KR102408985B1 - 식물체의 병 저항성을 조절하는 벼 유래의 OsMOR1a 유전자 및 이의 용도 - Google Patents

식물체의 병 저항성을 조절하는 벼 유래의 OsMOR1a 유전자 및 이의 용도 Download PDF

Info

Publication number
KR102408985B1
KR102408985B1 KR1020200058928A KR20200058928A KR102408985B1 KR 102408985 B1 KR102408985 B1 KR 102408985B1 KR 1020200058928 A KR1020200058928 A KR 1020200058928A KR 20200058928 A KR20200058928 A KR 20200058928A KR 102408985 B1 KR102408985 B1 KR 102408985B1
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
plant
osmor1a
rice
gene
resistance
Prior art date
Application number
KR1020200058928A
Other languages
English (en)
Other versions
KR20210142287A (ko
Inventor
이용환
김치열
Original Assignee
서울대학교산학협력단
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 서울대학교산학협력단 filed Critical 서울대학교산학협력단
Priority to KR1020200058928A priority Critical patent/KR102408985B1/ko
Publication of KR20210142287A publication Critical patent/KR20210142287A/ko
Application granted granted Critical
Publication of KR102408985B1 publication Critical patent/KR102408985B1/ko

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8201—Methods for introducing genetic material into plant cells, e.g. DNA, RNA, stable or transient incorporation, tissue culture methods adapted for transformation
    • C12N15/8202—Methods for introducing genetic material into plant cells, e.g. DNA, RNA, stable or transient incorporation, tissue culture methods adapted for transformation by biological means, e.g. cell mediated or natural vector
    • C12N15/8205—Agrobacterium mediated transformation
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01H—NEW PLANTS OR NON-TRANSGENIC PROCESSES FOR OBTAINING THEM; PLANT REPRODUCTION BY TISSUE CULTURE TECHNIQUES
    • A01H1/00—Processes for modifying genotypes ; Plants characterised by associated natural traits
    • A01H1/06—Processes for producing mutations, e.g. treatment with chemicals or with radiation
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01H—NEW PLANTS OR NON-TRANSGENIC PROCESSES FOR OBTAINING THEM; PLANT REPRODUCTION BY TISSUE CULTURE TECHNIQUES
    • A01H5/00—Angiosperms, i.e. flowering plants, characterised by their plant parts; Angiosperms characterised otherwise than by their botanic taxonomy
    • A01H5/10—Seeds
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/10—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA
    • C12N15/102—Mutagenizing nucleic acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8216—Methods for controlling, regulating or enhancing expression of transgenes in plant cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8241—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
    • C12N15/8261—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield
    • C12N15/8271—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance
    • C12N15/8279—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance for biotic stress resistance, pathogen resistance, disease resistance
    • C12N15/8281—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance for biotic stress resistance, pathogen resistance, disease resistance for bacterial resistance
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8241—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
    • C12N15/8261—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield
    • C12N15/8271—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance
    • C12N15/8279—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance for biotic stress resistance, pathogen resistance, disease resistance
    • C12N15/8282—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance for biotic stress resistance, pathogen resistance, disease resistance for fungal resistance
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/16—Hydrolases (3) acting on ester bonds (3.1)
    • C12N9/22—Ribonucleases RNAses, DNAses
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/10—Type of nucleic acid
    • C12N2310/20—Type of nucleic acid involving clustered regularly interspaced short palindromic repeats [CRISPRs]

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Botany (AREA)
  • Developmental Biology & Embryology (AREA)
  • Environmental Sciences (AREA)
  • Crystallography & Structural Chemistry (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Physiology (AREA)
  • Breeding Of Plants And Reproduction By Means Of Culturing (AREA)

Abstract

본 발명은 식물체의 병 저항성을 조절하는 벼 유래의 OsMOR1a (Oryza sativa Magnaporthe oryzae resistance 1a) 유전자 및 이의 용도에 관한 것으로, 본 발명에 따른 OsMOR1a 유전자는 반활물기생 또는 사물기생 병원균에 대해 양면적인(ambivalent) 기능을 가지는 유전자로, 벼의 생산성 및 기능성 향상을 위한 생명공학기술에 다양하게 활용가능할 것으로 기대된다.

Description

식물체의 병 저항성을 조절하는 벼 유래의 OsMOR1a 유전자 및 이의 용도{OsMOR1a gene from Oryza sativa regulating disease resistance of plant and uses thereof}
본 발명은 식물체의 병 저항성을 조절하는 벼 유래의 OsMOR1a (Oryza sativa Magnaporthe oryzae resistance 1a) 유전자 및 이의 용도에 관한 것이다.
식물체는 다양한 병원균에 맞닥뜨리지만, PAMP 유도 면역 (PTI, pathogen-associated molecular pattern(PAMP)-triggered immunity) 및 이펙터 유도 면역 (ETI, effector-triggered immunity)을 포함하는 식물체의 방어 기작을 피하거나 억제할 수 있는 전략을 가진 일부 병원균에 대해서 감수성을 나타낸다. PTI는 대부분의 잠재적인 병원균에 대항하는 중요한 방어 기전이지만, ETI는 PTI를 극복하는 전략으로 진화된 병원균 종의 특별한 레이스(race; 기주의 범위가 다른 한 병원균의 분화형 또는 변종 중에서 기주의 품종에 대한 기생성이 다른 것)에 대한 저항성을 부여한다. 작물 보호를 위한 합성 제초제의 높은 의존도에 관한 사회적 관심이 급증되고 있기 때문에, ETI에 속하는 저항성 유전자(R gene)를 육종을 통해 효율적으로 사용하는 방법과, 질병 감수성을 부여하는 유전자 (감수성 유전자, S gene)를 유전자 편집을 통해 변형시키는 방법이 지속가능하게 생산되는 작물에서 중요한 역할을 할 수 있을 것이다. 그러나, 육종에 사용된 R 유전자들을 압도하는 새로운 병원균 레이스가 출현하고, 일부 유전자들이 방어 기전에서 양면적인(ambivalent) 기능을 하는 것으로 나타나, 저항성 품종의 개량/공학 기술은 병원균의 다양성과 변이 그리고 다른 생활사를 가진 병원균에 대한 면역-연관 유전자의 기능에 대한 종합적인 이해가 전제되어야 한다. 예컨대, 활물기생균(biotroph)에 대해서는 효과적인 식물체의 방어 반응도 사물기생균(necrotrophs)에 대해서는 약한 방어능을 보이기 때문에, 병의 발생 기작(mechanism)에 기반하여 방어 반응을 조절하는 식물체의 특징을 이해하는 것이 중요하다.
도열병균 (Magnaporthe oryzae)에 의해 발생하는 벼 도열병은 매년 전 세계적으로 벼 생산량의 10-30% 손실을 야기시키는 가장 파괴적인 벼 질병이다. 도열병균은 분생포자(conidia) 발아 후 발아관 정단에 부착기(appressoria)가 분화하면서 형성되는 침입관(penetrating peg)을 통해 벼 잎에 감염을 시작한다. 침입 초기의 활물기생(biotrophic) 단계 동안 도열병균은 침입 균사를 형성하며 기주의 세포막에 둘러싸인채 성장한다. 반활물기생(hemibiotrophic) 병원균인 도열병균은 감염 후기에 침입 균사의 지속적인 성장으로 식물을 죽이며 도열병 병반(blast lesion)은 일반적으로 감염 7일 이내에 가시적으로 볼 수 있다. 벼 흰잎마름병균 (Xanthomonas oryzae pv. oryzae; Xoo)에 의해 발생하는 세균성 흰잎마름병(leaf blight)은 전 세계적으로 대부분의 벼 재배 국가들에서 벼 수확량 손실을 심각하게 발생시키는 벼 질병 중의 하나이다. 흰잎마름병균은 상처나 배수조직(hydathodes)을 통해서 식물체로 침입하여 피복조직에서 증식하고 물관에 침투한다.
한편, 한국등록특허 제1571067호에는 '벼 유래 OsWRKY67 유전자를 이용한 식물의 병 저항성을 증가시키는 방법 및 그에 따른 식물체'가 개시되어 있고, 한국등록특허 제1958668호에는 '벼 유래 OsSUS4 유전자를 이용한 도열병 저항성이 조절된 형질전환 식물체의 제조방법 및 그에 따른 식물체'가 개시되어 있으나, 본 발명의 식물체의 병 저항성을 조절하는 벼 유래의 OsMOR1a 유전자 및 이의 용도에 대해서는 기재된 바가 없다.
본 발명은 상기와 같은 요구에 의해 도출된 것으로서, 본 발명자는 도열병균에 저항성을 보이는 애기장대 유전자(AtMOR1)와 상동성을 보이는 벼 유전자를 동정하였고, 이 중 도열병균 감염 시 병원체의 활물기생 단계에서 발현 유도되는 유전자 중 OsMOR1a를 표적으로 하여 CRISPR/Cas9 시스템을 적용하여 상기 유전자의 동형접항성 돌연변이체(osmor1a)를 제작하였다. 그 후, 상기 osmor1a 돌연변이체의 병 저항성을 반활물기생(hemibiotrophic) 진균인 도열병균 및 반활물기생 세균인 흰잎마름병균 그리고, 사물기생(necrotrophic) 진균인 깨씨무늬병균 (Cochliobolus miyabeanus)을 이용하여 분석한 결과, osmor1a 돌연변이체는 야생형에 비해 도열병균과 흰잎마름병균에 대해서는 병 저항성이 증진되고, 깨씨무늬병균에 대해서는 병 감수성이 증가되어 OsMOR1a 유전자가 식물체의 병 저항성과 관련하여 양면적인(ambivalent) 기능으로 작용하는 것을 확인함으로써, 본 발명을 완성하였다.
상기 과제를 해결하기 위해, 본 발명은 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 벼 유래 OsMOR1a (Oryza sativa Magnaporthe oryzae resistance 1a) 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는 재조합 벡터로 식물세포를 형질전환시키는 단계를 포함하는 식물체의 식물병 저항성을 조절하는 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 벼 유래 OsMOR1a 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는 재조합 벡터로 식물세포를 형질전환하는 단계; 및 상기 형질전환된 식물세포로부터 식물을 재분화하는 단계;를 포함하는 식물병 저항성이 조절된 형질전환 식물체의 제조방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 벼 유래 OsMOR1a 유전자의 표적 염기서열에 특이적인 가이드 RNA(guide RNA)를 암호화하는 폴리뉴클레오티드 서열 및 엔도뉴클레아제(endonuclease) 단백질을 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 재조합 벡터를 벼 식물세포에 도입하여 유전체를 교정하는 단계; 및 상기 유전체가 교정된 벼 식물세포로부터 벼 식물체를 재분화하는 단계;를 포함하는, 식물병에 대한 저항성이 증가된 유전체 교정 벼 식물체의 제조방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 방법에 의해 제조된 식물병에 대한 저항성이 증가된 유전체 교정 벼 식물체 및 상기 식물체의 유전체가 교정된 종자를 제공한다.
또한, 본 발명은 벼 유래 OsMOR1a 유전자의 표적 염기서열에 특이적인 가이드 RNA를 암호화하는 폴리뉴클레오티드 서열 및 엔도뉴클레아제 단백질을 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 재조합 벡터를 유효성분으로 함유하는, 벼 식물체의 식물병 저항성을 증진시키기 위한 유전체 교정용 조성물을 제공한다.
열성 저항성은 병원체가 생존을 위해 필요로 하는 기주 유전자가 결여되거나 상호작용이 억제되었을 때 나타난다. 기존의 우성 저항성을 매개하는 R 유전자들을 이용한 전통적인 교배 육종을 통한 병저항성 품종 개발은 특이적 반응을 통해 대상 병원체에 대해 강한 저항성을 유발하지만, R-Avr (avirulence) 유전자의 상호작용의 특이성에 따라 병원체 인식의 스펙트럼이 좁고, 돌연변이가 빠르게 발생하는 병원체의 경우에 쉽게 저항성이 무너질 수 있다는 단점이 있다. 하지만, 본 발명의 OsMOR1a (Oryza sativa Magnaporthe oryzae resistance 1a) 유전자와 같은 열성 저항성은 우성 저항성보다 강하게 작용하며 다소 넓은 특이성으로 돌연변이 발생에 의한 저항성이 쉽게 무너지지 않는 장점이 있다. 따라서, 본 발명의 OsMOR1a 유전자는 벼의 생산성 및 기능성 향상을 위한 생명공학기술에 적용 가능하며, 산업적인 면에서 고부가가치를 창출할 수 있다.
도 1은 애기장대 mor1 돌연변이체의 특성을 보여주는 것으로, (a)는 T-DNA 삽입 위치를 보여주는 것이고, (b)는 도열병균 균주 70-15에 저항성을 보이는 애기장대 Ws-0 식물체와 mor1 돌연변이체에서 MOR1 전사체 발현 수준을 확인한 것이다.
도 2는 애기장대 mor1 돌연변이체의 도열병균 (Magnaporthe oryzae) 및 검은무늬병균 (Alternaria brassicicola)에 대한 증가된 병 감수성을 보여주는 것으로, (a)는 도열병균 70-15 균주 감염 6일 후의 Ws-0(top)와 mor1 돌연변이체(bottom)의 표현형을 보여주는 사진이며, (b)는 70-15 균주의 배양 여액을 감염시킨 후 3일째의 Ws-0와 mor1 돌연변이체의 잎 사진(top row)과 동일 잎의 Evans blue 염색 사진(bottom row)이다. (c)는 검은무늬병균 감염 5일 후의 Ws-0와 mor1 돌연변이체의 잎 사진, 감염 3일 후의 병반의 평균 너비 및 감염 8일 후의 병반에서 생산되는 포자의 수를 정량화한 그래프이다.
도 3은 애기장대 MOR1 유전자에 대한 유전적 상보성(complementation) 어세이 수행 결과로, 전체 MOR1 부위 및 그의 프로모터를 포함하는 전이유전자가 1 카피 도입된 C2-5 식물체에서 mor1 식물체의 도열병 저항성 손실이 완전하게 복구된 것을 확인할 수 있다.
도 4는 Ws-0 및 mor1 돌연변이체에 Pseudomonas syringae pv. tomato (Pst) DC3000를 106 cfu/㎖로 감염시킨 뒤, 6, 12, 24 및 48시간 뒤 세균 수를 분석한 결과이다. Pst에 대해서 Ws-0와 mor1 돌연변이체의 저항성 차이가 없음을 알 수 있다.
도 5는 Ws-0 및 mor1 돌연변이체에서 살리실산 관련 및 자스몬산 연관 유전자의 발현을 확인한 qRT-PCR 결과로, (a)와 (b)는 Ws-0에 비해 mor1 돌연변이체에서 각각 상향 또는 하향된 유전자이다.
도 6은 도열병균 감염 동안에 OsMOR1 유전자들의 발현 패턴을 확인한 결과이다.
도 7은 OsMOR1a 및 OsMOR1d 유전자의 모식도와 CRISPR/Cas9 시스템에 사용된 gRNA 서열 및 osmor1a 및 osmor1d 돌연변이체의 유전형 결과이다. OsMOR1a 유전자는 다섯번째 엑손을, OsMOR1d 유전자는 세번째 엑손을 각각 표적으로 gRNA를 고안하였으며, Wild-type으로 표시된 서열이 gRNA의 표적 서열이고, osmor1a 및 osmor1d로 표시된 서열이 돌연변이체에서 gRNA의 표적 서열 부위 시퀀싱 결과이다.
도 8은 병원체의 생활사에 따른 OsMOR1a의 ambivalent immunity를 보여주는 것으로, (a)는 동진벼, osmor1a 및 osmor1d에 대해 도열병 균주인 PO6-6를 분사 방식으로 감염시킨 후 11일 후의 모습이고, (b)는 동진벼, osmor1a 및 osmor1d의 상처를 입힌 잎에 포자 현탁액을 떨어 뜨리는 방식으로 감염시킨 후 10일 후의 병반의 모습 및 병반 수를 정량화한 그래프이다. (c)는 벼의 잎집에 도열병균을 접종하여 활물기생 시기의 표현형을 광학현미경으로 관찰한 결과이고 (스케일 바 = 20 μm), (d)는 벼 흰잎마름병균에 감염된 동진벼 및 osmor1a 돌연변이체의 접종 후 14일 째 사진 및 병반의 길이를 정량화한 그래프로, 빨간색 별표는 병반의 끝을 나타내며, (e)는 벼 깨씨무늬병 균주 Cm36을 접종한 후 4일 째의 동진벼 및 osmor1a 돌연변이체의 대표적인 잎을 관찰한 사진과, 두 번째와 세 번째 잎의 평균 병반 수를 정량화한 그래프이다. (b)와 (e)의 *는 각각 p < 0.0001 및 p < 0.01을 의미한다.
본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 벼 유래 OsMOR1a (Oryza sativa Magnaporthe oryzae resistance 1a) 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는 재조합 벡터로 식물세포를 형질전환시키는 단계를 포함하는 식물체의 식물병 저항성을 조절하는 방법을 제공한다.
본 발명의 방법에 있어서, 상기 OsMOR1a 단백질의 범위는 서열번호 2의 아미노산 서열번호를 갖는 단백질 및 상기 단백질의 기능적 동등물을 포함한다. "기능적 동등물"이란 아미노산의 부가, 치환 또는 결실의 결과, 상기 서열번호 2의 아미노산 서열과 적어도 70% 이상, 바람직하게는 80% 이상, 더욱 바람직하게는 90% 이상, 더 더욱 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 갖는 것으로, 서열번호 2의 아미노산 서열번호를 갖는 단백질과 실질적으로 동질의 생리활성을 나타내는 단백질을 말한다. "실질적으로 동질의 생리활성"이란 식물체의 식물병 저항성을 조절하는 활성을 의미한다.
또한, 상기 OsMOR1a 단백질을 코딩하는 유전자는 게놈 DNA와 cDNA를 모두 포함한다. 바람직하게는, 본 발명의 OsMOR1a 유전자는 서열번호 1로 표시되는 염기서열을 포함할 수 있다. 또한, 상기 염기서열의 상동체가 본 발명의 범위 내에 포함된다. 구체적으로, 상기 유전자는 서열번호 1의 염기서열과 70% 이상, 더욱 바람직하게는 80% 이상, 더 더욱 바람직하게는 90% 이상, 가장 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 가지는 염기서열을 포함할 수 있다. 폴리뉴클레오티드에 대한 "서열 상동성의 %"는 두 개의 최적으로 배열된 서열과 비교 영역을 비교함으로써 확인되며, 비교 영역에서의 폴리뉴클레오티드 서열의 일부는 두 서열의 최적 배열에 대한 참고 서열(추가 또는 삭제를 포함하지 않음)에 비해 추가 또는 삭제(즉, 갭)를 포함할 수 있다.
본 발명의 일 구현 예에 따른 방법은, 상기 OsMOR1a 단백질을 코딩하는 유전자의 발현을 식물세포에서 저해시켜 야생형에 비해 식물체의 식물병 저항성을 증가시키는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
또한, 본 발명에 따른 방법에 있어서, 상기 식물병은 반활물기생(hemibiotrophic) 병원균에 의해 유발되는 식물병일 수 있고, 바람직하게는 도열병균 (Magnaporthe oryzae) 또는 흰잎마름병균 (Xanthomonas oryzae pv. oryzae)에 의해 유발되는 식물병일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
용어 "재조합"은 세포가 이종의 핵산을 복제하거나, 상기 핵산을 발현하거나 또는 펩티드, 이종의 펩티드 또는 이종의 핵산에 의해 코딩된 단백질을 발현하는 세포를 지칭하는 것이다. 재조합 세포는 상기 세포의 천연 형태에서는 발견되지 않는 유전자 또는 유전자 절편을, 센스 또는 안티센스 형태 중 하나로 발현할 수 있다. 또한 재조합 세포는 천연 상태의 세포에서 발견되는 유전자를 발현할 수 있으며, 그러나 상기 유전자는 변형된 것으로서 인위적인 수단에 의해 세포 내 재도입된 것이다.
용어 "벡터"는 세포 내로 전달하는 DNA 단편(들), 핵산 분자를 지칭할 때 사용된다. 벡터는 DNA를 복제시키고, 숙주세포에서 독립적으로 재생산될 수 있다. 용어 "전달체"는 흔히 "벡터"와 호환하여 사용된다. 용어 "발현 벡터"는 목적한 코딩 서열과, 특정 숙주 생물에서 작동가능하게 연결된 코딩 서열을 발현하는데 필수적인 적정 핵산 서열을 포함하는 재조합 DNA 분자를 의미한다.
본 발명의 벡터는 전형적으로 클로닝 또는 발현을 위한 벡터로서 구축될 수 있다. 또한, 본 발명의 벡터는 원핵 세포 또는 진핵 세포를 숙주로 하여 구축될 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 벡터가 발현 벡터이고, 원핵 세포를 숙주로 하는 경우에는, 전사를 진행시킬 수 있는 강력한 프로모터 (예컨대, pLλ프로모터, trp 프로모터, lac 프로모터, T7 프로모터, tac 프로모터 등), 해독의 개시를 위한 리보좀 결합 자리 및 전사/해독 종결 서열을 포함하는 것이 일반적이다. 숙주 세포로서 대장균(Escherichia coli)이 이용되는 경우, E. coli 트립토판 생합성 경로의 프로모터 및 오퍼레이터 부위, 그리고 파아지 λ의 좌향 프로모터 (pLλ프로모터)가 조절 부위로서 이용될 수 있다.
한편, 본 발명에 이용될 수 있는 벡터는 당업계에서 종종 사용되는 플라스미드 (예: pSC101, ColE1, pBR322, pUC8/9, pHC79, pGEX 시리즈, pET 시리즈 및 pUC19 등), 파지 (예: λgt4-λB, λ-Charon, λΔz1 및 M13 등) 또는 바이러스 (예: SV40 등)를 조작하여 제작될 수 있다.
한편, 본 발명의 벡터가 발현 벡터이고, 진핵 세포를 숙주로 하는 경우에는, 포유동물 세포의 게놈으로부터 유래된 프로모터 (예: 메탈로티오닌 프로모터) 또는 포유동물 바이러스로부터 유래된 프로모터 (예: 아데노바이러스 후기 프로모터, 백시니아 바이러스 7.5K 프로모터, SV40 프로모터, 사이토메갈로바이러스 프로모터 및 HSV의 tk 프로모터)가 이용될 수 있으며, 전사 종결 서열로서 폴리아데닐화 서열을 일반적으로 갖는다.
발현 벡터는 바람직하게는 하나 이상의 선택성 마커를 포함한다. 상기 마커는 통상적으로 화학적인 방법으로 선택될 수 있는 특성을 갖는 핵산 서열로, 형질전환된 세포를 비형질전환 세포로부터 구별할 수 있는 모든 유전자가 이에 해당된다. 그 예로는 글리포세이트(glyphosate) 또는 포스피노트리신(포스피노트리신)과 같은 제초제 저항성 유전자, 카나마이신, G418, 블레오마이신(Bleomycin), 하이그로마이신(hygromycin), 클로람페니콜(chloramphenicol)과 같은 항생제 내성 유전자가 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
상기 재조합 벡터는 바람직하게는 재조합 식물 발현 벡터이다.
식물 발현 벡터의 바람직한 예는 아그로박테리움 튜머파시엔스 (Agrobacterium tumefaciens)와 같은 적당한 숙주에 존재할 때 그 자체의 일부, 소위 T-영역을 식물 세포로 전이시킬 수 있는 Ti-플라스미드 벡터이다. 다른 유형의 Ti-플라스미드 벡터 (EP 0 116 718 B1호 참조)는 현재 식물 세포, 또는 잡종 DNA를 식물의 게놈 내에 적당하게 삽입시키는 새로운 식물이 생산될 수 있는 원형질체로 잡종 DNA 서열을 전이시키는데 이용되고 있다. Ti플라스미드 벡터의 특히 바람직한 형태는 EP 0 120 516 B1호 및 미국 특허 제4,940,838호에 청구된 바와 같은 소위 바이너리(binary) 벡터이다. 본 발명에 따른 DNA를 식물 숙주에 도입시키는데 이용될 수 있는 다른 적합한 벡터는 이중 가닥 식물 바이러스 (예를 들면, CaMV) 및 단일 가닥 바이러스, 게미니 바이러스 등으로부터 유래될 수 있는 것과 같은 바이러스 벡터, 예를 들면 비완전성 식물 바이러스 벡터로부터 선택될 수 있다. 그러한 벡터의 사용은 특히 식물 숙주를 적당하게 형질전환하는 것이 어려울 때 유리할 수 있다.
본 발명에 따른 식물 발현 벡터에서, 프로모터는 CaMV 35S, 액틴, 유비퀴틴, pEMU, MAS 또는 히스톤 프로모터일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. "프로모터"란 용어는 구조 유전자로부터의 DNA 업스트림의 영역을 의미하며 전사를 개시하기 위하여 RNA 폴리머라아제가 결합하는 DNA 분자를 말한다. "식물 프로모터"는 식물 세포에서 전사를 개시할 수 있는 프로모터이다. "구성적(constitutive) 프로모터"는 대부분의 환경 조건 및 발달 상태 또는 세포 분화하에서 활성이 있는 프로모터이다. 형질전환체의 선택이 각종 단계에서 각종 조직에 의해서 이루어질 수 있기 때문에 구성적 프로모터가 본 발명에서 바람직할 수 있다. 따라서, 구성적 프로모터는 선택 가능성을 제한하지 않는다.
본 발명에 따른 식물 발현 벡터에서, 터미네이터는 통상의 터미네이터를 사용할 수 있으며, 그 예로는 노팔린합성효소(nopaline synthase, NOS), 벼 α-아밀라아제 RAmy1 A 터미네이터, 파세올린(phaseoline) 터미네이터, 아그로박테리움 튜머파시엔스의 옥토파인(Octopine) 유전자의 터미네이터 등이 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
또한, 본 발명의 벡터를 진핵세포에 형질전환시키는 경우에는 숙주세포로서, 효모 (예컨대, Saccharomyce cerevisiae), 곤충세포, 사람세포 (예컨대, CHO 세포주(Chinese hamster ovary), W138, BHK, COS-7, 293, HepG2, 3T3, RIN 및 MDCK 세포주) 및 식물세포 등이 이용될 수 있으며, 바람직하게는 식물세포이다.
본 발명의 벡터를 숙주세포 내로 운반하는 방법은, 숙주세포가 원핵세포인 경우, CaCl2 방법, 하나한 방법 (Hanahan, D., J. Mol. Biol., 166:557-580(1983)) 및 전기천공 방법 등에 의해 실시될 수 있다. 또한, 숙주세포가 진핵세포인 경우에는, 미세주입법, 칼슘포스페이트 침전법, 전기천공법, 리포좀-매개 형질감염법, DEAE-덱스트란 처리법, 및 유전자 밤바드먼트 등에 의해 벡터를 숙주세포 내로 주입할 수 있다.
본 발명은 또한,
서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 벼 유래 OsMOR1a (Oryza sativa Magnaporthe oryzae resistance 1a) 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는 재조합 벡터로 식물세포를 형질전환하는 단계; 및
상기 형질전환된 식물세포로부터 식물을 재분화하는 단계;를 포함하는 식물병 저항성이 조절된 형질전환 식물체의 제조방법을 제공한다.
본 발명에 따른 식물병 저항성이 조절된 형질전환 식물체의 제조방법은, 상기 OsMOR1a 단백질을 코딩하는 유전자의 발현을 식물세포에서 저해시켜 야생형에 비해 식물병 저항성이 증가된 식물체를 제조하는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
식물의 형질전환은 DNA를 식물에 전이시키는 임의의 방법을 의미한다. 그러한 형질전환 방법은 반드시 재생 및(또는) 조직 배양 기간을 가질 필요는 없다. 식물 종의 형질전환은 이제는 쌍자엽 식물뿐만 아니라 단자엽 식물 양자를 포함한 식물 종에 대해 일반적이다. 원칙적으로, 임의의 형질전환 방법은 본 발명에 따른 잡종 DNA를 적당한 선조 세포로 도입시키는데 이용될 수 있다. 방법은 원형질체에 대한 칼슘/폴리에틸렌 글리콜 방법(Krens et al., 1982, Nature 296: 72-74; Negrutiu et al., 1987, Plant Mol. Biol. 8: 363-373), 원형질체의 전기천공법(Shillito et al., 1985, Bio/Technol. 3: 1099-1102), 식물 요소로의 현미주사법(Crossway et al., 1986, Mol. Gen. Genet. 202: 179-185), 각종 식물 요소의(DNA 또는 RNA-코팅된) 입자 충격법(Klein et al., 1987, Nature 327: 70), 아그로박테리움 튜메파시엔스(Agrobacterium tumefaciens) 매개된 유전자 전이에서(비완전성) 바이러스에 의한 감염(EP 0 301 316호) 등으로부터 적당하게 선택될 수 있다. 본 발명에 따른 바람직한 방법은 아그로박테리움 매개된 DNA 전달을 포함한다. 특히 바람직한 것은 EP A 120 516호 및 미국 특허 제4,940,838호에 기재된 바와 같은 소위 이원 벡터 기술을 이용하는 것이다.
식물의 형질전환에 이용되는 "식물세포"는 어떤 식물세포도 된다. 식물세포는 배양 세포, 배양 조직, 배양 기관 또는 전체 식물, 바람직하게는 배양 세포, 배양 조직 또는 배양 기관 및 더욱 바람직하게는 배양 세포의 어떤 형태도 된다. "식물 조직"은 분화된 또는 미분화된 식물의 조직, 예를 들면 이에 한정되진 않으나, 열매, 줄기, 잎, 꽃가루, 종자, 암 조직 및 배양에 이용되는 다양한 형태의 세포들, 즉 단일 세포, 원형질체(protoplast), 싹 및 캘러스 조직을 포함한다. 식물 조직은 인 플란타(in planta)이거나 기관 배양, 조직 배양 또는 세포 배양 상태일 수 있다.
본 발명의 식물병 저항성이 조절된 형질전환 식물체의 제조방법은 형질전환된 식물세포로부터 형질전환 식물을 재분화하는 단계를 포함한다. 형질전환 식물세포로부터 형질전환 식물을 재분화하는 방법은 당업계에 공지된 임의의 방법을 이용할 수 있다.
본 발명은 또한,
벼 유래 OsMOR1a (Oryza sativa Magnaporthe oryzae resistance 1a) 유전자의 표적 염기서열에 특이적인 가이드 RNA(guide RNA)를 암호화하는 폴리뉴클레오티드 서열 및 엔도뉴클레아제(endonuclease) 단백질을 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 재조합 벡터를 벼 식물세포에 도입하여 유전체를 교정하는 단계; 및
상기 유전체가 교정된 벼 식물세포로부터 벼 식물체를 재분화하는 단계;를 포함하는, 식물병에 대한 저항성이 증가된 유전체 교정 벼 식물체의 제조방법을 제공한다.
본 발명의 일 구현 예에 따른 유전체 교정 벼 식물체의 제조방법에 있어서, 상기 벼 유래 OsMOR1a 유전자는 서열번호 1의 염기서열로 이루어진 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않으며, 그 범위는 전술한 것과 같다.
또한, 본 발명의 일 구현 예에 따른 유전체 교정 벼 식물체의 제조방법에 있어서, 가이드 RNA(guide RNA)는 OsMOR1a 유전자의 표적 염기서열에 특이적으로 고안된 것으로, 상기 OsMOR1a 유전자의 표적 염기서열은 바람직하게는 서열번호 3의 염기서열로 이루어진 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 즉, 본 발명에 따른 표적 염기서열에 특이적인 가이드 RNA가 표적하는 OsMOR1a 유전자 내 위치가 서열번호 3의 염기서열인 것이다.
용어 "유전체/유전자 교정(genome/gene editing)"은, 인간 세포를 비롯한 동·식물 세포의 유전체 염기서열에 표적지향형 변이를 도입할 수 있는 기술로서, DNA 절단에 의한 하나 이상의 핵산 분자의 결실, 삽입, 치환 등에 의하여 특정 유전자를 녹-아웃(knock-out) 또는 녹-인(knock-in)하거나, 단백질을 생성하지 않는 비-코딩 DNA 서열에도 변이를 도입할 수 있는 기술을 말한다. 본 발명의 목적상 상기 유전체 교정은 특히 엔도뉴클레아제(endonuclease) 예컨대, Cas9 단백질 및 가이드 RNA를 이용하여 식물체에 변이를 도입하는 것일 수 있다.
용어 "표적 유전자"는 본 발명을 통해 교정하고자 하는 식물체의 유전체 내에 있는 일부 DNA를 의미한다. 즉, 원칙적으로 그 유전자의 종류에 제한되지 않으며, 코딩 영역 및 비-코딩(non-coding) 영역을 모두 포함할 수 있다. 당업자는 그 목적에 따라, 제조하고자 하는 유전체 교정 식물체에 대하여 원하는 변이에 따라 상기 표적 유전자를 선별할 수 있다.
용어 "가이드 RNA(guide RNA)"는 표적 유전자의 염기서열을 암호화하는 DNA에 특이적인 RNA를 의미하며, 표적 DNA 염기서열과 전부 또는 일부가 상보적으로 결합하여 해당 표적 DNA 염기서열로 엔도뉴클레아제 단백질을 이끄는 역할을 하는 리보핵산을 의미한다. 상기 가이드 RNA는 두 개의 RNA, 즉, crRNA(CRISPR RNA) 및 tracrRNA(trans-activating crRNA)를 구성 요소로 포함하는 이중 RNA(dual RNA); 또는 표적 DNA 내 염기서열과 전부 또는 일부 상보적인 서열을 포함하는 제1 부위 및 RNA-가이드 뉴클레아제와 상호작용하는 서열을 포함하는 제2 부위를 포함하는 단일 사슬 가이드 RNA(sgRNA) 형태를 말하나, RNA-가이드 뉴클레아제가 표적 염기서열에서 활성을 가질 수 있는 형태라면 제한 없이 본 발명의 범위에 포함될 수 있다. 본 발명에 따른 가이드 RNA는 바람직하게는, 단일 가닥 가이드 RNA 형태일 수 있으나, 이에 제한되지 않으며, 사용된 엔도뉴클레아제의 종류 또는 엔도뉴클레아제의 유래 미생물 등에 당업계의 공지된 기술에 따라서 적절히 선택할 수 있다.
또한, 상기 가이드 RNA는 플라스미드 주형으로부터 전사된 것 또는 생체 외(in vitro)에서 전사된(transcribed) 것(예컨대, 올리고뉴클레오티드 이중가닥)일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 일 구현 예에 따른 유전체 교정 벼 식물체의 제조방법에 있어서, 상기 엔도뉴클레아제 단백질은 Cas9(CRISPR associated protein 9), Cpf1(CRISPR from Prevotella and Francisella 1), TALEN(Transcription activator-like effector nuclease), ZFN(Zinc Finger Nuclease) 또는 이의 기능적 유사체로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상일 수 있고, 바람직하게는 Cas9 단백질일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
Cas9 단백질 또는 유전자 정보는 NCBI(National Center for Biotechnology Information)의 GenBank와 같은 공지의 데이터베이스에서 얻을 수 있다. 예컨대, 상기 Cas9 단백질은 스트렙토코커스 피요제네스 (Streptococcus pyogenes) 유래의 Cas9 단백질, 캠필로박터 제주니 (Campylobacter jejuni) 유래의 Cas9 단백질, 스트렙토코커스 써모필러스 (Streptococcus thermophilus) 또는 스트렙토코커스 아우레우스 (Streptocuccus aureus) 유래의 Cas9 단백질, 네이쎄리아 메닝기티디스 (Neisseria meningitidis) 유래의 Cas9 단백질, 파스투렐라 물토시다 (Pasteurella multocida) 유래의 Cas9 단백질, 프란시셀라 노비시다 (Francisella novicida) 유래의 Cas9 단백질 등으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
Cas9 단백질은 RNA-guided DNA 엔도뉴클레아제 효소로, 이중 가닥 DNA 절단(double stranded DNA break)을 유도한다. Cas9 단백질이 정확하게 표적 DNA의 염기서열에 결합하여 DNA 가닥을 잘라내기 위해서는 PAM(Protospacer Adjacent Motif)이라 알려진 3개의 염기로 이루어진 짧은 염기서열이 표적 DNA의 염기서열 옆에 존재해야 하며, Cas9 단백질은 PAM 서열(NGG)로부터 3번째와 4번째 염기쌍 사이를 추정하여 절단한다.
본 발명의 일 구현 예에 따른 유전체 교정 벼 식물체의 제조방법에 있어서, 상기 가이드 RNA와 엔도뉴클레아제 단백질은 도입된 세포 내에서 리보핵산-단백질(ribonucleoprotein) 복합체를 형성하여 RNA 유전자 가위(RNA-Guided Engineered Nuclease, RGEN)로 작동한다.
본 발명에서 사용된 CRISPR/Cas9 시스템은 교정하고자 하는 특정 유전자의 특정위치에 이중나선 절단을 도입하여 DNA 수선 과정에서 유도되는 불완전 수선에 의한 삽입-결실(insertion-deletion, InDel) 돌연변이를 유도시키는 NHEJ(non-homologous end joining) 기작에 의한 유전자 교정 방법이다.
본 발명에 따른 유전체 교정 벼 식물체의 제조방법에 있어서, 상기 가이드 RNA와 엔도뉴클레아제 단백질의 복합체를 식물세포에 형질도입하는 방법은 전술한 식물의 형질전환 방법과 같다.
본 발명의 유전체 교정 벼 식물체의 제조방법에 있어서, 유전체가 교정된 식물세포로부터 유전체가 교정된 식물을 재분화하는 방법은 당업계에 공지된 임의의 방법을 이용할 수 있다. 캘러스 또는 원형질체 배양으로부터 성숙한 식물의 재분화를 위한 기술은 수많은 여러 가지 종에 대해서 당업계에 주지되어 있다(Handbook of Plant Cell Culture, 1-5권, 1983-1989 Momillan, N.Y.).
또한, 본 발명에 따른 유전체 교정 벼 식물체의 제조방법에 있어서, 상기 식물병은 반활물기생(hemibiotrophic) 병원균에 의해 유발되는 식물병일 수 있고, 바람직하게는 도열병균(M. oryzae) 또는 흰잎마름병균(Xanthomonas oryzae pv. oryzae)에 의해 유발되는 식물병일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명은 또한, 상기 방법에 의해 제조된 식물병에 대한 저항성이 증가된 유전체 교정 벼 식물체 및 상기 식물체의 유전체가 교정된 종자를 제공한다.
본 발명에 따른 식물병에 대한 저항성이 증가된 유전체 교정 벼 식물체는 OsMOR1a 유전자를 CRISPR/Cas9 시스템을 이용하여 교정한 것으로, 벼 유래 OsMOR1a 유전자가 녹-아웃(knock-out)되어, 유전체를 교정하지 않은 야생형 벼 식물체에 비해 반활물기생 병원균인 도열병균 또는 흰잎마름병균에 의해 유발되는 식물병에 대한 저항성이 증가되는 형질을 가지는 유전체 교정 벼 식물체이다.
본 발명은 또한, 벼 유래 OsMOR1a (Oryza sativa Magnaporthe oryzae resistance 1a) 유전자의 표적 염기서열에 특이적인 가이드 RNA(guide RNA)를 암호화하는 폴리뉴클레오티드 서열 및 엔도뉴클레아제(endonuclease) 단백질을 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 재조합 벡터를 유효성분으로 함유하는, 벼 식물체의 식물병 저항성을 증진시키기 위한 유전체 교정용 조성물을 제공한다.
본 발명의 유전체 교정용 조성물은 바람직하게는, 서열번호 3의 염기서열로 이루어진 OsMOR1a 유전자의 표적 염기서열에 특이적인 가이드 RNA를 포함하고 있어, OsMOR1a 유전자를 녹-아웃시킬 수 있고, OsMOR1a 유전자의 녹-아웃을 통해 식물병에 대한 저항성을 증진시킬 수 있는 것이다.
본 발명의 유전체 교정용 조성물에 있어서, 상기 식물병은 반활물기생(hemibiotrophic) 병원균에 의해 유발되는 식물병일 수 있고, 바람직하게는 도열병균 (M. oryzae) 또는 흰잎마름병균 (Xanthomonas oryzae pv. oryzae)에 의해 유발되는 식물병일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.
재료 및 방법
1. 식물체 및 병원균 생장 조건
애기장대 (Arabidopsis thaliana) Ws-0은 상업적인 혼합 상토와 펄라이트를 3:1의 비율로 혼합한 조건 또는 MS(Murashige and Skoog) 한천 배지를 사용하여 생장시켰다. 자포니카 품종인 동진벼 (Oryza sativa cv. Dongjin)는 비닐하우스 내에서 10시간 명/14시간 암의 광주기, 24~28℃ 온도 및 70~80% 습도 조건으로 생장시켰다.
모든 도열병균 (Magnaporthe oryzae) 균주는 곰팡이유전자원은행(Center for Fungal Genetic Resource, http://genebank.snu.ac.kr/)에서 분양받았으며, 분생포자(conidia)는 다음의 조건에 따라 생산하였다. 70-15 균주는 오트밀 한천 배지(50 g oatmeal 및 15 g agar per liter)에서 배양하였으며, 동진벼에 화합할 수 있는 PO6-6 균주는 V8 주스 한천 배지(80 ㎖ V8 juice 및 15 g agar per liter, pH 6.8)를 사용하여 형광등 조건 하에서 2주간 배양하였다. 검은무늬병균 (Alternaria brassicicola) MUCL 20297 균주는 PDA(Potato Dextrose Agar) 배지, 일정한 형광등 조건, 25℃의 온도로 배양하였으며, 깨씨무늬병균 (Cochliobolus miyabeanus) Cm36 균주는 PDA 배지에서 25℃ 조건으로 10일간 배양하였다.
2. 애기장대 감염
5개의 애기장대 식물체에 도열병균의 분생포자 현탁액(5 x 105 conidia/㎖) 20㎖을 에어브러시를 이용하여 분사하였다. 상기 접종된 식물체를 25℃, 100% 습도 조건의 결로 챔버(dew chamber)에 16시간 두었다가 생장 챔버(22℃, 80% 습도)로 옮겼다. 각 감염 실험은 3반복으로 수행하였다. 4주령의 애기장대 식물체에서 떨어진 잎들을 대상으로 검은무늬병균 포자 현탁액(5 x 105 spores/㎖) 10 ㎕를 떨어트려 병원균을 접종하였다. 접종된 잎들을 플라스틱 용기로 덮어 높은 습도를 유지하도록 하였다. 접종된 식물체에서 검은무늬병균 포자의 수는 이전의 방법(van Wees SC, et al., Plant Physiol. 2003, 132:606-17)을 이용하여 결정하였다.
3. 도열병균 배양 여액(culture filtrate) 준비
도열병균의 분생포자를 500 ㎖ 크기의 삼각 플라스크에 들어있는 300 ㎖의 PDB(potato dextrose broth)에 접종한 후 25℃, 암 조건에서 7일간 125 rpm의 속도로 교반시켰다. 그 후 상기 배양액을 멸균된 Whatman No. 2 필터 페이퍼를 통해 1차적으로 여과하여 균사(mycelia)를 제거하고, 연속적으로 0.22 μm 주사기 필터로 여과하여 분생포자를 제거한 후 배양 여액을 동결건조시켰다. 상기 동결 건조된 배양 여액을 5 ㎖의 아세톤으로 녹여주었다. 농축된 배양 여액의 5 ㎕를 28 내지 30일령의 Ws-0로부터 수집한 잎에 떨어트린 후 3일동안 관찰하였다. 그 후 상기 잎을 Evans blue를 사용하여 염색하였다(Park et al., Plant Physiol. 2009, 149:474-86).
4. 식물체의 병원균 감염 어세이
벼 식물체에 PO6-6 균주의 분생포자 현탁액(5 x 104 conidia/㎖ in 250 ppm Tween-20) 10 ㎖를 이용하여 병원균을 접종한 후, 상기 식물체를 25℃, 상대습도 100%인 암 조건에 1일간 놓아둔 후 28℃ 생장 챔버로 옮겨 10일간 두었다. 또한, 잎 위에 직경 2 mm의 press-injured spot을 3 내지 6개 만들고 각 spot에 10 ㎕의 분생포자 현탁액(5 x 106 conidia/㎖ in 250 ppm Tween-20)을 처리하였다. 병원균을 접종한 식물체를 밀폐된 챔버에서 25℃ 온도 및 100% 상대습도 조건으로 1일간 놓아둔 후, 25℃로 설정된 생장 챔버로 옮겨주었다. 접종 9일 후(9 dpi) 각각의 잎들을 촬영하고, 각 병반의 크기를 측정하였다.
또한, 잎집(leaf sheath)을 이용하여 곰팡이의 침투 및 증식의 정도를 미시적으로 비교하였다. 먼저, PO6-6 균주의 분생포자 현탁액(2 x 104 conidia/㎖ in sterile water)을 5주령 유묘로부터 분리한 절제한 잎집에 주입하고 상온에서 moistened 상자에 보관하였다. 감염 36시간 후(36 hpi)에 감염된 잎집에서 엽록소가 풍부한 부분을 제거하여 다듬고, 주맥(midvein)의 표피층(three to four cell layers thick)을 현미경으로 관찰하였다.
2개월 키운 벼 식물체의 잘 넓혀진 잎에 Xoo P6 (PXO99) 균주를 이전의 방법(Kim et al., J. Korean Soc. Appl. Biol. Chem. 2015, 58:669-75)에 따라 접종하였다. 상기 균주는 PSA (peptone sucrose agarA; 10 g peptone, 10 g sucrose, 16 g agar, 및 1 g glutamate per liter, pH 7.5) 배지에서 28℃의 온도 조건으로 3일간 배양하였다. 세균 덩어리는 멸균수를 이용하여 OD600 = 0.8이 되도록 현탁시키고, 발병도(disease severity)는 접종 14일 후 수침상(water-soaked) 병반의 길이를 측정하여 기록하였다.
깨씨무늬병균의 분생포자는 이전에 보고된 방법에 따라 준비하였고(Vleesschauwer et al., Plant Physiol. 2010, 152:2036-52), 1 x 103 conidia/㎖의 농도로 250 ppm의 Tween-20 용액에 현탁시켰다. 4주령의 벼 유묘에 상기 현탁액 10 ㎖을 분사한 후 25℃ 온도, 100% 상대 습도의 암 조건 생장 챔버에 1일간 놓아둔 후 28℃로 설정된 생장 챔버로 옮겨 4일간 놓아주었다. 상기 모든 실험은 3반복으로 수행하였다.
5. OsMOR1a 유전체 교정 식물체 제작
효과적인 PAM(protospacer adjacent motif) 자리를 찾고, off-target 효과를 줄이기 위해서, 본 발명자는 CRISPRdirect program(http://crispr.dbcls.jp/)을 사용하여 가능한 표적 서열을 스크리닝하여, OsMOR1a 유전자의 5번째 엑손에 위치하는 다음의 표적 염기서열을 확보하였다: 5'-GAGGAAGACGGTGAGGCTCCAGG-3' (밑줄은 PAM 자리로, PAM 자리를 제외한 염기서열(서열번호 3)이 gRNA 서열로 사용됨). 상기 gRNA 서열을 합성하고 폴리뉴클레오타이드 인산화효소(polynucleotide kinase)를 이용하여 인산화를 실시하고 혼성화하였다. 그 후, 상기 혼성화된 gRNA를 삽입하기 위해서 제한효소 BsaI로 잘린 pOs-sgRNA 벡터(Invitrogen)와 혼성화된 gRNA를 라이게이션(ligation)한 후, 대장균에 형질전환하여 양성 클론으로부터 플라스미드를 추출하였다. 이 후, 상기 플라스미드를 염기서열 분석하여 gRNA의 삽입 여부를 최종 확인하였다. gRNA 삽입이 확인된 pOs-sgRNA 컨스트럭트와 옥수수 유비퀴틴 프로모터에 의해 유도되는 Cas9을 포함하고 있는 pH-Ubi-cas9-7 벡터를 게이트웨이 클로닝 LR 반응을 수행하고 대장균에 형질전환하였다. 형질전환된 대장균으로부터 플라스미드 DNA를 추출한 후 염기서열을 분석하여 OsMOR1a-Cas9 컨스트럭트를 최종 확인하였다. 제작된 OsMOR1a-Cas9 벡터를 아그로박테리움 튜머파시엔스 (Agrobacterium tumefaciens) LBA4404 균주에 도입한 다음, 아그로박테리움 튜머파시엔스-매개 형질전환 방법을 통해 자포니카 벼 품종인 동진벼에 형질전환하였다. OsMOR1a-Cas9 컨스트럭트를 가진 아그로박테리움 튜머파시엔스 LBA4404 균주는 10 ㎎/L의 스트렙토마이신 및 50 ㎎/L의 하이그로마이신이 첨가된 AB 배지 (K2HPO4 3 g/L, NaH2PO4 1 g/L, NH4Cl 1 g/L, MgSO4 0.3 g/L, KCl 0.15 g/L, CaCl2 7.5 ㎎/L, FeSO4 2.5 ㎎/L)에서 28℃의 조건으로 3일 동안 배양시켰다. 이후, 공지된 방법에 따른 아그로박테리움-매개 공동 배양법(Jeon JS, Plant J. 2000, 22:561-570)을 통해 형질전환 캘러스를 수득하였다. 구체적으로, N6D 고형배지에서 동진벼 종자를 키웠으며, 암조건의 28℃ 생장실에서 30일 동안 생육시켜 캘러스를 유도하였다. 생성된 캘러스를 OsMOR1a-Cas9 컨스트럭트를 가진 아그로박테리움 튜머파시엔스 LBA4404 균주와 혼합하였고, N6D-아세토시린곤(Acetosyringone)을 포함한 배지에 넣은 후, 암조건의 22℃ 생장실에 방치하였다. 아그로박테리움에 오염된 상기 캘러스를 세포탁심(cefotaxime)이 첨가된 3차 증류수로 깨끗이 헹구어 낸 다음, 하이그로마이신을 첨가한 N6D 고체 배지에서 1차 및 2차에 걸쳐서 계대배양을 통해 항생제 내성을 보이는 형질전환 캘러스를 선발하였다. 선발된 캘러스를 재분화 배지인 MSR(하이그로마이신 40 ㎎/L 첨가) 고형배지에 옮겨 광조건의 28℃ 생장실에서 4주 동안 생육시켜 재분화를 유도한 후, 식물체를 MS 고체 배지로 옮기고 광조건의 28℃ 생장실에서 7일 동안 생육시킴으로써 OsMOR1a 유전체 교정식물체를 육성하였다. 각 식물체의 CRISPR 표적 자리를 포함하는 게노믹 부위는 PCR로 증폭시킨 후 염기서열을 분석하여 돌연변이를 가진 T0 벼 식물체를 동정하였다. 형질전환 식물체의 게노믹 DNA는 CTAB(cetyltrimethylammonium bromide) 방법을 통해 추출하였다. T1 및 T2 형질전환 벼 식물체의 유전형 분석을 위해, 독립적으로 분리된 형질전환 계통을 온실에서 재배하였다. Cas9 및 sgRNA 유전자의 PCR 증폭은 전이유전자의 존재를 확인하기 위해 수행되었고, 동형접합성 계통에서 표적 자리로부터 선택된 PCR 산물은 돌연변이를 확인하기 위해 서열분석 되었다.
6. 유전자 발현 분석(RT-PCR 및 qRT-PCR)
애기장대 Ws-0 식물체와 mor1 돌연변이체에서의 MOR1 전사체 발현 수준 비교를 위해 하기 표 1에 개시된 프라이머를 이용하여 RT-PCR을 수행하였다. 또한, OsMOR1a 및 OsMOR1d 유전자를 CRISPR/Cas9 시스템을 이용하여 교정한 T0, T1 및 T2 세대 벼 식물체에서 각 유전자들의 발현 수준을 하기 표 1에 개시된 프라이머를 이용하여 분석하였으며, AtMOR1의 상동체들인 OsMOR1 유전자들의 발현 수준은 qRT-PCR을 통해 분석하였다.
Figure 112020049706608-pat00001
RT-PCR은 분리된 총 RNA 5㎍를 ImProm-Ⅱ Reverse Transcription System(Promega)을 이용하여 역전사시킨 후, 합성된 cDNA를 주형으로 하여 수행되었으며, qRT-PCR은 2 ㎕의 cDNA (12.5 ng/㎖), 5 ㎕의 Power 26 SYBR Green PCR Master Mix(Thermo Fisher Scientific) 및 15 pmol의 각 프라이머를 혼합한 후 AB7500 Real-Time PCR system(Thermo Fisher Scientific)을 사용하여, 94℃에서 10분간 반응시킨 뒤 94℃에서 15초 및 58℃에서 1분의 과정을 40회 반복하였다. 모든 증폭 곡선은 액틴 유전자의 역치값으로 표준화하여 분석하였다.
7. 통계처리
통계 분석은 two-tailed, two-sample t-test를 사용하여 수행하였다.
실시예 1. 도열병균 저항성 연관 애기장대 유전자 탐색
애기장대 Ws-0은 도열병균 균주 70-15에 저항성을 보인다. 본 발명자는 상기 70-15 균주에 대한 저항성에 중요한 역할을 하는 유전자를 확인하기 위해서 T-DNA 삽입 돌연변이유발법을 통해 제조한 Ws-0 돌연변이체의 pool (3,300 M1 plants)을 동정하여, 21개의 비독립적인 돌연변이체들을 확인하였다. 4개의 돌연변이체가 단일 T-DNA 삽입을 가지고 있었으며, 그 중 1개 돌연변이체에서 T-DNA가 DNA 중합효소 A를 코딩하는 것으로 예측되는 유전자에 영향을 주었음을 알 수 있었다. 2개의 돌연변이체는 각각 가상적인 유전자에 T-DNA가 삽입된 것으로 확인되었고, 나머지 1개의 돌연변이체에서는 T-DNA가 당류 가수분해효소(glycosyl hydrolase) 패밀리 10에 속하는 단백질을 코딩하는 것으로 예측된 At4g33820의 두 번째 엑손에 삽입된 것을 알 수 있었다. 본 발명자는 상기 돌연변이된 유전자를 MOR1 ( M agnaporthe o ryzae r esistance 1)으로 명명하였다. 상기 유전자가 돌연변이된 식물체(mor1)은 MOR1 전사체를 생산하지 못하였다(도 1). 도열병균 70-15 균주는 접종 후 6일째(6 dpi)에 Ws-0에서 눈이 띄는 병증을 보여주지 않았으나, mor1은 3 dpi 내에 괴사 및 백화(chlorotic) 병반을 보여주었고, 6 dpi에 잎이 말라 죽었다(도 2a). 도열병균 균주 70-15의 배양 여액을 처리한 mor1 식물체의 자리는 조직 괴사 및 미세한 세포 사멸이 유발되었다(도 2b). 도열병균 균주 70-15 및 이의 배양 여액에 대한 감수성의 증가가 MOR1 유전자의 상실에 기인한 것인지 검증하기 위해, 유전적 상보성(complementation) 어세이를 수행하였다. 그 결과, 전체 MOR1 부위 및 그의 프로모터를 포함하는 전이유전자는 mor1 식물체의 도열병 저항성 손실을 완전하게 복구시켜주었고, 이러한 결과를 통해 MOR1 유전자의 돌연변이에 의해 유도된 표현형을 확인할 수 있었다(도 3).
실시예 2. 애기장대 MOR1 유전자의 병 저항성 관련 특성 분석
야생형 Ws-0와 비교하여 mor1 돌연변이체는 검은무늬병균 (Alternaria brassicicola)의 접종 후에 거대 병반이 발생하였다(도 2c). mor1 돌연변이체의 병반은 또한 더 많은 분생포자를 생산하였고(도 2d), 이는 MOR1이 검은무늬병균에 대한 방어에서 중요한 역할을 하는 것을 의미하였다. 그러나, Ws-0 및 mor1 돌연변이체 모두 반활물기생(hemibiotrophic) 병원균인 Pseudomonas syringae pv. tomato (Pst) DC3000에 대해서는 감염 후에 큰 차이를 보이지 않았다(도 4). 본 발명자는 애기장대 MOR1 유전자가 어떻게 식물체의 방어 기전에 관여하는지 조사하기 위해서 RNA-seq. 및 qRT-PCR (quantitative real-time PCR)을 수행하였다.
그 결과, Ws-0과 비교하여 mor1 돌연변이체에서 살리실산-의존적인 신호 경로에 의해 조절되는 방어-관련 유전자들이 상향 조절되고, 자스몬산에 의해 유도되는 유전자들이 하향 조절되는 것을 알 수 있었다(도 5).
실시예 3. 애기장대 MOR1 유전자의 벼 상동체 확인
본 발명자는 애기장대 식물체와 병원균과의 상호작용 결과로부터 MOR1의 상동체가 다른 식물체에서도 발병과 관련된 기전에 의존하여 저항성 또는 감수성에 관여할 것이라는 가설을 세웠다. 먼저 Carbohydrate-Active EnZymes (CAZy) 데이터 베이스 (http://www.cazy.org/Home.html)를 이용하여 당류 가수분해효소(glycosyl hydrolase) 패밀리 10을 코딩하는 벼 유전자를 확인하였고, At4g33820의 서열을 참고하여 Putative Orthologous Groups (POGs) 데이터 베이스 (http://pogs.uoregon.edu/#/)에서 이종상동유전자를 검색하였다. 그 결과, 벼의 게놈에서 13개의 MOR1 상동체를 확인하였으며, 이들을 OsMOR1a-OsMOR1m로 명명하였다. 그 후, 도열병균 (M. oryzae)이 감염된 벼에서 상기 유전자들의 발현을 분석하였다. 그 결과, 상기 유전자 중 11개의 유전자가 도열병균의 감염 동안에 구별되는 발현 양상을 보여주었다(도 6). 구체적으로 OsMOR1a 및 OsMOR1b는 활물기생(biotrophic) 단계에서 발현이 유도되었고, OsMOR1c, OsMOR1e-OsMOR1k 및 OsMOR1m은 사물기생(necrotrophic) 단계에서 현저히 높은 발현 수준을 유지하였다. 활물기생 단계 동안에, 반활물기생성 진균 병원균은 Hypersensitive response (HR) 억제를 통해 숙주세포를 죽이지 않으며 증식한다. 그래서, 활물기생 단계 동안에 다르게 발현되는 유전자들은 저항성 또는 감수성에 중요한 역할을 할 것으로 예상된다.
실시예 4. osmor1a 및 osmor1d 돌연변이체의 병 저항성 분석
본 발명자는 동진벼에서 CRISPR/Cas9 유전체 교정 시스템을 통해 활물기생 단계에서 발현 유도되는 OsMOR1a와 병원균 감염 동안에 발현이 유도되지 않는 OsMOR1d 유전자를 교정하여, 이형접합성의 osmor1a 및 osmor1d 돌연변이체를 획득하였다(도 7). 그 후, 도열병균 감염 시 동진벼와 상기 돌연변이체들의 특성을 비교하였다.
그 결과, 도열병균의 감염 시에 동진벼와 osmor1d 돌연변이체는 전형적인 병반이 생성되었으나, osmor1a 돌연변이체에서는 병반의 크기 및 수가 현저하게 작은 것이 관찰되었고, 이를 통해 osmor1a 돌연변이체가 도열병균에 대한 저항성이 증진되었음을 알 수 있었다(도 8a). 상처난 잎을 통한 osmor1a 돌연변이체의 감염 또한 동진벼와 비교하여 병반의 길이가 감소된 것을 알 수 있었고(도 8b), in planta 곰팡이 증식 및 숙주의 세포 반응을 미시적으로 비교해보았을 때 부착기의 형성 빈도는 동진벼 및 osmor1a 돌연변이체에서 유사한 것으로 관찰되었다. 동진벼 및 osmor1d 돌연변이체에서 감염균사(infection hyphae)는 초기에 세포에 침투해 접종 36시간 이내에 인접 세포로 이동했다(도 8c). 반면에, osmor1a 돌연변이체에서는 감염균사가 대부분 초기에 침투한 세포에 국한되어 있었고, 이러한 세포들이 세포사멸의 지표인 어두운 갈색 과립을 포함하고 있었다(도 8c). 상기의 결과는 OsMOR1a가 도열병균 감염에 대해 벼 식물체에서 감수성 유전자(S gene)로 기능함을 보여주었다.
실시예 5. 다른 병원균에 대한 OsMOR1a 유전자의 기능
osmor1a 돌연변이체는 Xoo에 대해서도 증진된 저항성을 보여주어(도 8d), OsMOR1a 유전자가 반활물기생 병원균에 대해 감수성 유전자로서 행동하는 것을 유추할 수 있었다. 반면, osmor1a 돌연변이체는 동진벼에 비해 벼의 갈색점무늬를 야기하는 사물기생 병원균인 깨씨무늬병균 (Cochliobolus miyabeanus) 감염 시에 현저히 증가된 병반 수를 보여주어(도 8e), OsMOR1a 유전자가 사물기생 병원균에 대해서는 저항성 유전자로서 기능함을 유추할 수 있었다. 그러나, AtMOR1 유전자와 OsMOR1a 유전자가 사물기생 병원균에 대한 저항성에는 보존된 기능을 보인 반면, 반활물기생 병원균에 대한 방어에서는 다른 기능을 보여주었다. 애기장대에서 MOR1의 존재는 Pst에 대한 감수성을 증가시키지 않은 반면, 벼에서 OsMOR1a의 존재는 도열병균 및 Xoo에 대한 감수성을 증가시켰다. 즉, 상기 결과를 통해 OsMOR1a는 병원균에 대한 방어에서 양면적인(ambivalent) 역할을 하는 유전자임을 알 수 있었다.
<110> Seoul National University R&DB Foundation <120> OsMOR1a gene from Oryza sativa regulating disease resistance of plant and uses thereof <130> PN20055 <160> 53 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 1725 <212> DNA <213> Oryza sativa <400> 1 atgaaggttg atccgatggg gaaactgttg ttcttgcttg catggattac tctcttgcaa 60 ggttgctgca tggtgaaatc cttttcttac gactactcat caagcattga gtgcttgcct 120 gagccgccgg agccccagta cggcggcggc gtcgtccgga acgccgactt cagcgctggc 180 ctccatggct ggtcggcctt cgggtacggc agcctcgccg agggctcgtc gccggcgggg 240 aacaggtacg ccgtggcgac gaaccggacg cggccgtacc agagcgtcag ccagaaggtc 300 ctcctccaga acgacacgca ctacaccctc tcagcgtggt tgcaggtgag cgacggtgtc 360 gccgacgtgc gggtggtcgt caaggccgcc ggcgacttca tccacgccgg cggcgtcgcc 420 gccaagtccg gctgctggtc catgctcaag ggcggcctca ccaccgtctc cggcggccgc 480 gccgagatct acttcgagag caacgcgacg gcggacatat gggtggacag cgtgtcgctg 540 aagccgttca ccaaggagga gtggagcaac caccgcgacg cgtcggcgag cacggcgagg 600 aggaagacgg tgaggctcca ggcgacggac tccgccggga acccgctgcc gggcgccgcc 660 gtgtcgctgg agaacgtccg caacggcttc cccctcggcg ccgccatgag cggcgagatc 720 ctgcgcaacc cgtcgtacca gcggtggttc gcgtcgcggt tcacggtgac cacgttcgag 780 aacgagatga agtggtacag cacggagccg gcgccgggga gggaggacta ctcggtgccg 840 gacgcgatgc tggagttcgc caggagccac ggcatcgcgg tgcgcgggca caacgtgttc 900 tgggacgacc cgaaccagca gccgcggtgg gtgcaggggc tcccctaccc gcagctgctg 960 gcggcggcgt cgcggcggat ccggtcggtg gtggcgaggt acgccgggaa gctcatcgcg 1020 tgggacgtgg tgaacgagaa cctgcacttc tccttcttcg agcgccgctt cgggtgggac 1080 gcttccacgg cgttctacgc ggcggcgcgg atgctggaca ccgggtcgac gctcatgttc 1140 atgaacgagt acaacacgct ggagcagccg ggcgacatgg cggcgctgcc ggcgaggtac 1200 gtgcagcggc tgaagcagat catcggcggg tacccgcaga acggcgccgg catggccatc 1260 ggcctcgagg gccacttcac cgcgccggtc aacatcccct acatgcgcgc cgccctggac 1320 accctcgcgc aggccggcgt ccccgtgtgg ctcaccgagg tcgacgtcgg cggcggcgcg 1380 tcgcaggcgt actacctgga ggagatcctc cgggaggcgt acgcgcaccc ggcggtgcag 1440 ggcgtcatcc tgtgggcggc gtggcggccg cagggctgct acgtcatgtg cctcaccgac 1500 aacgacttca acaacctgcc gcagggcgac gtcgtcgacc gcctcatcac cgagtggagc 1560 acggcgccgc gcgccggcac gacggacgcc gagggcttct tccaggccga gctcgcgcac 1620 ggcgagtaca aggtcaccgt cacccacccg tcgctcaaca cctccgtgtc gcagagcgtc 1680 aaggttgaaa tgggatcagg gagccactac ttcatccagg tctaa 1725 <210> 2 <211> 574 <212> PRT <213> Oryza sativa <400> 2 Met Lys Val Asp Pro Met Gly Lys Leu Leu Phe Leu Leu Ala Trp Ile 1 5 10 15 Thr Leu Leu Gln Gly Cys Cys Met Val Lys Ser Phe Ser Tyr Asp Tyr 20 25 30 Ser Ser Ser Ile Glu Cys Leu Pro Glu Pro Pro Glu Pro Gln Tyr Gly 35 40 45 Gly Gly Val Val Arg Asn Ala Asp Phe Ser Ala Gly Leu His Gly Trp 50 55 60 Ser Ala Phe Gly Tyr Gly Ser Leu Ala Glu Gly Ser Ser Pro Ala Gly 65 70 75 80 Asn Arg Tyr Ala Val Ala Thr Asn Arg Thr Arg Pro Tyr Gln Ser Val 85 90 95 Ser Gln Lys Val Leu Leu Gln Asn Asp Thr His Tyr Thr Leu Ser Ala 100 105 110 Trp Leu Gln Val Ser Asp Gly Val Ala Asp Val Arg Val Val Val Lys 115 120 125 Ala Ala Gly Asp Phe Ile His Ala Gly Gly Val Ala Ala Lys Ser Gly 130 135 140 Cys Trp Ser Met Leu Lys Gly Gly Leu Thr Thr Val Ser Gly Gly Arg 145 150 155 160 Ala Glu Ile Tyr Phe Glu Ser Asn Ala Thr Ala Asp Ile Trp Val Asp 165 170 175 Ser Val Ser Leu Lys Pro Phe Thr Lys Glu Glu Trp Ser Asn His Arg 180 185 190 Asp Ala Ser Ala Ser Thr Ala Arg Arg Lys Thr Val Arg Leu Gln Ala 195 200 205 Thr Asp Ser Ala Gly Asn Pro Leu Pro Gly Ala Ala Val Ser Leu Glu 210 215 220 Asn Val Arg Asn Gly Phe Pro Leu Gly Ala Ala Met Ser Gly Glu Ile 225 230 235 240 Leu Arg Asn Pro Ser Tyr Gln Arg Trp Phe Ala Ser Arg Phe Thr Val 245 250 255 Thr Thr Phe Glu Asn Glu Met Lys Trp Tyr Ser Thr Glu Pro Ala Pro 260 265 270 Gly Arg Glu Asp Tyr Ser Val Pro Asp Ala Met Leu Glu Phe Ala Arg 275 280 285 Ser His Gly Ile Ala Val Arg Gly His Asn Val Phe Trp Asp Asp Pro 290 295 300 Asn Gln Gln Pro Arg Trp Val Gln Gly Leu Pro Tyr Pro Gln Leu Leu 305 310 315 320 Ala Ala Ala Ser Arg Arg Ile Arg Ser Val Val Ala Arg Tyr Ala Gly 325 330 335 Lys Leu Ile Ala Trp Asp Val Val Asn Glu Asn Leu His Phe Ser Phe 340 345 350 Phe Glu Arg Arg Phe Gly Trp Asp Ala Ser Thr Ala Phe Tyr Ala Ala 355 360 365 Ala Arg Met Leu Asp Thr Gly Ser Thr Leu Met Phe Met Asn Glu Tyr 370 375 380 Asn Thr Leu Glu Gln Pro Gly Asp Met Ala Ala Leu Pro Ala Arg Tyr 385 390 395 400 Val Gln Arg Leu Lys Gln Ile Ile Gly Gly Tyr Pro Gln Asn Gly Ala 405 410 415 Gly Met Ala Ile Gly Leu Glu Gly His Phe Thr Ala Pro Val Asn Ile 420 425 430 Pro Tyr Met Arg Ala Ala Leu Asp Thr Leu Ala Gln Ala Gly Val Pro 435 440 445 Val Trp Leu Thr Glu Val Asp Val Gly Gly Gly Ala Ser Gln Ala Tyr 450 455 460 Tyr Leu Glu Glu Ile Leu Arg Glu Ala Tyr Ala His Pro Ala Val Gln 465 470 475 480 Gly Val Ile Leu Trp Ala Ala Trp Arg Pro Gln Gly Cys Tyr Val Met 485 490 495 Cys Leu Thr Asp Asn Asp Phe Asn Asn Leu Pro Gln Gly Asp Val Val 500 505 510 Asp Arg Leu Ile Thr Glu Trp Ser Thr Ala Pro Arg Ala Gly Thr Thr 515 520 525 Asp Ala Glu Gly Phe Phe Gln Ala Glu Leu Ala His Gly Glu Tyr Lys 530 535 540 Val Thr Val Thr His Pro Ser Leu Asn Thr Ser Val Ser Gln Ser Val 545 550 555 560 Lys Val Glu Met Gly Ser Gly Ser His Tyr Phe Ile Gln Val 565 570 <210> 3 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> gRNA <400> 3 gaggaagacg gtgaggctcc 20 <210> 4 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 4 agtggtcgta caaccggtat tgt 23 <210> 5 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 5 gatggcatgg aggaagagag aaac 24 <210> 6 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 6 ggcagaggaa gacggtgagg ctcc 24 <210> 7 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 7 aaacggagcc tcaccgtctt cctc 24 <210> 8 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 8 gtctcacttt gtggttttcc atgtg 25 <210> 9 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 9 tgctgtacca cttcatctcg ttctc 25 <210> 10 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 10 aggaatcaga tgtgcagtca g 21 <210> 11 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 11 tgctgtacca cttcatctcg ttctc 25 <210> 12 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 12 ttcttccctc gaaagctcaa 20 <210> 13 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 13 aaggcccacc agagtgtatg 20 <210> 14 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 14 agcttagcct caccaccaat gt 22 <210> 15 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 15 ccgatttgtc cagctgtgtg 20 <210> 16 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 16 gtggatgggc tacagcacc 19 <210> 17 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 17 aatagcagca acgaggagg 19 <210> 18 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 18 gcaagtgttt aagggtgaag aaca 24 <210> 19 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 19 gaacattgct acatccaaat ccaag 25 <210> 20 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 20 gatggaggat ttgaattgac 20 <210> 21 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 21 agttagctcc ggtacaagtg 20 <210> 22 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 22 tttgctgctt tcgacgcac 19 <210> 23 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 23 cgcaaacccc tgaccatg 18 <210> 24 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 24 gacgcttcat ctcgtcc 17 <210> 25 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 25 gtaaacgtag gtgagtcca 19 <210> 26 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 26 ggtgaaatcc ttttcttacg ac 22 <210> 27 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 27 tgtaccactt catctcgttc tc 22 <210> 28 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 28 ttacgactac tcgtcaagct ct 22 <210> 29 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 29 gtcaggatct ccttgctcat c 21 <210> 30 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 30 aacgagaacc tgcacttcaa 20 <210> 31 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 31 atgaagagga tggcgttctt 20 <210> 32 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 32 gagaggatga agaaggtgaa ga 22 <210> 33 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 33 gaagaagttg aagtggaggt tc 22 <210> 34 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 34 tgctaccaga tgtgcctgac 20 <210> 35 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 35 tctcccaaga aggcagaaaa 20 <210> 36 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 36 tgctaccaga tgtgcctcac 20 <210> 37 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 37 aggaatccgc tgaagctgta 20 <210> 38 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 38 ctacgaggtg aacaacgaga tg 22 <210> 39 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 39 gttgtagtcg ttgacgaaca gc 22 <210> 40 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 40 ctacgacgtc aacaacgaga tg 22 <210> 41 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 41 tgatctgctc gatgtacttc tcc 23 <210> 42 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 42 aagcgagacg tgattctcaa ct 22 <210> 43 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 43 cgaagttctc gcagaagaag tc 22 <210> 44 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 44 gttgatctcc ggagggagt 19 <210> 45 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 45 gacctcaccg agaaggctaa 20 <210> 46 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 46 atttcacgtt caggggctac 20 <210> 47 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 47 aaatttccat atccagcacg ag 22 <210> 48 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 48 aaggtacatt gcactgaagc aa 22 <210> 49 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 49 acgatctggt tacctttcct ga 22 <210> 50 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 50 gtccttctac caggacaagc tc 22 <210> 51 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 51 gttgtagtcg ttgacgaaca gc 22 <210> 52 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 52 tgtatgccag tggtcgtacc a 21 <210> 53 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 53 ccagcaaggt cgagacgaa 19

Claims (11)

  1. 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 벼 유래 OsMOR1a (Oryza sativa Magnaporthe oryzae resistance 1a) 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는 재조합 벡터로 식물세포를 형질전환시켜 OsMOR1a 단백질을 코딩하는 유전자의 발현을 식물세포에서 저해시키는 단계를 포함하는 야생형에 비해 식물체의 식물병 저항성을 증가시키는 방법.
  2. 삭제
  3. 제1항에 있어서, 상기 식물병은 반활물기생(hemibiotrophic) 병원균에 의해 유발되는 식물병인 것을 특징으로 하는 야생형에 비해 식물체의 식물병 저항성을 증가시키는 방법.
  4. 제3항에 있어서, 상기 반활물기생 병원균은 도열병균(Magnaporthe oryzae) 또는 흰잎마름병균(Xanthomonas oryzae pv. oryzae)인 것을 특징으로 하는 야생형에 비해 식물체의 식물병 저항성을 증가시키는 방법.
  5. 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 벼 유래 OsMOR1a (Oryza sativa Magnaporthe oryzae resistance 1a) 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는 재조합 벡터로 식물세포를 형질전환시켜 OsMOR1a 단백질을 코딩하는 유전자의 발현을 식물세포에서 저해시키는 단계; 및
    상기 형질전환된 식물세포로부터 식물을 재분화하는 단계;를 포함하는 야생형에 비해 식물병 저항성이 증가된 형질전환 식물체의 제조방법.
  6. 서열번호 1의 염기서열로 이루어진 벼 유래 OsMOR1a (Oryza sativa Magnaporthe oryzae resistance 1a) 유전자의 표적 염기서열에 특이적인 가이드 RNA(guide RNA)를 암호화하는 폴리뉴클레오티드 서열 및 엔도뉴클레아제(endonuclease) 단백질을 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 재조합 벡터를 벼 식물세포에 도입하여 유전체를 교정하는 단계; 및
    상기 유전체가 교정된 벼 식물세포로부터 벼 식물체를 재분화하는 단계;를 포함하는, 식물병에 대한 저항성이 증가된 유전체 교정 벼 식물체의 제조방법.
  7. 제6항에 있어서, 상기 OsMOR1a 유전자의 표적 염기서열은 서열번호 3의 염기서열로 이루어진 것을 특징으로 하는 식물병에 대한 저항성이 증가된 유전체 교정 벼 식물체의 제조방법.
  8. 제6항에 있어서, 상기 식물병은 반활물기생(hemibiotrophic) 병원균에 의해 유발되는 식물병인 것을 특징으로 하는 식물병에 대한 저항성이 증가된 유전체 교정 벼 식물체의 제조방법.
  9. 제6항 내지 제8항 중 어느 한 항의 방법에 의해 제조된 식물병에 대한 저항성이 증가된 유전체 교정 벼 식물체.
  10. 제9항에 따른 벼 식물체의 유전체가 교정된 종자.
  11. 서열번호 1의 염기서열로 이루어진 벼 유래 OsMOR1a (Oryza sativa Magnaporthe oryzae resistance 1a) 유전자의 표적 염기서열에 특이적인 가이드 RNA(guide RNA)를 암호화하는 폴리뉴클레오티드 서열 및 엔도뉴클레아제(endonuclease) 단백질을 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 재조합 벡터를 유효성분으로 함유하는, 벼 식물체의 식물병 저항성을 증진시키기 위한 유전체 교정용 조성물.
KR1020200058928A 2020-05-18 2020-05-18 식물체의 병 저항성을 조절하는 벼 유래의 OsMOR1a 유전자 및 이의 용도 KR102408985B1 (ko)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR1020200058928A KR102408985B1 (ko) 2020-05-18 2020-05-18 식물체의 병 저항성을 조절하는 벼 유래의 OsMOR1a 유전자 및 이의 용도

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR1020200058928A KR102408985B1 (ko) 2020-05-18 2020-05-18 식물체의 병 저항성을 조절하는 벼 유래의 OsMOR1a 유전자 및 이의 용도

Publications (2)

Publication Number Publication Date
KR20210142287A KR20210142287A (ko) 2021-11-25
KR102408985B1 true KR102408985B1 (ko) 2022-06-14

Family

ID=78745879

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020200058928A KR102408985B1 (ko) 2020-05-18 2020-05-18 식물체의 병 저항성을 조절하는 벼 유래의 OsMOR1a 유전자 및 이의 용도

Country Status (1)

Country Link
KR (1) KR102408985B1 (ko)

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Chi-Yeol Kim 등. ECFG15 학술대회. 페이지 165-166 (2020.02.17.)*
Genbank Accession number XP_015632159 (2018.08.07.)*

Also Published As

Publication number Publication date
KR20210142287A (ko) 2021-11-25

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US11299746B2 (en) Disease resistant pepper plants
EP1774003B1 (en) A method to increase pathogen resistance in plants
EP1859044B1 (en) Resistance against parasitic weeds
US11597944B2 (en) Gene conferring resistance to Cercospora beticola in beets
WO2018191663A1 (en) Methods and compositions for herbicide tolerance in plants
EP3325629A2 (en) Wheat plants resistant to powdery mildew
Chen et al. Overexpression of glucanase gene and defensin gene in transgenic tomato enhances resistance to Ralstonia solanacearum
JP7375028B2 (ja) 植物病害に対する抵抗性の遺伝子
US20210340557A1 (en) Beet necrotic yellow vein virus (bnyvv)-resistance modifying gene
CA3189532A1 (en) Plant resistance gene and means for its identification
KR102408985B1 (ko) 식물체의 병 저항성을 조절하는 벼 유래의 OsMOR1a 유전자 및 이의 용도
CN109593782B (zh) 利用本氏烟HIR3s基因获得抗病植物以及该基因的用途
Hoshino et al. Transgenic bialaphos-resistant snapdragon (Antirrhinum majus L.) produced by Agrobacterium rhizogenes transformation
CN110959043A (zh) 利用bcs1l基因和向导rna/cas核酸内切酶系统改良植物农艺性状的方法
US20230227841A1 (en) Gene conferring resistance to cercospora beticola in beets
CN106754968B (zh) 水稻基因OsASR2及抗病调控功能的应用
WO2004092372A1 (ja) 塩ストレス耐性を付与する遺伝子
JP2003250370A (ja) 病害抵抗性イネ科植物
US20220389443A1 (en) Gene for resistance to a pathogen of the genus heterodera
EA045304B1 (ru) Ген устойчивости к болезням растений
WO1998041612A1 (en) Cercosporin-degrading bacteria

Legal Events

Date Code Title Description
E902 Notification of reason for refusal
E902 Notification of reason for refusal
E701 Decision to grant or registration of patent right
GRNT Written decision to grant