CN104745551A - 利用talen敲除人乳头瘤病毒e6e7癌基因的方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及基因治疗领域，公开了一种高危型人乳头瘤病毒HPV E6E7基因定点敲除系统，即靶向切割HPV E6E7基因的转录激活子样效应因子核酸酶TLAENs；所述TALENs是根据高危型HPV E6E7基因序列，设计靶向特异位点的TALENs表达载体，靶向切割细胞中HPV E6E7基因序列，进而敲除目的基因，诱导相应亚型细胞的凋亡增加和增殖抑制，而对其他亚型HPV阳性或HPV阴性的细胞都无作用。在HPV阳性宫颈癌细胞的皮下瘤模型中转染TALEN表达载体，能明显的抑制皮下瘤的生长速度，而且使得瘤重减轻。本发明利用TALEN靶向敲除高危型HPV E6E7基因的方法，能高效的在DNA水平上破坏病毒癌基因，使得HPV感染细胞发生凋亡和增殖抑制，对于HPV感染相关性疾病特别是宫颈上皮内瘤变等癌前病变有巨大的治疗价值。

Description

利用TALEN敲除人乳头瘤病毒E6E7癌基因的方法

技术领域

本发明涉及基因治疗领域，本发明公开了包括针对高危型人乳头瘤病毒E6E7癌基因序列构建靶向的TALEN质粒的方法，并利用TALEN靶向敲除高危型人乳头瘤病毒E6E7癌基因的方法。

背景技术

宫颈癌是世界女性第三大常见的恶性肿瘤，也是第四大致死性恶性肿瘤。据统计，2008年世界范围内新发病例529,800例，占所有肿瘤总数的9％，其中死亡病例275,100，占女性肿瘤患者总死亡人数的8％；这些新发病例和死亡患者在发展中国家占据85％以上(Crosbie EJ等，柳叶刀杂志，2013，382：889-899；Jemal A等，CA：a cancer journal for clinicians杂志，2011，61：69-90)。

高危型人乳头状瘤病毒(Human Papillomavirus，HPV)，特别是HPV16和HPV18两种高危亚型，是宫颈癌发生发展的重要致病因素。HPV病毒感染宿主后，表达E6和E7两种早期癌蛋白。E6蛋白在细胞内与E6相关蛋白(E6-associated protein，E6AP)和抑癌蛋白p53形成三聚体复合物，诱导p53蛋白的泛素化并经过蛋白酶体降解；此外，E6也可以通过直接与p53结合干扰其DNA结合能力而阻断p53的转录。p53功能的缺失或蛋白的降解使得细胞逃逸正常的细胞凋亡。E7蛋白则抑制另一个抑癌蛋白RB1的活性，从而激活E2F转录因子家族，使得细胞的增殖能力增强，并能逃脱细胞周期对细胞生存的影响。在E6和E7蛋白的共同作用下，受感染的细胞增殖能力增强，不受细胞周期的控制，最终获得了肿瘤细胞所具有的恶性表型。因此，E6和E7成为HPV感染相关疾病特别是宫颈癌的基因治疗的最重要靶标。

文献报道利用靶向于HPV E6或E7的反义RNA技术(Hamada，K等，1996，Gynecologic oncology.63：219-227)、Ribozymes(核酶)技术(He，Y等，1993，FEBS letters.322：21-24)或小干扰RNA(siRNA)技术(司马妮等，2008，Apoptosis.13：273-281；王薇等，2010，Cancer letter.291：67-75)等基因治疗途径均能在一定程度上抑制E6或E7癌蛋白的表达，并在一定程度上抑制甚至逆转细胞的恶性表型，体现出一定的临床应用价值。但是，反义RNA技术、核酶技术和小干扰RNA技术等最大的缺陷在于这些途径只能从RNA水平上影响目的蛋白的翻译，并不影响DNA水平上的基因表达，也就是说，没有从根本上解决问题。除此之外，这类基因治疗途径使用的RNA本身易降解，加之由此造成的给药方式的缺陷又进一步限制了其在体内应用的潜力(Shillitoe，E.J，2006，Cancer gene therapy.13：445-450)。虽然有研究应用病毒载体等携带siRNA能有效的抑制E6或E7的表达，但是病毒载体本身的安全性限制了其在体内的应用价值。

TALEN(transcription activator-like effector nucleases，转录激活子样效应因子核酸酶)技术是一种新兴的靶向基因修饰的技术。TALEs最初来源于植物病原菌Xanthomonas，Xanthomonas感染植物 后，利用TALEs进入细胞核，与效应因子特异性的DNA序列相结合，调节基因转录表达。TALEs的结合序列是有一系列的串联重复的33-35个氨基酸序列组成的基序。每个重复序列中仅第12、13位氨基酸不同(repeat variable de-residue，RVD，重复可变双残基)，不同的RVD能特异性的识别不同的碱基对并能与之结合。在此基础上，连接上非特异性的核酸内切酶FokI，即可组装成TALENs。TALEs特异性的结合靶序列，FokI二聚体化后切割DNA序列，产生DNA双链断裂(DNA double-strand breaks，DSBs)。DSB的产生立即启动宿主细胞的自我修复机制。主要的修复机制有两种：同源重组(homologous recombination，HR)和非同源末端连接(non-homologous end joining，NHEJ)(Chapman，J R等，2012，Molecular cell.47：497-510)。同源重组可以利用以另一条姐妹染色单体或其他的DNA模板进行修复，是一种高保真的修复方式；非同源末端连接是真核生物细胞在不依赖DNA同源序列的条件下，直接将两个DNA断端连接在一起，这种修复方式虽然能避免DNA断裂造成的DNA降解对细胞生存的影响，但是极易在断裂点处引入小片段的基因插入或缺失，进而造成框移突变，最终下调基因的功能。而在哺乳动物细胞中，非同源末端连接修复方式占据着主导作用。因此，应用TALENs，即可通过在特异的DNA位点上诱导产生DSB，再借助细胞利用NHEJ方式修复DSB时造成框移突变，最终达到基因敲除的目的(图1)。

TALEN技术发展迅速，在Tomas Cermak等的工作基础上，TALE模块已经实现商品化，每个模块都只能特异性的识别某一个核酸碱基(Cermak T等，Nucleic acids research，2011，39：pp.e82)。因此，为了获得能特异性识别某一特定核酸序列的TALE，只需要按照给定核酸序列在TALEN在线设计工具(https：//tale-nt.cac.cornell.edu/node/add/talen/)上找出对应的TALE模版，即可快速高效的构建出目的TALEN对。切割效率高、特异性高、构建迅速并且构建成本低使得TALEN迅速成为新型的基因修饰技术。目前TALENs已在各种物种实现了基因修饰中，如水稻(Li T等，Nature biotechnology，2012，30：390-392)、酵母(Aouida M等，Current genetics，2014，60：61-74)、果蝇(Takasu Y等，Methods，2014，69：46-57)、家蚕(Wang F等，Molecular genetics and genomics：MGG，2013，288：683-690)、斑马鱼(Zu Y等，Nature Methods，2013，10：329-331；Xiao A等，Nucleic acids research，2013，41：e141)、小鼠(Wefers B等，Nature protocols，2013，8：2355-2379，Wang H等，Nature biotechnology，2013，31：530-532)、大鼠(Ponce de Leon等，PloS one，2014，9：e88146)、猴(Liu H等，Cell stem cell，2014，14：323-328)以及人类体细胞(Ding Q等，Cell stem cell，2013，12：238-251)等。

本发明利用构建的靶向高危型HPV E6E7癌基因的TALEN表达质粒，通过将表达质粒转染到细胞中，特异性的诱导相应亚型HPV阳性细胞的增殖抑制和细胞凋亡，体内研究结果证实在动物模型内应用靶向HPV16E7的TALEN可以有效的抑制皮下瘤的生长。因此，靶向高危型HPV E6E7的TALEN具有重要的临床应用价值。

发明内容

本发明的目的是提供一种利用TALENs技术敲除高危型人乳头瘤病毒E6E7基因的应用方法。

本发明中所述的高危型人乳头瘤病毒包括但不限于HPV16和HPV18两种最常见的HPV亚型。

为了实现本发明的目的，本发明采取了如下技术方案：

一对针对高危型HPV E6E7基因序列的转录激活子样效应因子核酸酶TALENs，能特异性的高效识别并切割高危型HPV E6E7基因序列；

所述的转录激活子样效应因子核酸酶TALENs由识别高危型HPV E6E7基因序列的模块TAL-HPV-F和TAL-HPV-R组成；

所述的TAL-HPV-F，其特征在于，由能识别HPV E6E7序列的TAL-HPV-F识别结构域与人工优化的DNA切割域FokI融合而成；所述的TAL-HPV-R，其特征在于，由能识别HPV E6E7序列的TAL-HPV-R识别结构域与人工优化的DNA切割域FokI融合而成； 

本发明提供上述靶向高危型HPV E6E7基因的定点修饰系统的制备方法，包括以下步骤：

以下步骤以高危型HPV亚型HPV16和HPV18为例，但不限于这两种亚型。

1)根据高危型人乳头瘤病毒E6E7基因序列，设计TALENs对，其作用的DNA序列分别为：HPV16和HPV18E6E7碱基序列(NCBI数据库RefSeq：NC_001526.2和NC_001357.1)。将这两种序列分别复制到TALEN RVD序列在线分析工具(https：//tale-nt.cac.cornell.edu/node/add/talen)进行分析，优先选择靠近转录起始位点处的靶点。选择靶点后，确定相应的RVD序列。

2)构建TALENs的真核表达载体。由于TALENs是以二聚体的形式发挥作用，因此每个作用位点都需要两个TALEN表达单体，以靶向HPV16E7基因512位点为例，TALEN-512L和TALEN-512R两个TALEN单体需要同时表达才能发挥敲除HPV16E7基因的功能，在构建表达载体的时候可分别构建TALEN-512L和TALEN-512R两个真核表达载体，将两个真核表达载体同时转染到细胞中即可同时两个TALEN单体，在HPV16E7基因512位点处发挥切割作用，进而达到敲除HPV16E7基因的目的。

选定位点后，构建按照Tomas Cermak等报道的方法进行构建(Cermak T等，Nucleic acids research，2011，39：pp.e82)，所述表达载体为包括pcDNA3.1+在内的真核表达载体，构建后通过测序确保碱基序列正确。

3)本发明提供利用TALENs特异性的敲除高危型HPV16和HPV18的E6E7基因的方法。所述特异性指HPV亚型的特异性，以HPV16E6E7基因为例，靶向HPV16E6E7基因的TALENs仅能特异性的敲除HPV16E6E7基因，对HPV18以及其他HPV亚型的E6E7基因无敲除作用。

4)本发明提供利用TALENs特异性诱导相应HPV亚型阳性细胞的凋亡增加和促进增殖抑制的方法。所述特异性指HPV亚型阳性细胞的特异性，以靶向HPV16E6E7基因的TALENs为例，仅能特异性的诱导HPV16阳性的细胞(如SiHa、S12等)的凋亡增加和增殖抑制，对HPV18阳性的细胞(如HeLa等)和HPV阴性 的细胞(如C33A、HEK293等)无促进凋亡和抑制增殖的作用。

5)本发明提供利用TALEN特异性的抑制动物模型中相应HPV亚型阳性细胞系所构建的皮下瘤的生长的方法。以靶向HPV16E6E7基因的ZFNs为例，仅能特异性的抑制SiHa细胞(HPV16阳性)皮下瘤的生长，对HeLa细胞(HPV18阳性)皮下瘤无抑制作用。

附图说明

图1为TALEN结合并敲除高危型HPV E6E7基因作用示意图。

图2为实施例中应用靶向HPV16E6E7基因的TALEN-512应用于SiHa细胞后的凋亡情况。图中Blank代表未处理细胞凋亡率，Vector代表空载体(仅含有FokI切割域，不含有DNA识别结构域)转染后的细胞凋亡率，TALEN-512代表TALEN-512转染后的细胞凋亡率(下同)。

图3为实施例中应用靶向HPV16E6E7基因的TALEN-512应用于S12细胞后的凋亡情况。

图4为实施例中应用靶向HPV16E6E7基因的TALEN-512应用于HeLa细胞后的凋亡情况。

图5为实施例中应用靶向HPV16E6E7基因的TALEN-512应用于C33A细胞后的凋亡情况。

图6为实施例中应用靶向HPV16E6E7基因的TALEN-512应用于HEK293细胞后的凋亡情况。

图7为实施例中应用靶向HPV16E6E7基因的TALEN-512应用于SiHa细胞后的增殖曲线。

图8为实施例中应用靶向HPV16E6E7基因的TALEN-512应用于S12细胞后的增殖曲线。

图9为实施例中应用靶向HPV16E6E7基因的TALEN-512应用于HeLa细胞后的增殖曲线。

图10为实施例中应用靶向HPV16E6E7基因的TALEN-512应用于C33A细胞后的增殖曲线。

图11为实施例中应用靶向HPV16E6E7基因的TALEN-512应用于HEK293细胞后的增殖曲线。

图12为实施例中在SiHa细胞形成的皮下瘤中瘤内注射TALEN-512后瘤体大小的变化情况。

具体实施方式

以下实施例仅用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。

在本实施例中，Golden Gate TALEN and TAL Effector Kit 2.0试剂盒购自Addgene(http：//www.addgene.org/)，真核表达载体pcDNA3.1(+)购自Invitrogen公司；如无特殊说明，所使用的引物均由Primer3Plus在线引物设计工具(http：//primer3plus.com/cgi-bin/dev/primer3plus.cgi)设计完成，引物合成以及测序由武汉华大基因科技有限公司完成；构建所使用的各种限制性内切酶、T4DNA连接酶、PCR产物试剂盒、胶回收试剂盒均购自美国Thermo Scientific公司；质粒提取试剂盒购自QIAGEN公司。

例1.TALEN-512表达载体的构建

从NCBI网站中查询获得HPV16的E6E7癌基因的全长序列信息，将序列按要求复制到TALEN RVD序列在线设计工具(https：//tale-nt.cac.cornell.edu/node/add/talen/)中，完成设计。挑选出靶向HPV16E7基因第512碱基(E6E7基因第1个碱基开始计数)的TALENs对，命名为TALEN-512。其靶向的DNA序列为：

TALEN-512：ATGTTAGATTTGCAACCAGAGACAACTgatctctactgttatgagcAATTAAATGACAGCTCAGAGGAGG

其中，大写字母为TALE的识别和结合区域，小写字母部分为Spacer区，即TALEN中FokI酶切割区域。具体地，

TALEN-512L：ATGTTAGATTTGCAACCAGAGACAACT

TALEN-512R：CCTCCTCTGAGCTGTCATTTAATT

识别模块TALEN-512L对应的优选的RVD序列：

NI-NG-NN-NG-NG-NI-NN-NI-NG-NG-NG-NN-HD-NI-NI-HD-HD-NI-NN-NI-NN-NI-HD-NI-NI-HD-NG 

识别模块TALEN-512R对应的优选的RVD序列：

HD-HD-NG-HD-HD-NG-HD-NG-NN-NI-NN-HD-NG-NN-NG-HD-NI-NG-NG-NG-NI-NI-NG-NG 

其中，NI识别A，NG识别T，NN识别G，HD识别C

确定RVD序列后，将RVD序列复制到Golden Gate TALE Assembly form表单(核酸研究杂志，2011，39：pp.e82)中去，生成2轮酶切连接反应序列以及相应的表达质粒序列。根据表单中生成的酶切连接反应序列中RVD的顺序编号，对照Golden Gate TALEN and TAL Effector Kit 2.0试剂盒挑选出相应的表达质粒，按照Tomas Cermak等报道的方法(Cermak T等，Nucleic acids research，2011，39：pp.e82)进行构建。构建完成后，常规测序与表单中生成的表达质粒序列进行比对确定构建表达载体序列正确无突变，再将表达载体通过酶切连接的方式连接到真核表达载体pcDNA3.1(+)中去。再次克隆测序鉴定，挑选正确克隆进行扩增并提取质粒。质粒的扩增、提取参照《分子克隆实验指南》第二版。

例2.TALEN-512诱导细胞凋亡 

靶向于HPV16E6E7的TALEN-512转染到细胞后表达出来的TALENs，可以迅速的识别靶序列并与之结合，两个单体上表达的FokI核酸内切酶在空间上接近并发生二聚体化，切断靶序列，形成双链DNA断裂(DSB)，DSB启动细胞进行自我修复。由于细胞优先采用易错的NHEJ方式进行修复，修复时易引起碱基插入或缺失导致密码子的框移突变，最终使得HPV16E6E7蛋白的表达受到抑制。而E6E7蛋白的表达是HPV感染细胞获得永生化的前提条件，因此，E6E7蛋白的表达受到抑制后，HPV感染细胞表现为增殖能力下降，凋亡能力增强。

具体操作方法是：

(1)细胞培养

宫颈癌细胞系SiHa(HPV16阳性)、HeLa(HPV18阳性)和C33A(HPV阴性)以及人胚肾细胞系HEK293(HPV阴性)用含有10％胎牛血清的DMEM培养基培养，培养在37℃、含5％CO₂的培养箱内。待细胞生长到细胞融合度达到70％以上时，使用0.25％的胰蛋白酶进行常规消化，DMEM完全培养基终止，将细胞接种到12孔板中，培养过夜。

(2)质粒转染

细胞培养过夜后，镜下观察确认细胞贴壁良好，细胞融合度达到70％，即可进行质粒转染。每孔转染500ng TALEN-512F和500ng TALEN-512R(共计1μg)，转染使用Invitrogen公司的Lipofectamine 3000转染试剂，转染步骤参见Lipofectamine 3000的说明书。此外，转染等量的空载体(共计1μg)作为阴性对照。转染后的细胞继续在37℃、5％CO₂培养箱中培养。

(3)细胞凋亡的检测

转染48小时后，常规使用0.25％的胰酶消化细胞，收集细胞到离心管中，常温条件下300g离心5分钟，PBS洗涤一次，常温条件下300g离心5分钟。使用南京凯基生物的Annexin V-FITC/PI细胞凋亡检测试剂盒(货号：KGA-107)中的Binding Buffer重悬细胞，分别加入Annexin V-FITC和PI，室温避光孵育15分钟。使用BD公司的FACSCalibur流式细胞仪检测细胞凋亡。

试验结果显示，转入TALEN-512的SiHa细胞凋亡明显增加，凋亡率达到50％，而转入等量空载体的SiHa细胞的凋亡未见明显增加。转染TALEN-512的HeLa、C33A和HEK293细胞的凋亡都未见明显增加。

例3.TALEN-512的切割效率验证

TALEN在细胞内发挥作用后切割形成的DSBs，可以迅速的诱导细胞进行自我修复。在真核生物细胞中，为避免DNA断裂造成的DNA降解对细胞生存的影响，细胞大多采用NHEJ的方式将两断端直接相连，但是这种易错的修复方式极易在断裂点处引入小片段的基因插入或缺失，引起密码子的框移突变，最终使得靶基因的表达受到阻碍。此时，若将这种已经过TALEN剪切又经细胞错误修复的碱基序列与未处理的正常的(野生型的)碱基序列混合后退火延伸，即可形成一种在剪切位点处存在错配的特殊的杂交双链(与修复后的碱基插入或缺失相对应)。这种杂交双链可被T7Endonuclease I识别并在错配处切断。

因此，细胞转染TALEN后，由于转染效率的限制，小部分没有成功转染的细胞的DNA序列没有被改变，而大部分成功转染的细胞在表达了TALEN后即可切割DNA序列。将这所有细胞的总基因组DNA提取出来，即可得到既含有切割后修复的DNA序列也含有未被处理的野生型序列的混合产物。再经PCR扩增，得到切割后修复的DNA序列和野生型序列的混合PCR产物，将此混合产物纯化后直接退火延伸，即可形成杂交双链，再应用T7Endonuclease I进行酶切处理，就能识别并切断杂交双链，通过琼脂糖凝胶电泳即可分辨。

具体实施方案如下：

(1)细胞的培养 

人宫颈癌细胞系SiHa(HPV16阳性)的融合度达70％以上时，常规0.25％胰酶消化，接种到12孔板中，每孔种植细胞量约5×10⁵个，继续在37℃、5％CO₂培养箱中培养过夜。

(2)质粒的转染 

细胞培养过夜后，相差显微镜下观察细胞贴壁良好，细胞融合度达到70％以上，即可进行质粒转染。每孔转染500ng TALEN-512F和500ng TALEN-512R(共计1μg)，转染等量的空载体(共计1μg)作为阴性对照。转染使用Invitrogen公司的Lipofectamine 3000转染试剂，转染步骤参见Lipofectamine 3000的说明书。转染后的细胞继续在37℃、5％CO₂培养箱中培养。

(3)基因组DNA的提取

转染48小时后，常规0.25％的胰酶消化，用DMEM完全培养基终止消化，收集细胞到离心管中，300g离心5分钟，弃除培养基，PBS洗涤一次，再次300g离心5分钟，弃除PBS，获得细胞渣，使用细胞基因组提取试剂盒(天根生化科技北京有限公司，货号：DP304)提取细胞基因组DNA，测量DNA浓度＞50ng/μL。

(4)引物的设计 

根据HPV16E6E7基因序列设计引物，引物两端横跨靶点(产物长度优选400～500bp，并且靶点距离引物两段的距离应当差别50bp以上以便在琼脂糖凝胶电泳时能有效的区分切开的两个小片段)。本实施例中与TALEN-512相对应的引物序列为：

TALEN-512-T7E1-F：cagcaatacaacaaaccgttg

TALEN-512-T7E1-R：ggggcacacaattcctagtg

设计PCR产物长度约480bp，引物两端距离TALEN-512切割位点的长度分别约200bp和280bp。

(5)PCR反应

以上述提取的基因组DNA为模版，用上述引物进行PCR反应。本实验使用的高保真DNA聚合酶为北京全式金生物科技有限公司的TransStart FastPfu DNA Polymerase(货号：AP221)。

PCR反应体系： 

PCR反应条件： 

PCR反应完成后，先取少量PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，根据电泳结果初步判定PCR产物的浓度以及条带大小是否正确等。确定无误后，使用GeneJET PCR Purification Kit(Thermo Scientific公司，#K0701)按照说明书要求进行PCR产物纯化。纯化完成后，取2μL纯化产物进行琼脂糖凝胶电泳确定产物成功纯化出来，同时使用NanoDrop(Thermo Scientific公司)测量纯化产物的浓度。

(6)T7Endonuclease I酶切反应及聚丙烯凝胶电泳

本实验使用的T7Endonuclease I以及配套的10×NEB Buffer 2购自New England Biolabs公司(货号：M0302S)。操作步骤如下：

取200ng纯化PCR产物进行如下反应：

反应体系： 

退火条件： 

退火反应完成后，杂交双链已经形成，此时再加入T7Endonuclease I 1μL，震荡混匀后，37℃孵育15分钟完成切割，加入2μL0.25M EDTA溶液终止酶切反应。反应完成后，使用5％聚丙烯凝胶进行电泳，电泳相关实验步骤参照《分子克隆实验指南》第二版中的聚丙烯凝胶电泳部分。

聚丙烯凝胶电泳结果显示，上述PCR产物能被T7Endonuclease I切断，出现两个较小的条带，说明TALEN-512在细胞内成功的切割HPV16E6E7基因序列，通过Image J软件对条带的灰度值进行测算，就能初步估算TALEN-512的切割效率。

例4.TALEN-512对细胞增殖的影响

(1)细胞培养

宫颈癌细胞系SiHa、HeLa和人胚肾细胞系HEK293细胞的融合度达到70％以上时，使用0.25％胰酶常规消化，DMEM完全培养基终止消化，计数，接种于96孔板中，共5块孔板，每块孔板上每种细胞设3组×5个复孔，每孔细胞数量5,000个，接种后继续在37℃、5％CO₂培养箱里培养。

(2)质粒的转染 

培养24h后，观察细胞贴壁良好，转染TALEN-512表达质粒或等量空载体表达质粒(阴性对照)，转染混合物的配制方法同实施例2所述。96孔板中每孔加入完全培养基100μL，加入20μL的转染混合物(对应质粒总量为0.4μg)。

(3)取1块孔板，更换培养基，每孔加入DMEM培养基100μL，在含有细胞的孔中加入10μL CCK-8试剂(日本东仁化学科技公司，货号：CK04)，另选5个空白的无细胞孔，每孔加100μL培养基和CCK-8试剂10μL，作为检测时的Blank对照。37℃避光条件下培养2h后在多功能酶标仪检测490nm处的吸光度值(第0d数据)，记录下数据，并计算平均值及标准差。

(4)第2天同一时间，取一块96孔板，处理方式同(3)，得到1d数据。以此类推，分别于第3、4、5天检测490nm处的吸光度值获得第2d、3d、4d的数据。

(5)汇总数据，绘制各细胞的增殖曲线图。结果显示，TALEN-512仅能特异性的抑制SiHa细胞的增殖，对HeLa、HEK293细胞的增殖无明显影响。

例5.皮下瘤内注射TALEN的抑制试验

(1)准备肿瘤细胞 

宫颈癌细胞SiHa和HeLa经大量扩增后，待细胞融合度达到70％时用0.25％的胰酶常规消化后，用DMEM完全培养基终止消化，将细胞收集到15mL离心管中，300g离心5分钟，弃去上清，用细胞用PBS重悬，再次300g离心5分钟，弃去上清，少量细胞用PBS重悬，计数细胞密度。

(2)制备皮下瘤模型

4-5周龄的BALB/c-nude雌性裸鼠(购自北京华阜康生物科技股份有限公司，于华中科技大学同济医学院动物实验中心SPF级动物房中饲养)随机分组。分别在每只BALB/c-nude裸鼠臀部接种1×10⁷个SiHa或5×10⁶个HeLa细胞，继续饲养等待皮下瘤的生长。

(3)接种后约15-20天，测量裸鼠皮下瘤长到约100～150mm³时，即可进行瘤内转染。取50μL无菌的5％葡萄糖溶液，加入10μg的TALEN-512(5μg TALEN-512L+5μg TALEN-512R)的表达质粒，充分混匀。加入1.2μL TurboFect in vivo体内转染试剂(购自Fermentas公司，货号：R0541)，混匀后室温下孵育15分钟。一次性使用无菌胰岛素注射器(规格：1mL，BD公司)抽取转染混合物，小心注射到皮下瘤内部。转染等量空载体质粒作为阴性对照，转染每3天重复1次，共转染6次。每次转染前用游标卡尺测量 瘤体大小并作记录。

(4)皮下瘤内注射转染试剂18天后，BALB/c-nude裸鼠在麻醉后处死，解剖出皮下瘤，称重。结果发现，瘤内注射转染TALEN-512后，SiHa细胞形成的皮下瘤生长速度明显变缓，而作为对照的转染等量空载体后的SiHa细胞形成的皮下瘤生长速度未见明显影响。瘤体称重结果显示转染TALEN-512后的SiHa细胞的皮下瘤的重量明显轻于对照组皮下瘤。

Claims (8)

1.一种高危型人乳头瘤病毒E6E7癌基因定点敲除系统，其特征在于有效的基因定点敲除系统是剪切嗯乳头瘤病毒E6E7癌基因序列的转录激活子样效应因子核酸酶TALENs。

2.所述的E6E7癌基因序列为NCBI数据库中RefSeq为NC_001526.2和NC_001357.1中E6和E7 CDS区序列。

3.所述的转录激活子样效应因子核酸酶TALENs是由识别HPV E6E7癌基因序列的TAL-HPV-F和TAL-HPV-R组成，所述的TAL-HPV-F，其特征在于，由HPV E6E7识别结构域和人工优化的DNA切割域FokI融合而成；所述的TAL-HPV-R，其特征在于，由HPV E6E7识别结构域和人工优化的DNA切割域FokI融合而成。

4.如权利要求1所述的TALENs，其针对的靶点可为野生型高危型人乳头瘤病毒的E6E7癌基因序列，也可为高危型人乳头瘤病毒的E6E7癌基因突变株；所述DNA切割域FokI优选人工改造的IIS型限制性内切核酸酶。

5.如权利要求1所述的高危型HPV，包括但不限于最常见的HPV16和HPV18两种亚型。

6.一种多核苷酸，其编码的蛋白质是权利要求1～3中任一项所述的TALENs。

7.一种融合蛋白质，能特异性的识别和结合高危型HPV E6E7癌基因的序列，并在结合后切断高危型HPV E6E7癌基因序列。

8.一种表达序列，其编码的蛋白质能识别并结合在高危型人乳头瘤病毒的E6E7癌基因序列上，并由所融合的FokI切割域切割高危型人乳头瘤病毒HPV16和HPV18的E6E7癌基因上的靶向位点。