KR102264215B1

KR102264215B1 - 유전자 교정을 이용한 아스코르브산 함량이 증가된 토마토 식물체의 제조방법 및 상기 제조방법에 의해 제조된 토마토 식물체

Info

Publication number: KR102264215B1
Application number: KR1020200181817A
Authority: KR
Inventors: 정영희; 심재성; 도주희
Original assignee: 전남대학교산학협력단
Priority date: 2020-12-23
Filing date: 2020-12-23
Publication date: 2021-06-11

Abstract

본 발명은 유전자 교정을 이용한 아스코르브산 함량이 증가된 토마토 식물체의 제조방법 및 상기 제조방법에 의해 제조된 토마토 식물체에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 토마토 유래 SlAPX4 (Solanum lycopersicum Ascorbate Peroxidase 4) 유전자의 표적 염기서열에 특이적인 가이드 RNA(guide RNA) 및 엔도뉴클레아제(endonuclease) 단백질을 토마토 식물세포에 도입하여 유전체를 교정하는 단계; 및 상기 유전체가 교정된 토마토 식물세포로부터 토마토 식물체를 재분화하는 단계;를 포함하는, 아스코르브산 함량이 증가된 유전체 교정 토마토 식물체의 제조방법 및 상기 방법에 의해 제조된 아스코르브산 함량이 증가된 유전체 교정 토마토 식물체에 관한 것이다.

Description

유전자 교정을 이용한 아스코르브산 함량이 증가된 토마토 식물체의 제조방법 및 상기 제조방법에 의해 제조된 토마토 식물체{Method for producing tomato plant having increased ascorbic acid content using gene editing and tomato plant produced by the same method}

본 발명은 유전자 교정을 이용한 아스코르브산 함량이 증가된 토마토 식물체의 제조방법 및 상기 제조방법에 의해 제조된 토마토 식물체에 관한 것이다.

토마토는 전 세계적으로 상업적，경제적 가치가 높은 작물로 식이섬유질이 풍부하고 열량이 낮으며，항산화 물질을 많이 함유하고 있어 건강기능식품으로 알려져 있다. 또한 항암 작용이 우수한 카로티노이드계의 리코펜(lycopene)과 혈압을 조절하는 데 도움을 주는 칼륨 또한 많이 함유되어 있다.

인간에게 비타민 C로 작용하는 아스코르브산은 여러 대사 경로가 제대로 작동하도록 하는 용해성 산화환원분자로 ROS (reactive oxygen species)로부터 다수의 효소 부위를 보호하는 역할을 수행하며，인간은 아스코르브산 생합성의 마지막 단계를 촉진하는 효소인 guluno-1,4γ-lactone oxidase (GuLo)가 결핍되어 있어 아스코르브산을 스스로 생합성할 수 없기 때문에 반드시 음식으로 섭취해야 한다. 아스코르브산은 식물과 과일에 많이 함유되어 있으며，식물 종에 따라 아스코르브산의 양이 매우 다양하게 나타난다. 열대우림 체리인 아세로라의 경우 아스코르브산이 1 g/100 g fwt로 풍부한데 비해 토마토는 아스코르브산의 농도가 10-40 mg/100g fwt로 적은 편에 속한다.

Ascorbate Peroxidase (APX)는 식물，조류 및 특정 시아노박테리아에 존재하는 유전자로 아스코르브산을 기질로 이용하여 과산화수소 의존 산화를 촉매하여 식물세포에 독성이 있는 ROS로부터 식물의 여러 대사경로를 보호하는 역할을 수행한다. 따라서 APX 유전자가 토마토의 아스코르브산 함량과 연관이 되어 있음을 추측할 수 있고，토마토 내에 존재하는 APX 유전자 발현을 조절하는 것이 토마토 열매 내에 아스코르브산 함량을 증가시키는 한 방법이 될 수 있다.

우수한 형질의 식물체를 개발하기 위해 EMS (ethyl methane sulfonate) 또는 감마선 처리 등을 이용하여 자연적 돌연변이를 유도하거나 우수한 양친을 교배하는 전통적 육종방법이 주로 이용되어져 왔으나, 이 방법의 경우 원하는 목표 형질만 바꾸는데 어려움이 있어，최근에는 목표 형질만 대입하기 위해 TALENs, ZFNs, CRISPR/Cas9 등을 이용한 신육종 방법이 적용되고 있다. 그러나 TALENs 또는 ZFNs의 경우 인공적인 뉴클레아제 설계 및 제작에 많은 시간과 비용이 소요되고，다수의 유전자를 편집하기 어려운 단점을 가진다.

그러나 CRISPR/Cas9 시스템은 매우 높은 표적 특이성을 가지고 있고 메틸화된 DNA도 표적으로 인지할 수 있기 때문에 매우 다양한 유전자에 적용할 수 있으며 멘델의 유전법칙에 따라 자손에게 전달되어 형질의 세대고정이 가능하다는 장점이 있다. 또한, Cas9 단백질과 sgRNA (single guide RNA)만을 필요로 하기 때문에 위의 두 방법에 비해 적은 비용으로 목표 형질의 도입이 가능하다는 장점이 있어 최근 동물 및 식물 등에서 널리 적용되어지고 있는 신육종 기술이다.

한편, 한국공개특허 제2019-0066718호에는 유전자 편집 기술을 이용해 토마토의 스테로이드 생합성 경로에 관여하는 DWF5와 CPD 유전자를 결실시킨 '고농도의 비타민 D를 함유한 토마토 및 그 제조방법'이 개시되어 있고, 한국공개특허 제2019-0043841호에는 '식물체에서 CRISPR/Cas9 시스템을 이용하여 LeMADS-RIN 유전자 편집에 의해 에틸렌 생산을 감소시키는 방법'이 개시되어 있으나, 본 발명의 '유전자 교정을 이용한 아스코르브산 함량이 증가된 토마토 식물체의 제조방법 및 상기 제조방법에 의해 제조된 토마토 식물체'에 대해서는 기재된 바가 없다.

본 발명은 상기와 같은 요구에 의해 도출된 것으로서, 본 발명자들은 토마토 열매 내 아스코르브산 함량을 증가시키기 위해 토마토 열매에서 특이적으로 발현하는 유전자인 SlAPX4 (Solanum lycopersicum Ascorbate Peroxidase 4)를 표적으로 하는 CRISPR/Cas9 벡터를 구축하여 형질전환 토마토를 개발하였고 형질전환 토마토에서 표적 부위의 염기서열을 분석하여 토마토 SlAPX4 유전자 서열상에 편집이 일어남을 확인하였다. 또한, 생식이 가능한 시기인 Ripen Red 시기의 야생형 토마토와 유전자 교정 토마토에서 아스코르브산 함량을 비교해 본 결과，야생형 토마토에 비해 SlAPX4 유전자 편집이 일어난 유전자 교정 토마토에서 아스코르브산 함량이 증가함을 확인함으로써，본 발명을 완성하였다.

상기 과제를 해결하기 위해, 본 발명은 식물체 유래 APX4 (Ascorbate Peroxidase 4) 유전자의 표적 염기서열에 특이적인 가이드 RNA(guide RNA)를 암호화하는 DNA 및 엔도뉴클레아제(endonuclease) 단백질을 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 재조합 벡터; 또는 식물체 유래 APX4 유전자의 표적 염기서열에 특이적인 가이드 RNA와 엔도뉴클레아제 단백질의 복합체(ribonucleoprotein);를 유효성분으로 함유하는, 식물체의 아스코르브산 함량을 증가시키기 위한 유전체 교정용 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 SlAPX4 (Solanum lycopersicum Ascorbate Peroxidase 4) 유전자를 구성하는 뉴클레오티드 서열 중 표적 영역에 특이적인 RNA 서열이며, 상기 표적 영역은 서열번호 5의 염기서열인 가이드 핵산을 제공한다.

또한, 본 발명은 (a) 토마토 유래 SlAPX4 (Solanum lycopersicum Ascorbate Peroxidase 4) 유전자의 표적 염기서열에 특이적인 가이드 RNA 및 엔도뉴클레아제 단백질을 토마토 식물세포에 도입하여 유전체를 교정하는 단계; 및 (b) 상기 유전체가 교정된 토마토 식물세포로부터 토마토 식물체를 재분화하는 단계;를 포함하는, 아스코르브산 함량이 증가된 유전체 교정 토마토 식물체의 제조방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 방법에 의해 제조된 아스코르브산 함량이 증가된 유전체 교정 토마토 식물체 및 이의 유전체가 교정된 종자를 제공한다.

본 발명에서 제시한 APX4 유전자 편집을 통한 돌연변이 유도는 식물체 내 아스코르브산의 분해를 저해시켜 아스코르브산의 축적을 증가시키므로，아스코르브산 함량이 증가된 식물체를 개발하는데 유용하게 이용할 수 있다. 또한, 본 발명에 따른 방법은 자연적 변이와 구별할 수 없는 변이를 유도하므로, 안전성과 환경 유해성 여부를 평가하기 위해 막대한 비용과 시간이 소모되는 GMO(Genetically Modified Organism) 작물과 달리 비용과 시간을 절약할 수 있을 것으로 기대된다.

도 1은 가공용 Heinz (Solanum lycopersicum cv. Heinz) 및 마이크로톰 (Solanum lycopersicum cv. Micro-Tom) 토마토에서 SlAPX4 (Solyc09g007270) 유전자의 발현 패턴을 보여주는 그래프이다.
도 2는 SlAPX4 유전자에서 표적 서열의 위치(A)와 Cas9 단백질 및 SlAPX4 유전자를 표적하는 sgRNA를 운반하는 재조합 벡터(B)의 구성을 보여준다.
도 3은 도 2에 나타난 재조합 벡터를 토마토에 형질전환한 후, 재분화시켜 개발한 형질전환 식물체(A)와 형질전환 식물체의 잎에서 추출한 DNA를 이용하여 PCR을 통해 도입 유전자(NPTⅡ 유전자와 Cas9 유전자)의 존재 여부를 확인한 결과(B)이다.
도 4는 개발된 형질전환 식물체 형질의 세대 고정여부를 파악하기 위해 형질전환 식물체 2세대에서 표적 서열 변화 (돌연변이 발생)를 확인한 결과(A)와 SlAPX4 유전자교정 식물체 2세대의 아스코르브산 함량을 측정한 그래프(B)이다.

본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 식물체 유래 APX4 (Ascorbate Peroxidase 4) 유전자의 표적 염기서열에 특이적인 가이드 RNA(guide RNA)를 암호화하는 DNA 및 엔도뉴클레아제(endonuclease) 단백질을 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 재조합 벡터; 또는 식물체 유래 APX4 유전자의 표적 염기서열에 특이적인 가이드 RNA와 엔도뉴클레아제 단백질의 복합체(ribonucleoprotein);를 유효성분으로 함유하는, 식물체의 아스코르브산 함량을 증가시키기 위한 유전체 교정용 조성물을 제공한다.

본 명세서에서 용어 "유전체/유전자 교정(genome/gene editing)"은, 인간 세포를 비롯한 동·식물 세포의 유전체 염기서열에 표적지향형 변이를 도입할 수 있는 기술로서, DNA 절단에 의한 하나 이상의 핵산 분자의 결실(deletion), 삽입(insertion), 치환(substitutions) 등에 의하여 특정 유전자를 녹-아웃(knock-out) 또는 녹-인(knock-in)하거나, 단백질을 생성하지 않는 비-코딩(non-coding) DNA 서열에도 변이를 도입할 수 있는 기술을 말한다. 본 발명의 목적상 상기 유전체 교정은 특히 엔도뉴클레아제(endonuclease) 예컨대, Cas9 (CRISPR associated protein 9) 단백질 및 가이드 RNA를 이용하여 식물체에 변이를 도입하는 것일 수 있다. 또한, '유전자 교정'은 '유전자 편집'과 혼용되어 사용될 수 있다.

또한, 용어 "표적 유전자"는 본 발명을 통해 교정하고자 하는 식물체의 유전체 내에 있는 일부 DNA를 의미하며, 그 유전자의 종류에 제한되지 않으며, 코딩 영역 및 비-코딩 영역을 모두 포함할 수 있다. 당업자는 그 목적에 따라, 제조하고자 하는 유전체 교정 식물체에 대하여 원하는 변이에 따라 상기 표적 유전자를 선별할 수 있다.

또한, 용어 "가이드 RNA(guide RNA)"는 짧은 단일 가닥의 RNA로, 표적 유전자를 암호화하는 염기서열 중 표적 DNA에 특이적인 RNA를 의미하며, 표적 DNA 염기서열과 전부 또는 일부가 상보적으로 결합하여 해당 표적 DNA 염기서열로 엔도뉴클레아제 단백질을 이끄는 역할을 하는 리보핵산을 의미한다. 상기 가이드 RNA는 두 개의 RNA, 즉, crRNA (CRISPR RNA) 및 tracrRNA (trans-activating crRNA)를 구성 요소로 포함하는 이중 RNA (dual RNA); 또는 표적 유전자 내 염기서열과 전부 또는 일부 상보적인 서열을 포함하는 제1 부위 및 엔도뉴클레아제(특히, RNA-가이드 뉴클레아제)와 상호작용하는 서열을 포함하는 제2 부위를 포함하는 단일 사슬 가이드 RNA(single guide RNA, sgRNA) 형태를 말하나, 엔도뉴클레아제가 표적 염기서열에서 활성을 가질 수 있는 형태라면 제한없이 본 발명의 범위에 포함될 수 있으며, 함께 사용된 엔도뉴클레아제의 종류 또는 엔도뉴클레아제의 유래 미생물 등을 고려하여 당업계의 공지된 기술에 따라 제조하여 사용할 수 있다.

또한, 상기 가이드 RNA는 플라스미드 주형으로부터 전사된 것, 생체 외(in vitro)에서 전사된(transcribed) 것(예컨대, 올리고뉴클레오티드 이중가닥) 또는 합성한 가이드 RNA 등일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

또한, 본 발명에 따른 유전체 교정용 조성물에 있어서, 상기 엔도뉴클레아제 단백질은 Cas9, Cpf1 (also known as Cas12a), TALEN (Transcription activator-like effector nuclease), ZFN (Zinc Finger Nuclease) 또는 이의 기능적 유사체로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상일 수 있고, 바람직하게는 RNA-가이드 뉴클레아제인 Cas9 또는 Cpf1 등일 수 있으며, 더욱 바람직하게는 Cas9 단백질일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

또한, 상기 Cas9 단백질은 스트렙토코커스 피요제네스(Streptococcus pyogenes) 유래의 Cas9 단백질, 캠필로박터 제주니(Campylobacter jejuni) 유래의 Cas9 단백질, 스트렙토코커스 써모필러스(S. thermophilus) 또는 스트렙토코커스 아우레우스(S. aureus) 유래의 Cas9 단백질, 네이쎄리아 메닝기티디스(Neisseria meningitidis) 유래의 Cas9 단백질, 파스투렐라 물토시다(Pasteurella multocida) 유래의 Cas9 단백질, 프란시셀라 노비시다(Francisella novicida) 유래의 Cas9 단백질 등으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. Cas9 단백질 또는 이의 유전자 정보는 NCBI(National Center for Biotechnology Information)의 GenBank와 같은 공지의 데이터베이스에서 얻을 수 있다. 상기 Cas9 유전자 정보는 공지된 서열을 그대로 사용할 수도 있고, 형질도입되는 대상(유기체)의 코돈에 최적화된 서열을 사용할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

Cas9 단백질은 RNA-guided DNA 엔도뉴클레아제 효소로, 이중 가닥 DNA 절단(double stranded DNA break)을 유도한다. Cas9 단백질이 정확하게 표적 염기서열에 결합하여 DNA 가닥을 잘라내기 위해서는 PAM (Protospacer Adjacent Motif)이라 알려진 3개의 염기로 이루어진 짧은 염기서열이 표적 염기서열 옆에 존재해야 하며, Cas9 단백질은 PAM 서열(NGG)로부터 3번째와 4번째 염기쌍 사이를 추정하여 절단한다.

본 발명에 따른 유전체 교정용 조성물에 있어서, 상기 가이드 RNA와 엔도뉴클레아제 단백질은 리보핵산-단백질(ribonucleoprotein) 복합체를 형성하여 RNA 유전자 가위(RNA-Guided Engineered Nuclease, RGEN)로 작동할 수 있다.

본 발명의 일 구현 예에 따른 유전체 교정용 조성물에 있어서, 상기 식물체 유래 APX4 유전자는 서열번호 1의 염기서열로 이루어진 토마토 유래 SlAPX4 유전자일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명에 따른 유전체 교정용 조성물에 있어서, 사용된 CRISPR/Cas9 시스템은 교정하고자 하는 특정 유전자의 특정위치에 이중나선 절단을 도입하여 DNA 수선 과정에서 유도되는 불완전 수선에 의한 삽입-결실(insertion-deletion, InDel) 돌연변이를 유도시키는 NHEJ(non-homologous end joining) 기작에 의한 유전자 교정 방법이다.

본 발명은 또한, SlAPX4 (Solanum lycopersicum Ascorbate Peroxidase 4) 유전자를 구성하는 뉴클레오티드 서열 중 표적 영역에 특이적인 RNA 서열이며, 상기 표적 영역은 서열번호 5의 염기서열인 가이드 핵산을 제공한다.

본 발명에 따른 '가이드 핵산'은 전술한 '가이드 RNA'를 의미하며, 표적 영역에 특이적인 RNA 서열 외에, 엔도뉴클레아제 결합 부위를 포함한다. 상기 엔도뉴클레아제 결합 부위는 엔도뉴클레아제 결합을 위한 스캐폴드 서열(scaffold sequence)을 의미하여, 사용되는 엔도뉴클레아제의 종류에 따라 선택하여 사용할 수 있다. 또한, 상기 엔도뉴클레아제는 바람직하게는 RNA-가이드 뉴클레아제일 수 있고, 더욱 바람직하게는 Cas9 단백질일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명의 가이드 핵산은 바람직하게는 단일 사슬 가이드 RNA(single guide RNA, sgRNA) 형태일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명의 일 구현 예에 따른 가이드 핵산은 서열번호 12의 염기서열로 이루어질 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명은 또한,

(a) 토마토 유래 SlAPX4 (Solanum lycopersicum Ascorbate Peroxidase 4) 유전자의 표적 염기서열에 특이적인 가이드 RNA(guide RNA) 및 엔도뉴클레아제(endonuclease) 단백질을 토마토 식물세포에 도입하여 유전체를 교정하는 단계; 및

(b) 상기 유전체가 교정된 토마토 식물세포로부터 토마토 식물체를 재분화하는 단계;를 포함하는, 아스코르브산 함량이 증가된 유전체 교정 토마토 식물체의 제조방법을 제공한다.

본 발명에 따른 제조방법에 있어서, 상기 (a) 단계의 가이드 RNA 및 엔도뉴클레아제 단백질을 토마토 식물세포에 도입하는 것은, 토마토 유래 SlAPX4 유전자의 표적 염기서열에 특이적인 가이드 RNA를 암호화하는 DNA 및 엔도뉴클레아제 단백질을 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 재조합 벡터; 또는 SlAPX4 유전자의 표적 염기서열에 특이적인 가이드 RNA와 엔도뉴클레아제 단백질의 복합체(ribonucleoprotein);를 이용하는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명의 일 구현 예에 따른 제조방법에 있어서, 상기 SlAPX4 유전자의 표적 염기서열은 서열번호 5의 염기서열로 이루어진 것일 수 있고, 상기 서열번호 5의 염기서열은 다른 가이드 RNA 표적 서열인 서열번호 2 내지 서열번호 4의 염기서열에 비해 표적 부위에서 InDel 돌연변이 유도 효율이 높은 것이 특징이다.

본 발명에 따른 제조방법에 있어서, 상기 가이드 RNA와 엔도뉴클레아제 단백질의 복합체를 식물세포에 형질도입하는 방법은 원형질체에 대한 칼슘/폴리에틸렌 글리콜 방법(Krens et al., 1982, Nature 296:72-74; Negrutiu et al., 1987, Plant Mol. Biol. 8:363-373), 원형질체의 전기천공법(Shillito et al., 1985, Bio/Technol. 3:1099-1102), 식물 요소로의 현미주사법(Crossway et al., 1986, Mol. Gen. Genet. 202:179-185), 각종 식물 요소의(DNA 또는 RNA-코팅된) 입자 충격법(Klein et al., 1987, Nature 327:70), 아그로박테리움 튜메파시엔스(Agrobacterium tumefaciens) 매개된 유전자 전이에서(비완전성) 박테리아에 의한 감염 등으로부터 적당하게 선택될 수 있다.

또한, 상기 표적 염기서열에 특이적인 가이드 RNA를 암호화하는 DNA 및 엔도뉴클레아제 단백질을 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 재조합 벡터를 식물세포에 도입하는 것은 형질전환 방법을 의미한다. 식물 종의 형질전환은 이제는 쌍자엽 식물뿐만 아니라 단자엽 식물 양자를 포함한 식물 종에 대해 일반적이다. 원칙적으로, 임의의 형질전환 방법은 본 발명에 따른 재조합 벡터를 적당한 선조 세포로 도입시키는데 이용될 수 있다.

본 발명의 일 구현 예에 따른 제조방법에 있어서, 상기 재조합 벡터가 식물 세포에 형질전환되면, DNA 결합 및 절단 활성이 있는 엔도뉴클레아제 단백질과 상기 엔도뉴클레아제 단백질에 결합되며 표적 서열로 엔도뉴클레아제 단백질을 이끄는 sgRNA가 함께 발현되게 된다.

본 명세서에서 용어 "재조합"은 세포가 이종의 핵산을 복제하거나, 상기 핵산을 발현하거나 또는 펩티드, 이종의 펩티드 또는 이종의 핵산에 의해 코딩된 단백질을 발현하는 세포를 지칭하는 것이다. 재조합 세포는 상기 세포의 천연 형태에서는 발견되지 않는 유전자 또는 유전자 절편을, 센스 또는 안티센스 형태 중 하나로 발현할 수 있다. 또한 재조합 세포는 천연 상태의 세포에서 발견되는 유전자를 발현할 수 있으며, 그러나 상기 유전자는 변형된 것으로서 인위적인 수단에 의해 세포 내 재도입된 것이다.

또한, 용어 "벡터"는 세포 내로 전달하는 DNA 단편(들), 핵산 분자를 지칭할 때 사용된다. 벡터는 DNA를 복제시키고, 숙주세포에서 독립적으로 재생산될 수 있다. 용어 "전달체"는 흔히 "벡터"와 호환하여 사용된다. 용어 "발현 벡터"는 목적한 코딩 서열과, 특정 숙주 생물에서 작동가능하게 연결된 코딩 서열을 발현하는데 필수적인 적정 핵산 서열을 포함하는 재조합 DNA 분자를 의미한다. 진핵세포에서 이용 가능한 프로모터, 인핸서, 종결신호 및 폴리아데닐레이션 신호는 공지되어 있다.

본 발명에 따른 제조방법에 있어서, 상기 표적 염기서열에 특이적인 가이드 RNA 및 엔도뉴클레아제 단백질이 도입되는 "식물세포"는 어떤 식물세포도 된다. 식물세포는 배양 세포, 배양 조직, 배양 기관 또는 전체 식물이다. "식물 조직"은 분화된 또는 미분화된 식물의 조직, 예를 들면 이에 한정되진 않으나, 뿌리, 줄기, 잎, 꽃가루, 소포자, 난세포, 종자 및 배양에 이용되는 다양한 형태의 세포들, 즉 단일 세포, 원형질체(protoplast), 싹 및 캘러스 조직을 포함한다. 식물 조직은 인 플란타(in planta)이거나 기관 배양, 조직 배양 또는 세포 배양 상태일 수 있다.

본 발명의 제조방법에 있어서, 유전체가 교정된 식물세포로부터 유전체가 교정된 식물을 재분화하는 방법은 당업계에 공지된 임의의 방법을 이용할 수 있다. 유전체가 교정된 식물세포는 전식물로 재분화되어야 한다. 캘러스 또는 원형질체 배양으로부터 성숙한 식물의 재분화를 위한 기술은 수많은 여러 가지 종에 대해서 당업계에 주지되어 있다(Handbook of Plant Cell Culture, 1-5권, 1983-1989 Momillan, N.Y.).

본 발명은 또한, 상기 방법에 의해 제조된 아스코르브산 함량이 증가된 유전체 교정 토마토 식물체 및 이의 유전체가 교정된 종자를 제공한다.

본 발명에 따른 아스코르브산 함량이 증가된 유전체 교정 토마토 식물체는 토마토 열매에서 특이적으로 발현되는 SlAPX4 (Solanum lycopersicum Ascorbate Peroxidase 4) 유전자를 CRISPR/Cas9 시스템을 이용하여 교정한 것으로, 토마토 유래 SlAPX4 유전자가 녹-아웃되어, 유전체를 교정하지 않은 토마토 식물체에 비해 아스코르브산 함량이 증가된 형질을 가지는 유전체 교정 토마토 식물체이다.

이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.

재료 및 방법

1. 식물재료 및 배양조건

본 실험에는 토마토 마이크로톰(Solanum lycopersicum CV. Micro-Tom)을 사용했다. 토마토 씨는 MS salt 4.4 g/L, 수크로스 30 g/L 및 플랜트 아가(plant agar) 8 g/L으로 이루어진 조성의 배지에서 발아시켰으며, 22-24℃, 16시간의 광(光), 8시간 암(暗) 상태로 유지되는 배양실에서 키웠다.

2. 식물에 존재하는 SlAPX 유전자 확인

토마토에 존재하는 APX 유전자를 확인하기 위해 Sol Genomics Network의 Tomato Expression Database (TEO)을 이용하여 토마토에 존재하는 SlAPX 유전자 각각이 발현되는 위치와 수준을 확인하였다.

3. 재조합 벡터 제작

토마토에 존재하는 SlAPX 유전자 중 열매에서 가장 많이 발현되는 APX4를 녹아웃(Knock-out)하기 위하여，APX4 유전자 서열을 대상으로 CRISPR/Cas9 시스템을 적용할 수 있는 sgRNA를 제작하고 Golden Gate system을 이용하여 벡터(pAGM4723::NPTⅡ::Cas9::sgRNA1-4::L3E)를 제작한 뒤, 아그로박테리움 튜메파시엔스(Agrobacterium tumefaciens) LBA4404에 삽입하였다. 유전자 존재 유무는 PCR과 염기서열 분석을 통해 확인하였다.

4. 토마토 형질전환체 개발

CRISPR/Cas9 벡터를 포함하고 있는 아그로박테리움 튜메파시엔스 LBA4404 균주를 YEP 액체배지 (yeast extract 10 g/L, peptone 10 g/L, NaCI 5 g/L, pH 7.2)에서 O.D₆₀₀ 값이 0.7~0.8이 될 때까지 배양한 후，원심분리하여 균주를 포집하였다. 그 후 상기 균주를 1/2 MS 배지 (MS salt 2.2 g/L, sucrose 20 g/L, MES 0.5 g/L, pH 5.7)와 200 μM 아세토시린곤(acetosyringone)을 넣고 재부유시킨 후，28℃에서 4시간 동안 배양하였다. 그 후, 상기 배양액을 2 등분하여 잘라놓은 토마토의 떡잎 조각과 10분간 공동 배양한 후, 떡잎을 MT-COM (co-culture medium)에 잎의 기공이 아래로 향하도록 배열한 뒤，배양용기를 밀봉하여 2일 동안 암배양하였다. 2일 후에 MT-COM 배지의 토마토 떡잎 조각들을 잎의 기공이 위로 향하도록 하여 MT-SRM (shoot induction medium)에 옮겨주었다. 2주에 한번씩 배지를 바꿔주며 상태를 관찰한 뒤, 신초(shoot)가 유도되면 MT-SEM (shoot elongation medium)에 옮겨주어 완전한 줄기로 분화시켰다. 줄기가 완전히 형성되면 식물체를 MT-RM (root induction medium)로 옮겨 뿌리를 유도하였다. 뿌리까지 완전하게 유도된 식물체는 흙으로 옮겨 생장시켰다. 각 실험에 사용된 배지의 조성은 하기 표 1에 나타내었다.

조직 배양 배지 조성

공배양 배지 (Co-culture medium)	신초유도배지(Shoot induction medium)	신초신장배지(Shoot elongation medium)	발근유도배지(Root induction medium)
15 g/L sucrose	30 g/L sucrose	15 g/L sucrose	15 g/L sucrose
4.4 g/L MS salt	4.4 g/L MS salt	4.4 g/L MS salt	4.4 g/L MS salt
1 μM IAA	50 ㎎/L kanamycin	50 ㎎/L kanamycin	50 ㎎/L kanamycin
10 μM Zeatin	0.1㎎/L IAA	250 ㎎/L Cefotaxim	2 ㎎/L IBA
200 μM acetosyringone	2 ㎎/L Zeatin	8 g/L plant agar	250 ㎎/L Cefotaxim
8 g/L plant agar	250 ㎎/L Cefotaxtim		8 g/L plant agar
	8 g/L plant agar
(pH 6.0)	(pH 6.0)	(pH 6.0)	(pH 6.0)

5. 표적 부위 돌연변이 확인

형질전환 식물체에서 CRISPR/Cas 9 시스템에 의해 표적 부위에 돌연변이가 유도되었는지를 확인하기 위해 표적 부위 주변의 약 600 bp 정도를 PCR로 증폭하였다. 형질전환체 확인 및 표적부위 돌연변이 확인을 위한 PCR 프라이머 정보는 표 2에 나타내었다. 그 후 염기서열 분석을 통해 표적 부위의 염기서열 변화를 확인하여 CRISPR/Cas9 시스템에 의해 표적 부위에 돌연변이 여부를 판단하였다.

본 발명에 사용된 프라이머 정보

프라이머 명칭	염기서열 (5'→3')	용도
NPTⅡ-F	AACAAGATGGATTGCACGCA (서열번호 6)	Transgenic plant screening
NPTⅡ-R	AAGAAGGCGATAGAAGGCGA (서열번호 7)
Cas9-300end-F	GACGCTAACCTCGATAAGGT (서열번호 8)
NOS-R	CAAGACCGGCAACAGGATTCAATC (서열번호 9)
APX Set 2-F	CTTGGTACTAGTCGTAATGTG (서열번호 10)	Amplification of the target region
APX Set 2-R	GAAACCATGTATTGCATCTTC (서열번호 11)	Amplification of the target region

6. 형질전환 식물체 열매에서 아스코르브산 측정

열매에서 아스코르브산 측정은 Abcam사의 Ascorbic Acid Assay Kit를 이용하여 측정되었다. 야생형과 형질전환 식물체의 ripen red 상태 열매를 실험에 이용하였다. 열매 조직 40 mg을 PBS 용액으로 세척한 후 400 ㎕의 멸균증류수와 함께 튜브에 넣어 균질기를 이용하여 균질화시킨 후 OD₅₉₃에서 30분 동안 매 1분마다 흡광도를 측정하여 각 샘플의 아스코르브산 함량을 계산하였다.

실시예 1 . 토마토에서 APX 유전자 발현양상 확인

본 발명자들은 토마토에 존재하는 SlAPX 유전자를 조사하고 열매에서 특이적으로 발현하는 SlAPX 유전자를 동정하였다 Sol genomics network의 Tomato expression database (TED) 조사 결과 SlAPX4 (Solyc09g007270)는 열매가 익을수록 발현량이 증가하는 경향을 보였으며，특히 breaker fruits와 ripen red fruits 단계에서 가장 높은 발현량을 보이는 것으로 나타났다(도 1A). 실제 실험모델인 마이크로톰 토마토에서 같은 경향성을 보이는지 확인하기 위해 토마토의 잎，뿌리，열매에서 조직별로 시료를 채취한 뒤, RNA를 추줄하여 Real-Time PCR을 통해 조직별 SlAPX4 유전자 발현양상을 비교한 결과 SlAPX4 유전자는 마이크로톰 토마토에서 breaker 단계에서부터 증가하였고 열매가 완전히 숙성되어지면 감소하는 경향을 나타냈다(도 1B). 두 결과를 종합한 결과 SlAPX4가 열매에서 아스코르브산 함량에 영향을 미치는 유전자임을 확인하였다.

실시예 2. sgRNA의 위치에 따른 CRISPR/Cas9 시스템 효율 비교

표적 유전자인 SlAPX4 안에서 sgRNA로 사용가능한 서열을 선발하여 4개의 sgRNA를 제작하였다. 본 발명에 있어서, 서열번호 2 내지 5의 염기서열은 하기 표 3의 표적 서열에서 PAM 염기(밑줄 표시)를 제외한 서열을 지칭한다.

SlAPX4 교정을 위한 sgRNA 후보 서열

	표적 서열 (23bp/with PAM)
gRNA1	TTTGGAAATCGACGTTTGATCGG (서열번호 2)
gRNA2	AAGCAGTTGAAAAATGTAAGAGG (서열번호 3)
gRNA3	GTTAAGAATTTTTTACATGATGG (서열번호 4)
gRNA4	GATGTCAAAACCAAAACTGGTGG (서열번호 5)

그 후 각각의 sgRNA와 CRISPR/Cas9 시스템을 가진 벡터를 Golden Gate system (Engler C et al., ACS Synth Biol. 2014, 3(11):839-43)을 이용하여 제작한 후, 아그로박테리움 튜메파시엔스 LBA4404에 형질전환시켜 토마토 떡잎에 Agro-infiltration 방법을 통해 CRISPR/Cas9 시스템을 일시적으로 발현시켰다. 그 후 DNA를 추출하여 pGEM-T Easy 벡터(Promega, USA)에 클로닝한 뒤, 콜로니의 염기서열을 확인하는 방법을 통해 CRISPR/Cas9 매개 돌연변이가 일어났는지를 확인하였다. 콜로니는 얻어지는 개수만큼 모두 PCR을 수행하여 염기서열을 분석하였으며, 효율은 다음의 식을 이용하여 비교하였다.

Efficiency(%) = (number of mutated colonies/number of total colonies) x 100

CRISPR/Cas9 매개 돌연변이는 염기서열 분석 원시데이터 중 CRISPR/Cas9 system 편집 위치인 PAM 서열 +3 bp 앞에서의 변화를 야생형의 염기서열과 비교하는 방법을 통해 확인하였고, 염기 삽입 또는 결실, 이중 피크 등이 일어난 것을 돌연변이가 일어난 것으로 판단하였다. 그 결과, sgRNA1은 총 442개의 콜로니를 얻어 염기서열 분석을 진행한 결과, PAM 서열 +3 bp 앞에서 아무런 변화가 나타나지 않았고, 이는 sgRNA2의 273개 콜로니에서도 마찬가지였다. sgRNA3의 경우 총 548개의 콜로니를 분석한 결과 2개에서 표적 유전자 부위에 돌연변이가 관찰되었고, sgRNA4의 경우 총 561개의 콜로니를 분석한 결과 5개의 콜로니에서 PAM 부분 +3 bp 서열에서 삽입 또는 결실이 관찰되어 CRISPR/Cas9 매개 돌연변이가 일어났음을 확인할 수 있었다. 즉, SlAPX4에 대한 각 sgRNA의 돌연변이 효율은 sgRNA1 및 sgRNA2가 0%, sgRNA3이 0.36%, sgRNA4가 0.89%로, 그 중 효율이 높은 sgRNA4를 이용하여 식물 형질전환을 진행하였다.

실시예 3. SlAPX4 유전자교정을 위한 형질전환 토마토 개발 및 목표 형질 세대 고정 확인

CRISPR/Cas9 시스템을 가진 pAGM4723::NPTⅡ::Cas9::sgRNA4::L3E 재조합벡터(도 2B)가 도입된 LBA4404 균주를 이용하여 아그로박테리움 매개 형질전환 방법으로 토마토 형질전환을 수행하였다. 아그로박테리움과 공배양한 토마토 조직을 카나마이신이 포함된 배지에서 재분화시켜 1차적으로 형질전환 식물체를 선별하였으며(도 3A), 식물체 잎에서 genomic DNA를 추출하여 Cas9과 NPTⅡ가 모두 발현된 식물체를 선발하여 형질전환 토마토를 개발하였다(도 3B).

선발된 형질전환 토마토는 모두 APX set2-F, APX set2-R 프라이머를 이용하여 표적 유전자 주변의 600 bp 정도를 PCR로 증폭한 후 염기서열 분석을 진행하여 CRISPR/Cas9 매개 돌연변이를 확인하였다. 염기서열 분석 결과 CRISPR/Cas9 system 편집 위치인 PAM 서열 앞 +3 bp에서 CRISPR/Cas9 매개 돌연변이가 일어난 식물체들을 선발하였다. SlAPX4 유전자교정이 일어난 형질전환 토마토의 종자를 수확하여 2세대 분석을 실시하였다. 종자를 흙에 파종하여 발아시킨 뒤 충분히 자란 식물체의 잎에서 genomic DNA를 추출하여 표적 유전자 부근 서열을 PCR과 염기서열 분석을 통해 유전자 편집여부를 확인하였다(도 4A). SlAPX4 유전자에 염기 결실 또는 삽입에 의해 frame-shift 돌연변이가 생긴 유전자교정체에서 ripen red 시기의 열매 내 아스코르브산 함량을 분석한 결과 유전자교정이 일어난 2세대 유전자교정 토마토에서 아스코르브산의 함량이 대조군에 비해 두배 이상 높게 나타난 것을 확인하였다(도 4B). 이 결과들을 토대로 SlAPX4 유전자가 토마토 열매의 아스코르브산 함량을 조절함을 규명하였고，SlAPX4 유전자교정이 토마토 열매 내 아스코르브산 함량 증가를 유도함을 확인하였다. 본 과정을 통해 SlAPX4 유전자 서열에 돌연변이가 존재하는 아스코르브산의 함량이 증가된 유전자교정 토마토를 개발하였다.

<110> INDUSTRY FOUNDATION OF CHONNAM NATIONAL UNIVERSITY <120> Method for producing tomato plant having increased ascorbic acid content using gene editing and tomato plant produced by the same method <130> PN20359 <160> 12 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 1126 <212> DNA <213> Unknown <220> <223> Solanum lycopersicum <400> 1 gcgcccataa cagttgctag atgtttctag taaatgctaa tttggaaatc gacgtttgat 60 cggagaagaa atggtgaagt gttatccgac ggtgagcgaa gagtatcaaa aagcagttga 120 aaaatgtaag aggaagctca gaggacttat cgccgagaag aattgtgctc cgattatgct 180 gagattagca tggcattcag cagggacata tgatgtcaaa accaaaactg gtggtccatt 240 tggaacaatc aggcacccga atgaacttaa acatggagct aacaatggtc ttgatattgc 300 tgttcgactt ttggagccga tcaaggaaca gttcccaatc ctatcctacg ctgactttta 360 tcagttggct ggagtagttg ctgttgaagt tacgggaggc cccgatattc cttttcatcc 420 tgggagacag gacaagacag aaccacctcc agaaggccgc ttgcctgacg ccaccaaagg 480 ctcagatcat ctgagggagg tttttggaca catgggattg agtgataaag acattgttgc 540 tttatctggt ggtcacactc tgggaaggtg ccacaaagaa cgctcaggat ttgagggagc 600 atggaccaac aaccctctca tatttgacaa ttcctatttc aaggagcttt tgagtggaga 660 gaaagaaggt ctcctccagc taccatcaga caaagcactc ttagaagatc cagtcttccg 720 ccctctagtc gagaaatatg ctgcagatga agatgcattc tttgctgatt atgctgaagc 780 tcatttgaag ctctcggagc tcggatttgc agatgctgag taaggtgtgg tgagaaagtt 840 gtttcaataa tctctggaga tcagtctggt tcttccaatt tttcatttgt actatttgtg 900 tatttaaaac tttaaaagtc taaaaaccag ctttacatat attatatgat tgaagaatat 960 tgtatggcta ttacataagt cttgtaataa tgcaactttt gtgtctttat gtttgttgct 1020 agtatataca atatattaag taatggtaaa atagtttgtt tattatattt tgttgcagta 1080 cgttagaatc ccatattttt aaaaatgtat taatttatgt aaattt 1126 <210> 2 <211> 20 <212> DNA <213> Unknown <220> <223> Solanum lycopersicum <400> 2 tttggaaatc gacgtttgat 20 <210> 3 <211> 20 <212> DNA <213> Unknown <220> <223> Solanum lycopersicum <400> 3 aagcagttga aaaatgtaag 20 <210> 4 <211> 20 <212> DNA <213> Unknown <220> <223> Solanum lycopersicum <400> 4 gttaagaatt ttttacatga 20 <210> 5 <211> 20 <212> DNA <213> Unknown <220> <223> Solanum lycopersicum <400> 5 gatgtcaaaa ccaaaactgg 20 <210> 6 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 6 aacaagatgg attgcacgca 20 <210> 7 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 7 aagaaggcga tagaaggcga 20 <210> 8 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 8 gacgctaacc tcgataaggt 20 <210> 9 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 9 caagaccggc aacaggattc aatc 24 <210> 10 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 10 cttggtacta gtcgtaatgt g 21 <210> 11 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 11 gaaaccatgt attgcatctt c 21 <210> 12 <211> 96 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> sgRNA <400> 12 gatgtcaaaa ccaaaactgg gttttagagc tagaaatagc aagttaaaat aaggctagtc 60 cgttatcaac ttgaaaaagt ggcaccgagt cggtgc 96

Claims

서열번호 5의 염기서열로 이루어진, 토마토 식물체 유래 APX4 (Ascorbate Peroxidase 4) 유전자의 표적 염기서열에 특이적인 가이드 RNA(guide RNA)를 암호화하는 DNA 및 엔도뉴클레아제(endonuclease) 단백질을 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 재조합 벡터; 또는 서열번호 5의 염기서열로 이루어진, 토마토 식물체 유래 APX4 유전자의 표적 염기서열에 특이적인 가이드 RNA와 엔도뉴클레아제 단백질의 복합체(ribonucleoprotein);를 유효성분으로 함유하는, 토마토 식물체의 아스코르브산 함량을 증가시키기 위한 유전체 교정용 조성물.
서열번호 5의 염기서열로 이루어진, 토마토 유래 SlAPX4 (Solanum lycopersicum Ascorbate Peroxidase 4) 유전자의 표적 염기서열 및 엔도뉴클레아제 결합 서열로 이루어진 염기 서열에 의해 코딩되는 가이드 RNA를 유효성분으로 함유하는, 토마토 식물체의 아스코르브산 함량을 증가시키기 위한 유전체 교정용 조성물.
(a) 서열번호 5의 염기서열로 이루어진, 토마토 유래 SlAPX4 (Solanum lycopersicum Ascorbate Peroxidase 4) 유전자의 표적 염기서열에 특이적인 가이드 RNA(guide RNA) 및 엔도뉴클레아제(endonuclease) 단백질을 토마토 식물세포에 도입하여 유전체를 교정하는 단계; 및
(b) 상기 유전체가 교정된 토마토 식물세포로부터 토마토 식물체를 재분화하는 단계;를 포함하는, 아스코르브산 함량이 증가된 유전체 교정 토마토 식물체의 제조방법.
제3항에 있어서, 상기 (a) 단계의 가이드 RNA 및 엔도뉴클레아제 단백질을 토마토 식물세포에 도입하는 것은, 서열번호 5의 염기서열로 이루어진, 토마토 유래 SlAPX4 유전자의 표적 염기서열에 특이적인 가이드 RNA를 암호화하는 DNA 및 엔도뉴클레아제 단백질을 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 재조합 벡터; 또는 서열번호 5의 염기서열로 이루어진, SlAPX4 유전자의 표적 염기서열에 특이적인 가이드 RNA와 엔도뉴클레아제 단백질의 복합체(ribonucleoprotein);를 이용하는 것을 특징으로 하는 제조방법.
삭제
제3항 또는 제4항의 방법에 의해 제조된 아스코르브산 함량이 증가된 유전체 교정 토마토 식물체.
제6항에 따른 토마토 식물체의 유전체가 교정된 종자.