KR102579767B1 - eIF4E1 유전자 교정에 의해 포티바이러스 저항성이 증가된 유전체 교정 토마토 식물체의 제조방법 및 상기 방법에 의해 제조된 포티바이러스 저항성이 증가된 유전체 교정 토마토 식물체 - Google Patents

eIF4E1 유전자 교정에 의해 포티바이러스 저항성이 증가된 유전체 교정 토마토 식물체의 제조방법 및 상기 방법에 의해 제조된 포티바이러스 저항성이 증가된 유전체 교정 토마토 식물체 Download PDF

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Abstract

본 발명은 토마토 유래 eIF4E1 (Eukaryotic translation initiation factor 4E-1) 유전자를 CRISPR/Cas 시스템으로 교정하여 포티바이러스에 대한 저항성이 증가된 유전체 교정 토마토 식물체의 제조방법에 관한 것으로, 본 발명의 유전체 교정 식물체의 제조방법은 외부 유전자가 삽입되어 있지 않고 자연적 변이와 구별할 수 없는 작은 변이만 가지고 있어, 안전성과 환경 유해성 여부를 평가하기 위해 막대한 비용과 시간이 소모되는 GMO (genetically modified organism) 작물과 달리 비용과 시간을 절약할 수 있을 것으로 기대된다.

Description

eIF4E1 유전자 교정에 의해 포티바이러스 저항성이 증가된 유전체 교정 토마토 식물체의 제조방법 및 상기 방법에 의해 제조된 포티바이러스 저항성이 증가된 유전체 교정 토마토 식물체{Method for producing genome-edited tomato plant with increased Potyvirus resistance by eIF4E1 gene editing and genome-edited tomato plant with increased Potyvirus resistance produced by the same method}
본 발명은 eIF4E1 유전자 교정에 의해 포티바이러스 저항성이 증가된 유전체 교정 토마토 식물체의 제조방법 및 상기 방법에 의해 제조된 포티바이러스 저항성이 증가된 유전체 교정 토마토 식물체에 관한 것이다.
토마토(Solanum lycopersicum)는 가지과에 속하는 식물로서 세계에서 가장 널리 재배되며, 농업적 가치가 큰 작물 중 하나이다. 또한 분자생물학에서 우수한 모델생물로 과일색, 병저항성, 숙성 과정 등 많은 분야에서 활발하게 연구되고 있다.
식물병은 전 세계 농작물 생산에 영향을 미치는 주요 요인 중 하나이다. 최근 바이러스에 의한 피해가 증가하고 있으며, 식물의 질병을 억제하기 위해 살충제나 물리적인 통제와 같은 방법들이 사용될 수도 있지만, 이 방법들은 지속가능하고 효과적이지 않다. 따라서 현재 바이러스를 억제하는 가장 효과적인 방법은 바이러스 내성 품종을 개발하는 것이다.
포티바이러스(Potyvirus)는 기존 식물 바이러스의 약 30%를 차지하며, 식물에 막대한 피해를 입히는 것으로 알려져 있다. 포티바이러스는 유전체결합 바이러스 단백질(VPg)과 다중 A 꼬리(poly (A) tail)가 각각 5'과 3' 말단에 결합된 단일 가닥 양성 RNA 게놈을 가지고 있다. 약 10 kb의 단립형(monopartite) 유전체는 단백질분해효소에 의해 잘린 단일의 다단백질을 암호화한다.
식물 바이러스는 최소한의 유전자를 가지고 있는 단순한 구조화된 세포내 기생충이며 바이러스의 수명주기 및 전신운동을 숙주에 의존한다. 진핵생물은 진핵생물개시인자(Eukaryotic initiation factor, eIF)를 가지고 있으며, 진핵생물 번역개시인자 4E(Eukaryotic translation initiation factor 4E, eIF4E)는 mRNA 번역 과정에 관여하는 다중 복합체 단백질의 구성분 중 하나로, 세포 mRNA의 캡 구조와의 인식과 상호작용을 가능하게 하여 단백질 번역을 시작한다.
포티바이러스의 유전체결합 바이러스 단백질(viral genome-linked protein, VPg)은 바이러스 RNA의 5' 말단과 공유결합으로 연결되어 있으며, 단백질 번역과정 중 mRNA의 캡 구조(Cap structure)의 역할을 대체할 수 있다. 이전 연구에서 기주 인자 eIF4E (또는 상동기관인 eIF(iso)4E)와 VPg 사이의 물리적 상호작용이 여러 종의 포티바이러스의 감염에 매우 중요하다고 보고되었다. 또한 이러한 기주 인자에서 발생하는 돌연변이는 기주 인자와 VPg간의 상호작용을 억제하고 결과적으로 바이러스의 감염을 예방하는 것으로 보고되었다(Duprat et al., (2002) Plant J. 32, 927-934; Lellis et al., (2002) Curr. Biol. 12, 1046-1051; Sato et al., (2005) FEBS Lett. 579, 1167-1171).
CRISPR/Cas9 (Clustered Regularly Interspaced Palindromic Repeats/CRISPR-associated protein9)은 화농성연쇄상구균(Streptococcus pyogenes)의 바이러스 감염에 대응하는 면역체계시스템으로부터 유래한 유전자 교정 기술 중 하나이다. CRISPR/Cas9은 미생물, 동물, 인간 세포, 식물을 포함하는 다양한 유기체에 위치 특이적 돌연변이를 일으킬 수 있는 기술로 사용되어져 왔다. CRISPR/Cas9은 PAM (protospacer adjacent motif)의 5'에 위치한 표적 DNA 서열과 20bp 크기의 gRNA가 상보적으로 결합하고, Cas9 효소에 의해 DSB (double-stranded break)를 일으킨다. 이 과정을 통해 세포내 수선기작인 비상동말단연결(Non-homologous end joining, NHEJ)이 발생하게 되는데, 이 과정 동안에 삽입과 결실, 치환과 같은 무작위 돌연변이를 일으킨다. 이러한 돌연변이들은 단백질의 개방형 해독틀(open reading frame, ORF)을 바꿀 수 있으며, 조기 종결 코돈을 일으키키도 한다.
한편, 한국공개특허 제2019-0043841호에는 '식물체에서 CRISPR/Cas9 시스템을 이용하여 LeMADS-RIN 유전자 편집에 의해 에틸렌 생산을 감소시키는 방법'이 개시되어 있고, 한국공개특허 제2017-0129186호에는 '포티바이러스 저항성을 가지는 Pvr4 유전자 및 이의 용도'가 개시되어 있으나, 본 발명의 'eIF4E1 유전자 교정에 의해 포티바이러스 저항성이 증가된 유전체 교정 토마토 식물체의 제조방법 및 상기 방법에 의해 제조된 포티바이러스 저항성이 증가된 유전체 교정 토마토 식물체'에 대해서는 개시된 바가 없다.
본 발명은 상기와 같은 요구에 의해 도출된 것으로서, 본 발명자들은 토마토 식물체의 포티바이러스 저항성을 증가시키기 위해서, 포티바이러스의 VPg (viral genome-linked protein)와 상호작용하는 것으로 보고된 eIF4E 단백질 코딩 유전자를 표적으로 하여 CRISPR/Cas9 시스템으로 토마토 eIF4E1 유전자의 돌연변이를 유도하고, 야생형의 eIF4E1 대립유전자를 포함하지 않는 삽입, 결실, 치환 형태의 돌연변이 양상을 가진 E0 식물들을 세대 진전시켜 eIF4E1 동형접합성 또는 이형접합성 돌연변이 E1 및 E2 세대를 이용하여 포티바이러스 중 TEV (Tobacco etch virus)와 PepMoV (Pepper mottle virus) 저항성을 확인한 결과, eIF4E1 유전체 교정 토마토 식물체에서 PepMov에 대한 저항성이 야생형 식물체에 비해 현저히 증가되었음을 확인함으로써, 본 발명을 완성하였다.
상기 과제를 해결하기 위해, 본 발명은 (a) 토마토 유래 eIF4E1 (Eukaryotic translation initiation factor 4E-1) 유전자의 표적 염기서열에 특이적인 가이드 RNA (guide RNA)를 암호화하는 DNA 및 엔도뉴클레아제(endonuclease) 단백질을 토마토 식물세포에 도입하여 유전체를 교정하는 단계; 및 (b) 상기 유전체가 교정된 토마토 식물세포로부터 토마토 식물을 재분화하는 단계;를 포함하는, 포티바이러스 저항성이 증가된 유전체 교정 토마토 식물체의 제조방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 방법에 의해 제조된 포티바이러스 저항성이 증가된 유전체 교정 토마토 식물체 및 이의 종자를 제공한다.
또한, 본 발명은 토마토 유래 eIF4E1 유전자의 표적 염기서열에 특이적인 가이드 RNA를 암호화하는 DNA 및 엔도뉴클레아제 단백질을 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 재조합 벡터; 또는 토마토 유래 eIF4E1 유전자의 표적 염기서열에 특이적인 가이드 RNA와 엔도뉴클레아제 단백질의 복합체;를 유효성분으로 함유하는, 토마토 식물체의 포티바이러스 저항성을 증가시키기 위한 유전체 교정용 조성물을 제공한다.
본 발명의 유전체 교정 식물체의 제조방법은 외부 유전자가 삽입되어 있지 않고 자연적 변이와 구별할 수 없는 작은 변이만 가지고 있어, 안전성과 환경 유해성 여부를 평가하기 위해 막대한 비용과 시간이 소모되는 GMO (genetically modified organism) 작물과 달리 비용과 시간을 절약할 수 있을 것으로 기대된다. 또한, 본 발명의 제조방법은 토마토 식물체의 바이러스 저항성을 증가시켜 생산량 증가 및 경제적인 효과를 기대할 수 있다.
도 1A는 CRISPR/Cas9 벡터 구조 모식도로, 35S 프로모터 발현에 제어되는 옥수수 코돈 최적화된 Cas9 유전자와 애기장대 U6-26 프로모터 발현에 의해 제어되는 eIF4E1-gRNA가 발현되는 카세트(pHSE401-eIF4E1) 모식도이고, 1B는 CRISPR/Cas9 시스템의 eIF4E1 유전자 표적 위치 및 gRNA 서열을 보여준다. 빨간색 글씨는 PAM 서열을 나타낸다.
도 2는 아그로박테리움 매개의 토마토(cv. 'Micro-Tom') 형질전환 과정을 보여주는 것으로, 종자 발아(A), 절편에 공동배양(B), 절편에서 shoot 유도(C), shoot 신장(D), 뿌리가 생성된 식물체(E), 토양으로 옮긴 식물체(F)의 모습이다.
도 3은 토마토 'Micro-Tom' 형질전환체의 스크리닝 결과로, eIF4E1 E0 형질전환체 gDNA에서 Cas9과 Hpt 유전자 유무를 PCR로 확인한 결과이다. NC: 음성대조군을 나타내는 야생형, PC: 양성대조군을 나타내는 Cas9 플라스미드.
도 4는 PCR 산물에서 다이렉트 시퀀싱을 통한 돌연변이 서열을 분석한 결과로, (A)는 삽입 유전자가 확인된 eIF4E1 표적 유전자 교정체 E0-1의 염기서열 정렬 결과로 야생형의 염기서열과 비교했을 때, eIF4E1 유전자의 표적 부위에서 단일 피크의 염기서열을 나타냈으며, 해당 개체는 비-돌연변이체로 간주하였다. 도 4(B)는 삽입 유전자가 확인된 eIF4E1 표적 유전자 교정체 E0-8의 염기서열 정렬 결과로, 야생형의 염기서열과 비교하여 eIF4E1 유전자의 표적 부위에서 InDel 돌연변이로 인해 혼합된 피크 형태의 염기서열을 나타내어, 해당 개체는 돌연변이체로 간주하였다.
도 5는 E0 라인의 돌연변이 서열 정렬 결과로, (A)는 야생형과 eIF4E1 E0-3 라인의 4개 콜로니 염기서열 정렬 결과이고, (B)는 야생형과 eIF4E1 E0-8 라인의 5개 콜로니 염기서열 정렬 결과이다. 서열 우측에 표시된 숫자는 각각의 염기서열에서 야생형(WT) 서열과 비교하여 삽입 또는 결실된 염기의 수를 나타낸다.
도 6(A)는 eIF4E1 유전자 교정체 E0-3 라인의 E1 개체들에서 PCR을 통한 삽입 유전자의 확인 결과이고, 도 6(B)는 eIF4E1 유전자 교정체 E0-8 라인의 E1 개체들에서 삽입 유전자를 확인한 결과이다.
도 7은 eIF4E1 유전자 교정 식물체의 돌연변이 양상을 분석한 것으로, (A)는 동형접합성 돌연변이 라인 eIF4E1 3-8 (E1), (B)는 이중대립성 돌연변이 라인 eIF4E1 3-11 (E1), (C)는 키메라 돌연변이 라인 eIF4E1 3-19 (E1)의 표적 부위의 서열변이를 보여준다.
도 8은 eIF4E1 유전자 교정 식물체 중 동형접합성 돌연변이를 가지는 E1 라인의 표적염기 부위의 서열 정렬 결과이다.
도 9는 eIF4E1 유전자 교정 식물체 중 동형접합성 돌연변이를 가지는 E1 라인의 표현형을 보여주는 사진이다.
도 10은 eIF4E1 유전자 교정 식물체(E1 세대)의 포티바이러스에 대한 저항성을 분석한 결과로, 각각 TEV-HAT(A) 및 PepMoV(B)에 대한 DAS-ELISA 결과이다. 별표는 'mock'과 실험군 사이의 유의미한 차이를 나타낸다.
도 11은 eIF4E1 유전자 교정 식물체(E2 세대)의 포티바이러스에 대한 저항성을 DAS-ELISA로 분석한 결과로, (A)는 TEV-HAT(A), (B)는 PepMoV에 대한 결과이다. mock: 음성 대조군, PepMoV-WT: 양성대조군으로 PepMoV를 접종한 야생형, E2-3-9 I: 3-9 라인의 E2 개체의 접종엽, E2-3-9 S: 3-9라인의 E2 개체의 상위엽.
본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 (a) 토마토 유래 eIF4E1 (Eukaryotic translation initiation factor 4E-1) 유전자의 표적 염기서열에 특이적인 가이드 RNA(guide RNA)를 암호화하는 DNA 및 엔도뉴클레아제(endonuclease) 단백질을 토마토 식물세포에 도입하여 유전체를 교정하는 단계; 및 (b) 상기 유전체가 교정된 토마토 식물세포로부터 토마토 식물을 재분화하는 단계;를 포함하는, 포티바이러스 저항성이 증가된 유전체 교정 토마토 식물체의 제조방법을 제공한다.
본 명세서에서 용어 '유전체/유전자 교정(genome/gene editing)'은, 인간 세포를 비롯한 동·식물 세포의 유전체 염기서열에 표적지향형 변이를 도입할 수 있는 기술로서, DNA 절단에 의한 하나 이상의 핵산 분자의 결실, 삽입, 치환 등에 의하여 특정 유전자를 녹-아웃(knock-out) 또는 녹-인(knock-in)하거나, 단백질을 생성하지 않는 비-코딩 DNA 서열에도 변이를 도입할 수 있는 기술을 말한다.
본 명세서에서 용어 "표적 유전자"는 본 발명을 통해 교정하고자 하는 식물체의 유전체 내에 있는 일부 DNA를 의미한다. 즉, 원칙적으로 그 유전자의 종류에 제한되지 않으며, 코딩 영역 및 비-코딩(non-coding) 영역을 모두 포함할 수 있다. 당업자는 그 목적에 따라, 제조하고자 하는 유전체 교정 식물체에 대하여 원하는 변이에 따라 상기 표적 유전자를 선별할 수 있다.
본 발명의 일 구현 예에 따른 포티바이러스 저항성이 증가된 유전체 교정 토마토 식물체의 제조방법에 있어서, 표적 유전자는 토마토 유래 eIF4E1 유전자일 수 있고, 바람직하게는 서열번호 1의 염기서열로 이루어진 유전자일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
또한, 본 발명의 일 구현 예에 따른 제조방법에 있어서, 가이드 RNA(guide RNA)는 eIF4E1 유전자의 표적 염기서열에 특이적으로 고안된 것으로, 상기 eIF4E1 유전자의 표적 염기서열은 바람직하게는 서열번호 2의 염기서열로 이루어진 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 즉, 본 발명에 따른 상기 서열번호 2의 염기서열로 이루어진 표적 염기서열은 가이드 RNA가 표적하는 서열인 것이다.
용어 "가이드 RNA(guide RNA)"는 표적 유전자의 염기서열을 암호화하는 DNA에 특이적인 RNA를 의미하며, 표적 DNA 염기서열과 전부 또는 일부가 상보적으로 결합하여 해당 표적 DNA 염기서열로 엔도뉴클레아제(endonuclease) 단백질을 이끄는 역할을 하는 리보핵산을 의미한다. 상기 가이드 RNA는 두 개의 RNA, 즉, crRNA(CRISPR RNA) 및 tracrRNA(trans-activating crRNA)를 구성 요소로 포함하는 이중 RNA(dual RNA); 또는 표적 DNA 내 염기서열과 전부 또는 일부 상보적인 서열을 포함하는 제1 부위 및 RNA-가이드 뉴클레아제와 상호작용하는 서열을 포함하는 제2 부위를 포함하는 단일 사슬 가이드 RNA(sgRNA) 형태를 말하나, RNA-가이드 뉴클레아제가 표적 염기서열에서 활성을 가질 수 있는 형태라면 제한 없이 본 발명의 범위에 포함될 수 있다. 본 발명에 따른 가이드 RNA는 바람직하게는, 단일 가닥 가이드 RNA 형태일 수 있으나, 이에 제한되지 않으며, 사용된 엔도뉴클레아제의 종류 또는 엔도뉴클레아제의 유래 미생물 등에 당업계의 공지된 기술에 따라서 적절히 선택할 수 있다.
또한, 상기 가이드 RNA는 플라스미드 주형으로부터 전사된 것 또는 생체 외(in vitro)에서 전사된(transcribed) 것(예컨대, 올리고뉴클레오티드 이중가닥)일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
또한, 본 발명의 일 구현 예에 따른 제조방법에 있어서, 상기 (a) 단계의 가이드 RNA를 암호화하는 DNA 및 엔도뉴클레아제 단백질의 토마토 식물세포로의 도입은, 토마토 유래 eIF4E1 유전자의 표적 염기서열에 특이적인 가이드 RNA를 암호화하는 DNA 및 엔도뉴클레아제 단백질을 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 재조합 벡터; 또는 토마토 유래 eIF4E1 유전자의 표적 염기서열에 특이적인 가이드 RNA와 엔도뉴클레아제 단백질의 복합체;를 이용하는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 일 구현 예에 따른 제조방법에 있어서, 상기 엔도뉴클레아제 단백질은 Cas9 (CRISPR associated protein 9), Cas12a (previously known as Cpf1) 및 이의 기능적 유사체로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상일 수 있고, 바람직하게는 Cas9 단백질일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
Cas9 단백질 또는 유전자 정보는 NCBI(National Center for Biotechnology Information)의 GenBank와 같은 공지의 데이터베이스에서 얻을 수 있다. 예컨대, 상기 Cas9 단백질은 스트렙토코커스 피요제네스(Streptococcus pyogenes) 유래의 Cas9 단백질, 캠필로박터 제주니(Campylobacter jejuni) 유래의 Cas9 단백질, 스트렙토코커스 써모필러스(S. thermophilus) 또는 스트렙토코커스 아우레우스(S. aureus) 유래의 Cas9 단백질, 네이쎄리아 메닝기티디스(Neisseria meningitidis) 유래의 Cas9 단백질, 파스투렐라 물토시다(Pasteurella multocida) 유래의 Cas9 단백질, 프란시셀라 노비시다(Francisella novicida) 유래의 Cas9 단백질 등으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
Cas9 단백질은 RNA-guided DNA 엔도뉴클레아제 효소로, 이중 가닥 DNA 절단(double stranded DNA break)을 유도한다. Cas9 단백질이 정확하게 표적 DNA의 염기서열에 결합하여 DNA 가닥을 잘라내기 위해서는 PAM (Protospacer Adjacent Motif)이라 알려진 3개의 염기로 이루어진 짧은 염기서열이 표적 DNA의 염기서열 옆에 존재해야 하며, Cas9 단백질은 PAM 서열(NGG)로부터 3번째와 4번째 염기쌍 사이를 추정하여 절단한다.
본 발명의 제조방법에 있어서, 상기 가이드 RNA와 엔도뉴클레아제 단백질은 리보핵산-단백질(ribonucleoprotein) 복합체를 형성하여 RNA 유전자 가위(RNA-Guided Engineered Nuclease, RGEN)로 작동한다.
본 발명에서 사용된 CRISPR/Cas9 시스템은 교정하고자 하는 특정 유전자의 특정위치에 이중나선 절단을 도입하여 DNA 수선 과정에서 유도되는 불완전 수선에 의한 삽입-결실(insertion-deletion, InDel) 돌연변이를 유도시키는 NHEJ(non-homologous end joining) 기작에 의한 유전자 교정 방법이다.
본 발명에 따른 유전체 교정 토마토 식물체의 제조방법에 있어서, 상기 가이드 RNA를 암호화하는 DNA 및 엔도뉴클레아제 단백질을 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 재조합 벡터를 식물세포에 도입하는 것은 형질전환 방법을 의미한다. 식물 종의 형질전환은 이제는 쌍자엽 식물뿐만 아니라 단자엽 식물 양자를 포함한 식물 종에 대해 일반적이다. 원칙적으로, 임의의 형질전환 방법은 본 발명에 따른 재조합 벡터를 적당한 선조 세포로 도입시키는데 이용될 수 있다. 상기 도입 방법은 식물 요소로의 현미주사법(Crossway et al., 1986, Mol. Gen. Genet. 202: 179-185), 각종 식물 요소의(DNA 또는 RNA-코팅된) 입자 충격법(Klein et al., 1987, Nature 327: 70), 식물의 침윤 또는 성숙 화분 또는 소포자의 형질전환에 의한 아그로박테리움 튜메파시엔스(Agrobacterium tumefaciens) 매개된 유전자 전이에서(비완전성) 바이러스에 의한 감염(EP 0 301 316호) 등으로부터 적당하게 선택될 수 있다. 본 발명에 따른 바람직한 방법은 아그로박테리움 매개된 DNA 전달을 포함한다.
또한, 본 발명에 따른 유전체 교정 토마토 식물체의 제조방법에 있어서, 상기 가이드 RNA와 엔도뉴클레아제 단백질의 복합체를 식물세포에 형질도입하는 방법은 원형질체에 대한 칼슘/폴리에틸렌 글리콜 방법(Krens et al., 1982, Nature 296: 72-74; Negrutiu et al., 1987, Plant Mol. Biol. 8: 363-373) 또는 원형질체의 전기천공법(Shillito et al., 1985, Bio/Technol. 3: 1099-1102) 등으로부터 적당하게 선택될 수 있다.
상기 형질전환에 이용되는 "식물세포"는 어떤 식물세포도 된다. 식물세포는 배양 세포, 배양 조직, 배양기관 또는 전체 식물이다. "식물 조직"은 분화된 또는 미분화된 식물의 조직, 예를 들면 이에 한정되진 않으나, 뿌리, 줄기, 잎, 꽃가루, 종자, 암 조직 및 배양에 이용되는 다양한 형태의 세포들, 즉 단일 세포, 원형질체(protoplast), 싹 및 캘러스 조직을 포함한다. 식물 조직은 인 플란타(in planta)이거나 기관 배양, 조직배양 또는 세포 배양 상태일 수 있다.
본 발명의 유전체 교정 토마토 식물체의 제조방법에 있어서, 유전체가 교정된 식물세포로부터 유전체가 교정된 식물을 재분화하는 방법은 당업계에 공지된 임의의 방법을 이용할 수 있다. 유전체가 교정된 식물세포는 전식물로 재분화되어야 한다. 캘러스 또는 원형질체 배양으로부터 성숙한 식물의 재분화를 위한 기술은 수많은 여러 가지 종에 대해서 당업계에 주지되어 있다(Handbook of Plant Cell Culture, 1-5권, 1983-1989 Momillan, N.Y.).
본 발명의 유전체 교정 토마토 식물체의 제조방법에 있어서, 상기 포티바이러스는 바람직하게는 고추 모틀 바이러스(Pepper mottle virus)일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명은 또한, 상기 방법에 의해 제조된 포티바이러스 저항성이 증가된 유전체 교정 토마토 식물체 및 이의 종자를 제공한다.
본 발명에 따른 포티바이러스 저항성이 증가된 유전체 교정 토마토 식물체는 포티바이러스의 VPg (viral genome-linked protein)와 상호작용하는 것으로 보고된 식물의 열성 바이러스 저항성 유전자인 eIF4E1 유전자를 CRISPR/Cas9 시스템을 이용하여 교정한 것으로, 토마토 유래 eIF4E1 유전자가 녹-아웃되어, 유전체를 교정하지 않은 토마토 식물체에 비해 포티바이러스에 대한 저항성이 증가되는 형질을 가지는 유전체 교정 토마토 식물체이다.
본 발명의 유전체 교정 토마토 식물체 및 이의 종자에 있어서, 상기 포티바이러스는 바람직하게는 고추 모틀 바이러스(Pepper mottle virus)일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명은 또한, 토마토 유래 eIF4E1 유전자의 표적 염기서열에 특이적인 가이드 RNA를 암호화하는 DNA 및 엔도뉴클레아제 단백질을 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 재조합 벡터; 또는 토마토 유래 eIF4E1 유전자의 표적 염기서열에 특이적인 가이드 RNA와 엔도뉴클레아제 단백질의 복합체;를 유효성분으로 함유하는, 토마토 식물체의 포티바이러스 저항성을 증가시키기 위한 유전체 교정용 조성물을 제공한다.
본 발명의 유전체 교정용 조성물은 토마토 eIF4E1 유전자의 표적 염기서열에 특이적인 가이드 RNA를 암호화하는 DNA 및 엔도뉴클레아제 단백질을 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 재조합 벡터, 또는 eIF4E1 유전자의 표적 염기서열에 특이적인 가이드 RNA와 엔도뉴클레아제 단백질의 복합체를 포함하고 있어, 상기 조성물을 토마토 식물세포에 처리할 경우, 상기 가이드 RNA와 엔도뉴클레아제 단백질의 복합체가 RNA 유전자 가위로 작동하여 표적 유전자인 eIF4E1을 교정할 수 있다.
본 발명의 유전체 교정용 조성물은 바람직하게는, 서열번호 2의 염기서열로 이루어진 토마토 eIF4E1 유전자의 표적 염기서열에 특이적인 가이드 RNA를 포함하고 있어, eIF4E1 유전자를 녹-아웃시킬 수 있고, eIF4E1 유전자의 녹-아웃을 통해 토마토 식물체의 포티바이러스 저항성을 증가시킬 수 있는 것이다.
이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.
재료 및 방법
1. 식물 재료
토마토(Solanum lycopersicum) 'Micro-Tom'의 종자를 70% 에탄올으로 1분, Tween 20을 포함하는 2% NaOCl로 15분 동안 표면 소독을 실시하였다. 이후, 멸균된 증류수로 4-5번 세척하였다. 소독된 종자들은 20 g/L 수크로스, 8 g/L 플랜트 아가를 포함하며 pH 5.8±1로 조정되어 121℃에서 20분 고압멸균되어 제작된 1/2 MS 배지에 치상하였다. 배지들은 알루미늄 호일로 감싸 3일 동안 암조건을 주고 이후에는 호일을 제거하여 광조건에서 균일한 발아를 유도하였다. 모든 조직배양체들은 16시간 광/8시간 암 조건의 광주기, 24℃의 형광등 아래서 유지되었다. 본엽이 전개하기 전 6-7일 연령된 유묘의 자엽들을 조직배양 절편으로 사용하였다. 이후 과정을 통해 뿌리를 내린 식물체들은 상토를 담은 화분으로 옮겨 순화과정을 거쳤으며 24℃의 생장상에서 유지되었다.
2. gudie RNA 제작 및 벡터 제작
gRNA의 목표서열은 CRISPR/Cas9 온라인 예측 프로그램인 CCTop를 이용하여 제작되어졌다(https://crispr.cos.uni-heidelberg.de/index.html). 본 발명에서는 옥수수 코돈 최적화된 Cas9 유전자를 포함하는 pHSE401 벡터를 사용하였다. 23bp의 eIF4E1gRNA_F와 eIF4E1gRNA_R는 증폭된 후 BsaI 제한효소 처리된 pHSE401 벡터에 기존의 보고된 Golden gate cloning 방법을 통해 클로닝 되었다(Xing et al., (2014) BMC Plant Biol. 14:327).
sgRNA 클로닝을 위한 프라이머
프라이머 염기서열 (5'→3') Tm (℃) GC 함량 (%)
eIF4E1gRNA_F ATTGAGTTGAAGGCCGCCGATGG (서열번호 3) 62 56.52
eIF4E1gRNA_R AAACCCATCGGCGGCCTTCAACT (서열번호 4) 62 56.52
3. 형질전환을 위한 아그로박테리움 배양
제작된 CRISPR/Cas9 벡터는 식물형질전환을 위해 전기천공법을 이용하여 아그로박테리움 GV3101 균주에 삽입되었다. 항생제 배지에서 생성된 단일 콜로니는 시퀀스 분석을 통해 확인되어졌으며, 확인된 단일 콜로니는 50 ㎍/㎖ 카나마이신과 50 ㎍/㎖ 리팜피신이 포함된 15 ㎖의 액체 LB 배지에 접종하여 28℃의 진탕배양기에서 12-16시간 동안 배양되었다. 아그로박테리움 현탁액은 20℃, 8,000rpm 조건에서 10분 원심분리하여 펠렛을 모았으며, 모아진 펠렛은 3%(w/v) 수크로스, 200 μM 아세토시린곤을 포함하는 1/2 액체 MS 배지로 다시 희석하여 OD600을 0.6으로 조정하였다.
4. 아그로박테리움 매개 토마토형질전환
자엽 절편은 멸균 조건에서 준비되었으며, 자엽의 말단 부분은 자른 후 한 개의 자엽을 두 조각으로 나누어 주었다. 절편들은 30 g/L 수크로스, 8 g/L 플랜트 아가, 1 ㎎/L NAA (1-Naphthaleneacetic acid) 및 1 ㎎/L BAP (benzylaminopurine)가 포함된 MS 전-배양 배지에서 2일 동안 배양되었다. 절편들은 아그로박테리움 현탁액에 20분 동안 접종된 후 멸균필터 종이에 가볍게 잔여 아그로박테리움 현탁액을 말린 후 동일한 조성을 가진 MS 배지에 치상하였다. 2일 후, 절편들을 MS에 30 g/L 수크로스, 8 g/L 플랜트 아가, 2 ㎎/L trans zeatin-riboside, 0.1 ㎎/L IAA (Indole-3-acetic acid), 10 ㎎/L 하이그로마이신, 250 ㎎/L 카르베니실린이 포함된 shoot-induction 배지에 치상하였다. 약 4-6주 후 절편들을 MS에 30 g/L 수크로스, 8 g/L 플랜트 아가, 1 ㎎/L trans zeatin-riboside, 0.1 ㎎/L IAA, 10 ㎎/L 하이그로마이신, 250 ㎎/L 카르베니실린이 포함된 shoot-elongation 배지에 치상하였다. 약 1-2 cm 정도로 자란 줄기 부위를 잘라 MS에 30 g/L 수크로스, 8 g/L 플랜트 아가, 1 ㎎/L IAA, 10 ㎎/L 하이그로마이신, 250 ㎎/L 카르베니실린이 포함된 rooting 배지에 치상하였다.
5. 핵산 추출 및 PCR 분석
1.5 ㎖의 튜브에 두 개의 3 mm 구슬을 넣고 Tissuelyser를 이용하여 순화된 식물의 잎 조직으로부터 CTAB (cetyltrimethylammonium bromid) 방법(Porebski et al., (1997) Plant Mol. Biol. Rep. 15, 8-15)을 통해 게노믹 DNA(gDNA)를 추출하였으며 추출된 gDNA는 Nanodrop 분광광도계(Nanodrop Technology, Inc., USA)를 이용하여 농도를 측정하였으며, 최종 농도 100 ng/㎕로 희석하였다. 추출한 gDNA를 이용하여 삽입 유전자 Cas9 코딩 서열 및 Hpt 특이적 프라이머를 이용한 PCR을 통해 삽입 유전자의 유무를 확인하였다.
삽입 유전자 확인을 위한 프라이머
프라이머 염기서열 (5'→3') 증폭산물 크기 (bp)
HygR_F GCGAAGAATCTCGTGCTTTC (서열번호 5) 209
HygR_R CAACGTGACACCCTGTGAAC (서열번호 6)
Cas9_pHSE_F ATCCAATCTTCGGCAACAT (서열번호 7) 484
Cas9_pHSE_R TTATCCAGGTCATCGTCGTAT (서열번호 8)
6. 돌연변이 확인
표적 유전자 교정 부위를 포함하는 프라이머를 이용하여 형질전환체의 돌연변이 여부를 확인하였다.
표적 유전자 교정 부위의 돌연변이 검증을 위한 프라이머
프라이머 염기서열 (5'→3') 증폭산물 크기 (bp)
Sl4E_F_2 ACACTATGGTCCAAACAGTTCTTAT (서열번호 9) 275
Sl4E_R_2 AACTGCTTGGGGAAGCTCAC (서열번호 10)
PCR 산물은 LaboPass PCR clean-up 키트 (Cosmo Genetech, Korea)를 통해 정제되었으며 정제된 산물은 TA 클로닝 벡터 pMD20-T vector (Mighty TA-cloning kit, TAKARA)에 제공되는 프로토콜을 따라 클로닝되었다. blue/white 콜로니 선발방법에서 선발된 흰색 콜로니들은 암피실린을 포함하는 액체 LB 배지에 접종하여 배양되었다. 배양액으로부터 Accuprep plasmid mini extraction 키트 (Bioneer, Korea)를 통하여 플라스미드를 추출하였으며, PCR 산물 당 최소 5개 이상의 클론은 시퀀스 분석을 실시하였다(Bionics, Korea). Lasergene's SeqMan 프로그램(DNASTAR, USA)을 이용하여 시퀀스 정렬하여 분석하였으며, E1 세대 식물체에서 돌연변이 서열 분석 또한 위에 명시한 대로 진행되었다.
7. 바이러스 접종
바이러스 접종원 준비를 위해, -80℃에 냉동되어 보관된 TEV와 PepMov의 접종원은 병 스크리닝 10일 전 담배(Nicotiana benthamiana)에 접종하였다. 냉동 접종원은 pH 7.0의 0.1M potassium phosphate buffer와 400-grit 카보런덤(carborundum)과 함께 섞어 담배의 세 번째 잎에 문질러 접종하였다. 10-20분 경과 후 정수된 물을 이용해 잎의 잔여물을 씻어주었다(Hull., (2009) Curr. Protoc. Microbiol. 13(1), 16B.6.1-16B.6.4). 토마토 잎에 접종하기 위해, 한 쌍의 자엽 및 본엽에 접종하였으며, 접종 후 식물체는 16시간 광/8시간 암조건이 유지되는 생장상에서 유지되었다. 바이러스 감염을 보다 확실히 하기 위해, 최초 접종 7일 후 식물체에 바이러스를 다시 접종하였다.
8. 바이러스에 대한 저항성 평가
바이러스 접종 후, 증상의 발현을 정기적으로 관찰하였다. 바이러스 감염여부를 확인하기 위해 잎조직에서 실험을 진행하였는데, TEV 또는 PepMoW의 코트 단백질의 축적 수준을 double-antibody sandwich enzyme-linked immunosorbent assay (DAS-ELISA)을 제조사(Agdia, Inc. USA)의 지침에 따라 진행하여 분석하였다. 바이러스의 축적량을 확인하기 위해 접종 후 7일과 20일 후에 실험을 진행하였다. 각각 3개체의 E1에 바이러스를 접종한 것과 접종하지 않은 잎을 분석에 사용하였다. 마이크로플레이트 리더기(Anthon zenith 340 micro plate reader, UK)를 사용하여 405 nm에서 흡광도를 측정하고, 유의성은 Student's t-test로 분석하였다.
실시예 1. CRISPR/Cas9 시스템 구축
CRISPR/Cas9 시스템을 적용하여 유전자 교정 토마토를 개발하기 위해, Eukaryotic translation initiation factor 4E-1 (eIF4E1 GenBank : AY723733) 유전자를 목표로 선택하였다. eIF4E는 포티바이러스의 감염에 필수적인 진핵생물 번역 개시인자로 알려져 있다. 또한, 그 유전자의 돌연변이로 인해 포티바이러스에 저항성을 가질 수 있다. 토마토에서는 2개의 유전자(eIF4E1 및 eIF4E2)가 eIF4E 단백질을 인코딩하는 것으로 알려져 있다. gRNA를 설계하기 위해 CCTop - CRISPR/Cas9 온라인 예측 프로그램 (https://crispr.cos.uni-heidelberg.de/index.html)을 사용하여 예상효율이 높은 목표 유전자 대상 gRNA 서열을 선정하였으며 eIF4E1 유전자 코딩 영역의 첫 번째 엑손을 목표로 하는 gRNA를 제작하였다(도 1B). 표적 부위에서 생성된 돌연변이는 프레임시프트(frameshift) 또는 조기 종결 코돈을 유발하여 비기능 단백질을 생성할 가능성을 증가시킬 것으로 예상하여, ORF의 5' 영역을 표적으로 결정하였다. eIF4E1 유전자의 번역 시작 부위에서부터 +50에서 +68을 대상으로 하는 sgRNA를 설계하였다.
실시예 2. eIF4E1 형질전환 토마토 개발
eIF4E1 유전자 교정 토마토를 개발하기 위해, eIF4E1 표적 sgRNA가 삽입된 pHSE401-eIF4E1 컨스트럭트를 아그로박테리움을 통해 토마토 'Micro-Tom'으로 도입하였다. eIF4E1 표적 형질전환 절편들은 캘러스를 통해 재분화 되었으며, 캘러스에서 생성된 줄기는 줄기 신장 배지로 옮겨주었다. 신장된 줄기는 적절한 크기로 잘라서 뿌리 생성 배지로 옮겨주었으며, 뿌리가 생성된 개체들은 토양으로 옮겨 순화 과정을 거쳤다(도 2). 최종 22개의 재분화 식물체를 얻었으며, 삽입 유전자 특이적 프라이머를 이용한 PCR을 통해 유전자의 유무를 확인하였다(도 3). 22개체 중 17개체에서 Cas9과 Hpt 유전자 삽입을 확인하였으며, 77%의 형질전환 효율을 나타내었다(표 4).
eIF4E1 표적 유전자 교정 요약
재분화체 식물 수 형질전환체 식물 수 eIF4E1 유전자 돌연변이체 수
22 17 (77%) 16 (94%)
실시예 3. 돌연변이 검출
CRISPR/Cas9 매개 돌연변이를 확인하기 위해, 형질전환이 확인된 17개체의 gDNA에서 gRNA 표적 위치를 포함하는 프라이머를 통해 PCR을 수행하였으며, PCR 산물을 시퀀싱하였다. 그 결과, 17개체의 유전자 교정 추정 형질전환체 중 16개체에서 혼합된 형태의 염기서열 피크를 나타내었다(도 4B). 이러한 결과를 통해 Cas9과 gRNA에 의한 돌연변이가 표적 유전자 교정 부위에 형성되었을 것이며, 94.1%의 표적 유전자 교정 효율을 확인할 수 있었다(표 4).
eIF4E1 돌연변이체 중, E0-3과 E0-8 라인은 E1 형질전환체 구축을 위해 무작위로 선정되었다. 돌연변이 서열을 확인하기 위한 추가적인 시퀀싱을 E0-3 및 E0-8에서 수행하였으며, 표적 유전자 부위를 포함하는 PCR 산물을 클로닝하였으며, 각각의 클론을 시퀀싱하였다. E0-3의 PCR 산물이 나타내는 시퀀싱 결과에서 4개의 서로 다른 대립유전자를 발견하였으며, E0-8의 PCR 산물에서는 5개의 서로 다른 대립유전자를 확인할 수 있었다(도 5).
실시예 4. E1 세대 유전형 검사
E1 세대를 구축하기 위해 E0-3 및 E0-8 라인을 자가수분 하였으며, E1 세대의 잎 샘플에서 gDNA를 추출하였다. 삽입 유전자 특이적 프라이머(표 2)를 이용한 PCR을 통해 삽입 유전자의 유무를 판단하였다. E0-3 라인에서 유래한 19개체 중에서 13개체 (#1, 2, 3, 4, 9, 10, 12, 13, 15, 16, 17, 18, 19)에서 삽입 유전자를 확인할 수 있었다. 또한 E0-8 라인에서 유래한 7개체 중, 5개체 (#3, 4, 5, 6, 7)에서도 삽입 유전자를 확인할 수 있었다(도 6). E1 식물체의 서열변이를 확인하기 위해 E0-3과 E0-8 라인에서 유래한 E1 식물체에서 표적 유전자 부위를 증폭한 산물을 시퀀싱하였다. 그 결과, 동형접합성(homozygous) 돌연변이, 이중대립성(biallelic) 돌연변이 및 혼합성(chimeric) 돌연변이의 유전자 서열을 확인할 수 있었다(도 7).
E0-3과 E0-8 라인으로부터 유래된 E1 식물에서의 서열을 확인하고자 TA 클로닝을 진행해 서열을 확인하였다. 그 결과, E0-3으로부터 유래된 2개의 라인(E1 3-8 및 E1 3-17)은 43bp 결실에 대해 동형접합이었다. 또한, E1 3-11 라인은 43bp와 11bp의 결실을 가지고 있고, E1 3-9 및 3-15는 각각 29bp 결실 및 38bp의 반복 서열의 삽입이 확인되었다. 그리고 E-19 라인에서는 12bp, 13bp 및 15bp의 크기로 결실 돌연변이가 확인되었다(도 8). E0-8 식물로부터 유래된 3 개의 라인(E1 8-3, 8-5, 8-7)은 11bp, 43bp 및 29bp 결실 및 38bp의 반복 서열 삽입에 대해 동형접합성이었다(도 8). E1 8-1 라인은 43bp 및 29bp 결실, 및 38bp 반복 서열 삽입을 갖는 이중 대립형인 반면, E1 8-4 라인은 야생형 대립 유전자와 혼합된 형태를 보였다(도 8). E0 식물에서의 것과 상이한 E1 계통에서의 새로운 돌연변이 패턴의 존재는 활성 체세포 돌연변이가 E0 식물에서 발생하고 있음을 시사하였다. 특히, E1 3-8은 동형접합성으로 교정된 eIF4E1 유전자를 가지지만 T-DNA 삽입은 없었다. 전반적으로, 상이한 대립 형질 변이체를 운반하는 더 적은 비율의 혼합성(chimeric) 돌연변이체와 함께, E1 세대에서 몇몇 동형접합성 및 이중대립성 돌연변이 라인이 확인되었다(표 5).
CRISPR/Cas9에 의해 유도된 E1 라인의 eIF4E1 돌연변이
라인 세대 분석 돌연변이체 수 돌연변이 형태 식물체 수 비율
E1 3 E1 19 homozygous 7 36.8%
biallelic 8 42.1%
chimeric 4 21.0%
E1 8 E1 7 homozygous 4 57.1%
biallelic 2 28.5%
chimeric 1 14.2%
실시예 5. eIF4E1 이 교정된 식물체에서의 포티바이러스 저항성 스크리닝
본 발명에서 CRISPR/Cas9을 통해 eIF4E1 유전자가 교정된 돌연변이 토마토 식물체가 포티바이러스에 대해 저항성을 가지는지 확인하기 위해, TEV (Tobacco etch virus)와 PepMoV (Pepper mottle virus)를 사용하여 저항성을 검증하였다.
먼저, E1 3-8(동형접합성 라인) 및 E1 3-11(이중대립성 라인) 식물들에 TEV-HAT를 접종하였다. 바이러스 감염을 확인하기 위해, 바이러스를 접종하지 않은 상위 잎을 이용하여 DAS-ELISA 분석을 수행하였다. 그 결과, E1 3-8과 E1 3-11 개체에서 야생형과 비슷한 양의 외피 단백질이 축적되었으며, eIF4E1 돌연변이체들이 TEV-HAT에 이병성임을 확인했다(도 10A). 다음으로, PepMoV 바이러스를 접종하고, 바이러스를 접종하지 않은 상위 잎을 이용하여 DAS-ELISA를 수행하였다. 그 결과, 야생형에서는 접종한 잎과 접종하지 않은 상부잎에서 모두 외피 단백질이 높은 비율로 축적되는 것이 확인하였다. 반면에 3개의 유전자 교정 라인에서는 모두 PepMoV 외피 단백질이 축적되지 않아, eIF4E1 유전자 교정 식물체가 PepMoV에 저항성을 가지는 것을 확인할 수 있었다(도 10B). E2 세대를 이용한 결과에서도 유사한 경향의 결과가 확인되었다(도 11).
<110> Seoul National University R&DB Foundation REPUBLIC OF KOREA(MANAGEMENT : RURAL DEVELOPMENT ADMINISTRATION) <120> Method for producing genome-edited tomato plant with increased Potyvirus resistance by eIF4E1 gene editing and genome-edited tomato plant with increased Potyvirus resistance produced by the same method <130> PN20235 <160> 10 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 696 <212> DNA <213> Lycopersicon esculentum <400> 1 atggcagcag ctgaaatgga gagaacgatg tcgtttgatg cagctgagaa gttgaaggcc 60 gccgatggag gaggaggaga ggtagacgat gaacttgaag aaggtgaaat tgttgaagaa 120 tcaaatgata cggcatcgta tttagggaaa gaaatcacag tgaagcatcc attggagcat 180 tcatggactt tttggtttga taaccctacc actaaatctc gacaaactgc ttggggaagc 240 tcacttcgaa atgtctacac tttctccact gttgaagatt tttggggtgc ttacaataat 300 atccatcacc caagcaagtt aattatggga gcagactttc attgttttaa gcacaaaatt 360 gagccaaagt gggaagatcc tgtatgtgcc aatggaggga cgtggaaaat gagtttttcg 420 aagggtaaat ctgataccag ctggctgtat acgctgctgg caatgattgg acatcaattc 480 gatcatggag atgaaatttg tggagcagtt gttagtgtcc gggctaaggg agaaaaaata 540 gctttgtgga ccaagaatgc tgcaaatgaa acagctcagg ttagcattgg taagcaatgg 600 aagcagtttc tagattacag tgattcggtt ggcttcatat ttcacgacga tgcaaagagg 660 ctcgacagaa atgccaagaa tcgttacacc gtatag 696 <210> 2 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> gRNA target site <400> 2 agttgaaggc cgccgatgga gg 22 <210> 3 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 3 attgagttga aggccgccga tgg 23 <210> 4 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 4 aaacccatcg gcggccttca act 23 <210> 5 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 5 gcgaagaatc tcgtgctttc 20 <210> 6 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 6 caacgtgaca ccctgtgaac 20 <210> 7 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 7 atccaatctt cggcaacat 19 <210> 8 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 8 ttatccaggt catcgtcgta t 21 <210> 9 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 9 acactatggt ccaaacagtt cttat 25 <210> 10 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 10 aactgcttgg ggaagctcac 20

Claims (8)

  1. (a) 서열번호 2의 염기서열로 이루어진 토마토 유래 eIF4E1 (Eukaryotic translation initiation factor 4E-1) 유전자의 표적 염기서열에 특이적인 가이드 RNA(guide RNA)를 암호화하는 DNA 및 엔도뉴클레아제(endonuclease) 단백질을 토마토 식물세포에 도입하여 유전체를 교정하는 단계; 및
    (b) 상기 유전체가 교정된 토마토 식물세포로부터 토마토 식물을 재분화하는 단계;를 포함하는, 고추 모틀 바이러스(Pepper mottle virus) 저항성이 증가된 유전체 교정 토마토 식물체의 제조방법.
  2. 삭제
  3. 제1항에 있어서, 상기 (a) 단계의 가이드 RNA를 암호화하는 DNA 및 엔도뉴클레아제 단백질의 토마토 식물세포로의 도입은, 서열번호 2의 염기서열로 이루어진 토마토 유래 eIF4E1 유전자의 표적 염기서열에 특이적인 가이드 RNA를 암호화하는 DNA 및 엔도뉴클레아제 단백질을 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 재조합 벡터; 또는 서열번호 2의 염기서열로 이루어진 토마토 유래 eIF4E1 유전자의 표적 염기서열에 특이적인 가이드 RNA와 엔도뉴클레아제 단백질의 복합체;를 이용하는 것을 특징으로 하는 제조방법.
  4. 삭제
  5. 제1항 또는 제3항의 방법에 의해 제조된 고추 모틀 바이러스(Pepper mottle virus) 저항성이 증가된 유전체 교정 토마토 식물체.
  6. 제5항에 따른 식물체의 유전체가 교정된 종자.
  7. 서열번호 2의 염기서열로 이루어진 토마토 유래 eIF4E1 (Eukaryotic translation initiation factor 4E-1) 유전자의 표적 염기서열에 특이적인 가이드 RNA를 암호화하는 DNA 및 엔도뉴클레아제 단백질을 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 재조합 벡터; 또는 서열번호 2의 염기서열로 이루어진 토마토 유래 eIF4E1 유전자의 표적 염기서열에 특이적인 가이드 RNA와 엔도뉴클레아제 단백질의 복합체;를 유효성분으로 함유하는, 토마토 식물체의 고추 모틀 바이러스(Pepper mottle virus) 저항성을 증가시키기 위한 유전체 교정용 조성물.
  8. 삭제
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Florence Piron et al., An Induced Mutation in Tomato eIF4E Leads to Immunity to Two Potyviruses, 2010, PLoS ONE, vol. 5, no.6 (2010.06.25.)*
NCBI Reference Sequence, Solanum pennellii eukaryotic translation initiation factor 4E-1-like(LOC107015477), mRNA, ACCESSION no. XM_015215760 (2019.01.28.)*

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