CN104450784B

CN104450784B - 一种samhd1基因敲除细胞系的构建方法

Info

Publication number: CN104450784B
Application number: CN201410654987.9A
Authority: CN
Inventors: 靳昌忠; 吴南屏
Original assignee: Zhejiang University ZJU
Current assignee: Zhejiang University ZJU
Priority date: 2014-11-18
Filing date: 2014-11-18
Publication date: 2017-03-22
Anticipated expiration: 2034-11-18
Also published as: CN104450784A

Abstract

本发明公开了一种SAMHD1基因敲除细胞系的构建方法，首先针对SAMHD1基因CDS1和CDS2共设计4对识别序列；然后将靶点识别单元模块的基因片段分别按照4对识别序列进行串联，并克隆入pCAG‑T7‑TALEN(Sangamo)‑ Destination质粒，构建4对TALEN表达质粒对；将4对TALEN质粒对分别转染293T细胞，并用新霉素筛选出敲除SAMHD1基因的细胞系；所述方法能够在基因组SAMHD1靶位点造成移码突变，形成目标基因敲除突变体，达到从基因组中稳定敲除SAMHD1基因的目的。

Description

一种SAMHD1基因敲除细胞系的构建方法

技术领域

本发明属于分子生物学技术领域，涉及一种从基因组中敲除SAMHD1基因的方法，可用于SAMHD1功能研究及构建SAMHD1表达稳定缺失的细胞系。

背景技术

最近，Laguette N等在HIV-1难以感染的髓系细胞中发现了一种HIV-1的宿主限制因子——SAMHD1，该分子可以水解dNTPs，从而抑制人类髓系细胞中HIV-1的复制。SAMHD1全长67020bp，包含16个外显子，蛋白由626个氨基酸组成。Goldstone等测定了它的结构和催化活性，晶体结构揭示SAMHD1是一个二聚体，其分子结构包括N-末端的SAM结构域，HD结构域和C末端区域。HD结构域以组氨酸/天冬氨酸残基双联体基序为特征，在进化上高度保守，在核酸代谢和信号传导等方面发挥重要作用。当SAM结构域缺失时，HD结构域可以表现完全磷酸水解酶的功能。

SAMHD1是一种dGTP依赖的磷酸水解酶。SAMHD1先形成二聚体结构的分子，再结合dGTP，并发生变构，从而暴露出磷酸水解酶的活性。它的主要功能是将dNTPs水解成脱氧核苷和无机的三磷酸，从而降低核内dNTPs的浓度，参与细胞内的dNTPs代谢过程。SAMHD1功能的缺失可以造成细胞内dNTPs的大量积聚，从而导致强烈的免疫活化和大量的I型干扰素分泌。先天性的SAMHD1基因突变可以引起一种罕见的遗传性自身免疫性疾病——AGS(Aicardi-Goutières syndrome），这是一种类似于先天性宫内病毒感染表现的先天性脑病，可以引起严重的脑萎缩和慢性脑脊液淋巴细胞增多，患者常伴有不适宜的免疫活化和IFN-α的大量产生。SAMHD1基因缺陷的AGS患者的单核细胞更容易感染HIV-1，进一步在人体原代细胞上验证了SAMHD1的HIV-1感染限制功能。

鉴于SAMHD1在细胞核酸代谢和HIV-1感染中的重要作用，敲除SAMHD1蛋白在SAMHD1的功能研究中是十分重要的手段。目前敲除或降低SAMHD1表达的方法仅限于RNAi，该方法仅能瞬时降低SAMHD1蛋白的表达，不能形成稳定敲除，更难以建立SAMHD1表达缺失的细胞系，而且降低的程度也有限，不能完全敲除SAMHD1的表达。因此，有必要开发一种从基因组中完全敲除SAMHD1基因的方法。TALENs(transcription activator-like (TAL)effector nucleases)的中文名为转录激活因子样效应物核酸酶，是基因组编辑核酸酶三大类之一。它是实现基因敲除、敲入或转录激活等靶向基因组编辑的里程碑。相比于传统的锌指核酸酶(ZFNs)技术，TALENs具有独特的优势：设计更简单，特异性更高，现在成为了科研人员用于研究基因功能和潜在基因治疗应用的重要工具。是目前较有发展前景的基因修饰技术。我们以TALENs技术为基础，开发了一种从基因组中完全敲除SAMHD1基因的方法。该方法将为研究SAMHD1功能、建立SAMHD1缺失的细胞系以及HIV-1感染机制研究打下基础。

发明内容

本发明的目的是针对目前瞬时敲除SAMHD1方法的不稳定性和不彻底性，提供一种从基因组中稳定敲除SAMHD1基因的方法，该方法除用于SAMHD1功能研究外，还可以用于建立SAMHD1表达缺失细胞系，为其它研究提供细胞模型。

本发明的目的通过以下技术方案实现：一种SAMHD1基因敲除细胞系的构建方法，包括以下步骤：

（1）针对SAMHD1基因的CDS1选取作用靶点，并设计2对识别序列，分别为L1/R1、L2/R2；针对SAMHD1基因的CDS2选取作用靶点，并设计2对识别序列，分别为L3/R3、 L4/R4；L1~L4的序列如SEQ ID NO.17~SEQ ID NO.20所示，R1~R4的序列如SEQ ID NO.21~SEQ IDNO.24所示；L1/R1、 L2/R2、L3/R3、 L4/R4具体为：

L1:gtgtagccatgcagcgag，R1:cgcaacggggacgcttgg；

L2:gccatgcagcgagccgat，R2:tcatcgcaacggggacgc；

L3:atgaaatcacaggcgcat，R3:tttcaaaacgagactcat；

L4:aaatcacaggcgcattac，R4:agattttcaaaacgagac；

（2）将靶点识别单元模块的基因片段分别按照L1/R1、L2/R2、L3/R3、L4/R4序列进行串联，串联成功后克隆入pCAG-T7-TALEN(Sangamo)- Destination质粒，共构建4对TALEN表达质粒对；靶点识别单元模块的基因片段按照L1序列进行串联后对应的氨基酸序列如SEQ ID NO.9所示；按照R1序列进行串联后对应的氨基酸序列如SEQ ID NO.10所示；按照L2序列进行串联后对应的氨基酸序列如SEQ ID NO.11所示；按照R2序列进行串联后对应的氨基酸序列如SEQ ID NO.12所示；按照L3序列进行串联后对应的氨基酸序列如SEQ ID NO.13所示；按照R3序列进行串联后对应的氨基酸序列如SEQ ID NO.14所示；按照L4序列进行串联后对应的氨基酸序列如SEQ ID NO.15所示；按照R4序列进行串联后对应的氨基酸序列如SEQ ID NO.16所示。

（3）将构建好的4对TALEN表达质粒对分别用脂质体转染试剂盒转染到表达SAMHD1的293T细胞系中，48小时后将细胞在含有浓度为100ug/ml的新霉素的DMEM培养基中培养10-14天，筛选出活细胞，得到SAMHD1基因敲除细胞系。

本发明的有益效果是：

本发明中，通过转染TALEN质粒对，在靶细胞内表达特异性的SAMHD1基因靶位点氨基酸识别序列和Fok1内切酶的融合蛋白，氨基酸识别序列分别找到其DNA靶位点并与靶位点特异性结合。此时，两个TALEN融合蛋白中的Fok1功能域形成同源二聚体，发挥非特异性内切酶活性，于两个靶位点之间打断SAMHD1基因的DNA双链。由于内切酶的切割诱发DNA损伤修复机制，由于在此过程中总是有一定的错误率存在，在修复过程中发生移码突变错误的个体就是SAMHD1基因敲除突变体。而本方法构建的SAMHD1基因敲除是在基因组水平上形成移码突变，故可以随着细胞的分裂、增殖传递到下一代，形成稳定的SAMHD1基因敲除细胞系。

附图说明

图1. pCAG-T7-TALEN(Sangamo)- Destination质粒图谱；

图2. SAMHD1 CDS1敲除靶位；

图3. SAMHD1 CDS1敲除靶位；

图4. SAMHD1基因TALEN敲除的酶切鉴定结果；

图5. TALEN、shRNA和Vpx-VLP三种方法敲除SAMHD1表达的效果比较。采用WesternBlotting检测SAMHD1蛋白的表达，A为处理后48小时的检测结果，B为处理后2周的检测结果。

具体实施方式

为了进一步理解本发明，下面结合实施例对本发明优先实施方案进行描述，但是应该理解，这些描述只是为进一步说明本发明，而不是本发明权利要求的限制。

实施例1：

SAMHD1基因敲除细胞系的构建及其检测，包括以下步骤：

（1）针对SAMHD1基因的CDS1选取作用靶点，并设计2对识别序列，分别为L1/R1和L2/R2（如图2）；针对SAMHD1基因的CDS2选取作用靶点，并设计2对识别序列，分别为L3/R3和L4/R4（如图2）；L1/R1、 L2/R2、L3/R3、 L4/R4具体为：

L1:gtgtagccatgcagcgag，R1:cgcaacggggacgcttgg；

L2:gccatgcagcgagccgat，R2:tcatcgcaacggggacgc；

L3:atgaaatcacaggcgcat，R3:tttcaaaacgagactcat；

L4:aaatcacaggcgcattac，R4:agattttcaaaacgagac；

（2）将靶点识别单元模块的基因片段分别按照L1/R1、L2/R2、L3/R3、L4/R4序列进行串联，串联成功后克隆入pCAG-T7-TALEN(Sangamo)- Destination质粒（如图1所示），共构建4对TALEN表达质粒对；

所述靶点识别单元模块包括NI、NG、HD和NN；单元模块NI识别碱基A，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；单元模块NG识别碱基T，其氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示，核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示；单元模块HD识别碱基C，其氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示，核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示；单元模块NN识别碱基G，其氨基酸序列如SEQ ID NO.7所示，核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示；

靶点识别单元模块的基因片段按照L1序列进行串联后对应的氨基酸序列如SEQID NO.9所示；按照R1序列进行串联后对应的氨基酸序列如SEQ ID NO.10所示；按照L2序列进行串联后对应的氨基酸序列如SEQ ID NO.11所示；按照R2序列进行串联后对应的氨基酸序列如SEQ ID NO.12所示；按照L3序列进行串联后对应的氨基酸序列如SEQ ID NO.13所示；按照R3序列进行串联后对应的氨基酸序列如SEQ ID NO.14所示；按照L4序列进行串联后对应的氨基酸序列如SEQ ID NO.15所示；按照R4序列进行串联后对应的氨基酸序列如SEQ ID NO.16所示。

所述质粒pCAG-T7-TALEN(Sangamo)- Destination的图谱如图1所示，购于美国Addgene公司。

（3）将构建好的4对TALEN表达质粒对分别用脂质体转染试剂盒转染到表达SAMHD1的293T细胞系中，48小时后将细胞在含有浓度为100ug/ml的新霉素的DMEM培养基中培养10-14天，完成SAMHD1基因的敲除。

（4）由于TALEN质粒对有一定的转染效率，并且Fok1内切酶切割后诱发的DNA损伤修复形成的移码突变具有随机性，故形成的SAMHD1基因敲除细胞是一群混合型的细胞。由于移码突变后会破坏原有的内切酶识别位点，故可以通过内切酶检测来鉴定不同TALEN质粒对的基因敲除效率，进一步的鉴定还可以通过基因测序来实现。

（4.1）内切酶法检测SAMHD1 TALEN质粒对的基因敲除效率

（a）将G418筛选后的293T细胞株用Qiagen全基因组DNA提取试剂盒提取基因组DNA；

（b）设计SAMHD1 包含CDS1和CDS2两个靶位点两端片段的PCR引物各一对，其序列分别为：CDS1 F：TGCTGGCAGCCTGACGGCCTT，CDS1 R：CTCTTCAAAGCCACCGCGCCTGA，CDS2 F：TCAGAGTATTGAGTGCTT，CDS2 R：GGTGAACAAGAGACTATCTCAA；

（c）通过PCR反应扩增SAMHD1 CDS1和CDS2两个片段，片段长度750bp左右；

（d）PCR扩增的片段分别用Ace I（CDS1）和Bsll（CDS2）内切酶酶切后，1％琼脂糖凝胶电泳鉴定。

如图4内切酶检测结果显示，野生型293T细胞株的SAMHD1 PCR产物均可以被Ace I（CDS1）和Bsll（CDS2）酶切，而TALEN质粒对L2/R2和L4/R4均能够在靶位点区域造成移码突变，破坏了Ace I（CDS1）和Bsll（CDS2）的酶切位点，使部分PCR产物片段不能被切断（图中箭头所指），形成目标基因敲除突变体。其中TALEN质粒对L2/R2效率更高。

（4.2）基因测序法鉴定SAMHD1基因移码突变的形成

（b）通过PCR反应扩增SAMHD1 CDS1和CDS2两个靶位点两端片段；

（c）将PCR产物与TA科隆质粒混合，用T4连接酶连接；

（d）取连接产物1μL，至于DH5α感受态细胞中，进行转化；

（e）转化好的感受态细胞均匀涂到LB琼脂平板上，37℃培养过夜；

（f）每对TALEN质粒对的TA克隆平板挑选30-40个克隆，于LB培养基中37℃摇菌，培养过夜；

（g）提取质粒，送测序公司进行基因测序。

从表1测序结果可以看出，L2/R2质粒对的移码突变效率最高，达到17.5%，其次为L4/R4质粒对，L3/R3质粒对未起作用。

表1 TALEN质粒对造成的SAMHD1基因移码突变效率

	L1/R1质粒对	L2/R2质粒对	L3/R3质粒对	L4/R4质粒对
					测序总克隆数及比例	40（100%）	40（100%）	38（100%）	35（100%）
移码突变克隆数及比例	1（2.5%）	7（17.5%）	0（0%）	3（8.6%）
					修复后位点缺失未形成移码突变的克隆数及比例	0（0%）	3（7.5%）	0（0%）	2（5.7%）
断裂未修复克隆数及比例	2（5%）	5（12.5%）	0（0%）	2（5.7%）
					未酶切成功克隆数及比例	37（92.5%）	25（62.5%）	38（100%）	28（80%）

实施例2

本实施例将本发明所述的方法与小RNA干扰技术在SAMHD1基因敲除效率和稳定性方面的对比。目前采用的SAMHD1敲除方法为以shRNA为主的小RNA干扰技术，此外还可以将HIV-1的Vpx表达质粒转染靶细胞，以降解SAMHD1蛋白。我们对比研究了以上两种方法与基于TALEN技术的SAMHD1敲除方法的效率很稳定性。

方法一：利用本发明所述的方法敲除293T细胞的SAMHD1表达；

方法二：将HIV-1 Vpx蛋白表达质粒Vpx-VPL转染293T细胞，降解SAMHD1表达；

方法三：按照文献中常用的SAMHD1 shRNA序列，合成shSAMHD1 5'-TGGAAATCTGTATGACATG和 shCtrl 5'-TCGGCGCAGTCTAATTATA，转染293T细胞；

将上述3种方法处理的293T细胞分别于处理后48h和处理后2周收集细胞，提取总蛋白，用Western Blotting检测SAMHD1蛋白的表达。

如图5所示，在处理后48小时左右，三种方法均能够显著敲除SAMHD1的表达，其中TALEN和Vpx-VLP敲除效果更好。2周后，只有TALEN技术处理的293T细胞SAMHD1表达被稳定敲除，其余两种方法均不能形成稳定的敲除。

上述实施例用来解释说明本发明，而不是对本发明进行限制，在本发明的精神和权利要求的保护范围内，对本发明作出的任何修改和改变，都落入本发明的保护范围。

Claims

1.一种SAMHD1基因敲除细胞系的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：

（1）针对SAMHD1基因的CDS1选取作用靶点，并设计2对识别序列，分别为L1/R1、L2/R2；针对SAMHD1基因的CDS2选取作用靶点，并设计2对识别序列，分别为L3/R3、L4/R4；L1~L4的序列如SEQ ID NO.17~SEQ ID NO.20所示，R1~R4的序列如SEQ ID NO.21~SEQ ID NO.24所示；

（2）将靶点识别单元模块的基因片段分别按照L1/R1、L2/R2、L3/R3、L4/R4序列进行串联，串联成功后克隆入pCAG-T7-TALEN(Sangamo)- Destination质粒，共构建4对TALEN表达质粒对；其中，靶点识别单元模块的基因片段按照L1序列进行串联后对应的氨基酸序列如SEQ ID NO.9所示；按照R1序列进行串联后对应的氨基酸序列如SEQ ID NO.10所示；按照L2序列进行串联后对应的氨基酸序列如SEQ ID NO.11所示；按照R2序列进行串联后对应的氨基酸序列如SEQ ID NO.12所示；按照L3序列进行串联后对应的氨基酸序列如SEQ ID NO.13所示；按照R3序列进行串联后对应的氨基酸序列如SEQ ID NO.14所示；按照L4序列进行串联后对应的氨基酸序列如SEQ ID NO.15所示；按照R4序列进行串联后对应的氨基酸序列如SEQ ID NO.16所示；

（3）将构建好的4对TALEN表达质粒对分别用脂质体转染试剂盒转染到表达SAMHD1的293T细胞系中，48小时后将细胞在含有浓度为100μg/mL的新霉素的DMEM培养基中培养10-14天，筛选出活细胞，得到敲除SAMHD1基因的细胞系。