KR20170041641A - 식물 원형질체로부터 식물체를 제조하는 방법 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 식물 원형질체로부터 식물체를 제조하는 방법에 관한 것으로, 구체적으로 식물 원형질체에서 식물의 내재적 유전자를 결손 또는 도입시키는 단계를 포함하는 식물체 제조 방법에 관한 것이다.

Description

식물 원형질체로부터 식물체를 제조하는 방법 {Method for producing whole plants from protoplasts}
본 발명은 식물 원형질체(protoplast)에서 하나 이상의 식물의 내재적 유전자를 결손 또는 도입시키는 단계를 포함하는 식물 원형질체로부터 식물체를 제조하는 방법, 및 상기 방법으로 제조된 유전체가 교정된 식물 원형질체로부터 재생된 식물체에 관한 것이다.
ZFN (zinc finger nuclease), TALLEN (transcription activator-like effector DNA binding protein) 및 RGENs (RNA-guided endonucleases) 등의 유전자 가위(programmable nucleases)는 박테리아, 조류 등의 CRISPR-Cas (type II clustered, regularly-interspaced palindromic repeat-CRISPR-associated) 획득 면역 시스템으로부터 목적에 맞게 만들어졌으며, 다양한 식물 종으로부터 유래한 세포 및 유기체의 유전체 교정에 사용되고 있으며, 생물의약 연구, 의약품 및 생명공학 분야에서 신규한 활용 방법으로 인식되고 있다(Kim, H. etc., Nat Rev Genet, 2014, 15: 321-334). 상술한 유전자 가위 중에서도, CRISPR RGENs는 가장 최근에 개발된 것으로서, 프로그래밍의 용이성 때문에 ZFNs, TALENs를 빠른 속도로 대체하고 있다.
스트렙토코커스 피요젠스(Streptococcus pyogenes)로부터 유래한 Cas9 단백질과 가이드-RNAs (gRNAs)로 구성된 RGENs은, RNA 구성요소만을 대체하도록 설계되어, 새로운 TALENs 및 ZFNs의 제조에 필요한 노동 집약적이고 많은 시간이 소요되는 단백질 공학이 필요하지 않게되었다. 아그로박테리움(Agrobacterium) 또는 뉴클라아제를 암호화하는 플라스미드의 형질주입을 통해 식물세포로 전달되는 유전자 가위는, 서열 의존적인 방법으로 염색체 표적 위치를 절단하여, 위치-특이적 DNA 이중-나선 절단(DNA double-strand breaks; DSBs)을 생성한다. 이러한 내재적 시스템을 통한 DSBs의 수선은 표적화 유전체 교정에 사용될 수 있다.
유전체 교정 식물이 유럽 및 타 국가에서 GMO (genetically-modified organism)로 규정되어 제제를 받을지 여부는 현재까지 불명확한 상태이다 (Jones, H.D., Nature Plants, 2015, 1: 14011). 유전자 가위 (programmable nuclease)는 유전체의 표적 위치에서 자연적으로 발생하는 변이와 구별할 수 없는 작은 규모의 삽입 및 결실 (insertions and deletions, indel), 또는 치환을 유도한다. 이와 같은 유전체 교정 식물은 몇몇 국가에서 GMO로 규정될 수 있어, 식물 생명공학 및 농업 분야에서 유전자 가위의 사용을 제한한다. 예를 들어, 아그로박테리움 (Agrobacterium)을 사용하는 경우, 이를 통해 제조된 유전체 교정 식물은 유전체 상에 유전자 가위를 코딩하는 유전자를 포함한 외래 DNA 서열을 가지게 된다. 이러한 아그로박테리움 유래 DNA 서열을 육종을 통해 제거하는 것은 포도, 감자 및 바나나와 같이 무성 생식을 하는 식물에서는 불가능하다.
대신에, 유전자 가위를 코딩하는 비-삽입성 플라스미드는 원형질체와 같은 식물 세포에 형질주입시킬 수 있다. 그러나 본 발명자들은, 인간 세포에서 보여진 것과 같이, 형질주입된 플라스미드가 세포 내에서 내인성 뉴클레아제에 의해 분해되고, 이로부터 생성된 작은 DNA 단편들이 Cas9의 표적 (on-target) 및 비표적 (off-target) 위치에 삽입될 수 있다는 사실에 주목하였다 (Kim, S, etc., Genome research, 2014, 24: 1012-1019).
Cas9 단백질 및 gRNA를 코딩하는 플라스미드를 식물 세포에 도입하는 방법에 비해, 미리 조립된 Cas9 단백질-gRNA RNP (ribonucleoprotein)를 이용하는 경우 숙주세포의 유전체에 재조합 DNA를 삽입할 가능성을 줄일 수 있다. 나아가, 인간 세포에서 확인된 것과 같이, RGEN (RNA-guided engineered nuclease) RNP는 형질주입 후 바로 염색체 표적 위치를 절단하고, 세포 내에서 내인적 단백질 분해효소에 의해 빠르게 분해되므로, 재생된 식물체에서 모자이크 현상 (mosaicism) 및 비표적 효과 (off-target effect)의 가능성을 감소시킬 수 있다. 미리 조립된 RGEN RNP는 사전 코돈 최적화 과정 및 각 식물 종에서 Cas9 및 gRNA를 발현시키기 위한 프로모터 없이도 광범위한 식물 종에 사용될 수 있다. 게다가, RGEN RNP는 고도의 활성을 가지는 gRNA를 시험관 내에서 미리 스크리닝할 수 있고, RFLP (restriction fragment length polymorphism) 분석을 통해 변이 클론의 유전형질을 확인할 수 있다.
그러나, RGEN RNPs는 어떠한 식물 종에서도 사용된 적이 없었다.
본 발명의 하나의 목적은 식물 원형질체(protoplast)에서 하나 이상의 식물의 내재적 유전자를 결손 또는 도입시키는 단계를 포함하는, 식물 원형질체로부터 식물체를 제조하는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 하나의 목적은 식물 원형질체로부터 식물체를 제조하는 상기 방법으로 제조된, 유전체가 교정된 식물 원형질체로부터 재생된 식물체를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 하나의 목적은 BIN2 (brassinosteroid Insensitive 2) 유전자, BKI1 유전자 또는 이들의 동족체 (homolog)를 암호화하는 DNA에 특이적인 가이드 RNA 또는 상기 가이드 RNA를 암호화하는 DNA; 및 Cas 단백질을 암호화하는 핵산 또는 Cas 단백질을 포함하는, 식물 세포에서 BIN2 유전자를 암호화하는 DNA를 절단하기 위한 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 하나의 목적은 BIN2 (brassinosteroid Insensitive 2) 유전자, BKI1 유전자 또는 이들의 동족체 (homolog)를 암호화하는 DNA에 특이적인 가이드 RNA 또는 상기 가이드 RNA를 암호화하는 DNA; 및 Cas 단백질을 암호화하는 핵산 또는 Cas 단백질을 포함하는, 식물 원형질체로부터 식물체를 제조하기 위한 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 하나의 목적은 식물 원형질체로부터 식물체를 제조하는 조성물을 포함하는, 식물 원형질체로부터 식물체를 제조하는 키트를 제공하는 것이다.
본 발명자들은 정제된 Cas9 단백질 및 가이드 RNAs를 다양한 식물 원형질체에 형질주입하였고, 상기 원형질체로부터 재생된 식물체에서 표적화된 변이의 발생 빈도는 최대 46%임을 확인하였다. 또한, 원형질체에 Cas9 리보뉴클레오단백질을 전달하는 것은 숙주 게놈에 외래 DNA가 삽입될 가능성을 피할 수 있었다. 상기 재생된 식물체는 자연적으로 야기된 변이와는 구분되지 않는, 생식세포 계열로 전달가능한 작은 도입 또는 결실을 표적화된 위치에서 가지고 있었다. 이는, 본 발명의 방법은 아그로박테리움 또는 플라스미드를 사용하는 방법과 관련한 조절 요구사항들을 필요로 하지 않음을 시사하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위한 본 발명의 하나의 양태로서, 식물 원형질체(protoplast)에서 하나 이상의 식물의 내재적 유전자를 결손 또는 도입시키는 단계를 포함하는, 식물 원형질체로부터 식물체를 제조하는 방법을 제공한다.
하나의 구체예에서, 상기 식물의 내재적 유전자는 유전자 결손 또는 도입에 의해 스트레스 저항성을 증가시키는 유전자인 것일 수 있다.
다른 하나의 구체예에서, 상기 식물의 내재적 유전자는 식물의 브라시노스테로이드(brassinosteroid) 신호전달에 관여하는 유전자인 것일 수 있다.
또 다른 하나의 구체예에서, (ⅰ) 상기 결손시키는 단계에서 내재적 유전자는 BIN2 유전자, BKI1 유전자, 및 이들의 동족체 (homolog) 유전자들로 이루어지는 군에서 선택되는 하나 이상인 것이고, (ⅱ) 상기 도입시키는 단계에서 도입되는 유전자는 BRI1 유전자, BSU 유전자, BZR1 유전자, DWF4 유전자, CYP85A1, 및 이들의 동족체 (homolog) 유전자들로 이루어지는 군에서 선택되는 하나 이상인 것일 수 있다.
또 다른 하나의 구체예에서, 상기 유전자 결손은 BIN2 유전자, BKI1 유전자, 및 이들의 동족체 (homolog) 유전자들로 이루어지는 군에서 선택되는 하나 이상의 유전자의 대립 유전자 하나 또는 둘을 결손시키는 것일 수 있다.
또 다른 하나의 구체예에서, 상기 유전자 결손은 유전자 제거(knock-out)를 통하여 수행되는 것이고, 상기 유전자 도입은 유전자 낙인 (knock-in)을 통하여 수행되는 것일 수 있다.
또 다른 하나의 구체예에서, 상기 유전자 결손은 BIN2 유전자, BKI1 유전자, 및 이들의 동족체 (homolog) 유전자들로 이루어지는 군에서 선택되는 하나 이상의 유전자에 특이적인 유전자 가위 (engineered nuclease)를 이용하여 수행되는 것일 수 있다.
또 다른 하나의 구체예에서, 상기 유전자 가위는 ZFN (zinc finger nuclease), TALEN (transcription activator-like effector nuclease), 및 RGEN (RNA-guided engineered nuclease)으로 이루어진 군에서 선택된 것일 수 있다.
또 다른 하나의 구체예에서, 상기 RGEN은 BIN2 유전자, BKI1 유전자, 및 이들의 동족체 (homolog) 유전자들로 이루어지는 군에서 선택되는 하나 이상의 유전자의 특정 서열에 특이적으로 결합하는 가이드 RNA 또는 상기 가이드 RNA를 암호화하는 DNA, 및 Cas 단백질을 암호화하는 핵산 또는 Cas 단백질을 포함하는 것일 수 있다.
또 다른 하나의 구체예에서, 상기 유전자 결손은 BIN2 유전자, BKI1 유전자, 및 이들의 동족체 (homolog) 유전자들로 이루어지는 군에서 선택되는 하나 이상의 유전자의 특정 서열에 특이적으로 결합하는 가이드 RNA 또는 상기 가이드 RNA를 암호화하는 DNA; 및 Cas 단백질을 암호화하는 핵산 또는 Cas 단백질을 식물 원형질체에 도입하여 수행되는 것일 수 있다.
또 다른 하나의 구체예에서, 상기 가이드 RNA는 crRNA 및 tracrRNA를 포함하는 이중 RNA (dual RNA) 또는 단일-사슬 가이드 RNA (sgRNA) 형태일 수 있다.
또 다른 하나의 구체예에서, 상기 단일-사슬 가이드 RNA는 crRNA 및 tracrRNA의 부분을 포함하는 것일 수 있다.
또 다른 하나의 구체예에서, 상기 단일-사슬 가이드 RNA는 분리된 RNA의 형태일 수 있다.
또 다른 하나의 구체예에서, 상기 가이드 RNA를 암호화하는 DNA는 벡터에 암호화되어 있고, 상기 벡터는 바이러스 벡터, 플라스미드 벡터, 또는 아그로박테리움 벡터일 수 있다.
또 다른 하나의 구체예에서, 상기 Cas 단백질은 Cas9 단백질 또는 이의 변이체일 수 있다.
또 다른 하나의 구체예에서, 상기 Cas 단백질은 NGG 트리뉴클레오타이드 (trinucleotide)를 인식하는 것일 수 있다.
또 다른 하나의 구체예에서, 상기 Cas 단백질은 단백질 전달 도메인 (protein transduction domain)에 연결되어 있는 것일 수 있다.
또 다른 하나의 구체예에서, 상기 Cas9 단백질의 변이체는 촉매 아스파라긴산 (aspartate) 잔기가 다른 아미노산으로 교체된 Cas9의 변이 형태일 수 있다.
또 다른 하나의 구체예에서, 상기 아미노산은 알라닌 (alanine)일 수 있다.
또 다른 하나의 구체예에서, 상기 Cas 단백질을 암호화하는 핵산 또는 Cas 단백질은 스트렙토코커스 속 (genus Streptococcus) 유래인 것일 수 있다.
또 다른 하나의 구체예에서, 상기 스트렙토코커스 속은 스트렙토코커스 피요젠스 (Streptococcus pyogenes)일 수 있다.
또 다른 하나의 구체예에서, 상기 식물 원형질체는 상추 (Lactuca sativa) 유래인 것일 수 있다.
또 다른 하나의 구체예에서, 상기 도입은 Cas 단백질을 암호화하는 핵산 또는 Cas 단백질, 및 상기 가이드 RNA 또는 가이드 RNA를 암호화하는 DNA를 식물 원형질체에 공동-형질주입 (co-transfecting) 또는 단계적 형질주입 (serial-transfecting)하는 것일 수 있다.
또 다른 하나의 구체예에서, 상기 단계적-형질주입은 Cas 단백질 또는 Cas 단백질을 암호화하는 핵산을 먼저 형질주입한 다음, 네이키드 가이드 RNA (naked guide RNA)를 두 번째 형질주입하여 수행될 수 있다.
또 다른 하나의 구체예에서, 상기 도입은 미세주입법, 전기천공법, DEAE-덱스트란 처리, 리포펙션, 나노파티클-매개 형질주입, 단백질 전달 도메인 매개 도입, 바이러스-매개 유전자 전달, 및 PEG-매개 형질주입으로 구성된 군으로부터 선택된 방법으로 수행될 수 있다.
또 다른 하나의 구체예에서, 상기 방법은 유전자가 결손된 식물 원형질체를 재생시키는 단계를 추가로 포함하는 것일 수 있다.
또 다른 하나의 구체예에서, 상기 재생시키는 단계는 BIN2 유전자, BKI1 유전자, 및 이들의 동족체 (homolog) 유전자들로 이루어지는 군에서 선택되는 하나 이상의 유전자가 결손된 식물 원형질체를 아가로스를 포함하는 배지에서 배양시켜 캘러스 (callus)를 형성시키는 단계, 및 상기 캘러스를 재생 배지에서 배양하는 단계를 포함하는 것일 수 있다.
본 발명의 다른 하나의 양태로서, 상기 방법에 의해 제조된 유전체가 교정된 식물 원형질체로부터 재생된 식물체를 제공한다.
본 발명의 또 다른 하나의 양태로서,BIN2 (brassinosteroid Insensitive 2) 유전자, BKI1 유전자 또는 이들의 동족체 (homolog)를 암호화하는 DNA에 특이적인 가이드 RNA 또는 상기 가이드 RNA를 암호화하는 DNA; 및 Cas 단백질을 암호화하는 핵산 또는 Cas 단백질을 포함하는, 식물 세포에서 BIN2 유전자를 암호화하는 DNA를 절단하기 위한 조성물을 제공한다.
또 다른 구체예에서, 상기 조성물은 식물 세포에서 표적화된 변이 (targeted mutagenesis)를 유도할 수 있다.
본 발명의 또 다른 하나의 양태로서, BIN2 (brassinosteroid Insensitive 2) 유전자, BKI1 유전자 또는 이들의 동족체 (homolog)를 암호화하는 DNA에 특이적인 가이드 RNA 또는 상기 가이드 RNA를 암호화하는 DNA; 및 Cas 단백질을 암호화하는 핵산 또는 Cas 단백질을 포함하는, 식물 원형질체로부터 식물체를 제조하기 위한 조성물을 제공한다.
본 발명의 또 다른 하나의 양태로서, 상기 조성물을 포함하는, 식물 원형질체로부터 식물체를 제조하기 위한, 키트를 제공한다.
본 발명에서, RGEN RNPs는 다양한 식물 종에서 유래한 식물 원형질체로 전달될 수 있으며, 또한 상기 원형질체로부터 재생된 식물체에서 표적화된 게놈 변이를 유도할 수 있다.
도 1은 다양한 식물의 원형질체에서 RGEN RNP-매개 유전자 결손을 확인한 것이다. (a) T7E1 어세이 및 표적화 딥시퀀싱 (targeted deep sequencing)으로 측정된 변이 빈도, (b) 식물 세포에서 RGEN RNP에 의해 유도된 변이 DNA 서열. PAM (protospacer-adjacent motif) 서열은 빨간색으로 표시하였고, 삽입된 뉴클레오티드는 파란색으로 표시하였다. WT, 야생형. (c) 애기장대 원형질체에서 유전체 교정의 시간 경과에 따른 분석. (상단) T7E1 분석. (하단) 야생형 (WT) 및 변이 서열의 DNA 서열.
도 2는 대규모 집단에서 RGEN RNP-매개 유전자 결손을 확인한 것이다. (a) BIN2 유전자의 표적 서열. PAM 서열은 빨간색으로 표시하였다. (b) 대규모 집단에서 T7E1 분석 및 표적화 딥시퀀싱을 통해 측정한 변이 빈도. (c) 식물 세포에서 Cas9 단백질-가이드 RNA RNP로 유도된 변이 DNA 서열. PAM 서열은 빨간색으로 표시하였고, 삽입된 뉴클레오티드는 파란색으로 표시하였다. WT, 야생형.
도 3은 RNA RNP로 처리한 단일 원형질체 유래 마이크로캘리 (microcalli)의 유전형을 분석한 결과이다. (a) 마이크로캘리의 유전형. (상단) RGEN RFLP 분석, (하단) 마이크로캘리에서 변이 DNA 서열. (b) T0 세대에서 BIN2 유전자의 유전형 변이를 정리한 표.
도 4는 상추에서, RNA RNP을 이용한 표적 유전자 제거를 보여준다. (a) BIN2 유전자의 표적 서열. PAM 서열은 빨간색으로 표시하였다. (b) 마이크로캘리의 유전형. (상단) RGEN RFLP 분석, (하단) 마이크로캘리에서 변이 DNA 서열. (c) RNA RNP-형질주입된 원형질체로부터 재생된 식물체.
도 5는 비표적 (off-target) 효과를 분석한 것이다. PHYB 및 BRI1 유전자-특이적 sgRNAs의 표적 및 잠재적 비교적 위치에서 변이 빈도를 표적화 딥시퀀싱으로 측정하였다. 인델 빈도(indel rate)를 계산하기 위하여 위치 당 약 ~80,000 쌍의 말단 조각 (reads)을 획득하였다.
도 6은 LsBIN2의 부분적 뉴클레오티드 및 아미노산 서열에 대한 것이다. 밑줄 및 박스로 표시된 글자는 각각 디제너레이트 (degenerate) 프라이머 및 sgRNA에 해당하는 서열을 나타낸다.
도 7은 RNA RNP-매개 형질주입된 상추의 원형질체로부터 식물체의 재생 과정을 나타내는 것이다. RNA RNP-매개 형질주입된 상추의 원형질체로부터 원형질체 분열, 캘러스 형성 및 싹 (shoot) 재생 과정을 보여준다. (a) 원형질체 배양 5일 후 세포 분열 (스케일바 = 100 ㎛). (b) 원형질체의 다세포 콜로니 (스케일바 = 100 ㎛). (c) 원형질체 배양 4주 후 아가로스에 박힌 콜로니. (d) 원형질체-유래 콜로니로부터 캘러스 형성. (e, f) 원형질체-유래 캘러스에서 기관형성 및 재생된 싹 (스케일바 = 5 ㎛).
도 8은 변이 캘러스의 표적화 딥시퀀싱 결과에 관한 것이다. 변이 캘러스의 유전형은 Illumina Miseq으로 확인하였다. 각 대립형질의 서열 및 시퀀싱 조각의 수를 분석하였다. (A1), 대립형질 1. (A2), 대립형질 2.
도 9는 RNA RNP-매개 형질주입된 상추의 원형질체로부터 식물체의 재생을 보여준다. (a-c) 원형질체-유래 캘러스로부터의 기관 및 싹 형성을 보여준다.; 야생형 (#28), 이-형질 (bi-allelic)/이형접합체 (heterozygote) (#24), 이-형질/동형접합체 (homozygote) (#30). (d) 인비트로 싹 분열 및 발달. (e) PGR-프리 MS 배양 배지에서 싹의 신장 및 성장. (f) 신장된 싹에서 뿌리의 유도. (g) 묘 (plantlets)의 적응. (h, i) 재생된 식물체.
도 10은 BIN2 변이 대립유전자 (alleles)의 생식세포 전달에 관한 것이다. (a) 재생된 식물체의 추대 및 개화. (b) T0-12로 명명된 동형접합체 이-형질 변이로부터 유래한 종자의 RGEN-RFLP 분석을 위한 유전형. (c) 야생형, T0-12 변이, 및 T0-12 라인으로부터 유래한 T1 변이의 DNA 서열. 빨간색 삼각형은 삽입된 뉴클레오티드를 가리킨다.
이하 본 발명을 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나 이들 실시예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 국한되는 것은 아니다.
방법
Cas9 단백질 및 가이드 RNAs
핵 위치 신호가 연결된 Cas9 단백질은 ToolGen, Inc. (South Korea)에서 구입하였다. Phusion 폴리머라제 (표 3-6)를 사용한 올리고-연장 (oligo-extension)을 통해 가이드 RNA 전사의 주형을 제조하였다. T7 RNA 중합효소 (New England Biolabs)를 사용한 런-오프(run-off) 반응으로 가이드 RNAs를 인비트로에서 전사하였다. 반응 혼합물은 1X DNase I 반응 버퍼에 포함된 DNase I (New England Biolabs)으로 처리하였다. 전사된 sgRNAs의 품질을 평가하기 위하여 SYBR gold 염색 (Invitrogen)된 8% 변성 요소-폴리아크릴 아마이드 겔(urea-polyacryl amide gel)로 sgRNAs를 확인하였다. 전사된 sgRNAs를 MGTM PCR Product Purification SV (Macrogen)으로 정제하였고, 분광광도계로 sgRNAs의 양을 측정하였다.
T7E1 어세이에 사용된 프라이머 목록
1st PCR 2nd PCR
표적 정방향
(5'에서 3')		 역방향
(5'에서 3')		 정방향
(5'에서 3')		 역방향
(5'에서 3')
AOC CGAGCTCAATGAACGTGACC
(서열번호 1)		 GATCAGAATGCAGAGTCCAGC
(서열번호 2)		 ATGCAGAGTCCAGCCGTTAT(서열번호 3)
PHYB TGGTTGTTTGCCATCACACT
(서열번호 4)		 GAAAAGCCTGAAAGGACGAA(서열번호 5) GCCTCCCCATTTGATTTCTT(서열번호 6)
P450 GGAGCTGAACCACTTCATCC(서열번호 7) CCCAGCACCTGCTTCACTAT(서열번호 8) ACCCCAGGCCAATTCATG(서열번호 9) GGGACAAAGATTCATGCAGCA(서열번호 10)
DWD1 CCTTTTCTTTGTGGGGTGTG(서열번호 11) TCCTTCTCCCTCTCCTCCTG(서열번호 12) ATCTCGTGCCATCTCCATCC(서열번호 13)
BRI1 ATTTGGGCTGATCCTTGTTG(서열번호 14) TGTTGAACACCTGAAACTTTGG(서열번호 15) ACCAATTGGAAGCTGACTGG(서열번호 16) CCATGCCAAAATCTGAAACC(서열번호 17)
표적화 딥시퀀싱에 사용된 프라이머 목록(1st 프라이머)
표적 정방향 (5'에서 3') 역방향 (5'에서 3')
PHYB-OT1 CCGCATTCAACAGCTCTCTC
(서열번호 18)		 GCTCAAATCAGGTGGCTACG
(서열번호 19)
PHYB-OT2 AGGCTGTTCAAAGTCCAGGT
(서열번호 20)		 ATCGCTGGGAGTTCAACAGA
(서열번호 21)
PHYB-OT3 CCAATGGGCCTGAAAGCTTT
(서열번호 22)		 ACAACCAAAATCCGCAACGA
(서열번호 23)
BRI1-TS1-OT1 CGCAAGTTGGTCAGAGTGAA
(서열번호 24)		 ACAAGGAGGCTGACGGAAA
(서열번호 25)
BRI1-TS1-OT2 ACTCGTTACAGGACTCGGTG
(서열번호 26)		 TACAGAGCTGCTTCTGGACC
(서열번호 27)
BRI1-TS1-OT3 TTACCGTAGCTGGGATCGTC
(서열번호 28)		 GACTTGTCTCCCTCGCCATA
(서열번호 29)
BRI1-TS1-OT4 GCAAGGACGGATGAGAAACC
(서열번호 30)		 TGGCATAGTCGCTATTTCGC
(서열번호 31)
BRI1-TS1-OT5 GTCTCCAAAATCCTCGTCGC
(서열번호 32)		 GGAAAATTTCTCCCCGCCTC
(서열번호 33)
BRI1-TS1-OT6 TATGGCGGAAGGTGTAGGTC
(서열번호 34)		 TTGCTTGGCTGAAACTCACC
(서열번호 35)
BRI1-TS2-OT1 CGAGTGCTGATGTGTGTGTT
(서열번호 36)		 TCTCTTGGTGCAGGGTGAAT
(서열번호 37)
BRI1-TS2-OT2 CCCTCTCAATTGCAGCCATT
(서열번호 38)		 CGTGTCTTCCTCTGCCATTG
(서열번호 39)
BRI1-TS2-OT3 ACATTTGCTGCATTGGGATCT
(서열번호 40)		 CCAACCCGGCTCAAACTTAC
(서열번호 41)
BRI1-TS2-OT4 CTCGTCTCAGCCAGGTTAGT
(서열번호 42)		 ATCAAGAATCCAATGGCGGC
(서열번호 43)
표적화 딥시퀀싱에 사용된 프라이머 목록(2nd 프라이머)
서열 (5'에서 3')
AOC-deepF ACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCTCGAGCTCAATGAACGTGACC
(서열번호 44)
AOC-deepR GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTGATCAGAATGCAGAGTCCAGC
(서열번호 45)
PHYB-deepF ACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCTGCAAATGTCAGAGAAACGCG
(서열번호 46)
PHYB-deepR GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTATCAGTGCTTAATCCGGTTGA
(서열번호 47)
P450-deepF ACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCTACCCCAGGCCAATTCATG
(서열번호 48)
P450-deepR GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTGGCTCTGGTTTCAAGTTAGTACA
(서열번호 49)
DWD1-deepF ACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCTCTGCCACAACCAACGGATC
(서열번호 50)
DWD1-deepR GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTTGGATTCAGACCCACCCG
(서열번호 51)
BRI1-TS1-deepF ACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCTTTGCGGATCTTCTTCAGGCT
(서열번호 52)
BRI1-TS1-deepR GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTGCTCGTCTCCAACTTTGCAA
(서열번호 53)
BRI1-TS2-deepF ACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCTTTGCAAAGTTGGAGACGAGC
(서열번호 54)
BRI1-TS2-deepR GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTATCTGAAACCCGAGCTTCCA
(서열번호 55)
BIN2-deepF ACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCTTGTGGTTTCTTTGAAGCATTGT
(서열번호 56)
BIN2-deepR GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTTGCCACTCACAATCACATGT
(서열번호 57)
PHYB-OT1-deepF ACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCTTTCATGAAGGTGGCTCAGGT
(서열번호 58)
PHYB-OT1-deepR GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTCTTCATTCTCTTGCCGTGGG
(서열번호 59)
PHYB-OT2-deepF ACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCTGGTGACAATGTGGCTAATGGT
(서열번호 60)
PHYB-OT2-deepR GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTACTCGGCCAATGTTACTCCA
(서열번호 61)
PHYB-OT3-deepF ACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCTGGCTTGTTGGGTGATCTTGA
(서열번호 62)
PHYB-OT3-deepR GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTGACCCACTTCACAGAAAGCA
(서열번호 63)
BRI1-TS1-OT1-deepF ACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCTTCTGCACGATTCTACCTGACA
(서열번호 64)
BRI1-TS1-OT1-deepR GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTTCTCCTGTCATGTGTTCCTAAC
(서열번호 65)
BRI1-TS1-OT2-deepF ACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCTTAGCTATGCCGGTGGAAGTT
(서열번호 66)
BRI1-TS1-OT2-deepR GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTACAGAAGTAGCCATTCCGAGA
(서열번호 67)
BRI1-TS1-OT3-deepF ACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCTCGGAGACCTTTAAGCTTCGC
(서열번호 68)
BRI1-TS1-OT3-deepR GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTTGCAAAACCATCAGCAGTGG
(서열번호 69)
BRI1-TS1-OT4-deepF ACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCTGTTTGAAGAAGGTGGCCCAG
(서열번호 70)
BRI1-TS1-OT4-deepR GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTGGTGGGACGATCGAGCTTAT
(서열번호 71)
BRI1-TS1-OT5-deepF ACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCTTGACTAACCGCTTGTCCTCA
(서열번호 72)
BRI1-TS1-OT5-deepR GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTACGTTGCCAGTAAAGTTCGC
(서열번호 73)
BRI1-TS1-OT6-deepF ACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCTCGTCTCTTACTCGCCTCCTT
(서열번호 74)
BRI1-TS1-OT6-deepR GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTTCATCTGAGGTTGGTTCGACA
(서열번호 75)
BRI1-TS2-OT1-deepF ACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCTTCATTCAGCTTTGCCAAACCA
(서열번호 76)
BRI1-TS2-OT1-deepR GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTTCCGGTGGAATTACTGCTCA
(서열번호 77)
BRI1-TS2-OT2-deepF ACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCTTGTTCACAATTACTGCCACCA
(서열번호 78)
BRI1-TS2-OT2-deepR GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTACTCTCTACGATCGCAACTCT
(서열번호 79)
BRI1-TS2-OT3-deepF ACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCTGGAGATGGAGGGGATGGAAC
(서열번호 80)
BRI1-TS2-OT3-deepR GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTCGGCTCTGAACAGGTCTACA
(서열번호 81)
BRI1-TS2-OT4-deepF ACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCTTGCAATCAGATGTCCGGTCA
(서열번호 82)
BRI1-TS2-OT4-deepR GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTGTACCTCTTCAGCAACCAAGT
(서열번호 83)
인비트로 전사 주형
서열 (5'에서 3')
AOC-sgF GAAATTAATACGACTCACTATAG CAAAAGACTGTCAATTCCCTGTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAG
(서열번호 84)
PHYB-sgF GAAATTAATACGACTCACTATAGG CACTAGGAGCAACACCCAACGTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAG
(서열번호 85)
P450-sgF GAAATTAATACGACTCACTATAGG CATATAGTTGGGTCATGGCAGTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAG
(서열번호 86)
DWD1-
TS1-sgF		 GAAATTAATACGACTCACTATAGG TGCATCGTCCAAGCGCACAGGTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAG
(서열번호 87)
DWD1-
TS2-sgF		 GAAATTAATACGACTCACTATAGG CTACGACGTCAGGTTCTACCGTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAG
(서열번호 88)
BRI1-
TS1-sgF		 GAAATTAATACGACTCACTATAGG TTTGAAAGATGGAAGCGCGGGTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAG
(서열번호 89)
BRI1-
TS2-sgF		 GAAATTAATACGACTCACTATAGG TGAAACTAAACTGGTCCACAGTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAG
(서열번호 90)
BIN2-sgF GAAATTAATACGACTCACTATAG ATCACAGTGATGCTCGTCAAGTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAG
(서열번호 91)
Universal sgR AAAAAAGCACCGACTCGGTGCCACTTTTTCAAGTTGATAACGGACTAGCCTTATTTTAACTTGCTATTTCTAGCTCTAAAAC
(서열번호 92)
원형질체 배양
기존의 공지된 방법에 따라 애기장대, 벼 및 상추로부터 원형질체를 분리하였다. 먼저, 애기장대 (Arabidopsis thaliana) 생태형 Columbia-0, 벼 (Oryza sativa L.) cv. 동진, 및 상추 (Lactuca sativa L.) cv. 청치마 종자를 70% 에탄올, 0.4% 하이포클로라이트 (hypochlorite) 용액에서 15분 동안 멸균한 뒤, 증류수로 3회 세척하고, 2% 수크로스를 함유하는 1/2X MS 고형 배지에서 배양하였다. 배양은 성장실에서 16시간 명 (150 μmol/m2s), 8시간 암 조건으로 25℃에서 수행하였다. 원형질체를 분리하기 위하여, 14일 된 애기장대의 묘 (plantlets), 14일 된 벼의 묘 유래 줄기 및 잎, 7일 된 상추 묘의 자엽을 암 조건으로 25℃에서 12시간 동안 효소 용액 (1.0 % 셀룰라제 R10, 0.5 % 매크로자임 (macerozyme) R10, 0.45 M 마니톨, 20 mM MES [pH 5.7], CPW 용액)과 함께 40 rpm으로 교반하면서 인큐베이션하여 분해한 다음, 동량의 W5 용액으로 희석시켰다. 상기 혼합물을 여과시키고, 원형바닥 튜브에서 100 g로 5분 동안 원심분리하여 원형질체를 회수하였다. 재현탁된 원형질체를 CPW 21S 용액 (21 % [w/v] 수크로스 함유 CPW 용액, pH 5.8)에 띄워 정제하고, 80 g로 7분 동안 원심분리하였다. 정제된 원형질체를 W5 용액으로 세척한 뒤 70 g로 5분 동안 원심분리하여 펠렛을 형성하였다. 마지막으로, 원형질체를 W5 용액에 재현탁하고, 헤마사이토미터 (hemacytometer)를 이용하여 현미경으로 수를 세었다. 원형질체를 1x106 원형질체/1 ml MMG 용액(0.4 M 만니톨 및 15 mM MgCl2, 4 mM MES [pH 5.7])의 밀도로 희석하였다.
원형질체 형질주입
기존의 방법에 따라 PEG-매개 RNP 형질주입을 수행하였다. RNP 복합체를 이용한 DSB (double strand break)를 유도하기 위해, 1 x 105 개의 원형질체 세포를 시험관 내 전사된 sgRNA (20-120 ㎍)와 미리 혼합된 Cas9 단백질 (10-60 ㎍)로 형질주입시켰다. 형질주입을 수행하기 전에, 저장 용액 (20 mM HEPES pH 7.5, 150 mM KCl, 1 mM DTT 및 10% 글리세롤)에 포함된 Cas9을 1X NEB 버퍼 3에 포함된 sgRNA와 혼합하였고, 상온에서 10분 동안 인큐베이션하였다. 상기 1 x 105 개(또는 상추의 경우 5 x 105 개)의 원형질체 혼합물을 200 ㎕ MMG 용액에 재현탁시키고, 5-20 ㎕ RNP 복합체와 210 ㎕의 새로 제조한 PEG 용액 (40 % [w/v] PEG 4000; Sigma No. 95904, 0.2 M 마니톨 및 0.1 M CaCl2)을 조심스럽게 혼합한 다음, 암조건의 25℃에서 10분 동안 인큐베이션하였다. 그 다음, 950 ㎕의 W5 용액(2 mM MES [pH 5.7], 154 mM NaCl, 125 mM CaCl2 및 5 mM KCl)을 천천히 첨가하여 조심스럽게 혼합하였다. 100 g에서 3분 동안 원심분리하여 원형질체 펠렛을 수득하였고, 이를 W1 용액 (0.5 M 만니톨, 20 mM KCl 및 4 mM MES, pH 5.7) 1 ml에 재현탁시켰다. 이후, 원형질체를 멀티-웰에 옮겨 암조건의 25℃에서 24-48 시간 동안 인큐베이션하였다. 상기 세포들은 형질주입 하루 뒤에 분석하였다.
원형질체 재생
RNP로 형질주입시킨 원형질체를 375 mg/L CaCl2·2H2O,18.35 mg/L NaFe-EDTA, 270 mg/L 소듐 석시네이트 (sodium succinate), 103 g/L 수크로스, 0.2 mg/L 2,4-D, 0.3 mg/L 6-BAP (benzylaminopurine), 및 0.1 g/L MES를 함유하는 1/2X B5 배양 배지에 재현탁시켰다. 그 다음 원형질체를 1/2X B5 배지와 2.4 % 아가로스의 1:1 용액과 함께 혼합하여 2.5 X 105 원형질체/ml의 밀도로 배양하였다. 아가로스에 둘러싸인 원형질체를 6-웰 플레이트로 옮기고, 2 ml의 1/2X B5 배양 배지로 25℃의 암조건에서 배양하였다. 7일 후, 상기 배지를 새로운 배지로 교체하고, 25℃의 명조건 (16 시간 명 [30 μmol/m2s] 및 8시간 암 조건)에서 배양하였다. 배양 3주 후, 마이크로캘리를 직경 수 mm까지 키우고, 30 g/L 수크로스, 0.6 % 플랜트아가, 0.1 mg/L α-NAA (naphthalaneacetic acid), 0.5 mg/L BAP를 함유하는 MS 재생 배지로 옮겨 배양하였다. 재생 배지에서 약 4주 경과 후, 다수의 상추 싹 (shoot)이 유도된 것을 확인하였다.
상추의 뿌리유도 및 토양에서의 성장
식물체를 재생하기 위하여, 분열 및 신장된 싹을 신선한 재생 배지에 옮긴 후, 25℃의 명조건 (16시간 명 [30 μmol/m2s] 및 8시간 암 조건)에서 배양하였다. 뿌리 유도를 위하여, 약 3-5 cm 길이의 묘 (plantlets)를 적출하여 마젠타(Magenta) 용기에 담긴 고체 호르몬-프리 1/2X 배지에 옮겼다. 싹으로부터 유래한 묘를 토양에 이식하고, 25℃의 성장 챔버(100-150 μmol m-2s-1의 백색 형광등 하에서 6시간의 광주기 조건)에 유지하여 새로운 환경에 순응시켰다.
T7E1 분석
DNeasy Plant Mini 키트 (Qiagen)를 이용하여 원형질체 또는 캘러스로부터 유전체 DNA를 분리하였다. 표적 DNA 영역을 증폭시키고 T7E1 분석을 수행하였다. 구체적으로, PCR 산물을 95℃로 변성시키고, 써멀 사이클러 (thermal cycler)를 이용하여 상온까지 온도를 천천히 낮추었다. 어닐링된 PCR 산물을 37℃에서 20분 동안 T7 엔도뉴클레아제 I (ToolGen, Inc.)과 인큐베이션하고, 아가로스 겔 전기영동을 통해 분석하였다.
RGEN-RFLP 분석
기존의 방법에 따라 RGEN-RFLP 분석을 수행하였다. 1X NEB 완충액 3에서 PCR 산물 (300 - 400 ng)과 Cas9 단백질 (1 ㎍) 및 sgRNA (750 ng)를 반응 부피 10 ㎕로, 37℃에서 60분 동안 인큐베이션하였다. 그 다음, 상기 반응 혼합물에 RNase A (4 ㎍)를 첨가하고 37℃에서 30 분 동안 인큐베이션하여 sgRNA를 제거하였다. 그 다음 6X 정지 용액 (30% 글리세롤, 1.2 % SDS 및 250 mM EDTA)을 첨가하여 상기 반응을 정지시켰다. 2.5% 아가로스 겔을 이용하여 DNA 산물을 전기영동하였다.
표적화 딥시퀀싱 (Targeted deep sequencing)
유전체 DNA에서 표적 위치 (on-target site)를 증폭시켰다. 인덱스와 시퀀싱 어댑터를 추가적인 PCR을 통해 부가하였다. Illumina Miseq (v2, 300-cycle)을 이용하여 고처리량 시퀀싱 (high-throughput sequencing)을 수행하였다.
결과
선조립된 RNP를 형성하기 위하여, 세 개의 식물 종에서 네 개의 유전자를 표적하는 gRNA의 10 배 몰 과량을 정제된 Cas9 단백질과 인비트로에서 혼합하였다. 폴리에틸렌 글리콜 (polyethylene glycol; PEG)이 존재하는 조건에서, RGEN RNPs를 애기장대 (A. thaliana), 야생형 담배 (N. attenuate) 및 벼 (O. sativa)에서 유래한 원형질체와 인큐베이션하였다. 형질주입 세포의 변이 빈도를 측정하기 위하여 T7E1 분석 및 표적화 딥시퀀싱을 사용하였다 (도 1a,b). 인델(indels)은 예상된 위치, 즉 PAM (NGG protospacer-adjacent motif)의 3 뉴클레오티드 (nt) 상류에서 8.4% 내지 44%의 범위의 빈도로 탐지되었다.
인간 세포에서 확인한 바와 같이, 동시에 야기된 두 개의 DSBs를 교정하는 것이 삽입된 서열의 표적화 결실을 야기할 수 있는지 여부를 조사하고자, 애기장대의 다른 유전자에서 201 bps로 분리된 곳을 표적하는 두 gRNA를 공동-형질주입하였다. 생어 시퀀싱 (Sanger sequencing) 결과를 통해, 원형질체에서 223 bp DNA 서열이 결실됨을 확인하였다(도 1c). RGEN-매개 변이는 형질주입 24시간 후에 관찰되었는데, 이를 통해 RGENs은 형질주입 후에 바로 표적 위치를 절단하며, 세포 분열의 전체 주기 이전에 변이를 유도함을 확인하였다.
다음으로, 본 발명자들은 RGEN RNPs가 표적 위치 (on-target)와 높은 상동성을 갖는 위치에서 비표적 (off-target) 변이를 유도할 수 있는지 분석하였다. 애기장대의 유전체에서 피토크롬 B(PHYTOCHROME B; PHYB) 및 브라시노스테로이드 민감성 1(BRASSINOSTEROID INSENSITIVE 1; BRI1) 유전자 특이적인 sgRNAs의 잠재적 비표적 위치를 조사하였고, 변이 빈도를 측정하기 위하여 Cas-OFFinder 프로그램 및 표적화 딥시퀀싱을 사용하였다(도 5). 2 내지 5 뉴클레오티드에 의한 표적 위치와는 다르게 인델은 어느 위치에서도 발견되지 않았는데, 이는 인간 세포에 대한 본 발명자의 기존 연구 내용과 일치함을 확인하였다.
본 발명자들은, 브라시노스테로이드(brassinosteroid; BR) 신호전달 경로에서 음성 조절자를 암호화하는 BIN2 (BRASSINOSTEROID INSENSITIVE 2) 유전자를 결손시키기 위하여, RGEN 표적 위치 (서열번호 93)를 디자인하였다(도 2a). PEG가 존재하는 조건에서 RGEN RNP를 형질주입하였고, RGEN에 의해 유도된 표적 유전자 변이 효율을 측정하기 위하여, T7E1 분석 및 표적화 딥시퀀싱을 이용하였다. 인델은 예상된 위치, 즉 PAM (NGG protospacer-adjacent motif)의 3 nt 상류에서 탐지되었고, T7E1 분석 시 8.3% 내지 11% (평균 9.0%) 범위의 변이율 및 NGS 분석 시 3.2% 내지 5.7% (평균 4.3%) 범위의 변이율을 나타내었다 (도 2b, c)
본 발명자들은, 상기 RGEN-RNP를 처리한 상추 원형질체로부터 BIN2 변이 대립유전자를 가지는 식물체를 제조하였다. 그 결과 상기 원형질체 중 극히 일부 (< 0.5 %)만이 캘러스를 거쳐 완전한 식물체로 배양됨을 확인하였다. 이중, 35개의 원형질체 라인에 대하여 추가적인 분석을 수행하였다 (도 3). 구체적으로, 본 발명자들은 상추 마이크로캘리의 유전형에 대하여 RGEN-RFLP 분석 및 표적화 딥시퀀싱을 수행하였다. RGEN-RFLP 분석은 이형접합 이-형질 (bi-allelic) 변이 클론 (비절단)과 단일-형질 변이 클론 (50% 절단)을 구분할 수 있었으며, 야생형 클론 (100% 절단)과 동형접합 이-형질 (bi-allelic) 변이 클론 (비절단)을 구분할 수 있었다. 분석 결과, 상기 35개 중 2개의 캘러스 (5.7%)의 표적위치가 단일-형질 변이이고, 14개의 캘러스 (40%)의 표적위치가 이-형질 변이인 것을 확인하였다. 이를 통해, 재생된 캘러스의 변이 빈도는 42.9% (=30 변이 대립유전자/70 대립유전자)이며, 원형질체에서의 변이 빈도보다 10배 높은 것임을 확인하였다. 상기 결과는 어떠한 선별 과정도 없이 43%의 빈도로 유전체 교정 상추를 수득한 것으로, 대규모 집단에서의 RGEN-RNP를 이용한 변이 빈도를 고려하였을 때 극히 높은 빈도이다. 상기 결과를 통해, 재생 과정에서 RGEN으로 유도되는 변이가 안정적으로 유지되어 축적됨을 알 수 있었다.
BIN2 유전자 결손은 다른 형태학적인 변화를 나타내지 않았지만, 몇몇의 벼에서 스트레스 내성을 나타내었다. 상기 결과를 통해, BIN2 유전자 결손에 의한 BR 신호전달의 상향 조절은 전체적인 세포 분열 및 성장 비율을 촉진하며, 이는 캘러스가 재생되는 과정에서 받는 스트레스에 대하여 긍정적인 반응을 나타낼 수 있도록 이점을 제공하는 것임을 알 수 있었다.
마지막으로, 본 발명자들은 브라시노스테로이드(brassinosteroid; BR) 신호전달 경로에서 음성 조절자를 암호화하는 애기장대 BIN2 유전자의 상추(Lactuca sativa) 동형체를 결손시키기 위하여, 상추 원형질체에 RGEN RNP를 형질주입하였고, RNP-형질주입된 세포로부터 재생된 마이크로캘리를 수득하였다(도 6). 본 발명자들은 상추 마이크로캘리의 유전형을 분석하기 위하여 RFLP 분석에서 동일한 RGEN RNP를 사용하였다(도 2 내지 4, 및 도 7). T7E1 분석과는 달리, RGEN-RFLP 분석은 이형접합 이-형질 (bi-allelic) 변이 클론 (비절단)과 단일-형질 변이 클론 (50% 절단)을 구분할 수 있었으며, 야생형 클론 (100% 절단)과 동형접합 이-형질 (bi-allelic) 변이 클론 (비절단)을 구분할 수 있었다. 또한, RGEN-RFLP 분석은 상추 유전체에 존재하는 뉴클레아제 표적 위치 근처에서 서열 다형성에 의한 제한이 없음을 확인하였다. 분석 결과, 상기 35개 중 2개의 캘러스 (5.7%)의 표적위치가 단일-형질 변이이고, 14개의 캘러스 (40%)의 표적위치가 이-형질 변이인 것을 확인하였다(도 3, 도 4b). 상기 결과를 통해, RGEN-유도 변이는 재생 후에도 안정적으로 유지됨을 알 수 있었다. 이때, 재생된 캘러스의 변이 빈도는 46%였다. 16개의 변이 캘러스에서 유전형을 확인하고자 표적화 딥시퀀싱을 수행한 결과, 표적 위치에서 결실 또는 삽입된 염기쌍의 수는 -9 내지 +1 범위에 존재하였으며, 이는 인간 세포에서 관찰된 변이 패턴과 일치함을 확인하였다. 상기 클론들에서 모자이크 현상 (mosaicism)은 관찰되지 않았으며(도 8), RGEN RNP은 형질주입 후 바로 표적 위치를 절단하며, 세포 분열 전에 인델을 유도함을 확인하였다.
이후, 본 발명자들은 BIN2-특이적 RGEN이 상추 유전체에서 부수적인 손상을 유도하는지 고처리량 시퀀싱 (high-throughput sequencing)을 이용하여 분석하였다. 그 결과, 91개의 상동의 위치에서 비표적 변이는 유도되지 않았고, BIN2-변이된 세 개의 묘의 표적 위치에서 1 내지 5개의 뉴클레오타이드가 다름을 확인하였다(표 1 및 2). 상기 결과는, CRISPR RGENs에 의해 유도된 비표적 변이는 단일-세포 클론에서 거의 발견되지 않는다는, 인간 세포에서 확인한 본 발명자들의 기존 연구 내용과 일치함을 알 수 있었다.
상추 유전체에서 존재하는 잠재적 비표적 위치의 수. 상추 유전체에서 잠재적 RGEN 비표적 위치는 Cas-OFFinder (www.regenome.net)에서 확인하였다. 본 발명자들은 표준 유전체로서 Legassy_V2 database (Genebank: AFSA00000000.1)를 사용하였고, 표적화 위치 서열과 최대 5 nt 다른 상동의 서열을 확인하였다. 총 92개의 위치를 선택하였고, 이에 대하여 표적화 딥시퀀싱을 수행하였다. 표준 유전체의 데이터의 품질이 낮음에 따라 PCR 프라이머가 결합하지 못하였고, PCR을 사용한 증폭물을 수득하지 못하였기 때문에, 본 분석에서는 몇몇의 위치를 제외하였다.
표적 위치에 대한 불일치의 수
0 1 2 3 4 5 총계
잠재적 비표적 위치의 수 1
(on-target)		 0 1 4 27 349 382
적절한 PCR 프라이머가 결합한 위치의 수 1 0 1 3 24 72 101
성공적으로 증폭된 위치의 수 1 0 1 3 22 65 92
Figure pat00001
Figure pat00002
Figure pat00003
Figure pat00004
Figure pat00005
Figure pat00006
결과적으로, 유전체 교정 캘러스로부터 식물체가 재생되었으며, 이는 토양에서도 잘 성장하는 것을 확인하였다(도 4c 및 도 9). 충분히 성장한 동형접합 이-형질 변이체로부터 종자를 수득하였다(도 10). 본 발명을 통해, BIN2-결손된 상추는 향상된 BR 신호를 나타냄을 확인하였다.
요약하면, RGEN RNPs는 식물 원형질체로 성공적으로 전달되며, 4개의 다른 식물 종의 6개 유전자에서 표적화 유전체 변이를 유도한다. 또한, RGEN-유도 변이는 원형질체로부터 재생된 식물체에서 안정적으로 유지되며, 생식세포로 전달된다. 본 과정에는 재조합 DNA가 사용되지 않았으므로, 본 발명의 유전체 교정 식물체는 현재의 GMO 규정에 해당되지 않을 수 있다. 이는, RNA-가이드 유전체 교정은 식물 생명공학 및 농업 분야에서 광범위하게 활용될 수 있음을 시사하는 것이다.
<110> INSTITUTE FOR BASIC SCIENCE AICT Seoul National University R&DB Foundation <120> Method for producing whole plants from protoplasts <130> KPA150876-KR-P2 <150> KR 10-2015-0140314 <151> 2015-10-06 <160> 194 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> AOC 1st PCR-F <400> 1 cgagctcaat gaacgtgacc 20 <210> 2 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> AOC 1st PCR-R <400> 2 gatcagaatg cagagtccag c 21 <210> 3 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> AOC 2st PCR-R <400> 3 atgcagagtc cagccgttat 20 <210> 4 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PHYB 1st PCR-F <400> 4 tggttgtttg ccatcacact 20 <210> 5 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PHYB 1st PCR-R <400> 5 gaaaagcctg aaaggacgaa 20 <210> 6 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PHYB 2nd PCR-R <400> 6 gcctccccat ttgatttctt 20 <210> 7 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> P450 1st PCR-F <400> 7 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Artificial Sequence <220> <223> BIN2-deepF <400> 56 acactctttc cctacacgac gctcttccga tcttgtggtt tctttgaagc attgt 55 <210> 57 <211> 54 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> BIN2-deepR <400> 57 gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg atcttgccac tcacaatcac atgt 54 <210> 58 <211> 53 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PHYB-OT1-deepF <400> 58 acactctttc cctacacgac gctcttccga tctttcatga aggtggctca ggt 53 <210> 59 <211> 54 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PHYB-OT1-deepR <400> 59 gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg atctcttcat tctcttgccg tggg 54 <210> 60 <211> 54 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PHYB-OT2-deepF <400> 60 acactctttc cctacacgac gctcttccga tctggtgaca atgtggctaa tggt 54 <210> 61 <211> 54 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PHYB-OT2-deepR <400> 61 gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg atctactcgg ccaatgttac tcca 54 <210> 62 <211> 53 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PHYB-OT3-deepF <400> 62 acactctttc cctacacgac gctcttccga tctggcttgt tgggtgatct tga 53 <210> 63 <211> 54 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PHYB-OT3-deepR <400> 63 gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg atctgaccca cttcacagaa agca 54 <210> 64 <211> 54 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> BRI-TS1-OT1-deepF <400> 64 acactctttc cctacacgac gctcttccga tcttctgcac gattctacct gaca 54 <210> 65 <211> 56 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> BRI-TS1-OT1-deepR <400> 65 gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg atcttctcct gtcatgtgtt cctaac 56 <210> 66 <211> 53 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> BRI-TS1-OT2-deepF <400> 66 acactctttc cctacacgac gctcttccga tcttagctat gccggtggaa gtt 53 <210> 67 <211> 55 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> BRI-TS1-OT2-deepR <400> 67 gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg atctacagaa gtagccattc cgaga 55 <210> 68 <211> 53 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> BRI-TS1-OT3-deepF <400> 68 acactctttc cctacacgac gctcttccga tctcggagac ctttaagctt cgc 53 <210> 69 <211> 54 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> BRI-TS1-OT3-deepR <400> 69 gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg atcttgcaaa accatcagca gtgg 54 <210> 70 <211> 53 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> BRI-TS1-OT4-deepF <400> 70 acactctttc cctacacgac gctcttccga tctgtttgaa gaaggtggcc cag 53 <210> 71 <211> 54 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> BRI-TS1-OT4-deepR <400> 71 gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg atctggtggg acgatcgagc ttat 54 <210> 72 <211> 53 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> BRI-TS1-OT5-deepF <400> 72 acactctttc cctacacgac gctcttccga tcttgactaa ccgcttgtcc tca 53 <210> 73 <211> 54 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> BRI-TS1-OT5-deepR <400> 73 gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg atctacgttg ccagtaaagt tcgc 54 <210> 74 <211> 53 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> BRI-TS1-OT6-deepF <400> 74 acactctttc cctacacgac gctcttccga tctcgtctct tactcgcctc ctt 53 <210> 75 <211> 55 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> BRI-TS1-OT6-deepR <400> 75 gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg atcttcatct gaggttggtt cgaca 55 <210> 76 <211> 54 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> BRI-TS2-OT1-deepF <400> 76 acactctttc cctacacgac gctcttccga tcttcattca gctttgccaa acca 54 <210> 77 <211> 54 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> BRI-TS2-OT1-deepR <400> 77 gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg atcttccggt ggaattactg ctca 54 <210> 78 <211> 54 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> BRI-TS2-OT2-deepF <400> 78 acactctttc cctacacgac gctcttccga tcttgttcac aattactgcc acca 54 <210> 79 <211> 55 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> BRI-TS2-OT2-deepR <400> 79 gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg atctactctc tacgatcgca actct 55 <210> 80 <211> 53 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> BRI-TS2-OT3-deepF <400> 80 acactctttc cctacacgac gctcttccga tctggagatg gaggggatgg aac 53 <210> 81 <211> 54 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> BRI-TS2-OT3-deepR <400> 81 gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg atctcggctc tgaacaggtc taca 54 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<213> Artificial Sequence <220> <223> DWD1-TS2-sgF <400> 88 gaaattaata cgactcacta taggctacga cgtcaggttc taccgtttta gagctagaaa 60 tagcaag 67 <210> 89 <211> 67 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> BRI1-TS1-sgF <400> 89 gaaattaata cgactcacta taggtttgaa agatggaagc gcgggtttta gagctagaaa 60 tagcaag 67 <210> 90 <211> 67 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> BRI1-TS2-sgF <400> 90 gaaattaata cgactcacta taggtgaaac taaactggtc cacagtttta gagctagaaa 60 tagcaag 67 <210> 91 <211> 66 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> BIN2-sgF <400> 91 gaaattaata cgactcacta tagatcacag tgatgctcgt caagttttag agctagaaat 60 agcaag 66 <210> 92 <211> 82 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Universal sgR <400> 92 aaaaaagcac cgactcggtg ccactttttc aagttgataa cggactagcc ttattttaac 60 ttgctatttc tagctctaaa ac 82 <210> 93 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> BIN2 target site <400> 93 atcacagtga tgctcgtcaa 20 <210> 94 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence 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<400> 148 aacatagcgt tgctagtcaa agg 23 <210> 149 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> OT55 <400> 149 atcacatgga tcctcctgaa agg 23 <210> 150 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> OT56 <400> 150 ttttcaatga tgctcatcaa agg 23 <210> 151 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> OT57 <400> 151 ttctctgtca tgttcgtcaa agg 23 <210> 152 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> OT58 <400> 152 atcacagtat tggtccacaa agg 23 <210> 153 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> OT59 <400> 153 atgctagaga tgcttgtcaa agg 23 <210> 154 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> OT60 <400> 154 atcacactga tgcactacag agg 23 <210> 155 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> OT61 <400> 155 ctcacactga tgcactacaa agg 23 <210> 156 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> OT62 <400> 156 ttgatagtgt tcctcgtcaa agg 23 <210> 157 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> OT63 <400> 157 atcacagata tcatggtcaa agg 23 <210> 158 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> OT64 <400> 158 atcttagtca agctagtcaa agg 23 <210> 159 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> OT65 <400> 159 atcagattta tgctcattaa agg 23 <210> 160 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> OT66 <400> 160 atctgagtga tcttcgtcga agg 23 <210> 161 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> OT67 <400> 161 atggcagtgt tcctagtcaa agg 23 <210> 162 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> OT68 <400> 162 atcacattta tgcttatcta agg 23 <210> 163 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> OT69 <400> 163 tccacagtgt tcctagtcaa agg 23 <210> 164 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> OT70 <400> 164 ttcttaggga tggtcgtcaa agg 23 <210> 165 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> OT71 <400> 165 aacacagtca tgctcaccag agg 23 <210> 166 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> OT72 <400> 166 aaaagagtga tgcttatcaa agg 23 <210> 167 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> OT73 <400> 167 cttccagtga tgatagtcaa agg 23 <210> 168 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> OT74 <400> 168 atcaaagtga gatacgtcaa agg 23 <210> 169 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> OT75 <400> 169 atgatattga cgcttgtcaa agg 23 <210> 170 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> OT76 <400> 170 atcacgctga tgggcctcaa agg 23 <210> 171 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> OT77 <400> 171 atagatgtga tgcttgtcaa agg 23 <210> 172 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> OT78 <400> 172 gtcccattga tgcacgacaa agg 23 <210> 173 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> OT79 <400> 173 ttgacaatta tgctcttcaa agg 23 <210> 174 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> OT80 <400> 174 attaaaatca tgttcgtcaa agg 23 <210> 175 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> OT81 <400> 175 cacacagtca tgttcctcaa agg 23 <210> 176 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> OT82 <400> 176 ttgacaatca tgctcttcaa agg 23 <210> 177 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> OT83 <400> 177 ttcatagtga tgtttttcaa agg 23 <210> 178 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> OT84 <400> 178 atcacgctca tgatcctcaa agg 23 <210> 179 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> OT85 <400> 179 atcacactca tggacctcaa agg 23 <210> 180 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> OT86 <400> 180 atcatattga agcccttcaa agg 23 <210> 181 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> OT87 <400> 181 atcacaatga tggtcgggga agg 23 <210> 182 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> OT88 <400> 182 atcataatga agcccttcaa agg 23 <210> 183 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> OT89 <400> 183 atgaatgtta tgctcttcaa agg 23 <210> 184 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> OT90 <400> 184 atcacactga taccctacaa agg 23 <210> 185 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> OT91 <400> 185 aatataatga ttctcgtcaa agg 23 <210> 186 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> OT92 <400> 186 atgactgtgt tccttgtcaa agg 23 <210> 187 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> OT93 <400> 187 ctcaaagtca tgatcttcaa agg 23 <210> 188 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> OT94 <400> 188 ctcaatgaga tgctcgacaa agg 23 <210> 189 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> OT95 <400> 189 atcacactta agctcttgaa agg 23 <210> 190 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> OT96 <400> 190 gtgacagtgt tgcttgtcga agg 23 <210> 191 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> OT97 <400> 191 ataacaacaa tgatcgtcaa agg 23 <210> 192 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> OT98 <400> 192 aacactgtga tgtttgtcag agg 23 <210> 193 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> OT99 <400> 193 atcacgctga tagtcctcaa agg 23 <210> 194 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> OT100 <400> 194 gtgacaatta tgctcttcaa agg 23

Claims (32)

  1. 식물 원형질체(protoplast)에서 하나 이상의 식물의 내재적 유전자를 결손 또는 도입시키는 단계를 포함하는, 식물 원형질체로부터 식물체를 제조하는 방법.
  2. 제1항에 있어서, 상기 식물의 내재적 유전자는 유전자 결손 또는 도입에 의해 스트레스 저항성을 증가시키는 유전자인 것인, 방법.
  3. 제1항에 있어서, 상기 식물의 내재적 유전자는 식물의 브라시노스테로이드(brassinosteroid) 신호전달에 관여하는 유전자인 것인, 방법.
  4. 제1항에 있어서,
    (ⅰ) 상기 결손시키는 단계에서 내재적 유전자는 BIN2 유전자, BKI1 유전자, 및 이들의 동족체 (homolog) 유전자들로 이루어지는 군에서 선택되는 하나 이상인 것이고,
    (ⅱ) 상기 도입시키는 단계에서 도입되는 유전자는 BRI1 유전자, BSU 유전자, BZR1 유전자, DWF4 유전자, CYP85A1, 및 이들의 동족체 (homolog) 유전자들로 이루어지는 군에서 선택되는 하나 이상인 것인, 방법.
  5. 제1항에 있어서, 상기 유전자 결손은 BIN2 유전자, BKI1 유전자, 및 이들의 동족체 (homolog) 유전자들로 이루어지는 군에서 선택되는 하나 이상의 유전자의 대립 유전자 하나 또는 둘을 결손시키는 것인, 방법.
  6. 제1항에 있어서, 상기 유전자 결손은 유전자 제거(knock-out)를 통하여 수행되는 것이고, 상기 유전자 도입은 유전자 낙인 (knock-in)을 통하여 수행되는 것인, 방법.
  7. 제1항에 있어서, 상기 유전자 결손은 BIN2 유전자, BKI1 유전자, 및 이들의 동족체 (homolog) 유전자들로 이루어지는 군에서 선택되는 하나 이상의 유전자에 특이적인 유전자 가위 (engineered nuclease)를 이용하여 수행되는 것인, 방법.
  8. 제7항에 있어서, 상기 유전자 가위는 ZFN (zinc finger nuclease), TALEN (transcription activator-like effector nuclease), 및 RGEN (RNA-guided engineered nuclease)으로 이루어진 군에서 선택된 것인, 방법.
  9. 제8항에 있어서, 상기 RGEN은 BIN2 유전자, BKI1 유전자, 및 이들의 동족체 (homolog) 유전자들로 이루어지는 군에서 선택되는 하나 이상의 유전자의 특정 서열에 특이적으로 결합하는 가이드 RNA 또는 상기 가이드 RNA를 암호화하는 DNA, 및 Cas 단백질을 암호화하는 핵산 또는 Cas 단백질을 포함하는 것인, 방법.
  10. 제1항에 있어서, 상기 유전자 결손은 BIN2 유전자, BKI1 유전자, 및 이들의 동족체 (homolog) 유전자들로 이루어지는 군에서 선택되는 하나 이상의 유전자의 특정 서열에 특이적으로 결합하는 가이드 RNA 또는 상기 가이드 RNA를 암호화하는 DNA; 및 Cas 단백질을 암호화하는 핵산 또는 Cas 단백질을 식물 원형질체에 도입하여 수행되는 것인, 방법.
  11. 제10항에 있어서, 상기 가이드 RNA는 crRNA 및 tracrRNA를 포함하는 이중 RNA (dual RNA) 또는 단일-사슬 가이드 RNA (sgRNA) 형태인, 방법.
  12. 제11항에 있어서, 상기 단일-사슬 가이드 RNA는 crRNA 및 tracrRNA의 부분을 포함하는, 방법.
  13. 제10항에 있어서, 상기 단일-사슬 가이드 RNA는 분리된 RNA의 형태인, 방법.
  14. 제10항에 있어서, 상기 가이드 RNA를 암호화하는 DNA는 벡터에 암호화되어 있고, 상기 벡터는 바이러스 벡터, 플라스미드 벡터, 또는 아그로박테리움 벡터인, 방법.
  15. 제10항에 있어서, 상기 Cas 단백질은 Cas9 단백질 또는 이의 변이체인, 방법.
  16. 제10항에 있어서, 상기 Cas 단백질은 NGG 트리뉴클레오타이드 (trinucleotide)를 인식하는, 방법.
  17. 제10항에 있어서, 상기 Cas 단백질은 단백질 전달 도메인 (protein transduction domain)에 연결되어 있는, 방법.
  18. 제15항에 있어서, 상기 Cas9 단백질의 변이체는 촉매 아스파라긴산 (aspartate) 잔기가 다른 아미노산으로 교체된 Cas9의 변이 형태인, 방법.
  19. 제18항에 있어서, 상기 아미노산은 알라닌 (alanine)인, 방법.
  20. 제10항에 있어서, 상기 Cas 단백질을 암호화하는 핵산 또는 Cas 단백질은 스트렙토코커스 속 (genus Streptococcus) 유래인 것인, 방법.
  21. 제20항에 있어서, 상기 스트렙토코커스 속은 스트렙토코커스 피요젠스 (Streptococcus pyogenes)인, 방법.
  22. 제1항에 있어서, 상기 식물 원형질체는 상추 (Lactuca sativa) 유래인 것인, 방법.
  23. 제9항에 있어서, 상기 도입은 Cas 단백질을 암호화하는 핵산 또는 Cas 단백질, 및 상기 가이드 RNA 또는 가이드 RNA를 암호화하는 DNA를 식물 원형질체에 공동-형질주입 (co-transfecting) 또는 단계적 형질주입 (serial-transfecting)하는 것인, 방법.
  24. 제23항에 있어서, 상기 단계적-형질주입은 Cas 단백질 또는 Cas 단백질을 암호화하는 핵산을 먼저 형질주입한 다음, 네이키드 가이드 RNA (naked guide RNA)를 두 번째 형질주입하여 수행되는, 방법.
  25. 제10항에 있어서, 상기 도입은 미세주입법, 전기천공법, DEAE-덱스트란 처리, 리포펙션, 나노파티클-매개 형질주입, 단백질 전달 도메인 매개 도입, 바이러스-매개 유전자 전달, 및 PEG-매개 형질주입으로 구성된 군으로부터 선택된 방법으로 수행되는, 방법.
  26. 제1항에 있어서, 유전자가 결손된 식물 원형질체를 재생시키는 단계를 추가로 포함하는 것인, 방법.
  27. 제26항에 있어서, 상기 재생시키는 단계는 BIN2 유전자, BKI1 유전자, 및 이들의 동족체 (homolog) 유전자들로 이루어지는 군에서 선택되는 하나 이상의 유전자가 결손된 식물 원형질체를 아가로스를 포함하는 배지에서 배양시켜 캘러스 (callus)를 형성시키는 단계, 및 상기 캘러스를 재생 배지에서 배양하는 단계를 포함하는 것인, 방법.
  28. 제1항 내지 제27항 중 어느 한 항의 방법에 의해 제조된 유전체가 교정된 식물 원형질체로부터 재생된 식물체.
  29. BIN2 (brassinosteroid Insensitive 2) 유전자, BKI1 유전자 또는 이들의 동족체 (homolog)를 암호화하는 DNA에 특이적인 가이드 RNA 또는 상기 가이드 RNA를 암호화하는 DNA; 및
    Cas 단백질을 암호화하는 핵산 또는 Cas 단백질을 포함하는,
    식물 세포에서 BIN2 유전자를 암호화하는 DNA를 절단하기 위한 조성물.
  30. 제28항에 있어서, 식물 세포에서 표적화된 변이 (targeted mutagenesis)를 유도하는, 조성물.
  31. BIN2 (brassinosteroid Insensitive 2) 유전자, BKI1 유전자 또는 이들의 동족체 (homolog)를 암호화하는 DNA에 특이적인 가이드 RNA 또는 상기 가이드 RNA를 암호화하는 DNA; 및
    Cas 단백질을 암호화하는 핵산 또는 Cas 단백질을 포함하는,
    식물 원형질체로부터 식물체를 제조하기 위한 조성물.
  32. 제29항 내지 제31항 중 어느 한 항에 따른 조성물을 포함하는, 식물 원형질체로부터 식물체를 제조하기 위한, 키트.
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