TWI672380B - 用於在作物中判定供體插入之快速靶向分析 - Google Patents

用於在作物中判定供體插入之快速靶向分析 Download PDF

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Abstract

本揭露內容提供用於檢測與辨識含有精確靶向基因座的植物品項之方法，及提供包含該靶向基因座之植物與植物細胞。該方法可作為一種高通量方法，供用於篩檢一供體DNA聚核苷酸在靶向基因座的插入作用。該等方法立即可用於辨識經由一種靶向方法所產生的植物品項，該靶向方法係源自使用一種定點核酸酶。

Description

用於在作物中判定供體插入之快速靶向分析 相關申請案之交互引述
依據專利法第35號法典第119(e)條，本申請案主張於2013年9月4日提出申請之美國第61/873,719號暫准申請案及於2013年11月4日提出申請之美國第61/899,569號暫准申請案之利益，其等的全部內容在此併入本案以為參考資料。
以電子方式提交的序列表之引述
序列表係於2013年11月4日所建立之檔案名稱為“226007_ST25.txt”及檔案大小為68.6千位元組之ASCII格式序列表形式，及以電子方式經由電子申請系統(EFS-Web)提交，其正式文本係與本說明書同時提出。該ASCII格式文件中所包含的序列表係本說明書的一部分，其全部內容在此併入本案以為參考資料。
發明領域
本揭露內容總體上係有關於分子生物學與生物化學領域。本揭露內容係有關於一種方法，其係用於分析一嵌入性供體聚核苷酸所插入的基因位點。該方法適用於嵌入性供體聚核苷酸之高通量分析，及可用於減少偽陽性 檢測結果。再者，該方法採用細胞式靶向作用與分析，毋需用於產生穩定靶向植物之生產製程。
發明背景
長久以來，植物的靶向基因體改造一直是應用與基礎研究難以實現的目標。將基因與基因堆疊靶向植物基因體的特定位置將提高基因轉殖品項的品質；降低基因轉殖品項的相關生產成本；及提供用於製造基因轉殖植物產品諸如序列性基因堆疊之新方法。總體而言，將轉殖基因靶向特定的基因位點很可能具有商業利機。在過去幾年，已在研發藉由定點核酸酶(如鋅指核酸酶(ZFNs)、巨核酸酶、轉錄激活因子樣效應因子核酸酶(TALENS)及群聚且有規律間隔的短迴文重複序列(CRISPR)/具有經工程改造的crRNA/tracrRNA之CRISPR相關核酸酶(Cas))，來靶向與剪切基因體DNA，以誘發靶向誘突變作用，誘發細胞DNA序列的靶向刪除作用，及促進外源性供體DNA聚核苷酸在一預定基因座中的靶向重組作用等方面，取得顯著進展。如見第號20030232410號、第20050208489號、第20050026157號、第20050064474號及第20060188987號美國專利公開案以及第WO2007/014275號國際專利公開案，在此就所有目的將其等的揭露內容併入本案以為參考資料。第20080182332號美國專利公開案述及非典型鋅指核酸酶(ZFN)在植物基因體的靶向改造方面之用途；而第20090205083號美國專利公開案述及植物EPSP基因座之 ZFN媒介型靶向改造作用。目前用於外源性DNA靶向插入作用之方法通常涉及植物組織與含有至少一個轉殖基因與一種定點核酸酶(如ZFN)的一供體DNA聚核苷酸之共轉形作用，該定點核酸酶係經設計來結合與剪切一特定基因座。這使得供體DNA聚核苷酸安定地插入經剪切的基因座中，導致在所指定的一基因座之添加靶向基因。
遺憾地，由靶向基因體改造作用所報導與所觀察到的頻率顯示，對於植物內的基因座之靶向作用的效率相對較低。鑑於所報導的低效率，而必須篩檢大量的植物品項，從中辨識出含有該靶向基因座的一特定品項。篩檢方法亦應該可以作為高通量方法，供快速辨識出含有一靶向基因座之植物品項。此外，當靶向基因插入作用連同隨機基因插入作用發生時，篩檢方法之設計必須在隨機插入作用的背景下，特異性地辨識出基因座的靶向作用，及必須區別基因體嵌入作用及可能產生偽陽性結果的外源性質體DNA。再者，該分析法的靈敏度應足以檢測在單一細胞中所發生之一事件，其中在其他數千個非靶向細胞之間，該細胞含有唯一的靶向事件。大部分報導的植物品項分析均仰賴單一分析方法來確認靶向作用，其可能導致對於靶向頻率的不正確估算及所得結果的可信度低。有需要研發改良的分子分析方法，特別是高通量分析法，該等方法可檢測定點式染色體嵌入作用及區別該等品項與外源性質體DNA。最後，目前用於評估靶向基因體改造之方法係以產生穩定的植物為基礎，這需要耗費大量時間與成本。因此， 需要容許快速靶向評估大量基因座及篩檢大量定點核酸酶之一種分析方法，以辨識與確認在該靶向基因座內之聚核苷酸供體序列插入作用。
上述的相關技術實例及其相關限制係作為說明之用，而不具有排他性。嫻熟技藝者在閱讀本說明書時，即可明瞭相關技術的其他限制。
發明概要
在一實施例中，本揭露內容係有關於一種分析法，其係用於檢測在一基因體靶位點內之一聚核苷酸供體序列的定點式嵌入作用，其中：使用經設計而與基因體DNA靶位點結合之第一外PCR引子(Out-PCR primer)及經設計而與所嵌入的聚核苷酸供體序列結合之第一內PCR引子(In-PCR primer)，藉由第一輪PCR擴增一基因體DNA而產生第一擴增子；及使用對於位於第一擴增子內的序列具有特異性之引子，藉由第二輪PCR擴增第一擴增子，而產生第二擴增子；及檢測是否存在第二擴增子，其中第二擴增子之產生係表示定點式嵌入事件之存在。
就該實施例的一方面而言，該基因體靶位點包含一個內源性或經工程改造的基因體靶位點。就該實施例的另一方面而言，所提供的第一內PCR引子的濃度係低於第一外PCR引子。在一實施例中，進行第一輪PCR時所用的第一外PCR引子相對於第一內PCR引子之相對濃度係約4：1、3：1或2：1。在另一實施例中，第一內PCR引子的濃度為0.05 至0.09μM，而第一外PCR引子的濃度係至少0.1μM。
就該實施例的後續方面而言，第二輪PCR包含經設計而與第一擴增子的基因體DNA靶位點結合之第二外PCR引子，及包含經設計而與第一擴增子之嵌入的聚核苷酸供體序列結合之第二內PCR引子。在一實施例中，所提供的第二內PCR引子的濃度係低於第二外PCR引子。在另一實施例中，進行第二輪PCR時所用的第二外PCR引子相對於第二內PCR引子之相對濃度係約4：1、3：1或2：1。在另一實施例中，第二內PCR引子的濃度為0.05至0.1μM，而第二外PCR引子的濃度為0.2μM。
就該實施例的另一方面而言，在基因體靶位點內包含定點式嵌入的聚核苷酸供體序列之基因體DNA，係一種植物基因體DNA。就一實施例而言，該植物基因體DNA係從一種單子葉植物中分離出來。就另一實施例而言，該植物基因體DNA係從一種雙子葉植物中分離出來。
就該實施例的另一方面而言，用一種定點核酸酶剪切基因體DNA靶位點，造成在基因體靶位點內之聚核苷酸供體序列的定點式嵌入作用。就一實施例而言，該定點核酸酶係選自由鋅指核酸酶、CRISPR核酸酶、TALEN核酸酶或巨核酸酶所組成之群組。在一後續實施例中，在基因體靶位點內之聚核苷酸供體序列的定點式嵌入作用係經由一種非同源性末端連接機制而發生。
就該實施例的一方面而言，該檢測步驟係第二擴增子的瓊脂糖凝膠或第二擴增子的定序反應。
在又一實施例中，本揭露內容係有關於一種方法，其用於檢測在轉染型植物細胞的一基因體靶位點內之一聚核苷酸供體序列的定點式嵌入作用，其包括：藉由第一輪PCR擴增一基因體DNA而產生第一擴增子，其中使用經設計而與基因體靶位點結合之第一外PCR引子及經設計而與聚核苷酸供體序列結合之第一內PCR引子，進行該PCR；再者，其中所提供的第一內PCR引子的濃度係低於第一外PCR引子；使用對於位於第一擴增子內的序列具有特異性之引子，藉由第二輪PCR擴增第一擴增子，而產生第二擴增子；及檢測是否存在第二擴增子，其中第二擴增子之產生係表示定點式嵌入事件之存在。在其他實施例中，該植物細胞係一種原生質體植物細胞。在一實施例中，定點式嵌入作用之檢測係在靶向與非靶向植物細胞的混合群體進行，其中非靶向植物細胞在一基因體靶位點內並不含有一聚核苷酸供體序列。
除了上述例示性方面與實施例之外，藉由閱讀下列說明，可明瞭其他方面與實施例。
圖1係說明pDAB111845的質體圖譜。
圖2係說明pDAB111846的質體圖譜。
圖3係說明pDAB117415的質體圖譜。
圖4係說明pDAB117416的質體圖譜。
圖5係說明pDAB117417的質體圖譜。
圖6係說明pDAB117419的質體圖譜。
圖7係說明pDAB117434的質體圖譜。
圖8係說明pDAB117418的質體圖譜。
圖9係說明pDAB117420的質體圖譜。
圖10係說明pDAB117421的質體圖譜。
圖11說明供經由NHEJ嵌入之通用型供體聚核苷酸序列之示意圖。
圖12說明供經由HDR嵌入之通用型供體聚核苷酸序列之示意圖。“HA”之標記係指同源臂；而“ZFN BS”之標記係指ZFN結合位點(就單體而言)。
圖13說明構築質體，該構築質體係用於靶向與驗證在所選擇的玉米(Zea mays)基因座內之通用型供體聚核苷酸系統嵌入作用。A)具有ZFN對的位置之ZFN設計間隔。B)ZFN表現構築質體之構形。“NLS”之標記係指細胞核定位訊號，“ZFP”之標記係指鋅指蛋白。C)用於針對所選擇的玉米基因座之NHEJ媒介型靶向作用的通用型供體聚核苷酸。Z1-Z6代表對於所選擇的玉米基因座標的具有特異性之ZFN結合位點。ZFN位點的數目係自3至6不等。垂直箭頭顯示獨特的限制酶切位點，而水平箭頭代表潛在的PCR引子位點。通用型供體聚核苷酸系統係一個短序列(110鹼基對)，其係用於嵌入所選擇的玉米基因座內之所有供體所共有的。
圖14係說明pDAB8393。
圖15A與15B說明在所選擇的玉米基因座標的之ZFN剪切活性。剪切活性係示為每百萬次高品質讀取中之 在ZFN剪切位點具有插入/缺失的序列數目。圖15A的數據係以條形圖形式呈現。圖15B的數據係以表格形式呈現。
圖16說明使用NHEJ式快速靶向分析方法，驗證所選擇的玉米基因座標的。
圖17說明經由隨機嵌入作用轉形進入玉米中之質體構築體，其包含用於側臨序列分析與轉殖基因表現研究之品項。
圖18說明在原生質體快速靶向分析中，在ELP之經由NHEJ的供體插入作用。插入作用能以前置或反置定向發生。
圖19說明ELP1中的ZFN剪切位點之破壞。就靶相對於基準之比例而言，破壞係示為qPCR訊號之降低。平均而言，觀察到ZFN1與ZFN3的訊號分別降低22%與15%。
圖20說明內-外PCR產物的序列。進行來自各內-外PCR(In-Out PCR)的四個殖株之定序，結果顯示完整的靶供體接合處(灰色)及經處理端接合處(黑色)。所列序列係如預期對應於序列辨識編號：248，A9-1係對應於序列辨識編號：249，A9-2係對應於序列辨識編號：250，A9-5係對應於序列辨識編號：251，A9-6係對應於序列辨識編號：252，G8-1係對應於序列辨識編號：253，G8-2係對應於序列辨識編號：254，G8-5係對應於序列辨識編號：255，G8-6係對應於序列辨識編號：256，G9-1係對應於序列辨識編號：257，G9-2係對應於序列辨識編號：258，G9-6係對應於序列辨識編號：259，H9-1係對應於序列辨識編號：260，H9-2係對 應於序列辨識編號：261，H9-5係對應於序列辨識編號：262，及H9-6係對應於序列辨識編號：263。
圖21說明在原生質體快速靶向分析中，在E32經由NHEJ之供體插入作用。插入作用能以前置或反置定向發生。
圖22說明一示意圖，其顯示針對供體聚核苷酸所設計的引子與鋅指結合序列之關係。
圖23係說明pDAB7221。
圖24說明用於基因座破壞分析法的探針/引子之一示意圖。顯示FAD2 2.3與2.6基因的F2 ZFN結合位點及用於破壞分析法的引子。
圖25提供內-外PCR產物之序列，藉由使用F2、ZFN2鋅指核酸酶之一供體序列在FAD2 2.3基因座中的NHEJ靶向作用，而產生該內-外PCR產物。參考序列(該圖最上方)代表反置定向的供體載體靶向插入作用之構形。填入FokI酶切作用所產生的DNA單股端，以建立參考序列。顯示桑格(Sanger)序列。在F2、ZFN2 ZFN結合序列畫有底線。在右方列出具有與所指定序列相似的序列之質體殖株。
詳細說明 I.綜論
目前已揭露用於定點核酸酶靶向型植物品項的快速篩檢、辨識與特性分析之新穎方法。該等方法可經由 第一與第二擴增反應，分析在一基因體靶基因座內之一供體聚核苷酸嵌入作用。第一與第二擴增反應係“內-外”PCR擴增反應，其係用於篩檢靶向一基因座內之一供體DNA聚核苷酸的3’及/或5’接合處序列。若存在含有3’及/或5’接合處序列之擴增產物，則表示該供體DNA聚核苷酸係存在於該靶向基因座內。
所揭露的篩檢分析法說明用於辨識與獲得靶向型轉殖基因插入品項之高品質、高通量方法。運用該篩檢分析法得以分析大量植物品項，篩檢及挑選在一靶向基因座內插入一供體DNA聚核苷酸之特定品項，及區別該等品項與偽陽性結果。此外，所揭露的方法可作為高通量分析法，使得以快速及有效率地辨識一試樣子集，然後可藉由其他分子確認方法進一步分析該試樣子集。目前所揭露之標的包括植物與植物細胞，該植物與植物細胞包含使用新穎篩檢方法所挑選的核酸酶靶向型植物品項。再者，該方法即可適用於分析任一植物物種。
II.用語
本申請案所用的所有技術與科學用語之含義係與本揭露內容所涉及技藝領域的一般技術人員通常理解者相同，除非另有定義。如有相左，則以本申請案所包括之定義為準。單數用詞應包括複數，而複數用詞應包括單數，除非上下文另有要求。在本申請案中所提及的所有出版物、專利及其他參考文獻係就所有目的在此完整併入本案以為參考資料，猶如個別出版物或專利申請案係明確與個別地 表明併入本案以為參考資料，除非表明僅將專利或專利申請案的特定部分併入以為參考資料。
提供下列用語、縮寫及定義，以進一步闡明本揭露內容。
如本申請案所用之“包含(comprises)”、“包含(comprising)”、“包括(includes)”、“包括(including)”、“具有(has)”、“具有(having)”、“含有(contains)”或“含有(containing)”等詞及其他任何變體，係意指非排他性或開放性。例如，包含單元列表之一組成物、混合物、製程、方法、物件或裝置未必侷限於該等單元，而可能包括未明確列出或該組成物、混合物、製程、方法、物件或裝置所固有的其他單元。此外，“或”一詞係指包含性而非排他性，除非明確說明不然。例如，下列任一項皆滿足條件A或B：A為真(或存在)且B為假(或不存在)；A為假(或不存在)且B為真(或存在)；以及A與B均為真(或存在)。
如本申請案所用之“發明”或“本發明”一詞係一個非限制性詞彙，涵蓋如本申請案所揭露的所有可能實施例，而無意指特定發明的任何單一實施例。
如本申請案所用之“植物”一詞，係包括全株植物及一植物的任何子代、細胞、組織或部位。“植物部位”一詞包括一植物的任何部分，例如包括但不限於：種子(包括成熟種子、未成熟種子及不具有種皮的未成熟胚芽)；植物切枝；植物細胞；植物細胞培養；植物器官(如花粉、胚芽、花、果、莖、葉、根、枝幹及相關培植體)。一植物組織或 植物器官可為種子、癒合組織或經組合成為一結構或功能單元之其他任何植物細胞群組。一植物細胞或組織培養可再生成為具有該植物的生理與形態特徵之一植物，及從所產生的植物獲得細胞或組織；而所再生植物的基因型係與該植物實質上相同。反之，一些植物細胞無法再生成為植物。在一植物細胞或組織培養中之可再生型細胞可為胚芽、原生質體、分生細胞、癒合組織、花粉、葉、花藥、根、根尖、花絲、花、果仁、果穗、果穗軸、果殼或稈。
植物部位包括可採收之部位及適用於繁殖子代植物之部位。適用於繁殖之植物部位例如包括但不限於：種子、果、切枝、幼苗、塊莖及地下莖。植物可採收的部位可為該植物的任何可用部位，例如包括但不限於：花、花粉、幼苗、塊莖、葉、枝幹、果、種子及根。
植物細胞係該植物的結構與生理單元。如本申請案所用之植物細胞係包括原生質體及具有部分細胞壁的原生質體。植物細胞可為分離的單一細胞或細胞聚集體(如易碎的癒合組織與所培養的細胞)之形式，及可為更高級的組織單元(如植物組織、植物器官及植物)之一部分。因而，植物細胞可為原生質體、產生配子的細胞或為可再生成為全株植物之一細胞或細胞集合體。因此，在本申請案的實施例中，係將包含多個植物細胞及可再生成為全株植物之種子視為一“植物部位”。
如本申請案所用之“原生質體”一詞係指已完全或部分移除細胞壁而裸露出其脂質雙層膜之植物細胞。通 常，原生質體係所分離之不具有細胞壁的植物細胞，其有潛能再生成為細胞培養物或全株植物。
如本申請案所用之“內源性序列”係界定一聚核苷酸、基因或多肽在生物體的天然位置或在生物體的基因體中之原生形式。
如本申請案所用之“分離”一詞係指從其天然環境中移出。
如本申請案所用之“純化”一詞，係有關於一分子或化合物的分離作用，所分離出的分子或化合物形式係實質上不含有在原生或天然環境中通常與該分子或化合物結合的雜質物，及因著與原組成物中的其他組分分離，而意味著純度已增加。本申請案中所用的“純化型核酸”一詞，係指已與包括但不限於多肽、脂質及碳水化合物的其他化合物分離之一核酸序列。
如本申請案所用之“聚核苷酸”、“核酸”及“核酸分子”一詞係以可互換方式使用，及可涵蓋單一核酸；多個核酸；核酸片段、變異體或其衍生物；及核酸構築質體(如傳訊RNA(mRNA)與質體DNA(pDNA))。聚核苷酸或核酸可含有全長cDNA序列的核苷酸序列或其片段，其包括非轉譯的5'及/或3'序列及編碼序列。聚核苷酸或核酸可由任何聚核糖核苷酸或聚去氧核糖核苷酸所組成，其包括未經修飾的核糖核苷酸或去氧核糖核苷酸或經修飾的核糖核苷酸或去氧核糖核苷酸。例如，聚核苷酸或核酸可由單股與雙股DNA、由單股與雙股區混合之DNA、單股與雙股RNA及由單股與 雙股區混合之RNA所組成。包含DNA與RNA的雜交分子可為單股、雙股或混合具有單股與雙股區。前述詞彙亦包括聚核苷酸或核酸在化學上、酵素上及代謝上經修飾的形式。
應當理解特定DNA亦指其補體，其序列係依據去氧核糖核苷酸鹼基配對的法則判定。
如本申請案所用之“基因”一詞，係指編碼一功能產物(RNA或多肽/蛋白)之核酸。一基因可包括在編碼該功能產物的序列之前(5’非編碼序列)及/或之後(3’非編碼序列)之調控序列。
如本申請案所用之“編碼序列”一詞，係指編碼一特定胺基酸序列之核酸序列。“調控序列”係指位於一編碼序列的上游(如5’非編碼序列)、之內或下游(如3’非編碼序列)之一核苷酸序列，其影響轉錄作用、RNA的處理或安定性或相關編碼序列的轉譯作用。調控序列例如包括但不限於：啟動子、轉譯引導序列、內含子、多腺苷酸化辨識序列、RNA處理位點、效應子結合位點及莖環結構。
如本申請案所用之“多肽”一詞係包括單一多肽、多個多肽及其片段。該詞係指由醯胺鍵(亦稱作肽鍵)線性連接的單體(胺基酸)所組成之一分子。“多肽”一詞係指任何由二或多個胺基酸組成的一或多鏈，並非指產物的特定長度或大小。因此，在“多肽”的定義中包括肽、二肽、三肽、寡肽、蛋白、胺基酸鏈及其他用來指由二或多個胺基酸組成的一或多鏈之任何詞彙，及前述的詞彙係以可與本申請 案中的“多肽”一詞互換之方式使用。可從天然的生物來源分離出多肽，或藉由重組技術產生，但一種特定的多肽未必由一種特定的核酸轉譯而得。多肽可依任何適宜方式產生，例如包括但不限於藉由化學合成作用。
反之，“異源”一詞係指在參考(宿主)生物體中通常不會存在於該位置之一聚核苷酸、基因或多肽。例如，異源核酸可為通常存在於參考生物體的不同基因體位置之一核酸。進一步舉例而言，異源核酸可為在參考生物體中通常不存在的一核酸。可藉由將異源聚核苷酸、基因或多肽導入宿主生物體中，而產生包含一異源聚核苷酸、基因或多肽之宿主生物體。在特定實例中，異源聚核苷酸包含原生的編碼序列或其部分，其係以不同於對應原生聚核苷酸之形式重新導入來源生物體中。在特定實例中，異源基因包含原生的編碼序列或其部分，其係以不同於對應原生基因之形式重新導入來源生物體中。例如，異源基因可包括重新導入原生宿主中之原生的編碼序列，其係包括非原生調控區在內的嵌合基因之一部分。在特定實例中，異源多肽係一種原生多肽，其係以不同於對應原生多肽之形式重新導入來源生物體中。
異源基因或多肽可為包含功能性多肽或編碼功能性多肽的核酸序列之一基因或多肽，其與另一基因或多肽融合而產生一嵌合或融合多肽，或為編碼同一多肽之一基因。特定實施例中的基因與蛋白包括所具體例舉的全長序列及該等序列的部分、節段、片段(包括鄰接片段及相較 於全長分子的內部及/或末端缺失)、變異體、突變體、嵌合體與融合體。
如本申請案所用之“修飾作用”一詞可指改變本申請案所揭露的一種聚核苷酸，其導致降低、實質上消除或消除該聚核苷酸所編碼的一種多肽之活性；以及可指改變本申請案所揭露的一種多肽，其導致降低、實質上消除或消除該多肽的活性。任擇地，“修飾作用”一詞可指改變本申請案所揭露的一種聚核苷酸，其導致增加或增強該聚核苷酸所編碼的一種多肽之活性；以及可指改變本申請案所揭露的一種多肽，其導致增加或增強該多肽的活性。可藉由技藝中眾所周知的方法產生該等改變，而該等方法包括但不限於刪除、突變(如自發性誘突變作用、隨機誘突變作用、由增變基因所引發的誘突變作用或轉位子誘突變作用)、取代、插入、向下調節、改變細胞的位置、改變聚核苷酸或多肽之狀態(如甲基化，磷酸化或泛素化)、移除輔因子、導入反義RNA/DNA，導入干擾RNA/DNA、化學修飾作用、共價修飾作用、用紫外線或X光照射、同源重組作用、有絲分裂重組作用、啟動子置換方法及/或其組合。
如本申請案所用之“衍生物”一詞係指本揭露內容所述之一序列的修飾作用。該等修飾作用的示例係與本申請案所揭露之一編碼序列的核酸序列相關之一或多個鹼基的取代作用、插入作用及/或刪除作用，該等修飾作用保留、稍微改變或增加本申請案所揭露的一編碼序列在作物物種中的功能。例如，嫻熟技藝者藉由用於預測與最佳化 序列結構的電腦模式化技術，即可判定該等衍生物。因而，“衍生物”一詞亦包括其序列與本申請案所揭露的編碼序列具有實質一致性之核酸序列，藉此其等在用於施行本揭露內容的實施例時，可具有所揭露的功能性。
“啟動子”一詞係指能控制核酸編碼序列或功能性RNA的表現作用之一種DNA序列。在實例中，受控的編碼序列係位於啟動子序列的3’側。啟動子可完全衍生自一個原生基因，啟動子可由天然存在的不同啟動子所衍生之不同單元所組成，或者啟動子甚至可包含經循理設計的DNA節段。據嫻熟技藝者之理解，不同的啟動子可在不同的組織或細胞類型中，或在不同的發育階段，或因應不同的環境或生理條件，引導一基因的表現作用。上述的所有啟動子實例皆為技藝中所知，並應用於控制異源核酸的表現作用。在大部分時間及在大部分細胞類型中引導基因表現作用之啟動子，通常稱作“持續性啟動子”。再者，雖然本技術領域中有些人士試圖界定調控序列的確切邊界(許多案例皆未能成功)，根據目前之理解，不同長度的DNA片段可能具有相同的啟動子活性。可使用本技藝從事人員所孰知的技術，分析一特定核酸的啟動子活性。
“操作連接”一詞係指在單一核酸上之多個核酸序列的連接，其中一核酸序列的功能受到另一核酸序列之影響。例如，當一啟動子能影響一編碼序列的表現作用(如該編碼序列的轉錄作用受到該啟動子之控制)時，該啟動子則與該編碼序列操作連接。編碼序列可與同義或反義定向 的調控序列操作連接。
如本申請案所用之“表現作用”一詞，可指從一DNA所衍生的同義(mRNA)或反義RNA的轉錄作用及穩定的積累作用。表現作用亦可指mRNA轉譯成為多肽之轉譯作用。如本申請案所用之“過度表現”一詞，係指該表現作用係高於相同基因或相關基因的內源性表現作用。因而，若一異源基因的表現作用係高於一種可相比的內源基因的表現作用，則該異源基因係“過度表現”。
如本申請案所用之“轉形作用”或“轉形”一詞，係指將其一核酸或片段轉移及嵌入一宿主生物體中，而產生在基因上穩定之遺傳。含有轉形核酸之宿主生物體係稱作“基因轉殖型”、“重組型”或“轉形”生物體。已知的轉形方法例如包括：根癌農桿菌(Agrobacterium tumefaciens)或發根農桿菌(Agrobacterium rhizogenes)媒介型轉形作用；磷酸鈣轉形作用；聚凝胺轉形作用；原生質體融合作用；電穿孔法；超音波法(如音波穿孔法)；脂質體轉形作用；顯微注射法；用裸DNA進行之轉形作用；用質體載體進行之轉形作用；用病毒載體進行之轉形作用；生物發射型轉形作用(微粒轟擊法)；碳化矽WHISKERS媒介型轉形作用；氣溶膠發射法；及PEG媒介型轉形作用。
如本申請案所用之“導入”一詞(用於將核酸導入細胞中之情況)，係包括細胞的轉形作用，以及包括一種包含該核酸的植物與第二種植物雜交，使得第二種植物含有該核酸，如可採用常規植物育種技術所進行者。該等育種 技術係技藝中所知。關於植物育種技術之論述，請參見美國康乃狄克州西港市(Westport)的AVI出版公司於1995年出版及由Poehlman所著之“農作物之育種(Breeding Field Crops)”乙書第四版。
可採用回交法將一核酸導入植物中。數十年來，一直利用這種技術將性狀導入植物中。回交(及其他植物育種方法論)之說明實例，例如可參見上文所提及之Poelman(1995年)乙書；及美國紐約州紐約市的威利(Wiley)出版公司於1988年出版及由Jensen所著之“植物育種方法論(Plant Breeding Methodology)”乙書。在一種例示性回交程序中，所感興趣的原植物(“回交親本”)係與帶有待導入核酸之第二植物(“非回交親本”)雜交。該雜交作用所產生的子代再與回交親本雜交，重複該過程直到獲得轉化植物為止，其中該轉化植物已恢復回交親本之基本上所有所欲的形態與生理特徵，再加上來自非回交親本的核酸。
“結合作用”係指在巨分子之間(如在一蛋白與一核酸之間)之具序列特異性的非共價交互作用。在結合交互作用中，並非所有組分皆需具有序列特異性(如與DNA主鏈中的磷酸鹽殘基接觸者)，只要交互作用整體具有序列特異性即可。該等交互作用的特徵一般在於解離常數(Kd)為10-6M-1以下。“親和性’，係指結合作用的強度：Kd越低，則結合親和性越高。
“結合蛋白”係能以非共價方式與另一分子結合之蛋白。結合蛋白例如可與DNA分子(DNA型結合蛋白)、 RNA分子(RNA型結合蛋白)及/或蛋白分子(蛋白型結合蛋白)結合。在蛋白型結合蛋白的情況下，其可自行結合(而形成同型二聚體、同型三聚體等)及/或可與一或多種不同蛋白中的一或多個分子結合。結合蛋白可具有一種以上的結合活性。例如，鋅指蛋白具有DNA結合活性、RNA結合活性及蛋白結合活性。
“重組作用”係指在二種聚核苷酸之間交換遺傳訊息之過程，其包括但不限於藉由非同源性末端連接(NHEJ)的供體捕獲及同源重組作用。就本揭露內容的目的而言，“同源重組作用(HR)”係指例如在經由同源導向修復機制修復細胞內雙股斷裂期間所發生之該種特定的交換形式。該方法需要核苷酸序列同源性，使用一“供體”分子作為修復“標的”分子(亦即經歷雙股斷裂者)之模板，及稱作“非互換型基因轉換”或“短帶型基因轉換”等等，因為其導致遺傳訊息從供體轉移至標的。在不希望受限於任何特定理論之前提下，該轉移可能涉及斷裂標的與供體之間所形成之異源雙股DNA的誤配修正；及/或“合成依賴型股黏合作用”，其中使用供體再合成遺傳訊息，而該遺傳訊息將成為標的之一部份；及/或相關方法。該等特殊化同源重組作用通常導致標的分子之序列改變，使得部分或全部的供體聚核苷酸序列被納入標的聚核苷酸中。就同源重組導向型嵌入作用而言，該供體分子含有與基因體同源的至少一個區域(“同源臂”)，其長度至少為50至100個鹼基對。如見第20110281361號美國專利公開案。
在本揭露內容的方法中，如申請案所述之一或多個靶向核酸酶在靶序列(如細胞染色質)的一預定位址上產生雙股斷裂，從而可將與斷裂區的核苷酸序列具有同源性之一“供體”聚核苷酸導入細胞中。已顯示雙股斷裂之存在促進供體序列之嵌入。供體序列可實際上嵌入；或任擇地使用該供體聚核苷酸，作為經由同源重組作用修復該斷裂之模板，導致將供體中的所有或部分核苷酸序列引入細胞染色質中。因而，在特定實施例中，可將細胞染色質中的第一序列轉換為供體聚核苷酸中所存在的一序列。因而，可理解“置換”或“置換作用”等詞之使用係代表以另一核苷酸序列置換一核苷酸序列，(亦即置換在訊息上同義的一序列)，而不一定需要在物理或化學上以另一聚核苷酸置換一聚核苷酸。
“剪切”係指斷開DNA分子的共價主鏈。可藉由多種方法起始剪切作用，包括但不限於磷酸二酯鍵的酵素性或化學性水解作用。剪切作用可為單股與雙股的剪切作用，而雙股剪切作用可為二個各別的單股剪切事件之結果。DNA剪切作用可導致產生平整端或參差端。在特定實施例中，融合多肽係供靶向雙股DNA剪切作用之用。
如本申請案所用之“質體”與“載體”等詞，係指可能帶有一或多個基因的一種染色體外的單元，其並非細胞核心代謝作用的一部分。質體與載體通常為環狀雙股DNA分子。然而，質體與載體亦可為單股或雙股DNA或RNA之線狀或環狀核酸，及帶有基本上從任何來源所衍生的DNA， 其中將數個核苷酸序列連接或重組成為一個獨特的構築質體，該構築質體可將一啟動子片段與一編碼DNA序列連同任何適宜的3’非轉譯序列導入細胞中。在實例中，質體與載體可包括供在細菌宿主中增殖之自主複製序列。
在本申請案中，多肽與“蛋白”係以可互換方式使用，及包括二或多個胺基酸經由肽鍵連接的一分子鏈。該等詞並非指特定長度的產物。因而，“肽”與“寡肽”皆涵蓋於多肽的定義之內。該等詞涵蓋多肽的轉譯後修飾作用，例如醣化作用、乙醯化作用、磷酸化作用等。此外，蛋白片段、類似物、突變型或變異型蛋白、融合蛋白等係包括在多肽的含義之內。該等詞亦包括其中包含一或多個胺基酸類似物或非典型或非天然胺基酸之分子，該等分子可合成或使用已知的蛋白質工程技術以重組方式表現。此外，可藉由如申請案所述之眾所周知的有機化學技術而衍生本發明的融合蛋白。
“融合蛋白”一詞表示該蛋白所包括的多肽組分係衍生自一種以上的親代蛋白或多肽。通常，一融合蛋白係由一融合基因所表現，其中編碼來自一蛋白的多肽序列之一種核苷酸序列，係附加在編碼來自不同蛋白的多肽序列之一種核苷酸序列之同一個讀框，及選擇性地由一個連接子所分隔。然後，融合基因可藉由一重組型宿主細胞表現成為單一蛋白。
III.本發明的實施例
在一實施例中，本揭露內容係有關於一種分析法， 其係用於檢測在一基因體靶位點內之一種聚核苷酸供體序列的定點式嵌入作用。
在一些實施例中分析一基因體DNA，以檢測在一基因體靶位點內之一種聚核苷酸供體序列的定點式嵌入作用。就該實施例的多個方面而言，該基因體DNA包含：一染色體的基因體DNA、一線粒體的基因體DNA、一轉位元基因體DNA、從病毒嵌入作用所衍生之一基因體DNA、一種人工染色體的基因體DNA(參見PCT/US2002/017451與PCT/US2008/056993，其等包括在本申請案中作為非限制性實例)，及基因體DNA的其他來源。
在一些實施例中，經由聚合酶鏈反應(PCR)擴增基因體DNA。就該實施例的多個方面而言，PCR一般係指未經選殖或純化作用而增加基因體DNA混合物中之靶序列的一節段濃度之方法(第4,683,195號、第4,683,202號及第4,965,188號美國專利；其等在此併入本案以為參考資料)。該種用於擴增靶序列之方法包括在含有所欲靶序列之DNA混合物中導入二種過量的寡核苷酸引子，接著在DNA聚合酶之存在下進行按精確順序的熱循環。該二種引子係各自與雙股靶序列中的個別股互補。為完成擴增作用，使混合物變性，然後使引子各自與標的分子內的互補序列黏合。在黏合作用之後，藉由聚合酶延伸引子，從而形成一對新的互補股。可重複進行變性作用、引子黏合作用及聚合酶延伸作用等步驟多次(亦即由變性作用、黏合作用及延伸作用構成一個“循環”，可進行無數個“循環”)，以獲得高濃度 之所欲靶序列的擴增節段。所欲靶序列的擴增節段之長度係由引子彼此的相對位置決定，因此該長度係一項可受控的參數。鑑於該方法的重複性質，將該方法稱為“聚合酶鏈反應”(在下文中稱作“PCR”)。因為靶序列所欲擴增的節段變成混合物中的主要序列(就濃度而言)，其等被稱為“經PCR擴增”。
在其他實施例中，PCR反應產生一擴增子。就該實施例的一方面而言，擴增子係指經由一對擴增引子中的一者或二者之延伸作用所產生的擴增反應產物。若所用的二個引子皆與同一靶序列雜交，則擴增子可含有呈指數擴增的核酸。任擇地，若所用引子中之一者未與靶序列雜交，則可藉由線性擴增作用產生擴增子。因而，該詞在本申請案中係以統稱方式使用，未必意味著存在呈指數擴增的核酸。
可藉由任何適宜方法進行所選擇或靶向的核酸序列之擴增作用。一般參見Kwoh等人於期刊“Am.Biotechnol.Lab.”第8期第14-25頁(1990年)乙文。適宜的擴增技術之實例包括但不限於聚合酶鏈反應、接合酶鏈反應、股置換擴增作用(一般參見G.Walker等人於期刊“Proc.Natl.Acad.Sci.USA”第89期第392-396頁(1992年)乙文；G.Walker等人於期刊“Nucleic Acids Res.”第20期第1691-1696頁(1992年)乙文)、轉錄式擴增作用(參見D.Kwoh等人於期刊“Proc.Natl.Acad.Sci.USA”第86期第1173-1177頁(1989年)乙文)、自持續性序列複製作用(或“3SR”)(參見J.Guatelli 等人於期刊“Proc.Natl.Acad.Sci.USA”第87期第1874-1878頁(1990年)乙文)、Qβ複製酶系統(參見P.Lizardi等人於期刊“BioTechnology”第6期第1197-1202頁(1988年)乙文)、核酸序列式擴增作用(或“NASBA”)(參見R.Lewis於期刊“Genetic Engineering News”第12(9)期第1頁(1992年)乙文)、修復鏈反應(或“RCR”)(參見上文所述之R.Lewis乙文)及迴力棒DNA擴增作用(或"BDA")(參見上文所述之R.Lewis乙文)。一般以聚合酶鏈反應為較佳者。
在另一實施例中，基因體DNA的擴增作用係經由一種使用引子的PCR反應完成。就該實施例的一方面而言，該等引子可包括第一組的引子、第二組的引子、第三組的引子等等。因此，“第一”、“第二”、“第三”等名稱係指該等引子組在巢式PCR反應中之使用順序。例如，在第一PCR反應中最先使用“第一”組的引子，用以擴增一聚核苷酸序列。接著，在第二PCR反應中使用“第二”組的引子，用以擴增第一PCR反應產物。然後，在第三PCR反應中使用“第三”組的引子，用以擴增第二PCR反應產物，依此類推。就該實施例的其他方面而言，該等引子可為經設計而與基因體DNA靶位點結合之“外”引子；或為經設計而與嵌入一生物體的基因體內之一聚核苷酸供體序列結合之“內”引子。在其他實施例中，第一組的引子可由一種內與一種外引子所組成，或可經設計而包含二種相異的內引子，或包含二種相異的外引子。在一實施例中，“引子”一詞係指與在適宜的擴增緩衝液中待擴增之DNA模板互補之一寡核苷酸。在 特定實施例中，引子的長度可為自10個鹼基對至100個鹼基對，自10個鹼基對至50個鹼基對或自10個鹼基對至25鹼基對。
在本揭露內容的一實施例中，所提供的內引子濃度係低於外引子濃度。就該實施例的一方面而言，所包括之外引子相對於內引子的相對濃度係約為10：1、9：1、8：1、7：1、6：1、5：1、4：1、3：1或2：1。就該實施例的另一方面而言，所包含的內引子濃度為0.001、0.005、0.01、0.02、0.03、0.04、0.05、0.06、0.07、0.08或0.09μM，而外引子的濃度係至少為0.1μM。就該實施例的另一方面而言，所包含的內引子濃度為0.01、0.02、0.03、0.04、0.05、0.06、0.07、0.08、0.09、0.1、0.11、0.12、0.13、0.14、0.15、0.16、0.17、0.18或0.19μM，而外引子的濃度係至少為0.2μM。
在一些實施例中，基因體嵌入位點係一植物的基因體DNA。就一方面而言，依據本揭露內容所轉形的植物細胞包括但不限於任一高等植物，包括雙子葉與單子葉植物，及特別是包括作物植物在內的可消耗性植物。該等植物例如可包括但不限於：苜蓿、黃豆、棉花、油菜子(亦稱作菜籽)、亞麻仁、玉米、稻米、臂形草、小麥、紅花、高梁、甜菜、向日葵、菸草及草皮草。因而，可選擇任何植物物種或植物細胞。在實施例中，在本申請案中所用的植物細胞及自其所生長或所衍生的植物，係包括但不限於可從下列各者取得之細胞：油菜子((Brassica napus)；印度芥菜(Brassica juncea)；衣索匹亞芥(Brassica carinata)；蕪菁 (Brassica rapa)；甘藍(Brassica oleracea)；黃豆(Glycine max)；亞麻仁/亞麻(Linum usitatissimum)；玉米(亦稱作玉蜀黍)(Zea mays)；紅花(Carthamus tinctorius)；向日葵(Helianthus annuus)；菸草(Nicotiana tabacum)；阿拉伯芥(Arabidopsis thaliana)；巴西栗子(Betholettia excelsa)；篦麻(Ricinus communis)；椰子(Cocus nucifera)；芫荽(Coriandrum sativum)；棉花(Gossypium spp.)；花生(Arachis hypogaea)；荷荷巴(Simmondsia chinensis)；油棕櫚(Elaeis guineeis)；橄欖(Olea eurpaea)；稻米(Oryza sativa)；南瓜(Cucurbita maxima)；大麥(Hordeum vulgare)；甘蔗(Saccharum officinarum)；稻米(Oryza sativa)；小麥(小麥屬(Triticum)物種包括硬粒小麥(Triticum durum)與普通小麥(Triticum aestivum))；及浮萍(浮萍科(Lemnaceae)物種)。在一些實施例中，同一植物物種內的遺傳背景可能有所不同。
在產生基因改造植物方面，用於植物的遺傳工程方法係技藝中眾所周知。例如，已研發出用於植物轉形的多種方法，包括用於雙子葉植物以及單子葉植物之生物與物理轉形程序(如Goto-Fumiyuki等人於期刊“Nature Biotech”第17期第282-286頁(1999年)乙文；美國佛羅里達州博卡拉頓(Boca Raton)的CRC出版公司於1993年出版及由Glick,B.R.與Thompson,J.E.編輯之“植物分子生物學與生物技術方法(Methods in Plant Molecular Biology and Biotechnology)”乙書第67-88頁之Miki等人乙文)。此外，亦有用於植物細胞或組織轉形作用及植物再生作用之載體與試管內培養方法 可供採用，例如美國佛羅里達州博卡拉頓(Boca Raton)的CRC出版公司於1993年出版及由Glick,B.R.與Thompson,J.E.編輯之“植物分子生物學與生物技術方法(Methods in Plant Molecular Biology and Biotechnology)”乙書第89-119頁之Gruber等人乙文。
在將DNA插入一植物宿主細胞方面，有眾多技術可供採用。該等技術包括使用根癌農桿菌(Agrobacterium tumefaciens)或發根農桿菌(Agrobacterium rhizogenes)作為轉形劑之使用去毒型T-DNA的轉形作用、磷酸鈣轉染作用、聚凝胺轉形作用、原生質體融合作用、電穿孔法、超音波法(如音波穿孔法)、脂質體轉形作用、顯微注射法、裸DNA、質體載體、病毒載體、生物發射法(微粒轟擊法)、碳化矽WHISKERS媒介型轉形作用、氣溶膠發射法或PEG以及其他可能的方法。
例如，可使用諸如植物細胞原生質體的電穿孔法與顯微注射法之技術，將DNA構築質體直接導入植物細胞的基因體DNA中；或者可使用生物發射方法，諸如DNA粒子轟擊法，將DNA構築質體直接導入植物組織中(如參見Klein等人於期刊“Nature”第327期第70-73頁(1987年)乙文)。用於植物細胞轉形作用之其他方法包括經由碳化矽WHISKERS媒介型DNA攝入作用之顯微注射法(Kaeppler等人於期刊“Plant Cell Reporter”第9期第415-418頁(1990年)乙文)。任擇地，可經由奈米粒子轉形作用，將DNA構築質體導入植物細胞中(如參見第12/245,685號美國專利申請案， 其在此完整地併入本案以為參考資料)。
另一種已知的植物轉形方法是微粒發射體媒介型轉形作用，其中DNA係承載於微粒發射體的表面。在該方法中，利用生物發射裝置將載體導入植物組織中，該生物發射裝置使微粒發射體加速至足以穿透植物細胞壁與細胞膜之速度。Sanford等人於期刊“Part.Sci.Technol.”第5期第27頁(1987年)乙文；Sanford,J.C.於期刊“Trends Biotech.”第6期第299頁(1988年)乙文；Sanford,J.C.於期刊“Physiol.Plant”第79期第206頁(1990年)乙文；Klein等人於期刊“Biotechnology”第10期第268頁(1992年)乙文。
任擇地，基因轉移與轉形作用方法包括但不限於經由氯化鈣沈澱作用之原生質體轉形法；裸DNA之聚乙二醇(PEG)或電穿孔法媒介型攝入作用(參見Paszkowski等人於期刊“EMBO J”第3期第2717-2722頁(1984年)乙文；Potrykus等人於期刊“Molec.Gen.Genet.”第199期第169-177頁(1985年)乙文；Fromm等人於期刊“Proc.Nat.Acad.Sci.USA”第82期第5824-5828頁(1985年)乙文；及Shimamoto於期刊“Nature”第338期第274-276頁(1989年)乙文)；及植物組織的電穿孔法(D'Halluin等人於期刊“Plant Cell”第4期第1495-1505頁(1992年)乙文)。
用於將表現載體導入植物中之一種獲廣泛採用的方法，係以農桿菌的天然轉形系統為基礎。Horsch等人於期刊“Science”第227期第1229頁(1985年)乙文。根癌農桿菌(A.tumefaciens)與發根農桿菌(A.rhizogenes)係已知適用 於植物細胞的基因轉形作用之植物病原性土壤細菌。根癌農桿菌與發根農桿菌分別具有Ti與Ri質體，其中帶有負責植物基因轉形作用之基因。Kado,C.I.於期刊“Crit.Rev.Plant.Sci.”第10期第1頁(1991年)乙文。關於農桿菌載體系統及農桿菌媒介型基因轉移之方法，例如可參見上文所述之Gruber等人乙文、上文所述之Miki等人乙文、Moloney等人於期刊“Plant Cell Reports”第8期第238頁(1989年)乙文及第4,940,838號與第5,464,763號美國專利。
若在轉形作用中使用農桿菌，則應將待插入的DNA選殖至特殊質體中，亦即選殖至一個中間載體或一個二元載體中。中間載體本身無法在農桿菌中複製。藉由使用一輔助質體(接合作用)，可將中間載體轉移至根癌農桿菌中。日本菸草超級二元系統即為該種系統之一實例(美國紐澤西州托托瓦(Totowa)的胡馬納(Humana)出版公司出版之“分子生物學方法(Methods in Molecular Biology)”(K.Wang編輯)第343號“農桿菌程序(Agrobacterium Protocols)”(第2版第1冊)第15-41頁之Komari等人(2006年)綜合評論乙文；及Komori等人(2007年)於期刊“Plant Physiol.”第145期第1155-1160頁乙文)。二元載體本身可在大腸桿菌(E.coli)與在農桿菌中複製。其等包含一個篩選標記基因及一個連接子或多連接子，及係由右側與左側的T-DNA邊界區為框架。其等可直接轉形至農桿菌中(Holsters於1978年乙文)。作為宿主細胞之農桿菌需包含帶有一個vir區之一質體。Ti或Ri質體亦包含T-DNA轉移作用所需之vir區。需要有vir區，方 能將T-DNA轉移至植物細胞中。可能含有其他的T-DNA。
當使用二元T DNA載體(Bevan於期刊“Nuc.AcidRes.”第12期第8711-8721頁(1984年)乙文)或非二元T-DNA載體程序(Horsch等人於期刊”Science”第227期第1229-1231頁(1985年)乙文)使細胞受到根癌農桿菌感染時，根癌農桿菌宿主的致病功能將引導含有構築質體與相鄰標記之T股插入植物細胞DNA中。一般而言，農桿菌轉形系統係用於工程改造雙子葉植物(Bevan等人於期刊“Ann.Rev.Genet”第16期第357-384頁(1982年)乙文；Rogers等人於期刊“Methods Enzymol.”第118期第627-641頁(1986年)乙文)。農桿菌轉形系統亦可用於將DNA轉形以及轉移至單子葉植物與植物細胞中。參見第5，591,616號美國專利；Hernalsteen等人於期刊“EMBO J”第3期第3039-3041頁(1984年)乙文；Hooykass-Van Slogteren等人於期刊“Nature”第311期第763-764頁(1984年)乙文；Grimsley等人於期刊“Nature”第325期第1677-1679頁(1987年)乙文；Boulton等人於期刊“Plant Mol.Biol.”第12期第31-40頁(1989年)乙文；及Gould等人於期刊“Plant Physiol.”第95期第426-434頁(1991年)乙文。將基因構築質體導入特定的植物細胞之後，植物細胞可以生長，而當分化組織諸如莖與根出現時，可產生成熟的植物。在一些實施例中，可產生多種植物。用於再生植物之方法係該等具一般技藝者所知，及例如可參見：克魯沃學術出版社(Kluwer Academic Publishers)於1994年出版及由Vasil與Thorpe編輯之“植物細胞與組織培養(Plant Cell and Tissue Culture)”乙書；及參見：“植物細胞培養程序(Plant Cell Culture Protocols)(胡馬納(Humana)出版公司於1999年出版及由Hall編輯之“分子生物學方法”乙文(Methods in Molecular Biology)”第111號)。本申請案所述之基因改造植物可在發酵培養基中培養，或在適宜的介質諸如土壤中生長。在一些實施例中，適合高等植物使用之生長介質包括任何植物用的生長介質，包括但不限於土壤、砂、支持根部生長的其他任何顆粒性介質(如蛭石、珍珠岩等)或水耕栽培液，以及合適的光、水及營養補充劑，以最佳化高等植物之生長。
可培養藉由上述任一轉形技術所產生的轉形植物細胞，而再生具有所轉形的基因型及因而具有所欲的表現型之一全株植物。該等再生技術憑藉著在組織培養的生長介質中操縱某些植物激素，通常憑藉著在導入所欲核苷酸序列之際，同時導入一種除生物劑及/或除草劑標記。植物從所培養的原生質體之再生作用係述於美國紐約的麥克米蘭出版公司(Macmillian Publishing Company)於1983年出版之“植物細胞培養手冊(Handbook of Plant Cell Culture)”乙書第124-176頁之Evans等人所著“原生質體之分離與培養(Protoplasts Isolation and Culture)”乙文；及美國佛羅里達州博卡拉頓的CRC出版公司於1985年出版之“結合作用、植物再生作用、植物原生質體(Binding,Regeneration of Plants,Plant Protoplasts)”乙書第21-73頁。亦可自植物癒合組織、培植體、器官、花粉、胚芽或其部分進行再生作用。Klee 等人於期刊“Ann.Rev.of Plant Phys.”第38期第467-486頁(1987年)乙文中，整體說明了該等再生技術。
在其他實施例中，經轉形的植物細胞無法再生產生一植物。該等細胞係稱為暫時性轉形。所產生的暫時性轉形細胞可用於分析一特定轉殖基因的表現作用及/或功能性。暫時性轉形技術係技藝中所知，及包括對於上述轉形技術的小幅修改。嫻熟技藝者可選擇使用暫時性轉形作用，以迅速分析一特定轉殖基因的表現作用及/或功能性，因為暫時性轉形作用可迅速完成，不像穩定轉形技術需耗用眾多資源(如培養植物使其發育成全株植物，用於將一轉殖基因固定於基因體內之植物自花受精或雜交作用等)。
在一實施例中，基本上可將供體聚核苷酸導入任何植物中。可工程改造廣泛種類的植物與植物細胞系統，以供定點嵌入本揭露內容與上述各種轉形方法之供體聚核苷酸。在一實施例中，可供改造的標的植物與植物細胞包括但不限於該等單子葉與雙子葉植物，諸如作物及包括穀類作物(如小麥、玉蜀黍、稻米、小米、大麥)；果類作物(如番茄、蘋果、梨，草莓，橘子)；飼料作物(如苜蓿)；根菜類作物(如胡蘿蔔、馬鈴薯、甜菜、山藥)；葉菜類作物(如萵苣、菠菜)；開花植物(如矮牽牛、玫瑰、菊花)；針葉樹與松樹(如松杉、雲杉)；用於植物整治復育之植物(如積累重金屬之植物)；油料作物(如向日葵、油菜子)及實驗用植物(如筷子芥屬)。
在其他實施例中，將聚核苷酸供體序列導入一植 物細胞中，以供定點式靶向至一基因體靶位點內。在該等實施例中，該植物細胞可為一種原生質體植物細胞。原生質體可由不同類型的植物細胞產生。因此，具一般技藝者可採用不同技術或方法來產生原生質體植物細胞。例如，下列文獻提供原生質體的生成與生產作用：Green與Phillips於期刊“Crop Sc.”第15期第417-421頁(1975年)乙文；Harms等人於期刊“Z.Pflanzenzuechtg.”第77期第347-351頁(1976年)乙文；Lowe與Smith之歐洲專利申請案EP-0,160,390(1985年)；Cheng之歐洲專利申請案EP-0,176,162(1985年)；及之Close之歐洲專利申請案EP-0,177,738(1985年)；匈牙利布達佩斯的阿克達米亞克拉多(Akademiai Kiado)出版社於1976年出版及由Dudits等人編輯之“高等植物細胞遺傳學(Cell Genetics in Higher Plants)”乙書第129-140頁，及其中之參考文獻；W.F.Sheridan所編輯之“供生物研究用之玉米(Maize for Biological Research)”乙書(1982年)中之Harms所著“玉米和穀物原生質體-事實與觀點(Maize and Cereal Protoplasts-Facts and Perspectives)”乙文；Dale之“原生質體(Protoplasts)”乙書(1983年)；瑞士巴塞爾的柏克豪舍(Birkhauser)出版社於1983年出版及由Potrykus等人所編輯之“演講論文集-經驗補充”乙書第46冊第31-41頁，及其中之參考文獻。植物從所培養的原生質體之再生作用係述於美國紐約的麥克米蘭出版公司(MacMillan PublishingCo.)於1983年出版之“植物細胞培養手冊(Handbook of Plant Cell Culture)”乙書第124-176頁之Evans等人所著“原生質體 之分離與培養(Protoplasts Isolation and Culture)”乙文；Davey於“原生質體(Protoplasts)”乙書(瑞士巴塞爾的柏克豪舍(Birkhauser)出版社於1983年出版)第12-29頁之“植物原生質體培養與再生之最新進展(Recent Developments in the Culture and Regeneration of Plant Protoplasts)”乙文；Davey於“原生質體(Protoplasts)’，乙書(瑞士巴塞爾的柏克豪舍(Birkhauser)出版社於1983年出版)第31-41頁之“穀物與其他生物難分解性作物之原生質體培養與植物再生作用(Protoplast Culture and Plant Regeneration of Cereals and Other Recalcitrant Crops)”乙文；Binding於“植物原生質體(Plant Protoplasts)”乙書(美國佛羅里達州博卡拉頓的CRC出版公司於1985年出版)第21-73頁之“植物再生作用(Regeneration of Plants)”乙文。
靶位點之選擇；用於設計與構築融合蛋白(及編碼該融合蛋白的聚核苷酸)之ZFP與方法係嫻熟技藝者所知，及詳述於第6,140,081號美國專利；第5,789,538號美國專利；第6,453,242號美國專利；第6,534,261號美國專利；第5,925,523號美國專利；第6,007,988號美國專利；第6,013,453號美國專利；第6,200,759號美國專利；WO 95/19431；WO 96/06166；WO 98/53057；WO 98/54311；WO 00/27878；WO 01/60970；WO 01/88197；WO 02/099084；WO 98/53058；WO 98/53059；WO 98/53060；WO 02/016536及WO 03/016496。
在後續實施例中，包含一或多個DNA結合序列之 DNA結合域，係與一種鋅指結合蛋白、巨核酸酶結合蛋白、CRIPSR或TALEN結合蛋白結合。
在特定實施例中，本申請案所述之組成物與方法係採用一種巨核酸酶(歸位核酸內切酶)結合蛋白或巨核酸酶DNA結合域，以用於與供體分子結合及/或與該細胞基因體中的所關注區域結合。天然存在的巨核酸酶辨識具15至40個鹼基對的剪切位點，及通常分為四個家族：LAGLIDADG家族、GIY-YIG家族、組胺酸-半胱胺酸盒家族及HNH家族。例示性的歸位核酸內切酶包括I-SceI、I-CeuI、PI-PspI、PI-Sce、I-SceIV、I-CsmI、I-PanI、I-SceII、I-PpoI、I-SceIII、I-CreI、I-TevI、I-TevII及I-TevIII。已知其等的辨識序列。亦參見第5,420,032號美國專利；第6,833,252號美國專利；Belfort等人(1997年)於期刊“Nucleic Acids Res.”第25期第3379-3388頁乙文；Dujon等人(1989年)於期刊“Gene”第82期第115-118頁乙文；Perler等人(1994年)於期刊“Nucleic Acids Res.”第22期第1125-1127頁乙文；Jasin(1996年)於期刊“Trends Genet.”第12期第224-228頁乙文；Gimble等人(1996年)於期刊“J.Mol.Biol.”第263期第163-180頁乙文；Argast等人(1998年)於期刊“J.Mol.Biol.”第280期第345-353頁乙文；及新英格蘭生物實驗室(New England Biolabs)公司產品目錄。
在特定實施例中，本申請案所述方法與組成物係使用包含經工程改造(非天然存在)的歸位核酸內切酶(巨核酸酶)之一種核酸酶。目前已知歸位核酸內切酶與巨核酸酶 諸如I-SceI、I-CeuI、PI-PspI、PI-Sce、I-SceIV、I-CsmI、I-PanI、I-SceII、I-PpoI、I-SceIII、I-CreI、I-TevI、I-TevII及I-TevIII的辨識序列。亦參見第5,420,032號美國專利；第6,833,252號美國專利；Belfort等人(1997年)於期刊“Nucleic Acids Res.”第25期第3379-3388頁乙文；Dujon等人(1989年)於期刊“Gene”第82期第115-118頁乙文；Perler等人(1994年)於期刊“Nucleic Acids Res.”第22期第1125-1127頁乙文；Jasin(1996年)於期刊“Trends Genet.”第12期第224-228頁乙文；Gimble等人(1996年)於期刊“J.Mol.Biol.”第263期第163-180頁乙文；Argast等人(1998年)於期刊“J.Mol.Biol.”第280期第345-353頁乙文；及新英格蘭生物實驗室(New England Biolabs)公司產品目錄。此外，可改造歸位核酸內切酶與巨核酸酶的DNA結合特異性，使其與非天然的靶位點結合。如見Chevalier等人(2002年)於期刊“Molec.Cell”第10期第895-905頁乙文；Epinat等人(2003年)於期刊“Nucleic Acids Res.”第31期第2952-2962頁乙文；Ashworth等人(2006年)於期刊“Nature”第441期第656-659頁乙文；Paques等人(2007年)於期刊“Current Gene Therapy”第7期第49-66頁乙文；第20070117128號美國專利公開案。就整體核酸酶的情況而言，可改變歸位核酸內切酶與巨核酸酶的DNA結合域(亦即使得該核酸酶包括同源的剪切域)。
在其他實施例中，用於本申請案所述方法與組成物中之一或多種核酸酶的DNA結合域，係包含一個天然存在或經工程改造(非天然存在)的TAL效應子DNA結合域。如 參見第20110301073號美國專利公開案，其全部內容在此併入本案以為參考資料。已知黃單胞菌屬(Xanthomonas)的植物病原性細菌在重要的作物植物中引發多種疾病。黃單胞菌屬的致病力係取決於第III保留型分泌(T3S)系統，其將超過25種的不同效應子蛋白注入植物細胞中。在所注入的該等蛋白當中，存在轉錄激活因子樣(TAL)效應子，其模擬植物轉錄激活因子及操縱植物轉錄體(參見Kay等人(2007年)於期刊”Science”第318期第648-651頁乙文)。該等蛋白含有一個DNA結合域與一個轉錄激活域。來自茄科細菌性斑點病菌(Xanthomonas campestris pv.Vesicatoria)的AvrBs3係特性分析最為完整的TAL效應子(參見Bonas等人(1989年)於期刊“Mol Gen Genet”第218期第127-136頁乙文及WO 2010079430)。TAL效應子含有一個由縱排重複序列組成的集中域，各重複序列約含有34個胺基酸，該等蛋白的DNA結合特異性之關鍵在於該等重複序列。此外，其等含有一個核定位序列與一個酸性轉錄激活域(綜合評論請參見Schornack S等人(2006年)於期刊“J Plant Physiol”第163(3)期第256-272頁乙文)。此外，在植物病原性細菌青枯病羅爾斯頓氏菌(Ralstonia solanacearum)第一生化型菌株GMI1000與第四生化型菌株RS1000中，已發現青枯病羅爾斯頓氏菌之稱為brg11與hpx17的二個基因係與黃單胞菌屬的AvrBs3家族同源(參見Heuer等人(2007年)於期刊“Appl and Envir Micro”第73(13)期第4379-4384頁乙文)。該等基因的核苷酸序列之一致性為98.9%，差別僅在於在hpx17的重複序列域 刪除了1,575個鹼基對。然而，該二基因產物與黃單胞菌屬AvrBs3家族蛋白的序列一致性低於40%。如參見第20110239315號、第20110145940號及第20110301073號美國專利公開案，其等的全部內容在此併入本案以為參考資料。
該等TAL效應子的特異性係取決於存在於縱排重複序列中之序列。重複序列包含約102個鹼基對，及彼此的同源性通常約為91至100%(同上之Bonas等人乙文)。重複序列的多型性通常位於位置12與13，在位置12與13的二個高度可變性殘基與TAL效應子之靶序列的鄰接核苷酸之間，似乎有一對一之對應(參見Moscou與Bogdanove(2009年)於期刊”Science”第326期第1501頁乙文及Boch等人(2009年)於期刊”Science”第326期第1509-1512頁乙文)。已經由實驗確定該等TAL效應子的DNA辨識作用之天然編碼，位置12與13上的一個HD序列導致與胞嘧啶(C)結合，NG與T結合，NI與A、C、G或T結合，NN與A或G結合，及ING與T結合。已將該等DNA結合型重複序列組裝成為具有新的重複序列組合與數目之蛋白，而造出人工轉錄因子，其等可與新序列交互作用及激活植物細胞中的一種非內源性報導基因的表現作用(同上之Boch等人乙文)。當經工程設計的TAL蛋白與一個FokI剪切半域連接時，產生一個TAL效應子域核酸酶融合體(TALEN)，其在酵母菌報導子分析法(質體式標的)中展現活性。如參見第20110301073號美國專利公開案；Christian等人乙文((2010年)<Genetics epub 10.1534/ genetics.110.120717)。
在其他實施例中，該核酸酶系統係包含CRISPR(群聚且有規律間隔的短迴文重複序列)/Cas(CRISPR相關型)核酸酶系統。CRISPR/Cas係近期經工程改造的核酸酶系統，其係以可用於基因體工程之一細菌系統為基礎。其係部分基於許多細菌與古菌的適應性免疫反應。當病毒或質粒侵入細菌時，藉由‘免疫’反應將入侵者的DNA節段轉換成CRISPR RNA(crRNA)。該crRNA然後經由一個部分互補的區域而與稱作tracrRNA之另一類型的RNA結合，而引導Cas9核酸酶至一區域，該區域係與一個前間隔序列相鄰基序(PAM)NGG旁之靶DNA中的crRN同源。藉由crRNA轉錄本中所含有之具有20個核苷酸的引導序列，Cas9在所指定的位點剪切DNA而在雙股斷裂處產生平整端。Cas9在進行定點式DNA辨識與剪切作用時，係同時需要crRNA與tracrRNA。目前已工程改造該系統，使得crRNA與tracrRNA可以組合成一分子(“單導向RNA”)，及單導向RNA的crRNA等效部分可經工程改造而引導Cas9核酸酶靶向與PAM相鄰的任何所欲序列(參見Jinek等人(2012年)於期刊”Science”第337期第816-821頁乙文；Jinek等人(2013年)之eLife 2：e00471乙文；及David Segal(2013年)之eLife 2：e00563乙文)。因而，可工程改造CRISPR/Cas系統而在一基因體中的所欲標的產生雙股斷裂，及可藉由使用修復抑制劑而影響雙股斷裂之修復，使得修復作用之出錯增加。
在特定實施例中，用於在活體內剪切及/或靶向 剪切細胞基因體之一或多種核酸酶的DNA結合域，係包含一種鋅指蛋白。該鋅指蛋白較佳並非天然存在的，而是經工程改造而與所選擇的靶位點結合。如見Beerli等人(2002年)於期刊“Nature Biotechnol.”第20期第135-141頁乙文；Pabo等人(2001年)於期刊“Ann.Rev.Biochem.”第70期第313-340頁乙文；Isalan等人(2001)於期刊“Nature Biotechnol.”第19期第656-660頁乙文；Segal等人(2001年)於期刊“Curr.Opin.Biotechnol.”第12期第632-637頁乙文；Choo等人(2000年)於期刊“Curr.Opin.Struct.Biol.”第10期第411-416頁乙文；第6,453,242號美國專利；第6,534,261號美國專利；第6,599,692號美國專利；第6,503,717號美國專利；第6,689,558號美國專利；第7,030,215號美國專利；第6,794,136號美國專利；第7,067,317號美國專利；第7,262,054號美國專利；第7,070,934號美國專利；第7,361,635號美國專利；第7,253,273號美國專利；及第2005/0064474號、第2007/0218528號、第2005/0267061號美國專利公開案，其等的全部內容在此併入本案以為參考資料。
相較於一種天然存在的鋅指蛋白，經工程改造的鋅指結合域可具有新穎的結合特異性。工程化方法包括但不限於循理設計與各種類型的篩選作用。循理設計例如包括使用包含三聯體(或四聯體)核苷酸序列與個別鋅指胺基酸序列之資料庫，其中各個三聯體或四聯體核苷酸序列係與結合特定三聯體或四聯體序列之鋅指的一或多個胺基酸序列相關聯。如見專利權共有的第6,453,242號與第 6,534,261號美國專利，其等的全部內容在此併入本案以為參考資料。
例示性篩選方法包括噬菌體呈現與雙雜合系統，如第5,789,538號美國專利、第5,925,523號美國專利、第6,007,988號美國專利、第6,013,453號美國專利、第6,410,248號美國專利、第6,140,466號美國專利、第6,200,759號美國專利、第及6,242,568號美國專利以及WO 98/37186、WO 98/53057、WO 00/27878、WO 01/88197及GB 2,338,237中所揭露。此外，例如在專利權共有的WO 02/077227中，曾述及如何增進鋅指結合域的結合特異性。
此外，如該等參考資料及其他參考資料中所揭露，可使用任何適宜的連接子序列，例如包括長度為5個或更多個胺基酸之連接子，將鋅指域及/或多指型鋅指蛋白連接在一起。關於長度為6個或更多個胺基酸之例示性連接子亦參見第6,479,626號美國專利、第6,903,185號美國專利及第7,153,949號美國專利。本申請案所述之蛋白可包括位於該蛋白的個別鋅指之間之任何適宜的連接子組合。
在本申請案中述及組成物，特別是適用於在活體內剪切帶有一轉殖基因的一供體分子之核酸酶，及用於剪切一細胞基因體之核酸酶，使得該轉殖基因以靶向方式嵌入該基因體中。在特定實施例中，該等核酸酶中的一或多者係天然存在的核酸酶。在其他實施例中，該等核酸酶中的一或多者並非天然存在的，亦即具有經工程改造的DNA結合域及/或剪切域。例如，可能改變一種天然存在的核酸 酶之DNA結合域，使其與所選擇的靶位點結合(如經工程改造的巨核酸酶所結合的位點係不同於同源結合位點)。在其他實施例中，核酸酶包含異源的DNA結合域與剪切域(如鋅指核酸酶；TAL效應子域DNA結合蛋白；具有異源剪切域之巨核酸酶DNA結合域)。
任一適宜的剪切域可在操作上與一DNA結合域連接，而形成一核酸酶。例如，已將ZFP DNA結合域與核酸酶域融合而產生ZFN，亦即可經由其工程改造的(ZFP)DNA結合域而辨識其預定的核酸標的之一種功能性實體，及經由核酸酶活性而使得DNA在鄰近ZFP結合位點之處被剪切。如參見Kim等人(1996年)於期刊“Proc Natl Acad Sci USA”第93(3)期第1156-1160頁乙文。最近，在多種生物體中使用ZFN進行基因體改造。如見第20030232410號美國專利公開案、第20050208489號美國專利公開案、第20050026157號美國專利公開案、第20050064474號美國專利公開案、第20060188987號美國專利公開案、第20060063231號美國專利公開案及國際公開案WO 07/014275。同樣地，已將TALEDNA結合域與核酸酶域融合而產生TALEN。如參見第20110301073號美國專利公開案。
如上述，剪切域與DNA結合域可能是異源的，例如一個鋅指DNA結合域與來自一核酸酶的一個剪切域或者一個TALEN DNA結合域與一個剪切域，或者巨核酸酶DNA結合域與來自不同核酸酶的剪切域。可從特定的核酸內切酶或核酸外切酶獲得異源剪切域。自其可衍生剪切域之例 示性核酸內切酶包括但不限於特定的限制性核酸內切酶與歸位核酸內切酶。如見美國麻州貝弗利(Beverly)的新英格蘭生物實驗室(New England Biolabs)公司2002年-2003年產品目錄；及Belfort等人(1997年)於期刊“Nucleic Acids Res.”第25期第3379-3388頁乙文。已知剪切DNA的其他酵素(如S1核酸酶、綠豆核酸酶、胰臟DNase I、微球菌核酸酶、酵母菌HO核酸內切酶；亦參見冷泉港實驗室(Cold Spring Harbor Laboratory Press)出版公司於1993年出版及由Linn等人所編輯之“核酸酶(Nucleases)”乙書)。該等酵素中之一或多者(或其功能性片段)可作為剪切域與剪切半域之來源。
同樣地，如上述，剪切半域可從任何核酸酶或其部分獲得，其剪切活性需要二聚化作用。一般而言，若融合蛋白包含剪切半域，則剪切作用之進行需要二個融合蛋白。任擇地，可使用包含二個剪切半域之單一蛋白。該二個剪切半域可衍生自相同的核酸內切酶(或其功能性片段)，或者各剪切半域可各衍生自不同的核酸內切酶(或其功能性片段)。此外，該二融合蛋白的靶位點較佳相對於彼此配置，該二融合蛋白與各自靶位點之結合作用將剪切半域置於彼此的一空間定向，而容許剪切半域例如藉由二聚化作用而形成一功能性剪切域。因而，在特定實施例中，靶位點的近邊係相隔5至8個核苷酸或相隔15至18個核苷酸。然而，在兩個靶位點之間可介入任何整數的核苷酸或核苷酸對(如自2至50個或更多的核苷酸對)。一般而言，剪切位點係位於靶位點之間。
在多種物種中皆有限制性核酸內切酶(限制酶)，及能以序列特異性方式與DNA結合(在一辨識位置)，及在結合位點或在鄰近處剪切DNA。某些限制酶(如IIS型)在遠離辨識位置之位點剪切DNA，而具有可分離的結合域與剪切域。例如，IIS型酵素Fok I催化DNA的雙股剪切作用，在一股上係在距其辨識位置9個核苷酸之處剪切，而在另一股上係在距其辨識位置13個核苷酸之處剪切。如見第5,356,802號、第5,436,150號及第5,487,994號美國專利；以及Li等人(1992年)於期刊“Proc.Natl.Acad.Sci.USA”第89期第4275-4279頁乙文；Li等人(1993年)於期刊“Proc.Natl.Acad.Sci.USA”第90期第2764-2768頁乙文；Kim等人(1994年a)於期刊“Proc.Natl.Acad.Sci.USA”第91期第883-887頁乙文；Kim等人(1994年b)於期刊“J.Biol.Chem.”第269期第31,978-31,982頁乙文。因而，在一實施例中，包含來自至少一種IIS型限制酶的剪切域(或剪切半域)及一或多個鋅指結合域之融合蛋白或許可進行或者不可進行工程化。
Fok I係剪切域可與結合域分離之一種例示性IIS型限制酶。該特定的酵素的活性形式為二聚體。Bitinaite等人(1998年)於期刊“Proc.Natl.Acad.Sci.USA”第95期第10,570-10,575頁乙文。因此，就本揭露內容之目的而言，係將用於所揭露的融合蛋白之Fok I酵素的該部分視為一個剪切半域。因此，就使用鋅指-Fok I融合體之DNA序列的靶向雙股剪切作用及/或靶向置換作用而言，可使用各包含一個FokI剪切半域之二種融合蛋白來重新建構一個具有催化 活性的剪切域。任擇地，亦可使用含有一個鋅指結合域與二個Fok I剪切半域之單一多肽分子。使用鋅指-Fok I融合體的靶向剪切作用與靶向序列變更作用之參數，係提供於本揭露內容他處。
剪切域或剪切半域可為保有剪切活性或保有多聚化(如二聚化)之能力而形成一功能性剪切域之一蛋白的任一部分。
例示性IIS型限制酶係述於國際公開案WO 07/014275，其全部內容在此併入本案以為參考資料。亦有其他限制酶含有可分離的結合域與剪切域，而該等限制酶係涵蓋於本揭露內容中。如見Roberts等人(2003年)於期刊“Nucleic Acids Res.”第31期第418-420頁乙文。
在特定實施例中，剪切域包含一或多個經工程改造的剪切半域(亦稱作二聚化域突變體)而盡量減少或防止同型二聚化作用，如第20050064474號、第20060188987號、第20070305346號及第20080131962號美國專利公開案所述，其等的全部內容在此併入本案以為參考資料。位於Fok I的位置446、447、479、483、484、486、487、490、491、496、498、499、500、531、534、537及538之胺基酸殘基皆為用於影響Fok I剪切半域的二聚化作用之標的。
形成絕對異型二聚體之Fok I經工程改造的例示性剪切半域係包括一對剪切半域，其中第一剪切半域包括位於Fok I的位置490與538之胺基酸殘基的突變作用，而第二剪切半域包括位於位置486與499之胺基酸殘基的突變作 用。
因而，在一實施例中，在位置490的突變作用係以離胺酸(K)置換麩胺酸(E)；在位置538的突變作用係以離胺酸(K)置換異白胺酸(I)；在位置486的突變作用係以麩胺酸(E)置換麩醯胺(Q)；及在位置499的突變作用係以離胺酸(K)置換異白胺酸(I)。具體而言，本申請案所述之經工程改造的剪切半域之製備作用，係藉由促使一個剪切半域中的位置490(E→K)與位置538(I→K)突變，而產生一個稱作“E490K：I538K”之經工程改造的剪切半域；藉由促使另一個剪切半域中的位置486(Q→E)與位置499(I→L)突變，而產生一個稱作“Q486E：I499L”之經工程改造的剪切半域。本申請案所述之經工程改造的剪切半域係絕對異型二聚化突變體，其中的異常剪切作用已減至最少或消除。如參見第2008/0131962號美國專利公開案，其全部揭露內容在此就所有目的併入本案以為參考資料。在特定實施例中，經工程改造的剪切半域係包含在位置486、499與496(編號係相對於野生型Fok I而言)的突變作用；例如，突變作用係用麩胺酸(E)殘基置換位置486的野生型麩醯胺(Q)殘基，用白胺酸(L)殘基置換位置499的野生型異白胺酸(I)殘基，用天門冬胺酸(D)或麩胺酸(E)殘基置換位置496的野生型天冬醯胺酸(N)殘基(亦分別稱作“ELD”與“ELE”域)。在其他實施例中，經工程改造的剪切半域係包含在位置490、538與537(編號係相對於野生型Fok I而言)的突變作用；例如，突變作用係用離胺酸(K)殘基置換位置490的野生型麩胺酸(E)殘基， 用離胺酸(K)殘基置換位置538的野生型異白胺酸(I)殘基，及用離胺酸(K)殘基或精胺酸(R)殘基置換位置537的野生型組胺酸(H)殘基(亦分別稱作“KKK”與“KKR”域)。在其他實施例中，經工程改造的剪切半域係包含在位置490與537(編號係相對於野生型Fok I而言)的突變作用；例如，突變作用係用離胺酸(K)殘基置換位置490的野生型麩胺酸(E)殘基，及離胺酸(K)殘基或精胺酸(R)殘用置換位置537的野生型組胺酸(H)殘基(亦分別稱作“KIK”與“KIR”域)。(參見第20110201055號美國專利公開案)。在其他實施例中，經工程改造的剪切半域係包含“夏基(Sharkey)”及/或“夏基(Sharkey)”突變作用(參見Guo等人(2010)於期刊“J.Mol.Biol.”第400(1)期第96-107頁乙文)。
可使用任何適宜的方法製備本申請案所述之經工程改造的剪切半域，例如藉由述於第20050064474號、第20080131962號及第20110201055號美國專利公開案之野生型剪切半域(Fok I)的定點誘突變作用。
任擇地，可在核酸靶向位址使用所謂“分裂酵素”技術，而在活體內組裝核酸酶(如參見第20090068164號美國專利公開案)。該分裂酵素的組分可在不同的表現構築質體上表現，或可在一個開放讀框中連接，其中藉由一個自剪切型2A肽或IRES序列而將個別組分分開。組分可為個別的鋅指結合域，或為一個巨核酸酶核酸結合域的結構域。
在使用核酸酶之前，可先篩檢其活性，例如在WO 2009/042163與20090068164所述之酵母式染色體系統 中篩檢。使用技藝中的已知方法即可設計核酸酶表現構築質體。如參見第20030232410號、第20050208489號、第20050026157號、第20050064474號、第20060188987號、第20060063231號美國專利公開案；及國際公開案WO 07/014275。核酸酶的表現作用可由一種持續性啟動子或一種誘導性啟動子控制，例如半乳糖激酶啟動子係在棉子糖及/或半乳糖存在下激活(去抑制)，及在葡萄糖存在下受抑制。
在一實施例中，聚核苷酸供體盒包含編碼一肽之一序列。為表現一肽，通常將編碼該肽序列的核苷酸序列次選殖至表現載體中，該表現載體含有用於引導轉錄作用的一啟動子。適宜的細菌型與真核型啟動子係技藝中眾所周知，及如下列文獻所述：Sambrook等人所著“分子選殖：實驗室手冊(Molecular Cloning,A Laboratory Manual)”乙書(1989年第二版；2001年第三版)；Kriegler所著“基因轉移與表現作用：實驗室手冊(Gene Transfer and Expression：A Laboratory Manua)”乙書(1990年))；及”當前分子生物學方法(Current Protocols in Molecular Biology)”乙書(Ausubel等人同上)。可取得例如在大腸桿菌(E.coli)、芽孢桿菌屬(Bacillus)物種及沙門桿菌屬(Salmonella)中表現之細菌型表現系統(Palva等人於期刊“Gene”第22期第229-235頁(1983年)乙文)。該等表現系統之套組已有市售。用於哺乳類動物細胞、酵母菌及昆蟲細胞的真核表現系統係嫻熟技藝者眾所周知，及亦已市售。
在一實施例中，聚核苷酸供體盒包含一基因表現 盒，盒中含有一轉殖基因。該基因表現盒通常含有一轉錄單元，或者表現盒含有在原核或真核的宿主細胞中表現該核酸所需的所有附加單元。因而，典型的基因表現盒含有例如與編碼該蛋白的一核酸序列操作連接之一啟動子，及如轉錄本的充分多腺苷酸化、轉錄終止作用、核糖體結合位點或轉譯終止作用所需的訊號。該盒的附加元件例如可包括增強子與異源剪接訊號。
在一實施例中，基因表現盒亦在所關注的異種核苷酸序列的3’端包括一個轉錄與轉譯終止區，該終止區在植物中具有功用。該終止區可為本揭露內容的實施例之啟動子核苷酸序列的原生終止區，可為所關注的DNA序列之的原生終止區，或可衍生自另一來源。可使用來自根癌農桿菌的Ti-質體之便利的終止區，諸如章魚鹼合成酶與胭脂鹼合成酶(nos)終止區(Depicker等人(1982年)於期刊“Mol.and Appl.Genet.”第1期第561-573頁乙文及Shaw等人(1984年)於期刊“Nucleic Acids Research”第12期第20號第7831-7846頁乙文(nos))；亦參見Guerineau等人(1991年)於期刊“Mol.Gen.Genet.”第262期第141-144頁乙文；Proudfoot(1991年)於期刊“Cell”第64期第671-674頁乙文；Sanfacon等人(1991年)於期刊“Genes Dev.”第5期第141-149頁乙文；Mogen等人(1990年)於期刊“Plant Cell”第2期第1261-1272頁乙文；Munroe等人(1990年)於期刊“Gene”第91期第151-158頁乙文；Ballas等人(1989年)於期刊“Nucleic Acid Res.”第17期第7891-7903頁乙文；Joshi等人(1987年)於期刊 “Nucleic Acid Res.”第15期第9627-9639頁乙文。
在其他實施例中，基因表現盒可另外含有5’引導序列。該引導序列可作用於提高轉譯作用。轉譯引導序列係技藝中所知，及例如包括微小RNA病毒引導序列、EMCV引導序列(腦心肌炎病毒5’非編碼區)，Elroy-Stein等人(1989年)於期刊“Proc.Nat.Acad.Sci.USA”第86期第6126-6130頁乙文；馬鈴薯Y病毒引導序列，例如TEV引導序列(菸草蝕紋病毒)(Carrington與Freed於期刊“Journal of Virology”第64期第1590-1597頁(1990年)乙文)、MDMV引導序列(玉米矮化嵌紋病毒)(Allison等人於期刊“Virology”第154期第9-20頁(1986年)乙文)；人類免疫球蛋白重鏈結合蛋白(BiP)，Macejak等人於期刊“Nature”第353期第90-94頁(1991年)乙文；來自苜蓿嵌紋病毒(AMV RNA 4)的外殼蛋白mRNA之非轉譯的引導序列，Jobling等人於期刊“Nature”第325期第622-625頁(1987年)乙文；菸草嵌紋病毒引導序列(TMV)，Gallie等人(1989年)於“RNA分子生物學(Molecular Biology of RNA)”乙書第237-256頁；及玉米黃化斑紋病毒引導序列(MCMV)，Lommel等人於期刊“Virology”第81期第382-385頁(1991年)乙文。亦參見Della-Cioppa等人於期刊“Plant Physiology”第84期第965-968頁(1987年)乙文。構築質體亦可含有提高轉譯作用及/或mRNA安定性之序列，諸如內含子。該內含子之一實例為阿拉伯芥(Arabidopsis thaliana)的組織蛋白H3.III變異體之基因II的第一內含子。Chaubet等人於期刊“Journal of Molecular Biology”第225期第569-574頁 (1992年)乙文。
在一實施例中，聚核苷酸供體序列的基因表現盒係包含一啟動子。用於引導編碼肽的一核酸之表現作用之啟動子，係依特定應用而定。例如，適合宿主細胞之持續性強啟動子係通常用於蛋白的表現作用及純化作用。較佳的植物啟動子之非限制性實例包括自下列所衍生的啟動子序列：阿拉伯芥泛素-10(ubi-10)(Callis等人(1990年)於期刊“J.Biol.Chem.”第265期第12486-12493頁乙文)；根癌農桿菌甘露鹼合成酶(Δmas)(Petolino等人之第6,730,824號美國專利)；及/或樹薯葉脈嵌紋病毒(CsVMV)(Verdaguer等人(1996年)於期刊“Plant Molecular Biology”第31期第1129-1139頁乙文)。
在本申請案所揭露的方法中，可採用引導一植物基因的表現作用之數種啟動子。該等啟動子可選自持續性、化學調控性、誘導性、組織特異性及種子優選型啟動子。
持續性啟動子例如包括核心花椰菜嵌紋病毒35S啟動子(Odell等人(1985年)於期刊“Nature”第313期第810-812頁乙文)；稻米肌動蛋白啟動子(McElroy等人(1990年)於期刊“Plant Cell”第2期第163-171頁乙文)；玉米泛素啟動子(第5,510,474號美國專利；Christensen等人(1989年)於期刊“Plant Mol.Biol.”第12期第619-632頁乙文及Christensen等人(1992年)於期刊“Plant Mol.Biol.”第18期第675-689頁乙文)；pEMU啟動子(Last等人(1991年)於期刊“Theor.Appl.Genet.”第81期第581-588頁乙文)；ALS啟動子(第5,659,026 號美國專利)；玉米組織蛋白啟動子(Chabouté等人於期刊“Plant Molecular Biology”第8期第179-191頁(1987年)乙文)等。
可取得的植物相容性啟動子之範圍包括組織特異性與誘導性啟動子。因著回應誘導劑，誘導性調控單元可直接或間接激活一或多種DNA序列或基因的轉錄作用。在誘導劑不存在之情況下，該DNA序列或基因不會被轉錄。蛋白因子係以特異性方式與一誘導性調控單元結合而激活轉錄作用，該蛋白因子通常以非活性形式存在，之後藉由誘導劑而直接或間接轉化成活性形式。誘導劑可為一種化學藥劑諸如一種蛋白、代謝物、生長調節劑、除草劑或酚化合物，或者由熱、冷、鹽或毒性元素所直接施加的生理壓力，或經由一病原體或致病因子諸如病毒的作用所間接的生理壓力。蛋白因子係以特異性方式與一誘導性調控單元結合而激活轉錄作用，該蛋白因子通常以非活性形式存在，之後藉由誘導劑而直接或間接轉化成活性形式。誘導劑可為一種化學藥劑諸如一種蛋白、代謝物、生長調節劑、除草劑或酚化合物，或者由熱、冷、鹽或毒性元素所直接施加的生理壓力，或經由一病原體或致病因子諸如病毒的作用所間接的生理壓力。藉由外部施加誘導劑至細胞或植物，諸如可藉由噴灑、澆水、加熱或類似的方法，而使得含有誘導性調控單元的一植物細胞暴露於一誘導劑。
在本揭露內容的實施例中可使用任一種誘導性啟動子。參見Ward等人於期刊“Plant Mol.Biol.”第22期第 361-366頁(1993年)乙文。例示性的誘導性啟動子包括蛻皮激素受體啟動子(第6,504,082號美國專利)；來自ACE1系統的啟動子，其係針對銅而回應(Mett等人於期刊“PNAS”第90期第4567-4571頁(1993年)乙文)；來自玉米的In2-1與In2-2基因，其係針對苯磺醯胺除草劑安全劑而回應(第5,364,780號美國專利；Hershey等人於期刊“Mol.Gen.Genetics”第227期第229-237頁(1991年)乙文及Gatz等人於期刊“Mol.Gen.Genetics”第243期第32-38頁(1994年)乙文)；來自Tn10的Tet抑制子(Gatz等人於期刊“Mol.Gen.Genet.”第227期第229-237頁(1991年)乙文)；或來自一種類固醇荷爾蒙基因之啟動子，其轉錄活性係由糖皮質素荷爾蒙所誘發，Schena等人於期刊“Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.”第88期第10421頁(1991年)乙文及McNe11is等人(1998年)於期刊“Plant J.”第14(2)期第247-257頁乙文；玉米GST啟動子，其係由作為萌芽前除草劑的疏水性親電子型化合物所激活(參見第5,965,387號美國專利及第WO 93/001294號國際專利申請公開案)；及菸草PR-1a啟動子，其係由柳酸所激活(參見Ono S、Kusama M、Ogura R、Hiratsuka K.於2011年9月23日期刊“Biosci Biotechnol Biochem.”第75(9)期第1796-800頁之“評估菸草PR-1a啟動子在藉由螢光素酶生物發光報導子系統監測防禦基因表現作用之用途”乙文)。所關注的其他化學調控型啟動子包括四環素誘導型與四環素抑制型啟動子(如參見Gatz等人(1991年)於期刊“Mol.Gen.Genet.”第227期第229-237頁乙文，及第5,814,618號與第5,789,156號美國 專利)。
所關注的其他可調控型啟動子包括一種針對冷而回應之調控單元或一種熱休克型調控單元，其等可分別因著暴露於冷或熱而引發其轉錄作用(Takahashi等人於期刊“Plant Physiol.”第99期第383-390頁(1992年)乙文)；醇去氫酶基因之啟動子(Gerlach等人於期刊“PNAS USA”第79期第2981-2985頁(1982年)乙文；Walker等人於期刊“PNAS”第84(19)期第6624-6628頁(1987)乙文)，其係由厭氧條件所誘導；及從豌豆rbcS基因或豌豆psaDb基因所衍生之光誘導性啟動子(Yamamoto等人(1997年)於期刊“Plant J.”第12(2)期第255-265頁乙文)；光誘導性調控單元(Feinbaum等人於期刊“Mol.Gen.Genet.”第226期第449頁(1991年)乙文；Lam and Chua於期刊“Science”第248期第471頁(1990年)乙文；Matsuoka等人(1993年)於期刊“Proc.Natl.Acad.Sci.USA”第90(20)期第9586-9590頁乙文；Orozco等人(1993年)於期刊“Plant Mol.Bio.”第23(6)期第1129-1138頁乙文)；植物荷爾蒙誘導性調控單元(Yamaguchi-Shinozaki等人於期刊“Plant Mol.Biol.”第15期第905頁(1990年)乙文；Kares等人於期刊“Plant Mol.Biol.”第15期第225頁(1990年)乙文)等。誘導性調控單元亦可為玉米In2-1或In2-2基因之啟動子，其係針對苯磺醯胺除草劑安全劑而回應(Hershey等人於期刊“Mol.Gen.Gene.”第227期第229-237頁(1991年)乙文；Gatz等人於期刊“Mol.Gen.Genet.”第243期第32-38頁(1994年)乙文)，及轉位子Tn10的Tet抑制子(Gatz等人於期刊“Mol.Gen. Genet.”第227期第229-237頁(1991年)乙文)。壓力誘導性啟動子包括鹽式/水式壓力誘導性啟動子，諸如P5CS(Zang等人(1997年)於期刊“Plant Sciences”第129期第81-89頁乙文)；冷誘導性啟動子，諸如cor15a(Hajela等人(1990年)於期刊“Plant Physiol.”第93期第1246-1252頁乙文)、cor15b(Wilhelm等人(1993年)於期刊“Plant Mol Biol”第23期第1073-1077頁乙文)、wsc120(Ouellet等人(1998年)於期刊“FEBS Lett.”第423期第324-328頁乙文)、ci7(Kirch等人(1997年)於期刊“Plant Mol Biol”第33期第897-909頁乙文)、ci21A(Schneider等人(1997年)於期刊“Plant Physiol.”第113期第335-45頁乙文)；乾旱誘導性啟動子，諸如Trg-31(Chaudhary等人(1996年)於期刊“Plant Mol.Biol.”第30期第1247-57頁乙文)、rd29(Kasuga等人(1999年)於期刊“Nature Biotechnology”第18期第287-291頁乙文)；滲透誘導性啟動子，諸如Rab17(Vilardell等人(1991年)於期刊“Plant Mol.Biol.”第17期第985-93頁乙文)及滲調蛋白(osmotin)(Raghothama等人(1993年)於期刊“Plant Mol Biol”第23期第1117-28頁乙文)；及熱誘導性啟動子，諸如熱休克蛋白(Barros等人(1992年)於期刊“Plant Mol.”第19期第665-75頁乙文；Marrs等人(1993年)於期刊“Dev.Genet.”第14期第27-41頁乙文)、smHSP(Waters等人(1996年)於期刊“J.Experimental Botany”第47期第325-338頁乙文)及來自洋芹泛素啟動子的熱休克誘導性單元(WO 03/102198)。其他的壓力誘導性啟動子包括rip2(第5,332,808號美國專利與第 2003/0217393號美國專利公開案)及rd29a(Yamaguchi-Shinozaki等人(1993年)於期刊“Mol.Gen.Genetics”第236期第331-340頁乙文)。有些啟動子係由損傷所誘導，包括農桿菌pMAS啟動子(Guevara-Garcia等人(1993年)於期刊“Plant J.”第4(3)期第495-505頁乙文)及農桿菌ORF13啟動子(Hansen等人(1997年)於期刊“Mol.Gen.Genet.”第254(3)期第337-343頁乙文)。
可使用組織優選型啟動子而靶向提高一特定植物組織內的轉錄作用及/或表現作用。當提及偏向型表現作用時，其係指在該特定植物組織中的表現水平係高於其他植物組織。該等類型啟動子之實例包括諸如藉由菜豆蛋白啟動子(Bustos等人(1989年)於期刊“The Plant Cell”第1期第839-853頁乙文)及玉米第一型球蛋白基因(Belanger等人(1991年)期刊“Genetics”第129期第863-972頁乙文)所提供的種子優選型表現作用。就雙子葉植物而言，種子優選型啟動子包括但不限於豆類β-菜豆蛋白、油菜儲藏蛋白(napin)、β-大豆種子儲存蛋白(conglycinin)、黃豆凝集蛋白、油菜種子儲藏蛋白(cruciferin)等。就單子葉植物而言，種子優選型啟動子包括但不限於玉米之15kDa玉米蛋白、22kDa玉米蛋白、27kDa玉米蛋白、γ-玉米蛋白、糯質基因、第一型矮化基因、第二型矮化基因、第一型球蛋白等。種子優選型啟動子亦包括主要引導種子內之特異性組織的基因表現作用之該等啟動子，諸如γ-玉米蛋白的內胚乳優選型啟動子、來自菸草的隱藏式啟動子(Fobert等人(1994年) 於期刊“Plant J.”第4期第567-577頁之“菸草中的種皮特異性隱藏式啟動子之T-DNA標定作用”乙文)、來自玉米的P基因啟動子(Chopra等人(1996年)於期刊“Plant J.”第7期第1149-1158頁之“具有相異的組織特異性及編碼具C端置換作用的Myb同源蛋白之玉米P基因的對偶基因”乙文，及Erratum(1997年)於期刊“Plant Cell.”第1期第109頁乙文)、來自玉米的第一型球蛋白啟動子(Belenger與Kriz(1991年)於期刊“Genetics”第129期第863-972頁之“玉米第一型球蛋白基因的對偶基因多型性之分子基礎”乙文)，及引導玉米果仁種皮或外皮的表現作用之啟動子，例如果皮特異性麩醯胺合成酶啟動子(Muhitch等人(2002年)於期刊“Plant Science”第163期第865-872頁之“來自麩醯胺合成酶1-2型基因及能在基因轉殖玉米中賦予組織特異性基因表現作用的一啟動子序列之分離作用”乙文)。
基因表現盒可含有一個5’引導序列。該引導序列可作用於提高轉譯作用。轉譯引導序列係技藝中所知，及例如包括微小RNA病毒引導序列、EMCV引導序列(腦心肌炎5’非編碼區)，Elroy-Stein等人(1989年)於期刊“Proc.Nat.Acad.Sci.USA”第86期第6126-6130頁乙文；馬鈴薯Y病毒引導序列，例如TEV引導序列(菸草蝕紋病毒)(Carrington與Freed於期刊“Journal of Virology”第64期第1590-1597頁(1990年)乙文)、MDMV(玉米矮化嵌紋病毒)引導序列(Allison等人於期刊“Virology”第154期第9-20頁(1986年)乙文)；人類免疫球蛋白重鏈結合蛋白(BiP)，Macejak等人於 期刊“Nature”第353期第90-94頁(1991年)乙文；來自苜蓿嵌紋病毒(AMV RNA 4)的外殼蛋白mRNA之非轉譯的引導序列，Jobling等人於期刊“Nature”第325期第622-625頁(1987年)乙文；菸草嵌紋病毒引導序列(TMV)，Gallie等人(1989年)於“RNA分子生物學(Molecular Biology of RNA)”乙書第237-256頁；及玉米黃化斑紋病毒(MCMV)引導序列，Lommel等人於期刊“Virology”第81期第382-385頁(1991年)乙文。亦參見Della-Cioppa等人於期刊“Plant Physiology”第84期第965-968頁(1987年)乙文。
構築質體亦可含有提高轉譯作用及/或mRNA安定性之序列，諸如內含子。該內含子之一實例為阿拉伯芥(Arabidopsis thaliana)的組織蛋白H3.III變異體之基因II的第一內含子。Chaubet等人於期刊“Journal of Molecular Biology”第225期第569-574頁(1992年)乙文。
在促使異種核苷酸序列所表現的產物導向一特定胞器係屬有利之情況下，尤其是色素體、澱粉體等胞器或導向至內質網，或者在細胞表面或細胞外分泌，表現盒可進一步包含用於一轉運肽之一編碼序列。該等轉運肽係技藝中眾所周知及包括但不限於用於醯基載體蛋白、RUBISCO的小型次單元、植物EPSP合成酶及向日葵(Helianthus annuus)的轉運肽(參見Lebrun等人之第5,510,417號美國專利)；玉米第一型脆質基因葉綠體轉運肽(Nelson等人(1998年)於期刊“Plant Physiol”第117(4)期第1235-1252頁乙文；Sullivan等人於期刊“Plant Cel”第3(12) 期第1337-48頁乙文；Sullivan等人(1995年)於期刊“Planta”第196(3)期第477-84頁乙文；Sullivan等人(1992年)於期刊“J.Biol.Chem.”第267(26)期第18999-9004頁乙文)等。此外，嵌合型葉綠體轉運肽係技藝中所知，諸如最佳化轉運肽(參見第5,510,471號美國專利)。第5,717,084號與第5,728,925號美國專利曾述及其他的葉綠體轉運肽。嫻熟技藝者即可理解有許多選項可供在特定胞器表現一產物之用。例如，大麥α澱粉酶序列通常用於引導內質網的表現作用。Rogers於期刊“J.Biol.Chem.”第260期第3731-3738頁(1985年)乙文。
在一實施例中，聚核苷酸供體盒包含一轉殖基因。本申請案的一些實施例提供編碼一種多肽的一轉殖基因，及該轉殖基因包含一基因表現盒。該轉殖基因適合種類廣泛之應用，以產生基因轉殖型植物。為了說明之目的，本申請案提供包含一基因表現盒的一轉殖基因之特定實例，及包括包含一個性狀基因、一個RNAi基因或一個報導子/可篩選標記基因在內之基因表現作用。
當工程設計在植物中表現的一基因時，例如可經由使用公開可得的DNA序列資料庫，找出植物基因體的密碼子分布或不同植物基因的蛋白編碼區之相關資訊，而判定預定宿主植物的密碼子偏移。一旦在紙上或在電腦中設計出一種最佳化(如一種植物最佳化)DNA序列之後，可在實驗室中合成實際的DNA分子，其序列係精確對應所設計的序列。可選殖及以其他方式操縱該等合成的核酸分子， 如同其等來自天然或原生來源一般。
本申請案在一實施例中揭露待表現的一個轉殖基因。基因表現盒可包含一個報導子/可篩選標記基因、一個性狀基因或一個RNAi基因。一個可篩選標記基因、一個性狀基因及一個RNAi基因之實例係進一步提供於下文。本申請案中所揭露的方法之優點在於其等提供用於篩選生殖系轉形體之一種方法，該方法不依賴轉殖基因的蛋白產物之特定功能或其他功能。
賦予抗害蟲或抗病能力之轉殖基因或編碼序列
(A)植物抗病基因。通常藉由植物的一個抗病基因(R)產物與病原體的一個對應致病性(Avr)基因產物之間的特異性交互作用，而啟動植物的防禦。可用所選殖的抗性基因將一植物品種轉形而改造該植物，使其對抗特定的病原體菌株。該等基因的實例包括用於對抗番茄葉黴病菌(Cladosporium fulvum)之番茄Cf-9基因(Jones等人(1994年)於期刊“Science”第266期第789頁乙文)；編碼一種蛋白激酶之番茄Pto基因，其係用於對抗番茄細菌性斑點病菌(Pseudomonas syringae pv.tomato)(Martin等人(1993年)於期刊“Science”第262期第1432頁乙文)；及用於對抗丁香假單胞菌(Pseudomonas syringae)之筷子芥屬(Arabidopsis)RSSP2基因(Mindrinos等人(1994年)於期刊“Ce11”第78期第1089頁乙文)。
(B)蘇力菌(Bacillus thuringiensis)蛋白、其衍生物或以其為模式的合成多肽，諸如一種Bt δ內毒素基因的核苷酸序 列(Geiser等人(1986年)於期刊“Gene”第48期第109頁乙文)；及一種植物性殺蟲(VIP)基因(如參見Estruch等人(1996年)於期刊“Proc.Natl.Acad.Sci.”第93期第5389-94頁乙文)。此外，可自美國菌種保存中心(美國馬里蘭州羅克維爾(Rockville))購得ATCC登錄號為40098、67136、31995及31998之編碼δ內毒素基因的DNA分子。
(C)凝集蛋白，諸如數種大花君子蘭(Clivia miniata)甘露糖結合型凝集蛋白基因的核苷酸序列(Van Damme等人(1994年)於期刊“Plant Molec.Biol”第24期第825頁乙文)。
(D)維生素結合蛋白，諸如抗生物素蛋白與抗生物素蛋白同系物，其等適合作為對抗害蟲的殺幼蟲藥。參見第5,659,026號美國專利。
(E)酵素抑制劑，如一種蛋白酶抑制劑或一種澱粉酶抑制劑。該等基因的實例包括稻米半胱胺酸蛋白酶抑制劑(Abe等人(1987年)於期刊“J.Biol.Chem.”第262期第16793頁乙文)、第I型菸草蛋白酶抑制劑(Huub等人(1993年)於期刊“Plant Molec.Biol”第21期第985頁乙文)及α-澱粉酶抑制劑(Sumitani等人(1993年)於期刊“Biosci.Biotech.Biochem.”第57期第1243頁乙文)。
(F)昆蟲特異性荷爾蒙或費洛蒙，諸如蛻皮類固醇與保幼激素及其變異體、以其為基礎的模擬物或其拮抗劑或促效劑，諸如所選殖的保幼激素酯酶之桿狀病毒表現作用，該酯酶係保幼激素的去活劑(Hammock等人(1990年)於期刊“Nature”第344期第458頁乙文)。
(G)昆蟲特異性肽或神經肽，當其表現時，會干擾受影響的害蟲之生理機能(期刊“J.Biol.Chem.”第269期第9頁乙文)。該等基因的實例包括昆蟲利尿激素受體(Regan於1994年乙文)，其係在斑點甲蠊(Diploptera punctata)中所發現的一種咽側體抑制素(allostatin)(Pratt於1989年乙文)；及具昆蟲特異性的麻痺性神經毒素(第5,266,361號美國專利)。
(H)在自然界由蛇、胡蜂等所產生的昆蟲特異性毒液，諸如蠍子的殺蟲毒肽(Pang(1992年)於期刊“Gene”第116期第165頁乙文)。
(I)酵素，其導致單萜、倍半萜、類固醇、羥胺酸、類苯基丙烷衍生物或具有殺蟲活性的另一種非蛋白分子之高度積累。
(J)涉及生物活性分子的修飾作用及包括轉譯後修飾作用之酵素；例如天然或合成的糖分解性酵素、蛋白分解性酵素、脂質分解性酵素、核酸酶、環化酶、轉胺酶、酯酶、水解酶、磷酸酶、激酶、磷酸化酶、聚合酶、彈性蛋白酶、殼質酶及聚葡萄糖酶。該等基因的實例包括海芋基因(PCT公開申請案WO93/02197)、殼質酶的編碼序列例如可從ATCC獲得及其登錄序號為3999637與67152)、菸草鈎蟲殼質酶(Kramer等人(1993年)於期刊“Insect Molec.Biol.”第23期第691頁乙文)及洋芹ubi4-2聚泛素基因(Kawalleck等人(1993年)於期刊“Plant Molec.Biol”第21期第673頁乙文)。
(K)刺激訊息傳導作用之分子。該等分子的實例包括綠豆調鈣蛋白cDNA殖株的核苷酸序列(Botella等人(1994年) 於期刊“Plant Molec.Biol”第24期第757頁乙文)及玉米調鈣蛋白cDNA殖株的核苷酸序列(Griess等人(1994年)於期刊“Plant Physiol.”第104期第1467頁乙文)。
(L)疏水矩肽。參見第5,659,026號與第5,607,914號美國專利；後者教導賦予抗病力之合成型抗微生物肽。
(M)膜通透酶、通道形成劑或通道阻斷劑，諸如天蠶素-β溶菌肽類似物(Jaynes等人(1993年)於期刊“Plant Sci.”第89期第43頁乙文)，其使得基因轉殖型菸草植物可對抗青枯假單孢菌(Pseudomonas solanacearum)。
(N)病毒侵襲性蛋白或自其所衍生的複合毒素。例如，病毒外殼蛋白在轉形植物細胞中之積累作用賦予對抗病毒感染及/或疾病發生之抗性，該病毒感染及/或疾病發生係由自其衍生外殼蛋白基因之病毒以及由相關病毒所引起。外殼蛋白媒介型抗性已賦予轉形植物對抗苜蓿嵌紋病毒、胡瓜嵌紋病毒、菸草條紋病毒、馬鈴薯X病毒、馬鈴薯Y病毒、菸草蝕紋病毒、菸草脆裂病毒及菸草嵌紋病毒。如參見Beachy等人(1990年)於期刊“Ann.Rev.Phytopathol.”第28期第451頁乙文。
(O)昆蟲特異性抗體或自其所衍生的免疫毒素。因此，靶向昆蟲腸道內的關鍵代謝功能之抗體將使得受影響的酵素失去活性，而殺死昆蟲。例如Taylor等人(1994年)於第七屆國際分子植物研討會之第497號摘要：“微生物交互作用在基因轉殖菸草中顯示經由產生單鏈抗體片段之酵素性去活化作用”。
(P)病毒特異性抗體。如參見Tavladoraki等人(1993年)於期刊“Nature”第266期第469頁乙文，其顯示表現重組型抗體基因之基因轉殖植物受到保護而免於病毒之攻擊。
(Q)在自然界中由病原體或寄生蟲所產生之發育阻滯型蛋白。因而，真菌的內切型α-1,4-D-聚半乳醣醛酸酶藉由溶解植物細胞壁的同-α-1,4-D-半乳糖醛酸酶，而促進真菌的菌落形成及植物營養素釋出作用(Lamb等人(1992年)於期刊“Bio/Technology”第10期第1436頁乙文。Toubart等人(於期刊“Plant J.”第2期第367頁(1992年)乙文)述及編碼一種豆類聚半乳醣醛酸內切酶抑制性蛋白之一基因的選殖與特性分析。
(R)在自然界中由植物所產生的發育阻滯型蛋白，諸如大麥核糖體去活化基因，其增加對於真菌疾病之抗性(Longemann等人(1992年)於期刊“Bio/Technology”第10期第3305頁乙文)。
(S)RNA干擾作用，其中使用RNA分子來抑制靶基因的表現作用。在一實例中，RNA分子係部分或全部雙股型RNA分子，其觸發一種靜默化反應，導致將dsRNA剪切成小型干擾RNA，然後嵌入一靶向複合體中而摧毀同源mRNA。如參見授予Fire等人之第6,506,559號美國專利；授予Graham等人之第6,573,099號美國專利。
賦予除草劑抗性之基因
(A)編碼對於抑制生長點或分生組織型除草劑的抗性或耐受性之基因，該等除草劑諸如咪唑啉酮、硫代苯甲醯胺 或磺醯尿素類除草劑。該類別的例示性基因係編碼一種突變型ALS酵素(Lee等人(1988年)於期刊“EMBOJ.”第7期第1241頁乙文)，其亦稱為AHAS酵素(Miki等人(1990年)於期刊“Theor.Appl.Genet.”第80期第449頁乙文)。
(B)編碼對於嘉磷塞(glyphosate)的抗性或耐受性之一或多個其他基因，該抗性或耐受性係藉由突變型EPSP合成酶與aroA基因所賦予，或經由諸如GAT(嘉磷塞乙醯基轉移酶)或GOX(嘉磷塞氧化酶)等基因及其他膦醯基化合物諸如固殺草(glufosinate)(pat基因與bar基因；DSM-2)及芳氧基苯氧丙酸類與環己二酮類(乙醯輔酶A羧化酶(ACCase)抑制劑編碼基因)之代謝性去活化作用所賦予。如參見第4,940,835號美國專利，其揭露可賦予嘉磷塞抗性之一種EPSP形式的核苷酸序列。可在ATCC登錄號39256下取得編碼突變型aroA基因之DNA分子，及該突變體基因的核苷酸序列係揭露於第4,769,061號美國專利中。第0333033號歐洲專利申請案與第4,975,374號美國專利揭露麩醯胺合成酶基因的核苷酸序列，其賦予對於除草劑諸如L-草胺膦(phosphinothricin)之抗性。第0242246號歐洲專利申請案提供一個草胺膦乙醯基轉移酶基因的核苷酸序列。De Greef等人(1989年)於期刊“Bio/Technology”第7期第61頁乙文述及產生表現嵌合型bar基因之基因轉殖植物，該嵌合型bar基因係編碼草胺膦乙醯基轉移酶活性。Marshall等人(1992年)於期刊“Theor.Appl.Genet.”第83期第435頁乙文述及Accl-S1、Accl-S2及Accl-S3基因，其等係賦予對於芳氧基 苯氧丙酸類與環己二酮類諸如西殺草(sethoxydim)與合氯氟(haloxyfop)的抗性之例示性基因。
(C)編碼對於抑制光合作用型除草劑的抗性或耐受性之基因，諸如三(psbA與gs+基因)與苯甲腈(腈酶基因)。Przibilla等人(1991年)於期刊“Plant Cell”第3期第169頁乙文述及使用編碼突變型psbA基因之質體進行單胞藻之轉形作用。第4,810,648號美國專利揭露腈酶基因的核苷酸序列，及可在ATCC登錄號53435、67441及67442下取得含有該等基因的DNA分子。Hayes等人(1992年)於期刊“Biochem.J.”第285期第173頁乙文述及編碼一種麩胱甘肽硫轉移酶之DNA的選殖與表現作用。
(D)編碼對於羥基苯丙酮酸鹽二氧酶(HPPD)結合型除草劑的抗性或耐受性之基因，該酵素係催化對羥基苯丙酮酸鹽(HPP)轉化成黑尿酸鹽之反應。其所包括的除草劑諸如異唑類(EP418175、EP470856、EP487352、EP527036、EP560482、EP682659、第5,424,276號美國專利)，尤其是異唑草酮，其係用於玉米的一種選擇性除草劑；二酮腈類(EP496630、EP496631)，尤其是2-氰基-3-環丙基-1-(2-SO2CH3-4-CF3苯基)丙烷-1,3-二酮與2-氰基-3-環丙基-1-(2-SO2CH3-4-2,3Cl2苯基)丙烷-1,3-二酮；三酮類(EP625505、EP625508、第5,506,195號美國專利)，尤其是磺草酮(sulcotrione)；及吡唑特(pyrazolinate)類。在植物中產生過多HPPD之基因可提供對抗該等除草劑之耐受性或抗性，例如包括第6,268,549號與第6,245,968號美國專利及 第20030066102號美國專利申請公開案中所述之基因。
(E)編碼對於苯氧基植物生長素類除草劑的抗性或耐受性之基因，該除草劑諸如2,4-二氯苯氧基乙酸(2,4-D)，及該等基因亦可賦予對抗芳氧基苯氧基丙酸酯(AOPP)類除草劑之抗性或耐受性。該等基因的實例包括第7,838,733號美國專利中所述之α-酮戊二酸依賴型二氧酶酵素(aad-1)基因。
(F)編碼對於苯氧基植物生長素類除草劑的抗性或耐受性之基因，該類除草劑諸如2,4-二氯苯氧基乙酸(2,4-D)，及該等基因亦可賦予對抗吡啶氧基植物生長素類除草劑諸如氟氯比(fluroxypyr)或三氯比(triclopyr)之抗性或耐受性。該等基因的實例包括WO 2007/053482A2中所述之α-酮戊二酸依賴型二氧酶酵素基因(aad-12)。
(G)編碼對於汰克草(dicamba)的抗性或耐受性之基因(如參見第20030135879號美國專利公開案)。
(H)提供對於抑制原紫質原氧化酶(PPO)型除草劑的抗性或耐受性之基因(參見第5,767,373號美國專利)。
(I)提供對於三類除草劑(諸如草脫淨(atrazine))及尿素衍生物(諸如達有龍(diuron))除草劑的抗性或耐受性之基因，該等除草劑係與光系統II反應中心(PS II)的核心蛋白結合(參見Brussian等人(1989年)於期刊“EMBO J.”第8(4)期第1237-1245頁乙文)。
賦予或有助於一種附加價值性狀之基因
(A)改良脂肪酸代謝作用，例如藉由一種反義基因或硬脂醯基-ACP去飽和酶進行玉米或十字花科植物之轉形，而 增加該植物的硬酯酸含量(Knultzon等人(1992年)於期刊“Proc.Nat.Acad.Sci.USA”第89期第2624頁乙文)。
(B)降低植酸鹽含量
(1)引入一個植酸酶編碼基因，諸如黑麴菌(Aspergillus niger)植酸酶基因(Van Hartingsveldt等人(1993年)於期刊“Gene”第127期第87頁乙文)，提高植酸鹽的分解，而在轉形植物中增加更多的游離磷酸鹽。
(2)可導入降低植酸鹽含量之一基因。在玉米中，例如可藉由選殖及重新導入與單一對偶基因相關聯之DNA而達成，該單一對偶基因導致玉米突變體具有低植酸含量之特徵(Raboy等人(1990年)於期刊“Maydica”第35期第383頁乙文)。
(C)改良碳水化合物組成，例如藉由用編碼改變澱粉分枝模式的酵素之一基因進行植物轉形作用而達成。該等酵素之實例包括黏液鏈球菌(Streptococcus mucus)的果糖基轉移酶基因(Shiroza等人(1988年)於期刊“J.Bacteriol.”第170期第810頁乙文)；枯草桿菌(Bacillus subtilis)的聚果糖蔗糖酶基因(Steinmetz等人(1985年)於期刊“Mol.Gen.Genel.”第200期第220頁乙文)；地衣桿菌(Bacillus licheniformis)的α-澱粉酶(Pen等人(1992年)於期刊“Bio/Technology”第10期第292頁乙文)；番茄轉化酶基因(Elliot等人於1993年乙文)；大麥澱粉酶基因(Sogaard等人(1993年)於期刊“J.Biol.Chem.”第268期第22480頁乙文)；及玉米內胚乳第II型澱粉分枝酵素(Fisher等人(1993年)於期刊“Plant Physiol.”第102 期第10450頁乙文)。
在後續實施例中，轉殖基因包含一個報導子基因。在不同實施例中，該報導基因係選自由yfp基因、gus基因、rfp基因、gfp基因、康黴素(kanamycin)抗性基因、aad-1基因、aad-12基因、pat基因及嘉磷塞耐受性基因所組成之群組。在轉形載體中可包括用於篩選轉形細胞或組織或植物部位或植物之報導子或標記基因。可篩選標記之實例包括該等賦予對於抗代謝物諸如除草劑或抗生素之抗性者，例如賦予對於胺甲喋呤(methotrexate)的抗性之二氫葉酸鹽還原酶(Reiss於期刊“Plant Physiol.(Life Sci.Adv.)”第13期第143-149頁(1994年)乙文；亦參見Herrera Estrella等人於期刊“Nature”第303期第209-213頁(1983年)乙文；Meijer等人於期刊“Plant Mol.Biol.”第16期第807-820頁(1991年)乙文)；賦予對於胺基糖苷類新黴素(neomycin)、康黴素及巴龍黴素(paromycin)的抗性之新黴素磷轉移酶(Herrera-Estrella於期刊“EMBO J.”第2期第987-995頁(1983年)乙文與Fraley等人於期刊“Proc.Natl.Acad.Sci USA”第80期第4803頁(1983年)乙文)；賦予對於潮黴素(hygromycin)的抗性之潮黴素磷轉移酶(Marsh於期刊“Gene”第32期第481-485頁(1984年)乙文；亦參見Waldron等人於期刊“Plant Mol.Biol.”第5期第103-108頁(1985年)乙文；Zhijian等人於期刊“Plant Science”第108期第219-227頁(1995年)乙文)；容許細胞用吲哚取代色胺酸之trpB；容許細胞用組胺醇取代組胺酸之hisD(Hartman於期刊“Proc.Natl.Acad.Sci.,USA”第85期第 8047頁(1988年)乙文)；容許細胞使用甘露糖之甘露糖-6-磷酸鹽異構酶(WO 94/20627)；賦予對於鳥胺酸去羧酶抑制劑2-(二氟甲基)-DL-鳥胺酸(DFMO)的抗性之鳥胺酸去羧酶(冷泉港實驗室(Cold Spring Harbor Laboratory)編輯之“當代分子生物學通訊(Current Communications in Molecular Biology)”中之McConlogue(1987年)乙文)；及賦予對於保米黴素(Blasticidin S)的抗性之土麴黴(Aspergillus terreus)去胺酶(Tamura於期刊“Biosci.Biotechnol.Biochem.”第59期第2336-2338頁(1995年)乙文)。
其他的篩選標記例如包括突變型乙醯乳酸合成酶，其賦予對於咪唑啉酮或磺醯尿素之抗性(Lee等人於期刊“EMBO J.”第7期第1241-1248頁(1988年)乙文)；一種突變型psbA，其賦予對於草脫淨(atrazine)之抗性(Smeda等人於期刊“Plant Physiol.”第103期第911-917頁(1993年)乙文)；或一種突變型原紫質原氧化酶(參見第5,767,373號美國專利)；或者賦予對於除草劑諸如固殺草(glufosinate)的抗性之其他標記。適宜的篩選標記基因之實例包括但不限於編碼對於下列各者的抗性之基因：氯黴素(Herrera Estrella等人於期刊“EMBO J.”第2期第987-992頁(1983年)乙文)；鏈黴素(Jones等人於期刊“Mol.Gen.Genet.”第210期第86-91頁(1987年)乙文)；觀黴素(spectinomycin)(Bretagne-Sagnard等人於期刊“Transgenic Res.”第5期第131-137頁(1996年)乙文)；博來黴素(bleomycin)(Hille等人於期刊“Plant Mol.Biol.”第7期第171-176頁(1990年)乙文)；磺醯胺(Guerineau等人於 期刊“Plant Mol.Biol.”第15期第127-136頁(1990年)乙文)；溴苯腈(bromoxynil)1(Stalker等人於期刊“Science”第242期第419-423頁(1988年)乙文)；嘉磷塞(Shaw等人於期刊“Science”第233期第478-481頁(1986年)乙文)；草胺膦(DeBlock等人於期刊“EMBO J.”第6期第2513-2518頁(1987年)乙文)等。
編碼對於固殺草(glufosinate)的抗性之DNA可作為選擇性基因之選項，及在一實施例中可為在樹薯葉脈嵌紋病毒啟動子控制下之草胺膦乙醯基轉移酶(pat)、玉米最佳化pat基因或bar基因。該等基因賦予對於畢拉草(bialaphos)的抗性。參見Wohlleben等人(1988年)於期刊“Gene”第70期第25-37頁乙文；Gordon-Kamm等人(1990年)於期刊“Plant Cell”第2期第603頁乙文；Uchimiya等人(1993年)於期刊“BioTechnology”第11期第835頁乙文；White等人(1990年)於期刊“Nucl.Acids Res.”第18期第1062頁乙文；Spencer等人(1990年)於期刊“Theor.Appl.Genet.”第79期第625-631頁乙文；及Anzai等人(1989年)於期刊“Mol.Gen.Gen.”第219期第492頁乙文。其中的一種pat基因形式係如第6,096,947號美國專利中所述的玉米最佳化pat基因。
此外，可採用標記及其促進辨識含有編碼該標記的聚核苷酸之植物細胞。當所存在的序列產生一種可測量的產物，並且可在不破壞植物細胞之情況下產生該產物時，則適合使用評分或篩選標記。實例包括β-葡萄糖醛酸酶或uidA基因(GUS)，其編碼一種酵素及已知該酵素的多種顯色 受質(例如第5,268,463號與第5,599,670號美國專利)；氯黴素乙醯基轉移酶(Jefferson等人於期刊“EMBO Journal”第6期第13號第3901-3907頁乙文)；及鹼性磷酸酶。在一個較佳實施例中，所用的標記係β-胡蘿蔔素或原維生素A(Ye等人(2000年)於期刊“Science”第287期第303-305頁乙文)。該基因曾用於提高稻米的營養，但此時卻是作為一種篩選標記，當該基因與所關注的一基因連接時，可由所產生的金色檢測出。就作為標記之目的而言，較少量的蛋白質即已足夠，這與該基因用於提高植物營養之情況不相同。其他的篩選標記包括一般的花青素/類黃酮基因(參見Taylor與Briggs於期刊“Plant Cell”第2期第115-127頁(1990年)乙文中之討論)，例如包括一種R基因座基因，其所編碼的一產物係調控植物組織中的花青素色素(紅色)生產作用(Dellaporta等人於克魯沃學術出版社(Kluwer Academic Publishers)於1988年出版及由Appels與Gustafson編輯之“染色體之結構與功能(Chromosome Structure and Function)”乙書第263-282頁乙文)；控制類黃酮色素的生物合成作用之基因，諸如玉米C1基因(Kao等人(1996年)於期刊“Plant Cell”第8期第1171-1179頁乙文；Scheffler等人(1994年)於期刊“Mol.Gen.Genet.”第242期第40-48頁乙文)及玉米C2基因(Wienand等人(1986年)於期刊“Mol.Gen.Genet.”第203期第202-207頁乙文)；B基因(Chandler等人(1989年)於期刊“Plant Cell”第1期第1175-1183頁乙文)；p1基因(Grotewold等人(1991年)於期刊“Proc.Natl.Acad.Sci USA”第88期第4587-4591頁乙文； Grotewold等人(1994年)於期刊“Cell”第76期第543-553頁乙文；Sidorenko等人(1999年)於期刊“Plant Mol.Biol.”第39期第11-19頁乙文)；青銅基因座基因(Ralston等人(1988年)於期刊“Genetics”第119期第185-197頁乙文；Nash等人(1990年)於期刊“Plant Cell”第2(11)期第1039-1049頁乙文)等等。
其他的適宜標記之實例包括靛青色螢光蛋白(CYP)基因(Bolte等人(2004年)於期刊“J.Cell Science”第117期第943-54頁乙文及Kato等人(2002年)於期刊“Plant Physiol”第129期第913-42頁乙文)；黃色螢光蛋白基因(愛弗隆杰(Evrogen)公司之PHIYFPTM；參見Bolte等人(2004年)於期刊“J.Cell Science”第117期第943-54頁乙文)；lux基因，其編碼一種螢光素酶，可使用例如X光片、閃爍計數法、螢光光譜測定法、微光攝影機、光子計數相機或多孔式光度測定法來檢測該螢光素酶之存在與否(Teeri等人(1989年)於期刊“EMBO J.”第8期第343頁乙文)；綠色螢光蛋白(GFP)基因(Sheen等人(1995年)於期刊“Plant J.”第8(5)期第777-84頁乙文)；及DsRed2，其中經該標記基因轉形的植物細胞呈現紅色，因而可目視挑選(Dietrich等人(2002年)於期刊“Biotechniques”第2(2)期第286-293頁乙文)。其他實例包括β-內醯胺酶基因(Sutcliffe於期刊“Proc.Nat’l.Acad.Sci.U.S.A.”第75期第3737頁(1978年)乙文)，其編碼一種酵素及已知該酵素的多種顯色受質(如PADAC，其係一種顯色型頭孢菌素)；xylE基因(Zukowsky等人於期刊“Proc.Nat’l.Acad.Sci.U.S.A.”第80期第1101頁(1983年)乙文)，其編碼可轉化 顯色型兒茶酚之一種兒茶酚二氧酶；及α-澱粉酶基因(Ikuta等人(1990年)於期刊“Biotech.”第8期第241頁乙文)；及酪胺酸酶基因(Katz等人(1983年)於期刊“J.Gen.Microbiol.”第129期第2703頁乙文)，其所編碼的一種酵素可將酪胺酸氧化成為DOPA與多巴醌，DOPA與多巴醌進而縮合形成一種易於檢測的化合物即黑色素。顯然有許多標記可供採用及為嫻熟技藝者所知。
如技藝中所知，“一致性百分比”(或“一致性%”)一詞係指二或多種多肽序列或二或多種聚核苷酸序列之間之關係，其係藉由比對序列而測定。在技藝中，“一致性”視情況亦指多肽或聚核苷酸序列之間之序列相關性的程度，如藉由該等序列之間的相符程度所判定。藉由已知方法即可計算“一致性”與“相似性”，該等方法包括但不限於下列文獻所揭露者：1.)美國紐約牛津大學出版社於1988年出版及由Lesk,A.M.編輯之“計算子生物學(Computational Molecular Biology)”乙書；2.)美國紐約學術(Academic)出版社於1993年出版及由Smith,D.W.編輯之“生物學計算：資訊學與基因體計畫(Biocomputing：Informatics and Genome Projects)”乙書；3.)美國紐澤西州胡馬納(Humana)出版社於1994年出版及由Griffin,A.M.與Griffin,H.G.編輯之“序列資料之電腦分析(Computer Analysis of Sequence Data)”乙書第一部；4.)美國學術(Academic)出版社於1987年出版及由von Heinje,G.編輯之“分子生物學之序列分析(Sequence Analysis in Molecular Biology)”乙書；及5.)美國紐約史塔頓 (Stockton)出版社於1991年出版及由Gribskov,M.與Devereux,J.編輯之“序列分析引子(Sequence Analysis Primer)”乙書。
用於測定核酸與胺基酸序列的一致性之技術係技藝中所知。通常，該等技術包括測定一基因的mRNA之核苷酸序列及/或測定其所編碼的胺基酸序列，及將該等序列與第二核苷酸或胺基酸序列比對。基因體序列亦可按這種方式測定與比對。一般而言，一致性係分別指二種聚核苷酸或多肽序列之核苷酸相對於核苷酸或胺基酸相對於胺基酸的確切對應。可藉由測定二或多種序列(聚核苷酸或胺基酸序列)的一致性百分比，而進行其等的比對。不論是核酸或胺基酸序列，二個序列的一致性百分比係二個比對序列之間確切相符的數目除以較短序列的長度，再乘以100。參見Russell,R.與Barton,G.於期刊“J.Mol.Biol.”第244期第332-350頁(1994年)之“結構特性在具相似摺疊的蛋白中可能不被保留”乙文第337頁，其在此完整地併入本案以為參考資料。
此外，用於測定一致性與相似性之方法已編纂寫入公開可得的電腦程式中。例如可使用Vector NTI®套裝程式的AlignX程式(美國加州卡爾斯巴德(Carlsbad)的英杰(Invitrogen)公司)或LASERGENE生物資訊運算套裝程式的MegAlignTM程式(美國威斯康辛州麥迪遜的DNASTAR有限公司)，進行序列比對與一致性百分比之計算。使用“Clustal比對法”進行序列的多重比對，該方法所涵蓋的數種演算法 包括對應於稱為Clustal V的比對方法之“Clustal V比對法”(Higgins與Sharp於期刊“CABIOS.”第5期第151-153頁(1989年)乙文中所揭露；Higgins,D.G.等人於期刊“Comput.Appl.Biosci.”第8期第189-191頁(1992年)乙文)，及可參見LASERGENE生物資訊運算套裝程式的MegAlignTM程式(DNASTAR有限公司)。就多重比對而言，原設值係對應於間隙罰分=10及間隙長度罰分=10。用於兩兩比對及計算蛋白序列的一致性百分比之Clustal方法的預設參數為KTUPLE=1，間隙罰分=3，窗口=5及所儲存對角=5。就核酸而言，該等參數為KTUPLE=2，間隙罰分=5，窗口=4及所儲存對角=4。在使用Clustal V程式進行序列比對之後，可藉由檢視同一程式中的“序列距離”表，而得到“一致性百分比”。此外，有“Clustal W比對方法”可供使用，其係對應於稱為Clustal W之比對方法(Higgins與Sharp於期刊“CABIOS.”第5期第151-153頁(1989年)乙文中所述；Higgins,D.G.等人於期刊“Comput.Appl.Biosci.”第8期第189-191頁(1992年)乙文)，及可參見LASERGENE生物資訊運算套裝程式的MegAlignTM程式第6.1版。多重比對的預設參數為間隙罰分=10，間隙長度罰分=0.2，延遲變異序列值(%)=30，DNA轉換權重=0.5，蛋白權重矩陣=貢內特(Gonnet)系列，DNA權重矩陣=IUB)。在使用Clustal W程式進行序列比對之後，可藉由檢視同一程式中的“序列距離”表，而得到“一致性百分比”。
嫻熟技藝者理解，對於來自其他物種之具有相同 或相近功能或活性的多肽而言，用於辨識其序列一致性之程度可有多種。適用的一致性百分比之實例包括但不限於：55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%或95%，或者自55%至100%的任一整數百分比皆可適用於說明本揭露內容的實施例，諸如55%、56%、57%、58%、59%、60%、61%、62%、63%、64%、65%、66%、67%、68%、69%、70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%。適宜的核酸片段不僅具有上述的同源性，並且所編碼的多肽通常具有至少50個胺基酸，較佳具有至少100個胺基酸，更佳具有至少150個胺基酸，又更佳具有至少200個胺基酸，及最佳具有至少250個胺基酸。
“序列分析軟體”一詞係指適用於分析核苷酸或胺基酸序列之任何電腦演算法或軟體程式。“序列分析軟體”可為市售或獨立研發的軟體。典型的序列分析軟體包括但不限於：1.)GCG套裝程式(美國威斯康辛州麥迪遜的遺傳學電腦集團(GCG)有限公司的威斯康辛套裝軟體第9.0版)；2.)BLASTP、BLASTN、BLASTX(Altschul等人於期刊“J.Mol.Biol.”第215期第403-410頁(1990年)乙文)；3.)DNASTAR軟體(美國威斯康辛州麥迪遜的DNASTAR有限公司)；4.)Sequencher軟體(美國密西根州安娜堡(Ann Arbor)的基因編碼(Gene Codes Corporation)公司)；及5.)整合納入史密斯-沃特曼(Smith-Waterman)演算法之FASTA程 式(美國紐約普列南(Plenum)出版公司於1994年出版及由Suhai,Sandor編輯之1992年“基因體研究之運算方法(Comput.Methods Genome Res.)國際研討會論文集”第111-20頁之W.R.Pearson乙文)。在本申請案的上下文中，應理解當使用序列分析軟體進行分析時，分析結果將以該程式所參照的“原設值”為基礎，除非另有說明。如本申請案所用之“原設值”係指該軟體首次進行初始化時所加載的任何數值或參數集合。
當提及雜交技術時，可使用一種已知的核苷酸序列之全部或部分作為探針，而選擇性地與來自所選定生物體的選殖基因體DNA片段或cDNA片段群體(亦即基因體或cDNA庫)中所存在之其他對應的核苷酸序列雜交。雜交探針可為基因體DNA片段、質體DNA片段、cDNA片段、RNA片段、PCR擴增DNA片段、寡核苷酸或其他聚核苷酸，及可加上一個可檢測基諸如32P之標記，或其他任何檢測標記。因而，例如可藉由在以揭露內容的實施例之DNA序列為基礎之合成寡核苷酸上進行標記，而製造供雜交所用的探針。用於製備供雜交所用的探針及用於建構cDNA與基因體庫之方法，係技藝中一般所知及已被揭露(Sambrook等人於1989年乙書)。
本揭露內容的實施例之核酸探針與引子係在嚴格條件下與一種靶DNA序列雜交。可使用任何常規的核酸雜交或擴增方法，以辨識在一試樣中是否存在來自一基因轉殖品項的DNA。其核酸分子或片段可在特定情況下以特 異性方式與其他核酸分子雜交。若二種核酸分子可形成反向平行的雙股核酸結構，則認為該二分子係彼此以特異性方式雜交。若二種核酸分子展現完整的互補性，則認為其中一核酸分子是另一核酸分子的“補體”。如本申請案，當其中一分子的各核苷酸皆與另一分子的一核苷酸互補時，則認為該等分子展現“完整的互補性”。展現完整互補性之分子的雜交作用一般具有充分的安定性，使其等在常規的“高度嚴格”條件下仍彼此黏合。常規的高度嚴格條件係述於Sambrook等人於1989年乙書中。
若二種分子的雜交作用所具有的安定性，係足以使其等至少在常規的“低度嚴格”條件下仍彼此黏合，則認為該二分子展現“最低互補性”。常規的低度嚴格條件係述於Sambrook等人於1989年乙書中。核酸分子僅需展現序列的最低互補性即可作為引子或探針，使該核酸分子可在所採用的特定溶劑與鹽濃度下形成安定的雙股結構。
影響雜交作用的嚴格程度之因子係嫻熟技藝者眾所周知，及該等因子包括但不限於溫度、pH值、離子強度及有機溶劑諸如甲醯胺與二甲亞碸的濃度。如嫻熟技藝者所知，雜交作用的嚴格程度係隨著溫度升高、離子強度降低及溶劑濃度降低而增加。
“嚴格的條件”或“嚴格條件”一詞在功能上之界定，係就一核酸探針與一靶核酸(亦即與所關注的一特定核酸序列)的雜交作用而言，該雜交作用係藉由Sambrook等人於1989年乙書9.52-9.55所論及之特異性雜交程序進行。亦 參見Sambrook等人於1989年乙書9.47-9.52及9.56-9.58。
通常，嚴格條件係鹽濃度低於約1.5M鈉離子，鈉離子濃度(或其他鹽類)通常約為0.01至1.0M及pH值為7.0至8.3，及用於短探針(如10至50個核苷酸)之溫度係至少約30℃，而用於長探針(如超過50個核苷酸)之溫度係至少約60℃。亦可藉由添加去穩定劑諸如甲醯胺而達到嚴格條件。例示性的低度嚴格條件包括在37℃用30至35%甲醯胺、1.0M氯化鈉、0.1%SDS(正十二烷硫酸鈉)的緩衝溶液進行雜交作用，及於50至55℃在1X至2X SSC(20X SSC=3.0M氯化鈉/0.3M檸檬酸三鈉)中清洗。例示性的中度嚴格條件包括在37℃及在40至45%甲醯胺、1.0M氯化鈉、0.1%SDS中進行雜交作用，及於55至60℃在0.5X至1X SSC中清洗。例示性的高度嚴格條件包括在37℃及在50%甲醯胺、1.0M氯化鈉、0.1%SDS中進行雜交作用，及於60至65℃在0.1X SSC中清洗。
特異性通常受到雜交後的清洗作用之影響，關鍵因子為最終清洗溶液的離子強度與溫度。就DNA-DNA雜交體而言，可從下列公式得著Tm近似值：Tm=81.5℃+16.6(logM)+0.41(%GC)-0.61(%form.)-500/L，其中M為單價陽離子的莫耳濃度，%GC係DNA中的鳥糞核苷與胞嘧啶核苷酸之百分比，%form.係雜交溶液中的甲醯胺百分比，而L係以鹼基對為單位之雜交體長度(Meinkoth與Wahl於1984年乙文)。Tm係50%的互補性靶序列與完美匹配的探針雜交之溫度(在指定的離子強度與pH值之下)。每1%的誤配會使 Tm降低約1℃；因而，可調整Tm、雜交作用及/或清洗條件，而與具所欲一致性的序列進行雜交。例如，若尋求具90%一致性的序列，則可將Tm降低10℃。一般而言，在指定的離子強度與pH值下，所選擇的嚴格條件係比特定序列及其補體的熱熔點(Tm)低約5℃。然而，極度嚴格條件所採用之進行雜交及/或清洗作用的溫度可比熱熔點(Tm)低1、2、3或4℃；中度嚴格條件所採用之進行雜交及/或清洗作用的溫度可比熱熔點(Tm)低6、7、8、9或10℃；低度嚴格條件所採用之進行雜交及/或清洗作用的溫度可比熱熔點(Tm)低11至20℃。具一般技藝者將理解，藉由該公式、雜交與清洗組成物及所欲的Tm，已在本質上說明了雜交及/或清洗溶液的嚴格程度之變化。若所欲的誤配程度導致Tm低於45℃(水溶液)或32℃(甲醯胺溶液)，較佳增加SSC濃度，使得可使用較高的溫度。關於核酸雜交作用的詳盡說明指導可參見Ausubel等人於”分子生物學簡要實驗操作手冊(Short Protocols in Molecular Biology)”乙書(1997年)第三版第2-40頁，及參見Sambrook等人(1989年)乙書。
在本揭露內容的另一個實施例中，揭露用於靶向嵌入一植物細胞基因體內的聚核苷酸供體盒之一種方法。在特定實施例中，定點式DNA結合型核酸酶包含至少一個DNA結合域與至少一個核酸酶域，其中該至少一個DNA結合域係與在植物細胞基因體內表現的一個靶位點結合。在其他實施例中，該植物細胞係與聚核苷酸供體盒接觸。在另外的實施例中，用定點式DNA結合型核酸酶剪切植物細 胞基因體內的靶位點。在另一個實施例中，聚核苷酸供體盒係嵌入植物細胞基因體內的靶位點。
在一個實施例中，揭露經由一種同源導向修復機制而靶向嵌入一植物細胞基因體內的聚核苷酸供體盒之作用。在另一實施例中，揭露經由一種非同源性末端連接導向修復機制而靶向嵌入一植物細胞基因體內的聚核苷酸供體盒之作用。
本申請案所揭露的供體分子係經由靶向、無關同源性之方法嵌入一細胞的基因體中。為進行該靶向嵌入作用，利用核酸酶在一個所欲位置(或多個所欲位置)剪切該基因體，該核酸酶係例如一個DNA結合域(如鋅指結合域或TAL效應子域係經工程改造而與位於或鄰近預定剪切位點的一個靶位點結合)與核酸酶域(如剪切域或剪切半域)之間的融合體。在特定實施例中，在一個細胞中表現各包含一個DNA結合域與一個剪切半域的二種融合蛋白，及該等融合蛋白係與相鄰的靶位點結合，其方式使得一個功能性剪切域被重新構建及DNA在靶位點附近被剪切。在一實施例中，剪切作用係發生在二個DNA結合域的靶位點之間。可工程改造該等DNA結合域中的一者或二者。亦參見第7,888,121號美國專利；美國專利公開案20050064474；及國際專利公開案WO05/084190、WO05/014791與WO03/080809。
如申請案所述之核酸酶能以多肽及/或聚核苷酸的形式導入。例如，可將各包含前述一種多肽的編碼序列 之二種聚核苷酸導入一細胞中，而當該等多肽表現及各與其靶序列結合時，在靶序列或其附近發生剪切作用。任擇地，將包含二種融合多肽的編碼序列之單一聚核苷酸導入一細胞中。聚核苷酸可為DNA、RNA或為DNA及/或RNA的任何修飾形式或類似物。
在所關注區域引入一個雙股斷裂之後，並在如申請案所述的雙股供體分子之線性化之後，經由非同源依賴性方法(如非同源性末端連接(NHEJ))，依靶向方式將轉殖基因嵌入所關注區域。較佳在活體內用核酸酶進行雙股供體的線性化，例如使用在基因體內導入雙股斷裂之一或多種相同或不同的核酸酶。同步剪切細胞中的染色體與供體可限制供體DNA的降解作用(相較於供體分子在導入細胞前進行線性化作用)。供體線性化所用的核酸酶靶位點較佳不中斷轉殖基因序列。
可依核酸酶突出端的簡單接合作用所預期的方向(稱作“正向”或“AB”定向)，或依另一種方向(稱作“反向”或“BA”定向)，將轉殖基因嵌入基因體中。在特定實施例中，轉殖基因係在供體與染色體突出端的正確接合作用之後嵌入。在其他實施例中，轉殖基因之BA或AB定向的嵌入作用導致數個核苷酸被刪除。
IV.用於檢測供體聚核苷酸的定點式嵌入作用之分析法
在一實施例中，進行該擴增反應之定量作用。在其他實施例中，檢測該擴增反應。在不同的實施例中，該檢測作用可包括目視觀察瓊脂糖或丙烯醯胺凝膠、進行擴 增子之定序或使用特徵性廓型，其中特徵性廓型係選自由熔化溫度或螢光特徵性廓型所組成之群組。
可使用本揭露內容的實施例之核酸分子或其節段作為PCR擴增作用的引子。在進行PCR擴增作用時，可容忍引子與模板之間之一定程度的誤配。因此，所列舉之引子的突變作用、刪除作用及插入作用(尤其在5’或3’端添加核苷酸)係涵蓋於本揭露內容的範圍內。藉由具一般技藝者所知之方法，可在一特定引子中產生突變作用、插入作用及刪除作用。
檢測作用的另一實例係如Winge(於期刊“Innov.Pharma.Tech.”第00期第18-24頁(2000年)乙文)所述之焦磷酸定序技術。在該方法中，一寡核苷酸經設計而與相鄰的基因體DNA及插入DNA接合處重疊。寡核苷酸係與來自所關注區域的單股PCR產物雜交(一引子位於插入序列中而另一引子位於側臨基因體序列中)，及在DNA聚合酶、ATP、硫酸化酶、螢光素酶、三磷酸腺苷雙磷酸酶、5’磷酸硫酸腺苷及螢光素存在下培養。個別添加dNTP，及以光訊號方式測量納入作用的結果。光訊號係指由於成功的擴增作用、雜交作用及單個或多個鹼基延伸作用，而存在轉殖基因插入/側臨序列。(該技術係用於初始定序，而非用於檢測已知的特定基因。)
曾論及在檢測作用中使用分子信標。簡言之，FRET寡核苷酸探針經設計而與側臨基因體及插入DNA接合處重疊。FRET探針的獨特結構使其包含二級結構，該二 級結構使得螢光與淬熄基團彼此緊鄰。在一種熱安定性聚合酶與dNTP存在下，FRET探針與PCR引子(一引子位於插入DNA序列中而另一引子位於側臨基因體序列中)被循環使用。在成功的PCR擴增作用之後，FRET探針與靶序列的雜交作用導致探針的二級結構被移除，使得螢光基團與淬熄基團在空間上分離。螢光訊號係指由於成功的擴增作用與雜交作用，而存在側臨基因體/轉殖基因插入序列。
水解探針分析法亦稱作TAQMAN®(美國加州福斯特城(Foster City)的生命科技(Life Technologies)公司)，係用於檢測一DNA序列的存在與否及進行定量之一種方法。簡言之，FRET寡核苷酸探針之設計係在轉殖基因內具有一寡核苷酸及在側臨基因體序列內具有一寡核苷酸，以供進行品項特異性檢測作用。在一種熱安定性聚合酶與dNTP存在下，FRET探針與PCR引子(一引子位於插入DNA序列中而另一引子位於側臨基因體序列中)被循環使用。FRET探針的雜交作用造成剪切作用及釋出螢光基團，使得螢光基團與FRET探針上的淬熄基團遠離。螢光訊號係指由於成功的擴增作用與雜交作用，而存在側臨/轉殖基因插入序列。
KASPar分析法係用於檢測一DNA序列的存在與否及進行定量之一種方法。簡言之，使用稱作KASPar®分析系統的一種聚合酶鏈反應(PCR)式分析法，篩檢包含靶向基因座的基因體DNA試樣。用於實施本揭露內容的KASPar®分析法可使用一種KASPar® PCR分析混合物，其中含有多種引子。PCR分析混合物中所用的引子可包含至少 一種前置引子與至少一種反置引子。前置引子所含有的一序列係對應於供體DNA聚核苷酸的一個特定區域，而反置引子所含有的一序列係對應於基因體序列的一個特定區域。此外，PCR分析混合物中所用的引子可包含至少一種前置引子與至少一種反置引子。例如，KASPar® PCR分析混合物可使用對應於二個不同的對偶基因之二種前置引子及使用一種反置引子。其中一種前置引子所含有的一序列係對應於內源性基因體序列的特定區域。第二種前置引子所含有的一序列係對應於供體DNA聚核苷酸的一個特定區域。反置引子所含有的一序列係對應於基因體序列的一個特定區域。本揭露內容中的一實施例即為用於檢測擴增反應之KASPar®分析法。
在一些實施例中，螢光訊號或螢光染料係選自由HEX螢光染料、FAM螢光染料、JOE螢光染料、TET螢光染料、Cy 3螢光染料、Cy 3.5螢光染料、Cy 5螢光染料、Cy 5.5螢光染料、Cy 7螢光染料及ROX螢光染料所組成之群組。
在其他實施例中，使用適宜的第二種螢光性DNA染料來進行擴增反應，第二種螢光性DNA染料可在流動式細胞測量技術可檢測出的濃度範圍將細胞DNA染色，及其螢光發射光譜可藉由即時熱循環儀檢測出。具一般技藝者應理解尚有其他已知的核酸染料，目前也不斷找出其他核酸染料。可採用具有適宜的激發與發射光譜之任何適宜的核酸染料，諸如YO-PRO-1®、SYTOX Green®、SYBR Green I®、SYTO11®、SYTO12®、SYTO13®、BOBO®、YOYO® 及TOTO®。在一實施例中，第二種螢光性DNA染料為SYTO13®，其使用濃度係低於10μM，低於4μM或低於2.7μM。
在下列實例中，進一步舉例說明本揭露內容的實施例。應當理解該等實例僅供說明之用。嫻熟技藝者可從上述實施例與下列實例確定本揭露內容的必要特徵，並且可就揭露內容的實施例進行各種變化與修改，使其適合各種用途與條件，而不偏離本揭露內容的精神與範圍。因而，除了本申請案所述之外，嫻熟技藝者從上述說明將瞭解本揭露內容的實施例之各式修改。所附專利申請範圍之範疇意欲涵蓋該等修改。下列實例僅供說明之用，而非意圖限制本發明的範圍。
實例 例1：與玉米基因座結合的鋅指之設計
如前述設計鋅指蛋白，其係導向對抗可靶向型玉米基因座中所辨識的DNA序列。如參見Urnov等人(2005年)於期刊“Nature”第435期第646-551頁乙文。例示性靶序列與辨識螺旋係示於表1(辨識螺旋區設計)與表2(靶位點)。在表2中，位於ZFP辨識螺旋所接觸之靶位點中的核苷酸係以大寫字母顯示，而未接觸的核苷酸係以小寫字母顯示。鋅指核酸酶(ZFN)靶位點係針對所挑選的所有72個玉米基因座而設計。開發與測試了多種ZFP設計，而找出在酵母代理系統中以最高效率水平與72種不同的代表性基因座靶位點結合之鋅指，該等基因座靶位點係在玉米中所辨識與挑選的。 與鋅指辨識序列的結合效率水平最高之特定ZFP辨識螺旋(表1)，係用於靶向及嵌入玉米基因體內的一供體序列。
將玉米代表性基因座鋅指設計納入編碼一蛋白之鋅指表現載體中，該蛋白的至少一指具有CCHC結構。參見第2008/0182332號美國專利公開案。尤其，各蛋白中的最後一指具有用於辨識螺旋的一個CCHC主鏈。非典型的鋅指編碼序列係經由一個具有4個胺基酸的連接子及從玉米所衍生的一個opaque-2細胞核定位訊號，與IIS型限制酶FokI的核酸酶域(該序列的第384至579個胺基酸Wah等人(1998年)於期刊“Proc.Natl.Acad.Sci.USA”第95期第10564-10569頁乙文)融合，而形成鋅指核酸酶(ZFN)。參見第7,888,121號美國專利。選擇用於不同功能域的鋅指，以供活體內使用。在所設計、生產及測試與推定性基因體靶位點的結合作用之眾多ZFN當中，辨識出上述表2所述之ZFN具有活體內活性，及其特徵在於可有效結合與剪切植物中之獨特的玉米基因體聚核苷酸靶位點。
ZFN構築質體總成
使用技藝中眾所周知的技能與技術，設計及完成如上述所辨識之含有ZFN基因表現構築質體之質體載體(如參見Ausubel或Maniatis乙文)。各ZFN編碼序列係與編碼opaque-2細胞核定位訊號的一序列融合(Maddaloni等人(1989年)於期刊“Nuc.Acids Res.”第17期第7532頁乙文)， opaque-2細胞核定位訊號係位於鋅指核酸酶的上游。非典型鋅指編碼序列係與IIS型限制酶FokI的核酸酶域(該序列的第384至579個胺基酸，Wah等人(1998年)於期刊“Proc.Natl.Acad.Sci.USA”第95期第10564-10569頁乙文)融合。融合蛋白的表現作用係由來自玉米泛素基因的持續性強啟動子所驅動，泛素基因包括5’非轉譯區(UTR)(Toki等人(1992年)於期刊“Plant Physiology”第100期第1503-07頁乙文)。表現盒亦包括來自玉米第5型過氧化酶基因(Per5基因)(第2004/0158887號美國專利公開案)的3' UTR(包含轉錄終止子與多腺苷酸化位點)。在選殖至構築質體中的二個鋅指核酸酶融合蛋白之間，添加自水解性2A，其係編碼來自明脈扁刺蛾β四體病毒的核苷酸序列(Szymczak等人(2004年)於期刊“Nat Biotechnol.”第22期第760-760頁乙文)。
使用IN-FUSIONTM Advantage技術(美國加州山景城(Mountain View)的克隆技術(Clontech)公司)，組裝質體載體。自新英格蘭生物實驗室(New England Biolabs)公司(美國麻州伊普斯維奇(Ipswich))取得限制性核酸內切酶，及使用T4 DNA接合酶(美國加州卡爾斯巴德的英杰公司)進行DNA接合作用。使用NUCLEOSPIN®質體套組(美國賓州伯利恆的馬歇雷-納格爾(Macherey-Nagel)有限公司)，或使用質體Midi套組(凱傑(Qiagen)公司)，依照供應廠商的說明書進行質體製備作用。在瓊脂糖tris-乙酸鹽凝膠電泳之後，使用QIAQUICK凝膠提取套組TM(凱傑(Qiagen)公司)，分離DNA片段。藉由進行小量製備的DNA之限制酶切作用，初 步篩選所有接合反應的菌落。所選擇的殖株之質體DNA係由商業定序服務廠商(美國阿拉巴馬州亨茨維爾(Huntsville)的Eurofins MWG Operon公司)進行定序。序列數據係使用SEQUENCHERTM軟體(美國密西根州安娜堡(Ann Arbor)的基因編碼(Gene Codes Corporation)公司)進行組合與分析。
通用型供體構築質體總成
為了支援快速測試大量的靶基因座，而設計與建構一種新穎、有彈性的通用型供體系統序列。通用型供體聚核苷酸序列與高通量載體的構建方法及分析相容。通用型供體系統係由至少三種模組化結構域所組成：一種非可變的ZFN結合域、一種分析性與使用者自行界定的特徵結構域及用於增大載體的一種質體主鏈。非可變的通用型供體聚核苷酸序列是所有供體所共有的，使得以設計可供所有玉米靶位點所用之有限的分析法集合，從而提供靶向評估方面的一致性及減少分析週期時間。該等結構域的模組性質容許高通量供體總成。此外，通用型供體聚核苷酸序列具有其他獨特的特性，其目的在於簡化下游分析及增進對於結果之解釋。其含有非對稱性限制酶切位點序列，而容許將PCR產物酶切成為診斷上所預期的大小。包含二級結構之序列及預計在PCR擴增作用中造成問題之序列已被移除。通用型供體聚核苷酸序列具有小型尺寸(小於3.0 Kb)。最後，通用型供體聚核苷酸序列係建構在高套數的pUC19主鏈上，而容許及時地將大量的測試DNA批量。
就一實施例而言，包含一種通用型聚核苷酸供體 盒序列之質體實例係如序列辨識編號；132與圖1所提供。在另一個實施例中，聚核苷酸供體盒序列係如下列所提供：pDAB111846，序列辨識編號：133，圖2；pDAB117415，序列辨識編號：134，圖3；pDAB117416，序列辨識編號：135，圖4；pDAB117417，序列辨識編號：136，圖5；pDAB117419，序列辨識編號：137，圖6；pDAB117434序列辨識編號：138，圖7；pDAB117418，序列辨識編號：139，圖8；pDAB117420，序列辨識編號：140，圖9；及pDAB117421，序列辨識編號：141，圖10。在另一實施例中，可建構包含通用型供體聚核苷酸序列之其他序列，該通用型供體聚核苷酸序列具有功能表現型編碼序列或非功能(無啟動子)表現型編碼序列。在表3中，就上述構築質體註記組成該通用型供體系統的不同結構域(一種非可變的ZFN結合域、一種分析性與使用者自行界定的特徵結構域及一種簡單的質體主鏈)。
在另一實施例中，該通用型供體聚核苷酸序列係以質體形式運送之一種2至3 Kb的小型模組供體系統。這是一種極簡的供體，其包含任一數目的ZFN結合位點；稱作“DNA X”或“UZI序列”或“分析性結構域”(序列辨識編號：142與序列辨識編號：143)之一個100至150個鹼基對的短模板區，其帶有供引子設計(引子設計之的Tm係比所計算的任何二級結構高10℃)或編碼序列所用之限制酶切位點與DNA序列；及一種簡單的質體主鏈(圖11)。在一實施例中，依據分析性結構域之設計：含有40至60%的鳥糞嘌呤與胞 嘧啶鹼基對百分比；不含有超過9個鹼基對的重複序列(如5’-gtatttcatgtatttcat-3’)；不含有超過9個鹼基對的一致性鹼基對系列；並且不具有二級結構，其中二級結構的自由能係低於-18千卡/莫耳，如Markham,N.R.與Zuker,M.(2008年)於“UNAFold：供核酸折疊與雜交作用所用之軟體”乙文中計算所得。該文係收入在美國紐澤西州托托瓦(Totowa)的胡馬納(Humana Press)出版公司出版及由Keith,J.M.編輯的“生物資訊學”乙書(ISBN 978-1-60327-428-9)第二冊“結構、功能與應用”第453號“分子生物學方法”第一章第3-31頁。參見表4。當DNA雙股在適宜的ZFN結合位點斷裂之後，整個質體經由NHEJ插入；ZFN結合位點能以串聯方式嵌入。通用型供體聚核苷酸序列的這個實施例最適用於快速篩檢靶位點與ZFN，及在供體中將難以擴增的序列減至最少。
在另一實施例中，該通用型供體聚核苷酸序列係由至少4個模組所組成，及帶有部分的ZFN結合位點、同源臂、具有約100個鹼基對分析片段或編碼序列之DNA X。通 用型供體聚核苷酸序列的這個實施例係適於使用數種ZFN探究在多個聚核苷酸靶位點的NHEJ媒介型基因插入作用(圖12)。
通用型供體聚核苷酸序列可與具有確定的DNA結合域之所有靶向分子併用，及具有二種靶向供體插入模式(NHEJ/HDR)。因此，當通用型供體聚核苷酸序列與適宜的ZFN表現構築質體一同運送時，供體載體與玉米基因體均在一個特定位置被剪切，該特定位置係由特定ZFN的結合作用所決定。一旦線性化之後，可藉由NHEJ或HDR將供體嵌入基因體中。然後可利用載體設計中的不同分析性考量，來判定能最有效率達成靶向嵌入作用之鋅指(圖13)。
例2：玉米轉形程序
在運送至玉米(Zea mays c.v.Hi-II)原生質體之前，依照供應廠商的說明書使用PURE YIELD PLASMID MAXIPREP系統®(美國威斯康辛州麥迪遜的普洛麥格(Promega)公司)或PLASMID MAXI KIT®(美國加州瓦倫西亞(Valencia)的凱傑(Qiagen)公司)，從大腸桿菌(E.coli)培養物中製備用於ZFN構築質體的質體DNA。
原生質體分離作用
按3.5天的維持時間表維持玉米(Zea mays c.v.Hi-II)懸浮培養細胞，收集4毫升壓積細胞體積(PCV)的細胞及移入50毫升的無菌錐形管(飛世爾科技(Fisher Scientific)公司)中，錐形管中含有20毫升的酵素溶液(0.6% PECTOLYASETM、6% CELLULASETM(日本益力多(Yakult) 藥品工業株式會社的“Onozuka”R10)、4mM MES(pH值為5.7)、0.6M甘露糖醇、15mM氯化鎂)。用PARAFILMTM將培養物加蓋並包裹，及置於速度定為10的平臺式搖動器(賽默科技(Thermo Scientific)公司的Vari Mix平臺式搖動器)，在室溫培養16至18小時直至釋出原生質體為止。在培養之後，用顯微鏡評估細胞的酶切品質。將酶切後的細胞過濾通過100微米的細胞過濾器，以10毫升的W5培養基[2mM MES(pH值5.7)、205mM氯化鈉、167mM氯化鈣、6.7mM氯化鉀]沖洗，接著過濾通過70微米與40微米的細胞過濾器。用10毫升的W5培養基沖洗100微米與40微米的過濾器。用50毫升的離心管收集過濾後的原生質體連同沖洗培養基，最終體積約為40毫升。然後，將8毫升的“大梯度溶液”[500mM蔗糖、1mM氯化鈣、5mM MES(pH值6.0)]緩慢添加至原生質體/酵素溶液的底部，在具有搖臂型桶式旋轉器的離心機中，以300至350 x g離心15分鐘。在離心之後，取出約7至8毫升的原生質體帶狀，用25毫升的W5培養基清洗，及於180至200 x g離心15分鐘。然後將原生質體再懸浮於10毫升的MMG溶液[4mM MES(pH值5.7)、0.6M甘露糖醇、15mM氯化鎂]中。使用血球計或流式細胞儀計數原生質體，及用MMG稀釋至每毫升1.67百萬個。
使用PEG進行自原生質體所衍生的玉米(Zea maysc.v.Hi-II)懸浮培養物之轉形作用
將約50萬個原生質體(置於300微升的MMG溶液)移入2毫升的試管中，與40微升的DNA混合及在室溫培養5 至10分鐘。接著，添加300微升之新製備的PEG溶液(36% PEG 4000、0.3M甘露糖醇、0.4M氯化鈣)，該混合物在室溫培養15至20分鐘，及每隔一段時間藉由倒置而加以混合。在培養之後，緩慢添加1毫升的W5清洗液，輕緩地混合細胞及藉由在180至200 x g離心15分鐘，而使原生質體沉澱成團塊。將團塊再懸浮於1毫升的WI培養基[4mM MES(pH值為5.7)、0.6M甘露糖醇、20mM氯化鉀]中，用鋁箔包裹試管，在室溫過夜培養約16小時。
ZFN與供體的轉形作用
就所選擇的各基因座而言，以yfp基因表現對照組、僅ZFN、僅供體及ZFN與供體之比例為1：10(以重量計)的混合物進行玉米原生質體的轉染作用。用於轉染50萬個原生質體的DNA總量為80微克。所有的處理係以三重複或六重複之方式進行。所用的yfp基因表現對照組係pDAB8393(圖14)，其含有第1型玉米泛素啟動子-黃色螢光蛋白編碼序列-玉米Per5 3’UTR及第1型稻米肌動蛋白啟動子-pat編碼序列-玉米脂酶3’UTR基因表現盒。在一個典型的靶向實驗中，僅4微克的ZFN本身或與36微克的供體共轉染，及在各處理中添加40微克的YFP報導基因構築質體。納入相同量的yfp基因表現質體作為填料，而評估在多個基因座與重複之處理中的轉染品質。此外，使用相同量的yfp基因表現質體，使得以迅速解決供體插入的快速靶向分析中之任何技術問題。
例3：經由鋅指核酸酶之玉米基因座剪切作用
在轉染作用之後24小時，藉由置於2毫升的EPPENDORFTM管中及於1600rpm離心，而收集經ZFN轉染的玉米(Zea mays c.v.Hi-II)原生質體，及移除上清液。使用凱傑(QIAGEN)公司的植物DNA萃取套組(PLANT DNA EXTRACTION KIT)TM(美國加州瓦倫西亞(Valencia)的凱傑(Qiagen)公司)，從原生質體團塊中萃取基因體DNA。將分離出的DNA再懸浮於50微升的水中，及藉由NANODROP®(美國紐約州格蘭德島(Grand Island)的英杰(Invitrogen)公司)測定濃度。試樣藉由在0.8%瓊脂糖凝膠上進行電泳，而估算DNA完整性。就PCR擴增作用將所有試樣正規化(20至25奈克/微升)，以產生供定序用的擴增子(美國加州聖地牙哥的伊魯米納(Illumina)公司)。自IDT公司購得條碼型PCR引子(位於美國愛荷華克拉爾維爾(Coralville)，經HPLC純化)，其係經設計而用於擴增涵蓋處理組與對照組試樣的各試驗ZFN辨識序列之區域。藉由梯度PCR確定最佳的擴增條件，該梯度PCR係在23.5微升的反應中使用0.2μM的適宜條碼型引子ACCUPRIME PFX SUPERMIXTM(美國加州卡爾斯巴德的英杰公司)與100奈克的模板基因體DNA。循環之參數係在95℃進行初次變性作用(5分鐘)；接著進行35次變性作用循環(於95℃達15秒)；黏合作用(於55至72℃達30秒)；延伸作用(於68℃達1分鐘)及一次最終延伸作用(於68℃達7分鐘)。在3.5% TAE瓊脂糖凝膠上分析擴增產物，確定各引子組合物所適用的黏合溫度，及用於擴增如上述來自對照組與經ZFN處理試樣的擴增子。所有的擴增子皆在3.5%瓊脂 糖凝膠上純化，在水中洗提，及藉由NANODROPTM測定濃度。就次世代定序而言，將來自經ZFN處理及對應的玉米原生質體對照組之約100奈克的PCR擴增子匯集在一起，及使用伊魯米納(Illumina)次世代定序(NGS)技術進行定序。
分析適宜的ZFN在所選擇的各玉米基因座之剪切活性。從基因體DNA擴增涵蓋ZFN剪切位點的短型擴增子，及進行來自經ZFN處理及對照組玉米原生質體之伊魯米納(Illumina)次世代定序(NGS)。細胞的NHEJ修復途徑係藉由在剪切位點插入或刪除核苷酸(插入/缺失事件)，而化解ZFN所誘發的剪切作用或DNA雙股斷裂，因此可將在剪切位點存在插入/缺失事件視為測量ZFN活性之方式，及藉由次世代定序技術測定之。使用NGS分析軟體(第2012-0173,153號專利公開案之“DNA序列之資料分析”)，以每百萬個高品質序列中具有插入/缺失事件的序列數目之形式，估算特異性靶ZFN的剪切活性(圖15)。在所選擇的玉米靶基因座觀察到活性比對照組高5至100倍，及藉由序列比對進一步確認，序列比對顯示在各ZFN剪切位點的插入/缺失事件之多樣化足跡。該數據表明所選擇的玉米基因座適合藉由ZFN進行剪切。在各靶的差示性活性係反映其染色質狀態及對於剪切作用的順應性，以及反映各ZFN表現作用的效率。
例4：經由鋅指核酸酶之玉米基因座內的聚核苷酸供體序列嵌入作用之快速靶向分析
使用一種半通量原生質體式快速靶向分析方法， 驗證通用型供體聚核苷酸序列經由非同源性末端連接(NHEJ)媒介型供體插入作用在所選擇的玉米靶基因座內的靶向作用。就所選擇的各玉米靶基因座，試驗三至六種的ZFN設計，及藉由次世代定序方法(圖15)測量ZFN媒介型剪切作用及藉由接合式內-外PCR(圖16)測量供體插入作用，而評估靶向作用。所選擇的玉米基因座若在二種分析法中均呈現陽性，則被認定是可靶向性基因座。
ZFN供體插入作用之快速靶向分析
為判定所選擇的玉米靶基因座是否可供靶向進行供體插入作用，將一種ZFN構築質體與通用型供體聚核苷酸構築質體共同運送至玉米原生質體中，將其培養24小時，然後萃取基因體DNA以供分析。若所表現的ZFN同時可剪切位於所選擇的玉米靶基因座及位於供體中的靶結合位點，則線性化供體將經由非同源性末端連接(NHEJ)途徑而插入玉米基因體之經剪切的靶位點。以“內-外”PCR策略為基礎，而完成在所選擇的玉米靶基因座的靶向嵌入作用之確認，其中一種“外”引子辨識位於原生基因座之序列，而一種“內”引子則與供體DNA內的序列結合。該等引子之設計係唯有當供體DNA插入所選擇的玉米靶基因座時，PCR分析法才會產生一種具有所預期大小的擴增產物。內-外PCR分析法係同在插入作用接合處的5’端與3’端進行。表5提供用於分析所嵌入的聚核苷酸供體序列之引子。
使用巢式“內-外”PCR之ZFN供體在靶基因座的插入作用
使用TAKARA EX TAQ HSTM套組(美國加州山景 城的克隆技術(Clontech)公司)進行所有的PCR擴增作用。進行第一內-外PCR的最終反應體積為20微升，其中含有1X TAKARA EX TAQ HSTM緩衝液、0.2mM dNTP、0.2μM“外”引子(表5)、0.05μM“內”引子(按上述通用型供體盒之設計)、0.75單位的TAKARA EX TAQ HSTM聚合酶及10奈克之所萃取的玉米原生質體DNA。然後使用一種PCR程序進行該反應，該程序包括在94℃達2分鐘，在98℃達12秒及在68℃達2分鐘的循環共20次，接著在72℃達10分鐘及維持在4℃。最終的PCR產物連同1KB PLUS DNA LADDERTM(美國紐約州格蘭德島的生命科技(Life Technologies)公司)在瓊脂糖凝膠上進行電泳，以進行目視檢測。
進行巢式內-外PCR的最終反應體積為20微升，其中含有1X TAKARA EX TAQ HSTM緩衝液、0.2mM dNTP、0.2μM“外”引子(表5)、0.1μM“內”引子(按上述通用型供體盒之設計，表6)、0.75單位的TAKARA EX TAQ HSTM聚合酶及1微升的第一PCR產物。然後使用一種PCR程序進行該反應，該程序包括在94℃達2分鐘，在98℃達12秒、在66℃達30秒及在68℃達45秒之循環共31次，接著在72℃達10分鐘及維持在4℃。最終的PCR產物連同1KB PLUS DNA LADDERTM(美國紐約州格蘭德島的生命科技(Life Technologies)公司)在瓊脂糖凝膠上進行電泳，以進行目視檢測。
表5.用於最佳型基因座的巢式內-外PCR分析之所有“外”引子清單
在原生質體靶向系統中運用內-外PCR分析法係極具挑戰性，因轉染作用中使用大量的質體DNA，該大量的質體DNA留存在原生質體靶向系統中，及隨後與細胞基因體DNA一起被萃取。殘餘的質體DNA可能稀釋基因體DNA的相對濃度及降低檢測作用的總靈敏度，亦可能是導致非特異性、異常的PCR反應之一個顯著原因。ZFN所誘發的NHEJ式供體插入作用通常以前置或反置定向發生。用於前置定向插入作用的DNA之內-外PCR分析經常出現偽陽性帶狀，這可能歸因於在靶與供體中的ZFN結合位點附近所共享的同源區，其可能導致非嵌入性供體DNA在擴增作用期間的導引作用與延伸作用。並未在偵測反置定向插入作用產物之分析中發現偽陽性，因此所進行的所有靶向供體嵌入分析，係在快速靶向分析中探究反置供體插入作用。亦採用巢式PCR策略，以進一步增加特異性及降低背景值。巢式PCR策略使用第二PCR擴增反應，其擴增第一PCR反應的第一擴增產物內的一個較短區域。使用非對稱量的“內”與“外”引子，而進一步最佳化接合式PCR，以供用於所選基因座的快速靶向分析。
在瓊脂糖凝膠上目視觀察內-外PCR的分析結果。 就所選擇的所有玉米基因座而言，“ZFN+供體處理”在5’端與3’端產生接近所預期大小的帶狀。對照組ZFN或僅供體之處理係在PCR中為陰性，這表明該方法特別適用於在靶位點的供體嵌入作用。所有的處理係以三重複或六重複之方式進行，及藉由在多個重複(在二端均2個重複)中存在所預期的PCR產物來確認靶向作用。經由NHEJ的供體插入作用經常產生強度較低的副產物，其產生係歸因於在靶及/或供體ZFN位點的線性化端之處理。此外，觀察到不同ZFN所產生的靶向嵌入效率水平不同，一些ZFN穩定地產生高水平的供體嵌入作用，一些ZFN所產生的供體嵌入水平則較不一致，而其他ZFN未產生嵌入作用。總體而言，就所試驗之各個所選擇的玉米靶基因座而言，藉由一或多種ZFN證實在玉米代表性靶基因座內的靶向嵌入作用，其確認該等基因座中之各者皆為可靶向性。再者，所選擇的玉米靶基因座中之各者係適用於精確的基因轉形作用。已多次重複所選擇的該等玉米靶基因座之驗證作用，而每一次都得到相似的結果，因而證實了該驗證程序的再現性，驗證程序包括質體設計與構築質體、原生質體轉化作用、試樣處理與試樣分析。
結論
將供體質體與一種經設計而以特異性方式剪切所選擇的玉米靶基因座之ZFN，轉染至玉米(Zea mays c.v.Hi-II)原生質體中，及在24小時之後採集細胞。藉由內-外接合式PCR分析自對照組、經ZFN處理及經ZFN與供體處理的 原生質體中所分離的基因體DNA，顯示通用型供體聚核苷酸的靶向插入作用係ZFN剪切基因體DNA之結果(表8)。該等研究顯示通用型供體聚核苷酸系統可用於評估在內源性位點的靶向作用，及用於篩選候選的ZFN。最後，原生質體式快速靶向分析及新穎的通用型供體聚核苷酸序列系統提供用於篩檢基因體標的與ZFN之一種改良系統，以供在植物中進行精確的基因體工程相關工作。該方法可使用導入DNA雙股或單股斷裂的任一種核酸酶，而延伸用於評估在所關注的任何系統中之定點式剪切作用及在基因體標的之供體插入作用。
例5：玉米原生質體之產生與轉染作用
藉由與細胞壁分解酵素(纖維素酶，日本益力多(Yakult)藥品工業株式會社之“Onozuka”R10；及果膠酶，美國加州聖塔安娜(Santa Ana)的MP生物醫學(MP Biomedicals)公司型錄編號320952)一起培養，而從玉米(Zea mays c.v.Hi-II)懸浮培養細胞中衍生原生質體，及使用蔗糖梯度進行純化。就轉染作用而言，使用MMG(PH值6.0的MES、0.6M甘露糖醇、15mM氯化鎂)將原生質體的濃度稀釋成為1.67百萬/毫升，將300微升的原生質體(約500,000個)等分至無菌的2毫升試管中，在每個2毫升試管中添加總濃度為40微克的質體DNA(包含YFP轉殖基因表現盒、ZFN轉殖基因表現盒、聚核苷酸供體轉殖基因表現盒、由ZFN/聚核苷酸供體組合的轉殖基因表現盒)，輕緩地混合及在室溫培養5至10分鐘。接著，在原生質體/DNA溶液中添加300微升的PEG 4000，將混合物倒置直至PEG 4000與原生質體/DNA溶液完全混合為止。接著，在室溫培養原生質體/DNA/PEG混合物15至20分鐘。在培養之後，用1毫升的W5培養基(pH值6.0的2mM MES、205mM氯化鈉、167mM氯化鈣、6.7mM氯化鉀)清洗原生質體/DNA/PEG混合物，及於180至200 x g離心15分鐘。在移除上清液之後，添加1毫升的WI培養基(pH值6.0的4mM MES、0.6M甘露糖醇、20mM氯化鉀)及將細胞原生質體團塊再懸浮。用鋁箔覆蓋再懸浮的團塊及培養過夜。使用來自貝克曼-科爾特(Beckman-Coulter)公司(位於美國加州布瑞亞(Brea))的Quanta FlowcytometerTM計算原 生質體轉染效率，所計算出的轉染效率係位於10至50%之範圍。所有轉染處理皆以六重複方式進行。
使用上述用於玉米(Zea mays c.v.Hi-II)所衍生的原生質體之一種類似的轉染程序，來分離玉米(Zea mays c.v.B104)的原生質體。藉由以人工方式將果殼切成薄(約0.5毫米)條狀，然後橫向切割，而從果殼組織獲得原生質體。將切割後的組織移入含有25毫升的酵素溶液之無菌錐形燒瓶中，及將燒瓶置於乾燥室中15分鐘。然後將燒瓶加蓋，用鋁箔覆蓋，及在室溫中以迴轉式振盪器的最低速度振盪過夜。
例6：嵌入經工程改造的降落場基因位點內之供體聚核苷酸的快速靶向分析
在經工程改造的一玉米基因座之供體插入作用：使用一分析來證實一種5 Kb供體在如美國專利申請案2011/0191899所述之經工程改造的第1型降落場(ELP1)基因體標的內之插入作用。該供體DNA係經由一種NHEJ嵌入方法插入玉米(Zea mays c.v.Hi-II)系原生質體的基因體內(該系“106685[1]-007”係由pDAB106685的轉形作用與嵌入作用所產生)。該供體係嵌入ZFN1與ZFN3鋅指結合位點內(圖18)。供ELP1基因體標的內之NHEJ媒介型嵌入作用所用之方法，要求ELP1標的與供體質體需含有相同的ZFN位點(ZFN1或ZFN3)。當供體聚核苷酸序列與ZFN轉染進入原生質體細胞時，ZFN剪切ELP1基因體標的與質體供體DNA，使得所產生的末端相同。經由NHEJ媒介型細胞修復作用將 所產生的相同末端接合，導致質體供體DNA在ELP1基因體標的內之靶向插入作用。用ZFN相對於供體之二種不同的莫耳比率(1：1與1：10)證實對於ELP1基因體標的之靶向作用。使用基因座破壞分析法與內-外PCR確認供體嵌入作用之結果，但未包括非對稱性PCR引子濃度。供體聚核苷酸序列的插入作用能以二種定向發生，而所設計的內-外PCR係用於檢測該二種定向。
破壞分析法：破壞分析法係一種水解探針分析法(類似於TaqmanTM)，其測定一基因體DNA序列的ZFN結合位點是否經修飾或重排。依此方式分析ZFN結合位點的完整性。ZFN媒介型供體插入或剪切作用及接著進行的NHEJ修復作用導致喪失ZFN結合位點，及導致可檢測的qPCR訊號之降低(參見第2014/0173783號美國專利公開案，其在此併入本案以為參考資料)。ELP1在ZFN1與ZFN3位點的剪切作用及一供體序列在該等位點內的靶向嵌入作用之結果係示於圖19。藉由運送一種ZFN聚核苷酸，及以1：1與1：10的比例一起運送一種ZFN與供體聚核苷酸，而分析ZFN1位點。結果顯示ELP1的ZFN1位點受到破壞，藉此表明在該位點的潛在靶向作用。同樣地，結果顯示ELP1的ZFN3位點受到破壞，藉此表明在該位點的潛在靶向作用。該實驗的所有處理係以六重複之方式進行，而數據係以平均結果之形式呈現。
內-外PCR分析法：為確認在ELP1的ZFN1與ZFN3之靶向供體插入作用，在從對照組原生質體試樣(如該 等僅經ZFN聚核苷酸或供體聚核苷酸處理者)及同時經ZFN與供體聚核苷酸處理的原生質體試樣分離出的基因體DNA上進行內-外PCR。所設計的PCR引子係用於擴增及檢測任一定向的供體插入作用。內-外PCR的結果顯示，在所有測試試樣(如供體相對於ZFN之比例為1：1與1：10)之ELP1的ZFN1與ZFN3位點均有靶向供體插入作用。每六次中有四次靶向ZFN1位點，每六次中有三次靶向ZFN3位點。藉由內-外PCR分析法同時檢測前置與反置定向的供體插入作用。對於PCR物料的定序作用顯示預期的靶-供體接合序列以及顯示接合處，而供體/靶中任一者或二者在接合作用前係在該處先經處理(圖20)。
例7：嵌入玉米內源性基因座內的供體聚核苷酸之快速靶向分析
如第2014/0173783號美國專利公開案中所述之玉米品項DAS-59132(在本申請案中稱為E32)的基因座係經靶向供聚核苷酸供體插入，第2014/0173783號美國專利公開案在此併入本案以為參考資料。使用E32ZFN 6(pDAB 105906)，使含有aad-1轉殖基因(pDAB100651)的一種5 Kb供體聚核苷酸靶向玉米(E32)中的一內源性基因座。經由在供體所插入的聚核苷酸之5’端3’端之新穎的內-外PCR分析法(圖21)，使用快速靶向分析，確認供體聚核苷酸序列在玉米基因體內的定點式嵌入作用。
快速靶向分析在作為供原生質體轉染系統所用的內-外PCR分析法之應用上極具挑戰性，因原生質體轉染 系統係一種暫時性的轉形過程。因此，被運送至原生質體細胞的大量過量的質體DNA將留存在系統中，而可能連同細胞基因體DNA被萃取。所運送的大量質體DNA不僅稀釋基因體DNA的有效濃度，從而使得基因體靶向作用之檢測困難，也可能導致非特異性PCR反應而產生偽陽性。
在快速靶向分析式內-外PCR分析法的研發過程中，找出了原生質體系統中之偽陽性的一個主要來源。如該等研究所證實，NHEJ式供體插入作用能以二種不同的方向發生，供體能以前置或反置定向插入基因體中。前置定向插入作用之內-外PCR擴增作用及分析經常產生強勁、激烈的偽陽性擴增子。相反地，反置定向插入作用之內-外PCR擴增作用及分析並未產生大量的偽陽性擴增子。應當注意之處在於供體聚核苷酸與內源性E32基因座共享相同的ZFN結合位點，這可能引起PCR交叉反應(如圖22中所示)。偽陽性可能是模板複製作用所引起的交叉反應之副產物，模板複製作用產生一個納入ZFN結合位點的延伸擴增股。所產生的擴增股則可能與內源性基因體序列的ZFN結合位點結合；或在後續PCR循環中與聚核苷酸供體序列結合而產生偽陽性模板，該偽陽性模板又藉由PCR反應擴增。
非對稱性巢式內-外(ANIO)PCR：為進一步減少非特異性PCR擴增作用而設計一種巢式內-外PCR策略，使得可使用第二種內-外PCR擴增作用來擴增第一內-外PCR擴增子內的一區域。後續的PCR擴增作用進一步增進特異性及對於基因座內的供體靶向與嵌入作用之檢測。在設計 與實施巢式PCR反應期間，找出了用於減少非特異性擴增作用之另一項新穎改良。由於存在大量的供體質體DNA，因此懷疑與供體DNA結合的“內”引子可能是造成偽陽性的主要因素。藉由降低相較於“外”引子濃度之“內”引子濃度，而顯著減少偽陽性。使用所得的非對稱性巢式內-外(ANIO)PCR，來證實一供體聚核苷酸在原生質體細胞中的玉米E32基因座之靶向作用。所有PCR引子之設計係以一種正對照組質體為基礎，該質體之建構係模擬在E32基因座的靶向插入作用(表9)。
具體而言，第一內-外PCR的最終反應體積為20微升，其中含有1x TaKaRa Ex Taq HS緩衝液TM、0.2mM dNTP、0.2μM“外”引子、0.05μM“內”引子、0.75單位的TaKaRa Ex Taq HSTM聚合酶及10奈克之所萃取的玉米原生質體DNA。使用一種PCR程序來完成該PCR反應，該程序包括在94℃達2分鐘，在98℃達12秒及在68℃達2分鐘的循環共20次，接著在72℃達10分鐘及維持在4℃。
巢式(或第二)內-外PCR的最終反應體積為20微升，其中含有1x TaKaRa Ex Taq HS緩衝液TM、0.2mM dNTP、0.2μM“外”引子、0.1μM“內”引子、0.75單位的TaKaRa Ex Taq HS聚合酶TM及1微升的第一PCR產物。使用一種PCR程 序來完成該反應，該程序包括在94℃達2分鐘，在98℃達12秒、在66℃達30秒及在68℃達45秒之循環共31次，接著在72℃達10分鐘及維持在4℃。最終的PCR產物連同1Kb Plus DNA LadderTM(美國紐約州格蘭德島的生命科技(Life Technologies)公司)在瓊脂糖凝膠上進行電泳，以進行目視檢測。
快速靶向分析檢測出在E32基因體靶基因座內之反置定向的供體聚核苷酸插入作用。在經ZFN與供體組合處理之試樣中，六次反應中有六次在5’端與3’端均產生具有所預期大小的擴增子(相較於對照組並未導致供體聚核苷酸序列的定點式嵌入作用)。就3’端的擴增作用而言，在瓊脂糖凝膠上觀察到少量的模糊不規則狀或階梯狀。該項觀察可能歸因於在NHEJ修復作用之前所產生之DNA斷裂末端之處理。此外，在3’端擴增作用之“僅使用供體”的對照組試樣中，觀察到一種非特異性擴增子之擴增作用。相較於正對照組具有預期尺寸之擴增子而言，該非特異性擴增子的分子量較小。然而，該供體聚核苷酸供體成功地嵌入E32基因體靶基因座內，及運用快速靶向分析而有效率地辨識與檢測定點式嵌入體。
例8：嵌入一個黃豆內源性基因座內的供體聚核苷酸之快速靶向分析
使用上述轉形方法，將所設計的ZFN轉形至黃豆原生質體中。經由如第2014/0173783號美國專利公開案中所述之一種基因座破壞分析法，評估各種ZFN對於FAD2基 因座的剪切效率。此外，使用一種內-外PCR分析法，評估供體序列在FAD2基因座內的鋅指核酸酶媒介型嵌入作用，並且將所產生的PCR擴增子定序，以進行在黃豆基因體內的供體嵌入作用之特性分析。
該等實驗係由僅含有供體載體、僅含有ZFN載體或含有ZFN與供體載體的組合之處理組所組成(表10)。此外，該等實驗包括由未轉形細胞或以對照組載體pDAB7221(圖23)轉形的細胞所組成之負對照處理組，pDAB7221包含由CsVMV啟動子所驅動的一個綠色螢光蛋白表現盒，及其兩側係位於高套數質體內的AtuORF243’-UTR。在轉染作用後約18至24小時採集經轉形的試樣。初步數據顯示高F2活性，及質體pDAB 115601含有ZFN，因此，該ZFN質體係在後續所有實驗中作為正對照組。
如表10所詳述，轉形實驗組共含有80微克的DNA，按需要添加質體pDAB7221而使DNA總量增加至80微克。供體載體相對於ZFN表現質體之比例約為10：1。各實驗或處理係由六個實驗重複所組成，該等實驗重複之進行與分析係各自獨立。在兩組實驗中完成評估ZFN之實驗。
靶向作用之分析：使用一種基因座破壞分析法分析來自靶向實驗的DNA試樣，以檢測在FAD2 ZFN剪切位點的修飾作用及評估NHEJ的靶向作用。QPCR分析法之設計係測量FAD2標的中的完整ZFN結合位點。ZFN媒介型供體插入或剪切作用及接著進行的NHEJ修復作用導致喪失ZFN結合位點，及隨後導致可檢測的qPCR訊號之降低。相較於僅供體之處理，具有顯著剪切活性的ZFN導致擴增子生產作用具有較弱的訊號。用於基因座破壞分析法之引子與探針係示於表11，其等在FAD2基因座上的相對位置係示於圖24。
相較於自完整序列(僅供體)所獲得的訊號，在適宜的供體載體存在下，用FAD2 2.3 ZFN2_WT ZFN(二個實驗)與FAD2 2.6 ZFN ZFN4_HF(一個實驗)及F2 ZFN5_HF(二個實驗)處理原生質體之處理作用產生統計上顯著較低的訊號。
基因座特異性內-外PCR：為確認靶向供體插入作用，針對來自所有處理的DNA進行一種基因座特異性內-外PCR分析法。實驗中的供體載體之設計係含有正在測試的FAD2基因座內的靶向嵌入作用之所有ZFN的結合位點。將ZFN與供體一同運送至黃豆細胞中而導致在靶及在供體載體中之ZFN結合位點的剪切作用，及後續經由非同源性末端連接機制而將供體嵌入經剪切的FAD2基因座中。在嵌入FAD2基因座內之前，在FAD2染色體位點的末端及藉由ZFN剪切作用所產生的線性化供體載體上進行處理，及可能產生不完美的末端連接產物。以“內-外”PCR策略為基礎，確認在標的之靶向嵌入作用，其中“外”引子辨識位於原生基因座之序列，而“內”引子則與供體DNA內的序列結合。內-外PCR分析法係同在插入接合處的5’端與3’端進行。
所測試的所有ZFN皆在至少一個實驗中顯示將一供體片段靶向與嵌入FAD2黃豆基因座之一定的證據，其係藉由供體與ZFN試樣中的一種PCR產物所確定。嵌入供體靶向作用使用下列ZFN：F2 ZFN2_WT、F2 ZFN2_HF及F2 ZFN4_HF，及其結果具有可再現性，因在5’端與3’端的六次重複實驗中有二次產生PCR產物(表12)。
內-外PCR產物之定序：用pDAB1115620與F2ZFN2_WT或pDAB1115620與F2 ZFN2_HF完成各個內-外PCR靶向實驗，將其擴增子(具有所預期的大小)中的二個擴增子選殖至一質體中。T所產生的質體係藉由桑格(Sanger)定序方法進行定序。將序列與一參考序列比對，其中將預計從FokI剪切作用所產生的單4個鹼基對末端複製，以代表末端的所有可能組合。從所獲得的23種選殖序列中發現10種獨特的序列模式(圖25)。所有序列模式皆保有位於ZFN結合位點(GAAATTTC)之間之FAD2基因體參考序列的一部分，但相對於FAD2基因體參考序列而言，序列模式亦具有缺失。 4WT1與4WT4序列所含有的缺失延伸至位於GAAATTTC序列的3’端之ZFN結合位點中。1HF4與6HF4序列具有單一鹼基插入。所觀察到的DNA序列模式顯示，發生供體DNA插入黃豆FAD2基因座之靶向作用。
雖然已在特定實施例中說明本發明的各方面，其等可在本揭露內容的精神和範圍內進行進一步的修改。因此，本申請案意欲涵蓋應用本發明的一般原理之任何變化、用途或實施例的修改。此外，該等偏離本揭露內容者所涉及之技藝中的已知或習慣做法若與該等實施例相關及位於所附申請專利範圍的範圍內，則本申請案意欲涵蓋該等偏離部分。
<110> 陶氏農業科學公司
<120> 用於在作物中判定供體插入之快速靶向分析
<130> 14764-231326
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<170> 專利申請軟體3.5版
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<212> DNA
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<212> DNA
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<220>
<223> 通用型聚核苷酸供體盒序列
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<212> DNA
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<223> 通用型聚核苷酸供體盒序列
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Claims (18)

  1. 一種方法，其係用於檢測在一基因體靶位點內之聚核苷酸供體序列的定點式嵌入作用，該方法包括：a.使用經設計而與基因體DNA靶位點結合之第一外PCR引子(Out-PCR primer)及經設計而與所嵌入的聚核苷酸供體序列結合之第一內PCR引子(In-PCR primer)，藉由第一輪PCR擴增一基因體DNA而產生第一擴增子，其中該第一外PCR引子及該第一內PCR引子對係經選擇以僅擴增反置定向(reverse orientation)插入之聚核苷酸供體序列，其中該反置定向係相對於原轉形載體之定向；b.使用對於位於第一擴增子內的序列具有特異性之引子，藉由第二輪PCR擴增第一擴增子，而產生第二擴增子；及c.檢測是否存在第二擴增子，其中第二擴增子之產生係表示定點式嵌入事件之存在。
  2. 如請求項1之方法，其中該基因體靶位點包含一內源性或經工程改造的基因體靶位點。
  3. 如請求項1之方法，其中所提供的第一內PCR引子的濃度係低於第一外PCR引子。
  4. 如請求項1之方法，其中進行第一輪PCR時所用的第一外PCR引子相對於第一內PCR引子之相對濃度係約4：1、3：1或2：1。
  5. 如請求項1之方法，其中第一內PCR引子的濃度為0.05至0.09μM，而第一外PCR引子的濃度係至少0.1μM。
  6. 如請求項1至5項中任一項之方法，其中第二輪PCR包含經設計而與第一擴增子的基因體DNA靶位點結合之第二外PCR引子，及包含經設計而與第一擴增子之嵌入的聚核苷酸供體序列結合之第二內PCR引子。
  7. 如請求項6之方法，其中所提供的第二內PCR引子的濃度係低於第二外PCR引子。
  8. 如請求項6之方法，其中進行第二輪PCR時所用的第二外PCR引子相對於第二內PCR引子之相對濃度係約4：1、3：1或2：1。
  9. 如請求項6之方法，其中第二內PCR引子的濃度為0.05至0.1μM，而第二外PCR引子的濃度為0.2μM。
  10. 如請求項1之方法，其中該基因體DNA係一種植物基因體DNA，其在基因體靶位點內包含定點式嵌入的聚核苷酸供體序列。
  11. 如請求項10之方法，其中該植物基因體DNA係從一種單子葉植物中分離出來。
  12. 如請求項10之方法，其中該植物基因體DNA係從一種雙子葉植物中分離出來。
  13. 如請求項10之方法，其中在基因體靶位點內之聚核苷酸供體序列的定點式嵌入作用係藉由一種定點核酸酶剪切該基因體DNA靶位點所產生。
  14. 如請求項13之方法，其中該定點核酸酶係選自由鋅指核 酸酶、CRISPR核酸酶、TALEN核酸酶及巨核酸酶所組成之群組。
  15. 如請求項13之方法，其中在基因體靶位點內之聚核苷酸供體序列的定點式嵌入作用係經由一種非同源性末端連接機制而發生。
  16. 如請求項1之方法，其中該檢測步驟包括在一凝膠中進行第二擴增子之電泳。
  17. 如請求項1之方法，其中該檢測步驟包括第二擴增子之定序。
  18. .一種方法，其係用於檢測在轉染型植物細胞的一基因體靶位點內之聚核苷酸供體序列的定點式嵌入作用，該方法包括：a.藉由第一輪PCR擴增一基因體DNA而產生第一擴增子，其中該PCR之進行係使用經設計而與基因體靶位點結合之第一外PCR引子及經設計而與聚核苷酸供體序列結合之第一內PCR引子；再者，其中所提供的第一內PCR引子的濃度係低於第一外PCR引子，以及該第一外PCR引子及該第一內PCR引子對係經選擇以僅擴增反置定向插入之聚核苷酸供體序列，其中該反置定向係相對於原轉形載體之定向；b.使用一第二外PCR引子及一第二內PCR引子藉由第二輪PCR擴增第一擴增子，該第二外PCR引子係經設計以與該第一擴增子的基因體DNA靶位點結合，以及該第二內PCR引子係經設計以與該第一擴增子之嵌入的 聚核苷酸供體序列結合；及c.檢測是否存在第二擴增子，其中第二擴增子之產生係表示定點式嵌入事件之存在。
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