CN105324120B - 用于药物递送的修饰的聚(β-氨基酯) - Google Patents

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Abstract

本发明公开的是聚合物，所述聚合物是用至少一种寡肽修饰的聚(β‑氨基酯)(PBAE)。所述聚合物可以用于聚合物被发现是有用的任意领域，包括用于医药领域，特别是用于药物递送。所述聚合物特别是用于递送多核苷酸如DNA、RNA和siRNA，小分子或蛋白质。还公开的是包含所述聚合物和活性剂的组合物，将试剂包封入所述聚合物基质中的方法，以及所述聚合物和组合物用于药物。

Description

用于药物递送的修饰的聚(β-氨基酯)
本发明涉及适于用于活性剂的递送的聚合物。本发明还涉及包含这些聚合物的纳米颗粒和它们的制备方法。
缺乏递送多核苷酸如DNA和RNA的安全和有效率的载体仍是基因治疗成功的主要障碍(Luo，D.&Saltzman，W.M.Synthetic DNA dilivery systems.Nature Biotech.18，33-37(2000)；Kamimura K.等人，Advances in Gene Delivery Systems.Pharmaceut.Med.25，293-306(2011)；Miele E.等人，Nanoparticle-based delivery of small interferingRNA：challenges for cancer therapy.Int.J.Nanomedicine 7，3637-3657(2012))。大多数用于多核苷酸递送的方案使用病毒载体，其是高度有效率的递送系统。然而，病毒载体具有某些劣势，包括安全风险、有限的携带多核苷酸的容量和大规模生产的高成本。非病毒载体提供潜在的优势，包括高包装容量、容易生产、低毒性和免疫原性，但没有病毒载体有效率(Mintzer，M.A.&Simanek，E.E.Nonviral vectors for gene delivery.Chem.Rev.109，259-302(2009))。
已经描述了可生物降解的聚(β-氨基酯)(PBAE)作为潜在的非病毒多核苷酸递送载体，其能够将DNA和RNA二者浓缩在分离的纳米颗粒中(Green，J.J.等人Acc.ChemRes.41，749-759(2008))。用伯胺在PBAE的末端进行化学修饰(参见方案1)已经显示产生比商用转染剂如Lipofectamine 2000，Fugene和聚乙烯亚胺(PEI)高的转染效率(Zugates，G.T.等人Bioconjugate Chem.18，1887-1896(2007)；Green，J.J.等人Nano letters 8，3126-3130(2008)；WO02/31025A2)。
Figure GDA0001749553540000021
持续需要改善的无毒、可生物降解的、生物相容的、可以用于有效转染多核苷酸的、并且可以经济地制备的聚合物。这样的聚合物将用于在基因治疗中包装和递送DNA和RNA和用于包装和递送其它诊断、治疗和预防试剂。
尤其是，存在对可以用于有效转染在循环中具有差的稳定性的短多核苷酸，特别是siRNA和microRNA(miRNA)的聚合物的需求。已有的聚合多核苷酸递送载体不能以高载量包封siRNA和miRNA，原因是这些序列长度较短。此外，很多已有的用于siRNA和miRNA的聚合递送载体有细胞毒性。
本发明提供新型的末端修饰的PBAE，其可用于多种医药应用，包括药物递送，特别是用于递送多核苷酸；组织改造和生物材料。本发明特别涉及PBAE的医药应用。本发明还提供本发明的末端修饰的聚合物与多核苷酸的复合物，包括本发明的聚合物的药物递送装置(例如，微粒，纳米颗粒)，制备末端修饰的聚合物的方法，和使用本发明的末端修饰的聚合物的方法。
这些系统的聚酯性质由于其高的可生物降解性和降低的毒性，导致引人注目的生物相容属性。因此，这些聚合物作为非病毒多核苷酸递送载体在很多疾病如癌症、单成因疾病(monogenetic diseases)、血管疾病和感染性疾病的治疗中具有应用。这些多核苷酸递送载体的另一种应用是在体外研究中作为工具以研究基因功能或细胞和生理背景下的调节。
在第一个方面，本发明提供式I的聚合物：
Figure GDA0001749553540000022
其中
L1和L2独立地选自由以下各项组成的组：
Figure GDA0001749553540000031
O、S、NRx和键；其中Rx独立地选自由以下各项组成的组：氢、卤素、烷基、环烷基、烯基、环烯基、杂烷基、杂环烷基、酰基、芳基或杂芳基；
L3独立地选自由以下各项组成的组：亚烷基、亚烯基、杂亚烷基、杂亚烯基、亚芳基或杂亚芳基；
L4独立地选自由以下各项组成的组：
Figure GDA0001749553540000032
L5独立地选自由以下各项组成的组：亚烷基、亚烯基、杂亚烷基、杂亚烯基、亚芳基或杂亚芳基；
R1和R2独立地选自寡肽和Ry；
其中R1和R2中的至少一个是寡肽；
并且其中Ry选自由以下各项组成的组：氢、卤素、烷基、环烷基、烯基、环烯基、杂烷基、杂环烷基、酰基，芳基或杂芳基；
各个R3独立地选自由以下各项组成的组：氢、卤素、烷基、环烷基、烯基、环烯基、杂烷基、杂环烷基、酰基、芳基或杂芳基；和
n是5至10,000的整数；
或其药用盐。
在第二个方面，本发明提供式I的聚合物，其中
L1和L2独立地选自由以下各项组成的组：
Figure GDA0001749553540000041
O、S、NRx和键；其中Rx独立地选自由以下各项组成的组：氢、卤素、烷基、环烷基、烯基、环烯基、杂烷基、杂环烷基、酰基、芳基或杂芳基；
L3的至少一次出现是
Figure GDA0001749553540000042
其中T1是
Figure GDA0001749553540000043
并且T2选自H、烷基或
Figure GDA0001749553540000044
其中LT独立地选自由以下各项组成的组：
Figure GDA0001749553540000045
O、S、NRx和键；其中Rx独立地选自由以下各项组成的组：氢、卤素、烷基、环烷基、烯基、环烯基、杂烷基、杂环烷基、酰基、芳基或杂芳基；
其余的L3基团在每次出现时独立地选自由以下各项组成的组：亚烷基、亚烯基、杂亚烷基、杂亚烯基、亚芳基或杂亚芳基，其中
L4独立地选自由以下各项组成的组：
Figure GDA0001749553540000051
L5独立地选自由以下各项组成的组：亚烷基，亚烯基，杂亚烷基，杂亚烯基，亚芳基或杂亚芳基；
R1、R2和RT独立地选自寡肽和Ry；
其中R1、R2和RT中的至少一个是寡肽；
并且其中Ry选自由以下各项组成的组：氢、卤素、烷基、环烷基、烯基、环烯基、杂烷基、杂环烷基、酰基、芳基或杂芳基；
各个R3独立地选自由以下各项组成的组：氢、卤素、烷基、环烷基、烯基、环烯基、杂烷基、杂环烷基、酰基、芳基或杂芳基；并且
n是5至10,000的整数；
或其药用盐。
本发明因此提供末端被至少一种寡肽修饰的PBAE。这些PBAE用作多核苷酸的优良的浓缩剂和/或用作靶向配体以增强细胞摄取和转染效率。这些聚合物具有能够改善多核苷酸向细胞的递送的可生物降解的基团并且与已知的PBAE和商用转染剂相比在体外显示出高的转染效率和降低的细胞毒性。
式I的聚合物可以通过将式II的二丙烯酸酯单体与式L4H2的取代的胺反应以形成丙烯酸酯封端的中间体式III来制备。
Figure GDA0001749553540000052
随后，可以通过与末端丙烯酸酯基团的反应来添加基团R1L1和R2L2以形成式I的聚合物。
Figure GDA0001749553540000061
在根据本发明的聚合物中，选择各个L1和L2(并且，在第二个方面中，LT)以促进末端修饰基团R1和R2与PBAE聚合物的偶联。例如在末端修饰基团是包含末端半胱氨酸残基的寡肽的情况下，各个L1和L2(并且，在第二个方面，LT)可以是键。
在本发明的第二个方面中，选择LT以促进末端修饰基团RT与PBAE聚合物的偶联。例如在末端修饰基团是包含末端半胱氨酸残基的寡肽的情况下，LT可以是键。
在根据本发明的聚合物中，Rx可以独立地选自由以下各项组成的组：氢、烷基、环烷基、烯基、环烯基、杂烷基和杂环烷基，例如，选自由以下各项组成的组：氢、烷基和环烷基。
根据本发明，“寡肽”包括通过肽键连接在一起的至少三个氨基酸的链。这种肽优选仅包含天然氨基酸，但是可以备选地使用本领域已知的非天然氨基酸(即，不天然存在但可以并入多肽链中的化合物)和/或氨基酸类似物。此外，这种肽中的一个以上氨基酸可以例如，通过添加化学实体如碳水化合物基团、磷酸基、法呢基(farnesyl)、异法呢基(isofarnesyl)、脂肪酸基、或用于缀合、官能化、或其它修饰的接头等来修饰。本发明的聚合物中的寡肽通常包含3至20个氨基酸残基，更优选3至10个氨基酸残基，更优选3至6个氨基酸残基。备选地，本发明的聚合物中的寡肽可以包含4至20个氨基酸残基，更优选4至10个氨基酸残基，更优选4至6个氨基酸残基。
本发明还提供式I的聚合物，其中所述寡肽或各个寡肽在pH7具有净正电荷。所述寡肽或各个寡肽可以包含在pH7带正电的天然存在的氨基酸，即，赖氨酸、精氨酸和组氨酸。例如，所述或各个寡肽可以选自由以下各项组成的组：聚赖氨酸，聚精氨酸或聚组氨酸，其各自可以以半胱氨酸封端。
在一个实施方案中，所述或各个寡肽优选为式IV的化合物：
Figure GDA0001749553540000071
其中p是2至19，通常3至9或3至5的整数，并且其中Ra在每次出现时选自由以下各项组成的组：H2NC(＝NH)-NH(CH2)3–、H2N(CH2)4–或(1H-咪唑-4-基)-CH2-。
在所述寡肽或各个寡肽是式IV的化合物的情况下，将所述寡肽或各个寡肽与所述聚合物连接的L1和/或L2(和/或，在第二个方面，LT)是键并且末端半胱氨酸残基提供将所述寡肽或各个寡肽与丙烯酸酯封端的中间体式III偶联的方式。硫醇官能度提供更快、更有效且更容易控制的到双键的添加。相反，在所述寡肽或各个寡肽终止于胺官能度以用于偶联时，在偶联步骤中需要过量的这种化合物。
本发明还提供式I的聚合物，其中所述寡肽或各个寡肽在pH7具有净负电荷。所述寡肽或各个寡肽可以包含在pH7带负电的天然存在的氨基酸，即，天冬氨酸和谷氨酸。例如，所述或各个寡肽可以选自由以下各项组成的组：聚天冬氨酸和聚谷氨酸，其各自可以以半胱氨酸封端。在该实施方案中，所述寡肽或各个寡肽可以是式IV的化合物，其中p是2至19，通常3至9或3至5的整数，并且其中Ra是HO2C(CH2)2–或HO2C-CH2–。在该情况下，将所述寡肽或各个寡肽与所述聚合物连接的L1和/或L2是键，同时末端半胱氨酸残基提供将所述寡肽或各个寡肽与丙烯酸酯封端的中间体式IV偶联的方式。
备选地，所述或各个寡肽可以包含在pH7带负电的天然存在的氨基酸和在pH7带正电的天然存在的氨基酸的混合物。
本发明还提供式I的聚合物，其中所述寡肽或各个寡肽是疏水的。所述寡肽或各个寡肽可以包含疏水的天然存在的氨基酸如缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、甲硫氨酸、色氨酸、苯丙氨酸、半胱氨酸、酪氨酸和丙氨酸；尤其是，所述或各个寡肽可以包含缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、甲硫氨酸、色氨酸和苯丙氨酸。
本发明还提供式I的聚合物，其中所述寡肽或各个寡肽是亲水的。所述寡肽或各个寡肽可以包含亲水的天然存在的氨基酸，如丝氨酸、苏氨酸、半胱氨酸、天冬酰胺和谷氨酰胺，并且还可以包含在pH7带电的天然存在的氨基酸。
根据本发明的第一个方面，提供式I的聚合物，其中R1和R2二者都是寡肽，并且提供式I的聚合物，其中R1和R2中的一个是寡肽并且R1和R2中的一个是Ry。
根据本发明的第一个方面，当R1和R2中的一个是Ry时，则Ry优选选自由以下各项组成的组：氢、-(CH2)mNH2、-(CH2)mNHMe、-(CH2)mOH、-(CH2)mCH3、-(CH2)2(OCH2CH2)mNH2、-(CH2)2(OCH2CH2)mOH和-(CH2)2(OCH2CH2)mCH3，其中m是1至20，例如1至5的整数。优选地，Ry选自由以下各项组成的组：-(CH2)mNH2，-(CH2)mNHMe和-(CH2)2(OCH2CH2)mNH2。优选地，当L1是NH或NRx，并且R1和R2中的一个是Ry时，则Ry不同于R3。
本发明的聚合物可以是不对称的。例如，在根据本发明的第一个方面的聚合物中，R1和R2中的一个可以是寡肽并且另一个可以是Ry。备选地，R1和R2可以各自是不同的寡肽。在根据本发明的第二个方面的聚合物中，选自R1、R2的至少一个和R5的一次或两次出现可以是寡肽，并且选自R1、R2的其余基团和RT的一次或两次出现可以是Ry。备选地，R1、R2和RT的一次或两次出现可以各自是不同的寡肽。
本发明人已经发现，不对称的聚合物具有更高的多核苷酸递送效率。例如，根据本发明的第一个方面的聚合物(其中R1和R2中的一个是CysArgArgArg并且另一个衍生自H2N(CH2)3CH(CH3)CH2NH2)比其中R1和R2二者都是CysArgArgArg的聚合物和其中R1和R2二者都衍生自H2N(CH2)3CH(CH3)CH2NH2的聚合物具有更高的多核苷酸递送效率。
在根据本发明的聚合物中，L3和L5可以独立地选自亚烷基、亚烯基、杂亚烷基或杂亚烯基和聚乙二醇接头。所述亚烷基、亚烯基、杂亚烷基或杂亚烯基部分可以具有1-20个碳原子，优选1-12个碳原子，更优选1-6个碳原子。所述聚乙二醇接头的长度可以为3至25个原子，优选为3至18个原子。
任选地，L3和/或L5中的一个或多个碳原子可以被-S–S-替代。在主要聚合物链中包括至少一个二硫键允许有效地将治疗性多核苷酸释放在靶细胞内。
在根据本发明的聚合物中，各个R3可以独立地选自由以下各项组成的组：氢、-(CH2)pNH2、-(CH2)pNHMe、-(CH2)pOH、-(CH2)pCH3、-(CH2)2(OCH2CH2)qNH2、-(CH2)2(OCH2CH2)qOH和-(CH2)2(OCH2CH2)qCH3，其中p是1至20，例如1至5的整数，并且q是1至10，例如1至5的整数。
在上述式I或II中，n优选为5至1000，更优选为20至500。式I或式II的聚合物的分子量优选为1,000至100,000g/mol，更优选为2,000和50,000g/mol，更优选为5,000和40,000g/mol。
本发明的某些化合物可以以特定的几何或立体异构形式存在。本发明预期所有的这种化合物，包括顺式和反式异构体，R-和S-对映异构体，非对映异构体，(D)-异构体，(L)-异构体，其外消旋混合物，及其其他的混合物，其落在本发明的范围内。另外的不对称的碳原子可以存在于取代基如烷基中。所有这种异构体及其混合物意在被包括在本发明内。
可以根据本发明使用含有多种异构体比例中任一种的异构混合物。例如，在仅两种异构体组合的情况下，含有50:50，60:40，70:30，80:20，90:10，95:5，96:4，97:3，98:2或99:1异构体比例的混合物都为本发明所预期。本领域普通技术人源将容易理解，对于更复杂的异构体混合物，预期类似的比例。
化学基团
术语“卤素”(或“卤代”)包括氟、氯、溴和碘.
术语“烷基”包括单价、直链或支链、饱和、无环烃基。在一个实施方案中，烷基是C1-10烷基，在另一个实施方案中是C1-6烷基，在另一个实施方案中是C1-4烷基，如甲基、乙基、正丙基、异丙基或叔丁基。烷基可以被取代。
术语“环烷基”包括单价、饱和、环烃基。在一个实施方案中，环烷基是C3-10环烷基，在另一个实施方案中是C3-6环烷基如环戊基和环己基。环烷基可以被取代。
术语“烷氧基”是指烷基-O-。
术语“烷基氨基”是指烷基-NH-。
术语“烷基硫代(alkylthio)”是指烷基-S(O)t-，其中t在下文定义。
术语“烯基”包括具有至少一个碳碳双键并且在一个实施方案中无碳碳三键的单价、直链或支链、不饱和、无环烃基。在一个实施方案中，烯基是C2-10烯基，在另一个实施方案中是C2-6烯基，在另一个实施方案中是C2-4烯基。烯基可以被取代。
术语“环烯基”包括具有至少一个碳碳双键并且在一个实施方案中无碳碳三键的单价、部分不饱和、环烃基。在一个实施方案中，环烯基是C3-10环烯基，在另一个实施方案中是C5-10环烯基，例如环己烯基或苯并环己基。环烯基可以被取代。
术语“炔基”包括具有至少一个碳碳三键并且在一个实施方案中无碳碳双键的单价、直链或支链、不饱和、无环烃基。在一个实施方案中，炔基是C2-10炔基，在另一个实施方案中是C2-6炔基，在另一个实施方案中是C2-4炔基。炔基可以被取代。
术语“亚烷基”包括二价的、直链或支链、饱和、无环烃基。在一个实施方案中，亚烷基是C1-10亚烷基，在另一个实施方案中是C1-6亚烷基，在另一个实施方案中是C1-4亚烷基，如亚甲基、亚乙基、正亚丙基、异亚丙基或叔亚丁基。亚烷基可以被取代。
术语“亚烯基”包括具有至少一个碳碳双键并且在一个实施方案中无碳碳三键的二价、直链或支链、不饱和、无环烃基。在一个实施方案中，亚烯基是C2-10亚烯基，在另一个实施方案中是C2-6亚烯基，在另一个实施方案中是C2-4亚烯基。亚烯基可以被取代。
术语“杂烷基”包括烷基，例如，C1-65烷基、C1-17烷基或C1-10烷基，其中多至二十个碳原子，在一个实施方案中多至十个碳原子，在一个实施方案中多至两个碳原子，在另一个实施方案中一个碳原子，各自独立地被O、S(O)t或N替代，前提是保留至少一个烷基碳原子。杂烷基可以是C-连接的或杂-连接的，即其可以通过碳原子或通过O、S(O)t或N与分子的其余部分连接，其中t在下文限定。杂烷基可以被取代。
术语“杂环烷基”包括环烷基，其中多至十个碳原子，在一个实施方案中多至两个碳原子，在另一个实施方案中一个碳原子，各自独立地被O、S(O)t或N替代，前提是保留至少一个环烷基碳原子。杂环烷基的实例包括氧杂环丙基、硫杂环丙基、氮杂环丙基、氧杂环丁基、硫杂环丁基、氮杂环丁基、四氢呋喃基、四氢噻吩基、吡咯烷基、四氢吡喃基、四氢硫代吡喃基、哌啶基、1,4-二烷基、1,4-氧硫杂环己基、吗啉基、1,4-二硫杂环己基、哌嗪基、1,4-氮硫杂环己基、氧杂环庚基、硫杂环庚基、氮杂环庚基、1,4-二氮杂环庚基、1,4-氧硫杂环庚基、1,4-氧氮杂环庚基、1,4-二硫杂环庚基、1,4-硫氮杂环庚基和1,4-二氮杂环庚基。杂环烷基可以是C-连接的或N-连接的，即其可以通过碳原子或通过氮原子与分子的其余部分连接。杂环烷基可以被取代。
术语“杂烯基”包括烯基，例如，C1-65烯基、C1-17烯基或C1-10烯基，其中多至二十个碳原子，在一个实施方案中多至十个碳原子，在一个实施方案中多至两个碳原子，在另一个实施方案中一个碳原子，各自独立地被O、S(O)t或N替代，前提是保留至少一个烯基碳原子。杂烯基可以是C-连接的或杂-连接的，即其可以通过碳原子或通过O、S(O)t或N与分子的其余部分连接。杂烯基可以被取代。
术语“杂环烯基”包括环烯基，其中多至三个碳原子，在一个实施方案中多至两个碳原子，在另一个实施方案中一个碳原子，各自独立地被O、S(O)t或N替代，前提是保留至少一个环烯基碳原子。杂环烯基的实例包括3,4-二氢-2H-吡喃基，5-6-二氢-2H-吡喃基，2H-吡喃基，1,2,3,4-四氢吡啶基和1,2,5,6-四氢吡啶基。杂环烯基可以是C-连接的或N-连接的，即其可通过碳原子或通过氮原子与分子的其余部分连接。杂环烯基可以被取代。
术语“杂炔基”包括炔基，例如，C1-65炔基、C1-17炔基或C1-10炔基，其中多至二十个碳原子，在一个实施方案中，其中多至十个碳原子，在一个实施方案中多至两个碳原子，在另一个实施方案中一个碳原子，各自独立地被O、S(O)t或N替代，前提是保留至少一个炔基碳原子。杂炔基可以是C-连接的或杂-连接的，即其可以通过碳原子或通过O、S(O)t或N与分子的其余部分连接。杂炔基可以被取代。
术语“杂亚烷基”包括亚烷基，例如，C1-65亚烷基、C1-17亚烷基或C1-10亚烷基，其中多至二十个碳原子，在一个实施方案中，其中多至十个碳原子，在一个实施方案中多至两个碳原子，在另一个实施方案中一个碳原子，各自独立地被O、S(O)t或N替代，前提是保留至少一个亚烷基碳原子。杂亚炔基可以被取代。
术语“杂亚烯基”包括亚烯基，例如，C1-65亚烯基，C1-17亚烯基或C1-10亚烯基，其中多至二十个碳原子，在一个实施方案中，其中多至十个碳原子，在一个实施方案中多至两个碳原子，在另一个实施方案中一个碳原子，各自独立地被O、S(O)t或N替代，前提是保留至少一个亚烯基碳原子。杂亚烯基可以被取代。
术语“芳基”包括单价、芳族、环烃基，如苯基或萘基(例如1-萘基或2-萘基)。通常，芳基可以是单环或多环稠合环芳基。优选的芳基是C6-C14芳基。芳基可以被取代。
芳基的其它实例是醋蒽烯(aceanthrylene)、苊烯(acenaphthylene)、醋菲烯(acephenanthrylene)、蒽、薁、、晕苯、荧蒽(fluoranthene)、芴、不对称引达省(as-indacene)、对称引达省(s-indacene)、茚、萘、卵苯、苝、非那烯(phenalene)、菲、苉、七曜烯、芘、皮蒽和玉红省的单价衍生物。
术语“芳基烷基”是指被芳基取代的烷基，例如苄基。
术语“杂芳基”包括芳基，其中一个或多个碳原子各自被独立地选自O、S、N和NRN的杂原子替代，其中RN在下文中限定(并且在一个实施方案中是H或烷基(例如C1-6烷基))。杂芳基可以被取代。
通常，杂芳基可以是单环或多环(例如双环)稠合环杂芳基。通常，杂芳基含有5-14个环成员(优选5-10个环成员)，其中1，2，3或4个环成员独立地选自O、S、N和NRN。在一个实施方案中，杂芳基可以是5、6、9或10元，例如5-元单环、6-元单环、9-元稠合环双环或10-元稠合环双环。
单环杂芳基包括含有5-6个环成员的杂芳基，其中1，2，3或4个环成员独立地选自O、S、N或NRN。
在一个实施方案中，5-元单环杂芳基含有1个环成员，所述环成员是-NRN-基团、–O-原子或–S-原子，和任选地1-3个环成员(例如1或2个环成员)，所述环成员是＝N-原子(其中5个环成员的其余部分是碳原子)。
5-元单环杂芳基的实例是吡咯基、呋喃基、噻吩基、吡唑基、咪唑基、异唑基、唑基、异噻唑基、噻唑基、1,2,3三唑基、1,2,4三唑基、1,2,3二唑基、1,2,4二唑基、1,2,5二唑基、1,3,4二唑基、1,3,4噻二唑基、吡啶基、嘧啶基、哒嗪基、吡嗪基、1,3,5三嗪基、1,2,4三嗪基、1,2,3三嗪基和四唑基。
6-元单环杂芳基的实例是吡啶基、哒嗪基、嘧啶基和吡嗪基。
在一个实施方案中，6-元单环杂芳基含有1或2个环成员，所述环成员是＝N-原子(其中6个环成员的其余部分是碳原子)。
双环杂芳基包括含有9-14个环成员的稠合环杂芳基，其中1，2，3，4或更多的环成员独立地选自O、S、N或NRN。
在一个实施方案中，9-元双环杂芳基含有1个环成员，所述环成员是-NRN-基团、–O-原子或–S-原子，和任选地1-3个环成员(例如1或2个环成员)，所述环成员是＝N-原子(其中9个环成员的其余部分是碳原子)。
9-元稠合环双环杂芳基的实例是苯并呋喃基、苯并噻吩基、吲哚基、苯并咪唑基、吲唑基、苯并三唑基、吡咯并[2,3-b]吡啶基、吡咯并[2,3-c]吡啶基、吡咯并[3,2-c]吡啶基、吡咯并[3,2-b]吡啶基、咪唑并[4,5-b]吡啶基、咪唑并[4,5-c]吡啶基、吡唑并[4,3-d]吡啶基、吡唑并[4,3-c]吡啶基、吡唑并[3,4-c]吡啶基、吡唑并[3,4-b]吡啶基、异吲哚基、吲唑基、嘌呤基、二氢吲哚基、咪唑并[1,2-a]吡啶基、咪唑并[1,5-a]吡啶基、吡唑并[1,2-a]吡啶基、吡咯并[1,2-b]哒嗪基和咪唑并[1,2-c]嘧啶基。
在一个实施方案中，10-元双环杂芳基含有1-3个环成员，所述环成员是＝N-原子(其中10环成员的其余部分是碳原子)。
10-元稠合环双环杂芳基的实例是喹啉基、异喹啉基、噌啉基、喹唑啉基、喹啉基、酞嗪基、1,6-萘啶基、1,7-萘啶基、1,8-萘啶基、1,5-萘啶基、2,6-萘啶基、2,7-萘啶基、吡啶并[3,2-d]嘧啶基、吡啶并[4,3-d]嘧啶基、吡啶并[3,4-d]嘧啶基、吡啶并[2,3-d]嘧啶基、吡啶并[2,3-b]吡嗪基、吡啶并[3,4-b]吡嗪基、嘧啶并[5,4-d]嘧啶基、吡嗪并[2,3-b]吡嗪基和嘧啶并[4,5-d]嘧啶基。
术语“杂芳基烷基”是指被杂芳基取代的烷基。
酰基的实例包括烷基-C(＝O)-、环烷基-C(＝O)-、烯基-C(＝O)-、环烯基-C(＝O)-、杂烷基-C(＝O)-、杂环烷基-C(＝O)-、芳基-C(＝O)-或杂芳基-C(＝O)-、尤其是，烷基-C(＝O)-和芳基-C(＝O)-。
除非另有明确说明，当在本文中基团的组合被称为一个部分(例如芳基烷基)时，最后提及的基团含有这样的原子，通过该原子，所述部分与分子的其余部分连接。
当提及被O、S(O)t或N替代的烷基或其它基团的碳原子时，所意在的是：
Figure GDA0001749553540000131
被
Figure GDA0001749553540000132
替代
–CH＝被–N＝替代；
≡C-H被≡N替代；或
–CH2-被–O–，–S(O)t–或–NRN-替代。
作为澄清，关于上文提及的含有杂原子的基团(如杂烷基等)，当给出碳原子数(例如C3-6杂烷基)时，意在表明基于C3-6烷基的基团，其中3-6个链碳原子中的一个或多个被O、S(O)t或N替代。因此，例如，C3-6杂烷基将含有少于3-6个链碳原子。
在上文提及的情况下，RN是H、烷基、环烷基、芳基、杂芳基、-C(O)-烷基、-C(O)-芳基、-C(O)-杂芳基、-S(O)t-烷基、–S(O)t-芳基或–S(O)t-杂芳基。RN尤其可以是H、烷基(例如C1-6烷基)或环烷基(例如C3-6环烷基)。
在上文提及的情况下，t独立地是0、1或2，例如2。通常，t是0。
当基团具有至少2个可以被取代的位置时，所述基团可以被亚烷基或杂亚烷基链的两个末端取代，形成环部分。
本发明的化合物的任选地被取代的基团(例如烷基、环烷基、烷氧基、烯基、环烯基、炔基、亚烷基、亚烯基、杂烷基、杂环烷基、杂烯基、杂环烯基、杂炔基、杂亚烷基、杂亚烯基、芳基、芳基烷基、芳基杂烷基、杂芳基、杂芳基烷基或杂芳基杂烷基等)可以是取代的或未取代的，在一个实施方案中是未取代的。通常，取代包括理论上的用取代基替代氢原子，或在被＝O取代的情况下，两个氢原子被替代。
当被取代时，通常将存在1至3个取代基，在一个实施方案中为1或2个取代基，在一个实施方案中为1个取代基。
任选的取代基独立地是卤素、三卤代甲基、三卤代乙基、-OH、-NH2、-NO2、-CN、-N+(C1-6烷基)2O-、-CO2H、-CO2C1-6烷基、-SO3H、-SOC1-6烷基、-SO2C1-6烷基、-SO3C1-6烷基、-OC(＝O)OC1-6烷基、-C(＝O)H、-C(＝O)C1-6烷基、-OC(＝O)C1-6烷基、＝O、-NH(C1-6烷基)、-N(C1-6烷基)2、-C(＝O)NH2、-C(＝O)N(C1-6烷基)2、-N(C1-6烷基)C(＝O)O(C1-6烷基)、-N(C1-6烷基)C(＝O)N(C1-6烷基)2、-OC(＝O)N(C1-6烷基)2、-N(C1-6烷基)C(＝O)C1-6烷基、-C(＝S)N(C1-6烷基)2、-N(C1-6烷基)C(＝S)C1-6烷基、-SO2N(C1-6烷基)2、-N(C1-6烷基)SO2C1-6烷基、-N(C1-6烷基)C(＝S)N(C1-6烷基)2、-N(C1-6烷基)SO2N(C1-6烷基)2、-C1-6烷基、-C1-6杂烷基、-C3-6环烷基、-C3-6杂环烷基、-C2-6烯基、-C2-6杂烯基、-C3-6环烯基、-C3-6杂环烯基、-C2-6炔基、-C2-6杂炔基、–Zu-C1-6烷基、–Zu-C3-6环烷基、-Zu-C2-6烯基、–Zu-C3-6环烯基或–Zu-C2-6炔基，其中
Zu独立地是O、S、NH或N(C1-6烷基)。
在另一个实施方案中，任选的一个或多个取代基独立地是卤素、三卤代甲基、三卤代乙基、-NO2、-CN、-N+(C1-6烷基)2O-、-CO2H、-SO3H、-SOC1-6烷基、-SO2C1-6烷基、-C(＝O)H、-C(＝O)C1-6烷基、＝O、-N(C1-6烷基)2、-C(＝O)NH2、-C1-6烷基、-C3-6环烷基、-C3-6杂环烷基、–ZuC1-6烷基或–Zu-C3-6环烷基，其中Zu在上文定义。
在另一个实施方案中，任选的取代基独立地是卤素、三卤代甲基、-NO2、-CN、-CO2H、-C(＝O)C1-6烷基、＝O、-N(C1-6烷基)2、-C(＝O)NH2、-C1-6烷基、-C3-6环烷基、-C3-6杂环烷基、–ZuC1-6烷基或–Zu-C3-6环烷基，其中Zu在上文定义。
在另一个实施方案中，任选的取代基独立地是卤素、-NO2、-CN、-CO2H、＝O、-N(C1-6烷基)2、-C1-6烷基、-C3-6环烷基或-C3-6杂环烷基。
在另一个实施方案中，任选的取代基独立地是卤素、-OH、NH2、NH(C1-6烷基)、-N(C1-6烷基)2、-C1-6烷基、-C3-6环烷基或-C3-6杂环烷基。
如本文使用的，术语“本发明的聚合物”和“式I的聚合物”等包括其药用衍生物及其多晶型物、异构体和同位素标记的变体。
术语“药用衍生物”包括式I的化合物的任意药用盐、溶剂化物、水合物或前药。在一个实施方案中，所述药用衍生物是式I的化合物的药用盐、溶剂化物或水合物。
术语“药用盐”包括由药用无毒酸或碱(包括无机或有机酸和碱)制备的盐。
含有碱性基团，例如氨基的式I的化合物能够与酸形成药用盐。在一个实施方案中，式I的化合物的药用酸加成盐包括，但不限于，无机酸如氢卤酸(例如盐酸、氢溴酸和氢碘酸)、硫酸、硝酸和磷酸的那些。在一个实施方案中，式I的化合物的药用酸加成盐包括，但不限于，有机酸如脂肪族、芳香族、羧酸和磺酸类型的有机酸的那些，其实例包括：脂肪族单羧酸如甲酸、乙酸、丙酸或丁酸；脂肪族羟基酸如乳酸、柠檬酸、酒石酸或苹果酸；二羧酸如马来酸或琥珀酸；芳香族羧酸如苯甲酸、对氯苯甲酸、苯基乙酸、二苯基乙酸或三苯基乙酸；芳香族羟基酸如邻羟基苯甲酸、对羟基苯甲酸、1-羟基萘-2-甲酸或3-羟基萘-2-甲酸；和磺酸如甲磺酸、乙磺酸或苯磺酸。式I的化合物的其它药用酸加成盐包括，但不限于，乙醇酸、葡糖醛酸、糠酸、谷氨酸、氨茴酸、水杨酸、扁桃酸、恩波酸(扑酸)、泛酸、硬脂酸、磺胺酸、藻酸和半乳糖醛酸的那些。其中式I的化合物包含多种碱性基团，多个中心可以被质子化以提供式I的化合物的多种盐，例如二-或三盐。例如，本文所述的式I的化合物的氢卤酸盐可以是一氢卤酸盐、二氢卤酸盐或三氢卤酸盐等。在一个实施方案中，所述盐包括，但不限于由上文公开的任意酸的加成而得到的那些。在式I的化合物的一个实施方案中，两个碱性基团形成酸加成盐。在进一步的实施方案中，两种加成盐抗衡离子是相同种类，例如二氢氯酸盐，二氢硫酸盐等。通常，所述药用盐是盐酸盐，如二盐酸盐。
含有酸性基团，例如羧基的式I的化合物能够与碱形成药用盐。在一个实施方案中，式I的化合物的药用碱性盐包括，但不限于，金属盐如碱金属或碱土金属盐(例如钠盐、钾盐、镁盐或钙盐)和锌或铝盐。在一个实施方案中，式I的化合物的药用碱性盐包括，但不限于，与氨或药用有机胺或杂环碱如乙醇胺(例如二乙醇胺)、苄胺、N-甲基-葡糖胺、氨基酸(例如赖氨酸)或吡啶形成的盐。
还可以形成酸和碱的半盐，例如半硫酸盐。
式I的化合物的药用盐可以通过本领域公知的方法制备。
对于药用盐的综述，参见Stahl和Wermuth，Handbook of Pharmaceutical Salts：Properties，Selection and Use(Wiley-VCH，Weinheim，德国，2002)。
本发明的化合物可以以非溶剂化的和溶剂化的两种形式存在。术语“溶剂化物”包括包含本发明的化合物和一种以上药用溶剂分子如水或C1-6醇例如乙醇的分子复合物。术语“水合物”是指在溶剂是水的“溶剂化物”。
本发明的化合物可以以无定形到晶体形式的固体状态存在。所有这样的固定形式都包括在本发明内。
本发明的化合物可以以一种以上的几何的、光学的、对映体的、非对映体的和互变的形式存在，包括但不限于顺式-和反式-形式、E-和Z-形式，R-、S-和meso-形式，酮-和烯醇-形式。所有的这样的异构形式都包括在本发明内。所述异构形式可以是异构纯的或富集的形式，以及是在异构体的混合物(例如外消旋的或非对映异构的混合物)中。
本发明包括药用同位素标记的式I的化合物，其中一个或多个原子被具有相同原子数，但原子质量或质量数与通常天然发现的原子质量或质量数不同的原子替代。
适于包括在本发明的化合物中的同位素的实例包括氢的同位素，如2H和3H、碳的同位素，如11C、13C和14C，氯的同位素，如36Cl，氟的同位素，如18F，碘的同位素，如123I和125I，氮的同位素，如13N和15N，氧的同位素，如15O、17O和18O，磷的同位素，如32P，和硫的同位素，如35S。某些同位素标记的式I的化合物，例如，结合放射性同位素的那些，可用于药物和/或底物组织分布研究。鉴于其容易结合并且易于检测，放射性同位素3H和14C对于该目的特别有用。
利用正电子发射同位素如11C、18F、15O和13N的取代，可以用于正电子发射断层照相术(PET)以检查底物受体占据。
同位素标记的式I的化合物通常可以通过本领域技术人员已知的常规技术或通过与本文所描述的那些类似的方法，使用适当的同位素标记试剂替代之前使用的未标记的试剂来制备。
将理解，本文所述的聚合物可以被任意数量的取代基或功能部分取代。当在本文中使用时，术语取代的，不论是否在前面加上术语“任选地”，以及取代基，是指本领域技术人员理解的将一个官能团改变为另一个官能团的能力，前提是保持所有原子的化合价。当任何给定结构中的超过一个位置可以被超过一个选自指定组的取代基取代时，每个位置上的取代基可以相同或不同。取代基还可以进一步被取代(例如，芳基取代基可以具有另一个取代基，如另一个芳基，所述芳基在一个或多个位置进一步被氟取代)。
如本文使用的术语硫代羟基或硫醇，是指式-SH的基团。
本发明还提供一种组合物，所述组合物包含活性剂和式I的聚合物。所述组合物可以包含含有活性剂和所述聚合物的纳米颗粒和/或微粒。所述组合物可以包含两种以上不同的式I中定义的聚合物。例如，所述组合物可以包含其中R1和R2二者都是CysLysLysLys的式I的聚合物，和其中R1和R2二者都是CysHisHisHis的式I的聚合物。
所述活性剂可以是多核苷酸、蛋白或小分子。通常，所述活性剂是多核苷酸。所述多核苷酸可以选自由以下各项组成的组：DNA、RNA、siRNA和miRNA，优选地选自由以下各项组成的组：siRNA和miRNA。在一个实施方案中，所述多核苷酸选自由以下各项组成的组：DNA、RNA和siRNA。
通常，多核苷酸包含至少三个核苷酸。优选地，所述多核苷酸的长度为20-30个核苷酸，更优选长度为20-25个核苷酸，例如，长度为22个核苷酸。
所述多核苷酸可以衍生自天然核苷(即，腺苷、胸苷、鸟苷、胞苷、尿苷、肌苷、黄苷、脱氧腺苷、脱氧胸苷、脱氧鸟苷、脱氧肌苷、和脱氧胞苷)，核苷类似物(例如，2-氨基腺苷、2-硫胸苷、肌苷、吡咯并嘧啶、3-甲基腺苷、C5-丙炔基胞苷、C5-丙炔基尿苷、C5-溴尿苷、C5-氟尿苷、C5-碘尿苷、C5-甲基胞苷、7-脱氮腺苷、7-脱氮鸟苷、8-氧代腺苷、8-氧代鸟苷、O(6)-甲基鸟嘌呤、和2-硫代胞苷)，或其混合物。所述核苷酸可以衍生自化学修饰的碱基、生物修饰的碱基(例如，甲基化的碱基)、插入的碱基、未修饰的或修饰的糖(例如，2'-氟核糖、核糖、2'-脱氧核糖、阿拉伯糖和己糖)、和/或未修饰的或修饰的磷酸基团(例如，磷硫酰和5'-N-亚磷酰胺连接)。
当在本文中使用时，术语“小分子”是指具有较低的分子量并且不是蛋白质、多肽或多核苷酸的，天然存在的或人工形成的(例如，通过化学合成)有机化合物。通常，小分子具有小于约1500g/mol的分子量。
接着进一步讨论本发明的纳米颗粒。将理解，该讨论同样适用于微粒。
纳米颗粒可以包含多核苷酸和式I的聚合物，其中所述寡肽或各个寡肽在pH7具有净正电荷。在纳米颗粒形成过程中，带正电的寡肽与带负电的多核苷酸相互作用并且促进将多核苷酸包封在纳米颗粒中。
纳米颗粒可以包含其中所述寡肽或各个寡肽在pH 7具有净负电荷的式I或II的聚合物和在pH7具有净正电荷的活性剂。在纳米颗粒形成过程中，带负电的寡肽与带正电的活性剂相互作用，并促进活性剂包封在纳米颗粒中。
所述纳米颗粒可以任选地包含本发明的不同聚合物的混合物。例如，纳米颗粒可以包含
(a)根据式I或式II的聚合物，其中所述寡肽或各个寡肽在pH 7具有净正电荷；和
(b)根据式I或式II的聚合物，其中所述寡肽或各个寡肽在pH 7具有净负电荷。
因此，本发明提供具有可以通过改变上述聚合物(a)和(b)的比例来改变的净表面电荷的纳米颗粒。以重量计，(a)与(b)的比例可以是1:99，5:95，10:90，25:75，50:50，75:25，90:10，95:5，或99:1。
这种纳米颗粒适于药物多核苷酸包封并且显示出改善的药理学性质。
包括一群用在pH 7具有净负电荷的寡肽修饰的聚合物促进通过较短的DNA和RNA序列的纳米沉淀的包封。当用于本领域已知的利用PBAE的纳米沉淀步骤时，较短的DNA和RNA序列显示比较长的序列低的包封效率和/或低的绝对载量。本发明人发现，加入其它聚阴离子种类，如这里描述的带负电的聚合物，有助于在纳米沉淀过程中组装得到的含有聚合物和多核苷酸的纳米颗粒。
这尤其可用于包封短的多核苷酸如siRNA和miRNA序列，其具有大约20至30个碱基对的长度并且在体内循环中不稳定。由于其较少的电荷，之前将短的多核苷酸如siRNA和miRNA结合到纳米颗粒中存在困难。
本发明人发现，组合使用其中所述寡肽或各个寡肽在pH 7具有净正电荷的根据式I或式II的聚合物和其中所述寡肽或各个寡肽在pH 7具有净负电荷的根据式I或式II的聚合物，允许以高的包封效率和高的载量将短多核苷酸如siRNA或miRNA加载入纳米颗粒中。此外，使用上文描述的两种类型的聚合物防止了短多核苷酸的降解并且允许更有效的转染。据认为，带正电的寡核苷酸“包裹”带负电的多核苷酸，并且带负电的寡核苷酸“包裹”带正电的寡核苷酸以中和过量电荷(被发明人称为“覆盖物效应(mantle effect)”)。
此外，包括用在pH 7具有净负电荷的寡肽修饰的聚合物促进纳米颗粒通过复杂身体屏障如肠和肺粘膜的递送，因为净表面电荷变化在与那些屏障相互作用期间可以改变。
本发明的纳米颗粒可以以高活性剂含量和高包封效率形成。
在本文中，活性剂包封效率是指结合到纳米颗粒中的活性剂占含有活性剂的纳米颗粒的制备方法中使用的总活性剂的重量百分比。其通常多至并且包括95％，更通常为70％至95％。
本文中，活性剂捕获率(entrapment)是指加载活性剂的纳米颗粒中的活性剂的重量百分数。活性剂捕获率优选为至少2重量％，更优选至少5重量％，更优选至少10重量％并且通常为2重量％至20重量％，更优选5重量％至20重量％，更优选10重量％至20重量％。
当所述组合物包含纳米颗粒时，优选地，所述纳米颗粒构成所述组合物重量的约1％至约90％。更优选地，所述纳米颗粒构成所述组合物重量的约5％至约50％，更优选，约10％至约30％。所述组合物还可以包含载体。所述载体可以是任意药用稀释剂或赋形剂，如本领域已知的。所述载体通常是药理学无活性的。优选地，所述载体是极性液体。特别优选的载体包括水和生理学可接受的含有盐和/或缓冲剂的水溶液，例如，盐水或磷酸盐缓冲盐水。任选地，所述载体是生物学流体。液体载体可以通过例如，冻干、蒸发或离心来去除，以用于储存或提供用于肺部或鼻给药的粉末剂，用于输注的悬浮液的粉末剂，或用于口服给药的片剂或胶囊。
活性剂可以存在于纳米颗粒内或纳米颗粒表面上。通常，纳米颗粒存在于纳米颗粒内。所述活性剂和纳米颗粒间的相互作用通常是非共价的，例如，氢键合、静电相互作用或物理包封。通常所述相互作用是静电的。
所述纳米颗粒是生物相容的并且足以耐受其使用环境，以致在进入哺乳动物体内后足够量的纳米颗粒基本上保持完整，从而能够到达希望的靶点并实现所需的生理效果。本文所述的聚合物是生物相容的并且优选为可生物降解的。
本文中，术语‘生物相容的’描述了这样的物质，其可以被插入或注射入活的受试者中而不引起不良反应。例如，其不引起由不能充分控制的免疫系统导致的炎症或急性排斥。将认识到，“生物相容的”是相对术语，并且甚至对于与活体组织高度相容的物质，也预期会有某些程度的免疫反应。评估物质的生物相容性的体外测试为将其暴露于细胞；生物相容的物质在适当浓度(例如，29μg/104个细胞)通常不会导致显著的细胞死亡(例如，＞20％)。
在本文中，术语‘可生物降解的’描述了在生理环境中降解形成可以被细胞再利用或处理掉而无显著毒性作用的单体和/或其它非聚合部分的聚合物。降解可以是生物的，例如，通过酶活性或细胞机制，或可以是化学的，通常是在生理条件下发生的化学过程。聚合物的降解可以以改变的速率，以大约数日、数周、数月或数年的半衰期发生，这取决于使用的聚合物或共聚物。所述组分在体内优选地不诱发炎症或其它不良反应。在某些优选的实施方案中，所依赖的用于分解所述可生物降解化合物的化学反应是非催化的。
在本文中，术语‘纳米颗粒’是指直径为约1至约1000nm的固体颗粒。在本文中，术语‘微粒’是指直径为约1μm至约100μm的固体颗粒。本发明纳米颗粒的平均直径可以通过本领域已知的方法，优选通过动态光散射确定。尤其是，本发明涉及当通过动态光散射以90°的散射角并且在25℃的温度，使用用过滤水适当稀释的样品和适当的仪器如来自MalvernInstruments(UK)的ZetasizerTM仪器，根据标准测试方法ISO 22412:2008(累积量法A.1.3.2)分析时，为具有约1至约1000nm的直径的固体颗粒的纳米颗粒。当颗粒被说成是具有x nm的直径时，通常将存在该平均值附近的颗粒分布，但以数量计至少50％(例如＞60％，＞70％，＞80％，＞90％，或更多)的颗粒将具有在x±20％范围内的直径。
优选地，所述纳米颗粒的直径为约10至约1000nm，更优选约5至约500nm，更优选约50至约400nm，更优选约50至约150nm。备选地，所述纳米颗粒的直径为约1至约100nm。在一个实施方案中，如通过投射电镜确定的，所述纳米颗粒呈现小于10％，优选小于5％，优选小于1％的团聚程度，并且优选所述纳米颗粒是基本上不团聚的。
本发明还提供将试剂包封在式I或式II的聚合物的基质中以形成纳米颗粒的方法，所述方法包括以下步骤：提供试剂；提供所述聚合物；和将所述试剂和所述聚合物在适当条件下接触以形成纳米颗粒。尤其是，所述试剂和聚合物可以在溶液中以适于获得所需比例的浓度混合，剧烈混合并随后在温箱中在约37℃孵育约30分钟。
本发明还提供合成式I的聚合物的方法，所述方法包括将式II的化合物(其中L3如上文定义)与式L4H2的伯胺(其中L4如上文定义)反应，产生式II的聚合物，如方案2中所示。
Figure GDA0001749553540000211
式III的化合物进一步与式IV的化合物反应，形成式V的化合物：
Figure GDA0001749553540000212
Figure GDA0001749553540000221
其中p和Ra在每次出现独立地选自上文定义的列表。在一些情况下，p的每次出现是相同的并且选择Ra基团以使从硫连接开始的Ra基团的序列在所述化合物的各个末端相同，即，选择p和Ra以使聚合物具有关于L4的双重对称。
在上述步骤的替代方案中，式III的化合物进一步与式H2NRy的化合物(其中Ry如上文定义)和式IV的化合物反应并且分离得到的混合物，从而获得式VI的化合物：
Figure GDA0001749553540000222
其中Ra在每次出现时独立地选自上文限定的列表并且p如上文定义。
将认识到，进一步将寡肽连接于式III的化合物的方法对于技术人员来说将是可获得的，所述技术人员将知道在式III的末端丙烯酸酯基团处反应的适当的亲核试剂。
附图简述
图1显示以50:1比例(w/w)使用不同寡肽末端修饰的PBAE和pGFP质粒制备的聚合物-DNA复合物的流体动力学直径和ζ电势。
图2显示与DNA复合的寡肽末端修饰的PBAE和参比聚合物的琼脂糖凝胶电泳分析。
图3显示寡肽末端修饰的PBAE和参比聚合物的缓冲能力。
图4显示在用不同的寡肽末端修饰的PBAE和参比聚合物转染的(a)cos-7，(b)hnDf和(c)HaCaT细胞中GFP表达的流式细胞术分析。
图5显示用不同寡肽末端修饰的PBAE转染的cos-7细胞的存活力。
图6显示以200:1的比例(w/w)使用不同的寡肽末端修饰的PBAE和GFP特异性siRNA制备的聚合物–siRNA复合物的流体动力学直径和ζ电势。
图7显示使用不同的寡肽末端修饰的PBAE、用GFP特异性siRNA转染的MDA-MB-231/GFP细胞中GFP表达沉默的流式细胞术分析。
图8显示以200:1(w/w)的最终聚合物:蛋白比例使用谷氨酸和赖氨酸末端修饰的PBAE的牛胰岛素的包封程度。
本发明通过以下实施例进一步说明。将理解，实施例仅用于说明的目的并且不意在限制本发明为上文所述的。在不偏离本发明的范围的情况下，可以对详细内容进行改进。
实施例
材料
除非另有说明，试剂和溶剂从Sigma-Aldrich和Panreac获得并且按来样使用。质粒pmaxGFP(3486bp)获自Amaxa。细胞系获自ATCC(Manassas，VA)并在37℃，在5％CO2气氛，在获自Gibco的含有10％胎牛血清，100单位/ml青霉素，100ug/mL链霉素，0.1mM MEM非关键氨基酸(NEAA)，2mM L-谷氨酰胺的完全DMEM中维持。
实施例1：PBAE聚合物的合成
聚(β-氨基酯)按照文献中(例如在Montserrat，N.等人J.Biol.Chem.286，12417-12428(2011)中)描述的两步法合成。首先，通过将伯胺与二丙烯酸酯(1:1.2摩尔比的胺:二丙烯酸酯)加成反应合成丙烯酸酯-封端的聚合物。最后，通过用不同类型的携带胺和硫醇的部分给得到的丙烯酸酯-封端的聚合物末端加帽修饰获得PBAE。通过1H-NMR和FT-IR分析确认合成的结构。在400MHz Varian(Varian NMR仪器，Claredon Hills，IL)中记录NMR谱并且使用甲醇-d4作为溶剂。使用带有KBr分光器的Nicolet Magna 560(Thermo FisherScientific，Waltham，MA)，使用甲醇作为溶剂在蒸发膜中，获得IR谱。在装有两个GPCUltrastyragel柱，103和
Figure GDA0001749553540000231
(5μm混合的，300mm x 19mm，Waters MilliporeCorporation，Milford，MA，USA)并且以THF为流动相的Hewlett-Packard 1050Series HPLC系统上进行分子量确定。通过与聚苯乙烯标准的保留时间比较来计算分子量。
实施例2：丙烯酸酯封端的中间体的合成
将1,4-丁二醇二丙烯酸酯(8.96g，4.07×10-2mol)和5-氨基-1-戊醇(3.5g，3.39×10-2mol)在小瓶中混合。将混合物在90℃搅拌24h，并且随后冷却至室温，形成浅黄色粘性固体，丙烯酸酯封端的中间体(指定为C32)。将中间体C32储存在4℃，随后用于之后的步骤。
Figure GDA0001749553540000241
实施例3(比较例)：用伯胺进行末端修饰的PBAE的合成
用伯胺进行末端修饰的PBAE如Zugates，G.T.等人.Bioconjugate Chem.18，1887-1896(2007)中定义的制备。将中间体C32(1g，0.5mmol)在THF(2ml)中的溶液与1,5-二氨基-2-甲基-戊烷(0.24g，0.271ml，2mmol)在THF(8ml)中的溶液混合。将混合物在室温搅拌过夜，随后在二乙醚(100ml)中沉淀并最后在真空中干燥。
Figure GDA0001749553540000242
实施例4(比较例)：用伯胺进行末端修饰的PBAE的进一步合成
按照在其它地方(Zugates，G.T.等人.Bioconj.Chem.181887–1896(2007)，Yang，F.等人，Proc.Natl Acad.Sci.USA.1073317–3322(2010)，Sunshine，J.C.BiomacroMolecules 123592–3600(2011))中描述的方法合成二胺末端修饰的聚(β-氨基酯)，B3。简言之，将5-氨基-1-戊醇(3.44g，33mmol)和1,4-丁二醇二丙烯酸酯(7.93g，40mmol)在磁性搅拌下在90℃聚合24小时。将得到的丙烯酸酯-封端的聚合物C32(1g，0.4mmol)和2-甲基-1,5-戊二胺(0.23g，0.27mL，2mmol)溶解在四氢呋喃中并且在室温搅拌过夜。通过在二乙醚中沉淀将得到的二胺末端修饰的聚合物B3分离并且在真空下干燥。
IR(蒸发膜(evaporated film)：ν＝1055,1089,1125,1196(C-O),1257,1463,1733(C＝O),2079,2191,2253,2861,2936,3398(N-H,O-H)cm-1
1H-NMR(400MHz,CD3OD,TMS)(ppm):δ＝4.11(t,CH2-CH 2-O),3.72(t),3,55(t,CH2-CH 2-OH),2.87(t,-NH-CH 2-CH2-C(＝O)-),2.77(t,CH2-CH 2-N-),2.60-2.51(br,-NH-CH 2-(CH2)2-CH(CH3)-NH-),2.46(br,＞N-CH 2-(CH2)4-OH,＞N-CH2-CH 2-C(＝O)-O),1.87(br),1.73(br),1.60-1.41(br,-O-CH2-CH 2-CH 2-CH2-O,-CH 2-CH2-OH,-CH 2-CH2-NH2),1.35(br,-N-CH2-CH 2-CH 2-(CH2)2-OH),0.94(d,CH 3-CH<自二胺)。
实施例5：末端用寡肽修饰的PBAE的合成
通常，如下获得寡肽修饰的PBAE：将丙烯酸酯-封端的聚合物C32或C32SS和胺-或硫醇-封端的寡肽(例如，HS-Cys-Arg-Arg-Arg(CR3)，H2N-Arg-Arg-Arg(R3)或HS-Cys-Glu-Glu-Glu(CE3)–其它寡肽通过使用标准单字母编码的相似缩写表明)以1:2的摩尔比在DMSO中混合。将混合物在室温搅拌过夜并且通过在二乙醚:丙酮(3:1)中沉淀获得产生的聚合物。
(a)以下用于获得三精氨酸末端修饰的PBAE的合成步骤作为实例显示：中间体C32如以上实施例1中所述制备。将中间体C32(0.15g，0.075mmol)在DMSO(2ml)中的溶液与寡肽(Cys-Arg-Arg-Arg(CR3；0.11g，0.15mmol)在DMSO(1mL)中的相应溶液以适当摩尔比，1:2分别混合。将混合物在室温搅拌过夜，然后在二乙醚/丙酮(3:1)中沉淀。
Figure GDA0001749553540000251
IR(蒸发膜)：ν＝721,801,834,951,1029,1133(C-O),1201,1421,1466,1542,1672(C＝O,自肽酰胺),1731(C＝O,自酯),2858,2941,3182,3343(N-H,O-H)cm-1
1H-NMR(400MHz,CD3OD,TMS)(ppm):δ＝4.41-4.33(br,NH2-C(＝O)-CH-NH-C(＝O)-CH-NH-C(＝O)-CH-NH-C(＝O)-CH-CH2-,4.11(t,CH2-CH 2-O),3.55(t,CH2-CH 2-OH),3.22(br,NH2-C(＝NH)-NH-CH 2-,OH-(CH2)4-CH 2-N-),3.04(t,CH2-CH 2-N-),2.82(dd,-CH 2-S-CH 2),2.48(br,-N-CH2-CH 2-C(＝O)-O),1.90(m,NH2-C(＝NH)-NH-(CH2)2-CH 2-CH-),1.73(br,-O-CH2-CH2-CH2-CH2-O),1.69(m,NH2-C(＝NH)-NH-CH2-CH 2-CH2-),1.56(br,-CH 2-CH2-CH 2-CH2-OH),1.39(br,-N-(CH2)2-CH 2-(CH2)2-OH)。
(b)三赖氨酸修饰的寡肽(K3C-C32-CK3)根据相同方案制备并且表征如下：
IR(蒸发膜)：ν＝721,799,834,1040,1132,1179(C-O),1201,1397,1459,1541,1675(C＝O,from peptide amide),1732(C＝O,from ester),2861,2940,3348(N-H,O-H)cm-1
1H-NMR(400MHz,CD3OD,TMS)(ppm):δ＝4.38-4.29(br,NH2-(CH2)4-CH-),4.13(t,CH2-CH 2-O-),3.73(br,NH2-CH-CH2-S-),3.55(t,CH2-CH 2-OH),2.94(br,CH2-CH 2-N-,NH2-CH 2-(CH2)3-CH-),2.81(dd,-CH 2-S-CH 2),2.57(br,-N-CH2-CH 2-C(＝O)-O),1.85(m,NH2-(CH2)3-CH 2-CH-),1.74(br,-O-CH2-CH2-CH2-CH2-O),1.68(m,NH2-CH2-CH 2-(CH2)2-CH-),1.54(br,-CH 2-CH2-CH 2-CH2-OH),1.37(br,-N-(CH2)2-CH 2-(CH2)2-OH)。
(c)三组氨酸修饰的寡肽(H3C-C32-CH3)根据相同方案制备并且表征如下：
IR(蒸发膜)：ν＝720,799,832,1040,1132,1201,1335,1403,1467,1539,1674(C＝O,自肽酰胺),1731(C＝O,自酯),2865,2941,3336(N-H,O-H)cm-1
1H-NMR(400MHz,CD3OD,TMS)(ppm):δ＝8.0-7.0(br-N(＝CH)-NH-C(＝CH)-)4.61-4.36(br,-CH2-CH-),4.16(t,CH2-CH 2-O-),3.55(t,CH2-CH 2-OH),3.18(t,CH2-CH 2-N-,3.06(dd,-CH 2-CH-),2.88(br,OH-(CH2)4-CH 2-N-),2.82(dd,-CH 2-S-CH 2-),2.72(br,-N-CH2-CH 2-C(＝O)-O),1.75(br,-O-CH2-CH2-CH2-CH2-O),1.65(m,NH2-CH2-CH 2-(CH2)2-CH-),1.58(br,-CH 2-CH2-CH 2-CH2-OH),1.40(br,-N-(CH2)2-CH 2-(CH2)2-OH)。
实施例6：具有不对称末端修饰的PBAE的合成
通常，如下获得不对称寡肽修饰的PBAE：将丙烯酸酯-封端的聚合物C32(或C32SS)和胺-或硫醇-封端的寡肽(例如，CR3，R3或CE3)以1:1的摩尔比在DMSO中混合。将混合物在室温搅拌过夜。加入等摩尔量的第二胺-或硫醇-封端的寡肽，或伯胺，并将混合物在室温搅拌过夜。通过在二乙醚/丙酮(3:1)中沉淀获得产生的不对称PBAE聚合物。
以下用于获得不对称末端修饰的B3-C32-CR3PBAE的合成步骤作为实例显示：将中间体C32(0.15g，0.075mmol)在DMSO(2mL)中的溶液与寡肽Cys-Arg-Arg-Arg(CR3；0.055g，0.075mmol)在DMSO(1ml)中的相应溶液混合并在室温搅拌过夜。接着，在DMSO中，在室温，将2-甲基-1,5-戊二胺(0.017g，0.02ml，0.15mmol)加入混合物中达4h。通过在二乙醚/丙酮(3:1)中沉淀过夜获得不对称末端修饰的聚合物B3-C32-CR3与B3-C32-B3和R3C-C32-CR3的混合物。混合物无进一步纯化即可使用或所述不对称末端修饰的聚合物B3-C32-CR3可以通过标准方法从混合物分离。
Figure GDA0001749553540000281
Figure GDA0001749553540000291
Figure GDA0001749553540000301
实施例8：聚合物–DNA复合物的形成和表征
所有聚合物的储液制备在DMSO中(100mg/ml)。将这些聚合物溶液以适当的浓度稀释(25mM乙酸盐缓冲液pH 5.0)，获得所需比例聚合物–DNA(w/w)。然后将100 l稀释的聚合物加至100 l质粒DNA(60g/mL在乙酸盐缓冲液25mM pH 5.0中)，涡旋剧烈混合数秒，然后在37℃温箱中孵育30min。将得到的纳米颗粒稀释在磷酸盐缓冲盐水中用于纳米颗粒表征。使用动态光散射(Zetasizer nano zs90，Malvern Instruments)就尺寸和ζ电势表征聚合物–DNA复合物。结果显示在图1中。
纳米颗粒还通过琼脂糖凝胶电泳表征。为了评估质粒延迟，将不同w/w比例的含有0.48μg pGFP的PBAE-DNA复合物加至琼脂糖凝胶(0.8％，含有1μg/mL溴化乙锭)的孔中。将样品在60V运行45min(Apelex PS 305，France)以分辨质粒延迟并且通过UV照射可视化。结果显示在图2中。
实施例9：质子海绵效应
质子海绵效应是显示促进内体逃逸的现象并且由具有高缓冲能力的聚合物介导，导致增加的转染效率(Varkouhi，A.K.等人，J.Control.Rel.151 220–228(2011).)。通常，在其结构中具有叔胺的聚合物在5.0至7.5的内体pH范围显示缓冲效应，其引起渗透压增加，导致内体破坏Behr，J.Chimia 2 34–36(1997))。根据质子海绵效应，新合成的聚(β-氨基酯)的缓冲能力通过聚合物溶液的酸滴定确定(图2)。
通过酸碱滴定确定聚合物的缓冲能力。简言之，将聚合物以1mg/mL的最终浓度溶解在氯化钠水溶液(150mM)中。将得到的聚合物溶液用氢氧化钠调节至pH 10。通过逐步加入10μL等份的盐酸(0.1M)来确定滴定曲线。在每次添加后用pH计(Crison Basic 20+，Crison Instruments)测量pH，直到达到pH 2。滴定不含有聚合物的溶液作为对照。结果显示在图3中。
首先，确定聚(β-氨基酯)B3的缓冲效果，显示低至pH 5.8的适当的缓冲能力。在组氨酸封端的聚(β-氨基酯)的情况下观察到最高缓冲能力，其在7.5到5.3的pH范围中呈现高缓冲。赖氨酸-修饰的聚(β-氨基酯)呈现合适的缓冲能力直至pH 5.9。相比之下，末端用精氨酸寡肽加帽的聚(β-氨基酯)仅在7.4至6.4的范围内呈现有限的缓冲能力。因为所有聚合物源自相同的丙烯酸酯-封端的前聚合物C32，由富胺的终端导致观察到的额外的缓冲能力。
实施例10：转染效力
通过评估将编码绿色荧光蛋白(pGFP)的质粒递送到细胞的效率来比较本发明的聚合物和已知聚合物的转染效力。
利用质粒pGFP的细胞转染：使用pGFP质粒在HaCaT，hnDf，cos-7，A549和HeLa细胞中进行细胞转染。这些细胞系获自ATCC(Manassas,VA)并在含有10％胎牛血清、100单位/ml青霉素，100g/mL链霉素，0.1mM MEM非必需氨基酸(NEAA)，2mM L-谷氨酰胺的完全DMEM中，在37℃在5％CO2气氛中维持。
以10,000个细胞/孔将细胞接种在96-孔板上并且孵育过夜至大致80–90％汇合，之后进行转染实验。以50:1的聚合物:质粒比例使用pGFP质粒如上文所述制备聚合物–DNA复合物。将聚复合物(polyplexes)稀释在无血清培养基中并且以0.6μg pGFP/孔的最终质粒浓度加至细胞。将细胞在37℃在5％CO2气氛中孵育3h。随后，将细胞用PBS洗涤一次并且加入完全DMEM。48h后，收获细胞并且通过流式细胞术分析GFP表达。针对阴性对照(未处理的细胞)以及作为阳性对照的
Figure GDA0001749553540000321
(Merck KGaA，Germany)和B3-C32-B3比较GFP表达。结果显示在图4a-c中，其中R/H，K/H和R/K表示R3C-C32-CR3，K3C-C32-CK3或H3C-C32-CH3PBAE的1:1混合物(w/w)。
实施例11：细胞毒性
使用MTS测定(CellTiter
Figure GDA0001749553540000322
AQueous One Solution Cell ProliferationAssay，Promega Corporation，USA)评估转染有本申请所述的聚合物的cos-7细胞的存活力。转染后48h，根据制造商说明，使用MTS测定评估细胞存活力。简言之，通过与实施例5中类似的方法用pGFP转染细胞。转染后48h，去除培养基，将细胞用PBS洗涤并且加入补充有MTS(20％v/v)的完全培养基。将细胞在37℃孵育并且使用微量板读数器在490nm测量吸光度。将细胞存活力表示为与未处理细胞相比的相对百分数。结果显示在图5中，其中R/H，K/H和R/K表示R3C-C32-CR3，K3C-C32-CK3或H3C-C32-CH3PBAE的1:1混合物(w/w)。
实施例12：基因沉默测定
使用GFP特异性siRNA，在GFP报告子稳定细胞系中评估本发明聚合物的siRNA递送效率。
聚合物–siRNA复合物的制备：聚合物的储液被制备在DMSO中(100mg/ml)。将这些聚合物溶液以适当的浓度稀释(25mM乙酸盐缓冲液pH 5.0)，获得所需比例聚合物–siRNA(w/w)。然后将100μl适当稀释的聚合物加至100μl的GFP-特异性siRNA(10μg/mL，在乙酸盐缓冲液25mM pH 5.0中；ThermoScientific Dharmacon GFP Duplex I)，剧烈涡旋混合数秒，然后在37℃孵育30min。将得到的复合物稀释在磷酸盐缓冲盐水中用于纳米颗粒表征。使用动态光散射(Zetasizer nano zs90，Malvern Instruments)就尺寸和ζ电势表征聚合物–siRNA复合物。结果显示在图6中，其中K/H和K/R表示R3C-C32-CR3，K3C-C32-CK3或H3C-C32-CH3PBAE的60:40混合物(w/w)。K/E和K/D表示K3C-C32-CK3和D3C-C32-CD3或E3C-C32-CE3PBAE的70:30混合物(w/w)。
利用GFP特异性siRNA的细胞转染：使用GFP特异性siRNA在MDA-MB-231/GFP细胞(Cell Biolabs Inc.)中进行细胞转染。在37℃，在5％CO2气氛中，将细胞维持在含有10％胎牛血清，100单位/ml青霉素，100μg/mL链霉素的完全DMEM中。
简言之，将细胞以10,000个细胞/孔接种在96-孔板上并且孵育过夜至大致80–90％汇合，之后进行转染实验。以200:1的聚合物:siRNA比例使用GFP特异性siRNA如上所述制备聚合物–siRNA复合物。将复合物稀释在无血清培养基中并且以50nM siRNA/孔的最终质粒浓度加至细胞。在37℃在5％CO2气氛中将细胞孵育3h。随后，将细胞用PBS洗涤一次并且加入完全DMEM。48h后，收获细胞并且通过流式细胞术分析GFP沉默。针对阴性对照(未处理细胞)和作为阳性对照的INTERFERinTM(PolyPlus TransfectionTM)和B3比较GFP表达的沉默。结果显示在图7中，其中R/H，K/H和R/K表示R3C-C32-CR3，K3C-C32-CK3或H3C-C32-CH3PBAE的1:1混合物(w/w)，而SS(R/H)，SS(K/H)和SS(R/K)表示R3C-C32SS-CR3，K3C-C32SS-CK3或H3C-C32SS-CH3PBAE的1:1混合物(w/w)。
实施例13：使用谷氨酸和赖氨酸末端修饰的PBAE包封牛胰岛素
使用牛胰岛素(Sigma Aldrich)评估本发明的聚合物的包封效率。简言之，将谷氨酸末端修饰的PBAE E3C-C32-CE3(16.7μL，60mg/mL)加至牛胰岛素的溶液(1mL，0.01mg/mL于HEPES缓冲液中，100mM，pH 7.2)，接着加入赖氨酸末端修饰的PBAE K3C-C32-CK3(10μL，100mg/mL)，获得200:1的最终聚合物:蛋白比例。将混合物在室温孵育30min。使用Centricon装置(10KDa截取值(cut-off)，Merck Millipore)离心得到的纳米颗粒，从而将含有胰岛素的纳米颗粒与未包封的胰岛素分离。通过使用二辛可宁测定(bicinchoninicassay)(BCA蛋白测定试剂，ThermoScientific)确定未包封的胰岛素并与胰岛素原溶液比较来计算包封程度。结果显示在图8中，其中NP1和NP2是独立的重复。

Claims (23)

1.式I的聚合物：
Figure 679623DEST_PATH_IMAGE002
式I
其中
各个L1和L2独立地选自由以下各项组成的组：
Figure DEST_PATH_IMAGE003
、O、S、NRx和键；
其中Rx独立地选自由以下各项组成的组：氢、烷基或环烷基；
L3独立地选自由以下各项组成的组：亚烷基、亚烯基、杂亚烷基或杂亚烯基，其具有1-20个碳原子；
L4为
Figure 212104DEST_PATH_IMAGE004
；
L5独立地选自由以下各项组成的组：亚烷基、亚烯基、杂亚烷基或杂亚烯基，其具有1-20个碳原子；
R1和R2独立地选自寡肽和Ry；
其中R1和R2中的至少一个是寡肽；
其中所述寡肽或各个寡肽在pH 7具有净正电荷，并且所述寡肽或各个寡肽包含选自由以下各项组成的组的氨基酸残基：赖氨酸、精氨酸和组氨酸；
并且其中Ry选自由以下各项组成的组：氢、卤素、烷基、环烷基、烯基、环烯基、杂烷基、杂环烷基、酰基、芳基或杂芳基；
各个R3独立地选自由以下各项组成的组：氢、-(CH2)pNH2、-(CH2)pNHMe、-(CH2)pOH、-(CH2)pCH3、-(CH2)2(OCH2CH2)qNH2、-(CH2)2(OCH2CH2)qOH和-(CH2)2(OCH2CH2)qCH3，其中p是1至20的整数；q是1至10的整数；
n是5至1000的整数；
或其药用盐。
2.权利要求1所述的聚合物，其中所述寡肽或各个寡肽包含选自由赖氨酸和精氨酸组成的组的氨基酸残基。
3.权利要求1所述的聚合物，其中所述寡肽或各个寡肽包含3至20个氨基酸残基。
4.权利要求2所述的聚合物，其中所述寡肽或各个寡肽包含3至20个氨基酸残基。
5.权利要求1所述的聚合物，其中所述寡肽或各个寡肽是式VII的化合物：
Figure DEST_PATH_IMAGE005
其中p是2至19的整数并且其中Ra在每次出现时选自由以下各项组成的组：H2NC(=NH)-NH(CH2)3-、H2N(CH2)4-或(1H-咪唑-4-基)-CH2-。
6.权利要求1所述的聚合物，其中R1和R2二者都是寡肽。
7.权利要求6所述的聚合物，其中R1和R2是不同的寡肽。
8.权利要求1所述的聚合物，其中R1和R2中的一个是寡肽并且R1和R2中的一个是Ry。
9.权利要求1所述的聚合物，其中n是1至20。
10.权利要求1所述的聚合物，其中Ry选自由以下各项组成的组：氢、-(CH2)mNH2、-(CH2)mNHMe、-(CH2)mOH、-(CH2)mCH3、-(CH2)2(OCH2CH2)mNH2、-(CH2)2(OCH2CH2)mOH或-(CH2)2(OCH2CH2)mCH3，其中m是1至20的整数。
11.权利要求1所述的聚合物，其中各个L3独立地选自由以下各项组成的组：-C1-10亚烷基-(S-S)q-C1-10亚烷基-，其中q是0或1。
12.一种纳米颗粒，其包含：
（a）式I的聚合物：
Figure DEST_PATH_IMAGE007
式I
其中
各个L1和L2独立地选自由以下各项组成的组：
Figure 408468DEST_PATH_IMAGE008
、O、S、NRx和键；
其中Rx独立地选自由以下各项组成的组：氢、烷基或环烷基；
L3独立地选自由以下各项组成的组：亚烷基、亚烯基、杂亚烷基或杂亚烯基，其具有1-20个碳原子；
L4为
Figure 653330DEST_PATH_IMAGE004
；
L5独立地选自由以下各项组成的组：亚烷基、亚烯基、杂亚烷基或杂亚烯基，其具有1-20个碳原子；
R1和R2独立地选自寡肽和Ry；
其中R1和R2中的至少一个是寡肽；
其中所述寡肽或各个寡肽在pH 7具有净正电荷，并且所述寡肽或各个寡肽包含选自由以下各项组成的组的氨基酸残基：赖氨酸、精氨酸和组氨酸；
并且其中Ry选自由以下各项组成的组：氢、卤素、烷基、环烷基、烯基、环烯基、杂烷基、杂环烷基、酰基、芳基或杂芳基；
各个R3独立地选自由以下各项组成的组：氢、-(CH2)pNH2、-(CH2)pNHMe、-(CH2)pOH、-(CH2)pCH3、-(CH2)2(OCH2CH2)qNH2、-(CH2)2(OCH2CH2)qOH和-(CH2)2(OCH2CH2)qCH3，其中p是1至20的整数；q是1至10的整数；
n是5至1000的整数；
或其药用盐；和
（b）式I的聚合物：
Figure 180127DEST_PATH_IMAGE010
式I
其中
各个L1和L2独立地选自由以下各项组成的组：
Figure 770377DEST_PATH_IMAGE003
、O、S、NRx和键；
其中Rx独立地选自由以下各项组成的组：氢、烷基或环烷基；
L3独立地选自由以下各项组成的组：亚烷基、亚烯基、杂亚烷基或杂亚烯基，其具有1-20个碳原子；
L4选自由以下各项组成的组：
Figure 622795DEST_PATH_IMAGE004
；
L5独立地选自由以下各项组成的组：亚烷基、亚烯基、杂亚烷基或杂亚烯基，其具有1-20个碳原子；
R1和R2独立地选自寡肽和Ry；
其中R1和R2中的至少一个是寡肽；
其中所述寡肽或各个寡肽在pH 7具有净负电荷，并且所述寡肽或各个寡肽包含选自由以下各项组成的组的氨基酸残基：天冬氨酸和谷氨酸；
并且其中Ry选自由以下各项组成的组：氢、卤素、烷基、环烷基、烯基、环烯基、杂烷基、杂环烷基、酰基、芳基或杂芳基；
各个R3独立地选自由以下各项组成的组：氢、-(CH2)pNH2、-(CH2)pNHMe、-(CH2)pOH、-(CH2)pCH3、-(CH2)2(OCH2CH2)qNH2、-(CH2)2(OCH2CH2)qOH和-(CH2)2(OCH2CH2)qCH3，其中p是1至20的整数；q是1至10的整数；
n是5至1000的整数；
或其药用盐。
13.一种如权利要求12所述的纳米颗粒，进一步包含活性剂。
14.组合物，所述组合物包含活性剂和权利要求1-11中任一项所述的聚合物，或所述组合物包含如权利要求13所述的纳米颗粒。
15.权利要求14所述的组合物，其中所述活性剂是多核苷酸。
16.权利要求15所述的组合物，其中所述多核苷酸是RNA或DNA。
17.权利要求15所述的组合物，其中所述多核苷酸是siRNA。
18.权利要求15所述的组合物，其中所述组合物包含含有所述多核苷酸和所述聚合物的纳米颗粒。
19.权利要求16所述的组合物，其中所述组合物包含含有所述多核苷酸和所述聚合物的纳米颗粒。
20.将试剂包封入根据权利要求1至11中任一项所述的聚合物的基质中以形成纳米颗粒的方法，所述方法包括以下步骤：提供试剂；提供所述聚合物；和将所述试剂和所述聚合物在适当条件下接触以形成纳米颗粒，其中所述试剂是选自DNA和RNA的多核苷酸。
21.权利要求20所述的方法，其中所述试剂是siRNA。
22.权利要求20或21所述的方法，其中所述接触步骤包括(a)喷雾干燥所述试剂和所述聚合物的混合物，(b)双乳化溶剂蒸发技术或(c)相转化技术。
23.根据权利要求1至11中任一项所述的聚合物，根据权利要求12或13所述的纳米颗粒，或根据权利要求14至19中任一项所述的组合物，其用于制备药物。
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