JP6473421B2 - 薬物送達用の修飾ポリ（ベータ−アミノエステル） - Google Patents

Description

本発明は、活性薬剤の送達に使用するのに適切なポリマーに関する。本発明はまた、これらのポリマーを含むナノ粒子及びそれらの製造法にも関する。

ＤＮＡ及びＲＮＡのようなポリヌクレオチドを送達するための安全で効率的なベクターがないことは、依然として遺伝子治療の成功のための主たる障害となっている(Ｌｕｏ，Ｄ．＆ Ｓａｌｔｚｍａｎ，Ｗ．Ｍ．合成ＤＮＡ送達システム(Synthetic DNA delivery systems)．Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ．１８，３３−３７（２０００）；Ｋａｍｉｍｕｒａ Ｋ．ら，遺伝子送達システムの進歩(Advances in Gene Delivery Systems)．Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔ．Ｍｅｄ．２５，２９３−３０６（２０１１）；Ｍｉｅｌｅ Ｅ．ら，ナノ粒子をベースにした低分子干渉ＲＮＡの送達：がん治療への挑戦(Nanoparticle-based delivery of small interfering RNA: challenges for cancer therapy)．Ｉｎｔ．Ｊ． Ｎａｎｏｍｅｄｉｃｉｎｅ ７，３６３７−３６５７（２０１２））。ポリヌクレオチド送達のためのプロトコルのほとんどはウィルスベクターを採用している。これは非常に効率的な送達システムであるが、ウィルスベクターには、安全性リスク、ポリヌクレオチド運搬能力の限界及び高い大規模製造コストなど、一定の不利益もある。非ウィルスベクターは、高いパッキング能力、容易な製造、低い毒性及び免疫原性といった潜在的利点を提供するが、ウィルスベクターほど効率的でない（Ｍｉｎｔｚｅｒ，Ｍ．Ａ．＆ Ｓｉｍａｎｅｋ，Ｅ．Ｅ．遺伝子送達のための非ウィルスベクター(Nonviral vectors for gene delivery)．Ｃｈｅｍ．Ｒｅｖ．１０９，２５９−３０２（２００９））。

生分解性ポリ（β−アミノエステル）（ＰＢＡＥｓ）は、ＤＮＡ及びＲＮＡをどちらも離散(discrete)ナノメートル粒子に凝縮できる有望な非ウィルス性のポリヌクレオチド送達ベクターであると言われている（Ｇｒｅｅｎ，Ｊ．Ｊ．ら，Ａｃｃ．Ｃｈｅｍ Ｒｅｓ．４１，７４９−７５９（２００８））。ＰＢＡＥｓの末端を第一アミンで化学修飾すると（スキーム１参照）、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ２０００、Ｆｕｇｅｎｅ及びポリエチレンイミン（ＰＥＩ）のような市販のトランスフェクション試薬より高いトランスフェクション効果をもたらすことが示されている（Ｚｕｇａｔｅｓ，Ｇ．Ｔ．ら，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍ．１８，１８８７−１８９６（２００７）；Ｇｒｅｅｎ，Ｊ．Ｊ．ら，Ｎａｎｏ ｌｅｔｔｅｒｓ ８，３１２６−３１３０（２００８）；ＷＯ０２／３１０２５Ａ２）。

国際特許出願公開第ＷＯ０２／３１０２５号

Ｌｕｏ，Ｄ．＆ Ｓａｌｔｚｍａｎ，Ｗ．Ｍ．Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ．１８，３３−３７（２０００） Ｋａｍｉｍｕｒａ Ｋ．ら，Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔ．Ｍｅｄ．２５，２９３−３０６（２０１１） Ｍｉｅｌｅ Ｅ．ら，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｎａｎｏｍｅｄｉｃｉｎｅ ７，３６３７−３６５７（２０１２） Ｍｉｎｔｚｅｒ，Ｍ．Ａ．＆ Ｓｉｍａｎｅｋ，Ｅ．Ｅ．，Ｃｈｅｍ．Ｒｅｖ．１０９，２５９−３０２（２００９） Ｇｒｅｅｎ，Ｊ．Ｊ．ら，Ａｃｃ．Ｃｈｅｍ Ｒｅｓ．４１，７４９−７５９（２００８） Ｚｕｇａｔｅｓ，Ｇ．Ｔ．ら，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍ．１８，１８８７−１８９６（２００７） Ｇｒｅｅｎ，Ｊ．Ｊ．ら，Ｎａｎｏ ｌｅｔｔｅｒｓ ８，３１２６−３１３０（２００８）

ポリヌクレオチドを効率的にトランスフェクトするために使用でき、そして経済的に製造できる改良された非毒性、生分解性、生体適合性ポリマーに対する継続的な需要が存在する。そのようなポリマーは、遺伝子治療におけるＤＮＡ及びＲＮＡのパッケージング及び送達に、そしてまた他の診断用、治療用及び予防用薬剤のパッケージング及び送達に有用であろう。

特に、循環中で安定性に乏しい短鎖ポリヌクレオチド、特にｓｉＲＮＡ及びマイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）を効率的にトランスフェクトするために使用できるポリマーが求められている。既存のポリマー性のポリヌクレオチド送達ベクターは、ｓｉＲＮＡ及びｍｉＲＮＡを、これらの配列の長さが比較的短いために、高担持量(high loading)でカプセル化することができない。さらに、ｓｉＲＮＡ及びｍｉＲＮＡ用の多くの既存のポリマー性送達ベクターは細胞毒性である。

本発明は、薬物送達、特にポリヌクレオチドの送達；組織工学（再生医療）及び生体材料を含む様々な医学用途に有用な新規の末端修飾ＰＢＡＥｓを提供する。本発明は特に、ＰＢＡＥｓの医学的応用に向けられる。本発明はまた、発明的末端修飾ポリマーとポリヌクレオチドとの複合体、発明的ポリマーを含む薬物送達デバイス（例えば、マイクロ粒子、ナノ粒子）、末端修飾ポリマーの製造法、及び発明的末端修飾ポリマーの使用法も提供する。

これらのシステムが持つポリエステルの性質は、それらの高い生分解性及び低い毒性のために、魅力的な生体適合性プロフィールをもたらす。従って、これらのポリマーは、がん、単一遺伝子疾患(monogenetic disease)、血管疾患及び感染症などの多くの疾患の治療における非ウィルス性ポリヌクレオチド送達ベクターとしての用途を有する。これらのポリヌクレオチド送達ベクターの別の用途は、インビトロ研究において、細胞及び生理学的体系内での遺伝子機能や調節を調べるためのツールとしての用途である。

第一の側面において、本発明は、式Ｉ：

［式中、Ｌ_１及びＬ_２は、

、Ｏ、Ｓ、ＮＲ_ｘ及び結合からなる群から独立に選ばれ；ここで、Ｒ_ｘは、水素、ハロゲン、アルキル、シクロアルキル、アルケニル、シクロアルケニル、ヘテロアルキル、ヘテロシクロアルキル、アシル、アリール又はヘテロアリールからなる群から独立に選ばれ；
Ｌ_３は、アルキレン、アルケニレン、ヘテロアルキレン、ヘテロアルケニレン、アリーレン又はヘテロアリーレンからなる群から独立に選ばれ；
Ｌ_４は、

からなる群から独立に選ばれ；
Ｌ_５は、アルキレン、アルケニレン、ヘテロアルキレン、ヘテロアルケニレン、アリーレン又はヘテロアリーレンからなる群から独立に選ばれ；
Ｒ_１及びＲ_２は、オリゴペプチド及びＲ_ｙから独立に選ばれ；
ここで、Ｒ_１及びＲ_２の少なくとも一つはオリゴペプチドであり；
そして、Ｒ_ｙは、水素、ハロゲン、アルキル、シクロアルキル、アルケニル、シクロアルケニル、ヘテロアルキル、ヘテロシクロアルキル、アシル、アリール又はヘテロアリールからなる群から選ばれ；
各Ｒ_３は、水素、ハロゲン、アルキル、シクロアルキル、アルケニル、シクロアルケニル、ヘテロアルキル、ヘテロシクロアルキル、アシル、アリール又はヘテロアリールからなる群から独立に選ばれ；そして
ｎは５〜１０，０００の整数である］のポリマー
又はその薬学的に許容可能な塩を提供する。

第二の側面において、本発明は、式Ｉ：
［式中、Ｌ_１及びＬ_２は、

、Ｏ、Ｓ、ＮＲ_ｘ及び結合からなる群から独立に選ばれ；ここで、Ｒ_ｘは、水素、ハロゲン、アルキル、シクロアルキル、アルケニル、シクロアルケニル、ヘテロアルキル、ヘテロシクロアルキル、アシル、アリール又はヘテロアリールからなる群から独立に選ばれ；
Ｌ_３の出現の少なくとも１回は、

であり；
ここで、Ｔ_１は、

であり、Ｔ_２は、Ｈ、アルキル又は

から選ばれ；
ここで、Ｌ_Ｔは、

、Ｏ、Ｓ、ＮＲ_ｘ及び結合からなる群から独立に選ばれ；ここで、Ｒ_ｘは、水素、ハロゲン、アルキル、シクロアルキル、アルケニル、シクロアルケニル、ヘテロアルキル、ヘテロシクロアルキル、アシル、アリール又はヘテロアリールからなる群から独立に選ばれ；
残りのＬ_３基は、出現するたびに、アルキレン、アルケニレン、ヘテロアルキレン、ヘテロアルケニレン、アリーレン又はヘテロアリーレンからなる群から独立に選ばれ；
Ｌ_４は、

からなる群から独立に選ばれ；
Ｌ_５は、アルキレン、アルケニレン、ヘテロアルキレン、ヘテロアルケニレン、アリーレン又はヘテロアリーレンからなる群から独立に選ばれ；
Ｒ_１、Ｒ_２及びＲ_Ｔは、オリゴペプチド及びＲ_ｙから独立に選ばれ；
ここで、Ｒ_１、Ｒ_２及びＲ_Ｔの少なくとも一つはオリゴペプチドであり；
そして、Ｒ_ｙは、水素、ハロゲン、アルキル、シクロアルキル、アルケニル、シクロアルケニル、ヘテロアルキル、ヘテロシクロアルキル、アシル、アリール又はヘテロアリールからなる群から選ばれ；
各Ｒ_３は、水素、ハロゲン、アルキル、シクロアルキル、アルケニル、シクロアルケニル、ヘテロアルキル、ヘテロシクロアルキル、アシル、アリール又はヘテロアリールからなる群から独立に選ばれ；そして
ｎは５〜１０，０００の整数である］のポリマー
又はその薬学的に許容可能な塩を提供する。

このように、本発明は、少なくとも一つのオリゴペプチドで末端修飾されたＰＢＡＥｓを提供する。これらのＰＢＡＥｓは、ポリヌクレオチドのための優れた凝縮剤(condensing agent)として、及び／又は細胞取込み及びトランスフェクション効率を増強するための標的化リガンドとして働く。これらのポリマーは、公知のＰＢＡＥｓ及び市販のトランスフェクション試薬と比べて、ポリヌクレオチドの細胞への送達を改良できる生分解性の基を有し、インビトロにおいて高いトランスフェクション効果及び低い細胞毒性を示している。

式Ｉのポリマーは、式IIのジアクリレートモノマーを式Ｌ_４Ｈ_２の置換アミンと反応させて、アクリレート末端中間体、式IIIを形成させることによって製造できる。

次に、基Ｒ_１Ｌ_１及びＲ_２Ｌ_２を末端アクリレート基との反応によって付加すれば、式Ｉのポリマーを形成できる。

本発明によるポリマーにおいて、各Ｌ_１及びＬ_２（及び、第二の側面においてはＬ_Ｔ）は、末端修飾基Ｒ_１及びＲ_２のＰＢＡＥポリマーへの結合を促すように選ばれる。各Ｌ_１及びＬ_２（及び、第二の側面においてはＬ_Ｔ）は、例えば末端修飾基が末端システイン残基を含むオリゴペプチドの場合、結合でもよい。

本発明の第二の側面において、Ｌ_Ｔは、末端修飾基Ｒ_ＴのＰＢＡＥポリマーへの結合を促すように選ばれる。Ｌ_Ｔは、例えば末端修飾基が末端システイン残基を含むオリゴペプチドの場合、結合でもよい。

本発明によるポリマーにおいて、Ｒ_ｘは、水素、アルキル、シクロアルキル、アルケニル、シクロアルケニル、ヘテロアルキル及びヘテロシクロアルキルからなる群、例えば、水素、アルキル及びシクロアルキルからなる群から独立に選ばれうる。

本発明によれば、“オリゴペプチド”は、ペプチド結合によって一緒に連結された少なくとも３個のアミノ酸の鎖を含む。そのようなペプチドは、好ましくは天然アミノ酸のみを含有するが、非天然アミノ酸（すなわち、天然には存在しないが、ポリペプチド鎖に組み込むことができる化合物）及び／又は当該技術分野で公知のアミノ酸類似体を代替として使用することもできる。また、そのようなペプチド中の一つ又は複数のアミノ酸は、例えば、炭水化物基、リン酸基、ファルネシル基、イソファルネシル基、脂肪酸基、又はコンジュゲーション(conjugation)、官能化、もしくは他の修飾のためのリンカーなどの化学物質の付加によって修飾されていてもよい。本発明のポリマー中のオリゴペプチドは、典型的には３〜２０個のアミノ酸残基、さらに好ましくは３〜１０個のアミノ酸残基、さらに好ましくは３〜６個のアミノ酸残基を含む。あるいは、本発明のポリマー中のオリゴペプチドは４〜２０個のアミノ酸残基、さらに好ましくは４〜１０個のアミノ酸残基、さらに好ましくは４〜６個のアミノ酸残基を含んでいてもよい。

本発明はさらに、一つの又は各オリゴペプチドがｐＨ７で正味の正電荷を有する式Ｉのポリマーを提供する。一つの又は各オリゴペプチドは、ｐＨ７で正に荷電した天然アミノ酸、すなわち、リシン、アルギニン及びヒスチジンを含みうる。例えば、一つの又は各オリゴペプチドは、ポリリシン、ポリアルギニン又はポリヒスチジンからなる群から選ぶことができ、そのそれぞれは末端にシステインを有していてもよい。

一態様において、一つの又は各オリゴペプチドは、好ましくは、式IV：

［式中、ｐは２〜１９、典型的には３〜９又は３〜５の整数であり、Ｒ_ａは、出現するたびに、Ｈ_２ＮＣ（＝ＮＨ）−ＮＨ（ＣＨ_２）_３−、Ｈ_２Ｎ（ＣＨ_２）_４−又は（１Ｈ−イミダゾール−４−イル）−ＣＨ_２−からなる群から選ばれる］の化合物である。

一つの又は各オリゴペプチドが式IVの化合物の場合、一つの又は各オリゴペプチドをポリマーに連結しているＬ_１及び／又はＬ_２（及び／又は、第二の側面においてはＬ_Ｔ）は結合であり、末端システイン残基が一つの又は各オリゴペプチドを式IIIのアクリレート末端中間体に結合させる手段を提供する。チオール官能基は、二重結合へのより迅速で、より効率的、そしてより容易な制御付加を提供する。これに対し、一つの又は各オリゴペプチドがアミン官能基を末端に有し、これが結合に使用される場合、結合工程には過剰のこの化合物が必要になる。

本発明はさらに、一つの又は各オリゴペプチドがｐＨ７で正味の負電荷を有する式Ｉのポリマーを提供する。一つの又は各オリゴペプチドは、ｐＨ７で負に荷電した天然アミノ酸、すなわち、アスパラギン酸及びグルタミン酸を含みうる。例えば、一つの又は各オリゴペプチドは、ポリアスパラギン酸及びポリグルタミン酸からなる群から選ぶことができ、そのそれぞれは末端にシステインを有していてもよい。この態様において、一つの又は各オリゴペプチドは、ｐが２〜１９、典型的には３〜９又は３〜５の整数であり、Ｒ_ａがＨＯ_２Ｃ（ＣＨ_２）_２−又はＨＯ_２Ｃ−ＣＨ_２−である式IVの化合物でありうる。この場合、一つの又は各オリゴペプチドをポリマーに連結しているＬ_１及び／又はＬ_２は、末端システイン残基が一つの又は各オリゴペプチドを式IVのアクリレート末端中間体に結合させる手段を提供するので、結合である。

あるいは、一つの又は各オリゴペプチドは、ｐＨ７で負に荷電した天然アミノ酸と、ｐＨ７で正に荷電した天然アミノ酸との混合物を含んでいてもよい。

本発明はさらに、一つの又は各オリゴペプチドが疎水性である式Ｉのポリマーを提供する。一つの又は各オリゴペプチドは、バリン、ロイシン、イソロイシン、メチオニン、トリプトファン、フェニルアラニン、システイン、チロシン及びアラニンのような疎水性である天然アミノ酸を含みうる。特に、一つの又は各オリゴペプチドは、バリン、ロイシン、イソロイシン、メチオニン、トリプトファン及びフェニルアラニンを含みうる。

本発明はさらに、一つの又は各オリゴペプチドが親水性である式Ｉのポリマーを提供する。一つの又は各オリゴペプチドは、セリン、トレオニン、システイン、アスパラギン及びグルタミンのような親水性である天然アミノ酸を含みうる。そしてさらに、ｐＨ７で荷電している天然アミノ酸を含みうる。

本発明の第一の側面に従って、Ｒ_１及びＲ_２がともにオリゴペプチドである式Ｉのポリマーと、Ｒ_１及びＲ_２の一つがオリゴペプチドでＲ_１及びＲ_２の一つがＲ_ｙである式Ｉのポリマーを提供する。

本発明の第一の側面に従って、Ｒ_１及びＲ_２の一つがＲ_ｙの場合、Ｒ_ｙは、好ましくは、水素、−（ＣＨ_２）_ｍＮＨ_２、−（ＣＨ_２）_ｍＮＨＭｅ、−（ＣＨ_２）_ｍＯＨ、−（ＣＨ_２）_ｍＣＨ_３、−（ＣＨ_２）_２（ＯＣＨ_２ＣＨ_２）_ｍＮＨ_２、−（ＣＨ_２）_２（ＯＣＨ_２ＣＨ_２）_ｍＯＨ及び−（ＣＨ_２）_２（ＯＣＨ_２ＣＨ_２）_ｍＣＨ_３からなる群から選ばれ、ｍは１〜２０、例えば１〜５の整数である。好ましくは、Ｒ_ｙは、−（ＣＨ_２）_ｍＮＨ_２、−（ＣＨ_２）_ｍＮＨＭｅ及び−（ＣＨ_２）_２（ＯＣＨ_２ＣＨ_２）_ｍＮＨ_２からなる群から選ばれる。好ましくは、Ｌ_１がＮＨ又はＮＲ_ｘで、Ｒ_１及びＲ_２の一つがＲ_ｙの場合、Ｒ_ｙはＲ_３とは異なる。

本発明のポリマーは対称でなくてもよい。例えば、本発明の第一の側面によるポリマーにおいて、Ｒ_１及びＲ_２の一方はオリゴペプチドで、他方はＲ_ｙでありうる。あるいは、Ｒ_１及びＲ_２はそれぞれ異なるオリゴペプチドでもよい。本発明の第二の側面によるポリマーにおいては、Ｒ_１、Ｒ_２及びＲ_Ｔの１回又は２回の出現から選ばれる少なくとも一つはオリゴペプチドで、Ｒ_１、Ｒ_２及びＲ_Ｔの１回又は２回の出現から選ばれる残りの基はＲ_ｙでありうる。あるいは、Ｒ_１、Ｒ_２及びＲ_Ｔの１回又は２回の出現はそれぞれ異なるオリゴペプチドでもよい。

発明者らは、非対称ポリマーの方がより高いポリヌクレオチド送達効率を有していることを見出した。例えば、Ｒ_１及びＲ_２の一方がＣｙｓＡｒｇＡｒｇＡｒｇで、他方がＨ_２Ｎ（ＣＨ_２）_３ＣＨ（ＣＨ_３）ＣＨ_２ＮＨ_２から誘導されている本発明の第一の側面によるポリマーは、Ｒ_１及びＲ_２がともにＣｙｓＡｒｇＡｒｇＡｒｇであるポリマーと、Ｒ_１及びＲ_２がともにＨ_２Ｎ（ＣＨ_２）_３ＣＨ（ＣＨ_３）ＣＨ_２ＮＨ_２から誘導されているポリマーの両者より高いポリヌクレオチド送達効率を有している。

本発明によるポリマーにおいて、Ｌ_３及びＬ_５は、アルキレン、アルケニレン、ヘテロアルキレン又はヘテロアルケニレン及びポリエチレングリコールリンカーから独立に選ぶことができる。前記アルキレン、アルケニレン、ヘテロアルキレン又はヘテロアルケニレン部分は、１〜２０個の炭素原子、好ましくは１〜１２個の炭素原子、さらに好ましくは１〜６個の炭素原子のものでありうる。前記ポリエチレングリコールリンカーは、３〜２５原子の長さ、好ましくは３〜１８原子の長さのものでありうる。

任意に、Ｌ_３及び／又はＬ_５中の１個又は複数個の炭素原子は−Ｓ−Ｓ−で置換されていてもよい。主ポリマー鎖中に少なくとも一つのジスルフィド結合を含むと、標的細胞内部で治療用ポリヌクレオチドの効率的な放出(unpacking)が可能になる。

本発明によるポリマーにおいて、各Ｒ_３は、水素、−（ＣＨ_２）_ｐＮＨ_２、−（ＣＨ_２）_ｐＮＨＭｅ、−（ＣＨ_２）_ｐＯＨ、−（ＣＨ_２）_ｐＣＨ_３、−（ＣＨ_２）_２（ＯＣＨ_２ＣＨ_２）_ｑＮＨ_２、−（ＣＨ_２）_２（ＯＣＨ_２ＣＨ_２）_ｑＯＨ及び−（ＣＨ_２）_２（ＯＣＨ_２ＣＨ_２）_ｑＣＨ_３からなる群から独立に選ぶことができ、ｐは１〜２０、例えば１〜５の整数であり、ｑは１〜１０、例えば１〜５の整数である。

上記式Ｉ又はIIにおいて、ｎは好ましくは５〜１０００、さらに好ましくは２０〜５００である。式Ｉ又は式IIのポリマーの分子量は、好ましくは１，０００〜１００，０００ｇ／ｍｏｌ、さらに好ましくは２，０００〜５０，０００ｇ／ｍｏｌ、さらに好ましくは５，０００〜４０，０００ｇ／ｍｏｌである。

本発明の一定の化合物は、特別の幾何又は立体異性形で存在しうる。本発明は、シス−及びトランス−異性体、Ｒ−及びＳ−エナンチオマー、ジアステレオマー、（Ｄ）−異性体、（Ｌ）−異性体、それらのラセミ混合物、及びそれらのその他の混合物を含むすべてのそのような化合物も本発明の範囲内に含まれると考えている。アルキル基のような置換基中に追加の不斉炭素原子が存在することもありうる。すべてのそのような異性体ならびにそれらの混合物も本発明に含まれるものとする。

任意の様々な異性体比を含有する異性体混合物が本発明に従って利用できる。例えば、二つの異性体のみの組合せの場合、５０：５０、６０：４０、７０：３０、８０：２０、９０：１０、９５：５、９６：４、９７：３、９８：２又は９９：１の異性体比を含有する混合物は、すべて本発明によって想定されている。当業者であれば、より複雑な異性体混合物に対しても同様の比率が想定されることは容易に分かるであろう。

化学基
用語“ハロゲン”（又は“ハロ”）は、フッ素、塩素、臭素及びヨウ素を含む。

用語“アルキル”は、一価の直鎖又は分枝鎖飽和非環式ヒドロカルビル基を含む。一態様において、アルキルはＣ_１−１０アルキルであり、別の態様ではＣ_１−６アルキル、別の態様ではＣ_１−４アルキル、例えばメチル、エチル、ｎ−プロピル、ｉ−プロピル又はｔ−ブチル基である。アルキルは置換されていてもよい。

用語“シクロアルキル”は、一価の飽和環式ヒドロカルビル基を含む。一態様において、シクロアルキルはＣ_３−１０シクロアルキルであり、別の態様ではＣ_３−６シクロアルキル、例えばシクロペンチル及びシクロヘキシルである。シクロアルキルは置換されていてもよい。

用語“アルコキシ”は、アルキル−Ｏ−を意味する。

用語“アルキルアミノ”は、アルキル−ＮＨ−を意味する。

用語“アルキルチオ”は、アルキル−Ｓ（Ｏ）_ｔ−（式中、ｔは以下に定義する）を意味する。

用語“アルケニル”は、少なくとも一つの炭素炭素二重結合を有し、一態様においては炭素炭素三重結合を持たない一価の直鎖又は分枝鎖不飽和非環式ヒドロカルビル基を含む。一態様において、アルケニルはＣ_２−１０アルケニルであり、別の態様ではＣ_２−６アルケニル、別の態様ではＣ_２−４アルケニルである。アルケニルは置換されていてもよい。

用語“シクロアルケニル”は、少なくとも一つの炭素炭素二重結合を有し、一態様においては炭素炭素三重結合を持たない一価の部分不飽和環式ヒドロカルビル基を含む。一態様において、シクロアルケニルはＣ_３−１０シクロアルケニルであり、別の態様ではＣ_５−１０シクロアルケニル、例えばシクロヘキセニル又はベンゾシクロヘキシルである。シクロアルケニルは置換されていてもよい。

用語“アルキニル”は、少なくとも一つの炭素炭素三重結合を有し、一態様においては炭素炭素二重結合を持たない一価の直鎖又は分枝鎖不飽和非環式ヒドロカルビル基を含む。一態様において、アルキニルはＣ_２−１０アルキニルであり、別の態様ではＣ_２−６アルキニル、別の態様ではＣ_２−４アルキニルである。アルキニルは置換されていてもよい。

用語“アルキレン”は、二価の直鎖又は分枝鎖飽和非環式ヒドロカルビル基を含む。一態様において、アルキレンはＣ_１−１０アルキレンであり、別の態様ではＣ_１−６アルキレン、別の態様ではＣ_１−４アルキレン、例えばメチレン、エチレン、ｎ−プロピレン、ｉ−プロピレン又はｔ−ブチレン基である。アルキレンは置換されていてもよい。

用語“アルケニレン”は、少なくとも一つの炭素炭素二重結合を有し、一態様においては炭素炭素三重結合を持たない二価の直鎖又は分枝鎖不飽和非環式ヒドロカルビル基を含む。一態様において、アルケニレンはＣ_２−１０アルケニレンであり、別の態様ではＣ_２−６アルケニレン、別の態様ではＣ_２−４アルケニレンである。アルケニレンは置換されていてもよい。

用語“ヘテロアルキル”は、アルキル基、例えばＣ_１−６５アルキル基、Ｃ_１−１７アルキル基又はＣ_１−１０アルキル基を含み、その２０個までの炭素原子、一態様においては１０個までの炭素原子、一態様においては２個までの炭素原子、別の態様では１個の炭素原子がそれぞれ独立に、Ｏ、Ｓ（Ｏ）_ｔ又はＮによって置換されている。ただし、少なくとも１個のアルキル炭素原子は残っていなければならない。ヘテロアルキル基は、Ｃ−連結でもヘテロ−連結でもよい。すなわち、残りの分子に炭素原子を通じて連結されていても、又はＯ、Ｓ（Ｏ）_ｔもしくはＮを通じて連結されていてもよい（前記ｔは以下に定義する）。ヘテロアルキルは置換されていてもよい。

用語“ヘテロシクロアルキル”は、１０個までの炭素原子、一態様においては２個までの炭素原子、別の態様では１個の炭素原子がそれぞれ独立に、Ｏ、Ｓ（Ｏ）_ｔ又はＮによって置換されているシクロアルキル基を含む。ただし、少なくとも１個のシクロアルキル炭素原子は残っていなければならない。ヘテロシクロアルキル基の例は、オキシラニル、チアラニル、アジリジニル、オキセタニル、チアタニル、アゼチジニル、テトラヒドロフラニル、テトラヒドロチオフェニル、ピロリジニル、テトラヒドロピラニル、テトラヒドロチオピラニル、ピペリジニル、１，４−ジオキサニル、１，４−オキサチアニル、モルホリニル、１，４−ジチアニル、ピペラジニル、１，４−アザチアニル、オキセパニル、チエパニル、アゼパニル、１，４−ジオキセパニル、１，４−オキサチエパニル、１，４−オキサアゼパニル、１，４−ジチエパニル、１，４−チエアゼパニル及び１，４−ジアゼパニルなどである。ヘテロシクロアルキル基は、Ｃ−連結でも又はＮ−連結でもよい。すなわち、残りの分子に炭素原子を通じて連結されていても、窒素原子を通じて連結されていてもよい。ヘテロシクロアルキルは置換されていてもよい。

用語“ヘテロアルケニル”は、アルケニル基、例えばＣ_１−６５アルケニル基、Ｃ_１−１７アルケニル基又はＣ_１−１０アルケニル基を含み、その２０個までの炭素原子、一態様においては１０個までの炭素原子、一態様においては２個までの炭素原子、別の態様では１個の炭素原子がそれぞれ独立に、Ｏ、Ｓ（Ｏ）_ｔ又はＮによって置換されている。ただし、少なくとも１個のアルケニル炭素原子は残っていなければならない。ヘテロアルケニル基は、Ｃ−連結でも又はヘテロ−連結でもよい。すなわち、残りの分子に炭素原子を通じて連結されていても、又はＯ、Ｓ（Ｏ）_ｔもしくはＮを通じて連結されていてもよい。ヘテロアルケニルは置換されていてもよい。

用語“ヘテロシクロアルケニル”は、３個までの炭素原子、一態様においては２個までの炭素原子、別の態様では１個の炭素原子がそれぞれ独立に、Ｏ、Ｓ（Ｏ）_ｔ又はＮによって置換されているシクロアルケニル基を含む。ただし、少なくとも１個のシクロアルケニル炭素原子は残っていなければならない。ヘテロシクロアルケニル基の例は、３，４−ジヒドロ−２Ｈ−ピラニル、５−６−ジヒドロ−２Ｈ−ピラニル、２Ｈ−ピラニル、１，２，３，４−テトラヒドロピリジニル及び１，２，５，６−テトラヒドロピリジニルなどである。ヘテロシクロアルケニル基は、Ｃ−連結でも又はＮ−連結でもよい。すなわち、残りの分子に炭素原子を通じて連結されていても、窒素原子を通じて連結されていてもよい。ヘテロシクロアルケニルは置換されていてもよい。

用語“ヘテロアルキニル”は、アルキニル基、例えばＣ_１−６５アルキニル基、Ｃ_１−１７アルキニル基又はＣ_１−１０アルキニル基を含み、その２０個までの炭素原子、一態様においては１０個までの炭素原子、一態様においては２個までの炭素原子、別の態様では１個の炭素原子がそれぞれ独立に、Ｏ、Ｓ（Ｏ）_ｔ又はＮによって置換されている。ただし、少なくとも１個のアルキニル炭素原子は残っていなければならない。ヘテロアルキニル基は、Ｃ−連結でも又はヘテロ−連結でもよい。すなわち、残りの分子に炭素原子を通じて連結されていても、又はＯ、Ｓ（Ｏ）_ｔもしくはＮを通じて連結されていてもよい。ヘテロアルキニルは置換されていてもよい。

用語“ヘテロアルキレン”は、アルキレン基、例えばＣ_１−６５アルキレン基、Ｃ_１−１７アルキレン基又はＣ_１−１０アルキレン基を含み、その２０個までの炭素原子、一態様においては１０個までの炭素原子、一態様においては２個までの炭素原子、別の態様では１個の炭素原子がそれぞれ独立に、Ｏ、Ｓ（Ｏ）_ｔ又はＮによって置換されている。ただし、少なくとも１個のアルキレン炭素原子は残っていなければならない。ヘテロアルキレンは置換されていてもよい。

用語“ヘテロアルケニレン”は、アルケニレン基、例えばＣ_１−６５アルケニレン基、Ｃ_１−１７アルケニレン基又はＣ_１−１０アルケニレン基を含み、その２０個までの炭素原子、一態様においては１０個までの炭素原子、一態様においては２個までの炭素原子、別の態様では１個の炭素原子がそれぞれ独立に、Ｏ、Ｓ（Ｏ）_ｔ又はＮによって置換されている。ただし、少なくとも１個のアルケニレン炭素原子は残っていなければならない。ヘテロアルケニレンは置換されていてもよい。

用語“アリール”は、一価の芳香族環式ヒドロカルビル基、例えばフェニル又はナフチル（例えば１−ナフチル又は２−ナフチル）を含む。一般に、アリール基は単環式でも又は多環式縮合環芳香族基でもよい。好適なアリールはＣ_６〜Ｃ_１４アリールである。アリールは置換されていてもよい。

アリール基の他の例は、アセアントリレン、アセナフチレン、アセフェナントリレン、アントラセン、アズレン、クリセン、コロネン、フルオランテン、フルオレン、ａｓ−インダセン、ｓ−インダセン、インデン、ナフタレン、オバレン、ペリレン、フェナレン、フェナントレン、ピセン、プレイアデン、ピレン、ピラントレン及びルビセンの一価誘導体である。

用語“アリールアルキル”は、アリール基で置換されたアルキルを意味する。例えばベンジルである。

用語“ヘテロアリール”は、１個又は複数個の炭素原子がそれぞれ、Ｏ、Ｓ、Ｎ及びＮＲ^Ｎから独立に選ばれるヘテロ原子によって置換されているアリール基を含む。前記Ｒ^Ｎは以下に定義する（そして、一態様において、Ｈ又はアルキル（例えばＣ_１−６アルキル）である）。ヘテロアリールは置換されていてもよい。

一般に、ヘテロアリール基は単環式でも又は多環式（例えば二環式）縮合環ヘテロ芳香族基でもよい。典型的には、ヘテロアリール基は５〜１４個の環員子（好ましくは５〜１０員）を含有し、その１、２、３又は４個の環員子は、Ｏ、Ｓ、Ｎ及びＮＲ^Ｎから独立に選ばれる。一態様において、ヘテロアリール基は、５、６、９又は１０員、例えば５−員単環式、６−員単環式、９−員縮合環二環式又は１０−員縮合環二環式でありうる。

単環式ヘテロ芳香族基は、５〜６個の環員子を含有し、その１、２、３又は４個の環員子はＯ、Ｓ、Ｎ又はＮＲ^Ｎから独立に選ばれるヘテロ芳香族基を含む。

一態様において、５−員の単環式ヘテロアリール基は、−ＮＲ^Ｎ−基、−Ｏ−原子又は−Ｓ−原子である１個の環員子、及び任意に＝Ｎ−原子である１〜３個の環員子（例えば、１又は２個の環員子）を含有する（５個の環員子の残りは炭素原子である）。

５−員の単環式ヘテロアリール基の例は、ピロリル、フラニル、チオフェニル、ピラゾリル、イミダゾリル、イソオキサゾリル、オキサゾリル、イソチアゾリル、チアゾリル、１，２，３−トリアゾリル、１，２，４−トリアゾリル、１，２，３−オキサジアゾリル、１，２，４−オキサジアゾリル、１，２，５−オキサジアゾリル、１，３，４−オキサジアゾリル、１，３，４−チアジアゾリル、ピリジル、ピリミジニル、ピリダジニル、ピラジニル、１，３，５−トリアジニル、１，２，４−トリアジニル、１，２，３−トリアジニル及びテトラゾリルである。

６−員の単環式ヘテロアリール基の例は、ピリジニル、ピリダジニル、ピリミジニル及びピラジニルである。

一態様において、６−員の単環式ヘテロアリール基は、＝Ｎ−原子である１又は２個の環員子を含有する（６個の環員子の残りは炭素原子である）。

二環式ヘテロ芳香族基は、９〜１４個の環員子を含有し、その１、２、３、４個又は５個以上の環員子はＯ、Ｓ、Ｎ又はＮＲ^Ｎから独立に選ばれる縮合環ヘテロ芳香族基を含む。

一態様において、９−員の二環式ヘテロアリール基は、−ＮＲ^Ｎ−基、−Ｏ−原子又は−Ｓ−原子である１個の環員子、及び任意に＝Ｎ−原子である１〜３個の環員子（例えば、１又は２個の環員子）を含有する（９個の環員子の残りは炭素原子である）。

９−員の縮合環二環式ヘテロアリール基の例は、ベンゾフラニル、ベンゾチオフェニル、インドリル、ベンズイミダゾリル、インダゾリル、ベンゾトリアゾリル、ピロロ［２，３−ｂ］ピリジニル、ピロロ［２，３−ｃ］ピリジニル、ピロロ［３，２−ｃ］ピリジニル、ピロロ［３，２−ｂ］ピリジニル、イミダゾ［４，５−ｂ］ピリジニル、イミダゾ［４，５−ｃ］ピリジニル、ピラゾロ［４，３−ｄ］ピリジニル、ピラゾロ［４，３−ｃ］ピリジニル、ピラゾロ［３，４−ｃ］ピリジニル、ピラゾロ［３，４−ｂ］ピリジニル、イソインドリル、インダゾリル、プリニル、インドリニニル(indolininyl)、イミダゾ［１，２−ａ］ピリジニル、イミダゾ［１，５−a］ピリジニル、ピラゾロ［１，２−ａ］ピリジニル、ピロロ［１，２−ｂ］ピリダジニル及びイミダゾ［１，２−ｃ］ピリミジニルである。

一態様において、１０−員の二環式ヘテロアリール基は、＝Ｎ−原子である１〜３個の環員子を含有する（１０個の環員子の残りは炭素原子である）。

１０−員の縮合環二環式ヘテロアリール基の例は、キノリニル、イソキノリニル、シンノリニル、キナゾリニル、キノキサリニル、フタラジニル、１，６−ナフチリジニル、１，７−ナフチリジニル、１，８−ナフチリジニル、１，５−ナフチリジニル、２，６−ナフチリジニル、２，７−ナフチリジニル、ピリド［３，２−ｄ］ピリミジニル、ピリド［４，３−ｄ］ピリミジニル、ピリド［３，４−ｄ］ピリミジニル、ピリド［２，３−ｄ］ピリミジニル、ピリド［２，３−ｂ］ピラジニル、ピリド［３，４−ｂ］ピラジニル、ピリミド［５，４−ｄ］ピリミジニル、ピラジノ［２，３−ｂ］ピラジニル及びピリミド［４，５−ｄ］ピリミジニルである。

用語“ヘテロアリールアルキル”は、ヘテロアリール基で置換されたアルキルを意味する。

アシル基の例は、アルキル−Ｃ（＝Ｏ）−、シクロアルキル−Ｃ（＝Ｏ）−、アルケニル−Ｃ（＝Ｏ）−、シクロアルケニル−Ｃ（＝Ｏ）−、ヘテロアルキル−Ｃ（＝Ｏ）−、ヘテロシクロアルキル−Ｃ（＝Ｏ）−、アリール−Ｃ（＝Ｏ）−又はヘテロアリール−Ｃ（＝Ｏ）−、特にアルキル−Ｃ（＝Ｏ）−及びアリール−Ｃ（＝Ｏ）−などである。

特に明記されない限り、本明細書において基の組合せが一つの部分として言及されている場合（例えばアリールアルキル）、最後に言及された基が、その部分を残りの分子に結合させる原子を含有する。

アルキル基又は他の基の炭素原子がＯ、Ｓ（Ｏ）_ｔ又はＮによって置換されていると言及される場合、意図するところは、

が、

によって置換されている；
−ＣＨ＝が−Ｎ＝によって置換されている；
≡Ｃ−Ｈが≡Ｎによって置換されている；又は
−ＣＨ_２−が、−Ｏ−、−Ｓ（Ｏ）_ｔ−又は−ＮＲ^Ｎ−によって置換されている
ということである。

明確にするために述べると、上記ヘテロ原子含有基（例えばヘテロアルキルなど）に関し、Ｃ_３−６ヘテロアルキルなどのように炭素原子の数値が与えられている場合、意図するところは、Ｃ_３−６アルキルをベースにした基であって、その３〜６個の鎖炭素原子のうちの１個又は複数個がＯ、Ｓ（Ｏ）_ｔ又はＮによって置換されているということである。従って、Ｃ_３−６ヘテロアルキル基は、例えば３〜６個未満の鎖炭素原子しか含有していないことになる。

上で言及したＲ^Ｎは、Ｈ、アルキル、シクロアルキル、アリール、ヘテロアリール、−Ｃ（Ｏ）−アルキル、−Ｃ（Ｏ）−アリール、−Ｃ（Ｏ）−ヘテロアリール、−Ｓ（Ｏ）_ｔ−アルキル、−Ｓ（Ｏ）_ｔ−アリール又は−Ｓ（Ｏ）_ｔ−ヘテロアリールである。Ｒ^Ｎは、特に、Ｈ、アルキル（例えばＣ_１−６アルキル）又はシクロアルキル（例えばＣ_３−６シクロアルキル）でありうる。

上で言及したｔは、独立に、０、１又は２、例えば２である。典型的にはｔは０である。

基が、置換されうる少なくとも２つの位置を有する場合、その基は、アルキレン又はヘテロアルキレン鎖の両端によって置換されて環状部分を形成することもできる。

本発明の化合物の置換されていてもよい基（例えば、アルキル、シクロアルキル、アルコキシ、アルケニル、シクロアルケニル、アルキニル、アルキレン、アルケニレン、ヘテロアルキル、ヘテロシクロアルキル、ヘテロアルケニル、ヘテロシクロアルケニル、ヘテロアルキニル、ヘテロアルキレン、ヘテロアルケニレン、アリール、アリールアルキル、アリールヘテロアルキル、ヘテロアリール、ヘテロアリールアルキル又はヘテロアリールヘテロアルキル基など）は、置換されていても又はされていなくてもよく、一態様においては非置換である。典型的には、置換は、１個の置換基による１個の水素原子の、又は＝Ｏによる置換の場合、２個の水素原子の理論的置換を含む。

置換されている場合、一般的に１〜３個の置換基、一態様においては１又は２個の置換基、一態様においては１個の置換基が存在することになる。

任意選択の置換基は、独立に、ハロゲン、トリハロメチル、トリハロエチル、−ＯＨ、−ＮＨ_２、−ＮＯ_２、−ＣＮ、−Ｎ^＋（Ｃ_１−６アルキル）_２Ｏ⁻、−ＣＯ_２Ｈ、−ＣＯ_２Ｃ_１−６アルキル、−ＳＯ_３Ｈ、−ＳＯＣ_１−６アルキル、−ＳＯ_２Ｃ_１−６アルキル、−ＳＯ_３Ｃ_１−６アルキル、−ＯＣ（＝Ｏ）ＯＣ_１−６アルキル、−Ｃ（＝Ｏ）Ｈ、−Ｃ（＝Ｏ）Ｃ_１−６アルキル、−ＯＣ（＝Ｏ）Ｃ_１−６アルキル、＝Ｏ、−ＮＨ（Ｃ_１−６アルキル）、−Ｎ（Ｃ_１−６アルキル）_２、−Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ_２、−Ｃ（＝Ｏ）Ｎ（Ｃ_１−６アルキル）_２、−Ｎ（Ｃ_１−６アルキル）Ｃ（＝Ｏ）Ｏ（Ｃ_１−６アルキル）、−Ｎ（Ｃ_１−６アルキル）Ｃ（＝Ｏ）Ｎ（Ｃ_１−６アルキル）_２、−ＯＣ（＝Ｏ）Ｎ（Ｃ_１−６アルキル）_２、−Ｎ（Ｃ_１−６アルキル）Ｃ（＝Ｏ）Ｃ_１−６アルキル、−Ｃ（＝Ｓ）Ｎ（Ｃ_１−６アルキル）_２、−Ｎ（Ｃ_１−６アルキル）Ｃ（＝Ｓ）Ｃ_１−６アルキル、−ＳＯ_２Ｎ（Ｃ_１−６アルキル）_２、−Ｎ（Ｃ_１−６アルキル）ＳＯ_２Ｃ_１−６アルキル、−Ｎ（Ｃ_１−６アルキル）Ｃ（＝Ｓ）Ｎ（Ｃ_１−６アルキル）_２、−Ｎ（Ｃ_１−６アルキル）ＳＯ_２Ｎ（Ｃ_１−６アルキル）_２、−Ｃ_１−６アルキル、−Ｃ_１−６ヘテロアルキル、−Ｃ_３−６シクロアルキル、−Ｃ_３−６ヘテロシクロアルキル、−Ｃ_２−６アルケニル、−Ｃ_２−６ヘテロアルケニル、−Ｃ_３−６シクロアルケニル、−Ｃ_３−６ヘテロシクロアルケニル、−Ｃ_２−６アルキニル、−Ｃ_２−６ヘテロアルキニル、−Ｚ^ｕ−Ｃ_１−６アルキル、−Ｚ^ｕ−Ｃ_３−６シクロアルキル、−Ｚ^ｕ−Ｃ_２−６アルケニル、−Ｚ^ｕ−Ｃ_３−６シクロアルケニル又は−Ｚ^ｕ−Ｃ_２−６アルキニルであり、ここでＺ^ｕは、独立に、Ｏ、Ｓ、ＮＨ又はＮ（Ｃ_１−６アルキル）である。

別の態様において、任意選択の置換基は、独立に、ハロゲン、トリハロメチル、トリハロエチル、−ＮＯ_２、−ＣＮ、−Ｎ^＋（Ｃ_１−６アルキル）_２Ｏ⁻、−ＣＯ_２Ｈ、−ＳＯ_３Ｈ、−ＳＯＣ_１−６アルキル、−ＳＯ_２Ｃ_１−６アルキル、−Ｃ（＝Ｏ）Ｈ、−Ｃ（＝Ｏ）Ｃ_１−６アルキル、＝Ｏ、−Ｎ（Ｃ_１−６アルキル）_２、−Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ_２、−Ｃ_１−６アルキル、−Ｃ_３−６シクロアルキル、−Ｃ_３−６ヘテロシクロアルキル、−Ｚ^ｕＣ_１−６アルキル又は−Ｚ^ｕ−Ｃ_３−６シクロアルキルであり、ここでＺ^ｕは上記定義の通りである。

別の態様において、任意選択の置換基は、独立に、ハロゲン、トリハロメチル、−ＮＯ_２、−ＣＮ、−ＣＯ_２Ｈ、−Ｃ（＝Ｏ）Ｃ_１−６アルキル、＝Ｏ、−Ｎ（Ｃ_１−６アルキル）_２、−Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ_２、−Ｃ_１−６アルキル、−Ｃ_３−６シクロアルキル、−Ｃ_３−６ヘテロシクロアルキル、−Ｚ^ｕＣ_１−６アルキル又は−Ｚ^ｕ−Ｃ_３−６シクロアルキルであり、ここでＺ^ｕは上記定義の通りである。

別の態様において、任意選択の置換基は、独立に、ハロゲン、−ＮＯ_２、−ＣＮ、−ＣＯ_２Ｈ、＝Ｏ、−Ｎ（Ｃ_１−６アルキル）_２、−Ｃ_１−６アルキル、−Ｃ_３−６シクロアルキル又は−Ｃ_３−６ヘテロシクロアルキルである。別の態様において、任意選択の置換基は、独立に、ハロゲン、−ＯＨ、−ＮＨ_２、−ＮＨ（Ｃ_１−６アルキル）、−Ｎ（Ｃ_１−６アルキル）_２、−Ｃ_１−６アルキル、−Ｃ_３−６シクロアルキル又は−Ｃ_３−６ヘテロシクロアルキルである。

本明細書において、“本発明のポリマー”及び“式Ｉのポリマー”などの用語は、その薬学的に許容可能な誘導体ならびにその多形、異性体及び同位体標識体を含む。

用語“薬学的に許容可能な誘導体”は、式Ｉの化合物のあらゆる薬学的に許容可能な塩、溶媒和物、水和物又はプロドラッグを含む。一態様のいて、薬学的に許容可能な誘導体は、式Ｉの化合物の薬学的に許容可能な塩、溶媒和物又は水和物である。

用語“薬学的に許容可能な塩”は、無機又は有機酸及び塩基を含む薬学的に許容可能な非毒性の酸又は塩基から製造される塩を含む。

塩基性の基、例えばアミノ基を含有する式Ｉの化合物は、酸とともに薬学的に許容可能な塩を形成することができる。一態様において、式Ｉの化合物の薬学的に許容可能な酸付加塩は、ハロゲン化水素酸（例えば、塩酸、臭化水素酸及びヨウ化水素酸）、硫酸、硝酸及びリン酸などの無機酸の塩を含むが、これらに限定されない。一態様において、式Ｉの化合物の薬学的に許容可能な酸付加塩は、脂肪族、芳香族、カルボン酸系及びスルホン酸系の有機酸などの有機酸の塩を含むが、これらに限定されない。例を挙げると、脂肪族モノカルボン酸、例えばギ酸、酢酸、プロピオン酸又は酪酸；脂肪族ヒドロキシ酸、例えば乳酸、クエン酸、酒石酸又はリンゴ酸；ジカルボン酸、例えばマレイン酸又はコハク酸；芳香族カルボン酸、例えば安息香酸、ｐ−クロロ安息香酸、フェニル酢酸、ジフェニル酢酸又はトリフェニル酢酸；芳香族ヒドロキシル酸、例えばｏ−ヒドロキシ安息香酸、ｐ−ヒドロキシ安息香酸、１−ヒドロキシナフタレン−２−カルボン酸又は３−ヒドロキシナフタレン−２−カルボン酸；及びスルホン酸、例えばメタンスルホン酸、エタンスルホン酸又はベンゼンスルホン酸などである。式Ｉの化合物の他の薬学的に許容可能な酸付加塩は、グリコール酸、グルクロン酸、フロ酸（フランカルボン酸）、グルタミン酸、アントラニル酸、サリチル酸、マンデル酸、エンボン酸（パモ酸）、パントテン酸、ステアリン酸、スルファニル酸、アルギン酸(algenic acid)及びガラクツロン酸の塩などであるが、これらに限定されない。式Ｉの化合物が複数の塩基性基を含む場合、複数の中心がプロトン化されて多塩、例えば式Ｉの化合物の二塩又は三塩を生じうる。例えば、本明細書中に記載の式Ｉの化合物のハロゲン化水素酸塩は、一ハロゲン化水素酸塩、二ハロゲン化水素酸塩又は三ハロゲン化水素酸塩などでありうる。一態様において、塩は、上に開示されたいずれかの酸の付加から得られるものなどであるが、これらに限定されない。式Ｉの化合物の一態様において、二つの塩基性基が酸付加塩を形成する。更なる態様において、二つの付加塩の対イオンは同じ種である（例えばジヒドロクロリド、ジヒドロスルフィドなど）。典型的には、薬学的に許容可能な塩は、二塩酸塩のような塩酸塩である。

酸性の基、例えばカルボキシル基を含有する式Ｉの化合物は、塩基とともに薬学的に許容可能な塩を形成することができる。一態様において、式Ｉの化合物の薬学的に許容可能な塩基性塩は、アルカリ金属又はアルカリ土類金属塩のような金属塩（例えば、ナトリウム、カリウム、マグネシウム又はカルシウム塩）及び亜鉛又はアルミニウム塩などであるが、これらに限定されない。一態様において、式Ｉの化合物の薬学的に許容可能な塩基性塩は、アンモニア又は薬学的に許容可能な有機アミン又はヘテロサイクリック塩基、例えばエタノールアミン（例えばジエタノールアミン）、ベンジルアミン、Ｎ−メチル−グルカミン、アミノ酸（例えばリシン）又はピリジンとともに形成される塩などであるが、これらに限定されない。

酸及び塩基の半塩も形成されうる（例えばヘミ硫酸塩）。

式Ｉの化合物の薬学的に許容可能な塩は、当該技術分野で周知の方法によって製造できる。

薬学的に許容可能な塩の再検討に関しては、Ｓｔａｈｌ及びＷｅｒｍｕｔｈ，Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓａｌｔｓ：Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ， Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ ａｎｄ Ｕｓｅ（Ｗｉｌｅｙ−ＶＣＨ，ドイツ・ワインハイム，２００２）参照。

本発明の化合物は非溶媒和物形でも溶媒和物形でも存在しうる。用語“溶媒和物”は、本発明の化合物と一つ又は複数の薬学的に許容可能な溶媒分子、例えば水又はＣ_１−６アルコール、例えばエタノールとを含む分子錯体を含む。用語“水和物”とは、溶媒が水である“溶媒和物”を意味する。

本発明の化合物は、アモルファス形ないし結晶形の固体状態で存在しうる。すべてのそのような固体形も本発明に含まれる。

本発明の化合物は、一つ又は複数の幾何、光学、エナンチオ、ジアステレオ及び互変異性体形、例えば、特に制限されないが、シス及びトランス形、Ｅ−及びＺ−形、Ｒ−、Ｓ−及びメソ−形、ケト及びエノール形で存在しうる。すべてのそのような異性体形も本発明に含まれる。異性体形は、異性体的に純粋な形態又は富化形態のほか、異性体の混合物（例えばラセミ混合物又はジアステレオマー混合物）でもよい。

本発明は、式Ｉの薬学的に許容可能な同位体標識化合物も含む。すなわち、１個又は複数個の原子が、同じ原子番号を有するが原子質量又は質量数は天然に通常見られる原子質量又は質量数とは異なる原子によって置換されている化合物である。

本発明の化合物に含めるのに適切な同位体の例は、水素の同位体、例えば^２Ｈ及び^３Ｈ、炭素の同位体、例えば^１１Ｃ、^１３Ｃ及び^１４Ｃ、塩素の同位体、例えば^３６Ｃｌ、フッ素の同位体、例えば^１８Ｆ、ヨウ素の同位体、例えば^１２３Ｉ及び^１２５Ｉ、窒素の同位体、例えば^１３Ｎ及び^１５Ｎ、酸素の同位体、例えば^１５Ｏ、^１７Ｏ及び^１８Ｏ、リンの同位体、例えば^３２Ｐ、及び硫黄の同位体、例えば^３５Ｓを含む。式Ｉのある種の同位体標識化合物、例えば放射性同位体を組み込んだものは、薬物及び／又は基質の組織分布研究に有用である。放射性同位体の^３Ｈ及び^１４Ｃは、それらの組込みの容易性及び既成の検出手段の観点からこの目的に特に有用である。

^１１Ｃ、^１８Ｆ、^１５Ｏ及び^１３Ｎのような陽電子放出同位体による置換は、基質受容体占有(substrate receptor occupancy)を調べるための陽電子放出トポグラフィー（ＰＥＴ）研究に有用でありうる。

同位体標識された式Ｉの化合物は、一般的に、当業者に公知の従来技術によって、又は前に使用された非標識試薬の代わりに適切な同位体標識試薬を使用して本明細書中に記載の方法と類似の方法によって製造することができる。

本明細書中に記載のポリマーは任意の数の置換基又は官能部分で置換されうることは分かるであろう。本明細書においては、置換されている(substituted)という用語（その前に“任意に(optionally)”という用語が付いているいないに関わらず）及び置換基という用語は、当業者には分かる通り、すべての原子の価数が維持されている限り、一つの官能基を別の官能基と交換する能力のことを言う。任意の所与の構造中の二つ以上の位置が、特定の群から選ばれる二つ以上の置換基で置換されうる場合、置換基はどの位置においても同じでも又は異なっていてもよい。置換基がさらに置換されていてもよい（例えば、置換基がアリール基の場合、別のアリール基のような別の置換基を有することができ、それもさらに一つ又は複数の位置でフッ素で置換されている）。

本明細書において、チオヒドロキシル又はチオールという用語は、式−ＳＨの基のことを言う。

本発明はさらに、活性薬剤と式Ｉのポリマーとを含む組成物も提供する。組成物は、活性薬剤とポリマーを含有するナノ粒子及び／又はミクロ粒子を含みうる。組成物は、式Ｉで定義された二つ以上の異なるポリマーを含んでいてもよい。例えば、組成物は、Ｒ_１及びＲ_２ともＣｙｓＬｙｓＬｙｓＬｙｓである式Ｉのポリマーと、Ｒ_１及びＲ_２ともＣｙｓＨｉｓＨｉｓＨｉｓである式Ｉのポリマーを含んでいてもよい。

活性薬剤はポリヌクレオチド、タンパク質又は小分子でありうる。典型的には、活性薬剤はポリヌクレオチドである。ポリヌクレオチドは、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ及びｍｉＲＮＡからなる群から、好ましくはｓｉＲＮＡ及びｍｉＲＮＡからなる群から選ばれうる。一態様において、ポリヌクレオチドは、ＤＮＡ、ＲＮＡ及びｓｉＲＮＡからなる群から選ばれる。

典型的には、ポリヌクレオチドは少なくとも３個のヌクレオチドを含む。好ましくは、ポリヌクレオチドは、２０〜３０ヌクレオチドの長さ、さらに好ましくは２０〜２５ヌクレオチドの長さ、例えば２２ヌクレオチドの長さである。

ポリヌクレオチドは、天然ヌクレオシド（すなわち、アデノシン、チミジン、グアノシン、シチジン、ウリジン、イノシン、キサントシン、デオキシアデノシン、デオキシチミジン、デオキシグアノシン、デオキシイノシン、及びデオキシシチジン）、ヌクレオシド類似体（例えば、２−アミノアデノシン、２−チオチミジン、イノシン、ピロロ−ピリミジン、３−メチルアデノシン、Ｃ５−プロピニルシチジン、Ｃ５−プロピニルウリジン、Ｃ５−ブロモウリジン、Ｃ５−フルオロウリジン、Ｃ５−ヨードウリジン、Ｃ５−メチルシチジン、７−デアザアデノシン、７−デアザグアノシン、８−オキソアデノシン、８−オキソグアノシン、Ｏ（６）−メチルグアニン、及び２−チオシチジン）、又はそれらの混合物から誘導されうる。ヌクレオチドは、化学修飾塩基、生物修飾塩基（例えばメチル化塩基）、挿入塩基(intercalated base)、非修飾又は修飾糖（例えば、２’−フルオロリボース、リボース、２’−デオキシリボース、アラビノース、及びヘキソース）、及び／又は非修飾又は修飾リン酸基（例えば、ホスホロチオエート及び５’−Ｎ−ホスホロアミダイト結合）から誘導されうる。

本明細書において、用語“小分子”とは、比較的低い分子量を有し、タンパク質でもポリペプチドでも又はポリヌクレオチドでもない有機化合物のことを言う。それらは天然のものでも、人工的に創製されたものでもよい（例えば化学合成により）。典型的には、小分子は約１５００ｇ／ｍｏｌ未満の分子量を有する。

本発明のナノ粒子について以下でさらに検討する。この検討はミクロ粒子にも等しく適用されることは理解されるであろう。

ナノ粒子は、ポリヌクレオチドと、式Ｉのポリマー（一つの又は各オリゴペプチドはｐＨ７で正味の正電荷を有する）とを含みうる。正に荷電したオリゴペプチドは、負に荷電したポリヌクレオチドとナノ粒子形成工程中に相互作用し、ポリヌクレオチドのナノ粒子へのカプセル化を容易にする。

ナノ粒子は、式Ｉ又はIIのポリマー（一つの又は各オリゴペプチドはｐＨ７で正味の負電荷を有する）と、ｐＨ７で正味の正電荷を有する活性薬剤とを含みうる。負に荷電したオリゴペプチドは、正に荷電した活性薬剤とナノ粒子形成工程中に相互作用し、活性薬剤のナノ粒子へのカプセル化を容易にする。

ナノ粒子は、任意に、本発明の異なるポリマーの混合物を含んでいてもよい。例えば、ナノ粒子は、
（ａ）式Ｉ又は式IIによるポリマーであって、一つの又は各オリゴペプチドがｐＨ７で正味の正電荷を有するポリマー；及び
（ｂ）式Ｉ又は式IIによるポリマーであって、一つの又は各オリゴペプチドがｐＨ７で正味の負電荷を有するポリマー
を含んでいてもよい。

従って、本発明は、上記ポリマー（ａ）と（ｂ）の割合を変更することによって正味の表面電荷が変動しうるナノ粒子を提供する。（ａ）対（ｂ）の比率は、重量比で１：９９、５：９５、１０：９０、２５：７５、５０：５０、７５：２５、９０：１０、９５：５、又は９９：１でありうる。

そのようなナノ粒子は、薬物のカプセル化にもポリヌクレオチドのカプセル化にも適しており、改良された薬理学的特性を示す。

ｐＨ７で正味の負電荷を有するオリゴペプチドで修飾されたポリマーの集団の包含により、短いＤＮＡ及びＲＮＡ配列のナノ沈殿によるカプセル化が促進される。短いＤＮＡ及びＲＮＡ配列は、当該技術分野で公知のＰＢＡＥｓを用いたナノ沈殿工程で使用されると、長い配列より低いカプセル化効率及び／又は低い絶対担持量しか示さない。本発明者らは、本明細書中に記載の負に荷電したポリマーのような他のポリアニオン性種を加えると、ナノ沈殿工程中、ポリマー及びポリヌクレオチドを含有する得られるナノ粒子の組立に役立つことを見出した。

これは、特に、約２０〜３０塩基対の長さしかなく、体内の循環中で不安定な、ｓｉＲＮＡ及びｍｉＲＮＡのような短鎖ポリヌクレオチドのカプセル化に有用である。ｓｉＲＮＡ及びｍｉＲＮＡのような短鎖ポリヌクレオチドのナノ粒子への組込みは、それらの低電荷のためにこれまで困難であった。

本発明者らは、一つの又は各オリゴペプチドがｐＨ７で正味の正電荷を有する式Ｉ又は式IIによるポリマーと、一つの又は各オリゴペプチドがｐＨ７で正味の負電荷を有する式Ｉ又は式IIによるポリマーとの組合せを使用すると、ｓｉＲＮＡ又はｍｉＲＮＡのような短鎖ポリヌクレオチドのナノ粒子への組込み(loading)を高いカプセル化効率及び高い担持量(loading)で可能にすることを見出した。さらに、上記２種類のポリマーの使用は、短鎖ポリヌクレオチドの分解を防止し、より効率的なトランスフェクションを可能にする。正に荷電したオリゴヌクレオチドは負に荷電したポリヌクレオチドの周りに“巻き付き”、負に荷電したオリゴヌクレオチドは正に荷電したオリゴヌクレオチドの周りに“巻き付き”、過剰の電荷を中和すると考えられている（発明者らにより“マントル効果”と呼ばれる）。

さらに、ｐＨ７で正味の負電荷を有するオリゴペプチドで修飾されたポリマーの包含は、ナノ粒子が腸粘膜及び肺粘膜のような複雑な身体障壁を通過して送達されることを容易にする。なぜならば、正味の表面電荷変化はこれらの障壁との相互作用中に変動しうるからである。

本発明のナノ粒子は、高い活性薬剤含有量及び高いカプセル化効率で形成できる。

本明細書において、活性薬剤カプセル化効率とは、ナノ粒子に組み込まれる活性薬剤を、活性薬剤含有ナノ粒子の製造法で使用される全活性薬剤の重量パーセンテージで表したもののことを言う。典型的には９５％以下、さらに典型的には７０％〜９５％である。

本明細書において、活性薬剤取込み(entrapment)とは、活性薬剤担持ナノ粒子中の活性薬剤の重量パーセンテージのことを言う。活性薬剤の取込みは、好ましくは少なくとも２ｗｔ％、さらに好ましくは少なくとも５ｗｔ％、さらに好ましくは少なくとも１０ｗｔ％、典型的には２ｗｔ％〜２０ｗｔ％、さらに好ましくは５ｗｔ％〜２０ｗｔ％、さらに好ましくは１０ｗｔ％〜２０ｗｔ％の範囲である。

組成物がナノ粒子を含む場合、好ましくは、ナノ粒子は組成物の約１％〜約９０重量％を構成する。さらに好ましくは、ナノ粒子は組成物の約５％〜約５０重量％、さらに好ましくは、約１０％〜約３０％を構成する。組成物はさらにビヒクルを含んでいてもよい。ビヒクルは、当該技術分野で公知の任意の薬学的に許容可能な希釈剤又は賦形剤でよい。ビヒクルは典型的には薬理学的に不活性である。好ましくは、ビヒクルは極性液体である。特に好適なビヒクルは、水、及び塩及び／又はバッファーを含有する生理学的に許容可能な水溶液、例えば生理食塩水又はリン酸緩衝生理食塩水などである。任意に、ビヒクルは生体液であってもよい。液体ビヒクルは、貯蔵のため、又は、肺もしくは鼻腔投与用粉末、注入懸濁液用粉末、又は経口投与用の錠剤もしくはカプセルを提供するために、例えば、凍結乾燥、蒸発又は遠心分離によって除去することができる。

活性薬剤（単数又は複数種類）は、ナノ粒子の内部に存在しても又はナノ粒子の表面に存在してもよい。典型的には、活性薬剤はナノ粒子の内部に存在する。活性薬剤（単数又は複数種類）とナノ粒子間の相互作用は、典型的には非共有結合で、例えば、水素結合、静電相互作用又は物理的カプセル化である。典型的には、相互作用は静電気的である。

ナノ粒子は、哺乳動物体内に入った後も十分な量のナノ粒子が実質的に無傷のままで、所望の標的に到達して所望の生理学的作用を達成できるように、生体適合性であり、それらの使用環境に対して十分抵抗性である。本明細書中に記載のポリマーは、生体適合性であり、好ましくは生分解性である。

本明細書において、用語“生体適合性”は、有害反応を引き起こすことなく生体内に挿入又は注入できる物質と説明される。例えば、その物質は、適切に制御できない炎症又は免疫系による急性拒絶を引き起こさない。“生体適合性”は相対的用語であり、生体組織との適合性が非常に高い物質でさえも一定程度の免疫反応は予期されることは認識されるであろう。物質の生体適合性を評価するためのインビトロ試験は、それを細胞に暴露することである。生体適合性物質は、典型的には中程度の濃度で（例えば２９μｇ／１０^４細胞）で重大な細胞死（例えば、＞２０％）を招かない。

本明細書において、用語“生分解性”は、生理学的環境中で分解して、細胞によって再使用できる又は重大な毒作用なしに処分できるモノマー及び／又はその他の非ポリマー性部分を形成するポリマーと説明される。分解は、例えば酵素活性又は細胞機構による生物的分解でも、又は化学的分解（典型的には生理学的条件下で起こる化学プロセス）でもよい。ポリマーの分解は、使用されるポリマー又はコポリマーに応じて、半減期が日、週、月、又は年の単位など、様々な速度で起こりうる。成分は好ましくはインビボで炎症又はその他の有害作用を誘発しない。一定の好適な態様において、生分解性化合物を分解するために依拠する化学反応は無触媒性である。

本明細書において、用語“ナノ粒子”とは、約１〜約１０００ｎｍの直径を有する固体粒子のことを言う。本明細書において、用語“ミクロ粒子”とは、約１μｍ〜約１００μｍの直径を有する固体粒子のことを言う。本発明のナノ粒子の平均直径は、当該技術分野で公知の方法、好ましくは動的光散乱によって決定できる。特に、本発明は、動的光散乱により、散乱角９０°及び温度２５℃で、ろ過水で適切に希釈されたサンプル及び適切な装置、例えばＭａｌｖｅｒｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ社（英国）製Ｚｅｔａｓｉｚｅｒ^ＴＭ装置を用い、標準試験法ＩＳＯ ２２４１２：２００８（キュムラント法Ａ．１．３．２）に従って分析された場合に、約１〜約１０００ｎｍの直径を有する固体粒子であるナノ粒子に関する。粒子がｘｎｍの直径を有すると言われる場合、一般的にはこの平均の周りに粒子が分布しているが、粒子の数の少なくとも５０％（例えば、＞６０％、＞７０％、＞８０％、＞９０％、又はそれより大）はｘ±２０％の範囲内の直径を有する。

好ましくは、ナノ粒子の直径は、約１０〜約１０００ｎｍ、さらに好ましくは約５〜約５００ｎｍ、さらに好ましくは約５０〜約４００ｎｍ、さらに好ましくは約５０〜約１５０ｎｍである。あるいは、ナノ粒子の直径は約１〜約１００ｎｍである。一態様において、ナノ粒子は、１０％未満、好ましくは５％未満、好ましくは１％未満の凝集度(degree of agglomeration)を示し、好ましくは、ナノ粒子は透過電子顕微鏡法による測定で実質的に非凝集である。

本発明はさらに、薬剤を式Ｉ又は式IIのポリマーマトリックス中にカプセル化してナノ粒子を形成する方法も提供する。該方法は、薬剤を準備し；ポリマーを準備し；そして薬剤とポリマーを適切な条件下で接触させてナノ粒子を形成させる工程を含む。特に、薬剤とポリマーは、所望の比率を得るのに適切な濃度で溶液中で混合され、激しく混合した後、約３７℃のオーブン中で約３０分間インキュベートされうる。

本発明はさらに、式Ｉのポリマーの合成法も提供する。該方法は、スキーム２に示されているように、式II（式中、Ｌ_３は上記定義の通り）の化合物を、式Ｌ_４Ｈ_２（式中、Ｌ_４は上記定義の通り）の第一アミンと反応させて式IIIのポリマーを製造する工程を含む。

式IIIの化合物をさらに式IVの化合物と反応させて、式Ｖ：

の化合物を形成させる。上記式中、ｐ及びＲ_ａは、独立に、出現するたびに、上に定義されたリストから選ばれる。場合によっては、ｐは出現するたびに同じであり、Ｒ_ａ基は、硫黄連結から始まるＲ_ａ基の配列が化合物の各末端で同じであるように選ばれる。すなわち、ｐ及びＲ_ａは、ポリマーがＬ_４に対して２倍の対称を有するように選ばれる。

上記工程の代替において、式IIIの化合物をさらに式Ｈ_２ＮＲ_ｙ（式中、Ｒ_ｙは上記定義の通り）の化合物及び式IVの化合物と反応させ、得られた混合物を分離して、式VI：

の化合物を得る。上記式中、Ｒ_ａは、独立に、出現するたびに、上に定義されたリストから選ばれ、ｐは上記定義の通りである。

式IIIの化合物にオリゴペプチドを結合させる更なる方法も、当業者には利用可能であることは分かるであろう。当業者であれば、式IIIの末端アクリレート基における反応のための適切な求核試薬を承知しているであろう。

図１は、様々なオリゴペプチド末端修飾ＰＢＡＥｓとｐＧＦＰプラスミドを５０：１の比（ｗ／ｗ）で使用して製造されたポリマー−ＤＮＡ複合体の流体力学直径とゼータ電位を示す。 図２は、ＤＮＡと複合体化されたオリゴペプチド末端修飾ＰＢＡＥｓ及び参照ポリマーのアガロースゲル電気泳動分析を示す。 図３は、オリゴペプチド末端修飾ＰＢＡＥｓ及び参照ポリマーの緩衝能を示す。 図４は、様々なオリゴペプチド末端修飾ＰＢＡＥｓ及び参照ポリマーをトランスフェクトされた（ａ）ｃｏｓ−７、（ｂ）ｈｎＤｆ及び（ｃ）ＨａＣａＴ細胞におけるＧＦＰ発現のフローサイトメトリー分析を示す。 図５は、様々なオリゴペプチド末端修飾ＰＢＡＥｓをトランスフェクトされたｃｏｓ−７細胞の生存率を示す。 図６は、様々なオリゴペプチド末端修飾ＰＢＡＥｓとＧＦＰ特異的ｓｉＲＮＡを２００：１の比（ｗ／ｗ）で使用して製造されたポリマー−ｓｉＲＮＡ複合体の流体力学直径とゼータ電位を示す。 図７は、様々なオリゴペプチド末端修飾ＰＢＡＥｓを用いてＧＦＰ特異的ｓｉＲＮＡをトランスフェクトされたＭＤＡ−ＭＢ−２３１／ＧＦＰ細胞におけるＧＦＰ発現サイレンシングのフローサイトメトリー分析を示す。 図８は、ウシインスリンをグルタミン酸及びリシン末端修飾ＰＢＡＥｓを用いて最終のポリマー：タンパク質比２００：１（ｗ／ｗ）でカプセル化した場合のカプセル化の程度を示す。

本発明を以下の実施例によってさらに説明する。当然のことながら、実施例は説明のためだけに提供されるものであり、上記の本発明を制限する意図はないことは理解されるであろう。詳細の修正は本発明の範囲を逸脱することなく実施することができる。

材料
試薬及び溶媒は、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社及びＰａｎｒｅａｃ社より入手し、特に記載のない限り、そのまま使用した。プラスミドｐｍａｘＧＦＰ（３４８６ｂｐ）はＡｍａｘａ社から入手した。細胞株は、ＡＴＣＣ（バージニア州マナッサス）から入手し、３７℃、５％ＣＯ２雰囲気下にて、Ｇｉｂｃｏ社より入手した、１０％ウシ胎仔血清、１００単位／ｍｌのペニシリン、１００ｕｇ／ｍＬのストレプトマイシン、０．１ｍＭのＭＥＭ非必須アミノ酸（ＮＥＡＡ）、２ｍＭのＬ−グルタミンを含有する完全ＤＭＥＭ中に維持した。

実施例１：ＰＢＡＥポリマーの合成
ポリ（β−アミノエステル）は、文献（例えば、Ｍｏｎｔｓｅｒｒａｔ，Ｎ．ら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２８６，１２４１７−１２４２８（２０１１））に記載されている２工程手順に従って合成した。最初に、アクリレート末端ポリマーを、第一アミンとジアクリレートの付加反応によって合成した（アミン：ジアクリレートを１：１．２のモル比で）。最後に、得られたアクリレート末端ポリマーを異なる種類のアミン−及びチオール−含有部分(amine- and thiol-bearing moieties)で末端キャッピング修飾することにより、ＰＢＡＥｓを得た。合成された構造は、^１Ｈ−ＮＭＲ及びＦＴ−ＩＲ分析により確認した。ＮＭＲスペクトルは、４００ＭＨｚ Ｖａｒｉａｎ（Ｖａｒｉａｎ ＮＭＲ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ社、イリノイ州Ｃｌａｒｅｄｏｎ Ｈｉｌｌｓ）にて記録し、メタノール−ｄ_４を溶媒として使用した。ＩＲスペクトルは、Ｎｉｃｏｌｅｔ Ｍａｇｎａ ５６０（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社、マサチューセッツ州ウォルサム）とＫＢｒビームスプリッターを用い、蒸着膜中の溶媒としてメタノールを使用して得た。分子量測定は、２本のＧＰＣ Ｕｌｔｒａｓｔｙｒａｇｅｌカラム、１０^３及び１０^４Å（５μｍ混合、３００ｍｍ×１９ｍｍ、Ｗａｔｅｒｓ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ社、米国マサチューセッツ州ミルフォード）を備えたＨｅｗｌｅｔｔ−Ｐａｃｋａｒｄ １０５０ Ｓｅｒｉｅｓ ＨＰＬＣシステム上で、ＴＨＦを移動相として実施した。分子量は、ポリスチレン標準のリテンションタイムとの比較により算出した。

実施例２：アクリレート末端中間体の合成
１，４−ブタンジオールジアクリレート（８．９６ｇ、４．０７×１０^−２ｍｏｌ）と５−アミノ−１−ペンタノール（３．５ｇ、３．３９×１０^−２ｍｏｌ）をバイアル中で混合した。混合物を９０℃で２４時間撹拌した後、室温に冷却して、わずかに黄色の粘稠固体、アクリレート末端中間体（Ｃ３２とする）を形成させた。中間体Ｃ３２は、次の工程で使用されるまで４℃で保管された。

実施例３（比較）：第一アミンで末端修飾されたＰＢＡＥｓの合成
第一アミンで末端修飾されたＰＢＡＥｓを、Ｚｕｇａｔｅｓ，Ｇ．Ｔ．ら，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍ．１８，１８８７−１８９６（２００７）に規定されているようにして製造した。中間体Ｃ３２（１ｇ、０．５ｍｍｏｌ）のＴＨＦ（２ｍｌ）中溶液を１，５−ジアミノ−２−メチル−ペンタン（０．２４ｇ、０．２７１ｍｌ、２ｍｍｏｌ）のＴＨＦ（８ｍｌ）中溶液と混合した。混合物を室温で一晩撹拌し、次いでジエチルエーテル（１００ｍｌ）中に沈殿させ、最後に真空下で乾燥させた。

実施例４（比較）：第一アミンで末端修飾されたＰＢＡＥｓの更なる合成
ジアミン末端修飾ポリ（β−アミノエステル）、Ｂ３を、各所に記載の手順に従って合成した（Ｚｕｇａｔｅｓ，Ｇ．Ｔ．ら，Ｂｉｏｃｏｎｊ．Ｃｈｅｍ．１８ １８８７-１８９６（２００７）、Ｙａｎｇ，Ｆ．ら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．１０７ ３３１７-３３２２（２０１０）、Ｓｕｎｓｈｉｎｅ，Ｊ．Ｃ．Ｂｉｏｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ １２ ３５９２-３６００（２０１１））。簡潔に述べると、５−アミノ−１−ペンタノール（３．４４ｇ、３３ｍｍｏｌ）及び１，４−ブタンジオールジアクリレート（７．９３ｇ、４０ｍｍｏｌ）を、磁気撹拌下９０℃で２４時間重合させた。得られたアクリレート末端ポリマーＣ３２（１ｇ、０．４ｍｍｏｌ）及び２−メチル−１，５−ペンタンジアミン（０．２３ｇ、０．２７ｍＬ、２ｍｍｏｌ）をテトラヒドロフラン中に溶解し、室温で一晩撹拌した。得られたジアミン末端修飾ポリマーＢ３をジエチルエーテル中での沈殿により単離し、真空下で乾燥させた。
ＩＲ（蒸着膜）：ν = 1055, 1089, 1125, 1196 (C-O), 1257, 1463, 1733 (C=O), 2079, 2191, 2253, 2861, 2936, 3398 (N-H, O-H) cm^−１
１H-NMR (400 MHz, CD_３OD, TMS) (ppm): δ = 4.11 (t, CH_２-CH _２-O), 3.72 (t), 3,55 (t, CH_２-CH _２-OH), 2.87 (t, -NH-CH _２-CH_２-C(=O)-), 2.77 (t, CH_２-CH _２-N-), 2.60-2.51 (br, -NH-CH _２-(CH_２)_２-CH(CH_３)-NH-), 2.46 (br, >N-CH _２-(CH_２)_４-OH, >N-CH_２-CH _２-C(=O)-O), 1.87 (br), 1.73 (br), 1.60-1.41 (br, -O-CH_２-CH _２-CH _２-CH_２-O, -CH _２-CH_２-OH, -CH _２-CH_２-NH_２), 1.35 (br, -N-CH_２-CH _２-CH _２-(CH_２)_２-OH), 0.94 (d, CH _３-CH< ジアミン由来)。

実施例５：オリゴペプチドで末端修飾されたＰＢＡＥｓの合成
一般に、オリゴペプチド修飾ＰＢＡＥｓは以下のようにして得た。アクリレート−末端ポリマーＣ３２又はＣ３２ＳＳと、アミン−又はチオール−末端オリゴペプチドのいずれか（例えば、ＨＳ−Ｃｙｓ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ａｒｇ（ＣＲ３）、Ｈ_２Ｎ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ａｒｇ（Ｒ３）又はＨＳ−Ｃｙｓ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ（ＣＥ３）−他のオリゴペプチドも標準の一文字コードを用いる同様の略号により表記される）をＤＭＳＯ中に１：２のモル比で混合した。混合物を室温で一晩撹拌し、得られたポリマーをジエチルエーテル：アセトン（３：１）中での沈殿により得た。

（ａ）トリアルギニン末端修飾ＰＢＡＥｓを得るための以下の合成手順は一例として示される。中間体Ｃ３２を上記実施例１に記載のようにして製造した。中間体Ｃ３２（０．１５ｇ、０．０７５ｍｍｏｌ）のＤＭＳＯ（２ｍｌ）中溶液を、対応するオリゴペプチド（Ｃｙｓ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ａｒｇ（ＣＲ３；０．１１ｇ、０．１５ｍｍｏｌ）のＤＭＳＯ（１ｍＬ）中溶液と、適切なモル比、それぞれ１：２で混合した。混合物を室温で一晩撹拌し、次いでジエチルエーテル／アセトン（３：１）中で沈殿させた。

IR (蒸着膜): ν = 721, 801, 834, 951, 1029, 1133 (C-O), 1201, 1421, 1466, 1542, 1672 (C=O, ペプチドのアミド由来), 1731 (C=O, エステル由来), 2858, 2941, 3182, 3343 (N-H, O-H) cm^−１
１H-NMR (400 MHz, CD_３OD, TMS) (ppm): δ = 4.41-4.33 (br, NH_２-C(=O)-CH-NH-C(=O)-CH-NH-C(=O)-CH-NH-C(=O)-CH-CH_２-, 4.11 (t, CH_２-CH _２-O), 3.55 (t, CH_２-CH _２-OH), 3.22 (br, NH_２-C(=NH)-NH-CH _２-, OH-(CH_２)_４-CH _２-N-), 3.04 (t, CH_２-CH _２-N-), 2.82 (dd, -CH _２-S-CH _２), 2.48 (br, -N-CH_２-CH _２-C(=O)-O), 1.90 (m, NH_２-C(=NH)-NH-(CH_２)_２-CH _２-CH-), 1.73 (br, -O-CH_２-CH2-CH2-CH_２-O), 1.69 (m, NH_２-C(=NH)-NH-CH_２-CH _２-CH_２-), 1.56 (br, -CH _２-CH_２-CH _２-CH_２-OH), 1.39 (br, -N-(CH_２)_２-CH _２-(CH_２)_２-OH)。

（ｂ）トリリシン修飾オリゴペプチド（Ｋ３Ｃ−Ｃ３２−ＣＫ３）も同じプロトコルに従って製造され、以下のように特徴付けされた。
IR (蒸着膜): ν = 721, 799, 834, 1040, 1132, 1179 (C-O), 1201, 1397, 1459, 1541, 1675 (C=O, ペプチドのアミド由来), 1732 (C=O, エステル由来), 2861, 2940, 3348 (N-H, O-H) cm^−１
１H-NMR (400 MHz, CD_３OD, TMS) (ppm): δ = 4.38-4.29 (br, NH_２-(CH_２) _４-CH-), 4.13 (t, CH_２-CH _２-O-),3.73 (br,NH_２-CH-CH_２-S-), 3.55 (t, CH_２-CH _２-OH), 2.94 (br, CH_２-CH _２-N-, NH_２-CH _２-(CH_２)_３-CH-), 2.81 (dd, -CH _２-S-CH _２), 2.57 (br, -N-CH_２-CH _２-C(=O)-O), 1.85 (m, NH_２-(CH_２)_３-CH _２-CH-), 1.74 (br, -O-CH_２-CH2-CH2-CH_２-O), 1.68 (m, NH_２-CH_２-CH _２-(CH_２) _２-CH-), 1.54 (br, -CH _２-CH_２-CH _２-CH_２-OH), 1.37 (br, -N-(CH_２)_２-CH _２-(CH_２)_２-OH)。

（ｃ）トリヒスチジン修飾オリゴペプチド（Ｈ３Ｃ−Ｃ３２−ＣＨ３）も同じプロトコルに従って製造され、以下のように特徴付けされた。
IR (蒸着膜): ν = 720, 799, 832, 1040, 1132, 1201, 1335, 1403, 1467, 1539, 1674 (C=O, ペプチドのアミド由来), 1731 (C=O, エステル由来), 2865, 2941, 3336 (N-H, O-H) cm^−１
１H-NMR (400 MHz, CD_３OD, TMS) (ppm): δ = 8.0-7.0 (br -N(=CH)-NH-C(=CH)-) 4.61-4.36 (br, -CH2-CH-), 4.16 (t, CH_２-CH _２-O-), 3.55 (t, CH_２-CH _２-OH), 3.18 (t, CH_２-CH _２-N-, 3.06 (dd, -CH _２-CH-), 2.88 (br, OH-(CH_２)_４-CH _２-N-), 2.82 (dd, -CH _２-S-CH _２-), 2.72 (br, -N-CH_２-CH _２-C(=O)-O), 1.75 (br, -O-CH_２-CH2-CH2-CH_２-O), 1.65 (m, NH_２-CH_２-CH _２-(CH_２)_２ -CH-), 1.58 (br, -CH _２-CH_２-CH _２-CH_２-OH), 1.40 (br, -N-(CH_２)_２-CH _２-(CH_２)_２-OH)。

実施例６：非対称末端修飾を有するＰＢＡＥｓの合成
一般に、非対称オリゴペプチド修飾ＰＢＡＥｓは以下のようにして得た。アクリレート−末端ポリマーＣ３２（又はＣ３２ＳＳ）と、アミン−又はチオール−末端オリゴペプチドのいずれか（例えば、ＣＲ３、Ｒ３又はＣＥ３）をＤＭＳＯ中で１：１のモル比で混合した。混合物を室温で一晩撹拌した。等モル量の第二アミン−又はチオール−末端オリゴペプチド、又は第一アミンを加え、混合物を室温で一晩撹拌した。得られた非対称ＰＢＡＥポリマーをジエチルエーテル／アセトン（３：１）中での沈殿により得た。非対称末端修飾Ｂ３−Ｃ３２−ＣＲ３ ＰＢＡＥｓを得るための以下の合成手順は一例として示される。中間体Ｃ３２（０．１５ｇ、０．０７５ｍｍｏｌ）のＤＭＳＯ（２ｍＬ）中溶液を対応するオリゴペプチドＣｙｓ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ａｒｇ（ＣＲ３；０．０５５ｇ、０．０７５ｍｍｏｌ）のＤＭＳＯ（１ｍｌ）中溶液と混合し、室温で一晩撹拌した。その後、２−メチル−１，５−ペンタンジアミン（０．０１７ｇ、０．０２ｍｌ、０．１５ｍｍｏｌ）を、ＤＭＳＯ中、室温で４時間の間、混合物に加えた。非対称末端修飾ポリマーＢ３−Ｃ３２−ＣＲ３とＢ３−Ｃ３２−Ｂ３及びＲ３Ｃ−Ｃ３２−ＣＲ３との混合物がジエチルエーテル／アセトン（３：１）中での一晩の沈殿により得られた。混合物はそれ以上の精製をせずに使用することも、又は非対称末端修飾ポリマーＢ３−Ｃ３２−ＣＲ３は標準法によって混合物から分離することもできる。

実施例７：化合物のライブラリー
様々なオリゴペプチド末端修飾ＰＢＡＥｓのライブラリーを、第一アミンをジアクリレートに加え、次いで末端修飾することによって合成した。式Ｉに従って、表１に示されているオリゴペプチド末端修飾ＰＢＡＥｓを合成した。

実施例８：ポリマー−ＤＮＡ複合体の形成と特徴付け
全ポリマーのストック溶液をＤＭＳＯ中に調製した（１００ｍｇ／ｍｌ）。これらのポリマー溶液を適当な濃度に希釈して（２５ｍＭ酢酸緩衝液、ｐＨ５．０）、所望比率のポリマー−ＤＮＡ（ｗ／ｗ）を得た。次に、１００μｌの希釈ポリマーを１００μｌのプラスミドＤＮＡ（２５ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ５．０）中６０μｇ／ｍＬ）に加え、数秒間激しく渦混合し、次いで３７℃のオーブン中で３０分間インキュベートした。得られたナノ粒子を、ナノ粒子の特徴付けのためにリン酸緩衝生理食塩水中に希釈した。ポリマー−ＤＮＡ複合体を、動的光散乱を用い、サイズ及びゼータ電位について特徴付けした（Ｚｅｔａｓｉｚｅｒ ｎａｎｏ ｚｓ９０、Ｍａｌｖｅｒｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ社）。結果を図１に示す。

ナノ粒子はアガロースゲル電気泳動でも特徴付けされた。プラスミド遅延(plasmid retardation)を評価するために、異なるｗ／ｗ比で０．４８μｇのｐＧＦＰを含有するＰＢＡＥ−ＤＮＡ複合体をアガロースゲル（０．８％、１μｇ／ｍＬの臭化エチジウム含有）のウェルに加えた。サンプルを６０Ｖで４５分間運転し（Ａｐｅｌｅｘ ＰＳ ３０５、フランス）、プラスミド遅延を分解し、ＵＶ照射により視覚化した。結果を図２に示す。

実施例９：プロトンスポンジ効果
プロトンスポンジ効果とは、エンドソーム脱出を促進することが示されている現象のことで、高い緩衝能を有するポリマーによって媒介され、トランスフェクション効率の増大をもたらす（Ｖａｒｋｏｕｈｉ，Ａ．Ｋ．ら，Ｊ．Ｃｏｎｔｒｏｌ．Ｒｅｌ．１５１ ２２０−２２８（２０１１）．）。一般に、第三アミンを構造中に有するポリマーは、５．０〜７．５のエンドソームｐＨ範囲で緩衝効果を示す。これによって浸透圧の増大が引き起こされ、エンドソームの崩壊がもたらされる（Ｂｅｈｒ，Ｊ．Ｃｈｉｍｉａ ２ ３４−３６（１９９７））。プロトンスポンジ効果に従って、新規に合成されたポリ（β−アミノエステル）の緩衝能をポリマー溶液の酸滴定により決定した（図２）。

ポリマーの緩衝能は酸−塩基滴定によって決定された。簡潔に述べると、ポリマーを１ｍｇ／ｍＬの最終濃度で塩化ナトリウムの水溶液（１５０ｍＭ）中に溶解した。得られたポリマー溶液を水酸化ナトリウムでｐＨ１０に調整した。滴定曲線は、１０μＬの分量の塩酸（０．１Ｍ）を段階添加することによって決定された。各添加後にｐＨをｐＨメーター（Ｃｒｉｓｏｎ Ｂａｓｉｃ ２０＋、Ｃｒｉｓｏｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ社）でｐＨ２に達するまで測定した。ポリマーを含有していない溶液も対照として滴定した。結果を図３に示す。

最初に、ポリ（β−アミノエステル）Ｂ３の緩衝効果を測定したところ、ｐＨ５．８になるまで適切な緩衝能を示した。最も高い緩衝能は、ヒスチジン−末端ポリ（β−アミノエステル）で観察された。これは７．５〜５．３のｐＨ範囲で高い緩衝を示した。リシン−修飾ポリ（β−アミノエステル）は、ｐＨ５．９まで適切な緩衝能を示した。これに対し、アルギニンオリゴペプチドで末端キャッピングされたポリ（β−アミノエステル）は、７．４〜６．４の範囲で限定的な緩衝能しか示さなかった。すべてのポリマーは、同じアクリレート−末端プレポリマーＣ３２から派生しているので、観察された追加の緩衝能は、アミン豊富末端に由来している。

実施例１０：トランスフェクション効果
本発明のポリマーと公知ポリマーのトランスフェクション効果を、緑色蛍光タンパク質をコードしたプラスミド（ｐＧＦＰ）の細胞への送達効率を評価することによって比較した。

プラスミドｐＧＦＰによる細胞トランスフェクション：ｐＧＦＰプラスミドを用いて、ＨａＣａＴ、ｈｎＤｆ、ｃｏｓ−７、Ａ５４９及びＨｅＬａ細胞への細胞トランスフェクションを実施した。これらの細胞株は、ＡＴＣＣ（バージニア州マナッサス）から入手し、３７℃、５％ＣＯ_２雰囲気下にて、１０％ウシ胎仔血清、１００単位／ｍｌのペニシリン、１００μｇ／ｍＬのストレプトマイシン、０．１ｍＭのＭＥＭ非必須アミノ酸（ＮＥＡＡ）、２ｍＭのＬ−グルタミンを含有する完全ＤＭＥＭ中に維持した。

細胞を１０，０００細胞／ウェルで９６ウェルプレートに播種し、一晩インキュベートして、およそ８０〜９０％コンフルエンスにした後、トランスフェクション実験を実施した。ポリマー−ＤＮＡ複合体を、上記のように、ｐＧＦＰプラスミドを用い、ポリマー：プラスミド比５０：１で製造した。ポリプレックス(polyplexes)を無血清培地中に希釈し、最終プラスミド濃度０．６μｇ ｐＧＦＰ／ウェルで細胞に加えた。細胞を３７℃、５％ＣＯ_２雰囲気下で３時間インキュベートした。その後、細胞をＰＢＳで１回洗浄し、完全ＤＭＥＭを加えた。４８時間後、細胞を収穫し、フローサイトメトリーによりＧＦＰ発現を分析した。ＧＦＰ発現を、陰性対照（非処理細胞）と、陽性対照としてＧｅｎｅＪｕｉｃｅ（登録商標）（Ｍｅｒｃｋ ＫＧａＡ，ドイツ）及びＢ３−Ｃ３２−Ｂ３に対して比較した。結果を図４ａ〜ｃに示す。図中、Ｒ／Ｈ、Ｋ／Ｈ及びＲ／Ｋは、Ｒ３Ｃ−Ｃ３２−ＣＲ３、Ｋ３Ｃ−Ｃ３２−ＣＫ３又はＨ３Ｃ−Ｃ３２−ＣＨ３ ＰＢＡＥｓの１：１混合物（ｗ／ｗ）を表す。

実施例１１：細胞毒性
ＭＴＳアッセイ（ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ ９６（登録商標） ＡＱｕｅｏｕｓ Ｏｎｅ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ Ｃｅｌｌ Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ Ａｓｓａｙ，米国Ｐｒｏｍｅｇａ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ社）を用いて、本願に記載されたポリマーをトランスフェクトされたｃｏｓ−７細胞の生存率を評価した。細胞生存率は、トランスフェクションの４８時間後、ＭＴＳアッセイを製造業者の指示通りに用いて評価した。簡潔に述べると、実施例５と同様の方法によって、細胞にｐＧＦＰをトランスフェクトした。トランスフェクションの４８時間後に培地を除去し、細胞をＰＢＳで洗浄し、ＭＴＳ（２０％ｖ／ｖ）を補充された完全培地を加えた。細胞を３７℃でインキュベートし、マイクロプレートリーダーを用いて吸光度を４９０ｎｍで測定した。細胞生存率は、非処理細胞と比較した相対パーセンテージで表された。結果を図５に示す。図中、Ｒ／Ｈ、Ｋ／Ｈ及びＲ／Ｋは、Ｒ３Ｃ−Ｃ３２−ＣＲ３、Ｋ３Ｃ−Ｃ３２−ＣＫ３又はＨ３Ｃ−Ｃ３２−ＣＨ３ ＰＢＡＥｓの１：１混合物（ｗ／ｗ）を表す。

実施例１２：遺伝子抑制（サイレンシング）アッセイ
本発明のポリマーのｓｉＲＮＡ送達効率を、ＧＦＰ特異的ｓｉＲＮＡを用い、ＧＦＰレポーター安定細胞株にて評価した。

ポリマー−ｓｉＲＮＡ複合体の製造：ポリマーのストック溶液をＤＭＳＯ中に調製した（１００ｍｇ／ｍｌ）。これらのポリマー溶液を適当な濃度に希釈して（２５ｍＭ酢酸緩衝液、ｐＨ５．０）、所望比率のポリマー−ｓｉＲＮＡ（ｗ／ｗ）を得た。次に、１００μｌの適当に希釈されたポリマーを１００μｌのＧＦＰ特異的ｓｉＲＮＡ（２５ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ５．０）中１０μｇ／ｍＬ；ＴｈｅｒｍｏＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｄｈａｒｍａｃｏｎ ＧＦＰ Ｄｕｐｌｅｘ Ｉ）に加え、数秒間激しく渦混合し、次いで３７℃で３０分間インキュベートした。得られた複合体を、ナノ粒子の特徴付けのためにリン酸緩衝生理食塩水中に希釈した。ポリマー−ｓｉＲＮＡ複合体を、動的光散乱を用い、サイズ及びゼータ電位について特徴付けした（Ｚｅｔａｓｉｚｅｒ ｎａｎｏ ｚｓ９０、Ｍａｌｖｅｒｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ社）。結果を図６に示す。図中、Ｋ／Ｈ及びＫ／Ｒは、Ｒ３Ｃ−Ｃ３２−ＣＲ３、Ｋ３Ｃ−Ｃ３２−ＣＫ３又はＨ３Ｃ−Ｃ３２−ＣＨ３ ＰＢＡＥｓの６０：４０混合物（ｗ／ｗ）を表す。Ｋ／Ｅ及びＫ／Ｄは、Ｋ３Ｃ−Ｃ３２−ＣＫ３及びＤ３Ｃ−Ｃ３２−ＣＤ３又はＥ３Ｃ−Ｃ３２−ＣＥ３ ＰＢＡＥｓの７０：３０混合物（ｗ／ｗ）を表す。

ＧＦＰ特異的ｓｉＲＮＡによる細胞トランスフェクション：ＧＦＰ特異的ｓｉＲＮＡを用いて、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１／ＧＦＰ細胞（Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌａｂｓ Ｉｎｃ．社）への細胞トランスフェクションを実施した。細胞は、３７℃、５％ＣＯ_２雰囲気下にて、１０％ウシ胎仔血清、１００単位／ｍｌのペニシリン、１００μｇ／ｍＬのストレプトマイシンを含有する完全ＤＭＥＭ中に維持した。

簡潔に述べると、細胞を１０，０００細胞／ウェルで９６ウェルプレートに播種し、一晩インキュベートして、およそ８０〜９０％コンフルエンスにした後、トランスフェクション実験を実施した。ポリマー−ｓｉＲＮＡ複合体を、上記のように、ＧＦＰ特異的ｓｉＲＮＡを用い、ポリマー：ｓｉＲＮＡ比２００：１で製造した。ポリプレックスを無血清培地中に希釈し、最終プラスミド濃度５０ｎＭ ｓｉＲＮＡ／ウェルで細胞に加えた。細胞を３７℃、５％ＣＯ_２雰囲気下で３時間インキュベートした。その後、細胞をＰＢＳで１回洗浄し、完全ＤＭＥＭを加えた。４８時間後、細胞を収穫し、フローサイトメトリーによりＧＦＰサイレンシングを分析した。ＧＦＰ発現のサイレンシングを、陰性対照（非処理細胞）と、陽性対照としてＩＮＴＥＲＦＥＲｉｎＴＭ（ＰｏｌｙＰｌｕｓ ＴｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎＴＭ）及びＢ３に対して比較した。結果を図７に示す。図中、Ｒ／Ｈ、Ｋ／Ｈ及びＲ／Ｋは、Ｒ３Ｃ−Ｃ３２−ＣＲ３、Ｋ３Ｃ−Ｃ３２−ＣＫ３又はＨ３Ｃ−Ｃ３２−ＣＨ３ ＰＢＡＥｓの１：１混合物（ｗ／ｗ）を表し、ＳＳ（Ｒ／Ｈ）、ＳＳ（Ｋ／Ｈ）及びＳＳ（Ｒ／Ｋ）は、Ｒ３Ｃ−Ｃ３２ＳＳ−ＣＲ３、Ｋ３Ｃ−Ｃ３２ＳＳ−ＣＫ３又はＨ３Ｃ−Ｃ３２ＳＳ−ＣＨ３ ＰＢＡＥｓの１：１混合物（ｗ／ｗ）を表す。

実施例１３：グルタミン酸及びリシン末端修飾ＰＢＡＥｓを用いるウシインスリンのカプセル化
本発明のポリマーのカプセル化効率をウシインスリン（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ社）を用いて評価した。簡潔に述べると、グルタミン酸末端修飾ＰＢＡＥｓ Ｅ３Ｃ−Ｃ３２−ＣＥ３（６０ｍｇ／ｍＬで１６．７μＬ）をウシインスリンの溶液（ＨＥＰＥＳ緩衝液中０．０１ｍｇ／ｍＬで１ｍＬ、１００ｍＭ及びｐＨ７．２）に加え、次いでリシン末端修飾ＰＢＡＥｓ Ｋ３Ｃ−Ｃ３２−ＣＫ３（１００ｍｇ／ｍＬで１０μＬ）を加え、最終のポリマー：タンパク質比を２００：１とした。混合物を室温で３０分間インキュベートした。得られたナノ粒子をＣｅｎｔｒｉｃｏｎ装置（１０ＫＤａカットオフ、Ｍｅｒｃｋ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社）を用いて遠心分離し、インスリン含有ナノ粒子を非カプセル化インスリンから分離した。カプセル化の程度は、ビシンコニンアッセイ（ＢＣＡタンパク質アッセイ試薬、ＴｈｅｒｍｏＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）を用いて非カプセル化インスリンを測定し、インスリンのオリジナル溶液と比較することによって計算した。結果を図８に示す。図中、ＮＰ１及びＮＰ２は独立した複製である。
本発明の態様
態様１ 式Ｉ：

［式中、各Ｌ _１ 及びＬ _２ は、

、Ｏ、Ｓ、ＮＲ _ｘ 及び結合からなる群から独立に選ばれ；ここで、Ｒ _ｘ は、水素、ハロゲン、アルキル、シクロアルキル、アルケニル、シクロアルケニル、ヘテロアルキル、ヘテロシクロアルキル、アシル、アリール又はヘテロアリールからなる群から独立に選ばれ；
Ｌ _３ は、アルキレン、アルケニレン、ヘテロアルキレン、ヘテロアルケニレン、アリーレン又はヘテロアリーレンからなる群から独立に選ばれ；
Ｌ _４ は、

からなる群から選ばれ；
Ｌ _５ は、アルキレン、アルケニレン、ヘテロアルキレン、ヘテロアルケニレン、アリーレン又はヘテロアリーレンからなる群から独立に選ばれ；
Ｒ _１ 及びＲ _２ は、オリゴペプチド及びＲ _ｙ から独立に選ばれ；
ここで、Ｒ _１ 及びＲ _２ の少なくとも一つはオリゴペプチドであり；
そして、Ｒ _ｙ は、水素、ハロゲン、アルキル、シクロアルキル、アルケニル、シクロアルケニル、ヘテロアルキル、ヘテロシクロアルキル、アシル、アリール又はヘテロアリールからなる群から選ばれ；
各Ｒ _３ は、水素、ハロゲン、アルキル、シクロアルキル、アルケニル、シクロアルケニル、ヘテロアルキル、ヘテロシクロアルキル、アシル、アリール又はヘテロアリールからなる群から独立に選ばれ；そして
ｎは５〜１０，０００の整数である］のポリマー
又はその薬学的に許容可能な塩。
態様２ 一つの又は各オリゴペプチドが、３〜２０個のアミノ酸残基を含む、態様１に記載のポリマー。
態様３ 一つの又は各オリゴペプチドがｐＨ７で正味の正電荷を有する、前記態様のいずれかに記載のポリマー。
態様４ 一つの又は各オリゴペプチドが、リシン、アルギニン及びヒスチジンからなる群から選ばれるアミノ酸残基を含む、態様３に記載のポリマー。
態様５ 一つの又は各オリゴペプチドが、式VII：

［式中、ｐは２〜１９の整数であり、Ｒ _ａ は、出現するたびに、Ｈ _２ ＮＣ（＝ＮＨ）−ＮＨ（ＣＨ _２ ） _３ −、Ｈ _２ Ｎ（ＣＨ _２ ） _４ −又は（１Ｈ−イミダゾール−４−イル）−ＣＨ _２ −からなる群から選ばれる］の化合物である、前記態様のいずれかに記載のポリマー。
態様６ 一つの又は各オリゴペプチドがｐＨ７で正味の負電荷を有する、態様１に記載のポリマー。
態様７ 一つの又は各オリゴペプチドが、式VII：

［式中、ｐは２〜１９の整数であり、Ｒ _ａ は、出現するたびに、ＨＯ _２ Ｃ（ＣＨ _２ ） _２ −又はＨＯ _２ Ｃ−ＣＨ _２ −からなる群から選ばれる］の化合物である、態様６に記載のポリマー。
態様８ Ｒ _１ 及びＲ _２ がともにオリゴペプチドである、前記態様のいずれかに記載のポリマー。
態様９ Ｒ _１ 及びＲ _２ が異なるオリゴペプチドである、態様８に記載のポリマー。
態様１０ Ｒ _１ 及びＲ _２ の一つがオリゴペプチドで、Ｒ _１ 及びＲ _２ の一つがＲ _ｙ である、態様１〜７のいずれかに記載のポリマー。
態様１１ ｎが１〜２０である、前記態様のいずれかに記載のポリマー。
態様１２ Ｒ _ｙ が、水素、−（ＣＨ _２ ） _ｍ ＮＨ _２ 、−（ＣＨ _２ ） _ｍ ＮＨＭｅ、−（ＣＨ _２ ） _ｍ ＯＨ、−（ＣＨ _２ ） _ｍ ＣＨ _３ 、−（ＣＨ _２ ） _２ （ＯＣＨ _２ ＣＨ _２ ） _ｍ ＮＨ _２ 、−（ＣＨ _２ ） _２ （ＯＣＨ _２ ＣＨ _２ ） _ｍ ＯＨ又は−（ＣＨ _２ ） _２ （ＯＣＨ _２ ＣＨ _２ ） _ｍ ＣＨ _３ からなる群から選ばれ、ｍが１〜２０の整数である、前記態様のいずれかに記載のポリマー。
態様１３ 各Ｌ _３ が、−Ｃ _１−１０ アルキレン−（Ｓ−Ｓ） _ｑ −Ｃ _１−１０ アルキレン−からなる群から独立に選ばれ、ｑが０又は１である、前記態様のいずれかに記載のポリマー。
態様１４ 各Ｒ _３ が、水素、Ｃ _１−６ アルキル、Ｃ _１−６ アルケニル、Ｃ _１−６ アルキニル、Ｃ _１−６ ヒドロキシアルキル、ヒドロキシル、Ｃ _１−６ アルコキシ、ハロゲン、アリール、ヘテロサイクリック、ヘテロアリール、シアノ、−Ｏ _２ Ｃ−Ｃ _１−６ アルキル、カルバモイル、−ＣＯ２Ｈ、−ＣＯ _２ −Ｃ _１−６ アルキル、Ｃ _１−６ アルキルチオエーテル、チオール、又はウレイドから独立に選ばれる、前記態様のいずれかに記載のポリマー。
態様１５ 活性薬剤と、態様１〜１４のいずれか１項に記載のポリマーとを含む組成物。
態様１６ 活性薬剤がポリヌクレオチドである、態様１５に記載の組成物。
態様１７ ポリヌクレオチドがｓｉＲＮＡ又はｍｉＲＮＡである、態様１６に記載の組成物。
態様１８ ポリヌクレオチドが、２０〜３０ヌクレオチドの長さである、態様１６に記載の組成物。
態様１９ 組成物が、ポリヌクレオチドとポリマーを含有するナノ粒子を含む、態様１６〜１８のいずれかに記載の組成物。
態様２０ ポリマーが、態様３に記載のポリマーと態様６に記載のポリマーを含む、態様１５〜１９のいずれかに記載の組成物。
態様２１ 薬剤を、態様１〜１４のいずれかに記載のポリマーのマトリックス中にカプセル化してナノ粒子を形成させる方法であって、該方法は、薬剤を準備し；ポリマーを準備し；そして薬剤とポリマーを適切な条件下で接触させてナノ粒子を形成させる工程を含む方法。
態様２２ 薬剤が、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ及びｍｉＲＮＡから選ばれるポリヌクレオチド、小分子又はタンパク質である、態様２１に記載の方法。
態様２３ 接触工程が、（ａ）薬剤とポリマーの混合物のスプレー乾燥、（ｂ）二重エマルション溶媒蒸発技術(double emulsion solvent evaporation techniques)又は（ｃ）転相技術を含む、態様２１又は２２に記載の方法。
態様２４ 医薬に使用するための、態様１〜１４のいずれか１項に記載のポリマー又は態様１５〜２０のいずれか１項に記載の組成物。

Claims (23)

1. 式Ｉ：
   

   

   ［式中、各Ｌ_１及びＬ_２は、
   

   

   、Ｏ、Ｓ、ＮＲ_ｘ及び結合からなる群から独立に選ばれ；ここで、Ｒ_ｘは、水素、ハロゲン、アルキル、シクロアルキル、アルケニル、シクロアルケニル、ヘテロアルキル、ヘテロシクロアルキル、アシル、アリール又はヘテロアリールからなる群から独立に選ばれ；
   Ｌ_３は、アルキレン、アルケニレン、ヘテロアルキレン、ヘテロアルケニレン、アリーレン又はヘテロアリーレンからなる群から独立に選ばれ；
   Ｌ_４は、
   

   

   からなる群から選ばれ；
   Ｌ_５は、アルキレン、アルケニレン、ヘテロアルキレン、ヘテロアルケニレン、アリーレン又はヘテロアリーレンからなる群から独立に選ばれ；
   Ｒ_１及びＲ_２は、オリゴペプチド及びＲ_ｙから独立に選ばれ；
   ここで、Ｒ_１及びＲ_２の少なくとも一つはオリゴペプチドであり；
   一つの又は各オリゴペプチドがｐＨ７で正味の正電荷を有する；または一つの又は各オリゴペプチドがｐＨ７で負に荷電した天然アミノ酸とｐＨ７で正に荷電した天然アミノ酸との混合物を含み；
   そして、Ｒ_ｙは、水素、ハロゲン、アルキル、シクロアルキル、アルケニル、シクロアルケニル、ヘテロアルキル、ヘテロシクロアルキル、アシル、アリール又はヘテロアリールからなる群から選ばれ；
   各Ｒ_３は、水素、ハロゲン、アルキル、シクロアルキル、アルケニル、シクロアルケニル、ヘテロアルキル、ヘテロシクロアルキル、アシル、アリール又はヘテロアリールからなる群から独立に選ばれ；そして
   ｎは５〜１０，０００の整数である］のポリマー
   又はその薬学的に許容可能な塩。
2. 一つの又は各オリゴペプチドが、リシン及びアルギニンからなる群から選択されるアミノ酸残基を含み；または一つの又は各オリゴペプチドがｐＨ７で負に荷電した天然アミノ酸とｐＨ７で正に荷電した天然アミノ酸との混合物を含む、請求項１に記載のポリマー。
3. 一つの又は各オリゴペプチドが、３〜２０個のアミノ酸残基を含む、請求項１または２に記載のポリマー。
4. 一つの又は各オリゴペプチドがｐＨ７で正味の正電荷を有する、請求項１〜３のいずれかに記載のポリマー。
5. 一つの又は各オリゴペプチドが、リシン、アルギニン及びヒスチジンからなる群から選ばれるアミノ酸残基を含む、請求項１または２に記載のポリマー。
6. 一つの又は各オリゴペプチドが、式VII：
   

   

   ［式中、ｐは２〜１９の整数であり、Ｒ_ａは、出現するたびに、Ｈ_２ＮＣ（＝ＮＨ）−ＮＨ（ＣＨ_２）_３−、Ｈ_２Ｎ（ＣＨ_２）_４−又は（１Ｈ−イミダゾール−４−イル）−ＣＨ_２−からなる群から選ばれる］の化合物である、請求項１〜５のいずれか１項に記載のポリマー。
7. Ｒ_１及びＲ_２がともにオリゴペプチドである、請求項１〜６のいずれか１項に記載のポリマー。
8. Ｒ_１及びＲ_２が異なるオリゴペプチドである、請求項７に記載のポリマー。
9. Ｒ_１及びＲ_２の一つがオリゴペプチドで、Ｒ_１及びＲ_２の一つがＲ_ｙである、請求項１〜７のいずれか１項に記載のポリマー。
10. ｎが１〜２０である、請求項１〜９のいずれか１項に記載のポリマー。
11. Ｒ_ｙが、水素、−（ＣＨ_２）_ｍＮＨ_２、−（ＣＨ_２）_ｍＮＨＭｅ、−（ＣＨ_２）_ｍＯＨ、−（ＣＨ_２）_ｍＣＨ_３、−（ＣＨ_２）_２（ＯＣＨ_２ＣＨ_２）_ｍＮＨ_２、−（ＣＨ_２）_２（ＯＣＨ_２ＣＨ_２）_ｍＯＨ又は−（ＣＨ_２）_２（ＯＣＨ_２ＣＨ_２）_ｍＣＨ_３からなる群から選ばれ、ｍが１〜２０の整数である、請求項１〜１０のいずれか１項に記載のポリマー。
12. 各Ｌ_３が、−Ｃ_１−１０ アルキレン−（Ｓ−Ｓ）_ｑ−Ｃ_１−１０アルキレン−からなる群から独立に選ばれ、ｑが０又は１である、請求項１〜１１のいずれか１項に記載のポリマー。
13. 各Ｒ_３が、水素、Ｃ_１−６アルキル、Ｃ_１−６アルケニル、Ｃ_１−６アルキニル、Ｃ_１−６ヒドロキシアルキル、ヒドロキシル、Ｃ_１−６アルコキシ、ハロゲン、アリール、ヘテロサイクリック、ヘテロアリール、シアノ、−Ｏ_２Ｃ−Ｃ_１−６アルキル、カルバモイル、−ＣＯ２Ｈ、−ＣＯ_２−Ｃ_１−６アルキル、Ｃ_１−６アルキルチオエーテル、チオール、又はウレイドから独立に選ばれる、請求項１〜１２のいずれか１項に記載のポリマー。
14. （ａ）式Ｉ：
    

    

    ［式中、各Ｌ_１及びＬ_２は、
    

    

    、Ｏ、Ｓ、ＮＲ_ｘ及び結合からなる群から独立に選ばれ；ここで、Ｒ_ｘは、水素、ハロゲン、アルキル、シクロアルキル、アルケニル、シクロアルケニル、ヘテロアルキル、ヘテロシクロアルキル、アシル、アリール又はヘテロアリールからなる群から独立に選ばれ；
    Ｌ_３は、アルキレン、アルケニレン、ヘテロアルキレン、ヘテロアルケニレン、アリーレン又はヘテロアリーレンからなる群から独立に選ばれ；
    Ｌ_４は、
    

    

    からなる群から選ばれ；
    Ｌ_５は、アルキレン、アルケニレン、ヘテロアルキレン、ヘテロアルケニレン、アリーレン又はヘテロアリーレンからなる群から独立に選ばれ；
    Ｒ_１及びＲ_２は、オリゴペプチド及びＲ_ｙから独立に選ばれ；
    ここで、Ｒ_１及びＲ_２の少なくとも一つはオリゴペプチドであり；
    一つの又は各オリゴペプチドがｐＨ７で正味の正電荷を有し；
    そして、Ｒ_ｙは、水素、ハロゲン、アルキル、シクロアルキル、アルケニル、シクロアルケニル、ヘテロアルキル、ヘテロシクロアルキル、アシル、アリール又はヘテロアリールからなる群から選ばれ；
    各Ｒ_３は、水素、ハロゲン、アルキル、シクロアルキル、アルケニル、シクロアルケニル、ヘテロアルキル、ヘテロシクロアルキル、アシル、アリール又はヘテロアリールからなる群から独立に選ばれ；そして
    ｎは５〜１０，０００の整数である］のポリマー
    又はその薬学的に許容可能な塩；と
    （ｂ）式Ｉ：
    

    

    ［式中、各Ｌ_１及びＬ_２は、
    

    

    、Ｏ、Ｓ、ＮＲ_ｘ及び結合からなる群から独立に選ばれ；ここで、Ｒ_ｘは、水素、ハロゲン、アルキル、シクロアルキル、アルケニル、シクロアルケニル、ヘテロアルキル、ヘテロシクロアルキル、アシル、アリール又はヘテロアリールからなる群から独立に選ばれ；
    Ｌ_３は、アルキレン、アルケニレン、ヘテロアルキレン、ヘテロアルケニレン、アリーレン又はヘテロアリーレンからなる群から独立に選ばれ；
    Ｌ_４は、
    

    

    からなる群から選ばれ；
    Ｌ_５は、アルキレン、アルケニレン、ヘテロアルキレン、ヘテロアルケニレン、アリーレン又はヘテロアリーレンからなる群から独立に選ばれ；
    Ｒ_１及びＲ_２は、オリゴペプチド及びＲ_ｙから独立に選ばれ；
    ここで、Ｒ_１及びＲ_２の少なくとも一つはオリゴペプチドであり；
    一つの又は各オリゴペプチドがｐＨ７で正味の負電荷を有し；
    そして、Ｒ_ｙは、水素、ハロゲン、アルキル、シクロアルキル、アルケニル、シクロアルケニル、ヘテロアルキル、ヘテロシクロアルキル、アシル、アリール又はヘテロアリールからなる群から選ばれ；
    各Ｒ_３は、水素、ハロゲン、アルキル、シクロアルキル、アルケニル、シクロアルケニル、ヘテロアルキル、ヘテロシクロアルキル、アシル、アリール又はヘテロアリールからなる群から独立に選ばれ；そして
    ｎは５〜１０，０００の整数である］のポリマー
    又はその薬学的に許容可能な塩；とを含む、
    ナノ粒子。
15. 活性薬剤をさらに含む、請求項１４に記載のナノ粒子。
16. 活性薬剤と、請求項１〜１３のいずれか１項に記載のポリマーとを含む組成物、または請求項１５に記載のナノ粒子を含む組成物。
17. 活性薬剤がポリヌクレオチドである、請求項１６に記載の組成物。
18. ポリヌクレオチドがＲＮＡ、ＤＮＡ又はｓｉＲＮＡである、請求項１６に記載の組成物。
19. 組成物が、ポリヌクレオチドとポリマーを含有するナノ粒子を含む、請求項１７または１８に記載の組成物。
20. 薬剤を、請求項１〜１３のいずれか１項に記載のポリマーのマトリックス中にカプセル化してナノ粒子を形成させる方法であって、該方法は、薬剤を準備し；ポリマーを準備し；そして薬剤とポリマーを適切な条件下で接触させてナノ粒子を形成させる工程を含む方法。
21. 薬剤が、ＤＮＡ、ＲＮＡ及びｓｉＲＮＡから選ばれるポリヌクレオチド、小分子又はタンパク質である、請求項２０に記載の方法。
22. 接触工程が、（ａ）薬剤とポリマーの混合物のスプレー乾燥、（ｂ）二重エマルション溶媒蒸発技術(double emulsion solvent evaporation techniques)又は（ｃ）転相技術を含む、請求項２０又は２１に記載の方法。
23. 医薬に使用するための、請求項１〜１３のいずれか１項に記載のポリマー、請求項１４または１５に記載のナノ粒子、又は請求項１６〜１８のいずれか１項に記載の組成物。

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