KR102516522B1 - 반수체 식물을 유도하는 pPLAⅡη 유전자 및 이의 용도 - Google Patents

반수체 식물을 유도하는 pPLAⅡη 유전자 및 이의 용도 Download PDF

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Abstract

본 발명은 반수체 식물을 유도하는 pPLAⅡη 유전자 및 이의 용도에 관한 것으로, 본 발명에서는 pPLAⅡη 유전자의 발현을 저해시켜 반수체 식물을 유도할 수 있음을 보여주었으므로 형질이 고정된 순계의 육종 소재를 단기간에 구축하기 위한 전략으로 본 발명의 유전자를 유용하게 활용할 수 있을 것이다.

Description

반수체 식물을 유도하는 pPLAⅡη 유전자 및 이의 용도{pPLAⅡη gene inducing haploid plant and uses thereof}
본 발명은 반수체 식물을 유도하는 pPLAⅡη 유전자 및 이의 용도에 관한 것이다.
쌍(pair)의 염색체가 동일한 유전적 특성을 가지는 동형이배수체(homozygous diploid)는 식물의 품종을 고정시키는데 필수적인 요소이다. 이들로부터 유래하는 후대의 식물들은 모두 유전자형이 동일하며 품종으로서 필요조건을 충족하게 된다. 근래에는 동형접합 식물을 얻기 위해 여러 식물에서 반수체의 이배체화라는 방법을 주로 사용한다. 이 기술은 대상 식물의 반수체 부분을 배양하는 과정에서 자동적 또는 인위적으로 염색체수가 두 배로 증가하는 특성을 이용한다.
반수체(haploid)는 정상적인 개체가 갖는 염색체 수(2n)의 절반, 즉 배우체의 핵형(n)을 갖는 개체를 일컫는다. 반수체는 감수분열로 염색체의 수가 절반인 생식세포를 기반으로 생산되며, 부계의 웅핵 기원과 모계의 난핵 세포 기원으로 분류된다. 한편, 생성방법에 따라서 자연적 발생과 인위적 유도에 의한 발생으로 구분되며, 인위적 유도는 교배를 통한 생체내(in vivo) 유도와 조직배양을 통한 기내(in vitro) 유도로 더욱 구분된다. 반수체 식물은 모본보다 크기가 작고 활력이 낮으며 정상적인 감수분열이 불가능하여 세대의 진전이 불가능한 반면, 반수체가 자연적으로 혹은 인위적으로 염색체가 2배로 증가된 배가반수체(doubled haploid, DH)를 형성하면 상동염색체가 동형(homozygous)인 상태로 안정적으로 발달하고 세대를 진전한다. 이러한 반수체 육종은 5~7회의 반복적인 자가수분을 수행하는 것보다 단기간에 순계화를 가능하게 하여 육종에 걸리는 시간을 단축하고, 열성형질의 표현형도 즉시 확인할 수 있다는 장점이 있다.
벼의 게놈에서 총 31개의 인산가수분해효소 A(phospholipase A, PLA)가 확인되었으며, 도메인 구조, 보존된 모티프 및 계통발생에 근거하여 phospholipase A1 (PLA1), patatin like phospholipases (pPLA) 그리고 저분자량의 분비형 phospholipase A2 (sPLA2)로 분류되었다(Singh A et al., 2012 PLoS ONE 7(2):e30947). OspPLA-Ⅱβ(LOC_Os11g400009)는 종자 단계에서 발현이 감소되고, OspPLA-Ⅱδ(LOC_Os08g37180)는 비생물학적 스트레스 조건에서 발현이 증가되는 것으로 보고되었다.
본 발명에서는 벼 pPLAⅡη (LOC_Os09g28770)의 발현을 저해한 결과 in vivo 상태(in planta)에서 반수체가 유기되는 것을 확인함으로써 벼 pPLAⅡη 유전자가 반수체 유도인자로 사용될 수 있음을 증명하였다.
한편, 한국공개특허 제2019-0088512호에는 '동시 유전자 편집 및 반수체 유도'가 개시되어 있고, 한국공개특허 제2012-0048626호에는 '2중 반수체 식물의 제조방법'이 개시되어 있고, 한국공개특허 제2006-0117080호에는 RanGAP (Ran GTPase activating protein) 유전자를 이용한 '형질전환을 통해 제조된 당대 반수체 및 동형이배수체 식물'이 개시되어 있으나, 본 발명의 '반수체 식물을 유도하는 pPLAⅡη 유전자 및 이의 용도'에 대해서는 기재된 바가 없다.
본 발명은 상기와 같은 요구에 의해 도출된 것으로서, 본 발명자들은 CRISPR/Cas9 시스템을 이용하여 벼 유래 pPLAⅡη 단백질 코딩 유전자를 교정하여 기능상실을 일으킨 결과, 반수체의 식물체가 유도되는 것을 확인함으로써, 본 발명을 완성하였다.
상기 과제를 해결하기 위해, 본 발명은 벼 유래 pPLAⅡη 단백질 코딩 유전자를 유효성분으로 포함하는, 반수체(haploid) 식물 유도용 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 벼 유래 pPLAⅡη 단백질 코딩 유전자를 포함하는 재조합 벡터로 식물세포를 형질전환시켜 pPLAⅡη 유전자의 발현을 저해하는 단계; 및 상기 형질전환된 식물세포로부터 형질전환된 식물체를 재분화하는 단계;를 포함하는, 반수체(haploid) 식물의 제조방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 방법에 의해 제조된 반수체(haploid) 식물체 및 이의 종자를 제공한다.
또한, 본 발명은 (a) 벼 유래 pPLAⅡη 단백질 코딩 유전자의 표적 염기서열에 특이적인 가이드 RNA(guide RNA) 및 엔도뉴클레아제(endonuclease) 단백질을 식물세포에 도입하여 유전체를 교정하는 단계; 및 (b) 상기 유전체가 교정된 식물세포로부터 식물체를 재분화하는 단계;를 포함하는, 반수체(haploid)가 유도된 유전체 교정 식물체의 제조방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 식물체에서 벼 유래 pPLAⅡη 단백질 코딩 유전자의 발현을 조절하는 단계를 포함하는, 식물체의 염색체 수를 조절하는 방법을 제공한다.
본 발명에서는 pPLAⅡη 유전자의 발현을 저해시켜 반수체 식물을 유도할 수 있음을 보여주었다. 식물 유전연구 및 육종 프로그램은 유전자원의 유용한 형질을 엘리트 품종에 빠르고 정확하게 도입하는 것을 목표로 하므로, 형질이 고정된 순계의 육종 소재를 단기간에 구축하기 위한 전략으로 본 발명의 방법을 유용하게 활용할 수 있을 것이다.
도 1은 벼 pPLAⅡη 유전자의 서열 정보로, 유전자 편집을 위한 가이드 RNA의 표적 염기서열의 위치를 보여준다.
도 2는 다양한 식물종에서 pPLAs의 계통수를 분석한 결과이다.
도 3은 OspPLAⅡη 유전자 편집을 위한 벡터 컨스트럭트의 모식도이다.
도 4는 OspPLAⅡη 유전자의 게노믹 구조와 single guide RNA의 표적 위치, 및 유전자 편집 개체의 표적 부위 서열분석 결과이다.
도 5는 3개월 성장한 동진벼 및 OspPLAⅡη 유전자 편집 개체(SgOspPLAⅡη)의 표현형(A), 이삭 형태(B) 및 종자 수정률 분석 결과(C)이다. 종자 수정률은 동진벼, SgOspPLAⅡη-1 및 SgOspPLAⅡη-2 각각 41개체, 85개체 및 29개체를 대상으로 분석하였다. **: p<0.01, scale bar = 10 cm(A), 1 cm(B).
도 6은 자가수정을 통해 생성된 SgOspPLAⅡη-1의 이배체 및 반수체 식물체의 표현형으로 2주 생장된 식물체의 모습이다. scale bar = 1 cm.
도 7은 OspPLAⅡη 유전자 편집 계통의 자가수정을 통한 반수체 유도율 검정 결과로, 2주령 식물체의 잎을 사용하여 분석한 결과이다.
본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 벼 유래 pPLAⅡη 단백질 코딩 유전자를 유효성분으로 포함하는, 반수체(haploid) 식물 유도용 조성물을 제공한다. 본 발명의 조성물은 유효성분으로 벼 유래 pPLAⅡη 단백질 코딩 유전자를 포함하며, 상기 유전자의 발현이 저해되면, 식물체에서 반수체가 유도될 수 있다.
본 발명의 일 구현 예에 따른 조성물에 있어서, 상기 벼 유래 pPLAⅡη 단백질은 바람직하게는 서열번호 3의 아미노산 서열로 이루어진 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명에 따른 벼 유래 pPLAⅡη 단백질의 범위는 서열번호 3으로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 단백질 및 상기 단백질의 기능적 동등물을 포함한다. 본 발명에 있어서, 용어 "기능적 동등물"이란 아미노산의 부가, 치환 또는 결실의 결과, 상기 서열번호 3으로 표시되는 아미노산 서열과 적어도 70% 이상, 바람직하게는 80% 이상, 더욱 바람직하게는 90% 이상, 더 더욱 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 갖는 것으로, 서열번호 3으로 표시되는 단백질과 실질적으로 동질의 생리활성을 나타내는 단백질을 말한다. "실질적으로 동질의 생리활성"이란 반수체(haploid) 식물의 유도 활성을 의미한다.
또한, 본 발명은 상기 벼 유래 pPLAⅡη 단백질을 암호화하는 유전자를 제공한다. 본 발명의 유전자는 벼 유래 pPLAⅡη 단백질을 암호화하는 게놈 DNA(서열번호 1)와 cDNA(서열번호 2)를 모두 포함한다. 바람직하게는, 본 발명의 유전자는 서열번호 2로 표시되는 염기서열을 포함할 수 있다. 또한, 상기 염기서열의 상동체가 본 발명의 범위 내에 포함된다. 구체적으로, 상기 유전자는 서열번호 2의 염기서열과 각각 70% 이상, 더욱 바람직하게는 80% 이상, 더 더욱 바람직하게는 90% 이상, 가장 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 가지는 염기서열을 포함할 수 있다. 폴리뉴클레오티드에 대한 "서열 상동성의 %"는 두 개의 최적으로 배열된 서열과 비교 영역을 비교함으로써 확인되며, 비교 영역에서의 폴리뉴클레오티드 서열의 일부는 두 서열의 최적 배열에 대한 참고 서열(추가 또는 삭제를 포함하지 않음)에 비해 추가 또는 삭제(즉, 갭)를 포함할 수 있다.
본 발명은 또한, 벼 유래 pPLAⅡη 단백질 코딩 유전자를 포함하는 재조합 벡터로 식물세포를 형질전환시켜 pPLAⅡη 유전자의 발현을 저해하는 단계; 및 상기 형질전환된 식물세포로부터 형질전환된 식물체를 재분화하는 단계;를 포함하는, 반수체(haploid) 식물의 제조방법, 상기 방법에 의해 제조된 반수체(haploid) 식물체 및 이의 종자를 제공한다.
본 발명에 따른 반수체 식물의 제조방법에 있어서, 상기 벼 유래 pPLAⅡη 단백질 및 이의 코딩 유전자는 전술한 것과 같다.
본 명세서에서 용어 "재조합"은 세포가 이종의 핵산을 복제하거나, 상기 핵산을 발현하거나 또는 펩티드, 이종의 펩티드 또는 이종의 핵산에 의해 암호된 단백질을 발현하는 세포를 지칭하는 것이다. 재조합 세포는 상기 세포의 천연 형태에서는 발견되지 않는 유전자 또는 유전자 절편을, 센스 또는 안티센스 형태 중 하나로 발현할 수 있다. 또한 재조합 세포는 천연 상태의 세포에서 발견되는 유전자를 발현할 수 있으며, 그러나 상기 유전자는 변형된 것으로서 인위적인 수단에 의해 세포 내 재도입된 것이다.
용어 "벡터"는 세포 내로 전달하는 DNA 단편(들), 핵산 분자를 지칭할 때 사용된다. 벡터는 DNA를 복제시키고, 숙주세포에서 독립적으로 재생산될 수 있다. 용어 "전달체"는 흔히 "벡터"와 호환하여 사용된다. 용어 "발현 벡터"는 목적한 코딩 서열과, 특정 숙주 생물에서 작동가능하게 연결된 코딩 서열을 발현하는데 필수적인 적정 핵산 서열을 포함하는 재조합 DNA 분자를 의미한다.
본 발명의 상기 벡터는 전형적으로 클로닝 또는 발현을 위한 벡터로서 구축될 수 있다. 또한, 본 발명의 벡터는 원핵 세포 또는 진핵 세포를 숙주로 하여 구축될 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 벡터가 발현 벡터이고, 원핵 세포를 숙주로 하는 경우에는, 전사를 진행시킬 수 있는 강력한 프로모터 (예컨대, pLλ프로모터, Trp 프로모터, Lac 프로모터, T7 프로모터, Tac 프로모터 등), 해독의 개시를 위한 리보좀 결합 자리 및 전사/해독 종결 서열을 포함하는 것이 일반적이다. 숙주 세포로서 대장균(Escherichia coli)이 이용되는 경우, E. coli 트립토판 생합성 경로의 프로모터 및 오퍼레이터 부위, 그리고 파아지 λ의 좌향 프로모터 (pLλ프로모터)가 조절 부위로서 이용될 수 있다.
본 발명의 재조합 벡터에서, 상기 프로모터는 형질전환에 적합한 프로모터들로서, 바람직하게는 CaMV 35S 프로모터, 액틴 프로모터, 유비퀴틴 프로모터, pEMU 프로모터, MAS 프로모터 또는 히스톤 프로모터일 수 있으며, 바람직하게는 CaMV 35S 프로모터일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명에 있어서, "프로모터"란 용어는 구조 유전자로부터의 DNA 업스트림의 영역을 의미하며 전사를 개시하기 위하여 RNA 폴리머라아제가 결합하는 DNA 분자를 말한다. "식물 프로모터"는 식물 세포에서 전사를 개시할 수 있는 프로모터이다. "항시성(constitutive) 프로모터"는 대부분의 환경 조건 및 발달 상태 또는 세포 분화하에서 활성이 있는 프로모터이다. 형질전환체의 선택이 각종 단계에서 각종 조직에 의해서 이루어질 수 있기 때문에 항시성 프로모터가 본 발명에서 바람직할 수 있다. 따라서, 항시성 프로모터는 선택 가능성을 제한하지 않는다.
재조합 벡터는 바람직하게는 하나 이상의 선택성 마커를 포함할 수 있다. 상기 마커는 통상적으로 화학적인 방법으로 선택될 수 있는 특성을 갖는 핵산 서열로, 형질전환된 세포를 비형질전환 세포로부터 구별할 수 있는 모든 유전자가 이에 해당된다. 상기 마커 유전자는 항생제 저항성 유전자(dominant drug resistance gene)일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 재조합 벡터는 당업자에 주지된 방법에 의해 구축될 수 있다. 상기 방법은 시험관 내 재조합 DNA 기술, DNA 합성 기술 및 생체 내 재조합 기술 등을 포함한다. 상기 DNA 서열은 mRNA 합성을 이끌기 위해 발현 벡터 내의 적당한 프로모터에 효과적으로 연결될 수 있다. 또한 벡터는 번역 개시 부위로서 리보솜 결합 부위 및 전사 터미네이터를 포함할 수 있다.
식물 발현 벡터의 바람직한 예는 아그로박테리움 투머파시엔스(Agrobacterium tumefaciens)와 같은 적당한 숙주에 존재할 때 그 자체의 일부, 소위 T-영역을 식물 세포로 전이시킬 수 있는 Ti-플라스미드 벡터이다. 다른 유형의 Ti-플라스미드 벡터 (EP 0 116 718 B1호 참조)는 현재 식물 세포, 또는 잡종 DNA를 식물의 게놈 내에 적당하게 삽입시키는 새로운 식물이 생산될 수 있는 원형질체로 잡종 DNA 서열을 전이시키는데 이용되고 있다. Ti-플라스미드 벡터의 특히 바람직한 형태는 EP 0 120 516 B1호 및 미국 특허 제4,940,838호에 청구된 바와 같은 소위 바이너리(binary) 벡터이다. 본 발명에 따른 DNA를 식물 숙주에 도입시키는데 이용될 수 있는 다른 적합한 벡터는 이중 가닥 식물 바이러스 (예를 들면, CaMV) 및 단일 가닥 바이러스, 게미니 바이러스 등으로부터 유래될 수 있는 것과 같은 바이러스 벡터, 예를 들면 비완전성 식물 바이러스 벡터로부터 선택될 수 있다. 그러한 벡터의 사용은 특히 식물 숙주를 적당하게 형질전환하는 것이 어려울 때 유리할 수 있다.
본 발명의 재조합 벡터의 이에 한정되지 않으나, VIGS 벡터 또는 RNAi 벡터일 수 있다. VIGS는 바이러스 벡터에 식물 유전자를 도입한 후 식물체를 감염시키면, 그 도입된 유전자의 내인성 유전자가 발현이 억제되는 현상을 말한다. 이는 PTGS (Post-transcriptional gene silencing)의 일종으로서, 전사-후(post-transcriptional), RNA 턴오버(RNA turnover) 및 뉴클레오티드 서열 특이적(nucleotide sequence-specific) 이라는 특징들을 가진다. 상기 VIGS 벡터는 외래 유전자를 도입한 식물체 내에서 일시적으로 발현시킬 수 있는 일시적(transient) 발현 벡터 및 외래 유전자가 도입된 식물체에서 영구적으로 발현시킬 수 있는 식물 발현 벡터로 사용할 수 있다.
본 발명의 벡터를 안정되면서 연속적으로 클로닝 및 발현시킬 수 있는 숙주세포는 미세조류, 미생물 등을 포함한 당업계에 공지된 어떠한 숙주세포도 이용할 수 있으며, 예컨대, E. coli JM109, E. coli BL21, E. coli RR1, E. coli LE392, E. coli B, E. coli X 1776, E. coli W3110, 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis), 바실러스 츄린겐시스(B. thuringiensis)와 같은 바실러스 속 균주, 그리고 살모넬라 티피무리움(Salmonella typhimurium), 세라티아 마르세슨스(Serratia marcescens) 및 다양한 슈도모나스(Pseudomonas) 종과 같은 장내균과 균주 등이 있다.
또한, 본 발명의 벡터를 진핵 세포에 형질전환시키는 경우에는 숙주세포로서, 효모 (예컨대, Saccharomyce cerevisiae), 곤충세포, 사람세포 (예컨대, CHO 세포주(Chinese hamster ovary), W138, BHK, COS-7, 293, HepG2, 3T3, RIN 및 MDCK 세포주) 및 식물세포 등이 이용될 수 있으며, 바람직하게는 식물세포이다.
식물의 형질전환은 DNA를 식물에 전이시키는 임의의 방법을 의미한다. 그러한 형질전환 방법은 반드시 재생 및(또는) 조직 배양기간을 가질 필요는 없다. 식물 종의 형질전환은 이제는 쌍자엽 식물뿐만 아니라 단자엽 식물 양자를 포함한 식물 종에 대해 일반적이다. 원칙적으로, 임의의 형질전환 방법은 본 발명에 따른 잡종 DNA를 적당한 선조 세포로 도입시키는데 이용될 수 있다. 방법은 원형질체에 대한 칼슘/폴리에틸렌 글리콜 방법(Krens, F.A. et al., 1982, Nature 296, 72-74; Negrutiu I. et al., 1987, Plant Mol. Biol. 8, 363-373), 원형질체의 전기천공법(Shillito R.D. et al., 1985 Bio/Technol. 3, 1099-1102), 식물 요소로의 현미주사법(Crossway A. et al., 1986, Mol. Gen. Genet. 202, 179-185), 각종 식물 요소의 (DNA 또는 RNA-코팅된) 입자충격법(Klein T.M. et al., 1987, Nature 327, 70), 식물의 침윤 또는 성숙 화분 또는 소포자의 형질전환에 의한 아그로박테리움 투머파시엔스 매개된 유전자 전이에서 (비완전성) 바이러스에 의한 감염(EP 0 301 316호) 등으로부터 적당하게 선택될 수 있다. 본 발명에 따른 바람직한 방법은 아그로박테리움 매개된 DNA 전달을 포함한다.
또한, 본 발명의 제조방법에 있어서, 상기 형질전환된 식물세포로부터 형질전환 식물을 재분화하는 방법은 당업계에 공지된 임의의 방법을 이용할 수 있다. 형질전환된 식물세포는 전식물로 재분화되어야 한다. 캘러스 또는 원형질체 배양으로부터 성숙한 식물의 재분화를 위한 기술은 수많은 여러 가지 종에 대해서 당업계에 주지되어 있다(Handbook of Plant Cell Culture, 1-5권, 1983-1989 Momillan, N.Y.).
식물의 형질전환에 이용되는 "식물세포"는 어떤 식물세포도 된다. 식물세포는 배양 세포, 배양 조직, 배양기관 는 전체 식물이다. "식물 조직"은 분화된 또는 미분화된 식물의 조직, 예를 들면 이에 한정되진 않으나, 뿌리, 줄기, 잎, 꽃가루, 종자, 암 조직 및 배양에 이용되는 다양한 형태의 세포들, 즉 단일 세포, 원형질체(protoplast), 싹 및 캘러스 조직을 포함한다. 식물 조직은 인 플란타(in planta)이거나 기관 배양, 조직배양 또는 세포 배양 상태일 수 있다.
본 발명의 일 구현 예에 따른 반수체 식물의 제조방법에 있어서, 상기 형질전환된 식물세포는 벼 유래 pPLAⅡη 단백질 코딩 유전자의 발현이 저해된 것이 특징이다.
반수의 염색체를 가진 반수체식물은 다음과 같은 이용 가치를 기대할 수 있다: ⅰ) 반수체식물의 염색체를 배가함으로써 순계를 단기간에 얻을 수 있음. ⅱ) 치사유전자가 선택되기 때문에 순계의 생활력이 강함. ⅲ) 반수체 식물에서는 대립유전자간의 상호작용이 없으므로 열성형질도 발현하므로 유전자를 쉽게 추정할 수 있음. ⅳ) 각종 염색체 공학에 이용할 수 있음. ⅴ) 이질배수체(alloploid)의 반수체는 세포유전학의 실험에 활용가능.
본 발명은 또한, (a) 벼 유래 pPLAⅡη 단백질 코딩 유전자의 표적 염기서열에 특이적인 가이드 RNA(guide RNA) 및 엔도뉴클레아제(endonuclease) 단백질을 식물세포에 도입하여 유전체를 교정하는 단계; 및 (b) 상기 유전체가 교정된 식물세포로부터 식물체를 재분화하는 단계;를 포함하는, 반수체(haploid)가 유도된 유전체 교정 식물체의 제조방법 및 상기 방법에 의해 제조된 반수체가 유도된 유전체 교정 식물체를 제공한다.
본 명세서에서 용어 "유전체/유전자 교정(genome/gene editing)"은, 인간 세포를 비롯한 동·식물 세포의 유전체 염기서열에 표적지향형 변이를 도입할 수 있는 기술로서, DNA 절단에 의한 하나 이상의 핵산 분자의 결실(deletion), 삽입(insertion), 치환(substitutions) 등에 의하여 특정 유전자를 녹-아웃(knock-out) 또는 녹인(knock-in)하거나, 단백질을 생성하지 않는 비-코딩(non-coding) DNA 서열에도 변이를 도입할 수 있는 기술을 말한다. 본 발명의 목적상 상기 유전체 교정은 특히 엔도뉴클레아제(endonuclease) 예컨대, Cas9 (CRISPR associated protein 9) 단백질 및 가이드 RNA를 이용하여 식물체에 변이를 도입하는 것일 수 있다. 또한, '유전자 교정'은 '유전자 편집'과 혼용되어 사용될 수 있다.
또한, 용어 "표적 유전자"는 본 발명을 통해 교정하고자 하는 식물체의 유전체 내에 있는 일부 DNA를 의미하며, 그 유전자의 종류에 제한되지 않으며, 코딩 영역 및 비-코딩 영역을 모두 포함할 수 있다. 당업자는 그 목적에 따라, 제조하고자 하는 유전체 교정 식물체에 대하여 원하는 변이에 따라 상기 표적 유전자를 선별할 수 있다.
또한, 용어 "가이드 RNA(guide RNA)"는 짧은 단일 가닥의 RNA로, 표적 유전자를 암호화하는 염기서열 중 표적 DNA에 특이적인 RNA를 의미하며, 표적 DNA 염기서열과 전부 또는 일부가 상보적으로 결합하여 해당 표적 DNA 염기서열로 엔도뉴클레아제 단백질을 이끄는 역할을 하는 리보핵산을 의미한다. 상기 가이드 RNA는 두 개의 RNA, 즉, crRNA (CRISPR RNA) 및 tracrRNA (trans-activating crRNA)를 구성 요소로 포함하는 이중 RNA (dual RNA); 또는 표적 유전자 내 염기서열과 전부 또는 일부 상보적인 서열을 포함하는 제1 부위 및 엔도뉴클레아제(특히, RNA-가이드 뉴클레아제)와 상호작용하는 서열을 포함하는 제2 부위를 포함하는 단일 사슬 가이드 RNA(single guide RNA, sgRNA) 형태를 말하나, 엔도뉴클레아제가 표적 염기서열에서 활성을 가질 수 있는 형태라면 제한없이 본 발명의 범위에 포함될 수 있으며, 함께 사용된 엔도뉴클레아제의 종류 또는 엔도뉴클레아제의 유래 미생물 등을 고려하여 당업계의 공지된 기술에 따라 제조하여 사용할 수 있다.
또한, 상기 가이드 RNA는 플라스미드 주형으로부터 전사된 것, 생체 외(in vitro)에서 전사된(transcribed) 것 (예컨대, 올리고뉴클레오티드 이중가닥) 또는 합성한 가이드 RNA 등일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명에 따른 반수체가 유도된 유전체 교정 식물체의 제조방법에 있어서, 상기 엔도뉴클레아제 단백질은 Cas9, Cpf1 (also known as Cas12a), TALEN (Transcription activator-like effector nuclease), ZFN (Zinc Finger Nuclease) 또는 이의 기능적 유사체로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상일 수 있고, 바람직하게는 RNA-가이드 뉴클레아제인 Cas9 또는 Cpf1 등일 수 있으며, 더욱 바람직하게는 Cas9 단백질일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
또한, 상기 Cas9 단백질은 스트렙토코커스 피요제네스(Streptococcus pyogenes) 유래의 Cas9 단백질, 캠필로박터 제주니(Campylobacter jejuni) 유래의 Cas9 단백질, 스트렙토코커스 써모필러스(S. thermophilus) 또는 스트렙토코커스 아우레우스(S. aureus) 유래의 Cas9 단백질, 네이쎄리아 메닝기티디스(Neisseria meningitidis) 유래의 Cas9 단백질, 파스투렐라 물토시다(Pasteurella multocida) 유래의 Cas9 단백질, 프란시셀라 노비시다(Francisella novicida) 유래의 Cas9 단백질 등으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. Cas9 단백질 또는 이의 유전자 정보는 NCBI(National Center for Biotechnology Information)의 GenBank와 같은 공지의 데이터베이스에서 얻을 수 있다. 상기 Cas9 유전자 정보는 공지된 서열을 그대로 사용할 수도 있고, 형질도입되는 대상(유기체)의 코돈에 최적화된 서열을 사용할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
Cas9 단백질은 RNA-guided DNA 엔도뉴클레아제 효소로, 이중 가닥 DNA 절단(double stranded DNA break)을 유도한다. Cas9 단백질이 정확하게 표적 염기서열에 결합하여 DNA 가닥을 잘라내기 위해서는 PAM (Protospacer Adjacent Motif)이라 알려진 3개의 염기로 이루어진 짧은 염기서열이 표적 염기서열 옆에 존재해야 하며, Cas9 단백질은 PAM 서열(NGG)로부터 3번째와 4번째 염기쌍 사이를 추정하여 절단한다.
본 발명에 따른 반수체가 유도된 유전체 교정 식물체의 제조방법에 있어서, 사용된 CRISPR/Cas9 시스템은 교정하고자 하는 특정 유전자의 특정위치에 이중나선 절단을 도입하여 DNA 수선 과정에서 유도되는 불완전 수선에 의한 삽입-결실(insertiondeletion, InDel) 돌연변이를 유도시키는 NHEJ(non-homologous end joining) 기작에 의한 유전자 교정 방법이다.
본 발명에 따른 반수체가 유도된 유전체 교정 식물체의 제조방법에 있어서, 상기 (a) 단계의 가이드 RNA 및 엔도뉴클레아제 단백질을 식물세포에 도입하는 것은, 벼 유래 pPLAⅡη 단백질 코딩 유전자의 표적 염기서열에 특이적인 가이드 RNA를 암호화하는 DNA 및 엔도뉴클레아제 단백질을 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 재조합 벡터; 또는 벼 유래 pPLAⅡη 단백질 코딩 유전자의 표적 염기서열에 특이적인 가이드 RNA와 엔도뉴클레아제 단백질의 복합체(ribonucleoprotein);를 이용하는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 일 구현 예에 있어서, 상기 벼 유래 pPLAⅡη 단백질 코딩 유전자의 표적 염기서열은 서열번호 4 또는 서열번호 5의 염기서열로 이루어진 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명에 따른 반수체가 유도된 유전체 교정 식물체의 제조방법에 있어서, 상기 표적 염기서열에 특이적인 가이드 RNA를 암호화하는 DNA 및 엔도뉴클레아제 단백질을 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 재조합 벡터를 식물세포에 도입하는 것은 형질전환 방법을 의미한다. 식물 종의 형질전환은 이제는 쌍자엽 식물뿐만 아니라 단자엽 식물 양자를 포함한 식물 종에 대해 일반적이다. 원칙적으로, 임의의 형질전환 방법은 본 발명에 따른 재조합 벡터를 적당한 선조 세포로 도입시키는데 이용될 수 있다. 식물 종의 형질전환 방법은 전술한 것과 같다.
본 발명은 또한, 식물체에서 벼 유래 pPLAⅡη 단백질 코딩 유전자의 발현을 조절하는 단계를 포함하는, 식물체의 염색체 수를 조절하는 방법을 제공한다.
본 발명의 일 구현 예에 따른 식물체의 염색체 수를 조절하는 방법에 있어서, 상기 벼 유래 pPLAⅡη 단백질 코딩 유전자의 발현 조절은 벼 유래 pPLAⅡη 단백질 코딩 유전자의 발현을 저해하여 식물체의 염색체 수를 감소시키는 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 일 구현 예에 있어서, 상기 벼 유래 pPLAⅡη 단백질을 코딩하는 유전자의 발현 억제는 벼 유래 pPLAⅡη 단백질 코딩 유전자에 VIGS (Virus-induced gene silencing) 시스템, RNAi 또는 안티센스 RNA, T-DNA 삽입, 내생 트랜스포존(transposon), X-레이 또는 γ-레이 조사를 통한 돌연변이 유발, 또는 CRISPR/Cas9 유전자 교정 시스템 등을 이용하여 벼 유래 pPLAⅡη 단백질 코딩 유전자의 발현을 저해(억제)하는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않으며, 유전자의 발현을 저해하는 당업계의 통상의 방법이면 모두 가능할 수 있다.
이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.
재료 및 방법
1. 벼 식물체 및 생장 조건
본 발명에서는 동진벼 품종 (Oryza sativa ssp. japonica cv. Dongjin)을 유전자 교정 개체 제조에 사용하였다. 동진벼 및 OspPLAⅡη 유전자 교정 벼는 28℃, 장일조건(16 h light/8 h dark)의 생장 챔버 또는 경희대학교 수원캠퍼스 LMO 포장에서 생장시켰다.
2. OSpPLAⅡη 유전자 편집 개체 확보방법
CRISPR-Cas9를 활용하여 OspPLAⅡη (LOC_Os09g28770) 유전자 편집을 진행하였다. OspPLAⅡη의 첫 번째 또는 두 번째 엑손에 위치하는 서열을 표적으로 하는 2개의 single guide RNA (sgRNA)를 CRISPR RGEN Tools (http://www.rgenome.net/)을 사용하여 디자인하였다. PAM 자리를 제외한 20 bp의 합성된 sgRNA 올리고머를 상보적인 서열과 결합시킨 후 pRGEB32 벡터의 BsaI 제한효소 자리에 클로닝하였다.
Figure 112022033629720-pat00001
이후 sgRNA 서열을 포함하는 컨스트럭트들을 아그로박테리움 투머파시엔스(Agrobacterium tumefaciens) LBA4404에 도입하였고 벼 캘러스를 이용한 아그로박테리움 매개 공동 배양 방법(Lee et al., 1999. Journal of Plant Biology 42(4):310-316)을 통해 벼 식물체를 형질전환하여 형질전환체를 확보하였다. 유전자 편집 개체의 경우 sgRNA가 타겟으로 하는 DNA 염기서열을 포함한 부분을 증폭 및 정제한 뒤 표적 심층 서열분석(targeted deep seqencing)을 통해서 OspPLAⅡη 유전자가 교정된 식물체 계통을 확인하였다.
3. 유세포분석기를 활용한 배수성 분석
벼 유세포 분석을 위한 샘플 준비과정은 CyStainTM PI Absolute P (05-5022, Sysmex, Germany)의 사용 설명서를 따라 진행하였다. 2주령의 벼 잎 조직 (0.5 cm x 0.5 cm 크기)에 100 ㎕의 핵 추출 용액을 처리 후 면도날을 사용하여 잘게 파쇄하였다. 이후 propidium iodide 염색 시약을 400 ㎕ 처리한 뒤 30 μm CellTricTM 필터를 통해 크기가 큰 잎 조직을 제거하였다. 이후 암조건에서 20분간 반응한 뒤에 유세포분석기(Guava® Muse® Cell Analyzer, Luminex, USA)를 사용하여 DNA 함량 분석을 진행하였다. 이배체인 동진벼의 DNA 함량을 분석하여 나타난 G1 peak를 이배체(2n) peak로 기준을 잡고 기준에 비해 절반 크기의 DNA 함량을 보이는 peak를 반수체(n) peak로 판단하였다.
실시예 1. OSpPLAⅡη 유전자 편집 식물체의 표현형 및 수정률 분석
CRISPR-Cas9를 활용하여 OspPLAⅡη 유전자의 편집을 시도하였고, 유전자 편집 개체를 대상으로 표적 부위 염기서열 분석을 수행하여 단백질 번역의 조기종결 돌연변이가 나타난 개통을 선발하였다(도 4 및 표 2).
OspPLAⅡη 유전자 편집 유형에 따른 단백질 번역의 변화
계통 편집 유형 단백질 변화
SgOspplaⅡη-1#5 +1 bp (+A) 49번째 아미노산에서 조기 종결
SgOspplaⅡη-1#12 +1 bp (+T) 145번째 아미노산에서 조기 종결
SgOspplaⅡη-1#18 +1 bp (+T) 145번째 아미노산에서 조기 종결
SgOspplaⅡη-2#5 +1 bp (+A) 259번째 아미노산에서 조기 종결
OspPLAⅡη 유전자 편집에 따른 효과를 알아보기 위해, 동일 조건에서 3개월 생장시킨 동진벼(WT), OspPLAⅡη 유전자 편집 개체들의 표현형 및 종자 수정률을 분석하였다. 그 결과, 동진벼 및 유전자 편집 벼의 초장에는 큰 차이가 나타나지 않았으나, OspPLAⅡη 유전자 편집된 개체들에서 이삭의 낟알 수가 동진벼 대비 감소된 것을 관찰할 수 있었다. 또한, 종자의 수정률을 분석한 결과, OspPLAⅡη 유전자 편집 개체들이 동진벼 대비 현저히 감소된 수정률을 나타내어, OspPLAⅡη 유전자의 기능상실은 벼 식물체의 수정률을 감소시키는 영향이 있음을 알 수 있었다(도 5).
실시예 2. OspPLAⅡη 유전자 편집 개체의 자가수정을 통한 반수체 유도율 검정
OspPLAⅡη 유전자 편집 개체(SgOspplaⅡη-1#5)의 자가수정을 통해 생성된 개체의 표현형 및 DNA 함량을 분석하였다. 그 결과, 일부 OspPLAⅡη 유전자 편집 개체는 동진벼와 유사한 생육 상태를 보여주었으나, 일부 OspPLAⅡη 유전자 편집 개체에서는 동진벼 대비 저해된 생육 상태가 관찰되었고, 상기 개체들의 잎을 이용한 유세포 분석 결과, 생육이 저해된 OspPLAⅡη 유전자 편집 개체들은 염색체 수가 반감된 반수체 상태임을 확인할 수 있었다(도 6 및 도 7).
또한, 각기 다른 돌연변이 형태를 나타내는 OspPLAⅡη 유전자 편집 계통들을 이용하여 자가수정을 통한 반수체 유도율을 분석하였다. 그 결과, 동형으로 OspPLAⅡη 유전자가 편집된 계통(#5, #12, #18)의 경우 평균 6.33%로 반수체 식물체가 유도되었다.
OspPLAⅡη 유전자 편집 계통들의 자가수정을 통한 반수체 유도율 검정 결과
Event HIR* (haploid plant/total analyzed plant)
동진벼 (WT) 0.00% (0/52)
SgOspplaⅡη-1 #5
(+A, homo)		 6.00% (12/200)
SgOspplaⅡη-1 #12
(+T, homo)		 3.50% (6/171)
SgOspplaⅡη-1 #18
(+T, homo)		 11.01% (13/118)
Average 6.33% (31/489)
* HIR: haploid induction rate.
<110> INDUSTRY FOUNDATION OF CHONNAM NATIONAL UNIVERSITY Pusan National University Industry-University Cooperation Foundation <120> pPLAII eta gene inducing haploid plant and uses thereof <130> PN22075 <160> 5 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 2563 <212> DNA <213> Oryza sativa <400> 1 atggagagtg aaaaacatat catttgtaga catccaccaa cttatggcaa cctcataaca 60 gttctctcga ttgatggtgg agggattcga ggaatcattc cagctgttgt tcttaccttt 120 ctagaatcag agttgcaggt aaatatttat gttatactat gagttccatt tcgtggccaa 180 ggcaactcta acttgtcgag agataagttc caaggacaag ggaaaactgg tgctctaggg 240 ttaggaaacg gcatttgttt ggtttgcttg ttttaaattt aaaccattta gattcaaact 300 taattcagta accatatctt tctataaatt aagacatcct ttcgtttcga agtagatctt 360 aattcttaaa aaccttttgc attagtgcca gaatgagatt tactgatctt ttctgccata 420 tgttctgtct ttagccattt cttttatgca gatgtaattg ttcaacagtt gctcaggttt 480 ttcagcattt ctttctgcat cgaatattcc gaattcattt ttgatacggc tggaacagcc 540 ataacaatta ttctgctaat tgagaaaatc tgattgttat gtcccatcta tagatggtga 600 attgaatgtt 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Ile Pro Ala Val Val Leu Thr Phe Leu Glu Ser Glu Leu Gln Lys Leu 35 40 45 Asp Gly Glu Glu Ala Arg Ile Ala Asp Tyr Phe Asp Val Ile Ala Gly 50 55 60 Thr Ser Thr Gly Gly Leu Val Thr Ala Met Leu Ala Ala Pro Asn Lys 65 70 75 80 Lys Arg Arg Pro Leu Phe Ala Ala Lys Asp Ile Lys Ala Phe Tyr Met 85 90 95 Asn His Ala Pro Lys Ile Phe Pro Gln Leu Arg Gly Pro Phe Gly Arg 100 105 110 Met Met Arg Ile Phe Arg Ser Met Ser Gly Pro Ser Tyr Asp Gly Lys 115 120 125 His Leu His Glu Val Val Arg Glu Lys Leu Gly Ser Thr Arg Leu His 130 135 140 Gln Thr Leu Thr Asn Val Val Ile Pro Thr Phe Asp Ile Lys Trp Leu 145 150 155 160 Gln Pro Thr Ile Phe Ser Ser Tyr Glu Val Lys Lys Lys Asn Asn Asn 165 170 175 Thr Met Asp Ala Leu Leu Ser Asp Ile Cys Ile Ser Thr Ser Ala Ala 180 185 190 Pro Thr Tyr Leu Pro Ala His Phe Phe Arg Thr Glu Asp Cys His Gly 195 200 205 Asn Ile Lys Glu Phe Asn Leu Ile Asp Gly Gly Val Ala Ala Asn Asn 210 215 220 Pro Ala Leu Val Ala Ile Gly Glu Val Ser Lys Gln Ile Phe Lys Lys 225 230 235 240 Asn Pro Asp Phe Phe Pro Val Lys Pro Met Asp Tyr Gly Arg Phe Leu 245 250 255 Val Ile Ser Leu Gly Thr Gly Ser Pro Lys Ile Glu Gly Lys Tyr Asn 260 265 270 Ala Gln Lys Ala Lys Ser Trp Gly Val Leu Asp Trp Leu Leu Val Gly 275 280 285 Gly Ser Thr Pro Leu Val Asp Ile Phe Thr Gln Ala Ser Ala Asp Met 290 295 300 Val Asp Ile His Ile Ala Ala Val Phe Lys Val Leu His Ser Glu Gln 305 310 315 320 Asn Tyr Leu Arg Ile Gln Asp Asp Thr Leu Glu Gly Thr Leu Ala Ser 325 330 335 Val Asp Val Ala Thr Arg Asp Asn Leu Glu Lys Leu Ala Asn Val Gly 340 345 350 Glu Ile Leu Leu Asn Lys Pro Val Ser Arg Ala Asn Leu Glu Thr Gly 355 360 365 Gln Met Met Pro Ala Cys Asp Asp Ser Glu Ile Thr Asn Gly Glu Ala 370 375 380 Leu Lys Arg Phe Ala Arg Leu Leu Ser Asp Glu Lys Arg Ile Arg Glu 385 390 395 400 Ala Arg Ser Pro Lys 405 <210> 4 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SgOspPLAII eta-1 <400> 4 ctgcaactct gattctagaa agg 23 <210> 5 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SgOspPLAII eta-2 <400> 5 cattgctggg actagcacag ggg 23

Claims (10)

  1. 삭제
  2. 삭제
  3. 서열번호 3의 아미노산 서열로 이루어진 벼 유래 pPLAⅡη 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는 재조합 벡터로 식물세포를 형질전환시켜 pPLAⅡη 유전자의 발현을 저해하는 단계; 및
    상기 형질전환된 식물세포로부터 형질전환된 식물체를 재분화하는 단계;를 포함하는, 반수체(haploid) 식물의 제조방법.
  4. 제3항의 방법에 의해 제조된 반수체(haploid) 식물체.
  5. 제4항에 따른 식물체의 종자.
  6. (a) 서열번호 3의 아미노산 서열로 이루어진 벼 유래 pPLAⅡη 단백질을 코딩하는 유전자의 표적 염기서열에 특이적인 가이드 RNA(guide RNA) 및 엔도뉴클레아제(endonuclease) 단백질을 식물세포에 도입하여 유전체를 교정하는 단계; 및
    (b) 상기 유전체가 교정된 식물세포로부터 식물체를 재분화하는 단계;를 포함하는, 반수체(haploid)가 유도된 유전체 교정 식물체의 제조방법.
  7. 제6항에 있어서, 상기 (a) 단계의 가이드 RNA 및 엔도뉴클레아제 단백질을 식물세포에 도입하는 것은, 서열번호 3의 아미노산 서열로 이루어진 벼 유래 pPLAⅡη 단백질을 코딩하는 유전자의 표적 염기서열에 특이적인 가이드 RNA를 암호화하는 DNA 및 엔도뉴클레아제 단백질을 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 재조합 벡터; 또는 서열번호 3의 아미노산 서열로 이루어진 벼 유래 pPLAⅡη 단백질을 코딩하는 유전자의 표적 염기서열에 특이적인 가이드 RNA와 엔도뉴클레아제 단백질의 복합체(ribonucleoprotein);를 이용하는 것을 특징으로 하는, 반수체가 유도된 유전체 교정 식물체의 제조방법.
  8. 삭제
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