BR112015021709B1 - Poli(beta-amino ésteres) modificados para administração de fármacos e nanopartícula compreendendo os mesmos, uma composição compreendendo os mesmos, método de encapsulamento de um agente em uma matriz de polímeros para formar nanopartículas, e uso dos poli(beta-amino ésteres) - Google Patents

Poli(beta-amino ésteres) modificados para administração de fármacos e nanopartícula compreendendo os mesmos, uma composição compreendendo os mesmos, método de encapsulamento de um agente em uma matriz de polímeros para formar nanopartículas, e uso dos poli(beta-amino ésteres) Download PDF

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Nathaly SEGOVIA RAMOS
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Abstract

POLI (BETA-AMINO ÉSTER) ES MODIFICADOS PARA ADMINISTRAÇÃO DE FÁRMACOS Descreve-se polímeros que são poli (beta-amino éster) es (PBAEs) modificados com pelo menos um oligopeptídeo. Os polímeros podem ser usados em qualquer campo onde os polímeros foram verificados como úteis, incluindo nos campos da medicina, particularmente na administração do fármaco. Os polímeros são particularmente úteis na administração de um polinucleotídeo, tal como DNA, RNA e siRNA, uma pequena molécula ou uma proteína. Também são descritas composições que compreendem os referidos polímeros e um agente ativo, métodos de encapsulação de um agente em uma matriz dos referidos polímeros, e os referidos polímeros e composições para utilização em medicina.

Description

[0001] A invenção relaciona-se com polímeros adequados para utilização no fornecimento de agentes ativos. A invenção refere-se também a nanoparticulas que compreendem estes polímeros e métodos para a sua produção.
[0002] A falta de vetores seguros e eficientes para administrar polinucleotídeos, tais como DNA e RNA, permanece a principal desvantagem para o sucesso da terapia gênica (Luo, D. & Saltzman, WM Synthetic DNA delivery systems. Nature Biotech. 18, 33-37 (2000); Kamimura K. et al, Advances in Gene Delivery Systems. Pharmaceut. Med. 25, 293-306 (2011); Miele E. et al, Nanoparticle-based delivery of small interfering RNA: challenges for cancer therapy. Int. J. Nanomedicine 7, 3637-3657 (2012)). A maioria dos protocolos de administração de polinucleotídeo empregam vetores virais, que são sistemas de entrega altamente eficientes. No entanto, os vetores virais têm certas desvantagens, incluindo o risco de segurança, capacidade limitada para transportar polinucleotídeos e alto custo de produção em larga escala. Os vetores não virais oferecem vantagens potenciais, incluindo elevada capacidade de embalagem, facilidade de produção, a baixa toxicidade e imunogenicidade, mas são menos eficientes do que os vetores virais (Mintzer, MA & Simanek, EE Nonviral vetors for gene delivery. Chem. Rev. 109, 259-302 (2009)).
[0003] Os poli (β-amino éster)es biodegradáveis (PBAEs) foram descritos como vetores de administração de polinucleotídeos não virais potenciais capazes de condensar ambos DNA e RNA em partículas nanométricas discretas (verde, JJ et al. Acc. Chem Res. 41, 749-759 (2008)). A modificação química nos terminais de PBAEs com aminas primárias (ver Esquema 1) tem sido demonstrada para produzir eficácia de transfecção mais elevada do que os agentes de transfecção comerciais, tais como Lipofectamina 2000, Fugene e polietilenimina (PEI) (Zugates, GT et al. Bioconjugate Chem. 18, 1887-1896 (2007); Green, J.J. et al. Nano letters 8, 3126-3130 (2008); WO02/31025A2).
Figure img0001
[0004] Existe uma necessidade contínua de polímeros biocompatíveis, não-tóxicos, biodegradáveis melhorados que possam ser usados para transfectar de forma eficiente polinucleotídeos e que podem ser preparados economicamente. Tais polímeros seriam úteis na embalagem e entrega de DNA e RNA, em terapia gênica e para o empacotamento e entrega de outros agentes de diagnóstico, terapêuticos e profilácticos.
[0005] Em particular, há uma necessidade de polímeros que podem ser usados para transfectar de forma eficiente polinucleotídeos curtos, em particular siRNA e microRNA (miRNA), que têm fraca estabilidade em circulação. Os vetores de administração de polinucleotídeo polimérico existentes não podem encapsular siRNA e miRNA com carga elevada devido ao comprimento relativamente curto de uma destas sequências. Além disso, muitos vetores de administração poliméricos existentes para siRNA e miRNA são citotóxicos.
[0006] A presente invenção proporciona novos PBAEs com finais modificados úteis numa variedade de aplicações médicas, incluindo a administração de fármacos, particularmente na administração dos polinucleotídeos; a engenharia de tecidos e biomateriais. A presente invenção é particularmente dirigida para aplicações médicas de PBAEs. O invento também fornece complexos dos polímeros com finais modificados da invenção com polinucleotídeos, dispositivos de libertação de fármacos (por exemplo, micropartículas, nanopartículas), incluindo os polímeros da invenção, métodos de preparação de polímeros com finais modificados, e métodos de utilização dos polímeros com finais modificados da invenção.
[0007] A natureza destes sistemas de poliéster resulta em um perfil biocompatível atraente devido à sua alta biodegradabilidade e a toxicidade reduzida. Portanto, estes polímeros têm aplicações como vetores de administração de polinucleotídeos não virais no tratamento de muitas doenças, tais como câncer, doenças monogenéticos, doenças vasculares e doenças infecciosas. Outra aplicação destes vetores de administração de polinucleotídeos está na pesquisa in vitro como ferramenta para investigar a função do gene ou regulação dentro de um contexto celular e fisiológico.
[0008] Em um primeiro aspecto, a invenção proporciona polímeros de Fórmula I:
Figure img0002
em que L1 e L2 são independentemente selecionados a partir do grupo que consiste de:
Figure img0003
, O, S, NRX e uma ligação; em que RX é selecionado independentemente a partir do grupo que consiste em hidrogênio, halogênio, alquil, cicloalquil, alquenil, cicloalquenil, heteroalquil, heterocicloalquil, acil, aril ou heteroaril; L3 é selecionado independentemente a partir do grupo que consiste em alquileno, alquenileno, heteroalquileno, heteroalquenileno, arileno ou heteroarileno; L4 é selecionado do grupo consistindo de
Figure img0004
L5 é selecionado independentemente a partir do grupo que consiste em alquileno, alquenileno, heteroalquileno, heteroalquenileno, arileno ou heteroarileno; R1 e R2 são independentemente selecionados de um oligopeptídeo e Ry; em que pelo menos um de R1 e R2 é um oligopeptídeo; e em que RY é é selecionado a partir do grupo que consiste em hidrogênio, halogênio, alquil, cicloalquil, alquenil, cicloalquenil, heteroalquil, heterocicloalquil, acil, aril ou heteroaril; cada R3 é selecionado independentemente dentre o grupo que consiste em hidrogênio, halogênio, alquil, cicloalquil, alquenil, cicloalquenil, heteroalquil, heterocicloalquil, acil, aril ou heteroaril; e n é um número inteiro de 5 a 10.000; ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo.
[0009] Em um segundo aspecto, a invenção proporciona polímeros de Fórmula I, em que L1 e L2 são independentemente selecionados a partir do grupo que consiste de:
Figure img0005
, O, S, NRx e uma ligação; em que NRx é selecionado independentemente a partir do grupo que consiste em hidrogênio, halogênio, alquil, cicloalquil, alquenil, cicloalquenil, heteroalquil, heterocicloalquil, acil, aril ou heteroaril; pelo menos uma ocorrência de L3 é
Figure img0006
em que T1 é
Figure img0007
selecionado a partir de H, alquil ou
Figure img0008
em que LT é independentemente selecionado a partir do grupo consistindo de:
Figure img0009
, O, S, NRx e uma ligação; em que NRx é selecionado independentemente a partir do grupo que consiste em hidrogênio, halogênio, alquil, cicloalquil, alquenil, cicloalquenil, heteroalquil, heterocicloalquil, acil, aril ou heteroaril; os restantes L3 restantes são selecionados, independentemente, em cada ocorrência, do grupo que consiste em alquileno, alquenileno, heteroalquileno, heteroalquenileno, arileno ou heteroarileno, em que L4 é selecionado do grupo consistindo de
Figure img0010
L5 é selecionado independentemente a partir do grupo que consiste em alquileno, alquenileno, heteroalquileno, heteroalquenileno, arileno ou heteroarileno; R1, R2 e RT são selecionados independentemente de um oligopeptídeo e Ry; em que pelo menos um de R1, R2 e RT é um oligopeptídeo; e em que RY é selecionado a partir do grupo que consiste em hidrogênio, halogênio, alquil, cicloalquil, alquenil, cicloalquenil, heteroalquil, heterocicloalquil, acil, aril ou heteroaril; cada R3 é selecionado independentemente dentre o grupo que consiste em hidrogênio, halogênio, alquil, cicloalquil, alquenil, cicloalquenil, heteroalquil, heterocicloalquil, acil, aril ou heteroaril; e n é um número inteiro de 5 a 10.000; ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo.
[0010] A presente invenção proporciona assim PBAEs de final modificado com pelo menos um oligopeptídeo. Estes PBAEs atuam como agentes de condensação superiores para polinucleotídeos e/ou como ligantes de direcionamento para aumentar a absorção celular e a eficiência da transfecção. Estes polímeros têm grupos biodegradáveis capazes de melhorar o fornecimento de polinucleotídeos para células e têm mostrado alta eficácia de transfecção e reduzida citotoxicidade in vitro em comparação com PBAEs conhecidos e agentes de transfecção comerciais.
[0011] Os polímeros de fórmula I podem ser preparados através da reação de monômeros de diacrilato de Fórmula II com aminas substituídas de fórmula L4H2 para formar um intermediário terminado de acrilato, Fórmula III.
Figure img0011
[0012] Grupos R1L1 e R2L2 podem, em seguida, serem adicionados por meio de reação com um grupo acrilato terminal para formar um polímero de Fórmula I.
Figure img0012
[0013] Em polímeros de acordo com a presente invenção, cada L1 e L 2 (e, no segundo aspecto, LT) é selecionado para facilitar o acoplamento dos grupos finais de modificação de R1 e R2 para o polímero PBAE. Cada L1 e L2 (e, no segundo aspecto, LT) pode ser uma ligação, por exemplo, onde o grupo de final de modificação é um oligopeptídeo que compreende um resíduo de cisteína terminal.
[0014] No segundo aspecto da invenção, LT é selecionado para facilitar o acoplamento do grupo RT de final de modificação para o polímero PBAE. LT pode ser uma ligação, por exemplo, onde o grupo de modificação do fnal é um oligopeptídeo que compreende um resíduo de cisteína terminal.
[0015] Nos polímeros de acordo com a presente invenção, Rx pode ser selecionado independentemente a partir do grupo que consiste em hidrogênio, alquil, cicloalquil, alquenil, cicloalquenil, heteroalquil e heterocicloalquil, por exemplo, a partir do grupo consistindo de hidrogênio, alquil e cicloalquil.
[0016] De acordo com a presente invenção, um “oligopeptídeo” compreende uma cadeia de pelo menos três aminoácidos ligados entre si por ligações peptídicas. Tais peptídeos de preferência contêm apenas aminoácidos naturais, apesar de aminoácidos não naturais (ou seja, compostos que não ocorrem na natureza mas que podem ser incorporados numa cadeia polipeptídica) e/ou análogos de aminoácidos como são conhecidos na técnica podem ser alternativamente empregados. Além disso, um ou mais dos aminoácidos de tais peptídeos podem ser modificados, por exemplo, pela adição de uma entidade química tal como um grupo carboidrato, um grupo fosfato, um grupo franesil, um grupo isofranesil, um grupo de ácido graxo, ou um ligante para conjugação, funcionalização, ou outra modificação, etc. Os oligopeptídeos nos polímeros da presente invenção compreendem normalmente entre 3 a 20 resíduos de aminoácidos, com maior preferência de 3 a 10 resíduos de aminoácidos, com maior preferência de 3 a 6 resíduos de aminoácidos. Alternativamente, os oligopeptídeos nos polímeros da presente invenção podem compreender de 4 a 20 resíduos de aminoácidos, com maior preferência de 4 a 10 resíduos de aminoácidos, com maior preferência de 4 a 6 resíduos de aminoácidos.
[0017] A presente invenção proporciona ainda polímeros de fórmula I, em que o ou cada um oligopeptídeo tem uma carga global positiva a pH 7. O ou cada oligopeptídeo pode compreender os aminoácidos que ocorrem naturalmente e que estão carregados positivamente a pH 7, isto é, lisina, arginina e histidina. Por exemplo, o ou cada oligopeptídeo pode ser selecionado a partir do grupo que consiste de polilisina, poliarginina ou poli-histidina, cada um dos quais pode ser terminado com cisteína.
[0018] Em uma modalidade, o ou cada oligopeptídeo é de preferência um composto de Fórmula IV:
Figure img0013
p é um número inteiro de 2 a 19, tipicamente de 3 a 9, ou de 3 a 5, e em que Ra é selecionado em cada ocorrência do grupo consistindo de H2NC(=NH)-NH(CH2) 3-, H2N(CH2)4— ou (1H-imidazol-4-yl)-CH2-.
[0019] Quando o ou cada oligopeptídeo é um composto de Fórmula IV, L1 e/ou L2 (e/ou, no segundo aspecto, LT) ligando o ou cada oligopeptídeo para o polímero é uma ligação e o resíduo de cisteína terminal fornece um meio de acoplamento a ou cada oligopeptídeo ao intermediário terminado acrilato, Fórmula III. A funcionalidade tiol fornece adição controlada mais rápida, mais eficiente e mais facilmente para a ligação dupla. Em contrapartida, quando o ou cada oligopeptídeo é terminado em uma funcionalidade amina para acoplamento, um excesso deste composto é necessário na etapa de acoplamento.
[0020] A presente invenção proporciona ainda polímeros de fórmula I, em que o ou cada um oligopeptídeo tem uma carga líquida negativa a pH 7. O ou cada oligopeptídeo pode compreender os aminoácidos que ocorrem naturalmente e que estão carregados negativamente a pH 7, isto é, ácido aspártico e ácido glutâmico. Por exemplo, o ou cada oligopeptídeo pode ser selecionado a partir do grupo que consiste de ácido poliaspártico e ácido glutâmico, cada um dos quais pode ser terminado com cisteína. Nesta modalidade, o ou cada oligopeptídeo pode ser um composto de Fórmula IV em que p é um número inteiro de 2 a 19, tipicamente de 3 a 9, ou de 3 a 5, e em que Ra é HO2C(CH2)2- ou HO2C-CH2-. Neste caso, o Li e/ou L2 que liga o ou cada oligopeptídeo para o polímero é uma ligação como o resíduo de cisteína terminal fornece um meio de acoplamento a ou cada oligopeptídeo para o intermediário terminado de acrilato, fórmula IV.
[0021] Alternativamente, o ou cada oligopeptídeo pode compreender uma mistura de aminoácidos de ocorrência natural que são negativamente carregados a pH 7 e aminoácidos que ocorrem naturalmente que são carregadas positivamente a pH 7.
[0022] A presente invenção proporciona ainda polímeros de fórmula I, em que o ou cada oligopeptídeo é hidrofóbico. O ou cada oligopeptídeo pode compreender aminoácidos de ocorrência natural que são hidrofóbicos, tais como valina, leucina, isoleucina, metionina, triptofano, fenilalanina, cisteína, tirosina e alanina; em particular, o ou cada oligopeptídeo pode compreender valina, leucina, isoleucina, metionina, triptofano e fenilalanina.
[0023] A presente invenção proporciona ainda polímeros de fórmula I, em que o ou cada um oligopeptídeo é hidrofílico. O ou cada oligopeptídeo pode compreender aminoácidos de ocorrência natural que são hidrofílicos, tais como serina, treonina, cisteína, asparagina e glutamina, e pode ainda compreender os aminoácidos de ocorrência natural que estão carregados a pH 7.
[0024] De acordo com o primeiro aspecto da invenção, são fornecidos polímeros de fórmula I, que ambos de R1 e R2 são oligopeptídeos e polímeros de fórmula I, em que um de R1 e R2 é um oligopeptídeo e um de R1 e R2 é Ry.
[0025] De acordo com o primeiro aspecto da invenção, onde um de R1 e R2 é Ry, então Ry é de preferência selecionado de entre o grupo que consiste em hidrogênio, - (CH2)mNH2, -(CH2)mNHMe, -(CH2)mOH, -(CH2)mCH3, - (CH2)2(OCH2CH2)mNH2, -(CH2)2(OCH2CH2)mOH e -(CH2)2(OCH2CH2)mCH3, em que m é um número inteiro de 1 a 20, por exemplo de 1 a 5. De preferência, Ry é selecionado do grupo que consiste em -(CH2)mNH2, -(CH2)mNHMe e -(CH2)2(OCH2CH2)mNH2. De preferência, quando L1 é NH ou NRx, e um de R1 e R2 é Ry, então Ry é diferente de R3.
[0026] Os polímeros da presente invenção podem ser assimétricos. Por exemplo, em polímeros de acordo com o primeiro aspecto da invenção, um de R1 e R2 pode ser um oligopeptídeo e o outro pode ser Ry. Alternativamente, R1 e R2 pode ser cada um oligopeptídeo diferente. Em polímeros de acordo com o segundo aspecto da invenção, pelo menos um selecionado de R1, R2 e uma ou duas ocorrências de RT podem ser um oligopeptídeo e os restantes grupos selecionados de entre R1, R2 e uma ou duas ocorrências de RT pode ser Ry. Alternativamente, R1, R2 e uma ou duas ocorrências de cada de RT pode ser um oligopeptídeo diferente.
[0027] Os inventores verificaram que os polímeros assimétricos têm uma maior eficiência de administração de polinucleotídeo. Por exemplo, os polímeros de acordo com o primeiro aspecto da invenção em que um dos substituintes de R1 e R2 é CysArgArgArg e outro derivado de H2N(CH2)3CH(CH3)CH2NH2 possuem uma maior eficiência de administração de polinucleotídeo de ambos os polímeros em que ambos os substituintes R1 e R2 são CysArgArgArg, e polímeros em que ambos os substituintes R1 e R2 são derivados a partir de H2N(CH2)3CH(CH3)CH2NH2.
[0028] Em polímeros de acordo com a presente invenção, a L3 e L5 podem ser independentemente selecionados a partir de ligantes de alquileno, alquenileno, heteroalquileno ou heteroalquenileno e polietilenoglicol. As referidas porções de alquileno, alquenileno, heteroalquileno ou heteroalquenileno podem ser de 1-20 átomos de carbono, de preferência de 1-12 átomos de carbono, mais preferencialmente de 1-6 átomos de carbono. Os referidos ligadores de polietilenoglicol pode ser de 3 a 25 átomos de comprimento, de preferência de 3 a 18 átomos em comprimento.
[0029] Opcionalmente, um ou mais átomos de carbono em L3 e/ou L5 podem ser substituído por -S-S-. A inclusão de pelo menos uma ponte de dissulfeto na cadeia de polímero principal permite desempacotamento eficiente de polinucleotídeos terapêuticos no interior das células alvo.
[0030] Em polímeros de acordo com a presente invenção, cada R3 pode ser selecionado independentemente a partir do grupo que consiste em hidrogênio, -(CH2)pNH2, - (CH2)pNHMe, -(CH2)pOH, -(CH2)pCH3, -(CH2)2(OCH2CH2)qNH2, - (CH2)2(OCH2CH2)qOH e -(CH2)2(OCH2CH2)qCH3em que p é um número inteiro de 1 a 20, por exemplo de 1 a 5, e o símbolo q representa um número inteiro de 1 a 10, por exemplo de 1 a 5.
[0031] Na fórmula I ou II acima, n é preferencialmente de 5 a 1000, mais preferivelmente de 20 a 500. O peso molecular do polímero de fórmula I ou fórmula II é, de preferência de 1.000 a 100.000 g/mol, mais preferivelmente de 2.000 e 50.000 g/mol e mais preferencialmente de 5.000 e 40.000 g/mol.
[0032] Certos compostos da presente invenção podem existir em formas geométricas particulares ou estereoisoméricas. A presente invenção contempla todos esses compostos, incluindo cis-isômeros e trans-isômeros, R- e S- enantiômeros, diastereoisômeros, (d)-isômeros, (l)- isômeros, as suas misturas racêmicas, e outras misturas dos mesmos, como caindo dentro do escopo da invenção. Átomos de carbono assimétricos adicionais podem estar presentes num substituinte tal como um grupo alquil. Todos esses isômeros, bem como as suas misturas, destinam-se a serem incluídos na presente invenção.
[0033] Misturas isoméricas que contenham qualquer um de uma variedade de proporções de isômeros podem ser utilizadas de acordo com a presente invenção. Por exemplo, no caso de apenas dois isômeros serem combinados, misturas contendo proporções de isômeros de 50:50, 60:40, 70:30, 80:20, 90: 10, 95: 5, 96: 4, 97: 3, 98: 2 ou 99: 1 estão contempladas pela presente invenção. Os técnicos especialistas no assunto apreciarão facilmente que as proporções análogas são contempladas para mais misturas isoméricas complexas. Grupos químicos
[0034] O termo “halogênio” (ou “halo”) inclui flúor, cloro, bromo e iodo.
[0035] O termo “alquil” inclui grupos hidrocarbil monovalente, linear ou ramificado, saturado, acíclico. Em uma modalidade alquil é C1-10alquil, em outra modalidade C1- 6alquil, em outra modalidade C1-4alquil, tais como metil, etil, n-propil, i-propil ou t-butil. Alquil pode ser substituído.
[0036] O termo “cicloalquil” inclui grupos hidrocarbil cíclicos, monovalentes, saturados. Em uma modalidade cicloalquil é C3-10cicloalquil, em outra modalidade C3-6cicloalquil, tal como ciclopentil e ciclohexil. Cicloalquil pode ser substituído.
[0037] O termo “alcóxi” significa alquil-O-.
[0038] O termo “alquilamino” significa alquil-NH-.
[0039] O termo “alquiltio” significa alquil-S(O)t-, em que t é definido abaixo.
[0040] O termo “alquenil” inclui grupos hidrocarbil acíclico, insaturado, ramificado ou linear, monovalente com pelo menos uma dupla ligação carbono-carbono e, em uma modalidade, não há ligações triplas carbono-carbono. Em uma modalidade alquenil é C2-1alquenil, em outra modalidade C2- 6alquenil, em outra modalidade C2-4alquenil. Alquenil pode ser substituído.
[0041] O termo “cicloalquenil” inclui grupos hidrocarbil cíclicos monovalentes, parcialmente insaturados que têm pelo menos uma ligação dupla carbono-carbono e, em uma modalidade, sem ligações triplas carbono-carbono. Em uma modalidade cicloalquenil é C3-10cicloalquenil, em outra modalidade C5-10cicloalquenil, por exemplo, ciclohexenil ou benzociclohexil. Cicloalquenil pode ser substituído.
[0042] O termo “alquinil” inclui grupos hidrocarbil acíclico, monovalente, linear ou ramificado, insaturado, tendo pelo menos uma ligação tripla carbono-carbono e, em uma modalidade, não há ligações duplas carbono-carbono. Em uma modalidade, alquinil é C2-10alquinil, em outra modalidade C2-6alquinil, em outra modalidade C2-4alquinil. Alquinil pode ser substituído.
[0043] O termo “alquileno” inclui grupos hidrocarbil acíclicos divalente, linear ou ramificado, saturado. Em uma modalidade alquileno é C1-10alquileno, em outra modalidade C1-6alquileno, em outra modalidade C1- 4alquileno, tal como os grupos metileno, etileno, n- propileno, i-propileno ou t-butileno. Alquileno pode ser substituído.
[0044] O termo “alquenileno” inclui grupos hidrocarbil divalentes, lineares ou ramificados, insaturados, com dupla ligação, pelo menos, uma ligação dupla carbono-carbono e, em uma modalidade, não há ligações triplas carbono-carbono. Em uma modalidade alquenileno é C2-10alquenileno, em outra modalidade C2-6alquenileno, em outra modalidade C2-4alquenileno. Alquenileno pode ser substituído.
[0045] O termo “heteroalquil” inclui grupos alquil, por exemplo, grupos C1-65alquil, grupos C1-17alquil ou grupos C1-10alquil, em que até vinte átomos de carbono, em uma modalidade até dez átomos de carbono, em uma modalidade até dois átomos de carbono, em outra modalidade um átomo de carbono, são cada um independentemente substituído por O, S(O)t ou N, desde que pelo menos um dos átomos de carbono no grupo alquil permanece. O grupo heteroalquil pode ser C- ligado ou hetero-ligado, isto é, pode ser ligado ao resto da molécula através de um átomo de carbono ou através de O, S(O)t ou N, em que t é definido abaixo. Heteroalquil pode ser substituído.
[0046] O termo “heterocicloalquil” inclui grupos cicloalquil em que até dez átomos de carbono, em uma modalidade até dois átomos de carbono, em outra modalidade de um átomo de carbono, são cada um independentemente substituídos por O, S(O)t ou N, desde que pelo menos um dos átomos de carbono cicloalquil permanece. Exemplos de grupos heterocicloalquil incluem oxiranil, tiaranil, aziridinil, oxetanil, tiatanil, azetidinil, tetrahidrofuranil, tetrahidrotiofenil, pirrolidinil, tetrahidropiranil, tetrahidrotiopiranil, piperidinil, 1,4-dioxanil, 1,4- oxatianil, morfolinil, 1,4-ditianilo, piperazinil, 1,4- azatianil, oxepanil, tiepanil, azepanil, 1,4-dioxepanil, 1,4-oxatiepanil, 1,4-oxaazepanil, 1,4-ditiepanil, 1,4- tieazepanil e 1,4-diazepanil. O grupo heterocicloalquil pode ser C-ligado ou N-ligado, isto é, pode ser ligado ao resto da molécula através de um átomo de carbono ou através de um átomo de nitrogênio. O heterocicloalquil pode ser substituído.
[0047] O termo “heteroalquenil” inclui grupos alquenil, por exemplo, grupos C1-65alquenil, grupos C1- 17alquenil ou grupos C1-10alquenil, em que até vinte átomos de carbono, em uma modalidade até dez átomos de carbono, em uma modalidade até dois átomos de carbono, em outra modalidade um átomo de carbono, são cada um independentemente substituído por O, S(O)t ou N, desde que pelo menos um dos átomos de carbono alquenil permanece. O grupo heteroalquenil pode ser C-ligado ou hetero-ligado, isto é, pode ser ligado ao resto da molécula através de um átomo de carbono ou através de O, S(O)t ou N. Heteralquenil pode ser substituído.
[0048] O termo “heterocicloalquenil” inclui grupos cicloalquenil em que até três átomos de carbono, em uma modalidade até dois átomos de carbono, em outra modalidade átomos de carbono, são cada um independentemente substituídos por O, S(O)t ou N, desde que pelo menos um dos átomos de carbono de cicloalquenil permaneça. Exemplos de grupos heterocicloalquenil incluem 3,4-di-hidro-2H-piranil, 5-6-di-hidro-2H-piranil, 2H-piranil, 1,2,3,4- tetrahidropiridinil e 1,2,5,6-tetrahidropiridinil. O grupo heterocicloalquenil pode ser C-ligado ou N-ligado, isto é, pode ser ligado ao resto da molécula através de um átomo de carbono ou através de um átomo de nitrogênio. Heterocicloalquenil pode ser substituído.
[0049] O termo “heteroalquinil” inclui grupos alquinil, por exemplo, grupos C1-65alquinil, grupos C1- 17alquinil ou grupos C1-10alquinil, em que até vinte átomos de carbono, em uma modalidade na qual um máximo de dez de carbono átomos, em uma modalidade até dois átomos de carbono, em outra modalidade um átomo de carbono, são cada um independentemente substituídos por O, S(O)t ou N, desde que pelo menos um dos átomos de carbono de alquinil permaneça. O grupo heteroalquinil pode ser C-ligado ou hetero-ligado, isto é, pode ser ligado ao resto da molécula através de um átomo de carbono ou através de O, S(O)t ou N. Heteroalquinil pode ser substituído.
[0050] O termo “heteroalquileno” inclui grupos alquileno, por exemplo, grupos C1-65alquileno, grupos C1- 17alquileno ou grupos C1-10alquileno, em que até vinte átomos de carbono, em uma modalidade na qual um máximo de dez de carbono átomos, em uma modalidade até dois átomos de carbono, em outra modalidade um átomo de carbono, são cada um independentemente substituídos por O, S(O)t ou N, desde que pelo menos um dos átomos de carbono de alquileno permanece. Heteroalquinileno pode ser substituído.
[0051] O termo “heteroalquenileno” inclui grupos alquenileno, por exemplo, grupos C1-65alquenileno, grupos C1- 17alquenileno, ou grupos C1-10alquenileno, em que até vinte átomos de carbono, em uma modalidade na qual um máximo de dez de carbono átomos, em uma modalidade até dois átomos de carbono, em outra modalidade um átomo de carbono, são cada um independentemente substituídos por O, S(O)t ou N, desde que pelo menos um dos átomos de carbono de alquenileno permaneça. Heteroalquenileno pode ser substituído.
[0052] O termo “aril” inclui grupos hidrocarbil cíclicos, monovalente, aromáticos, tais como fenil ou naftil (por exemplo, 1-naftil ou 2-naftil). Em geral, os grupos aril podem ser grupos aromáticos de anel fundido monocíclico ou policíclico. Os arils preferidos são C6- C14aril. Aril pode ser substituído.
[0053] Outros exemplos de grupos aril são derivados monovalentes de aceantrileno, acenaftileno, acefenantrileno, antraceno, azuleno, criseno, coroneno, fluoranteno, fluoreno, as-indaceno, s-indaceno, indeno, naftaleno, ovaleno, perileno, fenaleno, fenantreno, piceno, pleiadeno, pireno, pirantreno e rubiceno.
[0054] O termo “arilalquil” significa alquil substituído com um grupo aril, por exemplo, benzil.
[0055] O termo “heteroaril” inclui grupos aril em que um ou mais átomos de carbono são cada um substituídos por heteroátomos selecionados independentemente a partir de O, S, N e NRN, em que RN é abaixo (e Em uma modalidade é H ou alquil (por exemplo, C1-alquil)). Heteroaril pode ser substituído.
[0056] Em geral, os grupos heteroaril podem ser grupos heteroaromáticos de anel fundido monocíclico ou policíclico (por exemplo, bicíclico) Tipicamente, os grupos heteroaril contêm 5-4 membros no anel (de preferência 5-10 membros), em que 1, 2, 3 ou 4 membros no anel são independentemente selecionados a partir de O, S, N e NRN. Em uma modalidade, um grupo heteroaril pode ser 5, 6, 9 ou 10 membros, por exemplo, monocíclico de 5 membros, monocíclico de 6 membros, bicíclico de anel fundido de 9 membros ou bicíclico de anel fundido de 10 membros.
[0057] Grupos heteroaromáticos monocíclicos incluem grupos heteroaromáticos contendo 5 a 6 membros do anel em que 1, 2, 3 ou 4 membros do anel são selecionados independentemente de entre O, S, N ou NRN.
[0058] Em uma modalidade, os grupos heteroaril monocíclicos de 5 membros contêm um membro do anel, que é um grupo -NRN-, um átomo -O- ou um átomo de -S- e, opcionalmente, 1-3 membros no anel (por exemplo, 1 ou 2 membros do anel), que são átomos =N- (a parte restante dos 5 membros do anel sendo átomos de carbono).
[0059] Exemplos de grupos heteroaril monocíclicos de 5 membros são pirrolil, furanil, tiofenil, pirazolil, imidazolil, isoxazolil, oxazolil, isotiazolil, tiazolil, 1,2,3 triazolil, 1,2,4 triazolil, 1,2,3 oxadiazolil, 1,2,4 oxadiazolil, 1,2,5 oxadiazolil, 1,3,4 oxadiazolil, 1,3,4 tiadiazolil, piridil, pirimidinil, piridazinil, pirazinil, 1,3,5 triazinil, 1,2,4 triazinil, 1,2,3 triazinil e tetrazolil.
[0060] Exemplos de grupos heteroaril monocíclico de 6 membros são piridinil, piridazinil, pirimidinil e pirazinil.
[0061] Em uma modalidade, os grupos heteroaril monocíclico de 6 membros contém 1 ou 2 membros de anel que são =N- átomos (a parte restante dos membros do anel sendo 6 átomos de carbono).
[0062] Grupos heteroaromáticos bicíclicos incluem grupos heteroaromáticos de anel fundido contendo 9-14 membros no anel em que 1, 2, 3, 4 ou mais membros do anel são selecionados independentemente de entre O, S, N ou NRN.
[0063] Em uma modalidade, os grupos heteroaril bicíclicos de 9 membros contêm um membro do anel, que é um grupo -NRN-, um átomo -O- ou um átomo -S- e, opcionalmente, 1-3 membros no anel (por exemplo, 1 ou 2 membros do anel), que são =N- átomos (sendo a parte restante dos 9 membros do anel são átomos de carbono).
[0064] Exemplos de grupos heteroaril bicíclicos de 9 membros de anel fundido são benzofuranil, benzothiophenil, indolil, benzimidazolil, indazolil, benzotriazolil, pirrolo[2,3-b]piridinil, pirrol[2,3- c]piridinil, pirrol[3,2-c]piridinil, pirrol[3,2- b]piridinil, imidazo[4,5-b]piridinil, imidazo[4,5- c]piridinil, pirazol[4,3-d]piridinil, pirazol[4,3- c]piridinil, pirazol[3,4-c]piridinil, pirazol[3,4- b]piridinil, isoindolil, indazolil, purinil, indolininil, imidazo[1,2-a]piridinil, imidazo[1,5-a]piridinil, pirazol[1,2-a]piridinil, pirrol[1,2-b]piridazinil e imidazo[1,2-c]pirimidinil.
[0065] Em uma modalidade, os grupos heteroaril bicíclicos de 10 membros contêm de 1-3 membros de anel que são =N- átomos (sendo a parte restante das 10 membros do anel são átomos de carbono).
[0066] Exemplos de grupos heteroaril bicíclicos de anel fundido de 10 membros são quinolinil, isoquinolinil, cinnolinil, quinazolinil, quinoxalinil, ftalazinil, 1,6- naftiridinil, 1,7-naftiridinil, 1,8-naftiridinil, 1,5- naftiridinil, 2,6-naftiridinil, 2,7-naftiridinil, pirido[3,2-d]pirimidinil, pirido[4,3-d]pirimidinil, pirido[3,4-d]pirimidinil, pirido[2,3-d]pirimidinil, pirido[2,3-b]pirazinil, pirido[3,4-b]pirazinil, pirimido[5,4-d]pirimidinil, pirazino[2,3-b]pirazinil e pirimido[4,5-d]pirimidinil.
[0067] O termo “heteroarilalquil” significa alquil substituído com um grupo heteroaril.
[0068] Exemplos de grupos acil incluem alquil- C(=O)-, cicloalquil-C(=O)-, alquenil-C(=O)-, cicloalquenil- C(=O)-, heteroalquil-C(=O)-, heterocicloalquil-C(=O)-, aril-C(=O)- ou heteroaril-C(=O)-, em particular, alquil- C(=O)- e aril-C(=O)-.
[0069] A não ser que explicitamente indicado de outro modo, em que as combinações de grupos são aqui referidas como uma porção de, por exemplo, arilalquil, o ultimo grupo mencionado contém o átomo através do qual o radical é ligado ao resto da molécula.
[0070] Sempre que se faz referência a um átomo de carbono de um grupo alquil ou outro grupo a ser substituído por O, S(O)t ou N, o que se pretende é que:
Figure img0014
é substituído por ;
Figure img0015
-CH= é substituído por -N=; =C-H é substituído por =N; ou -CH2- é substituído por -O-, -S(O)t- ou -NRN-.
[0071] A título de esclarecimento, em relação ao heteroátomo contendo grupos acima mencionados (tais como heteroalquil, etc.), onde um número de átomos de carbono é dado, por exemplo, C3-6heteroalquil, o que se pretende é um grupo baseado em C3-6alquil, em que um ou mais dos 3-6 átomos de carbono da cadeia é substituído por O, S(O)t ou N. Assim, um grupo heteroalquil C3-6, por exemplo, irá conter menos do que 3-6 átomos de cadeia carbonada.
[0072] Onde mencionado acima, RN é H, alquil, cicloalquil, aril, heteroaril, -C(O)-alquil, -C(O)-aril, - C(O)-heteroaril, -S(O)t-alquil, -S(O)t-aril ou -S(O)t- heteroaril. RN pode, em particular, ser H, alquil (por exemplo, C1-6alquil) ou cicloalquil (por exemplo, C3- 6cicloalquil).
[0073] Quando mencionado acima, t representa independentemente 0, 1 ou 2, por exemplo, 2. Tipicamente, t é 0.
[0074] Quando um grupo tem pelo menos 2 posições, que podem ser substituídas, o grupo pode ser substituído por ambas as extremidades de uma cadeia alquileno ou heteroalquileno de modo a formar uma porção cíclica.
[0075] Grupos facultativamente substituídos dos compostos da invenção (por exemplo, alquil, cicloalquil, alcoxi, alquenil, cicloalquenil, alquinil, alquileno, alquenileno, heteroalquil, heterocicloalquil, heteroalquenil, heterocicloalquenil, heteroalquinil, heteroalquileno, heteroalquenileno, aril, arilalquil, aril- heteroalquil, heteroaril, heteroarilalquil ou grupos heteroalquil etc.) podem ser substituídos ou não substituídos, em uma modalidade não substituída. Tipicamente, a substituição envolve a substituição nominal de um átomo de hidrogênio com um grupo substituinte, ou dois átomos de hidrogênio no caso de substituição por = O.
[0076] Quando substituídos, geralmente haverá de 1 a 3 substituintes, em uma modalidade 1 ou 2 substituintes, em uma modalidade 1 substituinte.
[0077] O substituinte(s) é/são independentemnte halogênio, trihalometil, trihaloetil, -OH, -NH2, -NO2, -CN, -N+(C1-6alquil)2O-, -CO2H, -CO2C1-6alquil, -SO3H, -SOC1- 6alquil, -SO2C1-6alquil, -SO3C1-6alquil, -OC(=O)OC1-6alquil, - C(=O)H, -C(=O)C1-6alquil, -OC(=O)C1-6alquil, =O, -NH(C1- 6alquil), -N(C1-6alquil)2, -C(=O)NH2, -C(=O)N(C1-6alquil)2, - N(C1-6alquil)C(=O)O(C1-6alquil), -N(C1-6alquil)C(=O)N(C1- 6alquil)2, -OC(=O)N(C1-6alquil)2, -N(C1-6alquil)C(=O)C1- 6alquil, -C(=S)N(C1-6alquil)2, -N(C1-6alquil)C(=S)C1-6alquil, -SO2N(C1-6alquil)2, -N(C1-6alquil)SO2C1-6alquil, -N(C1- 6alquil)C(=S)N(C1-6alquil)2, -N(C1-6alquil)SO2N(C1-6alquil)2, - C1-6alquil, -C1-6heteroalquil, -C3-6cicloalquil, -C3- 6heterocicloalquil, -C2-6alquenil, -C2-6heteroalquenil,-C3- cicloalquenil, -C3-6heterocicloalquenil, -C2-6alquinil, -C2- βheteroalquinil, -Zu-Ci-6alquil, -Zu- -Cs-βcicloalquil, -Zu- C2-6alquenil, -Zu-C3—6cicloalquenil ou -Zu-C2-βalquinil, em que Zu é, independentemente, O, S, NH ou N(C1-6alquil).
[0078] Numa outra modalidade, o substituinte(s) opcional é/são independentemente, halogênio, trihalometil, trihaloetil, -NO2, -CN, -N+(C1-6alquil)2O-, -CO2H, -SO3H, - SOC1-6alquil, -SO2C1-6alquil, -C(=O)H, -C(=O)C1-6alquil, =O, - N(C1-6alquil)2, -C(=O)NH2, -C1-6alquil, -C3-6cicloalquil, -C3- 6heterocicloalquil, -ZuC1-6alquil ou -Zu-C3-6cicloalquil, em que Zu é definido acima.
[0079] Numa outra modalidade, o substituinte(s) opcional é/são independentemente, halogênio, trihalometil, -NO2, -CN, -CO2H, -C(=O)C1-6alquil, =O, -N(C1- 6alquil)2, -C(=O)NH2, -C1-6alquil, -C3-6cicloalquil, -C3-6hete rocicloalquil, -ZuC1-6alquil ou -Zu-C3-6cicloalquil, em que Zu é definido acima.
[0080] Numa outra modalidade, o substituinte(s) opcional é/são independentemente, halogênio, -NO2, -CN, - CO2H, =O, -N(C1-6alquil)2, -C1-6alquil, -C3-6cicloalquil ou - C3-6heterocicloalquil
[0081] Numa outra modalidade, o substituinte(s) opcional é/são independentemente, halogênio, -OH, NH2, NH(C1-6alquil), -N(C1-6alquil)2, -C1-6alquil, -C3-6cicloalquil ou -C3-6heterocicloalquil.
[0082] Tais como aqui utilizados, os termos “polímeros da invenção” e “polímero de fórmula I”, etc incluem derivados farmaceuticamente aceitáveis e polimorfos, os isômeros e variantes marcadas isotopicamente dos mesmos.
[0083] O termo “derivado farmaceuticamente aceitável” inclui qualquer sal, solvato, hidrato ou pró- fármaco farmaceuticamente de um composto de Fórmula I. Em uma modalidade, os seus derivados farmaceuticamente aceitáveis são sais farmaceuticamente aceitáveis, solvatos ou hidratos de um composto de Fórmula I.
[0084] O termo “sal farmaceuticamente aceitável” inclui um sal preparado a partir de ácidos ou bases não tóxicas farmaceuticamente aceitáveisincluindo bases ou ácidos inorgânicos ou orgânicos.
[0085] Os compostos de Fórmula I que contêm grupos básicos, por exemplo, amino, são capazes de formar sais farmaceuticamente aceitáveis com ácidos. Em uma modalidade, os sais de adição de ácidos farmaceuticamente aceitáveis dos compostos de Fórmula I incluem, mas não estão limitados a, aqueles de ácidos inorgânicos tais como ácidos hidrohálico (por exemplo, ácido clorídrico, bromídrico e iodídrico), ácido sulfúrico, ácido nítrico e ácido fosfórico. Em uma modalidade, os sais de adição de ácidos farmaceuticamente aceitáveis dos compostos de Fórmula I incluem, mas não estão limitados a, aqueles de ácidos orgânicos, tais como grupos alifáticos, aromáticos, carboxílicos e sulfônicos de classes de ácidos orgânicos, exemplos dos quais incluem: ácidos monocarboxílicos alifáticos tais como ácido fórmico, ácido acético, ácido propiônico ou ácido butírico; ácidos hidróxi alifáticos, tais como ácido lático, ácido cítrico, ácido tartárico ou ácido málico; ácidos dicarboxílicos, tais como ácido maleico ou ácido succínico; ácidos carboxílicos aromáticos tais como ácido benzóico, ácido p-clorobenzóico, ácido fenilacético, ácido difenilacético ou ácido trifenilacético; ácidos hidróxi aromáticos, tais como ácido o-hidroxibenzóico, ácido p-hidroxibenzóico, ácido 1- hidroxinaftaleno-2-carboxílico ou ácido 3-hidroxinaftaleno- 2-carboxílico; e ácidos sulfônicos tais como ácido metanossulfônico, ácido etanossulfônico ou ácido benzenossulfônico. Outros sais de adição de ácido farmaceuticamente aceitáveis dos compostos de Fórmula I incluem, mas não estão limitados a, aqueles de ácido glicólico, ácido glicurônico, ácido furóico, ácido glutâmico, ácido antranílico, ácido salicílico, ácido mandélico, ácido embônico (pamóico), ácido pantotênico, ácido esteárico, ácido sulfanílico, ácido algênico e ácido galacturônico. Onde o composto de Fórmula I compreende uma pluralidade de grupos básicos, múltiplos centros podem ser protonados para proporcionar múltiplos sais, por exemplo, di- ou tri-sais dos compostos de Fórmula I. Por exemplo, um sal de ácido halídrico de um composto de Fórmula I como aqui descrito, pode ser um monohidrohaleto, dihidrohaleto ou trihidrohaleto, etc. Em uma modalidade, os sais incluem, mas não estão limitados aos que resultam da adição de qualquer um dos ácidos acima descritos. Em uma modalidade do composto de Fórmula I, dois grupos básicos formam sais de adição de ácido. Numa outra modalidade, os dois contra- íons de sal de adição são da mesma espécie, por exemplo, di-hidrocloreto, dihidrosulfeto, etc. Tipicamente, o sal farmaceuticamente aceitável é um sal cloreto, tal como um sal dicloridrato.
[0086] Os compostos de Fórmula I que contêm ácidos, por exemplo, carboxilo, grupos são capazes de formar sais farmaceuticamente aceitáveiscom bases. Em uma modalidade, os sais básicos farmaceuticamente aceitáveis dos compostos de Fórmula I incluem, mas não estão limitados a, sais de metais, tais como metais alcalinos ou sais de metais alcalino-terrosos (por exemplo, sais de sódio, potássio, magnésio ou cálcio) e sais de zinco ou alumínio. Em uma modalidade, os sais básicos farmaceuticamente aceitáveis dos compostos de Fórmula I incluem, mas não estão limitados a, sais formados com amônia ou aminas orgânicas farmaceuticamente aceitáveis ou bases heterocíclicas tais como a etanolamina (por exemplo, dietanolamina), benzilaminas, N-metil-glucamina, os aminoácidos (por exemplo, lisina) ou piridina.
[0087] Hemisais de ácidos e bases podem também ser formados, por exemplo, sais de hemissulfato.
[0088] Os sais farmaceuticamente aceitáveisdos compostos de Fórmula I podem ser preparados por métodos bem conhecidos na técnica.
[0089] Para uma revisão de sais farmaceuticamente aceitáveis, ver Stahl and Wermuth, Handbook of Pharmaceutical Salts: Properties, Selection and Use (Wiley- VCH, Weinheim, Germany, 2002).
[0090] Os compostos da invenção podem existir em ambas as formas não solvatadas e solvatadas. O termo “solvato” inclui complexos moleculares que compreendem um composto da invenção e uma ou mais moléculas de solvente farmaceuticamente aceitáveis, tais como água ou alcoóis C16, por exemplo, etanol. O termo “hidrato” significa um “solvato”, onde o solvente é a água.
[0091] Os compostos da invenção podem existir em estados de sólidos amorfos através de formas cristalinas. Todas essas formas sólidas estão incluídas no escopo da invenção.
[0092] Os compostos da invenção podem existir em uma ou mais formas geométricas, ótica, enantioméricas, diastereoméricas e tautoméricas , incluindo mas não se limitando a formas cis- e trans-, e - formas E- e Z, formas S- e meso-, formas ceto- e enol-. Todas essas formas isoméricas estão incluídas no escopo da invenção. As formas isoméricas podem estar na forma isomericamente pura ou enriquecida, assim como em misturas de isômeros (por exemplo, misturas racêmicas ou diastereoméricas).
[0093] A invenção inclui compostos isotopicamente marcados farmaceuticamente aceitáveis de Fórmula I em que um ou mais átomos são substituídos por átomos que têm o mesmo número atômico, mas uma massa atômica ou número de massa diferente da massa atômica ou número de massa usualmente encontrado na natureza.
[0094] Exemplos de isótopos apropriados para inclusão nos compostos da invenção incluem isótopos de hidrogênio, tais como 2H e 3H, carbono, tais como 11C, 13C e 14C, cloro, tal como 36Cl, flúor, tal como 18F, iodo, tal como 123I e 125I, nitrogênio, tal como 13N e 15N, oxigênio, tal como 15O, 17O e 18O, fósforo, tal como 32P, e enxofre, tal como 35S. Certos compostos marcados isotopicamente de Fórmula I, por exemplo, aqueles que incorporam um isótopo radioativo, são úteis em estudos de distribuição de tecido de substrato e/ou fármacos. Os isótopos radioativos 3H e 14C são particularmente úteis para esta finalidade, tendo em conta a sua facilidade de incorporação e meios rápidos de detecção.
[0095] A substituição com isótopos emissores de positróns, tais como 11C, 18F, 15O e 13N podem ser úteis em Topografia de Emissão de Pósitron (PET) para examinar a ocupação do receptor de substrato.
[0096] Os compostos marcados isotopicamente de Fórmula I podem geralmente ser preparados por técnicas convencionais conhecidas dos técnicos especialistas no assunto ou por processos análogos aos aqui descritos utilizando um reagente isotopicamente marcado adequado em lugar do reagente não-marcado previamente empregue.
[0097] Será apreciado que os polímeros, tal como aqui descrito, podem ser substituídos com qualquer número de substituintes ou porções funcionais. Os termos substituídos, se precedidos pelo termo “opcionalmente” ou não, e substituinte, como aqui utilizados, referem-se à capacidade, como apreciado por um técnico especialista no assunto, a alteração de um grupo funcional por outro grupo funcional desde que a valência de todos os átomos seja mantida. Quando mais do que uma posição numa dada estrutura pode ser substituída com mais do que um substituinte selecionado de entre um grupo especificado, o substituinte pode ser o mesmo ou diferente em cada posição. Os substituintes podem também ser adicionalmente substituídos (por exemplo, um grupo aril substituinte pode ter um outro substituinte fora dele, tal como outro grupo aril, que está adicionalmente substituído com flúor em uma ou mais posições).
[0098] O termo thiohidroxil ou tiol, como aqui utilizado, refere-se a um grupo de fórmula -SH.
[0099] A presente invenção proporciona ainda uma composição compreendendo um agente ativo e um polímero de fórmula I. A composição pode compreender nanopartículas e/ou micropartículas contendo o agente ativo e o polímero. A composição pode compreender dois ou mais polímeros diferentes como definidos na fórmula I. Por exemplo, a composição pode compreender polímeros de fórmula I em que R1 e R2 são ambos CysLysLysLys e polímeros de fórmula I, em que R1 e R2 são ambos CysHisHisHis.
[0100] O agente ativo pode ser um polinucleotídeo, proteína ou molécula pequena. Tipicamente, o agente ativo é um polinucleotídeo. O polinucleotídeo pode ser selecionado a partir do grupo que consiste em DNA, RNA, siRNA e miRNA, de um modo preferido a partir do grupo consistindo de siRNA e miRNA. Em uma modalidade, o polinucleotídeo é selecionado do grupo consistindo em DNA, RNA e siRNA.
[0101] Tipicamente, um polinucleotídeo compreende pelo menos três nucleotídeos. De preferência, o polinucleotídeo é de 20-30 nucleotídeos de comprimento, mais preferivelmente 20-25 nucleotídeos de comprimento, por exemplo, 22 nucleotídeos de comprimento.
[0102] O polinucleotídeo pode ser derivado a partir de nucleosídeos naturais (isto é, adenosina, timidina, guanosina, citidina, uridina, inosina, xantosina, desoxiadenosina, desoxitimidina, desoxiguanosina, desoxiinosina, e desoxicitidina), análogos de nucleosídeos (por exemplo, 2-aminoadenosina, 2-tiotimidina, inosina, pirrol-pirimidina, 3-metil adenosina, C5-propinilcitidina, C5-propiniluridina, C5-bromouridina, C5-fluorouridina, C5- iodouridina, C5-metilcitidina, 7-deazaadenosina, 7- desazaguanosina, 8-oxoadenosina, 8-oxoguanosina, O(6)- metilguanina e 2-tiocitidina), ou suas misturas. Os nucleotídeos podem ser derivados de bases quimicamente modificadas, bases biolgicamente modificadas (por exemplo, bases metiladas), bases intercaladas, açúcares modificados ou não modificados (por exemplo, 2 '-fluororibose, ribose, 2'-desoxirribose, arabinose e hexose), e/ou grupos fosfato modificados ou não modificados (por exemplo, ligação em cadeia de fosforotioatos e 5 '-N-fosforamidito).
[0103] Tal como aqui utilizado, o termo “molécula pequena” refere-se a compostos orgânicos, ou de ocorrência natural ou criado artificialmente (por exemplo, através de síntese química) que têm peso molecular relativamente baixo e que não são proteínas, polipeptídeos, ou polinucleotídeos. Tipicamente, pequenas moléculas têm um peso molecular inferior a cerca de 1500 g/mol.
[0104] Uma discussão adicional das nanopartículas da presente invenção segue. Deve entender-se que a discussão se aplica igualmente às micropartículas.
[0105] As nanopartículas podem compreender um polinucleotídeo e polímeros de fórmula I, em que o ou cada oligopeptídeo tem uma carga positiva a pH 7. Os oligopeptídeos carregados positivamente interagem com polinucleotídeo carregado negativamente durante o processo de formação de nanopartículas e facilita a encapsulação do polinucleotídeo nas nanopartículas.
[0106] As nanopartículas podem compreender polímeros de fórmula I ou II em que o ou cada oligopeptídeo tem uma carga global negativa a um pH de 7 e um agente ativo que tem uma carga global positiva a pH 7. Os oligopeptídeos carregados negativamente interagem com o agente ativo carregado positivamente durante o processo de formação de nanopartículas e facilitam a encapsulação do agente ativo nas nanopartículas.
[0107] As nanopartículas podem compreender, opcionalmente, uma mistura de diferentes polímeros da invenção. Por exemplo, as nanopartículas podem compreender (a) um polímero de acordo com a fórmula I ou fórmula II em que o ou cada oligopeptídeo tem uma carga positiva a pH 7; e (b) um polímero de acordo com a fórmula I ou fórmula II em que o ou cada oligopeptídeo tem uma carga global negativa a pH 7.
[0108] Assim, a invenção fornece nanopartículas com carga de superfície líquida que pode ser variada modificando as proporções de polímeros de (a) e (b) acima. A proporção de (a) para (b) pode ser de 1:99, 5:95, 10:90, 25:75, 50:50, 75:25, 90:10, 95:5, ou 99:1, em peso .
[0109] Essas nanopartículas são apropriadas tanto para encapsulamento de fármacos e polinucleotídeo e mostram as propriedades farmacológicas melhoradas.
[0110] A inclusão de uma população de polímeros modificados com oligopeptídeos que têm uma carga líquida negativa a pH 7 facilita o encapsulamento por nanoprecipitação de sequências de DNA and RNA menores. As sequências de DNA e de RNA mais curtas mostram uma menor eficiência de encapsulamento e/ou carga absoluta mais baixa do que sequências mais longas, quando utilizadas em uma etapa de nanoprecipitação com PBAEs conhecidos na técnica. Os inventores verificaram que a adição de outras espécies polianiônicas, tais como os polímeros carregados negativamente descritos aqui, ajuda na montagem durante o processo de nanoprecipitação das nanopartículas resultantes contendo polímero e polinucleotídeo.
[0111] Isto é especialmente útil para o encapsulamento de polinucleotídeos curtos, tais como sequências de siRNA e miRNA, que têm um comprimento de cerca de 20 a 30 pares de bases e são instáveis durante a circulação no corpo. A incorporação de polinucleotídeos curtos, como siRNA e miRNA em nanopartículas já havia apresentado dificuldades devido à sua taxa mais baixa.
[0112] Os inventores verificaram que a utilização de polímeros de acordo com a fórmula I ou fórmula II em que o ou cada oligopeptídeo tem uma carga positiva líquida a um pH de 7, em combinação com polímeros de acordo com a fórmula I ou fórmula II em que o ou cada oligopeptídeo tem uma carga negativa líquida a pH 7 permite o carregamento de polinucleotídeos curtos, tais como siRNA ou miRNA em nanopartículas com alta eficiência de encapsulação e elevada carga. Além disso, a utilização dos dois tipos de polímeros acima descritos evita a degradação dos polinucleotídeos curtos e permite a transfecção mais eficiente. Pensa-se que os oligonucleotídeos com carga positiva “embrulham” em torno dos polinucleotídeos carregados negativamente, e os oligonucleidos carregados negativamente “enrolam” em torno dos oligonucleotídeos carregados positivamente para neutralizar o excesso de carga (referido pelos inventores como o “efeito manto”).
[0113] Além disso, a inclusão de polímeros modificados com oligopeptídeos que têm uma carga líquida negativa a pH 7 facilita a entrega das nanopartículas por meio de barreiras complexas do corpo, tais como a mucosa intestinal e pulmonar, como as alterações líquidas de carga de superfície pode variar durante a interação com essas barreiras.
[0114] As nanopartículas da presente invenção podem ser formadas com elevado teor de agente ativo e de alta eficiência de encapsulamento.
[0115] Aqui, o agente ativo a eficiência de encapsulamento refere-se ao agente ativo incorporado nas nanoparticulas como uma percentagem em peso do agente ativo total utilizado no método de preparação das nanopartículas contendo o agente ativo. É tipicamente até e incluindo 95%, mais tipicamente de 70% a 95%.
[0116] Nisto, o aprisionamento de agente ativo refere-se à percentagem em peso do agente ativo nas nanoparticulas carregadas com agente ativo. Aprisionamento de agente ativo é, de preferência, pelo menos, 2% em peso, mais preferencialmente pelo menos 5% em peso, mais preferencialmente pelo menos 10% em peso e, tipicamente, no intervalo de desde 2% em peso a 20% em peso, mais preferencialmente de 5% em peso a 20 em peso %, mais preferivelmente de 10% em peso a 20% em peso.
[0117] Quando a composição compreende nanopartículas, de um modo preferido, as nanopartículas constituem desde cerca de 1% a cerca de 90% em peso da composição. Mais preferencialmente, as nanopartículas constituem cerca de 5% a cerca de 50% em peso da composição, mais preferivelmente, cerca de 10% a cerca de 30%. A composição pode compreender ainda um veículo. O veículo pode ser qualquer diluente ou excipiente farmaceuticamente aceitável, tal como é conhecido na técnica. O veículo é tipicamente farmacolgicamente inativo. De preferência, o veículo é um líquido polar. Particularmente veículos preferenciais incluem água e soluções aquosas contendo sais fisiolgicamente aceitáveis e/ou tampões, por exemplo, solução salina ou solução salina tamponada com fosfato. Opcionalmente, o veículo é um fluido biológico. Um veículo líquido pode ser removido, por exemplo, liofilização, evaporação ou por centrifugação, para armazenamento ou para fornecer um pó para administração nasal ou pulmonar, de um pó para suspensão para infusão, ou comprimidos ou cápsulas para administração oral.
[0118] O agente(s) ativo pode estar presente dentro das nanopartículas ou sobre as superfícies das nanopartículas. Tipicamente, os agentes ativos estão presentes dentro das nanopartículas. A interação entre o agente(s) ativo e a nanopartícula é tipicamente não- covalente, por exemplo, ligação de hidrogênio, interação electrostática ou encapsulamento físico. Tipicamente, a interação é eletrostática
[0119] As nanopartículas são biocompatíveis e suficientemente resistentes ao seu ambiente de utilização que uma quantidade suficiente das nanopartículas permanecem substancialmente intacta depois da entrada no corpo do mamífero, de modo a ser capaz de atingir o alvo pretendido e conseguir o efeito fisiológico desejado. Os polímeros aqui descritos são biocompatíveis e de preferência biodegradáveis.
[0120] Aqui, o termo “biocompativel” descreve como substância que pode ser inserido ou injetado em um indivíduo vivo sem causar uma resposta adversa. Por exemplo, ele não causa inflamação ou rejeição aguda pelo sistema imunológico que não pode ser adequadamente controlada. Será reconhecido que “biocompatível” é um termo relativo, e um certo grau de resposta imune está a ser esperado, mesmo para as substâncias que são altamente compatíveis com o tecido vivo. Um teste in vitro para avaliar a biocompatibilidade de uma substância é a expô-la a células; substâncias biocompatíveis tipicamente não vão resultar em morte significativa de células (por exemplo,> 20%) em concentrações moderadas (por exemplo, células 29 μg/104).
[0121] Aqui, o termo “biodegradável” descreve um polímero que se degrada num ambiente fisiológico para formar monômeros e/ou outras porções não poliméricas que podem ser reutilizadas por células ou eliminadas de sem efeito tóxico significativo. A degradação biológica pode ser, por exemplo, atividade enzimática ou por maquinaria celular, ou pode ser, tipicamente química, um processo químico que ocorre em condições fisiológicas. Degradação de um polímero pode ocorrer a taxas variáveis, com uma meia- vida da ordem de dias, semanas, meses ou anos, dependendo do polímero ou copolímero utilizado. Os componentes de preferência não provocam inflamação ou outros efeitos adversos in vivo. Em certas modalidades preferidas, as reações químicas invocadas para quebrar os compostos biodegradáveissão não catalisadas.
[0122] Aqui, o termo “nanopartículas” refere-se a uma partícula sólida com um diâmetro de cerca de 1 a cerca de 1000 nm. Aqui, o termo “micropartículas” refere-se a uma partícula sólida com um diâmetro de cerca de 1μm a cerca de 100μm. O diâmetro médio das nanopartículas da presente invenção pode ser determinado por métodos conhecidos na técnica, de preferência por dispersão dinâmica da luz. Em particular, a invenção refere-se a nanopartículas que são partículas sólidas com um diâmetro de cerca de 1 a cerca de 1000 nm quando analisadas por dispersão dinâmica de luz com um ângulo de dispersão de 90° e a uma temperatura de 25°C, usando uma amostra apropriadamente diluída com água filtrada e um instrumento adequado, tal como os instrumentos Zetasizer™ da Malvern Instruments (UK) de acordo com o método de teste padrão ISO 22412: 2008 (método cumulante A.1.3.2). Quando uma partícula é dita que tem um diâmetro de x nm, geralmente haverá uma distribuição de partículas sobre este meio, mas, pelo menos, 50% em número (por exemplo> 60%,> 70%,> 80%,> 90%, ou mais) das partículas terá um diâmetro dentro do intervalo x ± 20%.
[0123] De preferência, o diâmetro das nanopartículas é de cerca de 10 a cerca de 1000 nm, mais preferivelmente de cerca de 5 a cerca de 500 nm, mais preferivelmente de cerca de 50 a cerca de 400 nm, mais preferivelmente de cerca de 50 a cerca de 150 nm. Alternativamente, o diâmetro das nanopartículas é de cerca de 1 a cerca de 100 nm. Em uma modalidade, as nanopartículas exibem um certo grau de aglomeração inferior a 10%, de preferência menos do que 5%, de preferência menos do que 1%, e de preferência, as nanopartículas são substancialmente não aglomeradas, tal como determinado por microscopia eletrônica de transmissão.
[0124] A presente invenção proporciona ainda um método de encapsular um agente numa matriz de polímero de fórmula I ou fórmula II para formar nanopartículas, o método compreendendo as etapas de: proporcionar um agente; proporcionar o polímero; e contatar o agente e o polímero sob condições adequadas para formar nanopartículas. Em particular, o agente e o polímero podem ser misturados em solução, a concentrações adequadas para se obter a proporção desejada, misturado vigorosamente e, em seguida, incubados num forno a cerca de 37°C durante cerca de 30 minutos.
[0125] A presente invenção proporciona ainda um método para sintetizar um polímero de fórmula I compreendendo as etapas de fazer reagir um composto de Fórmula II, em que L3 é como acima definido com uma amina primária de fórmula L4H2, em que L4 é como definido acima, para produzir um polímero de Fórmula II como mostrado no Esquema 2.
Figure img0016
[0126] O composto de Fórmula III é posteriormente reagido com compostos de Fórmula IV para formar um composto de Fórmula V:
Figure img0017
em que p e Ra independentemente, em cada ocorrência são selecionados a partir das listas definidas acima. Em alguns casos, cada ocorrência de p é a mesma, e os grupos Ra são selecionados de tal modo que a sequência de grupos Ra a partir da ligação de enxofre é a mesma em cada extremidade do composto, isto é, p e Ra são selecionados, tal que o polímero tem uma simetria dupla sobre L4.
[0127] Numa alternativa à etapa acima, o composto de Fórmula III é posteriormente reagido com compostos de fórmula H2NRy, em que Ry é como definido acima, e compostos de Fórmula IV e a mistura resultante é separada para se obter um composto de Fórmula VI:
Figure img0018
em que Ra é independentemente selecionado em cada ocorrência a partir das listas acima definidas, e p é como definido acima.
[0128] Será reconhecido que outros métodos de ligação de um oligopeptídeo ao composto de Fórmula III estaria disponível para o técnico especialista no assunto, que estaria ciente de nucleófilos adequados para a reação com os grupos terminais de acrilato Fórmula III.
BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS
[0129] A Figura 1 mostra o potencial zeta e diâmetro hidrodinâmico de complexos de polímero-DNA preparados utilizando diferentes PBAEs com final modificado com oligopeptídeos e plasmídeo pGFP a 50:1 (p/p).
[0130] A Figura 2 mostra análise de electroforese em gel de agarose de PBAEs com final modificado com oligopeptídeos e polímeros de referência complexados com DNA.
[0131] A Figura 3 mostra a capacidade de tamponamento de PBAEs com final modificado com oligopeptídeos e polímeros de referência.
[0132] A Figura 4 mostra a análise de citometria de fluxo da expressão da GFP em a) cos-7, (b) hnDf e (c) células HaCaT transfectadas com diferentes PBAEs com final modificado com oligopeptídeos e um polímero de referência.
[0133] A Figura 5 mostra a viabilidade de células cos-7 transfectadas com PBAEs com final modificado com oligopeptídeos diferentes.
[0134] A Figura 6 apresenta o potencial zeta e diâmetro hidrodinâmico de complexos de siRNA-polímero preparados utilizando diferentes PBAEs com final modificado com oligopeptídeos específicos e siRNA-GFP em proporção de 200: 1 (p/p).
[0135] A Figura 7 mostra a análise de citometria de fluxo de silenciamento da expressão de GFP em células MDA- MB-231/GFP transfectadas com siRNA específico de GFP utilizando PBAEs com final modificado com oligopeptídeos.
[0136] A Figura 8 mostra o grau de encapsulamento de insulina bovina usando ácido glutâmico e PBAEs com final modificado com lisina a uma razão final de polímero:proteína de 200:1 (p/p).
[0137] A invenção é ainda ilustrada pelos exemplos seguintes. Será apreciado que os exemplos são apenas para fins ilustrativos e não se destinam a limitar a invenção tal como descria acima. A modificação de detalhes pode ser feita sem se afastar do escopo da invenção. EXEMPLOS Materiais
[0138] Os reagentes e solventes foram obtidos a partir de Sigma-Aldrich e Panreac e utilizados como recebidos, a menos que indicado de outra forma. O plasmídeo pmaxGFP (3486 bp) foi obtido a partir de Amaxa. As linhagens celulares foram obtidas de ATCC (Manassas, VA) e mantidas a 37°C em 5% de atmosfera de CO2 em DMEM completo contendo 10% de soro fetal bovino, 100 unidades/ml de penicilina, 100 ug/mL de estreptomicina, 0,1 mM de aminoácidos não-essenciais MEM (NEAA), 2 mM de L-glutamina obtidos da Gibco. Exemplo 1: Síntese de polímeros PBAE
[0139] Os poli(β-amino éster)es foram sintetizados seguindo um procedimento em duas etapas, descrito na literatura (por exemplo, em Montserrat, N. et al. J. Biol. Chem. 286, 12417-12428 (2011)). Em primeiro lugar, um polímero terminado em acrilato foi sintetizado por reação de adição de aminas primárias com diacrilatos (em razão molar de1: 1,2 de amina: diacrilato). Finalmente, PBAEs foram obtidos por modificação de substituintes terminais do polímero terminado em acrilato resultante com diferentes tipos de porções de suporte de aminas e tióis. Sintetizado estruturas foram confirmadas por análise de 1H-NMR e FT-IR Os espectros de RMN foram registados em um Varian 400 MHz (RMN Varian Instruments, Claredon Hills, IL) e metanol-d 4 foi utilizado como solvente. Os espectros de IR foram obtidos usando um espectrômetro Nicolet Magna 560 (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA) com um separador de feixe de KBr, utilizando metanol como solvente em filme evaporado. Determinação do peso molecular foi conduzida em um sistema Hewlett-Packard 1050 Series HPLC equipado com duas colunas GPC Ultrastyragel, 103 e 104 Â (5 μm mixed, 300 mm x 19 mm, Waters Millipore Corporation, Milford, MA, USA) e THF como fase móvel. O peso molecular foi calculado por comparação com os tempos de retenção dos padrões de poliestireno. Exemplo 2: Síntese de intermediário terminado com acrilato
[0140] Diacrilato de 1,4-butanodiol (8,96 g, 4,07 x 10 2 mol) e 5-amino-1-pentanol (3,5 g, 3,39 x 10-2 mol) foram misturados em um frasco. A mistura foi agitada a 90°C durante 24 h, e, em seguida, arrefecida até à temperatura ambiente para formar um sólido viscoso ligeiramente amarelo, o intermediário terminado com acrilato (designado C32). Intermediário C32 foi armazenado a 4°C antes de ser utilizado em etapas subsequentes.
Figure img0019
Exemplo 3(comparativo): Síntese de PBAEs com finais modificados com aminas primárias
[0141] PBAEs com finais modificados foram preparados com aminas primárias, tal como definido em Zugates, GT et al. Bioconjugate Chem. 18, 1887-1896 (2007). Uma solução de intermediário C32 (1 g, 0,5 mmol) em THF (2 ml) foi misturada com uma solução de 1,5-diamino-2-metil- pentano (0,24 g, 0,271 mL, 2 mmol) em THF (8 ml ). A mistura foi agitada durante a noite à temperatura ambiente, em seguida, foi precipitada em éter dietílico (100 ml) e finalmente seca em vácuo.
Figure img0020
Exemplo 4 (comparativo ): Síntese adicional de PBAEs de finais modificados com aminas primárias
[0142] O poli(β-amino éster) com final modificado de diamina, B3, foi sintetizado seguindo um procedimento descrito em outro lugar (Zugates, GT et al. Bioconj. Chem. 18 1887-1896 (2007), Yang, F. et al., Proc. Natl Acad. Sci. USA. 107 3317-3322 (2010), Sunshine, J.C. Biomacromolecules 12 3592-3600 (2011)). Resumidamente, 5-amino-1-pentanol (3,44 g, 33 mmol) e diacrilato de 1,4-butanodiol (7,93 g, 40 mmol) foram polimerizados sob agitação magnética a 90°C durante 24 horas. O polímero C32 resultante terminado em acrilato (1 g, 0,4 mmol) e 2-metil-1,5-pentanodiamina (0,23 g, 0,27 mL, 2 mmol) foram dissolvidos em tetra-hidrofurano e agitados durante a noite à temperatura ambiente. O polímero de final modificado de diamina resultante B3 foi isolado por precipitação em éter dietílico e secos sob vácuo. IR (filme evaporado): n = 1055, 1089, 1125, 1196 (CO), 1257, 1463, 1733 (C=O), 2079, 2191, 2253, 2861, 2936, 3398 (N-H, O-H) cm-1 1H-NMR (400 MHz, CD3OD, TMS) (ppm): δ = 4,11 (t, CH2- CH2-O), 3,72 (t), 3,55 (t, CH2-CH2-OH), 2,87 (t, -NH-CH2- CH2-C(=O)-), 2,77 (t, CH2-CH2-N-), 2,60-2,51 (br, -NH-CH2- (CH2) 2-CH(CH3)-NH-), 2,46 (br, >N-CH2-(CH2) 4-OH, >N-CH2-CH2- C(=O)-O), 1,87 (br), 1,73 (br), 1,60-1,41 (br, -O-CH2-CH2- CH2-CH2-O, -CH2-CH2-OH, -CH2-CH2-NH2), 1,35 (br, -N-CH2-CH2- CH2-(CH2) 2-OH), 0,94 (d, CH3-CH< de diamina). Exemplo 5: Síntese de PBAEs de final modificado com oligopeptídeos
[0143] Em geral, PBAEs modificados com oligopeptídeos foram obtidos como se segue: polímero C32 or C32SS terminado em acrilato e ou oligopeptídeo terminado em tiol ou amina (por exemplo, HS-Cys-Arg-Arg-Arg (CR3), H2N- Arg-Arg-Arg (R3) ou HS-Cys-Glu-Glu-Glu (CE3) - outros oligopeptídeos são indicados por abreviaturas semelhantes utilizando o código de uma letra padrão) foram misturados em uma proporção molar de 1:2 em DMSO. A mistura foi agitada durante a noite à temperatura ambiente e o polímero resultante foi obtido por precipitação em éter dietílico: acetona (3: 1). (a) O procedimento de síntese que se segue para obter PBAEs com finais modificados de tri-arginina é mostrado como um exemplo: Intermediário C32 foi preparado como descrito no Exemplo 1 acima. Uma solução de C32 intermediário (0,15 g, 0,075 mmol) em DMSO (2 ml) foi misturada com a solução correspondente de oligopeptídeo (Cys-Arg-Arg-Arg (CR3; 0,11 g, 0,15 mmol) em DMSO (1 mL) em uuma proporção molar adequada de 1:2 , respectivamente. A mistura foi agitada durante a noite à temperatura ambiente, em seguida, foi precipitada em éter dietílico/acetona (3:1).
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IR (filme evaporado): n = 721, 801, 834, 951, 1029, 1133 (C-O), 1201, 1421, 1466, 1542, 1672 (C=O, de peptídeo amina), 1731 (C=O, de éster), 2858, 2941, 3182, 3343 (N-H, O-H) cm-1 1H-NMR (400 MHz, CD3OD, TMS) (ppm): δ = 4,41-4,33 (br, NH2-C(=O)-CH-NH-C(=O)-CH-NH-C(=O)-CH-NH-C(=O)-CH-CH2-, 4, 11 (t, CH2-CH2-O), 3,55 (t, CH2-CH2-OH), 3,22 (br, NH2-C(=NH)- NH-CH2-, OH-(CH2) 4-CH2-N-), 3,04 (t, CH2-CH2-N-), 2,82 (dd, - CH2-S-CH2), 2,48 (br, -N-CH2-CH2-C(=O)-O), 1,90 (m, NH2- C(=NH)-NH-(CH2) 2-CH2-CH-), 1,73 (br, -O-CH2-CH2-CH2-CH2-O), 1,69 (m, NH2-C(=NH)-NH-CH2-CH2-CH2-), 1,56 (br, -CH2-CH2-CH2- CH2-OH), 1,39 (br, -N-(CH2) 2-CH2-(CH2) 2-OH). (b) oligopeptídeos Tri-lisina modificados (K3C-C32- CK3) foram preparados de acordo com o mesmo protocol e caracterizados como se segue: IR (filme evaporado): n = 721, 799, 834, 1040, 1132, 1179 (C-O), 1201, 1397, 1459, 1541, 1675 (C=O, de peptídeo amida), 1732 (C=O, de éster), 2861, 2940, 3348 (N-H, O-H) cm-1 1H-NMR (400 MHz, CD3OD, TMS) (ppm): δ = 4,38-4,29 (br, NH2-(CH2) 4-CH-), 4,13 (t, CH2-CH2-O-),3,73 (br,NH2-CH-CH2-S- ), 3,55 (t, CH2-CH2-OH), 2,94 (br, CH2-CH2-N-, NH2-CH2- (CH2)3-CH-), 2,81 (dd, -CH2-S-CH2), 2,57 (br, -N-CH2-CH2- C(=O)-O), 1,85 (m, NH2-(CH2) 3-CH2-CH-), 1,74 (br, -O-CH2- CH2-CH2-CH2-O), 1,68 (m, NH2-CH2-CH2-(CH2) 2—CH-), 1,54 (br, -CH2-CH2-CH2-CH2-OH), 1,37 (br, -N-(CH2) 2-CH2-(CH2) 2-OH). (c) oligopeptídeos modificados Tri-histidina (H3C-C32- CH3) foram preparados de acordo com o mesmo protocolo e caracterizados como se segue: IR (filme evaporado): n = 720, 799, 832, 1040, 1132, 1201, 1335, 1403, 1467, 1539, 1674 (C=O, a partir de peptídeo amida), 1731 (C=O, de éster), 2865, 2941, 3336 (N- H, O-H) cm-1 1H-NMR (400 MHz, CD3OD, TMS) (ppm): δ = 8,0-7,0 (br - N(=CH)-NH-C(=CH)-) 4,61-4,36 (br, -CH2-CH-), 4,16 (t, CH2- CH2-O-), 3,55 (t, CH2-CH2-OH), 3,18 (t, CH2-CH2-N-, 3,06 (dd, —CH2 — CH—), 2,88 (br, OH— (CH2) 4 — CH2—N—), 2,82 (dd, —CH2 — S-CH2-), 2,72 (br, -N-CH2-CH2-C(=O)-O), 1,75 (br, -O-CH2- CH2-CH2-CH2-O), 1,65 (m, NH2-CH2-CH2-(CH2) 2 -CH-), 1,58 (br, -CH2-CH2-CH2-CH2-OH), 1,40 (br, -N-(CH2) 2-CH2-(CH2) 2-OH). Exemplo 6: Síntese de PBAEs com modificações finais assimétricas
[0144] Em geral, PBAEs modificados com oligopeptídeos assimétricos foram obtidos como se segue: Polímero C32 terminado em acrilato (ou C32SS) e ou oligopeptídeo terminado com tiol ou amina (por exemplo, CR3, R3 ou CE3) foram misturados a razão molar 1: 1 em DMSO. A mistura foi agitada durante a noite à temperatura ambiente. Quantidade equimolar de um segundo oligopeptídeo terminado em amina ou tiol, ou de uma amina primária, foi adicionada e a mistura foi agitada durante a noite à temperatura ambiente. Os polímeros PBAE assimétricos resultantes foram obtidos por precipitação em éter dietílico/acetona (3:1).
[0145] O procedimento de síntese que se segue para se obter B3-C32-CR3 PBAEs de final modifico assimétrico é mostrado como um exemplo: uma solução de intermediário C32 (0,15 g, 0,075 mmol) em DMSO (2 mL) foi misturada com a solução correspondente de oligopeptídeo Cys-Arg-Arg-Arg (CR3; 0,055 g, 0,075 mmol) em DMSO (1 ml) e foi agitada durante a noite à temperatura ambiente. Subsequentemente, 2-metil-1,5-pentanodiamina (0,017 g, 0,02 ml, 0,15 mmol) foi adicionado na mistura durante 4 h à temperatura ambiente em DMSO. Uma mistura de polímero B3-C32-CR3 de final modificado assimétrico com B3-C32-B3 e R3C-C32-CR3 foi obtida por precipitação durante a noite em éter dietílico/acetona (3:1). A mistura pode ser utilizada sem purificação adicional ou polímero B3-C32-CR3 com final modificado assimétrico podem ser separados da mistura através de métodos convencionais.
Figure img0022
Exemplo 7 : Biblioteca de compostos
[0146] Uma biblioteca de diferentes PBAEs com finais modificados com oligopeptídeos foi sintetizada por adição de aminas primárias a diacrilatos seguido por modificação do final. De acordo com a Fórmula I, os PBAEs de final modificado com oligopeptídeo mostrados na Tabela 1 foram sintetizados. Tabela 1: Biblioteca de PBAEs de final modificado com oligopeptídeo
Figure img0023
Figure img0024
Exemplo 8: A formação e caracterização de complexos de DNA-polímero
[0147] Soluções de reserva de todos os polímeros foram preparadas em DMSO (100mg/ml). Estas soluções de polímero foram diluídas (25 mM de tampão de acetato de pH 5,0) na concentração adequada para se obter o polímero de DNA na proporção desejada (p/p). Em seguida, 100μl de polímero diluído foi adicionado a 100 μl de DNA de plasmídeo (60g/mL em tampão de acetato 25 mM pH 5,0), misturou-se com vortex vigorosamente durante alguns segundos e depois incubou-se em estufa a 37°C durante 30 min. As nanopartículas resultantes foram diluídas em solução salina tamponada com fosfato para a caracterização de nanopartículas. Os complexos de DNA-polímero foram caracterizados em termos de tamanho e potencial zeta usando espalhamento dinâmico de luz (Zetasizer zs90 nano, Malvern Instruments). Os resultados são mostrados na figura 1.
[0148] As nanopartículas foram também caracterizadas por eletroforese em gel de agarose. Para avaliar o retardo de plasmídeo, os complexos de PBAE-DNA contendo 0,48 μg de pGFP em diferentes proporções de p/p foram adicionados a poços de gel de agarose (0,8%, contendo 1 μg/mL de brometo de etídio). As amostras foram executadas em 60 V para 45 min (Apelex PS 305, França) para resolver o retardo do plasmídeo e visualizadas por iluminação UV. Os resultados são mostrados na figura 2. Exemplo 9 : Efeito de esponja de prótons
[0149] O efeito de esponja de prótons é um fenômeno que tem sido mostrado para facilitar a fuga endossomal, e é mediado por polímeros com elevada capacidade de tamponamento, resultando num aumento da eficiência da transfecção (Varkouhi, A.K. et al, J. Control. Rel. 151 220-228 (2011).). Em geral, os polímeros possuindo aminas terciárias na sua estrutura mostram um efeito de tamponamento no intervalo de pH endossomal entre 5,0 e 7,5, o que provoca um aumento na pressão osmótica que resulta na ruptura do endossoma Behr, Chimia J. 2 34-36 (1997)). De acordo com o efeito de esponja de prótons, a capacidade de tamponamento dos poli (β-amino éster)es recentemente sintetizados foi determinado por titulação ácidz de soluções de polímero (Figura 2).
[0150] A capacidade de tampão de polímeros foi determinada por titulação ácido-base. Resumidamente, os polímeros foram dissolvidos, a uma concentração final de 1 mg/mL em uma solução aquosa de cloreto de sódio (150 mM). A solução de polímero resultante foi ajustada a pH 10 com hidróxido de sódio. A curva de titulação foi determinada pela adição gradual de alíquotas de 10 μL de ácido clorídrico (0,1 M). O pH foi medido após cada adição com um medidor de pH (Crison básica 20+, Crison Instruments) até o pH 2 ser alcançado. Uma solução que não contém polímero foi titulada como um controle. Os resultados são mostrados na figura 3.
[0151] Em primeiro lugar, o efeito de tamponamento de poli (β-amino éster) B3 foi determinado, o que mostra a capacidade de tamponamento adequada para baixo para pH 5,8. A capacidade de tamponamento mais elevada foi observada com poli(β-amino éster) terminado com histidina, o qual demonstrou um tamponamento elevado no intervalo de pH entre 7,5 e 5,3. Os poli (β-amino éster)es modificado por lisina apresentaram capacidade tampão adequada até pH 5,9. Em contraste, terminais de poli(β-amino éster)es tampados com oligopeptídeos de arginina mostraram apenas capacidade limitada de tamponamento no intervalo entre 7,4 e 6,4. Uma vez que todos os polímeros derivam do mesmo C32 pré- polímero terminado em acrilato, a capacidade de tamponamento adicional observada resultou das terminações ricas em amina. Exemplo 10: Eficácia de transfecção
[0152] A eficácia de transfecção dos polímeros da presente invenção e polímeros conhecidos foi comparada através da avaliação da eficiência de entrega de uma proteína fluorescente verde que codifica plasmídeo (pGFP) para as células.
[0153] Transfecção celular com o plasmídeo pGFP: Transfecção celular foi realizada usando plasmídeo pGFP em HaCaT, hnDf, COS-7, A549 e células HeLa. Estas linhagens celulares foram obtidas de ATCC (Manassas, VA) e mantidas em DMEM completo contendo 10% de soro fetal bovino, 100 unidades/ml de penicilina, 100 μg/mL de estreptomicina, 0,1 mM de aminoácidos não essenciais MEM (NEAA), 2 mM de L- glutamina, a 37°C em atmosfera de 5% de CO2.
[0154] As células foram semeadas em placas de 96 poços a 10.000 células/poço e incubadas durante a noite a cerca de 80-90% de confluência, antes de realizar as experiências de transfecção. Complexos de DNA-polímero foram preparados tal como descrito acima, utilizando o plasmídeo pGFP a uma razão polímero:plasmídeo de 50: 1. Poliplexos foram diluídos em meio isento de soro e adicionados às células a uma concentração de plasmídeo final de 0,6 μg pGFP/poço. As células foram incubadas durante 3 h a 37°C em atmosfera de 5% CO2 Subsequentemente, as células foram lavadas uma vez com PBS e adicionou-se DMEM completo. Depois de 48h, as células foram colhidas e analisadas para a expressão de GFP por citometria de fluxo. Expressão da GFP foi comparada com um controle negativo (células não tratadas) e GeneJuice® (Merck KGaA, Alemanha) e B3-C32-B3 como um controle positivo. Os resultados são mostrados na Figura 4a-c, em que R/H, K/H e R/K representam misturas de 1:1 (p/p) de R3C-C32-CR3, K3C-C32-CK3 ou H3C- C32-CH3 PBAEs. Exemplo 11: Citotoxicidade
[0155] O ensaio MTS (CellTiter 96® Aqueous One Solution celular Ensaio de Proliferação, Promega Corporation, EUA) foi utilizado para avaliar a viabilidade de células COS-7 transfectadas com os polímeros descritos no presente pedido. A viabilidade celular foi avaliada 48 horas após a transfecção utilizando o ensaio de MTS com as instruções do fabricante. Resumidamente, as células foram transfectadas com pGFP por um método semelhante ao do exemplo 5. 48h após a transfecção, o meio foi removido, as células foram lavadas com PBS e meio completo suplementado com MTS (20% v/v) foi adicionado. As células foram incubadas a 37°C e a absorbância foi medida a 490 nm utilizando um leitor de microplacas. A viabilidade celular foi expressa como percentagem relativa em comparação com células não tratadas. Os resultados são mostrados na Figura 5, em que R/H, K/H e R/K representam misturas 1: 1 (p/p) de R3C-C32-CR3, K3C-C32-CK3 ou H3C-C32-CH3 PBAEs. Exemplo 12 Ensaio de silenciamento do gene
[0156] A eficiência de transferência por siRNA de polímeros da presente invenção foi avaliada utilizando siRNA específico de GFP na linhagem celular estável repórter GFP.
[0157] Preparação de complexos de siRNA-polímero: As soluções estoque de polímeros foram preparadas em DMSO (100 mg/mL). Estas soluções de polímero foram diluídas (pH 25 mM de acetato de 5,0) a uma concentração adequada para se obter a proporção desejada de polímero-siRNA (p/p). Em seguida, 100 μl de polímero apropriadamente diluído foi adicionado 100 μl de siRNA específico de GFP (10 μg/mL em tampão de acetato 25 mM, pH 5,0; ThermoScientific Dharmacon GFP Duplex I), misturado com vortex vigorosamente durante alguns segundos e depois incubado a 37°C durante 30 min. Os complexos resultantes foram diluídos em solução salina tamponada com fosfato para a caracterização de nanopartículas. Complexos de polímero e siRNA foram caracterizados em termos de tamanho e potencial zeta usando espalhamento dinâmico de luz (Zetasizer zs90 nano, Malvern Instruments). Os resultados são mostrados na Figura 6, em que K/H e K/R representam misturas 60:40 (p/p) de R3C-C32- CR3, K3C-C32-CK3 ou H3C-C32-CH3 PBAEs. K/E e K/D representam misturas 70:30 (p/p) de K3C-C32-CK3 e D3C-C32- CD3 ou E3C-C32-CE3 PBAEs.
[0158] Transfecção celular com siRNA específico de GFP: Transfecção celular foi realizada utilizando siRNA específico deGFP em células MDA-MB-231/GFP (Cell Biolabs Inc.). As células foram mantidas em DMEM completo contendo 10% de soro fetal bovino, 100 unidades/ml de penicilina, 100 μg/mL de estreptomicina, a 37°C em atmosfera 5% CO2.
[0159] Resumidamente, as células foram semeadas em placas de 96 poços a 10.000 células/poço e incubadas durante a noite a cerca de 80-90% de confluência, antes de realizar as experiências de transfecção. Complexos de polímero e de siRNA foram preparados como descrito acima, utilizando siRNA específica do GFP a uma razão polímero:RNAsi de 200:1. Poliplexos foram diluídos em meio isento de soro e adicionados às células a uma concentração de plasmídeo final de 50 nM de RNAsi/poço. As células foram incubadas durante 3 h a 37°C em atmosfera de 5% CO2 Subsequentemente, as células foram lavadas uma vez com PBS e adicionou-se DMEM completo. Depois de 48h, as células foram colhidas e analisadas para silenciamento GFP por citometria de fluxo. O silenciamento de expressão da GFP foi comparado com um controle negativo (células não tratadas) e INTERFERinTM (Polyplus TransfectionTM) e B3 como controles positivos. Os resultados são mostrados na Figura 7, em que R/H, K/H e R/K representam misturas 1: 1 (p/p) de R3C-C32-CR3, K3C-C32-CK3 ou H3C-C32-CH3 PBAEs, e SS(R/H), SS(K/H) e SS(R/K) representam misturas 1:1 (p/p) de R3C-C32SS-CR3, K3C-C32SS-CK3 ou PBAEs H3C-C32SS-CH3. Exemplo 13: A encapsulação de insulina bovina usando ácido glutâmico e de PBAEs modificados no final com lisina
[0160] A eficiência de encapsulação de polímeros da presente invenção foi avaliada utilizando insulina de bovino (Sigma Aldrich). Resumidamente, PBAEs E3C-C32-CE3 de final modificado com ácido glutâmico (16,7 μL em 60 mg/mL) foi adicionado a uma solução de insulina bovina (1 mL em 0,01 mg/mL em tampão HEPES, 100 mM e pH 7,2) seguido por PBAEs K3C-C32-CK3 de final modificado com lisina (10 μL em 100 mg/mL) para atingir uma última razão de polímero: proteína de 1: 200. A mistura foi incubada durante 30 min à temperatura ambiente. As nanopartículas resultantes foram centrifugadas usando um dispositivo Centricon (10kDa de corte, Merck Millipore), a fim de separar as nanopartículas contendo insulina a partir de insulina não encapsulada. O grau de encapsulação foi calculado pela determinação da insulina não encapsulada utilizando o ensaio do ácido bicinconínico (reagente de ensaio de proteína BCA, ThermoScientific) e comparação com a solução original da insulina. Os resultados são mostrados na Figura 8, em que NP1 e NP2 são duplicados independentes.

Claims (23)

1. Polímero caracterizado pelo fato de que tem a fórmula I:
Figure img0025
em que cada L1 e L2 é independentemente selecionado a partir do grupo que consiste de:
Figure img0026
e uma ligação; em que RX é selecionado independentemente a partir do grupo que consiste em hidrogênio, halogênio, alquila, cicloalquila, alquenila, cicloalquenila, heteroalquila, heterocicloalquila, acila, aril ou heteroaril; L3 é selecionado independentemente a partir do grupo que consiste em alquileno, alquenileno, heteroalquileno, heteroalquenileno, arileno ou heteroarileno; L4 é selecionado do grupo consistindo de:
Figure img0027
L5 é independentemente selecionado a partir do grupo que consiste em alquileno, alquenileno, heteroalquileno, heteroalquenileno, arileno ou heteroarileno; R1 e R2 são independentemente selecionados de um oligopeptídeo e RY; em que pelo menos um de R1 e R2 é um oligopeptídeo; em que o ou cada oligopeptídeo tem uma carga global positiva em pH 7; ou em que o ou cada oligopeptídeo compreende uma mistura de aminoácidos de ocorrência natural que são negativamente carregados em pH 7 e aminoácidos de ocorrência natural que são positivamente carregados em pH 7; e em que RY é selecionado a partir do grupo que consiste em hidrogênio, halogênio, alquila, cicloalquila, alquenila, cicloalquenila, heteroalquila, heterocicloalquila, acila, aril ou heteroaril; cada R3 é selecionado independentemente dentre o grupo que consiste em hidrogênio, halogênio, alquila, cicloalquila, alquenila, alquinila C2-6, hidroxila , ciano, tiol, cicloalquenila, heteroalquila, heterocicloalquila, acial, arila ou heteroarila; e n é um número inteiro de 5 a 10.000; ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo.
2. Polímero, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o ou cada oligopeptídeo compreende resíduos de aminoácidos selecionados a partir do grupo que consiste em lisina e arginina; ou em que o ou cada oligopeptídeo compreende uma mistura de aminoácidos de ocorrência natural que são negativamente carregados em pH 7 e aminoácidos de ocorrência natural que são positivamente carregados em pH 7.
3. Polímero, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que o ou cada oligopeptídeo compreende de 3 a 20 resíduos de aminoácidos.
4. Polímero, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizado pelo fato de que o ou cada oligopeptídeo tem uma carga global positiva em pH 7.
5. Polímero, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que o ou cada oligopeptídeo compreende resíduos de aminoácidos selecionados a partir do grupo que consiste em lisina, arginina e histidina.
6. Polímero, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, caracterizado pelo fato de que o ou cada oligopeptídeo é um composto de Fórmula VII:
Figure img0028
em que p é um número inteiro de 2 a 19 e em que Ra é selecionado em cada ocorrência a partir do grupo consistindo de H2NC(=NH)-NH(CH2)3-, H2N(CH2)4- ou (1H- imidazol-4-il)-CH2-.
7. Polímero, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, caracterizado pelo fato de que R1 e R2 são ambos oligopeptídeos.
8. Polímero, de acordo com a reivindicação 7, caracterizado pelo fato de que R1 e R2 são oligopeptídeos diferentes.
9. Polímero, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7, caracterizado pelo fato de que um de R1 e R2 é um oligopeptídeo e um de R1 e R2 é Ry.
10. Polímero, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 9, caracterizado pelo fato de que n é de 5 a 20.
11. Polímero, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 10, caracterizado pelo fato de que RY é selecionado dentre um grupo que consiste em hidrogênio, - (CH2)mNH2, -(CH2)mNHMe, -(CH2)mOH, -(CH2)mCH3, - (CH2)2(OCH2CH2)mNH2, -(CH2)2(OCH2CH2)mOH ou -(CH2)2(OCH2CH2)mCH3 em que m é um número inteiro de 1 a 20.
12. Polímero, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 11, caracterizado pelo fato de que cada L3 é selecionado independentemente a partir do grupo que consiste em -Ci-ioalquileno-(S-S) q-Ci-ioalquileno-, em que q é 0 ou 1.
13. Polímero, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 12, caracterizado pelo fato de que cada R3 é selecionado independentemente dentre hidrogênio, Ci-6 alquila, C2-6 alquenila, C2-6 alquinila, Ci-6 hidroxialquila, hidroxila, Ci-6 alcóxi, halogênio, arila, heterocicloalquila, heteroarila, ciano, -O2C-Ci-6alquila, carbamoila, -CO2H, -CO2-Ci-6 alquila, Ci-6 alquiltioéter, tiol, ou ureído.
14. Nanopartícula caracterizada pelo fato de que compreende: a) um polímero de acordo com a fórmula I, conforme definido na reivindicação 1
Figure img0029
em que cada L1 e L2 é independentemente selecionado a partir do grupo que consiste de:
Figure img0030
, O, S, NRX e uma ligação; em que RX é selecionado independentemente a partir do grupo que consiste em hidrogênio, halogênio, alquila, cicloalquila, alquenila, cicloalquenila, heteroalquila, heterocicloalquila, acila, aril ou heteroaril; L3 é selecionado independentemente a partir do grupo que consiste em alquileno, alquenileno, heteroalquileno, heteroalquenileno, arileno ou heteroarileno; L4 é selecionado do grupo consistindo de:
Figure img0031
L5 é independentemente selecionado a partir do grupo que consiste em alquileno, alquenileno, heteroalquileno, heteroalquenileno, arileno ou heteroarileno; R1 e R2 são independentemente selecionados de um oligopeptídeo e RY; em que pelo menos um de R1 e R2 é um oligopeptídeo; em que o ou cada oligopeptídeo tem uma carga global positiva em pH 7; e em que RY é selecionado a partir do grupo que consiste em hidrogênio, halogênio, alquila, cicloalquila, alquenila, cicloalquenila, heteroalquila, heterocicloalquila, acila, aril ou heteroaril; cada R3 é selecionado independentemente dentre o grupo que consiste em hidrogênio, halogênio, alquila, cicloalquila, alquenila, cicloalquenila, heteroalquila, heterocicloalquila, acila, aril ou heteroaril; e n é um número inteiro de 5 a 10.000; ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo; e b) um polímero de acordo com a fórmula I, conforme definido na reivindicação 1
Figure img0032
em que cada L1 e L2 é independentemente selecionado a partir do grupo que consiste em:
Figure img0033
e uma ligação; em que RX é selecionado independentemente a partir do grupo que consiste em hidrogênio, halogênio, alquila, cicloalquila, alquenila, cicloalquenila, heteroalquila, heterocicloalquila, acila, aril ou heteroaril; L3 é selecionado independentemente a partir do grupo que consiste em alquileno, alquenileno, heteroalquileno, heteroalquenileno, arileno ou heteroarileno; L4 é selecionado do grupo consistindo de:
Figure img0034
L5 é independentemente selecionado a partir do grupo que consiste em alquileno, alquenileno, heteroalquileno, heteroalquenileno, arileno ou heteroarileno; R1 e R2 são independentemente selecionados de um oligopeptídeo e RY; em que pelo menos um de R1 e R2 é um oligopeptídeo; em que o ou cada oligopeptídeo tem uma carga global negativa em pH 7; e em que RY é selecionado a partir do grupo que consiste em hidrogênio, halogênio, alquila, cicloalquila, alquenila, cicloalquenila, heteroalquila, heterocicloalquila, acila, aril ou heteroaril; cada R3 é selecionado independentemente dentre o grupo que consiste em hidrogênio, halogênio, alquila, cicloalquila, alquenila, cicloalquenila, heteroalquila, heterocicloalquila, acila, aril ou heteroaril; e n é um número inteiro de 5 a 10.000; ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo.
15. Nanopartícula, de acordo com a reivindicação 14, caracterizada pelo fato de que compreende um agente ativo.
16. Composição caracterizada pelo fato de que compreende um agente ativo e um polímero conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 13, ou uma composição compreendendo uma nanopartícula conforme definida na reivindicação 15.
17. Composição, de acordo com a reivindicação 16, caracterizada pelo fato de que o agente ativo é um polinucleotídeo.
18. Composição, de acordo com a reivindicação 16, caracterizada pelo fato de que o polinucleotídeo é um RNA, DNA ou um siRNA.
19. Composição, de acordo com qualquer uma das reivindicações 17 ou 18, caracterizada pelo fato de que a composição compreende nanopartículas contendo o polinucleotídeo e o polímero.
20. Método de encapsulamento de um agente em uma matriz de polímeros conforme definidos em qualquer uma das reivindicações 1 a 13 para formar nanopartículas caracterizado pelo fato de que compreende as etapas de: proporcionar um agente; proporcionar o polímero; e por em contato o agente e o polímero sob condições adequadas para formar nanopartículas.
21. Método, de acordo com a reivindicação 20, caracterizado pelo fato de que o agente é um polinucleotídeo selecionado a partir de DNA, RNA, siRNA, uma molécula pequena ou uma proteína.
22. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 20 ou 21, caracterizado pelo fato de que a etapa de por em contato compreende: (a) secar por pulverização uma mistura do agente e do polímero, (b) técnicas de evaporação de solvente de dupla emulsão ou (c) uma técnica de inversão de fase.
23. Uso de um polímero conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 13, de uma nanopartícula conforme definida em qualquer uma das reivindicações 14 ou 15, ou de uma composição conforme definida em qualquer uma das reivindicações 16 a 18, caracterizado pelo fato de que é para a preparação de uma composição farmacêutica para tratar diabetes.
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