KR20190088512A - 동시 유전자 편집 및 반수체 유도 - Google Patents

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Abstract

본원에 개시된 청구주제는 (기존 또는 생성된) 반수체 유도 계통을 사용하고, 반수체 계통이 유전자를 편집할 수 있는 세포 기구를 암호화하도록 반수체 계통을 형질 전환하는 것에 관한 것이다. 형질 전환된 반수체 유도 계통은 2개의 식물 사이의 교배에서의 부모로서 사용된다. 수분 동안에 부모 생식세포는 융합하여 배아를 형성하고; 또한 유전자 편집 기구는 이 시기에 배아로 전달된다. 배아 발생 동안에 한 세트의 부모 염색체가 소실되고, 유전자 편집 기구는 나머지 염색체 세트 상에서 작용한다. 따라서, 교배로 인해, 편집된 유전자를 갖는 적어도 하나의 반수체 자손이 생산된다.

Description

동시 유전자 편집 및 반수체 유도
본 발명은 식물 생명공학 분야, 구체적으로는 식물 육종뿐만 아니라 농업 생명공학 및 유전자 편집 분야에 관한 것이다. 본원에 개시된 청구주제는 (기존 또는 생성된) 반수체 유도 계통을 사용하고 반수체 유도 계통이 유전자를 편집할 수 있는 세포 기구를 암호화하는 DNA를 함유하도록 반수체 유도 계통을 형질 전환하는 것에 관한 것이다.
서열 목록
본 출원에는 2017년 12월 4일자로 생성된 대략 334킬로바이트 크기의 81189_ST25.txt란 표제의 서열 목록이 첨부되어 있다. 이러한 서열 목록은 그 전체가 본원에서 참고로 포함된다. 이러한 서열 목록은 여기에 EFS-Web을 통해 제출되어 있으며, 37 C.F.R. § 1.824(a)(2)-(6) 및 (b)를 준수한다.
표적화 돌연변이 유발("유전자 편집"으로도 공지됨)은 농작물 육종에 있어서 매우 중요한 기술이다. 현재 CRISPR, TALEN, 메가뉴클레아제 및 징크 핑거(zinc finger)를 비롯하여 특정 유전자 표적을 편집하기 위한 수많은 방법이 존재한다. 편집 기구를 식물 내로 도입하기 위한 하나의 방법은 아그로박테리움(Agrobacterium)을 이용하거나 식물 조직의 바이오리스틱 형질 전환(biolistic transformation)을 이용하는 것이다. 형질 전환에서, 편집 기구를 암호화하는 DNA(예를 들어, CAS9 및 가이드 RNA)는 식물 캘러스, 종자 또는 배아 조직 내로 도입된다. 이어서, 안정하게 형질 전환된 식물("이벤트(event)")이 회수되는데, 선택적으로는 선택 마커의 도움으로 회수된다. 그러나 조직 배양이 유전자형 의존성이기 때문에 이러한 경로는 모든 농작물에 대해 유효하지 않거나, 심지어 이것이 유효한 농작물의 모든 변종에 대해서도 유효하지 않을 것이다. 이들은 형질 전환-저항성 농작물 또는 변종으로서 알려져 있다. 이들 농작물 또는 변종은 이들의 성능으로 인해 가치 평가될 수 있지만, 이들이 형질 전환될 수 없어서 형질 전환을 통해 직접 편집될 수 없다는 것이 생명공학에서의 하나의 과제이다. 저항성 변종에 있어서, 바람직한 돌연변이를 도입하기 위해 2개의 대안적인 접근법 중 하나가 사용될 수 있다. 먼저, 하나의 접근법에서는 형질 유전자 이입(trait introgression)을 통해 편집체를 도입할 수 있다. 이러한 경로는 고가이며, 힘이 들고, 시간이 걸린다. 이는 또한 유전자 연관으로 인해 최종 산물의 불순물을 의미한다. 즉, 형질 전환 가능한 공여자 계통에서 유래하는 유전자 및 대립 유전자를 함유하는, 유전자 이입된 편집체를 둘러싼 연관 블록이 존재할 것이다. 이러한 연관은, 임의의 이들의 유전자 또는 대립 유전자가 형질 전환-저항성 계통("우량 계통"로도 지칭될 수 있음)의 성능에 영향을 미치는 경우에 문제가 될 수 있다. 두 번째로, 다른 접근법에서는 아라비돕시스(Arabidopsis) 형질 전환용 꽃 침지(floral dipping)와 같은 조직 배양 없이 편집 기구를 재배 식물에 일시적으로 도입할 수 있다. 어려운 점은, 편집체가 생식 계통에 기여하는 세포에 정착하는 것을 보장하여 자손 종자에 전달되도록 하는 것이다. 농작물에서 이를 수행하기 위한 확립된 방법 또는 통상의 방법이 거의 존재하지 않는다.
이에, 본 발명자들은 반수체 유도 동안에 일시적으로 편집 기구를 도입하기 위한 새로운 방법을 제시한다. 반수체 유도("HI")는 수정 동안 또는 그 이후, 종종 초기 배아 발생 동안 배아로부터 하나의 부모 염색체(반수체 유도체 부모에서 유래하는 염색체) 세트의 손실을 특징으로 하는 부류의 식물 현상이다. 또한 반수체 유도는, 유도체 계통이 교배 시에 웅성으로서 사용되는 경우에 자성생식(gynogenesis)으로 알려져 있거나, 유도체 계통이 교배 시에 자성으로서 사용되는 경우에 동정생식(androgenesis)으로 알려져 있다. 반수체 유도는 수수, 보리, 밀, 옥수수, 아라비돕시스 및 다수의 기타 종과 같은 수많은 식물종에서 관찰되고 있다.
흔히, 반수체 유도 동안에 유도 교배에 사용되는 부모 계통은 둘 모두 이배체이어서 이들의 생식세포(난세포 및 정자세포)는 반수체이다. 반수체 유도는 종종 유도체 계통의 중간 내지 낮은 침투 형질이어서 얻어진 자손은 종 또는 상황에 따라 이배체(어떠한 유전체 손실도 발생하지 않는 경우) 또는 반수체(유전체 손실이 실제 발생한 경우)일 수 있다. 반수체 유도체와 교배된 부모 계통이 이배체가 아니거나, 오히려 사배체, 6배체 또는 보다 높은 배수성을 갖는 기타 식물인 경우, 반수체 유도란 용어는 다소 잘못된 용어이며, 이는 생산된 "반수체" 자손이 생식 염색체 개수를 가질 것이며, 따라서 실제로는 반수체가 아니라 오히려 이배체(부모가 사배체인 경우) 또는 삼배체(부모가 6배체인 경우) 등일 수 있다. 따라서, 본원에서 사용된 바와 같이, "반수체"는 한쪽 부모 염색체의 개수의 절반을 가지며; 따라서 이배체 생물(예를 들어, 옥수수)의 반수체는 일배성을 나타내고; 사배체 생물(예를 들어, 독보리(ryegrass))의 반수체는 이배성을 나타내며; 6배체 생물(예를 들어, 밀)의 반수체는 삼배성을 나타낸다.
반수체 유도는 동일한 종 내의 2개의 계통의 자가 수분 또는 이종교배 동안에 발생할 수 있거나, 이는 원연 교배(wide cross; 이는 혼성화 장벽으로서 간주될 수 있음) 동안에 발생할 수 있어서, 종간 혼성체의 형성을 방지할 수 있다. 옥수수에서, 가장 흔하게 이용되는 반수체 유도 방법은 1번 염색체의 영역의 재배열, 이의 돌연변이 및/또는 재조합, 삽입 또는 결실에 의해 주로 개시되는 종내 반수체 유도체 웅성 계통, 구체적으로는 NOT LIKE DAD1(NLD1) 및 포스포리파아제 A1(PLA1)로도 공지된 MATRILINEAL(MATL) 유전자(3번 염색체 상의 INDETERMINATE GAMETOPHYTE1 유전자 내 돌연변이의 결과인 ig형 반수체 유도를 특별히 예외로 함)의 사용을 통한 것이다. 밀에서, 가장 흔한 반수체 유도 방법은 옥수수 화분에 대한 원연 교배에 의한 것이며, 부모 유전자형 또는 혈통과는 무관하게 이는 거의 모든 옥수수 화분에 의해 교배된 거의 모든 밀에 작용한다.
HI 옥수수 계통은 반수체 유도의 변이의 적어도 66%에 관여하는 1번 염색체 상에 양적 형질 유전자위("QTL")를 함유한다. QTL은 다양한 배경 내로 유전자 이입되는 경우에 서로 다른 속도로 반수체 유도를 유발한다. 종자 산업에 사용되는 모든 옥수수 반수체 유도체 계통은 Stock6로 공지된 창립 HI 계통의 유도체이며, 이들 모두는 1번 염색체 QTL의 반수체 유도체에서의 돌연변이를 갖는다.
옥수수에서, 반수체 종자 또는 배아는 반수체 유도체 웅성(즉, "반수체 유도체 화분")과 당업자가 선택한 사실상 모든 이삭 사이에서 교배함으로써 특이적으로 생산되며; 이삭은 임의의 동종교배, 혼성체 또는 기타 생식질일 수 있다. 반수체는 반수체 유도체 화분 DNA가 배아의 제1 세포분열을 통해 완전히 전달 및/또는 유지되지 않는 경우에 생산된다. 얻어진 표현형은 완전 투과성이 아니며, 이때 일부 밑씨(ovule)는 반수체 배아를 함유하고, 기타 밑씨는 이배체 배아, 이수체 배아, 키메라 배아 또는 발육 정지된 배아를 함유한다. 정상 삼배체 내배유(triploid endosperm) 이외에도 반수체 종실(haploid kernel)은 모계 DNA만을 함유하는 배아를 갖는다. 반수체 유도 이후, 반수체 배아 또는 종자는 전형적으로 표현형 또는 유전자 마커 스크린을 이용하여 이배체 및 이수체 자매로부터 분리되고, 반수체 식물로 성장 또는 배양된다. 이이서, 이들 식물은 자연적으로 또는 화학적 조작(예를 들어, 콜히친과 같은 항미소관제의 사용)을 통해 배가 반수체("DH") 식물로 전환되며, 이어서 이 같은 식물은 동종교배 종자를 생산한다.
식물 육종은 배가 반수체(DH) 식물의 사용에 의해 조장된다. DH 식물의 생산에 의해 식물 육종가는 다세대 동계 교배 없이 동종교배 계통을 얻을 수 있게 되며, 그 결과 동형 접합성 식물을 생산하는데 필요한 시간을 감소시킨다. DH 식물은, 특히 동종교배 계통의 생성, QTL 매핑, 세포질 변환, 형질 유전자 이입 및 고출력 형질 개선을 위한 F2 스크리닝을 위해 식물 육종가에게 유용한 도구를 제공한다. 동형 접합성 계통이 본질적으로 1세대에서 생성되므로 시간이 많이 절약되며, 따라서 다세대 단일 종자 계통(통상적인 동계 교배)이 필요 없게 된다. 특히, DH 식물이 전적으로 동형 접합성이기 때문에 이들은 양적 유전학 연구에 매우 바람직하다. 반수체 종자의 생산은 배가 반수체 육종 과정에 매우 중요하다. 반수체 종자는 Stock 6 및 Stock 6-유도 계통과 같은 자성 생식성 유도체에서 유래하는 화분에 의해 수정되는 경우에 모계 생식질 상에서 생산된다.
이제, 본 발명자들에 의해 생체 내 반수체 유도 과정이 반수체 유도체 부모(이식 유전자로서 안정하게 통합되거나 일시적으로 발현됨)에 편집 기구를 포함시킴으로써 이를 임의의 생식질 내로 일시적으로 도입하도록 선택될 수 있는 신규한 방법이 기술된다. 반수체 유도 및 동시 편집은 원연 교배 또는 데보노(de novo) 반수체 유도, 예를 들어 CENH3 돌연변이(즉, CENH3-변형 반수체 유도체; 예를 들어 본원에서 그 전체가 참고로 포함되는 WO 2017/004375 참조) 또는 지질 분무(본원에서 그 전체가 참고로 포함되는 PCT 특허 출원 제PCT/US2016/62548호 참조)를 통해 거의 모든 농작물에서 이루어질 수 있다. 본 발명자들은 반수체 유도체 웅성을 편집용 공여자 계통으로서 사용하여 옥수수(사료용 옥수수 및 사탕 옥수수 둘 모두) 내의 HI의 예를 보여준다. 게다가, 본 발명자들은 CENH3-변형 반수체 유도체 계통을 사용하여 아라비돕시스 내의 HI의 예를 보여준다.
또한 본 발명자들은 원연 교배에서 옥수수 화분을 편집용 공여자 계통으로서 사용하여 밀 내의 HI의 예를 보여준다. 밀, 벼, 보리, 브래시카(brassica) 및 기타 농작물에서, 반수체 유도에 대한 경로는 원연 교배를 통해 반수체를 유도하는 화분 공여자를 사용하는 것일 수 있다. 예를 들어, 밀에 대해 옥수수 화분을 사용하고, 밀에 대해 기장 화분을 사용하고, 보리 화분을 기타 보리 종에 대해 사용할 수 있거나, 임의의 기타 원연 교배 방법을 사용할 수 있다. 이들 자성 생식성 반수체 유도의 경우, 편집 기구는 반수체 유도 과정에서 제거되는 웅성(화분 유래) DNA이기 때문에 웅성 계통이 이를 함유하는 것이 바람직할 수 있다. 동정생식성 반수체 유도의 경우, 예를 들어 옥수수 내의 ig1 시스템에서 또는 임의의 농작물(웅성 또는 자성을 통해 작용할 수 있음)에서의 변경된 CENH3을 통해 편집 기구는 자성 부모(female parent)에 최적으로 존재할 수 있는데, 이는 자성 염색체가 반수체 유도 과정에서 제거되기 때문이다.
반수체 유도 및 동시 편집에서, 조직 배양 없이 농작물 및 우량 계통을 신속하고 비용 효율적으로 편집("편집용 최종 계통(editing destination line)")하는 것이 목표이다. 편집체를 받아들이는 계통은 우량 생식질일 수 있으며, 편집 기구 자체는 반수체 유도 과정 동안에 제거될 수 있다. 동시에, 편집된 배가 반수체 계통이 생산된다.
조직 배양 저항성은 농작물 전체에 걸쳐 우량 계통의 신속한 편집에 있어서 주요 과제이다. 반수체 유도 계통을 사용하여 표적화 돌연변이 유발 기구를 우량 계통에 전달하고 동시에 반수체를 유도한다는 것은 이러한 주요 장애에 대한 극복을 나타낸다. 차세대 육종 프로그램이 이러한 과정에 의존하게 될지도 모른다.
편집 기구는 유도체 계통을 통해 전달된다. 편집 기구는, 주로 일부 경우에 RNA와 결합되어 있고 또한 일부 경우에는 DNA와도 결합되어 있는 DNA-결합 단백질이다. 편집 기구를 구성하는 DNA, RNA 및 단백질은, 예를 들어 충격(bombardment) 또는 아그로박테리움 매개 형질 전환을 통해 유도체에 안정하게 삽입되었기 때문에 유도체 계통에 의해 암호화되거나 여기에 존재한다. 기타 예에서, 편집 기구는 수정 이전에 (외생성 인가를 통해) 일시적으로 도입되거나, 배우체에서 일시적으로 발현된다. 수정 후, 유도체 염색체의 제거 이전 또는 동안에 비-유도체 표적 유전자 내에서 편집 기구에 의해 편집체가 만들어진다. 그 결과는, 비-유도체 부모에서만 유래하는 염색체 세트를 함유하는 반수체 배아 또는 식물 또는 종자이며, 이때 염색체 세트는 편집되어 있는 DNA 서열을 함유한다. 이들 편집된 반수체가 동정되고 배양될 수 있으며, 이들의 염색체는 바람직하게는 콜히친 또는 기타 유사분열 억제제에 의해 배가될 수 있다. 이어서, 이러한 계통은 하류 육종 프로그램에서 직접 사용될 수 있다.
하나의 실시형태에서, 본 발명은 식물의 유전체 DNA를 편집하는 방법을 제공한다. 이는, 제1 식물(반수체 유도 식물이며, 또한 편집을 달성하는데 필요한 기구(예를 들어, Cas9 효소 및 가이드 RNA)를 이의 DNA 내로 암호화하고 있음)을 채취하고, 이러한 제1 식물의 화분을 이용하여 제2 식물을 수분시킴으로써 이루어진다. 제2 식물은 편집될 식물이다. 수분 이벤트에서, 자손(예를 들어, 배아 또는 종자)가 생산되며; 이들 중 적어도 하나는 반수체 종자일 수 있다. 이러한 반수체 종자는 오직 제2 식물의 염색체를 함유할 것이고; 제1 식물의 염색체는 사라지게 되지만(제거, 손실 또는 퇴화됨), 이렇게 되기 전에 제1 식물의 염색체는 유전자 편집 기구가 발현되도록 한다. 다음으로 이론과 결부되지 않으려는 한, 제1 식물은 수분 시에 화분관을 통해 이미 발현된 편집 기구를 전달한다. 또는, 반수체 유도체 계통이 교배 시에 자성인 경우, 반수체 유도 식물의 난세포는 "야생형" 또는 비-반수체 유도 화분립에 의한 수정 시에 존재하거나 아마도 이미 발현되어 있는 편집 기구를 함유한다. 임의의 이들 경로를 통해, 교배에 의해 수득된 반수체 자손의 유전체도 편집되게 될 것이다.
하나의 양태에서, 편집 기구는 임의의 DNA 변형 효소이지만, 바람직하게는 부위 특이적 뉴클레아제이다. 부위 특이적 뉴클레아제는 바람직하게는 CRISPR 기반이지만, 또한 메가뉴클레아제, 전사 활성인자 유사 효과기 뉴클레아제(TALEN) 또는 징크 핑거 뉴클레아제일 수 있다. 본 발명에서 사용된 뉴클레아제는 Cas9, Cfp1, dCas9-FokI, 키메라 FEN1-FokI일 수 있다. 하나의 양태에서, DNA 변형 효소는 Cas9-시티딘 데아미나아제 또는 Cas9-아데닌 데아미나아제와 같은 부위 특이적 염기 편집 효소이며, 여기서 Cas9는 이의 뉴클레아제 활성의 불활성화, 즉 시티딘 데아미나아제 또는 아데닌 데아미나아제에 융합된 Cas9(dCas9) 활성의 비활성화 또는 키메라 Cas9 닉카아제(nCas9) 중 하나 또는 둘 모두를 가질 수 있다. 선택적인 가이드 RNA는 편집되어야 할 특이적 부위에서 유전체를 표적화한다. 하나의 양태에서, 선택적인 가이드 RNA는 서열번호 2, 서열번호 4, 서열번호 8, 서열번호 21, 서열번호 23, 서열번호 25, 서열번호 29, 서열번호 32 및 서열번호 33 중 임의의 것과 상동성을 갖는, 18개 내지 21개로 구성된 뉴클레오티드 서열을 포함한다.
편집된 반수체 자손이 수득되면, 이의 염색체는 선택적으로 염색체 배가제(예를 들어 콜히친, 프로나미드, 디티오피르, 트리플루라린 또는 다른 공지된 항미소관제)에 의해 배가될 수 있다.
하나의 실시형태에서, 제1 식물은 외떡잎식물 또는 쌍떡잎식물이다. 제1 식물의 양태로는 옥수수, 밀, 벼, 보리, 귀리, 라이밀(triticale), 수수, 진주 기장, 테오신트(teosinte), 대나무, 사탕수수, 아스파라거스, 양파 및 마늘을 들 수 있다. 하나의 실시형태에서, 제2 식물은 외떡잎식물 또는 쌍떡잎식물이다. 제2 식물의 양태로는 옥수수, 밀, 벼, 보리, 귀리, 라이밀, 수수, 진주 기장, 테오신트, 대나무, 사탕수수, 아스파라거스, 양파 및 마늘을 들 수 있다. 하나의 실시형태에서, 제1 식물은 제2 식물과는 다른 종인 외떡잎식물 또는 쌍떡잎식물이다. 예를 들어, 하나의 양태에서, 제1 식물은 옥수수이고, 제2 식물은 밀이다. 다른 양태에서, 제1 식물은 밀이고, 제2 식물은 옥수수이다. 다른 실시형태에서, 제1 식물은 Stock 6, RWK, RWS, UH400, AX5707RS, NP2222-matl 또는 임의의 몇몇 기타 공지된 HI 계통과 같은 계통에서 선택 및/또는 유래하는 옥수수 식물이다. 또 다른 실시형태에서, 제1 식물은 CENH3 유전자에서의 돌연변이, ig1 유전자에서의 돌연변이, 또는 부계 반수체 유도 시스템을 부여하는 다른 돌연변이를 포함한다. 다른 실시형태에서, 제1 식물은 MATL 유전자가 변형되거나 녹아웃(knock-out)되어, 반수체 유도체 계통이 되는 벼 식물이다.
다른 실시형태에서, 제1 식물은 반드시 반수체 유도체는 아닐지라도, 제1 식물은 유전자 편집 기구를 편집하는데 필요한 유전자를 포함한다. 이러한 실시형태에서, 반수체 유도는 수분 동안, 직전 또는 직후에 화합물을 투여함으로써 유발된다. 하나의 양태에서, 조성물은 지질 또는 포스포리파아제 억제제를 포함한다. 다른 양태에서, 조성물은 메틸 알파-리놀레노일 플루오로포스포네이트(MALFP), 리놀산 에틸에스테르(LLAEE), 리놀산(LLA), 옥수수 오일, 디스테아로일-포스파티딜콜린(DSPC), 메틸아라키도닐 플루오로포스포네이트(MAFP), 팔미틸 트리플루오로메틸케톤(PACOCF3), 아라키도닐 트리플루오로메틸케톤(AACOCF3), 마노알리드, 리놀렌산 에틸에스테르(LNAEE), 리놀렌산 에틸에스테르(LNAEE), 올레산 메틸에스테르(OAME), 올레산 에틸에스테르(OAEE), 팔미트산 에틸에스테르(PAEE), 팔미톨레산 에틸에스테르(PLAEE), 아마인 오일, 옥수수 오일, 알파-리놀렌산(aLNA), 감마-리놀렌산(gLNA), 올레산, 아라키돈산, 스테아르산, 9(Z)-11(E)-접합 리놀산 또는 2-올레오일-1-팔미토일-sn-글리세로-3-포스포-에탄올아민을 포함한다.
서열 목록의 서열에 대한 간단한 설명
서열번호 1은 벡터 23396용 뉴클레오티드 서열이다.
서열번호 2는 옥수수에서 VLHP1을 편집하기 위한 gRNA 서열을 암호화하는 뉴클레오티드 서열이다.
서열번호 3은 벡터 23399용 뉴클레오티드 서열이다.
서열번호 4는 옥수수에서 GW2-2를 편집하기 위한 gRNA 서열이다.
서열번호 5는 TALEN 구조체를 포함하는 벡터 22808용 뉴클레오티드 서열이다.
서열번호 6은 22808의 TALEN용 표적 서열이다.
서열번호 7은 Cas9 구조체를 포함하는 벡터 23123용 뉴클레오티드 서열이다.
서열번호 8은 옥수수에서 MATL을 편집하기 위한 gRNA이다.
서열번호 9는 NP2222 내의 MATL의 관련 부분에 대한 뉴클레오티드 서열이다.
서열번호 10은 Stock6 내의 MATL의 관련 부분에 대한 뉴클레오티드 서열이다.
서열번호 11은 USR01350333-3 대립 유전자 1 내의 MATL의 관련 부분에 대한 뉴클레오티드 서열이다.
서열번호 12는 USR01350333-3 대립 유전자 2 내의 MATL의 관련 부분에 대한 뉴클레오티드 서열이다.
서열번호 13은 USR01350344-2 대립 유전자 1 내의 MATL의 관련 부분에 대한 뉴클레오티드 서열이다.
서열번호 14는 USR01350344-2 대립 유전자 2 내의 MATL의 관련 부분에 대한 뉴클레오티드 서열이다.
서열번호 15는 USR01350343-1 대립 유전자 1 내의 MATL의 관련 부분에 대한 뉴클레오티드 서열이다.
서열번호 16은 USR01350328-1 대립 유전자 1 내의 MATL의 관련 부분에 대한 뉴클레오티드 서열이다.
서열번호 17은 USR01350337-2 대립 유전자 1 내의 MATL의 관련 부분에 대한 뉴클레오티드 서열이다.
서열번호 18은 USR01350337-2 대립 유전자 2 내의 MATL의 관련 부분에 대한 뉴클레오티드 서열이다.
서열번호 19는 cDNA 야생형 MATL의 뉴클레오티드 서열이다.
서열번호 20은 벡터 23397용 뉴클레오티드 서열이다.
서열번호 21은 옥수수에서 VLHP2를 편집하기 위한 gRNA 서열이다.
서열번호 22는 벡터 23398용 뉴클레오티드 서열이다.
서열번호 23은 옥수수에서 GW2-1을 편집하기 위한 gRNA 서열이다.
서열번호 24는 벡터 23763용 뉴클레오티드 서열이다.
서열번호 25는 밀에서의 VLHP1을 위한 gRNA 서열이다.
서열번호 26은 TaVLHP2용 밀 VLHP 표적 서열이다.
서열번호 27은 TaVLHP3용 밀 VLHP 표적 서열이다.
서열번호 28은 편집을 위한 ZmVLHP2-03 내의 표적 서열이다.
서열번호 29는 ZmVLHP2-03 내의 편집된 서열이다.
서열번호 30은 ZmPYL-D 내에 E149L 돌연변이를 생성하기 위한 수선 공여자 주형 서열이다.
서열번호 31은 벡터 23136용 뉴클레오티드 서열이다.
서열번호 32는 벡터 23136의 gRNA이다.
서열번호 33은 벼 PLA 유전자인 Os03g27610의 뉴클레오티드 서열이다.
서열번호 34는 벡터 24038용 뉴클레오티드 서열이다.
서열번호 35는 벡터 24039용 뉴클레오티드 서열이다.
서열번호 36은 벡터 24079용 뉴클레오티드 서열이다.
서열번호 37은 벡터 24091용 뉴클레오티드 서열이다.
서열번호 38은 벡터 24094용 뉴클레오티드 서열이다.
서열번호 39 내지 서열번호 97는 식별된 PCR Taqman 검정에 사용되는 프라이머 및 탐침이다.
서열번호 98은 벡터 24075용 뉴클레오티드 서열이다.
도 1은 USR01350334-3:이배체에 대한 배수성 분석(유동 세포 분석) 데이터(200에서의 주요 피크, 400에서의 2차 피크)를 보여준다.
도 2는 USR01350333-3:반수체에 대한 배수성 분석(유동 세포 분석) 데이터(100에서의 주요 피크, 200에서의 2차 피크)를 보여준다.
도 3은 USR01350333-10:이배체에 대한 배수성 분석(유동 세포 분석) 데이터(200에서의 주요 피크, 400에서의 2차 피크)를 보여준다.
도 4는 USR01350344-2:반수체에 대한 배수성 분석(유동 세포 분석) 데이터(100에서의 주요 피크, 200에서의 2차 피크)를 보여준다.
도 5는 USR01350343-1:반수체에 대한 배수성 분석(유동 세포 분석) 데이터(100에서의 주요 피크, 200에서의 2차 피크)를 보여준다.
도 6은 USR01350341-1:이배체에 대한 배수성 분석(유동 세포 분석) 데이터(200에서의 주요 피크, 400에서의 2차 피크)를 보여준다.
도 7은 USR01350328-1:반수체에 대한 배수성 분석(유동 세포 분석) 데이터(100에서의 주요 피크, 200에서의 2차 피크)를 보여준다.
도 8은 USR01350321-3:이배체에 대한 배수성 분석(유동 세포 분석) 데이터(200에서의 주요 피크, 400에서의 2차 피크)를 보여준다.
도 9는 ZmVLHP1 유전자 내에 표적화 돌연변이를 생성하기 위한 옥수수의 미성숙 배아에 대한 아그로박테리움 매개 형질 전환용으로 사용되는 벡터 23396(서열번호 1)의 개략도이다. xZmVLHP-01: 가이드 RNA(gRNA) 서열(5'-GCAGGAGGCGTCGAGCAGCG-3', 서열번호 2); rsgRNAZmVLHP-01: gRNA, tracRNA 및 PolIII 종결 서열을 포함하는 단일 가이드 RNA(sgRNA). cPMI: PMI 선택 마커 유전자; cCas9: Cas9 뉴클레아제 유전자; RB: T-DNA 우측 경계; LB: T-DNA 좌측 경계; tNOS: 노팔린 합성효소 종결인자. cSpec: 스펙티노마이신 내성 유전자.
도 10은 ZmGW2 유전자 내에 표적화 돌연변이를 생성하기 위한 옥수수의 미성숙 배아의 아그로박테리움 매개 형질 전환용으로 사용되는 벡터 23399(서열번호 3)의 개략도이다. xZmGW2-02: 가이드 RNA(gRNA) 서열(5'-AAGCTCGCGCCCTGCTACCC-3', 서열번호 4); rsgRNAZmGW2-02: gRNA, tracrRNA 및 PolIII 종결 서열을 포함하는 단일 가이드 RNA(sgRNA). cPMI-09: PMI 선택 마커 유전자; cCas9-01: Cas9 뉴클레아제 유전자; RB: T-DNA 우측 경계; LB: T-DNA 좌측 경계; tNOS: 노팔린 합성효소 종결인자. cSpec: 스펙티노마이신 내성 유전자.
도 11은 편집된 반수체 사탕 옥수수 계통인 JSER82A056에 대한 배수성 검정을 보여주고, 도 12는 편집된 반수체 사탕 옥수수 계통인 JSER82A063에 대한 동일한 검정을 보여준다. 이들 계통은 CRISPR-Cas9 발현 벡터 23399의 이식 유전자 유전자위를 갖는 RWKS 반수체 유도 계통과의 교배를 통해 수득되었다.
도 13은 반수체 사탕 옥수수 계통인 JSER82A063에서의 GW2-02 표적 부위의 편집에 대한 확인을 서열분석을 통해 보여준다. 예상되는 Cas9 개열 부위 다음에 있는 단일 염기 C가 결실되어 있다.
도 14는 야생형 대조군에 대한 배수성 분석을 보여주고, 도 15는 편집된 반수체 밀 계통인 JSWER30A22에 대한 배수성 분석을 보여준다.
도 16은 반수체 밀 계통인 JSWER30A22에서의 TaVLHP1-4B 표적 부위의 편집에 대한 확인을 서열분석을 통해 보여준다. 하부 패널에서는 TaVLHP1-4B 서열의 97 bp가 예상되는 Cas9 개열 부위 바로 하류에서 결실되어 있다는 것이 나타나 있다. 97 bp가 결실된 서열은 2개의 화살표로 표시되어 있다.
도 17은 제웅(emasculation)된 봄밀 계통인 AC-Nanda를 수분시키기 위해 사용되는 벡터 24038, 벡터 24039, 벡터 24079, 벡터 24091 및 벡터 24094의 T-DNA를 갖는 형질 전환 옥수수 T0 식물에서 수집된 화분으로 측정할 때의 화분의 발현을 보여준다. 화분에서 발현이 높으며, 다수의 옥수수 및 밀의 예에서 사용되는 사탕수수 유비퀴틴 프로모터와 비교하여 T-DNA 벡터 24038, T-DNA 벡터 24039 및 T-DNA 벡터 24079를 갖는 식물에서 평균적으로 약 100배 더 높다. 또한 발현은 MATRILINEAL 프로모터 구조체(24094 및 24091)를 갖는 화분과 비교할 때 벡터 24038, 벡터 24039 및 벡터 24079를 함유하는 식물에서 유래하는 화분에서 더 높았다.
도 18은 이배체 대조군(부모 USR01424135)에 대한 배수성 분석 히스토그램을 보여준다. 첫 번째 피크는 로그 X축 상의 "2" 위치에 위치한다. 이것은 아라비돕시스에서 유래하는 잎 조직이기 때문에 정상적인 수준의 내재복제(endoreduplication)를 나타내는 다중 피크가 보인다.
도 19는 이배체 대조군(부모 USR01431603)에 대한 배수성 분석 히스토그램을 보여준다. 첫 번째 피크는 로그 X축 상의 "2" 위치에 위치한다. 이것은 아라비돕시스에서 유래하는 잎 조직이기 때문에 본 발명자들은 다중 피크가 정상적인 내재복제 수준을 나타낸다는 것을 확인한다.
도 20은 이배체 대조군(부모 USR01431609)에 대한 배수성 분석 히스토그램을 보여준다. 첫 번째 피크는 로그 X축 상의 "2" 위치에 위치한다. 이것은 아라비돕시스에서 유래하는 잎 조직이기 때문에 정상적인 수준의 내재복제를 나타내는 다중 피크가 보인다.
도 21은 플레이트 1033의 웰 C3으로부터의 편집된 반수체(USR01424135 X Ler-427)에 대한 배수성 분석 히스토그램을 보여준다. 첫 번째 피크는 로그 X축 상의 "1" 위치에 위치하며, 이는 이것이 반수체임을 나타낸다. 이것은 아라비돕시스에서 유래하는 잎 조직이기 때문에 정상적인 수준의 내재복제를 나타내는 다중 피크가 보인다.
도 22는 플레이트 1033의 웰 E4로부터의 편집된 반수체(USR01424135 X Ler-437)에 대한 배수성 분석 히스토그램을 보여준다. 첫 번째 피크는 로그 X축 상의 "1" 위치에 위치하며, 이는 이것이 반수체임을 나타낸다. 이것은 아라비돕시스에서 유래하는 잎 조직이기 때문에 정상적인 수준의 내재복제를 나타내는 다중 피크가 보인다.
도 23은 플레이트 1046의 웰 H12로부터의 편집된 반수체(USR01431609 X Ler-123)에 대한 배수성 분석 히스토그램을 보여준다. 첫 번째 피크는 로그 X축 상의 "1" 위치에 위치하며, 이는 이것이 반수체임을 나타낸다. 이것은 아라비돕시스에서 유래하는 잎 조직이기 때문에 정상적인 수준의 내재복제를 나타내는 다중 피크가 보인다.
도 24는 랜드스베르그 에렉타(Landsberg erecta) 화분에 의한 이종교배에서 유래하는 모든 서열 분석되고 편집된 반수체 및 부모 #USR01424135 내에서의 GL1 표적 부위 서열 돌연변이를 보여준다. 다양한 반수체에서 만들어진 정확한 편집체는 서로 다르다는 것이 명백하다.
정의
하기 용어가 당해 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에 의해 잘 이해되는 것으로 여겨질지라도 하기 정의는 본원에 개시된 청구주제의 설명을 용이하게 하기 위해 개시되어 있다.
본원에서 사용된 모든 기술 및 과학 용어는, 하기에서 달리 정의하지 않는 한, 당해 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에 의해 흔히 이해되는 바와 동일한 의미를 갖는 것으로 간주된다. 본원에서 이용된 기법에 대한 인용은 당해 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에 의해 흔히 이해되는 바와 같은 기법을 지칭하기 위한 것으로, 이들 기법에 대한 변형 및/또는 당업자에게 자명할 수 있는 등가의 기법에 대한 치환을 포함한다. 하기 용어가 당해 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에 의해 잘 이해되는 것으로 여겨질지라도 하기 정의는 본원에 개시된 청구주제의 설명을 용이하게 하기 위해 개시되어 있다.
오랜 기간 존재한 특허법 상의 관행(patent law convention)에 따라서 청구항을 포함하여 본원에 사용되는 경우에 "하나" 및 "일"이란 용어는 "하나 이상"을 지칭한다. 예를 들어, "세포"란 문구는 하나 이상의 세포를 지칭하고, 일부 실시형태에서는 조직 및/또는 기관을 지칭할 수 있다. 유사하게, 실체(entity)를 지칭하기 위해 본원에서 사용할 때 "적어도 하나"란 문구는, 예를 들어 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개, 15개, 20개, 25개, 30개, 35, 40개, 45개, 50개, 75개, 100개 또는 그 이상의 이러한 실체를 지칭하며, 이는 100 초과의 정수뿐만 아니라 1과 100 사이의 모든 정수를 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.
달리 표시하지 않는 한, 본 명세서 및 청구항에 사용된 성분의 양, 반응 조건 등을 나타내는 모든 숫자는 모든 경우에 "약"이란 용어에 의해 수식되는 것으로 이해되어야 한다. 질량, 중량, 시간, 부피, 농도 또는 비율의 양과 같은 측정 가능한 값을 지칭할 때 본원에서 사용된 바와 같이, "약"이란 용어는 특정된 양으로부터 일부 실시형태에서 ±20%, 일부 실시형태에서 ±10%, 일부 실시형태에서 ±5%, 일부 실시형태에서 ±1%, 일부 실시형태에서 ±0.5%, 및 일부 실시형태에서 ±0.1%의 변화를 포함한다는 것을 의미하여, 변화는 개시된 방법을 수행하고/하거나 개시된 조성물, 핵산, 폴리펩티드 등을 이용하기에 적절하다. 따라서, 달리 반대로 나타내지 않는 한, 본 명세서 및 첨부된 청구항에 개시된 수적 변수는 본원에 개시된 청구주제에 의해 수득하려고 했던 목적하는 특징에 따라 달라 질 수 있는 근사치이다.
본원에서 사용된 바와 같이, "대립 유전자"란 용어는 유전자위에 있는 변이체 또는 대안적인 서열 형태를 지칭한다. 이배체에서, 단일 대립 유전자는 각각의 유전자위에서 각각의 부모와는 별도로 자손 개체에게 유전된다. 비록 당업자라면 임의의 특정 개체에서의 대립 유전자가 해당 종에 존재하는 모든 대립 유전자를 반드시 대표하지 않는다는 것을 이해할지라도 이배체 생물에 존재하는 특정 유전자위의 2개의 대립 유전자는 한 쌍의 상동 염색체 상에서 상응하는 위치를 차지한다.
본원에서 사용된 바와 같이, 실체 목록의 문맥에서 사용되는 경우에 "및/또는"이란 용어는 실체가 단독 또는 조합으로 존재한다는 것을 지칭한다. 따라서, 예를 들어 "A, B, C 및/또는 D"란 문구는 개별적인 A, B, C 및 D를 포함할 뿐만 아니라, A, B, C 및 D의 임의의 모든 조합 및 하위조합(예를 들어, AB, AC, AD, BC, BD, CD, ABC, ABD 및 BCD)을 포함한다. 일부 실시형태에서, "및/또는"이 지칭하는 요소들 중 하나 이상은 또한 조합(들) 및/또는 하위조합(들) 중에 1회 또는 수회 개별적으로 존재할 수 있다.
본원에서 사용된 바와 같이, "~와 연관된"이란 용어는 2개의 실체 사이의 식별 및/또는 검정 가능한 관계를 지칭한다. 예를 들어, "HI와 연관된"이란 문구는 형질, 유전자위, 유전자, 대립 유전자, 마커, 표현형 등을 지칭하거나, 이의 발현을 지칭하며, 여기서 이의 존재 또는 부재는 식물 또는 이의 자손이 HI를 나타내는 정도 및/또는 수준에 영향을 미칠 수 있다. 이와 같이, 마커가 형질에 연결된 경우 및 마커의 존재가 마커를 포함하는 식물/생식질에서 목적하는 형질 또는 형질 형태가 발생할 것인지를 보여주는 지표이고/이거나 목적하는 형질 또는 형질 형태가 어느 정도로 발생할 것인지를 보여주는 지표일 경우, 마커는 형질과 "연관"되어 있다. 유사하게, 마커가 대립 유전자에 연결된 경우 및 마커의 존재가 마커를 포함하는 식물/생식질에서 대립 유전자가 존재하는지를 나타내는 지표인 경우, 마커는 대립 유전자와 "연관"되어 있다. 예를 들어, "HI와 연결된 마커"는 그 존재 또는 부재가 식물이 반수체 유도를 나타낼 것인지의 여부 및/또는 식물이 어느 정도로 반수체 유도를 나타낼 것인지를 예상하기 위해 사용될 수 있는 마커를 지칭한다.
"포함하는", "함유하는" 및 "특징으로 하는"과 동의어인 "포함하는"이란 용어는 포괄적이고 무제한적이며, 부가적인 인용되지 않은 요소 및/또는 방법의 단계를 배제하지 않는다. "포함하는"은 지정된 요소 및/또는 단계가 존재한다는 것을 의미하지만, 기타 요소 및/또는 단계가 부가될 수 있으며, 여전히 관련 청구주제의 범위 내에 있다는 것을 의미하는 전문 용어이다.
본원에서 사용된 바와 같이, "~(으)로 이루어진"이란 문구는 구체적으로 인용되지 않은 임의의 요소, 단계 또는 성분을 제외한다. "~(으)로 이루어진"이란 문구가 전제부 바로 다음이 아니라 청구항의 본문의 절에 나타나 있는 경우, 이는 절에 개시된 요소만을 제한하며; 기타 요소는 청구항 전체로부터 제외되지 않는다.
본원에서 사용된 바와 같이, "본질적으로 ~(으)로 이루어진"이란 문구는, 명시된 재료 및/또는 단계 이외에도 개시 및/또는 청구된 청구주제의 기본적이고 신규한 특성(들)에 크게 영향을 미치지 않는 재료 및/또는 단계에 관련 개시내용 또는 청구항의 범주를 제한한다.
"포함하는", "본질적으로 ~(으)로 이루어진" 및 "~(으)로 이루어진"이란 용어와 관련하여, 이들 3개의 용어 중 하나가 본원에서 사용되는 경우, 본 발명에 개시되고 청구된 청구주제는 일부 실시형태에서 기타 2개의 용어 중 하나의 사용을 포함할 수 있다. 예를 들어, 만약 일부 실시형태에서 청구주제가 서열번호 9 또는 서열번호 19와 적어도 95% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드를 암호화하는 핵산에 관한 것이면, 이렇게 개시된 청구주제는 일부 실시형태에서 서열번호 9 또는 서열번호 19와 적어도 95% 동일한 아미노산 서열로 이루어진 폴리펩티드를 암호화하는 핵산뿐만 아니라 일부 실시형태에서 본질적으로는 이러한 서열번호 9 또는 서열번호 19와 적어도 95% 동일한 아미노산 서열로 이루어진 폴리펩티드를 암호화하는 핵산을 포함하는 것으로 이해된다. 유사하게, 일부 실시형태에서는 개시된 청구주제를 위한 방법은 본원에 개시되어 있는 단계를 포함하고, 일부 실시형태에서는 본원에 개시된 청구주제를 위한 방법은 본질적으로 개시되어 있는 단계로 이루어져 있으며, 일부 실시형태에서는 개시된 청구주제를 위한 방법은 본원에 개시되어 있는 단계로 이루어져 있는 것으로 또한 이해된다.
본원에서 사용된 바와 같이, "데보노 반수체 유도"란 용어는 자연(spontaneous) 반수체 유도제의 도입에 의해 반수체 유도를 촉발하는 것에 관한 것이다. 이 같은 도입은 국소 분무, 인공 수분, 돌연변이 유발 또는 형질 전환 방법에 의해 달성될 수 있다. "데보노 반수체 유도", "데보노 HI" 및 "반수체 유도 데보노"란 용어는 본 명세서 전반에서 상호 교환 가능하게 사용된다.
본원에서 사용된 바와 같이, "유전자"란 용어는 염색체 상의 특정 위치를 차지하고 생물에서 특정 특성 또는 형질에 대한 유전 명령(genetic instruction)을 함유하는 DNA의 서열을 포함하는 유전 단위를 지칭한다.
"유전자 지도"는 도면 또는 도표 형태로 일반적으로 도시된, 소정의 종 내에 있는 하나 이상의 염색체 상의 유전자위 사이의 유전자 연관 관계를 설명한 것이다.
본원에서 사용된 바와 같이, "반수체"로서 지칭되는 식물은 반수체 식물에서 감소된 염색체 개수(n)를 가지며, 이의 염색체 세트는 생식세포의 염색체 세트와 같다. 반수체 생물에서는 정상적인 염색체 개수의 절반만이 존재한다. 따라서 이배체 생물(예를 들어, 옥수수)의 반수체는 일배성을 나타내고; 사배체 생물(예를 들어, 독보리)의 반수체는 이배성을 나타내고; 6배체 생물(예를 들어, 밀)의 반수체는 삼배성을 나타낸다. 본원에서 사용된 바와 같이, "배가 반수체"로서 지칭되는 식물은 염색체의 반수체 세트를 배가함으로써 개발된다. 임의의 세대수까지 자가 수분된 배가 반수체 식물에서 수득된 식물 또는 종자는 여전히 배가 반수체 식물로서 확인될 수 있다. 배가 반수체 식물은 동형 접합성 식물로 간주된다. 식물의 생장 부분 전체가 염색체 세트가 배가된 세포로 이루어지지 않는 경우에도 식물이 생식력이 있다면 배가 반수체인 것으로 간주되며; 즉 식물의 영양 조직이 키메라인 경우에도 식물이 생존 가능한 생식세포를 함유하면 이는 배가 반수체로 간주될 것이다.
본원에서 사용된 바와 같이, "인간 유발 돌연변이"란 용어는 직접 또는 간접적인 인간 활동의 결과로서 일어나는 임의의 돌연변이를 지칭한다. 이러한 용어는 임의의 표적화 돌연변이 유발 방법에 의해 수득되는 돌연변이를 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.
본원에서 사용된 바와 같이, "도입된"은 핵산 또는 단백질 또는 이의 조합이든지 간에 목적하는 대상을 다른 대상으로 전달하는 것을 나타내기 위한 전달된, 발현된, 적용된, 전송된, 이송된, 침투된 또는 기타 유사 용어를 의미한다. 예를 들어, 부위 특이적 뉴클레아제를 암호화하는 핵산 및 선택적으로는 적어도 하나의 가이드 RNA는 반수체 유도 시에 반수체 배아에 도입될 수 있다. 마찬가지로, 기존의 편집 기구(부위 특이적 뉴클레아제 단백질 및 선택적으로는 적어도 하나의 가이드 RNA를 포함함)는 적절한 세포 투과성 펩티드를 적용할 때 반수체 배아에 도입될 수 있다.
본원에서 사용된 바와 같이, "마커 탐침" 및 "탐침"이란 용어는 핵산 혼성화를 통해 보다 큰 서열 내의 서열의 존재 또는 부재를 검출하기 위해 사용될 수 있는 뉴클레오티드 서열 또는 핵산 분자, 예를 들어 마커 또는 마커 유전자위의 전체 또는 일부에 상보적인 핵산 탐침을 지칭한다. 약 8개, 약 10개, 약 15개, 약 20개, 약 30개, 약 40개, 약 50개, 약 60개, 약 70개, 약 80개, 약 90개, 약 100개 또는 그 이상의 인접한 뉴클레오티드를 포함하는 마커 탐침이 핵산 혼성화용으로 사용될 수 있다.
본원에서 사용된 바와 같이, "분자 마커"란 용어는 HI 연관 유전자위의 존재/부재를 확인할 때 기준점으로서 사용되는, 상기에서 정의된 바와 같은 유전자 마커 또는 이의 암호화 산물(예를 들어, 단백질)을 지칭하기 위해 사용될 수 있다. 분자 마커는 유전체 뉴클레오티드 서열에서 유래할 수 있거나, 발현된 뉴클레오티드 서열(예를 들어, RNA, cDNA 등)에서 유래할 수 있다. 또한 상기 용어는 마커 서열에 상보적이거나 마커 서열 측면에 있는 뉴클레오티드 서열, 예를 들어 마커 서열을 증폭할 수 있는 프라이머 및/또는 탐침으로서 사용되는 뉴클레오티드 서열을 지칭한다. 뉴클레오티드 서열은 (예를 들어, 왓슨-크릭(Watson-Crick)의 염기 쌍 형성 규칙에 따라)용해되어 특이적으로 혼성화 하는 경우에 "상보적"이다. 또한 이러한 용어는 마커 서열에 상보적이거나 마커 서열 측면에 있는 뉴클레오티드 서열, 예를 들어 마커 서열을 증폭할 수 있는 프라이머 및/또는 탐침으로서 사용되는 뉴클레오티드 서열의 부재에 의해 형질을 나타내는 유전자 마커를 지칭한다.
본원에서 사용된 바와 같이, "뉴클레오티드 서열", "폴리뉴클레오티드", "핵산 서열", "핵산 분자" 및 "핵산 단편"이란 용어는 단일 가닥 또는 이중 가닥인 RNA 또는 DNA의 중합체를 지칭하며, 이는 선택적으로는 합성, 비천연 및/또는 변경된 뉴클레오티드 염기를 함유한다. "뉴클레오티드"는 DNA 또는 RNA 중합체를 구성하고, 푸린 또는 피리미딘 염기, 펜토오스 및 인산기로 이루어져 있는 단량체 단위이다. 뉴클레오티드(대개 이들의 5'-모노포스페이트 형태로 발견됨)는 하기와 같이 이들의 단일 문자 명칭에 의해 나타나 있다: "A"는 (RNA 또는 DNA 각각에 대해) 아데닐레이트 또는 데옥시아데닐레이트에 대해 지정되고, "C"는 시티딜레이트 또는 데옥시시티딜레이트에 대해 지정되고, "G"는 구아닐레이트 또는 데옥시구아닐레이트에 대해 지정되고, "U"는 우리딜레이트에 대해 지정되고, "T"는 데옥시티미딜레이트에 대해 지정되고, "R"은 푸린(A 또는 G)에 대해 지정되고, "Y"는 피리미딘(C 또는 T)에 대해 지정되고, "K"는 G 또는 T에 대해 지정되고, "H"는 A 또는 C 또는 T에 대해 지정되고, "I"는 이노신에 대해 지정되며, "N"은 임의의 뉴클레오티드에 대해 지정된다.
본원에서 사용된 바와 같이, "뉴클레오티드 서열 동일성"이란 용어는 2개의 폴리뉴클레오티드의 상응하는 위치에 동일한 뉴클레오티드의 존재를 지칭한다. 폴리뉴클레오티드는 최대 상응성(maximum correspondence)을 위해 (예를 들어, 비교 범위(comparison window) 내에서) 배열할 때 2개의 폴리뉴클레오티드 내의 뉴클레오티드의 서열이 동일한 경우에 "동일한" 서열을 갖는다. 2개 이상의 폴리뉴클레오티드 사이에서의 서열 비교는 일반적으로 서열 유사성이 있는 국부 영역을 확인하고 비교하기 위해 비교 범위에 걸쳐 2개의 서열의 일부를 비교함으로써 수행된다. 비교 범위는 일반적으로 약 20개 내지 약 200개의 인접한 뉴클레오티드이다. 폴리뉴클레오티드에 대한 "서열 동일성의 비율(%)", 예를 들어 약 50%, 약 55%, 약 60%, 약 65%, 약 70%, 약 75%, 약 80%, 약 85%, 약 90%, 약 95%, 약 98%, 약 99% 또는 약 100%의 서열 동일성은 비교 범위에 걸쳐 2개의 최적으로 배열된 서열을 비교함으로써 측정될 수 있으며, 이때 비교 범위 내의 폴리뉴클레오티드 서열의 일부는 2개의 서열에 대한 최적의 배열을 위한 참조 서열과 비교할 때 부가 또는 결실(즉, 간극)을 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 비율은 (a) 2개의 서열 모두에서 동일한 핵산 염기가 발생하는 위치 개수를 알아내고; (b) 매칭된 위치 개수를 비교 범위 내의 총 위치 개수로 나누고; (c) 결과를 100으로 곱함으로써 산정된다. 비교를 위한 최적의 서열 배열은 또한 공지된 알고리즘의 컴퓨터 실행(computerized implementation) 또는 육안 검사에 의해 수행될 수 있다. 쉽게 이용 가능한 서열 비교 및 다중 서열 배열 알고리즘은 각각 인터넷(예를 들어, EMBL-EBI의 웹사이트)에서 이용 가능한 기본 국부 배열 검색 기구(Basic Local Alignment Search Tool: BLAST) 및 ClustalW/ClustalW2/Clustal Omega 프로그램이다. 기타 적합한 프로그램으로는 미국 캘리포니아주 샌디에고 소재의 악셀리스 인코포레이티드(Accelrys, Inc.)로부터 구입 가능한 악셀리스 GCG 패키지의 일부인 GAP, BestFit, Plot Similarity 및 FASTA를 들 수 있지만, 이에 제한되지 않는다. 또한 문헌[Smith & Waterman, 1981; Needleman & Wunsch, 1970; Pearson & Lipman, 1988; Ausubel et al., 1988; and Sambrook & Russell, 2001]을 참고한다.
서열 동일성 비율(%) 및 서열 유사성을 알아내기에 적합한 알고리즘의 일례로는 문헌[Altschul et al., 1990]에 설명되어 있는 BLAST 알고리즘이 있다. 일부 실시형태에서, 서열 동일성 비율(%)은 gDNA, cDNA, 또는 비교되는 서열번호 1의 가장 큰 ORF 내의 예상되는 단백질 서열들 중 하나의 전장에 걸친 서열 동일성을 지칭한다. 일부 실시형태에서, 핵산 서열 동일성 비율(%)을 알아내기 위한 계산은 비교된 핵산 중 하나가 "N"을 포함하는 임의의 뉴클레오티드 위치(즉, 임의의 뉴클레오티드가 이러한 위치에 존재할 수 있음)를 상기 계산에 포함하지 않는다.
"개방형 판독 프레임"(ORF)란 용어는 폴리펩티드를 암호화하는 핵산 서열을 지칭한다. 일부 실시형태에서, ORF는 번역 개시 코돈(즉, 시작 코돈), 번역 종결(즉, 정지 코돈), 및 폴리펩티드에 존재하는 아미노산을 암호화하는, 이들 사이에 있는 핵산 서열을 포함한다. "개시 코돈" 및 "종결 코돈"이란 용어는 각각 단백질 합성(mRNA 번역)의 개시 및 사슬 종결을 명시하는 암호화 서열 내의 3개의 인접한 뉴클레오티드의 단위(즉, 코돈)을 지칭한다.
또한 파타틴(patatin) 유사 포스포리파아제 A2α는 PLA, pPLA, pPLAIIA pPLAIIα, PLA2알파 또는 PLA2, 또는 기타 유사한 변형예로 알려져 있을 수 있다. 파타틴 유사 포스포리파아제 AIIα는 MATRILINEAL(MATL)로도 지칭된다. 이들 용어는 전체가 상호 교환 가능하게 사용된다. 4개의 염기 쌍으로 이루어진 프레임시프트 돌연변이를 포함하는 MATRILINEAL 유전자는 matrilineal(matl)로서 지칭된다.
본원에서 사용된 바와 같이, "표현형", "표현 형질" 또는 "형질"이란 용어는 식물 또는 식물 세포의 하나 이상의 형질을 지칭한다. 표현형은 육안으로 또는 당해 기술분야에 공지된 임의의 기타 평가 수단, 예를 들어 현미경 검사, 생화학적 분석 또는 전기 기계적 검정에 의해 관찰 가능할 수 있다. 일부 경우, 표현형은 단일 유전자 또는 유전자위에 의해 직접 제어된다(즉, "단일 유전자 형질"에 상응함). 반수체 유도의 경우, R Navajo, 및 종자 내의 색의 존재 또는 부재에 의해 시각화되는 이식 유전자를 포함하는 기타 마커와 같은 컬러 마커의 사용에 의해 종자가 유도된 반수체 종자인지가 증명된다. 컬러 마커로서 R Navajo의 사용 및 이식 유전자의 사용은 자성 식물에서 반수체 종자의 유도를 검출하기 위한 수단으로서 당해 기술분야에 잘 알려져 있다. 기타의 경우, 표현형은 일부 유전자들 사이의 상호작용의 결과이며, 이는 일부 실시형태에서는 식물 및/또는 식물 세포와 이의 환경과의 상호작용에서 또한 기인한다.
본원에서 사용된 바와 같이, "식물"이란 용어는 식물 전체 또는 임의의 이의 일부, 또는 식물에서 유래하는 세포 또는 조직 배양물을 지칭할 수 있다. 따라서 "식물"이란 용어는 식물 전체, 식물 구성성분 또는 기관(예를 들어, 잎, 줄기, 뿌리 등), 식물 조직, 종자 및/또는 식물 세포 중 임의의 것을 지칭할 수 있다.
식물 세포는 식물에서 채취하거나 배양을 통해 식물에서 채취한 세포에서 유래하는 식물의 세포이다. 따라서 "식물 세포"란 용어는 종자, 현탁 배양물, 배아, 분열조직 영역, 캘러스 조직, 잎, 새싹, 배우체, 포자체, 화분 및 소포자 내의 세포를 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. "식물 부분"이란 문구는 식물, 세포 클럼프(plant clump), 및 식물이 재생될 수 있는 조직 배양물에서 온전한 식물 세포와 같은 단세포 및 세포 조직을 포함하는 식물의 일부를 지칭한다. 식물 부분의 예로는 어린 가지(scion), 근경, 원형질체, 캘러스 등 뿐만 아니라 화분, 밑씨, 잎, 배아, 뿌리, 근단, 꽃밥, 꽃, 열매, 줄기, 새싹 및 종자에서 유래하는 단세포 및 조직을 들 수 있지만, 이에 제한되지 않는다.
본원에서 사용된 바와 같이, "프라이머"란 용어는 핵산 표적에 어닐링((일부 실시형태에서는 핵산 표적에 특이적으로 어닐링)하여 DNA 폴리메라아제 및/또는 역전사 효소가 여기에 부착할 수 있도록 하고, 그 결과 프라이머 연장 산물의 합성이 유도되는 조건 하에 놓여 있는 경우(예를 들어, 뉴클레오티드 및 DNA 폴리메라아제와 같은 중합제의 존재 하에 적절한 온도 및 pH에서) DNA 합성의 개시점으로서 작용할 수 있는 올리고뉴클레오티드를 지칭한다. 일부 실시형태에서, 하나 이상의 복수의 프라이머는 (예를 들어, 폴리메라아제 연쇄 반응(PCR)을 이용하여) 식물 핵산을 증폭하기 위해 이용된다.
본원에서 사용된 바와 같이, "탐침"이란 용어는 표적 핵산 서열 내의 상보적인 서열과 수소 결합된 이중구조(hydrogen-bonded duplex)를 형성할 수 있는 핵산(예를 들어, 단일 가닥 핵산 또는 이중 가닥 또는 보다 고차원의 핵산의 가닥 또는 이의 하위서열)을 지칭한다. 전형적으로, 탐침은 그 보체와 안정하고 서열 특이적인 이중구조 분자를 형성하기에 충분한 길이를 가지며, 이와 같이 일부 실시형태에서는 복수의 핵산에 존재하는 관심 서열을 검출하기 위해 이용될 수 있다.
본원에서 사용된 바와 같이, "자손" 및 "자손 식물"이란 용어는 하나 이상의 부모 식물로부터 영양 생식 또는 유성 생식에 의해 생성되는 식물을 지칭한다. 자성생식 매개 반수체 유도에서, 자성 부모 상의 반수체 배아는 웅성 염색체를 제외하고 자성 염색체를 포함하며, 따라서 이는 웅성 반수체 유도 계통의 자손은 아니다. 반수체 옥수수 종자는 전형적으로 여전히 웅성 유전체를 함유하는 정상 삼배체 내배유를 갖는다. 편집된 반수체 자손 및 후속적인 편집된 배가 반수체 식물 및 후속적인 종자만이 목적하는 자손인 것은 아니다. 종종 반수체 유도 식물의 Cas9 이식 유전자를 함유하는, 반수체 유도체 계통 자체에서 유래하는 종자, 및 반수체 유도 식물의 후속적인 식물 및 종자 자손도 존재한다. 반수체 종자 및 반수체 유도체(자가 수분 유래) 종자 둘 모두는 자손일 수 있다. 자손 식물은 단일 부모 식물을 클로닝 또는 자가 수분하거나, 2개 이상의 부모 식물을 교배함으로써 수득될 수 있다. 예를 들어, 자손 식물은 하나의 부모 식물을 클로닝 또는 자가 수분하거나, 2개의 부모 식물을 자가 수분함으로써 수득될 수 있으며, F1 또는 F2 또는 그 이상의 세대와 같은 자식(selfing)을 포함한다. F1은 적어도 한쪽이 최초로 형질 공여자로 사용되는 부모로부터 생산된 1세대 자손인 반면, 2세대(F2) 또는 후속 세대(F3, F4 등)의 자손은 자가 수분, 이종교배, 역교배 및/또는 기타 F1, F2 등의 교배에 의해 생산되는 시료이다. 따라서 F1은 2개의 순수 육종 부모(즉, 순수하게 육종되는 부모는 각각 관심 형질 또는 이의 대립 유전자로 인해 동형 접합성을 가짐) 사이의 교배에 의해 얻어지는 혼성체일 수 있는 반면(일부 실시형태에서는 혼성체인 반면), F2는 F1 혼성체의 자가 수분으로 얻어지는 자손일 수 있다(일부 실시형태에서는 자손이다).
본원에서 사용된 바와 같이, "재조합"이란 문구는 유사하거나 동일한 뉴클레오티드 서열의 영역 내에서 쌍 형성 염색체의 2개의 DNA 분자 또는 염색분체 사이의 DNA 단편의 교환("교차")을 지칭한다. 본원에서 "재조합 이벤트"는 일부 실시형태에서 감수분열 교차를 지칭하는 것으로 이해된다.
본원에서 사용된 바와 같이, "참조 서열"이란 용어는 뉴클레오티드 서열의 비교를 위한 근거로서 사용되는 소정의 뉴클레오티드 서열을 지칭한다. 일부 실시형태에서, 서열번호 2, 서열번호 4, 서열번호 8, 서열번호 21, 서열번호 23, 서열번호 25, 서열번호 29, 서열번호 32 및 서열번호 33 중 임의의 것은 식물에서 수득되는 기타 서열과 비교하기 위한 참조 서열로서 작용할 수 있다.
본원에서 사용된 바와 같이, "재생체(regenerate)"란 용어 및 이의 문법적 변이체(grammatical variant)는 조직 배양물로부터 식물의 생산을 지칭한다.
본원에서 사용된 바와 같이, "엄격한 혼성화 조건"이란 문구는 폴리뉴클레오티드가 전형적으로는 복합 핵산 혼합물에서 이의 표적 하위서열과 혼성화 하지만 본질적으로는 기타 서열과는 혼성화 하지 않는 조건을 지칭한다. 엄격한 조건은 서열 의존적이며, 다양한 환경 하에서 서로 다를 수 있다.
보다 긴 서열은 전형적으로 보다 높은 온도에서 특이적으로 혼성화 한다. 핵산의 혼성화에 관한 광범위한 지침은 문헌[Sambrook & Russell, 2001]에 나타나 있다. 일반적으로, 엄격한 조건은 소정의 이온 강도, pH에서 특정 서열에 대한 열적 융점(Tm)보다 약 5 ℃ 내지 약 10 ℃ 낮도록 선택된다. Tm은, 표적에 상보적인 탐침의 50%가 평형상태에서 표적 서열에 혼성화 하는 (소정의 이온 강도, pH 및 핵산 농도 하의) 온도이다(표적 서열이 과량으로 존재함에 따라 Tm에서 탐침은 평형상태에서 50%가 점유되어 있음). 예시적인 엄격한 조건은, 염 농도가 약 1.0 M 나트륨 이온보다 낮고, 전형적으로 pH 7.0 내지 pH 8.3에서 약 0.01 M 내지 1.0 M 나트륨 이온(또는 기타 염) 농도이며, 온도가 짧은 탐침(예를 들어, 10개 내지 50개의 뉴클레오티드)의 경우에 적어도 약 30 ℃ 및 긴 탐침(예를 들어, 50개 초과의 뉴클레오티드)의 경우에 적어도 약 60 ℃인 조건이다.
또한 엄격한 조건은 포름아미드와 같은 불안정화제를 첨가함으로써 달성될 수 있다. 부가적이고 예시적인 엄격한 혼성화 조건은 50% 포름아미드, 5x SSC 및 1% SDS, 42 ℃에서의 배양; 또는 SSC, 1% SDS, 65 ℃에서의 배양을 포함하며; 65 ℃에서 0.2x SSC 및 0.1% SDS로 1회 초과로 세척한다. PCR에 있어서, 어닐링 온도가 프라이머 길이에 따라 약 32 ℃ 내지 48 ℃(또는 그 이상)에서 변경될 수 있을 지라도 약 36 ℃의 온도가 저엄격성 증폭을 위해서는 일반적이다. 혼성화 매개변수를 알아내기 위한 부가적인 지침은 다수의 참고문헌에 제공되어 있다(예를 들어, 문헌[Ausubel et al., 1999] 참조).
본원에서 사용된 바와 같이, "형질"이란 용어는 관심 표현형, 관심 표현형에 기여하는 유전자뿐만 아니라 관심 표현형에 기여하는 유전자와 연관된 핵산 서열을 지칭한다. 예를 들어, "HI 형질"은 반수체 유도 표현형뿐만 아니라, 반수체 유도에 기여하는 유전자(예를 들어, 옥수수의 경우 matl 또는 벼의 경우 Os03g27610) 및 반수체 유도 표현형의 존재 또는 부재와 연관된 핵산 서열 (예를 들어, HI 연관 유전자 산물)을 지칭한다.
본원에서 사용된 바와 같이, "이식 유전자"란 용어는 일부 형태의 인공 전달 기법에 의해 생물 또는 하나 이상의 이의 선조(ancestor) 내로 도입된 핵산 분자를 지칭한다. 따라서 인공 전달 기법에 의해 "형질 전환 생물" 또는 "형질 전환 세포"가 생성된다. 인공 전달 기법은 선조 생물(또는 그 내부의 세포 및/또는 선조 생물로 발달할 수 있는 세포)에서 발생할 수 있으며, 또한 1회 이상의 천연 및/또는 보조 육종으로 인해 인공적으로 전달된 핵산 분자가 자손 개체에 존재하게 될지라도 인공적으로 전달된 핵산 분자 또는 이의 단편을 갖는 임의의 자손 개체는 여전히 형질 전환 가능한 것으로 간주되는 것으로 이해된다.
본원에서 사용된 바와 같이, "표적화 돌연변이 유발" 또는 "돌연변이 유발 전략"이란 용어는 선택된 유전자의 의도적인 돌연변이 유발을 초래하는 임의의 돌연변이 유발 방법을 지칭한다. 표적화 돌연변이 유발로는 CRISPR, TILLING, TALEN, 및 아직까지는 발견되지 않았지만 동일한 결과를 구현하기 위해 사용될 수 있는 기타 방법과 같은 방법을 들 수 있다.
본원에서 사용된 바와 같이, 반수체 유도율("HIR")은 이삭이 반수체 유도체 화분에 의해 수분된 이후에 종실의 총 개수에 대한 생존한 반수체 종실의 개수를 의미한다.
특정 문제점은 이러한 반수체 유도를 어렵게 한다: 배아 발육 정지율(embryo abortion rate)의 증가 및 수정 실패율의 증가(결실률의 감소). 이러한 이유로 인해, HI의 원인을 성공적으로 알아내고 반수체 식물을 안정하게 또는 점점 더 증가하게 생성하고, 동시에 수정 실패 및 배아 발육 정지를 줄이는 방법을 알아내는 데에 이러한 지식을 사용하는 것이 필요하다.
당업자가 식물에서 이식 유전자의 발현을 위한 요소의 유용성을 잠재적으로 개선시키기 위해 프로모터를 돌연변이 시킬 수 있다는 것이 특히 고려되고 있다. 이들 요소의 돌연변이 유발은 무작위로 실시될 수 있으며, 돌연변이된 프로모터 서열의 활성은 시행착오 절차를 통해 스크리닝할 수 있다. 대안적으로, 바람직한 발현 특성을 갖는 프로모터 또는 발현 증강 활성을 갖는 프로모터를 제공하는 특정 서열이 확인될 수 있으며, 이들 서열 또는 유사한 서열이 돌연변이를 통해 프로모터 내로 도입될 수 있다. 당업자는 특정 종에서 이들 이식 유전자의 발현을 향상시키기 위해 이들 서열을 돌연변이 시킬 수 있다는 것이 추가로 고려된다. 본 발명의 프로모터 서열을 암호화하는 DNA 절편을 돌연변이 시키기 위한 수단은 당업자에게 잘 알려져 있다. 지적한 바와 같이, 프로모터 또는 기타 조절 요소에 대한 변형은 무작위 또는 부위 특이적 돌연변이 유발 절차에 의해 이루어질 수 있다. 프로모터 및 기타 조절 요소는 상응하는 변형되지 않은 서열을 암호화하는 서열로부터 하나 이상의 뉴클레오티드의 부가 또는 결실을 통해 이들의 구조를 변경함으로써 변형될 수 있다.
돌연변이 유발은 당해 기술분야에 공지된 임의의 기법, 예를 들어 특정 조절 서열 중의 서열 내에 하나 이상의 돌연변이를 갖는 올리고뉴클레오티드를 합성하는 기법에 따라 수행될 수 있지만, 이에 제한되지 않는다. 특히, 부위 특이적 돌연변이 유발은 기본이 되는 DNA에 대한 특정 돌연변이 유발을 통해 프로모터 돌연변이체를 제조하는데 유용한 기법이다. RNA 가이드 엔도뉴클레아제("RGEN", 예를 들어 CRISPR/Cas9)가 또한 사용될 수 있다. 상기 기법은, 예를 들어 전술한 고려사항들 중 하나 이상을 결합하여 하나 이상의 뉴클레오티드 서열 변화를 DNA에 도입함으로써 서열 변이체를 제조하고 시험할 준비가 되어 있는 능력을 추가로 제공한다. 부위 특이적 돌연변이 유발은 충분한 개수의 인접한 뉴클레오티드뿐만 아니라 목적하는 돌연변이를 갖는 DNA 서열을 암호화하는 특정 올리고뉴클레오티드 서열의 사용을 통해 돌연변이체의 생산을 가능케 하여, 교차되는 결실 연접부(deletion junction)의 양측 상에 안정한 이중구조를 형성하기에 충분한 크기 및 서열 복잡성을 갖는 프라이머 서열을 제공한다. 전형적으로, 약 17개 내지 약 75개 뉴클레오티드 또는 그 이상의 길이를 갖는 프라이머가 바람직하며, 이때 서열의 연접부 양측 상의 약 10개 내지 약 25개 이상의 잔기가 변경되어 있다.
프로모터를 포함하는 클론이 본 발명에 따라 단리되는 경우, 당업자는 클론 내에 필수 프로모터 영역의 범위를 정하기를 원할 수 있다. 돌연변이 된 프로모터를 제조하기 위한 하나의 효율적인 표적화 수단은 프로모터 서열 내의 추정상의 조절 요소를 확인하는 것에 의존한다. 이는 유사한 조직 특이적 또는 발생학적을 독특한 패턴으로 발현되는 것으로 알려져 있는 프로모터 서열과의 비교에 의해 개시될 수 있다. 유사한 발현 패턴을 갖는 프로모터들 사이에서 공유되는 서열은 전사 인자의 결합을 위한 후보자일 가능성이 있으며, 따라서 발현 패턴을 부여하는 요소일 가능성이 있다. 이들 추정상의 조절 요소의 확인은 추정상의 조절 서열 각각에 대한 결실 분석 이후에 각각의 구조체에 기능적으로 부착되어 있는 리포터 유전자를 검정함으로써 각각의 결실 구조체에 대한 기능 분석에 의해 구현될 수 있다. 이와 같이, 일단 시작 프로모터 서열이 제공되면, 시작 프로모터의 다수의 상이한 결실 돌연변이체 중 어떤 것이라도 쉽게 제조될 수 있다.
본원에 개시된 본 발명은 신규한 키메라 조절 요소를 구성하는데 사용될 수 있는 조절 요소 단편을 포함하는 폴리뉴클레오티드 분자를 제공한다. 이들 폴리뉴클레오티드 분자의 단편 및 적어도 하나의 기타 조절 요소 또는 단편을 포함하는 신규한 조합은 식물에서 구성되고 시험될 수 있으며, 본 발명의 범주 내에 있는 것으로 고려된다. 따라서 키메라 조절 요소의 설계, 구성 및 용도는 본 발명의 하나의 실시형태이다. 본 발명의 프로모터는 본 발명의 프로모터 서열과의 상동성을 나타내는 유전자 조절에 영향을 미치는 것으로 알려져 있는 시스 요소(cis element)의 상동체를 포함한다.
본원에 설명된 전사 조절용 핵산들 중 하나의 기능상 동등한 단편은 적어도 50개, 100개, 150개, 200개, 250개, 300개, 350개, 400개, 450개, 500개, 550개, 600개, 650개, 700개, 750개, 800개, 850개, 900개, 950개 또는 1,000개의 염기 쌍의 전사 조절용 핵산을 포함한다. mRNA의 5'-비번역 영역을 암호화하는 영역을 결실시킴으로써 수득되는 전사 조절용 핵산의 동등한 단편은 오직 (전사되지 않은) 프로모터 영역을 제공할 수 있다. 5'-비번역 영역은 당해 기술분야에 공지된 방법(예를 들어, 5'-RACE 분석)에 의해 쉽게 알아낼 수 있다. 따라서 본원에 설명된 전사 조절용 핵산들 중 일부는 기타 서열의 동등한 단편이다.
상기에 나타낸 바와 같이, 본 발명의 프로모터의 결실 돌연변이체는 또한 무작위로 제조되고 검정될 수 있다. 이러한 전략에 따라, 일련의 구조체가 제조되고, 이때 각각의 구조체는 프로모터의 상이한 부분(하위클론)을 함유하며, 이어서 이들 구조체는 활성에 대해 스크리닝된다. 활성에 대한 스크리닝에 적합한 수단은 결실된 절편을 함유하는 결실된 프로모터 또는 인트론 구조체를 선택 또는 스크리닝 가능한 마커에 부착시키고 마커 유전자를 발현하는 세포만을 단리하는 것이다. 이렇게 하여, 여전히 목적하는 활성 또는 심지어 향상된 활성을 유지하는 다수의 상이하고 결실된 프로모터 구조체가 확인된다. 이로 인해, 활성을 위해 요구되는 가장 작은 절편은 선택된 구조체의 비교를 통해 확인된다. 이어서, 이러한 절편은 외생성 유전자의 발현을 위한 벡터를 구성하기 위해 사용될 수 있다.
본원에 설명된 바와 같은 발현 카세트는 추가의 조절 요소를 포함할 수 있다. 이러한 문맥에서 상기 용어는 발현 카세트의 구성 또는 기능에 영향을 미칠 수 있는 서열 모두를 포함한다는 광범위한 의미로 이해되어야 한다. 조절 요소는, 예를 들어 원핵생물 또는 진핵생물에서 전사 및/또는 번역을 변경할 수 있다. 본원에 설명된 발현 카세트는 발현될 핵산 서열 하류(3' 방향)에 있을 수 있으며, 선택적으로 전사 또는 번역 인핸서와 같은 부가적인 조절 요소를 함유할 수 있다. 각각의 부가적인 조절 요소는 발현될 핵산 서열(또는 전사 조절용 뉴클레오티드 서열)에 작동 가능하게 연결될 수 있다. 부가적인 조절 요소는 발현 조절 특징을 변경 또는 향상시킬 수 있는, 부가적인 프로모터, 최소 프로모터, 프로모터 요소 또는 트랜스포존 요소를 포함할 수 있다. 발현 카세트는 또한 하나 이상의 인트론, 하나 이상의 엑손 및 하나 이상의 종결인자를 함유할 수 있다.
더욱이, 하나 초과의 프로모터에서 유래하는 요소를 조합한 프로모터가 유용할 수 있는 것으로 고려된다. 예를 들어, 미국 특허 제5,491,288호에는 꽃양배추 모자이크 바이러스(Cauliflower Mosaic Virus) 프로모터를 히스톤 프로모터와 조합하는 것이 개시되어 있다. 따라서, 본원에 개시된 프로모터에서 유래하는 요소는 기타 프로모터에서 유래하는 요소와 조합될 수 있다. 식물 이식 유전자의 발현에 유용한 프로모터로는 유도성, 바이러스성, 합성, 구성성(문헌[Odell Nature 313: 810~812 (1985)])이고, 시간적으로 조절되고, 공간적으로 조절되고, 조직 특이성이며, 시공간적으로 조절되는 것을 들 수 있다. 본원에 설명된 조절 요소를 사용하여 다수의 작물 유전자가 형질 전환된 식물에서 발현될 수 있다. 보다 구체적으로는, 식물은 작물학적 관심이 있는 다양한 표현형을 발현하기 위해 유전적으로 조작될 수 있다.
상세한 설명
본 발명의 하나의 실시형태는 식물 유전체 DNA를 편집하는 방법을 제공하며, 이때 상기 방법은 (i) 제1 식물을 수득하되, 제1 식물은 식물의 반수체 유도체 계통이고, 상기 제1 식물은 DNA 변형 효소 및 선택적으로는 가이드 핵산을 발현할 수 있는 단계; (ii) 제2 식물을 수득하되, 제2 식물은 편집되어야 할 식물 유전체 DNA를 포함하는 단계; (iii) 1 식물에서 유래하는 화분으로 제2 식물을 수분시키는 단계; 및 (iv) 상기 단계 (c)의 수분에 의해 생산된 적어도 하나의 반수체 자손을 선택하되, 반수체 자손은 제2 식물의 유전체를 포함하지만 제1 식물의 유전체를 포함하지 않고, 반수체 자손의 유전체는 제1 식물에 의해 전달되는 DNA 변형 효소 및 선택적인 가이드 핵산에 의해 변형되어 있는 단계를 포함한다.
방법의 하나의 양태에서, DNA 변형 효소는 메가뉴클레아제(MN), 징크 핑거 뉴클레아제(ZFN), 전사 활성인자 유사 효과기 뉴클레아제(TALEN), Cas9 뉴클레아제, Cfp1 뉴클레아제, dCas9-FokI, dCpf1-FokI, 키메라 Cas9-시티딘 데아미나아제, 키메라 Cas9-아데닌 데아미나아제, 키메라 FEN1-FokI 및 Mega-TAL, 닉카아제 Cas9(nCas9), 키메라 dCas9 비-FokI 뉴클레아제 및 dCpf1 비-FokI 뉴클레아제로 이루어진 군으로부터 선택되는 부위 특이적 뉴클레아제이며; 또한 가이드 핵산은 가이드 RNA이다.
방법의 다른 양태에서, 편집된 반수체 자손은 염색체 배가제로 처리되며, 그 결과 편집된 배가 반수체 자손이 생성된다. 예를 들어, 염색체 배가제로는 콜히친, 프로나미드, 디티오피르, 트리플루라린 또는 다른 공지된 항미소관제가 있다.
방법의 다른 양태에서, 제1 식물은 외떡잎식물 또는 쌍떡잎식물이다. 예를 들어, 제1 식물은 옥수수, 밀, 벼, 보리, 귀리, 라이밀, 수수, 진주 기장, 테오신트, 대나무, 사탕수수, 아스파라거스, 양파 및 마늘로 이루어진 군으로부터 선택되는 외떡잎식물이다. 다른 양태에서, 제2 식물은 외떡잎식물 또는 쌍떡잎식물이다. 예를 들어, 제2 식물은 옥수수, 밀, 벼, 보리, 귀리, 라이밀, 수수, 진주 기장, 테오신트, 대나무, 사탕수수, 아스파라거스, 양파 및 마늘로 이루어진 군으로부터 선택되는 외떡잎식물이다.
방법의 다른 양태에서, 선택적인 가이드 RNA는 18개 내지 21개로 구성된 뉴클레오티드 서열이고, 서열번호 2, 서열번호 4, 서열번호 8, 서열번호 21, 서열번호 23, 서열번호 25, 서열번호 29, 서열번호 32 및 서열번호 33으로 이루어진 군으로부터 선택되는 서열과 상동이다. 다른 양태에서, 제1 식물은 마커 유전자를 발현한다. 예를 들어, 마커 유전자는 GUS, PMI, PAT, GFP, RFP, CFP, B1, C1, R-nj, 안토시아닌 색소 및 임의의 기타 마커 유전자로 이루어진 군으로부터 선택된다.
방법의 다른 양태에서, 제1 식물은 Stock 6, RWK, RWS, UH400, AX5707RS, NP2222-matl 또는 임의의 몇몇 기타 공지된 HI 계통과 같은 계통으로부터 선택 및/또는 유래하는 옥수수 식물이다.
하나의 실시형태에서, 제1 식물 및 제2 식물은 서로 다른 종이다. 하나의 양태에서, 제1 식물은 밀 식물이고, 제2 식물은 옥수수 식물이다. 다른 양태에서, 제1 식물은 옥수수 식물이고, 제2 식물은 밀 식물이다.
본 발명의 하나의 목적은 제공된 방법에 의해 생산되는 유전자 편집된 식물이다.
다른 실시형태에서, 본 발명은 식물 유전체 DNA를 편집하는 방법을 제공하며, 이때 상기 방법은 (i) 제1 식물을 수득하되, 상기 제1 식물은 DNA 변형 효소 및 선택적으로는 가이드 핵산을 발현할 수 있는 단계; (ii) 제2 식물을 수득하되, 제2 식물은 편집되어야 할 식물 유전체 DNA를 포함하는 단계; (iii) 제1 식물에서 유래하는 화분으로 제2 식물을 수분시키는 단계; (iv) 단계 ((iii)의 수분 직전, 동안 또는 이후에 지질 또는 포스포리파아제 억제제를 포함하는 조성물을 도포하는 단계; 및 (v) 단계 (iii)의 수분에 의해 생산된 적어도 하나의 반수체 자손을 선택하되, 반수체 자손은 제2 식물의 유전체를 포함하지만 제1 식물의 유전체를 포함하지 않고, 반수체 자손의 유전체는 제1 식물에 의해 전달되는 DNA 변형 효소 및 선택적인 가이드 핵산에 의해 변형되어 있는 단계를 포함한다. 하나의 양태에서, 조성물은 메틸 알파-리놀레노일 플루오로포스포네이트(MALFP), 리놀산 에틸에스테르(LLAEE), 리놀산(LLA), 옥수수 오일, 디스테아로일-포스파티딜콜린(DSPC), 메틸아라키도닐 플루오로포스포네이트(MAFP), 팔미틸 트리플루오로메틸케톤(PACOCF3), 아라키도닐 트리플루오로메틸케톤(AACOCF3), 마노알리드, 리놀렌산 에틸에스테르(LNAEE), 리놀렌산 에틸에스테르(LNAEE), 올레산 메틸에스테르(OAME), 올레산 에틸에스테르(OAEE), 팔미트산 에틸에스테르(PAEE), 팔미톨레산 에틸에스테르(PLAEE), 아마인 오일, 옥수수 오일, 알파-리놀렌산(aLNA), 감마-리놀렌산(gLNA), 올레산, 아라키돈산, 스테아르산, 9(Z)-11(E)-접합 리놀산 또는 2-올레오일-1-팔미토일-sn-글리세로-3-포스포-에탄올아민을 포함한다.
다른 실시형태에서, 본 발명은 식물 유전체 DNA를 편집하는 방법을 제공하며, 이때 상기 방법은 (i) 제1 식물을 수득하되, 상기 제1 식물은 DNA 변형 효소 및 선택적으로는 가이드 핵산을 발현할 수 있는 단계; (ii) 제2 식물을 수득하되, 제2 식물은 편집되어야 할 식물 유전체 DNA를 포함하는 단계; (iii) 제1 식물을 제2 식물과 교배하는 단계; 및 (iv) 단계 (iii)의 교배에 의해 생산된 적어도 하나의 반수체 자손을 선택하되, 반수체 자손은 제2 식물의 유전체를 포함하지만 제1 식물의 유전체를 포함하지 않고, 반수체 자손의 유전체는 제1 식물에 의해 전달되는 DNA 변형 효소 및 선택적인 가이드 핵산에 의해 변형되어 있는 단계를 포함한다. 하나의 양태에서, 제1 식물은 단계 (iii)의 교배에서 자성 부모로서 작용한다. 다른 양태에서, 제1 식물은 CENH3 유전자에서의 돌연변이, ig1 유전자에서의 돌연변이, 또는 부계 반수체 유도 시스템을 부여하는 다른 돌연변이를 포함한다.
실시예
I. 편집 기구를 포함하는 새로운 반수체 유도체 계통을 생산하기.
본 발명자들은 NP2222로 지칭되는 옥수수의 형질 전환 가능한 계통을 TALEN 구조체로 형질 전환하고, 별도로 이러한 계통을 Cas9 및 가이드 RNA 구조체로 형질 전환하였다. TALEN 구조체(표적 서열 내의 개열을 표적화하는 TALEN을 갖는 pBSC22808(서열번호 5); 5'-TCCAGGGTCAACGTGGAGACAGGGAGGTACGAACCGGTGACTGGCGAAGGAAGCA-3'(서열번호 6); TALEN 인식 서열에 밑줄 쳐 있음) 및 Cas9 구조체(xZmPLAIIA의 가이드 RNA 서열을 갖는 pBSC23123(서열번호 7); 5'-GGGTCAACGTGGAGACAGGG-3'(서열번호 8))는 MATRILINEAL(MATL; GRAMENE ID: GRMZM2G471240)로 지칭되는 옥수수 유전자의 네 번째 엑손 내로의 돌연변이를 표적화하도록 설계되었다. 이러한 유전자는 TALEN 또는 Cas9 및 가이드 RNA에 의해 표적 부위에서 돌연변이 되는 경우 녹아웃되며, 그 결과 단백질 산물의 기능이 소실된다. 이전에, 본 발명자들은 MATL에서의 기능 소실 돌연변이로 인해 동형 접합성인 계통이 반수체 유도체 계통임을 증명하였으며, 이는 이들이 교배 시에 화분 공여자로 사용되는 경우에 얻어진 이삭에 대해 반수체의 형성을 유도한다는 것을 의미한다(그 전체가 본원에서 참고로 포함되는, 2016년 11월 17일자로 출원된 PCT 특허 출원 제PCT/US2016/62548호 참조).
본 발명자들은 몇몇 이벤트를 생산하고 이들을 자가 수분시켜 T1 종자를 만들었다. 본 발명자들은 사건 MZET152408A042A로부터 T1 개체를 성장시켰다. 본 발명자들은 안정하게 형질 전환된 Cas9 및 가이드 RNA 편집 기구를 2개의 복제수로 유지하며, MATL 유전자에 대한 동형 접합성 돌연변이체인 5개의 T1 자손을 회수하였다. 표 1을 참고한다.
[표 1]
Figure pct00001
MATL(본원에서 MATL 또는 야생형-MATL로 지칭됨: 이들 용어는 전체가 상호 교환 가능하게 사용됨)의 야생형 복제를 증폭하는 TaqMan 검정을 이용하여 MATL 돌연변이를 검출한다. MATL의 복제 둘 모두가 돌연변이 되는 경우, 이러한 검정에서는 음성(즉, "-")으로 판독된다. Cas9 및 가이드 RNA 편집 기구는 구조체 23123(서열번호 7)을 통해 안정하게 삽입되었다. 본 발명자들은 PCR 및 하위클로닝을 통해 MATL 내의 돌연변이를 시퀀싱하였다. 각각의 PCR 산물의 4개의 복제를 시퀀싱하였으며, 소정의 개체에 대한 모든 콜로니는 동일한 서열을 가졌으며, 이는 이들 식물이 모두 MATL 대립 유전자(본원에서 Stock6 및 기타 Stock6 유래 계통에서 발견되는 MATRILINEAL 내의 4개의 염기 쌍의 삽입을 지칭하는 경우에 matl로도 지칭되거나, MATRILINEAL 내의 임의의 기타 인간 유발 돌연변이를 지칭하는 경우에 μMATL로도 지칭됨)에 대한 동형 접합성 돌연변이체임을 나타낸다. 8 bp 결실을 갖는 식물이 2개 존재하고, 13 bp 결실을 갖는 식물이 3개 존재한다.
II. 웅성 부모로서의 새로운 HI 계통의 이용 및 자손 분석.
본 발명자들은 열성 컬러 마커를 함유하지만 MATL 유전자에 대해 야생형인 자성 검정 계통에 대한 웅성 화분 공여자로서의 상술한 새로운 HI 식물을 교배하였다. 웅성 반수체 유도체 계통은 동일한 컬러 마커에 대해 동형 접합성 야생형이다. 따라서 이러한 자성 계통은 비-반수체 유도체이고, MATL 유전자에 대해 동형 접합성 야생형이지만, 컬러 마커에 대해 동형 접합성 돌연변이체이었다. 본 발명자들은 교배를 통해 종자를 회수하고, 이로부터 묘목을 발아시켰다.
자손 묘목에는 몇몇 검정이 적용되었다. 자손 묘목이 컬러 마커를 나타내지 않는 경우(열성 마커가 웅성 유도체 DNA에 의해 보완되기 때문) 이를 이배체로 기록하였다. 열성 마커가 보완되지 않았기 때문에 자손 묘목이 컬러 마커를 나타내는 경우에 이를 추정상의 반수체로 기록하였다. 식재된 2,656개의 종자 중에서 본 발명자들은 컬러 검정을 이용하여 90개의 묘목을 추정상의 반수체로 확인하였다.
본 발명자들은 Taqman 마커 검정을 이용하여 야생형 MATL 유전자의 존재를 확인하기 위해 90개의 추정상의 반수체를 추가로 분석하였다. 이들 중에서 82개가 MATL에 대해 양성이었으며, 이는 이들이 웅성 부모에 의해 제공되는 편집 기구에 의해 편집되지 않았음을 의미한다. Taqman 마커를 이용하여 나머지 8개의 추정상의 반수체 묘목은 야생형 MATL에 대해 음성이었으며, 이는 이들이 웅성 부모에 의해 제공되는 편집 기구에 의해 편집되었을 수 있음을 의미한다.
본 발명자들은 배수성 분석기에서 잎 조직을 이용하여 이들 8개의 추정상의 편집된 반수체 묘목에 대해 유동 세포 분석법을 통한 배수성 분석을 수행하였다. 도 1 내지 도 8을 참고한다. 본 발명자들은 이들 중 4개가 순수 반수체인 반면 나머지는 실제로 이배체임을 발견하였다. 본 발명자들이 하기에 토의한 바와 같이, 본 발명자들은 PCR를 운행하여 이들 4개의 순수 반수체 내의 MATL 유전자 내의 돌연변이뿐만 아니라, MATL Taqman 검정에 따르면 유전체 편집 기구에 의해 편집되지 않은 식물인 USR01350337-2에 대한 돌연변이를 시퀀싱하였다.
90개의 추정상의 반수체 중에 4개의 이배체가 존재한다는 발견은 예상치 못한 것은 아니었다: 묘목 검정은 완전한 것이 아니며, 종종 위 양성이 존재한다. 본 발명자들은 Cas9 구조체(구조체 23123)의 존재를 확인하기 위해 90개의 반수체를 시험하였으며, 90개 중에서 상술한 4개의 순수 반수체를 포함하여 86개에서 이것이 결실되어 있다는 것을 발견하였다. 이에 반해, 배수성 분석 동안에 본 발명자들이 발견한 4개의 편집된 이배체는 모두 Cas9 구조체가 존재하였으며, 반수체 묘목 검정에 의해 반수체인 것으로 잘못 확인되었었던 이들의 상태가 혼성 이배체인 것으로 확인되었다.
이어서, 본 발명자들은 잎 조직을 사용하여 유전체 DNA를 단리하였으며, PCR 반응을 실시하여 이들 4개의 순수 반수체 개체(추정상 편집됨) 내의 MATL 유전자를 시퀀싱하였으며, 구체적으로는 가이드 RNA 표적 돌연변이 유발 부위 옆에 있는 서열에 초점을 맞추었다. 이는 여기서 발생할 수 있거나 발생하지 않았던 편집체의 특징을 알아내기 위한 것이다. 본 발명자들은 시판되는 TOPO Blunt IV 키트를 이용하여 PCR 단편을 하위클로닝하고, 적어도 4개의 콜로니를 각각 시퀀싱하였다(전방향 및 역방향 시퀀싱). 편집된 대립 유전자과 참고용 야생형-MATL 대립 유전자의 비교를 위해 하기 표 2을 참고한다.
[표 2]
Figure pct00002
USR01350333-3 개체는 cDNA 서열의 1,143번째 염기 쌍에 알라닌(표 2에서 밑줄 쳐 있음)을 삽입함으로써 편집된 MATL 대립 유전자를 생산하였다. 이는 암호화 서열에서의 프레임시프트를 야기하기에 충분할 수 있으며, 이는 미성숙 정지 코돈을 생산할 수 있다. 앞서 본 발명자들이 고려했던 것은, USR01350333-3의 편집된 대립 유전자 #2(GACAAGGGAGGTAC의 13개의 염기 쌍의 결실)가 실제로 PCR 오염의 결과였다는 것이었다. 재시퀀싱 이후, 본 발명자들은 이러한 식물만이 하나의 편집된 대립 유전자를 가지며, 이는 6개의 콜로니 중의 6개에서 발견되었다는 것을 확인하였다.
이러한 대립 유전자가 이러한 개체의 웅성 부모(male parent) 및 자성 부모 식물에서 중 어디서도 존재하지 않는다는 점에서 이는 신규한 것이다. 이러한 개체에 대한 웅성 부모 ID는 USR01283391이었으며, 이러한 식물은 8 bp 결실로 인해 동형 접합성인 것으로 밝혀졌다.
개체 USR01350344-2 는 A의 결실(야생형 cDNA 서열의 1,143번째 염기 쌍의 결실)을 제공한다. 이러한 돌연변이는 암호화 서열에서의 프레임시프트를 야기하고 미성숙 정지 코돈을 생산하기에 충분할 수 있다. 재시퀀싱 및 PCR 오염의 발견 이후, 본 발명자들은 이것이 6개의 콜로니 중의 6개에서 발견되었다는 것을 확인하였다. 이전에 USR01350344-2의 편집된 대립 유전자 #2로서 확인된 이것은 PCR 오염으로 확인되었다.
개체 USR01350343-1은 cDNA 서열의 1,143번째 염기 쌍의 A의 삽입을 제공한다. 이는 암호화 서열에서의 프레임시프트를 야기하고 미성숙 정지 코돈을 생산하기에 충분할 수 있다. 이는 4개의 콜로니 중의 4개에서 발견되었다.
개체 USR01350328-1은 A의 결실(야생형 cDNA 서열의 1,143번째 염기 쌍의 결실)을 제공한다. 이러한 돌연변이는 암호화 서열에서의 프레임시프트를 야기하고 미성숙 정지 코돈을 생산하기에 충분할 수 있다. 이는 4개의 콜로니 중의 4개에서 발견되었다.
개체 USR01350337-2는 변화가 없었다: 이의 서열은 야생형-MATL의 서열과 100% 동일하였다.
요약하면, 본 발명자들은 86개의 확인된 반수체 중에서 4개가 MATL 유전자에서 돌연변이를 갖는다는 것을 발견하였다. 본 발명자들은 이들 식물이 반수체이며, 어떠한 Cas9 DNA도 함유하지 않는다는 것을 확인하였다. Cas9 이식 유전자가 배아 발생 과정 동안에 웅성 유래 DNA 중 나머지와 함께 제거되었으며, 배아 발생 과정에서 자성(난세포 유래) 유전체에 편집이 발생하였다는 것이 자명하다.
본 발명자들은 이 같은 편집이 신규한 것이며, 반수체 유도체 계통이 전형적으로 모계 반수체를 만들기 때문에 배아 발생 과정에서 자성 유전체에서 발생한다는 것을 알았으며, 본 발명자들은 이들이 실제로 반수체임을 확인하였다. 당업자라면 이들이 실제로 부계 반수체이고, 본 발명자들이 관찰한 편집체가 실제로 부계 DNA에 이미 존재하는 편집체일 가능성이 있다고 주장하려고 할 수 있다. 그러나, 본 발명자들은 이는 실제로는 그렇지 않다는 것을 증명할 수 있다. 먼저, 돌연변이는 부계 부모의 돌연변이와 일치하지 않는다. 이는 표 3 및 표4(하기에 도시됨)에서 명백히 알 수 있다. 편집된 반수체 식물인 USR01350343-1은 단일 뉴클레오티드("A")의 삽입으로 인해 동형 접합성이지만, 웅성 부모 식물은 13개의 뉴클레오티드의 결실을 갖는다. 유사하게, USR01350328-1 식물은 A의 결실로 인해 동형 접합성이지만, 웅성 부모는 13개의 뉴클레오티드의 결실을 갖는다. 종합하면, 이들 실시예에서는 반수체 유도 과정 동안에 모계 유전체의 편집이 일어나게 되는 것이 가능하며, 그 결과 편집된 모계 반수체의 형성이 야기된다는 것이 증명된다. 이에 따르면서도, MATL 존재를 검출하는 검정 및 배수성 분석을 통한 확인에 기초하여, 그리고 옥수수 유비퀴틴 프로모터에 의해 제어되는 웅성 측상의 Cas9 이식 유전자를 이용하여 반수체 유도 과정 동안의 편집율은 약 4/86 또는 4.65%이다.
더욱이, 반수체 유도 과정 동안의 편집율은 다양한 반수체 유도체 계통을 이용하거나 원연 교배를 이용하는 경우에 매우 다를 수 있다. MATL 돌연변이체 계통을 이용하는 옥수수에서의 반수체 유도 및 보리, 밀 또는 기타 농작물에서의 원연 교배 둘 모두는 유사한 기작을 통해 작동하는 것처럼 보인다: 수정 이후에 유전체가 제거된다. 또한 수정과 유전체 제거 사이의 기간은 유도체 계통이 혼성화되어 있는 계통의 유전체(표적 생식질)에서 편집 기구가 표적 유전자를 편집하기에 충분히 길다. 안전하게 형질 전환된 편집용 단백질 시스템의 발현을 조장하는 프로모터의 선택은 반수체에서의 편집율에 큰 영향을 미칠 수 있다는 것이 주지된다. 본 발명자들은 항시성 사탕수수 프로모터(prSoUbi4)를 사용하였지만, 웅성 DNA가 옥수수 반수체 유도체 시스템 또는 CENH3형 반수체 유도체 시스템과 같은 종내 반수체 유도체 시스템에서 보다 훨씬 더 강력하고 빠르게 제거되는 원연 교배의 경우에 특히 배낭, 난세포, 화분 또는 정자세포에서 높거나 특이적인 발현을 조장하는 기타 프로모터가 보다 더 효과적일 수 있다. 다시 말해, 원연 교배 동안, 예를 들어 옥수수 화분을 밀 이삭과 교배하는 경우(이는 밀 모계 반수체를 유도하기 위해 이루어짐), 이는 옥수수 화분에서의 편집 기구가 아마도 접합자의 발현 이외에도 화분 또는 정자세포의 강력한 발현을 보이는 프로모터에 의해 구동되도록 가장 잘 작동하여, 풍부한 편집 기구(RNA 및 단백질)가 전달되고, 웅성 DNA가 매우 빠르게 제거 또는 소실되더라도 접합자 세포 내에, 그리고 후속적인 2세포, 4세포 또는 8세포 배아 단계 동안에 존재한다.
[표 3]
Figure pct00003
[표 4]
Figure pct00004
III. 우량 옥수수 동종교배 계통에서의 동시 반수체 유도 및 편집
형질 전환 가능한 반수체 유도체 계통인 NP2222-HI, RWK, RWS 또는 UH400 또는 Stock6 또는 임의의 기타 반수체 유도체 계통은 이미 모두 MATL의 돌연변이 형태를 갖는데, 이는 Cas9 + 가이드 RNA(문헌[Cong, L. et al. 2013. Multiplex genome engineering using CRISPR/Cas systems. Science 339, 819~823]), dCas9-FokI+ 가이드 RNA(문헌[Tsai, S. Q. et al. 2014, Dimeric CRISPR RNA-guided FokI nucleases for highly specific genome editing. Nature Biotechnol. 32, 569~576]), TALEN(문헌[Li et al., 2012, High-efficiency TALEN-based gene editing produces disease-resistant rice. Nature Biotech. 30, 390~392]), 조작된 메가뉴클레아제(문헌[Gao et al., 2010, Heritable targeted mutagenesis in maize using a designed endonuclease. Plant Journal. 61: 176~187]), 징크 핑거 뉴클레아제(문헌[Shukla et al. 2009. Precise genome modification in the crop species Zea mays using zinc-finger nucleases. Nature 459, 437~441]), dCas9-시티딘 데아미나아제(문헌[Komor et al. 2016, Programmable editing of a target base in genomic DNA without double-stranded DNA cleavage. Nature doi: 10.1038/nature17946]) 또는 임의의 기타 유전체 변형 시스템과 같은 유전체 변형 시스템을 발현하는 구조체로 안정하게 형질 전환된다. 이어서, 편집 기구를 발현하는 형질 전환 반수체 유도체 계통도 또한 화분 공여자로 사용되어 이종교배를 통해 표적 계통에서 돌연변이 및 반수체를 유발한다. 이어서, 반수체 배아 또는 종자가 회수되고, 반수체로서 확인되며, (TALEN 구조체의 설계 또는 Cas9 가이드 RNA의 설계로 인해 어떤 표적 부위가 선택되든지 간에) 표적 부위에서의 편집체에 대해 시험된다. 목적하는 편집체를 함유하는 반수체는 콜히친, 트리플루라린 또는 기타 염색체 배가제와 같은 표준 수단을 이용하는 표준 절차를 이용하여 염색체 상에서 배가된다. 유도된 반수체의 확인은 옥수수의 배가 반수체의 생산에서 전형적으로 이루지는 바와 같이 컬러 마커를 이용하여 단순화될 수 있다: 이러한 컬러 마커는 얻어진 배아, 종자, 묘목 또는 성체 식물에서 나타날 수 있다. 표적 부위에서의 돌연변이의 존재는 서열 분석(DNA 시퀀싱), 마커 분석 또는 표현형에 의해 확인될 수 있다. 반수체 식물에는 돌연변이될 DNA의 복제본이 단 하나 존재하기 때문에 열성 표현형이 나타날 것이어서, 이는 편집된 반수체를 확인하는 다른 방법일 수 있다.
A. 반수체 유도체 계통에서 직접 생성된 형질 전환 편집 유전자위를 갖는 우량 옥수수 동종교배 계통에서의 VLHP 표적의 돌연변이 유발
VLHP1 및 VLHP2는 호메오도메인-류신 지퍼 클래스I 호메오박스 유전자이면서 식물에 고유한 단백질 부류의 멤버이다. HD 도메인은 DNA 결합과 연관이 있는 반면, Zip 도메인은 동형 및 이형 이량화와 연관이 있다. HD-Zip I 단백질은 일반적으로 비생물학적 스트레스, 아브시스산(ABA), 청색광, 탈황화(de-etiolation) 및 배아 발생과 관련이 있는 반응과 연관이 있다(문헌[Elhiti and Stasolla, 2009. Structure and function of homodomain-leucine zipper (HD-Zip) proteins. Plant Signal Behav. 4: 86~88]). VLHP1 및 VLHP2는 Grassy Tillers1(GT1)과 동일한 유전자 패밀리 내에 있다. GT1은 곁눈 휴면을 조장하고, 옥수수에서 측면 지경(lateral ear branch)의 연장을 억제한다.
본 실시예에서, Cas9 및 단일 가이드 RNA(sgRNA)를 발현시키기 위한 벡터 23396(서열번호 1; 또한 도 9 참조)은 옥수수인 VLHP1(GRMZM2G104204) 유전자 및 이의 상동체인 VLHP2 (GRMZM2G062244) 유전자를 표적화하기 위해 제조되었다. 벡터 23396은 20개의 뉴클레오티드로 이루어진 표적화 서열인 xZmVLHP-01(5'-GCAGGAGGCGTCGAGCAGCG-3'; 서열번호 2)을 이용하여 sgRNA를 발현하였다. xZmVLHP-01은 제2 엑손에 있는 VLHP1 및 VLHP2 유전자 둘 모두를 표적화한다. 벡터 23396은 만노오스 선택 기능을 이용한 아그로박테리움 매개 형질 전환을 이용하여 형질 전환 가능한 반수체 유도체 계통인 NP2222-HI 내로 도입되었다. NP2222-HI는 반수체 유도(HI) 유전자위를 유전자 이입하기 위해 Stock 6 유도 계통인 RWKS에 대한 형질 전환 가능한 옥수수 동종교배 계통인 NP2222의 교배로부터 유래하였다. NP2222-HI는 약 9.2%의 평균 반수체 유도율을 갖는다.
유전체 VLHP 표적 서열(5'-GCAGGAGGCGTCGAGCA/GCG-3'; 서열번호 2)을 변형하기 위해 벡터 23396으로부터의 NP2222-HI 형질 전환체를 검정하였다. 슬래시("/")는 Cas9 개열 위치를 나타낸다. 표적 유전자위 편집 활성은 앞서 개시된 바와 같은 양적 PCR Taqman 방법(본원에 참고로 포함되는 WO2016106121)을 이용하여 측정되었다. 높은 표적 부위 변형 활성을 갖는 형질 전환 계통, 즉 VLHP1 및 VLHP2 유전자 둘 모두가 변형되었으며, 바람직하게는 단일 복제 이식 유전자를 함유하고 있는데, 이들 유전자는 추가적인 연구를 위해 선택되었으며, 교배 또는 자손 생산을 위해 사용되었다.
23396의 T0 형질 전환체에서 유래하는 화분은 반수체 배아의 생산을 유도하기 위해 우량 동종교배 계통인 ID5829 또는 기타 옥수수 계통(사탕 옥수수 계통을 포함함)의 이삭을 수분시키는데 직접 사용된다. 대안적으로, NP2222-HI 배경에서의 23396의 T0 형질 전환체는 동형 접합성 이식 유전자를 갖는 자손 계통을 생산하기 위해 자가 수분되고, 자손 식물에서 유래하는 화분은 기타 옥수수 계통을 수분시켜 반수체 배아의 형성을 유도하는데 사용된다. 유도된 반수체 배아를 종실에서 추출하고, 직접 발아를 위해 배아 회생 배지 위에 놓거나, 성숙시켜 종자를 형성하도록 한다. 유도된 반수체 배아 및 얻어진 식물에서 유래하는 조직을 검정하여 VLHP 표적 서열에서 편집이 발생하였는지를 알아낸다. 유도된 반수체 배아 또는 식물이 목적하는 돌연변이를 함유하고 있는 경우, 염색체 배가 처리가 적용되어 이들로부터 배가 반수체 계통을 생산한다. 예를 들어, 배아 회생 방법을 이용하여, 수분 이후 일수("DAP")가 18일 내지 22일째인 날에 23396 편집 유전자위를 갖는 형질 전환 반수체 유도체 계통으로 수분된 우량 계통 ID5829의 이삭으로부터 배아를 추출한다(10 내지 25 DAP 사이의 추출이 이론적으로 가능함). 발아된 반수체 묘목으로부터 DNA를 단리하고, 검정용으로 사용한다. 콜히친 처리는 염색체의 배가를 위해 묘목에 적용된다. 대안적으로, 염색체 배가제는 발아 동안에 단리된 배아에 도포될 수 있다. 발아된 묘목으로부터 DNA를 추출하고, xZmVLHP-01 표적 서열에서 돌연변이가 발생하였다는 것을 알아내기 위해 사용된다.
대안적인 방법이 이용 가능하다. 하나의 방법은 종자가 성숙하도록 하고 추후에 다른 표현형에 의해 반수체를 선택하도록 할 수 있다. 또 하나의 방법은 종자가 마르도록 하고 추후 날짜에 종자를 발아시켜 (예를 들어, 컬러 마커를 부여하는 유전자가 아닌 식물 크기를 이용하여) 마커 없이 반수체를 결정하도록 할 수 있으며, 이 시점에 편집체를 시험하고 염색체 배가제를 적절한 곳에 도포할 있도록 할 수 있다. 이러한 방법은 배아 스크리닝 및/또는 회생이 불필요하다는 점에서 이의 이점을 가질 수 있다.
B. 반수체 유도체 계통에 직접 도입되는 형질 전환 편집 유전자위를 이용한 우량 옥수수 동종교배 계통에서의 GW2 표적의 돌연변이 유발
벼의 E3-유비퀴틴 리가아제 유전자인 DA2에서의 돌연변이는 보다 큰 종자를 초래한다(문헌[Song et al., 2007]). 벼 DA2는 2개의 옥수수 상동체, 즉 GW2-1(GRMZM2G170088) 및 GW2-2(GRMZM2G007288)를 갖는다. 옥수수 유전자는 단백질 수준에서 94% 동일하고, DNA 수준에서 90% 동일하다. GRMZM2G170088은 GRMZM2G007288과 비교하여 177 bp의 큰 삽입체(59개의 아미노산(aa))를 갖는다.
본 실시예에서, 벡터 23399(서열번호 3, 또한 도 10 참조)는 옥수수 GW2-1(GRMZM2G170088) 및 이의 상동체 GW2-2(GRMZM2G007288) 유전자 둘 모두를 표적화하기 위해 Cas9 및 sgRNA의 발현용으로 제조되었다. GW2-1 및 GW2-2 유전자 둘 모두는 엑손 1 내에 표적 서열인 xZmGW2-02(5'-AAGCTCGCGCCCTGCTACCC-3'; 서열번호 4)를 함유하며, 이러한 서열은 벡터 23399에서 발현되는 sgRNA를 설계하기 위해 사용되었다. 이원 벡터 23399는 crRNA 및 tracrRNA 둘 모두로 구성되는 단일 가이드 RNA 스캐폴드에 융합된 20-뉴클레오티드 표적화 서열인 xZmGW2-02와 함께 단일 가이드 RNA(sgRNA)를 발현한다. 벡터 23399는 만노오스 선택 기능을 이용한 아그로박테리움 매개 형질 전환을 이용하여 형질 전환 가능한 반수체 유도체 계통인 NP2222-HI 내로 도입되었다. NP2222-HI는 반수체 유도(HI) 유전자위를 유전자 이입하기 위해 Stock 6 유도 계통인 RWKS에 대한 형질 전환 가능한 옥수수 동종교배 계통인 NP2222의 교배로부터 유래하였다.
유전체 GW2-2 표적 서열(5'-AAGCTCGCGCCCTGCTA/CCC-3'; 서열번호 4: 슬래시("/")는 Cas9 개열 위치를 나타냄)을 변형하기 위해 벡터 23399의 NP2222-HI 형질 전환체를 검정하였다. 표적 서열 편집 활성은 앞서 개시한 바와 같은 양적 PCR Taqman 방법(WO2016106121)을 이용하여 결정되었다. 높은 표적 부위 변형 활성을 갖는 형질 전환 계통, 즉 GW2-1 및 GW2-2 유전자 둘 모두가 변형되었으며, 바람직하게는 단일 복제 이식 유전자를 함유하고 있는데, 이들 유전자는 추가적인 연구를 위해 선택되었으며, 교배 또는 자손 생산을 위해 사용되었다.
23399의 T0 형질 전환체에서 유래하는 화분은 반수체 배아의 생산을 유도하기 위해 우량 동종교배 계통인 ID5829 또는 기타 옥수수 계통(사탕 옥수수 계통을 포함함)의 이삭을 수분시키는데 직접 사용된다. 대안적으로, NP2222-HI 배경에서의 23399의 T0 형질 전환체는 동형 접합성 이식 유전자를 갖는 자손 계통을 생산하기 위해 자가 수분되고, 자손 식물에서 유래하는 화분은 기타 옥수수 계통을 수분시켜 반수체 배아의 형성을 유도하는데 사용된다. 유도된 반수체 배아를 종실에서 추출하고, 직접 발아를 위해 배아 회생 배지 위에 놓거나, 성숙시켜 종자를 형성하도록 한다. 유도된 반수체 배아 및 얻어진 식물에서 유래하는 조직을 검정하여 옥수수 GW2 표적 서열에서 편집이 발생하였는지를 결정한다. 유도된 반수체 배아 또는 식물이 목적하는 돌연변이를 함유하고 있는 경우, 염색체 배가 처리가 적용되어 이들로부터 배가 반수체 계통을 생산한다. 예를 들어, 배아 회생 방법을 이용하여, 수분 이후 18일 내지 22일째 날에 23396 편집 유전자위를 갖는 형질 전환 반수체 유도체 계통으로 수분된 우량 계통 ID5829의 이삭으로부터 배아를 추출한다. 발아된 반수체 묘목으로부터 DNA를 단리하고, 검정용으로 사용한다. 콜히친 처리는 염색체의 배가를 위해 묘목에 적용된다. 대안적으로, 염색체 배가제는 발아 동안에 단리된 배아에 도포될 수 있다. 발아된 묘목으로부터 DNA를 추출하고, xZmGW2-02 표적 서열에서 돌연변이가 발생하였다는 것을 알아내기 위해 사용된다. 대안적으로, 하나의 방법은 종자가 성숙하고 다른 표현형에 의해 추후에 반수체를 선택하도록 할 수 있다. 또 하나의 방법은 종자가 마르도록 하고 추후 날짜에 종자를 발아시켜 (예를 들어, 컬러 마커를 부여하는 유전자가 아닌 식물 크기를 이용하여) 마커 없이 반수체를 결정하도록 할 수 있으며, 이 시점에 편집체를 시험하고 염색체 배가제를 적절한 곳에 도포할 있도록 할 수 있다. 이러한 방법은 배아 스크리닝 및/또는 회생이 불필요하다는 점에서 이의 이점을 가질 수 있다.
IV. 화학적 기반 반수체 유도를 통한 옥수수, 벼, 해바라기 또는 임의의 기타 농작물에서의 동시 반수체 유도 및 편집
옥수수, 벼, 밀, 토마토, 해바라기, 보리 또는 임의의 기타 농작물의 임의의 계통은 편집용 구조체(특정 표적 부위를 돌연변이 시키도록 설계된 Cas9와 가이드 RNA의 조합)로 형질 전환 가능하고, 이어서 선택적으로 (형질 전환된 이벤트의 자가 수분을 통해) 편집용 구조체를 이형 접합성 또는 동형 접합성으로 만든 후, 데보노 반수체를 유도하는 동시에 표적 유전체 내의 표적 부위를 편집하기 위해 이종교배(표적 계통에 대한 수분) 동안에 지질 또는 오일 도포를 이용한다. 이들 지질 도포는 -웅성 부모와는 무관하게- 임의 식물의 화분, 수염(silk), 꽃 또는 술(tassel)에 적용될 때 반수체를 유도하는 능력을 갖는다. 특히, 웅성 부모는 MATL 유전자 내의 임의의 돌연변이를 가질 필요가 없다(즉, 이는 MATRILINEAL 유전자에 대해 동형 접합성 야생형일 수 있음). 이들 지질 도포는 어떠한 유전적 요건 없이 부모 둘 중 하나를 대신하여 데보노에서 반수체를 유도한다. 그 전체가 본원에서 참고로 포함되는 PCT 특허 출원 제PCT/US2016/62548호를 참고한다. 지질 분무를 통한 데보노 반수체 유도 기작은 명백히 -수정 후 염색체 제거를 통해- matl 돌연변이체(유전자 반수체 유도체) 계통에 작용하는 방식과 동일하게 작용한다. 반수체 자손을 단리하고, 유도된 돌연변이(편집 과정을 통해 유발됨)에 대해 점검한 후, 배가하여 편집된 배가 반수체 식물을 제조한다.
V. 반수체 유도체 계통 내로 유전자 이입된 형질 전환 편집 유전자위를 이용한 우량 사료용 옥수수 및 사탕 옥수수 동종교배 계통에서의 표적 서열의 돌연변이 유발
유전체 편집 기구를 발현하는 형질 전환 유전자위는 또한 반수체 유도 활성이 없는 통상적인 형질 전환 가능한 옥수수 계통, 예를 들어 A188, Hi-II 또는 NP2222에서 생성된 후, NP2222-HI, RWK, RWKS, RWS, 또는 UH400 또는 Stock6과 같은 반수체 유도체 계통 또는 임의의 기타 반수체 유도체 계통 내로 유전자 이입될 수 있다.
본 실시예에서, 옥수수 동종교배 계통인 NP2222는 VLHP Cas9-sgRNA 벡터(23396 및 23397) 및 GW2 Cas9-sgRNA 벡터(23398 및 23399)로 형질 전환된다. 벡터 23396 및 벡터 23399는 이전 실시예(실시예 IIIA 및 실시예 IIIB)에 개시되어 있다. gRNA-암호화 서열인 xZmVLHP-01(5'-GCAGGAGGCGTCGAGCAGCG-3'; 서열번호 2)이 xZmVLHP-02(5'-GCTGGAGCTGAGCTTCCGGG-3'; 서열번호 21)로 교체된다는 것을 제외하고, 벡터 23397(서열번호 20)는 23396과 동일하다. 23399 내의 gRNA-암호화 서열인 xZmGW2-02(5'-AAGCTCGCGCCCTGCTACCC-3'; 서열번호 4)가 xZmGW2-01(5'-GAGCGGTTCACGCGGCCGCA-3'; 서열번호 23)로 교체된다는 것을 제외하고, 벡터 23398(서열번호 23)는 23399와 동일하다. 이들 벡터는 아그로박테리움 균주인 LBA4404(pVGW7) 내로 도입되었다. 벡터 23396, 벡터 23397, 벡터 23398 또는 벡터 23399를 함유하는 얻어진 아그로박테리움 균주는 형질 전환 가능한 우량 동종교배 계통인 NP2222의 미성숙 배아를 형질 전환하기 위해 사용되었다. 캘러스는 감염된 미성숙 배아로부터 유도되었으며, 만노오스 배지 상에서 선택되어 형질 전환 캘러스를 회수하였다. 형질 전환 캘러스를 재생 및 발근 배지 상에 놓아서 CRISPR-Cas9 편집 기구를 발현하는 형질 전환 식물을 회수하였다. 형질 전환 식물은 이식 유전자 복제수를 확인하기 위해 검정하였으며, 종자의 생산을 위해 온실로 옮겼다.
23396의 단일 복제 형질 전환체(MZET154902A004A, MZET154902B006A), 23397의 단일 복제 형질 전환체(MZET154903B009A, MZET154903B012A), 23398의 단일 복제 형질 전환체(MZET154904B005A, MZET154904B014A) 및 23399의 단일 복제 형질 전환체(MZET154905A002A, MZET154905A010A)를 확인하고, 비-형질 전환 NP2222와 역교배하였다. 상술한 벡터 각각의 T-DNA 삽입체를 함유하는 형질 전환 자손 식물의 이삭을 반수체 유도체 계통인 RWKS의 화분으로 수분시켜 F1 자손을 생산하였다. 형질 전환 유전자위 및 반수체 유도 유전자위를 함유하는 F1 자손을 유전자형 검정에 의해 확인하였으며, 자가 수분하여 F2 자손 종자를 생산하였다. F2 자손 종자를 식재하고, 묘목 식물을 검정하여, qPCR Taqman 검정을 이용하여 형질 전환 Cas9-sgRNA 유전자위(검정 #2540) 및 반수체 유도 유전자위(검정 #2827)에 대해 동형 접합성인 식물을 확인하였다.
반수체 유도 유전자위 및 바람직하게는 동형 접합성 형질 전환 23396, 23397, 23398, 및 23399 Cas9-sgRNA 편집 유전자위에 대해 동형 접합성인 계통은 반수체의 유도를 위한 표적 우량 사료용 옥수수 계통인 ID5829 및 사탕 옥수수 계통(SWC726 또는 SWC412F)으로부터 이삭을 수분시키기 위해 사용되었다. 유도된 반수체 배아를 수분된 ID5829, SWC412F, SWC726 이삭으로부터 단리하고, 배아 회생 배지 상에서 발아시켰다. 대안적으로, 수분된 이삭을 성숙하도록 하였으며, 반수체 배아를 갖는 종실을 발아시켰다. 잎 샘플을 수집하고, Taqman 검정으로 분석하여 VLHP 및 GW2 유전자 내에 돌연변이를 함유하지만 형질 전환 Cas9-sgRNA 또는 기타 비-형질 전환 마커 유전자 서열과 같은 유도 계통 유래 유전 성분이 존재하지 않는 식물을 확인하였다. 표적화된 GW2 또는 VLHP 유전자 돌연변이를 갖는 것으로 확인된 반수체 식물은 염색체의 배가를 위해 콜히친으로 처리하여 종자 생산을 위한 배가 반수체 식물을 회수하였다. 대안적으로, 추출된 반수체 배아를 콜히친과 같은 염색체 배가제로 처리할 수 있으며, GW2 또는 VLHP 유전자에서의 배수성 수준 및 표적화 돌연변이의 존재를 확인하기 위해 얻어진 식물을 분석한다. 종자 생산 및 추가의 자손 평가를 위해 표적화된 GW2 및 VLHP 유전자 돌연변이를 갖는 식물을 성숙시킨다.
예를 들어, 23399 Cas9-sgRNA 이식 유전자를 함유하는 반수체 유도체로 수분된 사탕 옥수수 계통인 SWC412F의 이삭 사이의 교배를 통해 편집된 반수체 계통(JSER82A056 및 JSER82A063)을 확인하였다. JSER82A056 계통은 GW2-01 및 GW2-02 표적 유전자 둘 모두가 돌연변이 되어 있는 반면, JSER82A063 계통은 GW2-02 유전자만이 돌연변이 되어 있다(표 5 참조). 웅성 유전체가 반수체로부터 제거되었으므로 이들 계통들 중 어느 것도 Cas9 이식 유전자(Cas9에 대한 검정 #2540 또는 PMI 선택 마커 유전자에 대한 검정 #1750) 또는 반수체 유도체 유전자 (검정 #2827)를 함유하지 않는다. 배수성 수준 분석에 따르면 계통 둘 모두는 반수체인 것으로 확인되었다(도 11 및 도 12). 반수체 내의 야생형("WT") 유전자는 "2"의 복제수를 갖고, 돌연변이체는 복제콜(copy call)이 내생성 ADH 유전자의 복제수에 비례하기 때문에 "0"일 것임을 주지한다. 따라서, 편집되지 않는 야생형 GW2-01 또는 GW2-02 유전자를 갖는 반수체 계통은 "2"의 복제콜(copy call)을 가질 것이다. 야생형 반수체 유도체 유전자위는 검정 #2826에 대해 "2"의 복제콜을 가질 것이고, 검정 #2827(반수체 유도체 변이체)에 대해 "0"의 복제콜을 가질 것이다. 옥수수 식물 계통이 사탕 옥수수와 형질 전환 유도체 사이의 이배체인 경우, 이는 반수체 유도체 유전자에 대해 이형 접합성일 것이고, 따라서 검정 #2826 및 검정 #2827 둘 모두에 대해 "1"의 복제콜을 가질 것이다.
[표 5]
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이들 반수체 계통에서의 표적 특이적 편집을 추가로 확인하기 위해, PCR에 의해 JSER82A063으로부터 GW2-02 표적 영역을 증폭하고, PCR 산물을 시퀀싱하였다. 정확히 Cas9 개열 부위에서 야생형 서열과 비교하여 JSER82A063에서는 단일 염기 C가 결실되어 있었다(도 13). 이들 결과에 따르면 웅성 배우체로부터 난세포 내로 전해진 편집 기구는 웅성 유전체가 중복 수정 이후에 제거되어 반수체 배아를 형성하기 전에 자성 유전체를 편집할 수 있는 것으로 명백히 증명되었다. 이식 유전자가 없는 편집된 반수체 계통 후보자는 0.5% DMSO 중의 0.125% 콜히친의 주사 또는 0.06% 콜히친 용액 중의 묘목 관주(seedling drenching)에 의해 처리되었다(문헌[Eder and Chalyk, 2002, In vivo haploid induction in maize. Theor. Appl. Genetics 104: 703~708]). 처리된 계통을 토양에 식재하고, 자손 종자의 생산을 위해 온실에서 재배하였다.
VI. 원연 교배를 통한 밀 및 기타 외떡잎식물에서의 동시 반수체 유도 및 편집
또한 반수체 유도는 종간 또는 속간 원연 교배를 이용하여 구현된다(문헌[Kasha and Kao, 1970, High frequency haploid production in barley (Hordeum vulgare L.). Nature 225: 874~886]). 예를 들어, 밀 반수체는 옥수수(문헌[Suenaga and Nakajima 1989]), 진주 기장(문헌[Inagaki and Mujeeb-Kazi 1995]), 테오신트(문헌[Ushiyama et al. 1991]), 호르디움 불보숨(Hordeum bulbosum; 문헌[Barclay 1975]) 및 수수(문헌[Ohkawa et al. 1992])와의 다양한 속간 교배를 통해 수분에 의해 수득될 수 있다. 보리 반수체는 호르디움 불보숨 화분과의 수분에 의해 수득된다. 담배 반수체는 니코티아나 아프리카나(N. africana) 화분과의 교배에 의해 수득될 수 있다. 다수의 기타 실시예가 기타 농작물에서 존재한다.
형질 전환 편집 유전자위를 Stock6 유도 계통에 도입할 때 상술한 실시예와 유사하게, 형질 전환 편집 유전자위는 반수체 유도 및 표적화된 서열 돌연변이를 유도하기 위해 원연 교배용으로 사용되는 이들 계통 내로 도입될 수 있다. 편집 기구를 발현하는 형질 전환 계통은 직접적인 형질 전환 또는 이종교배에 의해 옥수수, 밀, 보리, 호밀, 진주 기장, 벼, 브래시카, 상추, 토마토 또는 임의의 기타 농작물 중 임의의 계통에서 생성될 수 있다. 바람직하게는, 형질 전환 유전자위는 동형 접합성으로 만들어진 후, 계통은 반수체를 유도하여 목적하는 편집체를 생산하기 위해 기타 양립 가능한 수용체 농작물과의 원연 교배 시에 화분 공여자로서 사용된다. 원연 교배 시에 수정 후 유전체 제거 과정은 일부 경우에 외래 화분 유래 DNA 및 편집 기구가 배아 발생 다소 초기에 제거될 수 있을 지라도 옥수수 MATL 돌연변이체 시스템에서의 과정과 근본적으로 동일한데, 이 때문에 이러한 방법이 바람직하게는 화분, 정자세포 및/또는 접합자 세포 내의 편집 기구의 발현을 조장하는 프로모터를 사용하여 실행되어, 웅성 DNA가 수정 이후에 다소 신속하게 제거될 지라도 편집용 RNA 및 단백질이 존재하여 표적 유전체를 편집할 수 있다.
원연 교배를 통한 동시 반수체 유도 및 편집 가능성을 증명하기 위해, 밀 VLHP 유전자 서열을 표적화하는 sgRNA 및 Cas9를 발현하는 옥수수 형질 전환 계통이 생성되었다. 벡터 23763(서열번호 24)는 밀에서 TaVLHP1 표적 부위의 Cas9 매개 개열을 유도하기 위한 프로토스페이서 서열인 xTaVLHP1(5'-GACGAGCAGGCGCAGTTCC-3'; 서열번호 25)을 함유하는 Cas9 및 sgRNA용 발현 카세트를 함유한다. 밀 유전체는 총 3개의 xTaVLHP1 표적(TaVLHP1-4A, TaVLHP1-4B 및 TaVLHP1-4D)을 가지며, 이들 각각은 이의 3개의 하위유전체 내에 있다. 23397(서열번호 20) 내의 가이드 서열인 xZmVLHP(5'-GCTGGAGCTGAGCTTCCGGG-3'; 서열번호 21)는 또한 밀 VLHP 표적 서열인 xTaVLHP2-1A(5'-GCTGGAGCTGAGCTTCCGGG-3'; 서열번호 26) 또는 xTaVLHP2-1B(5'-TCTGGAGCTGAGCTTCCGGG-3'; 서열번호 27)의 개열을 조장할 것이다. 중국 봄밀 유전체 내에는 xTaVLHP2-1A를 함유하는 3개의 VLHP2A 유전자 및 xTaVLHP2-1B 서열을 함유하는 3개의 VLHP2B 유전자가 존재하다. 벡터 23397 및 벡터 23763는 Cas9 및 sgRNA를 발현하는 형질 전환 계통을 생성하기 위해 아그로박테리움 매개 형질 전환을 이용하여 옥수수 동종교배 계통인 NP2222 내로 형질 전환되었다. 형질 전환 옥수수 계통을 온실에서 재배하고 자가 수분시켜 T1 식물을 생산하였다.
벡터 23397 또는 벡터 23763의 T-DNA를 갖는 형질 전환 옥수수 T0 또는 자손 T1 식물로부터 수집된 화분은 제웅된 봄밀 계통인 AC-Nanda를 수분시키기 위해 사용되었다. 개화 전 1일 내지 2일째 날에, 밀 꽃부분(wheat floret)을 제웅하고, 2일 후에 편집 기구를 갖는 신선한 옥수수 화분으로 수분시켰다. 편의상, 신젠타(Syngenta) 우량 세포질 웅성 불임(cytoplasmic male sterile("CMS")) 밀 계통(16A300292)에서 유래하는 소수(spikelet)는 또한 23397 또는 23763 Cas9-sgRNA를 발현하는 형질 전환 옥수수 화분에 의한 반수체 배아의 형성을 유도하기 위해 자성 공여자로서 직접 사용되었다. 밀 x 옥수수 반수체 유도 시스템으로부터 반수체 묘목을 회수하기 위해 배아 회생을 위한 수분 이후 14일 내지 20일째 날에 배아를 수분된 꽃부분으로부터 추출하였다. 유기 보충물의 다양한 변형을 함유하는 전강도 MS(문헌[Murashige and Skoog 1962]) 또는 1/2 MS 또는 B5 기본 배지에서 적출된 배아를 배양하고, 20 ℃ 내지 25 ℃에서 3주 내지 5주 동안 시험관 내에서 16시간의 광주기로 재배하였다.
예를 들어, 벡터 23763을 함유하는 형질 전환 옥수수 계통인 MZET164902A044A에서 유래하는 T1 자손의 화분은 CMS 계통인 16A300292의 수상화서(spike)를 수분시켜 밀 반수체를 유도하는데 사용되었다. 반수체 배아를 회생하고, 얻어진 밀 반수체 묘목을 qPCR 분석용으로 샘플링하여 VLHP 표적 서열의 복제수를 측정하였다(표 6 참조). 반수체 계통(JSWER30A22)들 중 하나는 TaVLHP1-4B 유전자 내에 돌연변이를 함유하지만, A 및 D 하위유전체 내의 이의 상동유전자(ortholog)인 TaVLHP1-4A 및 TaVLHP1-4D 내에는 돌연변이를 함유하지 않는 것으로 밝혀졌다. 배수성 수준 분석에 따르면 JSWER30A22가 순수 반수체인 것으로 확인되었다(도 14 및 도 15 참조). TaVLHP1-4B 표적 영역 내의 돌연변이는 시퀀싱에 의해 추가로 특성 분석되었으며, 예상되는 Cas9 개열 부위에서 시작하여 97 bp 결실을 함유하는 것으로 밝혀졌다(도 16). 본 발명자들은 또한 TaVLHP1-4A 유전자(검정 #3252) 내의 복제가 "0"인 다른 계통인 JSW16A07을 확인하였으며, 이는 표적 서열에서의 표적화된 편집을 시사한다. 그러나, 본 발명자들이 시퀀싱용 PCR 산물을 회수할 수 없기 때문에 이러한 표적 유전자에서의 결실은 아마도 프라이머 결합 부위(들)의 결실 시에 매우 크다. 편집된 표적 부위를 갖는 반수체 묘목은 3주 내지 5주간의 시험관 내 배양 이후 토양에 이식되었다. 이식된 묘목을 동일한 환경 체제(environmental regime) 하의 재배실에서 1주 동안 강화시켰다. 새싹이 형성된 이후에 콜히친을 첨가하였다. 그러나, 염색체 배가 처리는 먼저 시험관 내 배양의 배아 회생 단계에 실시되거나, 나중에는 이식 후에 실시될 수 있다. 밀 묘목 전체가 배가를 위해 처리되는 경우, 반수체 묘목의 뿌리를 가지치기 하여 2 ㎝ 내지 3 ㎝ 크기의 구역을 남긴 후, 2% 디메틸 설폭시드(DMSO) 및 대략 0.05% 트윈-20을 함유하는 0.1% 콜히친 용액에서 20 ℃에서 5시간 동안 침지하였다. 이러한 처리 이후, 뿌리를 세척하여 잔류 콜히친을 제거하고, 이탄토(peat soil)에 심었다. 돌연변이 검출을 위해 반수체 묘목으로부터 식물 조직 샘플을 제거하여 TaVLHP 표적 유전자 서열 내에 돌연변이를 갖는 식물을 확인할 수 있지만, 형질 전환 편집 기구를 암호화하는 서열을 포함하는 옥수수 염색체는 완전히 제거되었다. JSWER30A22가 CMS 계통에서 유래한 것이므로 식물을 복원유전자(restorer)로 수분시켜 자손 종자를 생산한다.
[표 6]
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Figure pct00007
원연 교배를 통한 동시 반수체 유도 및 편집 가능성을 추가로 증명하기 위해, 화분에서 높은 발현 및/또는 특이적 발현을 보이는 5개의 프로모터로부터 Cas9를 밀 VLHP 유전자 서열을 표적화하는 sgRNA와 함께 발현하는 옥수수 형질 전환 계통을 생성하였다. 이들 5개의 벡터는 24038(서열번호 34), 24039(서열번호 35), 24079(서열번호 36), 24091(서열번호 37) 및 24094(서열번호 38)이었다. 이들 5개의 벡터 모두는 밀에서 TaVLHP2 표적 부위의 Cas9 매개 개열을 유도하기 위한 프로토스페이서 서열인 xTaVLHP2(5'-GCTGGAGCTGAGCTTCCGGG-3'; 서열번호 21)를 함유하는 동일한 sgRNA를 이용하였다. 밀 유전체는 총 3개의 xTaVLHP2 표적(TaVLHP2-2A, TaVLHP2-2B 및 TaVLHP2-2D)을 가지며, 이들 각각은 이의 3개의 하위유전체 내에 있다. 이들 5개의 구조체 내의 가이드 서열은 또한 밀 VLHP 표적 서열인 xTaVLHP2(5'-GCTGGAGCTGAGCTTCCGGG-3'; 서열번호 26) 또는 xTaVLHP3(5'-TCTGGAGCTGAGCTTCCGGG-3'; 서열번호 27)의 개열을 조장할 것이다. 중국 봄밀 유전체 내에는 xTaVLHP2를 함유하는 3개의 TaVLHP2 유전자 및 xTaVLHP2-1B 서열을 함유하는 3개의 TaVLHP3 유전자가 존재한다.
벡터 24038(서열번호 34)는 화분 내의 RNA 및 단백질 수준에서 매우 높은 자가 발현(native expression)을 보이고 높은 정자세포 발현의 증거가 있는 옥수수 prf3(프로필린 상동체3) 유전자에서 유래하는 화분-선호적 고발현 프로모터인 prZmGRMZM5G876285 및 종결인자인 tZmGRMZM5G876285의 제어를 받는 Cas9용 발현 카세트를 함유한다.
벡터 24039(서열번호 35)는 화분 내의 RNA 및 단백질 수준에서 매우 높은 자가 발현을 보이고 정자세포 발현의 증거가 있는 옥수수 EXPB2(BETA EXPANSIN2) 유전자에서 유래하는 화분-선호적 고발현 프로모터인 prZmGRMZM2G020852 및 종결인자인 tZmGRMZM2G020852의 제어를 받는 Cas9용 발현 카세트를 함유한다.
벡터 24079(서열번호 36)는 화분 내의 RNA 및 단백질 수준에서 매우 높은 자가 발현을 보이고 정자세포 발현의 증거가 있는 옥수수 EXPB1(BETA EXPANSIN1) 유전자에서 유래하는 화분-선호적 고발현 프로모터인 prZmGRMZM2G146551 및 종결인자인 tZmGRMZM2G146551의 제어를 받는 Cas9용 발현 카세트를 함유한다.
벡터 24091(서열번호 37)는 RNA 및 단백질 수준에서 화분 및 가능하게는 정자세포 발현의 증거를 보이는 옥수수 MATL(MATRILINEAL) 유전자에서 유래하는 화분-선호적 프로모터인 prZmGRMZM2G471240 및 종결인자인 tZmGMRMZM2G471240의 제어를 받는 Cas9용 발현 카세트를 함유한다.
벡터 24094(서열번호 38)는 RNA 및 단백질 수준에서 화분 및 가능하게는 정자세포 발현의 증거를 보이는 옥수수 MATL(MATRILINEAL) 유전자에서 유래하는 화분-선호적 프로모터인 prZmGRMZM2G471240 및 종결인자인 tZmGMRMZM2G471240의 제어를 받는 Cas9용 발현 카세트를 함유한다. 부가적으로, 이러한 구조체는 화분 내 Cas9 부위의 이미지화 및 시각화를 위해 Cas9 분자 상의 AmCyan 형광 단백질의 N-말단 융합체를 갖는다.
이들 5개의 벡터(24038, 24039, 24079, 24091 및 24094)는 Cas9 및 sgRNA를 발현하는 형질 전환 계통을 생성하기 위해 아그로박테리움 매개 형질 전환을 이용하여 옥수수 동종교배 계통인 NP2222 내로 형질 전환하였다.
형질 전환 옥수수 계통을 온실에서 재배하였으며, 단일 복제 및 2-복제 형질 전환 식물을 봄밀 및 CMS 밀 계통에 대해 이종교배하였다. 벡터 24038, 벡터 24039, 벡터 24079, 벡터 24091 및 벡터 24094 중 하나의 T-DNA를 갖는 형질 전환 옥수수 T0 식물에서 수집한 화분은 제웅된 봄밀 계통인 AC-Nanda를 수분시키기 위해 사용되었다. 또한 화분은 qRT 실험용으로 사용되었으며, 여기서 Cas9의 발현은 Cas9가 상기에 제시된 다수의 옥수수 및 밀 실시예에서 사용된 사탕수수 유비퀴틴 프로모터에 의해 구동되는 경우에 RNA 수준에서 측정되고 잎 샘플에서의 Cas9 발현과 비교하였다. 도 17에서 알 수 있는 바와 같이, 화분에서의 발현이 높았으며, 유비퀴틴 프로모터와 비교하여 T-DNA 벡터 24038, T-DNA 벡터 24039 및 T-DNA 벡터 24079를 갖는 식물에서 평균적으로 약 100배 더 높다. 보다 낮은 자가 유전자 발현을 보이는 것으로 알려져 있는, MATRILINEAL 프로모터 구조체(24094 및 24091)를 갖는 화분과 비교할 때 벡터 24038, 벡터 24039 및 벡터 24079를 함유하는 식물에서 유래하는 화분에서의 발현이 또한 보다 더 높았다. 이들 5종의 프로모터는 모두 화분에 제한된 발현 패턴을 갖는다. 프로모터가 적절히 작동하고 있다는 표시로서, 본 발명자들은 캘러스 묘목 잎에서의 Cas9의 T0 발현을 관찰하지 못하였으며, T0 옥수수 잎에서의 VLHP 표적 부위의 편집은 없었다(이론과 결부되지 않으려는 한, 편집은 Cas9가 최초로 발현된 경우, 십중팔구 성숙한 화분 단계에서 옥수수 표적 부위에서 발생할 수 있음).
개화 전 1일 내지 2일째 날에, CMS 계통 및 AC Nanda 계통으로부터 밀 꽃부분을 제웅하였다. 2일 후, 구조체 24038, 구조체 24039, 구조체 24091 또는 구조체 24094에서 유래하는 편집 기구인 Cas9-sgRNA를 갖는 신선한 옥수수 화분으로 꽃부분을 수분시켰다(구조체 24079에 의한 T0 식물의 형질 전환이 지연되었으며, 이러한 방식으로 밀과 교배되지 않았음). 밀 x 옥수수 반수체 유도 시스템으로부터 반수체 묘목을 회수하기 위해 배아 회생을 위한 수분 이후 14일 내지 20일째 날에 밀 배아를 수분된 꽃부분으로부터 추출하였다. 유기 보충물의 다양한 변형을 함유하는 전강도 MS(문헌[Murashige and Skoog 1962]) 또는 1/2 MS 또는 B5 기본 배지에서 적출된 배아를 배양하고, 20 ℃ 내지 25 ℃에서 1주 내지 5주 동안 시험관 내에서 16시간의 광주기로 재배하였다. 예를 들어, 벡터 24039를 함유하는 형질 전환 옥수수 계통인 MZKE172601A100A에서 유래하는 T0 자손의 화분은 CMS 계통인 16A300292의 수상화서를 수분시켜 밀 반수체를 유도하는데 사용되었다. 반수체 배아를 회생하고, 얻어진 밀 반수체 묘목을 qPCR 분석용으로 샘플링하여 VLHP 표적 서열의 복제수를 측정하였다(표 7). 이러한 분석에서, 본 발명자들은 검정 #2540을 이용하여 Cas9 이식 유전자를 시험하였다. 회생되고 시험된 모든 밀 배아에는 이러한 이식 유전자가 없었으며, 이들이 발생 배아에 어떠한 옥수수 DNA도 갖지 않으며, 따라서 이식 유전자를 갖지 않기 때문에 Cas9에 대해 "0"의 점수를 내었다. 옥수수 DNA는 완전히 제거되거나, 축출되거나, 애초에 수정 동안 및/또는 이후에 일어나는 반수체 유도 과정 동안에 완전히 전달되지 못하게 된다. Cas9 이외에, 본 발명자들은 VLHP2-2A 및 VLHP2-2D 대립 유전자 둘 모두를 비특이적으로 증폭하는 검정 #3332 및 검정 #3333을 시험하였다. 이들 검정에서는 전형적으로 반수체 밀에서 "2" 또는 "2 초과"로 판독되었으며, 형질 전환 옥수수 화분을 이용하여 본 발명자들이 생산한 대부분의 반수체는 이들 검정에 대해 2 또는 2 초과의 점수가 매겨졌다. 본 발명자들은 0 또는 1의 점수를 찾아봄으로써 추정상의 편집된 반수체를 찾기 위해 이들 검정을 이용하였다. "1"의 콜(call)은 2개의 대립 유전자 중 하나, 즉 VLHP2-2A 또는 VLHP2-2D가 편집되었다는 것을 나타낼 수 있다. 마지막으로, 본 발명자들은 VLHP2-2B를 특이적으로 검출하는, AC Nanda 반수체 내의 검정 3255를 시험하였다. CMS 계통이 야생형일지라도 이는 이러한 검정을 증폭하지 않으며, 따라서 본 발명자들은 CMS 반수체용으로 이를 사용하지 않았다. 편집되지 않은 반수체에는 "2"의 점수가 주어진 반면, 추정상의 편집된 반수체는 "0"의 점수를 가졌기 때문에 발견된다. "1"의 점수는 잘못된 판독 또는 부분적으로 편집된 키메라 샘플을 나타낼 수 있다.
일례로서, AC Nanda 반수체 식물들 중 하나(440-A5)는 TaVLHP2-2B 유전자 내에 돌연변이를 함유하지만, A 및 D 하위유전체 내의 이의 상동유전자인 TaVLHP2-2A 및 TaVLHP2-2D 내에는 돌연변이를 함유하지 않는 것으로 밝혀졌다(표 7). 또한 Taqman 데이터에 따르면 여기에는 Cas9 이식 유전자가 없는 것으로 나타났다. TaVLHP2-2B 표적 영역 내의 돌연변이는 시퀀싱에 의해 추가로 특성 분석되었지만, 본 발명자들이 A 및 D 대립 유전자를 증폭할 수 있었을지라도 본 발명자들은 B 대립 유전자를 더 이상 증폭할 수 없었으며, 이는 PCR 산물의 증폭을 더 이상 못하게 하는 보다 큰 편집, 아마도 대규모 결실이 있다는 것을 암시한다.
다른 예로서, CMS 반수체 식물들 중 하나(450-D11)는 검정 3332 및 검정 3333 둘 모두에 대한 "1"의 점수에 따라 TaVLHP2-2D 또는 TaVLHP2-2A 상동체 내에 돌연변이를 함유하는 것으로 밝혀졌다(표 7). Taqman 데이터에 따르면 여기에는 Cas9 이식 유전자가 없는 것으로 나타났다. TaVLHP2-2A, TaVLHP2-2B 및 TaVLHP2-2D 표적 영역은 시퀀싱에 의해 추가로 특성 분석되었지만, 본 발명자들이 A 및 B 대립 유전자를 증폭할 수 있었을지라도 본 발명자들은 D 대립 유전자를 더 이상 증폭할 수 없었으며, PCR 실패를 초래하는 보다 큰 편집체가 존재한다는 것을 암시한다.
하기 5개의 화분-선호적 발현 구조체(24038, 24039, 24091 및 24094)들 중 하나를 갖는 옥수수 화분과의 교배에 의해 생산된 2295 밀 반수체를 고려하여, 본 발명자들은 VLHP2-2A, VLHP2-2D 또는 VLHP2-2B 표적 부위에서의 가능한 편집을 나타내는 Taqman 검정 데이터를 제공하는 15개의 반수체를 발견하였다. 시퀀싱 이후, 이들 반수체 중 7개는 표적 부위에 야생형 서열을 갖는 것으로 밝혀졌으며, Taqman 오류로 인해 위 양성으로 판정되었다. 이들 오류는, 검정 #3332 및 검정 #3333이 VLHP-2A 및 VLHP-2D 대립 유전자에 대해 비특이적 증폭을 보여서 일부 잘못된 콜을 초래한다는 사실로 인한 것이거나 적은 DNA량으로 인한 것으로 사료된다.
나머지 8개의 추정상의 편집된 반수체 중 6개는 편집용 이식 유전자가 구조체 24038에서 유래한 AC Nanda(440-B3, 440-D3, 440-A5, 447-G8, 456-G9, 459-A2)이었다. 이들 중 4개(440-B3, 440-D3, 440-A5 및 456-G9)는 VLHP2-2B 내에 편집체를 함유하고 있었다. 이들은 검정 3255에 대해 "0"의 Taqman 점수를 가졌기 때문에 발견되었다. 이들 식물에는 Cas9가 없었지만("0"의 점수), VLHP2-2A 또는 VLHP2-2D(검정 #3332 및 검정 #3333)에 대해 야생형 "2"의 점수를 가졌으며, 이는 이들이 이들 부위에서 편집되지 않았다는 것을 보여준다. 이들 6개의 식물은 배수성 분석에 의해 반수체인 것으로 확인되었다. 본 발명자들은 편집된 대립 유전자를 시퀀싱하려고 시도하였지만, 2A 및 2D에 대한 PCR 및 시퀀싱 반응이 잘 작동하였을지라도 본 발명자들은 2B에 대한 PCR 산물을 수득할 수 없었다. 본 발명자들은 광범위한 반응 조건을 이용하여 PCR을 수회 반복하였지만, 이들 반수체 식물로부터 2B 상동체를 증폭할 수 없었다. 이는 편집이, 결국 프라이머 어닐링 부위의 결실을 가져올 수 있는 이들 식물 내의 2B 유전자의 대규모 변경을 유발하였다는 것을 나타낼 수 있다. 본 발명자들은 다수의 CMS 식물이 또한 VLHP2-2B 표적 부위에 편집체를 갖는다는 것을 예상하지만, 본 발명자들은 CMS 계통으로부터 VLHP2-2B 대립 유전자를 검출하기 위한 검정을 보유하지 못하였다.
AC Nanda 단독만을 고려하여, 본 발명자들은 모든 구조체에 대한 이러한 대립 유전자에서의 전체 편집율을 0.7%로 계산하였지만, 구조체 24038에 대해 편집율을 특히 높은 1.4%로 계산되었다.
3255에 대해 "0"의 점수를 갖는 이들 4개의 편집된 반수체 이외에, 몇몇 기타 식물은 3255에 대해 "0 또는 1" 또는 "1"의 점수를 내었으며, 이는 키메라 현상(배아 또는 묘목의 특정 세포 혈통에서의 부분 편집)이 가능하다는 것을 나타내지만, 본 발명자들은 이들 식물에 대한 후속 조치를 취하지 않았다. AC Nanda 상동체 VLHP2-2A에 있어서, 식물 447-G8은, 2B 및 2D가 증폭하여 야생형 서열을 함유하고 있을 지라도 PCR 반응이 실패하였기 때문에 본 발명자들이 시퀀싱할 수 없었던 편집체를 함유하고 있었다. 본 발명자들은 광범위한 반응 조건을 이용하여 PCR을 수회 반복하였지만, 2A 상동체를 증폭할 수 없었다. 유사하게, VLHP2-2D에 있어서, 식물 459-A2는 PCR 반응이 실패하였기 때문에 본 발명자들이 시퀀싱할 수 없었던 편집체를 함유하고 있었다. 본 발명자들은 광범위한 반응 조건을 이용하여 PCR을 수회 반복하였지만, 2D 상동체를 증폭할 수 없었다. 또한 본 발명자들은 447-H12 및 440-G6에서 추정상의 편집체를 발견하였지만, 시퀀싱을 하여 본 발명자들은 이들이 위 양성임을 발견하였다.
CMS 반수체에 있어서, 식물 450-D11은 검정 #3332 및 검정 #3333에 대해 "1"의 점수를 내었다(표 7). 시퀀싱을 하여 본 발명자들은 2A 상동체는 야생형 서열을 갖는다는 것을 발견하였지만, 본 발명자들은 2D 상동체를 PCR 증폭할 수 없었으며, 이는 대형 편집체가 발생하였다는 것을 시사한다. 본 발명자들은 광범위한 반응 조건을 이용하여 PCR를 수회 반복하였지만, 2D 상동체를 증폭할 수 없었다. 식물 452-B11에 있어서, #3332(VLHP2-2A)에 대한 Taqman 점수는 "0"이었으며, 본 발명자들은 2D 및 2B PCR 산물 및 서열이 정상적이었을지라도 시퀀싱을 위해 이러한 대립 유전자를 증폭할 수 없었다. 본 발명자들은 광범위한 반응 조건을 이용하여 PCR를 수회 반복하였지만, 2A 상동체를 증폭할 수 없었다. 또한 본 발명자들은 검정 3332 및 검정 3333에 대한 Taqman 데이터에 따라 추정상의 편집체를 갖는 5개의 식물을 발견하였지만, PCR-시퀀싱에 따르면 이들은 위 양성인 것으로 나타났으며, 서열은 야생형이었다(편집되지 않음).
종합하면, 본 발명자들은 2개의 편집된 CMS 반수체 및 6개의 편집된 AC Nanda 반수체를 발견하였다. 본 발명자들이 이들 5개의 구조체 내의 가이드 RNA의 VLHP3 유전자 표적 부위에 대한 검정뿐만 아니라 CMS 식물에 있어 2B 유전자에 대한 검정도 보유하고 있지 않기 때문에 본 발명자들이 검출할 수 없었던 추가로 편집된 다수의 반수체가 존재할 수 있다.
이들 편집된 반수체로부터의 시퀀싱 데이터는 가이드 RNA 표적 부위 주변에서의 대규모 결실, 전위 또는 재배열의 개념과 일치하며, 아마도 프라이머 결합 부위들 중 하나의 제거를 포함하도록 충분히 확장된 것이다. 이러한 유형의 큰 변화는, 특히 비상동성 말단 접합을 통한 DNA 수선이 보다 느리거나 억제된 조직에서 Cas9에 의한 편집 동안에는 드물지 않은 일이다: 이는 방금 수정된 접합자 또는 초기 반수체 밀 배아의 경우에 해당할 수 있다.
[표 7]
Figure pct00008
Figure pct00009
Figure pct00010
Figure pct00011
전반적으로, 본 발명자들은 구조체 24038에 대한 편집 빈도(확인된 편집된 반수체의 개수를 반수체 총 개수로 나눈 값)는 0.79%이고; 구조체 24039에 대한 편집 빈도는 0%이고; 구조체 24091에 대한 편집 빈도는 0%이고; 구조체 24094에 대한 편집 빈도는 0.75%임을 확인하였다. 그러나, 이러한 편집율은 본 발명자들이 다수의 가이드 RNA 표적 부위에서 편집체를 검출하기 위한 검정을 보유하고 있지 않기 때문에 명백한 가소 평가이다. 부가적으로, 본 발명자들이 단일 복제 또는 2-복제인 T0 화분을 사용하였기 때문에 본 발명자들은 단일 복제 화분의 경우 수정용 화분립의 50%만이 Cas9를 함유할 것이고, 그래서 배아의 절반만이 편집될 기회를 갖는다는 것을 알고 있으며; 유사하게 2-복제 식물에 있어서, 웅성 감수분열에서 이식 유전자가 무작위로 분리된다고 가정하면, 본 발명자들은 화분의 약 75%가 Cas9를 함유하는 것으로 기대할 것이고, 그래서 배아의 25%가 편집되지 않을 수 있다. 당업자가 화분에 의해 전달되는 편집 기구를 이용하여 반수체 유도 기술과 더불어 이러한 동시 편집을 사용하려고 하면 일부 경우에 화분 및 정자세포 내에서 특이적으로 또는 고도로 발현되는 프로모터를 사용하는 것이 더욱 최적일 수 있어서, Cas9를 보다 높은 수준으로 발현할 수 있다는 결론을 내리는 것이 합당하다. 유전자 표적이 잎에서 발현되지 않는 화분- 또는 정자-선호적 프로모터를 갖는 것이 유용할 수 있는데, 이는 발생 동안에 반수체 유도체 식물에서 표적 유전자를 편집하는 것, 아마도 먼저 화분에서 이를 편집하는 것을 피할 수 있기 때문이다.
정자세포가 난자를 수정시키기 때문에 이들은 (제거될 웅성 염색체들 중 하나로 통합되는 이식 유전자 DNA 자체뿐만 아니라) Cas9 RNA 및 단백질을 전달할 잠재성을 갖는다. 본 실시예에서 본 발명자들이 원연 교배 작업으로 증명한 바와 같이, 우량 계통을 편집하기 위해 웅성으로서 반수체 유도체를 이용하는 경우, 화분 및 특히 정자세포에서 특이적으로 또는 고도로 발현되는 프로모터의 제어를 받는 Cas9 및/또는 가이드 RNA를 갖는 것이 유효할 수 있다. 본 발명자들은 영양핵, 정자세포 또는 둘 모두에서 MATRILINEAL, EXPB1, EXPB2 및 PRF3이 발현하는지, 그리고 접합자 세포 유형에서 임의의 발현이 존재할 수 있는지 정확히 알 수 없지만, 이들은 화분에서 고도로 및/또는 특이적으로 발현되는 것으로 추정되기 때문에 선택되었다. PRF3 프로모터는 프로모터 내에 DUO1 결합 모티프를 가지며, 이는 이것이 정자세포에서 발현한다는 것을 나타낼 수 있다. 이는 프로모터가 보다 높은 편집 빈도를 갖는다는 사실과 일치한다. 원연 교배 이후에 본 발명자들이 다수의 편집된 밀 반수체를 발견하였다는 사실로 인해, 이들 또는 임의의 기타 프로모터를 이용하여 화분에서 Cas9의 발현이 높은 경우, 이러한 발현이 원연 교배 이후에 밀 배아에서의 편집을 초래할 수 있다는 것이 자명하게 된다. 이들 프로모터뿐만 아니라 화분 또는 특히 정자세포에서 발현을 조장하는 기타 프로모터가 옥수수 반수체 유도 또는 벼 반수체 유도 동안에 편집 과정의 효율성을 증가시킬 수 있다는 가능성이 크다.
유사하게, 하기의 다음 실시예에서, 본 발명자들은 CENH3-변형-반수체 유도체 계통을 이용하여 쌍떡잎식물에서의 반수체 편집을 제시하고, 본 발명자들은 항시성 프로모터를 이용하여 Cas9를 구동한다. 그러나 반수체 편집의 효율성을 증가시키려는 시도에서, 본 발명자들은 EGG APPARATUS1 유전자의 프로모터("prEA1")(예를 들어, 문헌[Gray-Mitsumune, M. and Matton, D.P., The Egg apparatus 1 gene from maize is a member of a large gene family found in both monocots and dicots, Planta 223(3): 618~625 (Feb. 2006)] 참조) 또는 난세포1(EC1)(예를 들어, 문헌[Sprunck S, et al., Egg cell-secreted EC1 triggers sperm cell activation during double fertilization. Science 2012; 338: 1093~97; PMID: 23180860; http://dx.doi.org/ 10.1126/science.1223944] 참조)과 같은 난세포에서 높고/높거나 특이적인 발현을 조장하는 프로모터를 사용하기로 선택할 수 있다.
이에 대한 일례로서, 당업자는 정자 세포 발현 프로모터, 예를 들어 아라비돕시스 정자 특이적 DUO1 프로모터(예를 들어, 문헌[Engel, et al., Green Sperm. Identification of Male Gamete Promoters in Arabidopsis, Plant Physiology Aug 2005, 138 (4) 2124~2133; DOI: 10.1104/pp.104.054213] 참조), 또는 기타 종에서 유래하는 DUO1의 상동체(예를 들어, 옥수수 유전자인 GRMZM2G105137 및 GRMZM2G046443 모두는 유사한 화분 특이적 발현 패턴을 공유하는 DUO1 상동체임)를 이용할 수 있다. 당업자가 이들 중 임의의 것을 이용하여 RWK, NP2222-HI 또는 matl 돌연변이체와 같은 반수체 유도체 계통의 정자세포에서 Cas9 발현을 조장하는 경우, 이는 각각 종내 또는 원연 교배를 통해 다양한 우량 옥수수 또는 밀 생식질을 편집하는데 사용하기 위한 매우 효율적인 반수체 편집 계통을 만들 수 있다.
정자세포에서의 높은 Cas9 발현을 조장한다는 이러한 개념에 적합한 기타 정자 발현 프로모터는 밀, 벼, 보리, 토마토, 해바라기 또는 기타 외떡잎식물 또는 쌍떡잎식물에 DUO1 상동체를 포함할 수 있다. 이러한 개념에 적합한 기타 프로모터는 하기 표 8에 나타나 있다. 농작물 종에서의 이들 프로모터 또는 이들의 상동체는 이러한 개념에 매우 유용할 수 있다. 작업 시에 중요한 것은, 편집 기구의 생식세포 발현은 본 발명의 속도 또는 효율성을 증가시킬 수 있다는 것이며, 이는 편집이 신속하게 일어날 수 있도록 수정 동안에 배아에 존재하거나 배아로 전달되는 풍부한 편집용 단백질 또는 RNA가 존재한다는 것을 의미하기 때문이다.
[표 8]
Figure pct00012
VII. 원연 교배 또는 CENH3 변경 계통 또는 기타 반수체 유도 계통과의 교배를 통한 쌍떡잎식물에서의 동시 반수체 유도 및 편집
또한 생체 내 반수체 유도는 쌍떡잎식물 식물종에 대한 종간 또는 속간 원연 교배, 예를 들어 목화(문헌[Turcotte et al. 1969, Semigametic production of haploids in pima cotton. Crop Sci. 9: 653~655]) 및 담배(문헌[Burke et al., 1979, Maternal haploids of Nicotiana tabacum L. Science 206: 585]; 문헌[Wernsman et al. 1989, Androgenetic vs. gynogenetic doubled haploids of tobacco. Crop Sci. 29: 1151~1155])에서의 종간 또는 속간 원연 교배를 이용하여 구현될 수 있다. 반수체 아라비돕시스 식물은 돌연변이체 CENH3 식물에서 유래한 화분과의 교배에 의해 수득되거나, 자성으로서의 상기 식물을 야생형 화분과 교배함으로써 수득될 수 있다(문헌[Ravi and Chan, 2010, Haploid plants produced by centromere-mediated genome elimination. Nature 464: 615~618]). 반수체 유도체 및 SEDHI 편집 계통을 생성하기 위해 변형될 수 있는 기타 후보 유전자로는 MSI2 및 해바라기 PLA2뿐만 아니라 KNL2 및 CENPC(이들 둘 모두는 동원체 매개 단친성 유전체의 제거를 통해 작동할 수 있음)를 들 수 있다. 이 경우, 반수체 유도성 유전체(이는 교배 시에 웅성 또는 자성임)는 또한 편집 기구를 함유하여, 반수체 유도 과정 동안에 편집이 구현될 수 있으며, 그 결과 변경된 CENH3 또는 편집용 이식 유전자가 없는 편집된 모계 또는 부계 반수체 자손 식물이 얻어진다. 예를 들어, 그 전체가 본원에서 참고로 포함되는 WO 2017/004375를 참고한다. 편집 기구를 발현하는 형질 전환 유전자위는 임의의 쌍떡잎식물 농작물, 또는 브래시카, 토마토, 후추, 상추, 가지, 대두, 해바라기, 사탕무, 목화, 자주개자리(alfalfa), 담배 등의 이들의 야생 근연종(wild relative) 내에 도입될 수 있다. 이어서, 편집 기구를 발현하는 형질 전환 계통은 화분 공여자로서 사용되거나, CENH3의 경우에 반수체 유도 및 동시 유전체 편집을 위한 종간 또는 속간 원연 교배 시에 화분 공여자 또는 수여자(acceptor)로서 사용된다. 예를 들어, 담배 지베렐린 20-옥시다아제를 표적화하는 sgRNA를 발현하는 니코티아나 아프리카나 형질 전환 CRISPR-Cas9 계통은 아그로박테리움 매개 형질 전환을 통해 생성되고, 제웅된 담배 꽃을 수분시켜 지베렐린 20-옥시다아제 유전자위에서 유전체가 편집된 반수체 식물을 유도하는데 사용된다. 바람직하게는, 화분수가 많고 쉽게 형질 전환 가능한 계통이 반수체 유도용 화분 공여자로서 사용되고, 일시적으로 편집 기구를 제공하기 위해 사용된다. 반수체 생산을 위한 수용체 식물은, 쉽게 제웅되거나 웅성 불임인 꽃을 갖는다. 보다 바람직하게는, 컬러 마커 또는 기타 시각 마커는 유도 계통 내에 존재하거나, 편집 유전자위에 포함되어 정상적인 접합자 발생으로부터 얻어진 이배체로부터 반수체 배아 또는 식물을 쉽게 분화시킨다.
본 발명자들은 콜롬비아 생태형(Columbia ecotype)인 아라비돕시스 반수체 유도체 계통을 이용하고, 녹아웃되는 경우에 모상체(trichome) 결핍 표현형을 보이는 GLABROUS1 유전자(GL1)를 표적화하는 단일 가이드 RNA 및 Cas9의 발현을 암호화하는 구조체를 이용하여 이를 형질 전환시킴으로써 이를 예시하였다. 본 발명자들은 자성으로서의 T0을 랜드스베르그 에렉타(Ler) 생태형 화분으로 교배시키고, gl1 편집된 반수체 자손을 회수하였다.
반수체 유도체 물질은 캘리포니아 데이비스 대학의 코마이 실험실(Comai lab)에서 얻었다. 이들 물질은 전형적으로 부계 반수체 유도체 계통(자성으로서 야생형 웅성과 교배하는 경우에 동정생식을 유발함)으로서 이용되지만, 모계 반수체 유도체(웅성으로서 야생형 자성과 교배하는 경우에 자성생식을 유발함)으로서 작용할 수도 있다. 이어서, 이들 계통은, 문헌[Maheshwari, et al, 2017, Centromere location in Arabidopsis is unaltered by extreme divergence in CENH3 protein sequence. Genome Research 27(3)]에 보고된 바와 같이, 자가 CENH3 유전자를 Zea Mays CENH3 이식 유전자로 교체함으로써 반수체 유도체가 되도록 변경되었다.
특히, 자가 AtCENH3 유전자의 복제 둘 모두는 녹아웃되었으며, 안정하게 삽입된 ZmCENH3 이식 유전자로 보충되었으며, 이는 정상적인 식물 발생에 영향을 미치지 않으며, 자가 수분 시에 반수체를 생산하지 않았지만, 이종교배 시에 약 10%의 반수체를 생산하였다. 이는 문헌[Ravi and Chan, 2010, Haploid plants produced by centromere-mediated genome elimination. Nature 464: 615~618] 및 다수의 후속 공개물에 상세하게 설명된 CENH3-tailswap의 초기 개념에 대한 변형예이다.
본 발명자들이 캘리포니아 데이비스 대학으로부터 CENH3* 계통을 얻은 후, 본 발명자들은 이들을 재배하였으며, 이들이 ZmCENH3 이식 유전자를 가졌고 자가 AtCENH3 유전자에 대해 동형 접합성 "null"임을 확인하였다. 본 발명자들은 ZmCENH3에 대한 Taqman qPCR 검정(검정 #2298)을 설계함으로써, 그리고 60 ℃의 어닐링 온도에서 Xbal 전방향 및 역방향 프라이머(서열번호: TKX 및 TKY) 및 레디 믹스(Reddy mix)를 이용하여 PCR을 실행하고 37 ℃에서 하룻밤 동안 Xbal 제한 효소로 절단함으로써 AtCENH3 유전자형의 접합성에 대해 183개의 묘목을 시험하기 위해 PCR 및 겔 전기영동을 이용함으로써 이를 수행하였다. 야생형 대립 유전자는 이러한 효소에 의해 절단되어 2개의 밴드(189 bp, 25 bp)를 생성하는 반면, 돌연변이체는 215 bp로 유지될 수 있다. 이들 시험에 따르면 캘리포니아 데이비스 대학에서 보내온 모든 종자는 돌연변이체 대립 유전자인 Atcenh3-1에 대해 동형 접합성이며, ZmCENH3 이식 유전자의 다수의 복제가 존재하는 것으로 나타났다.
이들 획득된 종자가 실제로 반수체 유도체임을 확신한 본 발명자들은 100개의 식물을 보관하고 있으며, 2개의 표적 부위에서 아라비돕시스(GL1) 유전자(AT3G27920)를 표적화하는 sgRNA 카세트를 함유하는 이원 벡터 24075(서열번호 98)에 의한 꽃 침지 형질 전환을 개시하였다. 표적 서열은 5'-GGAAAAGTTGTAGACTGAGA-3' 및 5'-GCAGTGATGAACAATGACGG-3'(상보 가닥)이다. GL1 유전자의 파괴는 부분 또는 완전 무모 식물(무모 식물에는 모상체가 없음)의 가시적 표현형을 생산한다. 이러한 벡터 내의 Cas9 유전자(cCas9-05)는 아라비돕시스 탈리아나(Arabidopsis thaliana) 신장 인자 프로모터에 의해 구동된다. 또한 벡터는 CMP-02 프로모터 및 글리신 맥스(Glycine max) UBI-01 프로모터에 의해 각각 구동되는, Kan 내성 및 AmCyan 형광을 부여하는 2개의 선택 가능한 마커 카세트를 함유한다. 벡터는 아그로박테리움 균주인 EHA101 내로 이동한 후, 반수체 유도체 아라비돕시스 식물로의 꽃 침지 형질 전환이 이루어졌다.
형질 전환 프로토콜은 하기와 같았다: 아침에 본 발명자들은 플레이트에서 수득된 24075 EHA101 RecA 아그로박테리움을 YPSpec100Kan50 플레이트에 도말하였다. 본 발명자들은 이를 24시간 동안 28 ℃ 암실에서 배양하였다. 본 발명자들은 투과 배지(4 ℓ)(1/2 XMS 염(8.66 g), 1XGamborg의 B5 비타민(4 ㎖), 5%(W/V) 수크로오스(200 g), 40 ㎕의 0.044 μM BAP(12.5 ㎎---12.5 ㎖의 DMSO))를 제조한 후, 여과 살균을 수행하였다. 이어서, 본 발명자들은 250 ㎕의 40 ㎎/㎖ AS(20 ㎎/ℓ) 및 25 ㎕의 SIlwet L-77(50 ㎕/ℓ)을 500 ㎖의 투과 배지에 첨가하였다. 아그로박테리움을 수집하여 여과 살균용 용액 약 10 ㎖이 들어있는 50 ㎖ 튜브에 넣기 위해 루프를 사용함으로써, 본 발명자들은 아그로박테리움이 0.54의 광학 밀도 600으로 1 ℓ를 생성할 때까지 이를 현탁하였다. 본 발명자들은 20초 내지 30초 동안 꽃차례 새싹(inflorescence shoot)을 현탁 배지에 침지하고, 뚜껑을 이용하여 쟁반을 덮었다. 본 발명자들은 OD600이 0.552인 다른 현탁액으로 다시 이를 반복하였다.
형질 전환한지 약 4주 후, 대략 100,000개의 자가 수분된 종자를 수확하고, 2일간의 춘화 처리(vernalization)를 위해 4 ℃에서 배양한 후, 종자를 70% 에탄올에 1분 동안 침지한 후 추가의 10분 동안 0.05% (v/v) 트리톤 X-100 함유 50%(V/V) 표백제에 침지하고, 이어서 멸균수를 4회 변경하여 종자를 세척함으로써 멸균하였다. 이어서, 종자를 식물 조직 배양실(23 ℃ 명주기, 24 ℃ 암주기, 16시간 조명)에서 발아 스크리닝/선택용 카나마이신(50 ㎍/㎖) 플레이트 위에 놓았다. 38개의 양성 형질 전환체는 카나마이신 선택에 대해 내성이기 때문에 확인되었으며, 이들은 토양으로 옮겨심기 전에 묘목으로 재배하였으며, 이를 샘플링하여 2개의 가이드 RNA 절단 부위(검정 #3321 및 검정 #3322)의 상태뿐만 아니라 Cas9 T-DNA(검정 #3049)의 존재를 시험하였다. GL1의 대립 유전자 둘 모두가 돌연변이 되어 있고, 모상체 결핍 표현형을 갖는 10개의 단일 복제 및 15개의 2-복제 이벤트를 확인하였다. 이들 식물은 (돌연변이 된 GL1 및 무모 표현형으로 인해) Cas9 활성의 증거를 보였고, 이들은 Cas9 이식 유전자를 가졌으며, 이들은 qPCR 검정에 의해 ZmCENH3 이식 유전자를 가졌기 때문에 우선시하였다. 이들 식물을 하기 성장 조건에 방치함으로써 장기간 동안 개화하도록 유도하였다: 16시간 조명, 주간 온도: 23 ℃/야간 온도: 20 ℃, 60%를 초과하지 않는 상대 습도.
동시에, Cas9 구조체로 형질 전환된 이들 반수체 유도체 식물이 확인됨에 따라 본 발명자들은 오하이오 주립대학교의 아라비돕시스 생물자원 센터에서 얻은 랜드스베르그 에렉타(Ler) 종자(계통 #CS20)의 개체군을 파종하고 재배하고 있었다. 이들은 야생형 종자이며, CS20 내의 GL1 가이드 RNA 표적 부위의 서열은 본 발명자의 구조체 내의 가이드 RNA의 서열과 일치한다. 본 발명자들은 개체군 둘 모두가 개화하도록 하였으며, 약 2,000회의 제어 교배를 실시하였으며, 이때 야생형 Ler 식물을 웅성 화분-공여자로서 사용하고, 자성으로서 사용된 Cas9 구조체를 갖는 대략 25개의 반수체 유도체에 대해 교배를 실시하였다. 본 발명자들은 자성 당 100회의 교배를 실시하여, 교배된 꽃을 흑색 마커로 표시하고, 자가 수분된 장각(silique)을 수확할 가능성을 제한하기 위해 본 발명자들이 교배하지 않은 꽃을 제거하였다. 대부분의 경우, 본 발명자들은 또한 자가 수분된 종자에 의한 오염을 피하기 위해 겸자로 꽃밥을 제거함으로써 수분 이전에 자성 꽃을 제웅시켰지만, 일부 경우에 꽃밥이 어리거나 발육이 불량하였기 때문에 이는 불필요하였다.
약 15일째, 본 발명자들은 담갈색을 나타내는 장각을 수확하였다. 이어서, 본 발명자들은 장각을 개방하고, 토양에 종자를 심었다. 이어서, 이를 6 ℃(주간 및 조명), 8시간의 광주기, 200 umal/m2s의 조명, 4일 동안 60%의 상대 습도로 설정된 재배실에 넣었다. 이어서, 본 발명자들은 이를 7일 내지 10일 동안 16시간 조명, 23 ℃의 주간 온도, 20 ℃의 야간 온도, 60%를 초과하지 않는 습도로 설정된 재배실로 옮겼다. 본 발명자들은 거의 모든 장각에서 발육 정지된 종자를 높은 빈도로 관찰하였는데, 이는 평균적으로 총 종자의 약 40% 내지 50%를 차지한다. 이러한 발육 정지된 배아의 개수는 공개된 보고서에서의 이러한 반수체 유도체 물질의 성능과 매우 일치한다. 이러한 이론에 제한되지 않으려는 한, 발육 정지된 종자는 내배유 불균형 및 장해를 초래하는, 내배유에서의 부분 또는 완전한 유전체 제거에 의해 야기될 가능성 가장 큰 것으로 추정되고 있다. 이는 이종교배 동안에 CENH3형 반수체 유도체 계통에서의 자연적인 현상이며, Cas9 이식 유전자의 존재와 연계되어 있지 않을 가능성이 있다. 이들 발육 정지된 배아는 발아하지 않는다. 모든 이종교배된 장각에서 일정하고 신뢰 가능한 배아 발육 정지율로 인해, 본 발명자들은 결국 우발적인 자가 수분인 장각을 가려내기 위해 이러한 표현형의 부재를 이용하게 되었다. 이러한 방식으로 본 발명자들은 이종교배되어 있는 장각을 발아시켰다.
종합하면, 본 발명자들은 대략 2,000개의 발아된 자손을 회수하였으며, 이들 중 대부분은 이종교배되어 있었다. 본 발명자들은 qPCR 마커 검정 및/또는 표현형 스크리닝의 조합을 통해 편집된 반수체를 확인하였다. 편집된 반수체를 검출하기 위해 본 발명자들이 사용한 마커는 하기와 같았다.
먼저, 본 발명자들은 ZmCENH3 검정에 대해 "0"의 점수를 찾아보았다. 이는 모계 유전체가 손실되어 있기 때문에 식물이 반수체이어서, 모계 반수체 유도체 식물의 복수의 복제 내에 존재하는 ZmCENH3 이식 유전자가 또한 손실되어 있다는 것을 나타낸다. 이에 반해, 이배체는 모계 유전체와 부계 유전체 사이의 혼성체일 것이며, 모계 식물의 복제수에 따라 이러한 검정에 대해 "1" 또는 "2" 또는 그 이상의 Taqman 점수를 가질 것이다. 중요한 것은, 모든 이배체가 이러한 이식 유전자의 증거를 보일 것이지만, Ler 유전체만을 갖는 부계 반수체는 이러한 증거를 보이지 않으며, 따라서 "0"이 아니거나 "0"일 것이라는 것이다.
두 번째, 본 발명자들은 Cas9 검정에 대해 "0"의 점수를 찾아보았으며, 이는 비-형질 전환성임을 나타낸다. 이는 또한 형광을 사용하고, CFP 형광 마커를 찾음으로써 시각적으로 관찰될 수 있다.
셋째, 본 발명자들은 GL1 표적 부위 검정들 중 하나에 대해 "0"의 점수를 찾아보았으며, 이는 식물이 편집되었음을 나타낸다. 이배체 식물은 이들 검정에 대해 "0", "1" 또는 "2"를 나타낼 수 있지만, 반수체는 역시 "2" 또는 "0"을 나타냈다. 검정 3321에서는 반수체 유도체(T0)가 "0" 및 "1"을 매우 우세하게 나타났지만, 검정 3322에서는 주로 "2"가 나타났기 때문에 2개의 GL1 가이드 RNA 중 첫 번째 것은 명백히 두 번째 것보다 훨씬 높은 편집 효율성을 가졌다.
이들 검정을 사용함으로써 본 발명자들은 편집되지 않은 반수체(ZmCENH3 및 Cas9에 대해 "0"이지만 GL1 표적 부위에 대해 "2"의 점수를 가졌음) 및 또한 편집된 반수체(ZmCENH3, Cas9 및 GL1(3321) 검정에 대해 "0"을 가졌음)를 확인할 수 있었다. 또한 본 발명자들은 Cas9를 갖는 이배체 혼성체(종종 GL1 부위에 편집됨) 및 Cas9를 갖지 않은 이배체 혼성체(종종 (모계 부모에서 유래한) GL1의 하나의 복제가 편집되어 있지만, 다른 것은 편집되지 않아서 GL1 검정에 대해 "1"의 점수를 가짐)를 확인할 수 있었다. 또한 본 발명자들은 몇몇 추정상의 편집된 반수체가 표적 부위 검정(3321), ZmCENH3(2298) 및 Cas9(3049)에 대해 "0"의 점수를 가졌기 때문에 이들을 확인할 수 있다. 3개의 추정상의 편집된 반수체(웰 F2 내의 식물 254, 웰 D3 내의 식물 260 및 식물 E3 내의 식물 261)를 함유하는 부모 USR01424136로부터의 자손 Taqman 데이터의 실시예에 대하여 하기 표 9를 참고한다.
[표 9]
Figure pct00013
단순히 종자를 발아시키고 qPCR Taqman 분석용으로 샘플링함으로써 본 발명자들은 8개의 추정상의 편집된 반수체를 확인할 수 있었다. 편집된 반수체는 표현형 시각 스크리닝에 의해서도 확인된 후, Taqman 검정에 의해 추후에 확인되었다. 본 발명자들은 GL1 유전자에 대한 임의의 야생형 대립 유전자를 갖지 않는다는 것을 나타내는 모상체 결핍 식물 또는 무모 식물을 찾고, Cas9 T-DNA가 결여되어 있다는 것을 나타내는, 배아 또는 묘목 뿌리에서의 시안 형광 단백질("CFP")의 발현의 결여를 찾음으로써 편집된 반수체를 스크리닝하였다. 본 발명자들은 이들 식물 중 몇몇을 관찰하고, 이들을 Taqman 검정에 적용하였다. 본 발명자들이 표현형으로 확인한 이 같은 식물 3개체에 있어서, 본 발명자들은 Taqman 검정에 의해 이들이 실제로 편집된 반수체임을 확인할 수 있었다. 본 발명자들은 CFP가 없는 이들 무모 식물들 중 일부는, CFP가 침묵 상태이기 때문에 또는 완전히 편집된 모계 식물의 자가 수분 및 null 분리 개체(segregant)인 완전히 편집된(따라서 무모인) 자손의 생산으로 인해 위 양성일 가능성이 있다는 사실을 알고 있었다. Taqman 검정은 Cas9 이식 유전자뿐만 아니라 어떠한 자가 수분된 발아 종자에든지 분명히 존재할 ZmCENH3 대립 유전자의 존재를 직접 시험하기 때문에, 이들 위 양성을 검출하고 차단할 수 있었다. 본 발명자들은 모두가 하나의 모계 식물에서 유래한 자가 수분된 종자에 대한 몇몇 예를 발견하였다. 이 같은 모계에 대한 수분 노트(pollination note)에 따르면 화분이 매우 풍부하게 존재하여 일부 자가 수분을 초래할 수 있었을 것으로 나타났다. 본 발명자들은 총 분석에서 이들 자손을 배제하였다.
Taqman 검정에 의해 확인된 모든 추정상의 편집된 반수체가 시퀀싱되었다. 본 발명자들은 PCR을 이용하여 편집된 대립 유전자를 증폭한 후, 추정상의 편집된 대립 유전자 각각에 대해 적어도 8개의 콜로니를 하위클로닝 및 시퀀싱하였다. 제1 가이드 RNA(검정 #3321) 표적 부위에 있는 편집된 반수체에서 본 발명자들이 발견한 서열 변화뿐만 아니라 T0 부모의 Taqman 데이터에 대해서는 표 10을 참고한다. 종합하면, 본 발명자들은 19개의 추정상의 편집된 반수체를 발견하였으며, 본 발명자들은 본 발명자들이 시퀀싱하려고 했던 12개의 편집된 반수체 중 11개가 3321 표적 부위에서 돌연변이를 갖는 것으로 확인하였다. 기타 7개 역시 돌연변이를 갖는지의 여부는 시퀀싱을 하면 확인 될 것이다. 도 24에서 이들 편집체에 대한 서열 배열을 참고한다.
[표 10]
Figure pct00014
본 발명자들은 3개의 이배체 대조군(모계 부모 식물로부터 샘플링된 조직)과 함께 3개의 편집된 반수체 식물로부터의 잎 샘플에 대해 추가로 배수성 분석을 실시하였으며, 그 결과 이들이 순수 반수체인 것으로 나타났다(도 18 내지 도 23) 이는 편집된 반수체로서의 이들의 상태를 재확인하는 역할을 하였다.
본 발명자들이 자가 수분 오염이 존재하지 않는 것으로 확신한 3개의 부모 계통에서, 본 발명자들은 임의의 표현형 예비 스크리닝을 수행하지 않았지만, 대신에 Taqman 분석을 위해 모든 발아된 자손을 샘플링하였다(표 11). 이들 자손에 대한 3개의 자성 부모는 USR01431603, USR01431609 및 USR01431604이었다. 본 발명자들은 ZmCENH3 및 Cas9 이식 유전자가 결여된 자손의 개수(59)을 샘플링된 자손의 총 개수(605)로 나눔으로써 계산된 반수체 유도율이 약 9.7%인 것으로 확인하였다. 본 발명자들은 59개의 반수체 중 10개가 편집되었다는 것을 발견하였다. 이는, 평균적으로, 반수체의 16.9%가 모계 유전체의 제거 이전에 모계 Cas9에 의해 편집되었다는 것을 의미한다. 이러한 최종 숫자에 제한되지 않으려는 한, 이는 이러한 시스템을 이용하여 총 자손의 비율(%)로서 모든 발아된 자손의 1.64%(9.7% * 16.9%)가 편집된 반수체라는 것을 의미한다.
[표 11]
Figure pct00015
CENH3*형 반수체의 편집율 또는 기타 부계 반수체의 편집율(모계 반수체 유도체 계통을 사용함)은, 수정 이전의 난세포 및/또는 수정 동안 또는 이후의 접합자 세포에서 Cas9 및/또는 가이드 RNA의 발현을 보다 높은 수준까지 조장하는 프로모터의 사용을 통해 증가될 수 있었다. 다수의 기타 예들이 존재할 지라도 이 같은 프로모터의 일례는 EA1(EGG APPARATUS1)에 대한 프로모터(GRMZM2G456746)일 수 있다. 프로모터는 난세포 또는 매우 초기 접합자에서 인접한 유전자의 발현을 자극하는 77-bp 서열인 난장치(egg apparatus) 특이적 인핸서(EASE)의 맥락에서 Cas9를 또한 발현할 수 있다(예를 들어, 문헌[Yang, et al. An Egg Apparatus-Specific Enhancer of Arabidopsis, Identified by Enhancer Detection, PLANT PHYSIOLOGY Nov 2005, 139 (3) 1421~1432; DOI: https://doi.org/10.1104/pp.105.068262] 참조).
VIII. 유전체 DNA 서열 내의 표적 염기의 직접 변형을 통한 동시 반수체 유도 및 편집
DNA 서열의 표적화 돌연변이 유발은 또한 이중 가닥 절단(DSB)에 대한 요구 없이 하나의 DNA 염기에서 다른 DNA 염기로의 직접적인 전환을 통해 달성될 수 있다. 예를 들어, 시티딘 데아미나아제(APOBEC1), 아데닌 데아미나아제 및 기타 증강용 구성성분(예를 들어, 우라실 DNA 글리코실라아제(UDG))은 이중 가닥 DNA 절단의 도입 없이 DNA 서열의 편집을 지시하도록 Cas9(A840H) 닉카아제 또는 뉴클레아제-불활성화된 절단 기능이 없는(dead) Cas9(dCa9)에 융합될 수 있다(문헌[Komor et al. 2016. Programmable editing of a target base in genomic DNA without double-stranded DNA cleavage. Nature doi: 10.1038/nature17946]; 문헌[Gaudelli et al. 2017. Programmable base editing of A:T to G:C in genomic DNA without DNA cleavage. Nature doi: 10.1038/nature24644]; 문헌[Komor et al. 2017. Improved base excision repair inhibition and bacteriophage Mu Gam protein yields C:G-to-T:A base editors with higher efficiency and product purity. Science Advances, Vol. 3, no. 8, eaao4774, DOI: 10.1126/sciadv.aao4774]). 이러한 종류의 염기 편집 기구는 또한 기타 변종에서 표적 서열 내의 염기 편집을 직접 유도하기 위해 반수체 유도 계통을 통해 전달될 수 있다. 예를 들어, 가이드 RNA 서열인 xZmVLHP-03(5'-AGGCGTCGAGCAGCGAGGTG-3'; 서열번호 28)은 시티딘 데아미나아제 염기 편집 시스템을 표적화하여 ZmVLHP 유전자 엑손 2 유전체 서열인 5'-AGGCGTCGAGCAGCGAGGTG-3'(서열번호 28)를 5'-AGGCGTTGAGCAGCGAGGTG-3'(서열번호 29)로 변환하도록 설계되었으며, 따라서 암호화 서열에서 아르기닌 코돈(CGA)을 정지 코돈(TGA)으로 변경하고, 단백질 서열의 미성숙 종결 및 기능 유전자의 녹아웃을 유발하였다. C에서 T로의 돌연변이에는 밑줄이 쳐 있다. 유사하게, 키메라 nCas9- 또는 dCas9-아데닌 데아미나아제 염기 편집 시스템은 변경된 유전자 활성을 갖는 변이체를 생성하기 위해 ZmVLHP 또는 기타 유전자의 암호화 영역, 스플라이싱 연접부 또는 프로모터 서열을 돌연변이 시키는데 사용될 수 있다. 시티딘 및 아데닌 데아미나아제 둘 모두는 표준형 스플라이싱 연접부가 5'-.....AG/GT...3' 서열(또는 맞은편 가닥 내에 5'-......AC/CT......3')을 가지므로 전사체 스플라이싱을 변경하는데 특히 유용하다.
IX. DNA 주형을 이용한 대립 유전자의 교환에 의한 동시 반수체 유도 및 편집
생체 내 반수체 유도 시스템은 표적 서열의 개열 또는 전환을 위한 단백질, RNA 또는 DNA을 도입하기 위해 사용될 수 있을 뿐만 아니라, 이는 형질 전환 DNA의 형태로 표적 영역 내의 정밀한 서열 교환을 위해 상동성 의존성 수선을 위한 DNA 주형을 전달하기 위해 사용될 수 있다. 주형 DNA은 동일한 형질 전환 유전자위 또는 상이한 유전자위에 CRISPR-Cas9 시스템과 같은 유전체 편집 기구를 갖는 유도체 계통 유전체 내로 삽입될 수 있다. Cas9-sgRNA 및 주형 DNA 둘 모두가 유도된 반수체 배아 내에 존재하는 경우, 표적 서열의 개열로 인해 상동성 형질 전환 DNA 서열을 주형으로서 사용하여 염색체 절단을 수선하게 될 것이다. 예를 들어, ZmPYL-D 유전자(GRMZM2G048733_P02)(본원에서 참고로 포함되는 WO16033230을 참조) 내에 E149L 돌연변이를 생성하기 위해, 공여자 서열을 함유하는 DNA 단편(5'-CCTTGGTGTTGCCGTCGGGGACGTCGACGACGAATGACAGGATGACGAGCGTCCCTGGCCGGCCGTCGATGACCT-3'; 서열번호 30)을 수선 공여자로서 사용한다. 부가적인 상동 서열이 이러한 코어 수선 공여자 서열 옆에 있도록 부가될 수 있다는 것이 주지될 것이다. 이러한 수선 공여자 서열의 하나 이상의 복제가 대립 유전자 변형 벡터인 pBSC23136-AMD를 형성하기 위해 가이드 RNA(5'-GTCGGGGACGTCGACGACGA-3'; 서열번호 32)를 발현하는 Cas9-sgRNA 발현 벡터인 23136(서열번호 31) 내로 삽입된다. 통합된 공여자 서열이 pBSC23136-AMD로부터 발현된 Cas9-sgRNA 복합체에 의해 개열되지 않도록 잠재적인 PAM 부위가 공여자 DNA 서열로부터 제거되어 있다는 것이 주지될 것이다. pBSC23136-AMD는 형질 전환 편집 계통을 생성하기 위해 반수체 유도체 계통인 NP2222-HI 내로 형질 전환된다. 형질 전환 편집용 반수체 유도 계통은 자가 수분되어 동형 접합성 편집 유전자위를 갖는 자손 계통을 생산한다. 이들 동형 접합성 계통은 표적 우량 옥수수 동종교배 계통을 수분시켜 반수체의 형성을 유도하는데 사용되며, 또한 화분 공여자 염색체가 제거되기 전에 일시적으로 존재하는 공여자 DNA를 이용하여 발현된 Cas9-sgRNA에 의해 변형된 대립 유전자를 도입하는데 사용된다.
X. 벼에서의 반수체의 유도 및 동시 유전자 편집
HI 벼 계통을 수득한다. 예를 들어, 벼 MATL 상동유전자인 Os03g27610(서열번호 33)은 새로운 벼 HI 계통을 생성하기 위해 돌연변이 된다. 이러한 계통은 벼 유전체를 편집하기 위한 부위 특이적 돌연변이 유발 시스템, 예를 들어 CRISPR/Cas9 시스템을 포함하는 벡터로 형질 전환된다.
벼 HI 계통을 다른 벼 계통, 바람직하게는 우량 계통과 교배하여 적어도 하나의 자손 반수체 배아를 생산한다. 적어도 하나의 자손 반수체 배아를 생산하기 위한 교배 동안에 HI 부모 벼 식물은 또한 유전체 편집 기구, 예를 들어 Cas9와 가이드 RNA를 배아로 전달되도록 한다. 이 시점에, 편집 기구는 반수체 배아의 유전체를 편집하도록 작동하며, 따라서 편집된 반수체 자손 식물이 수득된다.
XI. Taqman 검정 및 조건
몇몇 검정은 번호 또는 표적 명칭으로 언급된다. 상술한 검정 및 관련 프라이머 및 탐침의 서열에 대한 표가 하기에 제공된다. PCR에 대한 조건은 모든 검정에 대해 표준이며, 하기와 같다: 2분 동안 98 ℃에서의 변성; 그 이후 (i) 30초 동안 98 ℃에서의 변성, (ii) 30초 동안 60 ℃에서의 어닐링, (iii) 1분 동안 72 ℃에서의 연장의 35 사이클; 그 이후 10분 동안 72 ℃에서 최종 연장 및 준비가 될 때까지 4 ℃로 유지. 달리 하기에 언급하지 않는 한, 이들 조건에서 검정을 실시한다.
[표 12]
Figure pct00016
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Figure pct00018
Figure pct00019
SEQUENCE LISTING <110> Syngenta Participations AG Que, Qiudeng Kelliher, Timothy <120> SIMULTANEOUS GENE EDITING AND HAPLOID INDUCTION <130> 81189-WO-REG-ORG-P-1 <150> US 62/429260 <151> 2016-12-02 <160> 98 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 15722 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> vector 23396 <220> <221> misc_feature <222> (4)..(259) <223> bNRB-05 <220> <221> promoter <222> (304)..(2100) <223> prSoUbi4-04 <220> <221> gene <222> (2117)..(6286) <223> cCas9-01 <220> <221> mutation <222> (5606)..(5608) <223> L to V mutation <220> <221> mutation <222> (5651)..(5653) <223> I to V mutation <220> <221> terminator <222> (6292)..(6544) <223> tNOS-05-01 <220> <221> promoter <222> (6551)..(6925) <223> prOsU3-01 <220> <221> misc_feature <222> (6927)..(6946) <223> xZmVLHP <220> <221> misc_feature <222> (6927)..(7032) <223> rsgRNAZmVLHP-01 <220> <221> promoter <222> (7042)..(9033) <223> prUbi1-04 <220> <221> gene <222> (9050)..(10228) <223> cPMI-09 <220> <221> terminator <222> 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cagggatccg gcagcagcca tgcagaagct 9060 gatcaacagc gtgcagaact acgcctgggg cagcaagacc gccctgaccg agctgtacgg 9120 catggagaac cccagcagcc agcccatggc cgagctgtgg atgggcgccc accccaagag 9180 cagcagccgc gtgcagaacg ccgccggcga catcgtgagc ctgcgcgacg tgatcgagag 9240 cgacaagagc accctgctgg gcgaggccgt ggccaagcgc ttcggcgagc tgcccttcct 9300 gttcaaggtg ctgtgcgccg cccagcccct gagcatccag gtgcacccca acaagcacaa 9360 cagcgagatc ggcttcgcca aggagaacgc cgccggcatc cccatggacg ccgccgagcg 9420 caactacaag gaccccaacc acaagcccga gctggtgttc gccctgaccc ccttcctggc 9480 catgaacgcc ttccgcgagt tcagcgagat cgtgagcctg ctgcagcccg tggccggcgc 9540 ccaccccgcc atcgcccact tcctgcagca gcccgacgcc gagcgcctga gcgagctgtt 9600 cgccagcctg ctgaacatgc agggcgagga gaagagccgc gccctggcca tcctgaagag 9660 cgccctggac agccagcagg gcgagccctg gcagaccatc cgcctgatca gcgagttcta 9720 ccccgaggac agcggcctgt tcagccccct gctgctgaac gtggtgaagc tgaaccccgg 9780 cgaggccatg ttcctgttcg ccgagacccc ccacgcctac ctgcagggcg tggccctgga 9840 ggtgatggcc aacagcgaca acgtgctgcg 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tatcatcgac tgcacggtgc accaatgctt ctggcgtcag 10740 gcagccatcg gaagctgtgg tatggctgtg caggtcgtaa atcactgcat aattcgtgtc 10800 gctcaaggcg cactcccgtt ctggataatg ttttttgcgc cgacatcata acggttctgg 10860 caaatattct gaaatgagct gttgacaatt aatcatccgg ctcgtataat gtgtggaatt 10920 gtgagcggat aacaatttca cacaggaaac agaccatgag ggaagcgttg atcgccgaag 10980 tatcgactca actatcagag gtagttggcg tcatcgagcg ccatctcgaa ccgacgttgc 11040 tggccgtaca tttgtacggc tccgcagtgg atggcggcct gaagccacac agtgatattg 11100 atttgctggt tacggtgacc gtaaggcttg atgaaacaac gcggcgagct ttgatcaacg 11160 accttttgga aacttcggct tcccctggag agagcgagat tctccgcgct gtagaagtca 11220 ccattgttgt gcacgacgac atcattccgt ggcgttatcc agctaagcgc gaactgcaat 11280 ttggagaatg gcagcgcaat gacattcttg caggtatctt cgagccagcc acgatcgaca 11340 ttgatctggc tatcttgctg acaaaagcaa gagaacatag cgttgccttg gtaggtccag 11400 cggcggagga actctttgat ccggttcctg aacaggatct atttgaggcg ctaaatgaaa 11460 ccttaacgct atggaactcg ccgcccgact gggctggcga tgagcgaaat gtagtgctta 11520 cgttgtcccg catttggtac agcgcagtaa ccggcaaaat cgcgccgaag gatgtcgctg 11580 ccgactgggc aatggagcgc ctgccggccc agtatcagcc cgtcatactt gaagctaggc 11640 aggcttatct tggacaagaa gatcgcttgg cctcgcgcgc agatcagttg gaagaatttg 11700 ttcactacgt gaaaggcgag atcaccaaag tagtcggcaa ataaagctct agtggatctc 11760 cgtacccggg gatctggctc gcggcggacg cacgacgccg gggcgagacc ataggcgatc 11820 tcctaaatca atagtagctg taacctcgaa gcgtttcact tgtaacaacg attgagaatt 11880 tttgtcataa aattgaaata cttggttcgc atttttgtca tccgcggtca gccgcaattc 11940 tgacgaactg cccatttagc tggagatgat tgtacatcct tcacgtgaaa atttctcaag 12000 cgctgtgaac aagggttcag attttagatt gaaaggtgag ccgttgaaac acgttcttct 12060 tgtcgatgac gacgtcgcta tgcggcatct tattattgaa taccttacga tccacgcctt 12120 caaagtgacc gcggtagccg acagcaccca gttcacaaga gtactctctt ccgcgacggt 12180 cgatgtcgtg gttgttgatc tagatttagg tcgtgaagat gggctcgagc taggagcaag 12240 tgattttatc gctaagccgt tcagtatcag agagtttcta gcacgcattc gggttgcctt 12300 gcgcgtgcgc cccaacgttg tccgctccaa agaccgacgg tctttttgtt ttactgactg 12360 gacacttaat ctcaggcaac gtcgcttgat gtccgaagct ggcggtgagg tgaaacttac 12420 ggcaggtgag ttcaatcttc tcctcgcgtt tttagagaaa ccccgcgacg ttctatcgcg 12480 cgagcaactt ctcattgcca gtcgagtacg cgacgaggag gtttatgaca ggagtataga 12540 tgttctcatt ttgaggctgc gccgcaaact tgaggcagat ccgtcaagcc ctcaactgat 12600 aaaaacagca agaggtgccg gttatttctt tgacgcggac gtgcaggttt cgcacggggg 12660 gacgatggca gcctgagcca attcccagat ccccgaggaa tcggcgtgag cggtcgcaaa 12720 ccatccggcc cggtacaaat cggcgcggcg ctgggtgatg acctggtgga gaagttgaag 12780 gccgcgcagg ccgcccagcg gcaacgcatc gaggcagaag cacgccccgg tgaatcgtgg 12840 caagcggccg ctgatcgaat ccgcaaagaa tcccggcaac cgccggcagc cggtgcgccg 12900 tcgattagga agccgcccaa gggcgacgag caaccagatt ttttcgttcc gatgctctat 12960 gacgtgggca cccgcgatag tcgcagcatc atggacgtgg ccgttttccg tctgtcgaag 13020 cgtgaccgac gagctggcga ggtgatccgc tacgagcttc cagacgggca cgtagaggtt 13080 tccgcagggc cggccggcat ggccagtgtg tgggattacg acctggtact gatggcggtt 13140 tcccatctaa ccgaatccat gaaccgatac cgggaaggga agggagacaa 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acggttctgg 10860 caaatattct gaaatgagct gttgacaatt aatcatccgg ctcgtataat gtgtggaatt 10920 gtgagcggat aacaatttca cacaggaaac agaccatgag ggaagcgttg atcgccgaag 10980 tatcgactca actatcagag gtagttggcg tcatcgagcg ccatctcgaa ccgacgttgc 11040 tggccgtaca tttgtacggc tccgcagtgg atggcggcct gaagccacac agtgatattg 11100 atttgctggt tacggtgacc gtaaggcttg atgaaacaac gcggcgagct ttgatcaacg 11160 accttttgga aacttcggct tcccctggag agagcgagat tctccgcgct gtagaagtca 11220 ccattgttgt gcacgacgac atcattccgt ggcgttatcc agctaagcgc gaactgcaat 11280 ttggagaatg gcagcgcaat gacattcttg caggtatctt cgagccagcc acgatcgaca 11340 ttgatctggc tatcttgctg acaaaagcaa gagaacatag cgttgccttg gtaggtccag 11400 cggcggagga actctttgat ccggttcctg aacaggatct atttgaggcg ctaaatgaaa 11460 ccttaacgct atggaactcg ccgcccgact gggctggcga tgagcgaaat gtagtgctta 11520 cgttgtcccg catttggtac agcgcagtaa ccggcaaaat cgcgccgaag gatgtcgctg 11580 ccgactgggc aatggagcgc ctgccggccc agtatcagcc cgtcatactt gaagctaggc 11640 aggcttatct tggacaagaa gatcgcttgg cctcgcgcgc 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tatcttaaag aattacttat 9660 aaaaatctac ggaagaatat cttacaaagt gaaaaacaaa tgagaaagaa tttagtggga 9720 tgattatgat tttatttgaa aattgaaaaa ataattatta aagactttag tggagtaaga 9780 aagctttcct attagtcttt tcttatccat aaaaaaaaaa aaaaatctag cgtgacagct 9840 tttccataga ttttaataat gtaaaatact ggtagcagcc gaccgttcag gtaatggaca 9900 ctgtggtcct aacttgcaac gggtgcgggc ccaatttaat aacgccgtgg taacggataa 9960 agccaagcgt gaagcggtga aggtacatct ctgactccgt caagattacg aaaccgtcaa 10020 ctacgaagga ctccccgaaa tatcatctgt gtcataaaca ccaagtcaca ccatacatgg 10080 gcacgcgtca caatatgatt ggagaacggt tccaccgcat atgctataaa atgcccccac 10140 acccctcgac cctaatcgca cttcaattgc aatcaaatta gttcattctc tttgcgcagt 10200 tccctacctc tcctttcaag gttcgtagat ttcttctgtt tttttttctt cttctttatt 10260 gtttgttcta catcagcatg atgttgattt gattgtgttt tctatcgttt catcgattat 10320 aaattttcat aatcagaaga ttcagctttt attaatgcaa gaacgtcctt aattgatgat 10380 tttataaccg taaattaggt ctaattagag tttttttcat aaagattttc agatccgttt 10440 acaacaagcc ttaattgttg attctgtagt cgtagattaa ggtttttttc atgaactact 10500 tcagatccgt taaacaacag ccttatttgt tgatacttca gtcgtttttc aagaaattgt 10560 tcagatccgt tgataaaagc cttattcgtt gattctgtat ggtatttcaa gagatattgc 10620 tcaggtcctt tagcaactac cttatttgtt gattctgtgg ccatagatta ggattttttt 10680 tcacgaaatt gcttcttgaa attacgtgat ggattttgat tctgatttat cttgtgattg 10740 ttgactctac agagatctaa aaaaatggcc ctgtccaaca agttcatcgg cgacgacatg 10800 aagatgacct accacatgga cggctgcgtg aacggccact acttcaccgt gaagggcgag 10860 ggcagcggca agccctacga gggcacccag acctccacct tcaaggtgac gatggccaac 10920 ggcggccccc tggccttctc cttcgacatc ctgtccaccg tgttcatgta cggcaaccgc 10980 tgcttcaccg cctaccccac cagcatgccc gactacttca agcaggcctt ccccgacggc 11040 atgtcctacg agagaacctt cacctacgag gacggcggcg tggccaccgc cagctgggag 11100 atcagcctga agggcaactg cttcgagcac aagtccacct tccacggcgt gaacttcccc 11160 gccgacggcc ccgtgatggc caagaagacc accggctggg atccctcctt cgagaagatg 11220 accgtgtgcg acggcatctt gaagggcgac gtgaccgcct tcctgatgct gcagggcggc 11280 ggcaactaca gatgccagtt ccacacctcc tacaagacca agaagcccgt gaccatgccc 11340 cccaaccacg tggtggagca ccgcatcgcc agaaccgacc tggacaaggg cggcaacagc 11400 gtgcagctga ccgagcacgc cgtggcccac atcacctccg tggtgccctt ctgatgaact 11460 agtgaattcg agctcaagct ttcgttcgta tcatcggttt cgacaacgtt cgtcaagttc 11520 aatgcatcag tttcattgcg cacacaccag aatcctactg agtttgagta ttatggcatt 11580 gggaaaactg tttttcttgt accatttgtt gtgcttgtaa tttactgtgt tttttattcg 11640 gttttcgcta tcgaactgtg aaatggaaat ggatggagaa gagttaatga atgatatggt 11700 ccttttgttc attctcaaat taatattatt tgttttttct cttatttgtt gtgtgttgaa 11760 tttgaaatta taagagatat gcaaacattt tgttttgagt aaaaatgtgt caaatcgtgg 11820 cctctaatga ccgaagttaa tatgaggagt aaaacacttg tagttgtacc attatgctta 11880 ttcactaggc aacaaatata ttttcagacc tagaaaagct gcaaatgtta ctgaatacaa 11940 gtatgtcctc ttgtgtttta gacatttatg aactttcctt tatgtaattt tccagaatcc 12000 ttgtcagatt ctaatcattg ctttataatt atagttatac tcatggattt gtagttgagt 12060 atgaaaatat tttttaatgc attttatgac ttgccaattg attgacaaca tgcatcaatc 12120 ggaccgttaa ctagctagac ggccaggatc gccgcgtgag cctttagcaa ctagctagat 12180 taattaaacg tccgcaatgt gttattaagt tgtctaagcg tcaatttgtt tacaccacaa 12240 tatatcctgc caccagccag ccaacagctc cccgaccggc agctcggcac aaaatcacca 12300 ctcgatacag gcagcccatc agtccgggac ggcgtcagcg ggagagccgt tgtaaggcgg 12360 cagactttgc tcatgttacc gatgctattc ggaagaacgg caactaagct gccgggtttg 12420 aaacacggat gatctcgcgg agggtagcat gttgattgta acgatgacag agcgttgctg 12480 cctgtgatca aatatcatct ccctcgcaga gatccgaatt atcagccttc ttattcattt 12540 ctcgcttaac cgtgacaggc tgtcgatctt gagaactatg ccgacataat aggaaatcgc 12600 tggataaagc cgctgaggaa gctgagtggc gctatttctt tagaagtgaa cgtcgactca 12660 tgtttgacag cttatcatcg actgcacggt gcaccaatgc ttctggcgtc aggcagccat 12720 cggaagctgt ggtatggctg tgcaggtcgt aaatcactgc ataattcgtg tcgctcaagg 12780 cgcactcccg ttctggataa tgttttttgc gccgacatca taacggttct ggcaaatatt 12840 ctgaaatgag ctgttgacaa ttaatcatcc ggctcgtata atgtgtggaa ttgtgagcgg 12900 ataacaattt cacacaggaa acagaccatg agggaagcgt tgatcgccga agtatcgact 12960 caactatcag aggtagttgg cgtcatcgag cgccatctcg aaccgacgtt gctggccgta 13020 catttgtacg gctccgcagt ggatggcggc ctgaagccac acagtgatat tgatttgctg 13080 gttacggtga ccgtaaggct tgatgaaaca acgcggcgag ctttgatcaa cgaccttttg 13140 gaaacttcgg cttcccctgg agagagcgag attctccgcg ctgtagaagt caccattgtt 13200 gtgcacgacg acatcattcc gtggcgttat ccagctaagc gcgaactgca atttggagaa 13260 tggcagcgca atgacattct tgcaggtatc ttcgagccag ccacgatcga cattgatctg 13320 gctatcttgc tgacaaaagc aagagaacat agcgttgcct tggtaggtcc agcggcggag 13380 gaactctttg atccggttcc tgaacaggat ctatttgagg cgctaaatga aaccttaacg 13440 ctatggaact cgccgcccga ctgggctggc gatgagcgaa atgtagtgct tacgttgtcc 13500 cgcatttggt acagcgcagt aaccggcaaa atcgcgccga aggatgtcgc tgccgactgg 13560 gcaatggagc gcctgccggc ccagtatcag cccgtcatac ttgaagctag gcaggcttat 13620 cttggacaag aagatcgctt ggcctcgcgc gcagatcagt tggaagaatt tgttcactac 13680 gtgaaaggcg agatcaccaa agtagtcggc aaataaagct ctagtggatc tccgtacccg 13740 aggaatcggc gtgagcggtc gcaaaccatc cggcccggta caaatcggcg cggcgctggg 13800 tgatgacctg gtggagaagt tgaaggccgc gcaggccgcc cagcggcaac gcatcgaggc 13860 agaagcacgc cccggtgaat cgtggcaagc ggccgctgat cgaatccgca aagaatcccg 13920 gcaaccgccg gcagccggtg cgccgtcgat taggaagccg cccaagggcg acgagcaacc 13980 agattttttc gttccgatgc tctatgacgt gggcacccgc gatagtcgca gcatcatgga 14040 cgtggccgtt ttccgtctgt cgaagcgtga ccgacgagct ggcgaggtga tccgctacga 14100 gcttccagac gggcacgtag aggtttccgc agggccggcc ggcatggcca gtgtgtggga 14160 ttacgacctg gtactgatgg cggtttccca tctaaccgaa tccatgaacc gataccggga 14220 agggaaggga gacaagcccg gccgcgtgtt ccgtccacac gttgcggacg tactcaagtt 14280 ctgccggcga gccgatggcg gaaagcagaa agacgacctg gtagaaacct gcattcggtt 14340 aaacaccacg cacgttgcca tgcagcgtac caagaaggcc aagaacggcc gcctggtgac 14400 ggtatccgag ggtgaagcct tgattagccg ctacaagatc gtaaagagcg aaaccgggcg 14460 gccggagtac atcgagatcg agctggctga ttggatgtac cgcgagatca cagaaggcaa 14520 gaacccggac gtgctgacgg ttcaccccga ttactttttg atcgatcccg gcatcggccg 14580 ttttctctac cgcctggcac gccgcgccgc aggcaaggca gaagccagat ggttgttcaa 14640 gacgatctac gaacgcagtg gcagcgccgg agagttcaag aagttctgtt tcaccgtgcg 14700 caagctgatc gggtcaaatg acctgccgga gtacgatttg aaggaggagg cggggcaggc 14760 tggcccgatc ctagtcatgc gctaccgcaa cctgatcgag ggcgaagcat ccgccggttc 14820 ctaatgtacg gagcagatgc tagggcaaat tgccctagca ggggaaaaag gtcgaaaagg 14880 actctttcct gtggatagca cgtacattgg gaacccaaag ccgtacattg ggaaccggaa 14940 cccgtacatt gggaacccaa agccgtacat tgggaaccgg acacacatgt aagtgactga 15000 tataaaagag aaaaaaggcg atttttccgc ctaaaactct ttaaaactta ttaaaactct 15060 taaaacccgc ctggcctgtg cataactgtc tggccagcgc acagccgaag agctgcaaaa 15120 agcgcctacc cttcggtcgc tgcgctccct acgccccgcc gcttcgcgtc ggcctatcgc 15180 ggccgctggc cgctcaaaaa tggctggcct acggccaggc aatctaccag ggcgcggaca 15240 agccgcgccg tcgccactcg accgccggcg ctgaggtctg cctcgtgaag aaggtgttgc 15300 tgactcatac caggccatta atgaatcggc caacgcgcgg ggagaggcgg tttgcgtatt 15360 gggcgctctt ccgcttcctc gctcactgac tcgctgcgct cggtcgttcg gctgcggcga 15420 gcggtatcag ctcactcaaa ggcggtaata cggttatcca cagaatcagg ggataacgca 15480 ggaaagaaca tgtgagcaaa aggccagcaa aaggccagga accgtaaaaa ggccgcgttg 15540 ctggcgtttt tccataggct ccgcccccct gacgagcatc acaaaaatcg acgctcaagt 15600 cagaggtggc gaaacccgac aggactataa agataccagg cgtttccccc tggaagctcc 15660 ctcgtgcgct ctcctgttcc gaccctgccg cttaccggat acctgtccgc ctttctccct 15720 tcgggaagcg tggcgctttc tcatagctca cgctgtaggt atctcagttc ggtgtaggtc 15780 gttcgctcca agctgggctg tgtgcacgaa ccccccgttc agcccgaccg ctgcgcctta 15840 tccggtaact atcgtcttga gtccaacccg gtaagacacg acttatcgcc actggcagca 15900 gccactggta acaggattag cagagcgagg tatgtaggcg gtgctacaga gttcttgaag 15960 tggtggccta actacggcta cactagaaga acagtatttg gtatctgcgc tctgctgaag 16020 ccagttacct tcggaaaaag agttggtagc tcttgatccg gcaaacaaac caccgctggt 16080 agcggtggtt tttttgtttg caagcagcag attacgcgca gaaaaaaagg atctcaagaa 16140 gatcctttga tcttttctac ggggtctgac gctcagtgga acgaaaactc acgttaaggg 16200 attttggtca tgagattatc aaaaaggatc ttcacctaga tccttttgat ccggacaaac 16260 aaacaaatac agtaattta 16279

Claims (22)

  1. 식물 유전체 DNA를 편집하는 방법으로서,
    a) 제1 식물을 수득하되, 상기 제1 식물은 식물의 반수체 유도체 계통이고, 상기 제1 식물은 DNA 변형 효소 및 선택적으로는 적어도 하나의 가이드 핵산을 발현할 수 있는 단계;
    b) 제2 식물을 수득하되, 상기 제2 식물은 편집되어야 할 식물 유전체 DNA를 포함하는 단계;
    c) 상기 제1 식물에서 유래하는 화분으로 상기 제2 식물을 수분시키는 단계; 및
    d) 상기 단계 (c)의 수분에 의해 생산된 적어도 하나의 반수체 자손을 선택하되, 상기 반수체 자손은 상기 제2 식물의 유전체를 포함하지만 상기 제1 식물의 유전체는 포함하지 않고, 상기 반수체 자손의 유전체는 상기 제1 식물에 의해 전달되는 DNA 변형 효소 및 선택적인 가이드 핵산에 의해 변형되어 있는 단계를 포함하는, 식물 유전체 DNA를 편집하는 방법.
  2. 제1항에 있어서, 상기 DNA 변형 효소는 메가뉴클레아제(MN), 징크 핑거 뉴클레아제(ZFN), 전사 활성인자 유사 효과기 뉴클레아제(TALEN), Cas9 뉴클레아제, Cfp1 뉴클레아제, dCas9-FokI, dCpf1-FokI, 키메라 Cas9-시티딘 데아미나아제, 키메라 Cas9-아데닌 데아미나아제, 키메라 FEN1-FokI 및 Mega-TAL, 닉카아제 Cas9(nCas9), 키메라 dCas9 비-FokI 뉴클레아제 및 dCpf1 비-FokI 뉴클레아제로 이루어진 군으로부터 선택되는 부위 특이적 뉴클레아제인 것인 방법.
  3. 제1항에 있어서, 상기 적어도 하나의 가이드 핵산은 가이드 RNA인 것인 방법.
  4. 제1항에 있어서, 상기 편집된 반수체 자손은 염색체 배가제로 처리하여 편집된 배가 반수체 자손을 생성하는 방법.
  5. 제4항에 있어서, 상기 염색체 배가제는 콜히친, 프로나미드(pronamide), 디티오피르(dithiopyr), 트리플루라린(trifluralin) 또는 다른 공지된 항미소관제(anti-microtubule agent)인 것인 방법.
  6. 제1항에 있어서, 상기 제1 식물은 외떡잎식물 또는 쌍떡잎식물인 것인 방법.
  7. 제6항에 있어서, 상기 제1 식물은 옥수수, 밀, 벼, 보리, 귀리, 라이밀(triticale), 수수, 진주 기장, 테오신트(teosinte), 대나무, 사탕수수, 아스파라거스, 양파 및 마늘로 이루어진 군으로부터 선택되는 외떡잎식물인 것인 방법.
  8. 제1항에 있어서, 상기 제2 식물은 외떡잎식물 또는 쌍떡잎식물인 것인 방법.
  9. 제8항에 있어서, 상기 제2 식물은 옥수수, 밀, 벼, 보리, 귀리, 라이밀, 수수, 진주 기장, 테오신트, 대나무, 사탕수수, 아스파라거스, 양파 및 마늘로 이루어진 군으로부터 선택되는 외떡잎식물인 것인 방법.
  10. 제1항에 있어서, 상기 선택적인 가이드 RNA는 18개 내지 21개로 구성된 뉴클레오티드 서열이고, 서열번호 2, 서열번호 4, 서열번호 8, 서열번호 21, 서열번호 23, 서열번호 25, 서열번호 29, 서열번호 32 및 서열번호 33으로 이루어진 군으로부터 선택되는 서열과 상동을 갖는 방법.
  11. 제1항에 있어서, 상기 제1 식물은 마커 유전자를 발현하는 방법.
  12. 제11항에 있어서, 상기 마커 유전자는 GUS, PMI, PAT, GFP, RFP, CFP, B1, C1, R-nj, 안토시아닌 색소 및 임의의 기타 마커 유전자로 이루어진 군으로부터 선택되는 방법.
  13. 제1항에 있어서, 상기 제1 식물은 Stock 6, RWK, RWS, UH400, AX5707RS, NP2222-matl 또는 임의의 몇몇 기타 공지된 HI 계통과 같은 계통으로부터 선택 및/또는 유래하는 옥수수 식물인 방법.
  14. 제1항에 있어서, 상기 제1 식물 및 상기 제2 식물은 서로 다른 종인 것인 방법.
  15. 제14항에 있어서, 상기 제1 식물은 밀 식물이고, 상기 제2 식물은 옥수수 식물인 방법.
  16. 제14항에 있어서, 상기 제1 식물은 옥수수 식물이고, 상기 제2 식물은 밀 식물인 방법.
  17. 제1항의 방법에 의해 생산되는 유전자 편집된 식물.
  18. 식물 유전체 DNA를 편집하는 방법으로서,
    a) 제1 식물을 수득하되, 상기 제1 식물은 DNA 변형 효소 및 선택적으로는 가이드 핵산을 발현할 수 있는 단계;
    b) 제2 식물을 수득하되, 상기 제2 식물은 편집되어야 할 식물 유전체 DNA를 포함하는 단계;
    c) 상기 제1 식물에서 유래하는 화분으로 상기 제2 식물을 수분시키는 단계;
    d) 상기 단계 (c)의 수분 직전, 동안 또는 이후에 지질 또는 포스포리파아제 억제제를 포함하는 조성물을 도포하는 단계; 및
    e) 상기 단계 (c)의 수분에 의해 생산된 적어도 하나의 반수체 자손을 선택하되, 상기 반수체 자손은 상기 제2 식물의 유전체를 포함하지만 상기 제1 식물의 유전체는 포함하지 않고, 상기 반수체 자손의 유전체는 상기 제1 식물에 의해 전달되는 DNA 변형 효소 및 선택적인 가이드 핵산에 의해 변형되어 있는 단계를 포함하는, 식물 유전체 DNA를 편집하는 방법.
  19. 제18항에 있어서, 상기 단계 (d)의 조성물은 메틸 알파-리놀레노일 플루오로포스포네이트(MALFP), 리놀산 에틸에스테르(LLAEE), 리놀산(LLA), 옥수수 오일, 디스테아로일-포스파티딜콜린(DSPC), 메틸아라키도닐 플루오로포스포네이트(MAFP), 팔미틸 트리플루오로메틸케톤(PACOCF3), 아라키도닐 트리플루오로메틸케톤(AACOCF3), 마노알리드(Manoalide), 리놀렌산 에틸에스테르(LNAEE), 리놀렌산 에틸에스테르(LNAEE), 올레산 메틸에스테르(OAME), 올레산 에틸에스테르(OAEE), 팔미트산 에틸에스테르(PAEE), 팔미톨레산 에틸에스테르(PLAEE), 아마인 오일, 옥수수 오일, 알파-리놀렌산(aLNA), 감마-리놀렌산(gLNA), 올레산, 아라키돈산, 스테아르산, 9(Z)-11(E)-접합 리놀산 또는 2-올레오일-1-팔미토일-sn-글리세로-3-포스포-에탄올아민을 포함하는 방법.
  20. 식물 유전체 DNA를 편집하는 방법으로서,
    a) 제1 식물을 수득하되, 상기 제1 식물은 DNA 변형 효소 및 선택적으로는 가이드 핵산을 발현할 수 있는 단계;
    b) 제2 식물을 수득하되, 상기 제2 식물은 편집되어야 할 식물 유전체 DNA를 포함하는 단계;
    c) 상기 제1 식물을 상기 제2 식물과 교배하는 단계; 및
    d) 상기 단계 (c)의 교배에 의해 생산된 적어도 하나의 반수체 자손을 선택하되, 상기 반수체 자손은 상기 제2 식물의 유전체를 포함하지만 상기 제1 식물의 유전체는 포함하지 않고, 상기 반수체 자손의 유전체는 상기 제1 식물에 의해 전달되는 DNA 변형 효소 및 선택적인 가이드 핵산에 의해 변형되어 있는 단계를 포함하는, 식물 유전체 DNA를 편집하는 방법.
  21. 제20항에 있어서, 상기 제1 식물은 상기 단계 (c)의 교배에서 자성 부모(female parent)으로서 작용하는 방법.
  22. 제21항에 있어서, 상기 제1 식물은 CENH3 유전자에서의 돌연변이, ig1 유전자에서의 돌연변이, 또는 부계 반수체 유도 시스템을 부여하는 다른 돌연변이를 포함하는 것인 방법.
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