Hills,IL)中記錄NMR光譜及甲醇-d4用作溶劑。利用具有KBr分光器之Nicolet Magna 560(Thermo Fisher Scientific,Waltham,MA)，在蒸發膜中利用甲醇作為溶劑而獲得IR光譜。在配有兩個GPC Ultrastyragel柱103及104Å(5μm混合的，300mm x 19mm,Waters Millipore Corporation,Milford,MA,USA)及THF作為流動相之Hewlett-Packard 1050 Series HPLC系統中進行分子量測定。藉由與聚苯乙烯標準之滯留時間比較計算分子量。
實例2：經丙烯酸酯基封端之中間產物之合成
將1,4-丁二醇二丙烯酸酯(8.96g,4.07×10-2mol)及5-胺基-1-戊醇(3.5g,3.39×10-2mol)混合在小瓶中。在90℃下攪拌混合物24h，及接著冷卻至室溫以形成略黃的黏性固體，經丙烯酸酯基封端之中間產物(命名為C32)。將中間產物C32儲存在4℃下，然後用於下一步中。
實例3(對照)：末端經一級胺改質的PBAE的合成
按Zugates,G.T.等人，Bioconjugate Chem. 18,1887-1896(2007)中 定義的方式製備末端經一級胺改質的PBAE。將中間產物C32(1g,0.5mmol)之THF(2ml)溶液與1,5-二胺基-2-甲基戊烷(0.24g,0.271ml,2mmol)之THF(8ml)溶液混合。在室溫下隔夜攪拌混合物，接著在乙醚(100ml)中沉澱及最後於真空中乾燥。
實例4(對照)：末端經一級胺改質的PBAE的另一合成
遵循其他處所述之程序(Zugates,G.T.等人，Bioconj.Chem. 181887-1896(2007),Yang,F.等人，Proc.Natl Acad.Sci.USA.1073317-3322(2010),Sunshine,J.C.Biomacromolecules 12 3592-3600(2011))合成末端經二胺改質的聚(β-胺基酯)B3。簡而言之，在磁性攪拌及90℃下，使5-胺基-1-戊醇(3.44g,33mmol)及1,4-丁二醇二丙烯酸酯(7.93g,40mmol)聚合24小時。將所得經丙烯酸酯基封端之聚合物C32(1g,0.4mmol)及2-甲基-1,5-戊二胺(0.23g,0.27mL,2mmol)溶解於四氫映喃並在室溫下隔夜攪拌。所得末端經二胺改質的聚合物B3係藉由在乙醚中沉澱而分離及於真空中乾燥。
IR(蒸發膜)：ν=1055,1089,1125,1196(C-O),1257,1463,1733(C=O),2079,2191,2253,2861,2936,3398(N-H,O-H)cm-1
1 H-NMR(400MHz,CD3OD,TMS)(ppm)：δ=4.11(t,CH2-CH 2-O),3.72(t),3,55(t,CH2-CH 2-OH),2.87(t,-NH-CH 2-CH2-C(=O)-),2.77 (t,CH2-CH 2-N-),2.60-2.51(br,-NH-CH 2-(CH2)2-CH(CH3)-NH-),2.46(br,>N-CH 2-(CH2)4-OH,>N-CH2-CH 2-C(=O)-O),1.87(br),1.73(br),1.60-1.41(br,-O-CH2-CH 2-CH 2-CH2-O,-CH 2-CH2-OH,-CH 2-CH2-NH2),1.35(br,-N-CH2-CH 2-CH 2-(CH2)2-OH),0.94(d,CH 3-CH<來自二胺)。
實例5：末端經寡肽改質的PBAE的合成
一般而言，末端經寡肽改質的PBAE係獲得如下：經丙烯酸酯基封端之聚合物C32或C32SS及經胺或氫硫基封端之寡肽(例如，HS-Cys-Arg-Arg-Arg(CR3)、H2N-Arg-Arg-Arg(R3)或HS-Cys-Glu-Glu-Glu(CE3)-其他寡肽係利用標準單字母規則藉由類似的縮寫表示)係以1：2莫耳比混合於DMSO中。在室溫下隔夜攪拌混合物及藉由在乙醚：丙酮(3：1)中沉澱獲得所得聚合物。
(a)以實例顯示用於獲得末端經三精胺酸改質的PBAE的下列合成程序：按以上實例1中所述之方式製備中間產物C32。將中間產物C32(0.15g,0.075mmol)之DMSO(2ml)溶液與寡肽(Cys-Arg-Arg-Arg(CR3；0.11g,0.15mmol)之DMSO(1mL)對應溶液以分別為1：2之適宜莫耳比混合。在室溫下隔夜攪拌混合物及然後在乙醚/丙酮(3：1)中沉澱。
IR(蒸發膜)：ν=721,801,834,951,1029,1133(C-O),1201,1421,1466,1542,1672(C=O，來自肽醯胺)，1731(C=O，來自酯)，2858,2941,3182,3343(N-H,O-H)cm-1
1 H-NMR(400MHz,CD3OD,TMS)(ppm)：δ=4.41-4.33(br,NH2-C(=O)-CH-NH-C(=O)-CH-NH-C(=O)-CH-NH-C(=O)-CH-CH2-,4.11(t,CH2-CH 2-O),3.55(t,CH2-CH 2-OH),3.22(br,NH2-C(=NH)-NH-CH 2-,OH-(CH2)4-CH 2-N-),3.04(t,CH2-CH 2-N-),2.82(dd,-CH 2-S-CH 2),2.48(br,-N-CH2-CH 2-C(=O)-O),1.90(m,NH2-C(=NH)-NH-(CH2)2-CH 2-CH-),1.73(br,-O-CH2-CH2-CH2-CH2-O),1.69(m,NH2-C(=NH)-NH-CH2-CH 2-CH2-),1.56(br,-CH 2-CH2-CH 2-CH2-OH),1.39(br,-N-(CH2)2-CH 2-(CH2)2-OH)。
(b)根據相同的方案製備末端經三離胺酸改質的寡肽(K3C-C32-CK3)及表徵如下：IR(蒸發膜)：ν=721,799,834,1040,1132,1179(C-O),1201,1397,1459,1541,1675(C=O，來自肽醯胺)，1732(C=O，來自酯)，2861,2940,3348(N-H,O-H)cm-1
1 H-NMR(400MHz,CD3OD,TMS)(ppm)：δ=4.38-4.29(br,NH2-(CH2)4-CH-),4.13(t,CH2-CH 2-O-),3.73(br,NH2-CH-CH2-S-),3.55(t,CH2-CH 2-OH),2.94(br,CH2-CH 2-N-,NH2-CH 2-(CH2)3-CH-),2.81(dd,-CH 2-S-CH 2),2.57(br,-N-CH2-CH 2-C(=O)-O),1.85(m,NH2-(CH2)3-CH 2-CH-),1.74(br,-O-CH2-CH2-CH2-CH2-O),1.68(m,NH2-CH2-CH 2-(CH2)2-CH-),1.54(br,-CH 2-CH2-CH 2-CH2-OH),1.37(br,-N-(CH2)2-CH 2-(CH2)2-OH)。
(c)根據相同的方案製備末端經三組胺酸改質的寡肽(H3C-C32-CH3)及表徵如下： IR(蒸發膜)：ν=720,799,832,1040,1132,1201,1335,1403,1467,1539,1674(C=O，來自肽醯胺)，1731(C=O，來自酯)，2865,2941,3336(N-H,O-H)cm-1
1 H-NMR(400MHz,CD3OD,TMS)(ppm)：δ=8.0-7.0(br-N(=CH)-NH-C(=CH)-)4.61-4.36(br,-CH2-CH-),4.16(t,CH2-CH 2-O-),3.55(t,CH2-CH 2-OH),3.18(t,CH2-CH 2-N-,3.06(dd,-CH 2-CH-),2.88(br,OH-(CH2)4-CH 2-N-),2.82(dd,-CH 2-S-CH 2-),2.72(br,-N-CH2-CH 2-C(=O)-O),1.75(br,-O-CH2-CH2-CH2-CH2-O),1.65(m,NH2-CH2-CH 2-(CH2)2-CH-),1.58(br,-CH 2-CH2-CH 2-CH2-OH),1.40(br,-N-(CH2)2-CH 2-(CH2)2-OH)。
實例6：具有不對稱末端改質之PBAE的合成
一般而言，經不對稱寡肽改質的PBAE係獲得如下：經丙烯酸酯基封端之聚合物C32(或C32SS)及經胺或氫硫基封端之寡肽(例如，CR3、R3或CE3)係以1：1莫耳比混合於DMSO中。在室溫下隔夜攪拌混合物。添加等莫耳量的經二級胺或氫硫基封端之寡肽，或一級胺及在室溫下隔夜攪拌混合物。藉由在乙醚/丙酮(3：1)中沉澱而獲得所得不對稱PBAE聚合物。以實例顯示用於獲得不對稱的末端經改質的B3-C32-CR3 PBAE的下列合成程序：將中間產物C32(0.15g,0.075mmol)之DMSO(2mL)溶液與寡肽Cys-Arg-Arg-Arg(CR3；0.055g,0.075mmol)之DMSO(1ml)對應溶液混合並在室溫下隔夜攪拌。隨後，在室溫下歷時4h，將2-甲基-1,5-戊二胺(0.017g,0.02ml,0.15mmol)之DMSO添加至混合物中。藉由在乙醚/丙酮(3：1)中隔夜沉澱獲得不對稱的末端經改質的聚合物B3-C32-CR3與B3-C32-B3及R3C-C32-CR3的混合物。無需進一步純化即可使用該混合物或藉由標準方法可自混合物分離不對稱的末端經改質的聚合物B3-C32-CR3。
實例7：化合物庫
藉由將一級胺添加至二丙烯酸酯，然後藉由末端改質合成不同的末端經寡肽改質的PBAE的庫。根據式I，合成表1所示之末端經寡肽改質的PBAE。
實例8：聚合物-DNA錯合物之形成及表徵
在DMSO(100mg/ml)中製備所有聚合物之儲備液。以適宜的濃度稀釋(25mM乙酸鹽緩沖劑，pH 5.0)該等聚合物溶液以獲得所需比例的聚合物-DNA(w/w)。然後將100μl經稀釋之聚合物添加至100μl質體DNA(60μg/mL，含於乙酸鹽緩沖劑中，25mM，pH 5.0)，利用渦流激烈地混合數秒，接著在37℃爐子中培養30min。在經磷酸鹽緩衝之鹽水中稀釋所得奈米顆粒以供奈米顆粒表徵。利用動態光散射(Zetasizer nano zs90,Malvern Instruments)，表徵聚合物-DNA錯合物之大小及ζ電位。結果顯示於圖1中。
亦藉由瓊脂糖凝膠電泳表徵奈米顆粒。為評估質體阻滯，將不同w/w比之含0.48μg pGFP的聚合物-DNA錯合物添加至瓊脂糖凝膠孔(0.8%，包含1μg/mL溴化乙錠)。在60V下操作樣品45min(Apelex PS 305,France)以解析質體阻滯及藉由UV照射而可視化。結果顯示於圖2中。
實例9：質子海綿效應
質子海綿效應為一種已經表現可促進內小體逃逸的現象及藉由具有高緩衝性能的聚合物調控，產生高轉染效率(Varkouhi,A.K.等人，J.Control.Rel.151 220-228(2011).)。一般而言，其結構中具有三級胺之聚合物在介於5.0及7.5之間的內小體pH範圍下表現緩衝效果，此引起滲透壓的增加，從而導致內小體破壞(Behr,J.Chimia 2 34-36(1997))。根據質子海綿效應，新合成之聚(β-胺基酯)的緩衝性能係藉由聚合物溶液的酸滴定測定(圖2)。
藉由酸鹼滴定測定聚合物之緩衝性能。簡而言之，聚合物以1mg/mL之最終濃度溶解於氯化鈉水溶液(150mM)。利用氫氧化鈉將所得聚合物溶液調整至pH 10。藉由逐步添加10μL氫氯酸(0.1M)等分試樣確定滴定曲線。在每次滴加之後利用pH計(Crison Basic 20+,Crison Instruments)測量pH直到達到pH 2。作為對照，滴定不含聚合物之溶液。結果顯示於圖3中。
首先，測定聚(β-胺基酯)B3之緩衝效果，表現下降至pH 5.8的適宜緩衝性能。在經組胺酸封端之聚(β-胺基酯)中觀察到最高的緩衝性能，其證明在介於7.5與5.3之間之pH範圍的高緩衝。經離胺酸改質之聚(β-胺基酯)呈現適宜的緩衝性能，直到pH 5.9。相比之下，經精胺酸寡肽封端之聚(β-胺基酯)在介於7.4與6.4之間之範圍內僅表現有限的緩衝性能。由於所有聚合物來自相同的經丙烯酸酯基封端之預聚物C32，觀察之額外的緩衝性能來自富含胺的封端。
實例10：轉染效率
藉由評定將編碼綠色螢光蛋白質之質體(pGFP)傳遞至細胞的效率來比較本發明之聚合物及已知的聚合物的轉染效率。
利用質體pGFP之細胞轉染：利用pGFP質體在HaCaT、hnDf、cos-7、A549及HeLa細胞中進行細胞轉染。該等細胞系係獲自ATCC(Manassas,VA)及保持在完全DMEM(包含10%胎牛血清、100單位/ml青黴素、100μg/mL鏈黴素、0.1mM MEM非必需胺基酸(NEAA)、2mM L-麩胺醯胺)、在37℃、5% CO2氛圍中。
以10,000細胞/孔將細胞接種在96孔板上及隔夜培養至約80-90%匯合度，然後進行轉染實驗。按上述方式，利用pGFP質體，以50：1之聚合物：質體比製備聚合物-DNA錯合物。在無血清培養基中稀釋多聚物(Polyplexes)及以0.6μg pGFP/孔的最終質體濃度添加至細胞。在37℃及5% CO2氛圍培養細胞達3h。接著，利用PBS洗滌細胞一次及添加完全DMEM。48h之後，收穫細胞及藉由流式細胞儀分析GFP表現。將GFP表現與陰性對照(未經處理的細胞)及GeneJuice®(Merck KGaA,Germany)及作為陽性對照的B3-C32-B3進行比較。結果顯示於圖4a-c中，其中R/H、K/H及R/K代表R3C-C32-CR3、K3C-C32-CK3或 H3C-C32-CH3 PBAE之1：1混合物(w/w)。
實例11：細胞毒性
使用MTS分析(CellTiter 96® AQueous One Solution Cell Proliferation Assay,Promega Corporation,USA)評估利用本申請案中所述之聚合物轉染的cos-7細胞的存活率。按照製造商之指示，在轉染後48h，利用MTS分析評定細胞存活率。簡而言之，細胞係藉由類似於實例5中之彼等的方法經pGFP轉染。在轉染後48h，除去培養基，利用PBS洗滌細胞及添加補充MTS(20% v/v)的完全培養基。在37℃下培養細胞及利用微盤讀取器，在490nm下測量吸光率。細胞存活率表達為與未經處理之細胞比較的相對百分比。結果顯示於圖5中，其中R/H、K/H及R/K代表R3C-C32-CR3、K3C-C32-CK3或H3C-C32-CH3 PBAE之1：1混合物(w/w)。
實例12：基因-默化分析
在GFP受體穩定的細胞系中利用GFP-特異性siRNA評定本發明之聚合物的siRNA傳遞效率。
聚合物-siRNA錯合物之製備：在DMSO(100mg/ml)中製備聚合物的儲備液。以適宜的濃度稀釋(25mM，乙酸鹽緩沖劑，pH 5.0)該等聚合物溶液以獲得所需比例的聚合物-siRNA(w/w)。然後將100μl經適當稀釋之聚合物添加至100μl GFP-特異性siRNA(10μg/mL，於乙酸鹽緩衝劑中，25mM，pH 5.0；ThermoScientific Dharmacon GFP Duplex I)中，利用渦流激烈地混合數秒，接著在37℃下培養30min。在經磷酸鹽緩衝之鹽水中稀釋所得錯合物以供奈米顆粒表徵。利用動態光散射(Zetasizer nano zs90,Malvern Instruments)，表徵聚合物-siRNA錯合物的大小及ζ電位。結果顯示於圖6中，其中K/H及K/R代表R3C-C32-CR3、K3C-C32-CK3或H3C-C32-CH3 PBAE之60：40混合物(w/w)。K/E及K/D代表K3C-C32-CK3及D3C-C32-CD3或E3C-C32-CE3 PBAE之70：30混合物(w/w)。
利用GFP-特異性siRNA之細胞轉染：在MDA-MB-231/GFP細胞(Cell Biolabs Inc.)中利用GFP-特異性siRNA進行細胞轉染。該等細胞保持在完全DMEM(包含10%胎牛血清、100單位/ml青黴素、100μg/mL鏈黴素)、在37℃、5% CO2氛圍中。
簡而言之，以10,000細胞/孔將細胞接種在96孔板上及隔夜培養至約80-90%匯合度，然後進行轉染實驗。按上述方式，利用GFP-特異性siRNA，以200：1之聚合物：siRNA比製備聚合物-siRNA錯合物。在無血清培養基中稀釋多聚物及以50nM siRNA/孔的最終質體濃度添加至細胞。在37℃、5% CO2氛圍培養細胞達3h。接著，利用PBS洗滌細胞一次及添加完全DMEM。48h之後，收穫細胞及藉由流式細胞儀分析GFP默化。將GFP表現默化與陰性對照(未經處理的細胞)及INTERFERinTM(PolyPlus TransfectionTM)及作為陽性對照之B3進行比較。結果顯示於圖7中，其中R/H、K/H及R/K代表R3C-C32-CR3、K3C-C32-CK3或H3C-C32-CH3 PBAE之1：1混合物(w/w)，及SS(R/H)、SS(K/H)及SS(R/K)代表R3C-C32SS-CR3、K3C-C32SS-CK3或H3C-C32SS-CH3 PBAE之1：1混合物(w/w)。
實例13：利用末端經麩胺酸及離胺酸改質之PBAE封裝牛胰島素
利用牛胰島素(Sigma Aldrich)評定本發明之聚合物的封裝效率。簡而言之，將末端經麩胺酸改質之PBAE E3C-C32-CE3(16.7μL，60mg/mL)添加至牛胰島素溶液(1mL，0.01mg/mL，在HEPES緩衝劑中，100mM及pH 7.2)，然後添加末端經離胺酸改質的PBAE K3C-C32-CK3(10μL，100mg/mL)以實現200：1的最終聚合物：蛋白質比。在室溫下培養混合物達30min。利用Centricon裝置(10KDa臨界值，Merck Millipore)離心所得奈米顆粒以自未經封裝之胰島素分離含胰島素之奈米顆粒。藉由利用雙辛可寧酸分析(BCA蛋白質分析試劑， ThermoScientific)測定未經封裝之胰島素並與胰島素源溶液比較計算封裝程度。結果顯示於圖8中，其中NP1及NP2為獨立的重複測量。
圖1顯示利用50：1比(w/w)之不同的末端經寡肽改質的PBAE及pGFP質體製備的聚合物-DNA錯合物的流體動力直徑及ζ電位。
圖2顯示末端經寡肽改質的PBAE及與DNA錯合之參考聚合物的瓊脂糖凝膠電泳分析。
圖3顯示末端經寡肽改質的PBAE及參考聚合物的緩衝性能。
圖4顯示在利用不同的末端經寡肽改質的PBAE及參考聚合物轉染的(a)cos-7、(b)hnDf及(c)HaCaT細胞中的GFP表現的流式細胞儀分析。
圖5顯示利用不同的末端經寡肽改質的PBAE轉染的cos-7細胞的存活率。
圖6顯示利用200：1比(w/w)之不同的末端經寡肽改質的PBAE及GFP-特異性siRNA製備的聚合物-siRNA錯合物的流體動力直徑及ζ電位。
圖7顯示在利用不同的末端經寡肽改質的PBAE以GFP-特異性siRNA轉染的MDA-MB-231/GFP細胞中的GFP表現默化的流式細胞儀分析。
圖8顯示利用200：1(w/w)之最終聚合物：蛋白質比的麩胺酸及末端經離胺酸改質的PBAE的牛胰島素的封裝程度。
藉由以下實例進一步說明本發明。應理解，實例僅用於說明的目的及無意限制上述本發明。在不背離本發明範圍下可作出細節的修改。

Claims (25)

  1. 一種式I聚合物， 其中各L1及L2獨立地選自由如下組成之群： 、O、S、NRx及鍵；其中Rx獨立地選自由如下組成之群：氫、鹵素、烷基、環烷基、烯基、環烯基、雜烷基、雜環烷基、醯基、芳基或雜芳基；L3獨立地選自由如下組成之群：伸烷基、伸烯基、伸雜烷基、伸雜烯基、伸芳基或伸雜芳基； L4選自由如下組成之群：及；L5獨立地選自由如下組成之群：伸烷基、伸烯基、伸雜烷基、伸雜烯基、伸芳基或伸雜芳基；R1及R2獨立地選自寡肽及Ry；其中R1及R2中之至少一者為寡肽；且其中Ry選自由如下組成之群：氫、鹵素、烷基、環烷基、烯基、環烯基、雜烷基、雜環烷基、醯基、芳基或雜芳基；各R3獨立地選自由如下組成之群：氫、鹵素、烷基、環烷基、烯基、環烯基、雜烷基、雜環烷基、醯基、芳基或雜芳 基；及n為5至10,000之整數；或其醫藥上可接受的鹽。
  2. 如請求項1之聚合物，其中該或各寡肽包括3至20個胺基酸殘基。
  3. 如請求項1或2之聚合物，其中該或各寡肽在pH 7具有凈正電荷。
  4. 如請求項3之聚合物，其中該或各寡肽包括選自由離胺酸、精胺酸及組胺酸組成之群的胺基酸殘基。
  5. 如請求項1或2之聚合物，其中該或各寡肽為式VII化合物： 其中p為2至19之整數且其中Ra在每次出現時選自由如下組成之群：H2NC(=NH)-NH(CH2)3-、H2N(CH2)4-或(1H-咪唑-4-基)-CH2-。
  6. 如請求項1之聚合物，其中該或各寡肽在pH7具有凈負電荷。
  7. 如請求項6之聚合物，其中該或各寡肽為式VII化合物： 其中p為2至19之整數且其中Ra在每次出現時選自由如下組成之群：HO2C(CH2)2-或HO2C-CH2-。
  8. 如請求項1、2、6或7之聚合物，其中R1及R2均為寡肽。
  9. 如請求項8之聚合物，其中R1及R2為不同的寡肽。
  10. 如請求項1、2、6或7之聚合物，其中R1及R2中之一者為寡肽及R1及R2中之一者為Ry。
  11. 如請求項1、2、6或7之聚合物，其中n為1至20。
  12. 如請求項1、2、6或7之聚合物，其中Ry係選自由氫、-(CH2)mNH2、-(CH2)mNHMe、-(CH2)mOH、-(CH2)mCH3、-(CH2)2(OCH2CH2)mNH2、-(CH2)2(OCH2CH2)mOH或-(CH2)2(OCH2CH2)mCH3組成之群，其中m為1至20的整數。
  13. 如請求項1、2、6或7之聚合物，其中各L3獨立地選自由-C1-10伸烷基-(S-S)q-C1-10伸烷基-組成之群，其中q為0或1。
  14. 如請求項1、2、6或7之聚合物，其中各R3獨立地選自由氫、C1-6烷基、C1-6烯基、C1-6炔基、C1-6羥基烷基、羥基、C1-6烷氧基、鹵素、芳基、雜環基、雜芳基、氰基、-O2C-C1-6烷基、胺基甲醯基、-CO2H、-CO2-C1-6烷基、C1-6烷基硫醚、氫硫基(thiol)或脲基組成之群。
  15. 一種組合物，其包括活性劑及如請求項1至14中任一項之聚合物。
  16. 如請求項15之組合物，其中該活性劑為多核苷酸。
  17. 如請求項15之組合物，其中該多核苷酸為siRNA或miRNA。
  18. 如請求項15之組合物，其中該多核苷酸為20-30個核苷酸長度。
  19. 如請求項16或17之組合物，其中該組合物包括含多核苷酸及聚合物的奈米顆粒。
  20. 如請求項15至18中任一項之組合物，其中該聚合物包括如請求 項3之聚合物及如請求項6之聚合物。
  21. 一種封裝藥劑於如請求項1至14中任一項之聚合物之基質中以形成奈米顆粒的方法，該方法包括以下步驟：提供藥劑；提供聚合物；及使該藥劑及該聚合物在適宜條件下接觸以形成奈米顆粒。
  22. 如請求項21之方法，其中該藥劑為選自DNA、RNA、siRNA及miRNA的多核苷酸、小分子或蛋白質。
  23. 如請求項21或22之方法，其中該接觸步驟包括(a)噴霧乾燥該藥劑及該聚合物之混合物，(b)雙重乳液溶劑蒸發技術或(c)相轉換技術。
  24. 一種如請求項1、2、6或7之聚合物，其用於醫藥中。
  25. 一種如請求項15至18中任一項之組合物，其用於醫藥中。
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