KR102238137B1 - 공여자 삽입을 결정하기 위한 작물에서의 신속 표적화 분석 - Google Patents

공여자 삽입을 결정하기 위한 작물에서의 신속 표적화 분석 Download PDF

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Abstract

본 개시내용은 정밀 표적화 게놈 유전자좌를 함유하는 식물 이벤트를 검출하고 확인하는 방법, 및 이러한 표적화 게놈 유전자좌를 포함하는 식물 및 식물 세포를 제공한다. 상기 방법은 표적화 게놈 유전자좌에서의 공여자 DNA 폴리뉴클레오티드 삽입을 스크리닝하는데 이용되는 고처리량 과정으로서 전개될 수 있다. 상기 방법은 부위 특이적 뉴클레아제의 사용에 기인하는 표적화 방법을 통해 생산된 식물 이벤트의 확인에 용이하게 적용가능하다.

Description

공여자 삽입을 결정하기 위한 작물에서의 신속 표적화 분석 {RAPID TARGETING ANALYSIS IN CROPS FOR DETERMINING DONOR INSERTION}
관련 출원에 대한 상호 참조
본 출원은 35 U.S.C. § 119(e) 하에 2013년 9월 4일에 출원된 미국 특허 가출원 번호 61/873,719 및 2013년 11월 4일에 출원된 미국 특허 가출원 번호 61/899,569에 대해 이익을 주장하며, 이들 내용은 그 전문이 본 출원에 참조로 포함된다.
전자적으로 제출된 서열 목록에 대한 참조
서열 목록의 공식 사본은 파일명 "226007_ST25.txt"의 2013년 11월 4일에 생성된 68.6 킬로바이트 크기의 ASCII 포맷 서열 목록으로서 EFS-웹을 통해 전자적으로 제출되었고, 이는 본 명세서와 공동으로 출원된다. 이러한 ASCII 포맷 문서에 포함된 서열 목록은 본 명세서의 일부이고 그 전문이 본원에 참조로 포함된다.
발명의 분야
본 개시내용은 일반적으로 분자 생물학 및 생화학의 분야에 관한 것이다. 본 개시내용은 통합된 공여자 폴리뉴클레오티드의 삽입의 게놈 부위를 분석하기 위한 방법에 관한 것이다. 상기 방법은 통합된 공여자 폴리뉴클레오티드의 고처리량 분석에 적용가능하고, 가양성 결과의 검출을 최소화하기 위해 사용될 수 있다. 게다가, 상기 방법은 안정하게 표적화된 식물을 생성하는 생산을 필요로 하지 않으면서 세포 기반 표적화 및 분석을 사용한다.
식물의 표적화 게놈 변형은 응용 연구 및 기초 연구 둘 다의 장기간의 달성하기 어려운 목표가 되어 왔다. 식물 게놈의 특정 위치에 대한 유전자의 표적화 및 유전자 스택은 트랜스제닉 이벤트의 품질을 개선시키고, 트랜스제닉 이벤트의 생산과 연관된 비용을 감소시키며, 트랜스제닉 식물 생성물을 제조하기 위한 신규 방법 예컨대 순차적 유전자 스택킹을 제공할 것이다. 전체적으로, 특정 게놈 부위에 대한 트랜진의 표적화가 상업적으로 유익할 수 있다. 미리 결정된 게놈 유전자좌 내에서 표적화 돌연변이유발을 유도하고 세포 DNA 서열의 표적화 결실을 유도하고 외인성 공여자 DNA 폴리뉴클레오티드의 표적화 재조합을 용이하게 하기 위해 부위 특이적 뉴클레아제 (예를 들어, 아연 핑거 뉴클레아제 (ZFN), 메가뉴클레아제, 전사 활성화제-유사 이펙터 뉴클레아제 (TALEN) 및 조작된 crRNA/tracr RNA를 갖는 클러스터링된 규칙적 간격의 짧은 회문식 반복부/CRISPR-연관 뉴클레아제 (CRISPR/Cas))에 의해 게놈 DNA를 표적화하고 절단하는 방법 및 조성물의 개발에 대하여 지난 몇 년간 유의한 진보가 이루어져 왔다. 예를 들어, 미국 특허 공개 번호 20030232410; 20050208489; 20050026157; 20050064474; 및 20060188987, 및 국제 특허 공개 번호 WO 2007/014275를 참조하며, 이들 개시내용은 모든 목적을 위해 그 전문이 참조로 포함된다. 미국 특허 공개 번호 20080182332에는 식물 게놈의 표적화 변형을 위한 비-정규 아연 핑거 뉴클레아제 (ZFN)의 용도가 기재되어 있고, 미국 특허 공개 번호 20090205083에는 식물 EPSP 게놈 유전자좌의 ZFN-매개 표적화 변형이 기재되어 있다. 외인성 DNA의 표적화 삽입을 위한 현행 방법은 전형적으로 적어도 1개의 트랜스진을 함유하는 공여자 DNA 폴리뉴클레오티드, 및 특정 게놈 유전자좌에 결합하고 이를 절단하도록 설계된 부위 특이적 뉴클레아제 (예를 들어, ZFN)를 사용한 식물 조직의 공동-형질전환을 포함한다. 이는 공여자 DNA 폴리뉴클레오티드가 절단된 게놈 유전자좌 내로 안정하게 삽입되도록 하여 명시된 게놈 유전자좌에서의 표적화 유전자 부가를 일으킨다.
불행하게도, 표적화 게놈 변형의 보고 및 관찰된 빈도는 식물 내의 게놈 유전자좌를 표적화하는 것이 상대적으로 비효율적임을 나타낸다. 보고된 비효율은 표적화 게놈 유전자좌를 함유하는 특이적 이벤트를 확인하기 위해 수많은 식물 이벤트의 스크리닝을 필요로 한다. 스크리닝 방법은 또한 표적화 게놈 유전자좌를 함유하는 식물 이벤트의 신속한 확인을 위한 고처리량 방법으로서 적용가능해야 한다. 추가로, 표적화 유전자 삽입이 무작위 유전자 삽입과 함께 일어나기 때문에, 스크리닝 방법은 무작위 삽입의 배경 내에서 게놈 유전자좌의 표적화를 특이적으로 확인하고 가양성 결과를 생산할 수 있는 외인성 플라스미드 DNA로부터 게놈 통합을 식별하도록 설계되어야 한다. 게다가, 검정은 수천개의 다른 비-표적화 세포들 사이에서 단독의 표적화 이벤트를 함유하는 단일 세포에서 발생하는 이벤트를 검출하기에 충분히 감수성이어야 한다. 대부분의 보고된 식물 이벤트 분석은 표적화를 확인하기 위한 단일 분석 방법에 의존하며, 이는 표적화 빈도의 부정확한 추정 및 낮은 신뢰 결과로 이어질 수 있다. 부위 특이적 염색체 통합을 검출하고 외인성 플라스미드 DNA로부터 이들 이벤트를 식별할 수 있는 개선된 분자 검정 방법, 특히 고처리량 분석의 개발에 대한 필요성이 존재한다. 최종적으로, 표적화 게놈 변형을 평가하기 위한 현행 방법은 안정한 식물의 생성을 기반으로 하며, 시간 및 비용 집약적이다. 따라서, 다수의 게놈 유전자좌에서의 신속 표적화 평가 및 다수의 부위-특이적 뉴클레아제의 스크리닝을 가능하게 하여 표적화 게놈 유전자좌 내의 폴리뉴클레오티드 공여자 서열의 삽입을 확인 및 확증하는 분석 방법에 대한 필요성이 존재한다.
관련 기술분야의 상기 예 및 이와 관련된 제한은 예시적이며 배타적인 것으로 의도되지 않는다. 관련 기술분야의 다른 제한은 본 명세서를 읽음으로써 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 명백해질 것이다.
한 실시양태에서, 본 개시내용은 게놈 표적 부위 내의 폴리뉴클레오티드 공여자 서열의 부위 특이적 통합을 검출하기 위한 검정에 관한 것이며, 여기서 제1 앰플리콘을 생산하기 위해 게놈 DNA 표적 부위에 결합하도록 설계된 제1 아웃-PCR 프라이머; 통합된 폴리뉴클레오티드 공여자 서열에 결합하도록 설계된 제1 인-PCR 프라이머를 사용하여 제1 라운드의 PCR에 의해 게놈 DNA를 증폭시키고, 제2 앰플리콘을 생산하기 위해 제1 앰플리콘 내에 위치한 서열에 특이적인 프라이머를 사용하여 제2 라운드의 PCR에 의해 제1 앰플리콘을 증폭시키고; 제2 앰플리콘의 존재를 검출하며, 여기서 제2 앰플리콘의 생산은 부위 특이적 통합 이벤트의 존재를 나타낸다.
실시양태의 한 측면에서, 게놈 표적 부위는 내인성 또는 조작된 게놈 표적 부위를 포함한다. 실시양태의 또 다른 측면에서, 제1 인-PCR 프라이머는 제1 아웃-PCR 프라이머보다 낮은 농도로 제공된다. 한 실시양태에서, 제1 라운드의 PCR은 약 4:1, 3:1 또는 2:1의 제1 아웃-PCR 프라이머 대 제1 인-PCR 프라이머의 상대 농도를 사용하여 수행된다. 또 다른 실시양태에서, 제1 인-PCR 프라이머는 0.05 - 0.09 μM의 농도로 포함되고, 제1 아웃-PCR 프라이머는 적어도 0.1 μM의 농도로 포함된다.
실시양태의 후속 측면에서, 제2 라운드의 PCR은 제1 앰플리콘의 게놈 DNA 표적 부위에 결합하도록 설계된 제2 아웃-PCR 프라이머 및 제1 앰플리콘의 통합된 폴리뉴클레오티드 공여자 서열에 결합하도록 설계된 제2 인-PCR 프라이머를 포함한다. 한 실시양태에서, 제2 인-PCR 프라이머는 제2 아웃-PCR 프라이머보다 낮은 농도로 제공된다. 또 다른 실시양태에서, 제2 라운드의 PCR은 약 4:1, 3:1 또는 2:1의 제2 아웃-PCR 프라이머 대 제2 인-PCR 프라이머의 상대 농도를 사용하여 수행된다. 추가 실시양태에서, 제2 인-PCR 프라이머는 0.05 - 0.1 μM의 농도로 포함되고, 제2 아웃-PCR 프라이머는 0.2 μM의 농도로 포함된다.
실시양태의 추가 측면에서, 게놈 표적 부위 내의 폴리뉴클레오티드 공여자 서열의 부위 특이적 통합을 포함하는 게놈 DNA는 식물 게놈 DNA이다. 한 실시양태로서, 식물 게놈 DNA는 단자엽 식물로부터 단리된다. 또 다른 실시양태로서, 식물 게놈 DNA는 쌍자엽 식물로부터 단리된다.
실시양태의 또 다른 측면에서, 부위 특이적 뉴클레아제를 사용한 게놈 DNA 표적 부위의 절단은 게놈 표적 부위 내의 폴리뉴클레오티드 공여자 서열의 부위 특이적 통합을 일으킨다. 한 실시양태로서, 부위 특이적 뉴클레아제는 아연 핑거 뉴클레아제, CRISPR 뉴클레아제, TALEN 뉴클레아제 또는 메가뉴클레아제로 이루어진 군으로부터 선택된다. 후속 실시양태에서, 게놈 표적 부위 내의 폴리뉴클레오티드 공여자 서열의 부위 특이적 통합은 비 상동 말단 연결 메카니즘을 통해 일어난다.
실시양태의 한 측면에서, 검출 단계는 제2 앰플리콘의 아가로스 겔 또는 제2 앰플리콘의 서열분석 반응이다.
실시양태의 또 다른 측면에서, 본 개시내용은, 제1 앰플리콘을 생산하기 위해 제1 라운드의 PCR에 의해 게놈 DNA를 증폭시키며, 여기서 상기 PCR은 게놈 표적 부위에 결합하도록 설계된 제1 아웃-PCR 프라이머 및 폴리뉴클레오티드 공여자 서열에 결합하도록 설계된 제1 인-PCR 프라이머를 사용하여 수행되고, 추가로 여기서 상기 제1 인-PCR 프라이머는 제1 아웃-PCR 프라이머보다 낮은 농도로 제공되는 것인 단계; 제2 앰플리콘을 생산하기 위해 제1 앰플리콘 내에 위치한 서열에 특이적인 프라이머를 사용하여 제2 라운드의 PCR에 의해 제1 앰플리콘을 증폭시키는 단계; 및 제2 앰플리콘의 존재를 검출하며, 여기서 제2 앰플리콘의 생산은 부위 특이적 통합 이벤트의 존재를 나타내는 것인 단계를 포함하는, 형질감염된 식물 세포의 게놈 표적 부위 내의 폴리뉴클레오티드 공여자 서열의 부위 특이적 통합을 검출하는 방법에 관한 것이다. 다른 실시양태에서, 식물 세포는 원형질체 식물 세포이다. 한 실시양태에서, 부위 특이적 통합의 검출은 표적화 및 비-표적화 식물 세포의 혼합 집단에 대해 수행되며, 여기서 비-표적화 식물 세포는 게놈 표적 부위 내에 폴리뉴클레오티드 공여자 서열을 함유하지 않는다.
상기 기재된 예시적인 측면 및 실시양태 이외에도, 추가 측면 및 실시양태가 하기 기재의 연구에 의해 명백해질 것이다.
도 1은 pDAB111845의 플라스미드 지도를 예시한다.
도 2는 pDAB111846의 플라스미드 지도를 예시한다.
도 3은 pDAB117415의 플라스미드 지도를 예시한다.
도 4는 pDAB117416의 플라스미드 지도를 예시한다.
도 5는 pDAB117417의 플라스미드 지도를 예시한다.
도 6은 pDAB117419의 플라스미드 지도를 예시한다.
도 7은 pDAB117434의 플라스미드 지도를 예시한다.
도 8은 pDAB117418의 플라스미드 지도를 예시한다.
도 9는 pDAB117420의 플라스미드 지도를 예시한다.
도 10은 pDAB117421의 플라스미드 지도를 예시한다.
도 11은 NHEJ를 통한 통합을 위한 범용 공여자 폴리뉴클레오티드 서열의 표현을 예시한다.
도 12는 HDR을 통한 통합을 위한 범용 공여자 폴리뉴클레오티드 서열의 표현을 예시한다. 표지 "HA"는 상동성 아암을 나타내고; 표지 "ZFN BS"는 (단량체에 대한) ZFN 결합 부위를 나타낸다.
도 13은 제아 메이스(Zea mays) 선택 게놈 유전자좌 표적화 확인에서의 범용 공여자 폴리뉴클레오티드 시스템 통합의 표적화 및 확인에 사용된 구축물을 예시한다. A) ZFN 쌍의 위치가 있는 ZFN 설계 공간. B) ZFN 발현 구축물의 형상. 표지 "NLS"는 핵 국재화 신호를 나타내고, 표지 "ZFP"는 아연 핑거 단백질을 나타낸다. C) 제아 메이스 선택 게놈 유전자좌의 NHEJ 매개 표적화를 위한 범용 공여자 폴리뉴클레오티드. Z1-Z6은 제아 메이스 선택 게놈 유전자좌 표적에 특이적인 ZFN 결합 부위를 나타낸다. ZFN 부위의 수는 3-6개로 달라질 수 있다. 수직 화살표는 고유한 제한 부위를 제시하고, 수평 화살표는 잠재적 PCR 프라이머 부위를 나타낸다. 범용 공여자 폴리뉴클레오티드 시스템은 제아 메이스 선택 게놈 유전자좌 내의 통합에 사용된 모든 공여자에 공통적인 짧은 (110 bp) 서열이다.
도 14는 pDAB8393의 플라스미드 지도를 예시한다.
도 15a 및 15b는 제아 메이스 선택된 게놈 유전자좌 표적에서의 ZFN 절단 활성을 예시한다. 절단 활성은 1백만 개의 고품질 리드당 ZFN 절단 부위에서 Indel을 갖는 서열의 수로 나타낸다. 도 15a는 데이터를 막대 그래프 형태로 나타낸다. 도 15b는 데이터를 표로 나타낸다.
도 16은 NHEJ 기반 신속 표적화 분석 방법을 사용한 제아 메이스 선택된 게놈 유전자좌 표적의 확인을 예시한다.
도 17은 플랭킹 서열 분석 및 트랜스진 발현 연구에 사용된 이벤트를 포함하는 무작위 통합을 통해 제아 메이스 내로 형질전환된 플라스미드 구축물을 예시한다.
도 18은 원형질체 신속 표적화 분석에서 ELP에서의 NHEJ를 통한 공여자 삽입을 예시한다. 삽입은 정방향 또는 역방향 배향으로 일어날 수 있다.
도 19는 ELP1에서의 ZFN 절단 부위의 파괴를 예시한다. 파괴는 표적 대 참조 비의 측면에서 qPCR 신호의 감소로 나타난다. 신호에서 평균 22% 및 15% 감소가 ZFN1 및 ZFN3 각각에 대해 관찰된다.
도 20은 인-아웃 증폭된 PCR 생성물의 서열을 예시한다. 각각의 인-아웃 PCR로부터의 4개의 클론을 서열분석하였고, 결과는 무손상 표적 공여자 접합부 및 프로세싱된 말단 접합부를 나타내었다. 열거된 서열은 추정으로서의 서열 248, A9-1로서의 서열 249, A9-2로서의 서열 250, A9-5로서의 서열 251, A9-6으로서의 서열 252, G8-1로서의 서열 253, G8-2로서의 서열 254, G8-5로서의 서열 255, G8-6으로서의 서열 256, G9-1로서의 서열 257, G9-2로서의 서열 258, G9-6으로서의 서열 259, H9-1로서의 서열 260, H9-2로서의 서열 261, H9-5로서의 서열 262, 및 H9-6으로서의 서열 263에 상응한다.
도 21은 원형질체 신속 표적화 분석에서 E32에서의 NHEJ를 통한 공여자 삽입을 예시한다. 삽입은 정방향 또는 역방향 배향으로 일어날 수 있다.
도 22는 공여자 폴리뉴클레오티드에 대해 설계된 프라이머 및 아연 핑거 결합 서열의 관계를 제시하는 개략도를 예시한다.
도 23은 pDAB7221의 플라스미드 지도를 예시한다.
도 24는 유전자좌 파괴 검정에 대한 프로브/프라이머의 개략도를 예시한다. 파괴 검정에 사용된 FAD2 2.3 및 2.6 유전자에 대한 F2 ZFN 결합 부위 및 프라이머가 나타나 있다.
도 25는 FAD2 2.3 유전자좌에서 F2, ZFN2 아연 핑거 뉴클레아제를 사용한 공여자 서열의 NHEJ 표적화로부터 생성된 인-아웃 PCR 생성물의 서열을 제공한다. 참조 서열 (도면의 상단)은 역방향 배향으로의 공여자 벡터의 표적화 삽입의 형상을 나타낸다. FokI 소화로부터 생성된 DNA의 단일-가닥 말단을 채워서 참조 서열을 생성하였다. 생어 서열이 제시된다. F2, ZFN2 ZFN 결합 서열은 밑줄로 표시된다. 명시된 서열과 유사한 서열을 갖는 플라스미드 클론이 우측에 열거된다.
I. 개관
본 발명에 이르러, 부위 특이적 뉴클레아제 표적화 식물 이벤트의 신속한 스크리닝, 확인 및 특성화를 위한 신규 방법이 개시되었다. 상기 방법은 제1 및 제2 증폭 반응을 통해 게놈 표적 유전자좌 내의 공여자 폴리뉴클레오티드의 통합을 분석하는데 사용될 수 있다. 제1 및 제2 증폭 반응은 게놈 유전자좌 내에 표적화된 공여자 DNA 폴리뉴클레오티드의 3' 및/또는 5' 접합부 서열을 스크리닝하기 위한 "인-아웃" PCR 증폭 반응이다. 3' 및/또는 5' 접합부 서열을 함유하는 증폭된 생성물의 존재는 공여자 DNA 폴리뉴클레오티드가 표적화 게놈 유전자좌 내에 존재한다는 것을 나타낸다.
개시된 스크리닝 검정은 표적화 트랜스진 삽입 이벤트를 확인하고 수득하기 위한 고품질, 고처리량 과정을 기재한다. 스크리닝 검정의 전개는 다수의 식물 이벤트를 분석 및 스크리닝하여 표적화 게놈 유전자좌 내에 삽입된 공여자 DNA 폴리뉴클레오티드를 갖는 특정 이벤트를 선택하고 가양성 결과로부터 이들 이벤트를 식별하는 것을 가능하게 한다. 더욱이, 개시된 방법은 샘플의 하위세트의 신속하고 효율적인 확인을 가능하게 하는 고처리량 검정으로서 전개될 수 있으며, 이는 이어서 다른 분자 확인 방법에 의해 추가로 분석될 수 있다. 본원에 개시된 대상은 신규 스크리닝 방법을 이용하여 선택된 뉴클레아제 표적화 식물 이벤트를 포함하는 식물 및 식물 세포를 포함한다. 게다가, 상기 방법론은 임의의 식물 종의 분석에 용이하게 적용가능하다.
II. 용어
달리 정의되지 않는 한, 본원에 사용된 모든 기술 과학 용어는 본 개시내용이 관련된 분야의 통상의 기술자에 의해 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 상충하는 경우, 정의를 비롯하여 본원이 우선할 것이다. 문맥에서 달리 요구되지 않는 한, 단수의 용어는 복수를 포함할 것이고, 복수의 용어는 단수를 포함할 것이다. 본원에 인용된 모든 공개, 특허 및 다른 참고문헌은, 특허 또는 특허 공개의 단지 특정 섹션만이 참조로 포함되는 것으로 나타내지 않는 한, 각각의 개별 공개 또는 특허 출원이 구체적으로 및 개별적으로 참조로 포함되는 것으로 나타낸 경우와 같이, 모든 목적을 위해 그 전문이 참조로 포함된다.
본 개시내용을 추가로 명확화하기 위해, 하기 용어, 약어 및 정의가 제공된다.
본원에 사용된 용어 "포함한다", "포함하는", "포괄한다", "포괄하는", "갖는다", "갖는", "함유한다", 또는 "함유하는", 또는 그의 임의의 다른 변형은 비-배타적이거나 또는 개방형인 것을 의도한다. 예를 들어, 일련의 요소들을 포함하는 조성물, 혼합물, 과정, 방법, 물품, 또는 장치는 반드시 이들 요소에만 제한되는 것은 아니며, 이러한 조성물, 혼합물, 과정, 방법, 물품, 또는 장치에 명백히 열거되지 않거나 내재되지 않은 다른 요소를 포함할 수 있다. 또한, 달리 명백하게 언급되지 않는 한, "또는"은 포함적 논리합을 지칭하며 배타적 논리합을 지칭하지 않는다. 예를 들어, 조건 A 또는 B는 다음 중 임의의 하나에 의해 충족된다: A가 참이고 (또는 존재하고) B가 거짓인 (또는 존재하지 않는) 것, A가 거짓이고 (또는 존재하지 않고) B가 참인 (또는 존재하는) 것, 및 A 및 B 둘 다가 참인 (또는 존재하는) 것.
본원에 사용된 용어 "발명" 또는 "본 발명"은 비제한적 용어이며, 특정한 본 발명의 임의의 단일 실시양태를 지칭하는 것으로 의도되지 않고, 본원에 개시된 모든 가능한 실시양태를 포괄하도록 의도된다.
본원에 사용된 용어 "식물"은 전체 식물 및 임의의 자손, 세포, 조직, 또는 식물의 부분을 포함한다. 용어 "식물 부분"은, 예를 들어 비제한적으로, 종자 (성숙 종자, 미성숙 종자, 및 외종피가 없는 미성숙 배아 포함); 식물 삽목부; 식물 세포; 식물 세포 배양물; 식물 기관 (예를 들어, 화분, 배아, 꽃, 열매, 싹, 잎, 뿌리, 줄기 및 관련된 외식편)을 비롯한 식물의 임의의 부분(들)을 포함한다. 식물 조직 또는 식물 기관은 종자, 캘러스, 또는 구조적 또는 기능적 단위로 조직화된 식물 세포의 임의의 다른 군일 수 있다. 식물 세포 또는 조직 배양물은 세포 또는 조직을 얻은 식물의 생리학적 및 형태학적 특징을 갖는 식물을 재생할 수 있고, 식물과 실질적으로 동일한 유전자형을 갖는 식물을 재생할 수 있다. 대조적으로, 일부 식물 세포는 식물을 생산하도록 재생될 수 없다. 식물 세포 또는 조직 배양물에서 재생가능한 세포는 배아, 원형질체, 분열조직 세포, 캘러스, 화분, 잎, 꽃밥, 뿌리, 근단, 수염, 꽃, 커넬, 이삭, 속대, 껍질, 또는 줄기일 수 있다.
식물 부분은 수확가능한 부분 및 자손 식물의 번식에 유용한 부분을 포함한다. 번식에 유용한 식물 부분은, 예를 들어 비제한적으로, 종자; 열매; 삽목부; 묘목; 괴경; 및 근경을 포함한다. 식물의 수확가능한 부분은, 예를 들어 비제한적으로 꽃; 화분; 묘목; 괴경; 잎; 줄기; 열매; 종자 및 뿌리를 비롯한 식물의 임의의 유용한 부분일 수 있다.
식물 세포는 식물의 구조적 및 생리학적 단위이다. 본원에 사용된 식물 세포는 원형질체 및 부분 세포벽 내의 원형질체를 포함한다. 식물 세포는 단리된 단일 세포, 또는 세포의 응집체 (예를 들어, 이쇄성 캘러스 및 배양된 세포)의 형태일 수 있고, 보다 고차원적으로 조직화된 단위 (예를 들어, 식물 조직, 식물 기관, 및 식물)의 일부일 수 있다. 따라서, 식물 세포는 원형질체, 배우체 생산 세포, 또는 전체 식물로 재생될 수 있는 세포 또는 세포의 집단일 수 있다. 이에 따라, 다수의 식물 세포를 포함하며 전체 식물로 재생될 수 있는 종자는 본원의 실시양태에서 "식물 부분"으로 간주된다.
본원에 사용된 용어 "원형질체"는 세포벽이 완전히 또는 부분적으로 제거되었으며 네이키드 지질 이중층 막을 갖는 식물 세포를 지칭한다. 전형적으로, 원형질체는 세포 배양물 또는 전체 식물로 재생되는 효력을 갖는, 세포벽이 없는 단리된 식물 세포이다.
본원에 사용된 "내인성 서열"은 유기체 또는 유기체의 게놈 내의 그의 자연 위치에 존재하는 천연 형태의 폴리뉴클레오티드, 유전자 또는 폴리펩티드를 정의한다.
본원에 사용된 용어 "단리된"은 그의 자연 환경에서 제거되었음을 의미한다.
본원에 사용된 용어 "정제된"은 천연 또는 자연 환경에서 분자 또는 화합물과 정상적으로 회합되어 있는 오염물이 실질적으로 없는 형태의 분자 또는 화합물의 단리에 관한 것이며, 본래 조성물의 다른 성분으로부터 분리된 결과로서 순도가 증가된 것을 의미한다. 용어 "정제된 핵산"은 본원에서 폴리펩티드, 지질 및 탄수화물을 포함하나 이에 제한되지는 않는 다른 화합물로부터 분리된 핵산 서열을 기재하기 위해 사용된다.
본원에 사용된 용어 "폴리뉴클레오티드", "핵산", 및 "핵산 분자"는 교환가능하게 사용되고, 단수의 핵산; 복수의 핵산; 핵산 단편, 변이체, 또는 그의 유도체; 및 핵산 구축물 (예를 들어, 메신저 RNA (mRNA) 및 플라스미드 DNA (pDNA))을 포괄할 수 있다. 폴리뉴클레오티드 또는 핵산은 전장 cDNA 서열의 뉴클레오티드 서열, 또는 비번역 5' 및/또는 3' 서열 및 코딩 서열(들)을 비롯한 그의 단편을 함유할 수 있다. 폴리뉴클레오티드 또는 핵산은 임의의 폴리리보뉴클레오티드 또는 폴리데옥시리보뉴클레오티드로 구성될 수 있고, 이는 비변형된 리보뉴클레오티드 또는 데옥시리보뉴클레오티드 또는 변형된 리보뉴클레오티드 또는 데옥시리보뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 예를 들어, 폴리뉴클레오티드 또는 핵산은 단일- 및 이중-가닥 DNA; 단일- 및 이중-가닥 영역의 혼합물인 DNA; 단일- 및 이중-가닥 RNA; 및 단일- 및 이중-가닥 영역의 혼합물인 RNA로 구성될 수 있다. DNA 및 RNA를 포함하는 하이브리드 분자는 단일-가닥, 이중-가닥, 또는 단일- 및 이중-가닥 영역의 혼합물일 수 있다. 상기 용어는 또한 화학적으로, 효소적으로, 및 대사적으로 변형된 형태의 폴리뉴클레오티드 또는 핵산을 포함한다.
특이적 DNA는 또한 데옥시리보뉴클레오티드 염기-쌍형성의 규칙에 따라 결정되는 서열을 갖는 그의 상보체를 지칭하는 것으로 이해된다.
본원에 사용된 용어 "유전자"는 기능적 생성물 (RNA 또는 폴리펩티드/단백질)을 코딩하는 핵산을 지칭한다. 유전자는 기능적 생성물을 코딩하는 서열의 앞 (5' 비-코딩 서열) 및/또는 뒤 (3' 비-코딩 서열)에 조절 서열을 포함할 수 있다.
본원에 사용된 용어 "코딩 서열"은 특정 아미노산 서열을 코딩하는 핵산 서열을 지칭한다. "조절 서열"은 연관된 코딩 서열의 전사, RNA 프로세싱 또는 안정성, 또는 번역에 영향을 미치는, 코딩 서열의 상류 (예를 들어, 5' 비-코딩 서열), 내부 또는 하류 (예를 들어, 3' 비-코딩 서열)에 위치하는 뉴클레오티드 서열을 지칭한다. 조절 서열은, 예를 들어 비제한적으로 프로모터; 번역 리더 서열; 인트론; 폴리아데닐화 인식 서열; RNA 프로세싱 부위; 이펙터 결합 부위; 및 스템-루프 구조를 포함한다.
본원에 사용된 용어 "폴리펩티드"는 단수의 폴리펩티드, 복수의 폴리펩티드 및 그의 단편을 포함한다. 이 용어는 아미드 결합 (펩티드 결합으로도 공지됨)에 의해 선형으로 연결된 단량체 (아미노산)로 구성된 분자를 지칭한다. 용어 "폴리펩티드"는 2개 이상의 아미노산의 임의의 쇄 또는 쇄들을 지칭하고, 특정 길이 또는 크기의 생성물을 지칭하지는 않는다. 따라서, 펩티드, 디펩티드, 트리펩티드, 올리고펩티드, 단백질, 아미노산 쇄, 또는 2개 이상의 아미노산의 쇄 또는 쇄들을 지칭하기 위해 사용되는 임의의 다른 용어는 "폴리펩티드"의 정의 내에 포함되고, 상기 용어는 본원에서 "폴리펩티드"와 교환가능하게 사용된다. 폴리펩티드는 천연 생물학적 공급원으로부터 단리되거나 또는 재조합 기술에 의해 생산될 수 있으나, 특정 폴리펩티드가 반드시 특정 핵산 서열로부터 번역되는 것은 아니다. 폴리펩티드는 예를 들어 비제한적으로 화학적 합성을 포함하는 임의의 적절한 방식으로 생성될 수 있다.
대조적으로, 용어 "이종"은 참조 (숙주) 유기체 내의 그의 위치에서 정상적으로 발견되지 않는 폴리뉴클레오티드, 유전자 또는 폴리펩티드를 지칭한다. 예를 들어, 이종 핵산은 참조 유기체 내에서 상이한 게놈 위치에서 정상적으로 발견되는 핵산일 수 있다. 추가의 예로서, 이종 핵산은 참조 유기체에서 정상적으로 발견되지 않는 핵산일 수 있다. 이종 폴리뉴클레오티드, 유전자 또는 폴리펩티드를 포함하는 숙주 유기체는 이종 폴리뉴클레오티드, 유전자 또는 폴리펩티드를 숙주 유기체 내로 도입함으로써 생산될 수 있다. 특정한 예에서, 이종 폴리뉴클레오티드는 상응하는 천연 폴리뉴클레오티드와 상이한 형태로 공급원 유기체 내로 재도입된 천연 코딩 서열 또는 그의 일부를 포함한다. 특정한 예에서, 이종 유전자는 상응하는 천연 유전자와 상이한 형태로 공급원 유기체 내로 재도입된 천연 코딩 서열 또는 그의 일부를 포함한다. 예를 들어, 이종 유전자는 천연 숙주 내로 재도입된 비-천연 조절 영역을 포함하는 키메라 유전자의 일부인 천연 코딩 서열을 포함할 수 있다. 특정한 예에서, 이종 폴리펩티드는 상응하는 천연 폴리펩티드와 상이한 형태로 공급원 유기체 내로 재도입된 천연 폴리펩티드이다.
이종 유전자 또는 폴리펩티드는 키메라 또는 융합 폴리펩티드, 또는 이를 코딩하는 유전자를 생산하기 위해 또 다른 유전자 또는 폴리펩티드에 융합된 기능적 폴리펩티드를 코딩하는 기능적 폴리펩티드 또는 핵산 서열을 포함하는 유전자 또는 폴리펩티드일 수 있다. 특정한 실시양태의 유전자 및 단백질은 구체적으로 예시된 전장 서열 및 일부, 절편, 단편 (인접 단편 및 전장 분자와 비교한 내부 및/또는 말단 결실 포함), 변이체, 돌연변이체, 키메라, 및 이들 서열의 융합체를 포함한다.
본원에 사용된 용어 "변형"은 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩된 폴리펩티드의 활성을 감소시키거나, 실질적으로 제거하거나 또는 제거하는 본원에 개시된 폴리뉴클레오티드에서의 변화, 뿐만 아니라 폴리펩티드의 활성을 감소시키거나, 실질적으로 제거하거나 또는 제거하는 본원에 개시된 폴리펩티드에서의 변화를 지칭할 수 있다. 대안적으로, 용어 "변형"은 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩된 폴리펩티드의 활성을 증가시키거나 또는 증진시키는 본원에 개시된 폴리뉴클레오티드에서의 변화, 뿐만 아니라 폴리펩티드의 활성을 증가시키거나 또는 증진시키는 본원에 개시된 폴리펩티드에서의 변화를 지칭할 수 있다. 이러한 변화는 결실, 돌연변이 (예를 들어, 자발적 돌연변이유발, 무작위 돌연변이유발, 돌연변이유발 유전자에 의해 초래된 돌연변이유발, 또는 트랜스포손 돌연변이 유발), 치환, 삽입, 하향조절, 세포 위치 변경, 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드의 상태 변경 (예를 들어, 메틸화, 인산화 또는 유비퀴틴화), 보조인자 제거, 안티센스 RNA/DNA의 도입, 간섭 RNA/DNA의 도입, 화학적 변형, 공유 변형, UV 또는 X-선 조사, 상동 재조합, 유사분열 재조합, 프로모터 교체 방법, 및/또는 이들의 조합을 포함하나 이로 제한되지는 않는 관련 기술분야에 널리 공지된 방법에 의해 이루어질 수 있다.
본원에 사용된 용어 "유도체"는 본 개시내용에 제시된 서열의 변형을 지칭한다. 이러한 변형의 예는 작물 종에서 본원에 개시된 코딩 서열의 기능을 보존하거나, 경미하게 변경하거나 증가시키는, 본원에 개시된 코딩 서열의 핵산 서열에 관련된 1개 이상의 염기의 치환, 삽입, 및/또는 결실이다. 이러한 유도체는 예를 들어 서열 구조를 예측하고 최적화하기 위한 컴퓨터 모델링 기술을 사용하여 관련 기술분야의 통상의 기술자에 의해 용이하게 결정될 수 있다. 따라서, 용어 "유도체"는 또한 본 개시내용의 실시양태의 생산에 사용하기 위한 개시된 관능기를 가질 수 있도록 본원에 개시된 코딩 서열과 실질적인 서열 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함한다.
용어 "프로모터"는 핵산 코딩 서열 또는 기능적 RNA의 발현을 제어할 수 있는 DNA 서열을 지칭한다. 예에서, 제어되는 코딩 서열은 프로모터 서열에 대해 3'에 위치한다. 프로모터는 그 전체가 천연 유전자로부터 유래될 수 있거나, 프로모터는 자연에서 발견된 상이한 프로모터로부터 유래된 상이한 요소로 구성될 수 있거나, 또는 프로모터는 심지어 합리적으로 설계된 DNA 절편을 포함할 수 있다. 관련 기술분야의 통상의 기술자는 상이한 프로모터가 상이한 조직 또는 세포 유형에서, 또는 상이한 발생 단계에서, 또는 상이한 환경적 또는 생리학적 조건에 반응하여 유전자의 발현을 지시할 수 있음을 이해한다. 상기 모든 프로모터의 예는 공지되어 있고, 이종 핵산의 발현을 제어하기 위해 관련 기술분야에서 사용된다. 대부분의 시기에 대부분의 세포 유형 내에서 유전자의 발현을 지시하는 프로모터는 통상적으로 "구성적 프로모터"로 지칭된다. 게다가, 관련 기술분야의 통상의 기술자들이 조절 서열의 정확한 경계를 설명하기 위해 시도해왔지만 (많은 경우에 비성공적임), 상이한 길이의 DNA 단편이 동일한 프로모터 활성을 가질 수 있는 것으로 이해되고 있다. 특정한 핵산의 프로모터 활성은 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 친숙한 기술을 사용하여 검정될 수 있다.
용어 "작동가능하게 연결된"은 핵산 서열 중 하나의 기능이 또 다른 것에 의해 영향을 받는, 단일 핵산 상의 핵산 서열들의 회합을 지칭한다. 예를 들어, 프로모터가 코딩 서열의 발현에 영향을 미칠 수 있는 경우에 프로모터는 그 코딩 서열과 작동가능하게 연결된다 (예를 들어, 코딩 서열은 프로모터의 전사 제어 하에 있다). 코딩 서열은 조절 서열에 센스 또는 안티센스 배향으로 작동가능하게 연결될 수 있다.
본원에 사용된 용어 "발현"은 DNA로부터 유래된 센스 (mRNA) 또는 안티센스 RNA의 전사 및 안정한 축적을 지칭할 수 있다. 발현은 또한 mRNA의 폴리펩티드로의 번역을 지칭할 수 있다. 본원에 사용된 용어 "과다발현"은 동일한 유전자 또는 관련 유전자의 내인성 발현보다 더 높은 발현을 지칭한다. 따라서, 이종 유전자는 그의 발현이 대등한 내인성 유전자의 발현보다 더 높은 경우에 "과다발현"된다.
본원에 사용된 용어 "형질전환" 또는 "형질전환된"은 유전적으로 안정한 유전을 일으키는, 핵산 또는 그의 단편의 숙주 유기체 내로의 전달 및 통합을 지칭한다. 형질전환 핵산을 함유하는 숙주 유기체는 "트랜스제닉", "재조합" 또는 "형질전환된" 유기체로 지칭된다. 공지된 형질전환 방법은 예를 들어 아그로박테리움 투메파시엔스(Agrobacterium tumefaciens)- 또는 에이. 리조게네스(A. rhizogenes)-매개 형질전환; 인산칼슘 형질전환; 폴리브렌 형질전환; 원형질체 융합; 전기천공; 초음파 방법 (예를 들어, 초음파천공); 리포솜 형질전환; 미세주사; 네이키드 DNA로의 형질전환; 플라스미드 벡터로의 형질전환; 바이러스 벡터로의 형질전환; 바이오리스틱 형질전환 (마이크로입자 포격); 탄화규소 WHISKERS-매개 형질전환; 에어로졸 비밍; 및 PEG-매개 형질전환을 포함한다.
본원에 사용된 용어 "도입된" (핵산을 세포 내로 도입하는 것과 관련됨)은 세포의 형질전환, 뿐만 아니라 통상의 식물 육종 기술을 이용하여 수행할 수 있는, 제2 식물이 핵산을 함유하도록 핵산을 포함하는 식물을 제2 식물과 교배하는 것을 포함한다. 이러한 육종 기술은 관련 기술분야에 공지되어 있다. 식물 육종 기술의 논의에 대해서는, 문헌 [Poehlman (1995) Breeding Field Crops, 4th Edition, AVI Publication Co., Westport CT]을 참조한다.
역교배 방법이 핵산을 식물 내로 도입하기 위해 사용될 수 있다. 이 기술은 수 십년 동안 형질을 식물 내로 도입하기 위해 사용되어 왔다. 역교배 (및 다른 식물 육종 방법론)에 대한 설명의 예는 예를 들어 상기 문헌 [Poelman (1995)]; 및 [Jensen (1988) Plant Breeding Methodology, Wiley, New York, NY]에서 찾아볼 수 있다. 예시적인 역교배 프로토콜에서, 관심 대상의 본래 식물 ("반복친")은 도입될 핵산을 보유하는 제2 식물 ("비-반복친")과 교배된다. 상기 교배로부터 생성되는 자손은 이어서 다시 반복친과 교배되고, 비-반복친으로부터의 핵산 이외에도 반복친의 본질적으로 모든 목적하는 형태학적 및 생리학적 특징이 전환된 식물에서 회복되는 전환된 식물이 얻어질 때까지 이 과정을 반복한다.
"결합"은 거대분자들 간의 (예를 들어, 단백질과 핵산 간의) 서열-특이적인 비-공유 상호작용을 지칭한다. 전체로서의 상호작용이 서열-특이적인 한, 결합 상호작용의 모든 성분이 서열-특이적일 필요는 없다 (예를 들어, DNA 백본 내의 포스페이트 잔기와의 접촉). 이러한 상호작용은 일반적으로 10-6 M-1 이하의 해리 상수 (Kd)에 의해 특성화된다. "친화도"는 결합 강도를 지칭하고, 결합 친화도의 증가는 보다 낮은 Kd와 상호관련된다.
"결합 단백질"은 또 다른 분자에 비-공유적으로 결합할 수 있는 단백질이다. 결합 단백질은, 예를 들어 DNA 분자 (DNA-결합 단백질), RNA 분자 (RNA-결합 단백질) 및/또는 단백질 분자 (단백질-결합 단백질)에 결합할 수 있다. 단백질-결합 단백질의 경우에, 이는 자신에게 결합할 수 있고/거나 (동종이량체, 동종삼량체 등을 형성) 이는 상이한 단백질 또는 단백질들의 1개 이상의 분자에 결합할 수 있다. 결합 단백질은 1종 초과의 유형의 결합 활성을 가질 수 있다. 예를 들어, 아연 핑거 단백질은 DNA-결합, RNA-결합 및 단백질-결합 활성을 갖는다.
"재조합"은 비-상동 말단 연결 (NHEJ) 및 상동 재조합에 의한 공여자 포획을 포함하나 이로 제한되지는 않는 2개의 폴리뉴클레오티드 사이의 유전 정보의 교환 과정을 지칭한다. 본 개시내용의 목적을 위해, "상동 재조합 (HR)"은 예를 들어 상동성-지정 복구 메카니즘을 통한 세포에서의 이중-가닥 파괴의 복구 동안 발생하는 상기 교환의 특수한 형태를 지칭한다. 이 과정은 뉴클레오티드 서열 상동성을 필요로 하고, "표적" 분자 (즉, 이중-가닥 파괴를 겪은 것)의 주형 복구를 위해 "공여자" 분자를 사용하며, 이는 공여자로부터 표적으로의 유전자 정보의 전달을 유도하기 때문에 "비-교차 유전자 전환" 또는 "쇼트 트랙 유전자 전환"으로 다양하게 공지되어 있다. 어떠한 특정한 이론에 얽매이는 것을 원하지는 않지만, 이러한 전달은 파괴된 표적과 공여자 사이에 형성된 헤테로듀플렉스 DNA의 미스매치 수정, 및/또는 표적의 일부가 될 유전자 정보를 재합성하는데 공여자가 사용되는 "합성-의존성 가닥 어닐링" 및/또는 관련된 과정을 포함할 수 있다. 이러한 특수화된 HR은 종종, 공여자 폴리뉴클레오티드의 서열의 일부 또는 전부가 표적 폴리뉴클레오티드 내로 혼입되도록 표적 분자의 서열의 변경을 일으킨다. HR-유도 통합을 위해, 공여자 분자는 적어도 50-100개 염기쌍 길이의 게놈에 대한 적어도 1개의 상동성 영역 ("상동성 아암")을 함유한다. 예를 들어, 미국 특허 공개 번호 20110281361을 참조한다.
본 개시내용의 방법에서, 본원에 기재된 1종 이상의 표적화 뉴클레아제는 미리 결정된 부위에서 표적 서열 (예를 들어, 세포 염색질)에 이중-가닥 파괴를 생성하고, 파괴 영역에서 뉴클레오티드 서열에 대한 상동성을 갖는 "공여자" 폴리뉴클레오티드가 세포 내로 도입될 수 있다. 이중-가닥 파괴의 존재는 공여자 서열의 통합을 용이하게 하는 것으로 밝혀졌다. 공여자 서열은 물리적으로 통합될 수 있거나, 또는 대안적으로, 공여자 폴리뉴클레오티드는 상동 재조합을 통한 파괴의 복구를 위한 주형으로 사용되어 공여자 내의 뉴클레오티드 서열의 전부 또는 일부의 세포 염색질 내로의 도입을 일으킨다. 따라서, 세포 염색질 내의 제1 서열은 변경될 수 있고, 특정 실시양태에서, 공여자 폴리뉴클레오티드에 존재하는 서열로 전환될 수 있다. 따라서, 용어 "교체하다" 또는 "교체"의 사용은 하나의 뉴클레오티드 서열의 또 다른 것에 의한 교체 (즉, 정보를 제공하는 의미에서 서열의 교체)를 나타내는 것으로 이해될 수 있고, 하나의 폴리뉴클레오티드의 또 다른 것에 의한 물리적 또는 화학적 교체를 반드시 필요로 하는 것은 아니다.
"절단"은 DNA 분자의 공유결합 백본의 파괴를 지칭한다. 절단은 포스포디에스테르 결합의 효소적 또는 화학적 가수분해를 포함하나 이에 제한되지는 않는 다양한 방법에 의해 개시될 수 있다. 단일-가닥 절단 및 이중-가닥 절단 둘 다가 가능하고, 이중-가닥 절단은 2개의 별개의 단일-가닥 절단 이벤트의 결과로서 발생할 수 있다. DNA 절단은 평활 말단 또는 스태거형 말단의 생산을 일으킬 수 있다. 특정 실시양태에서, 융합 폴리펩티드가 표적화 이중-가닥 DNA 절단에 사용된다.
본원에 사용된 용어 "플라스미드" 및 "벡터"는 세포의 중추적 대사의 일부가 아닌 1개 이상의 유전자(들)를 보유할 수 있는 염색체외 요소를 지칭한다. 플라스미드 및 벡터는 전형적으로 원형 이중-가닥 DNA 분자이다. 그러나, 플라스미드 및 벡터는 단일- 또는 이중-가닥 DNA 또는 RNA의 선형 또는 원형 핵산일 수 있고, 프로모터 단편 및 코딩 DNA 서열을 임의의 적절한 3' 비번역된 서열과 함께 세포 내로 도입할 수 있는 고유 구축 내로 다수의 뉴클레오티드 서열이 연결되거나 재조합된, 본질적으로 임의의 공급원으로부터 유래된 DNA를 보유할 수 있다. 예에서, 플라스미드 및 벡터는 박테리아 숙주에서의 전파를 위한 자율 복제 서열을 포함할 수 있다.
폴리펩티드 및 "단백질"은 본원에서 교환가능하게 사용되고, 펩티드 결합을 통해 연결된 2개 이상의 아미노산의 분자 쇄를 포함한다. 이들 용어가 특정 길이의 생성물을 지칭하는 것은 아니다. 따라서, "펩티드" 및 "올리고펩티드"는 폴리펩티드의 정의 내에 포함된다. 상기 용어는 폴리펩티드의 번역후 변형, 예를 들어 글리코실화, 아세틸화, 인산화 등을 포함한다. 추가로, 단백질 단편, 유사체, 돌연변이된 또는 변이체 단백질, 융합 단백질 등은 폴리펩티드의 의미 내에 포함된다. 상기 용어는 또한, 합성될 수 있거나 또는 공지된 단백질 조작 기술을 사용하여 재조합적으로 발현될 수 있는 1종 이상의 아미노산 유사체 또는 비-정규 또는 비천연 아미노산이 포함된 분자를 포함한다. 추가로, 본 발명의 융합 단백질은 널리 공지된 유기 화학 기술에 의해 본원에 기재된 바와 같이 유도체화될 수 있다.
용어 "융합 단백질"은 단백질이 1종 초과의 모 단백질 또는 폴리펩티드로부터 유래된 폴리펩티드 성분을 포함한다는 것을 나타낸다. 전형적으로, 융합 단백질은, 1종의 단백질로부터의 폴리펩티드 서열을 코딩하는 뉴클레오티드 서열이 상이한 단백질로부터의 폴리펩티드 서열을 코딩하는 뉴클레오티드 서열에 인 프레임으로 첨부되고, 임의로 링커에 의해 이로부터 분리되어 있는 융합 유전자로부터 발현된다. 이어서, 융합 유전자가 재조합 숙주 세포에 의해 단일 단백질로서 발현될 수 있다.
III. 본 발명의 실시양태
한 실시양태에서, 본 개시내용은 게놈 표적 부위 내의 폴리뉴클레오티드 공여자 서열의 부위 특이적 통합을 검출하기 위한 검정에 관한 것이다.
일부 실시양태에서, 게놈 DNA는 게놈 표적 부위 내의 폴리뉴클레오티드 공여자 서열의 부위 특이적 통합을 검출하기 위해 검정된다. 실시양태의 측면에서, 게놈 DNA는 염색체 게놈 DNA, 미토콘드리아 게놈 DNA, 전위 요소 게놈 DNA, 바이러스 통합으로부터 유도된 게놈 DNA, 인공 염색체 게놈 DNA (비제한적 예로서 본원에 포함되는 PCT/US2002/017451 및 PCT/US2008/056993 참조), 및 게놈 DNA의 다른 공급원을 포함한다.
일부 실시양태에서, 게놈 DNA는 폴리머라제 연쇄 반응 (PCR)을 통해 증폭된다. 실시양태의 측면에서, PCR은 일반적으로 클로닝 또는 정제 없이 게놈 DNA의 혼합물 중 표적 서열의 절편의 농도를 증가시키는 방법을 지칭한다 (미국 특허 번호 4,683,195; 4,683,202; 및 4,965,188; 본원에 참조로 포함됨). 표적 서열을 증폭시키기 위한 이 과정은 목적 표적 서열을 함유하는 DNA 혼합물에 과량의 2종의 올리고뉴클레오티드 프라이머를 도입시키는 것, 이어서 DNA 폴리머라제의 존재 하에서의 정확한 순서의 열 사이클링을 포함한다. 2종의 프라이머는 이중 가닥 표적 서열의 그의 각각의 가닥에 대해 상보적이다. 증폭을 일으키기 위해, 혼합물을 변성시키고, 이어서 프라이머를 표적 분자 내의 그의 상보적 서열에 어닐링한다. 어닐링 후, 새로운 쌍의 상보적 가닥이 형성되도록 프라이머는 폴리머라제로 연장된다. 변성, 프라이머 어닐링 및 폴리머라제 연장의 단계는 고농도의 목적 표적 서열의 증폭된 절편을 수득하기 위해 수회 반복될 수 있다 (즉, 변성, 어닐링 및 연장이 한 "사이클"을 구성하며; 다수의 "사이클"이 존재할 수 있다). 목적하는 표적 서열의 증폭된 절편의 길이는 서로에 대한 프라이머의 상대적 위치에 의해 결정되고, 따라서 상기 길이는 제어가능한 파라미터이다. 과정의 반복되는 측면으로 인에, 상기 방법은 "폴리머라제 연쇄 반응" (이하 "PCR")로 지칭된다. 표적 세포의 목적하는 증폭된 절편이 혼합물 내에서 우세한 서열 (농도 측면에서)이 되기 때문에, 이들은 "PCR 증폭된" 것으로 표현된다.
다른 실시양태에서, PCR 반응은 앰플리콘을 생산한다. 실시양태의 측면으로서, 앰플리콘은 한 쌍의 증폭 프라이머 중 어느 하나 또는 둘 다의 연장을 통해 생성된 증폭 반응의 생성물을 지칭한다. 앰플리콘은 이용된 프라이머 둘 다가 표적 서열에 혼성화되는 경우에 지수적으로 증폭된 핵산을 함유할 수 있다. 대안적으로, 앰플리콘은 이용된 프라이머 중 하나가 표적 서열에 혼성화되지 않는 경우에 선형 증폭에 의해 생성될 수 있다. 따라서, 상기 용어는 본원에서 일반적으로 사용되며, 반드시 지수적으로 증폭된 핵산의 존재를 의미하지는 않는다.
선택된 또는 표적, 핵산 서열의 증폭은 임의의 적합한 방법에 의해 수행될 수 있다. 일반적으로, 문헌 [Kwoh et al., Am. Biotechnol. Lab. 8, 14-25 (1990)]을 참조한다. 적합한 증폭 기술의 예는 폴리머라제 연쇄 반응, 리가제 연쇄 반응, 가닥 치환 증폭 (일반적으로 문헌 [G. Walker et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89, 392-396 (1992); G. Walker et al., Nucleic Acids Res. 20, 1691-1696 (1992)] 참조), 전사-기반 증폭 (문헌 [D. Kwoh et al., Proc. Natl. Acad Sci. USA 86, 1173-1177 (1989)] 참조), 자가-유지 서열 복제 (또는 "3SR") (문헌 [J. Guatelli et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87, 1874-1878 (1990)] 참조), Qβ 레플리카제 시스템 (문헌 [P. Lizardi et al., BioTechnology 6, 1197-1202 (1988)] 참조), 핵산 서열-기반 증폭 (또는 "NASBA") (문헌 [R. Lewis, Genetic Engineering News 12 (9), 1 (1992)] 참조), 복구 연쇄 반응 (또는 "RCR") (상기 문헌 [R. Lewis] 참조), 및 부메랑 DNA 증폭 (또는 "BDA") (상기 문헌 [R. Lewis] 참조)을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 폴리머라제 연쇄 반응이 일반적으로 바람직하다.
또 다른 실시양태에서, 게놈 DNA의 증폭은 프라이머를 사용한 PCR 반응을 통해 완성된다. 실시양태의 한 측면에서, 프라이머는 제1 세트의 프라이머, 제2 세트의 프라이머, 제3 세트의 프라이머 등을 포함할 수 있다. 이와 같은 명칭 "제1", "제2", "제3" 등은 프라이머 세트가 네스티드 PCR 반응에 사용된 순서를 나타낸다. 예를 들어, "제1" 세트의 프라이머는 PCR 폴리뉴클레오티드 서열을 증폭시키기 위한 제1 PCR 반응에서 처음에 사용된다. 그 다음, "제2" 세트의 프라이머가 제1 PCR 반응의 생성물을 증폭시키기 위한 제2 PCR 반응에서 사용된다. 이어서, "제3" 세트의 프라이머가 제2 PCR 반응의 생성물을 증폭시키기 위한 제3 PCR 반응에서 사용되는 등이다. 실시양태의 다른 측면에서, 프라이머는 게놈 DNA 표적 부위에 결합하도록 설계된 "아웃" 프라이머 또는 유기체의 게놈 내에 통합된 폴리뉴클레오티드 공여자 서열에 결합하도록 설계된 "인" 프라이머일 수 있다. 다른 실시양태에서, 제1 세트의 프라이머는 인 및 아웃 프라이머로 구성될 수 있거나, 또는 2개의 별개의 인 프라이머 또는 2개의 별개의 아웃 프라이머를 포함하도록 설계될 수 있다. 한 실시양태에서, 용어 프라이머는 적절한 증폭 완충제 중에서 증폭될 DNA 주형에 상보적인 올리고뉴클레오티드를 지칭한다. 특정 실시양태에서, 프라이머는 10 Bp 내지 100 Bp, 10 Bp 내지 50 Bp 또는 10 Bp 내지 25 Bp 길이일 수 있다.
본 개시내용의 한 실시양태에서, 인 프라이머는 아웃 프라이머보다 낮은 농도로 제공된다. 실시양태의 측면은 약 10:1, 9:1, 8:1, 7:1, 6:1, 5:1, 4:1, 3:1 또는 2:1의 아웃 프라이머 대 인 프라이머의 상대 농도를 포함한다. 또 다른 측면에서, 실시양태는 인 프라이머가 0.001, 0.005, 0.01, 0.02, 0.03, 0.04, 0.05, 0.06, 0.07, 0.008 또는 0.09 μM의 농도로 포함되고 아웃 프라이머가 적어도 0.1 μM의 농도로 포함되는 것을 포함한다. 추가 측면에서, 실시양태는 인 프라이머가 0.01, 0.02, 0.03, 0.04, 0.05, 0.06, 0.07, 0.08, 0.09, 0.1, 0.11 0.12, 0.13, 0.14, 0.15, 0.16, 0.17, 0.18 또는 0.19 μM의 농도로 포함되고 아웃 프라이머가 적어도 0.2 μM의 농도로 포함되는 것을 포함한다.
일부 실시양태에서, 게놈 통합 부위는 식물 게놈 DNA이다. 한 측면에서, 본 개시내용에 따라 형질전환되는 식물 세포는 쌍자엽 및 단자엽 식물 둘 다를 비롯한 임의의 고등 식물, 및 작물 식물을 비롯하여 특정하게 소비가능한 식물을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 이러한 식물은 예를 들어 알팔파, 대두, 목화, 평지씨 (또한 카놀라로 기재됨), 아마인, 콘, 벼, 브라키아리아, 밀, 홍화, 소르굼, 사탕무, 해바라기, 담배 및 터프 그래스를 포함할 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다. 따라서, 임의의 식물 종 또는 식물 세포가 선택될 수 있다. 실시양태에서, 본원에 사용된 식물 세포, 및 그로부터 성장 또는 유래된 식물은 평지씨 (브라시카 나푸스(Brassica napus)); 인도 머스타드 (브라시카 준세아(Brassica juncea)); 에티오피아 머스타드 (브라시카 카리나타(Brassica carinata)); 순무 (브라시카 라파(Brassica rapa)); 양배추 (브라시카 올레라세아(Brassica oleracea)); 대두 (글리신 맥스(Glycine max)); 아마인/아마 (리눔 우시타티시뭄(Linum usitatissimum)); 옥수수 (또한 콘으로 기재됨) (제아 메이스); 홍화 (카르타무스 틴크토리우스(Carthamus tinctorius)); 해바라기 (헬리안투스 안누스(Helianthus annuus)); 담배 (니코티아나 타바쿰(Nicotiana tabacum)); 아라비돕시스 탈리아나(Arabidopsis thaliana); 브라질 넛 (베톨레티아 엑셀사(Betholettia excelsa)); 피마자 (리시누스 콤뮤니스(Ricinus communis)); 코코넛 (코쿠스 누시페라(Cocus nucifera)); 코리안더 (코리안드룸 사티붐(Coriandrum sativum)); 목화 (고시피움(Gossypium) 아종); 땅콩 (아라키스 히포가에아(Arachis hypogaea)); 호호바 (심몬드시아 키넨시스(Simmondsia chinensis)); 기름 야자 (엘라에이스 구이니이스(Elaeis guineeis)); 올리브 (올레아 에우르파에아(Olea eurpaea)); 벼 (오리자 사티바(Oryza sativa)); 스쿼시 (쿠쿠르비타 막시마(Cucurbita maxima)); 보리 (호르데움 불가레(Hordeum vulgare)); 사탕수수 (사카룸 오피시나룸(Saccharum officinarum)); 벼 (오리자 사티바); 밀 (트리티쿰(Triticum) 아종, 예를 들어 트리티쿰 두룸(Triticum durum) 및 트리티쿰 아에스티붐(Triticum aestivum)); 및 좀개구리밥 (렘나세아에(Lemnaceae) 종)으로부터 수득가능한 세포를 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 일부 실시양태에서, 식물 종 내의 유전적 배경은 상이할 수 있다.
유전자 변형 식물의 생산에 관하여, 식물의 유전자 조작 방법은 관련 기술분야에 널리 공지되어 있다. 예를 들어, 쌍자엽 식물 뿐만 아니라 단자엽 식물에 대한 생물학적 및 생리적 형질전환 프로토콜을 비롯하여 식물 형질전환을 위한 다수의 방법이 개발되어 왔다 (예를 들어, 문헌 [Goto-Fumiyuki et al., Nature Biotech 17:282-286 (1999); Miki et al., Methods in Plant Molecular Biology and Biotechnology, Glick, B. R. and Thompson, J. E. Eds., CRC Press, Inc., Boca Raton, pp. 67-88 (1993)]). 추가로, 식물 세포 또는 조직 형질전환, 및 식물의 재생을 위한 벡터 및 시험관내 배양 방법은, 예를 들어 문헌 [Gruber et al., Methods in Plant Molecular Biology and Biotechnology, Glick, B. R. and Thompson, J. E. Eds., CRC Press, Inc., Boca Raton, pp. 89-119 (1993)]에서 이용가능하다.
식물 숙주 세포 내로 DNA를 삽입하는 다수의 기술이 이용가능하다. 이들 기술은 형질전환 작용제로서 아그로박테리움 투메파시엔스 또는 아그로박테리움 리조게네스를 사용한 비-아암 T-DNA에 의한 형질전환, 인산칼슘 형질감염, 폴리브렌 형질전환, 원형질체 융합, 전기천공, 초음파 방법 (예를 들어, 초음파천공), 리포솜 형질전환, 미세주사, 네이키드 DNA, 플라스미드 벡터, 바이러스 벡터, 바이오리스틱스 (마이크로입자 포격), 탄화규소 WHISKERS 매개 형질전환, 에어로졸 비밍, 또는 PEG 뿐만 아니라 다른 가능한 방법을 포함한다.
예를 들어, 식물 세포 원형질체의 전기천공 및 미세주사와 같은 기술을 사용하여 DNA 구축물을 식물 세포의 게놈 DNA 내로 직접 도입할 수 있거나, 또는 바이오리스틱 방법, 예컨대 DNA 입자 포격을 사용하여 DNA 구축물을 식물 조직으로 직접 도입할 수 있다 (예를 들어, 문헌 [Klein et al. (1987) Nature 327:70-73] 참조). 식물 세포 형질전환을 위한 추가의 방법은 탄화규소 WHISKERS 매개 DNA 흡수를 통한 미세주사를 포함한다 (Kaeppler et al. (1990) Plant Cell Reporter 9:415-418). 대안적으로, DNA 구축물은 나노입자 형질전환을 통해 식물 세포 내로 도입될 수 있다 (예를 들어, 전문이 본원에 참조로 포함되는 미국 특허 출원 번호 12/245,685 참조).
또 다른 공지된 식물 형질전환 방법은 미세발사체의 표면 상에서 DNA가 운반되는 미세발사체-매개 형질전환이다. 이 방법에서, 식물 세포 벽 및 막을 침투하기에 충분한 속도로 미세발사체를 가속화시키는 바이오리스틱 장치를 이용하여 발현 벡터를 식물 조직 내로 도입시킨다. Sanford et al., Part. Sci. Technol. 5:27 (1987), Sanford, J. C., Trends Biotech. 6:299 (1988), Sanford, J. C., Physiol. Plant 79:206 (1990), Klein et al., Biotechnology 10:268 (1992).
대안적으로, 유전자 전달 및 형질전환 방법은 염화칼슘 침전을 통한 원형질체 형질전환, 네이키드 DNA의 폴리에틸렌 글리콜 (PEG)-매개 또는 전기천공-매개 흡수 (문헌 [Paszkowski et al. (1984) EMBO J 3:2717-2722, Potrykus et al. (1985) Molec. Gen. Genet. 199:169-177; Fromm et al. (1985) Proc. Nat. Acad. Sci. USA 82:5824-5828; 및 Shimamoto (1989) Nature 338:274-276] 참조) 및 식물 조직의 전기천공 (D'Halluin et al. (1992) Plant Cell 4:1495-1505)을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다.
발현 벡터를 식물 내로 도입하기 위해 광범위하게 이용되는 방법은 아그로박테리움의 자연 형질전환 시스템에 기초한다. Horsch et al., Science 227:1229 (1985). 에이. 투메파시엔스 및 에이. 리조게네스는 식물 세포를 유전적으로 형질전환시키기에 유용한 것으로 공지된 식물 병원성 토양 박테리아이다. 에이. 투메파시엔스 및 에이. 리조게네스 각각의 Ti 및 Ri 플라스미드는 식물의 유전적 형질전환의 원인이 되는 유전자를 보유한다. Kado, C. I., Crit. Rev. Plant. Sci. 10:1 (1991). 아그로박테리움 벡터 시스템 및 아그로박테리움-매개 유전자 전달 방법에 관한 설명은 또한, 예를 들어 상기 문헌 [Gruber et al.], 상기 문헌 [Miki et al.], 문헌 [Moloney et al., Plant Cell Reports 8:238 (1989)], 및 미국 특허 번호 4,940,838 및 5,464,763에서 이용 가능하다.
아그로박테리움을 형질전환에 사용하는 경우에, 삽입시킬 DNA는 특수 플라스미드, 즉 중간 벡터 또는 이원 벡터 내로 클로되어야 한다. 중간 벡터는 그 자체가 아그로박테리움에서 복제될 수 없다. 중간 벡터는 헬퍼 플라스미드의 사용 (접합)에 의해 아그로박테리움 투메파시엔스 내로 전달될 수 있다. 재팬 토바코 슈퍼바이너리(Japan Tobacco Superbinary) 시스템은 이러한 시스템의 한 예이다 (문헌 [Komari et al., (2006) In: Methods in Molecular Biology (K. Wang, ed.) number 343: Agrobacterium Protocols (2nd Edition, Vol. 1) Humana Press Inc., Totowa, NJ, pp.15-41; 및 Komori et al., (2007) Plant Physiol. 145:1155-1160]에서 검토됨). 이원 벡터는 그 자체가 이. 콜라이(E. coli) 및 아그로박테리움 둘 다에서 복제될 수 있다. 이는 선택 마커 유전자, 및 우측 및 좌측 T-DNA 경계 영역에 의해 프레이밍되는 링커 또는 폴리링커를 포함한다. 이는 아그로박테리움 내로 직접 형질전환될 수 있다 (Holsters, 1978). 숙주 세포로서 사용된 아그로박테리움은 vir 영역을 보유하는 플라스미드를 포함해야 한다. Ti 또는 Ri 플라스미드는 또한 T-DNA의 전달에 필요한 vir 영역을 포함한다. vir 영역은 T-DNA를 식물 세포 내로 전달하는데 필요하다. 추가의 T-DNA가 함유될 수 있다.
아그로박테리움 투메파시엔스 숙주의 병독성 기능은, 세포가 이원 T DNA 벡터 (Bevan (1984) Nuc. Acid Res. 12:8711-8721) 또는 비-이원 T-DNA 벡터 절차 (Horsch et al. (1985) Science 227:1229-1231)를 사용하여 박테리아에 의해 감염되는 경우에, 구축물 및 인접 마커를 함유하는 T-가닥이 식물 세포 DNA 내로 삽입되도록 지시할 것이다. 일반적으로, 아그로박테리움 형질전환 시스템은 쌍자엽 식물을 조작하는데 사용된다 (Bevan et al. (1982) Ann. Rev. Genet 16:357-384; Rogers et al. (1986) Methods Enzymol. 118:627-641). 아그로박테리움 형질전환 시스템은 또한 DNA를 단자엽 식물 및 식물 세포로 형질전환시키는데, 뿐만 아니라 전달하는데 사용될 수 있다. 미국 특허 번호 5,591,616; 문헌 [Hernalsteen et al. (1984) EMBO J 3:3039-3041; Hooykass Van Slogteren et al. (1984) Nature 311:763-764; Grimsley et al. (1987) Nature 325:1677-179; Boulton et al. (1989) Plant Mol. Biol. 12:31-40; 및 Gould et al. (1991) Plant Physiol. 95:426-434]를 참조한다. 유전적 구축물을 특정한 식물 세포 내로 도입한 후, 식물 세포를 성장시킬 수 있고, 싹 및 뿌리와 같은 분화 조직의 출아 시에 성숙 식물이 생성될 수 있다. 일부 실시양태에서, 다수의 식물이 생성될 수 있다. 식물을 재생시키기 위한 방법론은 관련 기술부야의 통상의 기술자에게 공지되어 있고, 이는 예를 들어 문헌 [Plant Cell and Tissue Culture, 1994, Vasil and Thorpe Eds. Kluwer Academic Publishers 및 Plant Cell Culture Protocols (Methods in Molecular Biology 111, 1999 Hall Eds Humana Press)]에서 찾아볼 수 있다. 본원에 기재된 유전자 변형 식물은 발효 배지에서 배양하거나 또는 토양과 같은 적합한 매체에서 성장시킬 수 있다. 일부 실시양태에서, 고등 식물에 적합한 성장 매체는 식물을 위한 임의의 성장 매체, 예를 들어 비제한적으로 토양, 모래, 뿌리 성장을 지지하는 임의의 다른 미립자 매체 (예를 들어, 버미큘라이트, 펄라이트 등) 또는 수경재배 배양, 뿐만 아니라 적합한 빛, 물, 및 고등 식물의 성장을 최적화시키는 영양 보충제를 포함할 수 있다.
임의의 상기 형질전환 기술에 의해 생산된 형질전환된 식물 세포를 배양하여, 형질전환된 유전자형을 보유하고, 따라서 목적 표현형을 보유하는 전체 식물을 재생시킬 수 있다. 이러한 재생 기술은 조직 배양 성장 배지 내의 특정 피토호르몬의 조작에 의존하며, 전형적으로 목적 뉴클레오티드 서열과 함께 도입된 살생물제 및/또는 제초제 마커에 의존한다. 배양된 원형질체로부터의 식물 재생은 문헌 [Evans, et al., "Protoplasts Isolation and Culture" in Handbook of Plant Cell Culture, pp. 124-176, Macmillian Publishing Company, New York, 1983; 및 Binding, Regeneration of Plants, Plant Protoplasts, pp. 21-73, CRC Press, Boca Raton, 1985]에 기재되어 있다. 식물 캘러스, 외식편, 기관, 화분, 배아 또는 그의 부분으로부터 재생이 또한 수득될 수 있다. 이러한 재생 기술은 일반적으로 문헌 [Klee et al. (1987) Ann. Rev. of Plant Phys. 38:467-486]에 기재되어 있다.
다른 실시양태에서, 형질전환된 식물 세포는 식물을 생산하기 위해 재생될 수 없다. 이러한 세포는 일시적으로 형질전환된 것으로 표현된다. 일시적으로 형질전환된 세포는 특정 트랜스진의 발현 및/또는 기능성을 검정하기 위해 생산될 수 있다. 일시적 형질 전환 기술은 관련 기술분야에 공지되어 있고, 상기 기재된 형질전환 기술에 대한 작은 변형을 포함한다. 일시적 형질전환은 신속하게 완료되며 안정한 형질전환 기술만큼 많은 방책 (예를 들어, 전체 식물의 발달을 위한 식물의 배양, 자가-수정 또는 게놈 내의 트랜스진의 고정을 위한 식물의 교배 등)을 필요로 하지 않기 때문에, 관련 기술분야의 통상의 기술자는 특정 트랜스진의 발현 및/또는 기능성을 신속하게 검정하기 위해 일시적 형질전환의 이용을 선택할 수 있다.
한 실시양태에서, 공여자 폴리뉴클레오티드는 본질적으로 임의의 식물 내로 도입될 수 있다. 매우 다양한 식물 및 식물 세포 시스템이 본 개시내용의 공여자 폴리뉴클레오티드의 부위 특이적 통합 및 상기 언급된 다양한 형질전환 방법을 위해 조작될 수 있다. 한 실시양태에서, 조작하기 위한 표적 식물 및 식물 세포는 단자엽 및 쌍자엽 식물, 예컨대 작물, 예를 들어 곡실 작물 (예를 들어, 밀, 옥수수, 벼, 기장, 보리), 과일 작물 (예를 들어, 토마토, 사과, 배, 딸기, 오렌지), 사료 작물 (예를 들어, 알팔파), 뿌리 채소 작물 (예를 들어, 당근, 감자, 사탕무, 참마), 잎 채소 작물 (예를 들어, 상추, 시금치); 현화 식물 (예를 들어, 페튜니아, 장미, 국화), 침엽수 및 소나무 (예를 들어, 전나무, 가문비나무); 식물환경복원에 사용되는 식물 (예를 들어, 중금속 축적 식물); 오일 작물 (예를 들어, 해바라기, 평지씨) 및 실험 목적으로 사용되는 식물 (예를 들어, 아라비돕시스)를 포함하나, 이에 제한되지는 않는다.
다른 실시양태에서, 폴리뉴클레오티드 공여자 서열은 게놈 표적 부위 내의 부위 특이적 표적화를 위해 식물 세포 내로 도입된다. 이러한 실시양태에서, 식물 세포는 원형질체 식물 세포일 수 있다. 원형질체는 다양한 유형의 식물 세포로부터 생산될 수 있다. 따라서, 관련 기술분야의 통상의 기술자는 원형질체 식물 세포를 생산하기 위해 다양한 기술 또는 방법론을 이용할 수 있다. 예를 들어, 원형질체의 생성 및 생산은 문헌 [Green and Phillips, Crop Sc., 15 (1975) 417-421; Harms et al. Z. Pflanzenzuechtg., 77 (1976) 347-351]; 유럽 특허 출원 EP-0,160,390, Lowe and Smith (1985); EP-0,176,162, Cheng (1985); 및 EP-0,177,738, Close (1985); 문헌 [Cell Genetics in Higher Plants, Dudits et al., (eds), Akademiai Kiado, Budapest (1976) 129-140 및 그의 참고문헌; Harms, "Maize and Cereal Protoplasts-Facts and Perspectives," Maize for Biological Research, W. F. Sheridan, ed. (1982); Dale, in: Protoplasts (1983); Potrykus et al. (eds.) Lecture Proceedings, Experientia Supplementum 46, Potrykus et al., eds, Birkhauser, Basel (1983) 31-41 및 그의 참고문헌]에 제공된다. 배양된 원형질체로부터의 식물 재생은 문헌 [Evans et al. (1983) "Protoplast Isolation and Culture," Handbook of Plant Cell Cultures 1, 124-176 (MacMillan Publishing Co., New York; Davey (1983) "Recent Developments in the Culture and Regeneration of Plant Protoplasts," Protoplasts, pp. 12-29, (Birkhauser, Basel); Dale (1983) " Protoplast Culture and Plant Regeneration of Cereals and Other Recalcitrant Crops," Protoplasts pp. 31-41, (Birkhauser, Basel); Binding (1985) "Regeneration of Plants," Plant Protoplasts, pp. 21-73, (CRC Press, Boca Raton, FL)]에 기재되어 있다.
표적 부위의 선택; ZFP 및 융합 단백질 (및 이를 코딩하는 폴리뉴클레오티드)의 설계 및 구축 방법은 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 공지되어 있으며, 미국 특허 번호 6,140,081; 5,789,538; 6,453,242; 6,534,261; 5,925,523; 6,007,988; 6,013,453; 6,200,759; WO 95/19431; WO 96/06166; WO 98/53057; WO 98/54311; WO 00/27878; WO 01/60970 WO 01/88197; WO 02/099084; WO 98/53058; WO 98/53059; WO 98/53060; WO 02/016536 및 WO 03/016496에 상세하게 기재되어 있다.
후속 실시양태에서, 1개 이상의 DNA 결합 서열을 포함하는 DNA 결합 도메인은 아연 핑거 결합 단백질, 메가뉴클레아제 결합 단백질, CRIPSR 또는 TALEN 결합 단백질에 의해 결합된다.
특정 실시양태에서, 본원에 기재된 조성물 및 방법은 공여자 분자에 대한 결합 및/또는 세포의 게놈 내의 관심 영역에 대한 결합을 위해 메가뉴클레아제 (귀소 엔도뉴클레아제) 결합 단백질 또는 메가뉴클레아제 DNA-결합 도메인을 이용한다. 자연-발생 메가뉴클레아제는 15-40개의 염기-쌍 절단 부위를 인식하고, 통상적으로 4개의 패밀리로 분류된다: LAGLIDADG 패밀리, GIY-YIG 패밀리, His-Cyst 박스 패밀리 및 HNH 패밀리. 예시적인 귀소 엔도뉴클레아제는 I-SceI, I-CeuI, PI-PspI, PI-Sce, I-SceIV, I-CsmI, I-PanI, I-SceII, I-PpoI, I-SceIII, I-CreI, I-TevI, I-TevII 및 I-TevIII를 포함한다. 이들의 인식 서열은 공지되어 있다. 또한, 미국 특허 번호 5,420,032; 미국 특허 번호 6,833,252; 문헌 [Belfort et al. (1997) Nucleic Acids Res. 25:3379-3388; Dujon et al. (1989) Gene 82:115-118; Perler et al. (1994) Nucleic Acids Res. 22, 1125-1127; Jasin (1996) Trends Genet. 12:224-228; Gimble et al. (1996) J. Mol. Biol. 263:163-180; Argast et al. (1998) J. Mol. Biol. 280:345-353 및 the New England Biolabs catalogue]를 참조한다.
특정 실시양태에서, 본원에 기재된 방법 및 조성물은 조작된 (비-자연 발생) 귀소 엔도뉴클레아제 (메가뉴클레아제)를 포함하는 뉴클레아제를 사용한다. 귀소 엔도뉴클레아제 및 메가뉴클레아제, 예컨대 I-SceI, I-CeuI, PI-PspI, PI-Sce, I-SceIV, I-CsmI, I-PanI, I-SceII, I-PpoI, I-SceIII, I-CreI, I-TevI, I-TevII 및 I-TevIII의 인식 서열은 공지되어 있다. 또한, 미국 특허 번호 5,420,032; 미국 특허 번호 6,833,252; 문헌 [Belfort et al. (1997) Nucleic Acids Res. 25:3379-3388; Dujon et al. (1989) Gene 82:115-118; Perler et al. (1994) Nucleic Acids Res. 22, 1125-1127; Jasin (1996) Trends Genet. 12:224-228; Gimble et al. (1996) J. Mol. Biol. 263:163-180; Argast et al. (1998) J. Mol. Biol. 280:345-353 및 the New England Biolabs catalogue]를 참조한다. 추가로, 귀소 엔도뉴클레아제 및 메가뉴클레아제의 DNA-결합 특이성은 비-천연 표적 부위에 결합하도록 조작될 수 있다. 예를 들어, 문헌 [Chevalier et al. (2002) Molec. Cell 10:895-905; Epinat et al. (2003) Nucleic Acids Res. 31:2952-2962; Ashworth et al. (2006) Nature 441:656-659; Paques et al. (2007) Current Gene Therapy 7:49-66]; 미국 특허 공개 번호 20070117128을 참조한다. 귀소 엔도뉴클레아제 및 메가뉴클레아제의 DNA-결합 도메인은 전체적으로 뉴클레아제의 맥락에서 (즉, 뉴클레아제가 동족 절단 도메인을 포함하도록) 변경될 수 있다.
다른 실시양태에서, 본원에 기재된 방법 및 조성물에 사용되는 1종 이상의 뉴클레아제의 DNA-결합 도메인은 자연 발생 또는 조작된 (비-자연 발생) TAL 이펙터 DNA 결합 도메인을 포함한다. 예를 들어, 전문이 본원에 참조로 포함되는 미국 특허 공개 번호 20110301073을 참조한다. 크산토모나스(Xanthomonas) 속의 식물 병원성 박테리아는 중요한 작물 식물에서 많은 질병을 야기하는 것으로 공지되어 있다. 크산토모나스의 병원성은 25종 초과의 상이한 이펙터 단백질을 식물 세포 내로 주입하는 보존된 유형 III 분비 (T3S) 시스템에 의존한다. 이들 주입된 단백질 중에는 식물 전사 활성화제를 모방하고 식물 트랜스크립톰을 조작하는 전사 활성화제-유사 (TAL) 이펙터가 존재한다 (문헌 [Kay et al. (2007) Science 318:648-651] 참조). 이들 단백질은 DNA 결합 도메인 및 전사 활성화 도메인을 함유한다. 대부분의 잘 특성화된 TAL-이펙터 중 1종은 크산토모나스 캄페스트그리스 병원형 베시카토리아(Xanthomonas campestgris pv. Vesicatoria)로부터의 AvrBs3이다 (문헌 [Bonas et al. (1989) Mol Gen Genet 218: 127-136] 및 WO2010079430 참조). TAL-이펙터는 탠덤 반복부의 집중된 도메인을 함유하고, 각각의 반복부는 이들 단백질의 DNA 결합 특이성에 핵심적인 대략 34개의 아미노산을 함유한다. 추가로, 이들은 핵 국재화 서열 및 산성 전사 활성화 도메인을 함유한다 (검토에 대해서는, 문헌 [Schornack S, et al. (2006) J Plant Physiol 163(3): 256-272] 참조). 추가로, 식물병원성 박테리아 랄스토니아 솔라나세아룸(Ralstonia solanacearum), 알. 솔라나세아룸 생물변이형 1 균주 GMI1000 및 생물변이형 4 균주 RS1000에서 크산토모나스의 AvrBs3 패밀리에 상동성인 brg11 및 hpx17로 지정된 2개의 유전자가 발견되었다 (문헌 [Heuer et al. (2007) Appl and Envir Micro 73(13): 4379-4384] 참조). 이들 유전자는 서로 뉴클레오티드 서열이 98.9% 동일하지만, hpx17의 반복 도메인 내의 1,575 bp의 결실에서 상이하다. 그러나, 유전자 생성물 둘 다는 크산토모나스의 AvrBs3 패밀리 단백질과 40% 미만의 서열 동일성을 갖는다. 예를 들어, 전문이 본원에 참조로 포함되는 미국 특허 공개 번호 20110239315, 20110145940 및 20110301073을 참조한다.
이들 TAL 이펙터의 특이성은 탠덤 반복부에서 발견되는 서열에 따라 달라진다. 반복된 서열은 대략 102 bp를 포함하고, 반복부는 전형적으로 서로에 대해 91-100% 상동성이다 (상기 동일 문헌 [Bonas et al.]). 반복부의 다형성은 통상적으로 위치 12 및 13에 위치하고, 위치 12 및 13의 초가변 이잔기의 정체와 TAL-이펙터의 표적 서열 내의 인접 뉴클레오티드의 정체 사이에 1:1 대응이 존재하는 것으로 보인다 (문헌 [Moscou and Bogdanove, (2009) Science 326:1501 및 Boch et al. (2009) Science 326:1509-1512] 참조). 실험에 의해, 이들 TAL-이펙터의 DNA 인식을 위한 천연 코드는 위치 12 및 13의 HD 서열이 시토신 (C)에 결합하고, NG가 T에 결합하고, NI가 A, C, G 또는 T에 결합하고, NN이 A 또는 G에 결합하고, ING가 T에 결합하도록 결정되었다. 이들 DNA 결합 반복부는, 새로운 서열과 상호작용하고 식물 세포 내에서 비-내인성 리포터 유전자의 발현을 활성화시킬 수 있는 인공 전사 인자를 제조하기 위해 새로운 조합 및 반복부의 수를 갖는 단백질로 조립되었다 (상기 동일 문헌 [Boch et al.]). 조작된 TAL 단백질은 효모 리포터 검정 (플라스미드 기반 표적)에서 활성을 나타내는 TAL 이펙터 도메인 뉴클레아제 융합체 (TALEN)를 수득하기 위해 FokI 절단 절반 도메인에 연결되었다. 예를 들어, 미국 특허 공개 번호 20110301073; Christian et al. ((2010)< Genetics epub 10.1534/genetics.110.120717)을 참조한다.
다른 실시양태에서, 뉴클레아제는 CRISPR (클러스터링된 규칙적 간격의 짧은 회문식 반복부)/Cas (CRISPR 연관) 뉴클레아제 시스템을 포함하는 시스템이다. CRISPR/Cas는 게놈 조작을 위해 사용될 수 있는 박테리아 시스템을 기반으로 하는 최근 조작된 뉴클레아제 시스템이다. 이는 많은 박테리아 및 고세균의 적응 면역 반응의 일부를 기반으로 한다. 바이러스 또는 플라스미드가 박테리아에 침입하면, 침입자의 DNA의 절편은 '면역' 반응에 의해 CRISPR RNA (crRNA)로 전환된다. 이어서, 이러한 crRNA는 부분 상보성의 영역을 통해, 포토스페이서 인접 모티프 (PAM) NGG 다음의 표적 DNA 내의 crRNA에 상동성인 영역으로 Cas9 뉴클레아제를 가이드하기 위해 tracrRNA로 불리는 또 다른 유형의 RNA와 회합된다. Cas9는 crRNA 전사체 내에 함유된 20-뉴클레오티드 가이드 서열에 의해 특정된 부위에서 DSB에서 평활 말단을 생성하기 위해 DNA를 절단한다. Cas9는 부위 특이적 DNA 인식 및 절단을 위해 crRNA 및 tracrRNA 둘 다를 필요로 한다. 상기 시스템은 본 발명에 이르러 crRNA 및 tracrRNA가 하나의 분자 ("단일 가이드 RNA")로 조합될 수 있도록 조작되었고, 단일 가이드 RNA의 crRNA 동등 부분은 PAM에 인접한 표적 임의의 목적 서열로 Cas9 뉴클레아제를 가이드하도록 조작될 수 있다 (문헌 [Jinek et al. (2012) Science 337, p. 816-821, Jinek et al., (2013), eLife 2:e00471, 및 David Segal, (2013) eLife 2:e00563] 참조). 따라서, CRISPR/Cas 시스템은 게놈 내의 목적 표적에서 DSB를 생성하기 위해 조작될 수 있고, DSB의 복구는 오류 유발 복구의 증가를 유발하기 위한 복구 억제제의 사용에 의해 영향받을 수 있다.
특정 실시양태에서, 세포의 게놈의 생체내 절단 및/또는 표적화 절단을 위해 사용되는 1종 이상의 뉴클레아제의 DNA 결합 도메인은 아연 핑거 단백질을 포함한다. 바람직하게는, 아연 핑거 단백질은 선택 표적 부위에 결합하도록 조작되었다는 점에서 비-자연 발생적이다. 예를 들어, 문헌 [Beerli et al. (2002) Nature Biotechnol. 20:135-141; Pabo et al. (2001) Ann. Rev. Biochem. 70:313-340; Isalan et al. (2001) Nature Biotechnol. 19:656-660; Segal et al. (2001) Curr. Opin. Biotechnol. 12:632-637; Choo et al. (2000) Curr. Opin. Struct. Biol. 10:411-416]; 미국 특허 번호 6,453,242; 6,534,261; 6,599,692; 6,503,717; 6,689,558; 7,030,215; 6,794,136; 7,067,317; 7,262,054; 7,070,934; 7,361,635; 7,253,273; 및 미국 특허 공개공보 번호 2005/0064474; 2007/0218528; 2005/0267061을 참조하며, 이들 모두는 그 전문이 본원에 참조로 포함된다.
조작된 아연 핑거 결합 도메인은 자연-발생 아연 핑거 단백질과 비교하여 신규한 결합 특이성을 가질 수 있다. 조작 방법은 합리적 설계 및 다양한 유형의 선택을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 합리적 설계는, 예를 들어 삼중 (또는 사중) 뉴클레오티드 서열 및 개별 아연 핑거 아미노산 서열을 포함하는 데이터베이스의 사용을 포함하며, 여기서 각각의 삼중 또는 사중 뉴클레오티드 서열은 특정한 삼중 또는 사중 서열에 결합하는 아연 핑거의 1종 이상의 아미노산 서열과 회합된다. 예를 들어, 전문이 본원에 참조로 포함되는 공동 소유의 미국 특허 6,453,242 및 6,534,261을 참조한다.
파지 디스플레이 및 2-하이브리드 시스템을 비롯한 예시적인 선택 방법이 미국 특허 5,789,538; 5,925,523; 6,007,988; 6,013,453; 6,410,248; 6,140,466; 6,200,759; 및 6,242,568; 뿐만 아니라 WO 98/37186; WO 98/53057; WO 00/27878; WO 01/88197 및 GB 2,338,237에 개시되어 있다. 추가로, 아연 핑거 결합 도메인에 대한 결합 특이성의 증진은 예를 들어 공동 소유의 WO 02/077227에 기재된 바 있다.
추가로, 이들 및 다른 참고문헌에 개시된 바와 같이, 아연 핑거 도메인 및/또는 다중-핑거의 아연 핑거 단백질은 예를 들어 5개 이상의 아미노산 길이의 링커를 포함하는 임의의 적합한 링커 서열을 사용하여 함께 연결될 수 있다. 또한, 6개 이상의 아미노산 길이의 예시적인 링커 서열에 대해서는 미국 특허 번호 6,479,626; 6,903,185; 및 7,153,949를 참조한다. 본원에 기재된 단백질은 단백질의 개별 아연 핑거 사이의 적합한 링커의 임의의 조합을 포함할 수 있다.
조성물, 특히 트랜스진을 보유하는 공여자 분자의 생체내 절단에 유용한 뉴클레아제 및 트랜스진이 표적화 방식으로 게놈 내로 통합되도록 하는 세포의 게놈의 절단을 위한 뉴클레아제가 본원에 기재된다. 특정 실시양태에서, 1종 이상의 뉴클레아제는 자연 발생된다. 다른 실시양태에서, 1종 이상의 뉴클레아제는 비-자연 발생되며, 즉 DNA-결합 도메인 및/또는 절단 도메인에서 조작된다. 예를 들어, 자연-발생 뉴클레아제의 DNA-결합 도메인은 선택된 표적 부위에 결합하도록 변경될 수 있다 (예를 들어, 동족 결합 부위와 상이한 부위에 결합하도록 조작된 메가뉴클레아제). 다른 실시양태에서, 뉴클레아제는 이종 DNA-결합 및 절단 도메인 (예를 들어, 아연 핑거 뉴클레아제; TAL-이펙터 도메인 DNA 결합 단백질; 이종 절단 도메인을 갖는 메가뉴클레아제 DNA-결합 도메인)을 포함한다.
임의의 적합한 절단 도메인은 뉴클레아제를 형성하기 위해 DNA-결합 도메인에 작동적으로 연결될 수 있다. 예를 들어, ZFP DNA-결합 도메인은 뉴클레아제 도메인에 융합되어 ZFN - 그의 조작된 (ZFP) DNA 결합 도메인을 통해 그의 의도된 핵산 표적을 인식하고 뉴클레아제 활성을 통해 ZFP 결합 부위 부근에서 DNA를 절단할 수 있는 기능적 개체를 생성하였다. 예를 들어, 문헌 [Kim et al. (1996) Proc Natl Acad Sci USA 93(3):1156-1160]을 참조한다. 보다 최근에, ZFN은 다양한 유기체에서 게놈 변형을 위해 사용된 바 있다. 예를 들어, 미국 특허 공개 20030232410; 20050208489; 20050026157; 20050064474; 20060188987; 20060063231; 및 국제 공개 WO 07/014275를 참조한다. 마찬가지로, TALE DNA-결합 도메인은 뉴클레아제 도메인에 융합되어 TALEN을 생성하였다. 예를 들어, 미국 공개 번호 20110301073을 참조한다.
상기 나타낸 바와 같이, 절단 도메인은 DNA-결합 도메인, 예를 들어 아연 핑거 DNA-결합 도메인 및 뉴클레아제로부터의 절단 도메인 또는 TALEN DNA-결합 도메인 및 절단 도메인, 또는 메가뉴클레아제 DNA-결합 도메인 및 상이한 뉴클레아제로부터의 절단 도메인에 이종성일 수 있다. 이종 절단 도메인은 특정한 엔도뉴클레아제 또는 엑소뉴클레아제로부터 수득될 수 있다. 절단 도메인이 유래될 수 있는 예시적인 엔도뉴클레아제는 제한 엔도뉴클레아제 및 귀소성 엔도뉴클레아제를 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 예를 들어, 문헌 [2002-2003 Catalogue, New England Biolabs, Beverly, MA; 및 Belfort et al. (1997) Nucleic Acids Res. 25:3379-3388]을 참조한다. DNA를 절단하는 추가의 효소가 공지되어 있다 (예를 들어, S1 뉴클레아제; 녹두 뉴클레아제; 췌장 DNase I; 미크로코쿠스 뉴클레아제; 효모 HO 엔도뉴클레아제; 또한, 문헌 [Linn et al. (eds.) Nucleases, Cold Spring Harbor Laboratory Press,1993] 참조). 이들 효소 (또는 그의 기능적 단편) 중 1종 이상이 절단 도메인 및 절단 절반-도메인의 공급원으로 사용될 수 있다.
유사하게, 절단 절반-도메인은 상기 제시된 바와 같이, 절단 활성을 위해 이량체화를 필요로 하는 임의의 뉴클레아제 또는 그의 일부로부터 유래될 수 있다. 일반적으로, 융합 단백질이 절단 절반-도메인을 포함하는 경우에 2개의 융합 단백질이 절단에 필요하다. 대안적으로, 2개의 절단 절반-도메인을 포함하는 단일 단백질이 사용될 수 있다. 2개의 절단 절반-도메인이 동일한 엔도뉴클레아제 (또는 그의 기능적 단편)로부터 유래될 수 있거나, 또는 각각의 절단 절반-도메인이 상이한 엔도뉴클레아제 (또는 그의 기능적 단편)로부터 유래될 수 있다. 추가로, 2개의 융합 단백질의 각각의 표적 부위에 대한 결합이 절단 절반-도메인들을 서로에 대해 공간 배향으로 위치시켜 절단 절반-도메인들이 예를 들어 이량체화에 의해 기능적 절단 도메인을 형성하도록, 2개의 융합 단백질에 대한 표적 부위들은 바람직하게는 서로에 대해 배치된다. 따라서, 특정 실시양태에서, 표적 부위의 가까운 가장자리는 5-8개의 뉴클레오티드 또는 15-18개의 뉴클레오티드에 의해 분리된다. 그러나, 임의의 정수 개의 뉴클레오티드 또는 뉴클레오티드 쌍이 2개의 표적 부위 사이에 개재될 수 있다 (예를 들어, 2 내지 50개 또는 그 초과의 뉴클레오티드 쌍). 일반적으로, 절단 부위는 표적 부위 사이에 존재한다.
제한 엔도뉴클레아제 (제한 효소)는 많은 종에 존재하고, DNA에 서열-특이적으로 결합할 수 있고 (인식 부위에서), 결합 부위에서 또는 그 부근에서 DNA를 절단할 수 있다. 특정 제한 효소 (예를 들어, 유형 IIS)는 인식 부위에서 떨어진 부위에서 DNA를 절단하고, 분리가능한 결합 및 절단 도메인을 갖는다. 예를 들어, 유형 IIS 효소 Fok I은 하나의 가닥 상의 인식 부위로부터 9개의 뉴클레오티드, 및 다른 가닥 상의 인식 부위로부터 13개의 뉴클레오티드에서 DNA의 이중-가닥 절단을 촉매한다. 예를 들어, US 특허 5,356,802; 5,436,150 및 5,487,994; 뿐만 아니라 문헌 [Li et al. (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:4275-4279; Li et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:2764-2768; Kim et al. (1994a) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:883-887; Kim et al. (1994b) J. Biol. Chem. 269:31,978-31,982]을 참조한다. 따라서, 한 실시양태에서, 융합 단백질은 적어도 1종의 유형 IIS 제한 효소로부터의 절단 도메인 (또는 절단 절반-도메인), 및 조작되거나 조작되지 않을 수 있는 1개 이상의 아연 핑거 결합 도메인을 포함한다.
절단 도메인이 결합 도메인으로부터 분리가능한 예시적인 유형 IIS 제한 효소는 Fok I이다. 상기 특정한 효소는 이량체로서 활성이다. Bitinaite et al. (1998) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95: 10,570-10,575. 따라서, 본 개시내용의 목적을 위해, 개시된 융합 단백질에 사용된 Fok I 효소의 부분은 절단 절반-도메인으로 간주된다. 따라서, 아연 핑거-Fok I 융합체를 사용한 표적화 이중-가닥 절단 및/또는 DNA 서열의 표적화 교체를 위해, 각각 FokI 절단 절반-도메인을 포함하는 2개의 융합 단백질이 촉매 활성 절단 도메인을 재구성하기 위해 사용될 수 있다. 대안적으로, 아연 핑거 결합 도메인 및 2개의 Fok I 절단 절반-도메인을 함유하는 단일 폴리펩티드 분자가 또한 사용될 수 있다. 아연 핑거-Fok I 융합체를 사용한 표적화 절단 및 표적화 서열 변경을 위한 파라미터는 본 개시내용의 다른 곳에서 제공된다.
절단 도메인 또는 절단 절반-도메인은 절단 활성을 보유하거나 또는 기능적 절단 도메인을 형성하기 위해 다량체화 (예를 들어, 이량체화)하는 능력을 보유하는 단백질의 임의의 부분일 수 있다.
예시적인 유형 IIS 제한 효소는 전문이 본원에 포함되는 국제 공개 WO 07/014275에 기재되어 있다. 추가의 제한 효소가 또한 분리가능한 결합 및 절단 도메인을 함유하고, 이들은 본 개시내용에서 고려된다. 예를 들어, 문헌 [Roberts et al. (2003) Nucleic Acids Res. 31:418-420]을 참조한다.
특정 실시양태에서, 절단 도메인은, 예를 들어 미국 특허 공개 번호 20050064474; 20060188987; 20070305346 및 20080131962 (이들 모두의 개시내용은 그 전문이 본원에 참조로 포함됨)에 기재된 바와 같이 동종이량체화를 최소화하거나 또는 방지하는 1개 이상의 조작된 절단 절반-도메인 (이량체화 도메인 돌연변이체로도 지칭됨)을 포함한다. Fok I의 위치 446, 447, 479, 483, 484, 486, 487, 490, 491, 496, 498, 499, 500, 531, 534, 537, 및 538의 아미노산 잔기는 모두 Fok I 절단 절반-도메인의 이량체화에 영향을 주기 위한 표적이다.
절대적 이종이량체를 형성하는 Fok I의 예시적인 조작된 절단 절반-도메인은 제1 절단 절반-도메인이 Fok I의 위치 490 및 538의 아미노산 잔기에서의 돌연변이를 포함하고 제2 절단 절반-도메인이 아미노산 잔기 486 및 499에서의 돌연변이를 포함하는 쌍을 포함한다.
따라서, 한 실시양태에서, 490에서의 돌연변이는 Glu (E)를 Lys (K)로 교체하고; 538에서의 돌연변이는 Iso (I)를 Lys (K)로 교체하고; 486에서의 돌연변이는 Gln (Q)를 Glu (E)로 교체하고; 위치 499에서의 돌연변이는 Iso (I)를 Lys (K)로 교체한다. 구체적으로, 본원에 기재된 조작된 절단 절반-도메인은 "E490K:I538K"로 지정된 조작된 절단 절반-도메인을 생산하기 위해 하나의 절단 절반-도메인에서 위치 490 (E→K) 및 538 (I→K)을 돌연변이시키고, "Q486E:I499L"로 지정된 조작된 절단 절반-도메인을 생산하기 위해 또 다른 절단 절반-도메인에서 위치 486 (Q→E) 및 499 (I→L)를 돌연변이시킴으로써 제조하였다. 본원에 기재된 조작된 절단 절반-도메인은 비정상적 절단이 최소화되거나 또는 제거된 절대적 이종이량체 돌연변이체이다. 예를 들어, 미국 특허 공개 번호 2008/0131962를 참조하며, 그의 개시내용은 모든 목적을 위해 그 전문이 참조로 포함된다. 특정 실시양태에서, 조작된 절단 절반-도메인은 위치 486, 499 및 496 (야생형 FokI에 대해 넘버링됨)에서의 돌연변이, 예를 들어 위치 486의 야생형 Gln (Q) 잔기를 Glu (E) 잔기로, 위치 499의 야생형 Iso (I) 잔기를 Leu (L) 잔기로, 위치 496의 야생형 Asn (N) 잔기를 Asp (D) 또는 Glu (E) 잔기로 교체한 돌연변이 (각각 "ELD" 및 "ELE" 도메인으로도 지칭됨)를 포함한다. 다른 실시양태에서, 조작된 절단 절반-도메인은 위치 490, 538 및 537 (야생형 FokI에 대해 넘버링됨)에서의 돌연변이, 예를 들어 위치 490의 야생형 Glu (E) 잔기를 Lys (K) 잔기로, 위치 538의 야생형 Iso (I) 잔기를 Lys (K) 잔기로, 위치 537의 야생형 His (H) 잔기를 Lys (K) 잔기 또는 Arg (R) 잔기로 교체한 돌연변이 (각각 "KKK" 및 "KKR" 도메인으로도 지칭됨)를 포함한다. 다른 실시양태에서, 조작된 절단 절반-도메인은 위치 490 및 537 (야생형 FokI에 대해 넘버링됨)에서의 돌연변이, 예를 들어 위치 490의 야생형 Glu (E) 잔기를 Lys(K) 잔기로, 위치 537의 야생형 His (H) 잔기를 Lys (K) 잔기 또는 Arg (R) 잔기로 교체한 돌연변이 (각각 "KIK" 및 "KIR" 도메인으로도 지칭됨)를 포함한다. (미국 특허 공개 번호 20110201055 참조). 다른 실시양태에서, 조작된 절단 절반 도메인은 "Sharkey" 및/또는 "Sharkey'" 돌연변이를 포함한다 (문헌 [Guo et al., (2010) J. Mol. Biol. 400(1):96-107] 참조).
본원에 기재된 조작된 절단 절반-도메인은 임의의 적합한 방법을 사용하여, 예를 들어 미국 특허 공개 번호 20050064474; 20080131962; 및 20110201055에 기재된 바와 같은 야생형 절단 절반-도메인 (Fok I)의 부위-지정 돌연변이유발에 의해 제조될 수 있다.
대안적으로, 뉴클레아제는 소위 "분할-효소" 기술을 사용하여 핵산 표적 부위에서 생체내에서 조립될 수 있다 (예를 들어, 미국 특허 공개 번호 20090068164 참조). 이러한 분할 효소의 성분은 별개의 발현 구축물 상에서 발현될 수 있거나, 또는 개별 성분이 예를 들어 자가-절단 2A 펩티드 또는 IRES 서열에 의해 분리되는 1개의 오픈 리딩 프레임에 연결될 수 있다. 성분은 개별 아연 핑거 결합 도메인 또는 메가뉴클레아제 핵산 결합 도메인의 도메인일 수 있다.
뉴클레아제는 예를 들어 WO 2009/042163 및 20090068164에 기재된 바와 같은 효모-기반 염색체 시스템에서 사용 전에 활성에 대해 스크리닝될 수 있다. 뉴클레아제 발현 구축물은 관련 기술분야에 공지된 방법을 사용하여 용이하게 설계될 수 있다. 예를 들어, 미국 특허 공개 20030232410; 20050208489; 20050026157; 20050064474; 20060188987; 20060063231; 및 국제 공개 WO 07/014275를 참조한다. 뉴클레아제의 발현은 구성적 프로모터 또는 유도성 프로모터, 예를 들어 라피노스 및/또는 갈락토스의 존재 하에 활성화되고 (탈억제되고) 글루코스의 존재 하에 억제되는 갈락토키나제 프로모터의 제어 하에 이루어질 수 있다.
한 실시양태에서, 폴리뉴클레오티드 공여자 카세트는 펩티드를 코딩하는 서열을 포함한다. 펩티드의 발현을 위해, 펩티드 서열을 코딩하는 뉴클레오티드 서열은 전형적으로 전사를 지시하는 프로모터를 함유하는 발현 벡터 내로 서브클로닝된다. 적합한 박테리아 및 진핵 프로모터는 관련 기술분야에 널리 공지되어 있고, 예를 들어 문헌 [Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual (2nd ed. 1989; 3rd ed., 2001); Kriegler, Gene Transfer and Expression: A Laboratory Manual (1990); 및 Current Protocols in Molecular Biology (Ausubel et al., supra.)]에 기재되어 있다. 펩티드의 발현을 위한 박테리아 발현 시스템은, 예를 들어 이. 콜라이, 바실루스(Bacillus) 종 및 살모넬라(Salmonella)에서 이용가능하다 (Palva et al., Gene 22:229-235 (1983)). 상기 발현 시스템을 위한 키트는 상업적으로 입수가능하다. 포유동물 세포, 효모 및 곤충 세포를 위한 진핵생물 발현 시스템은 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 널리 공지되어 있고, 또한 상업적으로 입수가능하다.
한 실시양태에서, 폴리뉴클레오티드 공여자 카세트는 트랜스진을 포함하는 유전자 발현 카세트를 포함한다. 유전자 발현 카세트는 전형적으로 원핵 또는 진핵의 숙주 세포에서의 핵산 발현에 필요한 모든 추가의 요소들을 함유하는 전사 단위 또는 발현 카세트를 함유한다. 따라서, 전형적인 유전자 발현 카세트는, 예를 들어 단백질을 코딩하는 핵산 서열에 작동가능하게 연결된 프로모터, 및 필요한 신호, 예를 들어 전사체의 효율적인 폴리아데닐화, 전사 종결, 리보솜 결합 부위 또는 번역 종결에 필요한 신호를 함유한다. 카세트의 추가의 요소는 예를 들어 인핸서 및 이종 스플라이싱 신호를 포함할 수 있다.
한 실시양태에서, 유전자 발현 카세트는 또한 관심 이종 뉴클레오티드 서열의 3' 말단에 식물에서 기능성인 전사 및 번역 종결 영역을 포함할 것이다. 종결 영역은 본 개시내용의 실시양태의 프로모터 뉴클레오티드 서열 그대로일 수 있거나, 관심 DNA 서열 그대로일 수 있거나, 또는 또 다른 공급원으로부터 유래될 수 있다. 편리한 종결 영역은 에이. 투메파시엔스의 Ti-플라스미드, 예컨대 옥토핀 신타제 및 노팔린 신타제 (nos) 종결 영역으로부터 이용가능하며 (Depicker et al., Mol. and Appl. Genet. 1:561-573 (1982) 및 Shaw et al. (1984) Nucleic Acids Research vol. 12, No. 20 pp7831-7846(nos)); 또한 문헌 [Guerineau et al. Mol. Gen. Genet. 262:141-144 (1991); Proudfoot, Cell 64:671-674 (1991); Sanfacon et al. Genes Dev. 5:141-149 (1991); Mogen et al. Plant Cell 2:1261-1272 (1990); Munroe et al. Gene 91:151-158 (1990); Ballas et al. Nucleic Acids Res. 17:7891-7903 (1989); Joshi et al. Nucleic Acid Res. 15:9627-9639 (1987)]을 참조한다.
다른 실시양태에서, 유전자 발현 카세트는 5' 리더 서열을 추가로 함유할 수 있다. 이러한 리더 서열은 번역을 증진시키는 작용을 할 수 있다. 번역 리더는 관련 기술분야에 공지되어 있고, 예로서 피코르나바이러스 리더, EMCV 리더 (뇌심근염 5' 비코딩 영역) (Elroy-Stein et al. Proc. Nat. Acad. Sci. USA 86:6126-6130 (1989)); 포티바이러스 리더, 예를 들어, TEV 리더 (담배 식각 바이러스) (Carrington and Freed, Journal of Virology, 64: 1590-1597 (1990)), MDMV 리더 (옥수수 위축 모자이크 바이러스) (Allison et al., Virology 154:9-20 (1986)); 인간 이뮤노글로불린 중쇄 결합 단백질 (BiP) (Macejak et al. Nature 353:90-94 (1991)); 알팔파 모자이크 바이러스의 코트 단백질 mRNA로부터의 비번역된 리더 (AMV RNA 4) (Jobling et al. Nature 325:622-625 (1987)); 담배 모자이크 바이러스 리더 (TMV) (Gallie et al. (1989) Molecular Biology of RNA, pages 237-256); 및 옥수수 황백화 얼룩 바이러스 리더 (MCMV) (Lommel et al. Virology 81:382-385 (1991))를 포함한다. 또한 문헌 [Della-Cioppa et al. Plant Physiology 84:965-968 (1987)]을 참조한다. 또한, 구축물은 번역 및/또는 mRNA 안정성을 증진시키는 서열, 예컨대 인트론을 함유할 수 있다. 이러한 인트론의 한 예는 아라비돕시스 탈리아나(Arabidopsis thaliana)의 히스톤 H3.III 변이체의 유전자 II의 제1 인트론이다. Chaubet et al. Journal of Molecular Biology, 225:569-574 (1992).
한 실시양태에서, 폴리뉴클레오티드 공여자 서열의 유전자 발현 카세트는 프로모터를 포함한다. 펩티드 코딩 핵산의 발현을 지시하기 위해 사용되는 프로모터는 특정한 용도에 따라 달라진다. 예를 들어, 숙주 세포에 적합한 강한 구성적 프로모터는 전형적으로 단백질의 발현 및 정제에 사용된다. 바람직한 식물 프로모터의 비제한적 예는 에이. 탈리아나 유비퀴틴-10 (ubi-10) (Callis, et al., 1990, J. Biol. Chem., 265:12486-12493); 에이. 투메파시엔스 만노핀 신타제 (Δmas) (Petolino et al., 미국 특허 번호 6,730,824); 및/또는 카사바 베인 모자이크 바이러스 (CsVMV) (Verdaguer et al., 1996, Plant Molecular Biology 31:1129-1139)로부터 유래된 프로모터 서열을 포함한다.
본원에 개시된 방법에서, 식물에서 유전자의 발현을 지시하는 다수의 프로모터가 사용될 수 있다. 이러한 프로모터는 구성적, 화학적-조절, 유도성, 조직-특이적, 및 종자-우선 프로모터로부터 선택될 수 있다.
구성적 프로모터는 예를 들어 코어 콜리플라워 모자이크 바이러스 35S 프로모터 (Odell et al. (1985) Nature 313:810-812); 벼 액틴 프로모터 (McElroy et al. (1990) Plant Cell 2:163-171); 옥수수 유비퀴틴 프로모터 (미국 특허 번호 5,510,474; 문헌 [Christensen et al. (1989) Plant Mol. Biol. 12:619-632 및 Christensen et al. (1992) Plant Mol. Biol. 18:675-689]); pEMU 프로모터 (Last et al. (1991) Theor. Appl. Genet. 81:581-588); ALS 프로모터 (미국 특허 번호 5,659,026); 옥수수 히스톤 프로모터 (Chaboute et al. Plant Molecular Biology, 8: 179-191 (1987)) 등을 포함한다.
이용가능한 식물 상용성 프로모터의 범위는 조직 특이적 및 유도성 프로모터를 포함한다. 유도성 조절 요소는 유도인자에 반응하여 1종 이상의 DNA 서열 또는 유전자의 전사를 직접 또는 간접적으로 활성화시킬 수 있는 것이다. 유도인자의 부재 하에, DNA 서열 또는 유전자는 전사되지 않을 것이다. 전형적으로, 전사를 활성화시키기 위해 유도성 조절 요소에 특이적으로 결합하는 단백질 인자는 불활성 형태로 존재하고, 이어서 유도인자에 의해 활성 형태로 직접 또는 간접적으로 전환된다. 유도인자는 화학적 작용제, 예컨대 단백질, 대사물, 성장 조절제, 제초제 또는 페놀계 화합물, 또는 열, 추위, 염, 또는 독성 요소에 의해 직접적으로 또는 병원체 또는 질병원, 예컨대 바이러스의 작용을 통해 간접적으로 부가되는 생리학적 스트레스일 수 있다. 전형적으로, 전사를 활성화시키기 위해 유도성 조절 요소에 특이적으로 결합하는 단백질 인자는 불활성 형태로 존재하고, 이어서 유도인자에 의해 활성 형태로 직접 또는 간접적으로 전환된다. 유도인자는 화학적 작용제, 예컨대 단백질, 대사물, 성장 조절제, 제초제 또는 페놀계 화합물, 또는 열, 추위, 염, 또는 독성 요소에 의해 직접적으로 또는 병원체 또는 질병원, 예컨대 바이러스의 작용을 통해 간접적으로 부가되는 생리학적 스트레스일 수 있다. 유도성 조절 요소를 함유하는 식물 세포는 예컨대 분무, 살수, 가열 또는 유사한 방법에 의해 유도인자를 세포 또는 식물에 외부에서 적용함으로써 유도인자에 노출될 수 있다.
임의의 유도성 프로모터가 본 개시내용의 실시양태에 사용될 수 있다. 문헌 [Ward et al. Plant Mol. Biol. 22: 361-366 (1993)]을 참조한다. 예시적인 유도성 프로모터는 엑디손 수용체 프로모터 (미국 특허 번호 6,504,082); 구리에 반응하는 ACE1 시스템으로부터의 프로모터 (Mett et al. PNAS 90: 4567-4571 (1993)); 벤젠술폰아미드 제초제 완화제에 반응하는 옥수수로부터의 In2-1 및 In2-2 유전자 (미국 특허 번호 5,364,780; 문헌 [Hershey et al., Mol. Gen. Genetics 227: 229-237 (1991) 및 Gatz et al., Mol. Gen. Genetics 243: 32-38 (1994)]); Tn10으로부터의 Tet 리프레서 (Gatz et al., Mol. Gen. Genet. 227: 229-237 (1991)); 또는 전사 활성이 글루코코르티코스테로이드 호르몬에 의해 유도되는 스테로이드 호르몬 유전자로부터의 프로모터 (Schena et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 88: 10421 (1991) 및 McNellis et al., (1998) Plant J. 14(2):247-257); 출아전 제초제로서 사용되는 소수성 친전자성 화합물에 의해 활성화되는 옥수수 GST 프로모터 (미국 특허 번호 5,965,387 및 국제 특허 출원, 공개 번호 WO 93/001294 참조); 및 살리실산에 의해 활성화되는 담배 PR-1a 프로모터 (문헌 [Ono S, Kusama M, Ogura R, Hiratsuka K., "Evaluation of the Use of the Tobacco PR-1a Promoter to Monitor Defense Gene Expression by the Luciferase Bioluminescence Reporter System," Biosci Biotechnol Biochem. 2011 Sep 23;75(9):1796-800] 참조)를 포함한다. 관심 대상의 다른 화학물질-조절 프로모터는 테트라시클린-유도성 및 테트라시클린-억제성 프로모터를 포함한다 (예를 들어, 문헌 [Gatz et al., (1991) Mol. Gen. Genet. 227:229-237], 및 미국 특허 번호 5,814,618 및 5,789,156 참조).
관심 대상의 다른 조절성 프로모터는 각각 추위 또는 열에 대한 노출에 반응하여 전사가 일어날 수 있는 추위 반응성 조절 요소 또는 열 충격 조절 요소 (Takahashi et al., Plant Physiol. 99:383-390, 1992); 혐기성 조건에 의해 유도가능한 알콜 데히드로게나제 유전자의 프로모터 (Gerlach et al., PNAS USA 79:2981-2985 (1982); Walker et al., PNAS 84(19):6624-6628 (1987)); 및 완두콩 rbcS 유전자 또는 완두콩 psaDb 유전자로부터 유래된 광-유도성 프로모터 (Yamamoto et al. (1997) Plant J. 12(2):255-265); 광-유도성 조절 요소 (Feinbaum et al., Mol. Gen. Genet. 226:449, 1991; Lam and Chua, Science 248:471, 1990; Matsuoka et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90(20):9586-9590; Orozco et al. (1993) Plant Mol. Bio. 23(6): 1129-1138); 식물 호르몬 유도성 조절 요소 (Yamaguchi-Shinozaki et al., Plant Mol. Biol. 15:905, 1990; Kares et al., Plant Mol. Biol. 15:225, 1990) 등을 포함한다. 유도성 조절 요소는 또한 벤젠술폰아미드 제초제 완화제에 반응하는 옥수수 In2-1 또는 In2-2 유전자의 프로모터 (Hershey et al., Mol. Gen. Gene, 227:229-237, 1991; Gatz et al., Mol. Gen. Genet. 243:32-38, 1994), 및 트랜스포손 Tn10의 Tet 리프레서 (Gatz et al., Mol. Gen. Genet. 227:229-237, 1991)일 수 있다. 스트레스 유도성 프로모터는 염/물 스트레스-유도성 프로모터, 예컨대 P5CS (Zang et al. (1997) Plant Sciences 129:81-89); 추위-유도성 프로모터, 예컨대 cor15a (Hajela et al. (1990) Plant Physiol. 93:1246-1252), cor15b (Wilhelm et al. (1993) Plant Mol Biol 23: 1073-1077), wsc120 (Ouellet et al. (1998) FEBS Lett. 423-324-328), ci7 (Kirch et al. (1997) Plant Mol Biol. 33:897-909), ci21A (Schneider et al. (1997) Plant Physiol. 113:335-45); 가뭄-유도성 프로모터, 예컨대 Trg-31 (Chaudhary et al. (1996) Plant Mol. Biol. 30:1247-57), rd29 (Kasuga et al. (1999) Nature Biotechnology 18:287-291); 삼투압 유도성 프로모터, 예컨대 Rab17 (Vilardell et al. (1991) Plant Mol. Biol. 17:985-93) 및 오스모틴 (Raghothama et al. (1993) Plant Mol Biol 23:1117-28); 열 유도성 프로모터, 예컨대 열 충격 단백질 (Barros et al. (1992) Plant Mol. 19:665-75; Marrs et al. (1993) Dev. Genet. 14:27-41), smHSP (Waters et al. (1996) J. Experimental Botany 47:325-338), 및 파슬리 유비퀴틴 프로모터로부터의 열 충격 유도성 요소 (WO 03/102198)를 포함한다. 다른 스트레스-유도성 프로모터는 rip2 (미국 특허 번호 5,332,808 및 미국 공개 번호 2003/0217393) 및 rd29a (Yamaguchi-Shinozaki et al. (1993), Mol. Gen. Genetics 236:331-340)를 포함한다. 아그로박테리움 pMAS 프로모터 (Guevara-Garcia et al. (1993) Plant J. 4(3):495-505) 및 아그로박테리움 ORF13 프로모터 (Hansen et al., (1997) Mol. Gen. Genet. 254(3):337-343)를 비롯한 특정 프로모터는 상처에 의해 유도가능하다.
조직-우선 프로모터는 특정한 식물 조직 내의 증진된 전사 및/또는 발현을 표적화하기 위해 이용될 수 있다. 우선적 발현이 언급되는 경우, 이는 다른 식물 조직에서보다 특정한 식물 조직에서 더 높은 수준으로 발현되는 것을 의미한다. 이들 유형의 프로모터의 예는 종자 우선 발현, 예컨대 파세올린 프로모터 (Bustos et al.1989. The Plant Cell Vol. 1, 839-853) 및 옥수수 글로불린-1 유전자 (Belanger, et al. 1991 Genetics 129:863-972)에 의해 제공되는 것을 포함한다. 쌍자엽 식물의 경우, 종자-우선 프로모터는 콩 β-파세올린, 나핀, β-콘글리시닌, 대두 렉틴, 크루시페린 등을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 단자엽 식물의 경우, 종자-우선 프로모터는 옥수수 15 kDa 제인, 22 kDa 제인, 27 kDa 제인, γ-제인, 왁시, 슈렁큰 1, 슈렁큰 2, 글로불린 1 등을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 종자-우선 프로모터는 또한 종자 내의 특정 조직에 우세하게 유전자 발현을 지시하는 프로모터, 예컨대 예를 들어 γ-제인의 내배유-우선 프로모터, 담배로부터의 잠재 프로모터 (Fobert et al. 1994. T-DNA tagging of a seed coat-specific cryptic promoter in tobacco. Plant J. 4: 567-577), 콘으로부터의 P-유전자 프로모터 (Chopra et al. 1996. Alleles of the maize P gene with distinct tissue specificities encode Myb-homologous proteins with C-terminal replacements. Plant Cell 7:1149-1158, Erratum in Plant Cell.1997, 1:109), 콘으로부터의 글로불린-1 프로모터 (Belenger and Kriz.1991. Molecular basis for Allelic Polymorphism of the maize Globulin-1 gene. Genetics 129: 863-972), 및 종피 또는 콘 커넬의 껍질에 대한 발현을 지시하는 프로모터, 예를 들어 과피-특이적 글루타민 신테타제 프로모터 (Muhitch et al.,2002. Isolation of a Promoter Sequence From the Glutamine Synthetase1-2 Gene Capable of Conferring Tissue-Specific Gene Expression in Transgenic Maize. Plant Science 163:865-872)를 포함한다.
유전자 발현 카세트는 5' 리더 서열을 함유할 수 있다. 이러한 리더 서열은 번역을 증진시키는 작용을 할 수 있다. 번역 리더는 관련 기술분야에 공지되어 있고, 예로서 피코르나바이러스 리더, EMCV 리더 (뇌심근염 5' 비코딩 영역) (Elroy-Stein et al. Proc. Nat. Acad. Sci. USA 86:6126-6130 (1989)); 포티바이러스 리더, 예를 들어, TEV 리더 (담배 식각 바이러스) (Carrington and Freed, Journal of Virology, 64: 1590-1597 (1990)), MDMV 리더 (옥수수 위축 모자이크 바이러스) (Allison et al., Virology 154:9-20 (1986)); 인간 이뮤노글로불린 중쇄 결합 단백질 (BiP) (Macejak et al. Nature 353:90-94 (1991)); 알팔파 모자이크 바이러스의 코트 단백질 mRNA의 비번역된 리더 (AMV RNA 4) (Jobling et al. Nature 325:622-625 (1987)); 담배 모자이크 바이러스 리더 (TMV) (Gallie et al. (1989) Molecular Biology of RNA, pages 237-256); 및 옥수수 황백화 얼룩 바이러스 리더 (MCMV) (Lommel et al. Virology 81:382-385 (1991))를 포함한다. 또한 문헌 [Della-Cioppa et al. Plant Physiology 84:965-968 (1987)]을 참조한다.
구축물은 또한 번역 및/또는 mRNA 안정성을 증진시키는 서열, 예컨대 인트론을 함유할 수 있다. 이러한 인트론의 한 예는 아라비돕시스 탈리아나의 히스톤 H3.III 변이체의 유전자 II의 제1 인트론이다. Chaubet et al. Journal of Molecular Biology, 225:569-574 (1992).
특정한 소기관, 특히 색소체, 전분체, 또는 세포질 세망으로 지시되거나 또는 세포의 표면 또는 세포외로 분비되는 이종 뉴클레오티드 서열의 발현 생성물을 갖는 것이 바람직한 경우에, 발현 카세트는 통과 펩티드에 대한 코딩 서열을 추가로 포함할 수 있다. 이러한 통과 펩티드는 관련 기술분야에 널리 공지되어 있으며, 아실 운반체 단백질, RUBISCO의 작은 서브유닛, 식물 EPSP 신타제 및 헬리안투스 안누스(Helianthus annuus)에 대한 통과 펩티드 (Lebrun et al. US 특허 5,510,417 참조), 제아 메이스 브리틀(Brittle)-1 엽록체 통과 펩티드 (Nelson et al. Plant Physiol 117(4): 1235-1252 (1998); Sullivan et al. Plant Cell 3(12):1337-48; Sullivan et al., Planta (1995) 196(3):477-84; Sullivan et al., J. Biol. Chem. (1992) 267(26): 18999-9004) 등을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 추가로, 키메라 엽록체 통과 펩티드, 예컨대 최적화 통과 펩티드가 관련 기술분야에 널리 공지되어 있다 (미국 특허 번호 5,510,471 참조). 추가의 엽록체 통과 펩티드는 미국 특허 번호 5,717,084; 5,728,925에 이전에 기재된 바 있다. 통상의 기술자는 생성물을 특정한 소기관에서 발현시키는데 이용가능한 많은 옵션을 용이하게 인식할 것이다. 예를 들어, 보리 알파 아밀라제 서열은 종종 세포질 세망에서의 발현을 유도하기 위해 사용된다. Rogers, J. Biol. Chem. 260:3731-3738 (1985).
한 실시양태에서, 폴리뉴클레오티드 공여자 카세트는 트랜스진을 포함한다. 본원의 일부 실시양태는 유전자 발현 카세트를 포함하는 폴리펩티드를 코딩하는 트랜스진을 제공한다. 이러한 트랜스진은 트랜스제닉 식물을 생산하기 위한 임의의 매우 다양한 적용에서 유용할 수 있다. 유전자 발현 카세트를 포함하는 트랜스진의 특정한 예는 본원의 예시적 목적을 위해 제공되고, 형질 유전자, RNAi 유전자 또는 리포터/선택 마커 유전자를 포함하는 유전자 발현을 포함한다.
식물에서의 발현을 위해 유전자를 조작할 때, 유망한 숙주 식물(들)의 코돈 바이어스는, 예를 들어 식물 게놈의 코돈 분포 또는 다양한 식물 유전자의 단백질 코딩 영역에 대한 정보를 찾기 위한 공중 이용가능한 DNA 서열 데이터베이스를 사용하여 결정될 수 있다. 최적화된 (예를 들어, 식물-최적화된) DNA 서열이 종이 상에 설계되거나 또는 인 실리코 설계되면, 실제 DNA 분자는 서열이 설계된 서열에 정확하게 대응하도록 실험실에서 합성될 수 있다. 이러한 합성 핵산 분자(들)은 정확하게 이들이 자연 또는 천연 공급원으로부터 유래된 경우와 같이 클로닝되고 달리 조작될 수 있다.
한 실시양태에서, 발현될 트랜스진이 본원에 개시된다. 유전자 발현 카세트는 리포터/선택 마커 유전자, 형질 유전자 또는 RNAi 유전자를 포함할 수 있다. 선택 마커 유전자, 형질 유전자 및 RNAi 유전자의 예는 하기에 추가로 제공된다. 본원에 개시된 방법은 이들이 트랜스진의 단백질 생성물의 특정 기능 또는 다른 기능에 의존하지 않는 배선 형질전환체를 선택하는 방법을 제공한다는 점에서 유리하다.
해충 또는 질병에 대한 저항성을 부여하는 트랜스진 또는 코딩 서열
(A) 식물 질병 저항성 유전자. 식물 방어는 종종, 식물 내의 질병 저항성 유전자 (R)의 생성물과 병원체 내의 상응하는 비병원성 (Avr) 유전자의 생성물 사이의 특이적 상호작용에 의해 활성화된다. 식물 품종을 클로닝된 저항성 유전자로 형질전환시켜, 특정 병원체 균주에 저항성인 식물을 조작할 수 있다. 이러한 유전자의 예는 클라도스포리움 풀붐(Cladosporium fulvum)에 대한 저항성의 경우, 토마토 Cf-9 유전자 (Jones et al., 1994 Science 266:789); 슈도모나스 시린가에(Pseudomonas syringae) 병원형 토마토에 대한 저항성의 경우, 단백질 키나제를 코딩하는 토마토 Pto 유전자 (Martin et al., 1993 Science 262:1432); 및 슈도모나스 시린가에에 대한 저항성의 경우, 아라비돕시스 RSSP2 유전자 (Mindrinos et al., 1994 Cell 78:1089)를 포함한다.
(B) 바실루스 투린기엔시스(Bacillus thuringiensis) 단백질, 그의 유도체, 또는 이를 모델로 한 합성 폴리펩티드, 예컨대 Bt δ-내독소 유전자의 뉴클레오티드 서열 (Geiser et al., 1986 Gene 48:109), 및 영양 살곤충 (VIP) 유전자 (예를 들어, 문헌 [Estruch et al. (1996) Proc. Natl. Acad. Sci. 93:5389-94] 참조). 더욱이, δ-내독소 유전자를 코딩하는 DNA 분자는 ATCC 수탁 번호 40098, 67136, 31995 및 31998 하에 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션(American Type Culture Collection) (메릴랜드주 록빌)으로부터 구입할 수 있다.
(C) 렉틴, 예컨대 여러 클리비아 미니아타(Clivia miniata) 만노스-결합 렉틴 유전자의 뉴클레오티드 서열 (Van Damme et al., 1994 Plant Molec. Biol. 24:825).
(D) 곤충 해충에 대한 살유충제로서 유용한 비타민 결합 단백질, 예컨대 아비딘 및 아비딘 동족체. 미국 특허 번호 5,659,026을 참조한다.
(E) 효소 억제제, 예를 들어 프로테아제 억제제 또는 아밀라제 억제제. 이러한 유전자의 예는 벼 시스테인 프로테이나제 억제제 (Abe et al., 1987 J. Biol. Chem. 262:16793), 담배 프로테이나제 억제제 I (Huub et al., 1993 Plant Molec. Biol. 21:985), 및 α-아밀라제 억제제 (Sumitani et al., 1993 Biosci. Biotech. Biochem. 57:1243)를 포함한다.
(F) 곤충-특이적 호르몬 또는 페로몬, 예컨대 엑디스테로이드 및 유충 호르몬, 그의 변이체, 그에 기초한 모방체, 또는 그의 길항제 또는 효능제, 예컨대 유충 호르몬의 불활성인자인, 클로닝된 유충 호르몬 에스테라제의 바큘로바이러스 발현 (Hammock et al., 1990 Nature 344:458).
(G) 발현 시에, 침범한 해충의 생리학을 교란시키는 곤충-특이적 펩티드 또는 뉴로펩티드 (J. Biol. Chem. 269:9). 이러한 유전자의 예는 곤충 이뇨 호르몬 수용체 (Regan, 1994), 디플로프테라 푼크타타(Diploptera punctata)에서 확인된 알로스타틴 (Pratt, 1989), 및 곤충-특이적, 마비성 신경독소 (미국 특허 번호 5,266,361)를 포함한다.
(H) 뱀, 말벌 등에 의해 자연에서 생산된 곤충-특이적 독, 예컨대 전갈 곤충독성 펩티드 (Pang, 1992 Gene 116:165).
(I) 모노테르펜, 세스퀴테르펜, 스테로이드, 히드록삼산, 페닐프로파노이드 유도체 또는 살곤충 활성을 갖는 또 다른 비-단백질 분자의 과축적을 일으키는 효소.
(J) 생물학적 활성 분자의 변형 (번역후 변형 포함)에 관여하는 효소; 예를 들어, 천연이든 합성이든 관계없이, 당분해 효소, 단백질분해 효소, 지질분해 효소, 뉴클레아제, 시클라제, 트랜스아미나제, 에스테라제, 히드롤라제, 포스파타제, 키나제, 포스포릴라제, 폴리머라제, 엘라스타제, 키티나제 및 글루카나제. 이러한 유전자의 예는 callas 유전자 (PCT 공개 출원 WO93/02197), 키티나제-코딩 서열 (이는 예를 들어 수탁 번호 3999637 및 67152 하에 ATCC로부터 수득할 수 있음), 담배 구충 키티나제 (Kramer et al., 1993 Insect Molec. Biol. 23:691), 및 파슬리 ubi4-2 폴리유비퀴틴 유전자 (Kawalleck et al., 1993 Plant Molec. Biol. 21:673)를 포함한다.
(K) 신호 전달을 자극하는 분자. 이러한 분자의 예는 녹두 칼모듈린 cDNA 클론에 대한 뉴클레오티드 서열 (Botella et al., 1994 Plant Molec. Biol. 24:757) 및 옥수수 칼모듈린 cDNA 클론의 뉴클레오티드 서열 (Griess et al., 1994 Plant Physiol. 104:1467)을 포함한다.
(L) 소수성 모멘트 펩티드. 미국 특허 번호 5,659,026 및 5,607,914를 참조하며; 후자는 질병 저항성을 부여하는 합성 항미생물 펩티드를 교시한다.
(M) 막 퍼미아제, 채널 형성제 또는 채널 차단제 , 예컨대 트랜스제닉 담배 식물이 슈도모나스 솔라나세아룸(Pseudomonas solanacearum)에 대해 저항성이 되도록 하는 세크로핀-β 용해 펩티드 유사체 (Jaynes et al., 1993 Plant Sci. 89:43).
(N) 바이러스-침습성 단백질 또는 그로부터 유래된 복합 독소. 예를 들어, 형질전환된 식물 세포에스의 바이러스 코트 단백질의 축적은, 코트 단백질 유전자가 유래되는 바이러스 뿐만 아니라 관련 바이러스에 의한 바이러스 감염 및/또는 그에 의해 유발된 질병 발생에 대한 저항성을 부여한다. 코트 단백질-매개 저항성은 알팔파 모자이크 바이러스, 오이 모자이크 바이러스, 담배 줄무늬 바이러스, 감자 바이러스 X, 감자 바이러스 Y, 담배 식각 바이러스, 담배 얼룩무늬 바이러스 및 담배 모자이크 바이러스에 대해 형질전환된 식물에 부여되어 왔다. 예를 들어 문헌 [Beachy et al. (1990) Ann. Rev. Phytopathol. 28:451]을 참조한다.
(O) 곤충-특이적 항체 또는 그로부터 유래된 면역독소. 따라서, 곤충 장에서의 결정적 대사 기능을 표적화하는 항체는 침범된 효소를 불활성화시켜 곤충을 사멸시킬 것이다. 예를 들어, 문헌 [Taylor et al. (1994) Abstract #497, Seventh Int'l. Symposium on Molecular Plant-Microbe Interactions]에는 단일-쇄 항체 단편의 생산을 통한 트랜스제닉 담배에서의 효소적 불활성화가 제시되어 있다.
(P) 바이러스-특이적 항체. 예를 들어, 재조합 항체 유전자를 발현하는 트랜스제닉 식물이 바이러스 공격으로부터 보호된다는 것을 제시하는 문헌 [Tavladoraki et al. (1993) Nature 266:469]을 참조한다.
(Q) 병원체 또는 기생충에 의해 자연에서 생산된 발달-정지 단백질. 따라서, 진균 엔도 α-1,4-D 폴리갈락투로나제는 식물 세포벽 호모-α-1,4-D-갈락투로나제를 가용화시킴으로써 진균 콜로니화 및 식물 영양소 방출을 촉진시킨다 (Lamb et al., 1992) Bio/Technology 10:1436. 콩 엔도폴리갈락투로나제-억제 단백질을 코딩하는 유전자의 클로닝 및 특성화는 문헌 [Toubart et al. (1992 Plant J. 2:367)]에 기재되어 있다.
(R) 식물에 의해 자연에서 생산된 발달-정지 단백질, 예컨대 진균성 질병에 대한 증가된 저항성을 제공하는 보리 리보솜-불활성화 유전자 (Longemann et al., 1992). Bio/Technology 10:3305.
(S) RNA 분자를 사용하여 표적 유전자의 발현을 억제하는 RNA 간섭. 한 예에서 RNA 분자는 부분 또는 완전 이중 가닥이고, 이는 침묵화 반응을 촉발하여 dsRNA를 소형 간섭 RNA로 절단하고, 이어서 이는 상동 mRNA를 파괴하는 표적화 복합체 내로 혼입된다. 예를 들어, US 특허 6,506,559 (Fire et al.); 6,573,099 (Graham et al.)를 참조한다.
제초제에 대한 저항성을 부여하는 유전자
(A) 생장점 또는 분열조직을 억제하는 제초제, 예컨대 이미다잘리논, 술폰아닐리드 또는 술포닐우레아 제초제에 대한 저항성 또는 내성을 코딩하는 유전자. 이 카테고리 내의 예시적인 유전자는 AHAS 효소 (Miki et al., 1990 Theor. Appl. Genet. 80:449)로도 공지된 돌연변이체 ALS 효소 (Lee et al., 1988 EMBOJ. 7:1241)를 코딩한다.
(B) 돌연변이체 EPSP 신타제 및 aroA 유전자에 의해, 또는 유전자, 예컨대 GAT (글리포세이트 아세틸트랜스퍼라제) 또는 GOX (글리포세이트 옥시다제) 및 다른 포스포노 화합물, 예컨대 글루포시네이트 (pat 및 bar 유전자; DSM-2), 및 아릴옥시페녹시프로피온산 및 시클로헥산디온 (ACCase 억제제 코딩 유전자)의 대사 불활성화를 통해 부여된 글리포세이트에 대한 저항성 또는 내성을 코딩하는 1종 이상의 추가의 유전자. 예를 들어, 글리포세이트 저항성을 부여할 수 있는 EPSP의 형태의 뉴클레오티드 서열을 개시하고 있는 미국 특허 번호 4,940,835를 참조한다. 돌연변이체 aroA 유전자를 코딩하는 DNA 분자는 ATCC 수탁 번호 39256 하에 수득할 수 있고, 상기 돌연변이체 유전자의 뉴클레오티드 서열은 미국 특허 번호 4,769,061에 개시되어 있다. 유럽 특허 출원 번호 0 333 033 및 미국 특허 번호 4,975,374에는 L-포스피노트리신과 같은 제초제에 대한 저항성을 부여해주는 글루타민 신테타제 유전자의 뉴클레오티드 서열이 개시되어 있다. 포스피노트리신아세틸-트랜스퍼라제 유전자의 뉴클레오티드 서열은 유럽 출원 번호 0 242 246에 제공된다. 문헌 [De Greef et al. (1989) Bio/Technology 7:61]에는 포스피노트리신 아세틸 트랜스퍼라제 활성을 코딩하는 키메라 bar 유전자를 발현하는 트랜스제닉 식물의 생산이 기재되어 있다. 아릴옥시페녹시프로피온산 및 시클로헥산디온에 대한 저항성을 부여해주는 예시적인 유전자, 예컨대 세톡시딤 및 할옥시포프는 문헌 [Marshall et al. (1992) Theor. Appl. Genet. 83:435]에 기재된 Accl-S1, Accl-S2 및 Accl-S3 유전자이다.
(C) 광합성을 억제하는 제초제, 예컨대 트리아진 (psbA 및 gs+ 유전자) 및 벤조니트릴 (니트릴라제 유전자)에 대한 저항성 또는 내성을 코딩하는 유전자. 문헌 [Przibilla et al. (1991) Plant Cell 3:169]에는 클라미도모나스(Chlamydomonas)를 형질전환시키기 위해 돌연변이체 psbA 유전자를 코딩하는 플라스미드를 사용하는 것이 기재되어 있다. 니트릴라제 유전자에 대한 뉴클레오티드 서열은 미국 특허 번호 4,810,648에 개시되어 있고, 이들 유전자를 함유하는 DNA 분자는 ATCC 수탁 번호 53435, 67441 및 67442 하에 입수가능하다. 글루타티온 S-트랜스퍼라제를 코딩하는 DNA의 클로닝 및 발현은 문헌 [Hayes et al. (1992) Biochem. J. 285:173]에 기재되어 있다.
(D) 파라-히드록시페닐피루베이트 (HPP)를 호모겐티세이트 내로 형질전환시키는 반응을 촉매하는 효소인 히드록시페닐피루베이트 디옥시게나제 (HPPD)에 결합하는 제초제에 대한 저항성 또는 내성을 코딩하는 유전자. 이는 제초제, 예컨대 이속사졸 (EP418175, EP470856, EP487352, EP527036, EP560482, EP682659, 미국 특허 번호 5,424,276), 특히 옥수수에 대한 선택적 제초제인 이속사플루톨, 디케토니트릴 (EP496630, EP496631), 특히 2-시아노-3-시클로프로필-1-(2-SO2CH3-4-CF3 페닐)프로판-1,3-디온 및 2-시아노-3-시클로프로필-1-(2-SO2CH3-4-2,3Cl2페닐)프로판-1,3-디온, 트리케톤 (EP625505, EP625508, 미국 특허 번호 5,506,195), 특히 술코트리온 및 피라졸리네이트를 포함한다. 예를 들어 미국 특허 번호 6,268,549 및 6,245,968 및 미국 특허 출원, 공개 번호 20030066102에 기재된 유전자를 비롯하여, 식물에서 과잉의 HPPD를 생산하는 유전자가 이러한 제초제에 대한 내성 또는 저항성을 제공할 수 있다.
(E) 페녹시 옥신 제초제, 예컨대 2,4-디클로로페녹시아세트산 (2,4-D)에 대한 저항성 또는 내성을 코딩하며, 또한 아릴옥시페녹시프로피오네이트 (AOPP) 제초제에 대한 저항성 또는 내성을 부여할 수 있는 유전자. 이러한 유전자의 예는 미국 특허 번호 7,838,733에 기재된 α-케토글루타레이트-의존성 디옥시게나제 효소 (aad-1) 유전자를 포함한다.
(F) 페녹시 옥신 제초제, 예컨대 2,4-디클로로페녹시아세트산 (2,4-D)에 대한 저항성 또는 내성을 코딩하며, 또한 피리딜옥시 옥신 제초제, 예컨대 플루록시피르 또는 트리클로피르에 대한 저항성 또는 내성을 부여할 수 있는 유전자. 이러한 유전자의 예는 WO 2007/053482 A2에 기재된 α-케토글루타레이트-의존성 디옥시게나제 효소 유전자 (aad-12)를 포함한다.
(G) 디캄바에 대한 저항성 또는 내성을 코딩하는 유전자 (예를 들어 미국 특허 공개 번호 20030135879 참조).
(H) 프로토포르피리노겐 옥시다제 (PPO)를 억제하는 제초제에 대한 저항성 또는 내성을 제공하는 유전자 (미국 특허 번호 5,767,373 참조).
(I) 광화학계 II 반응 중심 (PS II)의 코어 단백질에 결합하는 트리아진 제초제 (예컨대 아트라진) 및 우레아 유도체 (예컨대 디우론) 제초제에 대한 저항성 또는 내성을 제공하는 유전자 (문헌 [Brussian et al., (1989) EMBO J. 1989, 8(4): 1237-1245] 참조).
가치-부가된 형질을 부여하거나 이에 기여하는 유전자
(A) 예를 들어, 옥수수 또는 브라시카를 안티센스 유전자 또는 스테아로일-ACP 데새투라제로 형질전환시켜 식물의 스테아르산 함량을 증가시킴으로써 변형된 지방산 대사 (Knultzon et al., 1992) Proc. Nat. Acad. Sci. USA 89:2624.
(B) 감소된 피테이트 함량
(1) 피타제-코딩 유전자, 예컨대 아스페르길루스 니거(Aspergillus niger) 피타제 유전자 (Van Hartingsveldt et al., 1993 Gene 127:87)의 도입은 피테이트의 붕괴를 증진시켜, 보다 많은 유리 포스페이트를 형질전환된 식물에 부가한다.
(2) 피테이트 함량을 감소시키는 유전자가 도입될 수 있다. 옥수수에서, 이는 예를 들어 낮은 수준의 피트산을 특징으로 하는 옥수수 돌연변이체를 발생시키는 단일 대립 유전자와 연관된 DNA를 클로닝하고, 이어서 재도입시킴으로써 달성될 수 있다 (Raboy et al., 1990 Maydica 35:383).
(C) 예를 들어 식물을 전분의 분지화 패턴을 변경시키는 효소를 코딩하는 유전자로 형질전환시킴으로써 달성된 변형된 탄수화물 조성. 이러한 효소의 예는 스트렙토코쿠스 무쿠스(Streptococcus mucus) 프룩토실트랜스퍼라제 유전자 (Shiroza et al., 1988 J. Bacteriol. 170:810), 바실루스 서브틸리스(Bacillus subtilis) 레반수크라제 유전자 (Steinmetz et al., 1985 Mol. Gen. Genel. 200:220]), 바실루스 리케니포르미스(Bacillus licheniformis) α-아밀라제 (Pen et al., 1992 Bio/Technology 10:292), 토마토 인버타제 유전자 (Elliot et al., 1993), 보리 아밀라제 유전자 (Sogaard et al., 1993 J. Biol. Chem. 268:22480), 및 옥수수 내배유 전분 분지화 효소 II (Fisher et al., 1993 Plant Physiol. 102:10450)를 포함한다.
후속 실시양태에서, 트랜스진은 리포터 유전자를 포함한다. 다양한 실시양태에서, 리포터 유전자는 yfp 유전자, gus 유전자, rfp 유전자, gfp 유전자, 카나마이신 내성 유전자, aad-1 유전자, aad-12 유전자, pat 유전자 및 글리포세이트 내성 유전자로 이루어진 군으로부터 선택된다. 형질전환된 세포 또는 조직 또는 식물 부분 또는 식물의 선택을 위한 리포터 또는 마커 유전자가 형질전환 벡터에 포함될 수 있다. 선택 마커의 예는 항대사물, 예컨대 제초제 또는 항생제에 대한 저항성을 부여해주는 것, 예를 들어 메토트렉세이트에 대한 저항성을 부여해주는 디히드로폴레이트 리덕타제 (Reiss, Plant Physiol. (Life Sci. Adv.) 13:143-149, 1994; 또한 문헌 [Herrera Estrella et al., Nature 303:209-213, 1983; Meijer et al., Plant Mol. Biol. 16:807-820, 1991] 참조); 아미노글리코시드 네오마이신, 카나마이신 및 파로마이신에 대한 저항성을 부여해주는 네오마이신 포스포트랜스퍼라제 (Herrera-Estrella, EMBO J. 2:987-995, 1983 및 Fraley et al. Proc. Natl. Acad. Sci USA 80:4803 (1983)) 및 히그로마이신에 대한 저항성을 부여해주는 히그로마이신 포스포트랜스퍼라제 (Marsh, Gene 32:481-485, 1984; 또한 문헌 [Waldron et al., Plant Mol. Biol. 5:103-108, 1985; Zhijian et al., Plant Science 108:219-227, 1995] 참조); 세포가 트립토판 대신 인돌을 이용할 수 있게 해주는 trpB; 세포가 히스티딘 대신 히스티놀을 이용할 수 있게 해주는 hisD (Hartman, Proc. Natl. Acad. Sci., USA 85:8047, 1988); 세포가 만노스를 이용할 수 있게 해주는 만노스-6-포스페이트 이소머라제 (WO 94/20627); 오르니틴 데카르복실라제 억제제, 2-(디플루오로메틸)-DL-오르니틴에 대한 저항성을 부여해주는 오르니틴 데카르복실라제 (DFMO; McConlogue, 1987, In: Current Communications in Molecular Biology, Cold Spring Harbor Laboratory ed.); 및 블라스티시딘 S에 대한 저항성을 부여해주는, 아스페르길루스 테레우스(Aspergillus terreus)로부터의 데아미나제 (Tamura, Biosci. Biotechnol. Biochem. 59:2336-2338, 1995)를 포함한다.
추가의 선택 마커는 예를 들어 이미다졸리논 또는 술포닐우레아 저항성을 부여해주는 돌연변이체 아세토락테이트 신타제 (Lee et al., EMBO J. 7:1241-1248, 1988), 아트라진에 대한 저항성을 부여해주는 돌연변이체 psbA (Smeda et al., Plant Physiol. 103:911-917, 1993), 또는 돌연변이체 프로토포르피리노겐 옥시다제 (미국 특허 번호 5, 767, 373 참조), 또는 글루포시네이트와 같은 제초제에 대한 저항성을 부여하는 다른 마커를 포함한다. 적합한 선택 마커 유전자의 예는 클로람페니콜 (Herrera Estrella et al., EMBO J. 2:987-992, 1983); 스트렙토마이신 (Jones et al., Mol. Gen. Genet. 210:86-91, 1987); 스펙티노마이신 (Bretagne-Sagnard et al., Transgenic Res. 5:131-137, 1996); 블레오마이신 (Hille et al., Plant Mol. Biol. 7:171-176, 1990); 술폰아미드 (Guerineau et al., Plant Mol. Biol. 15:127-136, 1990); 브로목시닐 (Stalker et al., Science 242:419-423, 1988); 글리포세이트 (Shaw et al., Science 233:478-481, 1986); 포스피노트리신 (DeBlock et al., EMBO J. 6:2513-2518, 1987) 등에 대한 저항성을 코딩하는 유전자를 포함하나, 이에 제한되지는 않는다.
선택적 유전자의 사용을 위한 한 가지 옵션은 글루포시네이트-저항성 코딩 DNA이고, 한 실시양태에서는 카사바 베인 모자이크 바이러스 프로모터의 제어 하의 포스피노트리신 아세틸 트랜스퍼라제 (pat), 옥수수 최적화 pat 유전자 또는 bar 유전자일 수 있다. 이들 유전자는 비알라포스에 대한 저항성을 부여한다. 문헌 [Wohlleben et al., (1988) Gene 70: 25-37; Gordon-Kamm et al., Plant Cell 2:603; 1990; Uchimiya et al., BioTechnology 11:835, 1993; White et al., Nucl. Acids Res. 18:1062, 1990; Spencer et al., Theor. Appl. Genet. 79:625-631, 1990; 및 Anzai et al., Mol. Gen. Gen. 219:492, 1989]을 참조한다. pat 유전자의 버전은 미국 특허 번호 6,096,947에 기재된 옥수수 최적화 pat 유전자이다.
추가로, 마커를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 함유하는 식물 세포의 확인을 촉진시키는 마커를 이용할 수 있다. 스코어링가능하거나 스크리닝가능한 마커가 유용하며, 여기서 서열의 존재로 인해 측정가능한 생성물이 생산되고, 식물 세포의 파괴 없이 상기 생성물이 생산될 수 있다. 그 예는 β-글루쿠로니다제, 또는 다양한 발색 기질이 공지되어 있는 효소를 코딩하는 uidA 유전자 (GUS) (예를 들어, US 특허 5,268,463 및 5,599,670); 클로람페니콜 아세틸 트랜스퍼라제 (Jefferson et al. The EMBO Journal vol. 6 No. 13 pp. 3901-3907); 및 알칼리성 포스파타제를 포함한다. 바람직한 실시양태에서, 사용된 마커는 베타-카로텐 또는 프로비타민 A이다 (Ye et al., Science 287:303-305- (2000)). 상기 유전자는 벼의 영양을 증진시키는데 사용되어 왔지만, 이러한 경우에 이는 스크리닝가능한 마커로서 대신 이용되고, 관심 유전자에 연결된 유전자의 존재는 제공된 금색에 의해 검출된다. 상기 유전자가 식물에 대한 그의 영양적 기여를 위해 사용되는 상황과는 달리, 제조 목적을 위해서는 보다 적은 양의 단백질도 충분하다. 다른 스크리닝가능한 마커는, 예를 들어 특히, 식물 조직에서 안토시아닌 색소 (적색)의 생산을 조절하는 생성물을 코딩하는 R-유전자좌 유전자 (Dellaporta et al., in Chromosome Structure and Function, Kluwer Academic Publishers, Appels and Gustafson eds., pp. 263-282 (1988)); 플라보노이드 색소의 생합성을 제어하는 유전자, 예컨대 옥수수 C1 유전자 (Kao et al., Plant Cell (1996) 8: 1171-1179; Scheffler et al. Mol. Gen. Genet. (1994) 242:40-48) 및 옥수수 C2 (Wienand et al., Mol. Gen. Genet. (1986) 203:202-207); B 유전자 (Chandler et al., Plant Cell (1989) 1:1175-1183), p1 유전자 (Grotewold et al., Proc. Natl. Acad. Sci USA (1991) 88:4587-4591; Grotewold et al., Cell (1994) 76:543-553; Sidorenko et al., Plant Mol. Biol. (1999)39:11-19); 브론즈 유전자좌 유전자 (Ralston et al., Genetics (1988) 119:185-197; Nash et al., Plant Cell (1990) 2(11): 1039-1049)를 비롯한 안토시아닌/플라보노이드 유전자를 전반적으로 포함한다 (문헌 [Taylor and Briggs, The Plant Cell (1990)2:115-127]에서의 논의 참조).
적합한 마커의 추가의 예는 시안 형광 단백질 (CYP) 유전자 (Bolte et al. (2004) J. Cell Science 117: 943-54 및 Kato et al. (2002) Plant Physiol 129:913-42), 황색 형광 단백질 유전자 (에브로겐(Evrogen)으로부터의 PHIYFP™; 문헌 [Bolte et al. (2004) J. Cell Science 117:943-54] 참조); 존재가 예를 들어 X선 필름, 섬광 계수, 형광 분광광도측정법, 저조도 비디오 카메라, 광자 계수 카메라 또는 멀티웰 발광측정법을 사용하여 검출될 수 있는 루시페라제를 코딩하는 lux 유전자 (Teeri et al. (1989) EMBO J. 8:343); 녹색 형광 단백질 (GFP) 유전자 (Sheen et al., Plant J. (1995) 8(5):777-84); 및 마커 유전자로 형질전환된 식물 세포가 적색이며, 이에 따라 시각적으로 선택가능한 DsRed2 (Dietrich et al. (2002) Biotechniques 2(2):286-293)를 포함한다. 추가의 예는 다양한 발색 기질 (예를 들어, PADAC, 발색 세팔로스포린)이 공지되어 있는 효소를 코딩하는 β-락타마제 유전자 (Sutcliffe, Proc. Nat'l. Acad. Sci. U.S.A. (1978) 75:3737); 발색 카테콜을 전환시킬 수 있는 카테콜 디옥시게나제를 코딩하는 xylE 유전자 (Zukowsky et al., Proc. Nat'l. Acad. Sci. U.S.A. (1983) 80:1101); α-아밀라제 유전자 (Ikuta et al., Biotech. (1990) 8:241); 및 티로신을 DOPA 및 도파퀴논 (이들은 이후에 축합되어 용이하게 검출가능한 화합물 멜라닌을 형성함)으로 산화시킬 수 있는 효소를 코딩하는 티로시나제 유전자 (Katz et al., J. Gen. Microbiol. (1983) 129:2703)를 포함한다. 분명하게는, 이러한 많은 마커가 이용가능하고, 통상의 기술자에게 공지되어 있다.
관련 기술분야에 공지되어 있는 용어 "퍼센트 동일성" (또는 "% 동일성")은 서열을 비교함으로써 결정되는, 2개 이상의 폴리펩티드 서열 또는 2개 이상의 폴리뉴클레오티드 서열 사이의 관계이다. 관련 기술분야에서 "동일성"은 또한 경우에 따라, 서열의 스트링 사이에서의 매칭에 의해 판단되는, 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드 서열 사이의 서열 관련성의 정도를 의미한다. "동일성" 및 "유사성"은 하기 문헌에 개시된 것들을 포함하나 이에 제한되지 않는 공지된 방법에 의해 용이하게 계산될 수 있다: 1.) Computational Molecular Biology (Lesk, A. M., Ed.) Oxford University: NY (1988); 2.) Biocomputing: Informatics and Genome Projects (Smith, D. W., Ed.) Academic: NY (1993); 3.) Computer Analysis of Sequence Data, Part I (Griffin, A. M., and Griffin, H. G., Eds.) Humania: NJ (1994); 4.) Sequence Analysis in Molecular Biology (von Heinje, G., Ed.) Academic (1987); 및 5.) Sequence Analysis Primer (Gribskov, M. and Devereux, J., Eds.) Stockton: NY (1991).
핵산 및 아미노산 서열 동일성을 결정하기 위한 기술은 관련 기술분야에 공지되어 있다. 전형적으로, 이러한 기술은 유전자에 대한 mRNA의 뉴클레오티드 서열을 결정하는 것 및/또는 이에 의해 코딩되는 아미노산 서열을 결정하는 것, 및 이들 서열을 제2의 뉴클레오티드 또는 아미노산 서열과 비교하는 것을 포함한다. 게놈 서열은 또한 이러한 방식으로 결정 및 비교될 수 있다. 일반적으로, 동일성은 2개의 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드 서열 각각의 정확한 뉴클레오티드-대-뉴클레오티드 또는 아미노산-대-아미노산 대응을 지칭한다. 2개 이상의 서열 (폴리뉴클레오티드 또는 아미노산)은 이들의 퍼센트 동일성을 결정함으로써 비교될 수 있다. 핵산 또는 아미노산 서열에 관계없이 2개의 서열의 퍼센트 동일성은 정렬된 2개의 서열 사이의 정확한 매치의 수를 더 짧은 서열의 길이로 나누고 100을 곱한 것이다. 전문이 본원에 참조로 포함되는 문헌 [Russell, R., and Barton, G., "Structural Features can be Unconserved in Proteins with Similar Folds," J. Mol. Biol. 244, 332-350 (1994)]의 337페이지를 참조한다.
추가로, 동일성 및 유사성을 결정하기 위한 방법은 공중 이용가능한 컴퓨터 프로그램으로 편성되어 있다. 서열 정렬 및 퍼센트 동일성 계산은 예를 들어 벡터(Vector) NTI® 스위트 (인비트로젠(Invitrogen), 캘리포니아주 칼스배드)의 얼라인X(AlignX) 프로그램 또는 레이저진(LASERGENE) 생물정보학 컴퓨팅 스위트 (DNASTAR 인크.(DNASTAR Inc.), 위스콘신주 매디슨)의 메갈라인(MegAlign)™ 프로그램을 사용하여 수행될 수 있다. 서열의 다중 정렬은 클러스탈(Clustal) V (문헌 [Higgins and Sharp, CABIOS. 5:151-153 (1989); Higgins, D.G. et al., Comput. Appl. Biosci., 8:189-191 (1992)]에 개시됨)로 표지된 정렬 방법에 상응하는 "클러스탈 V 정렬 방법"을 포함하는 몇몇 다양한 알고리즘을 포괄하며 레이저진 생물적보학 컴퓨팅 스위트 (DNASTAR 인크.)의 메갈라인™ 프로그램에서 발견되는 "클러스탈 정렬 방법"을 사용하여 수행된다. 다중 정렬의 경우, 디폴트 값은 갭 페널티=10 및 갭 길이 페널티=10에 상응한다. 클러스탈 방법을 사용한 단백질 서열의 쌍별 정렬 및 퍼센트 동일성의 계산을 위한 디폴트 파라미터는 KTUPLE=1, 갭 페널티=3, 윈도우=5 및 DIAGONALS SAVED=5이다. 핵산의 경우, 이들 파라미터는 KTUPLE=2, 갭 페널티=5, 윈도우=4 및 DIAGONALS SAVED=4이다. 클러스탈 V 프로그램을 사용한 서열의 정렬 후에, 동일한 프로그램에서 "서열 거리" 표를 살펴봄으로써 "퍼센트 동일성"을 얻을 수 있다. 추가로, "클러스탈 W 정렬 방법"이 이용가능하고, 클러스탈 W (문헌 [Higgins and Sharp, CABIOS. 5:151-153 (1989); Higgins, D.G. et al., Comput. Appl. Biosci. 8:189-191 (1992)]에 기재됨)로 표지되며 레이저진 생물정보학 컴퓨팅 스위트 (DNASTAR 인크.)의 메갈라인™ v6.1 프로그램에서 발견되는 정렬 방법에 상응한다. 다중 정렬을 위한 디폴트 파라미터 (갭 페널티=10, 갭 길이 페널티=0.2, 딜레이 디버전(Delay Divergen) 서열(%)=30, DNA 전이 가중치=0.5, 단백질 가중 매트릭스=고넷(Gonnet) 시리즈, DNA 가중 매트릭스=IUB). 클러스탈 W 프로그램을 사용한 서열의 정렬 후에, 동일한 프로그램에서 "서열 거리" 표를 살펴봄으로써 "퍼센트 동일성"을 얻을 수 있다.
많은 수준의 서열 동일성이 다른 종으로부터의 폴리펩티드를 확인하는데 유용하며, 여기서 이러한 폴리펩티드는 동일하거나 유사한 기능 또는 활성을 갖는다는 것이 관련 기술분야의 통상의 기술자에 의해 널리 이해된다. 퍼센트 동일성의 유용한 예는 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90% 또는 95%를 포함하나 이에 제한되지는 않거나, 또는 55% 내지 100%의 임의의 정수 백분율, 예컨대 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%가 본 개시내용의 실시양태를 기재하는데 유용할 수 있다. 적합한 핵산 단편은 상기 상동성을 가질 뿐만 아니라 전형적으로 적어도 50개의 아미노산, 바람직하게는 적어도 100개의 아미노산, 보다 바람직하게는 적어도 150개의 아미노산, 보다 더 바람직하게는 적어도 200개의 아미노산, 및 가장 바람직하게는 적어도 250개의 아미노산을 갖는 폴리펩티드를 코딩한다.
용어 "서열 분석 소프트웨어"는 뉴클레오티드 또는 아미노산 서열의 분석에 유용한 임의의 컴퓨터 알고리즘 또는 소프트웨어 프로그램을 지칭한다. "서열 분석 소프트웨어"는 상업적으로 입수가능하거나 또는 독립적으로 개발될 수 있다. 전형적인 서열 분석 소프트웨어는 1.) GCG 프로그램 스위트 (위스콘신 패키지 버전(Wisconsin Package Version) 9.0, 제네틱스 컴퓨터 그룹(Genetics Computer Group; GCG), 위스콘신주 메디슨); 2.) BLASTP, BLASTN, BLASTX (Altschul et al., J. Mol. Biol, 215:403-410 (1990)); 3.) DNASTAR (DNASTAR, 인크., 위스콘신주 메디슨); 4.) 시퀀처(Sequencher) (진 코드 코포레이션(Gene Codes Corporation), 미시건 주 앤 아버); 및 5.) 스미스-워터맨(Smith-Waterman) 알고리즘을 포함하는 FASTA 프로그램 (W. R. Pearson, Comput. Methods Genome Res., [Proc. Int. Symp.] (1994), Meeting Date 1992, 111-20. Editor(s): Suhai, Sandor. Plenum: New York, NY)을 포함할 것이나, 이에 제한되지는 않는다. 본 출원의 문맥에서, 서열 분석 소프트웨어가 분석에 사용되는 경우에 분석 결과는 달리 명시되지 않는 한, 언급된 프로그램의 "디폴트 값"을 기초로 할 것임이 이해될 것이다. 본원에 사용된 "디폴트 값"은 처음 초기화될 때 소프트웨어에 본래 로딩된 임의의 세트의 값 또는 파라미터를 의미할 것이다.
혼성화 기술이 언급되는 경우에, 공지된 뉴클레오티드 서열의 전부 또는 일부는 선택된 유기체로부터 클로닝된 게놈 DNA 단편 또는 cDNA 단편 (즉, 게놈 또는 cDNA 라이브러리)의 집단에 존재하는 다른 상응하는 뉴클레오티드 서열에 선택적으로 혼성화하는 프로브로서 사용될 수 있다. 혼성화 프로브는 게놈 DNA 단편, 플라스미드 DNA 단편, cDNA 단편, RNA 단편, PCR 증폭된 DNA 단편, 올리고뉴클레오티드 또는 다른 폴리뉴클레오티드일 수 있고, 검출가능한 기, 예컨대 32P 또는 임의의 다른 검출가능한 마커로 표지될 수 있다. 따라서, 예를 들어, 혼성화를 위한 프로브는 본 개시내용의 실시양태의 DNA 서열을 기초로 하는 합성 올리고뉴클레오티드를 표지함으로써 제조될 수 있다. 혼성화를 위한 및 cDNA 및 게놈 라이브러리의 구축을 위한 프로브의 제조 방법은 일반적으로 관련 기술분야에 공지되어 있고, 개시되어 있다 (Sambrook et al., 1989).
본 개시내용의 실시양태의 핵산 프로브 및 프라이머는 엄격한 조건 하에 표적 DNA 서열에 혼성화한다. 임의의 통상적인 핵산 혼성화 또는 증폭 방법이 샘플 중 트랜스제닉 이벤트로부터의 DNA의 존재를 확인하는 데 사용될 수 있다. 핵산 분자 또는 그의 단편은 특정 환경 하에 다른 핵산 분자에 특이적으로 혼성화할 수 있다. 본원에 사용된 바와 같이, 2개의 핵산 분자는 이 두 분자가 역평행의 이중-가닥 핵산 구조를 형성할 수 있는 경우에 서로에 대해 특이적으로 혼성화할 수 있는 것으로 표현된다. 핵산은 2개의 핵산 분자가 완전한 상보성을 나타내는 경우에 또 다른 핵산 분자의 "상보체"인 것으로 표현된다. 본원에 사용된 바와 같이, 분자 중 하나의 모든 뉴클레오티드가 다른 것의 뉴클레오티드에 상보적인 경우에, 분자는 "완전한 상보성"을 나타내는 것으로 표현된다. 완전한 상보성을 나타내는 분자는 일반적으로 통상적인 "고-엄격도" 조건 하에 서로 어닐링된 상태로 유지되도록 하는 충분한 안정성으로 서로에 대해 혼성화될 것이다. 통상적인 고-엄격도 조건은 문헌 [Sambrook et al., 1989]에 기재되어 있다.
2개의 분자는 이들이 적어도 통상적인 "저-엄격도" 조건 하에 서로 어닐링된 상태로 유지되도록 하는 충분한 안정성으로 서로에 대해 혼성화될 수 있는 경우에 "최소 상보성"을 나타내는 것으로 표현된다. 통상적인 저-엄격도 조건은 문헌 [Sambrook et al., 1989]에 기재되어 있다. 핵산 분자가 프라이머 또는 프로브로서 기능하기 위해서는, 이용된 특정한 용매 및 염 농도 하에 안정한 이중-가닥 구조를 형성할 수 있도록 서열의 최소 상보성을 나타낼 것만이 요구된다.
혼성화의 엄격도에 영향을 미치는 인자들은 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 널리 공지되어 있고, 온도, pH, 이온 강도, 및 유기 용매 예컨대 포름아미드 및 디메틸술폭시드의 농도를 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 널리 공지된 바와 같이, 혼성화 엄격도는 온도가 높을수록, 이온 강도가 낮을수록, 및 용매 농도가 낮을수록 증가된다.
용어 "엄격한 조건"은 또는 "엄격도 조건"은 문헌 [Sambrook et al., 1989]의 9.52-9.55에 논의된 특정 혼성화 절차에 의해 표적 핵산 (즉, 특정한 관심 핵산 서열)에 대한 핵산 프로브의 혼성화와 관련하여 기능적으로 정의된다. 또한, 문헌 [Sambrook et al., 1989]의 9.47-9.52 및 9.56-9.58을 참조한다.
전형적으로, 엄격한 조건은 염 농도가 pH 7.0 내지 8.3에서 약 1.5 M Na+ 이온 미만, 전형적으로 약 0.01 내지 1.0 M Na+ 이온 농도 (또는 다른 염)이고, 온도가 짧은 프로브 (예를 들어, 10 내지 50개의 뉴클레오티드)에 대해서는 적어도 약 30℃이고, 긴 프로브 (예를 들어, 50개 초과의 뉴클레오티드)에 대해서는 적어도 약 60℃인 조건일 것이다. 엄격한 조건은 또한 포름아미드와 같은 탈안정화제를 첨가함으로써 달성될 수 있다. 예시적인 저 엄격도 조건은 37℃에서 30 내지 35% 포름아미드, 1.0 M NaCl, 0.1% SDS (소듐 도데실 술페이트)의 완충 용액에 의한 혼성화, 및 50 내지 55℃에서 1X 내지 2X SSC (20X SSC=3.0 M NaCl/0.3 M 시트르산삼나트륨)에서의 세척을 포함한다. 예시적인 중간 정도의 엄격도 조건은 37℃에서 40 내지 45% 포름아미드, 1.0 M NaCl, 0.1% SDS에서의 혼성화, 및 55 내지 60℃에서 0.5X 내지 1X SSC에서의 세척을 포함한다. 예시적인 고 엄격도 조건은 37℃에서 50% 포름아미드, 1.0 M NaCl, 0.1% SDS에서의 혼성화, 및 60 내지 65℃에서 0.1X SSC에서의 세척을 포함한다.
특이성은 전형적으로 혼성화후 세척의 함수이고, 결정적인 인자는 이온 강도 및 최종 세척 용액의 온도이다. DNA-DNA 하이브리드의 경우, Tm은 식: Tm = 81.5℃+16.6 (logM)+0.41 (%GC)-0.61 (%form.)-500/L로부터 근사화될 수 있고; 여기서 M은 1가 양이온의 몰농도이고, %GC는 DNA 내의 구아노신 및 시토신 뉴클레오티드의 백분율이고, % form.은 혼성화 용액 중 포름아미드의 백분율이고, L은 염기 쌍 내의 하이브리드의 길이이다 (Meinkoth and Wahl, 1984). Tm은 (규정된 이온 강도 및 pH 하에) 상보적 표적 서열의 50%가 완벽하게 매칭되는 프로브에 혼성화되는 온도이다. Tm은 각각 1%의 미스매칭에 대해 약 1℃만큼 감소되며; 따라서, 혼성화를 위해 Tm, 혼성화 및/또는 세척 조건이 목적하는 동일성의 서열에 대해 조정될 수 있다. 예를 들어, 90%의 동일성을 갖는 서열을 고려하는 경우, Tm은 10℃ 감소될 수 있다. 일반적으로, 엄격한 조건은 규정된 이온 강도 및 pH에서 특정 서열 및 그의 보체에 대한 열 융점 (Tm)보다 약 5℃ 더 낮은 온도가 되도록 선택된다. 그러나, 극도로 엄격한 조건은 열 융점 (Tm)보다 1, 2, 3 또는 4℃ 더 낮은 온도에서의 혼성화 및/또는 세척을 이용할 수 있고; 중간 정도의 엄격한 조건은 열 융점 (Tm)보다 6, 7, 8, 9 또는 10℃ 더 낮은 온도에서의 혼성화 및/또는 세척을 이용할 수 있으며; 저 엄격도 조건은 열 융점 (Tm)보다 11 내지 20℃ 더 낮은 온도에서의 혼성화 및/또는 세척을 이용할 수 있다. 식, 혼성화 및 세척 조성물, 및 목적하는 Tm을 사용하여, 통상의 기술자는 혼성화 및/또는 세척 용액의 엄격도에서의 변화가 고유하게 기재됨을 이해할 것이다. 원하는 정도의 미스매칭이 45℃ (수용액) 또는 32℃ (포름아미드 용액) 미만의 Tm을 초래하는 경우, 더 높은 온도가 사용될 수 있도록 SSC 농도를 증가시키는 것이 바람직하다. 핵산의 혼성화에 대한 광범위한 안내가 문헌 [(1997) Ausubel et al., Short Protocols in Molecular Biology, pages 2-40, Third Edit. (1997) 및 Sambrook et al. (1989)]에서 발견된다.
본 개시내용의 또 다른 실시양태에서, 식물 세포의 게놈 내의 폴리뉴클레오티드 공여자 카세트의 표적화 통합을 위한 방법이 개시된다. 특정 실시양태에서, 적어도 1개의 DNA 결합 도메인 및 적어도 1개의 뉴클레아제 도메인을 포함하는 부위 특이적 DNA 결합 뉴클레아제 (여기서 적어도 1개의 DNA 결합 도메인은 식물 세포의 게놈 내의 표적 부위에 결합함)가 발현된다. 다른 실시양태에서, 식물 세포는 폴리뉴클레오티드 공여자 카세트와 접촉된다. 추가 실시양태에서, 식물 세포의 게놈 내의 표적 부위는 부위 특이적 DNA 결합 뉴클레아제로 절단된다. 또 다른 실시양태에서, 폴리뉴클레오티드 공여자 카세트는 식물 세포의 게놈 내의 표적 부위 내로 통합된다.
한 실시양태에서, 상동성 지정 복구 메카니즘을 통한 식물 세포의 게놈 내의 폴리뉴클레오티드 공여자 카세트의 표적화 통합이 개시된다. 또 다른 실시양태에서, 비-상동 말단 연결 지정 복구 메카니즘을 통한 식물 세포의 게놈 내의 폴리뉴클레오티드 공여자 카세트의 표적화 통합이 개시된다.
본원에 개시된 공여자 분자는 표적화, 상동성-독립적 방법을 통해 세포의 게놈 내로 통합된다. 이러한 표적화 통합을 위해, 게놈은 뉴클레아제, 예를 들어 DNA-결합 도메인 (예를 들어, 아연 핑거 결합 도메인 또는 TAL 이펙터 도메인은 미리 결정된 절단 부위에서 또는 그 부근에서 표적 부위에 결합하도록 조작됨)과 뉴클레아제 도메인 (예를 들어, 절단 도메인 또는 절단 절반-도메인) 사이의 융합체를 사용하여 목적하는 위치 (또는 위치들)에서 절단된다. 특정 실시양태에서, 각각 DNA-결합 도메인 및 절단 절반-도메인을 포함하는 2개의 융합 단백질이 세포 내에서 발현되고, 기능적 절단 도메인을 재구성하고 표적 부위 근처에서 DNA를 절단하는 방식으로 병렬배치된 표적 부위에 결합한다. 한 실시양태에서, 절단은 2개의 DNA-결합 도메인의 표적 부위 사이에서 발생한다. DNA-결합 도메인 중 하나 또는 둘 다가 조작될 수 있다. 또한, 미국 특허 번호 7,888,121; 미국 특허 공개 20050064474 및 국제 특허 출원 공개 WO05/084190, WO05/014791 및 WO 03/080809를 참조한다.
본원에 기재된 뉴클레아제는 폴리펩티드 및/또는 폴리뉴클레오티드로서 도입될 수 있다. 예를 들어, 각각 상기 언급된 폴리펩티드들 중 하나를 코딩하는 서열을 포함하는 2개의 폴리뉴클레오티드가 세포 내로 도입될 수 있고, 폴리펩티드들이 발현되어 각각 그의 표적 서열에 결합하면, 표적 서열에서 또는 그 부근에서 절단이 일어난다. 대안적으로, 융합 폴리펩티드 둘 다를 코딩하는 서열을 포함하는 단일 폴리뉴클레오티드가 세포 내로 도입될 수 있다. 폴리뉴클레오티드는 DNA, RNA, 또는 DNA 및/또는 RNA의 임의의 변형된 형태 또는 유사체일 수 있다.
관심 영역 내에 이중-가닥 파괴의 도입 후, 트랜스진은 본원에 기재된 이중-가닥 공여자 분자의 선형화 후에 비-상동성 의존성 방법 (예를 들어, 비-상동성 말단 연결 (NHEJ))을 통해 표적화 방식으로 관심있는 영역 내로 통합된다. 이중-가닥 공여자는 바람직하게는 뉴클레아제, 예를 들어 이중-가닥 파괴를 게놈에 도입하기 위해 사용되는 1개 이상의 동일하거나 상이한 뉴클레아제를 사용하여 생체 내에서 선형화된다. 세포에서 염색체 및 공여자의 동기화된 절단은 (세포 내로의 도입 전 공여자 분자의 선형화와 비교하여) 공여자 DNA 분해를 제한할 수 있다. 공여자의 선형화를 위해 사용되는 뉴클레아제 표적 부위(들)는 바람직하게는 트랜스진(들) 서열(들)을 파괴시키지 않는다.
트랜스진은 뉴클레아제 오버행의 간단한 라이게이션 ("정방향" 또는 "AB" 배향으로 지정됨)에 의해 또는 엇갈린 방향 ("역방향" 또는 "BA" 배향으로 지정됨)으로, 예상된 방향으로 게놈 내로 통합될 수 있다. 특정 실시양태에서, 트랜스진은 공여자 및 염색체 오버행의 정확한 라이게이션 후에 통합된다. 다른 실시양태에서, BA 또는 AB 배향의 트랜스진의 통합은 몇몇 뉴클레오티드의 결실을 일으킨다.
IV. 공여자 폴리뉴클레오티드의 부위 특이적 통합의 검출을 위한 검정
한 실시양태에서, 증폭 반응은 정량화된다. 다른 실시양태에서, 증폭 반응은 검출된다. 다양한 실시양태에서, 검출은 아가로스 또는 아크릴아미드 겔 상에서의 시각화, 앰플리콘의 서열분석, 또는 서명 프로파일의 사용 (여기서 서명 프로파일은 용융 온도 또는 형광 서명 프로파일로 이루어진 군으로부터 선택됨)을 포함할 수 있다.
본 개시내용의 실시양태의 핵산 분자 또는 그의 절편은 PCR 증폭을 위한 프라이머로서 사용될 수 있다. PCR 증폭의 수행에 있어서, 프라이머와 주형 사이에 어느 정도의 미스매치는 용인될 수 있다. 따라서, 예시된 프라이머의 돌연변이, 결실, 및 삽입 (특히 뉴클레오티드의 5' 또는 3' 말단으로의 부가)은 본 개시내용의 범위에 포함된다. 돌연변이, 삽입 및 결실은 통상의 기술자에게 공지된 방법에 의해 주어진 프라이머에서 생산될 수 있다.
검출 방법의 또 다른 예는 문헌 [Winge (Innov. Pharma. Tech. 00:18-24, 2000)]에 기재된 파이로시퀀싱 기술이다. 이 방법에서, 인접한 게놈 DNA 및 삽입 DNA 접합부에 중첩되는 올리고뉴클레오티드가 설계된다. 올리고뉴클레오티드는 관심 영역으로부터의 단일-가닥 PCR 생성물에 혼성화하고 (삽입된 서열에서 하나의 프라이머 및 플랭킹 게놈 서열에서 하나의 프라이머), DNA 폴리머라제, ATP, 술푸릴라제, 루시퍼라제, 아피라제, 아데노신 5' 포스포술페이트 및 루시페린의 존재 하에 인큐베이션된다. dNTP는 개별적으로 첨가되고, 혼입은 측정되는 광 신호를 생성한다. 광 신호는 성공적인 증폭, 혼성화, 및 단일 또는 다중-염기 연장으로 인한 트랜스진 삽입물/플랭킹 서열의 존재를 나타낸다. (이러한 기술은 최초의 서열분석을 위해 사용되고, 특정 유전자가 공지된 경우에 그의 검출을 위해 사용되지 않는다.)
검출에 사용하기 위한 분자 비콘이 기재된 바 있다. 간략하게, 플랭킹 게놈 및 삽입 DNA 접합부에 중첩되는 FRET 올리고뉴클레오티드 프로브가 설계된다. FRET 프로브 특유의 구조로 인해 이는 형광 및 켄칭 모이어티를 매우 근접한 상태로 유지하는 2차 구조를 함유하게 된다. FRET 프로브 및 PCR 프라이머 (삽입 DNA 서열에서 하나의 프라이머 및 플랭킹 게놈 서열에서 하나의 프라이머)를 열안정성 폴리머라제 및 dNTP의 존재하에 사이클링한다. 성공적인 PCR 증폭 후에, FRET 프로브(들)의 표적 서열에 대한 혼성화는 프로브 2차 구조의 제거 및 형광 및 켄칭 모이어티의 공간 분리를 일으킨다. 형광 신호는 성공적인 증폭 및 혼성화로 인한 플랭킹 게놈/트랜스진 삽입 서열의 존재를 나타낸다.
택맨(TAQMAN)® (라이프 테크놀로지스(Life Technologies), 캘리포니아주 포스터 시티)으로 달리 공지된 가수분해 프로브 검정은 DNA 서열의 존재를 검출 및 정량화하는 방법이다. 간략하게, FRET 올리고뉴클레오티드 프로브는 트랜스진 내에 하나의 올리고, 및 이벤트-특이적 검출을 위해 플랭킹 게놈 서열에 하나를 갖도록 설계된다. FRET 프로브 및 PCR 프라이머 (삽입 DNA 서열에서 하나의 프라이머 및 플랭킹 게놈 서열에서 하나의 프라이머)를 열안정성 폴리머라제 및 dNTP의 존재하에 사이클링한다. FRET 프로브의 혼성화는 FRET 프로브 상의 켄칭 모이어티로부터의 형광 모이어티의 절단 및 방출을 일으킨다. 형광 신호는 성공적인 증폭 및 혼성화로 인한 플랭킹/트랜스진 삽입 서열의 존재를 나타낸다.
KASPar 검정은 DNA 서열의 존재를 검출 및 정량화하는 방법이다. 간략하게, KASPar® 검정 시스템으로 공지된 폴리머라제 연쇄 반응 (PCR) 기반 검정을 사용하여 표적화 게놈 유전자좌를 포함하는 게놈 DNA 샘플을 스크리닝한다. 본 개시내용의 실시에 사용된 KASPar® 검정은 다수의 프라이머를 함유하는 KASPar® PCR 검정 혼합물을 이용할 수 있다. PCR 검정 혼합물에 사용된 프라이머는 적어도 1개의 정방향 프라이머 및 적어도 1개의 역방향 프라이머를 포함할 수 있다. 정방향 프라이머는 공여자 DNA 폴리뉴클레오티드의 특정 영역에 상응하는 서열을 함유하고, 역방향 프라이머는 게놈 서열의 특정 영역에 상응하는 서열을 함유한다. 추가로, PCR 검정 혼합물에 사용된 프라이머는 적어도 1개의 정방향 프라이머 및 적어도 1개의 역방향 프라이머를 포함할 수 있다. 예를 들어, KASPar® PCR 검정 혼합물은 2개의 상이한 대립유전자에 상응하는 2개의 정방향 프라이머 및 1개의 역방향 프라이머를 사용할 수 있다. 정방향 프라이머 중 하나는 내인성 게놈 서열의 특정 영역에 상응하는 서열을 함유한다. 제2 정방향 프라이머는 공여자 DNA 폴리뉴클레오티드의 특정 영역에 상응하는 서열을 함유한다. 역방향 프라이머는 게놈 서열의 특정 영역에 상응하는 서열을 함유한다. 증폭 반응의 검출을 위한 이러한 KASPar® 검정은 본 개시내용의 한 실시양태이다.
일부 실시양태에서, 형광 신호 또는 형광 염료는 HEX 형광 염료, FAM 형광 염료, JOE 형광 염료, TET 형광 염료, Cy 3 형광 염료, Cy 3.5 형광 염료, Cy 5 형광 염료, Cy 5.5 형광 염료, Cy 7 형광 염료 및 ROX 형광 염료로 이루어진 군으로부터 선택된다.
다른 실시양태에서, 증폭 반응은 유동 세포측정법에 의해 측정가능한 농도 범위에서 세포 DNA를 염색할 수 있는 적합한 제2 형광 DNA 염료를 사용하여 진행되며, 실시간 써모사이클러에 의해 검출가능한 형광 방출 스펙트럼을 갖는다. 관련 기술분야의 통상의 기술자는 다른 핵산 염료가 공지되어 있으며 계속해서 확인되고 있다는 것을 인지해야 한다. 적절한 여기 및 방출 스펙트럼을 갖는 임의의 적합한 핵산 염료, 예컨대 YO-PRO-1®, SYTOX 그린®, SYBR 그린 I®, SYTO11®, SYTO12®, SYTO13®, BOBO®, YOYO® 및 TOTO®가 이용될 수 있다. 한 실시양태에서, 제2 형광 DNA 염료는 10 μM 미만, 4 μM 미만, 또는 2.7 μM 미만으로 사용되는 SYTO13®이다.
본 개시내용의 실시양태는 하기 실시예 추가로 예시된다. 이들 실시예는 단지 예시의 방식으로 제공된다는 것을 이해해야 한다. 상기 실시양태 및 하기 실시예로부터, 통상의 기술자는 본 개시내용의 본질적인 특징을 확인할 수 있고, 그의 취지 및 범위로부터 벗어나지 않으면서 다양한 용법 및 조건에 적합하도록 본 개시내용의 실시양태를 다양하게 변화 및 변형시킬 수 있다. 따라서, 본원에 제시되고 기재된 것들 이외에도, 본 개시내용의 실시양태의 다양한 변형이 상기 설명으로부터 통상의 기술자에게 명백해질 것이다. 이러한 변형은 또한 첨부된 청구범위의 범위 내에 속하는 것으로 의도된다. 다음은 예시의 방식으로 제공되고, 본 발명의 범위를 제한하는 것으로 의도되지 않는다.
실시예
실시예 1: 제아 메이스 내의 게놈 유전자좌에 결합하는 아연 핑거의 설계
표적화가능한 제아 메이스 게놈 유전자좌의 확인된 DNA 서열에 대해 지시된 아연 핑거 단백질을 이전에 기재된 바와 같이 설계하였다. 예를 들어, 문헌 [Urnov et al., (2005) Nature 435:646-551]을 참조한다. 예시적인 표적 서열 및 인식 나선은 표 1 (인식 나선 영역 설계) 및 표 2 (표적 부위)에 제시된다. 표 2에서, ZFP 인식 나선이 접촉하는 표적 부위 내의 뉴클레오티드를 대문자로 나타내고; 비-접촉된 뉴클레오티드를 소문자로 나타내었다. 아연 핑거 뉴클레아제 (ZFN) 표적 부위를 제아 메이스 내의 모든 72개의 선택된 게놈 유전자좌에 대해 설계하였다. 다수의 ZFP 설계를 개발하고, 제아 메이스에서 확인되고 선택된 72개의 상이한 대표적인 게놈 유전자좌 표적 부위를 갖는 효모 프록시 시스템에서 최고 수준의 효율로 결합하는 핑거를 확인하기 위해 시험하였다. 아연 핑거 인식 서열에 최고 수준의 효율로 결합하는 특이적 ZFP 인식 나선 (표 1)을 표적화 및 제아 메이스 게놈 내의 공여자 서열의 통합을 위해 사용하였다.
<표 1> 제아 메이스 선택된 게놈 유전자좌에 대한 아연 핑거 설계 (N/A는 "적용가능하지 않음"을 나타냄).
Figure 112016030402011-pct00001
Figure 112016030402011-pct00002
<표 2> 제아 메이스 선택된 게놈 유전자좌의 표적 부위.
Figure 112016030402011-pct00003
제아 메이스 대표적인 게놈 유전자좌 아연 핑거 설계를 CCHC 구조의 적어도 1개의 핑거를 갖는 단백질을 코딩하는 아연 핑거 발현 벡터 내로 혼입시켰다. 미국 특허 공개 번호 2008/0182332를 참조한다. 특히, 각각의 단백질 내의 마지막 핑거는 인식 나선에 대한 CCHC 백본을 가졌다. 비-정규 아연 핑거-코딩 서열을, 제아 메이스로부터 유래된 opaque-2 핵 국재화 신호 및 4개의 아미노산 링커를 통해 유형 IIS 제한 효소 FokI의 뉴클레아제 도메인 (문헌 [Wah et al., (1998) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95:10564-10569]의 서열의 아미노산 384-579)에 융합시켜 아연-핑거 뉴클레아제 (ZFN)를 형성하였다. 미국 특허 번호 7,888,121을 참조한다. 다양한 기능적 도메인에 대한 아연 핑거를 생체내 사용을 위해 선택하였다. 추정 게놈 표적 부위에 결합하도록 설계, 생산 및 시험된 다수의 ZFN 중에서, 상기 표 2에 기재된 ZFN이 생체내 활성을 갖는 것으로 확인되었고, 식물체내에서 고유 제아 메이스 게놈 폴리뉴클레오티드 표적 부위에 효율적으로 결합하고 이를 절단할 수 있다는 것을 특징으로 하였다.
ZFN 구축물 조립
이전에 기재된 바와 같이 확인된 ZFN 유전자 발현 구축물을 함유하는 플라스미드 벡터를 관련 기술분야에 통상적으로 공지된 기능 및 기술을 사용하여 설계하고 완성하였다 (예를 들어, 문헌 [Ausubel 또는 Maniatis] 참조). 각각의 ZFN-코딩 서열을 아연 핑거 뉴클레아제의 상류에 위치한 opaque-2 핵 국재화 신호 (Maddaloni et al., (1989) Nuc. Acids Res. 17:7532)를 코딩하는 서열에 융합시켰다. 비-정규 아연 핑거-코딩 서열을 유형 IIS 제한 효소 FokI의 뉴클레아제 도메인에 융합시켰다 (amino acids 384-579 of the sequence of Wah et al. (1998) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95:10564-10569). 융합 단백질의 발현은 제아 메이스 유비퀴틴 유전자 (5' 비번역 영역 (UTR) 포함)로부터 강한 구성적 프로모터에 의해 유도되었다 (Toki et al., (1992) Plant Physiology 100;1503-07). 발현 카세트는 또한 제아 메이스 퍼옥시다제 5 유전자 (Per5) 유전자로부터의 3' UTR (전사 종결인자 및 폴리아데닐화 부위 포함)을 포함하였다 (미국 특허 공개 번호 2004/0158887). 토세아 아시그나(Thosea asigna) 바이러스 (Szymczak et al., (2004) Nat Biotechnol. 22:760-760)로부터의 뉴클레오티드 서열을 코딩하는 자가-가수분해 2A를 구축물 내로 클로닝된 2개의 아연 핑거 뉴클레아제 융합 단백질 사이에 부가하였다.
플라스미드 벡터를 인-퓨전(IN-FUSION)™ 어드밴티지 테크놀로지(Advantage Technology) (클론테크(Clontech), 캘리포니아주 마운틴 뷰)를 사용하여 조립하였다. 제한 엔도뉴클레아제는 뉴 잉글랜드 바이오랩스(New England BioLabs) (매사추세츠주 입스위치)로부터 입수하였고, T4 DNA 리가제 (인비트로젠, 캘리포니아주 칼스배드)를 DNA 라이게이션을 위해 사용하였다. 플라스미드 제조는 공급업체의 지침에 따라 뉴클레오스핀(NUCLEOSPIN)® 플라스미드 키트 (머셔레이-나겔 인크.(Macherey-Nagel Inc.), 펜실베니아주 베들레헴)) 또는 플라스미드 미디 키트(Plasmid Midi Kit) (퀴아젠(Qiagen))를 사용하여 수행하였다. DNA 단편을 아가로스 트리스-아세테이트 겔 전기영동 후에 퀴아퀵 겔 익스트랙션 키트(QIAQUICK GEL EXTRACTION KIT)™ (퀴아젠)를 사용하여 단리하였다. 모든 라이게이션 반응의 콜로니를 초기에 미니프렙 DNA의 제한 소화에 의해 스크리닝하였다. 선택된 클론의 플라스미드 DNA를 상업적 서열분석 업체 (유로핀스 MWG 오페론(Eurofins MWG Operon), 앨라배마주 헌츠빌)에 의해 서열분석하였다. 서열 데이터를 조립하고, 시퀀처™ 소프트웨어 (진 코드스 코포레이션(Gene Codes Corp.), 미시건주 앤 아버)를 사용하여 분석하였다.
범용 공여자 구축물 조립
다수의 표적 유전자좌의 신속한 시험을 지지하기 위해, 신규, 가요성 범용 공여자 시스템 서열을 설계하고, 구축하였다. 범용 공여자 폴리뉴클레오티드 서열은 고처리량 벡터 구축 방법론 및 분석과 상용성이었다. 범용 공여자 시스템은 적어도 3개의 모듈 도메인으로 구성되었다: 비-가변 ZFN 결합 도메인, 분석 및 사용자 규정 특징 도메인, 및 벡터 스케일 업을 위한 단순 플라스미드 백본. 비-가변 범용 공여자 폴리뉴클레오티드 서열은 모든 공여자에 공통적이었고, 모든 제아 메이스 표적 부위에 걸쳐 사용될 수 있는 유한 집합의 검정의 설계를 허용하며, 따라서 표적화 평가에서의 균일성을 제공하고 분석 사이클 시간을 감소시킨다. 이들 도메인의 모듈 특성은 고처리량 공여자 조립을 허용하였다. 추가로, 범용 공여자 폴리뉴클레오티드 서열은 하류 분석을 단순화하고 결과의 해석을 증진시키는 것을 목표로 하는 다른 고유 특징을 갖는다. 이는 진단적으로 예측된 크기로의 PCR 생성물의 소화를 가능하게 하는 비대칭 제한 부위 서열을 함유하였다. PCR 증폭에서 문제가 될 것으로 예상된 2차 구조를 포함하는 서열을 제거하였다. 범용 공여자 폴리뉴클레오티드 서열은 크기가 작았다 (3.0 Kb 미만). 최종적으로, 범용 공여자 폴리뉴클레오티드 서열은 대량의 시험 DNA가 시기적절한 방식으로 벌크화되도록 하는 고 카피 pUC19 백본 상에 구축하였다.
한 실시양태로서, 범용 폴리뉴클레오티드 공여자 카세트 서열을 포함하는 플라스미드의 예는 서열 132 및 도 1로서 제공된다. 추가 실시양태에서, 폴리뉴클레오티드 공여자 카세트 서열은 pDAB111846, 서열 133, 도 2; pDAB117415, 서열 134, 도 3; pDAB117416, 서열 135, 도 4; pDAB117417, 서열 136, 도 5; pDAB117419, 서열 137, 도 6; pDAB117434 서열 138, 도 7; pDAB117418, 서열 139, 도 8; pDAB117420, 서열 140, 도 9; 및 pDAB117421, 서열 141, 도 10으로서 제공된다. 또 다른 실시양태에서, 기능적 발현 코딩 서열 또는 무기능 (프로모터가 없는) 발현 코딩 서열을 갖는 범용 공여자 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 추가의 서열이 구축될 수 있다. 범용 공여자 시스템을 구성하는 다양한 도메인 (비-가변 ZFN 결합 도메인, 분석 및 사용자 규정 특징 도메인, 및 단순 플라스미드 백본)은 표 3에서 상기 기재된 바와 같은 구축물에 대해 주석 처리된다.
<표 3> 비-가변 ZFN 결합 도메인, 분석 및 사용자 규정 특징 도메인, 및 플라스미드 백본을 확인하기 위한 범용 공여자 시스템 벡터의 주석.
Figure 112016030402011-pct00004
또 다른 실시양태에서, 범용 공여자 폴리뉴클레오티드 서열은 플라스미드로서 전달된 작은 2-3 Kb 모듈 공여자 시스템이다. 이는, 제한 부위 및 프라이머 설계를 위한 DNA 서열 (프라이머는 임의의 계산된 2차 구조보다 10℃ 더 높은 Tm으로 설계됨) 또는 코딩 서열 및 단순 플라스미드 백본을 보유하는, "DNA X" 또는 "UZI 서열" 또는 "분석 도메인" (서열 142 및 서열 143)으로 지칭되는 짧은 100-150 bp 주형 영역인, 임의의 수의 ZFN 결합 부위를 포함하는 최소 공여자이다 (도 11). 한 실시양태에서, 분석 도메인은, 40 내지 60%의 구아닌 및 시토신 염기 쌍 백분율을 함유하고; 9 Bp 초과의 반복 서열 (예를 들어, 5'-gtatttcatgtatttcat-3')을 함유하지 않으며; 9 Bp초과의 일련의 동일한 염기 쌍을 함유하지 않도록 설계되고; 문헌 [Markham, N. R. & Zuker, M. (2008) UNAFold: software for nucleic acid folding and hybridization. In Keith, J. M., editor, Bioinformatics, Volume II. Structure, Function and Applications, number 453 in Methods in Molecular Biology, chapter 1, pages 3-31. Humana Press, Totowa, NJ. ISBN 978-1-60327-428-9]에서 계산된 바와 같이 자유 에너지가 -18 kcal/mol 미만인 2차 구조가 없다. 표 4를 참조한다. 전체 플라스미드는 적절한 ZFN 결합 부위에서 DNA 이중 가닥 파괴 후에 NHEJ를 통해 삽입되고; ZFN 결합 부위는 탠덤 혼입될 수 있다. 범용 공여자 폴리뉴클레오티드 서열의 이러한 실시양태는 표적 부위 및 ZFN의 신속한 스크리닝에 가장 적합하고, 증폭시키기 어려운 서열은 공여자에서 최소화된다.
<표 4> ΔG 자유 에너지, 동일한 염기 쌍의 9 Bp 진행의 수, 9 Bp 초과의 반복 서열의 수, 및 구아닌 / 시토신 백분율에 대한 분석 도메인 조성물의 분석.
Figure 112016030402011-pct00005
추가 실시양태에서, 범용 공여자 폴리뉴클레오티드 서열은 적어도 4개의 모듈로 구성되고, 부분 ZFN 결합 부위, 상동성 아암, 대략 100 bp 분석 조각 또는 코딩 서열을 갖는 DNA X를 보유한다. 범용 공여자 폴리뉴클레오티드 서열의 이러한 실시양태는 여러 ZFN을 사용하여 다양한 폴리뉴클레오티드 표적 부위에서의 NHEJ 매개 유전자 삽입을 조사하는데 적합하다. (도 12).
범용 공여자 폴리뉴클레오티드 서열은 2가지 방식의 표적화 공여자 삽입 (NHEJ/HDR)에서 규정된 DNA 결합 도메인을 갖는 모든 표적화 분자와 함께 사용될 수 있다. 이에 따라, 범용 공여자 폴리뉴클레오티드 서열이 적절한 ZFN 발현 구축물과 공동-전달되는 경우에, 공여자 벡터 및 옥수수 게놈은 둘 다 특정한 ZFN의 결합에 의해 지시된 1개의 특이적 위치에서 절단되다. 선형화되면, 공여자는 NHEJ 또는 HDR에 의해 게놈 내로 혼입될 수 있다. 이어서, 벡터 설계에서의 다양한 분석 고려사항을 이용하여 표적화 통합의 효율적 전달을 최대화하는 아연 핑거를 결정할 수 있다. (도 13).
실시예 2: 제아 메이스 형질전환 절차
제아 메이스 c.v. Hi-II 원형질체로의 전달 전에, 각각의 ZFN 구축물에 대한 플라스미드 DNA를 공급업체의 지침에 따라 퓨어 일드 플라스미드 맥시프렙 시스템(PURE YIELD PLASMID MAXIPREP SYSTEM)® (프로메가 코포레이션(Promega Corporation), 위스콘신주 매디슨) 또는 플라스미드 맥시 키트(PLASMID MAXI KIT)® (퀴아젠, 캘리포니아주 발렌시아)를 사용하여 이. 콜라이의 배양물로부터 제조하였다.
원형질체 단리
제아 메이스 c.v. Hi-II 현탁 세포를 3.5일 유지 스케줄로 유지하고, 4 mL 충전 세포 부피 (PCV)의 세포를 수집하고, 효소 용액 (0.6% 펙토리아제(PECTOLYASE)™, 6% 셀룰라제(CELLULASE)™ ("오노주카(Onozuka)" R10; 야쿠르트 파마슈티칼스(Yakult Pharmaceuticals), 일본), 4 mM MES (pH 5.7), 0.6 M 만니톨, 15 mM MgCl2) 20 mL를 함유하는 50 mL 멸균 원추형 튜브 (피셔 사이언티픽(Fisher Scientific))로 옮겼다. 배양물을 마개를 막고, 파라필름(PARAFILM)™으로 감싸고, 원형질체가 방출될 때까지 실온에서 16-18시간 동안 인큐베이션하기 위해 10으로 설정된 속도로 플랫폼 로커 (써모 사이언티픽(Thermo Scientific), 배리 믹스 플랫폼 로커(Vari Mix platform Rocker))에 두었다. 인큐베이션 후에, 세포를 소화의 품질에 대해 현미경으로 평가하였다. 소화된 세포를 100 μm 세포 스트레이너를 통해 여과하고, 10 mL W5 배지 [2mM MES (pH5.7), 205 mM NaCl, 167 mM CaCl2, 6.7mM KCl]로 세정하고, 이어서 70 μm 및 40 μm 세포 스트레이너를 통해 여과하였다. 100 μm 및 40 μm 스트레이너를 10 mL W5 배지로 세정하였다. 여과된 원형질체를 세정된 배지와 함께 50 ml 원심분리 튜브에 수집하였고, 최종 부피는 대략 40 mL였다. 이어서, "헤비 그래디언트(Heavy Gradient) 용액" [500 mM 수크로스, 1mM CaCl2, 5mM MES (pH6.0)] 8mL를 원형질체/효소 용액의 하부에 천천히 첨가하고, 300-350 x g로 15분 동안 스윙 암 버킷 로터를 사용한 원심분리로 원심분리하였다. 원심분리에 후에, 원형질체 밴드 약 7-8 mL를 제거하고, W5 25 mL로 세척하고, 180-200 x g로 15분 동안 원심분리하였다. 이어서, 원형질체를 MMG 용액 [4 mM MES (pH 5.7), 0.6 M 만니톨, 15 mM MgCl2] 10mL 중에 재현탁시켰다. 원형질체를 혈구계 또는 유동 세포측정기를 사용하여 계수하고, MMG를 사용하여 ml당 1.67백만개로 희석하였다.
PEG를 사용한 제아 메이스 c.v. Hi-II 현탁 배양물 유래 원형질체의 형질전환
대략 0.5백만개의 원형질체 (MMG 용액 중 300 μL)를 2 mL 튜브로 옮기고, DNA 40 μL와 혼합하고, 실온에서 5-10분 동안 인큐베이션하였다. 그 다음, 새로 제조한 PEG 용액 (36% PEG 4000, 0.3 M 만니톨, 0.4M CaCl2) 300 μL를 첨가하고, 혼합물을 반전에 의해 주기적으로 혼합하면서 15-20분 동안 실온에서 인큐베이션하였다. 인큐베이션 후, W5 세척액 1 mL를 천천히 첨가하고, 세포를 부드럽게 혼합하고, 원형질체를 15분 동안 180-200 x g로 원심분리에 의해 펠릿화하였다. 펠릿을 WI 배지 [4mM MES (pH 5.7), 0.6 M 만니톨, 20 mM KCl] 1 ml 중에 재현탁시키고, 튜브를 알루미늄 호일로 감싸고, 약 16시간 동안 밤새 실온에서 인큐베이션하였다.
ZFN 및 공여자의 형질전환
각각의 선택된 게놈 유전자좌에 대해, 제아 메이스 원형질체를 yfp 유전자 발현 대조군, ZFN 단독, 공여자 단독, 및 ZFN 및 공여자의 1:10 비 (중량 기준)의 혼합물로 형질감염시켰다. 0.5백만개의 원형질체의 형질감염을 위한 DNA의 총량은 80 μg이었다. 모든 처리는 3 또는 6회 반복하여 수행하였다. 사용된 yfp 유전자 발현 대조군은 제아 메이스 유비퀴틴 1 프로모터 - 황색 형광 단백질 코딩 서열 - 제아 메이스 Per5 3'UTR 및 벼 액틴1 프로모터 - pat 코딩 서열 - 제아 메이스 리파제 3'UTR 유전자 발현 카세트를 함유하는 pDAB8393 (도 14)이었다. 전형적인 표적화 실험에서, ZFN 단독 4 μg을, 또는 이를 공여자 36 μg과 함께 공동-형질감염시키고, YFP 리포터 유전자 구축물 40 μg을 각각의 처리에 첨가하였다. 충전제로서 일정한 양의 yfp 유전자 발현 플라스미드의 포함은 다수의 유전자좌에 걸친 형질감염 품질의 평가 및 반복 처리를 가능하게 한다. 추가로, 일정한 양의 yfp 유전자 발현 플라스미드의 사용은 공여자 삽입의 신속 표적화 분석에서 임의의 기술적 문제의 빠른 트러블 슈팅을 가능하게 한다.
실시예 3: 아연 핑거 뉴클레아제를 통한 제아 메이스에서의 게놈 유전자좌의 절단
ZFN 형질감염된 제아 메이스 c.v. Hi-II 원형질체를 형질감염 24시간 후에 2 mL 에펜도르프(EPPENDORF)™ 튜브에서 1600 rpm으로 원심분리하여 수확하고, 상청액을 제거하였다. 게놈 DNA를 퀴아젠 플랜트 DNA 익스트랙션 키트™ (퀴아젠, 캘리포니아주 발렌시아)를 사용하여 원형질체 펠릿으로부터 추출하였다. 단리된 DNA를 물 50 μL 중에 재현탁시키고, 농도를 나노드롭(NANODROP)® (인비트로젠, 뉴욕주 그랜드 아일랜드)에 의해 결정하였다. DNA의 정체를 0.8% 아가로스 겔 전기영동 상에 샘플을 진행시킴으로써 추정하였다. 서열분석 (일루미나, 인크.(Illumina, Inc.), 캘리포니아주 샌디에고)을 위한 앰플리콘을 생성하기 위한 PCR 증폭을 위해 모든 샘플을 정규화하였다 (20-25 ng/μL). 처리 샘플 및 대조군 샘플로부터의 각각의 시험 ZFN 인식 서열을 포함하는 영역을 증폭시키기 위한 바코딩된 PCR 프라이머를 IDT (아이오와주 코랄빌, HPLC 정제됨)로부터 설계하고 구입하였다. 최적 증폭 조건을 23.5 μL 반응물 중 0.2 μM 적절한 바코딩된 프라이머, 아큐프라임 PFX 슈퍼믹스(ACCUPRIME PFX SUPERMIX)™ (인비트로젠, 캘리포니아주 칼스배드) 및 주형 게놈 DNA 100 ng을 사용하여 구배 PCR에 의해 확인하였다. 사이클링 파라미터는 95℃에서의 초기 변성 (5분), 이어서 변성 (95℃, 15초), 어닐링 (55-72℃, 30초), 연장 (68℃, 1분)의 35회 사이클, 및 최종 연장 (68℃, 7분)이었다. 증폭 생성물을 3.5% TAE 아가로스 겔 상에서 분석하고, 각각의 프라이머 조합에 적절한 어닐링 온도를 결정하고, 이를 사용하여 상기 기재된 바와 같은 대조군 및 ZFN 처리된 샘플로부터 앰플리콘을 증폭시켰다. 모든 앰플리콘을 3.5% 아가로스 겔 상에서 정제하고, 물 중에서 용리시키고, 농도를 나노드롭™에 의해 결정하였다. 차세대 서열분석을 위해, ZFN 처리된 및 상응하는 옥수수 원형질체 대조군으로부터의 PCR 앰플리콘 대략 100 ng을 함께 모으고, 일루미나 차세대 서열분석 (NGS)을 사용하여 서열분석하였다.
각각의 제아 메이스 선택된 게놈 유전자좌에서의 적절한 ZFN의 절단 활성을 검정하였다. ZFN 절단 부위를 포함하는 짧은 앰플리콘을 게놈 DNA로부터 증폭시키고, 일루미나 NGS에 적용하였다 (ZFN 처리된 및 대조군 원형질체로부터). ZFN 유도된 절단 또는 DNA 이중 가닥 파괴를 절단 부위에서의 뉴클레오티드의 삽입 또는 결실 (Indel)에 의한 세포 NHEJ 복구 경로에 의해 해결하였으며, 따라서 절단 부위에서의 Indel의 존재는 ZFN 활성의 척도이며, 이를 NGS에 의해 결정하였다. 표적 특이적 ZFN의 절단 활성을 NGS 분석 소프트웨어 (특허 공개 2012-0173,153, DNA 서열의 데이터 분석)를 사용하여 1백만개의 고품질 서열당 Indel를 갖는 서열의 수로 추정하였다 (도 15). 대조군에 비해 5-100배 범위의 활성이 제아 메이스 선택된 게놈 유전자좌 표적에 대해 관찰되었고, 각각의 ZFN 절단 부위에서의 Indel의 다양한 발자국을 나타낸 서열 정렬에 의해 추가로 확인하였다. 이러한 데이터는 제아 메이스 선택된 게놈 유전자좌가 ZFN에 의해 절단될 수 있다는 것을 시사한다. 각각의 표적에서의 차등 활성은 그의 염색질 상태 및 절단에 대한 순종성 뿐만 아니라 각각의 ZFN의 발현의 효율을 반영한다.
실시예 4: 폴리뉴클레오티드 공여자의 통합의 신속 표적화 분석
아연 핑거 뉴클레아제를 통한 제아 메이스에서의 게놈 유전자좌 내의 서열
비-상동 말단 연결 (NHEJ) 매개 공여자 삽입을 통한 제아 메이스 선택된 게놈 유전자좌 표적 내의 범용 공여자 폴리뉴클레오티드 서열의 표적화의 확인을 반-처리량 원형질체 기반 신속 표적화 분석 방법을 사용하여 수행하였다. 각각의 제아 메이스 선택된 게놈 유전자좌 표적에 대해, 3 내지 6개의 ZFN 설계를 시험하고, 표적화를 차세대 서열분석 방법 (도 15)에 의한 ZFN 매개 절단의 측정 및 접합 인-아웃 PCR (도 16)에 의한 공여자 삽입의 측정에 의해 평가하였다. 검정 둘 다에서 양성인 제아 메이스 선택된 게놈 유전자좌를 표적화가능한 유전자좌로서 확인하였다.
ZFN 공여자 삽입 신속 표적화 분석
제아 메이스 선택된 게놈 유전자좌 표적이 공여자 삽입을 위해 표적화될 수 있는지를 결정하기 위해, ZFN 구축물 및 범용 공여자 폴리뉴클레오티드 구축물을 옥수수 원형질체로 공동-전달하고, 이를 24시간 동안 인큐베이션한 후, 분석을 위해 게놈 DNA를 추출하였다. 발현된 ZFN이 제아 메이스 선택된 게놈 유전자좌 표적 및 공여자 둘 다에서 표적 결합 부위를 컷팅할 수 있었던 경우에, 선형화된 공여자는 비-상동 말단 연결 (NHEJ) 경로를 통해 옥수수 게놈 내의 절단된 표적 부위 내로 삽입되었을 것이다. 제아 메이스 선택된 게놈 유전자좌 표적에서의 표적화된 통합의 확인을 "아웃" 프라이머가 천연 게놈 유전자좌에서의 서열을 인식하고 "인" 프라이머가 공여자 DNA 내의 서열에 결합하는 "인-아웃" PCR 전략에 기초하여 수행하였다. 공여자 DNA가 제아 메이스 선택된 게놈 유전자좌 표적에 삽압된 경우에만 PCR 검정이 예상된 크기의 증폭 생성물을 생산하는 방식으로 프라이머를 설계하였다. 인-아웃 PCR 검정을 삽입 접합부의 5'- 및 3'-말단 둘 다에서 수행하였다. 통합된 폴리뉴클레오티드 공여자 서열의 분석에 사용된 프라이머를 표 5에 제공하였다.
네스티드 "인-아웃" PCR을 사용한 표적 유전자좌에서의 ZFN 공여자 삽입
모든 PCR 증폭은 타카라(TAKARA) EX TAQ HS™ 키트 (클론테크(Clonetech), 캘리포니아주 마운틴 뷰)를 사용하여 수행하였다. 제1 인-아웃 PCR을 1X 타카라 EX TAQ HS™ 완충제, 0.2 mM dNTP, 0.2 μM "아웃" 프라이머 (표 5), 0.05 μM "인" 프라이머 (상기 기재된 범용 공여자 카세트로부터 설계), 0.75 단위의 타카라 EX TAQ HS™ 폴리머라제 및 10 ng 추출된 옥수수 원형질체 DNA를 함유하는 20 μL 최종 반응 부피로 수행하였다. 이어서, 2분 동안 94℃, 12초 동안 98℃ 및 2분 동안 68℃의 20 사이클, 이어서 10분 동안 72℃ 및 4℃에서 유지로 이루어진 PCR 프로그램을 사용하여 반응을 수행하였다. 최종 PCR 생성물을 시각화를 위해 1KB 플러스 DNA 래더(1KB PLUS DNA LADDER)™ (라이프 테크놀로지스(Life Technologies), 뉴욕주 그랜드 아일랜드)와 함께 아가로스 겔 상에서 진행시켰다.
네스티드 인-아웃 PCR을 1X 타카라 EX TAQ HS™ 완충제, 0.2 mM dNTP, 0.2 μM "아웃" 프라이머 (표 5), 0.1 μM "인" 프라이머 (상기 기재된 범용 공여자 카세트로부터 설계, 표 6), 0.75 단위의 타카라 EX TAQ HS™ 폴리머라제 및 1 μL의 제1 PCR 생성물을 함유하는 20 μL 최종 반응 부피로 수행하였다. 이어서, 2분 동안 94℃, 12초 동안 98℃, 30초 동안 66℃ 및 45초 동안 68℃의 31 사이클, 이어서 10분 동안 72℃ 및 4℃에서 유지로 이루어진 PCR 프로그램을 사용하여 반응을 수행하였다. 최종 PCR 생성물을 시각화를 위해 1KB 플러스 DNA 래더™ (라이프 테크놀로지스, 뉴욕주 그랜드 아일랜드)와 함께 아가로스 겔 상에서 진행시켰다.
<표 5> 최적 게놈 유전자좌의 네스티드 인-아웃 PCR 분석을 위한 모든 "아웃" 프라이머의 목록.
Figure 112016030402011-pct00006
Figure 112016030402011-pct00007
Figure 112016030402011-pct00008
<표 6> 최적 게놈 유전자좌의 네스티드 인-아웃 PCR 분석을 위한 모든 "인" 프라이머의 목록.
Figure 112016030402011-pct00009
<표 7> ZFN 절단 활성을 위한 프라이머.
Figure 112016030402011-pct00010
원형질체 표적화 시스템에서의 인-아웃 PCR 검정의 전개는, 대량의 플라스미드 DNA가 형질감염에 사용되며 대량의 플라스미드 DNA가 원형질체 표적화 시스템에 남고 세포 게놈 DNA 함께 후속적으로 추출되기 때문에 특히 과제가 되어 왔다. 나머지 플라스미드 DNA는 게놈 DNA의 상대 농도를 희석시키고 검출의 전반적 감수성을 감소시킬 수 있으며, 또한 비-특이적인 이상 PCR 반응의 중요한 원인이 될 수 있다. ZFN 유도된 NHEJ-기반 공여자 삽입은 전형적으로 정방향 또는 역방향 배향으로 일어난다. 정방향 배향 삽입에 대한 DNA의 인-아웃 PCR 분석은, 아마도 표적 내의 ZFN 결합 부위 주위의 상동성의 공유 영역, 및 증폭 과정 동안 비통합 공여자 DNA의 프라이밍 및 연장을 일으킬 수 있었던 공여자로 인해 종종 가양성 밴드를 나타내었다. 가양성은 역방향 배향 삽입 생성물에 대해 프로빙하는 분석에서는 나타나지 않았으며, 따라서 모든 표적화 공여자 통합 분석을 신속 표적화 분석에서 역방향 공여자 삽입을 조사하도록 수행하였다. 특이성을 추가로 증가시키고 배경을 감소시키기 위해, 네스티드 PCR 전략을 또한 이용하였다. 네스티드 PCR 전략은 제1 PCR 반응의 제1 증폭 생성물 내의 더 짧은 영역을 증폭시키는 제2 PCR 증폭 반응을 사용하였다. 비대칭 양의 "인" 및 "아웃" 프라이머의 사용은 선택된 게놈 유전자좌에서의 신속 표적화 분석에 대하여 접합 PCR을 추가로 최적화하였다.
인-아웃 PCR 분석 결과를 아가로스 겔 상에서 시각화하였다. 모든 제아 메이스 선택된 게놈 유전자좌에 대해, "ZFN + 공여자 처리"는 5' 및 3' 말단에서 거의 예상된 크기의 밴드를 생산하였다. 대조 ZFN 또는 공여자 단독 처리는 PCR에서 음성이었으며, 이는 상기 방법이 표적 부위에서의 공여자 통합에 대해 특이적으로 스코어링하였다는 것을 시사한다. 모든 처리는 3 내지 6회 반복하여 수행하였고, 다수의 반복 (양쪽 말단에서 ≥ 2)에서 예상되는 PCR 생성물의 존재를 사용하여 표적화를 확인하였다. NHEJ를 통한 공여자 삽입은 표적 및/또는 공여자 ZFN 부위에서 선형화된 말단의 프로세싱으로 인해 생성되는 보다 낮은 강도의 부산물을 종종 생산한다. 추가로, 일부 ZFN은 일관되게 높은 수준의 공여자 통합을 생산하고 일부 ZFN은 보다 덜 일관된 수준의 공여자 통합을 생산하며 다른 ZFN은 어떠한 통합도 일으키지 않으면서, 다양한 ZFN가 다양한 수준의 표적화 통합에 대한 효율을 일으켰음이 관찰되었다. 전체적으로, 시험된 각각의 제아 메이스 선택된 게놈 유전자좌 표적에 대해, 1종 이상의 ZFN에 의한 제아 메이스 대표적인 게놈 유전자좌 표적 내에서의 표적화 통합이 나타났으며, 이로써 각각의 이들 유전자좌가 표적화가능하였음이 확인된다. 게다가, 각각의 제아 메이스 선택된 게놈 유전자좌 표적은 정밀 유전자 형질전환에 적합하였다. 이들 제아 메이스 선택된 게놈 유전자좌 표적의 확인을 다수회 반복하였고, 매번 유사한 결과가 얻어졌으며, 이로써 플라스미드 설계 및 구축물, 원형질체 형질전환, 샘플 프로세싱 및 샘플 분석을 포함하는 확인 방법의 재현성이 확인된다.
결론
공여자 플라스미드, 및 제아 메이스 선택된 게놈 유전자좌 표적을 특이적으로 절단하도록 설계된 1개의 ZFN을 제아 메이스 c.v. Hi-II 원형질체 내로 형질감염시키고, 세포를 24시간 후에 수확하였다. 인-아웃 접합 PCR에 의한 대조군, ZFN 처리된 및 ZFN와 공여자 처리된 원형질체로부터 단리된 게놈 DNA의 분석은 ZFN 에 의한 게놈 DNA 절단의 결과로서 범용 공여자 폴리뉴클레오티드의 표적화 삽입을 제시하였다 (표 8). 이들 연구는, 범용 공여자 폴리뉴클레오티드 시스템이 내인성 부위에서의 표적화를 평가하고 후보 ZFN을 스크리닝하는데 사용될 수 있다는 것을 제시한다. 최종적으로, 원형질체 기반 신속 표적화 분석 및 신규 범용 공여자 폴리뉴클레오티드 서열 시스템은 식물에서의 정밀 게놈 조작 노력을 위해 게놈 표적 및 ZFN을 스크리닝하기 위한 개선된 시스템을 제공한다. 상기 방법은 DNA 이중 또는 단일 가닥 파괴를 도입하는 임의의 뉴클레아제를 사용한 임의의 관심 시스템의 게놈 표적에서의 부위 특이적 절단 및 공여자 삽입을 평가하기 위해 확장될 수 있다.
<표 8> 제아 메이스 선택된 게놈 유전자좌 표적 내의 범용 공여자 폴리뉴클레오티드 서열의 통합의 결과.
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실시예 5: 옥수수 원형질체 생성 및 형질감염
원형질체를 세포벽 소화 효소 (셀룰라제, "오노주카" R10 - 야쿠르트 파마슈티칼스, 일본; 및 펙토리아제, 320952 - MP 바이오메디칼스, 캘리포니아주 산타 아나)와의 인큐베이션에 의해 제아 메이스 c.v. Hi-II 현탁 세포로부터 유도하고, 수크로스 구배를 사용하여 정제하였다. 형질감염을 위해, 원형질체를 MMG (MES pH6.0, 0.6M 만니톨, 15 mM MgCl2)를 사용하여 1.67백만개/ml의 농도로 희석하고, 원형질체 300 μL (~500, 000개)를 멸균 2 ml 튜브 내로 분취하고, 플라스미드 DNA (YFP 트랜스진 발현 카세트, ZFN 트랜스진 발현 카세트, 폴리뉴클레오티드 공여자 트랜스진 발현 카세트, 조합 ZFN/ 폴리뉴클레오티드 공여자 트랜스진 발현 카세트 포함)를 각각의 2 ml 튜브에 40 μg의 총 농도로 첨가하고, 부드럽게 혼합하고, 실온에서 5-10분 동안 인큐베이션하였다. 그 다음, PEG 4000 300 μL를 원형질체/DNA 용액에 첨가하고, PEG 4000이 원형질체/DNA 용액과 완전히 혼합될 때까지 혼합물을 반전시켰다. 그 다음, 원형질체/DNA/PEG 혼합물을 실온에서 15-20분 동안 인큐베이션하였다. 인큐베이션 후에, 원형질체/DNA/PEG 혼합물을 W5 (2 mM MES pH6.0, 205 mM NaCl, 167 mM CaCl2, 6.7mM KCl) 1 ml로 세척하고, 15분 동안 180-200 x g로 원심분리하였다. 상청액의 제거 후에, WI 배지 (4 mM MES pH6.0, 0.6 M 만니톨, 20 mM KCl) 1 ml를 첨가하고, 이를 사용하여 세포 원형질체 펠릿을 재현탁시켰다. 재현탁된 펠릿을 알루미늄 호일로 덮고, 밤새 인큐베이션하였다. 원형질체 형질감염 효율을 베크만-쿨터 인크.(Beckman-Coulter Inc.) (캘리포니아주 브레아)로부터의 퀀타 플로우사이토미터(Quanta Flowcytometer)™를 사용하여 계산하였으며, 형질감염 효율은 10-50% 범위 내로 계산되었다. 모든 형질감염 처리는 6회 반복으로 수행하였다.
제아 메이스 c.v. Hi-II 유래 원형질체에 대해 앞서 기재된 것과 유사한 형질감염 프로토콜을 제아 메이스 c.v. B104 원형질체의 단리를 위해 전개하였다. 원형질체는, 껍질을 얇은 (약 0.5 mm) 스트립으로 수동으로 슬라이싱한 다음 십자형으로 슬라이싱함으로써 유약 껍질 조직으로부터 수득하였다. 슬라이싱된 조직을 효소 용액 25 ml를 함유하는 멸균 삼각 플라스크 내로 이동시키고, 플라스크를 15분 동안 건조 챔버에 두었다. 이어서, 플라스크를 마개를 막고, 알루미늄 호일로 덮고, 실온에서 가장 낮은 속도의 오비탈 진탕기 상에서 밤새 진탕시켰다.
실시예 6: 조작된 랜딩 패드 게놈 부위 내에 통합된 공여자 폴리뉴클레오티드의 신속 표적화 분석
옥수수 내의 조작된 유전자좌에서의 공여자 삽입: 미국 특허 출원 번호 2011/0191899에 기재된 바와 같은 분석을 사용하여 조작된 랜딩 패드 1 (ELP1) 게놈 표적 내의 5 Kb 공여자의 삽입을 입증하였다. 공여자 DNA를 NHEJ 통합 방법을 통해 제아 메이스 c.v. Hi-II 세포주 원형질체 (상기 세포주, "106685[1]-007"은 pDAB106685의 형질전환 및 통합으로부터 생산됨)의 게놈 내에 삽입하였다. 공여자는 ZFN1 및 ZFN3 아연 핑거 결합 부위 내에 통합되었다 (도 18). ELP1 게놈 표적 내의 NHEJ 매개 통합에 사용된 접근법은 ELP1 표적 및 공여자 플라스미드가 동일한 ZFN 부위 (ZFN1 또는 ZFN3)를 함유할 것을 필요로 하였다. 공여자 폴리뉴클레오티드 서열 및 ZFN이 원형질체 세포로 형질감염됨에 따라, ZFN은 ELP1 게놈 표적 및 플라스미드 공여자 DNA를 절단하고, 이로써 동일한 말단이 생성된다. 생성된 동일한 말단은 NHEJ 매개 세포 복구를 통해 라이게이션되어 ELP1 게놈 표적 내의 플라스미드 공여자 DNA의 표적화 삽입을 일으킨다. 2가지 상이한 ZFN-대-공여자 몰비 (1:1 및 1:10)를 사용하여 ELP1 게놈 표적의 표적화를 입증하였다. 유전자좌 파괴 검정 및 인-아웃 PCR을 사용하여 공여자 통합의 결과를 확인하였으나, 비대칭 PCR 프라이머 농도는 포함되지 않았다. 공여자 폴리뉴클레오티드 서열의 삽입은 2가지 배향으로 일어날 수 있으며, 인-아웃 PCR을 양쪽 배향의 검출을 위해 설계하였다.
파괴 검정: 파괴 검정은 게놈 DNA 서열 ZFN 결합 부위가 변형되거나 재배열되었는지 여부를 측정하는 가수분해 프로브 검정 (택맨(Taqman)™과 유사)이다. 따라서, ZFN 결합 부위의 무손상을 검정하였다. 후속적으로 NHEJ 복구가 이어지는 ZFN 매개 공여자 삽입 또는 절단은 ZFN 결합 부위의 손실 및 검출가능한 qPCR 신호의 감소를 유발한다 (본원에 참조로 포함되는 미국 특허 공개 번호 2014/0173783 참조). ZFN1 및 ZFN3 부위에서의 ELP1 절단의 결과 및 상기 부위 내의 공여자 서열의 표적화 통합이 도 19에 제공된다. ZFN1 부위를 1:1 및 1:10 비의 ZFN 및 공여자 폴리뉴클레오티드와 함께 ZFN 폴리뉴클레오티드의 전달로 검정하였다. 결과는 ELP1의 ZFN1 부위가 파괴었음을 나타내었고, 이로써 상기 부위에서의 잠재적 표적화가 시사된다. 마찬가지로, ELP1의 ZFN3 부위가 파괴되었으며, 이로써 상기 부위에서의 잠재적 표적화가 시사된다. 모든 처리는 상기 실험에 대해 6회 반복하여 수행하였고, 데이터는 평균 결과로 제시하였다.
인-아웃 PCR 검정: ELP1의 ZFN1 및 ZFN3에서의 표적화된 공여자 삽입을 확인하기 위해, 인-아웃 PCR을 대조 원형질체 샘플 (예를 들어, ZFN 폴리뉴클레오티드 또는 공여자 폴리뉴클레오티드 단독으로 처리한 것들), 및 ZFN 및 공여자 폴리뉴클레오티드 둘 다로 처리한 원형질체 샘플로부터 단리된 게놈 DNA에 대해 수행하였다. 어느 한 배향의 공여자 삽입을 증폭 및 검출하도록 PCR 프라이머를 설계하였다. 인-아웃 PCR의 결과는 시험된 모든 샘플 (예를 들어 공여자 대 ZFN의 1:1 및 1:10 비)에 대해 ELP1의 ZFN1 및 ZFN3 부위 둘 다에서의 표적화 공여자 삽입을 나타내었다. ZFN1 부위는 6회 중 4회 표적화되었고, ZFN3 부위는 6회 중 3회 표적화되었다. 정방향 및 역방향 배향 둘 다의 공여자 삽입이 인-아웃 PCR 검정에 의해 검출되었다. PCR 물질의 서열분석은 예상된 표적-공여자 접합 서열, 뿐만 아니라 어느 한 공여자/표적 또는 둘 다가 프로세싱된 후에 라이게이션된 접합을 제시하였다 (도 20).
실시예 7: 내인성 옥수수 유전자좌 내에 통합된 공여자 폴리뉴클레오티드의 신속 표적화 분석
본원에 참조로 포함되는 미국 특허 공개 번호 2014/0173783에 기재된 바와 같은 콘 이벤트 DAS-59132 (본원에서 E32로 지칭됨)의 게놈 유전자좌를 폴리뉴클레오티드 공여자 삽입을 위해 표적화하였다. aad-1 트랜스진 (pDAB100651)을 함유하는 5 Kb 공여자 폴리뉴클레오티드를 E32ZFN 6 (pDAB 105906)을 사용하여 옥수수 (E32) 내의 내인성 유전자좌로 표적화하였다. 옥수수 게놈 내의 공여자 폴리뉴클레오티드 서열의 부위 특이적 통합을 공여자 삽입된 폴리뉴클레오티드의 5' 말단 3' 말단에서의 신규 인-아웃 PCR 검정을 통해 신속 표적화 분석을 사용하여 확인하였다 (도 21).
원형질체 형질감염 시스템은 일시적 형질전환 과정이기 때문에, 원형질체 형질감염 시스템에 대한 인-아웃 PCR 검정으로서의 신속 표적화 분석의 적용은 특히 과제가 되어 왔다. 이에 따라, 원형질체 세포에 전달된 과량의 플라스미드 DNA는 시스템 내에 머무를 것이고, 세포 게놈 DNA와 함께 추출될 수 있다. 대량의 플라스미드 DNA의 전달은 게놈 DNA의 유효 농도를 희석하여 게놈 표적화의 검출을 어렵게 만들 뿐만 아니라, 또한 가양성을 일으키는 비-특이적 PCR 반응을 유발한다.
신속 표적화 분석 인-아웃 PCR 검정의 개발 동안, 원형질체 시스템에서의 가양성의 주요 공급원이 확인되었다. 이들 연구 동안 입증된 바와 같이, NHEJ-기반 공여자 삽입은 2가지 상이한 방향으로 일어날 수 있고, 공여자는 정방향 또는 역방향 배향으로 게놈 내로 삽입될 수 있다. 정방향 배향 삽입의 인-아웃 PCR 증폭 및 분석은 종종 가양성인 강하고 강렬한 앰플리콘을 생성한다. 반대로, 역방향 배향 삽입의 인-아웃 PCR 증폭 및 분석은 다수의 가양성 앰플리콘의 생성하지 않았다. 공여자 폴리뉴클레오티드 및 내인성 E32 유전자좌가 PCR 교차 반응을 유발할 수 있는 동일한 ZFN 결합 부위를 공유한다는 것을 주목해야 한다 (도 22에 나타난 바와 같음). 가양성은, ZFN 결합 부위를 포함하는 연장된 증폭 가닥을 생산하는 주형의 복제에 의해 유발된 교차 반응으로부터 생성되는 부산물일 수 있다. 이어서, 생성된 증폭 가닥은 후속 PCR 사이클에서 내인성 게놈 서열의 ZFN 결합 부위 또는 폴리뉴클레오티드 공여자 서열에 결합하여 PCR 반응에 의해 증폭되는 가양성 주형을 유발할 수 있다.
비대칭 네스티드 인-아웃 (ANIO) PCR: 비-특이적 PCR 증폭을 추가로 감소시키기 위해, 제2 인-아웃 PCR 증폭이 제1 인-아웃 PCR 앰플리콘 내의 영역을 증폭시키는데 이용될 수 있도록 네스티드 인-아웃 PCR 전략을 설계하였다. 후속적인 PCR 증폭은 공여자 표적화 및 게놈 유전자좌 내의 통합의 특이성 및 검출을 추가로 증가시켰다. 네스티드 PCR 반응의 설계 및 실행 동안, 비-특이적 증폭을 감소시키는 또 다른 신규 개선이 확인되었다. 대량의 공여자 플라스미드 DNA의 존재로 인해, 공여자 DNA에 결합하는 "인" 프라이머가 가양성에 대한 주요 원인일 수 있다는 것이 의심되었다. "아웃" 프라이머의 농도와 비교하여 "인" 프라이머의 농도를 감소시킴으로써, 가양성은 유의하게 감소되었다. 결과적인 비대칭 네스티드 인-아웃 (ANIO) PCR을 사용하여 원형질체 세포 내의 제아 메이스 E32 유전자좌에서의 공여자 폴리뉴클레오티드의 표적화를 입증하였다. 모든 PCR 프라이머는 E32 유전자좌에서의 표적화 삽입을 모의하도록 구축된 양성 대조군 플라스미드를 기초로 설계하였다 (표 9).
<표 9> ANIO PCR을 위한 프라이머의 목록이 하기 표에 제시됨.
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구체적으로, 제1 인-아웃 PCR을 1x 타카라 Ex Taq HS 완충제™, 0.2 mM dNTP, 0.2 μM "아웃" 프라이머, 0.05 μM "인" 프라이머, 0.75 단위의 타카라 Ex Taq HS™ 폴리머라제 및 10 ng 추출된 옥수수 원형질체 DNA를 함유하는 20 μL 최종 반응 부피로 수행하였다. PCR 반응을 2분 동안 94℃, 12초 동안 98℃ 및 2분 동안 68℃의 20 사이클, 이어서 10분 동안 72℃ 및 4℃에서 유지로 이루어진 PCR 프로그램을 사용하여 완료하였다.
네스티드 (또는 제2) 인-아웃 PCR을 1x 타카라 Ex Taq HS 완충제™, 0.2 mM dNTP, 0.2 μM "아웃" 프라이머, 0.1 μM "인" 프라이머, 0.75 단위의 타카라 Ex Taq HS 폴리머라제™ 및 1μL의 제1 PCR 생성물을 함유하는 20 μL 최종 반응 부피로 수행하였다. 반응을 2분 동안 94℃, 12초 동안 98℃, 30초 동안 66℃ 및 45초 동안 68℃의 31 사이클, 이어서 10분 동안 72℃ 및 4℃에서 유지로 이루어진 PCR 프로그램을 사용하여 완료하였다. 최종 PCR 생성물을 시각화를 위해 1Kb 플러스 DNA 래더™ (라이프 테크놀로지스, 뉴욕주 그랜드 아일랜드)와 함께 아가로스 겔 상에서 진행시켰다.
신속 표적화 분석은 역방향 배향으로의 E32 게놈 표적 유전자좌 내의 공여자 폴리뉴클레오티드 삽입을 검출하였다. ZFN 및 공여자 조합으로 처리한 샘플 중, (공여자 폴리뉴클레오티드 서열의 부위 특이적 통합을 일으키지 않는 대조군과 비교하여) 6회의 반응 중 6회에서 5' 및 3' 말단 둘 다에 대해 예상된 크기의 앰플리콘이 생성되었다. 3' 말단의 증폭의 경우, 낮은 양의 스미어링 또는 래더링이 아가로스 겔 상에서 관찰되었다. 이러한 관찰은 NHEJ 복구 전에 생산된 DNA 파괴의 말단의 프로세싱으로 인한 것일 수 있다. 추가로, 비-특이적 앰플리콘의 증폭이 3'-말단의 증폭의 경우에 "공여자 단독"으로 이루어진 대조 샘플에서 관찰되었다. 이러한 비-특이적 앰플리콘은 양성 대조군의 예상된 크기 앰플리콘과 비교하여 더 작은 분자량 크기였다. 그럼에도 불구하고, 공여자 폴리뉴클레오티드 공여자는 E32 게놈 표적 유전자좌 내에 성공적으로 통합되었고, 신속 표적화 분석을 전개하여 부위 특이적 구성요소를 효율적으로 확인하고 검출하였다.
실시예 8: 내인성 대두 유전자좌 내에 통합된 공여자 폴리뉴클레오티드의 표적화 분석
설계된 ZFN을 상기 기재된 형질전환 방법론을 사용하여 대두 원형질체 내로 형질전환시켰다. FAD2 유전자좌에 대한 절단 효율을 미국 특허 공개 번호 2014/0173783에 기재된 바와 같은 유전자좌 파괴 검정을 통해 다양한 ZFN에 대해 평가하였다. 추가로, FAD2 유전자좌 내의 공여자 서열의 아연 핑거 뉴클레아제-매개 통합을 인-아웃 PCR 검정을 사용하여 평가하고, 생성된 PCR 앰플리콘을 서열분석하여 대두 게놈 내의 공여자 통합을 특성화하였다.
실험은 공여자 벡터 단독, ZFN 벡터 단독 또는 조합된 ZFN 및 공여자 벡터를 포함하는 처리군으로 구성되었다 (표 10). 추가로, 실험은 비형질전환된 세포, 또는 CsVMV 프로모터에 의해 유도되고 고 카피수 플라스미드 내의 AtuORF24 3'-UTR에 의해 플랭킹된 녹색 형광 단백질 발현 카세트를 포함하는 대조군 벡터 pDAB7221 (도 23)로 형질전환된 세포의 음성 대조 처리군을 포함하였다. 형질전환된 샘플을 형질감염 대략 18-24시간 후에 수확하였다. 예비 데이터는 플라스미드, pDAB115601에 함유된 F2, ZFN의 높은 활성을 입증하였고, 상기 ZFN 플라스미드를 모든 후속 실험에서 양성 대조군으로서 사용하였다.
표 10에 상술된 바와 같이, 형질전환 실험은 DNA의 총량을 80 μg으로 만들기 위해 필요한 만큼 첨가된 플라스미드 pDAB7221과 함께 DNA 총 80 μg을 함유하였다. 공여자 벡터 대 ZFN-발현 플라스미드의 비는 대략 10:1이었다. 각각의 실험 또는 처리는 독립적으로 가공 및 분석되는 6회의 실험 반복으로 이루어졌다. ZFN을 평가하는 실험은 2 세트의 실험으로 수행하였다.
<표 10> 실험 설계. ZFN 플라스미드를 2 세트 (F2 ZFN 1-3 및 F2 ZFN 4-7)로 평가하였다. ZFN 플라스미드에 적절한 공여자 벡터를 표적화 실험에 사용하였다. 각각의 처리에 대해 6회 반복을 수행하였다.
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표적화의 분석: 표적화 실험으로부터의 DNA 샘플을 유전자좌 파괴 검정을 사용하여 분석하여 FAD2 ZFN 절단 부위에서의 변형을 검출하고 NHEJ에 의한 표적화를 평가하였다. FAD2 표적에서 무손상 ZFN 결합 부위를 측정하기 위해 qPCR 검정을 설계하였다. ZFN 매개 공여자 삽입 또는 절단에 이은 NHEJ 복구는 ZFN 결합 부위의 손실 및 검출가능한 qPCR 신호에서의 후속적인 감소를 유발한다. 유의한 절단 활성을 보유하는 ZFN은 공여자 단독 처리와 비교하여 감소된 신호를 갖는 앰플리콘의 생산을 유발하였다. 유전자좌 파괴 검정에 사용된 프라이머 및 프로브를 표 11에 제시하였으며, FAD2 유전자좌 상의 그의 상대 위치를 도 24에 제시하였다.
적절한 공여자 벡터의 존재 하에 FAD2 2.3 ZFN2_WT ZFN (실험 둘 다) 및 FAD2 2.6 ZFN ZFN4_HF (하나의 실험) 및 F2 ZFN5_HF (실험 둘 다)를 사용한 원형질체의 처리는 무손상 서열 (공여자 단독)로부터 수득된 것과 비교하여 통계적으로 유의하게 더 낮은 신호를 발생시켰다.
<표 11> 파괴 PCR을 위한 프라이머 및 프로브
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유전자좌 특이적 인-아웃 PCR: 표적화 공여자 삽입을 확인하기 위해, 모든 처리로부터의 DNA를 유전자좌-특이적 인-아웃 PCR 검정에 적용하였다. 실험에서의 공여자 벡터는, FAD2 유전자좌 내의 표적화 통합에 대해 시험되는 모든 ZFN에 대한 결합 부위를 함유하도록 설계하였다. 대두 세포 내로의 ZFN 및 공여자의 공동-전달은 표적 및 공여자 벡터에서의 ZFN 결합 부위의 절단 및 비-상동 말단-연결 메카니즘을 통한 절단된 FAD2 유전자좌 내로의 후속적인 공여자의 통합을 일으켰다. ZFN 절단에 의해 생성된 FAD2 염색체 부위의 말단 및 선형화된 공여자 벡터는 FAD2 유전자좌 내의 통합 전에 프로세싱을 겪고, 불완전한 말단 연결 생성물을 생성할 수 있다. 표적에서의 표적화 통합의 확인을 "아웃" 프라이머가 천연 게놈 유전자좌에서의 서열을 인식하고 "인" 프라이머가 공여자 DNA 내의 서열에 결합하는 "인-아웃" PCR 전략에 기초하여 수행하였다. 인-아웃 PCR 검정을 삽입 접합부의 5'- 및 3'-말단 둘 다에서 수행하였다.
시험된 모든 ZFN은 공여자 및 ZFN 샘플에서 PCR 생성물에 의해 결정 시에 적어도 한 실험에서 FAD2 대두 유전자좌 내로의 표적화 및 공여자 단편 통합의 일부 증거를 제시하였다. 하기 ZFN; F2 ZFN2_WT, F2 ZFN2_HF 및 F2 ZFN4_HF를 사용한 공여자 통합된 표적화의 결과는, 5' 및 3' 말단 둘 다에서의 6회 실험 반복 중 적어도 2회에서 PCR 생성물이 생산됨에 따라 재현가능하였다 (표 12).
<표 12> 대두 원형질체 내의 FAD2 유전자좌에서의 NHEJ 표적화의 요약. 독립적인 표적화 실험에서 인-아웃 PCR에 대해 양성인 반복 횟수를 실험 또는 처리에 대해 제시하였다.
Figure 112016030402011-pct00017
인-아웃 PCR 생성물의 서열분석: pDAB1115620 및 F2 ZFN2_WT 또는 pDAB1115620 및 F2 ZFN2_HF로 완료된 각각의 인-아웃 PCR 표적화 실험으로부터의 (예상된 크기의) 앰플리콘 중 2개를 플라스미드 내로 클로닝하였다. 생성된 플라스미드를 생어 서열분석 방법을 사용하여 서열분석하였다. 서열들을, FokI 절단으로부터 생성되는 것으로 예측되는 단일-가닥 4 bp 말단이 모든 가능한 조합의 말단을 나타내도록 반복된 참조 서열에 대해 정렬시켰다. 10개의 특유의 서열 패턴이 수득된 23개의 클로닝된 서열로부터 발견되었다 (도 25). 모든 서열 패턴은 ZFN 결합 부위 (GAAATTTC) 사이에 위치한 FAD2 게놈 참조 서열의 일부를 보유하였으나, 서열 패턴은 또한 FAD2 게놈 참조 서열과 비교하여 결실을 보유하였다. 서열 4WT1 및 4WT4는 GAAATTTC 서열의 3' 말단 상의 ZFN 결합 부위 내로 연장된 결실을 함유하였다. 2개의 서열 1HF4 및 6HF4는 단일-염기 삽입을 가졌다. 관찰된 DNA 서열 패턴은 대두 FAD2 유전자좌 내로 공여자 DNA의 표적화가 일어났음을 입증한다.
본 발명의 측면이 특정 실시양태에서 기재되었지만, 이들은 본 개시내용의 취지 및 범위 내에서 추가로 변형될 수 있다. 따라서, 본 출원은 그의 일반적 원리를 사용한 본 발명의 실시양태의 임의의 변경, 사용 또는 적합화를 포괄하는 것으로 의도된다. 또한, 본 출원은, 이들 실시양태가 관련되며 첨부된 청구범위의 제한 내에 속하는 관련 기술분야의 공지된 또는 통상의 실시 내에 있는 한, 본 개시내용으로부터의 이러한 이탈을 포괄하는 것으로 의도된다.
SEQUENCE LISTING <110> Dow AgroSciences LLC Sastry-Dent, Lakshmi Ainley, William M. Samuel, Jayakumar P. Cao, Zehui Shen, Liu Dewes, Cristie M. <120> RAPID TARGETING ANALYSIS IN CROPS FOR DETERMINING DONOR INSERTION <130> 14764-231326 <150> 61/873,719 <151> 2013-09-04 <150> 61/899,569 <151> 2013-11-04 <160> 209 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Zinc Finger Protein Recognition Helices <400> 1 Gln Ser Gly Asp Leu Thr Arg 1 5 <210> 2 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Zinc Finger Protein Recognition Helices <400> 2 Arg Lys Asp Gln Leu Val Ala 1 5 <210> 3 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Zinc Finger Protein Recognition Helices <400> 3 Arg Ser Asp Asp Leu Thr Arg 1 5 <210> 4 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Zinc Finger Protein Recognition Helices <400> 4 Thr Ser Ser Asn Arg Lys Thr 1 5 <210> 5 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Zinc Finger Protein Recognition Helices <400> 5 Arg Ser Asp Thr Leu Ser Glu 1 5 <210> 6 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial 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ttgtttgcaa gcagcagatt acgcgcagaa aaaaaggatc 780 tcaagaagat cctttgatct tttctacggg gtctgacgct cagtggaacg aaaactcacg 840 ttaagggatt ttggtcatgg cgttcggaac cgtgctgacc cgcaagtggc aacctcccgt 900 gcctctgctc acctttaccg cctggcaact ggcggccacc tgcagggcga tcgcaccgag 960 cgcttagtgg gaatttgtac cccttatcga accgggagca caggatgacg cctaacaatt 1020 cattcaagcc gacaccgctt cgcggcgcgg cttaattcag gagttaaaca tcatgaggga 1080 agcggtgatc gccgaagtat cgactcaact atcagaggta gttggcgtca tcgagcgcca 1140 tctcgaaccg acgttgctgg ccgtacattt gtacggctcc gcagtggatg gcggcctgaa 1200 gccacacagt gatattgatt tgctggttac ggtgaccgta aggcttgatg aaacaacgcg 1260 gcgagctttg atcaacgacc ttttggaaac ttcggcttcc cctggagaga gcgagattct 1320 ccgcgctgta gaagtcacca ttgttgtgca cgacgacatc attccgtggc gttatccagc 1380 taagcgcgaa ctgcaatttg gagaatggca gcgcaatgac attcttgcag gtatcttcga 1440 gccagccacg atcgacattg atctggctat cttgctgaca aaagcaagag aacatagcgt 1500 tgccttggta ggtccagcgg cggaggaact ctttgatccg gttcctgaac aggatctatt 1560 tgaggcgcta aatgaaacct taacgctatg 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tcgctgcgct cggtcgttcg 360 gctgcggcga gcggtatcag ctcactcaaa ggcggtaata cggttatcca cagaatcagg 420 ggataacgca ggaaagaaca tgtgagcaaa aggccagcaa aaggccagga accgtaaaaa 480 ggccgcgttg ctggcgtttt tccataggct ccgcccccct gacgagcatc acaaaaatcg 540 acgctcaagt cagaggtggc gaaacccgac aggactataa agataccagg cgtttccccc 600 tggaagctcc ctcgtgcgct ctcctgttcc gaccctgccg cttaccggat acctgtccgc 660 ctttctccct tcgggaagcg tggcgctttc tcatagctca cgctgtaggt atctcagttc 720 ggtgtaggtc gttcgctcca agctgggctg tgtgcacgaa ccccccgttc agcccgaccg 780 ctgcgcctta tccggtaact atcgtcttga gtccaacccg gtaagacacg acttatcgcc 840 actggcagca gccactggta acaggattag cagagcgagg tatgtaggcg gtgctacaga 900 gttcttgaag tggtggccta actacggcta cactagaaga acagtatttg gtatctgcgc 960 tctgctgaag ccagttacct tcggaaaaag agttggtagc tcttgatccg gcaaacaaac 1020 caccgctggt agcggtggtt tttttgtttg caagcagcag attacgcgca gaaaaaaagg 1080 atctcaagaa gatcctttga tcttttctac ggggtctgac gctcagtgga acgaaaactc 1140 acgttaaggg attttggtca tggcgttcgg aaccgtgctg acccgcaagt ggcaacctcc 1200 cgtgcctctg ctcaccttta ccgcctggca actggcggcc acctgcaggg cgatcgcacc 1260 gagcgcttag tgggaatttg taccccttat cgaaccggga gcacaggatg acgcctaaca 1320 attcattcaa gccgacaccg cttcgcggcg cggcttaatt caggagttaa acatcatgag 1380 ggaagcggtg atcgccgaag tatcgactca actatcagag gtagttggcg tcatcgagcg 1440 ccatctcgaa ccgacgttgc tggccgtaca tttgtacggc tccgcagtgg atggcggcct 1500 gaagccacac agtgatattg atttgctggt tacggtgacc gtaaggcttg atgaaacaac 1560 gcggcgagct ttgatcaacg accttttgga aacttcggct tcccctggag agagcgagat 1620 tctccgcgct gtagaagtca ccattgttgt gcacgacgac atcattccgt ggcgttatcc 1680 agctaagcgc gaactgcaat ttggagaatg gcagcgcaat gacattcttg caggtatctt 1740 cgagccagcc acgatcgaca ttgatctggc tatcttgctg acaaaagcaa gagaacatag 1800 cgttgccttg gtaggtccag cggcggagga actctttgat ccggttcctg aacaggatct 1860 atttgaggcg ctaaatgaaa ccttaacgct atggaactcg ccgcccgact gggctggcga 1920 tgagcgaaat gtagtgctta cgttgtcccg catttggtac agcgcagtaa ccggcaaaat 1980 cgcgccgaag gatgtcgctg ccgactgggc aatggagcgc ctgccggccc agtatcagcc 2040 cgtcatactt gaagctaggc aggcttatct tggacaagaa gatcgcttgg cctcgcgcgc 2100 agatcagttg gaagaatttg ttcactacgt gaaaggcgag atcaccaagg tagtcggcaa 2160 ataatgtcta acaattcgtt caagccgacg ccgcttcgcg gcgcggctta actcaagcgt 2220 ta 2222 <210> 142 <211> 110 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Analytical Domain <400> 142 gagccacagg ttagtagagt ggtaggagca gtgttggact gatggctcgc ttacataagc 60 agttctgtcc catggagcca atgtcctgat acggtaggac acatatccct 110 <210> 143 <211> 118 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Analytical Domain <400> 143 actagttttc atagggatat gtgaggacta accttggcca aaggagctgg aactgcctgc 60 agttatgtaa gggccttagt ccaaattgct ccaccctctg ggaagctaat ggactagt 118 <210> 144 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 144 cgccacaaat ctgaaccagc a 21 <210> 145 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 145 ccacgatcga cattgatctg gcta 24 <210> 146 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 146 gcgacatatc aggccaacag g 21 <210> 147 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 147 gggatatgtg tcctaccgta tcagg 25 <210> 148 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 148 ccagcataca gttagggccc a 21 <210> 149 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 149 gttgccttgg taggtccagc 20 <210> 150 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 150 cgaaaactca gcatgcggga a 21 <210> 151 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 151 gagccatcag tccaacactg c 21 <210> 152 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 152 acaggcgtac agcaacacca 20 <210> 153 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 153 gaccctatgg tgttggatcc ca 22 <210> 154 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 154 cgggagctag gcaacaaatc g 21 <210> 155 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 155 tctgactaaa cgggtggatg ctg 23 <210> 156 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 156 cggatcagtt gattcgctca ctttca 26 <210> 157 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 157 gccgaaaagc agcaactgga a 21 <210> 158 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 158 gattgctacg cagaccgcct a 21 <210> 159 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 159 cactattcct ccggcatgca g 21 <210> 160 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 160 tgacctattg atcggtcggc tc 22 <210> 161 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 161 tgccttgaat ctcagggatg ca 22 <210> 162 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 162 gccgaagcta actagcggac a 21 <210> 163 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 163 catggagtag cagctgtgct g 21 <210> 164 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 164 gaaaagcagt caccggctct g 21 <210> 165 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 165 ccatggacat gaattcggca cg 22 <210> 166 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 166 cttttgcacc acggagcaga c 21 <210> 167 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 167 gctagcaaaa ctttgaagct cgctc 25 <210> 168 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 168 gaggtccctt acgggtcatc g 21 <210> 169 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 169 accaggtcta tcttgcgcag ac 22 <210> 170 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 170 aatagcgtgg tcgggtccta g 21 <210> 171 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 171 acgaacgatc caaggtgcag t 21 <210> 172 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 172 tagagacgag gactctgggc t 21 <210> 173 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 173 aagtccaaca tgggcacaac c 21 <210> 174 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 174 cctcgttaag ggtgcaggtt g 21 <210> 175 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 175 ccaagtcagc ttctaagcca tcaaac 26 <210> 176 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 176 aaccctagac ttctgcctgg tg 22 <210> 177 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 177 gctcacttac gagcagatcc ca 22 <210> 178 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 178 ggtgcacgca tgttctcatg t 21 <210> 179 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 179 tgtttaccgc agccatgctt g 21 <210> 180 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 180 gttgtatacg gcatccatcc gct 23 <210> 181 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 181 gaatgaaact ggtggtctgc tcc 23 <210> 182 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 182 ccgacgaggt acaagtagca gg 22 <210> 183 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 183 cccgtagtcc agattcttgt ggt 23 <210> 184 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 184 gtcgtttgtt cggaagggga g 21 <210> 185 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 185 cgtagttgtc cggcatgtcc t 21 <210> 186 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 186 tgtatccctt cggtgagcac g 21 <210> 187 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 187 tgaatcgact cgctgacagg tg 22 <210> 188 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 188 ccacgatcga cattgatctg gcta 24 <210> 189 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 189 gggatatgtg tcctaccgta tcagg 25 <210> 190 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 190 gttgccttgg taggtccagc 20 <210> 191 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 191 gagccatcag tccaacactg c 21 <210> 192 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 192 tggcactaat ctcaccggct 20 <210> 193 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 193 agtcttagaa gtacgctacc gt 22 <210> 194 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 194 tacttggctt cggcggcga 19 <210> 195 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 195 gggtgacttt tacgcgtctc g 21 <210> 196 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 196 ggtcacgacg catggcctaa 20 <210> 197 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 197 aggatgcatg gatcaccgtc 20 <210> 198 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 198 gctctgttgt gcagccgtac 20 <210> 199 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 199 cgttgcagat accacagtgt ac 22 <210> 200 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 200 gctagtagct gtttacacgg cgtct 25 <210> 201 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 201 aggtcgagac aaccaagtag ag 22 <210> 202 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 202 acaggacatc gagcttgcat 20 <210> 203 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 203 cagaagaaag gcatcaactc atg 23 <210> 204 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 204 ctctttcacc tctactttta cttcag 26 <210> 205 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 205 attgaaccgt tgtcaaagcc a 21 <210> 206 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 206 cacagcgtca gggcggtaac 20 <210> 207 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 207 ggcacgcacc tgtcactgac 20 <210> 208 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 208 gtacgcgccc gggaactcct 20 <210> 209 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 209 cctgcggccc acgtgcatct 20

Claims (18)

  1. a. 제1 앰플리콘을 생산하기 위해 게놈 DNA 표적 부위에 결합하도록 설계된 제1 아웃-PCR 프라이머 및 통합된 폴리뉴클레오티드 공여자 서열에 결합하도록 설계된 제1 인-PCR 프라이머를 사용하여 제1 라운드의 PCR에 의해 게놈 DNA를 증폭시키는 단계로서, 여기서 제1 인-PCR 프라이머가 제1 아웃-PCR 프라이머보다 낮은 농도로 제공되고, 상기 제1 아웃-PCR 프라이머 및 상기 제1 인-PCR 프라이머는 역방향 배향으로 삽입된 폴리뉴클레오티드 공여자 서열을 증폭시키기 위해 선택되며, 역방향 배향은 본래 형질전환 벡터의 배향에 상대적인 것인 단계;
    b. 제2 앰플리콘을 생산하기 위해 제1 앰플리콘 내에 위치한 서열에 특이적인 프라이머를 사용하여 제2 라운드의 PCR에 의해 제1 앰플리콘을 증폭시키는 단계; 및
    c. 제2 앰플리콘의 존재를 검출하는 단계로서, 여기서 제2 앰플리콘의 생산은 부위 특이적 통합 이벤트의 존재를 나타내는 것인 단계
    를 포함하는, 게놈 표적 부위 내의 폴리뉴클레오티드 공여자 서열의 부위 특이적 통합을 검출하는 방법.
  2. 제1항에 있어서, 게놈 표적 부위가 내인성 또는 조작된 게놈 표적 부위를 포함하는 것인 방법.
  3. 제1항에 있어서, 제1 라운드의 PCR이 4:1, 3:1 또는 2:1의 제1 아웃-PCR 프라이머 대 제1 인-PCR 프라이머의 상대 농도를 사용하여 수행되는 것인 방법.
  4. 제1항에 있어서, 제1 인-PCR 프라이머가 0.05 - 0.09 μM의 농도로 포함되고, 제1 아웃-PCR 프라이머가 적어도 0.1 μM의 농도로 포함되는 것인 방법.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 제2 라운드의 PCR이 제1 앰플리콘의 게놈 DNA 표적 부위에 결합하도록 설계된 제2 아웃-PCR 프라이머 및 제1 앰플리콘의 통합된 폴리뉴클레오티드 공여자 서열에 결합하도록 설계된 제2 인-PCR 프라이머를 포함하는 것인 방법.
  6. 제5항에 있어서, 제2 인-PCR 프라이머가 제2 아웃-PCR 프라이머보다 낮은 농도로 제공되는 것인 방법.
  7. 제5항에 있어서, 제2 라운드의 PCR이 4:1, 3:1 또는 2:1의 제2 아웃-PCR 프라이머 대 제2 인-PCR 프라이머의 상대 농도를 사용하여 수행되는 것인 방법.
  8. 제5항에 있어서, 제2 인-PCR 프라이머가 0.05 - 0.1 μM의 농도로 포함되고, 제2 아웃-PCR 프라이머가 0.2 μM의 농도로 포함되는 것인 방법.
  9. 제1항에 있어서, 게놈 표적 부위 내의 폴리뉴클레오티드 공여자 서열의 부위 특이적 통합을 포함하는 게놈 DNA가 식물 게놈 DNA인 방법.
  10. 제9항에 있어서, 식물 게놈 DNA가 단자엽 식물로부터 단리된 것인 방법.
  11. 제9항에 있어서, 식물 게놈 DNA가 쌍자엽 식물로부터 단리된 것인 방법.
  12. 제9항에 있어서, 게놈 표적 부위 내의 폴리뉴클레오티드 공여자 서열의 부위 특이적 통합이 부위 특이적 뉴클레아제를 사용한 게놈 DNA 표적 부위의 절단에 의해 생산된 것인 방법.
  13. 제12항에 있어서, 부위 특이적 뉴클레아제가 아연 핑거 뉴클레아제, CRISPR 뉴클레아제, TALEN 뉴클레아제 및 메가뉴클레아제로 이루어진 군으로부터 선택된 것인 방법.
  14. 제12항에 있어서, 게놈 표적 부위 내의 폴리뉴클레오티드 공여자 서열의 부위 특이적 통합이 비 상동 말단 연결 메카니즘을 통해 일어나는 것인 방법.
  15. 제1항에 있어서, 검출 단계가 겔에서의 제2 앰플리콘의 전기영동을 포함하는 것인 방법.
  16. 제1항에 있어서, 검출 단계가 제2 앰플리콘의 서열분석을 포함하는 것인 방법.
  17. a. 제1 앰플리콘을 생산하기 위해 제1 라운드의 PCR에 의해 게놈 DNA를 증폭시키며, 여기서 상기 PCR은 게놈 표적 부위에 결합하도록 설계된 제1 아웃-PCR 프라이머 및 폴리뉴클레오티드 공여자 서열에 결합하도록 설계된 제1 인-PCR 프라이머를 사용하여 수행되고, 추가로 여기서 상기 제1 인-PCR 프라이머는 제1 아웃-PCR 프라이머보다 낮은 농도로 제공되며, 상기 제1 아웃-PCR 프라이머 및 상기 제1 인-PCR 프라이머는 역방향 배향으로 삽입된 폴리뉴클레오티드 공여자 서열을 증폭시키기 위해 선택되고, 역방향 배향은 본래 형질전환 벡터의 배향에 상대적인 것인 단계;
    b. 제1 앰플리콘의 게놈 DNA 표적 부위에 결합하도록 설계된 제2 아웃-PCR 프라이머 및 제1 앰플리콘의 통합된 폴리뉴클레오티드 공여자 서열에 결합하도록 설계된 제2 인-PCR 프라이머를 사용하여 제2 라운드의 PCR에 의해 제1 앰플리콘을 증폭시키는 단계; 및
    c. 제2 앰플리콘의 존재를 검출하는 단계로서, 여기서 제2 앰플리콘의 생산은 부위 특이적 통합 이벤트의 존재를 나타내는 것인 단계
    를 포함하는, 형질감염된 식물 세포의 게놈 표적 부위 내의 폴리뉴클레오티드 공여자 서열의 부위 특이적 통합을 검출하는 방법.
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