KR20210142210A - 뉴클레오티드 서열을 편집하기 위한 방법 및 조성물 - Google Patents

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KR20210142210A
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KR
South Korea
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nucleotides
guide rna
dna
sequence
seq
Prior art date
Application number
KR1020217033211A
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데이빗 알. 류
앤드루 비토 안잘론
맥스 월트 선
Original Assignee
더 브로드 인스티튜트, 인코퍼레이티드
프레지던트 앤드 펠로우즈 오브 하바드 칼리지
메사추세츠 인스티튜트 오브 테크놀로지
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Abstract

본 개시내용은 프라임 편집을 위한 새로운 프라임 편집제 가이드 RNA, 프라임 편집을 위한 구축물 및 그의 사용 방법을 제공한다. 추가로, 본 개시내용은 뉴클레오티드 변화 및/또는 표적화된 돌연변이유발 (예를 들어, 삽입 또는 결실)의 혼입을 가능하게 하는 표적 DNA 분자 (예를 들어, 게놈)의 프라임 편집을 수행하기 위한 조성물 및 방법을 제공한다. 뉴클레오티드 변화는 단일-뉴클레오티드 변화 (예를 들어, 임의의 전이 또는 임의의 전환), 1개 이상의 뉴클레오티드의 삽입 또는 1개 이상의 뉴클레오티드의 결실을 포함할 수 있다. 보다 특히, 본 개시내용은 프라임 편집제 RNA (PEgRNA)에 의해 특이적 DNA 서열로 가이드되는, 핵산 프로그램가능한 DNA 결합 단백질 (napDNAbp) 및 폴리머라제 (예를 들어, 리버스 트랜스크립타제)를 포함하는 융합 단백질을 제공한다. 프라임 편집제 가이드 RNA는 내인성 DNA 서열에 상동이지만 목적하는 1개 이상의 뉴클레오티드 변화를 함유하고 폴리머라제 (예를 들어, 리버스 트랜스크립타제)에 의한 합성 후에 표적 DNA 분자 내로 혼입되는 단일 가닥 DNA 플랩을 코딩하는 DNA 합성 주형 서열을 제공하는 연장 아암을 포함한다.

Description

뉴클레오티드 서열을 편집하기 위한 방법 및 조성물
정부 지원
본 발명은 미국 국립 보건원에 의해 수여된 승인 번호 U01AI142756, RM1HG009490, R01EB022376 및 R35GM118062 하의 정부 지원으로 이루어졌다. 정부는 본 발명에 특정 권리를 갖는다.
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병원성 단일 뉴클레오티드 돌연변이는 유전적 성분이 존재하는 인간 질환의 대략 67%에 기여한다7. 불행하게도, 이들 유전 장애를 갖는 환자에 대한 치료 옵션은 수십년의 유전자 요법 탐구8에도 불구하고 극히 제한적인 것으로 남아있다. 아마도 이러한 치료 과제에 대한 가장 간단한 해결책들 중 하나는 환자의 게놈 내의 단일 뉴클레오티드 돌연변이의 직접적 교정이며, 이는 질환의 근본 원인을 다룰 것이고, 지속적인 이익을 제공할 가능성이 있다. 이러한 전략은 이전에 생각할 수 없었지만, CRISPR/Cas 시스템9의 출현에 의해 야기된 게놈 편집 능력에서의 최근의 개선은 이제 이러한 치료 접근법을 도달할 수 있는 범위 내로 가져왔다. 표적 DNA 서열에 상보적인 ~20개의 뉴클레오티드를 함유하는 가이드 RNA (gRNA) 서열의 간단한 설계에 의해, 거의 모든 고려가능한 게놈 부위가 CRISPR 연관 (Cas) 뉴클레아제1,2에 의해 특이적으로 접근될 수 있다. 지금까지, 여러 단량체 박테리아 Cas 뉴클레아제 시스템이 확인되었고, 게놈 편집 적용10을 위해 적합화되었다. 이러한 Cas 뉴클레아제의 자연적 다양성은, 증가하는 조작된 변이체11-14의 집합물과 함께, 새로운 게놈 편집 기술을 개발하기 위한 비옥한 기반을 제공한다.
CRISPR을 사용한 유전자 파괴는 이제 성숙한 기술이지만, 인간 게놈 내의 단일 염기 쌍의 정밀 편집은 주요 과제로 남아있다3. 상동성 지정 복구 (HDR)는 목적하는 편집을 코딩하는 공여자 DNA 복구 주형을 사용하여 이중 가닥 파괴 (DSB)의 부위에서 DNA 서열을 삽입, 교정 또는 교환하기 위해 인간 세포 및 다른 유기체에서 오랫동안 사용되어 왔다15. 그러나, 전통적인 HDR은 대부분의 인간 세포 유형, 특히 비-분열 세포에서 매우 낮은 효율을 갖고, 경쟁 비-상동 말단 연결 (NHEJ)은 삽입-결실 (indel) 부산물을 우세하게 유도한다16. 다른 문제는 DSB의 생성에 관한 것이며, 이는 표적 유전자좌에서 큰 염색체 재배열 및 결실을 일으킬 수 있거나17, 또는 p53 축을 활성화시켜 성장 정지 및 아폽토시스를 유도할 수 있다18,19.
HDR의 결점을 다루는 여러 접근법이 탐구되어 왔다. 예를 들어, 올리고뉴클레오티드 공여자에 의한 단일 가닥 DNA 파괴 (닉)의 복구는 indel 형성을 감소시키는 것으로 밝혀졌지만, 목적하는 복구 생성물의 수율은 여전히 낮다20. 다른 전략은 소분자 및 생물학적 시약을 사용하여 NHEJ보다는 HDR 쪽으로 복구를 편향시키려 시도한다21-23. 그러나, 이들 방법의 유효성은 세포-유형 의존성이고, 정상 세포 상태의 교란은 바람직하지 않은 예측불가능한 효과를 유도할 수 있다.
최근에, 리우(Liu) 등은 DSB를 생성하지 않으면서 또는 HDR에 의존하지 않으면서 표적 뉴클레오티드를 편집하는 기술로서 염기 편집을 개발하였다4-6,24-27. Cas-융합된 데아미나제에 의한 DNA 염기의 직접적 변형은 높은 효율로 짧은 표적 윈도우 (~5-7개 염기)에서, C·G에서 T·A로의 또는 A·T에서 G·C로의 염기 쌍 전환을 가능하게 한다. 그 결과, 염기 편집제는 과학계에 의해 신속하게 채택되었다. 그러나, 여러 인자가 정밀 게놈 편집을 위한 그의 일반성을 제한할 수 있다.
따라서, 임의의 목적하는 단일 또는 다중 뉴클레오티드 변화를 도입할 수 있고/거나 뉴클레오티드 삽입 또는 결실 (예를 들어, 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100개 또는 그 초과의 염기 쌍 삽입 또는 결실)을 설치할 수 있고/거나 표적 부위에서의 뉴클레오티드 서열을 높은 특이성 및 효율로 변경 또는 변형시킬 수 있는 프로그램가능한 편집제의 개발은 CRISPR에 기초한 게놈 편집 기술의 범주 및 치료 잠재력을 실질적으로 확장시킬 것이다.
본 발명은 새로운 조성물 (예를 들어, 새로운 PEgRNA 및 그를 포함하는 PE 복합체) 및 본원에 기재된 특수화된 알고리즘을 사용하여 설계된 PEgRNA를 사용하여 치료 표적, 예를 들어 클린바(ClinVar) 데이터베이스에서 확인된 표적을 복구하기 위해 프라임 편집 (PE)을 사용하는 방법을 개시하였다. 따라서, 한 측면에서, 본 출원은 치료 표적 (예를 들어, 클린바 데이터베이스에 포함된 것)을 복구하는데 사용될 수 있는 PEgRNA에 대한 서열을 대규모로 예측하기 위한 알고리즘을 개시한다. 추가로, 본 출원은 개시된 알고리즘을 사용하여 설계될 수 있고 치료 표적을 복구하기 위해 프라임 편집과 함께 사용될 수 있는, 설계된 치료 PEgRNA에 대한 예측된 서열을 개시한다.
본원에 개시된 알고리즘 및 예측된 PEgRNA 서열은 일반적으로 프라임 편집에 관한 것이다. 따라서, 본 개시내용은 또한 적합한 napDNAbp (예를 들어, Cas9 닉카제) 및 폴리머라제 (예를 들어, 리버스 트랜스크립타제), 뿐만 아니라 본원에 개시된 치료 PEgRNA와 함께 사용될 수 있는 다른 적합한 성분 (예를 들어, 링커, NLS) 및 PE 융합 단백질을 비롯한, 프라임 편집의 다양한 성분 및 측면에 대한 설명을 제공한다.
본원에 개시된 바와 같이, 프라임 편집은 핵산 프로그램가능한 DNA 결합 단백질 ("napDNAbp")을 폴리머라제와 회합하여 작동하도록 (즉, 융합 단백질의 형태로 또는 달리 napDNAbp와 트랜스로 제공됨) 사용하여 새로운 유전자 정보를 명시된 DNA 부위 내로 직접 기록하는 다목적의 정확한 게놈 편집 방법이며, 여기서 프라임 편집 시스템은 표적 부위를 명시하고 또한 가이드 RNA 상에 (예를 들어, 5' 또는 3' 단부에 또는 가이드 RNA의 내부 부분에) 조작된 연장부 (DNA 또는 RNA)에 의해 대체 DNA 가닥의 형태로 목적하는 편집의 합성의 주형이 되는 프라임 편집 (PE) 가이드 RNA ("PEgRNA")로 프로그램화된다. 목적하는 편집 (예를 들어, 단일 핵염기 치환)을 함유하는 대체 가닥은 (목적하는 편집을 포함하는 것을 제외하고는) 편집될 표적 부위의 내인성 가닥과 동일한 서열을 공유한다. DNA 복구 및/또는 복제 기구를 통해, 표적 부위의 내인성 가닥은 목적하는 편집을 함유하는 새로 합성된 대체 가닥에 의해 대체된다. 일부 경우에, 프라임 편집은 "검색-및-대체" 게놈 편집 기술로서 생각될 수 있으며, 이는 프라임 편집제가, 본원에 기재된 바와 같이, 편집될 목적하는 표적 부위를 검색하고 위치를 찾아낼 뿐만 아니라, 동시에, 상응하는 표적 부위 내인성 DNA 가닥 대신에 설치된 목적하는 편집을 함유하는 대체 가닥을 코딩하기 때문이다. 본 개시내용의 프라임 편집제는, 부분적으로, 표적-프라이밍된 역전사 (TPRT) 또는 "프라임 편집"의 메카니즘이 (예를 들어, 도 1a-1f의 다양한 실시양태에 도시된 바와 같이) 높은 효율 및 유전적 유연성으로 정밀 CRISPR/Cas-기반 게놈 편집을 수행하기 위해 활용 또는 적합화될 수 있다는 발견에 관한 것이다. TPRT는 이동성 DNA 요소, 예컨대 포유동물 비-LTR 레트로트랜스포손 및 박테리아 그룹 II 인트론에 의해 자연적으로 사용된다28,29. 본 발명자들은 본원에서 Cas 단백질-리버스 트랜스크립타제 융합체 또는 관련 시스템을 사용하여 가이드 RNA에 의해 특이적 DNA 서열을 표적화하고, 표적 부위에서 단일 가닥 닉을 생성하고, 닉킹된 DNA를 가이드 RNA와 통합된 조작된 리버스 트랜스크립타제 주형의 역전사를 위한 프라이머로서 사용하였다. 그러나, 상기 개념이 DNA 폴리머라제 성분으로서 리버스 트랜스크립타제를 사용하는 프라임 편집제로 시작되지만, 본원에 기재된 프라임 편집제는 리버스 트랜스크립타제로 제한되는 것이 아니라, 실질적으로 임의의 DNA 폴리머라제의 사용을 포함할 수 있다. 실제로, 본 출원은 전반에 걸쳐 "리버스 트랜스크립타제"를 사용한 프라임 편집제를 언급할 수 있지만, 리버스 트랜스크립타제는 프라임 편집으로 작동할 수 있는 DNA 폴리머라제의 단지 한 유형인 것으로 본원에 제시된다. 따라서, 본 명세서가 "리버스 트랜스크립타제"를 언급할 때마다, 관련 기술분야의 통상의 기술자는 리버스 트랜스크립타제 대신에 임의의 적합한 DNA 폴리머라제가 사용될 수 있다는 것을 인지하여야 한다. 따라서, 한 측면에서, 프라임 편집제는 Cas9 (또는 등가의 napDNAbp)를 포함할 수 있으며, 이는 그것을 표적 DNA 내의 상보적 프로토스페이서에 어닐링하는 스페이서 서열을 함유하는 특수화된 가이드 RNA (즉, PEgRNA)와 회합시킴으로써 DNA 서열을 표적화하도록 프로그램화된다. 특수화된 가이드 RNA는 또한 표적 부위에서 상응하는 내인성 DNA 가닥을 대체하는데 사용되는 목적하는 유전자 변경을 함유하는 DNA의 대체 가닥을 코딩하는 연장부의 형태로 새로운 유전자 정보를 함유한다. PEgRNA로부터 표적 DNA로 정보를 전달하기 위해, 프라임 편집의 메카니즘은 DNA의 한 가닥 내의 표적 부위를 닉킹하여 3'-히드록실 기를 노출시키는 것을 수반한다. 이어서, 노출된 3'-히드록실 기를 사용하여 표적 부위 내로 직접 PEgRNA 상의 편집-코딩 연장부의 DNA 중합을 프라이밍할 수 있다. 다양한 실시양태에서, 편집을 함유하는 대체 가닥의 중합을 위한 주형을 제공하는 연장부는 RNA 또는 DNA로부터 형성될 수 있다. RNA 연장부의 경우에, 프라임 편집제의 폴리머라제는 RNA-의존성 DNA 폴리머라제 (예컨대, 리버스 트랜스크립타제)일 수 있다. DNA 연장부의 경우에, 프라임 편집제의 폴리머라제는 DNA-의존성 DNA 폴리머라제일 수 있다.
본원에 개시된 프라임 편집제에 의해 형성된 새로 합성된 가닥 (즉, 목적하는 편집을 함유하는 대체 DNA 가닥)은 목적하는 뉴클레오티드 변화 (예를 들어, 단일 뉴클레오티드 변화, 결실 또는 삽입 또는 그의 조합)의 포함을 제외하고는 게놈 표적 서열에 상동일 것이다 (즉, 그와 동일한 서열을 가질 것임). DNA의 새로 합성된 (또는 대체) 가닥은 또한 단일 가닥 DNA 플랩으로서 지칭될 수 있으며, 이는 상보적 상동 내인성 DNA 가닥과의 혼성화에 대해 경쟁함으로써 상응하는 내인성 가닥을 대체할 것이다. 특정 실시양태에서, 시스템은 오류-유발 리버스 트랜스크립타제 효소 (예를 들어, Cas9 도메인과의 융합 단백질로서 제공되거나 또는 Cas9 도메인에 대해 트랜스로 제공됨)의 사용과 조합될 수 있다. 오류-유발 리버스 트랜스크립타제 효소는 단일 가닥 DNA 플랩의 합성 동안 변경을 도입할 수 있다. 따라서, 특정 실시양태에서, 오류-유발 리버스 트랜스크립타제를 이용하여 표적 DNA에 뉴클레오티드 변화를 도입할 수 있다. 시스템과 함께 사용되는 오류-유발 리버스 트랜스크립타제에 따라, 변화는 무작위 또는 비-무작위일 수 있다.
혼성화된 중간체 (내인성 DNA 가닥에 혼성화된 리버스 트랜스크립타제에 의해 합성된 단일 가닥 DNA 플랩을 포함함)의 분해는 생성된 내인성 DNA의 대체 플랩의 제거 (예를 들어, 5' 단부 DNA 플랩 엔도뉴클레아제인 FEN1을 사용함), 합성된 단일 가닥 DNA 플랩의 표적 DNA에 대한 라이게이션, 및 세포 DNA 복구 및/또는 복제 과정의 결과로서 목적하는 뉴클레오티드 변화의 동화를 포함할 수 있다. 주형화된 DNA 합성은 삽입 및 결실을 포함한 임의의 뉴클레오티드의 변형을 위한 단일 뉴클레오티드 정밀도를 제공하기 때문에, 이러한 접근법의 범주는 매우 넓고, 기초 과학 및 요법에서 무수한 적용에 사용될 수 있을 것으로 예측된다.
치료 PEgRNA를 설계하는 알고리즘 및 방법
한 측면에서, 본 개시내용은 특히 1-오프 PEgRNA 설계 예와 대조적으로 대규모로 치료 PEgRNA를 설계하기 위한 신규 알고리즘에 관한 것이다.
따라서, 일부 측면은 프라임 편집제 가이드 RNA (PEgRNA)의 서열을 결정하기 위한 컴퓨터화 방법에 관한 것이다. 방법은 적어도 1개의 컴퓨터 하드웨어 프로세서를 사용하여 투입 대립유전자, 산출 대립유전자 및 핵산 프로그램가능한 DNA 결합 단백질 및 폴리머라제 (예를 들어, 리버스 트랜스크립타제)를 포함하는 융합 단백질을 나타내는 데이터에 액세스하는 단계를 포함한다. 이러한 방법은 투입 대립유전자, 산출 대립유전자 및 융합 단백질에 기초하여 PEgRNA 서열을 결정하는 단계를 포함하며 (여기서 PEgRNA 서열은 투입 대립유전자를 산출 대립유전자로 변화시키기 위해 융합 단백질과 회합되도록 설계됨), 예컨대 PEgRNA 서열에 대해 하기 특색들 중 하나 이상을 결정하는 것을 포함한다: 투입 대립유전자 내의 표적 뉴클레오티드 서열에 상보적인 스페이서 (즉, 도 27에 정의된 바와 같은 스페이서); 융합 단백질과 상호작용하기 위한 gRNA 백본 (즉, 도 27에 정의된 바와 같은 gRNA 코어); 및 투입 대립유전자를 산출 대립유전자로 변화시키기 위해 목적하는 뉴클레오티드 변화를 포함하는 DNA 합성 주형 (도 27에 제시된 바와 같음) 및 프라이머 결합 부위 (즉, 도 27에 제시된 바와 같은 프라이머 결합 부위) 중 하나 이상을 포함하는 연장부 (즉, 도 27에 제시된 바와 같은 연장 아암). PEgRNA는 또한 프로모터로부터의 전사를 종결시키는 3' 종결 신호를 포함할 수 있다. 추가로, PEgRNA는 연장 아암의 5' 단부에 제1 변형제 및 연장 아암의 3' 단부에 제2 변형제를 포함할 수 있다. 이러한 서열 (도 27에 "e1" 및 "e2"로 제시됨)은 스템-루프 서열을 포함할 수 있으며, 이는 PEgRNA의 안정성을 증가시킬 수 있다.
일부 예에서, 방법은 스페이서 및 연장부를 결정하는 단계 및 스페이서가 PEgRNA의 5' 단부에 있고 연장부가 PEgRNA 구조의 3' 단부에 있는 것으로 결정하는 단계를 포함한다.
일부 예에서, 방법은 스페이서 및 연장부를 결정하는 단계 및 스페이서가 PEgRNA의 5' 단부에 있고 연장부가 스페이서에 대해 3'인 것으로 결정하는 단계를 포함한다.
일부 예에서, 투입 대립유전자 및 산출 대립유전자를 나타내는 데이터에 액세스하는 단계는 투입 대립유전자 및 연관된 산출 대립유전자의 세트를 포함하는 데이터베이스에 액세스하는 것을 포함한다. 데이터베이스에 액세스하는 단계는 국립 생물 정보 센터의 클린바 데이터베이스 (www.ncbi.nlm.nih.gov/clinvar/)에 액세스하는 것을 포함할 수 있으며, 이 데이터베이스는 복수의 엔트리를 포함하고, 각각의 엔트리는 투입 대립유전자의 세트로부터의 투입 대립유전자 및 산출 대립유전자의 세트로부터의 산출 대립유전자 (예를 들어, 야생형 또는 목적하는 활성을 갖는 대립유전자)를 포함한다. PEgRNA 서열을 결정하는 단계는 세트 내의 각각의 투입 대립유전자 및 연관된 산출 대립유전자에 대한 1개 이상의 PEgRNA 서열을 결정하는 것을 포함할 수 있다.
일부 예에서, 융합 단백질을 나타내는 데이터에 액세스하는 단계는 복수의 융합 단백질로부터 융합 단백질을 결정하는 것을 포함한다.
일부 예에서, 융합 단백질은 Cas9 단백질을 포함한다. 융합 단백질은 Cas9-NG 단백질, Cas9-NGG, saCas9-KKH 또는 SpCas9 단백질을 포함할 수 있다.
일부 예에서, 투입 대립유전자를 산출 대립유전자로 변화시키는 것은 단일 뉴클레오티드 변화, 1개 이상의 뉴클레오티드의 삽입, 1개 이상의 뉴클레오티드의 결실 또는 그의 조합을 포함한다.
일부 실시양태에서, 방법은 스페이서를 결정하는 것을 포함하며, 여기서 스페이서는 1 내지 40개 뉴클레오티드의 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 방법은 스페이서를 결정하는 것을 포함하며, 여기서 스페이서는 5 내지 35개 뉴클레오티드의 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 방법은 스페이서를 결정하는 것을 포함하며, 여기서 스페이서는 10 내지 30개 뉴클레오티드의 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 방법은 스페이서를 결정하는 것을 포함하며, 여기서 스페이서는 15 내지 25개 뉴클레오티드의 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 일부 예에서, 방법은 스페이서를 결정하는 것을 포함하며, 여기서 스페이서는 대략 20개 뉴클레오티드의 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 방법은 상응하는 프로토스페이서 뉴클레오티드 서열 내의 변화의 위치에 기초하여 스페이서를 결정하는 것을 포함할 수 있다. 변화는 약 프로토스페이서 위치 -15 내지 프로토스페이서 위치 +39인 편집 윈도우에 설치될 수 있다. 변화는 약 프로토스페이서 위치 -10 내지 프로토스페이서 위치 +34인 편집 윈도우에 설치될 수 있다. 변화는 약 프로토스페이서 위치 -5 내지 프로토스페이서 위치 +29인 편집 윈도우에 설치될 수 있다. 변화는 약 프로토스페이서 위치 -1 내지 프로토스페이서 위치 +27인 편집 윈도우에 설치될 수 있다.
일부 예에서, 방법은 투입 대립유전자 및 융합 단백질에 기초하여 초기 후보 프로토스페이서의 세트를 결정하는 단계이며, 여기서 각각의 초기 후보 프로토스페이서는 투입 대립유전자 내의 융합 단백질의 PAM을 포함하는 것인 단계; 각각 비상용성 닉 위치를 포함하는 초기 후보 프로토스페이서의 세트로부터 1개 이상의 초기 후보 프로토스페이서를 결정하는 단계; 결정된 1개 이상의 초기 후보 프로토스페이서를 세트로부터 제거하여 나머지 후보 프로토스페이서의 세트를 생성하는 단계를 포함할 수 있으며; 여기서 PEgRNA 구조를 결정하는 단계는 복수의 PEgRNA 구조를 결정하는 것을 포함하고, 여기서 각각의 PEgRNA 구조는 나머지 후보 프로토스페이서의 세트로부터의 상응하는 프로토스페이서에 기초하여 결정된 상이한 스페이서를 포함한다.
일부 예에서, 방법은 연장부 및 DNA 합성 주형 (예를 들어, RT 주형 서열)을 결정하는 단계를 포함하며, 여기서 DNA 합성 주형 (예를 들어, RT 주형 서열)은 대략 1개 뉴클레오티드 내지 40개 뉴클레오티드를 포함한다. 일부 예에서, 방법은 연장부 및 DNA 합성 주형 (예를 들어, RT 주형 서열)을 결정하는 단계를 포함하며, 여기서 DNA 합성 주형 (예를 들어, RT 주형 서열)은 대략 3개 뉴클레오티드 내지 38개 뉴클레오티드를 포함한다. 일부 예에서, 방법은 연장부 및 DNA 합성 주형 (예를 들어, RT 주형 서열)을 결정하는 단계를 포함하며, 여기서 DNA 합성 주형 (예를 들어, RT 주형 서열)은 대략 5개 뉴클레오티드 내지 36개 뉴클레오티드를 포함한다. 일부 예에서, 방법은 연장부 및 DNA 합성 주형 (예를 들어, RT 주형 서열)을 결정하는 단계를 포함하며, 여기서 DNA 합성 주형 (예를 들어, RT 주형 서열)은 대략 7개 뉴클레오티드 내지 34개 뉴클레오티드를 포함한다.
일부 예에서, PEgRNA를 결정하는 단계는 투입 대립유전자 및/또는 융합 단백질에 기초하여 스페이서를 결정하는 것 및 스페이서에 기초하여 DNA 합성 주형 (예를 들어, RT 주형 서열)을 결정하는 것을 포함한다.
일부 예에서, DNA 합성 주형 (예를 들어, RT 주형 서열)은 닉 부위에 인접한 내인성 DNA 서열에 상보적인 단일 가닥 DNA 플랩을 코딩하며, 여기서 단일 가닥 DNA 플랩은 목적하는 뉴클레오티드 변화를 포함한다. 단일 가닥 DNA 플랩은 닉 부위에 인접한 내인성 DNA 서열에 혼성화함으로써, 목적하는 뉴클레오티드 변화를 설치할 수 있다. 단일 가닥 DNA 플랩은 닉 부위에 인접한 내인성 DNA 서열을 대체할 수 있다. 단일 가닥 DNA 플랩의 세포 복구는 목적하는 뉴클레오티드 변화의 설치를 유발함으로써, 목적하는 생성물을 형성할 수 있다.
일부 예에서, 융합 단백질은 PEgRNA와 복합체화된 경우에 표적 DNA 서열에 결합할 수 있다. 표적 DNA 서열은 변화가 발생하는 표적 가닥 및 상보적 비-표적 가닥을 포함할 수 있다.
일부 예에서, 투입 대립유전자는 병원성 DNA 돌연변이를 포함하고, 산출 대립유전자는 교정된 DNA 서열을 포함한다.
일부 실시양태는 적어도 1개의 프로세서 및 실행되는 경우에 적어도 1개의 프로세서로 하여금 PEgRNA 구조를 결정하기 위한 컴퓨터화 방법을 수행하도록 하는 명령이 코딩된 적어도 1개의 컴퓨터-판독가능 저장 매체를 포함하는 시스템에 관한 것이다.
일부 실시양태는 실행되는 경우에 적어도 1개의 프로세서로 하여금 PEgRNA의 서열을 결정하기 위한 컴퓨터화 방법을 수행하도록 하는 명령이 코딩된 적어도 1개의 컴퓨터-판독가능 저장 매체에 관한 것이다.
일부 실시양태는 PEgRNA를 결정하기 위한 컴퓨터화 방법에 따라 결정된 PEgRNA를 사용하는 염기 편집 방법에 관한 것이다.
치료 PEgRNA
또 다른 측면에서, 본 개시내용은 도 27 및 도 28에 의해 나타내어진 바와 같은, 본원에 개시된 알고리즘을 사용하여 설계된 치료 PEgRNA를 제공한다.
예를 들어, 본원의 개시내용에서 사용될 수 있는 PEgRNA는 도 27에 예시된다. 본 도면은 본원에서 고려되고 실시예 2에 규정된 방법론에 따라 설계될 수 있는 PEgRNA의 실시양태의 구조를 제공한다. PEgRNA는 5'에서 3' 방향으로 정렬된 3종의 주요 성분 요소, 즉: 스페이서, gRNA 코어 및 3' 단부의 연장 아암을 포함한다. 연장 아암은 5'에서 3' 방향으로 하기 구조적 요소, 즉: 프라이머 결합 부위 (A), 편집 주형 (B) 및 상동성 아암 (C)으로 추가로 나뉠 수 있다. 추가로, PEgRNA는 임의적인 3' 단부 변형제 영역 (e1) 및 임의적인 5' 단부 변형제 영역 (e2)을 포함할 수 있다. 또한 추가로, PEgRNA는 PEgRNA의 3' 단부에 전사 종결 신호를 포함할 수 있다 (도시되지 않음). 이들 구조적 요소는 본원에 추가로 정의된다. PEgRNA의 구조의 도시는 제한적인 것으로 의도되지 않고, 요소의 배열에서의 변형을 포괄한다. 예를 들어, 임의적인 서열 변형제 (e1) 및 (e2)는 제시된 임의의 다른 영역 내에 또는 사이에 위치할 수 있고, 3' 및 5' 단부에 위치하는 것으로 제한되지는 않는다. 도 27에 제시된 PEgRNA는 본원에 개시된 알고리즘에 의해 설계될 수 있다.
또 다른 예에서, 도 28은 본원에서 고려되고 실시예 2에 규정된 방법론에 따라 설계될 수 있는 PEgRNA의 또 다른 실시양태의 구조를 제공한다. PEgRNA는 5'에서 3' 방향으로 정렬된 3종의 주요 성분 요소, 즉: 스페이서, gRNA 코어 및 3' 단부의 연장 아암을 포함한다. 연장 아암은 5'에서 3' 방향으로 하기 구조적 요소, 즉: 프라이머 결합 부위 (A), 편집 주형 (B) 및 상동성 아암 (C)으로 추가로 나뉠 수 있다. 추가로, PEgRNA는 임의적인 3' 단부 변형제 영역 (e1) 및 임의적인 5' 단부 변형제 영역 (e2)을 포함할 수 있다. 또한 추가로, PEgRNA는 PEgRNA의 3' 단부에 전사 종결 신호를 포함할 수 있다 (도시되지 않음). 이들 구조적 요소는 본원에 추가로 정의된다. PEgRNA의 구조의 도시는 제한적인 것으로 의도되지 않고, 요소의 배열에서의 변형을 포괄한다. 예를 들어, 임의적인 서열 변형제 (e1) 및 (e2)는 제시된 임의의 다른 영역 내에 또는 사이에 위치할 수 있고, 3' 및 5' 단부에 위치하는 것으로 제한되지는 않는다. 도 27에 제시된 PEgRNA는 본원에 개시된 알고리즘에 의해 설계될 수 있다.
다양한 실시양태에서, 본 개시내용은 클린바 데이터베이스 엔트리에 대해 본원에 개시된 알고리즘을 사용하여 설계된 서열식별번호: 1-135514 및 813085-880462의 치료 PEgRNA를 제공한다.
다양한 다른 실시양태에서, 본원에 개시된 알고리즘을 사용하여 클린바 데이터베이스에 대해 설계된 예시적인 PEgRNA는 본 명세서의 일부를 형성하는 서열 목록에 포함된다. 서열 목록은 서열식별번호: 1-135514 및 813085-880462의 완전한 PEgRNA 서열을 포함한다. 각각의 이들 완전한 PEgRNA는 각각 스페이서 (서열식별번호: 135515-271028 및 880463-947840) 및 연장 아암 (서열식별번호: 271029-406542 및 947841-1015218)으로 구성된다. 추가로, 각각의 PEgRNA는, 예를 들어 서열식별번호: 1361579-1361580에 의해 규정된 gRNA 코어를 포함한다. 서열식별번호: 271029-406542 및 947841-1015218의 연장 아암은 추가로 각각 프라이머 결합 부위 (서열식별번호: 406543-542056 및 1015219-1082596), 편집 주형 (서열식별번호: 542057-677570 및 1082597-1149974) 및 상동성 아암 (서열식별번호: 677571-813084 및 1149975-1217352)으로 구성된다. PEgRNA는 임의로 5' 단부 변형제 영역 및/또는 3' 단부 변형제 영역을 포함할 수 있다. PEgRNA는 또한 PEgRNA의 3'에 역전사 종결 신호 (예를 들어, 서열식별번호: 1361560-1361566)를 포함할 수 있다. 본 출원은 이들 서열 모두의 설계 및 사용을 포괄한다.
다양한 실시양태에서, 프라임 편집제 가이드 RNA는 (a) 가이드 RNA 및 (b) 가이드 RNA의 5' 또는 3' 단부에 또는 가이드 RNA 내의 분자내 위치에 RNA 연장부를 포함하며, 이의 예는 도 3a-c에 도시된다. RNA 연장부는 (i) 목적하는 뉴클레오티드 변화를 포함하는 DNA 합성 주형, (ii) 역전사 프라이머 결합 부위 및 (iii) 임의로 링커 서열을 포함할 수 있다. 다양한 실시양태에서, DNA 합성 주형은 닉 부위에 인접한 내인성 DNA 서열에 상보적인 단일 가닥 DNA 플랩을 코딩하며, 여기서 단일 가닥 DNA 플랩은 목적하는 뉴클레오티드 변화를 포함한다.
다양한 실시양태에서, RNA 연장 아암은 적어도 5개 뉴클레오티드, 적어도 6개 뉴클레오티드, 적어도 7개 뉴클레오티드, 적어도 8개 뉴클레오티드, 적어도 9개 뉴클레오티드, 적어도 10개 뉴클레오티드, 적어도 11개 뉴클레오티드, 적어도 12개 뉴클레오티드, 적어도 13개 뉴클레오티드, 적어도 14개 뉴클레오티드, 적어도 15개 뉴클레오티드, 적어도 16개 뉴클레오티드, 적어도 17개 뉴클레오티드, 적어도 18개 뉴클레오티드, 적어도 19개 뉴클레오티드, 적어도 20개 뉴클레오티드, 적어도 21개 뉴클레오티드, 적어도 22개 뉴클레오티드, 적어도 23개 뉴클레오티드, 적어도 24개 뉴클레오티드 또는 적어도 25개 뉴클레오티드 길이이다.
특정 실시양태에서, 프라임 편집제 가이드 RNA는 서열식별번호: 1361548-1361581의 뉴클레오티드 서열 또는 서열식별번호: 1361548-1361581 중 어느 하나와 적어도 85% 또는 적어도 90% 또는 적어도 95% 또는 적어도 98% 또는 적어도 99% 서열 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열을 포함한다.
일부 실시양태에서, 프라임 편집제 가이드 RNA (PEgRNA)는 서열식별번호: 1361548-1361581의 뉴클레오티드 서열과 비교하여 적어도 1개의 돌연변이를 포함하는, 서열식별번호: 1361548-1361581의 뉴클레오티드 서열의 변이체를 포함한다. 일부 실시양태에서, 변이체는 서열식별번호: 1361548-1361581의 뉴클레오티드 서열과 비교하여 1개 초과 (예를 들어, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20개 또는 그 초과)의 돌연변이를 포함한다.
또 다른 측면에서, 본 개시내용은 가이드 RNA 및 적어도 1개의 RNA 연장부 (즉, 도 27에 따른 연장 아암)를 포함하는 프라임 편집제 가이드 RNA를 제공한다. RNA 연장부는 가이드 RNA의 3' 단부에 위치한다. 다른 실시양태에서, RNA 연장부는 가이드 RNA의 5'에 위치한다. 또 다른 실시양태에서, RNA 연장부는 가이드 RNA 내의 분자내 위치에 위치하며, 바람직하게는 연장된 부분의 분자내 위치는 프로토스페이서의 기능을 방해하지 않는다.
다양한 실시양태에서, 프라임 편집제 가이드 RNA (PEgRNA)는 napDNAbp에 결합할 수 있고 napDNAbp를 표적 DNA 서열로 지시할 수 있다. 표적 DNA 서열은 표적 가닥 및 상보적 비-표적 가닥을 포함할 수 있으며, 여기서 가이드 RNA는 표적 가닥에 혼성화하여 RNA-DNA 하이브리드 및 R-루프를 형성한다.
프라임 편집제 가이드 RNA의 다양한 실시양태에서, 적어도 1개의 RNA 연장부는 DNA 합성 주형을 포함한다. 다양한 다른 실시양태에서, RNA 연장부는 역전사 프라이머 결합 부위를 추가로 포함한다. 또 다른 실시양태에서, RNA 연장부는 RNA 연장부를 가이드 RNA에 연결하는 링커 또는 스페이서를 포함한다.
다양한 실시양태에서, RNA 연장부는 적어도 5개 뉴클레오티드, 적어도 6개 뉴클레오티드, 적어도 7개 뉴클레오티드, 적어도 8개 뉴클레오티드, 적어도 9개 뉴클레오티드, 적어도 10개 뉴클레오티드, 적어도 11개 뉴클레오티드, 적어도 12개 뉴클레오티드, 적어도 13개 뉴클레오티드, 적어도 14개 뉴클레오티드, 적어도 15개 뉴클레오티드, 적어도 16개 뉴클레오티드, 적어도 17개 뉴클레오티드, 적어도 18개 뉴클레오티드, 적어도 19개 뉴클레오티드, 적어도 20개 뉴클레오티드, 적어도 21개 뉴클레오티드, 적어도 22개 뉴클레오티드, 적어도 23개 뉴클레오티드, 적어도 24개 뉴클레오티드, 적어도 25개 뉴클레오티드, 적어도 30개 뉴클레오티드, 적어도 40개 뉴클레오티드, 적어도 50개 뉴클레오티드, 적어도 60개 뉴클레오티드, 적어도 70개 뉴클레오티드, 적어도 80개 뉴클레오티드, 적어도 90개 뉴클레오티드, 적어도 100개 뉴클레오티드, 적어도 150개 뉴클레오티드, 적어도 200개 뉴클레오티드, 적어도 300개 뉴클레오티드, 적어도 400개 뉴클레오티드 또는 적어도 500개 뉴클레오티드 길이일 수 있다.
다른 실시양태에서, DNA 합성 주형 (즉, 도 27에 따른 편집 주형)은 적어도 3개 뉴클레오티드, 적어도 4개 뉴클레오티드, 적어도 5개 뉴클레오티드, 적어도 6개 뉴클레오티드, 적어도 7개 뉴클레오티드, 적어도 8개 뉴클레오티드, 적어도 9개 뉴클레오티드, 적어도 10개 뉴클레오티드, 적어도 11개 뉴클레오티드, 적어도 12개 뉴클레오티드, 적어도 13개 뉴클레오티드, 적어도 14개 뉴클레오티드, 적어도 15개 뉴클레오티드, 적어도 16개 뉴클레오티드, 적어도 17개 뉴클레오티드, 적어도 18개 뉴클레오티드, 적어도 19개 뉴클레오티드, 적어도 20개 뉴클레오티드, 적어도 30개 뉴클레오티드, 적어도 40개 뉴클레오티드, 적어도 50개 뉴클레오티드, 적어도 60개 뉴클레오티드, 적어도 70개 뉴클레오티드, 적어도 80개 뉴클레오티드, 적어도 90개 뉴클레오티드, 적어도 100개 뉴클레오티드, 적어도 200개 뉴클레오티드, 적어도 300개 뉴클레오티드, 적어도 400개 뉴클레오티드 또는 적어도 500개 뉴클레오티드 길이이다.
또 다른 실시양태에서, 역전사 프라이머 결합 부위 서열 (즉, 도 27에 따른 프라이머 결합 부위)은 적어도 3개 뉴클레오티드, 적어도 4개 뉴클레오티드, 적어도 5개 뉴클레오티드, 적어도 6개 뉴클레오티드, 적어도 7개 뉴클레오티드, 적어도 8개 뉴클레오티드, 적어도 9개 뉴클레오티드, 적어도 10개 뉴클레오티드, 적어도 11개 뉴클레오티드, 적어도 12개 뉴클레오티드, 적어도 13개 뉴클레오티드, 적어도 14개 뉴클레오티드, 적어도 15개 뉴클레오티드, 적어도 16개 뉴클레오티드, 적어도 17개 뉴클레오티드, 적어도 18개 뉴클레오티드, 적어도 19개 뉴클레오티드, 적어도 20개 뉴클레오티드, 적어도 30개 뉴클레오티드, 적어도 40개 뉴클레오티드, 적어도 50개 뉴클레오티드, 적어도 60개 뉴클레오티드, 적어도 70개 뉴클레오티드, 적어도 80개 뉴클레오티드, 적어도 90개 뉴클레오티드, 적어도 100개 뉴클레오티드, 적어도 200개 뉴클레오티드, 적어도 300개 뉴클레오티드, 적어도 400개 뉴클레오티드 또는 적어도 500개 뉴클레오티드 길이이다.
다른 실시양태에서, 임의적인 링커 또는 스페이서는 적어도 3개 뉴클레오티드, 적어도 4개 뉴클레오티드, 적어도 5개 뉴클레오티드, 적어도 6개 뉴클레오티드, 적어도 7개 뉴클레오티드, 적어도 8개 뉴클레오티드, 적어도 9개 뉴클레오티드, 적어도 10개 뉴클레오티드, 적어도 11개 뉴클레오티드, 적어도 12개 뉴클레오티드, 적어도 13개 뉴클레오티드, 적어도 14개 뉴클레오티드, 적어도 15개 뉴클레오티드, 적어도 16개 뉴클레오티드, 적어도 17개 뉴클레오티드, 적어도 18개 뉴클레오티드, 적어도 19개 뉴클레오티드, 적어도 20개 뉴클레오티드, 적어도 30개 뉴클레오티드, 적어도 40개 뉴클레오티드, 적어도 50개 뉴클레오티드, 적어도 60개 뉴클레오티드, 적어도 70개 뉴클레오티드, 적어도 80개 뉴클레오티드, 적어도 90개 뉴클레오티드, 적어도 100개 뉴클레오티드, 적어도 200개 뉴클레오티드, 적어도 300개 뉴클레오티드, 적어도 400개 뉴클레오티드 또는 적어도 500개 뉴클레오티드 길이이다.
본원에 개시된 설계된 PEgRNA는 프라임 편집제 융합 단백질과 복합체화될 수 있다.
한 측면에서, 본 명세서는 핵산 프로그램가능한 DNA 결합 단백질 (napDNAbp) 및 리버스 트랜스크립타제를 포함하는 프라이머 편집제 융합 단백질을 제공한다. 다양한 실시양태에서, 융합 단백질은 프라임 편집제 가이드 RNA (PEgRNA)의 존재 하에 표적-프라이밍된 역전사에 의해 게놈 편집을 수행할 수 있다.
일부 실시양태에서, napDNAbp는 Cas9, CasX, CasY, Cpf1, C2c1, C2c2, C2C3 및 아르고노트로 이루어진 군으로부터 선택되고, 임의로 닉카제 활성을 갖는다.
다른 실시양태에서, 융합 단백질은 본원에 기재된 바와 같은 프라임 편집제 가이드 RNA와 복합체화된 경우에 표적 DNA 서열 (예를 들어, 게놈 DNA)에 결합할 수 있다.
또 다른 실시양태에서, 표적 DNA 서열은 표적 가닥 및 상보적 비-표적 가닥을 포함한다.
다른 실시양태에서, 프라임 편집제 가이드 RNA에 복합체화된 융합 단백질의 결합은 R-루프를 형성한다. R-루프는 (i) 프라임 편집제 가이드 RNA 및 표적 가닥을 포함하는 RNA-DNA 하이브리드 및 (ii) 상보적 비-표적 가닥을 포함할 수 있다.
또 다른 실시양태에서, 상보적 비-표적 가닥은 닉킹되어 유리 3' 단부를 갖는 리버스 트랜스크립타제 프라이밍 서열을 형성한다.
또 다른 실시양태에서, 단일 가닥 DNA 플랩은 닉 부위에 인접한 내인성 DNA 서열과 혼성화함으로써, 목적하는 뉴클레오티드 변화를 설치한다. 또 다른 실시양태에서, 단일 가닥 DNA 플랩은 닉 부위에 인접하고 유리 5' 단부를 갖는 내인성 DNA 서열을 대체한다. 일부 실시양태에서, 대체된 5' 단부를 갖는 내인성 DNA는 세포에 의해 절제된다.
다양한 실시양태에서, 단일 가닥 DNA 플랩의 세포 복구는 목적하는 뉴클레오티드 변화의 설치를 유발함으로써, 목적하는 생성물을 형성한다.
다양한 다른 실시양태에서, 목적하는 뉴클레오티드 변화는 PAM 서열의 약 -4 내지 +10인 편집 윈도우에 설치된다.
또 다른 실시양태에서, 목적하는 뉴클레오티드 변화는 닉 부위의 약 -5 내지 +5 뉴클레오티드 또는 닉 부위의 약 -10 내지 +10 또는 닉 부위의 약 -20 내지 +20 또는 닉 부위의 약 -30 내지 +30 또는 닉 부위의 약 -40 내지 +40 또는 닉 부위의 약 -50 내지 +50 또는 닉 부위의 약 -60 내지 +60 또는 닉 부위의 약 -70 내지 +70 또는 닉 부위의 약 -80 내지 +80 또는 닉 부위의 약 -90 내지 +90 또는 닉 부위의 약 -100 내지 +100 또는 닉 부위의 약 -200 내지 +200인 편집 윈도우에 설치된다.
다양한 실시양태에서, napDNAbp는 서열식별번호: 1361421의 아미노산 서열을 포함한다. 다양한 다른 실시양태에서, napDNAbp는 서열식별번호: 1361421-1361484 및 1361593-1361596 중 어느 하나의 아미노산 서열에 대해 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 98% 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 포함한다.
다른 실시양태에서, 본 개시내용의 융합 단백질 및/또는 조성물의 리버스 트랜스크립타제는 서열식별번호: 1361485-1361514 및 1361597-1361598의 아미노산 서열 중 어느 하나를 포함할 수 있다. 또 다른 실시양태에서, 리버스 트랜스크립타제는 서열식별번호: 1361485-1361514 및 1361597-1361598 중 어느 하나의 아미노산 서열에 대해 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 98% 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 이들 서열은, 예를 들어 레트로바이러스 또는 레트로트랜스포손으로부터의 자연 발생 리버스 트랜스크립타제 서열일 수 있거나, 또는 서열은 비-자연 발생 또는 조작될 수 있다.
다양한 다른 실시양태에서, 본원에 개시된 융합 단백질은 다양한 구조적 구성을 포함할 수 있다. 예를 들어, 융합 단백질은 구조 NH2-[napDNAbp]-[리버스 트랜스크립타제]-COOH; 또는 NH2-[리버스 트랜스크립타제]-[napDNAbp]-COOH를 포함할 수 있으며, 여기서 각각의 경우의 "]-["는 임의적인 링커 서열의 존재를 나타낸다.
다양한 실시양태에서, 링커 서열은 서열식별번호: 1361520-1361530, 1361585 및 1361603의 아미노산 서열 또는 서열식별번호: 1361520-1361530, 1361585 및 1361603의 링커 아미노산 서열 중 어느 하나에 대해 적어도 80%, 85% 또는 90% 또는 95% 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 포함한다.
다양한 실시양태에서, 표적 DNA 내로 혼입되는 목적하는 뉴클레오티드 변화는 단일 뉴클레오티드 변화 (예를 들어, 전이 또는 전환), 1개 이상의 뉴클레오티드의 삽입, 1개 이상의 뉴클레오티드의 결실 또는 그의 조합일 수 있다.
특정 경우에, 삽입은 적어도 1개, 적어도 2개, 적어도 3개, 적어도 4개, 적어도 5개, 적어도 6개, 적어도 7개, 적어도 8개, 적어도 9개, 적어도 10개, 적어도 11개, 적어도 12개, 적어도 13개, 적어도 14개, 적어도 15개, 적어도 16개, 적어도 17개, 적어도 18개, 적어도 19개, 적어도 20개, 적어도 30개, 적어도 40개, 적어도 50개, 적어도 60개, 적어도 70개, 적어도 80개, 적어도 90개, 적어도 100개, 적어도 200개, 적어도 300개, 적어도 400개 또는 적어도 500개 뉴클레오티드 길이이다.
특정의 다른 경우에, 결실은 적어도 1개, 적어도 2개, 적어도 3개, 적어도 4개, 적어도 5개, 적어도 6개, 적어도 7개, 적어도 8개, 적어도 9개, 적어도 10개, 적어도 11개, 적어도 12개, 적어도 13개, 적어도 14개, 적어도 15개, 적어도 16개, 적어도 17개, 적어도 18개, 적어도 19개, 적어도 20개, 적어도 30개, 적어도 40개, 적어도 50개, 적어도 60개, 적어도 70개, 적어도 80개, 적어도 90개, 적어도 100개, 적어도 200개, 적어도 300개, 적어도 400개 또는 적어도 500개 뉴클레오티드 길이이다.
프라임 편집제 가이드 RNA의 다양한 실시양태에서, DNA 합성 주형 (즉, 도 27에 따른 편집 주형)은 닉 부위에 인접한 내인성 DNA 서열에 상보적인 단일 가닥 DNA 플랩을 코딩할 수 있으며, 여기서 단일 가닥 DNA 플랩은 목적하는 뉴클레오티드 변화를 포함한다. 단일 가닥 DNA 플랩은 닉 부위에서 내인성 단일 가닥 DNA를 대체할 수 있다. 닉 부위에서 대체된 내인성 단일 가닥 DNA는 5' 단부를 가질 수 있고, 내인성 플랩을 형성할 수 있으며, 이는 세포에 의해 절제될 수 있다. 다양한 실시양태에서, 5' 단부 내인성 플랩의 절제는 생성물 형성을 구동하는 것을 도울 수 있으며, 이는 5' 단부 내인성 플랩의 제거가 단일 가닥 3' DNA 플랩의 상응하는 상보적 DNA 가닥에 대한 혼성화 및 단일 가닥 3' DNA 플랩에 의해 운반된 목적하는 뉴클레오티드 변화의 표적 DNA 내로의 혼입 또는 동화를 촉진하기 때문이다.
프라임 편집제 가이드 RNA의 다양한 실시양태에서, 단일 가닥 DNA 플랩의 세포 복구는 목적하는 뉴클레오티드 변화의 설치를 유발함으로써, 목적하는 생성물을 형성한다.
본 발명의 또 다른 측면에서, 본 명세서는 본원에 기재된 융합 단백질 및 상기 기재된 임의의 프라임 편집제 가이드 RNA (PEgRNA)를 포함하는 복합체를 제공한다.
본 발명의 또 다른 측면에서, 본 명세서는 napDNAbp (예를 들어, Cas9) 및 프라임 편집제 가이드 RNA를 포함하는 복합체를 제공한다. napDNAbp는 Cas9 닉카제 (예를 들어, spCas9)일 수 있거나, 또는 서열식별번호: 1361421의 아미노산 서열 또는 서열식별번호: 1361421-1361484 및 1361593-1361596 중 어느 하나의 아미노산 서열에 대해 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98% 또는 적어도 99% 동일한 아미노산 서열일 수 있다.
복합체를 수반하는 다양한 실시양태에서, 프라임 편집제 가이드 RNA는 napDNAbp를 표적 DNA 서열로 지시할 수 있다. 다양한 실시양태에서, 리버스 트랜스크립타제는 트랜스로 제공될 수 있으며, 즉 복합체 자체와 상이한 공급원으로부터 제공될 수 있다. 예를 들어, 리버스 트랜스크립타제는 복합체를 갖는 동일한 세포에 리버스 트랜스크립타제를 별개로 코딩하는 별개의 벡터를 도입함으로써 제공될 수 있다.
또 다른 측면에서, 본 명세서는 제약 조성물 (예를 들어, 본원에 기재된 융합 단백질, 서열식별번호: 1-135,514의 PEgRNA)을 제공한다. 일부 실시양태에서, 제약 조성물은 napDNAbp, 융합 단백질, 리버스 트랜스크립타제 및 프라임 편집제 가이드 RNA 중 하나 이상을 포함한다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 융합 단백질 및 제약상 허용되는 부형제. 다른 실시양태에서, 제약 조성물은 본원에 기재된 임의의 연장 가이드 RNA 및 제약상 허용되는 부형제를 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 제약 조성물은 본원에 기재된 임의의 연장 가이드 RNA를 본원에 기재된 임의의 융합 단백질 및 제약상 허용되는 부형제와 조합하여 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 제약 조성물은 napDNAbp, 융합 단백질, 리버스 트랜스크립타제 및 프라임 편집제 가이드 RNA 중 하나 이상을 코딩하는 임의의 폴리뉴클레오티드 서열을 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 본원에 개시된 다양한 성분은 1종 이상의 제약 조성물 내로 분리될 수 있다. 예를 들어, 제1 제약 조성물은 융합 단백질 또는 napDNAbp를 포함할 수 있고, 제2 제약 조성물은 리버스 트랜스크립타제를 포함할 수 있고, 제3 제약 조성물은 프라임 편집제 가이드 RNA를 포함할 수 있다.
추가 측면에서, 본 개시내용은 키트를 제공한다. 한 실시양태에서, 키트는 융합 단백질, napDNAbp, 리버스 트랜스크립타제 및 프라임 편집제 가이드 RNA (예를 들어, 서열식별번호: 1-135514 또는 813085-880462 중 어느 것)를 포함한 1종 이상의 성분을 코딩하는 1개 이상의 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 키트는 또한 벡터, 세포, 및 본원에 개시된 임의의 융합 단백질, napDNAbp 또는 리버스 트랜스크립타제를 포함한 폴리펩티드의 단리된 제제를 포함할 수 있다.
또 다른 측면에서, 본 개시내용은 개시된 물질의 PEgRNA 조성물을 사용하는 방법을 제공한다.
한 실시양태에서, 방법은 본원에 개시된 PEgRNA를 사용하여 이중 가닥 DNA에 목적하는 뉴클레오티드 변화를 설치하는 방법에 관한 것이다. 방법은 먼저 이중 가닥 DNA 서열을 본원에 기재된 바와 같은 융합 단백질 및 프라임 편집제 가이드 RNA를 포함하는 복합체와 접촉시키는 것을 포함하며, 여기서 융합 단백질은 napDNAbp 및 리버스 트랜스크립타제를 포함하고, 프라임 편집제 가이드 RNA는 목적하는 뉴클레오티드 변화를 포함하는 DNA 합성 주형을 포함한다. napDNAbp는 이중 가닥 DNA 서열을 비-표적 가닥 상에서 닉킹함으로써, 3' 단부를 갖는 유리 단일 가닥 DNA를 생성한다. 닉킹 후에, 유리 단일 가닥 DNA의 3' 단부는 DNA 합성 주형에 혼성화함으로써, 리버스 트랜스크립타제 도메인을 프라이밍한다. 이어서, 리버스 트랜스크립타제는 3' 단부로부터 DNA 중합을 용이하게 함으로써, 목적하는 뉴클레오티드 변화를 포함하는 단일 가닥 DNA 플랩을 생성한다. 이어서, 단일 가닥 DNA 플랩이 절단 부위에 인접한 내인성 DNA 가닥을 대체함으로써, 이중 가닥 DNA 서열에 목적하는 뉴클레오티드 변화를 설치한다.
다른 실시양태에서, 본 개시내용은 DNA 분자를 핵산 프로그램가능한 DNA 결합 단백질 (napDNAbp) 및 napDNAbp를 표적 유전자좌로 표적화하는 가이드 RNA와 접촉시키는 것을 포함하며, 여기서 가이드 RNA는 적어도 1개의 목적하는 뉴클레오티드 변화를 포함하는 리버스 트랜스크립타제 (RT) 주형 서열을 포함하는 것인, 표적 유전자좌에서 DNA 분자의 뉴클레오티드 서열에 1개 이상의 변화를 도입하는 방법을 제공한다. napDNAbp는 표적 유전자좌에서 DNA 가닥의 3' 단부를 노출시키고 이는 DNA 합성 주형 (예를 들어, RT 주형 서열)에 혼성화하여 역전사를 프라이밍한다. 이어서, DNA 합성 주형 (예를 들어, RT 주형 서열)에 기초하여 적어도 1개의 목적하는 뉴클레오티드 변화를 포함하는 단일 가닥 DNA 플랩이 리버스 트랜스크립타제에 의해 합성되거나 중합된다. 마지막으로, 적어도 1개의 목적하는 뉴클레오티드 변화가 상응하는 내인성 DNA 내로 혼입되어, 표적 유전자좌에서 DNA 분자의 뉴클레오티드 서열에 1개 이상의 변화를 도입한다.
또 다른 실시양태에서, 본 개시내용은 표적 유전자좌에서 DNA 분자를 (i) 핵산 프로그램가능한 DNA 결합 단백질 (napDNAbp) 및 리버스 트랜스크립타제를 포함하는 융합 단백질 및 (ii) 목적하는 뉴클레오티드 변화를 포함하는 RT 주형을 포함하는 가이드 RNA (예를 들어, 서열식별번호: 1-135514 또는 813085-880462 중 어느 것)와 접촉시키는 단계를 포함하며; 이 접촉은 RT 주형의 표적-프라이밍된 역전사를 용이하게 하여 목적하는 뉴클레오티드 변화를 포함하는 단일 가닥 DNA를 생성하고, 목적하는 뉴클레오티드 변화를 DNA 복구 및/또는 복제 과정을 통해 표적 유전자좌에서 DNA 분자 내로 혼입시키는 것인, 표적-프라이밍된 역전사에 의해 표적 유전자좌에서 DNA 분자의 뉴클레오티드 서열에 1개 이상의 변화를 도입하는 방법을 제공한다.
일부 실시양태에서, 내인성 DNA 가닥을 대체하는 단계는 (i) 단일 가닥 DNA 플랩을 절단 부위에 인접한 내인성 DNA 가닥에 혼성화시켜 서열 미스매치를 생성시키는 단계; (ii) 내인성 DNA 가닥을 절제하는 단계; 및 (iii) 미스매치를 복구시켜 DNA의 양쪽 가닥에 목적하는 뉴클레오티드 변화를 포함하는 목적하는 생성물을 형성하는 단계를 포함한다.
본원에 개시된 방법은 뉴클레아제 기능상실 Cas9 (dCas9), Cas9 닉카제 (nCas9) 또는 뉴클레아제 활성 Cas9인 napDNAbp를 갖는 융합 단백질을 포함할 수 있다. 다른 실시양태에서, napDNAbp 및 리버스 트랜스크립타제는 단일 융합 단백질로서 코딩되기 보다는, 별개의 구축물로 제공될 수 있다. 따라서, 일부 실시양태에서, 리버스 트랜스크립타제는 napDNAbp에 대해 트랜스로 (융합 단백질로 보다는) 제공될 수 있다.
방법을 수반하는 다양한 실시양태에서, napDNAbp는 서열식별번호: 1361421 (Cas9)의 아미노산 서열을 포함할 수 있다. napDNAbp는 또한 서열식별번호: 1361421 중 어느 하나의 아미노산 서열에 대해 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 98% 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
방법을 수반하는 다양한 실시양태에서, 리버스 트랜스크립타제는 서열식별번호: 1361485-1361514 및 1361597-1361598의 아미노산 서열 중 어느 하나를 포함할 수 있다. 리버스 트랜스크립타제는 또한 서열식별번호: 1361485-1361514 및 1361597-1361598 중 어느 하나의 아미노산 서열에 대해 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 98% 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
방법은 서열식별번호: 271029-406542 및 947841-1015218의 뉴클레오티드 서열 또는 그에 대해 적어도 80% 또는 적어도 85% 또는 적어도 90% 또는 적어도 95% 또는 적어도 99% 서열 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열을 갖는 연장된 RNA의 사용을 수반할 수 있다.
방법은 3' 단부에 RNA 연장부를 포함하는 프라임 편집제 가이드 RNA의 사용을 포함할 수 있으며, 여기서 RNA 연장부는 DNA 합성 주형을 포함하고, 예를 들어 도 3b에 제시된 PEgRNA (5'에서 3'로 기재된 바와 같은 하기 성분: 스페이서; gRNA 코어; 역전사 주형; 프라이머 결합 부위를 가짐)는 5'에서 3'로 역전사 주형 및 프라이머 결합 부위를 포함하는 연장 아암을 갖는다.
방법은 5' 단부에 RNA 연장부를 포함하는 프라임 편집제 가이드 RNA의 사용을 포함할 수 있으며, 여기서 RNA 연장부는 DNA 합성 주형을 포함하고, 예를 들어 도 3a에 제시된 PEgRNA (5'에서 3'로 기재된 바와 같은 하기 성분: 역전사 주형; 프라이머 결합 부위; 링커; 스페이서; gRNA 코어를 가짐)는 5'에서 3'로 역전사 주형, 프라이머 결합 부위 및 5-20개 뉴클레오티드 길이의 링커를 포함하는 연장 아암을 갖는다.
방법은 가이드 RNA 내의 분자내 위치에 RNA 연장부를 포함하는 프라임 편집제 가이드 RNA의 사용을 포함할 수 있으며, 여기서 RNA 연장부는 DNA 합성 주형을 포함한다.
방법은 적어도 1개, 적어도 2개, 적어도 3개, 적어도 4개, 적어도 5개, 적어도 6개, 적어도 7개, 적어도 8개, 적어도 9개, 적어도 10개, 적어도 11개, 적어도 12개, 적어도 13개, 적어도 14개, 적어도 15개, 적어도 16개, 적어도 17개, 적어도 18개, 적어도 19개, 적어도 20개, 적어도 30개, 적어도 40개, 적어도 50개, 적어도 60개, 적어도 70개, 적어도 80개, 적어도 90개, 적어도 100개, 적어도 200개, 적어도 300개, 적어도 400개 또는 적어도 500개 뉴클레오티드 길이인 1개 이상의 RNA 연장부를 갖는 프라임 편집제 가이드 RNA의 사용을 포함할 수 있다.
상기 개념 및 하기 논의된 추가의 개념은, 본 개시내용이 이와 관련하여 제한되지 않기 때문에, 임의의 적합한 조합으로 배열될 수 있는 것으로 인지되어야 한다. 추가로, 본 개시내용의 다른 이점 및 신규 특색은 첨부 도면과 함께 고려되는 경우에 다양한 비제한적 실시양태의 하기 상세한 설명으로부터 분명해질 것이다.
하기 도면은 본 명세서의 일부를 형성하고, 본 개시내용의 특정 측면을 추가로 입증하기 위해 포함되며, 이는 이들 도면 중 하나 이상을 본원에 제시된 구체적 실시양태의 상세한 설명과 함께 조합하여 참조함으로써 보다 잘 이해될 수 있다.
도 1aa는 프라임 편집제 가이드 RNA와 복합체를 이룬 napDNAbp (예를 들어, Cas9) 단백질에 융합된 리버스 트랜스크립타제를 포함하는 융합 단백질을 사용하여 단일 뉴클레오티드 변화, 삽입 및/또는 결실을 DNA 분자 (예를 들어, 게놈) 내로 도입하기 위한 예시적인 과정의 개략도를 제공한다. 이러한 실시양태에서, 가이드 RNA는 3' 단부에서 연장되어 DNA 합성 주형을 포함한다. 개략도는 가이드 RNA (gRNA)와 복합체를 이룬 Cas9 닉카제에 융합된 리버스 트랜스크립타제 (RT)가 DNA 표적 부위에 결합하고 표적 뉴클레오티드에 인접한 PAM-함유 DNA 가닥을 닉킹하는 방법을 보여준다. RT 주형은 gRNA로부터의 DNA 합성을 위한 프라이머로서 닉킹된 DNA를 사용하며, 이는 목적하는 편집을 코딩하는 새로운 DNA 가닥의 합성을 위한 주형으로서 사용된다. 제시된 편집 과정은 표적-프라이밍된 역전사 편집 (프라임 편집)으로 지칭될 수 있다. 도 1ab는 도 1aa에서와 동일한 표현을 제공하되, 예외로 프라임 편집제 복합체가 보다 일반적으로 [napDNAbp]-[P]:PEgRNA 또는 [P]-[napDNAbp]:PEgRNA로 나타내어지며, 여기서 "P"는 임의의 폴리머라제 (예를 들어, 리버스 트랜스크립타제)를 지칭하고, "napDNAbp"는 핵산 프로그램가능한 DNA 결합 단백질 (예를 들어, SpCas9)을 지칭하고, "PEgRNA"는 프라임 편집 가이드 RNA를 지칭하고, "]-["는 임의적인 링커를 지칭한다. 다른 곳, 예를 들어 도 3a-3g에 기재된 바와 같이, PEgRNA는 프라이머 결합 부위 및 DNA 합성 주형을 포함하는 5' 연장 아암을 포함한다. 제시되지 않았지만, PEgRNA의 연장 아암 (즉, 프라이머 결합 부위 및 DNA 합성 주형을 포함함)은 DNA 또는 RNA일 수 있는 것으로 고려된다. 이 구성에서 고려되는 특정한 폴리머라제는 DNA 합성 주형의 성질에 좌우될 것이다. 예를 들어, DNA 합성 주형이 RNA이면, 폴리머라제는 RNA-의존성 DNA 폴리머라제 (예를 들어, 리버스 트랜스크립타제)이다. DNA 합성 주형이 DNA이면, 폴리머라제는 DNA-의존성 DNA 폴리머라제일 수 있다. 다양한 실시양태에서, PEgRNA는 DNA-기반 DNA 합성 주형이 혼입되도록 조작 또는 합성될 수 있다.
도 1ba는 프라임 편집제 가이드 RNA와 복합체를 이룬 napDNAbp (예를 들어, Cas9)에 융합된 리버스 트랜스크립타제를 포함하는 융합 단백질을 사용하여 단일 뉴클레오티드 변화, 삽입 및/또는 결실을 DNA 분자 (예를 들어, 게놈) 내로 도입하기 위한 예시적인 과정의 개략도를 제공한다. 이러한 실시양태에서, 가이드 RNA는 5' 단부에서 연장되어 DNA 합성 주형을 포함한다. 개략도는 가이드 RNA (gRNA)와 복합체를 이룬 Cas9 닉카제에 융합된 리버스 트랜스크립타제 (RT)가 DNA 표적 부위에 결합하고 표적 뉴클레오티드에 인접한 PAM-함유 DNA 가닥을 닉킹하는 방법을 보여준다. 정규 PAM 서열은 5'-NGG-3'이지만, 상이한 PAM 서열은 상이한 Cas9 단백질 또는 상이한 유기체로부터의 등가의 단백질과 회합될 수 있다. 추가로, 임의의 주어진 Cas9 뉴클레아제, 예를 들어 SpCas9는 단백질의 PAM 특이성을 변경시켜 대안적 PAM 서열을 인식하도록 변형될 수 있다. RT 효소는 gRNA로부터의 DNA 합성을 위한 프라이머로서 닉킹된 DNA를 사용하며, 이는 목적하는 편집을 코딩하는 새로운 DNA 가닥의 합성을 위한 주형으로서 사용된다. 제시된 편집 과정은 표적-프라이밍된 역전사 편집 (TPRT 편집제 또는 프라임 편집제)으로 지칭될 수 있다. 도 1bb는 도 1ba에서와 동일한 표현을 제공하되, 예외로 프라임 편집제 복합체가 보다 일반적으로 [napDNAbp]-[P]:PEgRNA 또는 [P]-[napDNAbp]:PEgRNA로 나타내어지며, 여기서 "P"는 임의의 폴리머라제 (예를 들어, 리버스 트랜스크립타제)를 지칭하고, "napDNAbp"는 핵산 프로그램가능한 DNA 결합 단백질 (예를 들어, SpCas9)을 지칭하고, "PEgRNA"는 프라임 편집 가이드 RNA를 지칭하고, "]-["는 임의적인 링커를 지칭한다. 다른 곳, 예를 들어 도 3a-3g에 기재된 바와 같이, PEgRNA는 프라이머 결합 부위 및 DNA 합성 주형을 포함하는 3' 연장 아암을 포함한다. 제시되지 않았지만, PEgRNA의 연장 아암 (즉, 프라이머 결합 부위 및 DNA 합성 주형을 포함함)은 DNA 또는 RNA일 수 있는 것으로 고려된다. 이 구성에서 고려되는 특정한 폴리머라제는 DNA 합성 주형의 성질에 좌우될 것이다. 예를 들어, DNA 합성 주형이 RNA이면, 폴리머라제는 RNA-의존성 DNA 폴리머라제 (예를 들어, 리버스 트랜스크립타제)이다. DNA 합성 주형이 DNA이면, 폴리머라제는 DNA-의존성 DNA 폴리머라제일 수 있다.
도 1c는 합성된 DNA 단일 가닥 (목적하는 뉴클레오티드 변화를 포함함)이 분해되어 목적하는 뉴클레오티드 변화, 삽입 및/또는 결실이 DNA 내로 혼입되도록 하는 방법의 예시적인 과정을 도시하는 개략도이다. 제시된 바와 같이, 편집된 가닥 (또는 "돌연변이유발 가닥")의 합성 후에, 내인성 가닥과의 평형, 내인성 가닥의 플랩 절단 및 라이게이션은 미스매칭된 DNA 듀플렉스의 분해 후에 내인성 DNA 복구 및/또는 복제 과정의 작용을 통해 DNA 편집의 혼입을 유도한다.
도 1d는 "대향 가닥 닉킹"이 도 1c의 분해 방법 내로 혼입되어 복귀 생성물에 비해 목적하는 생성물의 형성을 구동하는 것을 도울 수 있음을 보여주는 개략도이다. 대향 가닥 닉킹에서, 제2 napDNAbp/gRNA 복합체 (예를 들어, Cas9/gRNA 복합체)를 사용하여, 초기 닉킹된 가닥으로부터의 대향 가닥 상에 제2 닉을 도입한다. 이는 내인성 세포 DNA 복구 및/또는 복제 과정을 유도하여 비편집된 가닥 (즉, 제2 닉 부위를 함유하는 가닥)을 우선적으로 대체한다.
도 1e는 프라임 편집제 가이드 RNA와 복합체화된 핵산 프로그램가능한 DNA 결합 단백질 (napDNAbp) (예를 들어, 프라임 편집)을 사용하여 적어도 1개의 뉴클레오티드 변화 (예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10개 또는 그 초과), 삽입 및/또는 결실을 표적 유전자좌의 DNA 분자 (예를 들어, 게놈) 내로 도입하는 예시적인 방법의 또 다른 개략도를 제공한다. 프라임 편집제 가이드 RNA는 가이드 RNA의 3' 또는 5' 단부에 또는 가이드 RNA 내의 분자내 위치에 연장부를 포함한다. 단계 (a)에서, napDNAbp/gRNA 복합체는 DNA 분자와 접촉하고, gRNA는 napDNAbp가 표적 유전자좌에 결합하도록 가이드한다. 단계 (b)에서, 표적 유전자좌의 DNA 가닥 (R-루프 가닥 또는 PAM-함유 가닥 또는 비-표적 DNA 가닥 또는 프로토스페이서 가닥) 중 하나에 닉을 도입하여 (예를 들어, 뉴클레아제 또는 화학적 작용제에 의해), 표적 유전자좌의 가닥 중 하나에 이용가능한 3' 단부를 생성한다. 특정 실시양태에서, 닉은 R-루프 가닥에 상응하는 DNA의 가닥, 즉 가이드 RNA 서열에 혼성화되지 않는 가닥에서 생성된다. 단계 (c)에서, 3' 단부 DNA 가닥은 역전사를 프라이밍하기 위해 가이드 RNA의 연장된 부분과 상호작용한다. 일부 실시양태에서, 3' 단부 DNA 가닥은 가이드 RNA의 연장된 부분 상의 특이적 프라이머 결합 부위에 혼성화한다. 단계 (d)에서, 프라이밍된 부위의 3' 단부로부터 가이드 RNA의 3' 단부를 향해 DNA의 단일 가닥을 합성하는 리버스 트랜스크립타제가 도입된다. 이는 목적하는 뉴클레오티드 변화 (예를 들어, 단일 또는 다중 염기 변화(들), 삽입(들), 결실(들) 또는 그의 조합)를 포함하는 단일 가닥 DNA 플랩을 형성한다. 단계 (e)에서, napDNAbp 및 가이드 RNA가 방출된다. 단계 (f) 및 (g)는 목적하는 뉴클레오티드 변화가 표적 유전자좌 내로 혼입되도록 하는 단일 가닥 DNA 플랩의 분해에 관한 것이다. 이러한 과정은 3' 단일 가닥 DNA 플랩이 다른 가닥 상의 상보적 서열에 침입하고 혼성화하였을 때 형성되는 상응하는 5' 내인성 DNA 플랩을 제거함으로써, 목적하는 생성물 형성을 향해 구동될 수 있다. 과정은 또한 도 1d에 예시된 바와 같이 제2 가닥 닉킹에 의해 생성물 형성을 향해 구동될 수 있다. 이 과정은 하기 유전자 변화: 전환, 전이, 결실 및 삽입 중 적어도 하나 이상을 도입할 수 있다.
도 1f는 본원에 기재된 표적-프라이밍된 역전사 편집 (프라임 편집) 과정으로 가능한 유전자 변화의 유형을 도시하는 개략도이다. 프라임 편집에 의해 달성가능한 뉴클레오티드 변화의 유형은 결실 (짧은 및 긴 결실 포함), 단일 및/또는 다중 뉴클레오티드 변화, 및 삽입 (짧은 및 긴 삽입 포함)을 포함한다.
도 1g는 프라임 편집제 복합체에 의해 예시된 시간적 제2 가닥 닉킹의 예를 도시하는 개략도이다. 시간적 제2 가닥 닉킹은 목적하는 편집된 생성물의 형성을 용이하게 하기 위한 제2 가닥 닉킹의 변형이다. "시간적"이라는 용어는 목적하는 편집이 편집 가닥에 설치된 후에만 비편집 가닥에 대한 제2-가닥 닉이 발생한다는 사실을 지칭한다. 이는 이중 가닥 DNA 파괴로 이어질 수 있는 양쪽 가닥 상의 공동 닉을 피한다.
도 1h는 napDNAbp (예를 들어, SpCas9 닉카제)를 임의의 프로그램가능한 뉴클레아제 도메인, 예컨대 아연 핑거 뉴클레아제 (ZFN) 또는 전사 활성인자-유사 이펙터 뉴클레아제 (TALEN)로 대체하는, 본원에서 고려되는 프라임 편집의 변형을 도시한다. 따라서, 적합한 뉴클레아제가 반드시 핵산 표적화 분자 (예컨대 가이드 RNA)에 의해 "프로그램화"될 필요는 없고, 오히려 DNA-결합 도메인, 예컨대 특히 뉴클레아제의 특이성을 규정함으로써 프로그램화될 수 있는 것으로 고려된다. napDNAbp 모이어티를 사용한 프라임 편집에서와 같이, 이러한 대안적 프로그램가능한 뉴클레아제는 표적 DNA의 1개의 가닥만이 절단되도록 변형되는 것이 바람직하다. 다시 말해서, 프로그램가능한 뉴클레아제는 바람직하게는 닉카제로서 기능해야 한다. 프로그램가능한 뉴클레아제 (예를 들어, ZFN 또는 TALEN)가 선택되면, 추가의 기능성을 시스템 내로 조작하여 그가 프라임 편집-유사 메카니즘에 따라 작동하도록 할 수 있다. 예를 들어, 프로그램가능한 뉴클레아제는 RNA 또는 DNA 연장 아암을 그에 (예를 들어, 화학적 링커를 통해) 커플링시킴으로써 변형될 수 있으며, 여기서 연장 아암은 프라이머 결합 부위 (PBS) 및 DNA 합성 주형을 포함한다. 프로그램가능한 뉴클레아제는 또한 폴리머라제에 (예를 들어, 화학적 또는 아미노산 링커를 통해) 커플링될 수 있으며, 이의 성질은 연장 아암이 DNA인지 또는 RNA인지에 좌우될 것이다. RNA 연장 아암의 경우에, 폴리머라제는 RNA-의존성 DNA 폴리머라제 (예를 들어, 리버스 트랜스크립타제)일 수 있다. DNA 연장 아암의 경우에, 폴리머라제는 DNA-의존성 DNA 폴리머라제 (예를 들어, Pol I, Pol II 또는 Pol III를 포함한 원핵 폴리머라제, 또는 Pol a, Pol b, Pol g, Pol d, Pol e 또는 Pol z를 포함한 진핵 폴리머라제)일 수 있다. 시스템은 또한 프로그램가능한 뉴클레아제에 대한 융합체로서 부가되거나 또는 트랜스로 부가되어 반응을 전체로서 용이하게 하기 위한 다른 기능성을 포함할 수 있다 (예를 들어, (a) 절단 부위에서 DNA를 풀어내어 3' 단부를 갖는 절단 가닥을 프라이머로서 이용가능하게 만드는 헬리카제, (b) 절단 가닥 상의 내인성 가닥을 제거하도록 도와 합성된 가닥으로 내인성 가닥을 대체하는 쪽으로 반응을 구동하는 FEN1, 또는 (c) 대향 가닥 상에 제2 부위 닉을 생성하여, 비-편집된 가닥의 선호되는 세포 복구를 통해 합성 복구의 통합을 구동하는 것을 도울 수 있는 nCas9:gRNA 복합체). napDNAbp에 의한 프라임 편집과 유사한 방식으로, 그 외의 다른 프로그램가능한 뉴클레아제를 갖는 이러한 복합체를 사용하여 관심 편집을 보유하는 DNA의 새로 합성된 대체 가닥을 합성한 다음, DNA의 표적 부위 내로 영구적으로 설치할 수 있다.
도 1i는, 한 실시양태에서, 프라임 편집에 의해 편집될 수 있는 표적 DNA의 해부학적 특색을 도시한다. 표적 DNA는 "비-표적 가닥" 및 "표적 가닥"을 포함한다. 표적-가닥은 PAM 부위 (이 경우에, 정규 SpCas9-기반 프라임 편집제에 의해 인식되는 NGG)를 인식하는 프라임 편집제 복합체의 PEgRNA의 스페이서에 어닐링되는 가닥이다. 표적 가닥은 또한 "비-PAM 가닥" 또는 "비-편집 가닥"으로 지칭될 수 있다. 대조적으로, 비-표적 가닥 (즉, 프로토스페이서 및 NGG의 PAM 서열을 함유하는 가닥)은 "PAM-가닥" 또는 "편집 가닥"으로 지칭될 수 있다. 다양한 실시양태에서, PE 복합체의 닉 부위는 PAM-가닥 상의 프로토스페이서 내에 존재할 것이다 (예를 들어, SpCas9-기반 PE에 의한 경우). 닉의 위치는 PE를 형성하는 특정한 Cas9의 특징일 것이다. 예를 들어, SpCas9-기반 PE에 의한 경우에, 포스포디에스테르 결합 내의 닉 부위는 염기 3 (PAM 서열의 위치 1에 대해 "-3" 위치)과 4 (PAM 서열의 위치 1에 대해 "-4" 위치) 사이이다. 프로토스페이서 내의 닉 부위는 유리 3' 히드록실 기를 형성하고, 이는 하기 도면에서 보이는 바와 같이, PEgRNA의 연장 아암의 프라이머 결합 부위와 복합체화되고, PEgRNA의 연장 아암의 DNA 합성 주형에 의한 DNA 코드의 단일 가닥의 중합을 시작하는 기질을 제공한다. 이 중합 반응은 5'에서 3' 방향으로 PE 융합 단백질의 폴리머라제 (예를 들어, 리버스 트랜스크립타제)에 의해 촉매된다. 중합은 gRNA 코어에 도달하기 전에 종결되어 (예를 들어, 중합 종결 신호, 또는 PE의 중합 활성을 종결시키는 기능을 하는 2차 구조의 포함에 의해), 닉킹된 PAM 가닥의 원래 3' 히드록실 기로부터 연장된 단일 가닥 DNA 플랩을 생성한다. DNA 합성 주형은 PAM 가닥 상의 닉 부위에 바로 이어지는 DNA의 내인성 5'-단부 단일 가닥에 상동인 단일 가닥 DNA를 코딩하고, 목적하는 뉴클레오티드 변화 (예를 들어, 단일 염기 치환, 삽입, 결실, 역위)를 포함한다. 목적하는 편집의 위치는 PAM 가닥 상의 닉 부위의 하류에 하기 임의의 위치에 있을 수 있으며, 이는 (닉 부위의 하류 위치에 대해) 위치 +1, +2, +3, +4 (PAM 부위의 시작), +5 (PAM 부위의 위치 2), +6 (PAM 부위의 위치 3), +7, +8, +9, +10, +11, +12, +13, +14, +15, +16, +17, +18, +19, +20, +21, +22, +23, +24, +25, +26, +27, +28, +29, +30, +31, +32, +33, +34, +35, +36, +37, +38, +39, +40, +41, +42, +43, +44, +45, +46, +47, +48, +49, +50, +51, +52, +53, +54, +55, +56, +57, +58, +59, +60, +61, +62, +63, +64, +65, +66, +67, +68, +69, +70, +71, +72, +73, +74, +75, +76, +77, +78, +79, +80, +81, +82, +83, +84, +85, +86, +87, +88, +89, +90, +91, +92, +93, +94, +95, +96, +97, +98, +99, +100, +101, +102, +103, +104, +105, +106, +107, +108, +109, +110, +111, +112, +113, +114, +115, +116, +117, +118, +119, +120, + 121, +122, +123, +124, +125, +126, +127, +128, +129, +130, +131, +132, +133, +134, +135, +136, +137, +138, +139, +140, +141, +142, +143, +144, +145, +146, +147, +148, +149 또는 +150 또는 그 초과를 포함할 수 있다. 3' 단부 단일 가닥 DNA (관심 편집을 함유함)가 내인성 5' 단부 단일 가닥 DNA를 대체하면, DNA 복구 및 복제 과정은 PAM 가닥 상의 편집 부위의 영구적 설치, 및 이어서 편집 부위에 존재할 비-PAM 가닥 상의 미스매치의 교정을 유발할 것이다. 이러한 방식으로, 편집은 표적 DNA 부위 상의 DNA 양쪽 가닥으로 연장될 것이다. "편집된 가닥" 및 "비-편집된" 가닥에 대한 언급은 단지 PE 메카니즘에 수반되는 DNA의 가닥을 서술하도록 의도되는 것으로 인지될 것이다. "편집된 가닥"은 닉 부위의 바로 하류의 5' 단부 단일 가닥 DNA를 목적하는 편집을 함유하는 합성된 3' 단부 단일 가닥 DNA로 대체함으로써 처음 편집되는 가닥이다. "비-편집된" 가닥은 편집된 가닥과의 가닥 쌍이지만, 이는 또한 그 자체가 복구 및/또는 복제를 통해 편집되어 편집된 가닥, 특히 관심 편집에 상보적이 된다.
도 1j는 표적 DNA, 프라임 편집제 복합체의 해부학적 특색 및 PEgRNA와 표적 DNA 사이의 상호작용을 보여주는 프라임 편집의 메카니즘을 도시한다. 먼저, 폴리머라제 (예를 들어, 리버스 트랜스크립타제) 및 napDNAbp (예를 들어, SpCas9 닉카제, 예를 들어 HNH 뉴클레아제 도메인 내의 탈활성화 돌연변이 (예를 들어, H840A) 또는 RuvC 뉴클레아제 도메인 내의 탈활성화 돌연변이 (D10A)를 갖는 SpCas9)를 갖는 융합 단백질을 포함하는 프라임 편집제는 편집될 표적 DNA를 갖는 DNA 및 PEgRNA와 복합체화된다. PEgRNA는 스페이서, gRNA 코어 (일명 gRNA 스캐폴드 또는 gRNA 백본) (이는 napDNAbp에 결합함), 및 연장 아암을 포함한다. 연장 아암은 3' 단부, 5' 단부 또는 PEgRNA 분자 내의 어딘가에 있을 수 있다. 제시된 바와 같이, 연장 아암은 PEgRNA의 3' 단부에 있다. 연장 아암은 3'에서 5' 방향으로 프라이머 결합 부위 및 DNA 합성 주형 (관심 편집 및 PAM 가닥 상의 닉 부위에 바로 이어지는 5' 단부 단일 가닥 DNA와 상동인 상동성의 영역 (즉, 상동성 아암) 둘 다를 포함함)을 포함한다. 제시된 바와 같이, 닉이 도입되어 닉 부위의 바로 상류에 유리 3' 히드록실 기를 생성하면, PAM 가닥 상의 닉 부위의 바로 상류에 있는 영역은 "프라이머 결합 부위"로 지칭되는 연장 아암의 3' 단부에서 상보적 서열에 어닐링되어, 이용가능한 3' 히드록실 단부를 갖는 짧은 이중 가닥 영역을 생성하고, 이는 프라임 편집제 복합체의 폴리머라제에 대한 기질을 형성한다. 이어서, 폴리머라제 (예를 들어, 리버스 트랜스크립타제)는 3' 히드록실 단부로부터 연장 아암의 단부까지 DNA의 가닥으로서 중합시킨다. 단일 가닥 DNA의 서열은 새로운 DNA를 합성하기 위해 폴리머라제에 의해 "판독"되는 연장 아암의 부분 (즉, 프라이머 결합 부위 제외)인 DNA 합성 주형에 의해 코딩된다. 이러한 중합은 초기 닉 부위의 원래 3' 히드록실 단부의 서열을 효과적으로 연장시킨다. DNA 합성 주형은 목적하는 편집뿐만 아니라 PAM 가닥 상의 닉 부위의 바로 하류의 DNA의 내인성 단일 가닥에 상동인 영역을 포함하는 DNA의 단일 가닥을 코딩한다. 다음으로, DNA의 코딩된 3' 단부 단일 가닥 (즉, 3' 단일 가닥 DNA 플랩)은 PAM 가닥 상의 닉 부위의 바로 하류의 DNA의 상응하는 상동 내인성 5'-단부 단일 가닥을 대체하여, 5'-단부 단일 가닥 DNA 플랩을 갖는 DNA 중간체를 형성하고, 이는 세포에 의해 (예를 들어, 플랩 엔도뉴클레아제에 의해) 제거된다. 내인성 5'-단부 단일 가닥 DNA 플랩의 상보체에 어닐링하는 3'-단부 단일 가닥 DNA 플랩은 5' DNA 플랩이 제거된 후에 내인성 가닥에 라이게이션된다. 이제 어닐링되고 라이게이션된 3' 단부 단일 가닥 DNA 플랩 내의 목적하는 편집은 상보체 가닥과의 미스매치를 형성하며, 이는 DNA 복구 및/또는 복제 라운드를 겪음으로써, 양쪽 가닥 상에 목적하는 편집을 영구적으로 설치한다.
도 2는 시험될 3종의 Cas 복합체 및 그의 PAM, gRNA 및 DNA 절단 특색을 보여준다. 도면은 SpCas9, SaCas9 및 LbCas12a를 포함하는 복합체에 대한 설계를 보여준다.
도 3a-3c는 조작된 5' 연장된 gRNA (도 3a), 3' 연장된 gRNA (도 3b) 및 분자내 연장부 (도 3c)에 대한 설계를 보여주며, 이들 각각은 프라임 편집에 사용될 수 있다. 실시양태는 3', 5' 및 분자내 연장된 gRNA의 연장된 부분에서의 DNA 합성 주형, 프라이머 결합 부위 및 임의적인 링커 서열의 예시적인 배열, 뿐만 아니라 프로토스페이서 및 코어 영역의 배열을 도시한다. 개시된 TPRT 과정은 프라임 편집제 가이드 RNA의 이들 구성으로 제한되지 않는다.
도 4a-4e는 시험관내 TPRT 검정을 나타낸다. 도 4a는 RT 효소에 의한 형광 표지된 DNA 기질 gRNA 주형화된 연장, 리버스 트랜스크립타제 생성물의 폴리아크릴아미드 겔 전기영동 (PAGE) 검정의 개략도이다. 도 4b는 사전-닉킹된 기질, dCas9 및 편집 주형 길이가 상이한 5'-연장된 gRNA를 사용한 TPRT를 보여준다. 도 4c는 Cas9의 부재 하에 사전-닉킹된 DNA 기질과의 RT 반응을 보여준다. 도 4d는 Cas9 (H840A) 및 5'-연장된 gRNA를 사용한 전체 dsDNA 기질에 대한 TPRT를 보여준다. 도 4e는 사전-닉킹된 및 전체 dsDNA 기질을 사용한 3'-연장된 gRNA 주형을 보여준다. 모든 반응은 M-MLV RT에 의한다.
도 5는 편집 주형 길이가 다양한 5'-연장된 gRNA를 사용한 시험관내 검증을 보여준다. 형광 표지된 (Cy5) DNA 표적을 기질로서 사용하고, 이 실험 세트에서 사전-닉킹하였다. 이들 실험에 사용된 Cas9는 촉매 기능상실 Cas9 (dCas9)이고, 사용된 RT는 슈퍼스크립트 III이며, 이는 몰로니-뮤린 백혈병 바이러스 (M-MLV)로부터 유래된 상업적으로 입수가능한 RT이다. dCas9:gRNA 복합체를 정제된 성분으로부터 형성하였다. 이어서, 형광 표지된 DNA 기질을 dNTP 및 RT 효소와 함께 첨가하였다. 37℃에서 1시간의 인큐베이션 후에, 반응 생성물을 변성 우레아-폴리아크릴아미드 겔 전기영동 (PAGE)에 의해 분석하였다. 겔 영상은 원래 DNA 가닥이 역전사 주형의 길이와 일치하는 길이로 연장된 것을 보여준다.
도 6은 편집 주형 길이가 다양한 5'-연장된 gRNA를 사용한 시험관내 검증을 보여주며, 이는 도 5에 제시된 것과 밀접하게 유사하다. 그러나, DNA 기질은 이 실험 세트에서 사전-닉킹되지 않는다. 이들 실험에 사용된 Cas9는 Cas9 닉카제 (SpyCas9 H840A 돌연변이체)이고, 사용된 RT는 슈퍼스크립트 III이며, 이는 몰로니-뮤린 백혈병 바이러스 (M-MLV)로부터 유래된 상업적으로 입수가능한 RT이다. 반응 생성물을 변성 우레아-폴리아크릴아미드 겔 전기영동 (PAGE)에 의해 분석하였다. 겔에 제시된 바와 같이, 닉카제는 표준 gRNA가 사용되는 경우에 DNA 가닥을 효율적으로 절단한다 (gRNA_0, 레인 3).
도 7은 3' 연장이 DNA 합성을 지지하고 Cas9 닉카제 활성에 유의하게 영향을 미치지 않는다는 것을 나타낸다. 사전-닉킹된 기질 (흑색 화살표)은 dCas9 또는 Cas9 닉카제가 사용될 때 RT 생성물로 거의-정량적으로 전환된다 (레인 4 및 5). RT 생성물 (적색 화살표)로의 50% 초과의 전환이 전체 기질 (레인 3)에서 관찰된다. Cas9 닉카제 (SpyCas9 H840A 돌연변이체), 촉매 기능상실 Cas9 (dCas9) 및 슈퍼스크립트 III (몰로니-뮤린 백혈병 바이러스 (M-MLV)로부터 유래된 상업적으로 입수가능한 RT)을 사용하였다.
도 8은 RT 반응이 시스의 gRNA (동일한 복합체에 결합됨)와 우선적으로 발생하는지 여부를 결정하는데 사용된 이중 색상 실험을 나타낸다. 5'-연장된 및 3'-연장된 gRNA에 대해 2개의 별개의 실험을 수행하였다. 생성물을 PAGE에 의해 분석하였다. 생성물 비는 (Cy3시스/Cy3트랜스)/(Cy5트랜스/Cy5시스)로서 계산하였다.
도 9a-9d는 플랩 모델 기질을 나타낸다. 도 9a는 플랩-지정 돌연변이유발을 위한 이중-FP 리포터를 보여준다. 도 9b는 HEK 세포에서의 정지 코돈 복구를 보여준다. 도 9c는 플랩 복구 후 서열분석된 효모 클론을 보여준다. 도 9d는 인간 세포에서의 상이한 플랩 특색의 시험을 보여준다.
도 10은 플라스미드 기질에 대한 프라임 편집을 나타낸다. 효모 (에스. 세레비지아에(S. cerevisiae)) 발현을 위해 이중-형광 리포터 플라스미드를 구축하였다. 효모에서의 이러한 구축물의 발현은 GFP만을 생성한다. 시험관내 TRT 반응은 점 돌연변이를 도입하고, 모 플라스미드 또는 시험관내 Cas9(H840A) 닉킹된 플라스미드를 효모 내로 형질전환시킨다. 콜로니가 형광 영상화에 의해 가시화된다. 효모 이중-FP 플라스미드 형질전환체가 제시된다. 모 플라스미드 또는 시험관내 Cas9 (H840A) 닉킹된 플라스미드를 형질전환시키는 것은 녹색 GFP 발현 콜로니만을 생성한다. 5'-연장된 또는 3'-연장된 gRNA와의 TRT 반응은 녹색 및 황색 콜로니의 혼합을 생산한다. 후자는 GFP 및 mCherry 둘 다를 발현한다. 더 많은 황색 콜로니가 3'-연장된 gRNA에서 관찰된다. 정지 코돈을 함유하지 않는 양성 대조군이 또한 제시된다.
도 11은 도 10에서의 실험과 유사한 플라스미드 기질에 대한 프라임 편집을 보여주지만, 정지 코돈에 점 돌연변이를 설치하는 대신에, 프라임 편집은 프레임시프트 돌연변이를 복구하고 하류 mCherry의 합성을 가능하게 하는 단일 뉴클레오티드 삽입 (좌측) 또는 결실 (우측)을 설치한다. 실험 둘 다는 3' 연장된 gRNA를 사용하였다.
도 12는 생어 서열분석에 의해 특징화된, 플라스미드 기질에 대한 프라임 편집의 편집 생성물을 보여준다. TRT 형질전환으로부터의 개별 콜로니를 선택하고, 생어 서열분석에 의해 분석하였다. 정확한 편집은 선택 콜로니를 서열분석함으로써 관찰되었다. 녹색 콜로니는 원래 DNA 서열을 갖는 플라스미드를 함유한 반면, 황색 콜로니는 프라임 편집 gRNA에 의해 설계된 정확한 돌연변이를 함유하였다. 다른 점 돌연변이 또는 indel은 관찰되지 않았다.
도 13은 새로운 프라임 편집 기술에 대한 잠재적 범주가 제시되고 데아미나제-매개 염기 편집제 기술과 비교된다는 것을 보여준다.
도 14는 인간 세포에서의 편집의 개략도를 보여준다.
도 15는 gRNA에서의 프라이머 결합 부위의 연장을 나타낸다.
도 16은 인접한 표적화를 위한 말단절단된 gRNA를 보여준다.
도 17a-17c는 인간 배아 신장 (HEK) 세포에서의 성분의 형질감염 후 표적 뉴클레오티드에서의 % T에서 A로의 전환을 나타내는 그래프이다. 도 17a는 Cas9 (H840A) 닉카제에 대한 야생형 MLV 리버스 트랜스크립타제의 N-말단 융합체 (32개-아미노산 링커)를 사용한 결과를 제시하는 데이터를 보여준다. 도 17b는 도 17a와 유사하지만, RT 효소의 C-말단 융합체에 대한 것이다. 도 17c는 도 17a와 유사하지만, MLV RT와 Cas9 사이의 링커가 32개 아미노산 대신 60개 아미노산 길이이다.
도 18은 고처리량 앰플리콘 서열분석에 의한 HEK3 부위에서의 고순도 T에서 A로의 편집을 보여준다. 서열분석 분석의 결과는 편집된 세포의 가장 풍부한 유전자형을 디스플레이한다.
도 19는 indel 비율 (각각의 막대 쌍의 우측 막대)과 함께 표적 뉴클레오티드에서의 편집 효율 (각각의 막대 쌍의 좌측 막대)을 보여준다. WT는 야생형 MLV RT 효소를 지칭한다. 돌연변이체 효소 (M1 내지 M4)는 우측에 열거된 돌연변이를 함유한다. 편집 비율을 게놈 DNA 앰플리콘의 고처리량 서열분석에 의해 정량화하였다.
도 20은 단일 가닥 닉이 표적 뉴클레오티드에 근접하여 상보적 DNA 가닥에 도입된 경우의 표적 뉴클레오티드의 편집 효율을 보여준다. 표적 뉴클레오티드로부터 다양한 거리에서의 닉킹을 시험하였다 (오렌지색 삼각형). 표적 염기 쌍에서의 편집 효율 (청색 막대)이 indel 형성 비율 (오렌지색 막대)과 함께 제시된다. "부재" 예는 상보적 가닥 닉킹 가이드 RNA를 함유하지 않는다. 편집 비율을 게놈 DNA 앰플리콘의 고처리량 서열분석에 의해 정량화하였다.
도 21은 목적하는 T에서 A로의 전환 돌연변이 및 다른 주요 게놈 편집 부산물의 일반적 부재를 보여주는 프로세싱된 고처리량 서열분석 데이터를 나타낸다.
도 22는 프라임 편집제 가이드 RNA와 복합체화된 핵산 프로그램가능한 DNA 결합 단백질 (napDNAbp)을 사용하여 표적 유전자좌 상에서 오류-유발 리버스 트랜스크립타제에 의해 표적화된 돌연변이유발을 수행하기 위한 예시적인 과정의 개략도를 제공한다. 이 과정은 표적화된 돌연변이유발을 위한 프라임 편집의 실시양태로 지칭될 수 있다. 프라임 편집제 가이드 RNA는 가이드 RNA의 3' 또는 5' 단부에 또는 가이드 RNA 내의 분자내 위치에 연장부를 포함한다. 단계 (a)에서, napDNAbp/gRNA 복합체는 DNA 분자와 접촉하고, gRNA는 napDNAbp가 돌연변이유발될 표적 유전자좌에 결합하도록 가이드한다. 단계 (b)에서, 표적 유전자좌의 DNA의 가닥 중 하나에 닉을 도입하여 (예를 들어, 뉴클레아제 또는 화학적 작용제에 의해), 표적 유전자좌의 가닥 중 하나에 이용가능한 3' 단부를 생성한다. 특정 실시양태에서, 닉은 R-루프 가닥에 상응하는 DNA의 가닥, 즉 가이드 RNA 서열에 혼성화되지 않는 가닥에서 생성된다. 단계 (c)에서, 3' 단부 DNA 가닥은 역전사를 프라이밍하기 위해 가이드 RNA의 연장된 부분과 상호작용한다. 일부 실시양태에서, 3' 단부 DNA 가닥은 가이드 RNA의 연장된 부분 상의 특이적 프라이머 결합 부위에 혼성화한다. 단계 (d)에서, DNA의 돌연변이유발된 단일 가닥을 프라이밍된 부위의 3' 단부로부터 가이드 RNA의 3' 단부를 향해 합성하는 오류-유발 리버스 트랜스크립타제가 도입된다. 예시적인 돌연변이는 별표 "*"로 표시된다. 이는 목적하는 돌연변이유발된 영역을 포함하는 단일 가닥 DNA 플랩을 형성한다. 단계 (e)에서, napDNAbp 및 가이드 RNA가 방출된다. 단계 (f) 및 (g)는 목적하는 돌연변이유발된 영역이 표적 유전자좌 내로 혼입되도록 하는 단일 가닥 DNA 플랩 (돌연변이유발된 영역을 포함함)의 분해에 관한 것이다. 이러한 과정은 3' 단일 가닥 DNA 플랩이 다른 가닥 상의 상보적 서열에 침입하고 혼성화하였을 때 형성되는 상응하는 5' 내인성 DNA 플랩을 제거함으로써, 목적하는 생성물 형성을 향해 구동될 수 있다. 과정은 또한 도 1d에 예시된 바와 같이 제2 가닥 닉킹에 의해 생성물 형성을 향해 구동될 수 있다. 내인성 DNA 복구 및/또는 복제 과정 후에, 돌연변이유발된 영역은 DNA 유전자좌의 DNA의 양쪽 가닥 내로 혼입된다.
도 23은 트리뉴클레오티드 반복 서열을 축소시키기 위한 gRNA 설계 및 TPRT 게놈 편집에 의한 트리뉴클레오티드 반복부 축소의 개략도이다. 트리뉴클레오티드 반복부 확장은 헌팅톤병, 유약 X 증후군 및 프리드라이히 운동실조를 포함한 다수의 인간 질환과 연관된다. 가장 흔한 트리뉴클레오티드 반복부는 CAG 트리플렛을 함유하지만, GAA 트리플렛 (프리드라이히 운동실조) 및 CGG 트리플렛 (유약 X 증후군)이 또한 발생한다. 확장에 대한 소인이 유전되거나 또는 이미 확장된 모 대립유전자를 획득하는 것은 질환을 획득할 가능성을 증가시킨다. 병원성 트리뉴클레오티드 반복부 확장은 프라임 편집을 사용하여 가설적으로 교정될 수 있다. 반복 영역의 상류 영역은 RNA-가이드된 뉴클레아제에 의해 닉킹되고, 이어서 건강한 수의 반복부 (이는 특정한 유전자 및 질환에 의존함)를 함유하는 새로운 DNA 가닥의 합성을 프라이밍하는데 사용될 수 있다. 반복 서열 후에, 반복부의 다른 단부 (적색 가닥)에 인접한 서열의 정체에 매칭되는 짧은 상동성 스트레치가 부가된다. 새로 합성된 가닥의 침입 및 내인성 DNA의 새로 합성된 플랩으로의 후속 대체는 축소된 반복 대립유전자를 유도한다.
도 24는 프라임 편집에 의한 정확한 10개-뉴클레오티드 결실을 보여주는 개략도이다. HEK3 유전자좌를 표적화하는 가이드 RNA를 닉 부위 뒤 10개-뉴클레오티드 결실을 코딩하는 역전사 주형으로 설계하였다. 형질감염된 HEK 세포에서의 편집 효율을 앰플리콘 서열분석을 사용하여 평가하였다.
도 25는 내인성 게놈 유전자좌에서의 펩티드 태그부착 유전자에 대한 gRNA 설계 및 TPRT 게놈 편집에 의한 펩티드 태그부착을 보여주는 개략도이다. FlAsH 및 ReAsH 태그부착 시스템은 다음 2가지 부분을 포함한다: (1) 형광단-이중비소 프로브 및 (2) 서열 FLNCCPGCCMEP (서열식별번호: 1361586)에 의해 예시되는 테트라시스테인 모티프를 함유하는 유전자 코딩된 펩티드. 세포 내에서 발현되는 경우에, 테트라시스테인 모티프를 함유하는 단백질은 형광단-비소 프로브로 형광 표지될 수 있다 (참고문헌: [J. Am. Chem. Soc., 2002, 124 (21), pp 6063-6076. DOI: 10.1021/ja017687n] 참조). "소르태깅(sortagging)" 시스템은 표지된 펩티드 프로브를 적합한 펩티드 기질을 함유하는 단백질에 공유 접합시키는 박테리아 소르타제 효소를 사용한다 (참고문헌: [Nat. Chem. Biol. 2007 Nov;3(11):707-8. DOI: 10.1038/nchembio.2007.31] 참조). FLAG-태그 (DYKDDDDK (서열식별번호: 1361587)), V5-태그 (GKPIPNPLLGLDST (서열식별번호: 1361588)), GCN4-태그 (EELLSKNYHLENEVARLKK (서열식별번호: 1361589)), HA-태그 (YPYDVPDYA (서열식별번호: 1361590)) 및 Myc-태그 (EQKLISEEDL (서열식별번호: 1361591))는 면역검정을 위한 에피토프 태그로서 통상적으로 사용된다. 파이-클램프는 펜타플루오로-방향족 기질로 표지될 수 있는 펩티드 서열 (FCPF (서열식별번호: 1361592))을 코딩한다 (참고문헌: [Nat. Chem. 2016 Feb;8(2):120-8. doi: 10.1038/nchem.2413]).
도 26은 His6-태그 및 FLAG-태그의 게놈 DNA 내로의 정확한 설치를 보여준다. HEK3 유전자좌를 표적화하는 가이드 RNA를 18-nt His-태그 삽입 또는 24-nt FLAG-태그 삽입을 코딩하는 역전사 주형으로 설계하였다. 형질감염된 HEK 세포에서의 편집 효율을 앰플리콘 서열분석을 사용하여 평가하였다. FLAG-태그의 전체 24-nt 서열은 보이는 프레임의 외부에 있다는 것을 주목한다 (서열분석으로 전체 및 정확한 삽입을 확인함).
도 27은 본원에서 고려되고 실시예 2에 규정된 방법론에 따라 설계될 수 있는 PEgRNA의 실시양태의 구조를 제공한다. PEgRNA는 5'에서 3' 방향으로 정렬된 3종의 주요 성분 요소, 즉: 스페이서, gRNA 코어 및 3' 단부의 연장 아암을 포함한다. 연장 아암은 5'에서 3' 방향으로 하기 구조적 요소, 즉: 프라이머 결합 부위 (A), 편집 주형 (B) 및 상동성 아암 (C)으로 추가로 나뉠 수 있다. 추가로, PEgRNA는 임의적인 3' 단부 변형제 영역 (e1) 및 임의적인 5' 단부 변형제 영역 (e2)을 포함할 수 있다. 또한 추가로, PEgRNA는 PEgRNA의 3' 단부에 전사 종결 신호를 포함할 수 있다 (도시되지 않음). 이들 구조적 요소는 본원에 추가로 정의된다. PEgRNA의 구조의 도시는 제한적인 것으로 의도되지 않고, 요소의 배열에서의 변형을 포괄한다. 예를 들어, 임의적인 서열 변형제 (e1) 및 (e2)는 제시된 임의의 다른 영역 내에 또는 사이에 위치할 수 있고, 3' 및 5' 단부에 위치하는 것으로 제한되지는 않는다. PEgRNA는, 특정 실시양태에서, 2차 RNA 구조, 예컨대 비제한적으로 헤어핀, 스템/루프, 토 루프, RNA-결합 단백질 동원 도메인 (예를 들어, MS2cp 단백질을 동원하고 이에 결합하는 MS2 압타머)을 포함할 수 있다. 예를 들어, 이러한 2차 구조는 스페이서, gRNA 코어 또는 연장 아암 내에, 특히 e1 및/또는 e2 변형제 영역 내에 위치할 수 있다. 2차 RNA 구조에 추가로, PEgRNA는 (예를 들어, e1 및/또는 e2 변형제 영역 내에) 화학적 링커 또는 폴리(N) 링커 또는 테일을 포함할 수 있으며, 여기서 "N"은 임의의 핵염기일 수 있다. 일부 실시양태에서 (예를 들어, 도 72(c)에 제시된 바와 같이), 화학적 링커는 sgRNA 스캐폴드 또는 코어의 역전사를 방지하는 기능을 할 수 있다. 추가로, 특정 실시양태에서 (예를 들어, 도 72(c) 참조), 연장 아암 (3)은 RNA 또는 DNA로 구성될 수 있고/거나, 1개 이상의 핵염기 유사체 (예를 들어, 온도 탄력성과 같은 기능성을 부가할 수 있음)를 포함할 수 있다. 또한 추가로, 연장 아암 (3)의 배향은 자연적인 5'에서 3' 방향일 수 있거나 또는 3'에서 5' 방향의 반대 배향으로 합성될 수 있다 (전체 PEgRNA 분자의 배향에 대해). 또한, 관련 기술분야의 통상의 기술자는 napDNAbp와의 융합체로서 구현되거나 또는 목적하는 편집을 포함하는 목적하는 주형-코딩된 3' 단일 가닥 DNA 플랩을 합성하기 위한 별개의 모이어티로서 트랜스로 제공되어 구현될 수 있는 프라임 편집에 사용하기 위해, 연장 아암의 핵산 물질 (즉, DNA 또는 RNA)의 성질에 따라 적절한 DNA 폴리머라제를 선택할 수 있을 것임을 주목한다. 예를 들어, 연장 아암이 RNA이면, DNA 폴리머라제는 리버스 트랜스크립타제 또는 임의의 다른 적합한 RNA-의존성 DNA 폴리머라제일 수 있다. 그러나, 연장 아암이 DNA이면, DNA 폴리머라제는 DNA-의존성 DNA 폴리머라제일 수 있다. 다양한 실시양태에서, DNA 폴리머라제의 제공은, 예를 들어 RNA-단백질 동원 도메인 (예를 들어, PEgRNA 상에 (예를 들어, e1 또는 e2 영역에 또는 다른 곳에) 설치된 MS2 헤어핀 및 DNA 폴리머라제에 융합된 MS2cp 단백질, 이에 의해 DNA 폴리머라제를 PEgRNA로 공동-국재화함)의 사용을 통해 트랜스로 이루어질 수 있다. 추가로, 프라이머 결합 부위는 일반적으로 목적하는 편집을 포함하는 생성된 3' 단일 가닥 DNA 플랩을 코딩하기 위해 DNA 폴리머라제 (예를 들어, 리버스 트랜스크립타제)에 의해 사용되는 주형의 일부를 형성하지 않는다는 것을 주목한다. 따라서, "DNA 합성 주형"의 명칭은 편집을 함유하는 목적하는 3' 단일 가닥 DNA 플랩을 코딩하기 위해 DNA 폴리머라제에 의해 주형으로서 사용되는 연장 아암 (3)의 영역 또는 부분을 지칭한다. 일부 실시양태에서, DNA 합성 주형은 "편집 주형" 및 "상동성 아암"을 포함한다. 다른 실시양태에서, DNA 합성 주형은 또한 e2 영역 또는 그의 한 부분을 포함할 수 있다. 예를 들어, e2 영역이 DNA 폴리머라제 활성의 종결을 유발하는 2차 구조를 포함한다면, e2 영역의 임의의 부분이 DNA로 실제로 코딩되기 전에 DNA 폴리머라제 기능이 종결될 가능성이 있다. e2 영역의 일부 또는 심지어 전부가 DNA로 코딩되는 것이 또한 가능하다. e2의 얼마나 많은 부분이 주형으로서 실제로 사용되는지는 그의 구성 및 그 구성이 DNA 폴리머라제 기능을 방해하는지 여부에 좌우될 것이다.
도 28은 본원에서 고려되고 실시예 2에 규정된 방법론에 따라 설계될 수 있는 PEgRNA의 또 다른 실시양태의 구조를 제공한다. PEgRNA는 5'에서 3' 방향으로 정렬된 3종의 주요 성분 요소, 즉: 스페이서, gRNA 코어 및 3' 단부의 연장 아암을 포함한다. 연장 아암은 5'에서 3' 방향으로 하기 구조적 요소, 즉: 프라이머 결합 부위 (A), 편집 주형 (B) 및 상동성 아암 (C)으로 추가로 나뉠 수 있다. 추가로, PEgRNA는 임의적인 3' 단부 변형제 영역 (e1) 및 임의적인 5' 단부 변형제 영역 (e2)을 포함할 수 있다. 또한 추가로, PEgRNA는 PEgRNA의 3' 단부에 전사 종결 신호를 포함할 수 있다 (도시되지 않음). 이들 구조적 요소는 본원에 추가로 정의된다. PEgRNA의 구조의 도시는 제한적인 것으로 의도되지 않고, 요소의 배열에서의 변형을 포괄한다. 예를 들어, 임의적인 서열 변형제 (e1) 및 (e2)는 제시된 임의의 다른 영역 내에 또는 사이에 위치할 수 있고, 3' 및 5' 단부에 위치하는 것으로 제한되지는 않는다. PEgRNA는, 특정 실시양태에서, 2차 RNA 구조, 예컨대 비제한적으로 헤어핀, 스템/루프, 토루프, RNA-결합 단백질 동원 도메인 (예를 들어, MS2cp 단백질을 동원하고 이에 결합하는 MS2 압타머)을 포함할 수 있다. 이들 2차 구조는 PEgRNA 분자 내 어느 곳에든 위치할 수 있다. 예를 들어, 이러한 2차 구조는 스페이서, gRNA 코어 또는 연장 아암 내에, 특히 e1 및/또는 e2 변형제 영역 내에 위치할 수 있다. 2차 RNA 구조에 추가로, PEgRNA는 (예를 들어, e1 및/또는 e2 변형제 영역 내에) 화학적 링커 또는 폴리(N) 링커 또는 테일을 포함할 수 있으며, 여기서 "N"은 임의의 핵염기일 수 있다. 일부 실시양태에서 (예를 들어, 도 27에 제시된 바와 같이), 화학적 링커는 sgRNA 스캐폴드 또는 코어의 역전사를 방지하는 기능을 할 수 있다. 추가로, 특정 실시양태에서 (예를 들어, 도 28 참조), 연장 아암 (3)은 RNA 또는 DNA로 구성될 수 있고/거나, 1개 이상의 핵염기 유사체 (예를 들어, 온도 탄력성과 같은 기능성을 부가할 수 있음)를 포함할 수 있다. 또한 추가로, 연장 아암 (3)의 배향은 자연적인 5'에서 3' 방향일 수 있거나 또는 3'에서 5' 방향의 반대 배향으로 합성될 수 있다 (전체 PEgRNA 분자의 배향에 대해). 또한, 관련 기술분야의 통상의 기술자는 napDNAbp와의 융합체로서 구현되거나 또는 목적하는 편집을 포함하는 목적하는 주형-코딩된 3' 단일 가닥 DNA 플랩을 합성하기 위한 별개의 모이어티로서 트랜스로 제공되어 구현될 수 있는 프라임 편집에 사용하기 위해, 연장 아암의 핵산 물질 (즉, DNA 또는 RNA)의 성질에 따라 적절한 DNA 폴리머라제를 선택할 수 있을 것임을 주목한다. 예를 들어, 연장 아암이 RNA이면, DNA 폴리머라제는 리버스 트랜스크립타제 또는 임의의 다른 적합한 RNA-의존성 DNA 폴리머라제일 수 있다. 그러나, 연장 아암이 DNA이면, DNA 폴리머라제는 DNA-의존성 DNA 폴리머라제일 수 있다. 다양한 실시양태에서, DNA 폴리머라제의 제공은, 예를 들어 RNA-단백질 동원 도메인 (예를 들어, PEgRNA 상에 (예를 들어, e1 또는 e2 영역에 또는 다른 곳에) 설치된 MS2 헤어핀 및 DNA 폴리머라제에 융합된 MS2cp 단백질, 이에 의해 DNA 폴리머라제를 PEgRNA로 공동-국재화함)의 사용을 통해 트랜스로 이루어질 수 있다. 추가로, 프라이머 결합 부위는 일반적으로 목적하는 편집을 포함하는 생성된 3' 단일 가닥 DNA 플랩을 코딩하기 위해 DNA 폴리머라제 (예를 들어, 리버스 트랜스크립타제)에 의해 사용되는 주형의 일부를 형성하지 않는다는 것을 주목한다. 따라서, "DNA 합성 주형"의 명칭은 편집을 함유하는 목적하는 3' 단일 가닥 DNA 플랩을 코딩하기 위해 DNA 폴리머라제에 의해 주형으로서 사용되는 연장 아암 (3)의 영역 또는 부분을 지칭한다. 일부 실시양태에서, DNA 합성 주형은 "편집 주형" 및 "상동성 아암"을 포함한다. 다른 실시양태에서, DNA 합성 주형은 또한 e2 영역 또는 그의 한 부분을 포함할 수 있다. 예를 들어, e2 영역이 DNA 폴리머라제 활성의 종결을 유발하는 2차 구조를 포함한다면, e2 영역의 임의의 부분이 DNA로 실제로 코딩되기 전에 DNA 폴리머라제 기능이 종결될 가능성이 있다. e2 영역의 일부 또는 심지어 전부가 DNA로 코딩되는 것이 또한 가능하다. e2의 얼마나 많은 부분이 주형으로서 실제로 사용되는지는 그의 구성 및 그 구성이 DNA 폴리머라제 기능을 방해하는지 여부에 좌우될 것이다.
도 29는 전형적인 PEgRNA와 이중 가닥 DNA의 표적 부위의 상호작용 및 관심 유전자 변화를 함유하는 3' 단일 가닥 DNA 플랩의 동반 생성을 도시하는 개략도이다. 이중 가닥 DNA는 3'에서 5' 배향의 상단 가닥 (즉, 표적 가닥) 및 5'에서 3' 방향의 하단 가닥 (즉, PAM 가닥 또는 비-표적 가닥)으로 제시된다. 상단 가닥은 "프로토스페이서"의 상보체 및 PAM 서열의 상보체를 포함하며, PEgRNA의 스페이서에 의해 표적화되고 이에 어닐링되는 가닥이기 때문에 "표적 가닥"으로 지칭된다. 상보적 하단 가닥은 PAM 서열 (예를 들어, NGG) 및 프로토스페이서를 함유하기 때문에 "비-표적 가닥" 또는 "PAM 가닥" 또는 "프로토스페이서 가닥"으로 지칭된다. 제시되지는 않았지만, 도시된 PEgRNA는 프라임 편집제 융합 단백질의 Cas9 또는 등가 도메인과 복합체화될 것이다. 개략도에 제시된 바와 같이, PEgRNA의 스페이서는 PAM 서열의 바로 하류에 위치하고 대략 20개 뉴클레오티드 길이인 프로토스페이서로 지칭되는 표적 가닥 상의 프로토스페이서의 상보적 영역에 어닐링된다. 이러한 상호작용은 스페이서 RNA와 프로토스페이서 DNA의 상보체 사이에 DNA/RNA 하이브리드로서 형성되고, 프로토스페이서의 대향 영역에 R 루프의 형성을 유도한다. 본원의 다른 곳에 교시된 바와 같이, Cas9 단백질 (제시되지 않음)은 이어서 제시된 바와 같은 비-표적 가닥에 닉을 유도한다. 이어서, 이는 *z*에 따라 프라이머 결합 부위에서 PEgRNA의 3' 단부와 상호작용하는 닉 부위의 바로 상류의 3' ssDNA 플랩 영역의 형성을 유도한다. ssDNA 플랩의 3' 단부 (즉, 리버스 트랜스크립타제 프라이머 서열)는 PEgRNA 상의 프라이머 결합 부위 (A)에 어닐링함으로써, 리버스 트랜스크립타제를 프라이밍한다. 이어서, 리버스 트랜스크립타제 (예를 들어, Cas9 구축물에 부착된 융합 단백질로서 시스로 제공되거나 또는 트랜스로 제공됨)는 DNA 합성 주형 (편집 주형 (B) 및 상동성 아암 (C) 포함)에 의해 코딩되는 DNA의 단일 가닥을 중합시킨다. 중합은 연장 아암의 5' 단부를 향해 계속된다. ssDNA의 중합된 가닥은, 다른 곳에 기재된 바와 같이 (예를 들어, 도 1e에 제시된 바와 같이), 내인성 DNA를 침입하고, 상응하는 내인성 가닥 (이는 내인성 DNA의 5' 단부 DNA 플랩으로서 제거됨)을 대체하며, 자연 발생 DNA 복구/복제 라운드를 통해 목적하는 뉴클레오티드 편집 (단일 뉴클레오티드 염기 쌍 변화, 결실, 삽입 (전체 유전자 포함))을 설치하는 ssDNA 3' 단부 플랩을 형성한다.
도 30은 서열 목록의 PEgRNA의 개시내용을 이해하는 것을 돕는다. 도면은 2개의 예시적인 PEgRNA 서열 (서열식별번호: 135529 (상단) 및 서열식별번호: 135880 (하단)) 및 다양한 개시된 서열 하위세트가 그 위에 맵핑되는 방법을 보여준다. 서열식별번호: 135529의 경우, 상응하는 서열은 스페이서 (서열식별번호: 271043), 연장 아암 (서열식별번호: 406557), 프라이머 결합 부위 (서열식별번호: 542071), 편집 주형 (서열식별번호: 677585) 및 상동성 아암 (서열식별번호: 813099)이다. 서열식별번호: 135880의 경우, 상응하는 서열은 스페이서 (서열식별번호: 880463), 연장 아암 (서열식별번호: 947841), 프라이머 결합 부위 (서열식별번호: 1015219), 편집 주형 (서열식별번호: 1082597) 및 상동성 아암 (서열식별번호: 1149975)이다.
도 31은 본 개시내용의 일부 실시양태에 따른, 연장된 gRNA 구조를 결정하기 위한 예시적인 고수준의 컴퓨터화 방법 (3100)을 보여주는 흐름도이다. 단계 (3102)에서, 컴퓨팅 장치 (예를 들어, 도 34와 함께 기재된 컴퓨팅 장치 (3400))는 투입 대립유전자, 산출 대립유전자 및 핵산 프로그램가능한 DNA 결합 단백질 및 리버스 트랜스크립타제를 포함하는 융합 단백질을 나타내는 데이터에 액세스한다. 단계 (3102)가 투입 대립유전자, 산출 대립유전자 및 융합 단백질 중 3가지 모두에 한 단계로 액세스하는 것을 기재하지만, 이는 예시적 목적을 위한 것이고, 이러한 데이터는 본원에 기재된 기술의 취지에서 벗어나지 않으면서 1개 이상의 단계를 사용하여 액세스될 수 있는 것으로 인지되어야 한다. 데이터에 액세스하는 것은 데이터를 수신하는 것, 데이터를 저장하는 것, 데이터베이스에 액세스하는 것 등을 포함할 수 있다.
도 32는 일부 실시양태에 따른, 연장부의 성분을 포함한 연장된 gRNA 구조의 성분을 결정하기 위한 예시적인 컴퓨터화 방법 (3200)을 보여주는 흐름도이다. 도 32는 예시적인 것으로 의도되므로, 연장된 gRNA를 결정하기 위해 사용된 기술은 도 32에 제시된 것보다 더 많거나 더 적은 단계를 포함할 수 있는 것으로 인지되어야 한다.
도 33은 일부 실시양태에 따른, 데이터베이스에서 각각의 돌연변이 엔트리에 대한 연장된 gRNA 구조의 세트를 결정하기 위한 예시적인 컴퓨터화 방법 (3300)을 보여주는 흐름도이다. 단계 (3302)에서, 컴퓨팅 장치는 각각 돌연변이를 나타내는 투입 대립유전자 및 교정된 야생형 서열을 나타내는 산출 대립유전자를 포함하는 돌연변이 엔트리의 세트를 포함하는 데이터베이스 (예를 들어, www.ncbi.nlm.nih.gov/clinvar/에서 액세스가능한 클린바 데이터베이스)에 액세스한다.
도 34는 본원에 개시된 기술 및 실시양태의 임의의 측면을 수행하는데 사용될 수 있는 컴퓨터 시스템 (3400)의 예시적 구현이다. 컴퓨터 시스템 (3400)은 1개 이상의 프로세서 (3410) 및 1개 이상의 비-일시적 컴퓨터-판독가능 저장 매체 (예를 들어, 메모리 (3420) 및 1개 이상의 비-휘발성 저장 매체 (3430)) 및 디스플레이 (3440)를 포함할 수 있다. 프로세서 (3410)는 임의의 적합한 방식으로 메모리 (3420) 및 비-휘발성 저장 장치 (3430)에 대한 데이터의 기록 및 그로부터의 데이터의 판독을 제어할 수 있으며, 이는 본원에 기재된 본 발명의 측면이 이와 관련하여 제한되지 않기 때문이다.
도 35a는 실시예 3과 관련하여 RNA 모티프를 코딩하는 서열의 PE-기반 삽입의 개략도이다.
도 35b는 실시예 3과 관련하여, 잠재적으로 삽입될 수 있는 일부 예시 모티프 및 그의 기능의 목록 (총체적은 아님)이다.
도 36은 다양한 세포주에서의 상이한 표적 부위에 걸친 PE2, PE2-말단절단, PE3 및 PE3-말단절단의 효율 (즉, "명시된 편집 또는 indel을 갖는 총 서열분석 판독물의 %)을 비교하는 막대 그래프를 제공한다. 데이터는 말단절단된 RT 변이체를 포함하는 프라임 편집제가 대략 비-말단절단된 RT 단백질을 포함하는 프라임 편집제만큼 효율적이었음을 보여준다.
도 37a는 3' 단부에서 "UGU"로 종결되고 토 루프 요소를 함유하지 않는 SpCas9 PEgRNA 분자의 뉴클레오티드 서열을 보여준다 (상단). 도면의 하단 부분은 동일한 SpCas9 PEgRNA 분자를 도시하지만, "UUU" 3' 단부 바로 앞에 서열 5'-"GAAANNNNN"-3'가 삽입된 토 루프 요소를 함유하도록 추가로 변형된다. "N"은 임의의 핵염기일 수 있다.
도 37b는 실시예 4의 결과를 보여주며, 이는 HEK 세포 또는 EMX 세포에서의 프라임 편집의 효율이 PEgRNA 함유 토 루프 요소를 사용하여 증가되는 반면, indel 형성의 퍼센트는 크게 변화되지 않는다는 것을 입증한다.
도 38은 각각의 프라임 편집제 절반 단백질의 단부 또는 시작부에 위치한 분할-인테인 절반의 자기-스플라이싱 작용을 통해 전체 프라임 편집제로서 재생하는 2개의 PE 절반 단백질로서 제공되는 프라임 편집제의 한 실시양태를 도시한다.
도 39는 폴리펩티드 서열로부터의 인테인 제거 및 N-말단과 C-말단의 엑스테인 서열 사이의 펩티드 결합의 재형성의 메카니즘을 도시한다. (a)는 각각 인테인 서열의 절반을 함유하는 2개의 절반 단백질의 일반적 메카니즘을 도시하며, 이들 단백질은 세포 내에서 접촉하는 경우에 완전-기능적 인테인을 생성하고, 이는 이어서 자기-스플라이싱 및 절제를 겪는다. 절제 과정은 N-말단 단백질 절반 (또는 "N 엑스테인")과 C-말단 단백질 절반 (또는 "C 엑스테인") 사이의 펩티드 결합의 형성을 유발하여 N 엑스테인 및 C 엑스테인 부분을 포함하는 전체 단일 폴리펩티드를 형성한다. 다양한 실시양태에서, N 엑스테인은 분할 프라임 편집제의 융합 단백질의 N-말단 절반에 상응할 수 있고, C 엑스테인은 분할 프라임 편집제의 C-말단 절반에 상응할 수 있다. (b)는 인테인 절제 및 N 엑스테인 절반 (적색 절반)과 C 엑스테인 절반 (청색 절반)을 연결하는 펩티드 결합의 재형성의 화학적 메카닉을 보여준다. 분할 인테인 (즉, 분할 인테인 구성에서 N 인테인 및 C 인테인)의 절제는 또한 트랜스로 제공되는 2개의 개별 성분의 스플라이싱 작용을 수반하기 때문에 "트랜스 스플라이싱"으로 지칭될 수 있다.
정의
안티센스 가닥
유전학에서, 이중 가닥 DNA 내의 절편의 "안티센스" 가닥은 주형 가닥이고, 이는 3'에서 5' 배향으로 진행하는 것으로 간주된다. 대조적으로, "센스" 가닥은 5'에서 3'로 진행하는 이중 가닥 DNA 내의 절편이며, 이는 3'에서 5'로 진행하는 DNA의 안티센스 가닥 또는 주형 가닥에 상보적이다. 단백질을 코딩하는 DNA 절편의 경우에, 센스 가닥은 mRNA와 동일한 서열을 갖는 DNA의 가닥이며, 이는 전사 동안 안티센스 가닥을 그의 주형으로서 취하고, 결국 (전형적으로, 항상은 아님) 단백질로의 번역을 겪는다. 따라서, 안티센스 가닥은 나중에 단백질로 번역되는 RNA를 담당하는 반면, 센스 가닥은 mRNA의 것과 거의 동일한 구성을 갖는다. dsDNA의 각각의 절편에 대해, 판독하는 방향에 따라 센스 및 안티센스의 2개의 세트가 존재할 가능성이 있다는 것 (센스 및 안티센스는 시각이 상대적이기 때문에)을 주목한다. 궁극적으로, dsDNA의 한 절편 중 어느 가닥이 센스 또는 안티센스로 지칭되는지를 좌우하는 것은 유전자 생성물 또는 mRNA이다.
Cas9
용어 "Cas9" 또는 "Cas9 뉴클레아제"는 Cas9 도메인 또는 그의 단편 (예를 들어, Cas9의 활성 또는 불활성 DNA 절단 도메인 및/또는 Cas9의 gRNA 결합 도메인을 포함하는 단백질)을 포함하는 RNA-가이드 뉴클레아제를 지칭한다. 본원에 사용된 "Cas9 도메인"은 Cas9의 활성 또는 불활성 절단 도메인 및/또는 Cas9의 gRNA 결합 도메인을 포함하는 단백질 단편이다. "Cas9 단백질"은 전장 Cas9 단백질이다. Cas9 뉴클레아제는 또한 때때로 casn1 뉴클레아제 또는 CRISPR (클러스터링된 규칙적 간격의 짧은 회문식 반복부)-연관 뉴클레아제로 지칭된다. CRISPR은 이동성 유전 요소 (바이러스, 전위가능 요소 및 접합 플라스미드)에 대한 보호를 제공하는 적응 면역계이다. CRISPR 클러스터는 스페이서, 이전의 이동성 요소에 상보적인 서열 및 표적 침입 핵산을 함유한다. CRISPR 클러스터는 CRISPR RNA (crRNA)로 전사 및 프로세싱된다. 유형 II CRISPR 시스템에서, 프리-crRNA의 정확한 프로세싱은 트랜스-코딩된 소형 RNA (tracrRNA), 내인성 리보뉴클레아제 3 (rnc) 및 Cas9 도메인을 요구한다. tracrRNA는 프리-crRNA의 리보뉴클레아제 3-보조 프로세싱을 위한 가이드로서의 역할을 한다. 후속적으로, Cas9/crRNA/tracrRNA는 스페이서에 상보적인 선형 또는 원형 dsDNA 표적을 핵산내부분해적으로 절단한다. crRNA에 상보적이지 않은 표적 가닥은 먼저 핵산내부분해적으로 절단된 다음, 핵산외부분해적으로 3'-5' 트리밍된다. 사실상, DNA-결합 및 절단은 전형적으로 단백질 및 둘 다의 RNA를 요구한다. 그러나, 단일 가이드 RNA ("sgRNA", 또는 간단히 "gRNA")는 crRNA 및 tracrRNA 둘 다의 측면을 단일 RNA 종 내로 혼입하도록 조작될 수 있다. 예를 들어, 문헌 [Jinek M., Chylinski K., Fonfara I., Hauer M., Doudna J.A., Charpentier E. Science 337:816-821(2012)]을 참조하며, 이의 전체 내용은 본원에 참조로 포함된다. Cas9는 CRISPR 반복 서열 내의 짧은 모티프 (PAM 또는 프로토스페이서 인접 모티프)를 인식하여 자기 대 비-자기 구별을 돕는다. Cas9 뉴클레아제 서열 및 구조는 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 널리 공지되어 있다 (예를 들어, 문헌 ["Complete genome sequence of an M1 strain of Streptococcus pyogenes." Ferretti et al., J.J., McShan W.M., Ajdic D.J., Savic D.J., Savic G., Lyon K., Primeaux C., Sezate S., Suvorov A.N., Kenton S., Lai H.S., Lin S.P., Qian Y., Jia H.G., Najar F.Z., Ren Q., Zhu H., Song L., White J., Yuan X., Clifton S.W., Roe B.A., McLaughlin R.E., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 98:4658-4663(2001); "CRISPR RNA maturation by trans-encoded small RNA and host factor RNase III." Deltcheva E., Chylinski K., Sharma C.M., Gonzales K., Chao Y., Pirzada Z.A., Eckert M.R., Vogel J., Charpentier E., Nature 471:602-607(2011); 및 "A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity." Jinek M., Chylinski K., Fonfara I., Hauer M., Doudna J.A., Charpentier E. Science 337:816-821(2012)] 참조, 이들 각각의 전체 내용은 본원에 참조로 포함됨). Cas9 오르토로그는 에스. 피오게네스(S. pyogenes) 및 에스. 써모필루스(S. thermophilus)를 포함하나 이에 제한되지는 않는 다양한 종에서 기재되어 있다. 추가의 적합한 Cas9 뉴클레아제 및 서열은 본 개시내용에 기초하여 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 명백할 것이고, 이러한 Cas9 뉴클레아제 및 서열은 그의 전체 내용이 본원에 참조로 포함되는 문헌 [Chylinski, Rhun, and Charpentier, "The tracrRNA and Cas9 families of type II CRISPR-Cas immunity systems" (2013) RNA Biology 10:5, 726-737]에 개시된 유기체 및 유전자좌로부터의 Cas9 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, Cas9 뉴클레아제는 DNA 절단 도메인을 부분적으로 손상 또는 불활성화시키는 1개 이상의 돌연변이를 포함한다.
뉴클레아제-불활성화된 Cas9 도메인은 상호교환가능하게 "dCas9" 단백질 (뉴클레아제-"기능상실" Cas9의 경우)로 지칭될 수 있다. 불활성 DNA 절단 도메인을 갖는 Cas9 도메인 (또는 그의 단편)을 생성하는 방법은 공지되어 있다 (예를 들어, 문헌 [Jinek et al., Science. 337:816-821(2012); Qi et al., "Repurposing CRISPR as an RNA-Guided Platform for Sequence-Specific Control of Gene Expression" (2013) Cell. 28;152(5):1173-83] 참조, 이들 각각의 전체 내용은 본원에 참조로 포함됨). 예를 들어, Cas9의 DNA 절단 도메인은 2개의 서브도메인, 즉 HNH 뉴클레아제 서브도메인 및 RuvC1 서브도메인을 포함하는 것으로 공지되어 있다. HNH 서브도메인은 gRNA에 상보적인 가닥을 절단하는 반면, RuvC1 서브도메인은 비-상보적 가닥을 절단한다. 이들 서브도메인 내의 돌연변이는 Cas9의 뉴클레아제 활성을 침묵시킬 수 있다. 예를 들어, 돌연변이 D10A 및 H840A는 에스. 피오게네스 Cas9의 뉴클레아제 활성을 완전히 불활성화시킨다 (Jinek et al., Science. 337:816-821(2012); Qi et al., Cell. 28;152(5):1173-83 (2013)). 일부 실시양태에서, Cas9의 단편을 포함하는 단백질이 제공된다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, 단백질은 다음 2개의 Cas9 도메인 중 하나를 포함한다: (1) Cas9의 gRNA 결합 도메인; 또는 (2) Cas9의 DNA 절단 도메인. 일부 실시양태에서, Cas9 또는 그의 단편을 포함하는 단백질은 "Cas9 변이체"로 지칭된다. Cas9 변이체는 Cas9 또는 그의 단편에 대한 상동성을 공유한다. 예를 들어, Cas9 변이체는 야생형 Cas9 (예를 들어 서열식별번호: 1361421의 SpCas9)에 대해 적어도 약 70% 동일하거나, 적어도 약 80% 동일하거나, 적어도 약 90% 동일하거나, 적어도 약 95% 동일하거나, 적어도 약 96% 동일하거나, 적어도 약 97% 동일하거나, 적어도 약 98% 동일하거나, 적어도 약 99% 동일하거나, 적어도 약 99.5% 동일하거나, 적어도 약 99.8% 동일하거나 또는 적어도 약 99.9% 동일하다. 일부 실시양태에서, Cas9 변이체는 야생형 Cas9 (예를 들어 서열식별번호: 1361421의 SpCas9)와 비교하여 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 21, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50개 또는 그 초과의 아미노산 변화를 가질 수 있다. 일부 실시양태에서, Cas9 변이체는 서열식별번호: X Cas9의 단편 (예를 들어, gRNA 결합 도메인 또는 DNA-절단 도메인)을 포함하여, 단편은 야생형 Cas9 (예를 들어, 서열식별번호: 1361421의 SpCas9)의 상응하는 단편에 대해 적어도 약 70% 동일하거나, 적어도 약 80% 동일하거나, 적어도 약 90% 동일하거나, 적어도 약 95% 동일하거나, 적어도 약 96% 동일하거나, 적어도 약 97% 동일하거나, 적어도 약 98% 동일하거나, 적어도 약 99% 동일하거나, 적어도 약 99.5% 동일하거나 또는 적어도 약 99.9% 동일하다. 일부 실시양태에서, 단편은 상응하는 야생형 Cas9 (예를 들어, 서열식별번호: 1361421의 SpCas9)의 아미노산 길이의 적어도 30%, 적어도 35%, 적어도 40%, 적어도 45%, 적어도 50%, 적어도 55%, 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 적어도 99.5%이다.
cDNA
용어 "cDNA"는 RNA 주형으로부터 카피된 DNA의 가닥을 지칭한다. cDNA는 RNA 주형에 상보적이다.
원형 순열체
본원에 사용된 용어 "원형 순열체"는 단백질의 아미노산 서열에 나타나는 아미노산의 순서의 변화를 수반하는 단백질의 구조적 구성의 변화인 원형 순열을 포함하는 단백질 또는 폴리펩티드 (예를 들어, Cas9)를 지칭한다. 다시 말해서, 원형 순열체는 야생형 대응물과 비교하여 N- 및 C-말단이 변경된 단백질이며, 예를 들어 단백질의 야생형 C-말단 절반이 새로운 N-말단 절반이 된다. 원형 순열 (또는 CP)은 본질적으로, 그의 서열을 상이한 위치에서 분할하여 새로운 인접한 N- 및 C-말단을 생성하면서 동시에 그의 N- 및 C-말단을 종종 펩티드 링커와 연결하는, 단백질의 1차 서열의 위상 재배열이다. 그 결과는, 상이한 연결성을 갖지만 종종 동일한 전체 유사한 3차원 (3D) 형상을 가질 수 있고, 가능하게는 감소된 단백질분해 감수성, 개선된 촉매 활성, 변경된 기질 또는 리간드 결합 및/또는 개선된 열안정성을 포함한 개선된 또는 변경된 특징을 포함할 수 있는 단백질 구조이다. 원형 순열체 단백질은 자연에서 발생할 수 있다 (예를 들어, 콘카나발린 A 및 렉틴). 추가로, 원형 순열은 번역후 변형의 결과로서 발생할 수 있거나 또는 재조합 기술을 사용하여 조작될 수 있다.
원형 순열 Cas9
용어 "원형 순열 Cas9"는 그의 N- 및 C-말단이 단백질의 1차 서열의 재배열을 통해 재구성된, 원형 순열체로서 발생하는 임의의 Cas9 단백질 또는 그의 변이체를 지칭한다. 이러한 원형 순열 Cas9 단백질 ("CP-Cas9") 또는 그의 변이체는 가이드 RNA (gRNA)와 복합체화되는 경우 DNA에 결합하는 능력을 보유한다. 문헌 [Oakes et al., "Protein Engineering of Cas9 for enhanced function," Methods Enzymol, 2014, 546:491-511 and Oakes et al., "CRISPR-Cas9 Circular Permutants as Programmable Scaffolds for Genome Modification," Cell, January 10, 2019, 176: 254-267]을 참조하며, 이들 각각은 본원에 참조로 포함된다. 본 개시내용은 임의의 이전에 공지된 CP-Cas9를 고려하거나 또는 생성된 원형 순열 단백질이 가이드 RNA (gRNA)와 복합체화되는 경우 DNA에 결합하는 능력을 보유하는 한, 새로운 CP-Cas9를 사용한다. 예시적인 CP-Cas9 단백질은 서열식별번호: 1361475-1361484이다.
DNA 합성 주형
본원에 사용된 용어 "DNA 합성 주형"은 목적하는 편집을 함유하는 3' 단일 가닥 DNA 플랩을 코딩하기 위해 프라임 편집제의 폴리머라제에 의해 주형 가닥으로서 이용되고, 이어서 프라임 편집의 메카니즘을 통해 표적 부위에서 DNA의 상응하는 내인성 가닥을 대체하는 PEgRNA의 연장 아암의 영역 또는 부분을 지칭한다. 다양한 실시양태에서, DNA 합성 주형은 도 3a (5' 연장 아암을 포함하는 PEgRNA의 맥락에서), 도 3b (3' 연장 아암을 포함하는 PEgRNA의 맥락에서), 도 3c (내부 연장 아암의 맥락에서), 도 3d (3' 연장 아암의 맥락에서), 및 도 3e (5' 연장 아암의 맥락에서)에 제시된다. DNA 합성 주형을 포함한 연장 아암은 DNA 또는 RNA로 구성될 수 있다. RNA의 경우에, 프라임 편집제의 폴리머라제는 RNA-의존성 DNA 폴리머라제 (예를 들어, 리버스 트랜스크립타제)일 수 있다. DNA의 경우에, 프라임 편집제의 폴리머라제는 DNA-의존성 DNA 폴리머라제일 수 있다. 다양한 실시양태에서 (예를 들어, 도 3d-3e에 도시된 바와 같이), DNA 합성 주형 (4)은 "편집 주형" 및 "상동성 아암", 및 임의적인 5' 단부 변형제 영역 e2의 모두 또는 부분을 포함할 수 있다. 즉, e2 영역의 성질 (예를 들어, 헤어핀, 토 루프 또는 스템/루프 2차 구조를 포함하는지 여부)에 따라, 폴리머라제는 또한 e2 영역 중 어느 것도 코딩하지 않을 수 있거나, 일부 또는 모두를 코딩할 수 있다. 상기 또 다른 방식으로, 3' 연장 아암의 경우에, DNA 합성 주형 (3)은 프라이머 결합 부위 (PBS)의 5' 단부로부터, 폴리머라제 (예를 들어, 리버스 트랜스크립타제)에 의한 DNA의 단일 가닥의 합성을 위한 주형으로서 작동할 수 있는 gRNA 코어의 3' 단부까지 걸쳐 있는 연장 아암 (3)의 부분을 포함할 수 있다. 5' 연장 아암의 경우에, DNA 합성 주형 (3)은 PEgRNA 분자의 5' 단부로부터 편집 주형의 3' 단부까지 걸쳐 있는 연장 아암 (3)의 부분을 포함할 수 있다. 바람직하게는, DNA 합성 주형은 3' 연장 아암 또는 5' 연장 아암을 갖는 PEgRNA의 프라이머 결합 부위 (PBS)를 배제한다. 본원에 기재된 특정 실시양태 (예를 들어, 도 71a)는 편집 주형 및 상동성 아암을 포함하는 "RT 주형", 즉 DNA 합성 동안 주형으로서 실제로 사용되는 PEgRNA 연장 아암의 서열을 지칭한다. 용어 "RT 주형"은 용어 "DNA 합성 주형"과 동등하다.
하류
본원에 사용된 용어 "상류" 및 "하류"는 5'에서 3' 방향으로 배향되는 핵산 분자 (단일 가닥이든 이중 가닥이든)에 위치한 적어도 2개의 요소의 선형 위치를 정의하는 상대성 용어이다. 특히, 제1 요소는 핵산 분자에서 제2 요소의 상류에 있으며, 여기서 제1 요소는 제2 요소에 대해 5'인 어딘가에 위치한다. 예를 들어, SNP가 닉 부위의 5' 측면 상에 있는 경우에 SNP는 Cas9-유도된 닉 부위의 상류에 있다. 반대로, 제1 요소는 핵산 분자에서 제2 요소의 하류에 있으며, 여기서 제1 요소는 제2 요소에 대해 3'인 어딘가에 위치한다. 예를 들어, SNP가 닉 부위의 3' 측면 상에 있는 경우에 SNP는 Cas9-유도된 닉 부위의 하류에 있다. 핵산 분자는 DNA (이중 또는 단일 가닥), RNA (이중 또는 단일 가닥), 또는 DNA와 RNA의 하이브리드일 수 있다. 분석은 단일 가닥 핵산 분자 및 이중 가닥 분자에 대해 동일하며, 이는 용어 상류 및 하류가 이중 가닥 분자의 어느 가닥이 고려되는지를 선택할 필요가 있다는 것을 제외하고는 핵산 분자의 단일 가닥만을 언급하기 때문이다. 종종, 적어도 2개의 요소의 위치적 상대성을 결정하는데 사용될 수 있는 이중 가닥 DNA의 가닥은 "센스" 또는 "코딩" 가닥이다. 유전학에서, "센스" 가닥은 5'에서 3'로 진행하는 이중 가닥 DNA 내의 절편이며, 이는 3'에서 5'로 진행하는 DNA의 안티센스 가닥 또는 주형 가닥에 상보적이다. 따라서, 예로서, SNP 핵염기는 SNP 핵염기가 센스 또는 코딩 가닥 상의 프로모터의 3' 측면 상에 존재하는 경우에 게놈 DNA (이중 가닥임) 내의 프로모터 서열의 "하류"에 있다.
CRISPR
CRISPR은 원핵생물을 침입한 바이러스에 의한 이전 감염의 조각(snippets)을 나타내는 박테리아 및 고세균에서의 DNA 서열 (즉, CRISPR 클러스터)의 패밀리이다. DNA의 조각은 유사한 바이러스에 의한 후속 공격으로부터 DNA를 검출하고 파괴하기 위해 원핵 세포에 의해 사용되고, CRISPR-연관 단백질 (Cas9 및 그의 상동체 포함) 및 CRISPR-연관 RNA의 어레이와 함께 원핵 면역 방어 시스템을 효과적으로 구성한다. 사실상, CRISPR 클러스터는 CRISPR RNA (crRNA)로 전사 및 프로세싱된다. 특정 유형의 CRISPR 시스템 (예를 들어, 유형 II CRISPR 시스템)에서, 프리-crRNA의 정확한 프로세싱은 트랜스-코딩된 소형 RNA (tracrRNA), 내인성 리보뉴클레아제 3 (rnc) 및 Cas9 단백질을 요구한다. tracrRNA는 프리-crRNA의 리보뉴클레아제 3-보조 프로세싱을 위한 가이드로서의 역할을 한다. 후속적으로, Cas9/crRNA/tracrRNA는 RNA에 상보적인 선형 또는 원형 dsDNA 표적을 핵산내부분해적으로 절단한다. 구체적으로, crRNA에 상보적이지 않은 표적 가닥은 먼저 핵산내부분해적으로 절단된 다음, 핵산외부분해적으로 3'-5' 트리밍된다. 사실상, DNA-결합 및 절단은 전형적으로 단백질 및 둘 다의 RNA를 요구한다. 그러나, 단일 가이드 RNA ("sgRNA", 또는 간단히 "gRNA")는 crRNA 및 tracrRNA 둘 다의 측면을 단일 RNA 종 - 가이드 RNA 내로 혼입하도록 조작될 수 있다. 예를 들어, 문헌 [Jinek M., Chylinski K., Fonfara I., Hauer M., Doudna J.A., Charpentier E. Science 337:816-821(2012)]을 참조하며, 이의 전체 내용은 본원에 참조로 포함된다. Cas9는 CRISPR 반복 서열 내의 짧은 모티프 (PAM 또는 프로토스페이서 인접 모티프)를 인식하여 자기 대 비-자기 구별을 돕는다. CRISPR 생물학, 뿐만 아니라 Cas9 뉴클레아제 서열 및 구조는 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 널리 공지되어 있다 (예를 들어, 문헌 ["Complete genome sequence of an M1 strain of Streptococcus pyogenes." Ferretti et al., J.J., McShan W.M., Ajdic D.J., Savic D.J., Savic G., Lyon K., Primeaux C., Sezate S., Suvorov A.N., Kenton S., Lai H.S., Lin S.P., Qian Y., Jia H.G., Najar F.Z., Ren Q., Zhu H., Song L., White J., Yuan X., Clifton S.W., Roe B.A., McLaughlin R.E., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 98:4658-4663(2001); "CRISPR RNA maturation by trans-encoded small RNA and host factor RNase III." Deltcheva E., Chylinski K., Sharma C.M., Gonzales K., Chao Y., Pirzada Z.A., Eckert M.R., Vogel J., Charpentier E., Nature 471:602-607(2011); 및 "A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity." Jinek M., Chylinski K., Fonfara I., Hauer M., Doudna J.A., Charpentier E. Science 337:816-821(2012)] 참조, 이들 각각의 전체 내용은 본원에 참조로 포함됨). Cas9 오르토로그는 에스. 피오게네스 및 에스. 써모필루스를 포함하나 이에 제한되지는 않는 다양한 종에서 기재되어 있다. 추가의 적합한 Cas9 뉴클레아제 및 서열은 본 개시내용에 기초하여 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 명백할 것이고, 이러한 Cas9 뉴클레아제 및 서열은 그의 전체 내용이 본원에 참조로 포함되는 문헌 [Chylinski, Rhun, and Charpentier, "The tracrRNA and Cas9 families of type II CRISPR-Cas immunity systems" (2013) RNA Biology 10:5, 726-737]에 개시된 유기체 및 유전자좌로부터의 Cas9 서열을 포함한다.
용어 "Cas9" 또는 "Cas9 뉴클레아제"는 Cas9 도메인 또는 그의 단편 (예를 들어, Cas9의 활성 또는 불활성 DNA 절단 도메인 및/또는 Cas9의 gRNA 결합 도메인을 포함하는 단백질)을 포함하는 RNA-가이드 뉴클레아제를 지칭한다. 본원에 사용된 "Cas9 도메인"은 Cas9의 활성 또는 불활성 절단 도메인 및/또는 Cas9의 gRNA 결합 도메인을 포함하는 단백질 단편이다. "Cas9 단백질"은 전장 Cas9 단백질이다. Cas9 뉴클레아제는 또한 때때로 casn1 뉴클레아제 또는 CRISPR (클러스터링된 규칙적 간격의 짧은 회문식 반복부)-연관 뉴클레아제로 지칭된다. CRISPR은 이동성 유전 요소 (바이러스, 전위가능 요소 및 접합 플라스미드)에 대한 보호를 제공하는 적응 면역계이다. CRISPR 클러스터는 스페이서, 이전의 이동성 요소에 상보적인 서열 및 표적 침입 핵산을 함유한다. CRISPR 클러스터는 CRISPR RNA (crRNA)로 전사 및 프로세싱된다. 유형 II CRISPR 시스템에서, 프리-crRNA의 정확한 프로세싱은 트랜스-코딩된 소형 RNA (tracrRNA), 내인성 리보뉴클레아제 3 (rnc) 및 Cas9 도메인을 요구한다. tracrRNA는 프리-crRNA의 리보뉴클레아제 3-보조 프로세싱을 위한 가이드로서의 역할을 한다. 후속적으로, Cas9/crRNA/tracrRNA는 스페이서에 상보적인 선형 또는 원형 dsDNA 표적을 핵산내부분해적으로 절단한다. crRNA에 상보적이지 않은 표적 가닥은 먼저 핵산내부분해적으로 절단된 다음, 핵산외부분해적으로 3'-5' 트리밍된다. 사실상, DNA-결합 및 절단은 전형적으로 단백질 및 둘 다의 RNA를 요구한다. 그러나, 단일 가이드 RNA ("sgRNA", 또는 간단히 "gRNA")는 crRNA 및 tracrRNA 둘 다의 측면을 단일 RNA 종 내로 혼입하도록 조작될 수 있다. 예를 들어, 문헌 [Jinek M., Chylinski K., Fonfara I., Hauer M., Doudna J.A., Charpentier E. Science 337:816-821(2012)]을 참조하며, 이의 전체 내용은 본원에 참조로 포함된다. Cas9는 CRISPR 반복 서열 내의 짧은 모티프 (PAM 또는 프로토스페이서 인접 모티프)를 인식하여 자기 대 비-자기 구별을 돕는다. Cas9 뉴클레아제 서열 및 구조는 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 널리 공지되어 있다 (예를 들어, 문헌 ["Complete genome sequence of an M1 strain of Streptococcus pyogenes." Ferretti et al., J.J., McShan W.M., Ajdic D.J., Savic D.J., Savic G., Lyon K., Primeaux C., Sezate S., Suvorov A.N., Kenton S., Lai H.S., Lin S.P., Qian Y., Jia H.G., Najar F.Z., Ren Q., Zhu H., Song L., White J., Yuan X., Clifton S.W., Roe B.A., McLaughlin R.E., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 98:4658-4663(2001); "CRISPR RNA maturation by trans-encoded small RNA and host factor RNase III." Deltcheva E., Chylinski K., Sharma C.M., Gonzales K., Chao Y., Pirzada Z.A., Eckert M.R., Vogel J., Charpentier E., Nature 471:602-607(2011); 및 "A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity." Jinek M., Chylinski K., Fonfara I., Hauer M., Doudna J.A., Charpentier E. Science 337:816-821(2012)] 참조, 이들 각각의 전체 내용은 본원에 참조로 포함됨). Cas9 오르토로그는 에스. 피오게네스 및 에스. 써모필루스를 포함하나 이에 제한되지는 않는 다양한 종에서 기재되어 있다. 추가의 적합한 Cas9 뉴클레아제 및 서열은 본 개시내용에 기초하여 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 명백할 것이고, 이러한 Cas9 뉴클레아제 및 서열은 그의 전체 내용이 본원에 참조로 포함되는 문헌 [Chylinski, Rhun, and Charpentier, "The tracrRNA and Cas9 families of type II CRISPR-Cas immunity systems" (2013) RNA Biology 10:5, 726-737]에 개시된 유기체 및 유전자좌로부터의 Cas9 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, Cas9 뉴클레아제는 DNA 절단 도메인을 부분적으로 손상 또는 불활성화시키는 1개 이상의 돌연변이를 포함한다.
뉴클레아제-불활성화된 Cas9 도메인은 상호교환가능하게 "dCas9" 단백질 (뉴클레아제-"기능상실" Cas9의 경우)로 지칭될 수 있다. 불활성 DNA 절단 도메인을 갖는 Cas9 도메인 (또는 그의 단편)을 생성하는 방법은 공지되어 있다 (예를 들어, 문헌 [Jinek et al., Science. 337:816-821(2012); Qi et al., "Repurposing CRISPR as an RNA-Guided Platform for Sequence-Specific Control of Gene Expression" (2013) Cell. 28;152(5):1173-83] 참조, 이들 각각의 전체 내용은 본원에 참조로 포함됨). 예를 들어, Cas9의 DNA 절단 도메인은 2개의 서브도메인, 즉 HNH 뉴클레아제 서브도메인 및 RuvC1 서브도메인을 포함하는 것으로 공지되어 있다. HNH 서브도메인은 gRNA에 상보적인 가닥을 절단하는 반면, RuvC1 서브도메인은 비-상보적 가닥을 절단한다. 이들 서브도메인 내의 돌연변이는 Cas9의 뉴클레아제 활성을 침묵시킬 수 있다. 예를 들어, 돌연변이 D10A 및 H840A는 에스. 피오게네스 Cas9의 뉴클레아제 활성을 완전히 불활성화시킨다 (Jinek et al., Science. 337:816-821(2012); Qi et al., Cell. 28;152(5):1173-83 (2013)). 일부 실시양태에서, Cas9의 단편을 포함하는 단백질이 제공된다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, 단백질은 다음 2개의 Cas9 도메인 중 하나를 포함한다: (1) Cas9의 gRNA 결합 도메인; 또는 (2) Cas9의 DNA 절단 도메인. 일부 실시양태에서, Cas9 또는 그의 단편을 포함하는 단백질은 "Cas9 변이체"로 지칭된다. Cas9 변이체는 Cas9 또는 그의 단편에 대한 상동성을 공유한다. 예를 들어, Cas9 변이체는 야생형 Cas9 (예를 들어 서열식별번호: 1361421의 SpCas9)에 대해 적어도 약 70% 동일하거나, 적어도 약 80% 동일하거나, 적어도 약 90% 동일하거나, 적어도 약 95% 동일하거나, 적어도 약 96% 동일하거나, 적어도 약 97% 동일하거나, 적어도 약 98% 동일하거나, 적어도 약 99% 동일하거나, 적어도 약 99.5% 동일하거나, 적어도 약 99.8% 동일하거나 또는 적어도 약 99.9% 동일하다. 일부 실시양태에서, Cas9 변이체는 야생형 Cas9 (예를 들어 서열식별번호: 1361421의 SpCas9)와 비교하여 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 21, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50개 또는 그 초과의 아미노산 변화를 가질 수 있다. 일부 실시양태에서, Cas9 변이체는 서열식별번호: 1361421의 단편 (예를 들어, gRNA 결합 도메인 또는 DNA-절단 도메인)을 포함하여, 단편은 야생형 Cas9 (예를 들어, 서열식별번호: 1361421의 SpCas9)의 상응하는 단편에 대해 적어도 약 70% 동일하거나, 적어도 약 80% 동일하거나, 적어도 약 90% 동일하거나, 적어도 약 95% 동일하거나, 적어도 약 96% 동일하거나, 적어도 약 97% 동일하거나, 적어도 약 98% 동일하거나, 적어도 약 99% 동일하거나, 적어도 약 99.5% 동일하거나 또는 적어도 약 99.9% 동일하다. 일부 실시양태에서, 단편은 상응하는 야생형 Cas9 (예를 들어, 서열식별번호: 1361421의 SpCas9)의 아미노산 길이의 적어도 30%, 적어도 35%, 적어도 40%, 적어도 45%, 적어도 50%, 적어도 55%, 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 적어도 99.5%이다.
편집 주형
용어 "편집 주형"은 폴리머라제, 예를 들어 DNA-의존성 DNA 폴리머라제, RNA-의존성 DNA 폴리머라제 (예를 들어, 리버스 트랜스크립타제)에 의해 합성된 단일 가닥 3' DNA 플랩에서 목적하는 편집을 코딩하는 연장 아암의 부분을 지칭한다. 본원에 기재된 특정 실시양태 (예를 들어, 도 71a)는 편집 주형 및 상동성 아암 둘 다를 함께 지칭하는 "RT 주형", 즉 DNA 합성 동안 주형으로서 실제로 사용되는 PEgRNA 연장 아암의 서열을 지칭한다. 용어 "RT 편집 주형"은 또한 용어 "DNA 합성 주형"과 동등하지만, 여기서 RT 편집 주형은 리버스 트랜스크립타제인 폴리머라제를 갖는 프라임 편집제의 사용을 반영하고, DNA 합성 주형은 임의의 폴리머라제를 갖는 프라임 편집제의 사용을 보다 광범위하게 반영한다.
오류-유발
본원에 사용된 용어 "오류-유발" 리버스 트랜스크립타제 (또는 보다 넓게는, 임의의 폴리머라제)는 자연 발생하거나 또는 야생형 M-MLV 리버스 트랜스크립타제의 오류율보다 더 적은 오류율을 갖는 또 다른 리버스 트랜스크립타제 (예를 들어, 야생형 M-MLV 리버스 트랜스크립타제)로부터 유래된 리버스 트랜스크립타제 (또는 보다 넓게는, 임의의 폴리머라제)를 지칭한다. 야생형 M-MLV 리버스 트랜스크립타제의 오류율은 15,000 (더 높음) 내지 27,000개 (더 낮음)에서 1개의 오류 범위인 것으로 보고되어 있다. 15,000개 중 1개의 오류율은 6.7 x 10-5의 오류율에 상응한다. 27,000개 중 1개의 오류율은 3.7 x 10-5의 오류율에 상응한다. 본원에 참조로 포함되는 문헌 [Boutabout et al. (2001) "DNA synthesis fidelity by the reverse transcriptase of the yeast retrotransposon Ty1," Nucleic Acids Res 29(11):2217-2222]을 참조한다. 따라서, 본 출원의 목적상, 용어 "오류 유발"은 15,000개 핵염기 혼입에서 1개의 오류 초과 (6.7 x 10-5 이상), 예를 들어 14,000개 핵염기에서 1개의 오류 (7.14 x 10-5 이상), 13,000개 핵염기 이하에서 1개의 오류 (7.7 x 10-5 이상), 12,000개 핵염기 이하에서 1개의 오류 (7.7 x 10-5 이상), 11,000개 핵염기 이하에서 1개의 오류 (9.1 x 10-5 이상), 10,000개 핵염기 이하에서 1개의 오류 (1 x 10-4 또는 0.0001 이상), 9,000개 핵염기 이하에서 1개의 오류 (0.00011 이상), 8,000개 핵염기 이하에서 1개의 오류 (0.00013 이상), 7,000개 핵염기 이하에서 1개의 오류 (0.00014 이상), 6,000개 핵염기 이하에서 1개의 오류 (0.00016 이상), 5,000개 핵염기 이하에서 1개의 오류 (0.0002 이상), 4,000개 핵염기 이하에서 1개의 오류 (0.00025 이상), 3,000개 핵염기 이하에서 1개의 오류 (0.00033 이상), 2,000개 핵염기 이하에서 1개의 오류 (0.00050 이상), 또는 1,000개 핵염기 이하에서 1개의 오류 (0.001 이상), 또는 500개 핵염기 이하에서 1개의 오류 (0.002 이상), 또는 250개 핵염기 이하에서 1개의 오류 (0.004 이상)인 오류율을 갖는 RT를 지칭한다.
연장 아암
용어 "연장 아암"은 리버스 트랜스크립타제에 대한 프라이머 결합 부위 및 편집 주형을 포함한, 여러 기능을 제공하는 PEgRNA의 뉴클레오티드 서열 성분을 지칭한다. 일부 실시양태, 예를 들어 도 3d에서, 연장 아암은 가이드 RNA의 3' 단부에 위치한다. 다른 실시양태, 예를 들어 도 3e에서, 연장 아암은 가이드 RNA의 5' 단부에 위치한다. 일부 실시양태에서, 연장 아암은 또한 상동성 아암을 포함한다. 다양한 실시양태에서, 연장 아암은 하기 성분을 5'에서 3' 방향으로 포함한다: 상동성 아암, 편집 주형 및 프라이머 결합 부위. 리버스 트랜스크립타제의 중합 활성이 5'에서 3' 방향으로 존재하기 때문에, 상동성 아암, 편집 주형 및 프라이머 결합 부위의 바람직한 배열은 5'에서 3' 방향으로 존재하여, 리버스 트랜스크립타제가 어닐링된 프라이머 서열에 의해 프라이밍되면, 상보적 주형 가닥으로서 편집 주형을 사용하여 DNA의 단일 가닥을 중합시킨다. 추가의 세부사항, 예컨대 연장 아암의 길이는 본원의 다른 곳에 기재되어 있다.
연장 아암은 또한, 예를 들어 도 3g (상단)에 제시된 바와 같이, 일반적으로 2개의 영역: 프라이머 결합 부위 (PBS) 및 DNA 합성 주형을 포함하는 것으로 기재될 수 있다. 프라이머 결합 부위는 프라임 편집제 복합체에 의해 닉킹될 때 표적 부위의 내인성 DNA 가닥으로부터 형성된 프라이머 서열에 결합하여, 내인성 닉킹된 가닥 상의 3' 단부를 노출시킨다. 본원에 설명된 바와 같이, PEgRNA의 연장 아암 상의 프라이머 결합 부위에 대한 프라이머 서열의 결합은 노출된 3' 단부 (즉, 프라이머 서열의 3')를 갖는 듀플렉스 영역을 생성하고, 이는 이어서 폴리머라제가 DNA 합성 주형의 길이를 따라 노출된 3' 단부로부터 DNA의 단일 가닥을 중합시키기 시작하기 위한 기질을 제공한다. 단일 가닥 DNA 생성물의 서열은 DNA 합성 주형의 상보체이다. 중합은 중합이 종결될 때까지 DNA 합성 주형 (또는 연장 아암)의 5'를 향해 계속된다. 따라서, DNA 합성 주형은 프라임 편집제 복합체의 폴리머라제에 의해 단일 가닥 DNA 생성물 (즉, 목적하는 유전자 편집 정보를 함유하는 3' 단일 가닥 DNA 플랩)로 코딩되고 궁극적으로 PE-유도된 닉 부위의 바로 하류에 위치하는 표적 부위의 상응하는 내인성 DNA 가닥을 대체하는 연장 아암의 부분을 나타낸다. 이론에 얽매이지는 않지만, DNA 합성 주형의 중합은 종결 사건까지 연장 아암의 5' 단부를 향해 계속된다. 중합은 (a) PEgRNA의 5' 말단에 도달하는 것 (예를 들어, DNA 폴리머라제가 단순히 주형으로부터 진행하는 5' 연장 아암의 경우), (b) 통과할 수 없는 RNA 2차 구조 (예를 들어, 헤어핀 또는 스템/루프)에 도달하는 것, 또는 (c) 복제 종결 신호, 예를 들어 폴리머라제를 차단 또는 억제하는 특이적 뉴클레오티드 서열, 또는 핵산 위상 신호, 예컨대 슈퍼코일드 DNA 또는 RNA에 도달하는 것을 포함하나 이에 제한되지는 않는 다양한 방식으로 종결될 수 있다. 유효량
본원에 사용된 용어 "유효량"은 목적하는 생물학적 반응을 도출하기에 충분한 생물학적 활성제의 양을 지칭한다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, 프라임 편집제의 유효량은 표적 부위 뉴클레오티드 서열, 예를 들어 게놈을 편집하기에 충분한 편집제의 양을 지칭할 수 있다. 일부 실시양태에서, 본원에 제공된 프라임 편집제, 예를 들어 닉카제 Cas9 도메인 및 리버스 트랜스크립타제를 포함하는 융합 단백질의 유효량은 융합 단백질에 의해 특이적으로 결합되고 편집되는 표적 부위의 편집을 유도하기에 충분한 융합 단백질의 양을 지칭할 수 있다. 통상의 기술자에 의해 인지될 바와 같이, 작용제, 예를 들어 융합 단백질, 뉴클레아제, 하이브리드 단백질, 단백질 이량체, 단백질 (또는 단백질 이량체) 및 폴리뉴클레오티드의 복합체, 또는 폴리뉴클레오티드의 유효량은 다양한 인자, 예를 들어 목적하는 생물학적 반응, 예를 들어 편집될 특정 대립유전자, 게놈 또는 표적 부위, 표적화될 세포 또는 조직, 및 사용될 작용제에 따라 달라질 수 있다.
기능적 등가물
용어 "기능적 등가물"은 제1 생체분자와 기능상 등가이지만 구조상 반드시 등가인 것은 아닌 제2 생체분자를 지칭한다. 예를 들어, "Cas9 등가물"은 Cas9와 동일하거나 실질적으로 동일한 기능을 갖지만 반드시 동일한 아미노산 서열을 갖는 것은 아닌 단백질을 지칭한다. 본 개시내용의 문맥에서, 본 명세서는 전반에 걸쳐 "단백질 X 또는 그의 기능적 등가물"을 언급한다. 이러한 문맥에서, 단백질 X의 "기능적 등가물"은 등가의 기능을 보유하는 단백질 X의 임의의 상동체, 파라로그, 단편, 자연 발생, 조작된, 돌연변이된 또는 합성 버전을 포괄한다.
융합 단백질
본원에 사용된 용어 "융합 단백질"은 적어도 2종의 상이한 단백질로부터의 단백질 도메인을 포함하는 하이브리드 폴리펩티드를 지칭한다. 1종의 단백질은 융합 단백질의 아미노-말단 (N-말단) 부분에 또는 카르복시-말단 (C-말단) 단백질에 위치하며, 따라서 각각 "아미노-말단 융합 단백질" 또는 "카르복시-말단 융합 단백질"을 형성할 수 있다. 단백질은 상이한 도메인, 예를 들어 핵산 결합 도메인 (예를 들어, 표적 부위에 대한 단백질의 결합을 지시하는 Cas9의 gRNA 결합 도메인) 및 핵산 절단 도메인 또는 핵산 편집 단백질의 촉매 도메인을 포함할 수 있다. 또 다른 예는 리버스 트랜스크립타제에 대한 Cas9 또는 그의 등가물을 포함한다. 본원에 제공된 임의의 단백질은 관련 기술분야에 공지된 임의의 방법에 의해 생산될 수 있다. 예를 들어, 본원에 제공된 단백질은 재조합 단백질 발현 및 정제를 통해 생산될 수 있으며, 이는 펩티드 링커를 포함하는 융합 단백질에 특히 적합하다. 재조합 단백질 발현 및 정제를 위한 방법은 널리 공지되어 있고, 문헌 [Green and Sambrook, Molecular Cloning: A Laboratory Manual (4th ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (2012))]에 기재된 것을 포함하며, 이의 전체 내용은 본원에 참조로 포함된다.
유전자 생성물
본원에 사용된 용어 "유전자 생성물"은 핵산 서열에 의해 코딩된 임의의 생성물을 지칭한다. 따라서, 유전자 생성물은, 예를 들어 1차 전사체, 성숙 전사체, 프로세싱된 전사체, 또는 전사체에 의해 코딩된 단백질 또는 펩티드일 수 있다. 따라서, 유전자 생성물의 예는 mRNA, rRNA, tRNA, 헤어핀 RNA, 마이크로RNA (miRNA), shRNA, siRNA 및 펩티드 및 단백질, 예를 들어 리포터 단백질 또는 치료 단백질을 포함한다.
관심 유전자 (GOI)
용어 "관심 유전자" 또는 "GOI"는 관심 생체분자 (예를 들어, 단백질 또는 RNA 분자)를 코딩하는 유전자를 지칭한다. 관심 단백질은 임의의 세포내 단백질, 막 단백질 또는 세포외 단백질, 예를 들어 핵 단백질, 전사 인자, 핵 막 수송체, 세포내 소기관 연관 단백질, 막 수용체, 촉매 단백질 및 효소, 치료 단백질, 막 단백질, 막 수송 단백질, 신호 전달 단백질 또는 면역학적 단백질 (예를 들어, IgG 또는 다른 항체 단백질) 등을 포함할 수 있다. 관심 유전자는 또한 메신저 RNA (mRNA), 전달 RNA (tRNA), 리보솜 RNA (rRNA), 소형 핵 RNA (snRNA), 안티센스 RNA, 가이드 RNA, 마이크로RNA (miRNA), 소형 간섭 RNA (siRNA) 및 세포-유리 RNA (cfRNA)를 포함하나 이에 제한되지는 않는 RNA 분자를 코딩할 수 있다.
가이드 RNA ("gRNA")
본원에 사용된 용어 "가이드 RNA"는 대부분 통상적으로 CRISPR-Cas9의 Cas 단백질과 회합되고 Cas9와 회합되어, Cas9 단백질을 가이드 RNA의 프로토스페이서 서열에 대한 상보성을 포함하는 DNA 분자 내의 특이적 서열로 지시하는 가이드 핵산의 특정한 유형이다. 다른 곳에 기재된 바와 같이, PEgRNA는 이러한 분자가 본원에 개시된 프라임 편집제와 함께 사용될 수 있게 하는 가이드의 3' 또는 5' 단부 상의 연장 아암을 추가로 포함하는 가이드 RNA의 하위카테고리이다. 용어 "가이드 RNA"는 또한 자연 발생이든 비-자연 발생이든 (예를 들어, 조작된 것이든 재조합이든), Cas9 등가물, 상동체, 오르토로그 또는 파라로그와 회합하고, 달리 Cas9 등가물을 특이적 표적 뉴클레오티드 서열에 국재화하도록 프로그램화하는 등가의 가이드 핵산 분자를 포괄한다. Cas9 등가물은 Cpf1 (유형-V CRISPR-Cas 시스템), C2c1 (유형 V CRISPR-Cas 시스템), C2c2 (유형 VI CRISPR-Cas 시스템) 및 C2c3 (유형 V CRISPR-Cas 시스템)을 포함한 임의의 유형의 CRISPR 시스템 (예를 들어, 유형 II, V, VI)으로부터의 다른 napDNAbp를 포함할 수 있다. 추가의 Cas-등가물은 문헌 [Makarova et al., "C2c2 is a single-component programmable RNA-guided RNA-targeting CRISPR effector," Science 2016; 353(6299)]에 기재되어 있으며, 이의 내용은 본원에 참조로 포함된다. 가이드 RNA의 예시적인 서열 및 구조가 본원에 제공된다. 추가로, 적절한 가이드 RNA 서열을 설계하는 방법이 본원에 제공된다. 본원에 사용된 "가이드 RNA"는 또한 본원에 개시된 프라임 편집 방법 및 조성물에 대해 발명된 "프라임 편집제 가이드 RNA" (또는 "PEgRNA")로 지칭되는 변형된 형태의 가이드 RNA와 대조되도록 "전통적인 가이드 RNA"로 지칭될 수 있다.
가이드 RNA 또는 PEgRNA는 하기를 포함하나 이에 제한되지는 않는 다양한 구조적 요소를 포함할 수 있다:
스페이서 서열 - 표적 DNA 내의 프로토스페이서 (본원 하기에 정의된 바와 같음)에 결합하는 가이드 RNA 또는 PEgRNA (약 10 내지 약 40개 (예를 들어, 약 10, 약 15, 약 20, 약 25, 약 30개) 뉴클레오티드 길이를 가짐) 내의 서열.
gRNA 코어 (또는 gRNA 스캐폴드 또는 백본 서열) - napDNAbp (예를 들어, Cas9) 결합을 담당하는 gRNA 내의 서열을 지칭하며, 이는 napDNAbp (예를 들어, Cas9)를 표적 DNA로 가이드하는데 사용되는 스페이서/표적화 서열을 포함하지 않는다.
연장 아암 - 상동성 아암, 편집 주형 및 프라이머 결합 부위를 포함하는 5' 또는 3' 단부에서의 가이드 RNA의 연장된 부분을 지칭한다. 이 성분은 다른 곳에 추가로 정의된다.
상동성 아암 - 내인성 가닥을 대체함으로써 표적 DNA 부위 내로 통합될, 생성된 리버스 트랜스크립타제-코딩된 단일 가닥 DNA 플랩의 부분을 코딩하는 연장 아암의 부분(들)을 지칭한다. 상동성 아암에 의해 코딩되는 단일 가닥 DNA 플랩의 부분은 표적 DNA 서열의 비-편집된 가닥에 상보적이며, 이는 내인성 가닥의 대체 및 그 자리에서의 단일 가닥 DNA 플랩의 어닐링을 용이하게 함으로써, 편집을 설치한다. 이 성분은 다른 곳에 추가로 정의된다.
편집 주형 - 리버스 트랜스크립타제에 의해 합성되는 단일 가닥 DNA 플랩 내 목적하는 편집을 코딩하는 연장 아암의 부분을 지칭한다. 이 성분은 다른 곳에 추가로 정의된다.
프라이머 결합 부위 - 프라이머 서열에 어닐링되는 연장 아암의 부분을 지칭하며, 이는 표적 DNA의 가닥으로부터 그에 대한 Cas9-매개 닉카제 작용 후에 형성된다. 이 성분은 다른 곳에 추가로 정의된다.
전사 종결인자 - 가이드 RNA 또는 PEgRNA는 이 분자의 3'에 전사 종결 서열을 포함할 수 있다. 전형적으로, 전사 종결인자 서열 (예를 들어, 서열식별번호: 1361560-1361565)은 약 70 내지 약 125개 뉴클레오티드 길이이지만, 더 짧고 더 긴 전사 종결인자 서열이 고려되고, 관련 기술분야에 공지된 임의의 것이 사용될 수 있다.
플랩 엔도뉴클레아제 (예를 들어, FEN1)
본원에 사용된 용어 "플랩 엔도뉴클레아제"는 5' 단일 가닥 DNA 플랩의 제거를 촉매하는 효소를 지칭한다. 이들은 DNA 복제를 비롯한 세포 과정 동안 형성된 5' 플랩의 제거를 프로세싱하는 자연 발생 효소이다. 본원에 기재된 프라임 편집 방법은 프라임 편집 동안 표적 부위에 형성된 내인성 DNA의 5' 플랩을 제거하기 위해 내인성으로 공급된 플랩 엔도뉴클레아제 또는 트랜스로 제공된 것을 이용할 수 있다. 플랩 엔도뉴클레아제는 관련 기술분야에 공지되어 있고, 문헌 [Patel et al., "Flap endonucleases pass 5′-flaps through a flexible arch using a disorder-thread-order mechanism to confer specificity for free 5′-ends," Nucleic Acids Research, 2012, 40(10): 4507-4519 및 Tsutakawa et al., "Human flap endonuclease structures, DNA double-base flipping, and a unified understanding of the FEN1 superfamily," Cell, 2011, 145(2): 198-211 및 Balakrishnan et al., "Flap Endonuclease 1," Annu Rev Biochem, 2013, Vol 82: 119-138] (이들 각각은 본원에 참조로 포함됨)에 기재된 바와 같이 발견될 수 있다. 예시적인 플랩 엔도뉴클레아제는 하기 아미노산 서열로 나타내어질 수 있는 FEN1이다:
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융합 단백질
본원에 사용된 용어 "융합 단백질"은 적어도 2종의 상이한 단백질로부터의 단백질 도메인을 포함하는 하이브리드 폴리펩티드를 지칭한다. 1종의 단백질은 융합 단백질의 아미노-말단 (N-말단) 부분에 또는 카르복시-말단 (C-말단) 단백질에 위치하며, 따라서 각각 "아미노-말단 융합 단백질" 또는 "카르복시-말단 융합 단백질"을 형성할 수 있다. 단백질은 상이한 도메인, 예를 들어 핵산 결합 도메인 (예를 들어, 표적 부위에 대한 단백질의 결합을 지시하는 Cas9의 gRNA 결합 도메인) 및 핵산 절단 도메인 (예를 들어, Cas9 닉카제, napDNAbp) 또는 핵산 편집 단백질의 촉매 도메인 (예를 들어, RT 도메인)을 포함할 수 있다. 또 다른 예는 리버스 트랜스크립타제에 융합된 napDNAbp (예를 들어, Cas9) 또는 그의 등가물을 포함한다. 본원에 제공된 임의의 단백질은 관련 기술분야에 공지된 임의의 방법에 의해 생산될 수 있다. 예를 들어, 본원에 제공된 단백질은 재조합 단백질 발현 및 정제를 통해 생산될 수 있으며, 이는 펩티드 링커를 포함하는 융합 단백질에 특히 적합하다. 재조합 단백질 발현 및 정제를 위한 방법은 널리 공지되어 있고, 문헌 [Green and Sambrook, Molecular Cloning: A Laboratory Manual (4th ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (2012))]에 기재된 것을 포함하며, 이의 전체 내용은 본원에 참조로 포함된다.
상동성 아암
용어 "상동성 아암"은 내인성 가닥을 대체함으로써 표적 DNA 부위 내로 통합될, 생성된 리버스 트랜스크립타제-코딩된 단일 가닥 DNA 플랩의 서열을 포함하는 연장 아암의 부분을 지칭한다. 상동성 아암에 의해 코딩되는 단일 가닥 DNA 플랩의 부분은 표적 DNA 서열의 비-편집된 가닥에 상보적이며, 이는 내인성 가닥의 대체 및 그 자리에서의 단일 가닥 DNA 플랩의 어닐링을 용이하게 함으로써, 편집을 설치한다. 이 성분은 다른 곳에 추가로 정의된다.
숙주 세포
본원에 사용된 용어 "숙주 세포"는 본원에 기재된 벡터, 예를 들어 napDNAbp 또는 napDNAbp 등가물 (예를 들어, Cas9 또는 등가물) 및 리버스 트랜스크립타제를 포함하는 융합 단백질을 코딩하는 핵산 분자를 포함하는 벡터를 숙주로서 받고, 복제하고, 발현할 수 있는 세포를 지칭한다.
단리된
"단리된"은 자연 상태로부터 변경 또는 제거된 것을 의미한다. 예를 들어, 살아있는 동물에 자연적으로 존재하는 핵산 또는 펩티드는 "단리된" 것이 아니지만, 그의 자연 상태의 공존 물질로부터 부분적으로 또는 완전히 분리된 동일한 핵산 또는 펩티드는 "단리된" 것이다. 단리된 핵산 또는 단백질은 실질적으로 정제된 형태로 존재할 수 있거나 또는 비-천연 환경, 예컨대, 예를 들어 숙주 세포에 존재할 수 있다.
일부 실시양태에서, 관심 유전자는 단리된 핵산에 의해 코딩된다. 본원에 사용된 용어 "단리된"은 그의 원래 또는 천연 환경 (예를 들어, 자연 발생인 경우에 자연 환경)으로부터 제거되는 본원에 제공된 바와 같은 물질의 특징을 지칭한다. 따라서, 살아있는 동물에 존재하는 자연 발생 폴리뉴클레오티드 또는 단백질 또는 폴리펩티드는 단리된 것이 아니지만, 자연계 내 공존 물질의 일부 또는 모두로부터 인간 개입에 의해 분리된 동일한 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드는 단리된 것이다. 따라서, 인공 또는 조작된 물질, 예를 들어 비-자연 발생 핵산 구축물, 예컨대 본원에 기재된 발현 구축물 및 벡터는 또한 단리된 것으로 지칭된다. 물질은 단리되기 위해 정제될 필요는 없다. 따라서, 물질은 벡터의 일부 및/또는 조성물의 일부일 수 있고, 이러한 벡터 또는 조성물은 사실상 물질이 발견된 환경의 일부가 아니라는 점에서 상기 물질은 여전히 단리된 것일 수 있다.
napDNAbp
본원에 사용된 용어 "핵산 프로그램가능한 DNA 결합 단백질" 또는 "napDNAbp" (Cas9가 한 예임)는 RNA:DNA 혼성화를 사용하여 DNA 분자 내의 특이적 서열을 표적화하고 그에 결합하는 단백질을 지칭한다. 각각의 napDNAbp는 적어도 1개의 가이드 핵산 (예를 들어, 가이드 RNA)과 회합되며, 이는 napDNAbp를 가이드 핵산 또는 그의 부분 (예를 들어, 가이드 RNA의 프로토스페이서)에 상보적인 DNA 가닥 (즉, 표적 가닥)을 포함하는 DNA 서열에 국재화시킨다. 다시 말해서, 가이드 핵산은 napDNAbp (예를 들어, Cas9 또는 등가물)를 상보적 서열에 국재화시키고 결합하도록 "프로그램화한다".
이론에 얽매이지는 않지만, napDNAbp - 가이드 RNA 복합체의 결합 메카니즘은 일반적으로 R-루프를 형성하여 napDNAbp가 이중 가닥 DNA 표적의 풀림을 유도하고, 그에 의해 napDNAbp에 의해 결합된 영역에서 가닥을 분리하는 단계를 포함한다. 이어서, 가이드 RNA 프로토스페이서는 "표적 가닥"에 혼성화된다. 이는 표적 가닥에 상보적인 "비-표적 가닥"을 대체하여, R-루프의 단일 가닥 영역을 형성한다. 일부 실시양태에서, napDNAbp는 1개 이상의 뉴클레아제 활성을 포함하며, 이는 이어서 DNA를 절단하여 다양한 유형의 병변을 남긴다. 예를 들어, napDNAbp는 제1 위치에서 비-표적 가닥을 절단하고/거나 제2 위치에서 표적 가닥을 절단하는 뉴클레아제 활성을 포함할 수 있다. 뉴클레아제 활성에 따라, 표적 DNA는 절단되어 "이중 가닥 파괴"를 형성할 수 있고, 이에 의해 양쪽 가닥이 절단된다. 다른 실시양태에서, 표적 DNA는 단일 부위에서만 절단될 수 있고, 즉 DNA는 1개의 가닥 상에서 "닉킹"된다. 상이한 뉴클레아제 활성을 갖는 예시적인 napDNAbp는 "Cas9 닉카제" ("nCas9") 및 뉴클레아제 활성을 갖지 않는 탈활성화된 Cas9 ("기능상실 Cas9" 또는 "dCas9")를 포함한다. 이들 및 다른 napDNAbp에 대한 예시적인 서열이 본원에 제공된다.
링커
본원에 사용된 용어 "링커"는 2개의 다른 분자 또는 모이어티를 연결하는 분자를 지칭한다. 링커는 관련 기술분야에 널리 공지되어 있고, 이들이 연결되는 구조의 적절한 기능을 용이하게 하기 위해 핵산 또는 아미노산의 임의의 적합한 조합을 포함할 수 있다. 링커는 일련의 아미노산일 수 있다. 링커는 2개의 융합 단백질을 연결하는 링커의 경우에 아미노산 서열일 수 있다. 예를 들어, napDNAbp (예를 들어, Cas9)는 아미노산 링커 서열에 의해 리버스 트랜스크립타제에 융합될 수 있다. 링커는 또한 2개의 뉴클레오티드 서열을 함께 연결하는 경우에 뉴클레오티드 서열일 수 있다. 예를 들어, 본 경우에, 전통적인 가이드 RNA는 DNA 합성 주형 (예를 들어, RT 주형 서열) 및 프라이머 결합 부위를 포함할 수 있는 프라임 편집제 가이드 RNA의 RNA 연장부에 스페이서 또는 링커 뉴클레오티드 서열을 통해 연결된다. 다른 실시양태에서, 링커는 유기 분자, 기, 중합체 또는 화학적 모이어티이다. 일부 실시양태에서, 링커는 5-100개 아미노산 길이, 예를 들어 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 30-35, 35-40, 40-45, 45-50, 50-60, 60-70, 70-80, 80-90, 90-100, 100-150 또는 150-200개 아미노산 길이이다. 일부 실시양태에서, 링커는 5-100개 뉴클레오티드 길이, 예를 들어 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 30-35, 35-40, 40-45, 45-50, 50-60, 60-70, 70-80, 80-90, 90-100, 100-150, 150-200, 200-300, 300-500, 500-1000, 1000-2000 또는 2000-5000개 뉴클레오티드이다. 보다 긴 또는 보다 짧은 링커가 또한 고려된다.
닉카제
용어 "닉카제"는 2개의 뉴클레아제 도메인 중 하나가 불활성화된 napDNAbp (예를 들어, Cas9)를 지칭한다. 이 효소는 표적 DNA의 한 가닥만을 절단할 수 있다.
핵 국재화 서열 (NLS)
용어 "핵 국재화 서열" 또는 "NLS"는, 예를 들어 핵 수송에 의한 세포 핵 내로의 단백질의 유입을 촉진하는 아미노산 서열을 지칭한다. 핵 국재화 서열은 관련 기술분야에 공지되어 있고, 통상의 기술자에게 명백할 것이다. 예를 들어, NLS 서열은 2001년 5월 31일에 WO2001/038547로서 공개된 2000년 11월 23일에 출원된 국제 PCT 출원 PCT/EP2000/011690 (Plank et al.)에 기재되어 있으며, 그의 내용은 예시적인 핵 국재화 서열의 개시내용에 대해 본원에 참조로 포함된다. 일부 실시양태에서, NLS는 아미노산 서열 PKKKRKV (서열식별번호: 1361531) 또는 MDSLLMNRRKFLYQFKNVRWAKGRRETYLC (서열식별번호: 1361533)를 포함한다.
핵산 분자
본원에 사용된 용어 "핵산"은 뉴클레오티드의 중합체 (즉, 다수, 1개 초과 (예를 들어, 2, 3, 4개 등))를 지칭한다. 중합체는 천연 뉴클레오시드 (즉, 아데노신, 티미딘, 구아노신, 시티딘, 우리딘, 데옥시아데노신, 데옥시티미딘, 데옥시구아노신 및 데옥시시티딘), 뉴클레오시드 유사체 (예를 들어, 2-아미노아데노신, 2-티오티미딘, 이노신, 피롤로-피리미딘, 3-메틸 아데노신, 5-메틸시티딘, C5 브로모우리딘, C5 플루오로우리딘, C5 아이오도우리딘, C5 프로피닐 우리딘, C5 프로피닐 시티딘, C5 메틸시티딘, 7 데아자아데노신, 7 데아자구아노신, 8 옥소아데노신, 8 옥소구아노신, O(6) 메틸구아닌, 4-아세틸시티딘, 5-(카르복시히드록시메틸)우리딘, 디히드로우리딘, 메틸슈도우리딘, 1-메틸 아데노신, 1-메틸 구아노신, N6-메틸 아데노신 및 2-티오시티딘), 화학적으로 변형된 염기, 생물학적으로 변형된 염기 (예를 들어, 메틸화 염기), 삽입된 염기, 변형된 당 (예를 들어, 2'-플루오로리보스, 리보스, 2'-데옥시리보스, 2'-O-메틸시티딘, 아라비노스 및 헥소스), 또는 변형된 포스페이트 기 (예를 들어, 포스포로티오에이트 및 5'-N 포스포르아미다이트 연결)를 포함할 수 있다.
핵염기
본원에 사용된 용어 "핵염기" (또한 "질소함유 염기" 또는 종종 간단히 "염기"로 공지됨)는 이후 뉴클레오티드의 성분이 되는 뉴클레오시드를 형성하는 질소-함유 생물학적 화합물이며, 이들 단량체 모두는 핵산의 기초 빌딩 블록을 구성한다. 염기 쌍을 형성하고 하나를 또 다른 것 상에 스태킹하는 핵염기의 능력은 직접적으로 장쇄 나선형 구조, 예컨대 리보핵산 (RNA) 및 데옥시리보핵산 (DNA)으로 이어진다.
아데닌 (A), 시토신 (C), 구아닌 (G), 티민 (T) 및 우라실 (U)인 5종의 핵염기는 1차 또는 정규로서 지칭될 수 있다. 이들은 유전자 코드의 기본 단위로서 기능하며, 염기 A, G, C 및 T는 DNA에서 발견되는 반면 A, G, C 및 U는 RNA에서 발견된다. 티민 및 우라실은 T가 U에서 결여된 메틸 기를 포함하는 것을 제외하고는 동일하다. DNA 및 RNA는 또한 변형된 핵염기를 함유할 수 있다. 예를 들어, 아데노신 및 구아노신 핵염기의 경우에, 대안적 핵염기는 각각 이노신, 크산토신 및 7-메틸구아노신의 대안적 뉴클레오시드에 상응하는 하이포크산틴, 크산틴 또는 7-메틸구아닌을 포함할 수 있다. 추가로, 예를 들어 시토신, 티민 또는 우리딘 핵염기의 경우에, 대안적 핵염기는 각각 디히드로우리딘, 5-메틸시티딘 및 5-히드록시메틸시티딘의 대안적 뉴클레오시드에 상응하는 5,6-디히드로우라실, 5-메틸시토신 또는 5-히드록시메틸시토신을 포함할 수 있다. 핵염기는 또한 핵염기 유사체를 포함할 수 있으며, 이의 막대한 수가 관련 기술분야에 공지되어 있다. 전형적으로, 유사체 핵염기는 특히 상이한 염기 쌍형성 및 염기 스태킹 특성을 부여한다. 예는 모든 4종의 정규 염기와 쌍형성할 수 있는 범용 염기 및 쇄의 특성에 영향을 미치는 포스페이트-당 백본 유사체, 예컨대 PNA (PNA는 심지어 삼중 나선을 형성할 수 있음)를 포함한다. 핵산 유사체는 또한 "제노 핵산"으로도 불리고, 대안적 생화학에 기초한 새로운 내지는 자연 형태의 생명의 설계인 이종생물학의 주요 기둥 중 하나를 나타낸다. 인공 핵산은 펩티드 핵산 (PNA), 모르폴리노 및 잠금 핵산 (LNA), 뿐만 아니라 글리콜 핵산 (GNA) 및 트레오스 핵산 (TNA)을 포함한다. 이들 각각은 분자의 백본에 대한 변화에 의해 자연 발생 DNA 또는 RNA와 구별된다. 유사체 예는 (예를 들어, 2-아미노아데노신, 2-티오티미딘, 이노신, 피롤로-피리미딘, 3-메틸 아데노신, 5-메틸시티딘, C5 브로모우리딘, C5 플루오로우리딘, C5 아이오도우리딘, C5 프로피닐 우리딘, C5 프로피닐 시티딘, C5 메틸시티딘, 7 데아자아데노신, 7 데아자구아노신, 8 옥소아데노신, 8 옥소구아노신, O(6) 메틸구아닌, 4-아세틸시티딘, 5-(카르복시히드록시메틸)우리딘, 디히드로우리딘, 메틸슈도우리딘, 1-메틸 아데노신, 1-메틸 구아노신, N6-메틸 아데노신 및 2-티오시티딘), 화학적으로 변형된 염기, 생물학적으로 변형된 염기 (예를 들어, 메틸화 염기), 삽입된 염기, 변형된 당 (예를 들어, 2'-플루오로리보스, 리보스, 2'-데옥시리보스, 2'-O-메틸시티딘, 아라비노스 및 헥소스), 또는 변형된 포스페이트 기 (예를 들어, 포스포로티오에이트 및 5'-N 포스포르아미다이트 연결)이다.
PEgRNA
본원에 사용된 용어 "프라임 편집제 가이드 RNA" 또는 "PEgRNA" 또는 "연장된 가이드 RNA"는 본원에 기재된 프라임 편집 방법, 조성물 및 시스템에 사용하기 위한 1개 이상의 추가의 서열을 포함하도록 변형된 특수화된 형태의 가이드 RNA를 지칭한다. 본원에 기재된 바와 같이, 프라임 편집제 가이드 RNA는 핵산 서열의 1개 이상의 "연장된 영역"을 포함한다. 연장된 영역은 단일 가닥 RNA를 포함할 수 있지만, 이에 제한되지는 않는다. 추가로, 연장된 영역은 전통적인 가이드 RNA의 3' 단부에서 발생할 수 있다. 다른 배열에서, 연장된 영역은 전통적인 가이드 RNA의 5' 단부에서 발생할 수 있다. 또 다른 배열에서, 연장된 영역은 전통적인 가이드 RNA의 단부들 중 하나보다는, 분자내 영역에서, 예를 들어 napDNAbp에 회합 및/또는 결합하는 gRNA 코어 영역에서 발생할 수 있다. 연장된 영역은 (a) 편집될 내인성 표적 DNA와 상동이도록 설계되었고, (b) 내인성 표적 DNA 내로 도입 또는 통합될 적어도 1개의 목적하는 뉴클레오티드 변화 (예를 들어, 전이, 전환, 결실, 삽입 또는 그의 조합)를 포함하는 단일 가닥 상보적 DNA (cDNA)를 코딩하는 단일 가닥 RNA 분자인 "리버스 트랜스크립타제 주형 서열"을 포함한다. 연장된 영역은 또한 다른 기능적 서열 요소, 예컨대 비제한적으로 "프라이머 결합 부위" 및/또는 "스페이서 또는 링커" 서열을 포함할 수 있다. 본원에 사용된 "프라이머 결합 부위"는 R-루프의 닉킹된 DNA로부터 생성된 3' 단부를 갖는 단일 가닥 DNA 서열에 혼성화하고 리버스 트랜스크립타제에 대한 프라이머를 포함하는 서열을 포함한다.
일부 실시양태에서, PEgRNA는 도 3a에 의해 나타내어지며, 이는 5' 연장 아암, 스페이서 및 gRNA 코어를 갖는 PEgRNA를 보여준다. 5' 연장부는 5'에서 3' 방향으로 리버스 트랜스크립타제 주형, 프라이머 결합 부위 및 링커를 추가로 포함한다.
일부 실시양태에서, PEgRNA는 도 3b에 의해 나타내어지며, 이는 3' 연장 아암, 스페이서 및 gRNA 코어를 갖는 PEgRNA를 보여준다. 3' 연장부는 5'에서 3' 방향으로 리버스 트랜스크립타제 주형 및 프라이머 결합 부위를 추가로 포함한다.
또 다른 실시양태에서, PEgRNA는 도 27에 의해 나타내어지며, 이는 5'에서 3' 방향으로 스페이서 (1), gRNA 코어 (2) 및 연장 아암 (3)을 갖는 PEgRNA를 보여준다. 연장 아암 (3)은 PEgRNA의 3' 단부에 있다. 연장 아암 (3)은 5'에서 3' 방향으로 "프라이머 결합 부위" (A), "편집 주형" (B) 및 "상동성 아암" (C)을 추가로 포함한다. 연장 아암 (3)은 또한 3' 및 5' 단부에, 동일한 서열 또는 상이한 서열일 수 있는 임의적인 변형제 영역을 포함할 수 있다. 추가로, PEgRNA의 3' 단부는 전사 종결인자 서열을 포함할 수 있다. PEgRNA의 이들 서열 요소는 본원에 추가로 기재되고 정의된다. 추가로, 본 명세서는 첨부된 서열 목록에서 본원에 개시된 방법에 따라 설계된 예시적인 PEgRNA를 개시한다.
또 다른 실시양태에서, PEgRNA는 도 28에 의해 나타내어지며, 이는 5'에서 3' 방향으로 연장 아암 (3), 스페이서 (1) 및 gRNA 코어 (2)를 갖는 PEgRNA를 보여준다. 연장 아암 (3)은 PEgRNA의 5' 단부에 있다. 연장 아암 (3)은 3'에서 5' 방향으로 "프라이머 결합 부위" (A), "편집 주형" (B) 및 "상동성 아암" (C)을 추가로 포함한다. 연장 아암 (3)은 또한 3' 및 5' 단부에, 동일한 서열 또는 상이한 서열일 수 있는 임의적인 변형제 영역을 포함할 수 있다. PEgRNA는 또한 3' 단부에 전사 종결인자 서열을 포함할 수 있다. PEgRNA의 이들 서열 요소는 본원에 추가로 기재되고 정의된다.
펩티드 태그
용어 "펩티드 태그"는 다양한 목적, 예컨대 가시화, 확인, 국재화, 정제, 가용화, 분리 등을 위해 단백질의 조작을 용이하게 하는 1개 이상의 기능을 단백질 상에 부여하기 위해 단백질 서열에 유전자 융합된 펩티드 아미노산 서열을 지칭한다. 펩티드 태그는 목적 또는 기능에 의해 카테고리화된 다양한 유형의 태그를 포함할 수 있으며, 이는 "친화성 태그" (단백질 정제를 용이하게 하기 위함), "가용화 태그" (단백질의 적절한 폴딩을 보조하기 위함), "크로마토그래피 태그" (단백질의 크로마토그래피 특성을 변경하기 위함), "에피토프 태그" (고친화도 항체에 결합하기 위함), "형광 태그" (세포 또는 시험관내에서 단백질의 가시화를 용이하게 하기 위함)를 포함할 수 있다.
PE1
본원에 사용된 바와 같이, "PE1"은 하기 구조: [NLS]-[Cas9(H840A)]-[링커]-[MMLV_RT(wt)] + 목적하는 PEgRNA를 갖는, Cas9(H840A) 및 야생형 MMLV RT를 포함하는 융합 단백질을 포함하는 PE 복합체를 지칭하며, 여기서 PE 융합체는 하기와 같이 제시되는 서열식별번호: 1361515의 아미노산 서열을 갖는다:
Figure pct00002
설명:
핵 국재화 서열 (NLS) 상단: (서열식별번호: 1361532), 하단: (서열식별번호: 1361541)
Cas9(H840A) (서열식별번호: 1361454)
33개-아미노산 링커 (서열식별번호: 1361528)
M-MLV 리버스 트랜스크립타제 (서열식별번호: 1361485).
PE2
본원에 사용된 바와 같이, "PE2"는 하기 구조: [NLS]-[Cas9(H840A)]-[링커]-[MMLV_RT(D200N)(T330P)(L603W)(T306K)(W313F)] + 목적하는 PEgRNA를 갖는, Cas9(H840A) 및 변이체 MMLV RT를 포함하는 융합 단백질을 포함하는 PE 복합체를 지칭하며, 여기서 PE 융합체는 하기와 같이 제시되는 서열식별번호: 1361516의 아미노산 서열을 갖는다:
Figure pct00003
설명:
핵 국재화 서열 (NLS) 상단: (서열식별번호: 1361532), 하단: (서열식별번호: 1361541)
Cas9(H840A) (서열식별번호: 1361454)
33개-아미노산 링커 (서열식별번호: 1361528)
M-MLV 리버스 트랜스크립타제 (서열식별번호: 1361514).
PE3
본원에 사용된 "PE3"은 PE2 플러스 PE2와 복합체화하고 비-편집된 DNA 가닥에 닉을 도입하여 편집된 가닥의 우선적 대체를 유도하는 제2-가닥 닉킹 가이드 RNA를 지칭한다.
PE3b
본원에 사용된 "PE3b"는 PE3을 지칭하지만, 여기서 제2-가닥 닉킹 가이드 RNA는 제2 가닥 닉이 목적하는 편집이 설치될 때까지 도입되지 않도록 시간적 제어를 위해 설계된다. 이는 단지 편집된 가닥에만 매칭되고 원래 대립유전자에는 매칭되지 않는 스페이서 서열을 갖는 gRNA를 설계함으로써 달성된다. 이하에서 PE3b로 지칭되는 이러한 전략을 사용할 때, 프로토스페이서와 비편집된 대립유전자 사이의 미스매치는 PAM 가닥 상의 편집 사건이 일어날 때까지 sgRNA에 의한 닉킹을 불리하게 할 것이다.
PE-짧은 형
본원에 사용된 "PE-짧은 형"은 C-말단이 말단절단된 리버스 트랜스크립타제에 융합된 PE 구축물을 지칭하고, 하기 아미노산 서열을 갖는다:
Figure pct00004
설명:
핵 국재화 서열 (NLS) 상단: (서열식별번호: 1361532), 하단: (서열식별번호: 1361541)
Cas9(H840A) (서열식별번호: 1361454)
33개-아미노산 링커 1 (서열식별번호: 1361528)
M-MLV 말단절단된 리버스 트랜스크립타제
(서열식별번호: 1361597)
퍼센트 동일성
서열 (예를 들어, 핵산 또는 아미노산)의 "퍼센트 동일성", "서열 동일성", "% 동일성" 또는 "% 서열 동일성" (이들은 본원에서 상호교환가능하게 사용될 수 있음)은 2개의 서열 (예를 들어, 핵산 또는 아미노산) 사이의 유사성의 정량적 측정치를 지칭한다. 인간과 다른 종 사이의 게놈 DNA 서열, 인트론 및 엑손 서열 및 아미노산 서열의 퍼센트 동일성은 종 유형에 따라 달라지며, 침팬지는 각각의 카테고리에서 모든 종의 인간과 가장 높은 퍼센트 동일성을 갖는다. 퍼센트 동일성은 문헌 [Karlin and Altschul, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:5873-77, 1993]에서와 같이 변형된 문헌 [Karlin and Altschul, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:2264-68, 1990]의 알고리즘을 사용하여 결정될 수 있다. 이러한 알고리즘은 문헌 [Altschul et al., J. Mol. Biol. 215:403-10, 1990]의 NBLAST 및 XBLAST 프로그램 (버전 2.0) 내에 혼입된다. BLAST 단백질 검색을 XBLAST 프로그램, 점수=50, 워드 길이=3으로 수행하여 관심 단백질 분자에 대해 상동인 아미노산 서열을 수득할 수 있다. 갭이 2개의 서열 사이에 존재하는 경우에, 갭드(Gapped) BLAST가 문헌 [Altschul et al., Nucleic Acids Res. 25(17):3389-3402, 1997]에 기재된 바와 같이 이용될 수 있다. BLAST 및 갭드 BLAST 프로그램을 이용하는 경우에, 각각의 프로그램 (예를 들어, XBLAST 및 NBLAST)의 디폴트 파라미터가 사용될 수 있다. 퍼센트 동일성 또는 그의 범위 (예를 들어, 적어도, 초과, 사이 등)이 언급 또는 인용되는 경우에, 달리 명시되지 않는 한, 종점이 포함될 것이고, 범위 (예를 들어, 적어도 70% 동일성)는 인용된 범위 내의 모든 범위 (예를 들어, 적어도 71%, 적어도 72%, 적어도 73%, 적어도 74%, 적어도 75%, 적어도 76%, 적어도 77%, 적어도 78%, 적어도 79%, 적어도 80%, 적어도 81%, 적어도 82%, 적어도 83%, 적어도 84%, 적어도 85%, 적어도 86%, 적어도 87%, 적어도 88%, 적어도 89%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 95.5%, 적어도 96%, 적어도 96.5%, 적어도 97%, 적어도 97.5%, 적어도 98%, 적어도 98.5%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 적어도 99.6%, 적어도 99.7%, 적어도 99.8%, 적어도 99.9% 동일성) 및 그의 모든 증분 (예를 들어, 퍼센트의 1/10 (즉, 0.1%), 퍼센트의 1/100 (즉, 0.01%) 등)을 포함할 것이다.
프라임 편집제
용어 "프라임 편집제"는 napDNAbp (예를 들어, Cas9 닉카제) 및 리버스 트랜스크립타제를 포함하는 본원에 기재된 융합 구축물을 지칭하고, PEgRNA (또는 "연장된 가이드 RNA")의 존재 하에 표적 뉴클레오티드 서열 상에서 프라임 편집을 수행할 수 있다. 용어 "프라임 편집제"는 융합 단백질 또는 PEgRNA와 복합체화된 융합 단백질을 지칭할 수 있다. 일부 실시양태에서, 프라임 편집제는 또한 융합 단백질 (napDNAbp에 융합된 리버스 트랜스크립타제), PEgRNA 및 본원에 기재된 바와 같은 비-편집된 가닥의 제2-부위 닉킹 단계를 지시할 수 있는 정규 가이드 RNA를 포함하는 복합체를 지칭할 수 있다. 특정 실시양태에서, "프라이머 편집제"의 리버스 트랜스크립타제 성분은 트랜스로 제공된다.
프라이머 결합 부위
용어 "프라이머 결합 부위" 또는 "PBS"는 연장 아암의 성분으로서 PEgRNA 상에 (전형적으로 연장 아암의 3' 단부에) 위치하는 뉴클레오티드 서열을 지칭하고, 프라임 편집제에 의한 표적 서열의 napDNAbp (예를 들어, Cas9) 닉킹 후에 형성된 프라이머 서열에 결합하는 역할을 한다. 다른 곳에 상술된 바와 같이, 프라임 편집제의 Cas9 닉카제 성분이 표적 DNA 서열의 한 가닥을 닉킹하는 경우에, 3'-단부 ssDNA 플랩이 형성되며, 이는 PEgRNA 상의 프라이머 결합 부위에 어닐링하여 역전사를 프라이밍하는 프라이머 서열의 역할을 한다. 도 27 및 28은 각각 3' 및 5' 연장 아암 상에 위치하는 프라이머 결합 부위의 실시양태를 보여준다.
단백질, 펩티드 및 폴리펩티드
용어 "단백질", "펩티드" 및 "폴리펩티드"는 본원에서 상호교환가능하게 사용되고, 펩티드 (아미드) 결합에 의해 함께 연결된 아미노산 잔기의 중합체를 지칭한다. 상기 용어는 임의의 크기, 구조 또는 기능의 단백질, 펩티드 또는 폴리펩티드를 지칭한다. 전형적으로, 단백질, 펩티드 또는 폴리펩티드는 적어도 3개의 아미노산 길이일 것이다. 단백질, 펩티드 또는 폴리펩티드는 개별 단백질 또는 단백질들의 집합을 지칭할 수 있다. 단백질, 펩티드 또는 폴리펩티드 내의 아미노산 중 1개 이상은, 예를 들어 화학 물질, 예컨대 탄수화물 기, 히드록실 기, 포스페이트 기, 파르네실 기, 이소파르네실 기, 지방산 기, 접합, 관능화 또는 다른 변형을 위한 링커 등의 부가에 의해 변형될 수 있다. 단백질, 펩티드 또는 폴리펩티드는 또한 단일 분자일 수 있거나 또는 다분자 복합체일 수 있다. 단백질, 펩티드 또는 폴리펩티드는 단지 자연 발생 단백질 또는 펩티드의 단편일 수 있다. 단백질, 펩티드 또는 폴리펩티드는 자연 발생, 재조합 또는 합성 또는 그의 임의의 조합일 수 있다. 본원에 제공된 임의의 단백질은 관련 기술분야에 공지된 임의의 방법에 의해 생산될 수 있다. 예를 들어, 본원에 제공된 단백질은 재조합 단백질 발현 및 정제를 통해 생산될 수 있으며, 이는 펩티드 링커를 포함하는 융합 단백질에 특히 적합하다. 재조합 단백질 발현 및 정제를 위한 방법은 널리 공지되어 있고, 문헌 [Green and Sambrook, Molecular Cloning: A Laboratory Manual (4th ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (2012))]에 기재된 것을 포함하며, 이의 전체 내용은 본원에 참조로 포함된다.
작동가능하게 연결된
본원에 사용될 수 있는 용어 "작동가능하게 연결된"은 이종 핵산 서열 (예를 들어, 트랜스진)의 발현을 유발하는, 조절 서열과 이종 핵산 서열 (예를 들어, 트랜스진) 사이의 기능적 연결을 지칭한다. 예를 들어, 제1 핵산 서열이 제2 핵산 서열과 기능적 관계로 위치하는 경우에 제1 핵산 서열은 제2 핵산 서열과 작동가능하게 연결된 것이다. 예를 들어, 프로모터가 코딩 서열의 전사 또는 발현에 영향을 미치는 경우에 프로모터는 코딩 서열에 작동가능하게 연결된 것이다. 일반적으로, 작동가능하게 연결된 핵산 서열은 인접하고, 2개의 단백질 코딩 영역을 연결하기 위해 필요한 경우에, 동일한 리딩 프레임 내에 존재한다.
프로모터
용어 "프로모터"는 관련 기술분야에 인식되어 있으며, 세포 전사 기구에 의해 인식되고 하류 유전자의 전사를 개시할 수 있는 서열을 갖는 핵산 분자를 지칭한다. 프로모터는 구성적으로 활성 (프로모터가 주어진 세포 맥락에서 항상 활성임을 의미함)일 수 있거나 또는 조건부로 활성 (프로모터가 특이적 조건의 존재 하에서만 활성임을 의미함)일 수 있다. 예를 들어, 조건부 프로모터는 프로모터 내의 조절 요소와 회합된 단백질을 기본 전사 기구에 연결하는 특이적 단백질의 존재 하에서만 또는 억제 분자의 부재 하에서만 활성일 수 있다. 조건부로 활성인 프로모터의 하위부류는 활성을 위해 소분자 "유도제"의 존재를 필요로 하는 유도성 프로모터이다. 유도성 프로모터의 예는 아라비노스-유도성 프로모터, Tet-on 프로모터 및 타목시펜-유도성 프로모터를 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 다양한 구성적, 조건부 및 유도성 프로모터가 통상의 기술자에게 널리 공지되어 있고, 통상의 기술자는 본 발명을 수행하는데 유용한 다양한 이러한 프로모터를 확인할 수 있을 것이며, 이와 관련하여 제한은 없다.
프로토스페이서 인접 모티프 (PAM)
본원에 사용된 용어 "프로토스페이서 인접 서열" 또는 "PAM"은 Cas9 뉴클레아제의 중요한 표적화 성분인 대략 2-6개 염기 쌍 DNA 서열을 지칭한다. 전형적으로, PAM 서열은 어느 한 가닥 상에 있고, Cas9 절단 부위의 5'에서 3' 방향으로 하류에 있다. 정규 PAM 서열 (즉, 스트렙토코쿠스 피오게네스(Streptococcus pyogenes)의 Cas9 뉴클레아제 또는 SpCas9와 연관된 PAM 서열)은 5'-NGG-3'이며, 여기서 "N"은 임의의 핵염기, 이어서 2개의 구아닌 ("G") 핵염기이다. 상이한 PAM 서열은 상이한 Cas9 뉴클레아제 또는 상이한 유기체로부터의 등가의 단백질과 연관될 수 있으며, 예를 들어 5'-NG-3' (여기서 "N"은 임의의 핵염기에 이어서 1개의 구아닌 ("G") 핵염기임) 또는 5'-KKH-3' (여기서 2개의 리신 ("K")에 이어서 1개의 히스티딘 ("H")임)이다. 추가로, 임의의 주어진 Cas9 뉴클레아제, 예를 들어 SpCas9는 뉴클레아제의 PAM 특이성을 변경시켜 뉴클레아제가 대안적 PAM 서열을 인식하도록 변형될 수 있다.
예를 들어, 서열식별번호: 1361421의 정규 SpCas9 아미노산 서열 (SpCas9 M1 QQ99ZW2 야생형)과 관련하여, PAM 서열은 (a) PAM 특이성을 NGAN 또는 NGNG로 변경시키는 D1135V, R1335Q 및 T1337R "VQR 변이체", (b) PAM 특이성을 NGAG로 변경시키는 D1135E, R1335Q 및 T1337R "EQR 변이체", 및 (c) PAM 특이성을 NGCG로 변경시키는 D1135V, G1218R, R1335E 및 T1337R "VRER 변이체"를 포함한 1개 이상의 돌연변이를 도입함으로써 변형될 수 있다. 추가로, 정규 SpCas9의 D1135E 변이체는 여전히 NGG를 인식하지만, 야생형 SpCas9 단백질과 비교하여 더 선택적이다.
또한, 상이한 박테리아 종으로부터의 Cas9 효소 (즉, Cas9 오르토로그)는 다양한 PAM 특이성을 가질 수 있는 것으로 인지될 것이다. 예를 들어, 스타필로코쿠스 아우레우스(Staphylococcus aureus)로부터의 Cas9 (SaCas9)는 NGRRT 또는 NGRRN을 인식한다. 추가로, 네이세리아 메닌기티티스(Neisseria meningitis)로부터의 Cas9 (NmCas)는 NNNNGATT를 인식한다. 또 다른 예에서, 스트렙토코쿠스 써모필리스(Streptococcus thermophilis)로부터의 Cas9 (StCas9)는 NNAGAAW를 인식한다. 또 다른 예에서, 트레포네마 덴티콜라(Treponema denticola)로부터의 Cas9 (TdCas)는 NAAAAC를 인식한다. 이들 예는 제한적인 것으로 의도되지 않는다. 비-SpCas9는 다양한 PAM 서열에 결합하며, 이는 목적하는 표적 절단 부위에 적합한 SpCas9 PAM 서열이 존재하지 않는 경우에 이들은 유용한 것으로 만든다고 추가로 인지될 것이다. 추가로, 비-SpCas9는 이들을 SpCas9보다 더 유용하게 만드는 다른 특징을 가질 수 있다. 예를 들어, 스타필로코쿠스 아우레우스로부터의 Cas9 (SaCas9)는 SpCas9보다 약 1 킬로염기 더 작아서, 아데노-연관 바이러스 (AAV) 내로 패키징될 수 있다. 추가로, 문헌 [Shah et al., "Protospacer recognition motifs: mixed identities and functional diversity," RNA Biology, 10(5): 891-899] (이는 본원에 참조로 포함됨)을 참조할 수 있다.
프로토스페이서
본원에 사용된 용어 "프로토스페이서"는 가이드 RNA의 스페이서 서열과 동일한 서열을 갖는 PAM (프로토스페이서 인접 모티프) 서열에 인접한 DNA 내의 서열 (~20 bp)을 지칭한다. 가이드 RNA는 표적 DNA 상의 프로토스페이서 서열의 상보체 (구체적으로, 그의 한 가닥, 즉 표적 서열의 "비-표적 가닥"에 비해 "표적 가닥")에 어닐링한다. Cas9가 기능하기 위해, 이는 또한 Cas9 유전자의 박테리아 종에 따라 달라지는 특이적 프로토스페이서 인접 모티프 (PAM)를 필요로 한다. 에스. 피오게네스로부터 유래된 가장 통상적으로 사용되는 Cas9 뉴클레아제는 비-표적 가닥 상에서, 게놈 DNA 내의 표적 서열의 바로 하류에서 발견되는 NGG의 PAM 서열을 인식한다. 통상의 기술자는 최신 기술의 문헌이 때때로 "프로토스페이서"를 "스페이서"로서 지칭하기 보다는 가이드 RNA 자체 상의 ~20-nt 표적-특이적 가이드 서열로서 지칭한다는 것을 인지할 것이다. 따라서, 일부 경우에, 본원에 사용된 용어 "프로토스페이서"는 용어 "스페이서"와 상호교환가능하게 사용될 수 있다. "프로토스페이서" 또는 "스페이서"의 출현을 둘러싼 기재의 문맥은 이 용어가 gRNA에 대한 것인지 또는 DNA 표적에 대한 것인지 여부에 관해 독자에게 알리는 것을 도울 것이다. 이들 용어의 둘 다의 용법은 최신 기술이 각각의 이들 방식에서 둘 다의 용어를 사용하기 때문에 허용가능하다.
리버스 트랜스크립타제
용어 "리버스 트랜스크립타제"는 RNA-의존성 DNA 폴리머라제로서 특징화되는 폴리머라제의 부류를 기재한다. 모든 공지된 리버스 트랜스크립타제는 RNA 주형으로부터 DNA 전사체를 합성하기 위한 프라이머를 필요로 한다. 역사적으로, 리버스 트랜스크립타제는 주로 mRNA를 cDNA로 전사하는데 사용되어 왔으며, 이는 이어서 추가의 조작을 위해 벡터 내로 클로닝될 수 있다. 조류 골수모구증 바이러스 (AMV) 리버스 트랜스크립타제가 최초로 널리 사용된 RNA-의존성 DNA 폴리머라제였다 (Verma, Biochim. Biophys. Acta 473:1 (1977)). 효소는 5'-3' RNA-지시된 DNA 폴리머라제 활성, 5'-3' DNA-지시된 DNA 폴리머라제 활성 및 RNase H 활성을 갖는다. RNase H는 RNA-DNA 하이브리드에 대한 RNA 가닥에 특이적인 진행성 5' 및 3' 리보뉴클레아제이다 (Perbal, A Practical Guide to Molecular Cloning, New York: Wiley & Sons (1984)). 전사에서의 오류는 리버스 트랜스크립타제에 의해 교정될 수 없으며, 이는 공지된 바이러스 리버스 트랜스크립타제가 교정에 필요한 3'-5' 엑소뉴클레아제 활성이 결여되어 있기 때문이다 (Saunders and Saunders, Microbial Genetics Applied to Biotechnology, London: Croom Helm (1987)). AMV 리버스 트랜스크립타제의 활성 및 그의 연관된 RNase H 활성의 상세한 연구는 문헌 [Berger et al., Biochemistry 22:2365-2372 (1983)]에 제시되었다. 분자 생물학에서 광범위하게 사용되는 또 다른 리버스 트랜스크립타제는 몰로니 뮤린 백혈병 바이러스 (M-MLV)로부터 기원하는 리버스 트랜스크립타제이다. 예를 들어, 문헌 [Gerard, G. R., DNA 5:271-279 (1986) 및 Kotewicz, M. L., et al., Gene 35:249-258 (1985)]을 참조한다. RNase H 활성이 실질적으로 결여된 M-MLV 리버스 트랜스크립타제가 또한 기재되었다. 예를 들어, 미국 특허 번호 5,244,797을 참조한다. 본 발명은 임의의 이러한 리버스 트랜스크립타제 또는 그의 변이체 또는 돌연변이체의 사용을 고려한다.
추가로, 본 발명은 오류-유발성인, 즉 오류-유발 리버스 트랜스크립타제 또는 중합 동안 뉴클레오티드의 고충실도 혼입을 지지하지 않는 리버스 트랜스크립타제로 지칭될 수 있는 리버스 트랜스크립타제의 사용을 고려한다. 가이드 RNA와 통합된 RT 주형을 기반으로 하는 단일 가닥 DNA 플랩의 합성 동안, 오류-유발 리버스 트랜스크립타제는 DNA 합성 주형 (예를 들어, RT 주형 서열)과 미스매칭된 1개 이상의 뉴클레오티드를 도입하여, 단일 가닥 DNA 플랩의 오류성 중합을 통해 뉴클레오티드 서열에 변화를 도입할 수 있다. 이어서, 단일 가닥 DNA 플랩의 합성 동안 도입된 이들 오류는 상응하는 내인성 표적 가닥에 대한 혼성화, 내인성 대체된 가닥의 제거, 라이게이션을 통해 및 이어서 1 라운드 이상의 내인성 DNA 복구 및/또는 복제를 통해 이중 가닥 분자 내로 통합된다.
역전사
본원에 사용된 용어 "역전사"는 주형으로서 RNA를 사용하여 DNA 가닥 (즉, 상보적 DNA 또는 cDNA)을 합성하는 효소의 능력을 나타낸다. 일부 실시양태에서, 역전사는 "오류-유발 역전사"일 수 있으며, 이는 그의 DNA 중합 활성에 있어서 오류-유발성인 특정 리버스 트랜스크립타제 효소의 특성을 지칭한다.
센스 가닥
유전학에서, "센스" 가닥은 5'에서 3'로 진행하는 이중 가닥 DNA 내의 절편이며, 이는 3'에서 5'로 진행하는 DNA의 안티센스 가닥 또는 주형 가닥에 상보적이다. 단백질을 코딩하는 DNA 절편의 경우에, 센스 가닥은 mRNA와 동일한 서열을 갖는 DNA의 가닥이며, 이는 전사 동안 안티센스 가닥을 그의 주형으로서 취하고, 결국 (전형적으로, 항상은 아님) 단백질로의 번역을 겪는다. 따라서, 안티센스 가닥은 나중에 단백질로 번역되는 RNA를 담당하는 반면, 센스 가닥은 mRNA의 것과 거의 동일한 구성을 갖는다. dsDNA의 각각의 절편에 대해, 판독하는 방향에 따라 센스 및 안티센스의 2개의 세트가 존재할 가능성이 있다는 것 (센스 및 안티센스는 시각이 상대적이기 때문에)을 주목한다. 궁극적으로, dsDNA의 한 절편 중 어느 가닥이 센스 또는 안티센스로 지칭되는지를 좌우하는 것은 유전자 생성물 또는 mRNA이다.
PEgRNA의 맥락에서, 제1 단계는 PEgRNA 연장 아암으로부터 주형화된, 5'에서 3' 방향으로 배향된 단일 가닥 상보적 DNA (즉, 혼입되는 3' ssDNA 플랩)의 합성이다. 3' ssDNA 플랩이 센스 가닥으로서 간주되어야 하는지 안티센스 가닥으로서 간주되어야 하는지의 여부는 전사 방향에 좌우되며, 이는 DNA의 양쪽 가닥이 전사를 위한 주형으로서의 역할을 할 수 있다는 것 (그러나 동시에는 아님)이 널리 받아들여지고 있기 때문이다. 따라서, 일부 실시양태에서, 3' ssDNA 플랩 (전체적으로 5'에서 3' 방향으로 진행함)은 코딩 가닥이기 때문에 센스 가닥으로서의 역할을 할 것이다. 다른 실시양태에서, 3' ssDNA 플랩 (전체적으로 5'에서 3' 방향으로 진행함)은 안티센스 가닥 및 이에 따라 전사를 위한 주형으로서의 역할을 할 것이다.
제2 가닥 닉킹
본원에 사용된 개념은 제1 닉 (즉, 가이드 RNA의 연장된 부분 상에서의 리버스 트랜스크립타제의 프라이밍에 사용하기 위한 유리 3' 단부를 제공하는 초기 닉 부위)의 하류 위치에 제2 닉을 도입하는 것을 지칭한다. 일부 실시양태에서, 제1 닉 및 제2 닉은 대향 가닥 상에 있다. 다른 실시양태에서, 제1 닉 및 제2 닉은 대향 가닥 상에 있다. 또 다른 실시양태에서, 제1 닉은 비-표적 가닥 (즉, R-루프의 단일 가닥 부분을 형성하는 가닥) 상에 있고, 제2 닉은 표적 가닥 상에 있다. 제2 닉은 제1 닉의 적어도 5개 뉴클레오티드 하류 또는 제1 닉의 적어도 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 또는 30개 또는 그 초과의 뉴클레오티드 하류에 위치한다. 이론에 얽매이지는 않지만, 제2 닉은 세포의 내인성 DNA 복구 및 복제 과정을 비편집된 가닥의 대체를 향해 유도한다. 일부 실시양태에서, 편집된 가닥은 비-표적 가닥이고, 비편집된 가닥은 표적 가닥이다. 다른 실시양태에서, 편집된 가닥은 표적 가닥이고, 비편집된 가닥은 비-표적 가닥이다.
스페이서 서열
가이드 RNA 또는 PEgRNA와 관련하여 본원에 사용된 용어 "스페이서 서열"은 표적 DNA 서열 내의 프로토스페이서 서열에 상보적인 뉴클레오티드 서열을 함유하는 약 10 내지 약 40개 (예를 들어, 약 10, 약 15, 약 20, 약 25, 약 30개) 뉴클레오티드의 가이드 RNA 또는 PEgRNA의 부분을 지칭한다. 스페이서 서열은 프로토스페이서 서열에 어닐링하여 표적 부위에서 ssRNA/ssDNA 하이브리드 구조 및 프로토스페이서 서열에 상보적인 내인성 DNA 가닥의 상응하는 R 루프 ssDNA 구조를 형성한다.
대상체
본원에 사용된 용어 "대상체"는 개별 유기체, 예를 들어 개별 포유동물을 지칭한다. 일부 실시양태에서, 대상체는 인간이다. 일부 실시양태에서, 대상체는 비-인간 포유동물이다. 일부 실시양태에서, 대상체는 비-인간 영장류이다. 일부 실시양태에서, 대상체는 설치류이다. 일부 실시양태에서, 대상체는 양, 염소, 소, 고양이 또는 개이다. 일부 실시양태에서, 대상체는 척추동물, 양서류, 파충류, 어류, 곤충, 파리 또는 선충류이다. 일부 실시양태에서, 대상체는 연구용 동물이다. 일부 실시양태에서, 대상체는 유전자 조작된, 예를 들어 유전자 조작된 비-인간 대상체이다. 대상체는 어느 하나의 성별일 수 있고 임의의 발달 단계일 수 있다.
표적 부위
용어 "표적 부위"는 본원에 개시된 프라임 편집제에 의해 편집되는 핵산 분자 내의 서열을 지칭한다. 표적 부위는 염기 편집제 및 gRNA의 복합체가 결합하는 핵산 분자 내의 서열을 추가로 지칭한다.
시간적 제2-가닥 닉킹
본원에 사용된 용어 "시간적 제2-가닥 닉킹"은 비편집된 가닥에의 제2 닉의 설치가 단지 편집된 가닥에 목적하는 편집이 설치된 후에만 발생하는 것인 제2 가닥 닉킹의 변형을 지칭한다. 이는 이중 가닥 DNA 파괴로 이어질 수 있는 양쪽 가닥 상의 공동 닉을 피한다. 제2-가닥 닉킹 가이드 RNA는 제2 가닥 닉이 목적하는 편집이 설치될 때까지 도입되지 않도록 시간적 제어를 위해 설계된다. 이는 단지 편집된 가닥에만 매칭되고 원래 대립유전자에는 매칭되지 않는 스페이서 서열을 갖는 gRNA를 설계함으로써 달성된다. 이러한 전략을 사용할 때, 프로토스페이서와 비편집된 대립유전자 사이의 미스매치는 PAM 가닥 상의 편집 사건이 일어날 때까지 sgRNA에 의한 닉킹을 불리하게 할 것이다.
tPERT
"트랜스 프라임 편집제 RNA 주형 (tPERT)"에 대한 정의를 참조한다.
시간적 제2-가닥 닉킹
본원에 사용된 용어 "시간적 제2-가닥 닉킹"은 비편집된 가닥에의 제2 닉의 설치가 단지 편집된 가닥에 목적하는 편집이 설치된 후에만 발생하는 것인 제2 가닥 닉킹의 변형을 지칭한다. 이는 이중 가닥 DNA 파괴로 이어질 수 있는 양쪽 가닥 상의 공동 닉을 피한다. 제2-가닥 닉킹 가이드 RNA는 제2 가닥 닉이 목적하는 편집이 설치될 때까지 도입되지 않도록 시간적 제어를 위해 설계된다. 이는 단지 편집된 가닥에만 매칭되고 원래 대립유전자에는 매칭되지 않는 스페이서 서열을 갖는 gRNA를 설계함으로써 달성된다. 이러한 전략을 사용할 때, 프로토스페이서와 비편집된 대립유전자 사이의 미스매치는 PAM 가닥 상의 편집 사건이 일어날 때까지 sgRNA에 의한 닉킹을 불리하게 할 것이다.
트랜스 프라임 편집
본원에 사용된 용어 "트랜스 프라임 편집"은 분할 PEgRNA를 이용하는 프라임 편집의 변형된 형태를 지칭하며, 즉 여기서 PEgRNA는 2개의 별개의 분자: sgRNA 및 트랜스 프라임 편집 RNA 주형 (tPERT)으로 분리된다. sgRNA는 목적하는 게놈 표적 부위에 프라임 편집제를 표적화하는 (또는 보다 일반적으로, 프라임 편집제의 napDNAbp 성분을 표적화하는) 역할을 하는 반면, tPERT는 일단 tPERT가 프라임 편집제 상에 및 tPERT 상에 위치한 결합 도메인의 상호작용에 의해 프라임 편집제에 트랜스로 동원되면 폴리머라제 (예를 들어, 리버스 트랜스크립타제)에 의해 새로운 DNA 서열을 표적 유전자좌에 기록하는데 사용된다. 한 실시양태에서, 결합 도메인은 RNA-단백질 동원 모이어티, 예컨대 tPERT 상에 위치한 MS2 압타머 및 프라임 편집제에 융합된 MS2cp 단백질을 포함할 수 있다. 트랜스 프라임 편집의 이점은 가이드 RNA로부터 DNA 합성 주형을 분리함으로써, 잠재적으로 보다 긴 길이의 주형을 사용할 수 있다는 것이다.
트랜스 프라임 편집의 실시양태는 도 3g 및 3h에 제시된다. 도 3g는 좌측에 트랜스 프라임 편집제 복합체의 조성 ("RP-PE:gRNA 복합체)을 보여주며, 이는 각각의 폴리머라제 (예를 들어, 리버스 트랜스크립타제) 및 rPERT 동원 단백질 (예를 들어, MS2sc)에 융합된 napDNAbp를 포함하고 가이드 RNA와 복합체화된다. 도 3g는 추가로 DNA 합성 주형 및 프라이머 결합 서열을 포함하는 PEgRNA의 연장 아암 특색을 포함하는 별개의 tPERT 분자를 보여준다. tPERT 분자는 또한 RNA-단백질 동원 도메인 (이 경우에, 스템 루프 구조이고, 예를 들어 MS2 압타머일 수 있음)을 포함한다. 도 3h에 기재된 과정에 도시된 바와 같이, RP-PE:gRNA 복합체는 표적 DNA 서열에 결합하여 그를 닉킹한다. 이어서, 동원 단백질 (RP)은 tPERT를 동원하여 DNA 표적 부위에 결합된 프라임 편집제 복합체에 공동-국재화시킴으로써, 프라이머 결합 부위가 닉킹된 가닥 상의 프라이머 서열에 결합하게 하고, 후속적으로 폴리머라제 (예를 들어, RT)가 tPERT의 5'까지 DNA 합성 주형에 대해 단일 가닥의 DNA를 합성하게 한다.
tPERT가 RNA-단백질 동원 도메인의 5' 단부 상에 PBS 및 DNA 합성 주형을 포함하는 것으로서 도 3g 및 도 3h에 제시되어 있지만, 다른 구성의 tPERT는 RNA-단백질 동원 도메인의 3' 단부 상에 PBS 및 DNA 합성 주형이 위치하도록 설계될 수 있다. 그러나, DNA의 단일 가닥의 합성이 tPERT의 5' 단부에서 자연적으로 종결될 것이고, 따라서 프라임 편집의 DNA 합성 단계 동안 주형으로서 RNA-단백질 동원 도메인의 임의의 부분을 사용할 위험이 없다는 점에서 5' 연장을 갖는 tPERT가 이점을 갖는다.
트랜스 프라임 편집제 RNA 주형 (tPERT)
본원에 사용된 "트랜스 프라임 편집제 RNA 주형 (tPERT)"은 PEgRNA를 2개의 별개의 분자: 가이드 RNA 및 tPERT 분자로 분리함으로써 작동하는 프라임 편집의 변형된 버전인 트랜스 프라임 편집에 사용되는 성분을 지칭한다. tPERT 분자는 표적 DNA 부위에서 프라임 편집제 복합체와 공동-국재화되어, 프라이머 결합 부위 및 DNA 합성 주형을 프라임 편집제로 트랜스로 가져오도록 프로그램화된다. 예를 들어, (1) RP-PE:gRNA 복합체 및 (2) RNA-단백질 동원 도메인에 연결된 프라이머 결합 부위 및 DNA 합성 주형을 포함하는 tPERT를 포함하는 2-성분 시스템을 보여주는 트랜스 프라임 편집제 (tPE)의 실시양태에 대해 도 3g를 참조하며, 여기서 RP-PE:gRNA 복합체의 RP (동원 단백질) 성분은 tPERT를 편집될 표적 부위로 동원함으로써 PBS 및 DNA 합성 주형을 프라임 편집제와 트랜스로 회합시킨다. 상기 또 다른 방식에서, tPERT는 프라이머 결합 부위 및 DNA 합성 주형을 포함하는 PEgRNA의 연장 아암을 (모두 또는 일부) 함유하도록 조작된다.
전이
본원에 사용된 "전이"는 퓨린 핵염기의 상호교환 (A ↔ G) 또는 피리미딘 핵염기의 상호교환 (C ↔ T)을 지칭한다. 이러한 부류의 상호교환은 유사한 형상의 핵염기를 수반한다. 본원에 개시된 조성물 및 방법은 표적 DNA 분자에서 1개 이상의 전이를 유도할 수 있다. 본원에 개시된 조성물 및 방법은 또한 동일한 표적 DNA 분자에서 전이 및 전환 둘 다를 유도할 수 있다. 이들 변화는 A ↔ G, G ↔ A, C ↔ T 또는 T ↔ C를 수반한다. 왓슨-크릭 쌍형성된 핵염기를 갖는 이중 가닥 DNA의 맥락에서, 전환은 하기 염기 쌍 교환을 지칭한다: A:T ↔ G:C, G:G ↔ A:T, C:G ↔ T:A 또는 T:A ↔ C:G. 본원에 개시된 조성물 및 방법은 표적 DNA 분자에서 1개 이상의 전이를 유도할 수 있다. 본원에 개시된 조성물 및 방법은 또한 동일한 표적 DNA 분자에서 전이 및 전환 둘 다, 뿐만 아니라 결실 및 삽입을 포함한 다른 뉴클레오티드 변화를 유도할 수 있다.
전환
본원에 사용된 "전환"은 퓨린 핵염기와 피리미딘 핵염기 또는 그 반대의 상호교환을 지칭하며, 따라서 유사하지 않은 형상을 갖는 핵염기의 상호교환을 수반한다. 이들 변화는 T ↔ A, T ↔ G, C ↔ G, C ↔ A, A ↔ T, A ↔ C, G ↔ C 및 G ↔ T를 수반한다. 왓슨-크릭 쌍형성된 핵염기를 갖는 이중 가닥 DNA의 맥락에서, 전환은 하기 염기 쌍 교환을 지칭한다: T:A ↔ A:T, T:A ↔ G:C, C:G ↔ G:C, C:G ↔ A:T, A:T ↔ T:A, A:T ↔ C:G, G:C ↔ C:G 및 G:C ↔ T:A. 본원에 개시된 조성물 및 방법은 표적 DNA 분자에서 1개 이상의 전환을 유도할 수 있다. 본원에 개시된 조성물 및 방법은 또한 동일한 표적 DNA 분자에서 전이 및 전환 둘 다, 뿐만 아니라 결실 및 삽입을 포함한 다른 뉴클레오티드 변화를 유도할 수 있다.
치료
용어 "치료", "치료하다" 및 "치료하는"은 본원에 기재된 바와 같은 질환 또는 장애 또는 그의 1종 이상의 증상을 역전시키거나, 완화시키거나, 그의 발병을 지연시키거나 또는 그의 진행을 억제하는 것을 목표로 하는 임상 개입을 지칭한다. 본원에 사용된 용어 "치료", "치료하다" 및 "치료하는"은 본원에 기재된 바와 같은 질환 또는 장애 또는 그의 1종 이상의 증상을 역전시키거나, 완화시키거나, 그의 발병을 지연시키거나 또는 그의 진행을 억제하는 것을 목표로 하는 임상 개입을 지칭한다. 일부 실시양태에서, 치료는 1종 이상의 증상이 발생한 후에 및/또는 질환이 진단된 후에 투여될 수 있다. 다른 실시양태에서, 치료는, 예를 들어 증상의 발병을 방지하거나 지연시키거나 또는 질환의 발병 또는 진행을 억제하기 위해 증상의 부재 하에 투여될 수 있다. 예를 들어, 치료는 증상의 발병 전에 (예를 들어, 증상의 병력에 비추어 및/또는 유전적 또는 다른 감수성 인자에 비추어) 감수성 개체에게 투여될 수 있다. 치료는 또한 증상이 해소된 후에, 예를 들어 그의 재발을 방지하거나 지연시키기 위해 계속될 수 있다.
트리뉴클레오티드 반복 장애
본원에 사용된 "트리뉴클레오티드 반복 장애" (또는 대안적으로, "확장 반복 장애" 또는 "반복부 확장 장애")는 특정 트리뉴클레오티드가 특정 유전자 또는 인트론에서 반복되는 일종의 돌연변이인 "트리뉴클레오티드 반복부 확장"에 의해 유발되는 유전 장애의 세트를 지칭한다. 트리뉴클레오티드 반복은 한 때 게놈에서 흔한 반복인 것으로 생각되었지만, 1990년대에 이들 장애를 명확히 하였다. DNA의 이들 겉보기 '양성' 스트레치는 때때로 확장되어 질환을 유발할 수 있다. 여러 규정된 특색이 트리뉴클레오티드 반복부 확장에 의해 유발된 장애 사이에 공유된다. 첫째로, 돌연변이체 반복은 체세포 및 배선 불안정성 둘 다를 나타내고, 보다 빈번하게는 후속 전달에서 축소되기보다는 확장된다. 둘째로, 보다 이른 연령에서의 발병 및 후속 세대에서의 표현형의 중증도 증가 (예상)는 일반적으로 보다 긴 반복 길이와 상관관계가 있다. 최종적으로, 질환 대립유전자의 모 기원이 종종 예상에 영향을 미칠 수 있으며, 부계 전달이 많은 이들 장애에 대한 보다 큰 확장 위험을 보유한다.
트리플렛 확장은 DNA 복제 동안 슬리피지에 의해 유발되는 것으로 생각된다. 이들 영역에서의 DNA 서열의 반복적 성질로 인해, DNA 복제 동안 합성되는 모 가닥과 딸 가닥 사이의 상보적 염기 쌍형성을 유지하면서 '루프 아웃' 구조가 형성될 수 있다. 루프 아웃 구조가 딸 가닥 상의 서열로부터 형성되는 경우에, 이는 반복 수의 증가를 유발할 것이다. 그러나, 루프 아웃 구조가 모 가닥 상에 형성되는 경우에는, 반복 수의 감소가 발생한다. 이들 반복의 확장은 감소보다 더 흔한 것으로 보인다. 일반적으로, 확장이 클수록 질환을 유발하거나 질환의 중증도를 증가시킬 가능성이 크다. 이러한 특성이 트리뉴클레오티드 반복 장애에서 나타나는 예상의 특징을 가져온다. 예상은 발병 연령이 감소하는 경향 및 증상의 중증도가 이들 반복의 확장으로 인해 이환 가족의 후속 세대를 통해 증가하는 경향을 기재한다.
뉴클레오티드 반복 장애는 트리플렛 반복이 비-코딩 영역에서 발생하는 것 (즉, 비-코딩 트리뉴클레오티드 반복 장애) 또는 코딩 영역에서 발생하는 것을 포함할 수 있다.
본원에 기재된 프라임 편집제 (PE) 시스템은 특히 유약 X 증후군 (FRAXA), 유약 XE MR (FRAXE), 프리드라이히 운동실조 (FRDA), 근긴장성 이영양증 (DM), 척수소뇌성 운동실조 유형 8 (SCA8) 및 척수소뇌성 운동실조 유형 12 (SCA12)를 포함할 수 있는 뉴클레오티드 반복 장애를 치료하는데 사용될 수 있다.
프라임 편집 또는 "프라임 편집 (PE)"
본원에 사용된 용어 "프라임 편집" 또는 "프라임 편집 (PE)"은 본 출원에 기재된 바와 같고 도 1a-1j의 실시양태에 예시된, napDNAbp 및 특수화된 가이드 RNA를 사용하는 유전자 편집을 위한 신규 접근법을 지칭한다. TPRT는 표적 DNA 분자가 한 실시양태에서 리버스 트랜스크립타제 (또는 또 다른 폴리머라제)에 의한 DNA 가닥의 합성을 프라이밍하는데 사용되기 때문에 "표적-프라이밍된 역전사"를 지칭한다. 다양한 실시양태에서, 프라임 편집은 표적 DNA 분자 (뉴클레오티드 서열 내의 변화가 도입되는 것이 요구됨)를 프라임 편집제 가이드 RNA와 복합체화된 핵산 프로그램가능한 DNA 결합 단백질 (napDNAbp)과 접촉시킴으로써 작동한다. 도 1e를 참조하면, 프라임 편집제 가이드 RNA는 가이드 RNA의 3' 또는 5' 단부에 또는 가이드 RNA 내의 분자내 위치에 연장부를 포함하고, 목적하는 뉴클레오티드 변화 (예를 들어, 단일 뉴클레오티드 변화, 삽입 또는 결실)를 코딩한다. 단계 (a)에서, napDNAbp/연장된 gRNA 복합체는 DNA 분자와 접촉하고, 연장된 gRNA는 napDNAbp가 표적 유전자좌에 결합하도록 가이드한다. 단계 (b)에서, 표적 유전자좌의 DNA의 가닥 중 하나에 닉을 도입하여 (예를 들어, 뉴클레아제 또는 화학적 작용제에 의해), 표적 유전자좌의 가닥 중 하나에 이용가능한 3' 단부를 생성한다. 일부 실시양태에서, 닉은 R-루프 가닥에 상응하는 DNA의 가닥, 즉 가이드 RNA 서열에 혼성화되지 않는 가닥, 즉 "비-표적 가닥"에서 생성된다. 그러나, 닉은 가닥 중 어느 하나에 도입될 수 있다. 즉, 닉은 "표적 가닥" (즉, 연장된 gRNA의 스페이서에 혼성화된 가닥) 또는 "비-표적 가닥" (즉, R-루프의 단일 가닥 부분을 형성하고 표적 가닥에 상보적인 가닥) 내로 도입될 수 있다. 단계 (c)에서, DNA 가닥의 3' 단부 (닉에 의해 형성됨)는 역전사를 프라이밍하기 위해 (즉, "표적-프라이밍된 RT") 가이드 RNA의 연장된 부분과 상호작용한다. 일부 실시양태에서, 3' 단부 DNA 가닥은 가이드 RNA의 연장된 부분 상의 특이적 프라이머 결합 부위, 즉 "리버스 트랜스크립타제 프라이밍 서열"에 혼성화한다. 단계 (d)에서, 프라이밍된 부위의 3' 단부로부터 프라임 편집제 가이드 RNA의 3' 단부를 향해 DNA의 단일 가닥을 합성하는 리버스 트랜스크립타제가 도입된다. 이는 목적하는 뉴클레오티드 변화 (예를 들어, 단일 염기 변화, 삽입 또는 결실 또는 그의 조합)를 포함하고, 그 외에는 닉 부위의 또는 그에 인접한 내인성 DNA에 상동인 단일 가닥 DNA 플랩을 형성한다. 단계 (e)에서, napDNAbp 및 가이드 RNA가 방출된다. 단계 (f) 및 (g)는 목적하는 뉴클레오티드 변화가 표적 유전자좌 내로 혼입되도록 하는 단일 가닥 DNA 플랩의 분해에 관한 것이다. 이러한 과정은 3' 단일 가닥 DNA 플랩이 내인성 DNA 서열에 침입하고 혼성화하였을 때 형성되는 상응하는 5' 내인성 DNA 플랩을 제거함으로써, 목적하는 생성물 형성을 향해 구동될 수 있다. 이론에 얽매이지는 않지만, 세포 내인성 DNA 복구 및 복제 과정은 미스매칭된 DNA를 분해하여 뉴클레오티드 변화(들)를 혼입시켜 목적하는 변경된 생성물을 형성한다. 과정은 또한 도 1d에 예시된 바와 같이 "제2 가닥 닉킹"에 의해 생성물 형성을 향해 구동될 수 있다. 이 과정은 하기 유전자 변화: 전환, 전이, 결실 및 삽입 중 적어도 하나 이상을 도입할 수 있다.
용어 "프라임 편집제 (PE) 시스템" 또는 "프라임 편집제" 또는 "PE 시스템" 또는 "PE 편집 시스템"은 napDNAbp, 리버스 트랜스크립타제, 융합 단백질 (예를 들어, napDNAbp 및 리버스 트랜스크립타제를 포함함), 프라임 편집제 가이드 RNA, 및 융합 단백질 및 프라임 편집제 가이드 RNA를 포함하는 복합체, 뿐만 아니라 프라임 편집 과정을 편집된 생성물 형성을 향해 구동시키는 것을 돕기 위한 보조 요소, 예컨대 제2 가닥 닉킹 성분 및 5' 내인성 DNA 플랩 제거 엔도뉴클레아제를 포함하나 이에 제한되지는 않는, 본원에 기재된 표적-프라이밍된 역전사 (TPRT)를 사용하는 게놈 편집 방법에 수반되는 조성물을 지칭한다.
상류
본원에 사용된 용어 "상류" 및 "하류"는 5'에서 3' 방향으로 배향되는 핵산 분자 (단일 가닥이든 이중 가닥이든)에 위치한 적어도 2개의 요소의 선형 위치를 정의하는 상대성 용어이다. 특히, 제1 요소는 핵산 분자에서 제2 요소의 상류에 있으며, 여기서 제1 요소는 제2 요소에 대해 5'인 어딘가에 위치한다. 예를 들어, SNP가 닉 부위의 5' 측면 상에 있는 경우에 SNP는 Cas9-유도된 닉 부위의 상류에 있다. 반대로, 제1 요소는 핵산 분자에서 제2 요소의 하류에 있으며, 여기서 제1 요소는 제2 요소에 대해 3'인 어딘가에 위치한다. 예를 들어, SNP가 닉 부위의 3' 측면 상에 있는 경우에 SNP는 Cas9-유도된 닉 부위의 하류에 있다. 핵산 분자는 DNA (이중 또는 단일 가닥), RNA (이중 또는 단일 가닥), 또는 DNA와 RNA의 하이브리드일 수 있다. 분석은 단일 가닥 핵산 분자 및 이중 가닥 분자에 대해 동일하며, 이는 용어 상류 및 하류가 이중 가닥 분자의 어느 가닥이 고려되는지를 선택할 필요가 있다는 것을 제외하고는 핵산 분자의 단일 가닥만을 언급하기 때문이다. 종종, 적어도 2개의 요소의 위치적 상대성을 결정하는데 사용될 수 있는 이중 가닥 DNA의 가닥은 "센스" 또는 "코딩" 가닥이다. 유전학에서, "센스" 가닥은 5'에서 3'로 진행하는 이중 가닥 DNA 내의 절편이며, 이는 3'에서 5'로 진행하는 DNA의 안티센스 가닥 또는 주형 가닥에 상보적이다. 따라서, 예로서, SNP 핵염기는 SNP 핵염기가 센스 또는 코딩 가닥 상의 프로모터의 3' 측면 상에 존재하는 경우에 게놈 DNA (이중 가닥임) 내의 프로모터 서열의 "하류"에 있다.
변이체
본원에 사용된 용어 "변이체"는 자연에서 발생하는 것으로부터 벗어난 패턴을 갖는 품질을 나타내는 것을 의미하는 것으로 이해되어야 하며, 예를 들어 변이체 Cas9는 야생형 Cas9 아미노산 서열과 비교하여 아미노산 잔기에서 1개 이상의 변화를 포함하는 Cas9이다. 용어 "변이체"는 참조 서열과 적어도 75% 또는 적어도 80% 또는 적어도 85% 또는 적어도 90% 또는 적어도 95% 또는 적어도 99% 퍼센트 동일성을 갖고 참조 서열과 동일하거나 실질적으로 동일한 기능적 활성 또는 활성들을 갖는 상동 단백질을 포괄한다. 상기 용어는 또한 참조 서열의 돌연변이체, 말단절단물 또는 도메인을 포괄하며, 이는 참조 서열과 동일하거나 실질적으로 동일한 기능적 활성 또는 활성들을 나타낸다.
벡터
본원에 사용된 용어 "벡터"는 관심 유전자를 코딩하도록 변형될 수 있고, 숙주 세포 내로 진입하여, 숙주 세포 내에서 돌연변이 및 복제된 다음, 복제된 형태의 벡터를 또 다른 숙주 세포 내로 전달할 수 있는 핵산을 지칭한다. 예시적인 적합한 벡터는 바이러스 벡터, 예컨대 레트로바이러스 벡터 또는 박테리오파지 및 사상 파지 및 접합 플라스미드를 포함한다. 추가의 적합한 벡터는 본 개시내용에 기초하여 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 명백할 것이다.
야생형
본원에 사용된 용어 "야생형"은 통상의 기술자에 의해 이해되는 관련 기술분야의 용어이고, 돌연변이체 또는 변이체 형태와 구별되는, 자연에서 발생하는 유기체, 균주, 유전자 또는 특징의 전형적 형태를 의미한다.
5' 내인성 DNA 플랩 제거
본원에 사용된 용어 "5' 내인성 DNA 플랩 제거" 또는 "5' 플랩 제거"는 RT-합성된 단일 가닥 DNA 플랩이 내인성 DNA에 경쟁적으로 침입하여 혼성화할 때 형성되는 5' 내인성 DNA 플랩의 제거를 지칭하며, 이 과정에서 내인성 가닥을 대체한다. 이러한 내인성 대체된 가닥을 제거하는 것은 목적하는 뉴클레오티드 변화를 포함하는 목적하는 생성물의 형성을 향해 반응을 구동할 수 있다. 세포 자신의 DNA 복구 효소 (예를 들어, 플랩 엔도뉴클레아제, 예컨대 EXO1 또는 FEN1)는 5' 내인성 플랩의 제거 또는 절제를 촉매할 수 있다. 또한, 숙주 세포는 상기 5' 내인성 플랩의 제거를 촉매하는 1종 이상의 효소 (예를 들어, 플랩 엔도뉴클레아제)를 발현하도록 형질전환되어, 상기 과정을 생성물 형성을 향해 구동할 수 있다. 플랩 엔도뉴클레아제는 관련 기술분야에 공지되어 있고, 문헌 [Patel et al., "Flap endonucleases pass 5'-flaps through a flexible arch using a disorder-thread-order mechanism to confer specificity for free 5'-ends," Nucleic Acids Research, 2012, 40(10): 4507-4519 및 Tsutakawa et al., "Human flap endonuclease structures, DNA double-base flipping, and a unified understanding of the FEN1 superfamily," Cell, 2011, 145(2): 198-211] (이들 각각은 본원에 참조로 포함됨)에 기재된 바와 같이 찾아볼 수 있다.
5' 내인성 DNA 플랩
본원에 사용된 용어 "5' 내인성 DNA 플랩"은 표적 DNA 내의 PE-유도된 닉 부위의 바로 하류에 위치한 DNA의 가닥을 지칭한다. PE에 의한 표적 DNA 가닥의 닉킹은 닉 부위의 상류 측 상에 3' 히드록실 기 및 닉 부위의 하류 측 상에 5' 히드록실 기를 노출시킨다. 3' 히드록실 기로 끝나는 내인성 가닥은 프라임 편집제의 DNA 폴리머라제를 프라이밍하는데 사용된다 (예를 들어, 여기서 DNA 폴리머라제는 리버스 트랜스크립타제임). 닉 부위의 하류 측 상에 노출된 5' 히드록실 기로 시작하는 내인성 가닥은 "5' 내인성 DNA 플랩"으로 지칭되고, 궁극적으로 제거되며, PEgRNA의 연장부에 의해 코딩되는 새로 합성된 대체 가닥 (즉, "3' 대체 DNA 플랩")에 의해 대체된다.
3' 대체 DNA 플랩
본원에 사용된 용어 "3' 대체 DNA 플랩" 또는 간단히 "대체 DNA 플랩"은 프라임 편집제에 의해 합성되고 프라임 편집제 PEgRNA의 연장 아암에 의해 코딩되는 DNA의 가닥을 지칭한다. 보다 특히, 3' 대체 DNA 플랩은 PEgRNA의 폴리머라제 주형에 의해 코딩된다. 3' 대체 DNA 플랩은 편집된 서열 (예를 들어, 단일 뉴클레오티드 변화)도 함유한다는 것을 제외하고는 5' 내인성 DNA 플랩과 동일한 서열을 포함한다. 3' 대체 DNA 플랩은 표적 DNA에 어닐링되어, 5' 내인성 DNA 플랩 (이는 예를 들어 5' 플랩 엔도뉴클레아제, 예컨대 FEN1 또는 EXO1에 의해 절제될 수 있음)을 대체 또는 교체시킨 다음, 라이게이션되어 3' 대체 DNA 플랩의 3' 단부를 내인성 DNA의 노출된 5' 히드록실 단부 (5' 내인성 DNA 플랩의 절제 후에 노출됨)에 연결함으로써, 포스포포디에스테르 결합을 재형성하고 3' 대체 DNA 플랩을 설치하여 1개의 편집된 가닥 및 1개의 비편집된 가닥을 함유하는 헤테로듀플렉스 DNA를 형성한다. DNA 복구 과정은 헤테로듀플렉스를 분해하여 편집된 가닥 내의 정보를 상보적 가닥에 카피함으로써 편집을 DNA 내에 영구적으로 설치한다. 이러한 분해 과정은 비편집된 가닥을 닉킹함으로써, 즉 본원에 기재된 바와 같은 "제2-가닥 닉킹"에 의해 추가로 구동되어 완료될 수 있다.
특정 실시양태의 상세한 설명
본 발명은 새로운 조성물 (예를 들어, 새로운 PEgRNA 및 그를 포함하는 PE 복합체) 및 본원에 기재된 특수화된 알고리즘을 사용하여 설계된 PEgRNA를 사용하여 치료 표적, 예를 들어 클린바 데이터베이스에서 확인된 표적을 복구하기 위해 프라임 편집 (PE)을 사용하는 방법을 개시하였다. 따라서, 본 출원은 치료 표적 (예를 들어, 클린바 데이터베이스에 포함된 것)을 복구하는데 사용될 수 있는 PEgRNA에 대한 서열을 대규모로 예측하기 위한 알고리즘을 개시한다. 추가로, 본 출원은 개시된 알고리즘을 사용하여 설계되고 치료 표적을 복구하기 위해 프라임 편집과 함께 사용될 수 있는 치료 PEgRNA에 대한 예측된 서열을 개시한다.
본원에 개시된 알고리즘 및 예측된 PEgRNA 서열은 일반적으로 프라임 편집에 관한 것이다. 따라서, 본 개시내용은 또한 적합한 napDNAbp (예를 들어, Cas9 닉카제) 및 리버스 트랜스크립타제, 뿐만 아니라 본원에 개시된 치료 PEgRNA와 함께 사용될 수 있는 다른 적합한 성분 (예를 들어, 링커, NLS) 및 PE 융합 단백질을 비롯한, 프라임 편집의 다양한 성분 및 측면에 대한 설명을 제공한다.
게놈 편집을 위한 클러스터링된 규칙적 간격의 짧은 회문식 반복부 (CRISPR) 시스템의 채택은 생명 과학을 혁신시켰다1-3. CRISPR을 사용한 유전자 파괴가 현재 상용화되어 있지만, 단일 뉴클레오티드 편집의 정확한 설치는 다수의 질환-원인 돌연변이를 연구하거나 교정하는데 필요함에도 불구하고 주요 도전과제로 남아있다. 상동성 지정 복구 (HDR)는 이러한 편집을 달성할 수 있지만, 낮은 효율 (종종 <5%), 공여자 DNA 복구 주형에 대한 요건, 및 이중 가닥 DNA 파괴 (DSB) 형성이라는 유해 효과를 겪는다. 최근에, 데이비드 리우 교수 등의 실험실이 DSB 없이 효율적인 단일 뉴클레오티드 편집을 달성하는 염기 편집을 개발하였다. 염기 편집제 (BE)는 CRISPR 시스템을 염기-변형 데아미나제 효소와 조합하여 표적 C·G 또는 A·T 염기 쌍을 각각 A·T 또는 G·C로 전환시킨다4-6. 전세계적으로 연구자들에 의해 이미 널리 사용되고 있기는 하지만, 현행 BE는 12개의 가능한 염기 쌍 전환 중 단지 4개만을 가능하게 하고, 작은 삽입 또는 결실은 교정할 수 없다. 더욱이, 염기 편집의 표적화 범주는 표적 염기에 인접한 비-표적 C 또는 A 염기의 편집 ("방관자 편집")에 의해 및 PAM 서열이 표적 염기로부터 15±2 bp에 존재해야 한다는 요건에 의해 제한된다. 따라서, 이들 제한을 극복하는 것은 게놈 편집의 기초 연구 및 치료 용도를 크게 확장시킬 것이다.
본 개시내용은 그의 주요 제한을 극복하면서 염기 편집의 많은 이익-즉, 이중 가닥 파괴 및 공여자 DNA 복구 주형의 회피-을 제공하는 새로운 정밀 편집 접근법을 제안한다. 본원에 기재된 제안된 접근법은 표적-프라이밍된 역전사 (TPRT)를 사용하여 표적 게놈 부위에의 편집된 DNA 가닥의 직접 설치를 달성한다. 본원에 논의된 설계에서, CRISPR 가이드 RNA (gRNA)는 목적하는 뉴클레오티드 변화를 포함하는 단일 가닥 DNA를 코딩하는 리버스 트랜스크립타제 (RT) 주형 서열을 보유하도록 조작될 것이다. CRISPR 뉴클레아제 (Cas9)-닉킹된 표적 부위 DNA는 변형된 gRNA 상의 주형 서열의 역전사를 위한 프라이머로서의 역할을 하여, 임의의 목적하는 뉴클레오티드 편집의 직접 혼입을 가능하게 할 것이다.
따라서, 본 발명은 부분적으로 표적-프라이밍된 역전사 (TPRT)의 메카니즘이 (예를 들어, 도 1a-1g의 다양한 실시양태에 도시된 바와 같이) 높은 효율 및 유전적 유연성으로 정밀 CRISPR/Cas-기반 게놈 편집을 수행하기 위해 활용 또는 적합화될 수 있다는 발견에 관한 것이다. 본 발명자들은 변형된 가이드 RNA ("연장된 가이드 RNA" 또는 PEgRNA)에 의해 특이적 DNA 서열을 표적화하기 위해 napDNAbp-폴리머라제 융합체 (예를 들어, 리버스 트랜스크립타제에 융합된 Cas9 닉카제)를 사용하고, 표적 부위에 단일 가닥 닉을 생성하고, 닉킹된 DNA를 PEgRNA의 성분인 DNA 합성 주형에 기초하여 폴리머라제 (예를 들어, 리버스 트랜스크립타제)에 의해 DNA를 합성하기 위한 프라이머로서 사용하는 것을 본원에서 제안하였다. 새로 합성된 가닥은 목적하는 뉴클레오티드 변화 (예를 들어, 단일 뉴클레오티드 변화, 결실 또는 삽입 또는 그의 조합)의 포함을 제외하고는 게놈 표적 서열에 상동일 것이다. DNA의 새로 합성된 가닥은 단일 가닥 DNA 플랩으로서 지칭될 수 있으며, 이는 상보적 상동 내인성 DNA 가닥과의 혼성화에 대해 경쟁함으로써 상응하는 내인성 가닥을 대체할 것이다. 이러한 혼성화된 중간체의 분해는 생성된 내인성 DNA의 대체 플랩의 제거 (예를 들어, 5' 단부 DNA 플랩 엔도뉴클레아제인 FEN1을 사용함), 합성된 단일 가닥 DNA 플랩의 표적 DNA에 대한 라이게이션, 및 세포 DNA 복구 및/또는 복제 과정의 결과로서 목적하는 뉴클레오티드 변화의 동화를 포함할 수 있다. 주형화된 DNA 합성은 단일 뉴클레오티드 정밀도를 제공하기 때문에, 이러한 접근법의 범주는 매우 넓고, 기초 과학 및 요법에서 무수한 적용에 사용될 수 있을 것으로 예측된다.
I. 치료 PEgRNA
본원에 기재된 프라임 편집제 (PE) 시스템은 임의의 적합한 프라임 편집제 가이드 RNA 또는 PEgRNA의 사용을 고려한다. 본 발명자들은 표적-프라이밍된 역전사 (TPRT)의 메카니즘이 폴리머라제 (예를 들어, 리버스 트랜스크립타제)에 의한 목적하는 뉴클레오티드 변화를 코딩하는 DNA 합성 주형을 포함하는 특수하게 구성된 가이드 RNA의 사용을 통해 정밀하고 다목적의 CRISPR/Cas-기반 게놈 편집을 수행하기 위해 활용되거나 적합화될 수 있다는 것을 발견하였다. 본 출원은 DNA 합성 주형이 표준 또는 전통적인 가이드 RNA 분자의 연장부로서 제공될 수 있기 때문에 이러한 특수하게 구성된 가이드 RNA를 "프라임 편집제 가이드 RNA" (또는 PEgRNA)로서 지칭한다. 본 출원은 프라임 편집제 가이드 RNA에 대한 임의의 적합한 구성 또는 배열을 고려한다.
다양한 실시양태에서, 본 개시내용은 클린바 데이터베이스 엔트리에 대해 본원에 개시된 알고리즘을 사용하여 설계된 서열식별번호: 1-135514 및 813085-880462의 치료 PEgRNA를 제공한다.
다양한 다른 실시양태에서, 본원에 개시된 알고리즘을 사용하여 클린바 데이터베이스에 대해 설계된 예시적인 PEgRNA는 본 명세서의 일부를 형성하는 서열 목록에 포함된다. 서열 목록은 서열식별번호: 1-135514 및 813085-880462의 완전한 PEgRNA 서열을 포함한다. 각각의 이들 완전한 PEgRNA는 각각 스페이서 (서열식별번호: 135515-271028 및 880463-947840) 및 연장 아암 (서열식별번호: 271029-406542 및 947841-1015218)으로 구성된다. 추가로, 각각의 PEgRNA는, 예를 들어 서열식별번호: 1361579-1361580에 의해 규정된 gRNA 코어를 포함한다. 서열식별번호: 271029-406542 및 947841-1015218의 연장 아암은 추가로 각각 프라이머 결합 부위 (서열식별번호: 406543-542056 및 1015219-1082596), 편집 주형 (서열식별번호: 542057-677570 및 1082597-1149974) 및 상동성 아암 (서열식별번호: 677571-813084 및 1149975-1217352)으로 구성된다. PEgRNA는 임의로 5' 단부 변형제 영역 및/또는 3' 단부 변형제 영역을 포함할 수 있다. PEgRNA는 또한 PEgRNA의 3'에 역전사 종결 신호 (예를 들어, 서열식별번호: 1361560-1361566)를 포함할 수 있다. 본 출원은 이들 서열 모두의 설계 및 사용을 포괄한다.
도 3a는 본원에 개시된 프라임 편집제 (PE) 시스템에 사용가능한 프라임 편집제 가이드 RNA ("PEgRNA" 또는 "연장된 gRNA"로 지칭됨)의 한 실시양태를 보여주며, 여기서 전통적인 가이드 RNA (녹색 부분)는 napDNAbp와 결합하는 스페이서 및 gRNA 코어 영역을 포함한다. 이러한 실시양태에서, 가이드 RNA는 5' 단부에 연장된 RNA 절편, 즉 5' 연장부를 포함한다. 이러한 실시양태에서, 5' 연장부는 DNA 합성 주형, 프라이머 결합 부위 및 임의적인 5-20개 뉴클레오티드 링커 서열을 포함한다. 도 1a에 제시된 바와 같이, 프라이머 결합 부위는 R-루프의 비-표적 가닥에서 닉이 형성된 후에 형성된 유리 3' 단부에 혼성화하여, 5'에서 3' 방향으로의 DNA 중합을 위한 폴리머라제 (예를 들어, 리버스 트랜스크립타제)를 프라이밍한다.
도 3b는 전통적인 가이드 RNA (녹색 부분)가 ~20개 nt 스페이서 및 napDNAbp와 결합하는 gRNA 코어를 포함하는 것인, 본원에 개시된 프라임 편집제 (PE) 시스템에 사용가능한 프라임 편집제 가이드 RNA의 또 다른 실시양태를 보여준다. 이러한 실시양태에서, 가이드 RNA는 3' 단부에 연장된 RNA 절편, 즉 3' 연장부를 포함한다. 이러한 실시양태에서, 3' 연장부는 DNA 합성 주형 및 프라이머 결합 부위를 포함한다. 도 1b에 제시된 바와 같이, 프라이머 결합 부위는 R-루프의 비-표적 가닥에 닉이 형성된 후에 형성된 유리 3' 단부에 혼성화하여, 5'에서 3' 방향으로의 DNA 중합을 위한 폴리머라제를 프라이밍한다.
도 3c는 전통적인 가이드 RNA (녹색 부분)가 ~20개 nt 스페이서 및 napDNAbp와 결합하는 gRNA 코어를 포함하는 것인, 본원에 개시된 프라임 편집제 (PE) 시스템에 사용가능한 프라임 편집제 가이드 RNA의 또 다른 실시양태를 보여준다. 이러한 실시양태에서, 가이드 RNA는 gRNA 코어 내의 분자간 위치에서 연장된 RNA 절편, 즉 분자내 연장부를 포함한다. 이러한 실시양태에서, 분자내 연장부는 DNA 합성 주형 및 프라이머 결합 부위를 포함한다. 프라이머 결합 부위는 R-루프의 비-표적 가닥에 닉이 형성된 후에 형성된 유리 3' 단부에 혼성화하여, 5'-3' 방향으로의 DNA 중합을 위한 폴리머라제를 프라이밍한다.
한 실시양태에서, 분자내 RNA 연장부의 위치는 가이드 RNA의 스페이서 내에 있다. 또 다른 실시양태에서, 분자내 RNA 연장부의 위치는 gRNA 코어 내에 있다. 또 다른 실시양태에서, 분자내 RNA 연장부의 위치는 스페이서 내 또는 스페이서를 파괴하는 위치를 제외하고는 가이드 RNA 분자 내의 임의의 위치이다.
한 실시양태에서, 분자내 RNA 연장부는 스페이서의 3' 단부로부터 하류에 삽입된다. 또 다른 실시양태에서, 분자내 RNA 연장부는 스페이서의 3' 단부의 적어도 1개 뉴클레오티드, 적어도 2개 뉴클레오티드, 적어도 3개 뉴클레오티드, 적어도 4개 뉴클레오티드, 적어도 5개 뉴클레오티드, 적어도 6개 뉴클레오티드, 적어도 7개 뉴클레오티드, 적어도 8개 뉴클레오티드, 적어도 9개 뉴클레오티드, 적어도 10개 뉴클레오티드, 적어도 11개 뉴클레오티드, 적어도 12개 뉴클레오티드, 적어도 13개 뉴클레오티드, 적어도 14개 뉴클레오티드, 적어도 15개 뉴클레오티드, 적어도 16개 뉴클레오티드, 적어도 17개 뉴클레오티드, 적어도 18개 뉴클레오티드, 적어도 19개 뉴클레오티드, 적어도 20개 뉴클레오티드, 적어도 21개 뉴클레오티드, 적어도 22개 뉴클레오티드, 적어도 23개 뉴클레오티드, 적어도 24개 뉴클레오티드, 적어도 25개 뉴클레오티드 하류에 삽입된다.
다른 실시양태에서, 분자내 RNA 연장부는 gRNA 내로 삽입되며, 이는 Cas9 단백질 또는 그의 등가물 (즉, 상이한 napDNAbp)과 결합 및/또는 상호작용하는 tracrRNA에 상응하거나 또는 그를 포함하는 가이드 RNA의 부분을 지칭한다. 바람직하게는, 분자내 RNA 연장부의 삽입은 tracrRNA 부분과 napDNAbp 사이의 상호작용을 방해하지 않거나 최소로 방해한다.
RNA 연장부의 길이는 임의의 유용한 길이일 수 있다. 다양한 실시양태에서, RNA 연장부는 적어도 5개 뉴클레오티드, 적어도 6개 뉴클레오티드, 적어도 7개 뉴클레오티드, 적어도 8개 뉴클레오티드, 적어도 9개 뉴클레오티드, 적어도 10개 뉴클레오티드, 적어도 11개 뉴클레오티드, 적어도 12개 뉴클레오티드, 적어도 13개 뉴클레오티드, 적어도 14개 뉴클레오티드, 적어도 15개 뉴클레오티드, 적어도 16개 뉴클레오티드, 적어도 17개 뉴클레오티드, 적어도 18개 뉴클레오티드, 적어도 19개 뉴클레오티드, 적어도 20개 뉴클레오티드, 적어도 21개 뉴클레오티드, 적어도 22개 뉴클레오티드, 적어도 23개 뉴클레오티드, 적어도 24개 뉴클레오티드, 적어도 25개 뉴클레오티드, 적어도 30개 뉴클레오티드, 적어도 40개 뉴클레오티드, 적어도 50개 뉴클레오티드, 적어도 60개 뉴클레오티드, 적어도 70개 뉴클레오티드, 적어도 80개 뉴클레오티드, 적어도 90개 뉴클레오티드, 적어도 100개 뉴클레오티드, 적어도 200개 뉴클레오티드, 적어도 300개 뉴클레오티드, 적어도 400개 뉴클레오티드 또는 적어도 500개 뉴클레오티드 길이이다.
DNA 합성 주형 (예를 들어, RT 주형 서열)은 또한 임의의 적합한 길이일 수 있다. 예를 들어, DNA 합성 주형 (예를 들어, RT 주형 서열)은 적어도 3개 뉴클레오티드, 적어도 4개 뉴클레오티드, 적어도 5개 뉴클레오티드, 적어도 6개 뉴클레오티드, 적어도 7개 뉴클레오티드, 적어도 8개 뉴클레오티드, 적어도 9개 뉴클레오티드, 적어도 10개 뉴클레오티드, 적어도 11개 뉴클레오티드, 적어도 12개 뉴클레오티드, 적어도 13개 뉴클레오티드, 적어도 14개 뉴클레오티드, 적어도 15개 뉴클레오티드, 적어도 16개 뉴클레오티드, 적어도 17개 뉴클레오티드, 적어도 18개 뉴클레오티드, 적어도 19개 뉴클레오티드, 적어도 20개 뉴클레오티드, 적어도 30개 뉴클레오티드, 적어도 40개 뉴클레오티드, 적어도 50개 뉴클레오티드, 적어도 60개 뉴클레오티드, 적어도 70개 뉴클레오티드, 적어도 80개 뉴클레오티드, 적어도 90개 뉴클레오티드, 적어도 100개 뉴클레오티드, 적어도 200개 뉴클레오티드, 적어도 300개 뉴클레오티드, 적어도 400개 뉴클레오티드 또는 적어도 500개 뉴클레오티드 길이일 수 있다.
또 다른 실시양태에서, 역전사 프라이머 결합 부위 서열은 적어도 3개 뉴클레오티드, 적어도 4개 뉴클레오티드, 적어도 5개 뉴클레오티드, 적어도 6개 뉴클레오티드, 적어도 7개 뉴클레오티드, 적어도 8개 뉴클레오티드, 적어도 9개 뉴클레오티드, 적어도 10개 뉴클레오티드, 적어도 11개 뉴클레오티드, 적어도 12개 뉴클레오티드, 적어도 13개 뉴클레오티드, 적어도 14개 뉴클레오티드, 적어도 15개 뉴클레오티드, 적어도 16개 뉴클레오티드, 적어도 17개 뉴클레오티드, 적어도 18개 뉴클레오티드, 적어도 19개 뉴클레오티드, 적어도 20개 뉴클레오티드, 적어도 30개 뉴클레오티드, 적어도 40개 뉴클레오티드, 적어도 50개 뉴클레오티드, 적어도 60개 뉴클레오티드, 적어도 70개 뉴클레오티드, 적어도 80개 뉴클레오티드, 적어도 90개 뉴클레오티드 또는 적어도 100개 뉴클레오티드 길이이다.
다른 실시양태에서, 임의적인 링커 또는 스페이서는 적어도 3개 뉴클레오티드, 적어도 4개 뉴클레오티드, 적어도 5개 뉴클레오티드, 적어도 6개 뉴클레오티드, 적어도 7개 뉴클레오티드, 적어도 8개 뉴클레오티드, 적어도 9개 뉴클레오티드, 적어도 10개 뉴클레오티드, 적어도 11개 뉴클레오티드, 적어도 12개 뉴클레오티드, 적어도 13개 뉴클레오티드, 적어도 14개 뉴클레오티드, 적어도 15개 뉴클레오티드, 적어도 16개 뉴클레오티드, 적어도 17개 뉴클레오티드, 적어도 18개 뉴클레오티드, 적어도 19개 뉴클레오티드, 적어도 20개 뉴클레오티드, 적어도 30개 뉴클레오티드, 적어도 40개 뉴클레오티드, 적어도 50개 뉴클레오티드, 적어도 60개 뉴클레오티드, 적어도 70개 뉴클레오티드, 적어도 80개 뉴클레오티드, 적어도 90개 뉴클레오티드, 적어도 100개 뉴클레오티드, 적어도 200개 뉴클레오티드, 적어도 300개 뉴클레오티드 또는 적어도 400개 뉴클레오티드 길이이다.
DNA 합성 주형 (예를 들어, RT 주형 서열)은, 일부 실시양태에서, 비-표적 가닥에 상동이지만 (따라서, 표적 가닥의 상응하는 부위에 상보적이지만), 1개 이상의 뉴클레오티드 변화를 포함하는 단일 가닥 DNA 분자를 코딩한다. 뉴클레오티드 변화는 1개 이상의 단일-염기 뉴클레오티드 변화, 1개 이상의 결실, 1개 이상의 삽입 및 그의 조합을 포함할 수 있다.
도 1e에 도시된 바와 같이, DNA 합성 주형 (예를 들어, RT 주형 서열)의 합성된 단일 가닥 DNA 생성물은 비-표적 가닥에 상동이고, 1개 이상의 뉴클레오티드 변화를 함유한다. DNA 합성 주형 (예를 들어, RT 주형 서열)의 단일 가닥 DNA 생성물은 상보적 표적 가닥 서열과 평형 상태로 혼성화하여, 상동 내인성 표적 가닥 서열을 대체한다. 대체된 내인성 가닥은 일부 실시양태에서 5' 내인성 DNA 플랩 종으로 지칭될 수 있다 (예를 들어, 도 1c 참조). 이러한 5' 내인성 DNA 플랩 종은 5' 플랩 엔도뉴클레아제 (예를 들어, FEN1)에 의해 제거될 수 있고, 이제 내인성 표적 가닥에 혼성화된 단일 가닥 DNA 생성물은 라이게이션되어 내인성 서열과 새로 합성된 가닥 사이에 미스매치를 생성할 수 있다. 미스매치는 세포의 선천성 DNA 복구 및/또는 복제 과정에 의해 해소될 수 있다.
다양한 실시양태에서, DNA 합성 주형의 뉴클레오티드 서열 (예를 들어, RT 주형 서열)은 5' 플랩 종으로서 대체되고 편집될 부위와 중첩되는 비-표적 가닥의 뉴클레오티드 서열에 상응한다.
프라임 편집제 가이드 RNA의 다양한 실시양태에서, DNA 합성 주형은 닉 부위에 인접한 내인성 DNA 서열에 상보적인 단일 가닥 DNA 플랩을 코딩할 수 있으며, 여기서 단일 가닥 DNA 플랩은 목적하는 뉴클레오티드 변화를 포함한다. 단일 가닥 DNA 플랩은 닉 부위에서 내인성 단일 가닥 DNA를 대체할 수 있다. 닉 부위에서 대체된 내인성 단일 가닥 DNA는 5' 단부를 가질 수 있고, 내인성 플랩을 형성할 수 있으며, 이는 세포에 의해 절제될 수 있다. 다양한 실시양태에서, 5' 단부 내인성 플랩의 절제는 생성물 형성을 구동하는 것을 도울 수 있으며, 이는 5' 단부 내인성 플랩의 제거가 단일 가닥 3' DNA 플랩의 상응하는 상보적 DNA 가닥에 대한 혼성화 및 단일 가닥 3' DNA 플랩에 의해 운반된 목적하는 뉴클레오티드 변화의 표적 DNA 내로의 혼입 또는 동화를 촉진하기 때문이다.
프라임 편집제 가이드 RNA의 다양한 실시양태에서, 단일 가닥 DNA 플랩의 세포 복구는 목적하는 뉴클레오티드 변화의 설치를 유발함으로써, 목적하는 생성물을 형성한다.
또 다른 실시양태에서, 목적하는 뉴클레오티드 변화는 닉 부위의 약 -5 내지 +5 또는 닉 부위의 약 -10 내지 +10 또는 닉 부위의 약 -20 내지 +20 또는 닉 부위의 약 -30 내지 +30 또는 닉 부위의 약 -40 내지 +40 또는 닉 부위의 약 -50 내지 +50 또는 닉 부위의 약 -60 내지 +60 또는 닉 부위의 약 -70 내지 +70 또는 닉 부위의 약 -80 내지 +80 또는 닉 부위의 약 -90 내지 +90 또는 닉 부위의 약 -100 내지 +100 또는 닉 부위의 약 -200 내지 +200인 편집 윈도우에 설치된다.
다양한 측면에서, 프라임 편집제 가이드 RNA는 가이드 RNA의 변형된 버전이다. 가이드 RNA는 자연 발생이거나, 코딩 핵산으로부터 발현되거나 또는 화학적으로 합성될 수 있다. 가이드 RNA를 수득하거나 또는 달리 합성하고, 관심 게놈 표적 부위의 표적 가닥과 상호작용하고 혼성화하는 스페이서를 포함한 가이드 RNA의 적절한 서열을 결정하는 방법은 관련 기술분야에 널리 공지되어 있다.
다양한 실시양태에서, 가이드 RNA 서열의 특정한 설계 측면은 다른 인자, 예컨대 PAM 서열 위치, 표적 서열 내의 퍼센트 G/C 함량, 미세상동성 영역의 정도, 2차 구조 등 중에서, 관심 게놈 표적 부위 (즉, 편집될 목적하는 부위)의 뉴클레오티드 서열 및 본원에 기재된 프라임 편집제 (PE) 시스템에 존재하는 napDNAbp (예를 들어, Cas9 단백질)의 유형에 좌우될 것이다.
일반적으로, 가이드 서열은 표적 서열과 혼성화하고 표적 서열에 대한 napDNAbp (예를 들어, Cas9, Cas9 상동체 또는 Cas9 변이체)의 서열-특이적 결합을 지시하기 위해 표적 폴리뉴클레오티드 서열과 충분한 상보성을 갖는 임의의 폴리뉴클레오티드 서열이다. 일부 실시양태에서, 가이드 서열과 그의 상응하는 표적 서열 사이의 상보성의 정도는, 적합한 정렬 알고리즘을 사용하여 최적으로 정렬한 경우에, 약 50%, 60%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97.5%, 99% 또는 그 초과이거나 또는 약 그보다 더 높다. 최적 정렬은 서열을 정렬하기 위한 임의의 적합한 알고리즘의 사용에 의해 결정될 수 있고, 그의 비제한적 예는 스미스-워터만(Smith-Waterman) 알고리즘, 니들만-분쉬(Needleman-Wunsch) 알고리즘, 버로우스-휠러 변환(Burrows-Wheeler Transform) (예를 들어, 버로우스 휠러 얼라이너(Burrows Wheeler Aligner)), 클러스탈W, 클러스탈 X, BLAT, 노보얼라인(Novoalign) (노보크라프트 테크놀로지스(Novocraft Technologies)), ELAND (일루미나(Illumina), 캘리포니아주 샌디에고), SOAP (soap.genomics.org.cn에서 이용가능함), 및 Maq (maq.sourceforge.net에서 이용가능함)에 기초한 알고리즘을 포함한다. 일부 실시양태에서, 가이드 서열은 약 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 35, 40, 45, 50, 75개 또는 그 초과의 뉴클레오티드 길이이거나 또는 약 그보다 더 길다.
일부 실시양태에서, 가이드 서열은 약 75, 50, 45, 40, 35, 30, 25, 20, 15, 12개 또는 그 미만보다 더 짧은 뉴클레오티드 길이이다. 표적 서열에 대한 염기 편집제의 서열-특이적 결합을 지시하는 가이드 서열의 능력은 임의의 적합한 검정에 의해 평가될 수 있다. 예를 들어, 시험될 가이드 서열을 포함한 염기 편집제의 성분은, 예컨대 본원에 개시된 염기 편집제의 성분을 코딩하는 벡터로의 형질감염에 의해 상응하는 표적 서열을 갖는 숙주 세포에 제공되고, 이어서 예컨대 본원에 기재된 바와 같은 서베이어 검정에 의해 표적 서열 내의 우선적 절단의 평가가 이루어질 수 있다. 유사하게, 표적 폴리뉴클레오티드 서열의 절단은 시험 튜브에서 표적 서열, 시험될 가이드 서열을 포함한 염기 편집제의 성분 및 시험 가이드 서열과 상이한 대조군 가이드 서열을 제공하고, 시험 및 대조군 가이드 서열 반응 사이에서 표적 서열에서의 결합 또는 절단율을 비교함으로써 평가될 수 있다. 다른 검정이 가능하고, 이는 관련 기술분야의 통상의 기술자에 의해 이루어질 것이다.
가이드 서열은 임의의 표적 서열을 표적화하도록 선택될 수 있다. 일부 실시양태에서, 표적 서열은 세포의 게놈 내의 서열이다. 예시적인 표적 서열은 표적 게놈에서 고유한 것을 포함한다. 예를 들어, 에스. 피오게네스 Cas9의 경우, 게놈 내의 고유한 표적 서열은 형태 MMMMMMMMNNNNNNNNNNNNXGG (서열식별번호: 1361548)의 Cas9 표적 부위를 포함할 수 있으며, 여기서 NNNNNNNNNNNNXGG (서열식별번호: 1361549) (N은 A, G, T 또는 C이고; X는 임의의 것일 수 있음)는 게놈에서 단일 발생된다. 게놈 내의 고유한 표적 서열은 형태 MMMMMMMMMNNNNNNNNNNNXGG (서열식별번호: 1361550)의 에스. 피오게네스 Cas9 표적 부위를 포함할 수 있으며, 여기서 NNNNNNNNNNNXGG (서열식별번호: 1361551) (N은 A, G, T 또는 C이고; X는 임의의 것일 수 있음)는 게놈에서 단일 발생된다. 에스. 써모필루스 CRISPR1Cas9의 경우, 게놈 내의 고유한 표적 서열은 형태 MMMMMMMMNNNNNNNNNNNNXXAGAAW (서열식별번호: 1361552)의 Cas9 표적 부위를 포함할 수 있으며, 여기서 NNNNNNNNNNNNXXAGAAW (서열식별번호: 1361553) (N은 A, G, T 또는 C이고; X는 임의의 것일 수 있고; W는 A 또는 T임)는 게놈에서 단일 발생된다. 게놈 내의 고유한 표적 서열은 형태 MMMMMMMMMNNNNNNNNNNNXXAGAAW (서열식별번호: 1361554)의 에스. 써모필루스 CRISPR 1 Cas9 표적 부위를 포함할 수 있으며, 여기서 NNNNNNNNNNNXXAGAAW (서열식별번호: 1361555) (N은 A, G, T 또는 C이고; X는 임의의 것일 수 있고; W는 A 또는 T임)는 게놈에서 단일 발생된다. 에스. 피오게네스 Cas9의 경우, 게놈 내의 고유한 표적 서열은 형태 MMMMMMMMNNNNNNNNNNNNXGGXG (서열식별번호: 1361556)의 Cas9 표적 부위를 포함할 수 있으며, 여기서 NNNNNNNNNNNNXGGXG (서열식별번호: 1361557) (N은 A, G, T 또는 C이고; X는 임의의 것일 수 있음)는 게놈에서 단일 발생된다. 게놈 내의 고유한 표적 서열은 형태 MMMMMMMMMNNNNNNNNNNNXGGXG (서열식별번호: 1361558)의 에스. 피오게네스 Cas9 표적 부위를 포함할 수 있으며, 여기서 NNNNNNNNNNNXGGXG (서열식별번호: 1361559) (N은 A, G, T 또는 C이고; X는 임의의 것일 수 있음)는 게놈에서 단일 발생된다. 이들 서열 각각에서, "M"은 A, G, T 또는 C일 수 있고, 서열을 고유한 것으로 확인하는데 고려될 필요는 없다.
일부 실시양태에서, 가이드 서열은 가이드 서열 내의 2차 구조의 정도를 감소시키도록 선택된다. 2차 구조는 임의의 적합한 폴리뉴클레오티드 폴딩 알고리즘에 의해 결정될 수 있다. 일부 프로그램은 최소 깁스 자유 에너지 계산에 기초한다. 이러한 한 알고리즘의 예는 문헌 [Zuker and Stiegler (Nucleic Acids Res. 9 (1981), 133-148)]에 기재된 바와 같은 mFold이다. 폴딩 알고리즘의 또 다른 예는 중심 구조 예측 알고리즘을 사용하는, 비엔나 대학교의 이론 화학 연구소에서 개발된 온라인 웹서버 RNA fold이다 (예를 들어, 문헌 [A. R. Gruber et al., 2008, Cell 106(1): 23-24; 및 PA Carr and GM Church, 2009, Nature Biotechnology 27(12): 1151-62] 참조). 추가의 알고리즘은 본원에 참조로 포함되는 미국 출원 일련 번호 61/836,080; 광역 참조 BI-2013/004A)에서 찾아볼 수 있다.
일반적으로, tracr 메이트 서열은 (1) 상응하는 tracr 서열을 함유하는 세포에서 tracr 메이트 서열과 플랭킹된 가이드 서열의 절제; 및 (2) 표적 서열에서의 복합체의 형성 (여기서 복합체는 tracr 서열에 혼성화된 tracr 메이트 서열을 포함함) 중 1가지 이상을 촉진하기 위해 tracr 서열과 충분한 상보성을 갖는 임의의 서열을 포함한다. 일반적으로, 상보성의 정도는 2개의 서열 중 더 짧은 것의 길이에 따른 tracr 메이트 서열 및 tracr 서열의 최적 정렬에 대한 것이다. 최적 정렬은 임의의 적합한 정렬 알고리즘에 의해 결정될 수 있고, 2차 구조, 예컨대 tracr 서열 또는 tracr 메이트 서열 내의 자기-상보성을 추가로 고려할 수 있다. 일부 실시양태에서, 최적으로 정렬될 때 2개 중 더 짧은 것의 길이에 따른 tracr 서열과 tracr 메이트 서열 사이의 상보성의 정도는 약 25%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 97.5%, 99% 또는 그 초과이거나 또는 약 그보다 더 높다. 일부 실시양태에서, tracr 서열은 약 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30, 40, 50개 또는 그 초과의 뉴클레오티드 길이이거나 또는 약 그보다 더 길다. 일부 실시양태에서, tracr 서열 및 tracr 메이트 서열은 단일 전사체 내에 함유되어, 둘 사이의 혼성화는 2차 구조, 예컨대 헤어핀을 갖는 전사체를 생성한다. 헤어핀 구조에 사용하기에 바람직한 루프 형성 서열은 4개 뉴클레오티드 길이이고, 가장 바람직하게는 서열 GAAA를 갖는다. 그러나, 대안적 서열일 수 있는 바와 같이, 더 길거나 더 짧은 루프 서열이 사용될 수 있다. 서열은 바람직하게는 뉴클레오티드 트리플렛 (예를 들어, AAA) 및 추가의 뉴클레오티드 (예를 들어 C 또는 G)를 포함한다. 루프 형성 서열의 예는 CAAA 및 AAAG를 포함한다. 본 발명의 한 실시양태에서, 전사체 또는 전사된 폴리뉴클레오티드 서열은 적어도 2개 이상의 헤어핀을 갖는다. 바람직한 실시양태에서, 전사체는 2, 3, 4 또는 5개의 헤어핀을 갖는다. 본 발명의 추가 실시양태에서, 전사체는 최대 5개의 헤어핀을 갖는다. 일부 실시양태에서, 단일 전사체는 전사 종결 서열을 추가로 포함하고; 바람직하게는 이는 폴리T 서열, 예를 들어 6개의 T 뉴클레오티드이다. 가이드 서열, tracr 메이트 서열 및 tracr 서열을 포함하는 단일 폴리뉴클레오티드의 추가의 비제한적 예는 하기와 같고 (5'에서 3'으로 열거됨), 여기서 "N"은 가이드 서열의 염기를 나타내고, 소문자의 제1 블록은 tracr 메이트 서열을 나타내고, 소문자의 제2 블록은 tracr 서열을 나타내고, 최종 폴리-T 서열은 전사 종결인자를 나타낸다: (1) NNNNNNNNgtttttgtactctcaagatttaGAAAtaaatcttgcagaagctacaaagataaggcttcatgccgaaatcaacaccctgtcattttatggcagggtgttttcgttatttaaTTTTTT (서열식별번호: 1361560); (2) NNNNNNNNNNNNNNNNNNgtttttgtactctcaGAAAtgcagaagctacaaagataaggcttcatgccgaaatcaacaccctgtcattttatggcagggtgttttcgttatttaaTTTTTT (서열식별번호: 1361561); (3) NNNNNNNNNNNNNNNNNNNNgtttttgtactctcaGAAAtgcagaagctacaaagataaggcttcatgccgaaatcaacaccctgtcattttatggcagggtgtTTTTT (서열식별번호: 1361562); (4) NNNNNNNNNNNNNNNNNNNNgttttagagctaGAAAtagcaagttaaaataaggctagtccgttatcaacttgaaaaagtggcaccgagtcggtgcTTTTTT (서열식별번호: 1361563); (5) NNNNNNNNNNNNNNNNNNNNgttttagagctaGAAATAGcaagttaaaataaggctagtccgttatcaacttgaaaaagtgTTTTTTT (서열식별번호: 1361564) 및 (6) NNNNNNNNNNNNNNNNNNNNgttttagagctagAAATAGcaagttaaaataaggctagtccgttatcaTTTTTTTT (서열식별번호: 1361565). 일부 실시양태에서, 서열 (1) 내지 (3)은 에스. 써모필루스 CRISPR1로부터의 Cas9와 조합되어 사용된다. 일부 실시양태에서, 서열 (4) 내지 (6)은 에스. 피오게네스로부터의 Cas9와 조합되어 사용된다. 일부 실시양태에서, tracr 서열은 tracr 메이트 서열을 포함하는 전사체와 별개의 전사체이다.
본원에 개시된 바와 같은 Cas9 도메인 및 단일 가닥 DNA 결합 단백질을 포함하는 융합 단백질 중 어느 것을 표적 부위, 예를 들어 편집될 점 돌연변이를 포함하는 부위로 표적화하기 위해, 전형적으로 융합 단백질을 가이드 RNA, 예를 들어 sgRNA와 함께 공동-발현시키는 것이 필요하다는 것은 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 명백할 것이다. 본원의 다른 곳에 보다 상세히 설명된 바와 같이, 가이드 RNA는 전형적으로 Cas9 결합을 가능하게 하는 tracrRNA 프레임워크 및 Cas9:핵산 편집 효소/도메인 융합 단백질에 서열 특이성을 부여하는 가이드 서열을 포함한다.
일부 실시양태에서, 가이드 RNA는 구조 5'-[가이드 서열]-guuuuagagcuagaaauagcaaguuaaaauaaaggcuaguccguuaucaacuugaaaaaguggcaccgagucggugcuuuuu-3' (서열식별번호: 1361566)를 포함하며, 여기서 가이드 서열은 표적 서열에 상보적인 서열을 포함한다. 가이드 서열은 전형적으로 20개 뉴클레오티드 길이이다. Cas9:핵산 편집 효소/도메인 융합 단백질을 특이적 게놈 표적 부위로 표적화하기에 적합한 가이드 RNA의 서열은 본 개시내용에 기초하여 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 명백할 것이다. 이러한 적합한 가이드 RNA 서열은 전형적으로 편집될 표적 뉴클레오티드의 50개 뉴클레오티드 상류 또는 하류 내의 핵산 서열에 상보적인 가이드 서열을 포함한다. 제공된 융합 단백질 중 어느 것을 특이적 표적 서열로 표적화하기에 적합한 일부 예시적인 가이드 RNA 서열이 본원에 제공된다. 추가의 가이드 서열은 관련 기술분야에 널리 공지되어 있고, 본원에 기재된 염기 편집제와 함께 사용될 수 있다.
다른 실시양태에서, PEgRNA는 가이드 RNA 및 3' 연장 아암을 포함하는, 도 27에 제시된 구조에 의해 도시된 것을 포함할 수 있다.
도 27은 본원에서 고려되고 실시예 2에 규정된 방법론에 따라 설계될 수 있는 PEgRNA의 실시양태의 구조를 제공한다. PEgRNA는 5'에서 3' 방향으로 정렬된 3종의 주요 성분 요소, 즉: 스페이서, gRNA 코어 및 3' 단부의 연장 아암을 포함한다. 연장 아암은 5'에서 3' 방향으로 하기 구조적 요소, 즉: 프라이머 결합 부위 (A), 편집 주형 (B) 및 상동성 아암 (C)으로 추가로 나뉠 수 있다. 추가로, PEgRNA는 임의적인 3' 단부 변형제 영역 (e1) 및 임의적인 5' 단부 변형제 영역 (e2)을 포함할 수 있다. 또한 추가로, PEgRNA는 PEgRNA의 3' 단부에 전사 종결 신호를 포함할 수 있다 (도시되지 않음). 이들 구조적 요소는 본원에 추가로 정의된다. PEgRNA의 구조의 도시는 제한적인 것으로 의도되지 않고, 요소의 배열에서의 변형을 포괄한다. 예를 들어, 임의적인 서열 변형제 (e1) 및 (e2)는 제시된 임의의 다른 영역 내에 또는 사이에 위치할 수 있고, 3' 및 5' 단부에 위치하는 것으로 제한되지는 않는다.
또 다른 실시양태에서, PEgRNA는 가이드 RNA 및 5' 연장 아암을 포함하는, 도 28에 제시된 구조에 의해 도시된 것을 포함할 수 있다.
도 28은 본원에서 고려되고 실시예 2에 규정된 방법론에 따라 설계될 수 있는 PEgRNA의 또 다른 실시양태의 구조를 제공한다. PEgRNA는 5'에서 3' 방향으로 정렬된 3종의 주요 성분 요소, 즉: 스페이서, gRNA 코어 및 3' 단부의 연장 아암을 포함한다. 연장 아암은 5'에서 3' 방향으로 하기 구조적 요소, 즉: 프라이머 결합 부위 (A) (서열식별번호: 406543-542056 및 1015219-1082596), 편집 주형 (B) (서열식별번호: 542057-677570 및 1082597-1149974) 및 상동성 아암 (C) (서열식별번호: 677571-813084 및 1149975-1217352)으로 추가로 나뉠 수 있다. 추가로, PEgRNA는 임의적인 3' 단부 변형제 영역 (e1) 및 임의적인 5' 단부 변형제 영역 (e2)을 포함할 수 있다. 또한 추가로, PEgRNA는 PEgRNA의 3' 단부에 전사 종결 신호를 포함할 수 있다 (도시되지 않음). 이들 구조적 요소는 본원에 추가로 정의된다. PEgRNA의 구조의 도시는 제한적인 것으로 의도되지 않고, 요소의 배열에서의 변형을 포괄한다. 예를 들어, 임의적인 서열 변형제 (e1) 및 (e2)는 제시된 임의의 다른 영역 내에 또는 사이에 위치할 수 있고, 3' 및 5' 단부에 위치하는 것으로 제한되지는 않는다.
PEgRNA는 또한 PEgRNA의 특성 및/또는 특징을 변형시켜 프라임 편집의 효능을 개선시킬 수 있는 추가의 설계 개선을 포함할 수 있다. 다양한 실시양태에서, 이들 개선은 (1) 부담스러운 서열 요건 없이 보다 긴 PEgRNA의 발현을 가능하게 할, 비-폴리머라제 III (pol III) 프로모터로부터의 기능적 PEgRNA의 효율적인 발현을 가능하게 하는 설계; (2) 효능을 개선시킬 수 있는 코어, Cas9-결합 PEgRNA 스캐폴드에 대한 개선; (3) RT 프로세싱성을 개선시켜 표적화된 게놈 유전자좌에서 보다 긴 서열의 삽입을 가능하게 하는, PEgRNA에 대한 변형; 및 (4) PEgRNA 안정성을 개선시키거나, RT 프로세싱성을 증진시키거나, PEgRNA의 미스폴딩을 방지하거나 또는 게놈 편집에 중요한 추가의 인자를 동원하는, PEgRNA의 5' 또는 3' 말단에의 RNA 모티프의 부가를 포함하나 이에 제한되지는 않는 다수의 상이한 카테고리 중 1종 이상에 속할 수 있다.
한 실시양태에서, PEgRNA는 보다 큰 연장 아암을 갖는 보다 긴-길이의 PEgRNA의 발현을 개선시키기 위해 polIII 프로모터와 함께 설계될 수 있다. sgRNA는 전형적으로 U6 snRNA 프로모터로부터 발현된다. 이러한 프로모터는 pol III를 동원하여 회합된 RNA를 발현하고, 핵 내에 보유된 짧은 RNA의 발현에 유용하다. 그러나, pol III는 고도로 프로세싱성이 아니고, 수백개 뉴클레오티드 길이보다 더 긴 RNA를 효율적인 게놈 편집에 요구되는 수준으로 발현할 수 없다. 추가적으로, pol III는 U 스트레치에서 멈추거나 종결될 수 있으며, 이는 잠재적으로 PEgRNA를 사용하여 삽입될 수 있는 서열 다양성을 제한한다. 폴리머라제 II (예컨대 pCMV) 또는 폴리머라제 I (예컨대 U1 snRNA 프로모터)을 동원하는 다른 프로모터를 보다 긴 sgRNA를 발현하는 그의 능력에 대해 검사하였다. 그러나, 이들 프로모터는 전형적으로 부분적으로 전사되고, 이는 발현된 PEgRNA에서 스페이서의 여분의 서열 5'를 생성할 것이며, 이는 부위-의존성 방식으로 현저하게 감소된 Cas9:sgRNA 활성을 생성하는 것으로 밝혀졌다. 추가적으로, pol III-전사된 PEgRNA는 단순히 연속 6-7개 U에서 종결될 수 있지만, pol II 또는 pol I로부터 전사된 PEgRNA는 상이한 종결 신호를 필요로 할 것이다. 종종 이러한 신호는 또한 폴리아데닐화를 발생시키며, 이는 핵으로부터 PEgRNA의 바람직하지 않은 수송을 발생시킬 것이다. 유사하게, pol II 프로모터, 예컨대 pCMV로부터 발현된 RNA는 전형적으로 5'-캡핑되며, 이는 또한 그의 핵 유출을 발생시킨다.
이전에, 린(Rinn) 및 동료들은 긴-비코딩 RNA- (lncRNA) 태그부착된 sgRNA의 생산을 위해 다양한 발현 플랫폼을 스크리닝하였다183. 이들 플랫폼은 pCMV로부터 발현되고 인간으로부터의 MALAT1 ncRNA로부터의 ENE 요소184, KSHV로부터의 PAN ENE 요소185, 또는 U1 snRNA로부터의 3' 박스186에서 종결하는 RNA를 포함한다. 특히, MALAT1 ncRNA 및 PAN ENE는 폴리A-테일을 보호하는 삼중 나선을 형성한다184, 187. 이들 구축물은 또한 RNA 안정성을 증진시킬 수 있다. 이들 발현 시스템은 또한 보다 긴 PEgRNA의 발현을 가능하게 할 것으로 고려된다.
또한, 자기-절단 리보자임, 예컨대 해머헤드188, 피스톨189, 해치트189, 헤어핀190, VS191, 트위스터192 또는 트위스터 시스터192 리보자임, 또는 전사된 가이드를 프로세싱하기 위한 다른 자기-절단 요소, 또는 Csy4193에 의해 인식되고 또한 가이드의 프로세싱으로 이어지는 헤어핀을 부가하는, PEgRNA의 일부로서 전사될 pol II 프로모터의 부분의 절단을 위한 일련의 방법이 설계되었다. 또한, 다중 ENE 모티프의 혼입은 KSHV PAN RNA 및 요소에 대해 이전에 입증된 바와 같이 개선된 PEgRNA 발현 및 안정성으로 이어질 수 있는 것으로 가설화된다185. 또한, PEgRNA를 원형 인트론 RNA (ciRNA)의 형태로 원형화하는 것은 또한 증진된 RNA 발현 및 안정성, 뿐만 아니라 핵 국재화로 이어질 수 있는 것으로 예상된다194.
다양한 실시양태에서, PEgRNA는 하기 서열에 의해 예시된 바와 같은 다양한 상기 요소를 포함할 수 있다.
비제한적 실시예 1 - pCMV, Csy4 헤어핀, PEgRNA 및 MALAT1 ENE로 이루어진 PEgRNA 발현 플랫폼
TAGTTATTAATAGTAATCAATTACGGGGTCATTAGTTCATAGCCCATATATGGAGTTCCGCGTTACATAACTTACGGTAAATGGCCCGCCTGGCTGACCGCCCAACGACCCCCGCCCATTGACGTCAATAATGACGTATGTTCCCATAGTAACGCCAATAGGGACTTTCCATTGACGTCAATGGGTGGAGTATTTACGGTAAACTGCCCACTTGGCAGTACATCAAGTGTATCATATGCCAAGTACGCCCCCTATTGACGTCAATGACGGTAAATGGCCCGCCTGGCATTATGCCCAGTACATGACCTTATGGGACTTTCCTACTTGGCAGTACATCTACGTATTAGTCATCGCTATTACCATGGTGATGCGGTTTTGGCAGTACATCAATGGGCGTGGATAGCGGTTTGACTCACGGGGATTTCCAAGTCTCCACCCCATTGACGTCAATGGGAGTTTGTTTTGGCACCAAAATCAACGGGACTTTCCAAAATGTCGTAACAACTCCGCCCCATTGACGCAAATGGGCGGTAGGCGTGTACGGTGGGAGGTCTATATAAGCAGAGCTGGTTTAGTGAACCGTCAGATCGTTCACTGCCGTATAGGCAGGGCCCAGACTGAGCACGTGAGTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAGTTAAAATAAGGCTAGTCCGTTATCAACTTGAAAAAGTGGGACCGAGTCGGTCCTCTGCCATCAAAGCGTGCTCAGTCTGTTTTAGGGTCATGAAGGTTTTTCTTTTCCTGAGAAAACAACACGTATTGTTTTCTCAGGTTTTGCTTTTTGGCCTTTTTCTAGCTTAAAAAAAAAAAAAGCAAAAGATGCTGGTGGTTGGCACTCCTGGTTTCCAGGACGGGGTTCAAATCCCTGCGGCGTCTTTGCTTTGACT (서열식별번호: 1361567)
비제한적 예 2 - pCMV, Csy4 헤어핀, PEgRNA 및 PAN ENE로 이루어진 PEgRNA 발현 플랫폼
TAGTTATTAATAGTAATCAATTACGGGGTCATTAGTTCATAGCCCATATATGGAGTTCCGCGTTACATAACTTACGGTAAATGGCCCGCCTGGCTGACCGCCCAACGACCCCCGCCCATTGACGTCAATAATGACGTATGTTCCCATAGTAACGCCAATAGGGACTTTCCATTGACGTCAATGGGTGGAGTATTTACGGTAAACTGCCCACTTGGCAGTACATCAAGTGTATCATATGCCAAGTACGCCCCCTATTGACGTCAATGACGGTAAATGGCCCGCCTGGCATTATGCCCAGTACATGACCTTATGGGACTTTCCTACTTGGCAGTACATCTACGTATTAGTCATCGCTATTACCATGGTGATGCGGTTTTGGCAGTACATCAATGGGCGTGGATAGCGGTTTGACTCACGGGGATTTCCAAGTCTCCACCCCATTGACGTCAATGGGAGTTTGTTTTGGCACCAAAATCAACGGGACTTTCCAAAATGTCGTAACAACTCCGCCCCATTGACGCAAATGGGCGGTAGGCGTGTACGGTGGGAGGTCTATATAAGCAGAGCTGGTTTAGTGAACCGTCAGATCGTTCACTGCCGTATAGGCAGGGCCCAGACTGAGCACGTGAGTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAGTTAAAATAAGGCTAGTCCGTTATCAACTTGAAAAAGTGGGACCGAGTCGGTCCTCTGCCATCAAAGCGTGCTCAGTCTGTTTTGTTTTGGCTGGGTTTTTCCTTGTTCGCACCGGACACCTCCAGTGACCAGACGGCAAGGTTTTTATCCCAGTGTATATTGGAAAAACATGTTATACTTTTGACAATTTAACGTGCCTAGAGCTCAAATTAAACTAATACCATAACGTAATGCAACTTACAACATAAATAAAGGTCAATGTTTAATCCATAAAAAAAAAAAAAAAAAAA (서열식별번호: 1361568)
비제한적 예 3 - pCMV, Csy4 헤어핀, PEgRNA 및 3xPAN ENE로 이루어진 PEgRNA 발현 플랫폼
TAGTTATTAATAGTAATCAATTACGGGGTCATTAGTTCATAGCCCATATATGGAGTTCCGCGTTACATAACTTACGGTAAATGGCCCGCCTGGCTGACCGCCCAACGACCCCCGCCCATTGACGTCAATAATGACGTATGTTCCCATAGTAACGCCAATAGGGACTTTCCATTGACGTCAATGGGTGGAGTATTTACGGTAAACTGCCCACTTGGCAGTACATCAAGTGTATCATATGCCAAGTACGCCCCCTATTGACGTCAATGACGGTAAATGGCCCGCCTGGCATTATGCCCAGTACATGACCTTATGGGACTTTCCTACTTGGCAGTACATCTACGTATTAGTCATCGCTATTACCATGGTGATGCGGTTTTGGCAGTACATCAATGGGCGTGGATAGCGGTTTGACTCACGGGGATTTCCAAGTCTCCACCCCATTGACGTCAATGGGAGTTTGTTTTGGCACCAAAATCAACGGGACTTTCCAAAATGTCGTAACAACTCCGCCCCATTGACGCAAATGGGCGGTAGGCGTGTACGGTGGGAGGTCTATATAAGCAGAGCTGGTTTAGTGAACCGTCAGATCGTTCACTGCCGTATAGGCAGGGCCCAGACTGAGCACGTGAGTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAGTTAAAATAAGGCTAGTCCGTTATCAACTTGAAAAAGTGGGACCGAGTCGGTCCTCTGCCATCAAAGCGTGCTCAGTCTGTTTTGTTTTGGCTGGGTTTTTCCTTGTTCGCACCGGACACCTCCAGTGACCAGACGGCAAGGTTTTTATCCCAGTGTATATTGGAAAAACATGTTATACTTTTGACAATTTAACGTGCCTAGAGCTCAAATTAAACTAATACCATAACGTAATGCAACTTACAACATAAATAAAGGTCAATGTTTAATCCATAAAAAAAAAAAAAAAAAAAACACACTGTTTTGGCTGGGTTTTTCCTTGTTCGCACCGGACACCTCCAGTGACCAGACGGCAAGGTTTTTATCCCAGTGTATATTGGAAAAACATGTTATACTTTTGACAATTTAACGTGCCTAGAGCTCAAATTAAACTAATACCATAACGTAATGCAACTTACAACATAAATAAAGGTCAATGTTTAATCCATAAAAAAAAAAAAAAAAAAATCTCTCTGTTTTGGCTGGGTTTTTCCTTGTTCGCACCGGACACCTCCAGTGACCAGACGGCAAGGTTTTTATCCCAGTGTATATTGGAAAAACATGTTATACTTTTGACAATTTAACGTGCCTAGAGCTCAAATTAAACTAATACCATAACGTAATGCAACTTACAACATAAATAAAGGTCAATGTTTAATCCATAAAAAAAAAAAAAAAAAAA (서열식별번호: 1361569)
비제한적 예 4 - pCMV, Csy4 헤어핀, PEgRNA 및 3' 박스로 이루어진 PEgRNA 발현 플랫폼
TAGTTATTAATAGTAATCAATTACGGGGTCATTAGTTCATAGCCCATATATGGAGTTCCGCGTTACATAACTTACGGTAAATGGCCCGCCTGGCTGACCGCCCAACGACCCCCGCCCATTGACGTCAATAATGACGTATGTTCCCATAGTAACGCCAATAGGGACTTTCCATTGACGTCAATGGGTGGAGTATTTACGGTAAACTGCCCACTTGGCAGTACATCAAGTGTATCATATGCCAAGTACGCCCCCTATTGACGTCAATGACGGTAAATGGCCCGCCTGGCATTATGCCCAGTACATGACCTTATGGGACTTTCCTACTTGGCAGTACATCTACGTATTAGTCATCGCTATTACCATGGTGATGCGGTTTTGGCAGTACATCAATGGGCGTGGATAGCGGTTTGACTCACGGGGATTTCCAAGTCTCCACCCCATTGACGTCAATGGGAGTTTGTTTTGGCACCAAAATCAACGGGACTTTCCAAAATGTCGTAACAACTCCGCCCCATTGACGCAAATGGGCGGTAGGCGTGTACGGTGGGAGGTCTATATAAGCAGAGCTGGTTTAGTGAACCGTCAGATCGTTCACTGCCGTATAGGCAGGGCCCAGACTGAGCACGTGAGTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAGTTAAAATAAGGCTAGTCCGTTATCAACTTGAAAAAGTGGGACCGAGTCGGTCCTCTGCCATCAAAGCGTGCTCAGTCTGTTTGTTTCAAAAGTAGACTGTACGCTAAGGGTCATATCTTTTTTTGTTTGGTTTGTGTCTTGGTTGGCGTCTTAAA (서열식별번호: 1361570)
비제한적 예 5 - pU1, Csy4 헤어핀, PEgRNA 및 3' 박스로 이루어진 PEgRNA 발현 플랫폼
CTAAGGACCAGCTTCTTTGGGAGAGAACAGACGCAGGGGCGGGAGGGAAAAAGGGAGAGGCAGACGTCACTTCCCCTTGGCGGCTCTGGCAGCAGATTGGTCGGTTGAGTGGCAGAAAGGCAGACGGGGACTGGGCAAGGCACTGTCGGTGACATCACGGACAGGGCGACTTCTATGTAGATGAGGCAGCGCAGAGGCTGCTGCTTCGCCACTTGCTGCTTCACCACGAAGGAGTTCCCGTGCCCTGGGAGCGGGTTCAGGACCGCTGATCGGAAGTGAGAATCCCAGCTGTGTGTCAGGGCTGGAAAGGGCTCGGGAGTGCGCGGGGCAAGTGACCGTGTGTGTAAAGAGTGAGGCGTATGAGGCTGTGTCGGGGCAGAGGCCCAAGATCTCAGTTCACTGCCGTATAGGCAGGGCCCAGACTGAGCACGTGAGTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAGTTAAAATAAGGCTAGTCCGTTATCAACTTGAAAAAGTGGGACCGAGTCGGTCCTCTGCCATCAAAGCGTGCTCAGTCTGTTTCAGCAAGTTCAGAGAAATCTGAACTTGCTGGATTTTTGGAGCAGGGAGATGGAATAGGAGCTTGCTCCGTCCACTCCACGCATCGACCTGGTATTGCAGTACCTCCAGGAACGGTGCACCCACTTTCTGGAGTTTCAAAAGTAGACTGTACGCTAAGGGTCATATCTTTTTTTGTTTGGTTTGTGTCTTGGTTGGCGTCTTAAA (서열식별번호: 1361571)
다양한 다른 실시양태에서, PEgRNA는 스캐폴드 또는 코어 서열에 개선을 도입하는 것에 의해 개선될 수 있다. 이는 공지된 것을 도입함으로써 수행될 수 있다.
코어, Cas9-결합 PEgRNA 스캐폴드는 PE 활성을 증진시키기 위해 개선될 가능성이 있을 수 있다. 여러 이러한 접근법은 이미 입증되었다. 예를 들어, 스캐폴드의 제1 쌍형성 요소 (P1)는 GTTTT-AAAAC 쌍형성 요소를 함유한다. 이러한 연속 T는 pol III 일시정지 및 RNA 전사체의 조기 종결을 발생시키는 것으로 밝혀졌다. P1의 이러한 부분에서 T-A 쌍 중 1개의 G-C 쌍으로의 합리적 돌연변이는 sgRNA 활성을 증진시키는 것으로 밝혀졌고, 이는 이러한 접근법이 또한 PEgRNA에 대해 실행가능할 것임을 시사한다195. 추가적으로, P1의 길이를 증가시키는 것은 또한 sgRNA 폴딩을 증진시키고 개선된 활성으로 이어지는 것으로 밝혀졌고195, 이는 이것이 PEgRNA 활성의 개선을 위한 또 다른 방안임을 시사한다. 코어에 대한 예시적인 개선은 하기를 포함할 수 있다:
P1에 대해 6 nt 연장을 함유하는 PEgRNA
GGCCCAGACTGAGCACGTGAGTTTTAGAGCTAGCTCATGAAAATGAGCTAGCAAGTTAAAATAAGGCTAGTCCGTTATCAACTTGAAAAAGTGGGACCGAGTCGGTCCTCTGCCATCAAAGCGTGCTCAGTCTGTTTTTTT (서열식별번호: 1361572)
P1 내에 T-A에서 G-C로의 돌연변이를 함유하는 PEgRNA
GGCCCAGACTGAGCACGTGAGTTTGAGAGCTAGAAATAGCAAGTTTAAATAAGGCTAGTCCGTTATCAACTTGAAAAAGTGGGACCGAGTCGGTCCTCTGCCATCAAAGCGTGCTCAGTCTGTTTTTTT (서열식별번호: 1361573)
다양한 다른 실시양태에서, PEgRNA는 편집 주형 영역에 변형을 도입함으로써 개선될 수 있다. PEgRNA에 의해 주형화되는 삽입의 크기가 증가함에 따라, 엔도뉴클레아제에 의해 분해되거나, 자발적 가수분해를 겪거나, 또는 RT에 의해 역전사될 수 없거나 PEgRNA 스캐폴드의 폴딩 및 후속 Cas9-RT 결합을 파괴하는 2차 구조로 폴딩될 가능성이 더 크다. 따라서, 전체 유전자의 삽입과 같은 대규모 삽입에 영향을 미치기 위해서는 PEgRNA의 주형에 대한 변형이 필요할 가능성이 있다. 이를 위한 일부 전략은 RNA를 분해 또는 가수분해에 대해 보다 저항성이게 하거나 또는 억제성 2차 구조를 채택할 가능성을 낮추는, 합성 또는 반합성 PEgRNA 내의 변형된 뉴클레오티드의 혼입을 포함한다196. 이러한 변형은 G-풍부 서열에서 RNA 2차 구조를 감소시킬 8-아자-7-데아자구아노신; 분해를 감소시키고 특정 종류의 RNA 2차 구조를 증진시키는 잠금 핵산 (LNA); RNA 안정성을 증진시키는 2'-O-메틸, 2'-플루오로 또는 2'-O-메톡시에톡시 변형을 포함할 수 있다. 이러한 변형은 또한 안정성 및 활성을 증진시키기 위해 PEgRNA의 다른 곳에 포함될 수 있다. 대안적으로 또는 추가적으로, PEgRNA의 주형은 목적하는 단백질 생성물을 코딩하고 또한 RT에 의해 언폴딩될 수 있는 간단한 2차 구조를 채택할 가능성이 더 크도록 설계될 수 있다. 이러한 간단한 구조는 열역학적 싱크로서 작용할 것이며, 이는 역전사를 막을 보다 복잡한 구조가 발생할 가능성을 줄인다. 마지막으로, 또한 주형을 2개의 별개의 PEgRNA로 분할할 수 있다. 이러한 설계에서, PE는 전사를 개시하고 또한 Cas9에 융합된 RNA-결합 단백질 또는 PEgRNA 자체 상의 RNA 인식 요소, 예컨대 MS2 압타머를 통해 표적화된 부위에 별개의 주형 RNA를 동원하는데 사용될 것이다. RT는 이러한 별개의 주형 RNA에 직접 결합할 수 있거나 또는 제2 주형으로 스와핑하기 전에 원래의 PEgRNA 상에서 역전사를 개시할 수 있다. 이러한 접근법은 긴 주형의 부가시 PEgRNA의 미스폴딩을 방지함으로써, 또한 아마도 PE-기반 긴 삽입을 억제할 수 있는, 긴 삽입이 이루어지는 게놈으로부터 Cas9의 해리를 필요로 하지 않음으로써 긴 삽입을 가능하게 할 수 있다.
(iv) 5' 또는 3' 말단에 추가의 RNA 모티프의 설치
또 다른 실시양태에서, PEgRNA는 PEgRNA의 5' 및 3' 말단에 추가의 RNA 모티프를 도입함으로써 개선될 수 있다. 여러 이러한 모티프, 예컨대 KSHV로부터의 PAN ENE 및 MALAT1로부터의 ENE는 비-pol III 프로모터로부터의 보다 긴 PEgRNA의 발현을 종결시키는 가능한 수단으로서 상기 논의되었다. 이들 요소는 폴리A 테일을 에워싸는 RNA 삼중 나선을 형성하여, 이들이 핵 내에 보유되게 한다184,187. 그러나, PEgRNA의 3' 말단에 말단 뉴클레오티드를 폐쇄하는 복합체 구조를 형성함으로써, 이들 구조는 또한 PEgRNA의 엑소뉴클레아제-매개 분해를 방지하는데 도움을 줄 가능성이 있을 것이다.
3' 말단에 삽입된 다른 구조적 요소도 또한 RNA 안정성을 증진시킬 수 있지만, 비-pol III 프로모터로부터의 종결은 가능하게 하지 않는다. 이러한 모티프는 3' 말단을 폐쇄할 헤어핀 또는 RNA 쿼드로플렉스197, 또는 3' 말단에서 2'-3'-시클릭 포스페이트의 형성을 발생시키고 또한 잠재적으로 PEgRNA가 엑소뉴클레아제에 의해 분해될 가능성을 낮출 자기-절단 리보자임, 예컨대 HDV198를 포함할 수 있다. PEgRNA를 불완전한 스플라이싱을 통해 고리화하도록 유도하여 - ciRNA를 형성하는 것은 - 또한 PEgRNA 안정성을 증가시키고 PEgRNA가 핵 내에 보유되도록 할 수 있다194.
추가의 RNA 모티프는 또한 RT 프로세싱성을 개선시키거나 또는 DNA-RNA 듀플렉스에 대한 RT 결합을 증진시킴으로써 PEgRNA 활성을 증진시킬 수 있다. 그의 동족 레트로바이러스 게놈에서 RT에 의해 결합된 천연 서열의 부가는 RT 활성을 증진시킬 수 있다199. 이는 레트로바이러스 게놈 이량체화 및 전사의 개시에 수반되는 천연 프라이머 결합 부위 (PBS), 폴리퓨린 트랙 (PPT) 또는 키싱 루프를 포함할 수 있다199.
PEgRNA의 5' 및 3' 말단에서의 이량체화 모티프 - 예컨대 키싱 루프 또는 GNRA 테트라루프/테트라루프 수용체 쌍200 - 의 부가는 또한 PEgRNA의 효과적인 원형화를 발생시켜 안정성을 개선시킬 수 있다. 추가적으로, 이들 모티프의 부가가 PEgRNA 스페이서 및 프라이머의 물리적 분리를 가능하게 하여, PE 활성을 방해할 스페이서의 폐쇄를 방지할 수 있는 것으로 고려된다. 스페이서 영역에서 작은 토홀드 헤어핀을 형성하는 PEgRNA에 대한 짧은 5' 연장부는 또한 스페이서에 결합하는 PEgRNA의 어닐링 영역과 유리하게 경쟁할 수 있다. 마지막으로, 키싱 루프를 또한 사용하여 다른 주형 RNA를 게놈 부위로 동원하고, RT 활성을 하나의 RNA에서 다른 것으로 스와핑할 수 있다. 예시적인 개선은 하기를 포함하나 이에 제한되지는 않는다:
PEgRNA -HDV 융합체
GGCCCAGACTGAGCACGTGAGTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAGTTAAAATAAGGCTAGTCCGTTATCAACTTGAAAAAGTGGGACCGAGTCGGTCCTCTGCCATCAAAGCGTGCTCAGTCTGGGCCGGCATGGTCCCAGCCTCCTCGCTGGCGCCGGCTGGGCAACATGCTTCGGCATGGCGAATGGGACTTTTTTT (서열식별번호: 1361574)
PEgRNA -MMLV 키싱 루프
GGTGGGAGACGTCCCACCGGCCCAGACTGAGCACGTGAGTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAGTTAAAATAAGGCTAGTCCGTTATCAACTTGAAAAAGTGGGACCGAGTCGGTCCTCTGCCATCAAAGCTTCGACCGTGCTCAGTCTGGTGGGAGACGTCCCACCTTTTTTT (서열식별번호: 1361575)
PEgRNA -VS 리보자임 키싱 루프
GAGCAGCATGGCGTCGCTGCTCACGGCCCAGACTGAGCACGTGAGTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAGTTAAAATAAGGCTAGTCCGTTATCAACTTGAAAAAGTGGGACCGAGTCGGTCCTCTGCCATCAAAGCTTCGACCGTGCTCAGTCTCCATCAGTTGACACCCTGAGGTTTTTTT (서열식별번호: 1361576)
PEgRNA -GNRA 테트라루프/테트라루프 수용체
GCAGACCTAAGTGGUGACATATGGTCTGGGCCCAGACTGAGCACGTGAGTTTTAGAGCTAUACGTAGCAAGTTAAAATAAGGCTAGTCCGTTATCAACTTUACGAAGTGGGACCGAGTCGGTCCTCTGCCATCAAAGCTTCGACCGTGCTCAGTCTGCATGCGATTAGAAATAATCGCATGTTTTTTT (서열식별번호: 1361577)
PEgRNA 주형 스위칭 2차 RNA-HDV 융합체
TCTGCCATCAAAGCTGCGACCGTGCTCAGTCTGGTGGGAGACGTCCCACCGGCCGGCATGGTCCCAGCCTCCTCGCTGGCGCCGGCTGGGCAACATGCTTCGGCATGGCGAATGGGACTTTTTTT (서열식별번호: 1361578)
PEgRNA 스캐폴드는 SpCas9 및 염기 편집제가 개선되는 방법과 유사한 방식으로 방향적 진화를 통해 추가로 개선될 수 있다. 방향적 진화는 Cas9 또는 진화된 Cas9 변이체에 의한 PEgRNA 인식을 증진시킬 수 있다. 추가적으로, 상이한 PEgRNA 스캐폴드 서열은 상이한 게놈 유전자좌에서 최적이어서, 해당 부위에서 PE 활성을 증진시키거나, 오프-타겟 활성을 감소시키거나 또는 둘 다일 가능성이 있다. 마지막으로, 다른 RNA 모티프가 부가된 PEgRNA 스캐폴드의 진화는 비진화된 융합 RNA에 비해 융합된 PEgRNA의 활성을 거의 확실히 개선시킬 것이다. 예를 들어, c-디-GMP-I 압타머 및 해머헤드 리보자임으로 구성된 알로스테릭 리보자임의 진화는 현저하게 개선된 활성으로 이어졌고202, 이는 진화가 해머헤드-PEgRNA 융합체의 활성을 또한 개선시킬 것임을 시사한다. 또한, Cas9는 현재 일반적으로 sgRNA의 5' 연장을 관용하지 않지만, 방향적 진화는 아마도 이러한 불관용을 완화시켜 추가의 RNA 모티프가 이용되도록 하는 돌연변이를 생성할 수 있을 것이다.
본 개시내용은 본원에 개시된 프라임 편집 시스템의 효능을 추가로 개선시키는 임의의 이러한 방식을 고려한다.
II. 치료 PEgRNA를 설계하기 위한 알고리즘 및 방법
본원에 기재된 바와 같이, 본 발명자들은 PEgRNA를 사용한 프라임 편집이 (전체 유전자 또는 단백질 코딩 영역을 포함한 임의의 길이의) 삽입, (임의의 길이의) 결실 및 정확한 병원성 돌연변이를 포함한 매우 다양한 뉴클레오티드 변화를 설치하는데 사용될 수 있다는 것을 발견하고 인지하였다. 그러나, PEgRNA의 다양한 성분, 예컨대 스페이서, gRNA 코어 및 연장 아암 (및 본원에 기재된 바와 같은 연장 성분)을 명시하는 것을 포함한, PEgRNA 구조를 결정 및/또는 예측하는 기술은 아직 존재하지 않는다. 본 발명자들은 연장된 gRNA 구조를 결정하는 것을 포함한, PEgRNA를 결정하기 위한 컴퓨터화 기술을 개발하였다. 각각의 연장된 gRNA 구조는 투입 대립유전자 (예를 들어, 병원성 돌연변이를 나타냄), 산출 대립유전자 (예를 들어, 교정된 야생형 서열을 나타냄), 및 융합 단백질 (예를 들어, PAM 모티프 및 프라임 편집제 닉의 상대 위치를 포함한, 프라임 편집을 위한 CRISPR 시스템)에 기초하여 결정될 수 있다. 투입 대립유전자와 산출 대립유전자 사이의 차이는 목적하는 편집 (예를 들어, 단일 뉴클레오티드 변화, 삽입, 결실 등)을 나타낸다. 결정된 구조를 생성하고, 이를 사용하여 염기 편집을 수행하여 본원에 추가로 기재된 바와 같이 투입 대립유전자를 산출 대립유전자로 변화시킬 수 있다.
도 31은 일부 실시양태에 따른, 연장된 gRNA 구조를 결정하기 위한 예시적인 고수준의 컴퓨터화 방법 (3100)을 보여주는 흐름도이다. 단계 (3102)에서, 컴퓨팅 장치 (예를 들어, 도 34와 함께 기재된 컴퓨팅 장치 (3400))는 투입 대립유전자, 산출 대립유전자 및 핵산 프로그램가능한 DNA 결합 단백질 및 리버스 트랜스크립타제를 포함하는 융합 단백질을 나타내는 데이터에 액세스한다. 단계 (3102)가 투입 대립유전자, 산출 대립유전자 및 융합 단백질 중 3가지 모두에 한 단계로 액세스하는 것을 기재하지만, 이는 예시적 목적을 위한 것이고, 이러한 데이터는 본원에 기재된 기술의 취지에서 벗어나지 않으면서 1개 이상의 단계를 사용하여 액세스될 수 있는 것으로 인지되어야 한다. 데이터에 액세스하는 것은 데이터를 수신하는 것, 데이터를 저장하는 것, 데이터베이스에 액세스하는 것 등을 포함할 수 있다.
단계 (3104)에서, 컴퓨팅 장치는 단계 (3102)에서 액세스된 투입 대립유전자, 산출 대립유전자 및 융합 단백질에 기초하여 연장된 gRNA 구조를 결정한다. 연장된 gRNA 구조는 융합 단백질과 회합되어 투입 대립유전자를 산출 대립유전자로 변화시키도록 설계된다. 융합 단백질은, 연장된 gRNA와 복합체화되는 경우에, 변화가 발생하는 표적 가닥 및 상보적 비-표적 가닥을 포함하는 표적 DNA 서열에 결합할 수 있다. 본원에 기재된 바와 같이, 투입 대립유전자는 병원성 DNA 돌연변이를 나타낼 수 있고, 산출 대립유전자는 교정된 DNA 서열을 나타낼 수 있다.
투입 대립유전자를 산출 대립유전자로 변화시키는 것은 단일 뉴클레오티드 변화, 1개 이상의 뉴클레오티드의 삽입, 1개 이상의 뉴클레오티드의 결실 및/또는 산출 대립유전자를 달성하도록 설계된 임의의 다른 변화를 포함할 수 있다. 특히, 단일 PEgRNA에 의해 유도될 수 있는 편집의 예시적인 부류는 단일 뉴클레오티드 치환, 1 nt 내지 대략 40 nt까지의 삽입, 1 nt 내지 대략 30 nt까지의 결실 및 그의 조합을 포함한다. 예를 들어, 프라임 편집은 스페이서 위치 -3 (예를 들어, 닉의 바로 3')에서 스페이서 위치 +27 (예를 들어, 투입 대립유전자 내 닉의 30 nt 3')로의 이들 유형의 변화를 지지할 수 있다. 다른 위치가 또한 사용될 수 있다. 예를 들어, 스페이서 위치 -4에서의 편집은 프라임 편집 (예를 들어, 스페이서 위치 -5와 -4 사이의 가끔의 RuvC 절단에 의해 유발될 수 있음)으로 SpCas9 시스템을 사용하여 수행될 수 있다. 변화의 유형, nt 변화의 수 및/또는 변화의 위치는 연장된 gRNA 구조를 결정하기 위해 컴퓨터화 기술이 사용할 수 있는 구성가능한 파라미터(들)일 수 있다.
도 3a-3b 및 도 27-28과 관련하여 논의된 바와 같이, 연장된 gRNA는 다양한 성분, 예컨대 투입 대립유전자 내의 표적 뉴클레오티드 서열에 상보적인 연장된 gRNA에 대한 스페이서, 융합 단백질과 상호작용하기 위한 gRNA 백본 및 연장부를 포함할 수 있다. 추가로 단계 (3104)를 참조하면, 컴퓨팅 장치는 스페이서, gRNA 백본 및 연장부 중 하나 이상을 결정한다. 일부 실시양태에서, 기술이 스페이서, gRNA 백본 및/또는 연장부의 임의의 조합을 결정하는 것을 포함할 수 있지만, 일부 실시양태에서 이러한 성분 및/또는 이러한 성분의 측면 중 하나 이상은 공지되어 있고 (예를 들어, 미리 결정되거나, 사전-명시되거나, 고정되어 있는 등), 따라서 단계 (3104)의 일부로서 결정되지 않을 수 있다.
본원에 기재된 바와 같이, gRNA 연장부는 다양한 성분을 포함할 수 있다. 예를 들어, 도 3a-3b 및 27-28에 제시된 바와 같이, 연장부는 RT 주형 (RT 편집 주형 및 상동성 아암을 포함함), 프라이머 결합 부위, RT 종결 신호, 임의적인 5' 단부 변형제 영역 및 임의적인 3' 단부 변형제 영역 중 하나 이상을 포함할 수 있다. 도 32는 일부 실시양태에 따른, 연장부의 성분을 포함한 연장된 gRNA 구조의 성분을 결정하기 위한 예시적인 컴퓨터화 방법 (3200)을 보여주는 흐름도이다. 도 32는 예시적인 것으로 의도되므로, 연장된 gRNA를 결정하기 위해 사용된 기술은 도 32에 제시된 것보다 더 많거나 더 적은 단계를 포함할 수 있는 것으로 인지되어야 한다.
단계 (3202)에서, 컴퓨팅 장치는 양쪽 가닥 상의 투입 대립유전자에서 선택된 CRISPR 시스템의 PAM 모티프와 상용성인 프로토스페이서의 세트를 결정한다. 일부 실시양태에서, 컴퓨팅 장치는 프로토스페이서의 초기 세트를 결정하고, 연관된 닉 위치가 산출 대립유전자에 대한 프라임 편집과 비상용성인 프로토스페이서를 필터링하여 나머지 후보 프로토스페이서의 세트를 생성한다. 예를 들어, 컴퓨팅 장치는 닉이 가닥 상의 목적하는 편집의 3' 측면 상에 있기 때문에 프로토스페이서가 비상용성인 것으로 결정할 수 있다. 또 다른 예로서, 컴퓨팅 장치는 닉과 목적하는 편집 사이의 거리가 너무 큰 것 (예를 들어, 사용자-정의된 한계값, 예를 들어 30 nt, 35 nt 등보다 큰 것)으로 결정할 수 있다.
단계 (3204)에서, 컴퓨팅 장치는 결정된 프로토스페이서 세트로부터 프로토스페이서를 선택한다. 단계 (3206)에서, 컴퓨팅 장치는 투입 대립유전자의 프로토스페이서 서열, 닉의 위치 및 목적하는 편집의 서열을 사용하여 스페이서 및 편집 주형 서열을 결정한다. 스페이서는 대략 20개 뉴클레오티드의 뉴클레오티드 서열을 포함할 수 있다.
단계 (3208)에서, 컴퓨팅 장치는 파라미터의 1개 이상의 세트를 선택하며, 여기서 각각의 세트 파라미터는 프라이머 결합 부위 길이 (예를 들어, nt의 수, 예컨대 대략 8 nt 내지 17 nt로 달라질 수 있음), 상동성 아암 길이 (예를 들어, nt의 수, 예컨대 대략 2 nt 내지 33 nt로 달라질 수 있음), 및 gRNA 백본 서열에 대한 값을 포함한다. 예를 들어, gRNA 백본 서열은 GTTTAAGAGCTATGCTGGAAACAGCATAGCAAGTTTAAATAAGGCTAGTCCGTTATCAACTTGAAAAAGTGGCACCGAGTCGGTGC (서열식별번호: 1361579), GTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAGTTAAAATAAGGCTAGTCCGTTATCAACTTGAAAAAGTGGCACCGAGTCGGTGC (서열식별번호: 1361580), 및/또는 다른 gRNA 백본 서열, 예컨대 야생형 RNA 2차 구조를 보유하는 gRNA 백본 서열일 수 있다.
단계 (3210)에서, 컴퓨팅 장치는 단계 (3208)에서 결정된 파라미터 세트를 선택한다. 단계 (3212)에서, 컴퓨팅 장치는 선택된 파라미터 세트를 사용하여 상동성 아암, 프라이머 결합 부위 서열 및 gRNA 백본을 결정한다. 단계 (3214)에서, 컴퓨팅 장치는 이어서 스페이서, gRNA 백본, PEgRNA 연장 아암 (이는 상동성 아암 및 편집 주형을 포함함)을 연결함으로써 생성된 PEgRNA 서열을 형성한다. 추가로, 연장 아암은 역전사의 종결을 촉발하는 서열인 종결인자 신호를 포함할 수 있다. 이러한 종결인자 서열은, 예를 들어 TTTTTTGTTTT (서열식별번호: 1361581)를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, PEgRNA 연장 아암은 종결 신호를 포함하는 것으로 간주될 수 있다. 다른 실시양태에서, PEgRNA 연장 아암은 종결 신호를 배제하는 것으로 간주될 수 있지만, 대신에 연장 아암이 연장 아암의 외부에 놓인 요소로서의 종결 신호에 부착된다.
방법 (3200)은 단계 (3216)로 진행하고, 컴퓨팅 장치는 더 많은 파라미터 세트가 존재하는지 여부를 결정한다. 예이면, 방법은 단계 (3210)으로 진행하고, 컴퓨팅 장치는 또 다른 파라미터 세트를 선택한다. 아니오이면, 방법은 단계 (3218)로 진행하고, 컴퓨팅 장치는 더 많은 프로토스페이서가 존재하는지 여부를 결정한다. 예이면, 방법은 단계 (3204)로 다시 진행하고, 컴퓨팅 장치는 프로토스페이서 세트로부터 또 다른 프로토스페이서를 선택한다. 아니오이면, 방법은 단계 (3220)으로 진행하고 종료한다.
본원에 기재된 바와 같이, 연장부의 DNA 합성 주형 (예를 들어, RT 주형 서열)은 투입 대립유전자를 산출 대립유전자로 변화시키기 위한 목적하는 뉴클레오티드 변화를 포함하고, RT 편집 주형 (예를 들어, 단계 (3206)에서 결정됨) 및 상동성 아암 (예를 들어, 단계 (3212)에서 결정됨)을 포함한다. 또한 본원에 기재된 바와 같이, DNA 합성 주형 (예를 들어, RT 주형 서열)은 닉 부위에 인접한 내인성 DNA 서열에 상보적인 단일 가닥 DNA 플랩을 코딩한다. 단일 가닥 DNA 플랩은 목적하는 뉴클레오티드 변화 (예를 들어, 단일 뉴클레오티드 변화, 1개 이상의 뉴클레오티드 삽입 및/또는 1개 이상의 뉴클레오티드 결실 등)를 포함한다. 일부 염기 편집 배치에서, 단일 가닥 DNA 플랩은 닉 부위에 인접한 내인성 DNA 서열에 혼성화하여 목적하는 뉴클레오티드 변화를 설치할 수 있다. 일부 염기 편집 배치에서, 단일 가닥 DNA 플랩은 닉 부위에 인접한 내인성 DNA 서열을 대체한다. 단일 가닥 DNA 플랩의 세포 복구는 목적하는 뉴클레오티드 변화를 설치하여 목적하는 산출 대립유전자 생성물을 형성할 수 있다. DNA 합성 주형 (예를 들어, RT 주형 서열)은 다양한 수의 뉴클레오티드를 가질 수 있고, 대략 7개 뉴클레오티드 내지 34개 뉴클레오티드의 범위일 수 있다.
도 32에 제시되지 않았지만, 컴퓨팅 장치는 연장된 gRNA의 다른 성분을 결정하도록 구성될 수 있다. 예를 들어, 일부 실시양태에서 컴퓨팅 장치는 RT 주형에 인접한 RT 종결 신호를 결정하도록 구성된다. 일부 실시양태에서, 컴퓨팅 장치는 RT 종결 신호에 인접한 제1 변형제를 결정하도록 구성될 수 있다. 일부 실시양태에서, 컴퓨팅 장치는 프라이머 결합 부위에 인접한 제2 변형제를 결정하도록 구성된다.
연장된 gRNA 성분은 상이한 입체형태, 예컨대 도 3a-3b 및 도 27-28에 제시된 것으로 배열될 수 있다. 예를 들어, 도 3a를 참조하면, 연장부는 연장된 gRNA 구조의 5' 단부에 있고, 스페이서는 연장부에 대해 3'이고, gRNA 코어에 대해 5'이다. 또 다른 예로서, 도 3b를 참조하면, 스페이서는 연장된 gRNA 구조의 5' 단부에 있고 (gRNA 코어에 대해 5'임), 연장부는 연장된 gRNA 구조의 3' 단부에 있다 (gRNA 코어에 대해 3'임).
일부 실시양태에서, 컴퓨팅 장치는 투입 대립유전자 및 연관된 산출 대립유전자의 세트를 포함하는 데이터베이스에 액세스한다. 예를 들어, 컴퓨팅 장치는 각각이 병원성 돌연변이를 나타내는 대립유전자 및 교정된 야생형 서열을 나타내는 대립유전자를 포함하는 수십만개의 돌연변이를 포함하는 클린바에 의해 제공된 데이터베이스에 액세스할 수 있다. 기술은 각각의 데이터베이스 엔트리에 대한 1개 이상의 연장된 gRNA 구조를 결정하는데 사용될 수 있다. 도 33은 일부 실시양태에 따른, 데이터베이스에서 각각의 돌연변이 엔트리에 대한 연장된 gRNA 구조의 세트를 결정하기 위한 예시적인 컴퓨터화 방법 (3300)을 보여주는 흐름도이다. 단계 (3302)에서, 컴퓨팅 장치는 각각 돌연변이를 나타내는 투입 대립유전자 및 교정된 야생형 서열을 나타내는 산출 대립유전자를 포함하는 돌연변이 엔트리의 세트를 포함하는 데이터베이스 (예를 들어, 클린바 데이터베이스)에 액세스한다.
단계 (3304)에서, 컴퓨팅 장치는 1종 이상의 융합 단백질의 세트에 액세스한다. 일부 실시양태에서, 기술은 단일 융합 단백질 및/또는 상이한 융합 단백질 (예를 들어, 상이한 Cas9 단백질)의 조합에 대한 연장된 gRNA 구조의 세트를 생성하는 것을 포함할 수 있다. 컴퓨팅 장치는 복수의 융합 단백질을 나타내는 데이터에 액세스하도록 구성될 수 있고, 본원에 기재된 바와 같은 각각의 융합 단백질 (예를 들어, Cas9-NG 단백질 및 SpCas9 단백질)에 대한 연장된 gRNA 구조의 세트를 생성할 수 있다.
단계 (3306)에서, 컴퓨팅 장치는 융합 단백질의 세트로부터 융합 단백질을 선택한다. 단계 (3308)에서, 컴퓨팅 장치는 데이터베이스 내 엔트리의 세트로부터 돌연변이 엔트리를 선택한다. 컴퓨팅 장치는, 예를 들어 데이터베이스 내 각각의 엔트리를 통해 반복하고 엔트리에 대한 연장된 gRNA 구조의 세트 (예를 들어, 특정한 융합 단백질에 대한 1개의 세트 및/또는 복수의 융합 단백질 각각에 대한 다중 세트)를 생성하도록 구성될 수 있다. 일부 실시양태에서, 컴퓨팅 장치는 데이터베이스 내 엔트리의 하위세트, 예컨대 사전-구성된 세트, 가장 높은 유의성을 갖는 돌연변이의 세트 (예를 들어, 공지된 치료 이익을 갖는 것) 등에 대해 연장된 gRNA 구조를 생성하도록 구성될 수 있다. 일부 실시양태에서, 데이터베이스가 프라임 편집을 위한 일부 융합 단백질과 상용성이 아닌 엔트리를 포함하는 경우에, 컴퓨팅 장치는 데이터베이스 내 어느 엔트리가 단계 (3304)로부터 선택된 융합 단백질을 사용하는 프라임 편집에 상용성인지를 결정하고, 단계 (3308)에서 선택된 융합 단백질과 상용성인 엔트리를 선택하도록 구성될 수 있다.
단계 (3310)에서, 컴퓨팅 장치는 본원에 기재된 기술을 사용하여 1개 이상의 연장된 gRNA 구조의 세트를 결정한다. 방법은 단계 (3310)에서 단계 (3312)로 진행하고, 컴퓨팅 장치는 데이터베이스에 추가의 엔트리가 존재하는지 여부를 결정한다. 예이면, 컴퓨팅 장치는 단계 (3308)로 다시 진행하여 또 다른 엔트리를 선택한다. 아니오이면, 컴퓨팅 장치는 단계 (3314)로 진행하고, 더 많은 융합 단백질이 존재하는지 여부를 결정한다. 예이면, 컴퓨팅 장치는 단계 (3306)로 다시 진행하고, 또 다른 융합 단백질을 선택한다. 아니오이면, 컴퓨팅 장치는 단계 (3316)으로 진행하고, 방법 (3300)을 종료한다.
일부 실시양태에서, 기술은 비-상보적 서열, 예컨대 상동성 아암의 5', 프라이머 결합 부위의 3' 또는 둘 다인 비-상보적 서열을 함유하는 gRNA 연장부를 갖는 PEgRNA를 설계할 수 있다. 예를 들어, 비-상보적 서열은 키싱 루프 상호작용을 형성하고/거나 RNA 안정성을 위한 보호 헤어핀으로서 작용하고/거나 기타로 설계될 수 있다.
일부 실시양태에서, PEgRNA는 다중 설계 후보 중에서 우선순위를 매기는 전략을 사용하여 설계될 수 있다. 예를 들어, 기술은 (예를 들어, sgRNA:Cas9 복합체에서 천연 뉴클레오티드-단백질 상호작용을 방해하기 때문에) 5'-최외곽 뉴클레오티드가 시토신인 PEgRNA 연장부를 피하도록 설계될 수 있다. 또 다른 예로서, 기술은 RNA 2차 구조 예측 도구를 사용하여 연장된 gRNA의 다른 파라미터, 예컨대 프로토스페이서 및/또는 목적하는 편집 등에 기초하여 바람직한 PBS 길이 및/또는 플랩 길이 등을 선택할 수 있다.
연장된 gRNA 구조를 결정하기 위한 본원에 기재된 컴퓨터화 기술의 예시적인 구현은 하기와 같다:
Figure pct00005
Figure pct00006
Figure pct00007
Figure pct00008
Figure pct00009
Figure pct00010
본원과 함께 제출된 예시적인 서열 목록은 투입 대립유전자 및 상응하는 산출 대립유전자에 대한 클린바 데이터베이스를 사용하여 본원에 기재된 기술을 사용하여 생성하였다. 클린바 데이터베이스 내 엔트리를 먼저 병원성 또는 가능하게는 병원성으로 주석달린 배선 돌연변이로 필터링하였다. 이들 예에 대해, Cas9-NG 및 SpCas9를 사용하여 상용성 돌연변이를 확인하였다. 필터링된 돌연변이 중에서, 대략 72,020개의 고유한 클린바 돌연변이가 Cas9-NG에 의한 프라임 편집과 상용성인 것으로 확인되었고, 대략 63,496개의 고유한 클린바 돌연변이가 NGG PAM을 갖는 SpCas9에 의한 프라임 편집과 상용성인 것으로 확인되었다. 다른 및/또는 추가의 돌연변이는 상이한 PAM 상용성을 갖는 상이한 Cas9 변이체를 함유하는 프라임 편집제를 사용하는 경우에 교정가능할 수 있다는 것이 인지되어야 한다.
다양한 실시양태에서, 상기 알고리즘을 사용하여, 클린바 데이터베이스 엔트리에 대해 본원에 개시된 알고리즘을 사용하여 설계된 서열식별번호: 1-135514 및 813085-880462의 치료 PEgRNA를 설계하였다.
다양한 다른 실시양태에서, 상기 알고리즘을 사용하여, 클린바 데이터베이스에 대해 본원에 개시된 알고리즘을 사용하여 본 명세서의 일부를 형성하는 서열 목록에 포함된 PEgRNA를 설계하였다. 서열 목록은 서열식별번호: 1-135514 및 813085-880462의 완전한 PEgRNA 서열을 포함한다. 각각의 이들 완전한 PEgRNA는 각각 스페이서 (서열식별번호: 135515-271028 및 880463-947840) 및 연장 아암 (서열식별번호: 271029-406542 및 947841-1015218)으로 구성된다. 추가로, 각각의 PEgRNA는, 예를 들어 서열식별번호: 1361579-1361580에 의해 규정된 gRNA 코어를 포함한다. 서열식별번호: 271029-406542 및 947841-1015218의 연장 아암은 추가로 각각 프라이머 결합 부위 (서열식별번호: 406543-542056 및 1015219-1082596), 편집 주형 (서열식별번호: 542057-677570 및 1082597-1149974) 및 상동성 아암 (서열식별번호: 677571-813084 및 1149975-1217352)으로 구성된다. PEgRNA는 임의로 5' 단부 변형제 영역 및/또는 3' 단부 변형제 영역을 포함할 수 있다. PEgRNA는 또한 PEgRNA의 3'에 역전사 종결 신호 (예를 들어, 서열식별번호: 1361560-1361566)를 포함할 수 있다. 본 출원은 이들 서열 모두의 설계 및 사용을 포괄한다.
돌연변이는 부차 대립유전자 빈도, 제출자의 수, 제출자가 그의 해석에서 상충되는지 여부 및 돌연변이가 전문가 패널에 의해 검토되었는지 여부를 사용하여 임상 유의성의 4가지 부류로 분류되었다. 63,496개의 SpCas9-상용성 돌연변이 중에서: 4,627개의 돌연변이가 가장 유의한 수준 (4)으로 확인되었고; 13,943개의 돌연변이가 유의성 수준 3 또는 4로 확인되었고; 44,385개의 돌연변이가 유의성 수준 2, 3 또는 4로 확인되었다.
제공된 서열 목록은 닉과 편집 사이의 거리가 가장 짧은 PEgRNA로서 선택된, 고유한 돌연변이당 단일 PEgRNA를 열거한다. 13 nt의 상동성 아암 길이, 13 nt의 프라이머 결합 부위 길이, 17 nt에서의 gRNA 닉 위치 및 20 nt의 gRNA 길이를 갖는 PEgRNA를 설계하였다. 편집에 대해 20 nt보다 더 먼 닉 부위를 갖는 프로토스페이서는 무시하였다. 사용된 gRNA 백본 서열은 GTTTAAGAGCTATGCTGGAAACAGCATAGCAAGTTTAAATAAGGCTAGTCCGTTATCAACTTGAAAAAGTGGCACCGAGTCGGTGC (서열식별번호: 1361579)였다. 사용된 종결인자 서열은 TTTTTTGTTTT (서열식별번호: 1361581)였다.
본원에 기재된 바와 같이, 제공된 예시적인 서열 목록은 제한적인 것으로 의도되지 않는다. 제공된 PEgRNA 설계에 대한 변경은 gRNA 백본 서열, 프라이머 결합 부위 길이, 플랩 길이 등을 변경시키는 것을 포함한, 본원에 기재된 변경을 포함할 수 있다는 것이 인지되어야 한다.
본원에 개시된 기술 및 실시양태의 임의의 측면을 수행하는데 사용될 수 있는 컴퓨터 시스템 (3400)의 예시적인 구현이 도 34에 제시된다. 컴퓨터 시스템 (3400)은 1개 이상의 프로세서 (3410) 및 1개 이상의 비-일시적 컴퓨터-판독가능 저장 매체 (예를 들어, 메모리 (3420) 및 1개 이상의 비-휘발성 저장 매체 (3430)) 및 디스플레이 (3440)를 포함할 수 있다. 프로세서 (3410)는 임의의 적합한 방식으로 메모리 (3420) 및 비-휘발성 저장 장치 (3430)에 대한 데이터의 기록 및 그로부터의 데이터의 판독을 제어할 수 있으며, 이는 본원에 기재된 본 발명의 측면이 이와 관련하여 제한되지 않기 때문이다. 본원에 기재된 기능 및/또는 기술을 수행하기 위해, 프로세서 (3410)는 프로세서 (3410)에 의한 실행을 위한 명령을 저장하는 비-일시적 컴퓨터-판독가능 저장 매체로서의 역할을 할 수 있는 1개 이상의 컴퓨터-판독가능 저장 매체 (예를 들어, 메모리 (3420), 저장 매체 등)에 저장된 1개 이상의 명령을 실행할 수 있다.
본원에 기재된 기술과 관련하여, 예를 들어 연장된 gRNA 구조를 결정하는데 사용되는 코드는 컴퓨터 시스템 (3400)의 1개 이상의 컴퓨터-판독가능 저장 매체 상에 저장될 수 있다. 프로세서 (3410)는 임의의 이러한 코드를 실행하여 본원에 기재된 바와 같은 예를 계획하기 위한 임의의 기술을 제공할 수 있다. 본원에 기재된 임의의 다른 소프트웨어, 프로그램 또는 명령이 또한 컴퓨터 시스템 (3400)에 의해 저장 및 실행될 수 있다. 컴퓨터 코드는 본원에 기재된 방법 및 기술의 임의의 측면에 적용될 수 있는 것으로 인지될 것이다. 예를 들어, 컴퓨터 코드는 작동 시스템과 상호작용하여 통상적인 작동 시스템 프로세스를 통해 연장된 gRNA 구조를 결정하기 위해 적용될 수 있다.
본원에 약술된 다양한 방법 또는 프로세스는 다양한 작동 시스템 또는 플랫폼 중 어느 하나를 사용하는 1개 이상의 프로세서 상에서 실행가능한 소프트웨어로서 코딩될 수 있다. 추가적으로, 이러한 소프트웨어는 임의의 수많은 적합한 프로그래밍 언어 및/또는 프로그래밍 또는 스크립팅 도구를 사용하여 작성될 수 있고, 또한 가상 기계 또는 적합한 프레임워크 상에서 실행되는 실행가능 기계 언어 코드 또는 중간 코드로서 컴파일링될 수 있다.
이와 관련하여, 다양한 발명의 개념은 1개 이상의 컴퓨터 또는 다른 프로세서 상에서 실행될 때 본 발명의 다양한 실시양태를 구현하는 1개 이상의 프로그램으로 코딩된 적어도 1개의 비-일시적 컴퓨터 판독가능 저장 매체 (예를 들어, 컴퓨터 메모리, 1개 이상의 플로피 디스크, 컴팩트 디스크, 광학 디스크, 자기 테이프, 플래쉬 메모리, 필드 프로그램가능한 게이트 어레이의 회로 구성 또는 다른 반도체 장치 등)로서 구현될 수 있다. 비-일시적 컴퓨터-판독가능 매체 또는 매체들은 전송가능할 수 있어, 그에 저장된 프로그램 또는 프로그램들이 임의의 컴퓨터 리소스 상에 로딩되어 상기 논의된 바와 같은 본 발명의 다양한 측면을 구현할 수 있다.
용어 "프로그램", "소프트웨어" 및/또는 "애플리케이션"은 상기 논의된 바와 같은 실시양태의 다양한 측면을 구현하기 위해 컴퓨터 또는 다른 프로세서를 프로그램화하는데 사용될 수 있는 임의의 유형의 컴퓨터 코드 또는 컴퓨터-실행가능 명령어 세트를 지칭하는 일반적 의미로 본원에 사용된다. 추가적으로, 한 측면에 따르면, 실행될 때 본 발명의 방법을 수행하는 1개 이상의 컴퓨터 프로그램은 단일 컴퓨터 또는 프로세서 상에 존재할 필요가 없고, 본 발명의 다양한 측면을 구현하기 위해 상이한 컴퓨터 또는 프로세서 사이에 모듈 방식으로 분포될 수 있다는 것인 인지되어야 한다.
컴퓨터-실행가능 명령은 1개 이상의 컴퓨터 또는 다른 장치에 의해 실행되는 프로그램 모듈과 같은 많은 형태일 수 있다. 일반적으로, 프로그램 모듈은 특정한 과제를 수행하거나 특정한 추상 데이터 유형을 구현하는 루틴, 프로그램, 객체, 구성요소, 데이터 구조 등을 포함한다. 전형적으로, 프로그램 모듈의 기능성은 다양한 실시양태에서 목적하는 대로 조합되거나 분포될 수 있다.
또한, 데이터 구조는 임의의 적합한 형태의 비-일시적 컴퓨터-판독가능 저장 매체에 저장될 수 있다. 데이터 구조는 데이터 구조 내의 위치를 통해 관련된 필드를 가질 수 있다. 이러한 관계는 마찬가지로 필드 사이의 관계를 전달하는 비-일시적 컴퓨터-판독가능 매체 내의 위치와 함께 필드에 대한 저장을 할당함으로써 달성될 수 있다. 그러나, 데이터 요소들 사이의 관계를 확립하는 포인터, 태그 또는 다른 메카니즘의 사용을 통한 것을 비롯하여 임의의 적합한 메카니즘이 데이터 구조의 필드 내 정보 사이의 관계를 확립하는데 사용될 수 있다.
다양한 발명의 개념이 1개 이상의 방법으로서 구현될 수 있고, 그 예가 제공되었다. 방법의 일부로서 수행되는 동작은 임의의 적합한 방식으로 순서화될 수 있다. 따라서, 동작이 예시된 것과 다른 순서로 수행되는 실시양태가 구축될 수 있으며, 이는 예시적인 실시양태에서 동작이 순차적으로 보여짐에도 불구하고, 일부 동작을 동시에 수행하는 것을 포함할 수 있다.
III. 치료 PEgRNA와 함께 사용하기 위한 프라임 편집제
본원에 개시된 알고리즘에 따라 설계된 치료 PEgRNA는 프라임 편집제와 복합체화된 경우에 프라임 편집을 수행하기 위해 사용될 수 있다. 프라임 편집제는 폴리머라제 (예를 들어, 리버스 트랜스크립타제) (또는 트랜스로 제공된 것)와 융합된 napDNAbp를 포함하며, 임의로 여기서 2개의 도메인은 링커에 의해 연결되고, 추가로 1개 이상의 NLS를 포함할 수 있다. 이들 측면은 하기와 같이 추가로 기재된다.
A. napDNAbp
본원에 기재된 프라임 편집제는 핵산 프로그램가능한 DNA 결합 단백질 (napDNAbp)을 포함할 수 있다.
한 측면에서, napDNAbp는 적어도 1개의 가이드 핵산 (예를 들어, 가이드 RNA 또는 PEgRNA)과 회합되거나 복합체화될 수 있으며, 이는 napDNAbp를 가이드 핵산 또는 그의 부분 (예를 들어, DNA 표적의 프로토스페이서에 어닐링되는 가이드 RNA의 스페이서)에 상보적인 DNA 가닥 (즉, 표적 가닥)을 포함하는 DNA 서열에 국재화시킨다. 다시 말해서, 가이드 핵산은 napDNAbp (예를 들어, Cas9 또는 등가물)를 DNA 내의 프로토스페이서의 상보적 서열에 국재화시키고 결합하도록 "프로그램화한다".
임의의 적합한 napDNAbp가 본원에 기재된 프라임 편집제에 사용될 수 있다. 다양한 실시양태에서, napDNAbp는 임의의 유형 II, 유형 V, 또는 유형 VI CRISPR-Cas 효소를 포함한 임의의 부류 2 CRISPR-Cas 시스템일 수 있다. 게놈 편집을 위한 도구로서 CRISPR-Cas의 급속한 개발을 고려할 때, CRISPR-Cas 효소, 예컨대 Cas9 및 Cas9 오르토로그를 기재하고/거나 확인하는데 사용되는 명명법에서 지속적인 개발이 있어왔다. 본 출원은 기존 및/또는 신규일 수 있는 명명법으로 CRISPR-Cas 효소를 언급한다. 통상의 기술자는 기존 (즉, "레거시")이든 또는 새로운 명명법이든, 사용되는 명명법에 기초하여 본 출원에서 언급되는 특정 CRISPR-Cas 효소를 확인할 수 있을 것이다. CRISPR-Cas 명명법은 문헌 [Makarova et al., "Classification and Nomenclature of CRISPR-Cas Systems: Where from Here?," The CRISPR Journal, Vol. 1. No. 5, 2018]에 광범위하게 논의되어 있으며, 그의 전체 내용은 본원에 참조로 포함된다. 본 출원에서 임의의 주어진 경우에 사용된 특정한 CRISPR-Cas 명명법은 어떠한 방식으로든 제한하는 것이 아니며, 통상의 기술자는 어느 CRISPR-Cas 효소가 언급되는지 확인할 수 있을 것이다.
예를 들어, 하기 유형 II, 유형 V, 및 유형 VI 부류 2 CRISPR-Cas 효소는 하기 관련 기술분야-인식의 기존 (즉, 레거시) 및 새로운 명칭을 갖는다. 각각의 이들 효소 및/또는 그의 변이체는 본원에 기재된 프라임 편집제와 함께 사용될 수 있다:
Figure pct00011
* 문헌 [Makarova et al., The CRISPR Journal, Vol. 1, No. 5, 2018] 참조.
이론에 얽매이지는 않지만, 본원에 고려된 특정 napDNAbp의 작용 메카니즘은 R-루프를 형성하여 napDNAbp가 이중 가닥 DNA 표적의 풀림을 유도하고, 그에 의해 napDNAbp에 의해 결합된 영역에서 가닥을 분리하는 단계를 포함한다. 이어서, 가이드 RNA 스페이서는 "표적 가닥"에 프로토스페이서 서열에서 혼성화한다. 이는 표적 가닥에 상보적인 "비-표적 가닥"을 대체하며, 이는 R-루프의 단일 가닥 영역을 형성한다. 일부 실시양태에서, napDNAbp는 1개 이상의 뉴클레아제 활성을 포함하며, 이는 이어서 DNA를 절단하여 다양한 유형의 병변을 남긴다. 예를 들어, napDNAbp는 제1 위치에서 비-표적 가닥을 절단하고/거나 제2 위치에서 표적 가닥을 절단하는 뉴클레아제 활성을 포함할 수 있다. 뉴클레아제 활성에 따라, 표적 DNA는 절단되어 "이중 가닥 파괴"를 형성할 수 있고, 이에 의해 양쪽 가닥이 절단된다. 다른 실시양태에서, 표적 DNA는 단일 부위에서만 절단될 수 있고, 즉, DNA는 1개의 가닥 상에서 "닉킹"된다. 상이한 뉴클레아제 활성을 갖는 예시적인 napDNAbp는 "Cas9 닉카제" ("nCas9") 및 뉴클레아제 활성을 갖지 않는 탈활성화된 Cas9 ("기능상실 Cas9" 또는 "dCas9")를 포함한다.
본원에 개시된 프라임 편집제와 관련하여 사용될 수 있는 다양한 napDNAbp에 대한 하기 설명은 어떠한 방식으로도 제한하는 것으로 의도되지 않는다. 프라임 편집제는 정규 SpCas9, 또는 임의의 오르토로그 Cas9 단백질, 또는 임의의 변이체 Cas9 단백질-공지되어 있거나 또는 방향적 진화상 과정 또는 달리 돌연변이유발 과정을 통해 제조 또는 진화될 수 있는 Cas9의 임의의 자연 발생 변이체, 돌연변이체, 또는 달리 조작된 버전 포함-을 포함할 수 있다. 다양한 실시양태에서, Cas9 또는 Cas9 변이체는 닉카제 활성을 갖고, 즉 표적 DNA 서열의 가닥만을 절단한다. 다른 실시양태에서, Cas9 또는 Cas9 변이체는 불활성 뉴클레아제를 가지며, 즉 "기능상실" Cas9 단백질이다. 사용될 수 있는 다른 변이체 Cas9 단백질은 정규 SpCas9보다 더 작은 분자량을 갖거나 (예를 들어, 보다 용이한 전달을 위함), 또는 변형되거나 재배열된 1차 아미노산 구조를 갖는 (예를 들어, 원형 순열체 포맷) 것이다.
본원에 기재된 프라임 편집제는 또한 수렴 진화의 결과인 Cas12a (Cpf1) 및 Cas12b1 단백질을 포함한 Cas9 등가물을 포함할 수 있다. 본원에 사용된 napDNAbp (예를 들어, SpCas9, Cas9 변이체, 또는 Cas9 등가물)는 또한 그의 PAM 특이성을 변경/증진시키는 다양한 변형을 함유할 수 있다. 마지막으로, 본 출원은 참조 Cas9 서열, 예컨대 참조 SpCas9 정규 서열 또는 참조 Cas9 등가물 (예를 들어, Cas12a (Cpf1))과 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 적어도 99.9% 서열 동일성을 갖는 임의의 Cas9, Cas9 변이체, 또는 Cas9 등가물을 고려한다.
napDNAbp는 CRISPR (클러스터링된 규칙적 간격의 짧은 회문식 반복부)-연관 뉴클레아제일 수 있다. 상기 개략된 바와 같이, CRISPR은 이동성 유전 요소 (바이러스, 전위가능 요소 및 접합 플라스미드)에 대한 보호를 제공하는 적응 면역계이다. CRISPR 클러스터는 스페이서, 선행 이동성 요소에 상보적인 서열, 및 표적 침입 핵산을 함유한다. CRISPR 클러스터는 CRISPR RNA (crRNA)로 전사 및 프로세싱된다. 유형 II CRISPR 시스템에서, 프리-crRNA의 교정 프로세싱은 트랜스-코딩된 소형 RNA (tracrRNA), 내인성 리보뉴클레아제 3 (rnc) 및 Cas9 단백질을 필요로 한다. tracrRNA는 프리-crRNA의 리보뉴클레아제 3-보조 프로세싱을 위한 가이드로서의 역할을 한다. 후속적으로, Cas9/crRNA/tracrRNA는 스페이서에 상보적인 선형 또는 원형 dsDNA 표적을 핵산내부분해적으로 절단한다. crRNA에 상보적이지 않은 표적 가닥이 먼저 핵산내부분해적으로 절단된 다음, 핵산외부분해적으로 3'-5' 트리밍된다. 사실상, DNA-결합 및 절단은 전형적으로 단백질 및 둘 다의 RNA를 필요로 한다. 그러나, 단일 가이드 RNA ("sgRNA", 또는 간단히 "gRNA")는 crRNA 및 tracrRNA 둘 다의 측면을 단일 RNA 종 내로 혼입하도록 조작될 수 있다. 예를 들어, 문헌 [Jinek M. et al., Science 337:816-821 (2012)]을 참조하며, 그의 전체 내용은 본원에 참조로 포함된다.
일부 실시양태에서, napDNAbp는 표적 서열의 위치에서, 예컨대 표적 서열 내에서 및/또는 표적 서열의 상보체 내에서 하나 또는 양쪽 가닥의 절단을 지시한다. 일부 실시양태에서, napDNAbp는 표적 서열의 제1 또는 마지막 뉴클레오티드로부터 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 50, 100, 200, 500개 또는 그 초과의 염기 쌍 내에서 하나 또는 양쪽 가닥의 절단을 지시한다. 일부 실시양태에서, 벡터는 돌연변이된 napDNAbp가 표적 서열을 함유하는 표적 폴리뉴클레오티드의 하나 또는 양쪽 가닥을 절단하는 능력이 결여되도록 상응하는 야생형 효소에 대해 돌연변이된 napDNAbp를 코딩한다. 예를 들어, 에스. 피오게네스(S. pyogenes)로부터의 Cas9의 RuvC I 촉매 도메인에서 아스파르테이트에서 알라닌으로의 치환 (D10A)은 Cas9를 양쪽 가닥을 절단하는 뉴클레아제로부터 닉카제 (단일 가닥을 절단함)로 전환시킨다. Cas9를 닉카제로 만드는 돌연변이의 다른 예는, 비제한적으로, 정규 SpCas9 서열, 또는 다른 Cas9 변이체 또는 Cas9 등가물에서의 등가의 아미노산 위치와 관련하여 H840A, N854A, 및 N863A를 포함한다.
본원에 사용된 용어 "Cas 단백질"은 자연으로부터 수득된 전장 Cas 단백질, 자연 발생 Cas 단백질과 상이한 서열을 갖는 재조합 Cas 단백질, 또는 그럼에도 불구하고 개시된 방법에 필요한 모든 또는 유의한 양의 필수적인 기본 기능, 즉 (i) 표적 DNA에 대한 Cas 단백질의 핵산 프로그램가능한 결합의 보유, 및 (ii) 하나의 가닥 상의 표적 DNA 서열을 닉킹하는 능력을 보유하는 Cas 단백질의 임의의 단편을 지칭한다. 본원에서 고려되는 Cas 단백질은 CRISPR Cas9 단백질, 뿐만 아니라 Cas9 등가물, 변이체 (예를 들어, Cas9 닉카제 (nCas9) 또는 뉴클레아제 불활성 Cas9 (dCas9)) 상동체, 오르토로그, 또는 파라로그 (자연 발생이든 또는 비-자연 발생 (예를 들어, 조작 또는 재조합)이든)를 포괄하고, Cas12a (Cpf1), Cas12e (CasX), Cas12b1 (C2c1), Cas12b2, Cas12c (C2c3), C2c4, C2c8, C2c5, C2c10, C2c9 Cas13a (C2c2), Cas13d, Cas13c (C2c7), Cas13b (C2c6), 및 Cas13b를 포함한 임의의 부류 2 CRISPR 시스템 (예를 들어, 유형 II, V, VI)으로부터의 Cas9 등가물을 포함할 수 있다. 추가의 Cas-등가물은 문헌 [Makarova et al., "C2c2 is a single-component programmable RNA-guided RNA-targeting CRISPR effector," Science 2016; 353(6299) 및 Makarova et al., "Classification and Nomenclature of CRISPR-Cas Systems: Where from Here?," The CRISPR Journal, Vol. 1. No. 5, 2018]에 기재되어 있으며, 그의 내용은 본원에 참조로 포함된다.
용어 "Cas9" 또는 "Cas9 뉴클레아제" 또는 "Cas9 모이어티" 또는 "Cas9 도메인"은 임의의 유기체로부터의 임의의 자연 발생 Cas9, 그의 임의의 자연 발생 Cas9 등가물 또는 기능적 단편, 임의의 유기체로부터의 임의의 Cas9 상동체, 오르토로그, 또는 파라로그, 및 자연 발생 또는 조작된 Cas9의 임의의 돌연변이체 또는 변이체를 포괄한다. 용어 Cas9는 특별히 제한적인 것으로 의도되지 않으며, "Cas9 또는 등가물"로 지칭될 수 있다. 예시적인 Cas9 단백질은 본원에 추가로 기재되고/거나 관련 기술분야에 기재되어 있고, 본원에 참조로 포함된다. 본 개시내용은 본 발명의 프라임 편집제 (PE)에 사용되는 특정한 Cas9와 관련하여 제한되지 않는다.
본원에 언급된 바와 같이, Cas9 뉴클레아제 서열 및 구조는 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 널리 공지되어 있다 (예를 들어, 문헌 ["Complete genome sequence of an M1 strain of Streptococcus pyogenes." Ferretti et al., J.J., McShan W.M., Ajdic D.J., Savic D.J., Savic G., Lyon K., Primeaux C., Sezate S., Suvorov A.N., Kenton S., Lai H.S., Lin S.P., Qian Y., Jia H.G., Najar F.Z., Ren Q., Zhu H., Song L., White J., Yuan X., Clifton S.W., Roe B.A., McLaughlin R.E., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 98:4658-4663(2001); "CRISPR RNA maturation by trans-encoded small RNA and host factor RNase III." Deltcheva E., Chylinski K., Sharma C.M., Gonzales K., Chao Y., Pirzada Z.A., Eckert M.R., Vogel J., Charpentier E., Nature 471:602-607(2011); 및 "A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity." Jinek M., Chylinski K., Fonfara I., Hauer M., Doudna J.A., Charpentier E. Science 337:816-821(2012)] 참조, 이들 각각의 전체 내용은 본원에 참조로 포함됨).
Cas9 및 Cas9 등가물의 예는 하기와 같이 제공되지만; 이들 구체적 예는 제한적인 것으로 의도되지 않는다. 본 개시내용의 프라이머 편집제는 임의의 적합한 Cas9 또는 Cas9 등가물을 포함한, 임의의 적합한 napDNAbp를 사용할 수 있다.
(i) 야생형 정규 SpCas9
한 실시양태에서, 본원에 기재된 프라이머 편집제 구축물은 에스. 피오게네스로부터의 "정규 SpCas9" 뉴클레아제를 포함할 수 있으며, 이는 게놈 조작을 위한 도구로서 널리 사용되어 왔고, 부류 2 CRISPR-Cas 시스템의 효소의 유형 II 하위군으로서 카테고리화된다. 이 Cas9 단백질은 2개의 별개의 뉴클레아제 도메인을 함유하는 대형의, 다중-도메인 단백질이다. 점 돌연변이를 Cas9 내로 도입하여 하나 또는 둘 다의 뉴클레아제 활성을 없앨 수 있으며, 이는 각각, sgRNA-프로그램화된 방식으로 DNA에 결합하는 그의 능력을 여전히 보유하는 닉카제 Cas9 (nCas9) 또는 기능상실 Cas9 (dCas9)를 생성한다. 원칙적으로, 또 다른 단백질 또는 도메인에 융합될 경우, Cas9 또는 그의 변이체 (예를 들어, nCas9)는 단순히 적절한 sgRNA와의 공동-발현에 의해 그러한 단백질을 사실상 모든 DNA 서열에 표적화할 수 있다. 본원에 사용된 정규 SpCas9 단백질은 하기 아미노산 서열을 갖는 스트렙토코쿠스 피오게네스로부터의 야생형 단백질을 지칭한다:
Figure pct00012
Figure pct00013
본원에 기재된 프라임 편집제는 정규 SpCas9, 또는 상기 제공된 야생형 Cas9 서열과 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 또는 적어도 99% 서열 동일성을 갖는 그의 임의의 변이체를 포함할 수 있다. 이들 변이체는 하기를 포함하는, 스위스프롯 수탁 번호 Q99ZW2 엔트리로 보고된 임의의 공지된 돌연변이를 포함하는, 1개 이상의 돌연변이를 함유하는 SpCas9 변이체를 포함할 수 있다:
Figure pct00014
본 개시내용에 사용될 수 있는 다른 야생형 SpCas9 서열은 하기를 포함한다:
Figure pct00015
Figure pct00016
Figure pct00017
Figure pct00018
본원에 기재된 프라임 편집제는 임의의 상기 SpCas9 서열, 또는 그와 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 또는 적어도 99% 서열 동일성을 갖는 그의 임의의 변이체를 포함할 수 있다.
(ii) 야생형 Cas9 오르토로그
다른 실시양태에서, Cas9 단백질은 에스. 피오게네스로부터의 정규 Cas9와 상이한 또 다른 박테리아 종으로부터의 야생형 Cas9 오르토로그일 수 있다. 예를 들어, 하기 Cas9 오르토로그가 본 명세서에 기재된 프라임 편집제 구축물과 관련하여 사용될 수 있다. 또한, 하기 오르토로그 중 임의의 것에 대해 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 또는 적어도 99% 서열 동일성을 갖는 임의의 변이체 Cas9 오르토로그가 또한 본 발명의 프라임 편집제와 함께 사용될 수 있다.
Figure pct00019
Figure pct00020
Figure pct00021
Figure pct00022
본원에 기재된 프라임 편집제는 임의의 상기 Cas9 오르토로그 서열, 또는 그와 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 또는 적어도 99% 서열 동일성을 갖는 그의 임의의 변이체를 포함할 수 있다.
napDNAbp는 임의의 적합한 상동체 및/또는 오르토로그 또는 자연 발생 효소, 예컨대 Cas9를 포함할 수 있다. Cas9 상동체 및/또는 오르토로그는 에스. 피오게네스 및 에스. 써모필루스(S. thermophilus)를 포함하나 이에 제한되지는 않는 다양한 종에서 기재되어 있다. 바람직하게는, Cas 모이어티는 닉카제로서 구성되고 (예를 들어, 돌연변이유발되거나, 재조합적으로 조작되거나, 또는 달리 자연으로부터 수득됨), 즉 표적 이중 가닥의 단일 가닥만을 절단할 수 있다. 추가의 적합한 Cas9 뉴클레아제 및 서열은 본 개시내용에 기초하여 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 명백할 것이고, 이러한 Cas9 뉴클레아제 및 서열은 그의 전체 내용이 본원에 참조로 포함되는 문헌 [Chylinski, Rhun, and Charpentier, "The tracrRNA and Cas9 families of type II CRISPR-Cas immunity systems" (2013) RNA Biology 10:5, 726-737]에 개시된 유기체 및 유전자좌로부터의 Cas9 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, Cas9 뉴클레아제는 불활성 (예를 들어, 불활성화된) DNA 절단 도메인을 가지며, 즉 Cas9는 닉카제이다. 일부 실시양태에서, Cas9 단백질은 표 3의 변이체 중 어느 하나에 의해 제공된 바와 같은 Cas9 단백질의 아미노산 서열과 적어도 80% 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, Cas9 단백질은 상기 표에서 Cas9 오르토로그 중 어느 하나에 의해 제공된 바와 같은 Cas9 단백질의 아미노산 서열과 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 92%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 적어도 99.5% 동일한 아미노산 서열을 포함한다.
(iii) 기능상실 Cas9 변이체
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 프라임 편집제는 Cas9의 둘 다의 뉴클레아제 도메인, 즉 RuvC 도메인 (비-프로토스페이서 DNA 가닥을 절단함) 및 HNH 도메인 (프로토스페이서 DNA 가닥을 절단함)을 불활성화시키는 1개 이상의 돌연변이로 인해 뉴클레아제 활성을 갖지 않는 기능상실 Cas9, 예를 들어 기능상실 SpCas9를 포함할 수 있다. 뉴클레아제 불활성화는 코딩된 단백질 또는 그와 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 또는 적어도 99% 서열 동일성을 갖는 그의 임의의 변이체의 아미노산 서열에서 1개 이상의 치환 및/또는 결실을 발생시키는 1개 이상의 돌연변이로 인한 것일 수 있다.
본원에 사용된 용어 "dCas9"는 뉴클레아제-불활성 Cas9 또는 뉴클레아제-기능상실 Cas9, 또는 그의 기능적 단편을 지칭하고, 임의의 유기체로부터의 임의의 자연 발생 dCas9, 그의 임의의 자연 발생 dCas9 등가물 또는 기능적 단편, 임의의 유기체로부터의 임의의 dCas9 상동체, 오르토로그, 또는 파라로그, 및 자연 발생 또는 조작된 dCas9의 임의의 돌연변이체 또는 변이체를 포괄한다. 용어 dCas9는 특별히 제한적인 것으로 의도되지 않으며, "dCas9 또는 등가물"로 지칭될 수 있다. 예시적인 dCas9 단백질 및 dCas9 단백질을 제조하는 방법은 본원에 추가로 기재되고/거나 관련 기술분야에 기재되어 있고, 본원에 참조로 포함된다.
다른 실시양태에서, dCas9는 Cas9 뉴클레아제 활성을 불활성화시키는 1개 이상의 돌연변이를 갖는 Cas9 아미노산 서열에 상응하거나, 또는 부분적으로 또는 전체적으로 그를 포함한다. 다른 실시양태에서, 내인성 Cas9 뉴클레아제 활성의 완전 또는 부분 불활성화를 초래할 수 있는, D10A 및 H840A 이외의 돌연변이를 갖는 Cas9 변이체가 제공된다 (예를 들어, 각각 nCas9 또는 dCas9). 이러한 돌연변이는, 예로서, D10 및 H820에서의 다른 아미노산 치환, 또는 야생형 서열, 예컨대 스트렙토코쿠스 피오게네스로부터의 Cas9 (NCBI 참조 서열: NC_017053.1 (서열식별번호: 1361424))와 관련하여 Cas9의 뉴클레아제 도메인 내의 다른 치환 (예를 들어, HNH 뉴클레아제 서브도메인 및/또는 RuvC1 서브도메인에서의 치환)을 포함한다. 일부 실시양태에서, Cas9의 변이체 또는 상동체 (예를 들어, 스트렙토코쿠스 피오게네스로부터의 Cas9의 변이체 (NCBI 참조 서열: NC_017053.1 (서열식별번호: 1361424)))가 제공되며, 이는 NCBI 참조 서열: NC_017053.1 (서열식별번호: 1361424)과 적어도 약 70% 동일하거나, 적어도 약 80% 동일하거나, 적어도 약 90% 동일하거나, 적어도 약 95% 동일하거나, 적어도 약 98% 동일하거나, 적어도 약 99% 동일하거나, 적어도 약 99.5% 동일하거나, 또는 적어도 약 99.9% 동일하다. 일부 실시양태에서, NC_017053.1 (서열식별번호: 1361424)보다 약 5개 아미노산, 약 10개 아미노산, 약 15개 아미노산, 약 20개 아미노산, 약 25개 아미노산, 약 30개 아미노산, 약 40개 아미노산, 약 50개 아미노산, 약 75개 아미노산, 약 100개 아미노산 또는 그 초과만큼 더 짧거나 더 긴 아미노산 서열을 갖는 dCas9의 변이체 (예를 들어, NCBI 참조 서열: NC_017053.1 (서열식별번호: 1361424)의 변이체)가 제공된다.
한 실시양태에서, 기능상실 Cas9는 Q99ZW2의 정규 SpCas9 서열을 기초로 할 수 있고, D10A 및 H810A 치환 (밑줄 및 볼드체)을 포함하는 하기 서열을 가질 수 있거나, 또는 그에 대해 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 또는 적어도 99% 서열 동일성을 갖는 서열식별번호: 1361444의 변이체일 수 있다:
Figure pct00023
(iv) Cas9 닉카제 변이체
한 실시양태에서, 본원에 기재된 프라임 편집제는 Cas9 닉카제를 포함한다. 용어 "Cas9 닉카제" 또는 "nCas9"는 이중 가닥 DNA 분자 표적에 단일 가닥 파괴를 도입할 수 있는 Cas9의 변이체를 지칭한다. 일부 실시양태에서, Cas9 닉카제는 단일 기능적 뉴클레아제 도메인만을 포함한다. 야생형 Cas9 (예를 들어, 정규 SpCas9)는 2개의 별개의 뉴클레아제 도메인, 즉 RuvC 도메인 (비-프로토스페이서 DNA 가닥을 절단함) 및 HNH 도메인 (프로토스페이서 DNA 가닥을 절단함)을 포함한다. 한 실시양태에서, Cas9 닉카제는 RuvC 뉴클레아제 활성을 불활성화시키는 RuvC 도메인 내의 돌연변이를 포함한다. 예를 들어, 아스파르테이트 (D) 10, 히스티딘 (H) 983, 아스파르테이트 (D) 986, 또는 글루타메이트 (E) 762에서의 돌연변이는 RuvC 뉴클레아제 도메인의 기능 상실 돌연변이 및 기능적 Cas9 닉카제의 생성으로서 보고되어 있다 (예를 들어, 문헌 [Nishimasu et al., "Crystal structure of Cas9 in complex with guide RNA and target DNA," Cell 156(5), 935-949], 이는 본원에 참조로 포함됨). 따라서, RuvC 도메인 내의 닉카제 돌연변이는 D10X, H983X, D986X, 또는 E762X를 포함할 수 있으며, 여기서 X는 야생형 아미노산 이외의 임의의 아미노산이다. 일부 실시양태에서, 닉카제는 D10A, 또는 H983A, 또는 D986A, 또는 E762A, 또는 그의 조합일 수 있다.
다양한 실시양태에서, Cas9 닉카제는 RuvC 뉴클레아제 도메인에 돌연변이를 가질 수 있고, 하기 아미노산 서열 중 하나, 또는 그와 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 또는 적어도 99% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 갖는 그의 변이체를 가질 수 있다.
Figure pct00024
Figure pct00025
Figure pct00026
또 다른 실시양태에서, Cas9 닉카제는 HNH 뉴클레아제 활성을 불활성화시키는 HNH 도메인 내의 돌연변이를 포함한다. 예를 들어, 히스티딘 (H) 840 또는 아스파라긴 (R) 863에서의 돌연변이는 HNH 뉴클레아제 도메인의 기능 상실 돌연변이 및 기능적 Cas9 닉카제의 생성으로서 보고되어 있다 (예를 들어, 문헌 [Nishimasu et al., "Crystal structure of Cas9 in complex with guide RNA and target DNA," Cell 156(5), 935-949], 이는 본원에 참조로 포함됨). 따라서, HNH 도메인 내의 닉카제 돌연변이는 H840X 및 R863X를 포함할 수 있으며, 여기서 X는 야생형 아미노산 이외의 임의의 아미노산이다. 일부 실시양태에서, 닉카제는 H840A 또는 R863A, 또는 그의 조합일 수 있다.
다양한 실시양태에서, Cas9 닉카제는 HNH 뉴클레아제 도메인에 돌연변이를 가질 수 있고, 하기 아미노산 서열 중 하나, 또는 그와 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 또는 적어도 99% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 갖는 그의 변이체를 가질 수 있다.
Figure pct00027
Figure pct00028
(v) 다른 Cas9 변이체
기능상실 Cas9 및 Cas9 닉카제 변이체 이외에도, 본원에 사용된 Cas9 단백질은 또한 임의의 야생형 Cas9, 또는 돌연변이체 Cas9 (예를 들어, 기능상실 Cas9 또는 Cas9 닉카제), 또는 단편 Cas9, 또는 원형 순열체 Cas9, 또는 본원에 개시되거나 관련 기술분야에 공지된 Cas9의 다른 변이체를 포함한 임의의 참조 Cas9 단백질과 적어도 약 70% 동일한, 적어도 약 80% 동일한, 적어도 약 90% 동일한, 적어도 약 95% 동일한, 적어도 약 96% 동일한, 적어도 약 97% 동일한, 적어도 약 98% 동일한, 적어도 약 99% 동일한, 적어도 약 99.5% 동일한, 또는 적어도 약 99.9% 동일한 다른 "Cas9 변이체"를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, Cas9 변이체는 참조 Cas9와 비교하여 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 21, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50개 또는 그 초과의 아미노산 변화를 가질 수 있다. 일부 실시양태에서, Cas9 변이체는 참조 Cas9의 단편 (예를 들어, gRNA 결합 도메인 또는 DNA-절단 도메인)을 포함하며, 이러한 단편은 야생형 Cas9의 상응하는 단편과 적어도 약 70% 동일하거나, 적어도 약 80% 동일하거나, 적어도 약 90% 동일하거나, 적어도 약 95% 동일하거나, 적어도 약 96% 동일하거나, 적어도 약 97% 동일하거나, 적어도 약 98% 동일하거나, 적어도 약 99% 동일하거나, 적어도 약 99.5% 동일하거나, 또는 적어도 약 99.9% 동일하다. 일부 실시양태에서, 단편은 상응하는 야생형 Cas9 (예를 들어, 서열식별번호: 1361421)의 아미노산 길이의 적어도 30%, 적어도 35%, 적어도 40%, 적어도 45%, 적어도 50%, 적어도 55%, 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 적어도 99.5%이다.
일부 실시양태에서, 개시내용은 또한, 그의 기능성을 보유하고 임의의 본원에 개시된 Cas9 단백질의 단편인 Cas9 단편을 활용할 수 있다. 일부 실시양태에서, Cas9 단편은 적어도 100개 아미노산 길이이다. 일부 실시양태에서, 단편은 적어도 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950, 1000, 1050, 1100, 1150, 1200, 1250개, 또는 적어도 1300개 아미노산 길이이다.
다양한 실시양태에서, 본원에 개시된 프라임 편집제는 하기와 같이 기재된 Cas9 변이체 중 하나, 또는 임의의 참조 Cas9 변이체와 적어도 약 70% 동일한, 적어도 약 80% 동일한, 적어도 약 90% 동일한, 적어도 약 95% 동일한, 적어도 약 96% 동일한, 적어도 약 97% 동일한, 적어도 약 98% 동일한, 적어도 약 99% 동일한, 적어도 약 99.5% 동일한, 또는 적어도 약 99.9% 동일한 그의 Cas9 변이체를 포함할 수 있다.
(vi) 작은-크기의 Cas9 변이체
일부 실시양태에서, 본원에 고려되는 프라임 편집제는 정규 SpCas9 서열보다 더 작은 분자량의 Cas9 단백질을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 보다 작은-크기의 Cas9 변이체는 예를 들어 발현 벡터, 나노입자, 또는 다른 전달 수단에 의한 세포로의 전달을 용이하게 할 수 있다. 특정 실시양태에서, 보다 작은-크기의 Cas9 변이체는 부류 2 CRISPR-Cas 시스템의 유형 II 효소로서 카테고리화된 효소를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 보다 작은-크기의 Cas9 변이체는 부류 2 CRISPR-Cas 시스템의 유형 V 효소로서 카테고리화된 효소를 포함할 수 있다. 다른 실시양태에서, 보다 작은-크기의 Cas9 변이체는 부류 2 CRISPR-Cas 시스템의 유형 VI 효소로서 카테고리화된 효소를 포함할 수 있다.
정규 SpCas9 단백질은 1368개 아미노산 길이이고, 158 킬로달톤의 예측 분자량을 갖는다. 본원에 사용된 용어 "작은-크기의 Cas9 변이체"는 적어도 1300개 미만의 아미노산, 또는 적어도 1290개 미만의 아미노산, 또는 1280개 미만의 아미노산, 또는 1270개 미만의 아미노산, 또는 1260개 미만의 아미노산, 또는 1250개 미만의 아미노산, 또는 1240개 미만의 아미노산, 또는 1230개 미만의 아미노산, 또는 1220개 미만의 아미노산, 또는 1210개 미만의 아미노산, 또는 1200개 미만의 아미노산, 또는 1190개 미만의 아미노산, 또는 1180개 미만의 아미노산, 또는 1170개 미만의 아미노산, 또는 1160개 미만의 아미노산, 또는 1150개 미만의 아미노산, 또는 1140개 미만의 아미노산, 또는 1130개 미만의 아미노산, 또는 1120개 미만의 아미노산, 또는 1110개 미만의 아미노산, 또는 1100개 미만의 아미노산, 또는 1050개 미만의 아미노산, 또는 1000개 미만의 아미노산, 또는 950개 미만의 아미노산, 또는 900개 미만의 아미노산, 또는 850개 미만의 아미노산, 또는 800개 미만의 아미노산, 또는 750개 미만의 아미노산, 또는 700개 미만의 아미노산, 또는 650개 미만의 아미노산, 또는 600개 미만의 아미노산, 또는 550개 미만의 아미노산, 또는 500개 미만의 아미노산이지만, 적어도 약 400개 초과의 아미노산이고, Cas9 단백질의 요구되는 기능을 보유하는 임의의 Cas9 변이체-자연 발생, 조작, 또는 그 밖의 것-를 지칭한다. Cas9 변이체는 부류 2 CRISPR-Cas 시스템의 유형 II, 유형 V, 또는 유형 VI 효소로서 카테고리화된 것을 포함할 수 있다.
다양한 실시양태에서, 본원에 개시된 프라임 편집제는 하기와 같이 기재된 작은-크기의 Cas9 변이체 중 하나, 또는 임의의 참조 작은-크기의 Cas9 단백질과 적어도 약 70% 동일한, 적어도 약 80% 동일한, 적어도 약 90% 동일한, 적어도 약 95% 동일한, 적어도 약 96% 동일한, 적어도 약 97% 동일한, 적어도 약 98% 동일한, 적어도 약 99% 동일한, 적어도 약 99.5% 동일한, 또는 적어도 약 99.9% 동일한 그의 Cas9 변이체를 포함할 수 있다.
Figure pct00029
Figure pct00030
(vii) Cas9 등가물
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 프라임 편집제는 임의의 Cas9 등가물을 포함할 수 있다. 본원에 사용된 용어 "Cas9 등가물"은 그의 아미노산 1차 서열 및/또는 그의 3차원 구조가 진화상 관점에서 상이할 수 있고/거나 관련되지 않을 수 있음에도 불구하고 본 발명의 프라임 편집제에서 Cas9와 동일한 기능을 제공하는 임의의 napDNAbp 단백질을 포괄하는 광범위한 용어이다. 따라서, Cas9 등가물은 진화적으로 관련된, 본원에 기재되거나 또는 본원에 포괄되는 임의의 Cas9 오르토로그, 상동체, 돌연변이체, 또는 변이체를 포함하는 한편, Cas9 등가물은 또한 Cas9와 동일하거나 유사한 기능을 갖도록 수렴 진화 과정을 통해 진화될 수 있지만, 아미노산 서열 및/또는 3차원 구조와 관련하여 임의의 유사성을 반드시 갖는 것은 아닌 단백질을 포괄한다. 본원에 기재된 프라임 편집제는 Cas9 등가물이 수렴 진화를 통해 발생한 단백질에 기초할 수 있음에도 불구하고 Cas9와 동일하거나 유사한 기능을 제공할 임의의 Cas9 등가물을 포괄한다. 예를 들어, Cas9가 CRISPR-Cas 시스템의 유형 II 효소를 지칭하는 경우에, Cas9 등가물은 CRISPR-Cas 시스템의 유형 V 또는 유형 VI 효소를 지칭할 수 있다.
예를 들어, Cas12e (CasX)는 보고된 바로는 Cas9와 동일한 기능을 갖지만 수렴 진화를 통해 진화된 Cas9 등가물이다. 따라서, 문헌 [Liu et al., "CasX enzymes comprises a distinct family of RNA-guided genome editors," Nature, 2019, Vol.566: 218-223]에 기재된 Cas12e (CasX) 단백질은 본원에 기재된 프라임 편집제와 함께 사용되는 것으로 고려된다. 또한, Cas12e (CasX)의 임의의 변이체 또는 변형이 고려될 수 있고, 본 개시내용의 범주 내에 있다.
Cas9는 매우 다양한 종에서 진화된 박테리아 효소이다. 그러나, 본원에 고려되는 Cas9 등가물은 또한 박테리아와 상이한 단일-세포 원핵 미생물의 역 및 계를 구성하는 고세균으로부터 수득될 수 있다.
일부 실시양태에서, Cas9 등가물은 Cas12e (CasX) 또는 Cas12d (CasY)를 지칭할 수 있으며, 이는 예를 들어 그의 전체 내용이 본원에 참조로 포함되는 문헌 [Burstein et al., "New CRISPR-Cas systems from uncultivated microbes." Cell Res. 2017 Feb 21. doi: 10.1038/cr.2017.21]에 기재되어 있다. 게놈-분해 메타게놈학을 사용하여, 생물 고세균 역에서 최초로 보고된 Cas9를 포함한 다수의 CRISPR-Cas 시스템이 확인되었다. 이러한 분기성 Cas9 단백질은 거의 연구되지 않은 나노고세균에서 활성 CRISPR-Cas 시스템의 일부로서 발견되었다. 박테리아에서, 2종의 이전에 알려지지 않은 시스템, CRISPR-Cas12e 및 CRISPR-Cas12d가 발견되었으며, 이들은 지금까지 발견된 가장 치밀한 시스템 중의 것이다. 일부 실시양태에서, Cas9는 Cas12e, 또는 Cas12e의 변이체를 지칭한다. 일부 실시양태에서, Cas9는 Cas12d, 또는 Cas12d의 변이체를 지칭한다. 다른 RNA-가이드된 DNA 결합 단백질이 핵산 프로그램가능한 DNA 결합 단백질 (napDNAbp)로서 사용될 수 있고, 이는 본 개시내용의 범주 내에 있다는 것이 인지되어야 한다. 또한, 문헌 [Liu et al., "CasX enzymes comprises a distinct family of RNA-guided genome editors," Nature, 2019, Vol.566: 218-223]을 참조한다. 이들 Cas9 등가물 중 임의의 것이 고려된다.
일부 실시양태에서, Cas9 등가물은 자연 발생 Cas12e (CasX) 또는 Cas12d (CasY) 단백질과 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 적어도 99.5% 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, napDNAbp는 자연 발생 Cas12e (CasX) 또는 Cas12d (CasY) 단백질이다. 일부 실시양태에서, napDNAbp는 야생형 Cas 모이어티 또는 본원에 제공된 임의의 Cas 모이어티와 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 적어도 99.5% 동일한 아미노산 서열을 포함한다.
다양한 실시양태에서, 핵산 프로그램가능한 DNA 결합 단백질은 비제한적으로 Cas9 (예를 들어, dCas9 및 nCas9), Cas12e (CasX), Cas12d (CasY), Cas12a (Cpf1), Cas12b1 (C2c1), Cas13a (C2c2), Cas12c (C2c3), 아르고노트, 및 Cas12b1을 포함한다. Cas9와 상이한 PAM 특이성을 갖는 핵산 프로그램가능한 DNA-결합 단백질의 한 예는 프레보텔라(Prevotella) 및 프란시셀라(Francisella) 1로부터의 클러스터링된 규칙적 간격의 짧은 회문식 반복부 (즉, Cas12a (Cpf1))이다. Cas9와 유사하게, Cas12a (Cpf1)도 또한 부류 2 CRISPR 이펙터이지만, 이는 유형 II 하위군보다는 효소의 유형 V 하위군의 구성원이다. Cas12a (Cpf1)는 강건한 DNA 간섭을 매개하는 것으로 제시되어 있고, 특색이 Cas9와 구별된다. Cas12a (Cpf1)는 tracrRNA가 결여된 단일 RNA-가이드된 엔도뉴클레아제이고, 이는 T-풍부 프로토스페이서-인접 모티프 (TTN, TTTN, 또는 YTN)를 이용한다. 또한, Cpf1은 엇갈린 DNA 이중 가닥 파괴를 통해 DNA를 절단한다. 16종의 Cpf1-패밀리 단백질 중에서, 아시다미노코쿠스(Acidaminococcus) 및 라크노스피라세아에(Lachnospiraceae)로부터의 2종의 효소는 인간 세포에서 효율적인 게놈-편집 활성을 갖는 것으로 제시된다. Cpf1 단백질은 관련 기술분야에 공지되어 있고, 이전에, 예를 들어 문헌 [Yamano et al., "Crystal structure of Cpf1 in complex with guide RNA and target DNA." Cell (165) 2016, p. 949-962]에 기재되었으며; 그의 전체 내용은 본원에 참조로 포함된다.
또 다른 실시양태에서, Cas 단백질은 Cas12a, Cas12b1, Cas1, Cas1B, Cas2, Cas3, Cas4, Cas5, Cas6, Cas7, Cas8, Cas9 (또한 Csn1 및 Csx12로도 공지됨), Cas10, Csy1, Csy2, Csy3, Cse1, Cse2, Csc1, Csc2, Csa5, Csn2, Csm2, Csm3, Csm4, Csm5, Csm6, Cmr1, Cmr3, Cmr4, Cmr5, Cmr6, Csb1, Csb2, Csb3, Csx17, Csx14, Csx10, Csx16, CsaX, Csx3, Csx1, Csx15, Csf1, Csf2, Csf3, Csf4, 그의 상동체, 또는 그의 변형된 버전을 포함하나 이에 제한되지는 않고, 바람직하게는 닉카제 돌연변이 (예를 들어, 서열식별번호: 1361421의 야생형 Cas9 폴리펩티드의 D10A 돌연변이에 상응하는 돌연변이)를 포함하는 임의의 CRISPR 연관 단백질을 포함할 수 있다.
다양한 다른 실시양태에서, napDNAbp는 하기 단백질 중 임의의 것일 수 있다: Cas9, Cas12a (Cpf1), Cas12e (CasX), Cas12d (CasY), Cas12b1 (C2c1), Cas13a (C2c2), Cas12c (C2c3), GeoCas9, CjCas9, Cas12g, Cas12h, Cas12i, Cas13b, Cas13c, Cas13d, Cas14, Csn2, xCas9, SpCas9-NG, 원형 순열 Cas9, 또는 아르고노트 (Ago) 도메인, 또는 그의 변이체.
예시적인 Cas9 등가물 단백질 서열은 하기를 포함할 수 있다:
Figure pct00031
Figure pct00032
본원에 기재된 프라임 편집제는 또한 가이드 뉴클레오티드 서열-프로그램가능한 DNA-결합 단백질 도메인으로서 사용될 수 있는 Cas12a/Cpf1 (dCpf1) 변이체를 포함할 수 있다. Cas12a/Cpf1 단백질은 Cas9의 RuvC 도메인과 유사한 RuvC-유사 엔도뉴클레아제 도메인을 갖지만, HNH 엔도뉴클레아제 도메인은 갖지 않고, Cpf1의 N-말단은 Cas9의 알파-나선 인식 로브를 갖지 않는다. Cpf1의 RuvC-유사 도메인이 둘 다의 DNA 가닥을 절단하는 것을 담당하고, RuvC-유사 도메인의 불활성화가 Cpf1 뉴클레아제 활성을 불활성화시킨다는 것이 문헌 [Zetsche et al., Cell, 163, 759-771, 2015] (이는 본원에 참조로 포함됨)에 제시되었다. 본원에 기재된 프라임 편집제는 또한 가이드 뉴클레오티드 서열-프로그램가능한 DNA-결합 단백질 도메인으로서 사용될 수 있는 Cas12a (Cpf1) (dCpf1) 변이체를 포함할 수 있다. Cas12a (Cpf1) 단백질은 Cas9의 RuvC 도메인과 유사한 RuvC-유사 엔도뉴클레아제 도메인을 갖지만, HNH 엔도뉴클레아제 도메인은 갖지 않고, Cas12a (Cpf1)의 N-말단은 Cas9의 알파-나선 인식 로브를 갖지 않는다. Cas12a (Cpf1)의 RuvC-유사 도메인이 둘 다의 DNA 가닥을 절단하는 것을 담당하고, RuvC-유사 도메인의 불활성화가 Cas12a (Cpf1) 뉴클레아제 활성을 불활성화시킨다는 것이 문헌 [Zetsche et al., Cell, 163, 759-771, 2015] (이는 본원에 참조로 포함됨)에 제시되었다.
일부 실시양태에서, napDNAbp는 미생물 CRISPR-Cas 시스템의 단일 이펙터이다. 미생물 CRISPR-Cas 시스템의 단일 이펙터는, 비제한적으로, Cas9, Cas12a (Cpf1), Cas12b1 (C2c1), Cas13a (C2c2), 및 Cas12c (C2c3)를 포함한다. 전형적으로, 미생물 CRISPR-Cas 시스템은 부류 1 및 부류 2 시스템으로 나뉜다. 부류 1 시스템은 멀티서브유닛 이펙터 복합체를 갖는 반면, 부류 2 시스템은 단일 단백질 이펙터를 갖는다. 예를 들어, Cas9 및 Cas12a (Cpf1)는 부류 2 이펙터이다. Cas9 및 Cas12a (Cpf1)에 더하여, 3종의 별개의 부류 2 CRISPR-Cas 시스템 (Cas12b1, Cas13a, 및 Cas12c)이 문헌 [Shmakov et al., "Discovery and Functional Characterization of Diverse Class 2 CRISPR Cas Systems", Mol. Cell, 2015 Nov 5; 60(3): 385-397]에 기재되어 있으며, 그의 전체 내용은 본원에 참조로 포함된다.
시스템 중 2개, Cas12b1 및 Cas12c의 이펙터는 Cas12a와 관련된 RuvC-유사 엔도뉴클레아제 도메인을 함유한다. 제3 시스템인 Cas13a는 2개의 예측 HEPN RNase 도메인을 갖는 이펙터를 함유한다. 성숙 CRISPR RNA의 생산은, Cas12b1에 의한 CRISPR RNA의 생산과는 달리, tracrRNA-비의존적이다. Cas12b1은 DNA 절단을 위해 CRISPR RNA 및 tracrRNA 둘 다에 의존한다. 박테리아 Cas13a는 그의 RNA-활성화된 단일 가닥 RNA 분해 활성과 구별되는 CRISPR RNA 성숙을 위한 고유한 RNase 활성을 보유하는 것으로 제시되었다. 이들 RNase 기능은 서로 상이하고, Cas12a의 CRISPR RNA-프로세싱 거동과 상이하다. 예를 들어, 문헌 [East-Seletsky, et al., "Two distinct RNase activities of CRISPR-Cas13a enable guide-RNA processing and RNA detection", Nature, 2016 Oct 13;538(7624):270-273]을 참조하며, 그의 전체 내용은 본원에 참조로 포함된다. 렙토트리키아 샤히이(Leptotrichia shahii)의 Cas13a의 시험관내 생화학적 분석은 Cas13a가 단일 CRISPR RNA에 의해 가이드되고, 상보적 프로토스페이서를 보유하는 ssRNA 표적을 절단하도록 프로그램화될 수 있다는 것을 보여주었다. 2개의 보존된 HEPN 도메인 내의 촉매 잔기는 절단을 매개한다. 촉매 잔기에서의 돌연변이는 촉매 불활성 RNA-결합 단백질을 생성한다. 예를 들어, 문헌 [Abudayyeh et al., "C2c2 is a single-component programmable RNA-guided RNA-targeting CRISPR effector", Science, 2016 Aug 5; 353(6299)]을 참조하고, 그의 전체 내용은 본원에 참조로 포함된다.
알리시클로바실루스 아시도테레스트리스(Alicyclobacillus acidoterrestris) Cas12b1 (AacC2c1)의 결정 구조는 키메라 단일-분자 가이드 RNA (sgRNA)와의 복합체로 보고되었다. 예를 들어, 문헌 [Liu et al., "C2c1-sgRNA Complex Structure Reveals RNA-Guided DNA Cleavage Mechanism", Mol. Cell, 2017 Jan 19;65(2):310-322]을 참조하고, 그의 전체 내용은 본원에 참조로 포함된다. 결정 구조는 또한 3원 복합체로서 표적 DNA에 결합된 알리시클로바실루스 아시도테레스트리스 C2c1로 보고되었다. 예를 들어, 문헌 [Yang et al., "PAM-dependent Target DNA Recognition and Cleavage by C2C1 CRISPR-Cas endonuclease", Cell, 2016 Dec 15;167(7):1814-1828]을 참조하고, 그의 전체 내용은 본원에 참조로 포함된다. AacC2c1의 촉매 적격 입체형태는, 표적 및 비-표적 DNA 가닥 둘 다와 함께, 단일 RuvC 촉매 포켓 내에 독립적으로 위치되어 포획되었고, 여기서 C2c1-매개된 절단은 표적 DNA의 엇갈린 7-뉴클레오티드 파괴를 유발한다. C2c1 3원 복합체와 이전에 확인된 Cas9 및 Cpf1 대응물 사이의 구조 비교는 CRISPR-Cas9 시스템에 의해 사용되는 메카니즘의 다양성을 입증한다.
일부 실시양태에서, napDNAbp는 C2c1, C2c2, 또는 C2c3 단백질일 수 있다. 일부 실시양태에서, napDNAbp는 C2c1 단백질이다. 일부 실시양태에서, napDNAbp는 Cas13a 단백질이다. 일부 실시양태에서, napDNAbp는 Cas12c 단백질이다. 일부 실시양태에서, napDNAbp는 자연 발생 Cas12b1 (C2c1), Cas13a (C2c2), 또는 Cas12c (C2c3) 단백질과 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 적어도 99.5% 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, napDNAbp는 자연 발생 Cas12b1 (C2c1), Cas13a (C2c2), 또는 Cas12c (C2c3) 단백질이다.
(viii) Cas9 원형 순열체
다양한 실시양태에서, 본원에 개시된 프라임 편집제는 Cas9의 원형 순열체를 포함할 수 있다.
용어 "원형 순열 Cas9" 또는 Cas9의 "원형 순열체" 또는 "CP-Cas9"는 Cas9 단백질 (예를 들어, 야생형 Cas9 단백질)의 N-말단 및 C-말단이 국소로 재배열된 것을 의미하는, 원형 순열체 변이체로서 발생하거나 또는 조작되도록 변형된 임의의 Cas9 단백질 또는 그의 변이체를 지칭한다. 이러한 원형 순열 Cas9 단백질 또는 그의 변이체는 가이드 RNA (gRNA)와 복합체화되는 경우에 DNA에 결합하는 능력을 보유한다. 문헌 [Oakes et al., "Protein Engineering of Cas9 for enhanced function," Methods Enzymol, 2014, 546: 491-511 및 Oakes et al., "CRISPR-Cas9 Circular Permutants as Programmable Scaffolds for Genome Modification," Cell, January 10, 2019, 176: 254-267]을 참조하고, 이들 각각은 본원에 참조로 포함된다. 본 개시내용은 임의의 이전에 공지된 CP-Cas9를 고려하거나, 또는 생성된 원형 순열 단백질이 가이드 RNA (gRNA)와 복합체화되는 경우 DNA에 결합하는 능력을 보유하는 한, 새로운 CP-Cas9를 사용한다.
임의의 변이체, 오르토로그, 또는 자연 발생 Cas9 또는 그의 등가물을 포함한 본원에 기재된 Cas9 단백질 중 임의의 것은 원형 순열 변이체로서 재구성될 수 있다.
다양한 실시양태에서, Cas9의 원형 순열체는 하기 구조를 가질 수 있다:
N-말단-[원래의 C-말단] - [임의적인 링커] - [원래의 N-말단]-C-말단.
예로서, 본 개시내용은 정규 에스. 피오게네스 Cas9 (유니프롯KB - Q99ZW2 (CAS9_STRP1)의 1368개 아미노산 (넘버링은 서열식별번호: 1361421에서의 아미노산 위치에 기초함))의 하기 원형 순열체를 고려한다:
N-말단-[1268-1368]-[임의적인 링커]-[1-1267]-C-말단;
N-말단-[1168-1368]-[임의적인 링커]-[1-1167]-C-말단;
N-말단-[1068-1368]-[임의적인 링커]-[1-1067]-C-말단;
N-말단-[968-1368]-[임의적인 링커]-[1-967]-C-말단;
N-말단-[868-1368]-[임의적인 링커]-[1-867]-C-말단;
N-말단-[768-1368]-[임의적인 링커]-[1-767]-C-말단;
N-말단-[668-1368]-[임의적인 링커]-[1-667]-C-말단;
N-말단-[568-1368]-[임의적인 링커]-[1-567]-C-말단;
N-말단-[468-1368]-[임의적인 링커]-[1-467]-C-말단;
N-말단-[368-1368]-[임의적인 링커]-[1-367]-C-말단;
N-말단-[268-1368]-[임의적인 링커]-[1-267]-C-말단;
N-말단-[168-1368]-[임의적인 링커]-[1-167]-C-말단;
N-말단-[68-1368]-[임의적인 링커]-[1-67]-C-말단; 또는
N-말단-[10-1368]-[임의적인 링커]-[1-9]-C-말단, 또는 다른 Cas9 단백질 (다른 Cas9 오르토로그, 변이체 등 포함)의 상응하는 원형 순열체.
특정한 실시양태에서, 원형 순열체 Cas9는 하기 구조 (에스. 피오게네스 Cas9 (유니프롯KB - Q99ZW2 (CAS9_STRP1)의 1368개 아미노산 (넘버링은 서열식별번호: 1361421에서의 아미노산 위치에 기초함)에 기초함)를 갖는다:
N-말단-[102-1368]-[임의적인 링커]-[1-101]-C-말단;
N-말단-[1028-1368]-[임의적인 링커]-[1-1027]-C-말단;
N-말단-[1041-1368]-[임의적인 링커]-[1-1043]-C-말단;
N-말단-[1249-1368]-[임의적인 링커]-[1-1248]-C-말단; 또는
N-말단-[1300-1368]-[임의적인 링커]-[1-1299]-C-말단, 또는 다른 Cas9 단백질 (다른 Cas9 오르토로그, 변이체 등 포함)의 상응하는 원형 순열체.
또 다른 실시양태에서, 원형 순열체 Cas9는 하기 구조 (에스. 피오게네스 Cas9 (유니프롯KB - Q99ZW2 (CAS9_STRP1)의 1368개 아미노산 (넘버링은 서열식별번호: 1361421에서의 아미노산 위치에 기초함)에 기초함)를 갖는다:
N-말단-[103-1368]-[임의적인 링커]-[1-102]-C-말단;
N-말단-[1029-1368]-[임의적인 링커]-[1-1028]-C-말단;
N-말단-[1042-1368]-[임의적인 링커]-[1-1041]-C-말단;
N-말단-[1250-1368]-[임의적인 링커]-[1-1249]-C-말단; 또는
N-말단-[1301-1368]-[임의적인 링커]-[1-1300]-C-말단, 또는 다른 Cas9 단백질 (다른 Cas9 오르토로그, 변이체 등 포함)의 상응하는 원형 순열체.
일부 실시양태에서, 원형 순열체는 직접적으로 또는 링커, 예컨대 아미노산 링커를 사용하여 Cas9의 C-말단 단편을 Cas9의 N-말단 단편에 연결함으로써 형성될 수 있다. 일부 실시양태에서, C-말단 단편은 Cas9의 아미노산 (예를 들어, 아미노산 약 1300-1368)의 C-말단 95% 이상, 또는 Cas9 (예를 들어, 서열식별번호: 1361421-1361484, 및 1361593-1361596 중 어느 하나)의 C-말단 90%, 85%, 80%, 75%, 70%, 65%, 60%, 55%, 50%, 45%, 40%, 35%, 30%, 25%, 20%, 15%, 10%, 또는 5% 또는 그 초과에 상응할 수 있다. N-말단 부분은 Cas9의 아미노산 (예를 들어, 아미노산 약 1-1300)의 N-말단 95% 이상, 또는 Cas9의 (예를 들어, 서열식별번호: 1361421의) N-말단 90%, 85%, 80%, 75%, 70%, 65%, 60%, 55%, 50%, 45%, 40%, 35%, 30%, 25%, 20%, 15%, 10%, 또는 5% 또는 그 초과에 상응할 수 있다.
일부 실시양태에서, 원형 순열체는 직접적으로 또는 링커, 예컨대 아미노산 링커를 사용하여 Cas9의 C-말단 단편을 Cas9의 N-말단 단편에 연결함으로써 형성될 수 있다. 일부 실시양태에서, N-말단으로 재배열된 C-말단 단편은 Cas9의 아미노산 (예를 들어, 서열식별번호: 1361421의 아미노산 1012-1368)의 C-말단 30% 이하를 포함하거나 또는 그에 상응한다. 일부 실시양태에서, N-말단으로 재배열된 C-말단 단편은 Cas9 (예를 들어, 서열식별번호: 1361421의 Cas9)의 아미노산의 C-말단 30%, 29%, 28%, 27%, 26%, 25%, 24%, 23%, 22%, 21%, 20%, 19%, 18%, 17%, 16%, 15%, 14%, 13%, 12%, 11%, 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2%, 또는 1%를 포함하거나 또는 그에 상응한다. 일부 실시양태에서, N-말단으로 재배열된 C-말단 단편은 Cas9 (예를 들어, 서열식별번호: 1361421의 Cas9)의 C-말단 410개 잔기 이하를 포함하거나 또는 그에 상응한다. 일부 실시양태에서, N-말단으로 재배열된 C-말단 부분은 Cas9 (예를 들어, 서열식별번호: 1361421의 Cas9)의 C-말단 410, 400, 390, 380, 370, 360, 350, 340, 330, 320, 310, 300, 290, 280, 270, 260, 250, 240, 230, 220, 210, 200, 190, 180, 170, 160, 150, 140, 130, 120, 110, 100, 90, 80, 70, 60, 50, 40, 30, 20, 또는 10개의 잔기를 포함하거나 또는 그에 상응한다. 일부 실시양태에서, N-말단으로 재배열된 C-말단 부분은 Cas9 (예를 들어, 서열식별번호: 1361421의 Cas9)의 C-말단 357, 341, 328, 120, 또는 69개의 잔기를 포함하거나 또는 그에 상응한다.
다른 실시양태에서, 원형 순열체 Cas9 변이체는 서열식별번호: 1361421의 에스. 피오게네스 Cas9에 기초하여, 하기 방법: (a) 원래의 단백질을 2개의 절반: N-말단 영역 및 C-말단 영역으로 절제하는, Cas9 1차 구조의 내부 아미노산 잔기에 상응하는 원형 순열체 (CP) 부위를 선택하는 것; (b) 원래의 C-말단 영역 (CP 부위 아미노산을 포함함)을 원래의 N-말단 영역에 선행하도록 이동시켜 Cas9 단백질 서열을 변형시킴으로써 (예를 들어, 유전자 조작 기술에 의함), 이제 CP 부위 아미노산 잔기로 시작하는 Cas9 단백질의 새로운 N-말단을 형성하는 것에 기초한 Cas9 1차 구조의 위상 재배열로서 정의될 수 있다. CP 부위는, 예를 들어 나선형-II 도메인, RuvCIII 도메인, 또는 CTD 도메인을 포함한 Cas9 단백질의 임의의 도메인에 위치할 수 있다. 예를 들어, CP 부위는 (서열식별번호: 1361421의 에스. 피오게네스 Cas9 대비) 원래의 아미노산 잔기 181, 199, 230, 270, 310, 1010, 1016, 1023, 1029, 1041, 1247, 1249, 또는 1282에 위치할 수 있다. 따라서, 일단 N-말단으로 재배치되면, 원래의 아미노산 181, 199, 230, 270, 310, 1010, 1016, 1023, 1029, 1041, 1247, 1249, 또는 1282는 새로운 N-말단 아미노산이 될 것이다. 이들 CP-Cas9 단백질의 명명법은 각각 Cas9-CP181, Cas9-CP199, Cas9-CP230, Cas9-CP270, Cas9-CP310, Cas9-CP1010, Cas9-CP1016, Cas9-CP1023, Cas9-CP1029, Cas9-CP1041, Cas9-CP1247, Cas9-CP1249, 및 Cas9-CP1282로 지칭될 수 있다. 이러한 설명은 서열식별번호: 1361421로부터 CP 변이체를 제조하는 것으로 제한하는 것으로 의도되지 않으며, 임의의 Cas9 서열에서 이들 위치에 상응하는 CP 부위에서 또는 다른 CP 부위 전체에서 CP 변이체를 제조하기 위해 구현될 수 있다. 이러한 설명은 어떠한 방식으로든 특이적 CP 부위를 제한하는 것으로 의도되지 않는다. 실질적으로 임의의 CP 부위를 사용하여 CP-Cas9 변이체를 형성할 수 있다.
서열식별번호: 1361421의 Cas9에 기초한 예시적인 CP-Cas9 아미노산 서열이 하기 제공되며, 여기서 링커 서열은 밑줄로 표시되고 임의적인 메티오닌 (M) 잔기는 볼드체로 표시된다. 개시내용은 링커 서열을 포함하지 않거나 또는 상이한 링커 서열을 포함하는 CP-Cas9 서열을 제공한다는 것을 인지해야 한다. CP-Cas9 서열은 서열식별번호: 1361421의 것 이외의 Cas9 서열에 기초할 수 있으며, 본원에 제공된 임의의 예는 제한하는 것으로 의도되지 않는다는 것을 인지해야 한다.
Figure pct00033
Figure pct00034
Figure pct00035
Cas9 원형 순열체는 본원에 기재된 프라임 편집 구축물에 유용할 수 있다. Cas9의 N-말단으로 재배열될 수 있는, 서열식별번호: 1361421의 Cas9에 기초한 Cas9의 예시적인 C-말단 단편이 하기 제공된다. Cas9의 이러한 C-말단 단편은 예시적인 것이며, 제한하는 것으로 의도되지 않는다는 것을 인지해야 한다.
Figure pct00036
(ix) 변형된 PAM 특이성을 갖는 Cas9 변이체
본 개시내용의 프라임 편집제는 또한 변형된 PAM 특이성을 갖는 Cas9 변이체를 포함할 수 있다. 본 개시내용의 일부 측면은 그의 3'-단부에 정규 PAM (5'-NGG-3', 여기서 N은 A, C, G, 또는 T임)을 포함하지 않는 표적 서열에 대해 활성을 나타내는 Cas9 단백질을 제공한다. 일부 실시양태에서, Cas9 단백질은 그의 3'-단부에 5'-NGG-3' PAM 서열을 포함하는 표적 서열에 대해 활성을 나타낸다. 일부 실시양태에서, Cas9 단백질은 그의 3'-단부에 5'-NNG-3' PAM 서열을 포함하는 표적 서열에 대해 활성을 나타낸다. 일부 실시양태에서, Cas9 단백질은 그의 3'-단부에 5'-NNA-3' PAM 서열을 포함하는 표적 서열에 대해 활성을 나타낸다. 일부 실시양태에서, Cas9 단백질은 그의 3'-단부에 5'-NNC-3' PAM 서열을 포함하는 표적 서열에 대해 활성을 나타낸다. 일부 실시양태에서, Cas9 단백질은 그의 3'-단부에 5'-NNT-3' PAM 서열을 포함하는 표적 서열에 대해 활성을 나타낸다. 일부 실시양태에서, Cas9 단백질은 그의 3'-단부에 5'-NGT-3' PAM 서열을 포함하는 표적 서열에 대해 활성을 나타낸다. 일부 실시양태에서, Cas9 단백질은 그의 3'-단부에 5'-NGA-3' PAM 서열을 포함하는 표적 서열에 대해 활성을 나타낸다. 일부 실시양태에서, Cas9 단백질은 그의 3'-단부에 5'-NGC-3' PAM 서열을 포함하는 표적 서열에 대해 활성을 나타낸다. 일부 실시양태에서, Cas9 단백질은 그의 3'-단부에 5'-NAA-3' PAM 서열을 포함하는 표적 서열에 대해 활성을 나타낸다. 일부 실시양태에서, Cas9 단백질은 그의 3'-단부에 5'-NAC-3' PAM 서열을 포함하는 표적 서열에 대해 활성을 나타낸다. 일부 실시양태에서, Cas9 단백질은 그의 3'-단부에 5'-NAT-3' PAM 서열을 포함하는 표적 서열에 대해 활성을 나타낸다. 또 다른 실시양태에서, Cas9 단백질은 그의 3'-단부에 5'-NAG-3' PAM 서열을 포함하는 표적 서열에 대해 활성을 나타낸다.
제1 아미노산 잔기 (예를 들어, A)에서 제2 아미노산 잔기 (예를 들어, T)로의 본원에 기재된 임의의 아미노산 돌연변이 (예를 들어, A262T)는 또한 제1 아미노산 잔기에서 제2 아미노산 잔기와 유사한 (예를 들어, 보존된) 아미노산 잔기로의 돌연변이를 포함할 수 있음을 인지해야 한다. 예를 들어, 아미노산의 소수성 측쇄 (예를 들어, 알라닌, 발린, 이소류신, 류신, 메티오닌, 페닐알라닌, 티로신, 또는 트립토판)로의 돌연변이는 상이한 소수성 측쇄 (예를 들어, 알라닌, 발린, 이소류신, 류신, 메티오닌, 페닐알라닌, 티로신, 또는 트립토판)를 갖는 제2 아미노산으로의 돌연변이일 수 있다. 예를 들어, 알라닌에서 트레오닌으로의 돌연변이 (예를 들어, A262T 돌연변이)는 또한 알라닌에서 트레오닌과 크기 및 화학적 특성이 유사한 아미노산, 예를 들어 세린으로의 돌연변이일 수 있다. 또 다른 예로서, 양으로 하전된 측쇄를 갖는 아미노산 (예를 들어, 아르기닌, 히스티딘, 또는 리신)의 돌연변이는 상이한 양으로 하전된 측쇄를 갖는 제2 아미노산 (예를 들어, 아르기닌, 히스티딘, 또는 리신)으로의 돌연변이일 수 있다. 또 다른 예로서, 극성 측쇄를 갖는 아미노산 (예를 들어, 세린, 트레오닌, 아스파라긴, 또는 글루타민)의 돌연변이는 상이한 극성 측쇄를 갖는 제2 아미노산 (예를 들어, 세린, 트레오닌, 아스파라긴, 또는 글루타민)으로의 돌연변이일 수 있다. 추가의 유사한 아미노산 쌍은 하기: 페닐알라닌 및 티로신; 아스파라긴 및 글루타민; 메티오닌 및 시스테인; 아스파르트산 및 글루탐산; 및 아르기닌 및 리신을 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 통상의 기술자는 이러한 보존적 아미노산 치환이 단백질 구조에 대해 미미한 효과를 가질 가능성이 있고, 기능을 손상시키지 않으면서 잘 용인될 가능성이 있음을 인식할 것이다. 일부 실시양태에서, 하나의 아미노산에서 트레오닌으로의 본원에 제공된 아미노산 돌연변이 중 임의의 것은 세린으로의 아미노산 돌연변이일 수 있다. 일부 실시양태에서, 하나의 아미노산에서 아르기닌으로의 본원에 제공된 아미노산 돌연변이 중 임의의 것은 리신으로의 아미노산 돌연변이일 수 있다. 일부 실시양태에서, 하나의 아미노산에서 이소류신으로의 본원에 제공된 아미노산 돌연변이 중 임의의 것은 알라닌, 발린, 메티오닌, 또는 류신으로의 아미노산 돌연변이일 수 있다. 일부 실시양태에서, 하나의 아미노산에서 리신으로의 본원에 제공된 아미노산 돌연변이 중 임의의 것은 아르기닌으로의 아미노산 돌연변이일 수 있다. 일부 실시양태에서, 하나의 아미노산에서 아스파르트산으로의 본원에 제공된 아미노산 돌연변이 중 임의의 것은 글루탐산 또는 아스파라긴으로의 아미노산 돌연변이일 수 있다. 일부 실시양태에서, 하나의 아미노산에서 발린으로의 본원에 제공된 아미노산 돌연변이 중 임의의 것은 알라닌, 이소류신, 메티오닌, 또는 류신으로의 아미노산 돌연변이일 수 있다. 일부 실시양태에서, 하나의 아미노산에서 글리신으로의 본원에 제공된 아미노산 돌연변이 중 임의의 것은 알라닌으로의 아미노산 돌연변이일 수 있다. 그러나, 추가의 보존된 아미노산 잔기가 통상의 기술자에 의해 인식될 것이고, 다른 보존된 아미노산 잔기로의 아미노산 돌연변이 중 임의의 것이 또한 본 개시내용의 범주 내에 있다는 것을 인지해야 한다.
일부 실시양태에서, 본 개시내용은 본원의 서열 목록 섹션에 개시된 Cas9 변이체 중 임의의 것을 이용할 수 있다.
Figure pct00037
Figure pct00038
Figure pct00039
일부 실시양태에서, Cas9 단백질은 그의 3'-단부에 5'-NAA-3' PAM 서열을 포함하는 표적 서열에 대해 활성을 나타내는 돌연변이의 조합을 포함한다. 일부 실시양태에서, 돌연변이의 조합은 표 1에 열거된 클론 중 어느 하나에 존재한다. 일부 실시양태에서, 돌연변이의 조합은 표 1에 열거된 클론의 보존적 돌연변이이다. 일부 실시양태에서, Cas9 단백질은 표 X에 열거된 Cas9 클론 중 어느 하나의 돌연변이의 조합을 포함한다.
표 X: NAA PAM 클론
Figure pct00040
일부 실시양태에서, Cas9 단백질은 표 1의 변이체 중 어느 하나에 의해 제공된 바와 같은 Cas9 단백질의 아미노산 서열과 적어도 80% 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, Cas9 단백질은 표 X의 변이체 중 어느 하나에 의해 제공된 바와 같은 Cas9 단백질의 아미노산 서열과 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 92%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 적어도 99.5% 동일한 아미노산 서열을 포함한다.
일부 실시양태에서, Cas9 단백질은 서열식별번호: 1361421에 의해 제공된 바와 같은 스트렙토코쿠스 피오게네스 Cas9와 비교하였을 때, 그의 3' 단부에 정규 PAM (5'-NGG-3')을 포함하지 않는 표적 서열에 대해 증가된 활성을 나타낸다. 일부 실시양태에서, Cas9 단백질은 동일한 표적 서열에 대한 서열식별번호: 1361421에 의해 제공된 바와 같은 스트렙토코쿠스 피오게네스 Cas9의 활성과 비교하였을 때, 적어도 5배 증가된, 정규 PAM 서열 (5'-NGG-3')에 바로 인접하지 않은 3' 단부를 갖는 표적 서열에 대한 활성을 나타낸다. 일부 실시양태에서, Cas9 단백질은 동일한 표적 서열에 대한 서열식별번호: 1361421에 의해 제공된 바와 같은 스트렙토코쿠스 피오게네스의 활성과 비교하였을 때, 적어도 10배, 적어도 50배, 적어도 100배, 적어도 500배, 적어도 1,000배, 적어도 5,000배, 적어도 10,000배, 적어도 50,000배, 적어도 100,000배, 적어도 500,000배, 또는 적어도 1,000,000배 증가된, 정규 PAM 서열 (5'-NGG-3')에 바로 인접하지 않은 표적 서열에 대한 활성을 나타낸다. 일부 실시양태에서, 표적 서열의 3' 단부는 AAA, GAA, CAA, 또는 TAA 서열에 바로 인접한다. 일부 실시양태에서, Cas9 단백질은 그의 3'-단부에 5'-NAC-3' PAM 서열을 포함하는 표적 서열에 대해 활성을 나타내는 돌연변이의 조합을 포함한다. 일부 실시양태에서, 돌연변이의 조합은 표 2에 열거된 클론 중 어느 하나에 존재한다. 일부 실시양태에서, 돌연변이의 조합은 표 2에 열거된 클론의 보존적 돌연변이이다. 일부 실시양태에서, Cas9 단백질은 표 Y에 열거된 Cas9 클론 중 어느 하나의 돌연변이의 조합을 포함한다.
표 Y NAC PAM 클론
Figure pct00041
Figure pct00042
일부 실시양태에서, Cas9 단백질은 표 2의 변이체 중 어느 하나에 의해 제공된 바와 같은 Cas9 단백질의 아미노산 서열과 적어도 80% 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, Cas9 단백질은 표 Y의 변이체 중 어느 하나에 의해 제공된 바와 같은 Cas9 단백질의 아미노산 서열과 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 92%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 적어도 99.5% 동일한 아미노산 서열을 포함한다.
일부 실시양태에서, Cas9 단백질은 서열식별번호: 1361421에 의해 제공된 바와 같은 스트렙토코쿠스 피오게네스 Cas9와 비교하였을 때, 그의 3' 단부에 정규 PAM (5'-NGG-3')을 포함하지 않는 표적 서열에 대해 증가된 활성을 나타낸다. 일부 실시양태에서, Cas9 단백질은 동일한 표적 서열에 대한 서열식별번호: 1361421에 의해 제공된 바와 같은 스트렙토코쿠스 피오게네스 Cas9의 활성과 비교하였을 때, 적어도 5배 증가된, 정규 PAM 서열 (5'-NGG-3')에 바로 인접하지 않은 3' 단부를 갖는 표적 서열에 대한 활성을 나타낸다. 일부 실시양태에서, Cas9 단백질은 동일한 표적 서열에 대한 서열식별번호: 1361421에 의해 제공된 바와 같은 스트렙토코쿠스 피오게네스의 활성과 비교하였을 때, 적어도 10배, 적어도 50배, 적어도 100배, 적어도 500배, 적어도 1,000배, 적어도 5,000배, 적어도 10,000배, 적어도 50,000배, 적어도 100,000배, 적어도 500,000배, 또는 적어도 1,000,000배 증가된, 정규 PAM 서열 (5'-NGG-3')에 바로 인접하지 않은 표적 서열에 대한 활성을 나타낸다. 일부 실시양태에서, 표적 서열의 3' 단부는 AAC, GAC, CAC, 또는 TAC 서열에 바로 인접한다.
일부 실시양태에서, Cas9 단백질은 그의 3'-단부에 5'-NAT-3' PAM 서열을 포함하는 표적 서열에 대해 활성을 나타내는 돌연변이의 조합을 포함한다. 일부 실시양태에서, 돌연변이의 조합은 표 3에 열거된 클론 중 어느 하나에 존재한다. 일부 실시양태에서, 돌연변이의 조합은 표 3에 열거된 클론의 보존적 돌연변이이다. 일부 실시양태에서, Cas9 단백질은 표 Z에 열거된 Cas9 클론 중 어느 하나의 돌연변이의 조합을 포함한다.
표 Z: NAT PAM 클론
Figure pct00043
본원에 개시된 프라임 편집제와 관련하여 사용될 수 있는 다양한 napDNAbp에 대한 상기 설명은 어떠한 방식으로도 제한하는 것으로 의도되지 않는다. 프라임 편집제는 정규 SpCas9, 또는 임의의 오르토로그 Cas9 단백질, 또는 임의의 변이체 Cas9 단백질-공지되어 있거나 또는 방향적 진화상 과정 또는 달리 돌연변이유발 과정을 통해 제조 또는 진화될 수 있는 Cas9의 임의의 자연 발생 변이체, 돌연변이체, 또는 달리 조작된 버전 포함-을 포함할 수 있다. 다양한 실시양태에서, Cas9 또는 Cas9 변이체는 닉카제 활성을 갖고, 즉 표적 DNA 서열의 가닥만을 절단한다. 다른 실시양태에서, Cas9 또는 Cas9 변이체는 불활성 뉴클레아제를 가지며, 즉 "기능상실" Cas9 단백질이다. 사용될 수 있는 다른 변이체 Cas9 단백질은 정규 SpCas9보다 더 작은 분자량을 갖거나 (예를 들어, 보다 용이한 전달을 위함), 또는 변형되거나 재배열된 1차 아미노산 구조를 갖는 (예를 들어, 원형 순열체 포맷) 것이다. 본원에 기재된 프라임 편집제는 또한 수렴 진화의 결과인 Cas12a/Cpf1 및 Cas12b 단백질을 포함한 Cas9 등가물을 포함할 수 있다. 본원에 사용된 napDNAbp (예를 들어, SpCas9, Cas9 변이체, 또는 Cas9 등가물)는 또한 그의 PAM 특이성을 변경/증진시키는 다양한 변형을 함유할 수 있다. 마지막으로, 본 출원은 참조 Cas9 서열, 예컨대 참조 SpCas9 정규 서열 또는 참조 Cas9 등가물 (예를 들어, Cas12a/Cpf1)과 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 적어도 99.9% 서열 동일성을 갖는 임의의 Cas9, Cas9 변이체, 또는 Cas9 등가물을 고려한다.
또한, 임의의 이용가능한 방법을 이용하여 변이체 또는 돌연변이체 Cas9 단백질을 수득하거나 구축할 수 있다. 본원에 사용된 용어 "돌연변이"는 서열, 예를 들어 핵산 또는 아미노산 서열 내의 잔기의 또 다른 잔기로의 치환, 또는 서열 내의 1개 이상의 잔기의 결실 또는 삽입을 지칭한다. 돌연변이는 전형적으로 원래 잔기를 확인한 다음, 서열 내의 잔기의 위치를 확인하고, 새로 치환된 잔기의 정체를 확인하는 것에 의해 본원에 기재된다. 본원에 제공된 아미노산 치환 (돌연변이)을 제조하는 다양한 방법은 관련 기술분야에 널리 공지되어 있고, 예를 들어 문헌 [Green and Sambrook, Molecular Cloning: A Laboratory Manual (4th ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (2012))]에 의해 제공된다. 돌연변이는 다양한 카테고리, 예컨대 단일 염기 다형성, 미세중복 영역, indel, 및 역위를 포함할 수 있고, 이는 어떠한 방식으로도 제한하는 것으로 의도되지 않는다. 돌연변이는 단백질 활성을 감소시키거나 제거하는 돌연변이의 정상적인 결과인 "기능 상실" 돌연변이를 포함할 수 있다. 대부분의 기능 상실 돌연변이는 열성이며, 이는 이형접합체에서 제2 염색체 카피가 그의 존재가 돌연변이의 효과를 보상하는 완전 기능적 단백질을 코딩하는 유전자의 비돌연변이된 버전을 보유하기 때문이다. 돌연변이는 또한 정상 상태에서는 달리 존재하지 않는 단백질 또는 세포에 비정상적 활성을 부여하는 것인 "기능 획득" 돌연변이를 포괄한다. 많은 기능 획득 돌연변이는 코딩 영역보다는 조절 서열에 존재하고, 따라서 다수의 결과를 가질 수 있다. 예를 들어, 돌연변이는 1개 이상의 유전자가 잘못된 조직에서 발현되게 할 수 있고, 이들 조직은 정상적으로는 결여되어 있는 기능을 얻는다. 그의 속성으로 인해, 기능 획득 돌연변이는 통상적으로 우성이다.
돌연변이는 부위-지정 돌연변이유발을 사용하여 참조 Cas9 단백질 내로 도입될 수 있다. 관련 기술분야에 공지된 부위-지정 돌연변이유발의 보다 오래된 방법은 단일 가닥 DNA 주형의 단리를 가능하게 하는 벡터, 예컨대 M13 박테리오파지 벡터 내로의 돌연변이시킬 서열의 서브-클로닝에 의존한다. 이들 방법에서, 돌연변이유발 프라이머 (즉, 돌연변이시킬 부위에 어닐링할 수 있지만 돌연변이시킬 부위에 1개 이상의 미스매치된 뉴클레오티드를 보유할 수 있는 프라이머)를 단일 가닥 주형에 어닐링시킨 후, 돌연변이유발 프라이머의 3' 단부로부터 출발하여 주형의 상보체를 중합시킨다. 이어서, 생성된 듀플렉스로 숙주 박테리아를 형질전환시키고, 목적하는 돌연변이에 대해 플라크를 스크리닝한다. 보다 최근에, 부위-지정 돌연변이유발은 단일 가닥 주형을 필요로 하지 않는 이점을 갖는 PCR 방법론을 이용하였다. 또한, 서브클로닝을 필요로 하지 않는 방법이 개발되었다. PCR-기반 부위-지정 돌연변이유발이 수행될 때 여러 이슈가 고려되어야 한다. 첫번째로, 이들 방법에서, 폴리머라제에 의해 도입된 바람직하지 않은 돌연변이의 확장을 방지하기 위해 PCR 사이클의 수를 감소시키는 것이 바람직하다. 두번째로, 반응에서 지속되는 비-돌연변이된 모 분자의 수를 감소시키기 위해 선택이 사용되어야 한다. 세번째로, 단일 PCR 프라이머 세트의 사용을 허용하기 위해 연장-길이 PCR 방법이 바람직하다. 그리고 네번째로, 일부 열안정성 폴리머라제의 비-주형-의존성 말단 연장 활성으로 인해, PCR-생성된 돌연변이체 생성물의 평활-말단 라이게이션 전에 말단-폴리싱 단계를 절차에 혼입시키는 것이 종종 필요하다.
돌연변이는 또한 방향적 진화 과정, 예컨대 파지-보조 연속 진화 (PACE) 또는 파지-보조 비연속 진화 (PANCE)에 의해 도입될 수 있다. 본원에 사용된 용어 "파지-보조 연속 진화 (PACE)"는 바이러스 벡터로서 파지를 사용하는 연속 진화를 지칭한다. PACE 기술의 일반적 개념은, 예를 들어 2010년 3월 11일에 WO 2010/028347로서 공개된, 2009년 9월 8일에 출원된 국제 PCT 출원 PCT/US2009/056194; 2012년 6월 28일에 WO 2012/088381로서 공개된, 2011년 12월 22일에 출원된 국제 PCT 출원 PCT/US2011/066747; 2015년 5월 5일에 허여된 미국 출원, 미국 특허 번호 9,023,594, 2015년 9월 11일에 WO 2015/134121로서 공개된, 2015년 1월 20일에 출원된 국제 PCT 출원 PCT/US2015/012022, 및 2016년 10월 20일에 WO 2016/168631로서 공개된, 2016년 4월 15일에 출원된 국제 PCT 출원 PCT/US2016/027795에 기재되어 있으며, 이들 각각의 전체 내용은 본원에 참조로 포함된다. 오류-유발 리버스 트랜스크립타제는 또한 파지-보조 비-연속적 진화 (PANCE)에 의해 수득될 수 있고, 이는 본원에 사용된 바와 같이, 바이러스 벡터로서 파지를 사용하는 비-연속 진화를 지칭한다. PANCE는 새로운 이. 콜라이(E. coli) 숙주 세포를 가로질러 진화시킬 관심 유전자를 함유하는 진화 '선택 파지' (SP)의 연속 플라스크 전달을 사용하여 숙주 이. 콜라이 내부의 유전자는 일정하게 유지되게 하는 한편 SP 내에 함유된 유전자가 연속적으로 진화하게 하는, 신속한 생체내 방향적 진화를 위한 단순화된 기술이다. 연속 플라스크 전달은 오랫동안 미생물의 실험실 진화를 위한 폭넓게 접근가능한 접근법으로서의 역할을 하였고, 보다 최근에는 박테리오파지 진화를 위한 유사한 접근법이 개발되었다. PANCE 시스템은 PACE 시스템보다 더 낮은 엄격도를 특색으로 한다.
Cas9 또는 Cas9 등가물에 관한 상기 언급된 참고문헌 중 임의의 것은, 그렇게 이미 언급되지 않았다면, 그 전문이 본원에 참조로 포함된다.
일부 실시양태에서, napDNAbp는 정규 (NGG) PAM 서열을 필요로 하지 않는 핵산 프로그램가능한 DNA 결합 단백질이다. 일부 실시양태에서, napDNAbp는 아르고노트 단백질이다. 이러한 핵산 프로그램가능한 DNA 결합 단백질의 한 예는 나트로노박테리움 그레고리(Natronobacterium gregoryi)로부터의 아르고노트 단백질 (NgAgo)이다. NgAgo는 ssDNA-가이드된 엔도뉴클레아제이다. NgAgo는 이를 그의 표적 부위로 가이드하기 위해 ~24개 뉴클레오티드의 5' 인산화된 ssDNA (gDNA)에 결합하고, 이는 gDNA 부위에서 DNA 이중 가닥 파괴를 만들 것이다. Cas9와 대조적으로, NgAgo-gDNA 시스템은 프로토스페이서-인접 모티프 (PAM)를 필요로 하지 않는다. 뉴클레아제 불활성 NgAgo (dNgAgo)를 사용하는 것은 표적화될 수 있는 염기를 크게 확장시킬 수 있다. NgAgo의 특징화 및 사용은 문헌 [Gao et al., Nat Biotechnol., 2016 Jul;34(7):768-73. PubMed PMID: 27136078; Swarts et al., Nature. 507(7491) (2014):258-61; 및 Swarts et al., Nucleic Acids Res. 43(10) (2015):5120-9]에 기재되어 있고, 이들 각각은 본원에 참조로 포함된다.
일부 실시양태에서, napDNAbp는 아르고노트 단백질의 원핵 상동체이다. 아르고노트 단백질의 원핵 상동체는 공지되어 있고, 예를 들어 문헌 [Makarova K., et al., "Prokaryotic homologs of Argonaute proteins are predicted to function as key components of a novel system of defense against mobile genetic elements", Biol Direct. 2009 Aug 25;4:29. doi: 10.1186/1745-6150-4-29]에 기재되어 있고, 그의 전체 내용은 본원에 참조로 포함된다. 일부 실시양태에서, napDNAbp는 마리니토가 피에조필라(Marinitoga piezophila) 아르고노트 (MpAgo) 단백질이다. CRISPR-연관 마리니토가 피에조필라 아르고노트 (MpAgo) 단백질은 5'-인산화된 가이드를 사용하여 단일 가닥 표적 서열을 절단한다. 5' 가이드는 모든 공지된 아르고노트에 의해 사용된다. MpAgo-RNA 복합체의 결정 구조는 5' 포스페이트 상호작용을 차단하는 잔기를 포함하는 가이드 가닥 결합 부위를 보여준다. 이 데이터는 5'-히드록실화된 가이드에 대한 비정규 특이성을 갖는 아르고노트 하위부류의 진화를 시사한다. 예를 들어, 문헌 [Kaya et al., "A bacterial Argonaute with noncanonical guide RNA specificity", Proc Natl Acad Sci U S A. 2016 Apr 12;113(15):4057-62]을 참조하고, 그의 전체 내용은 본원에 참조로 포함된다. 다른 아르고노트 단백질이 사용될 수 있고, 본 개시내용의 범주 내에 있다는 것을 인지해야 한다.
일부 실시양태에서, napDNAbp는 미생물 CRISPR-Cas 시스템의 단일 이펙터이다. 미생물 CRISPR-Cas 시스템의 단일 이펙터는, 비제한적으로, Cas9, Cpf1, C2c1, C2c2, 및 C2c3를 포함한다. 전형적으로, 미생물 CRISPR-Cas 시스템은 부류 1 및 부류 2 시스템으로 나뉜다. 부류 1 시스템은 멀티서브유닛 이펙터 복합체를 갖는 반면, 부류 2 시스템은 단일 단백질 이펙터를 갖는다. 예를 들어, Cas9 및 Cpf1은 부류 2 이펙터이다. Cas9 및 Cpf1에 더하여, 3종의 별개의 부류 2 CRISPR-Cas 시스템 (C2c1, C2c2, 및 C2c3)이 문헌 [Shmakov et al., "Discovery and Functional Characterization of Diverse Class 2 CRISPR Cas Systems", Mol. Cell, 2015 Nov 5; 60(3): 385-397]에 기재되어 있으며, 그의 전체 내용은 본원에 참조로 포함된다. 시스템 중 2개, C2c1 및 C2c3의 이펙터는 Cpf1과 관련된 RuvC-유사 엔도뉴클레아제 도메인을 함유한다. 제3 시스템인 C2c2는 2개의 예측된 HEPN RNase 도메인을 갖는 이펙터를 함유한다. 성숙 CRISPR RNA의 생산은, C2c1에 의한 CRISPR RNA의 생산과는 달리, tracrRNA-비의존적이다. C2c1은 DNA 절단을 위해 CRISPR RNA 및 tracrRNA 둘 다에 의존한다. 박테리아 C2c2는 그의 RNA-활성화된 단일 가닥 RNA 분해 활성과 구별되는 CRISPR RNA 성숙을 위한 고유한 RNase 활성을 보유하는 것으로 제시되었다. 이들 RNase 기능은 서로 상이하고, Cpf1의 CRISPR RNA-프로세싱 거동과 상이하다. 예를 들어, 문헌 [East-Seletsky, et al., "Two distinct RNase activities of CRISPR-C2c2 enable guide-RNA processing and RNA detection", Nature, 2016 Oct 13;538(7624):270-273]을 참조하며, 그의 전체 내용은 본원에 참조로 포함된다. 렙토트리키아 샤히이(Leptotrichia shahii)의 C2c2의 시험관내 생화학적 분석은 C2c2가 단일 CRISPR RNA에 의해 가이드되고, 상보적 프로토스페이서를 보유하는 ssRNA 표적을 절단하도록 프로그램화될 수 있다는 것을 보여주었다. 2개의 보존된 HEPN 도메인 내의 촉매 잔기는 절단을 매개한다. 촉매 잔기에서의 돌연변이는 촉매 불활성 RNA-결합 단백질을 생성한다. 예를 들어, 문헌 [Abudayyeh et al., "C2c2 is a single-component programmable RNA-guided RNA-targeting CRISPR effector", Science, 2016 Aug 5; 353(6299)]을 참조하고, 그의 전체 내용은 본원에 참조로 포함된다.
알리시클로바실루스 아시도테레스트리스 C2c1 (AacC2c1)의 결정 구조는 키메라 단일-분자 가이드 RNA (sgRNA)와의 복합체로 보고되었다. 예를 들어, 문헌 [Liu et al., "C2c1-sgRNA Complex Structure Reveals RNA-Guided DNA Cleavage Mechanism", Mol. Cell, 2017 Jan 19;65(2):310-322]을 참조하고, 그의 전체 내용은 본원에 참조로 포함된다. 결정 구조는 또한 3원 복합체로서 표적 DNA에 결합된 알리시클로바실루스 아시도테레스트리스 C2c1로 보고되었다. 예를 들어, 문헌 [Yang et al., "PAM-dependent Target DNA Recognition and Cleavage by C2C1 CRISPR-Cas endonuclease", Cell, 2016 Dec 15;167(7):1814-1828]을 참조하고, 그의 전체 내용은 본원에 참조로 포함된다. AacC2c1의 촉매 적격 입체형태는, 표적 및 비-표적 DNA 가닥 둘 다와 함께, 단일 RuvC 촉매 포켓 내에 독립적으로 위치되어 포획되었고, 여기서 C2c1-매개된 절단은 표적 DNA의 엇갈린 7-뉴클레오티드 파괴를 유발한다. C2c1 3원 복합체와 이전에 확인된 Cas9 및 Cpf1 대응물 사이의 구조 비교는 CRISPR-Cas9 시스템에 의해 사용되는 메카니즘의 다양성을 입증한다.
일부 실시양태에서, napDNAbp는 C2c1, C2c2, 또는 C2c3 단백질일 수 있다. 일부 실시양태에서, napDNAbp는 C2c1 단백질이다. 일부 실시양태에서, napDNAbp는 C2c2 단백질이다. 일부 실시양태에서, napDNAbp는 C2c3 단백질이다. 일부 실시양태에서, napDNAbp는 자연 발생 C2c1, C2c2, 또는 C2c3 단백질과 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 적어도 99.5% 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, napDNAbp는 자연 발생 C2c1, C2c2, 또는 C2c3 단백질이다.
개시내용의 일부 측면은 상이한 PAM 특이성을 갖는 Cas9 도메인을 제공한다. 전형적으로, Cas9 단백질, 예컨대 에스. 피오게네스로부터의 Cas9 (spCas9)는 특정한 핵산 영역에 결합하기 위해 정규 NGG PAM 서열을 필요로 한다. 이는 게놈 내의 목적하는 염기를 편집하는 능력을 제한할 수 있다. 일부 실시양태에서, 본원에 제공된 염기 편집 융합 단백질은 정확한 위치에 배치될 필요가 있을 수 있고, 예를 들어 여기서 표적 염기는 PAM의 대략 15개 염기 상류인 4개 염기 영역 (예를 들어, "편집 윈도우") 내에 배치된다. 문헌 [Komor, A.C., et al., "Programmable editing of a target base in genomic DNA without double-stranded DNA cleavage" Nature 533, 420-424 (2016)]을 참조하고, 그의 전체 내용은 본원에 참조로 포함된다. 따라서, 일부 실시양태에서, 본원에 제공된 융합 단백질 중 임의의 것은 정규 (예를 들어, NGG) PAM 서열을 함유하지 않는 뉴클레오티드 서열에 결합할 수 있는 Cas9 도메인을 함유할 수 있다. 비-정규 PAM 서열에 결합하는 Cas9 도메인은 관련 기술분야에 기재되어 있고, 통상의 기술자에게 명백할 것이다. 예를 들어, 비-정규 PAM 서열에 결합하는 Cas9 도메인은 문헌 [Kleinstiver, B. P., et al., "Engineered CRISPR-Cas9 nucleases with altered PAM specificities" Nature 523, 481-485 (2015); 및 Kleinstiver, B. P., et al., "Broadening the targeting range of Staphylococcus aureus CRISPR-Cas9 by modifying PAM recognition" Nature Biotechnology 33, 1293-1298 (2015)]에 기재되어 있고; 각각의 전체 내용은 본원에 참조로 포함된다.
예를 들어, 변경된 PAM 특이성을 갖는 napDNAbp 도메인, 예컨대 야생형 프란시셀라 노비시다(Francisella novicida) Cpf1 (서열식별번호: 1361472) (D917, E1006, 및 D1255는 볼드체 및 밑줄표시됨)과 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 또는 적어도 99% 서열 동일성을 갖는 도메인이 사용될 수 있다:
Figure pct00044
변경된 PAM 특이성을 갖는 추가의 napDNAbp 도메인, 예컨대 야생형 게오바실루스 써모데니트리피칸스(Geobacillus thermodenitrificans) Cas9 (서열식별번호: 1361473)와 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 또는 적어도 99% 서열 동일성을 갖는 도메인이 사용될 수 있다.
Figure pct00045
일부 실시양태에서, 핵산 프로그램가능한 DNA 결합 단백질 (napDNAbp)은 정규 (NGG) PAM 서열을 필요로 하지 않는 핵산 프로그램가능한 DNA 결합 단백질이다. 일부 실시양태에서, napDNAbp는 아르고노트 단백질이다. 이러한 핵산 프로그램가능한 DNA 결합 단백질의 한 예는 나트로노박테리움 그레고리(Natronobacterium gregoryi)로부터의 아르고노트 단백질 (NgAgo)이다. NgAgo는 ssDNA-가이드된 엔도뉴클레아제이다. NgAgo는 이를 그의 표적 부위로 가이드하기 위해 ~24개 뉴클레오티드의 5' 인산화된 ssDNA (gDNA)에 결합하고, 이는 gDNA 부위에서 DNA 이중 가닥 파괴를 만들 것이다. Cas9와 대조적으로, NgAgo-gDNA 시스템은 프로토스페이서-인접 모티프 (PAM)를 필요로 하지 않는다. 뉴클레아제 불활성 NgAgo (dNgAgo)를 사용하는 것은 표적화될 수 있는 염기를 크게 확장시킬 수 있다. NgAgo의 특징화 및 사용은 문헌 [Gao et al., Nat Biotechnol., 34(7): 768-73 (2016), PubMed PMID: 27136078; Swarts et al., Nature, 507(7491): 258-61 (2014); 및 Swarts et al., Nucleic Acids Res. 43(10) (2015): 5120-9]에 기재되어 있고, 이들 각각은 본원에 참조로 포함된다. 나트로노박테리움 그레고리 아르고노트의 서열이 서열식별번호: 1361474에서 제공된다.
개시된 융합 단백질은 야생형 나트로노박테리움 그레고리 아르고노트 (서열식별번호: 1361474)와 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 또는 적어도 99% 서열 동일성을 갖는 napDNAbp 도메인을 포함할 수 있다.
Figure pct00046
일부 실시양태에서, Cas9 도메인은 스타필로코쿠스 아우레우스(Staphylococcus aureus)로부터의 Cas9 도메인 (SaCas9)이다. 일부 실시양태에서, SaCas9 도메인은 뉴클레아제 활성 SaCas9, 뉴클레아제 불활성 SaCas9 (SaCas9d), 또는 SaCas9 닉카제 (SaCas9n)이다.
(x) 분할 PE 전달을 위한 나뉘어진 napDNAbp 도메인
다양한 실시양태에서, 본원에 기재된 프라임 편집제는 세포 내부에서 (수동 조립에 의해, 또는 분할 인테인 서열을 사용하는 것과 같은 능동 조립에 의해) 재구성된 프라임 편집제로 조립되는 2개 이상의 단편으로서 세포에 전달될 수 있다. 일부 경우에, 자기-조립은 2개 이상의 프라임 편집제 단편이 세포 내부에서 공유적으로 또는 비-공유적으로 회합되어 프라임 편집제를 재구성하는 수동적인 것일 수 있다. 다른 경우에, 자기-조립은 각각의 단편 상에 설치된 이량체화 도메인에 의해 촉매될 수 있다. 이량체화 도메인의 예는 본원에 기재되어 있다. 또 다른 경우에, 자기-조립은 각각의 프라임 편집제 단편 상에 설치된 분할 인테인 서열에 의해 촉매될 수 있다.
분할 PE 전달은 상이한 전달 접근법의 다양한 크기 제약을 다루는데 유리할 수 있다. 예를 들어, 전달 접근법은 바이러스-기반 전달 방법, 메신저 RNA-기반 전달 방법, 또는 RNP-기반 전달 (리보핵단백질-기반 전달)을 포함할 수 있다. 그리고, 각각의 이들 전달 방법은 프라임 편집제를 보다 작은 조각으로 분할함으로써 보다 효율적이고/거나 효과적일 수 있다. 일단 세포 내부로 들어가면, 보다 작은 조각은 기능적 프라임 편집제로 조립될 수 있다. 분할 수단에 따라, 나뉘어진 프라임 편집제 단편은 비-공유 방식 또는 공유 방식으로 재조립되어 프라임 편집제를 재형성할 수 있다. 한 실시양태에서, 프라임 편집제는 1개 이상의 분할 부위에서 2개 이상의 단편으로 분할될 수 있다. 단편은 (분할되는 것 외에) 비변형될 수 있다. 단편이 세포에 전달되면 (예를 들어, 리보핵단백질 복합체의 직접 전달에 의해 또는 핵산 전달 - 예를 들어, mRNA 전달 또는 바이러스 벡터 기반 전달에 의해), 단편은 공유적으로 또는 비-공유적으로 재회합되어 프라임 편집제를 재구성할 수 있다. 또 다른 실시양태에서, 프라임 편집제는 1개 이상의 분할 부위에서 2개 이상의 단편으로 분할될 수 있다. 각각의 단편은 이량체화 도메인을 포함하도록 변형될 수 있고, 이에 의해 형성되는 각각의 단편은 이량체화 도메인에 커플링된다. 일단 세포 내에 전달되거나 발현되면, 상이한 단편의 이량체화 도메인은 서로 회합하고 결합하여, 상이한 프라임 편집제 단편을 함께 모아 기능적 프라임 편집제를 재형성한다. 또 다른 실시양태에서, 프라임 편집제 단편은 분할 인테인을 포함하도록 변형될 수 있다. 일단 세포 내에 전달되거나 발현되면, 상이한 단편의 분할 인테인 도메인은 서로 회합하고 결합한 다음, 트랜스-스플라이싱을 겪고, 이는 각각의 단편으로부터 분할-인테인 도메인의 절제, 및 단편 사이의 펩티드 결합의 동반 형성을 유발하며, 그에 의해 프라임 편집제가 복원된다.
한 실시양태에서, 프라임 편집제는 분할-인테인 접근법을 사용하여 전달될 수 있다.
분할 부위의 위치는 napDNAbp 도메인, 폴리머라제 도메인 (예를 들어, RT 도메인), napDNAbp 도메인과 폴리머라제 도메인을 연결하는 링커 도메인 내를 포함한, 프라임 편집제 및 그 안의 임의의 도메인 내의 잔기의 임의의 1개 이상의 쌍 사이에 위치할 수 있다.
도 66에 도시된 한 실시양태에서, 프라임 편집제 (PE)는 napDNAbp 내의 분할 부위에서 나뉘어진다.
특정 실시양태에서, napDNAbp는 하기와 같은 서열식별번호: 1361421의 정규 SpCas9 폴리펩티드이다:
Figure pct00047
특정 실시양태에서, SpCas9는 서열식별번호: 1361421의 정규 SpCas9의 잔기 1과 2 사이, 또는 2와 3 사이, 또는 3과 4 사이, 또는 4와 5 사이, 또는 5와 6 사이, 또는 6과 7 사이, 또는 7과 8 사이, 또는 8과 9 사이, 또는 9와 10 사이, 또는 잔기 1-10, 10-20, 20-30, 30-40, 40-50, 50-60, 60-70, 70-80, 80-90, 90-100, 100-200, 200-300, 300-400, 400-500, 500-600, 600-700, 700-800, 800-900, 1000-1100, 1100-1200, 1200-1300, 또는 1300-1368 사이의 임의의 위치에 위치하는 잔기의 임의의 2개 쌍 사이에 위치하는 분할 부위에서 2개의 단편으로 분할된다.
특정 실시양태에서, napDNAbp는 서열식별번호: 1361421의 정규 SpCas9의 위치 1-10, 10-20, 20-30, 30-40, 40-50, 50-60, 60-70, 70-80, 80-90, 90-100, 100-200, 200-300, 300-400, 400-500, 500-600, 600-700, 700-800, 800-900, 1000-1100, 1100-1200, 1200-1300, 또는 1300-1368 사이의 임의의 위치에 위치하는 잔기의 임의의 2개의 쌍에 상응하는 잔기의 쌍에 위치하는 분할 부위에서 2개의 단편으로 분할된다.
특정 실시양태에서, SpCas9는 서열식별번호: 1361421의 정규 SpCas9의 잔기 1과 2 사이, 또는 2와 3 사이, 또는 3과 4 사이, 또는 4와 5 사이, 또는 5와 6 사이, 또는 6과 7 사이, 또는 7과 8 사이, 또는 8과 9 사이, 또는 9와 10 사이, 또는 잔기 1-10, 10-20, 20-30, 30-40, 40-50, 50-60, 60-70, 70-80, 80-90, 90-100, 100-200, 200-300, 300-400, 400-500, 500-600, 600-700, 700-800, 800-900, 1000-1100, 1100-1200, 1200-1300, 또는 1300-1368 사이의 임의의 위치에 위치하는 잔기의 임의의 2개 쌍 사이에 위치하는 분할 부위에서 2개의 단편으로 분할된다.
특정 실시양태에서, 분할 부위는 1개 이상의 폴리펩티드 결합 부위 (즉, "분할 부위 또는 분할-인테인 분할 부위")에 위치하고, 분할 인테인에 융합된 다음, 개별적으로-코딩된 융합 단백질로서 세포에 전달된다. 분할-인테인 융합 단백질 (즉, 단백질 절반)이 세포 내에서 발현되면, 단백질은 트랜스-스플라이싱을 거쳐, 연결된 분할-인테인 서열의 동반 제거와 함께 완전한 또는 전체 PE를 형성한다.
예를 들어, 도 38에 제시된 바와 같이, N-말단 엑스테인은 제1 분할-인테인 (예를 들어, N 인테인)에 융합될 수 있고, C-말단 엑스테인은 제2 분할-인테인 (예를 들어, C 인테인)에 융합될 수 있다. N-말단 엑스테인은 C-말단 엑스테인에 융합되어 세포 내에서 N 인테인 및 C 인테인의 자기-회합 시 napDNAbp 도메인 및 폴리머라제 도메인 (예를 들어, RT 도메인)을 포함하는 전체 프라임 편집제 융합 단백질을 재형성하고, 이어서 그의 자기-절제, 및 전체 프라임 편집제 (PE)의 N-말단 엑스테인 및 C-말단 엑스테인 부분 사이의 펩티드 결합의 동반 형성이 이어진다.
분할-인테인을 사용한 분할-PE 전달 전략을 이용하기 위해, 프라임 편집제는 1개 이상의 분할 부위에서 나뉘어져서 프라임 편집제의 적어도 2개의 별개의 절반을 생성할 필요가 있으며, 이들 각각은 각각의 절반이 분할-인테인 서열에 융합되는 경우에 세포 내부에서 재연결될 수 있다.
특정 실시양태에서, 프라임 편집제는 단일 분할 부위에서 분할된다. 특정의 다른 실시양태에서, 프라임 편집제는 2개의 분할 부위, 또는 3개의 분할 부위, 또는 4개의 분할 부위, 또는 그 초과에서 분할된다.
바람직한 실시양태에서, 프라임 편집제는 단일 분할 부위에서 분할되어 프라임 편집제의 2개의 별개의 절반을 생성하고, 이들 각각은 분할 인테인 서열에 융합될 수 있다.
예시적인 분할 인테인은 2개의 서브유닛, 즉 DnaE-N 및 DnaE-C를 포함하는 Ssp DnaE 인테인이다. 2개의 상이한 서브유닛은 별개의 유전자, 즉 각각 DnaE-N 및 DnaE-C 서브유닛을 코딩하는 dnaE-n 및 dnaE-c에 의해 코딩된다. DnaE는 시네코시스티스(Synechocystis) 종 PCC6803의 자연 발생 분할 인테인이고, 각각 DnaE-N 또는 DnaE-C와의 융합체를 포함한 2개의 별개의 단백질의 트랜스-스플라이싱을 지시할 수 있다.
추가의 자연 발생 또는 조작된 분할-인테인 서열은 관련 기술분야에 공지되어 있거나, 또는 본원에 기재된 전체-인테인 서열 또는 관련 기술분야에서 입수가능한 것으로부터 제조될 수 있다. 분할-인테인 서열의 예는 문헌 [Stevens et al., "A promiscuous split intein with expanded protein engineering applications," PNAS, 2017, Vol.114: 8538-8543; Iwai et al., "Highly efficient protein trans-splicing by a naturally split DnaE intein from Nostc punctiforme, FEBS Lett, 580: 1853-1858]에서 찾아볼 수 있으며, 이들 각각은 본원에 참조로 포함된다. 추가의 분할 인테인 서열은, 예를 들어 WO 2013/045632, WO 2014/055782, WO 2016/069774, 및 EP2877490에서 찾아볼 수 있으며, 이들 각각의 내용은 본원에 참조로 포함된다.
또한, 생체내 및 시험관내 트랜스로의 단백질 스플라이싱이 기재되어 있으며 (Shingledecker, et al., Gene 207:187 (1998), Southworth, et al., EMBO J. 17:918 (1998); Mills, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 95:3543-3548 (1998); Lew, et al., J. Biol. Chem., 273:15887-15890 (1998); Wu, et al., Biochim. Biophys. Acta 35732:1 (1998b), Yamazaki, et al., J. Am. Chem. Soc. 120:5591 (1998), Evans, et al., J. Biol. Chem. 275:9091 (2000); Otomo, et al., Biochemistry 38:16040-16044 (1999); Otomo, et al., J. Biolmol. NMR 14:105-114 (1999); Scott, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96:13638-13643 (1999)), 이는 예를 들어 2개의 개별적으로-발현된 절반으로부터 완전한 PE 융합 단백질의 형성에 관하여 도 38 및 39에 제시된 바와 같이, 기능적 생성물을 형성하기 위해 후속적으로 라이게이션을 거치는 2개의 불활성 단편에 대해 단백질로서의 발현 기회를 제공한다.
본원에 기재된 다양한 실시양태에서, 연속 진화 방법 (예를 들어, PACE)은 염기 편집제의 제1 부분을 진화시키는데 사용될 수 있다. 제1 부분은 단일 성분 또는 도메인, 예를 들어 Cas9 도메인, 데아미나제 도메인, 또는 UGI 도메인을 포함할 수 있다. 이어서, 개별적으로 진화된 성분 또는 도메인은 분할-인테인 폴리펩티드 도메인과 함께 진화된 부분 및 나머지 비-진화된 부분 둘 다를 개별적으로 발현시킴으로써 세포 내에서 염기 편집제의 나머지 부분에 융합될 수 있다. 제1 부분은 보다 넓게는 본원에 기재된 연속 진화 방법을 사용하여 진화시키는 것을 목적으로 하는 염기 편집제의 임의의 제1 아미노산 부분을 포함할 수 있다. 이러한 실시양태에서 제2 부분은 본원의 방법을 사용하여 진화되지 않는 염기 편집제의 나머지 아미노산 부분을 지칭할 것이다. 염기 편집제의 진화된 제1 부분 및 제2 부분은 각각 세포에서 분할-인테인 폴리펩티드 도메인과 함께 발현될 수 있다. 세포의 천연 단백질 스플라이싱 메카니즘은 진화된 제1 부분 및 비-진화된 제2 부분을 재조립하여 단일 융합 단백질 진화된 염기 편집제를 형성할 것이다. 진화된 제1 부분은 단일 융합 단백질의 N- 또는 C-말단 부분을 포함할 수 있다. 유사한 방식으로, 제2 직교 트랜스-스플라이싱 인테인 쌍의 사용은 진화된 제1 부분이 단일 융합 단백질의 내부 부분을 포함하도록 할 수 있다.
따라서, 본원에 기재된 염기 편집제의 진화된 및 비-진화된 성분 중 임의의 것은 세포 내에서 진화된 및 비-진화된 성분을 포함하는 완전한 염기 편집제의 형성을 용이하게 하기 위해 분할-인테인 태그와 함께 발현될 수 있다.
단백질 스플라이싱 과정의 메카니즘은 매우 상세하게 연구되었고 (Chong, et al., J. Biol. Chem. 1996, 271, 22159-22168; Xu, M-Q & Perler, F. B. EMBO Journal, 1996, 15, 5146-5153), 보존된 아미노산은 인테인 및 엑스테인 스플라이싱 지점에서 발견되었다 (Xu, et al., EMBO Journal, 1994, 13 5517-522). 본원에 기재된 구축물은 제1 유전자의 5'-말단 (예를 들어, 염기 편집제의 진화된 부분)에 융합된 인테인 서열을 함유한다. 적합한 인테인 서열은 단백질 스플라이싱 요소를 함유하는 것으로 공지된 단백질 중 임의의 것으로부터 선택될 수 있다. 모든 공지된 인테인을 함유하는 데이터베이스는 월드 와이드 웹에서 찾아볼 수 있다 (Perler, F. B. Nucleic Acids Research, 1999, 27, 346-347). 인테인 서열은 제2 유전자의 3' 단부에서 5' 단부에 융합된다. 이러한 유전자를 특정 소기관으로 표적화하기 위해, 펩티드 신호가 유전자의 코딩 서열에 융합될 수 있다. 제2 유전자 후에, 인테인-유전자 서열은 동일한 세포에서 다중 단백질의 발현을 위해 목적하는 만큼 자주 반복될 수 있다. 다중-인테인 함유 구축물의 경우, 상이한 공급원으로부터의 인테인 요소를 사용하는 것이 유용할 수 있다. 발현될 마지막 유전자의 서열 후에, 전사 종결 서열이 삽입되어야 한다. 한 실시양태에서, 변형된 인테인 스플라이싱 유닛은 인테인으로부터 엑스테인의 절제를 촉매할 수 있을뿐만 아니라 엑스테인의 라이게이션을 방지할 수 있도록 설계된다. 피로코쿠스(Pyrococcus) 종 GB-D DNA 폴리머라제에서의 C-말단 엑스테인 접합부의 돌연변이유발은 엑스테인 및 인테인의 절단을 유도하지만 엑스테인의 후속 라이게이션은 방지하는 변경된 스플라이싱 요소를 생성하는 것으로 밝혀졌다 (Xu, M-Q & Perler, F. B. EMBO Journal, 1996, 15, 5146-5153). 세린 538의 알라닌 또는 글리신으로의 돌연변이는 절단을 유도하였지만 라이게이션은 방지하였다. 다른 인테인 스플라이싱 유닛에서의 등가 잔기의 돌연변이는 또한 인테인에 대한 C-말단 엑스테인 접합부에서의 아미노산의 보존으로 인해 엑스테인 라이게이션을 방지할 것이다. 엔도뉴클레아제 도메인을 함유하지 않는 바람직한 인테인은 미코박테리움 크세노피(Mycobacterium xenopi) GyrA 단백질이다 (Telenti, et al., J. Bacteriol. 1997, 179, 6378-6382). 그 밖의 것이 자연에서 발견되었거나 또는 엔도뉴클레아제 도메인을 엔도뉴클레아제 함유 인테인으로부터 제거함으로써 인위적으로 생성되었다 (Chong, et al., J. Biol. Chem. 1997, 272, 15587-15590). 바람직한 실시양태에서, 인테인은, 미코박테리움 크세노피 GyrA 단백질로부터의 인테인과 같이, 스플라이싱 기능을 수행하는데 필요한 최소 개수의 아미노산으로 이루어지도록 선택된다 (Telenti, A., et al., J. Bacteriol. 1997, 179, 6378-6382). 대안적 실시양태에서, 엔도뉴클레아제 활성이 없는 인테인, 예컨대 미코박테리움 크세노피 GyrA 단백질로부터의 인테인 또는 엔도뉴클레아제 도메인을 제거하도록 변형된 사카로미세스 세레비지아에(Saccharomyces cerevisiae) VMA 인테인으로부터 선택된다 (Chong, 1997). 인테인 스플라이싱 유닛의 추가의 변형은 절단 반응의 반응 속도가 변경되도록 하여, 스플라이싱 유닛의 유전자 서열을 단순히 변형시키는 것에 의해 단백질 투여량이 제어되도록 할 수 있다.
인테인은 또한 2개의 개별적으로 전사되고 번역되는 유전자에 의해 코딩된 2개의 단편으로서 존재할 수 있다. 이들 소위 분할 인테인은 자기-회합하고, 단백질-스플라이싱 활성을 트랜스로 촉매한다. 분할 인테인은 다양한 시아노박테리아 및 고세균에서 확인되었지만 (Caspi et al., Mol Microbiol. 50: 1569-1577 (2003); Choi J. et al., J Mol Biol. 556: 1093-1106 (2006.); Dassa B. et al., Biochemistry. 46:322-330 (2007.); Liu X. and Yang J., J Biol Chem. 275:26315-26318 (2003); Wu H. et al., Proc Natl Acad Sci USA. ￡5:9226-9231 (1998.); 및 Zettler J. et al., FEBS Letters. 553:909-914 (2009)), 지금까지 진핵생물에서는 발견되지 않았다. 최근에, 환경 메타게놈 데이터의 생물정보학적 분석은 신규 게놈 배열을 갖는 26개의 상이한 유전자좌를 밝혀내었다. 각각의 유전자좌에서, 보존된 효소 코딩 영역은 분할 인테인에 의해 개재되고, 인테인 서브도메인을 코딩하는 섹션 사이에 자립형 엔도뉴클레아제 유전자가 삽입된다. 이들 중에서, 5개의 유전자좌가 완전히 조립되었다: DNA 헬리카제 (gp41-l, gp41-8); 이노신-5'-모노포스페이트 데히드로게나제 (IMPDH-1); 및 리보뉴클레오티드 리덕타제 촉매 서브유닛 (NrdA-2 및 NrdJ-1). 이러한 파괴된 유전자 조직은 주로 파지에 존재하는 것으로 보인다 (Dassa et al., Nucleic Acids Research. 57:2560-2573 (2009)).
분할 인테인 Npu DnaE는 단백질 트랜스-스플라이싱 반응에 대해 보고된 최고 속도를 갖는 것으로 특징화되었다. 또한, Npu DnaE 단백질 스플라이싱 반응은 상이한 엑스테인 서열, 6 내지 37℃의 온도, 및 최대 6M의 우레아의 존재와 관련하여 강건하고 고수율인 것으로 간주된다 (Zettler J. et al., FEBS Letters. 553:909-914 (2009); Iwai I. et al., FEBS Letters 550: 1853-1858 (2006)). 예상된 바와 같이, 이들 인테인의 N-도메인에서 Cysl Ala 돌연변이가 도입되었을 때, 초기 N에서 S- 아실 이동이 차단되었고, 따라서 단백질 스플라이싱이 차단되었다. 불행하게도, C-말단 절단 반응도 또한 거의 완전히 억제되었다. N-말단 절단가능한 펩티드 결합에서의 아실 이동에 대한 C-말단 스플라이스 접합부에서의 아스파라긴 고리화의 의존성은 자연 분할 DnaE 인테인 대립유전자에 공통적인 고유한 특성인 것으로 보인다 (Zettler J. et al., FEBS Letters. 555:909-914 (2009)).
단백질 스플라이싱의 메카니즘은 전형적으로 4개의 단계를 갖는다 [29-30]: 1) 상류 펩티드 결합을 파괴하고 N-엑스테인과 인테인의 제1 아미노산 (Cys 또는 Ser)의 측쇄 사이에 에스테르 결합을 형성하는, 인테인 N-말단에서의 N-S 또는 N-O 아실 이동; 2) N-엑스테인을 C-엑스테인의 제1 아미노산 (Cys, Ser, 또는 Thr)의 측쇄에 연결하는 새로운 에스테르 결합을 형성하는, N-엑스테인을 인테인 C-말단으로 재배치하는 에스테르교환; 3) 인테인과 C-엑스테인 사이의 펩티드 결합을 파괴하는 Asn 고리화; 및 4) 에스테르 결합을 N-엑스테인과 C-엑스테인 사이의 펩티드 결합으로 대체하는 S-N 또는 O-N 아실 이동.
분할 인테인에 의해 촉매되는 단백질 트랜스-스플라이싱은 전적으로 단백질 라이게이션을 위한 효소적 방법을 제공한다 [31]. 분할-인테인은 본질적으로 각각 N-인테인 및 C-인테인으로 명명되는 2개의 조각으로 분할된 인접 인테인 (예를 들어 미니-인테인)이다. 분할 인테인의 N-인테인 및 C-인테인은 비-공유적으로 회합되어 활성 인테인을 형성하고, 인접 인테인과 본질적으로 동일한 방식으로 스플라이싱 반응을 촉매할 수 있다. 분할 인테인은 자연에서 발견되었고, 또한 실험실에서 조작되었다 [31-35]. 본원에 사용된 용어 "분할 인테인"은 N-말단 및 C-말단 서열이 트랜스-스플라이싱 반응에 대해 기능적인 인테인으로 비-공유적으로 재회합 또는 재구성될 수 있는 별개의 분자가 되도록 N-말단 및 C-말단 아미노산 서열 사이에 1개 이상의 펩티드 결합 파괴가 존재하는 임의의 인테인을 지칭한다. 임의의 촉매 활성 인테인 또는 그의 단편은 본 발명의 방법에 사용하기 위한 분할 인테인을 유도하는데 사용될 수 있다. 예를 들어, 한 측면에서 분할 인테인은 진핵 인테인으로부터 유래될 수 있다. 또 다른 측면에서, 분할 인테인은 박테리아 인테인으로부터 유래될 수 있다. 또 다른 측면에서, 분할 인테인은 고세균 인테인으로부터 유래될 수 있다. 바람직하게는, 이와 같이 유래된 분할 인테인은 트랜스-스플라이싱 반응을 촉매하는데 필수적인 아미노산 서열만을 보유할 것이다.
본원에 사용된 "N-말단 분할 인테인 (In)"은 트랜스-스플라이싱 반응에 대해 기능적인 N-말단 아미노산 서열을 포함하는 임의의 인테인 서열을 지칭한다. 따라서, In은 또한 트랜스-스플라이싱이 발생할 때 스플라이싱되는 서열을 포함한다. In은 자연 발생 인테인 서열의 N-말단 부분의 변형인 서열을 포함할 수 있다. 예를 들어, In은, 추가의 및/또는 돌연변이된 잔기의 포함이 In을 트랜스-스플라이싱에서 비-기능적으로 만들지 않는 한, 이러한 추가의 아미노산 잔기 및/또는 돌연변이된 잔기를 포함할 수 있다. 바람직하게는, 추가의 및/또는 돌연변이된 잔기의 포함은 In의 트랜스-스플라이싱 활성을 개선 또는 증진시킨다.
본원에 사용된 "C-말단 분할 인테인 (Ic)"은 트랜스-스플라이싱 반응에 대해 기능적인 C-말단 아미노산 서열을 포함하는 임의의 인테인 서열을 지칭한다. 한 측면에서, Ic는 4 내지 7개의 인접 아미노산 잔기를 포함하고, 이 중 적어도 4개의 아미노산은 그가 유래된 인테인의 마지막 β-가닥으로부터의 것이다. 따라서, Ic는 또한 트랜스-스플라이싱이 발생할 때 스플라이싱되는 서열을 포함한다. Ic는 자연 발생 인테인 서열의 C-말단 부분의 변형인 서열을 포함할 수 있다. 예를 들어, Ic는, 추가의 및/또는 돌연변이된 잔기의 포함이 In을 트랜스-스플라이싱에서 비-기능적으로 만들지 않는 한, 이러한 추가의 아미노산 잔기 및/또는 돌연변이된 잔기를 포함할 수 있다. 바람직하게는, 추가의 및/또는 돌연변이된 잔기의 포함은 Ic의 트랜스-스플라이싱 활성을 개선 또는 증진시킨다.
본 발명의 일부 실시양태에서, Ic 또는 In에 연결된 펩티드는 특히 형광 기, 비오틴, 폴리에틸렌 글리콜 (PEG), 아미노산 유사체, 비천연 아미노산, 포스페이트 기, 글리코실 기, 방사성동위원소 표지, 및 제약 분자를 포함한 추가의 화학적 모이어티를 포함할 수 있다. 다른 실시양태에서, Ic에 연결된 펩티드는 특히 케톤, 알데히드, Cys 잔기 및 Lys 잔기를 포함하는 1개 이상의 화학적 반응성 기를 포함할 수 있다. 분할 인테인의 N-인테인 및 C-인테인은 비-공유적으로 회합되어 활성 인테인을 형성하고, "인테인-스플라이싱 폴리펩티드 (ISP)"가 존재하는 경우에 스플라이싱 반응을 촉매할 수 있다. 본원에 사용된 "인테인-스플라이싱 폴리펩티드 (ISP)"는 Ic, In, 또는 둘 다가 분할 인테인으로부터 제거될 때 남는 분할 인테인의 아미노산 서열의 부분을 지칭한다. 특정 실시양태에서, In은 ISP를 포함한다. 또 다른 실시양태에서, Ic는 ISP를 포함한다. 또 다른 실시양태에서, ISP는 In에도 Ic에도 공유 연결되지 않은 별개의 펩티드이다.
분할 인테인은 미니-인테인의 구조에서 발견되는 -12개의 보존된 베타-가닥 사이의 비구조화된 루프 또는 개재 아미노산 서열 내의 1개 이상의 분할 부위를 조작함으로써 인접 인테인으로부터 생성될 수 있다 [25-28]. 분할의 생성이 단백질 스플라이싱 활성이 상실되는데 충분한 정도로 인테인, 특히 구조화된 베타-가닥의 구조를 파괴하지 않을 것이라면, 베타-가닥 사이의 영역 내의 분할 부위의 위치에 일부 유연성이 존재할 수 있다.
단백질 트랜스-스플라이싱에서, 하나의 전구체 단백질은 N-엑스테인 부분에 이어 N-인테인으로 이루어지고, 또 다른 전구체 단백질은 C-인테인 부분에 이어 C-엑스테인으로 이루어지고, 트랜스-스플라이싱 반응 (N- 및 C-인테인에 의해 함께 촉매됨)은 2개의 인테인 서열을 절제하고, 2개의 엑스테인 서열을 펩티드 결합으로 연결한다. 효소 반응인 단백질 트랜스-스플라이싱은 매우 낮은 (예를 들어, 마이크로몰) 농도의 단백질로 작용할 수 있고, 생리학적 조건 하에 수행될 수 있다.
B. 프로그램가능한 뉴클레아제 (비-napDNAbp)
본원에 기재된 다양한 실시양태에서, 프라임 편집제는 napDNAbp, 예컨대 Cas9 단백질을 포함한다. 이들 단백질은, 가이드 RNA (또는 PEgRNA)의 스페이서 부분에 상보적인 서열을 보유하고 또한 요구되는 PAM 서열을 보유하는 DNA 상의 표적 부위로 Cas9 단백질을 가이드하는 gRNA (또는 경우에 따라 PEgRNA)와 복합체화되는 방식에 의해 "프로그램가능하다". 그러나, 본원에서 고려되는 특정 실시양태에서, napDNAbp는 상이한 유형의 프로그램가능한 단백질, 예컨대 아연 핑거 뉴클레아제 또는 전사 활성인자-유사 이펙터 뉴클레아제 (TALEN)로 치환될 수 있다.
도 1h는 napDNAbp (예를 들어, SpCas9 닉카제)를 임의의 프로그램가능한 뉴클레아제 도메인, 예컨대 아연 핑거 뉴클레아제 (ZFN) 또는 전사 활성인자-유사 이펙터 뉴클레아제 (TALEN)로 대체하는, 본원에서 고려되는 프라임 편집의 이러한 변경을 도시한다. 따라서, 적합한 뉴클레아제가 반드시 핵산 표적화 분자 (예컨대 가이드 RNA)에 의해 "프로그램화"될 필요는 없고, 오히려 DNA-결합 도메인, 예컨대 특히 뉴클레아제의 특이성을 규정함으로써 프로그램화될 수 있는 것으로 고려된다. napDNAbp 모이어티를 사용한 프라임 편집에서와 같이, 이러한 대안적 프로그램가능한 뉴클레아제는 표적 DNA의 1개의 가닥만이 절단되도록 변형되는 것이 바람직하다. 다시 말해서, 프로그램가능한 뉴클레아제는 바람직하게는 닉카제로서 기능해야 한다. 일단 프로그램가능한 뉴클레아제가 선택되면 (예를 들어, ZFN 또는 TALEN), 추가의 기능성을 시스템 내로 조작하여 이것이 프라임 편집-유사 메카니즘에 따라 작동하도록 할 수 있다. 예를 들어, 프로그램가능한 뉴클레아제는 RNA 또는 DNA 연장 아암을 (예를 들어, 화학적 링커를 통해) 그에 커플링시킴으로써 변형될 수 있으며, 여기서 연장 아암은 프라이머 결합 부위 (PBS) 및 DNA 합성 주형을 포함한다. 프로그램가능한 뉴클레아제는 또한 폴리머라제에 (예를 들어, 화학적 또는 아미노산 링커를 통해) 커플링될 수 있으며, 그의 속성은 연장 아암이 DNA인지 또는 RNA인지에 좌우될 것이다. RNA 연장 아암의 경우에, 폴리머라제는 RNA-의존성 DNA 폴리머라제 (예를 들어, 리버스 트랜스크립타제)일 수 있다. DNA 연장 아암의 경우에, 폴리머라제는 DNA-의존성 DNA 폴리머라제 (예를 들어, Pol I, Pol II, 또는 Pol III를 포함한 원핵 폴리머라제, 또는 Pol a, Pol b, Pol g, Pol d, Pol e, 또는 Pol z를 포함한 진핵 폴리머라제)일 수 있다. 시스템은 또한 프로그램가능한 뉴클레아제에 대한 융합체로서 부가되거나 또는 트랜스로 부가되어 반응을 전체로서 용이하게 하기 위한 다른 기능성을 포함할 수 있다 (예를 들어, (a) 절단 부위에서 DNA를 풀어내어 3' 단부를 갖는 절단 가닥을 프라이머로서 이용가능하게 하는 헬리카제, (b) 절단 가닥 상의 내인성 가닥을 제거하도록 도와 합성된 가닥으로 내인성 가닥을 대체하는 쪽으로 반응을 구동하는 FEN1, 또는 (c) 대향 가닥 상에 제2 부위 닉을 생성하여, 비-편집된 가닥의 선호되는 세포 복구를 통해 합성 복구의 통합을 구동하는 것을 도울 수 있는 nCas9:gRNA 복합체). napDNAbp에 의한 프라임 편집과 유사한 방식으로, 달리 프로그램가능한 뉴클레아제와의 이러한 복합체를 사용하여 관심 편집을 보유하는 DNA의 새로 합성된 대체 가닥을 합성한 다음, 이를 DNA의 표적 부위 내로 영구적으로 설치할 수 있다.
DNA의 표적 부위에 선택적으로 결합하도록 프로그램화될 수 있고, 폴리머라제, 및 프라이머 결합 부위 및 DNA 합성 주형을 포함하는 RNA 또는 DNA 연장 아암을 특이적 닉 부위에 공동-국재화하도록 상기 기재된 방식으로 추가로 변형될 수 있는 대안적 프라임 편집제 시스템을 구축하기 위해 napDNAbp:gRNA 복합체 대신 사용될 수 있는 적합한 대안적 프로그램가능한 뉴클레아제가 관련 기술분야에 널리 공지되어 있다. 예를 들어, 도 1h에 나타내어진 바와 같이, 전사 활성인자-유사 이펙터 뉴클레아제 (TALEN)는 본원에 기재된 프라임 편집 방법 및 물질의 조성물에서 프로그램가능한 뉴클레아제로서 사용될 수 있다. TALEN은 TAL 이펙터 DNA 결합 도메인을 DNA 절단 도메인에 융합시킴으로써 생성된 인공 제한 효소이다. 이들 시약은 효율적이고, 프로그램가능하고, 특이적인 DNA 절단을 가능하게 하고, 이는 계내 게놈 편집을 위한 강력한 도구를 나타낸다. 전사 활성인자-유사 이펙터 (TALE)는 실제로 임의의 DNA 서열에 결합하도록 신속하게 조작될 수 있다. 본원에 사용된 용어 TALEN은 광범위하고, 또 다른 TALEN으로부터의 보조 없이 이중 가닥 DNA를 절단할 수 있는 단량체 TALEN을 포함한다. 용어 TALEN은 또한 함께 작용하여 동일한 부위에서 DNA를 절단하도록 조작된 한 쌍의 TALEN의 하나 또는 둘 다의 구성원을 지칭하는데 사용된다. 함께 작용하는 TALEN은 좌측-TALEN 및 우측-TALEN으로 지칭될 수 있으며, 이는 DNA의 방향성을 지칭한다. 미국 일련 번호 12/965,590; 미국 일련 번호 13/426,991 (미국 특허 번호 8,450,471); 미국 일련 번호 13/427,040 (미국 특허 번호 8,440,431); 미국 일련 번호 13/427,137 (미국 특허 번호 8,440,432); 및 미국 일련 번호 13/738,381을 참조하며, 이들 모두는 그 전문이 본원에 참조로 포함된다. 또한, TALEN은 WO 2015/027134, US 9,181,535, 문헌 [Boch et al., "Breaking the Code of DNA Binding Specificity of TAL-Type III Effectors", Science, vol. 326, pp. 1509-1512 (2009), Bogdanove et al., TAL Effectors: Customizable Proteins for DNA Targeting, Science, vol. 333, pp. 1843-1846 (2011), Cade et al., "Highly efficient generation of heritable zebrafish gene mutations using homo- and heterodimeric TALENs", Nucleic Acids Research, vol. 40, pp. 8001-8010 (2012), 및 Cermak et al., "Efficient design and assembly of custom TALEN and other TAL effector-based constructs for DNA targeting", Nucleic Acids Research, vol. 39, No. 17, e82 (2011)]에 기재되어 있고, 이들 각각은 본원에 참조로 포함된다.
도 1h에 나타낸 바와 같이, 아연 핑거 뉴클레아제도 또한 napDNAbp, 예컨대 Cas9 닉카제 대신 프라임 편집에 사용하기 위한 대안적 프로그램가능한 뉴클레아제로서 사용될 수 있다. TALEN과 마찬가지로, ZFN 단백질은 이들이 닉카제로서 기능하도록 변형될 수 있으며, 즉, 본원에 기재된 프라임 편집제와 함께 사용되는 napDNAbp와 유사한 방식으로 표적 DNA의 오직 1개의 가닥만을 절단하도록 ZFN이 조작될 수 있다. ZFN 단백질은 관련 기술분야에, 예를 들어, 문헌 [Carroll et al., "Genome Engineering with Zinc-Finger Nucleases," Genetics, Aug 2011, Vol. 188: 773-782; Durai et al., "Zinc finger nucleases: custom-designed molecular scissors for genome engineering of plant and mammalian cells," Nucleic Acids Res, 2005, Vol. 33: 5978-90; 및 Gaj et al., "ZFN, TALEN, and CRISPR/Cas-based methods for genome engineering," Trends Biotechnol. 2013, Vol.31: 397-405]에 광범위하게 기재되어 있으며, 이들 각각은 그 전문이 본원에 참조로 포함된다.
C. 폴리머라제 (예를 들어, 리버스 트랜스크립타제)
다양한 실시양태에서, 본원에 개시된 프라임 편집제 (PE) 시스템은 폴리머라제 (예를 들어, DNA-의존성 DNA 폴리머라제 또는 RNA-의존성 DNA 폴리머라제, 예컨대 리버스 트랜스크립타제), 또는 그의 변이체를 포함하며, 이는 napDNAbp 또는 다른 프로그램가능한 뉴클레아제와의 융합 단백질로서 제공될 수 있거나, 또는 트랜스로 제공될 수 있다.
임의의 폴리머라제가 본원에 개시된 프라임 편집제에 사용될 수 있다. 폴리머라제는 야생형 폴리머라제, 기능적 단편, 돌연변이체, 변이체, 또는 말단절단된 변이체 등일 수 있다. 폴리머라제는 진핵, 원핵, 고세균, 또는 바이러스 유기체로부터의 야생형 폴리머라제를 포함할 수 있고/거나, 폴리머라제는 유전자 조작, 돌연변이유발, 방향적 진화-기반 과정에 의해 변형될 수 있다. 폴리머라제는 T7 DNA 폴리머라제, T5 DNA 폴리머라제, T4 DNA 폴리머라제, 클레나우 단편 DNA 폴리머라제, DNA 폴리머라제 III 등을 포함할 수 있다. 폴리머라제는 또한 열안정성일 수 있고, Taq, Tne, Tma, Pfu, Tfl, Tth, 스토펠 단편, VENT® 및 DEEPVENT® DNA 폴리머라제, KOD, Tgo, JDF3, 및 그의 돌연변이체, 변이체 및 유도체를 포함할 수 있다 (미국 특허 번호 5,436,149; 미국 특허 번호 4,889,818; 미국 특허 번호 4,965,185; 미국 특허 번호 5,079,352; 미국 특허 번호 5,614,365; 미국 특허 번호 5,374,553; 미국 특허 번호 5,270,179; 미국 특허 번호 5,047,342; 미국 특허 번호 5,512,462; WO 92/06188; WO 92/06200; WO 96/10640; 문헌 [Barnes, W. M., Gene 112:29-35 (1992); Lawyer, F. C., et al., PCR Meth. Appl. 2:275-287 (1993); Flaman, J.-M, et al., Nuc. Acids Res. 22(15):3259-3260 (1994)] 참조, 이들 각각은 참조로 포함됨). 보다 긴 핵산 분자 (예를 들어, 약 3-5 Kb 길이보다 긴 핵산 분자)의 합성을 위해, 적어도 2종의 DNA 폴리머라제가 사용될 수 있다. 특정 실시양태에서, 폴리머라제 중 1종은 3' 엑소뉴클레아제 활성이 실질적으로 결여될 수 있고, 다른 것은 3' 엑소뉴클레아제 활성을 가질 수 있다. 이러한 쌍형성은 동일하거나 상이한 폴리머라제를 포함할 수 있다. 3' 엑소뉴클레아제 활성이 실질적으로 결여된 DNA 폴리머라제의 예는 Taq, Tne(엑소-), Tma(엑소-), Pfu(엑소-), Pwo(엑소-), 엑소-KOD 및 Tth DNA 폴리머라제, 및 그의 돌연변이체, 변이체 및 유도체를 포함하나 이에 제한되지는 않는다.
바람직하게는, 본원에 개시된 프라임 편집제에 사용가능한 폴리머라제는 "주형-의존성" 폴리머라제이다 (폴리머라제는 프라임 편집 동안 합성 하의 DNA 가닥의 서열을 명시하기 위해 DNA 합성 주형에 의존하도록 의도되기 때문). 본원에 사용된 용어 "주형 DNA 분자"는, 예를 들어 PEgRNA의 DNA 합성 주형의 프라이머 연장 반응에서 DNA 폴리머라제에 의해 상보적 핵산 가닥이 합성되는 핵산의 가닥을 지칭한다.
본원에 사용된 용어 "주형 의존성 방식"은 프라이머 분자의 주형 의존성 연장 (예를 들어, DNA 폴리머라제에 의한 DNA 합성)을 수반하는 과정을 지칭하는 것으로 의도된다. 용어 "주형 의존성 방식"은 폴리뉴클레오티드의 새로 합성되는 가닥의 서열이 상보적 염기 쌍형성의 널리 공지된 규칙에 의해 좌우되는 RNA 또는 DNA의 폴리뉴클레오티드 합성을 지칭한다 (예를 들어, 문헌 [Watson, J. D. et al., In: Molecular Biology of the Gene, 4th Ed., W. A. Benjamin, Inc., Menlo Park, Calif. (1987)] 참조). 용어 "상보적"은 염기-쌍형성을 통한 2개의 폴리뉴클레오티드 가닥의 영역 사이 또는 2개의 뉴클레오티드 사이의 서열 상보성의 광범위한 개념을 지칭한다. 아데닌 뉴클레오티드는 티민 또는 우라실인 뉴클레오티드와 특이적 수소 결합 ("염기 쌍형성")을 형성할 수 있는 것으로 공지되어 있다. 유사하게, 시토신 뉴클레오티드는 구아닌 뉴클레오티드와 염기 쌍형성을 할 수 있는 것으로 공지되어 있다. 따라서, 프라임 편집의 경우에, DNA 합성 주형에 대해 프라임 편집제의 폴리머라제에 의해 합성된 DNA의 단일 가닥은 DNA 합성 주형의 서열에 "상보적"인 것으로 언급된다고 언급될 수 있다.
(i) 예시적인 폴리머라제
다양한 실시양태에서, 본원에 기재된 프라임 편집제는 폴리머라제를 포함한다. 개시내용은 임의의 자연 발생 유기체 또는 바이러스로부터 수득되거나, 또는 상업적 또는 비-상업적 공급원으로부터 수득된 임의의 야생형 폴리머라제를 고려한다. 또한, 개시내용의 프라임 편집제에 사용가능한 폴리머라제는 임의의 자연 발생 돌연변이체 폴리머라제, 조작된 돌연변이체 폴리머라제, 또는 기능을 보유하는 말단절단된 변이체를 포함한 다른 변이체 폴리머라제를 포함할 수 있다. 본원에 사용가능한 폴리머라제는 또한 특정 아미노산 치환, 예컨대 본원에 구체적으로 개시된 것을 함유하도록 조작될 수 있다. 특정의 바람직한 실시양태에서, 개시내용의 프라임 편집제에 사용가능한 폴리머라제는 주형-기반 폴리머라제이며, 즉 이들은 주형-의존성 방식으로 뉴클레오티드 서열을 합성한다.
폴리머라제는 뉴클레오티드 가닥을 합성하고 본원에 기재된 프라임 편집제 시스템과 관련하여 사용될 수 있는 효소이다. 폴리머라제는 바람직하게는 "주형-의존성" 폴리머라제 (즉, 주형 가닥의 뉴클레오티드 염기의 순서에 기초하여 뉴클레오티드 가닥을 합성하는 폴리머라제)이다. 특정 구성에서, 폴리머라제는 또한 "주형-비의존성" (즉, 주형 가닥의 필요 없이 뉴클레오티드 가닥을 합성하는 폴리머라제)일 수 있다. 폴리머라제는 또한 "DNA 폴리머라제" 또는 "RNA 폴리머라제"로 추가로 카테고리화될 수 있다. 다양한 실시양태에서, 프라임 편집제 시스템은 DNA 폴리머라제를 포함한다. 다양한 실시양태에서, DNA 폴리머라제는 "DNA-의존성 DNA 폴리머라제" (즉, 주형 분자가 DNA의 가닥임)일 수 있다. 이러한 경우에, DNA 주형 분자는 PEgRNA일 수 있으며, 여기서 연장 아암은 DNA의 가닥을 포함한다. 이러한 경우에, PEgRNA는 RNA 부분 (즉, 스페이서 및 gRNA 코어를 포함한 가이드 RNA 성분) 및 DNA 부분 (즉, 연장 아암)을 포함하는 키메라 또는 하이브리드 PEgRNA로 지칭될 수 있다. 다양한 다른 실시양태에서, DNA 폴리머라제는 "RNA-의존성 DNA 폴리머라제" (즉, 주형 분자가 RNA의 가닥임)일 수 있다. 이러한 경우에, PEgRNA는 RNA, 즉 RNA 연장부를 포함하는 RNA이다. 용어 "폴리머라제"는 또한 뉴클레오티드의 중합 (즉, 폴리머라제 활성)을 촉매하는 효소를 지칭할 수 있다. 일반적으로, 효소는 폴리뉴클레오티드 주형 서열에 어닐링된 프라이머 (예를 들어, 예컨대 PEgRNA의 프라이머 결합 부위에 어닐링된 프라이머 서열)의 3'-단부에서 합성을 개시할 것이고, 주형 가닥의 5' 단부쪽으로 진행할 것이다. "DNA 폴리머라제"는 데옥시뉴클레오티드의 중합을 촉매한다. DNA 폴리머라제와 관련하여 본원에 사용된 용어 DNA 폴리머라제는 "그의 기능적 단편"을 포함한다. "그의 기능적 단편"은 폴리머라제의 전체 미만의 아미노산 서열을 포괄하고, 적어도 1종의 세트의 조건 하에 폴리뉴클레오티드의 중합을 촉매하는 능력을 보유하는 야생형 또는 돌연변이체 DNA 폴리머라제의 임의의 부분을 지칭한다. 이러한 기능적 단편은 별개의 개체로서 존재할 수 있거나, 또는 보다 큰 폴리펩티드, 예컨대 융합 단백질의 구성성분일 수 있다.
일부 실시양태에서, 폴리머라제는 박테리오파지로부터의 것일 수 있다. 박테리오파지 DNA 폴리머라제는 일반적으로 5'에서 3' 엑소뉴클레아제 활성이 없는데, 이는 이러한 활성이 별개의 폴리펩티드에 의해 코딩되기 때문이다. 적합한 DNA 폴리머라제의 예는 T4, T7, 및 phi29 DNA 폴리머라제이다. 상업적으로 입수가능한 효소는 T4 (다수의 공급원, 예를 들어 에피센터(Epicentre)로부터 입수가능함) 및 T7 (다수의 공급원, 예를 들어 비변형된 것의 경우 에피센터, 및 3'에서 5' 엑소 T7 "시쿼나제" DNA 폴리머라제의 경우 USB로부터 입수가능함)이다.
다른 실시양태에서, 폴리머라제는 고세균 폴리머라제이다. 고세균에서 확인된 2가지 상이한 부류의 DNA 폴리머라제가 존재한다: 1. 패밀리 B/pol I 유형 (피로코쿠스 푸리오수스(Pyrococcus furiosus)로부터의 Pfu의 상동체) 및 2. pol II 유형 (피. 푸리오수스 DP1/DP2 2-서브유닛 폴리머라제의 상동체). 둘 다의 부류로부터의 DNA 폴리머라제는 연관된 5'에서 3' 엑소뉴클레아제 활성이 자연 결여되고 3'에서 5' 엑소뉴클레아제 (교정) 활성을 보유하는 것으로 밝혀졌다. 적합한 DNA 폴리머라제 (pol I 또는 pol II)는 목적하는 검정 온도와 유사한 최적 성장 온도를 갖는 고세균으로부터 유래될 수 있다.
열안정성 고세균 DNA 폴리머라제는 피로코쿠스(Pyrococcus) 종 (푸리오수스(furiosus), 종 GB-D, 보에시이(woesii), 아비씨(abyssi), 호르코쉬이(horikoshii)), 써모코쿠스(Thermococcus) 종 (코다카라엔시스(kodakaraensis) KOD1, 리토랄리스(litoralis), 종 9 디그리스 노스-7(9 degrees North-7), 종 JDF-3, 고르고나리우스(gorgonarius)), (피로딕티움 오쿨툼(Pyrodictium occultum)), 및 아르카에오글로부스 풀기두스(Archaeoglobus fulgidus)로부터 단리된다.
폴리머라제는 또한 유박테리아 종으로부터의 것일 수 있다. 유박테리아 DNA 폴리머라제의 3종의 부류, pol I, II, 및 III이 존재한다. Pol I DNA 폴리머라제 패밀리의 효소는 5'에서 3' 엑소뉴클레아제 활성을 보유하고, 특정 구성원은 또한 3'에서 5' 엑소뉴클레아제 활성을 나타낸다. Pol II DNA 폴리머라제는 5'에서 3' 엑소뉴클레아제 활성이 자연 결여되어 있지만, 3'에서 5' 엑소뉴클레아제 활성을 나타낸다. Pol III DNA 폴리머라제는 세포의 주요 복제 DNA 폴리머라제를 나타내고, 다중 서브유닛으로 구성된다. pol III 촉매 서브유닛은 5'에서 3' 엑소뉴클레아제 활성이 결여되어 있지만, 일부 경우에 3'에서 5' 엑소뉴클레아제 활성은 동일한 폴리펩티드에 위치한다.
다양한 상업적으로 입수가능한 Pol I DNA 폴리머라제가 존재하며, 이들 중 일부는 5'에서 3' 엑소뉴클레아제 활성을 감소시키거나 없애도록 변형되었다.
적합한 열안정성 pol I DNA 폴리머라제는 써무스(Thermus) 종 및 써모토가 마리티마(Thermotoga maritima) 예컨대 써무스 아쿠아티쿠스(Thermus aquaticus) (Taq), 써무스 써모필루스(Thermus thermophilus) (Tth) 및 써모토가 마리티마(Thermotoga maritima) (Tma UlTma)를 포함한 다양한 고온성 유박테리아로부터 단리될 수 있다.
상기 열거된 것과 관련된 추가의 유박테리아는 문헌 [Thermophilic Bacteria (Kristjansson, J. K., ed.) CRC Press, Inc., Boca Raton, Fla., 1992]에 기재되어 있다.
본 발명은 그의 내용의 전문이 본원에 참조로 포함되는 미국 특허 번호 5,677,152, 6,479,264 및 6,183,998에 개시된 방법에 따라 화학적으로 변형된 키메라 또는 비-키메라 DNA 폴리머라제를 추가로 제공한다.
상기 열거된 것과 관련된 추가의 고세균 DNA 폴리머라제는 하기 참고문헌에 기재되어 있다: [Archaea: A Laboratory Manual (Robb, F. T. and Place, A. R., eds.), Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1995 및 Thermophilic Bacteria (Kristjansson, J. K., ed.) CRC Press, Inc., Boca Raton, Fla., 1992].
(ii) B. 예시적인 리버스 트랜스크립타제
다양한 실시양태에서, 본원에 개시된 프라임 편집제 (PE) 시스템은 리버스 트랜스크립타제 또는 그의 변이체를 포함한다.
리버스 트랜스크립타제는 전형적으로 RNA- 및 DNA-의존성 DNA 중합 활성을 비롯한 3가지 효소적 활성, 및 RNA-DNA 하이브리드에서 RNA의 절단을 촉매하는 RNaseH 활성을 갖는 다기능성 효소이다. 리버스 트랜스크립타제의 일부 돌연변이체는 RNaseH 모이어티를 무력화시켜 mRNA에 대한 의도하지 않은 손상을 방지한다. 주형으로서 mRNA를 사용하여 상보적 DNA (cDNA)를 합성하는 이들 효소가 RNA 바이러스에서 최초로 확인되었다. 후속적으로, 바이러스 입자, 세포 또는 조직으로부터 리버스 트랜스크립타제가 직접 단리 및 정제되었다. (예를 들어, 문헌 [Kacian et al., 1971, Biochim. Biophys. Acta 46: 365-83; Yang et al., 1972, Biochem. Biophys. Res. Comm. 47: 505-11; Gerard et al., 1975, J. Virol. 15: 785-97; Liu et al., 1977, Arch. Virol. 55 187-200; Kato et al., 1984, J. Virol. Methods 9: 325-39; Luke et al., 1990, Biochem. 29: 1764-69 and Le Grice et al., 1991, J. Virol. 65: 7004-07] 참조, 이들 각각은 참조로 포함됨). 보다 최근에, 열안정성, 충실도 및 활성과 같은 개선된 특성에 대한 연구에서 돌연변이체 및 융합 단백질이 생성되었다. 관련 기술분야에 공지되어 있거나 또는 관련 기술분야에 공지된 방법을 사용하여 제조될 수 있는 리버스 트랜스크립타제의 야생형, 변이체, 및/또는 돌연변이체 형태 중 임의의 것이 본원에서 고려된다.
리버스 트랜스크립타제 (RT) 유전자 (또는 그 안에 함유된 유전자 정보)는 다수의 상이한 공급원으로부터 수득될 수 있다. 예를 들어, 유전자는 레트로바이러스로 감염된 진핵 세포로부터, 또는 레트로바이러스 게놈의 부분 또는 전체를 함유하는 다수의 플라스미드로부터 수득될 수 있다. 또한, RT 유전자를 함유하는 메신저 RNA-유사 RNA는 레트로바이러스로부터 수득될 수 있다. RT에 대한 공급원의 예는 몰로니 뮤린 백혈병 바이러스 (M-MLV 또는 MLVRT); 인간 T-세포 백혈병 바이러스 유형 1 (HTLV-1); 소 백혈병 바이러스 (BLV); 라우스 육종 바이러스 (RSV); 인간 면역결핍 바이러스 (HIV); 효모, 예컨대 사카로미세스(Saccharomyces), 뉴로스포라(Neurospora), 드로소필라(Drosophila); 영장류; 및 설치류를 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 예를 들어, 문헌 [Weiss, et al., 미국 특허 번호 4,663,290 (1987); Gerard, G. R., DNA:271-79 (1986); Kotewicz, M. L., et al., Gene 35:249-58 (1985); Tanese, N., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA):4944-48 (1985); Roth, M. J., et al., J. Biol. Chem. 260:9326-35 (1985); Michel, F., et al., Nature 316:641-43 (1985); Akins, R. A., et al., Cell 47:505-16 (1986), EMBO J. 4:1267-75 (1985); 및 Fawcett, D. F., Cell 47:1007-15 (1986)]을 참조한다 (각각은 그 전문이 본원에 참조로 포함됨).
(a) 야생형 RT
본원에 개시된 프라임 편집제와 함께 사용하기 위한 예시적인 효소는 M-MLV 리버스 트랜스크립타제 및 RSV 리버스 트랜스크립타제를 포함할 수 있으나 이에 제한되지는 않는다. 리버스 트랜스크립타제 활성을 갖는 효소는 상업적으로 입수가능하다. 특정 실시양태에서, 리버스 트랜스크립타제는 프라임 편집제 (PE) 시스템의 다른 성분에 트랜스로 제공된다. 즉, 리버스 트랜스크립타제는 개별 성분으로서 발현되거나 또는 달리 제공되며, 즉 napDNAbp와의 융합 단백질로서가 아니다.
관련 기술분야의 통상의 기술자는 몰로니 뮤린 백혈병 바이러스 (M-MLV); 인간 면역결핍 바이러스 (HIV) 리버스 트랜스크립타제 및 조류 육종-백혈증 바이러스 (ASLV) 리버스 트랜스크립타제, 예컨대 비제한적으로 라우스 육종 바이러스 (RSV) 리버스 트랜스크립타제, 조류 골수모구증 바이러스 (AMV) 리버스 트랜스크립타제, 조류 적모구증 바이러스 (AEV) 헬퍼 바이러스 MCAV 리버스 트랜스크립타제, 조류 골수구종증 바이러스 MC29 헬퍼 바이러스 MCAV 리버스 트랜스크립타제, 조류 세망내피증 바이러스 (REV-T) 헬퍼 바이러스 REV-A 리버스 트랜스크립타제, 조류 육종 바이러스 UR2 헬퍼 바이러스 UR2AV 리버스 트랜스크립타제, 조류 육종 바이러스 Y73 헬퍼 바이러스 YAV 리버스 트랜스크립타제, 라우스 연관 바이러스 (RAV) 리버스 트랜스크립타제, 및 골수모구증 연관 바이러스 (MAV) 리버스 트랜스크립타제를 포함하나 이에 제한되지는 않는 야생형 리버스 트랜스크립타제가 본원에 기재된 대상 방법 및 조성물에 적합하게 사용될 수 있다는 것을 인식할 것이다.
예시적인 야생형 RT 효소는 하기와 같다:
Figure pct00048
Figure pct00049
Figure pct00050
(b) 변이체 RT
다양한 실시양태에서, 리버스 트랜스크립타제는 변이체 리버스 트랜스크립타제일 수 있다. 본원에 사용된 "변이체 리버스 트랜스크립타제"는 참조 서열 (예를 들어, 참조 야생형 서열)에 비해 1개 이상의 돌연변이 (단일 돌연변이, 역위, 결실, 삽입, 및 재배열 포함)를 포함하는 임의의 자연 발생 또는 유전자 조작된 변이체를 포함한다. RT는 자연적으로 RNA-의존성 DNA 폴리머라제 활성, 리보뉴클레아제 H 활성, 및 DNA-의존성 DNA 폴리머라제 활성을 비롯한 여러 활성을 갖는다. 집합적으로, 이들 활성은 효소가 단일 가닥 RNA를 이중 가닥 cDNA로 전환시킬 수 있게 한다. 레트로바이러스 및 레트로트랜스포손에서, 이러한 cDNA는 이어서 숙주 게놈 내로 통합될 수 있고, 이로부터 숙주-세포 전사를 통해 새로운 RNA 카피가 제조될 수 있다. 변이체 RT는 이들 활성 중 1종 이상에 영향을 미치는 (이들 활성을 감소 또는 증가시키거나, 또는 이들 활성을 모두 함께 제거하는) 돌연변이를 포함할 수 있다. 또한, 변이체 RT는 RT를 더 안정하게 또는 덜 안정하게 하고, 응집 경향을 낮추고, 정제 및/또는 검출, 및/또는 특성 또는 특징의 다른 변형을 용이하게 하는 1개 이상의 돌연변이를 포함할 수 있다.
관련 기술분야의 통상의 기술자는 몰로니 뮤린 백혈병 바이러스 (M-MLV); 인간 면역결핍 바이러스 (HIV) 리버스 트랜스크립타제 및 조류 육종-백혈증 바이러스 (ASLV) 리버스 트랜스크립타제, 예컨대 비제한적으로 라우스 육종 바이러스 (RSV) 리버스 트랜스크립타제, 조류 골수모구증 바이러스 (AMV) 리버스 트랜스크립타제, 조류 적모구증 바이러스 (AEV) 헬퍼 바이러스 MCAV 리버스 트랜스크립타제, 조류 골수구종증 바이러스 MC29 헬퍼 바이러스 MCAV 리버스 트랜스크립타제, 조류 세망내피증 바이러스 (REV-T) 헬퍼 바이러스 REV-A 리버스 트랜스크립타제, 조류 육종 바이러스 UR2 헬퍼 바이러스 UR2AV 리버스 트랜스크립타제, 조류 육종 바이러스 Y73 헬퍼 바이러스 YAV 리버스 트랜스크립타제, 라우스 연관 바이러스 (RAV) 리버스 트랜스크립타제, 및 골수모구증 연관 바이러스 (MAV) 리버스 트랜스크립타제를 포함하나 이에 제한되지는 않는 다른 리버스 트랜스크립타제로부터 유래된 변이체 리버스 트랜스크립타제가 본원에 기재된 대상 방법 및 조성물에 적합하게 사용될 수 있다는 것을 인식할 것이다.
변이체 RT를 제조하는 하나의 방법은 유전자 변형에 의한 (예를 들어, 야생형 리버스 트랜스크립타제의 DNA 서열을 변형시키는 것에 의한) 것이다. DNA 서열의 무작위 돌연변이 뿐만 아니라 표적화된 돌연변이를 허용하는 다수의 방법이 관련 기술분야에 공지되어 있다 (예를 들어, 문헌 [Ausubel et al., Short Protocols in Molecular Biology (1995) 3.sup.rd Ed. John Wiley & Sons, Inc.] 참조). 또한, 통상적인 방법 및 PCR-기반 방법 둘 다를 포함한 부위-지정 돌연변이유발을 위한 다수의 상업적으로 입수가능한 키트가 존재한다. 예는 퀵체인지(QuikChange) 부위-지정 돌연변이유발 키트 (애질런트(AGILENT)®), Q5® 부위-지정 돌연변이유발 키트 (뉴 잉글랜드 바이오랩스(NEW ENGLAND BIOLABS)®), 및 진아트(GeneArt)™ 부위-지정 돌연변이유발 시스템 (써모피셔 사이언티픽(THERMOFISHER SCIENTIFIC)®)을 포함한다.
또한, 돌연변이체 리버스 트랜스크립타제는 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 공지된 방법론에 따라 삽입 돌연변이 또는 말단절단 (N-말단, 내부, 또는 C-말단 삽입 또는 말단절단)에 의해 생성될 수 있다. 본원에 사용된 용어 "돌연변이"는 서열, 예를 들어 핵산 또는 아미노산 서열 내의 잔기의 또 다른 잔기로의 치환, 또는 서열 내의 1개 이상의 잔기의 결실 또는 삽입을 지칭한다. 돌연변이는 전형적으로 원래 잔기를 확인한 다음, 서열 내의 잔기의 위치를 확인하고, 새로 치환된 잔기의 정체를 확인하는 것에 의해 본원에 기재된다. 본원에 제공된 아미노산 치환 (돌연변이)을 제조하는 다양한 방법은 관련 기술분야에 널리 공지되어 있고, 예를 들어 문헌 [Green and Sambrook, Molecular Cloning: A Laboratory Manual (4th ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (2012))]에 의해 제공된다. 돌연변이는 다양한 카테고리, 예컨대 단일 염기 다형성, 미세중복 영역, indel, 및 역위를 포함할 수 있고, 이는 어떠한 방식으로도 제한하는 것으로 의도되지 않는다. 돌연변이는 단백질 활성을 감소시키거나 제거하는 돌연변이의 정상적인 결과인 "기능 상실" 돌연변이를 포함할 수 있다. 대부분의 기능 상실 돌연변이는 열성이며, 이는 이형접합체에서 제2 염색체 카피가 그의 존재가 돌연변이의 효과를 보상하는 완전 기능적 단백질을 코딩하는 유전자의 비돌연변이된 버전을 보유하기 때문이다. 돌연변이는 또한 정상 상태에서는 달리 존재하지 않는 단백질 또는 세포에 비정상적 활성을 부여하는 것인 "기능 획득" 돌연변이를 포괄한다. 많은 기능 획득 돌연변이는 코딩 영역보다는 조절 서열에 존재하고, 따라서 다수의 결과를 가질 수 있다. 예를 들어, 돌연변이는 1개 이상의 유전자가 잘못된 조직에서 발현되게 할 수 있고, 이들 조직은 정상적으로는 결여되어 있는 기능을 얻는다. 그의 속성으로 인해, 기능 획득 돌연변이는 통상적으로 우성이다.
관련 기술분야에 공지된 부위-지정 돌연변이유발의 보다 오래된 방법은 단일 가닥 DNA 주형의 단리를 가능하게 하는 벡터, 예컨대 M13 박테리오파지 벡터 내로의 돌연변이시킬 서열의 서브-클로닝에 의존한다. 이들 방법에서, 돌연변이유발 프라이머 (즉, 돌연변이시킬 부위에 어닐링할 수 있지만 돌연변이시킬 부위에 1개 이상의 미스매치된 뉴클레오티드를 보유할 수 있는 프라이머)를 단일 가닥 주형에 어닐링시킨 후, 돌연변이유발 프라이머의 3' 단부로부터 출발하여 주형의 상보체를 중합시킨다. 이어서, 생성된 듀플렉스로 숙주 박테리아를 형질전환시키고, 목적하는 돌연변이에 대해 플라크를 스크리닝한다.
보다 최근에, 부위-지정 돌연변이유발은 단일 가닥 주형을 필요로 하지 않는 이점을 갖는 PCR 방법론을 이용하였다. 또한, 서브클로닝을 필요로 하지 않는 방법이 개발되었다. PCR-기반 부위-지정 돌연변이유발이 수행될 때 여러 이슈가 고려되어야 한다. 첫번째로, 이들 방법에서, 폴리머라제에 의해 도입된 바람직하지 않은 돌연변이의 확장을 방지하기 위해 PCR 사이클의 수를 감소시키는 것이 바람직하다. 두번째로, 반응에서 지속되는 비-돌연변이된 모 분자의 수를 감소시키기 위해 선택이 사용되어야 한다. 세번째로, 단일 PCR 프라이머 세트의 사용을 허용하기 위해 연장-길이 PCR 방법이 바람직하다. 그리고 네번째로, 일부 열안정성 폴리머라제의 비-주형-의존성 말단 연장 활성으로 인해, PCR-생성된 돌연변이체 생성물의 평활-말단 라이게이션 전에 말단-폴리싱 단계를 절차에 혼입시키는 것이 종종 필요하다.
1개 이상의 무작위로 위치한 돌연변이를 보유하는 돌연변이체 패널을 생성할 무작위 돌연변이유발 방법이 관련 기술분야에 존재한다. 이어서, 이러한 돌연변이체 패널을 대상으로 하여, 야생형 리버스 트랜스크립타제에 비해 목적하는 특성, 예를 들어 증가된 안정성을 나타내는 것에 관하여 스크리닝할 수 있다.
무작위 돌연변이유발 방법의 예는 소위 "오류-유발 PCR 방법"이다. 명칭이 암시하는 바와 같이, 방법은 DNA 폴리머라제가 고충실도 혼입을 지지하지 않는 조건 하에서 주어진 서열을 증폭시킨다. 상이한 DNA 폴리머라제에 대한 오류-유발 혼입을 촉진하는 조건은 다양하지만, 관련 기술분야의 통상의 기술자는 주어진 효소에 대한 이러한 조건을 결정할 수 있다. 많은 DNA 폴리머라제에 대한 증폭의 충실도에서의 핵심 변수는, 예를 들어 완충제 중 2가 금속 이온의 유형 및 농도이다. 따라서, 망가니즈 이온의 사용 및/또는 마그네슘 또는 망가니즈 이온 농도의 변경은 폴리머라제의 오류율에 영향을 미치도록 적용될 수 있다.
다양한 측면에서, 프라임 편집제의 RT는 "오류-유발" 리버스 트랜스크립타제 변이체일 수 있다. 관련 기술분야에 공지되고/거나 이용가능한 오류-유발 리버스 트랜스크립타제가 사용될 수 있다. 또한, RT는 방향적 진화 과정, 예컨대 파지-보조 연속 진화 (PACE) 또는 파지-보조 비연속 진화 (PANCE)를 포함한 임의의 이전에 언급된 돌연변이유발 방법을 사용하여 제조될 수 있다. 본원에 사용된 용어 "파지-보조 연속 진화 (PACE)"는 바이러스 벡터로서 파지를 사용하는 연속 진화를 지칭한다. PACE 기술의 일반적 개념은, 예를 들어 2010년 3월 11일에 WO 2010/028347로서 공개된, 2009년 9월 8일에 출원된 국제 PCT 출원 PCT/US2009/056194; 2012년 6월 28일에 WO 2012/088381로서 공개된, 2011년 12월 22일에 출원된 국제 PCT 출원 PCT/US2011/066747; 2015년 5월 5일에 허여된 미국 출원, 미국 특허 번호 9,023,594, 2015년 9월 11일에 WO 2015/134121로서 공개된, 2015년 1월 20일에 출원된 국제 PCT 출원 PCT/US2015/012022, 및 2016년 10월 20일에 WO 2016/168631로서 공개된, 2016년 4월 15일에 출원된 국제 PCT 출원 PCT/US2016/027795에 기재되어 있으며, 이들 각각의 전체 내용은 본원에 참조로 포함된다. 오류-유발 리버스 트랜스크립타제는 또한 파지-보조 비-연속적 진화 (PANCE)에 의해 수득될 수 있고, 이는 본원에 사용된 바와 같이, 바이러스 벡터로서 파지를 사용하는 비-연속 진화를 지칭한다. PANCE는 새로운 이. 콜라이 숙주 세포를 가로질러 진화시킬 관심 유전자를 함유하는 진화 '선택 파지' (SP)의 연속 플라스크 전달을 사용하여 숙주 이. 콜라이 내부의 유전자는 일정하게 유지되게 하는 한편 SP 내에 함유된 유전자가 연속적으로 진화하게 하는, 신속한 생체내 방향적 진화를 위한 단순화된 기술이다. 연속 플라스크 전달은 오랫동안 미생물의 실험실 진화를 위한 폭넓게 접근가능한 접근법으로서의 역할을 하였고, 보다 최근에는 박테리오파지 진화를 위한 유사한 접근법이 개발되었다. PANCE 시스템은 PACE 시스템보다 더 낮은 엄격도를 특색으로 한다.
돌연변이유발 또는 진화적 과정에 의해 생성된 목적하는 돌연변이체 리버스 트랜스크립타제에 대한 유전자를 서열분석하여 돌연변이의 부위 및 개수를 확인할 수 있다. 1개 초과의 돌연변이를 포함하는 그러한 돌연변이체에 대해, 주어진 돌연변이의 효과는 특정한 돌연변이체가 보유하는 다른 돌연변이와 별개로 부위-지정 돌연변이유발에 의한 야생형 유전자에의 확인된 돌연변이의 도입에 의해 평가될 수 있다. 이어서, 이와 같이 생산된 단일 돌연변이체의 스크리닝 검정은 그러한 돌연변이 단독의 효과의 결정을 가능하게 할 것이다.
본원에 사용된 변이체 RT 효소는 또한 임의의 야생형 RT, 또는 돌연변이체 RT, 또는 단편 RT, 또는 본원에서 개시되거나 고려되거나 또는 관련 기술분야에 공지된 RT의 다른 변이체를 포함한 임의의 참조 RT 단백질과 적어도 약 70% 동일한, 적어도 약 80% 동일한, 적어도 약 90% 동일한, 적어도 약 95% 동일한, 적어도 약 96% 동일한, 적어도 약 97% 동일한, 적어도 약 98% 동일한, 적어도 약 99% 동일한, 적어도 약 99.5% 동일한, 또는 적어도 약 99.9% 동일한 다른 "RT 변이체"를 포함할 수 있다.
일부 실시양태에서, RT 변이체는 참조 RT와 비교하여 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 21, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50개, 또는 최대 100개, 또는 최대 200개, 또는 최대 300개, 또는 최대 400개, 또는 최대 500개 또는 그 초과의 아미노산 변화를 가질 수 있다. 일부 실시양태에서, RT 변이체는 참조 RT의 상응하는 단편과 적어도 약 70% 동일하거나, 적어도 약 80% 동일하거나, 적어도 약 90% 동일하거나, 적어도 약 95% 동일하거나, 적어도 약 96% 동일하거나, 적어도 약 97% 동일하거나, 적어도 약 98% 동일하거나, 적어도 약 99% 동일하거나, 적어도 약 99.5% 동일하거나, 또는 적어도 약 99.9% 동일한 참조 RT의 단편을 포함한다. 일부 실시양태에서, 단편은 상응하는 야생형 RT (예를 들어, 서열식별번호: 1361485)의 아미노산 길이의 적어도 30%, 적어도 35%, 적어도 40%, 적어도 45%, 적어도 50%, 적어도 55%, 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 적어도 99.5%이다.
일부 실시양태에서, 개시내용은 또한 그의 기능성을 보유하고 임의의 본원에 개시된 RT 단백질의 단편인 RT 단편을 이용할 수 있다. 일부 실시양태에서, RT 단편은 적어도 100개 아미노산 길이이다. 일부 실시양태에서, 단편은 적어도 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550개, 또는 최대 600개 또는 그 초과의 아미노산 길이이다.
또 다른 실시양태에서, 개시내용은 또한 충분한 폴리머라제 기능을 여전히 보유하는 말단절단된 변이체를 생성하는, 특정 수의 아미노산만큼 N-말단 또는 C-말단, 또는 둘 다에서 말단절단된 RT 변이체를 이용할 수 있다. 일부 실시양태에서, RT 말단절단된 변이체는 단백질의 N-말단 단부에서 적어도 1, 적어도 2, 적어도 3, 적어도 4, 적어도 5, 적어도 6, 적어도 7, 적어도 8, 적어도 9, 적어도 10, 적어도 11, 적어도 12, 적어도 13, 적어도 14, 적어도 15, 적어도 16, 적어도 17, 적어도 18, 적어도 19, 적어도 20, 적어도 21, 적어도 22, 적어도 23, 적어도 24, 적어도 25, 적어도 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 210, 220, 230, 240, 또는 250개의 아미노산의 말단절단을 갖는다. 다른 실시양태에서, RT 말단절단된 변이체는 단백질의 C-말단 단부에서 적어도 1, 적어도 2, 적어도 3, 적어도 4, 적어도 5, 적어도 6, 적어도 7, 적어도 8, 적어도 9, 적어도 10, 적어도 11, 적어도 12, 적어도 13, 적어도 14, 적어도 15, 적어도 16, 적어도 17, 적어도 18, 적어도 19, 적어도 20, 적어도 21, 적어도 22, 적어도 23, 적어도 24, 적어도 25, 적어도 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 210, 220, 230, 240, 또는 250개의 아미노산의 말단절단을 갖는다. 또 다른 실시양태에서, RT 말단절단된 변이체는 N-말단 및 C-말단 단부에서 동일하거나 상이한 길이의 말단절단을 갖는다.
예를 들어, 본원에 개시된 프라임 편집제는 M-MLV 리버스 트랜스크립타제의 말단절단된 버전을 포함할 수 있다. 이러한 실시양태에서, 리버스 트랜스크립타제는 4개의 돌연변이를 함유한다 (D200N, T306K, W313F, T330P; PE2에 존재하는 L603W 돌연변이는 말단절단으로 인해 더 이상 존재하지 않음에 주목). 이러한 말단절단된 편집제를 코딩하는 DNA 서열은 PE2보다 522 bp 더 작고, 따라서 DNA 서열의 전달이 그의 크기로 인해 도전과제인 적용 (즉, 아데노-연관 바이러스 및 렌티바이러스 전달)에서 잠재적으로 유용하게 한다. 이러한 실시양태는 MMLV-RT(trunc)로 지칭되고, 하기 아미노산 서열을 갖는다:
Figure pct00051
다양한 실시양태에서, 본원에 개시된 프라임 편집제는 하기와 같이 기재된 Cas9 변이체 중 하나, 또는 임의의 참조 RT 변이체와 적어도 약 70% 동일한, 적어도 약 80% 동일한, 적어도 약 90% 동일한, 적어도 약 95% 동일한, 적어도 약 96% 동일한, 적어도 약 97% 동일한, 적어도 약 98% 동일한, 적어도 약 99% 동일한, 적어도 약 99.5% 동일한, 또는 적어도 약 99.9% 동일한 그의 RT 변이체를 포함할 수 있다.
다른 오류-유발 리버스 트랜스크립타제가 문헌에 기재되어 있고, 이들 각각은 본원의 방법 및 조성물에 사용하기 위해 고려된다. 예를 들어, 오류-유발 리버스 트랜스크립타제는 문헌 [Bebenek et al., "Error-prone Polymerization by HIV-1 Reverse Transcriptase," J Biol Chem, 1993, Vol. 268: 10324-10334 및 Sebastian-Martin et al., "Transcriptional inaccuracy threshold attenuates differences in RNA-dependent DNA synthesis fidelity between retroviral reverse transcriptases," Scientific Reports, 2018, Vol. 8: 627]에 기재되어 있고, 이들 각각은 참조로 포함된다. 또한, 오류-유발 리버스 트랜스크립타제를 비롯한 리버스 트랜스크립타제는 모두 뉴 잉글랜드 바이오랩스®로부터의 것인 프로토스크립트(ProtoScript)® (II) 리버스 트랜스크립타제, AMV 리버스 트랜스크립타제, 웜스타트(WarmStart)® 리버스 트랜스크립타제, 및 M-MuLV 리버스 트랜스크립타제, 또는 모두 다카라 바이오 유에스에이, 인크.(TAKARA BIO USA, INC.) (이전의 클론테크(CLONTECH))로부터의 것인 AMV 리버스 트랜스크립타제 XL, 스마트스크라이브(SMARTScribe) 리버스 트랜스크립타제, GPR 초순수 MMLV 리버스 트랜스크립타제를 포함하여 상업적 공급업체로부터 입수할 수 있다.
또 다른 실시양태에서, 본 발명의 방법 및 조성물은 그 내용이 본원에 참조로 포함되는 문헌 [Effefson et al., "Synthetic evolutionary origin of a proofreading reverse transcriptase," Science, June 24, 2016, Vol. 352: 1590-1593]에 기재된 바와 같은, 리버스 트랜스크립타제로 진화된 DNA 폴리머라제를 이용할 수 있다.
일부 실시양태에서, 리버스 트랜스크립타제는 napDNAbp를 또한 포함하는 융합 단백질의 성분으로서 제공된다. 다시 말해서, 일부 실시양태에서, 리버스 트랜스크립타제는 융합 단백질로서 napDNAbp에 융합된다.
본 개시내용의 다양한 실시양태에 따른 napDNAbp 단백질에 융합될 수 있거나 또는 개별 단백질로서 제공될 수 있는 일부 예시적인 리버스 트랜스크립타제가 하기 제공된다. 예시적인 리버스 트랜스크립타제는 하기 야생형 효소 또는 부분 효소와 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 또는 적어도 99% 서열 동일성을 갖는 변이체를 포함한다:
Figure pct00052
Figure pct00053
Figure pct00054
Figure pct00055
Figure pct00056
다양한 실시양태에서, 본원에 기재된 프라임 편집제 (RT는 융합 파트너로서 또는 트랜스로 제공됨)는 서열식별번호: 1361485의 야생형 M-MLV RT에서 또는 또 다른 야생형 RT 폴리펩티드 서열에서의 상응하는 아미노산 위치에서 하기 돌연변이: P51L, S67K, E69K, L139P, T197A, D200N, H204R, F209N, E302K, E302R, T306K, F309N, W313F, T330P, L345G, L435G, N454K, D524G, E562Q, D583N, H594Q, L603W, E607K, 또는 D653N 중 1개 이상을 포함하는 변이체 RT를 포함할 수 있다.
다양한 다른 실시양태에서, 본원에 기재된 프라임 편집제 (RT는 융합 파트너로서 또는 트랜스로 제공됨)는 서열식별번호: 1361485의 야생형 M-MLV RT에서 또는 또 다른 야생형 RT 폴리펩티드 서열에서의 상응하는 아미노산 위치에서 하기 돌연변이: P51X, S67X, E69X, L139X, T197X, D200X, H204X, F209X, E302X, T306X, F309X, W313X, T330X, L345X, L435X, N454X, D524X, E562X, D583X, H594X, L603X, E607X, 또는 D653X 중 1개 이상을 포함하는 변이체 RT를 포함할 수 있으며, 여기서 "X"는 임의의 아미노산일 수 있다.
다양한 다른 실시양태에서, 본원에 기재된 프라임 편집제 (RT는 융합 파트너로서 또는 트랜스로 제공됨)는 서열식별번호: 1361485의 야생형 M-MLV RT에서 또는 또 다른 야생형 RT 폴리펩티드 서열에서의 상응하는 아미노산 위치에서 P51X 돌연변이를 포함하는 변이체 RT를 포함할 수 있으며, 여기서 "X"는 임의의 아미노산일 수 있다. 일부 실시양태에서, X는 L이다.
다양한 다른 실시양태에서, 본원에 기재된 프라임 편집제 (RT는 융합 파트너로서 또는 트랜스로 제공됨)는 서열식별번호: 1361485의 야생형 M-MLV RT에서 또는 또 다른 야생형 RT 폴리펩티드 서열에서의 상응하는 아미노산 위치에서 S67X 돌연변이를 포함하는 변이체 RT를 포함할 수 있으며, 여기서 "X"는 임의의 아미노산일 수 있다. 일부 실시양태에서, X는 K이다.
다양한 다른 실시양태에서, 본원에 기재된 프라임 편집제 (RT는 융합 파트너로서 또는 트랜스로 제공됨)는 서열식별번호: 1361485의 야생형 M-MLV RT에서 또는 또 다른 야생형 RT 폴리펩티드 서열에서의 상응하는 아미노산 위치에서 E69X 돌연변이를 포함하는 변이체 RT를 포함할 수 있으며, 여기서 "X"는 임의의 아미노산일 수 있다. 일부 실시양태에서, X는 K이다.
다양한 다른 실시양태에서, 본원에 기재된 프라임 편집제 (RT는 융합 파트너로서 또는 트랜스로 제공됨)는 서열식별번호: 1361485의 야생형 M-MLV RT에서 또는 또 다른 야생형 RT 폴리펩티드 서열에서의 상응하는 아미노산 위치에서 L139X 돌연변이를 포함하는 변이체 RT를 포함할 수 있으며, 여기서 "X"는 임의의 아미노산일 수 있다. 일부 실시양태에서, X는 P이다.
다양한 다른 실시양태에서, 본원에 기재된 프라임 편집제 (RT는 융합 파트너로서 또는 트랜스로 제공됨)는 서열식별번호: 1361485의 야생형 M-MLV RT에서 또는 또 다른 야생형 RT 폴리펩티드 서열에서의 상응하는 아미노산 위치에서 T197X 돌연변이를 포함하는 변이체 RT를 포함할 수 있으며, 여기서 "X"는 임의의 아미노산일 수 있다. 일부 실시양태에서, X는 A이다.
다양한 다른 실시양태에서, 본원에 기재된 프라임 편집제 (RT는 융합 파트너로서 또는 트랜스로 제공됨)는 서열식별번호: 1361485의 야생형 M-MLV RT에서 또는 또 다른 야생형 RT 폴리펩티드 서열에서의 상응하는 아미노산 위치에서 D200X 돌연변이를 포함하는 변이체 RT를 포함할 수 있으며, 여기서 "X"는 임의의 아미노산일 수 있다. 일부 실시양태에서, X는 N이다.
다양한 다른 실시양태에서, 본원에 기재된 프라임 편집제 (RT는 융합 파트너로서 또는 트랜스로 제공됨)는 서열식별번호: 1361485의 야생형 M-MLV RT에서 또는 또 다른 야생형 RT 폴리펩티드 서열에서의 상응하는 아미노산 위치에서 H204X 돌연변이를 포함하는 변이체 RT를 포함할 수 있으며, 여기서 "X"는 임의의 아미노산일 수 있다. 일부 실시양태에서, X는 R이다.
다양한 다른 실시양태에서, 본원에 기재된 프라임 편집제 (RT는 융합 파트너로서 또는 트랜스로 제공됨)는 서열식별번호: 1361485의 야생형 M-MLV RT에서 또는 또 다른 야생형 RT 폴리펩티드 서열에서의 상응하는 아미노산 위치에서 F209X 돌연변이를 포함하는 변이체 RT를 포함할 수 있으며, 여기서 "X"는 임의의 아미노산일 수 있다. 일부 실시양태에서, X는 N이다.
다양한 다른 실시양태에서, 본원에 기재된 프라임 편집제 (RT는 융합 파트너로서 또는 트랜스로 제공됨)는 서열식별번호: 1361485의 야생형 M-MLV RT에서 또는 또 다른 야생형 RT 폴리펩티드 서열에서의 상응하는 아미노산 위치에서 E302X 돌연변이를 포함하는 변이체 RT를 포함할 수 있으며, 여기서 "X"는 임의의 아미노산일 수 있다. 일부 실시양태에서, X는 K이다.
다양한 다른 실시양태에서, 본원에 기재된 프라임 편집제 (RT는 융합 파트너로서 또는 트랜스로 제공됨)는 서열식별번호: 1361485의 야생형 M-MLV RT에서 또는 또 다른 야생형 RT 폴리펩티드 서열에서의 상응하는 아미노산 위치에서 E302X 돌연변이를 포함하는 변이체 RT를 포함할 수 있으며, 여기서 "X"는 임의의 아미노산일 수 있다. 일부 실시양태에서, X는 R이다.
다양한 다른 실시양태에서, 본원에 기재된 프라임 편집제 (RT는 융합 파트너로서 또는 트랜스로 제공됨)는 서열식별번호: 1361485의 야생형 M-MLV RT에서 또는 또 다른 야생형 RT 폴리펩티드 서열에서의 상응하는 아미노산 위치에서 T306X 돌연변이를 포함하는 변이체 RT를 포함할 수 있으며, 여기서 "X"는 임의의 아미노산일 수 있다. 일부 실시양태에서, X는 K이다.
다양한 다른 실시양태에서, 본원에 기재된 프라임 편집제 (RT는 융합 파트너로서 또는 트랜스로 제공됨)는 서열식별번호: 1361485의 야생형 M-MLV RT에서 또는 또 다른 야생형 RT 폴리펩티드 서열에서의 상응하는 아미노산 위치에서 F309X 돌연변이를 포함하는 변이체 RT를 포함할 수 있으며, 여기서 "X"는 임의의 아미노산일 수 있다. 일부 실시양태에서, X는 N이다.
다양한 다른 실시양태에서, 본원에 기재된 프라임 편집제 (RT는 융합 파트너로서 또는 트랜스로 제공됨)는 서열식별번호: 1361485의 야생형 M-MLV RT에서 또는 또 다른 야생형 RT 폴리펩티드 서열에서의 상응하는 아미노산 위치에서 W313X 돌연변이를 포함하는 변이체 RT를 포함할 수 있으며, 여기서 "X"는 임의의 아미노산일 수 있다. 일부 실시양태에서, X는 F이다.
다양한 다른 실시양태에서, 본원에 기재된 프라임 편집제 (RT는 융합 파트너로서 또는 트랜스로 제공됨)는 서열식별번호: 1361485의 야생형 M-MLV RT에서 또는 또 다른 야생형 RT 폴리펩티드 서열에서의 상응하는 아미노산 위치에서 T330X 돌연변이를 포함하는 변이체 RT를 포함할 수 있으며, 여기서 "X"는 임의의 아미노산일 수 있다. 일부 실시양태에서, X는 P이다.
다양한 다른 실시양태에서, 본원에 기재된 프라임 편집제 (RT는 융합 파트너로서 또는 트랜스로 제공됨)는 서열식별번호: 1361485의 야생형 M-MLV RT에서 또는 또 다른 야생형 RT 폴리펩티드 서열에서의 상응하는 아미노산 위치에서 L345X 돌연변이를 포함하는 변이체 RT를 포함할 수 있으며, 여기서 "X"는 임의의 아미노산일 수 있다. 일부 실시양태에서, X는 G이다.
다양한 다른 실시양태에서, 본원에 기재된 프라임 편집제 (RT는 융합 파트너로서 또는 트랜스로 제공됨)는 서열식별번호: 1361485의 야생형 M-MLV RT에서 또는 또 다른 야생형 RT 폴리펩티드 서열에서의 상응하는 아미노산 위치에서 L435X 돌연변이를 포함하는 변이체 RT를 포함할 수 있으며, 여기서 "X"는 임의의 아미노산일 수 있다. 일부 실시양태에서, X는 G이다.
다양한 다른 실시양태에서, 본원에 기재된 프라임 편집제 (RT는 융합 파트너로서 또는 트랜스로 제공됨)는 서열식별번호: 1361485의 야생형 M-MLV RT에서 또는 또 다른 야생형 RT 폴리펩티드 서열에서의 상응하는 아미노산 위치에서 N454X 돌연변이를 포함하는 변이체 RT를 포함할 수 있으며, 여기서 "X"는 임의의 아미노산일 수 있다. 일부 실시양태에서, X는 K이다.
다양한 다른 실시양태에서, 본원에 기재된 프라임 편집제 (RT는 융합 파트너로서 또는 트랜스로 제공됨)는 서열식별번호: 1361485의 야생형 M-MLV RT에서 또는 또 다른 야생형 RT 폴리펩티드 서열에서의 상응하는 아미노산 위치에서 D524X 돌연변이를 포함하는 변이체 RT를 포함할 수 있으며, 여기서 "X"는 임의의 아미노산일 수 있다. 일부 실시양태에서, X는 G이다.
다양한 다른 실시양태에서, 본원에 기재된 프라임 편집제 (RT는 융합 파트너로서 또는 트랜스로 제공됨)는 서열식별번호: 1361485의 야생형 M-MLV RT에서 또는 또 다른 야생형 RT 폴리펩티드 서열에서의 상응하는 아미노산 위치에서 E562X 돌연변이를 포함하는 변이체 RT를 포함할 수 있으며, 여기서 "X"는 임의의 아미노산일 수 있다. 일부 실시양태에서, X는 Q이다.
다양한 다른 실시양태에서, 본원에 기재된 프라임 편집제 (RT는 융합 파트너로서 또는 트랜스로 제공됨)는 서열식별번호: 1361485의 야생형 M-MLV RT에서 또는 또 다른 야생형 RT 폴리펩티드 서열에서의 상응하는 아미노산 위치에서 D583X 돌연변이를 포함하는 변이체 RT를 포함할 수 있으며, 여기서 "X"는 임의의 아미노산일 수 있다. 일부 실시양태에서, X는 N이다.
다양한 다른 실시양태에서, 본원에 기재된 프라임 편집제 (RT는 융합 파트너로서 또는 트랜스로 제공됨)는 서열식별번호: 1361485의 야생형 M-MLV RT에서 또는 또 다른 야생형 RT 폴리펩티드 서열에서의 상응하는 아미노산 위치에서 H594X 돌연변이를 포함하는 변이체 RT를 포함할 수 있으며, 여기서 "X"는 임의의 아미노산일 수 있다. 일부 실시양태에서, X는 Q이다.
다양한 다른 실시양태에서, 본원에 기재된 프라임 편집제 (RT는 융합 파트너로서 또는 트랜스로 제공됨)는 서열식별번호: 1361485의 야생형 M-MLV RT에서 또는 또 다른 야생형 RT 폴리펩티드 서열에서의 상응하는 아미노산 위치에서 L603X 돌연변이를 포함하는 변이체 RT를 포함할 수 있으며, 여기서 "X"는 임의의 아미노산일 수 있다. 일부 실시양태에서, X는 W이다.
다양한 다른 실시양태에서, 본원에 기재된 프라임 편집제 (RT는 융합 파트너로서 또는 트랜스로 제공됨)는 서열식별번호: 1361485의 야생형 M-MLV RT에서 또는 또 다른 야생형 RT 폴리펩티드 서열에서의 상응하는 아미노산 위치에서 E607X 돌연변이를 포함하는 변이체 RT를 포함할 수 있으며, 여기서 "X"는 임의의 아미노산일 수 있다. 일부 실시양태에서, X는 K이다.
다양한 다른 실시양태에서, 본원에 기재된 프라임 편집제 (RT는 융합 파트너로서 또는 트랜스로 제공됨)는 서열식별번호: 1361485의 야생형 M-MLV RT에서 또는 또 다른 야생형 RT 폴리펩티드 서열에서의 상응하는 아미노산 위치에서 D653X 돌연변이를 포함하는 변이체 RT를 포함할 수 있으며, 여기서 "X"는 임의의 아미노산일 수 있다. 일부 실시양태에서, X는 N이다.
본원에 기재된 프라임 편집제 (PE) 시스템은 하기 미국 특허 (이들 각각은 그 전문이 참조로 포함됨): 미국 특허 번호 10,202,658; 10,189,831; 10,150,955; 9,932,567; 9,783,791; 9,580,698; 9,534,201; 및 9,458,484 중 임의의 것에 기재되어 있거나 개시된 임의의 공중 이용가능한 리버스 트랜스크립타제, 및 돌연변이를 설치하는 것에 대한 공지된 방법 또는 단백질을 진화시키는 것에 대한 공지된 방법을 사용하여 제조될 수 있는 그의 임의의 변이체를 고려한다. 하기 참고문헌은 관련 기술분야의 리버스 트랜스크립타제를 기재한다. 각각의 그의 개시내용은 그 전문이 본원에 참조로 포함된다.
Figure pct00057
Figure pct00058
Figure pct00059
리버스 트랜스크립타제에 관한 상기 언급된 참고문헌 중 임의의 것은, 이미 언급되지 않은 한, 그 전문이 본원에 참조로 포함된다.
D. PE 융합 단백질
본원에 기재된 프라임 편집제 (PE) 시스템은 napDNAbp 및 폴리머라제 (예를 들어, DNA-의존성 DNA 폴리머라제 또는 RNA-의존성 DNA 폴리머라제, 예컨대 리버스 트랜스크립타제)를 포함하고, 임의로 링커에 의해 연결된 융합 단백질을 고려한다. 본 출원은 단일 융합 단백질로 조합될 임의의 적합한 napDNAbp 및 폴리머라제 (예를 들어, DNA-의존성 DNA 폴리머라제 또는 RNA-의존성 DNA 폴리머라제, 예컨대 리버스 트랜스크립타제)를 고려한다. napDNAbp 및 폴리머라제 (예를 들어, DNA-의존성 DNA 폴리머라제 또는 RNA-의존성 DNA 폴리머라제, 예컨대 리버스 트랜스크립타제)의 예는 각각 본원에 규정된다. 폴리머라제는 관련 기술분야에 널리 공지되어 있고, 아미노산 서열은 용이하게 이용가능하기 때문에, 본 개시내용은 어떠한 방식으로도 본원에서 확인된 그러한 특정 폴리머라제로 제한되는 것으로 의도되지 않는다.
다양한 실시양태에서, 융합 단백질은 임의의 적합한 구조적 구성을 포함할 수 있다. 예를 들어, 융합 단백질은 N-말단에서 C-말단 방향으로 napDNAbp-융합-폴리머라제 (예를 들어, DNA-의존성 DNA 폴리머라제 또는 RNA-의존성 DNA 폴리머라제, 예컨대 리버스 트랜스크립타제)를 포함할 수 있다. 다른 실시양태에서, 융합 단백질은 N-말단에서 C-말단 방향으로 폴리머라제 (예를 들어, 리버스 트랜스크립타제)-융합-napDNAbp를 포함할 수 있다. 융합된 도메인은 임의로 링커, 예를 들어 아미노산 서열에 의해 연결될 수 있다. 다른 실시양태에서, 융합 단백질은 구조 NH2-[napDNAbp]-[폴리머라제]-COOH; 또는 NH2-[폴리머라제]-[napDNAbp]-COOH를 포함할 수 있으며, 여기서 각각의 경우의 "]-["는 임의적인 링커 서열의 존재를 나타낸다. 폴리머라제가 리버스 트랜스크립타제인 실시양태에서, 융합 단백질은 구조 NH2-[napDNAbp]-[RT]-COOH; 또는 NH2-[RT]-[napDNAbp]-COOH를 포함할 수 있으며, 여기서 각각의 경우의 "]-["는 임의적인 링커 서열의 존재를 나타낸다.
예시적인 융합 단백질이 도 14에 도시되어 있으며, 이는 링커 서열을 통해 닉카제 Cas9 ("Cas9(H840A)")에 융합된 MLV 리버스 트랜스크립타제 ("MLV-RT")를 포함하는 융합 단백질을 보여준다. 이러한 예는 본원에 기재된 프라임 편집제 (PE) 시스템에 이용될 수 있는 융합 단백질의 범주를 제한하는 것으로 의도되지 않는다.
다양한 실시양태에서, 프라임 편집제 융합 단백질은 H840A 돌연변이를 포함하는 Cas9 변이체 (즉, Cas9 닉카제) 및 M-MLV RT 야생형, 뿐만 아니라 Cas9 닉카제 도메인의 C-말단을 RT 도메인의 N-말단에 연결하는 N-말단 NLS 서열 (19개 아미노산) 및 아미노산 링커 (32개 아미노산)를 포함하는 하기 아미노산 서열 (본원에서 "PE1"로 지칭됨)을 가질 수 있다. PE1 융합 단백질은 하기 구조를 갖는다: [NLS]-[Cas9(H840A)]-[링커]-[MMLV_RT(wt)]. PE1 및 그의 개별 성분의 아미노산 서열은 하기와 같다:
Figure pct00060
또 다른 실시양태에서, 프라임 편집제 융합 단백질은 H840A 돌연변이를 포함하는 Cas9 변이체 (즉, Cas9 닉카제) 및 돌연변이 D200N, T330P, L603W, T306K, 및 W313F를 포함하는 M-MLV RT, 뿐만 아니라 Cas9 닉카제 도메인의 C-말단을 RT 도메인의 N-말단에 연결하는 N-말단 NLS 서열 (19개 아미노산) 및 아미노산 링커 (33개 아미노산)를 포함하는 하기 아미노산 서열 (본원에서 "PE2"로 지칭됨)을 가질 수 있다. PE2 융합 단백질은 하기 구조를 갖는다: [NLS]-[Cas9(H840A)]-[링커]-[MMLV_RT(D200N)(T330P)(L603W)(T306K)(W313F)]. PE2의 아미노산 서열은 하기와 같다:
Figure pct00061
또 다른 실시양태에서, 프라임 편집제 융합 단백질은 하기 아미노산 서열을 가질 수 있다:
Figure pct00062
Figure pct00063
Figure pct00064
다양한 실시양태에서, 본원에서 고려되는 프라임 편집제 융합 단백질은 또한 PE1, PE2, 또는 상기 표시된 프라임 편집제 융합 서열 중 임의의 것과 적어도 약 70% 동일한, 적어도 약 80% 동일한, 적어도 약 90% 동일한, 적어도 약 95% 동일한, 적어도 약 96% 동일한, 적어도 약 97% 동일한, 적어도 약 98% 동일한, 적어도 약 99% 동일한, 적어도 약 99.5% 동일한, 또는 적어도 약 99.9% 동일한 아미노산 서열을 갖는 상기 개시된 서열의 임의의 변이체를 포함할 수 있다.
일부 실시양태에서, 링커는 본 발명의 펩티드 또는 펩티드 도메인 또는 모이어티 중 임의의 것을 연결하는데 사용될 수 있다 (예를 들어, 리버스 트랜스크립타제에 연결되거나 융합된 napDNAbp).
다른 실시양태에서, 프라임 편집제 융합 단백질은 변경된 PAM 특이성을 갖는 SaCas9 또는 SpCas9 닉카제, 예컨대 하기 예시적인 서열에 기초할 수 있다:
Figure pct00065
Figure pct00066
또 다른 실시양태에서, 본원에서 고려되는 프라임 편집제 융합 단백질은 M-MLV 리버스 트랜스크립타제의 말단절단된 버전에 융합된 Cas9 닉카제 (예를 들어, Cas9 (H840A))를 포함할 수 있다. 이러한 실시양태에서, 리버스 트랜스크립타제는 또한 4개의 돌연변이를 함유한다 (D200N, T306K, W313F, T330P; PE2에 존재하는 L603W 돌연변이는 말단절단으로 인해 더 이상 존재하지 않음에 주목). 이러한 말단절단된 편집제를 코딩하는 DNA 서열은 PE2보다 522 bp 더 작고, 따라서 DNA 서열의 전달이 그의 크기로 인해 도전과제인 적용 (즉, 아데노-연관 바이러스 및 렌티바이러스 전달)에서 잠재적으로 유용하게 한다. 이러한 실시양태는 Cas9(H840A)-MMLV-RT(trunc) 또는 "PE2-짧은 형" 또는 "PE2-trunc"로서 지칭되고, 하기 아미노산 서열을 갖는다:
Figure pct00067
다양한 세포주에서의 상이한 표적 부위에 대한 PE2, PE2-trunc, PE3, 및 PE3-trunc의 효율 (즉, "명시된 편집 또는 indel을 갖는 총 서열분석 판독물의 %")을 비교한 막대 그래프를 제공하는 도 36을 참조한다. 데이터는 말단절단된 RT 변이체를 포함하는 프라임 편집제가 약 비-말단절단된 RT 단백질을 포함하는 프라임 편집제만큼 효율적이었음을 보여준다.
다양한 실시양태에서, 본원에서 고려되는 프라임 편집제 융합 단백질은 또한 PE1, PE2, 또는 상기 표시된 프라임 편집제 융합 서열 중 임의의 것과 적어도 약 70% 동일한, 적어도 약 80% 동일한, 적어도 약 90% 동일한, 적어도 약 95% 동일한, 적어도 약 96% 동일한, 적어도 약 97% 동일한, 적어도 약 98% 동일한, 적어도 약 99% 동일한, 적어도 약 99.5% 동일한, 또는 적어도 약 99.9% 동일한 아미노산 서열을 갖는 상기 개시된 서열의 임의의 변이체를 포함할 수 있다.
특정 실시양태에서, 링커는 본 발명의 펩티드 또는 펩티드 도메인 또는 모이어티 중 임의의 것을 연결하는데 사용될 수 있다 (예를 들어, 리버스 트랜스크립타제에 연결되거나 융합된 napDNAbp).
E. 링커 및 다른 융합 단백질 도메인
PE 융합 단백질은 napDNAbp (예를 들어, Cas9 도메인) 및 폴리머라제 도메인 (예를 들어, RT 도메인) 이외의 다양한 다른 도메인을 포함할 수 있다. 예를 들어, napDNAbp가 Cas9이고 폴리머라제가 RT인 경우에, PE 융합 단백질은 Cas9 도메인을 RT 도메인과 연결하는 1개 이상의 링커를 포함할 수 있다. 링커는 또한 다른 기능적 도메인, 예컨대 핵 국재화 서열 (NLS) 또는 FEN1 (또는 다른 플랩 엔도뉴클레아제)을 PE 융합 단백질 또는 그의 도메인에 연결할 수 있다.
(i) 링커
상기 정의된 바와 같이, 본원에 사용된 용어 "링커"는 2개의 분자 또는 모이어티, 예를 들어 뉴클레아제의 절단 도메인 및 결합 도메인을 연결하는 화학적 기 또는 분자를 지칭한다. 일부 실시양태에서, 링커는 RNA-프로그램가능한 뉴클레아제의 gRNA 결합 도메인과 폴리머라제 (예를 들어, 리버스 트랜스크립타제)의 촉매 도메인을 연결한다. 일부 실시양태에서, 링커는 dCas9 및 리버스 트랜스크립타제를 연결한다. 전형적으로, 링커는 2개의 기, 분자, 또는 다른 모이어티 사이에 위치하거나 또는 그에 플랭킹하고, 공유 결합을 통해 서로 연결하여, 2개를 연결한다. 일부 실시양태에서, 링커는 아미노산 또는 복수의 아미노산 (예를 들어, 펩티드 또는 단백질)이다. 일부 실시양태에서, 링커는 유기 분자, 기, 중합체, 또는 화학적 모이어티이다. 일부 실시양태에서, 링커는 5-100개 아미노산 길이, 예를 들어, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 30-35, 35-40, 40-45, 45-50, 50-60, 60-70, 70-80, 80-90, 90-100, 100-150, 또는 150-200개 아미노산 길이이다. 보다 길거나 보다 짧은 링커가 또한 고려된다.
링커는 공유 결합만큼 단순할 수 있거나, 또는 많은 원자 길이의 중합체 링커일 수 있다. 일부 실시양태에서, 링커는 폴리펩티드이거나 또는 아미노산을 기초로 한다. 다른 실시양태에서, 링커는 펩티드-유사가 아니다. 일부 실시양태에서, 링커는 공유 결합 (예를 들어, 탄소-탄소 결합, 디술피드 결합, 탄소-헤테로원자 결합 등)이다. 일부 실시양태에서, 링커는 아미드 연결의 탄소-질소 결합이다. 일부 실시양태에서, 링커는 시클릭 또는 비-시클릭, 치환 또는 비치환, 분지형 또는 비분지형 지방족 또는 헤테로지방족 링커이다. 일부 실시양태에서, 링커는 중합체 (예를 들어, 폴리에틸렌, 폴리에틸렌 글리콜, 폴리아미드, 폴리에스테르 등)이다. 일부 실시양태에서, 링커는 아미노알칸산의 단량체, 이량체, 또는 중합체를 포함한다. 일부 실시양태에서, 링커는 아미노알칸산 (예를 들어, 글리신, 에탄산, 알라닌, 베타-알라닌, 3-아미노프로판산, 4-아미노부탄산, 5-펜탄산 등)을 포함한다. 일부 실시양태에서, 링커는 아미노헥산산 (Ahx)의 단량체, 이량체, 또는 중합체를 포함한다. 일부 실시양태에서, 링커는 카르보시클릭 모이어티 (예를 들어, 시클로펜탄, 시클로헥산)를 기초로 한다. 다른 실시양태에서, 링커는 폴리에틸렌 글리콜 모이어티 (PEG)를 포함한다. 다른 실시양태에서, 링커는 아미노산을 포함한다. 일부 실시양태에서, 링커는 펩티드를 포함한다. 일부 실시양태에서, 링커는 아릴 또는 헤테로아릴 모이어티를 포함한다. 일부 실시양태에서, 링커는 페닐 고리를 기초로 한다. 링커는 펩티드로부터 링커로의 친핵체 (예를 들어, 티올, 아미노)의 부착을 용이하게 하기 위해 관능화된 모이어티를 포함할 수 있다. 임의의 친전자체가 링커의 일부로서 사용될 수 있다. 예시적인 친전자체는 활성화된 에스테르, 활성화된 아미드, 마이클 수용자, 알킬 할라이드, 아릴 할라이드, 아실 할라이드, 및 이소티오시아네이트를 포함하나 이에 제한되지는 않는다.
일부 다른 실시양태에서, 링커는 아미노산 서열 (GGGGS)n (서열식별번호: 1361520), (G)n (서열식별번호: 1361521), (EAAAK)n (서열식별번호: 1361522), (GGS)n (서열식별번호: 1361523), (SGGS)n (서열식별번호: 1361524), (XP)n (서열식별번호: 1361525), 또는 그의 임의의 조합을 포함하고, 여기서 n은 독립적으로 1 내지 30의 정수이고, 여기서 X는 임의의 아미노산이다. 일부 실시양태에서, 링커는 아미노산 서열 (GGS)n (서열식별번호: 1361526)을 포함하고, 여기서 n은 1, 3, 또는 7이다. 일부 실시양태에서, 링커는 아미노산 서열 SGSETPGTSESATPES (서열식별번호: 1361527)를 포함한다. 일부 실시양태에서, 링커는 아미노산 서열 SGGSSGGSSGSETPGTSESATPESSGGSSGGS (서열식별번호: 1361528)를 포함한다. 일부 실시양태에서, 링커는 아미노산 서열 SGGSGGSGGS (서열식별번호: 1361529)를 포함한다. 일부 실시양태에서, 링커는 아미노산 서열 SGGS (서열식별번호: 1361530)를 포함한다.
특히, 프라임 편집제 도메인을 서로 연결하기 위해 다양한 실시양태에서 하기 링커가 사용될 수 있다:
GGS;
GGSGGS (서열식별번호: 1361523);
GGSGGSGGS (서열식별번호: 1361523);
SGGSSGGSSGSETPGTSESATPESSGGSSGGSS (서열식별번호: 1361528);
SGSETPGTSESATPES (서열식별번호: 1361527);
SGGSSGGSSGSETPGTSESATPESAGSYPYDVPDYAGSAAPAAKKKKLDGSGSGGSSGGS (서열식별번호: 1361585).
(ii) 핵 국재화 서열 (NLS)
다양한 실시양태에서, PE 융합 단백질은 단백질의 세포 핵으로의 전위를 촉진하는 것을 돕는 1개 이상의 핵 국재화 서열 (NLS)을 포함할 수 있다. 이러한 서열은 관련 기술분야에 널리 공지되어 있고, 하기 예를 포함할 수 있다:
Figure pct00068
상기 NLS 예는 비제한적이다. PE 융합 단백질은 문헌 [Cokol et al., "Finding nuclear localization signals," EMBO Rep., 2000, 1(5): 411-415 and Freitas et al., "Mechanisms and Signals for the Nuclear Import of Proteins," Current Genomics, 2009, 10(8): 550-7]에 기재된 것 중 임의의 것을 비롯한 임의의 공지된 NLS 서열을 포함할 수 있으며, 이들 각각은 본원에 참조로 포함된다.
다양한 실시양태에서, 프라임 편집제 및 본원에 개시된 프라임 편집제를 코딩하는 구축물은 1개 이상, 바람직하게는 적어도 2개의 핵 국재화 신호를 추가로 포함한다. 특정 실시양태에서, 프라임 편집제는 적어도 2개의 NLS를 포함한다. 적어도 2개의 NLS를 갖는 실시양태에서, NLS는 동일한 NLS일 수 있거나 또는 상이한 NLS일 수 있다. 또한, NLS는 프라임 편집제의 나머지 부분과의 융합 단백질의 일부로서 발현될 수 있다. 일부 실시양태에서, NLS 중 1개 이상은 2부분 NLS ("bpNLS")이다. 특정 실시양태에서, 개시된 융합 단백질은 2개의 2부분 NLS를 포함한다. 일부 실시양태에서, 개시된 융합 단백질은 2개 초과의 2부분 NLS를 포함한다.
NLS 융합체의 위치는 프라임 편집제의 N-말단, C-말단, 또는 서열 내일 수 있다 (예를 들어, 코딩된 napDNAbp 성분 (예를 들어, Cas9)과 폴리머라제 도메인 (예를 들어, 리버스 트랜스크립타제 도메인) 사이에 삽입됨).
NLS는 관련 기술분야의 임의의 공지된 NLS 서열일 수 있다. NLS는 또한 핵 국재화를 위한 임의의 추후-발견될 NLS일 수 있다. NLS는 또한 임의의 자연 발생 NLS, 또는 임의의 비-자연 발생 NLS (예를 들어, 1개 이상의 목적하는 돌연변이를 갖는 NLS)일 수 있다.
용어 "핵 국재화 서열" 또는 "NLS"는, 예를 들어 핵 수송에 의해 세포 핵 내로의 단백질의 유입을 촉진하는 아미노산 서열을 지칭한다. 핵 국재화 서열은 관련 기술분야에 공지되어 있고, 통상의 기술자에게 명백할 것이다. 예를 들어, NLS 서열은 2001년 5월 31일에 WO/2001/038547로서 공개된 2000년 11월 23일에 출원된 국제 PCT 출원 PCT/EP2000/011690 (Plank et al.)에 기재되어 있으며, 그의 내용은 본원에 참조로 포함된다. 일부 실시양태에서, NLS는 아미노산 서열 PKKKRKV (서열식별번호: 1361531), MDSLLMNRRKFLYQFKNVRWAKGRRETYLC (서열식별번호: 1361533), KRTADGSEFESPKKKRKV (서열식별번호: 1361659), 또는 KRTADGSEFEPKKKRKV (서열식별번호: 1361660)를 포함한다. 다른 실시양태에서, NLS는 아미노산 서열 NLSKRPAAIKKAGQAKKKK (서열식별번호: 1361661), PAAKRVKLD (서열식별번호: 1361536), RQRRNELKRSF (서열식별번호: 1361662), NQSSNFGPMKGGNFGGRSSGPYGGGGQYFAKPRNQGGY (서열식별번호: 1361663)를 포함한다.
개시내용의 한 측면에서, 프라임 편집제는 1개 이상의 핵 국재화 신호 (NLS), 바람직하게는 적어도 2개의 NLS로 변형될 수 있다. 특정 실시양태에서, 프라임 편집제는 2개 이상의 NLS로 변형된다. 개시내용은 개시내용의 시점에 관련 기술분야에 공지된 임의의 핵 국재화 신호, 또는 본 출원 시점 후에 최신 기술에서 확인되거나 또는 달리 이용가능하게 된 임의의 핵 국재화 신호의 사용을 고려한다. 대표적인 핵 국재화 신호는 서열이 발현될 세포의 핵으로 단백질을 지시하는 펩티드 서열이다. 핵 국재화 신호는 우세하게 염기성이고, 단백질의 아미노산 서열의 거의 어디에나 위치할 수 있고, 일반적으로 4개의 아미노산 (문헌 [Autieri & Agrawal, (1998) J. Biol. Chem. 273: 14731-37], 본원에 참조로 포함됨) 내지 8개의 아미노산의 짧은 서열을 포함하고, 전형적으로 리신 및 아르기닌 잔기가 풍부하다 (문헌 [Magin et al., (2000) Virology 274: 11-16], 본원에 참조로 포함됨). 핵 국재화 신호는 종종 프롤린 잔기를 포함한다. 다양한 핵 국재화 신호가 확인되었고, 생물학적 분자를 세포질로부터 세포의 핵으로 수송하는데 사용되었다. 예를 들어, 문헌 [Tinland et al., (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 89:7442-46; Moede et al., (1999) FEBS Lett. 461:229-34]을 참조하고, 이는 참조로 포함된다. 전위는 현재 핵공 단백질을 수반하는 것으로 생각된다.
대부분의 NLS는 3개의 일반적 군으로 분류될 수 있다: (i) SV40 대형 T 항원 NLS에 의해 예시되는 1부분 NLS (PKKKRKV (서열식별번호: 1361531)); (ii) 가변적 수의 스페이서 아미노산에 의해 분리되고, 크세노푸스(Xenopus) 뉴클레오플라스민 NLS에 의해 예시되는 2개의 염기성 도메인으로 이루어진 2부분 모티프 (KRXXXXXXXXXXKKKL (서열식별번호: 1361664)); 및 (iii) 비정규 서열, 예컨대 hnRNP Al 단백질의 M9, 인플루엔자 바이러스 핵단백질 NLS, 및 효모 Gal4 단백질 NLS (Dingwall and Laskey 1991).
핵 국재화 신호는 단백질의 아미노산 서열 내의 다양한 지점에서 나타난다. NLS는 단백질의 N-말단, C-말단 및 중심 영역에서 확인되었다. 따라서, 개시내용은 프라임 편집제의 C-말단, N-말단, 뿐만 아니라 내부 영역에서 1개 이상의 NLS로 변형될 수 있는 프라임 편집제를 제공한다. 성분 NLS 잔기로서 기능하지 않는 보다 긴 서열의 잔기는 핵 국재화 신호 자체를 예를 들어 장성에 의해 또는 입체적으로 방해하지 않도록 선택되어야 한다. 따라서, NLS-포함 서열의 조성에 대한 엄격한 제한은 없지만, 실제로, 이러한 서열은 길이 및 조성이 기능적으로 제한될 수 있다.
본 개시내용은 1개 이상의 NLS를 포함하도록 프라임 편집제를 변형시키는 임의의 적합한 수단을 고려한다. 한 측면에서, 프라임 편집제는 그의 N-말단 또는 그의 C-말단 (또는 둘 다)에서 1개 이상의 NLS에 번역상 융합된 프라임 편집제 단백질을 발현하도록, 즉 프라임 편집제-NLS 융합 구축물을 형성하도록 조작될 수 있다. 다른 실시양태에서, 프라임 편집제-코딩 뉴클레오티드 서열은 코딩된 프라임 편집제의 내부 영역에 1개 이상의 NLS를 코딩하는 리딩 프레임이 혼입되도록 유전자 변형될 수 있다. 또한, NLS는 프라임 편집제와 N-말단, C-말단, 또는 내부-부착된 NLS 아미노산 서열 사이에, 예를 들어 단백질의 중심 영역에, 코딩된 다양한 아미노산 링커 또는 스페이서 영역을 포함할 수 있다. 따라서, 본 개시내용은 또한 프라임 편집제 및 1개 이상의 NLS를 포함하는 융합 단백질을 발현시키기 위한 뉴클레오티드 구축물, 벡터, 및 숙주 세포를 제공한다.
본원에 기재된 프라임 편집제는 또한 1개 이상의 링커, 예를 들어, 및 중합체, 아미노산, 핵산, 폴리사카라이드, 화학적, 또는 핵산 링커 요소를 통해 프라임 편집제에 연결된 핵 국재화 신호를 포함할 수 있다. 개시내용의 고려되는 범주 내의 링커는 어떠한 제한을 갖는 것으로 의도되지 않으며, 임의의 적합한 유형의 분자 (예를 들어, 중합체, 아미노산, 폴리사카라이드, 핵산, 지질, 또는 임의의 합성 화학적 링커 도메인)일 수 있고, 프라임 편집제와 1개 이상의 NLS 사이에 결합 (예를 들어, 공유 연결, 수소 결합) 형성을 유발하는 임의의 적합한 전략에 의해 프라임 편집제에 연결될 수 있다.
(iii) 플랩 엔도뉴클레아제 (예를 들어, FEN1)
다양한 실시양태에서, PE 융합 단백질은 5' 단일 가닥 DNA 플랩의 제거를 촉매하는 효소를 지칭하는 플랩 엔도뉴클레아제 (예를 들어, FEN1)를 1개 이상 포함할 수 있다. 이는 DNA 복제를 비롯한 세포 과정 동안 형성된 5' 플랩의 제거를 프로세싱하는 자연 발생 효소이다. 본원에 기재된 프라임 편집 방법은 프라임 편집 동안 표적 부위에 형성된 내인성 DNA의 5' 플랩을 제거하기 위해 내인성으로 공급된 플랩 엔도뉴클레아제 또는 트랜스로 제공된 것을 이용할 수 있다. 플랩 엔도뉴클레아제는 관련 기술분야에 공지되어 있고, 문헌 [Patel et al., "Flap endonucleases pass 5'-flaps through a flexible arch using a disorder-thread-order mechanism to confer specificity for free 5'-ends," Nucleic Acids Research, 2012, 40(10): 4507-4519 및 Tsutakawa et al., "Human flap endonuclease structures, DNA double-base flipping, and a unified understanding of the FEN1 superfamily," Cell, 2011, 145(2): 198-211] (이들 각각은 본원에 참조로 포함됨)에 기재된 바와 같이 찾아볼 수 있다. 예시적인 플랩 엔도뉴클레아제는 하기 아미노산 서열로 표시될 수 있는 FEN1이다:
Figure pct00069
플랩 엔도뉴클레아제는 또한 임의의 FEN1 변이체, 돌연변이체, 또는 다른 플랩 엔도뉴클레아제 오르토로그, 상동체, 또는 변이체를 포함할 수 있다. 비제한적 예는 하기와 같다:
Figure pct00070
다양한 실시양태에서, 본원에서 고려되는 프라임 편집제 융합 단백질은 상기 서열 중 임의의 것과 적어도 약 70% 동일한, 적어도 약 80% 동일한, 적어도 약 90% 동일한, 적어도 약 95% 동일한, 적어도 약 96% 동일한, 적어도 약 97% 동일한, 적어도 약 98% 동일한, 적어도 약 99% 동일한, 적어도 약 99.5% 동일한, 또는 적어도 약 99.9% 동일한 아미노산 서열을 갖는 상기 개시된 서열의 임의의 플랩 엔도뉴클레아제 변이체를 포함할 수 있다.
5' 단부 단일 가닥 DNA 플랩의 제거를 용이하게 하기 위해 본 방법에 의해 이용될 수 있는 다른 엔도뉴클레아제는 (1) trex 2, (2) exo1 엔도뉴클레아제 (예를 들어, Keijzers et al., Biosci Rep. 2015, 35(3): e00206)를 포함하나 이에 제한되지는 않는다.
Trex 2
3' 3개의 프라임 복구 엑소뉴클레아제 2 (TREX2) - 인간
수탁 번호 NM_080701
Figure pct00071
3' 3개의 프라임 복구 엑소뉴클레아제 2 (TREX2) - 마우스
수탁 번호 NM_011907
Figure pct00072
3' 3개의 프라임 복구 엑소뉴클레아제 2 (TREX2) - 래트
수탁 번호 NM_001107580
Figure pct00073
ExoI
인간 엑소뉴클레아제 1 (EXO1)은 DNA 미스매치 복구 (MMR), 마이크로-매개 단부-연결, 상동 재조합 (HR), 및 복제를 포함한 많은 상이한 DNA 대사 과정에 연루되어 왔다. 인간 EXO1은 진핵 뉴클레아제 패밀리인 Rad2/XPG에 속하며, 이는 또한 FEN1 및 GEN1을 포함한다. Rad2/XPG 패밀리는 파지에서 인간까지의 종에 걸쳐 뉴클레아제 도메인에서 보존된다. EXO1 유전자 생성물은 5' 엑소뉴클레아제 및 5' 플랩 활성 둘 다를 나타낸다. 추가적으로, EXO1은 내재적 5' RNase H 활성을 함유한다. 인간 EXO1은 이중 가닥 DNA (dsDNA), 닉, 갭, 슈도 Y 구조를 프로세싱하는데 높은 친화도를 갖고, 그의 유전성 플랩 활성을 사용하여 홀리데이 접합부를 분해할 수 있다. 인간 EXO1은 MMR에 연루되며, MLH1 및 MSH2와 직접 상호작용하는 보존된 결합 도메인을 함유한다. EXO1 핵산분해 활성은 PCNA, MutSα (MSH2/MSH6 복합체), 14-3-3, MRN 및 9-1-1 복합체에 의해 양으로 자극된다.
엑소뉴클레아제 1 (EXO1) 수탁 번호 NM_003686 (호모 사피엔스(Homo sapiens) 엑소뉴클레아제 1 (EXO1), 전사체 변이체 3) - 이소형 A
Figure pct00074
엑소뉴클레아제 1 (EXO1) 수탁 번호 NM_006027 (호모 사피엔스 엑소뉴클레아제 1 (EXO1), 전사체 변이체 3) - 이소형 B
Figure pct00075
엑소뉴클레아제 1 (EXO1) 수탁 번호 NM_001319224 (호모 사피엔스 엑소뉴클레아제 1 (EXO1), 전사체 변이체 4) - 이소형 C
Figure pct00076
(iv) 인테인 및 분할-인테인
일부 실시양태 (예를 들어, AAV 입자를 사용한 생체내 프라임 편집제의 전달)에서, 폴리펩티드 (예를 들어, 데아미나제 또는 napDNAbp) 또는 융합 단백질 (예를 들어, 프라임 편집제)을 N-말단 절반 및 C-말단 절반으로 분할하고, 이를 개별적으로 전달한 다음, 그것을 공동국재화시켜 세포 내에서 완전한 단백질 (또는 경우에 따라 융합 단백질)을 재형성하도록 하는 것이 유리할 수 있음이 이해될 것이다. 단백질 또는 융합 단백질의 별개의 절반은 단백질 트랜스 스플라이싱의 메카니즘에 의한 완전한 단백질 또는 융합 단백질의 재형성을 용이하게 하기 위해 각각 분할-인테인 태그를 포함할 수 있다.
분할 인테인에 의해 촉매되는 단백질 트랜스-스플라이싱은 단백질 라이게이션을 위한 전적으로 효소적인 방법을 제공한다. 분할-인테인은 본질적으로 각각 N-인테인 및 C-인테인으로 명명되는 2개의 조각으로 분할된 인접 인테인 (예를 들어 미니-인테인)이다. 분할 인테인의 N-인테인 및 C-인테인은 비-공유적으로 회합되어 활성 인테인을 형성하고, 인접 인테인과 본질적으로 동일한 방식으로 스플라이싱 반응을 촉매할 수 있다. 분할 인테인은 자연에서 발견되었고, 또한 실험실에서 조작되었다. 본원에 사용된 용어 "분할 인테인"은 N-말단 및 C-말단 서열이 트랜스-스플라이싱 반응에 대해 기능적인 인테인으로 비-공유적으로 재회합 또는 재구성될 수 있는 별개의 분자가 되도록 N-말단 및 C-말단 아미노산 서열 사이에 1개 이상의 펩티드 결합 파괴가 존재하는 임의의 인테인을 지칭한다. 임의의 촉매 활성 인테인 또는 그의 단편은 본 발명의 방법에 사용하기 위한 분할 인테인을 유도하는데 사용될 수 있다. 예를 들어, 한 측면에서 분할 인테인은 진핵 인테인으로부터 유래될 수 있다. 또 다른 측면에서, 분할 인테인은 박테리아 인테인으로부터 유래될 수 있다. 또 다른 측면에서, 분할 인테인은 고세균 인테인으로부터 유래될 수 있다. 바람직하게는, 이와 같이 유래된 분할 인테인은 트랜스-스플라이싱 반응을 촉매하는데 필수적인 아미노산 서열만을 보유할 것이다.
본원에 사용된 "N-말단 분할 인테인 (In)"은 트랜스-스플라이싱 반응에 대해 기능적인 N-말단 아미노산 서열을 포함하는 임의의 인테인 서열을 지칭한다. 따라서, In은 또한 트랜스-스플라이싱이 발생할 때 스플라이싱되는 서열을 포함한다. In은 자연 발생 인테인 서열의 N-말단 부분의 변형인 서열을 포함할 수 있다. 예를 들어, In은, 추가의 및/또는 돌연변이된 잔기의 포함이 In을 트랜스-스플라이싱에서 비-기능적으로 만들지 않는 한, 이러한 추가의 아미노산 잔기 및/또는 돌연변이된 잔기를 포함할 수 있다. 바람직하게는, 추가의 및/또는 돌연변이된 잔기의 포함은 In의 트랜스-스플라이싱 활성을 개선 또는 증진시킨다.
본원에 사용된 "C-말단 분할 인테인 (Ic)"은 트랜스-스플라이싱 반응에 대해 기능적인 C-말단 아미노산 서열을 포함하는 임의의 인테인 서열을 지칭한다. 한 측면에서, Ic는 4 내지 7개의 인접 아미노산 잔기를 포함하고, 이 중 적어도 4개의 아미노산은 그가 유래된 인테인의 마지막 β-가닥으로부터의 것이다. 따라서, Ic는 또한 트랜스-스플라이싱이 발생할 때 스플라이싱되는 서열을 포함한다. Ic는 자연 발생 인테인 서열의 C-말단 부분의 변형인 서열을 포함할 수 있다. 예를 들어, Ic는, 추가의 및/또는 돌연변이된 잔기의 포함이 In을 트랜스-스플라이싱에서 비-기능적으로 만들지 않는 한, 이러한 추가의 아미노산 잔기 및/또는 돌연변이된 잔기를 포함할 수 있다. 바람직하게는, 추가의 및/또는 돌연변이된 잔기의 포함은 Ic의 트랜스-스플라이싱 활성을 개선 또는 증진시킨다.
본 발명의 일부 실시양태에서, Ic 또는 In에 연결된 펩티드는 특히 형광 기, 비오틴, 폴리에틸렌 글리콜 (PEG), 아미노산 유사체, 비천연 아미노산, 포스페이트 기, 글리코실 기, 방사성동위원소 표지, 및 제약 분자를 포함한 추가의 화학적 모이어티를 포함할 수 있다. 다른 실시양태에서, Ic에 연결된 펩티드는 특히 케톤, 알데히드, Cys 잔기 및 Lys 잔기를 포함하는 1개 이상의 화학적 반응성 기를 포함할 수 있다. 분할 인테인의 N-인테인 및 C-인테인은 비-공유적으로 회합되어 활성 인테인을 형성하고, "인테인-스플라이싱 폴리펩티드 (ISP)"가 존재하는 경우에 스플라이싱 반응을 촉매할 수 있다. 본원에 사용된 "인테인-스플라이싱 폴리펩티드 (ISP)"는 Ic, In, 또는 둘 다가 분할 인테인으로부터 제거될 때 남는 분할 인테인의 아미노산 서열의 부분을 지칭한다. 특정 실시양태에서, In은 ISP를 포함한다. 또 다른 실시양태에서, Ic는 ISP를 포함한다. 또 다른 실시양태에서, ISP는 In에도 Ic에도 공유 연결되지 않은 별개의 펩티드이다.
분할 인테인은 미니-인테인의 구조에서 발견되는 -12개의 보존된 베타-가닥 사이의 비구조화된 루프 또는 개재 아미노산 서열 내의 1개 이상의 분할 부위를 조작함으로써 인접 인테인으로부터 생성될 수 있다. 분할의 생성이 단백질 스플라이싱 활성이 상실되는데 충분한 정도로 인테인, 특히 구조화된 베타-가닥의 구조를 파괴하지 않을 것이라면, 베타-가닥 사이의 영역 내의 분할 부위의 위치에 일부 유연성이 존재할 수 있다.
단백질 트랜스-스플라이싱에서, 하나의 전구체 단백질은 N-엑스테인 부분에 이어 N-인테인으로 이루어지고, 또 다른 전구체 단백질은 C-인테인 부분에 이어 C-엑스테인으로 이루어지고, 트랜스-스플라이싱 반응 (N- 및 C-인테인에 의해 함께 촉매됨)은 2개의 인테인 서열을 절제하고, 2개의 엑스테인 서열을 펩티드 결합으로 연결한다. 효소 반응인 단백질 트랜스-스플라이싱은 매우 낮은 (예를 들어, 마이크로몰) 농도의 단백질로 작용할 수 있고, 생리학적 조건 하에 수행될 수 있다.
예시적인 서열은 하기와 같다:
리간드-의존성 인테인의 명칭 서열
2-4 인테인:
Figure pct00077
3-2 인테인
Figure pct00078
30R3-1 인테인
Figure pct00079
30R3-2 인테인
Figure pct00080
30R3-3 인테인
Figure pct00081
37R3-1 인테인
Figure pct00082
37R3-2 인테인
Figure pct00083
37R3-3 인테인
Figure pct00084
인테인은 가장 빈번하게는 인접 도메인으로서 발견되지만, 일부는 자연 분할 형태로 존재한다. 이러한 경우에, 2개의 단편은 별개의 폴리펩티드로서 발현되고, 이는 스플라이싱, 소위 단백질 트랜스-스플라이싱이 일어나기 전에 회합되어야 한다.
예시적인 분할 인테인은 2개의 서브유닛, 즉 DnaE-N 및 DnaE-C를 포함하는 Ssp DnaE 인테인이다. 2개의 상이한 서브유닛은 별개의 유전자, 즉 각각 DnaE-N 및 DnaE-C 서브유닛을 코딩하는 dnaE-n 및 dnaE-c에 의해 코딩된다. DnaE는 시네코시스티스 종 PCC6803의 자연 발생 분할 인테인이고, 각각 DnaE-N 또는 DnaE-C와의 융합체를 포함한 2개의 별개의 단백질의 트랜스-스플라이싱을 지시할 수 있다.
추가의 자연 발생 또는 조작된 분할-인테인 서열은 관련 기술분야에 공지되어 있거나, 또는 본원에 기재된 전체-인테인 서열 또는 관련 기술분야에서 입수가능한 것으로부터 제조될 수 있다. 분할-인테인 서열의 예는 문헌 [Stevens et al., "A promiscuous split intein with expanded protein engineering applications," PNAS, 2017, Vol.114: 8538-8543; Iwai et al., "Highly efficient protein trans-splicing by a naturally split DnaE intein from Nostc punctiforme, FEBS Lett, 580: 1853-1858]에서 찾아볼 수 있으며, 이들 각각은 본원에 참조로 포함된다. 추가의 분할 인테인 서열은, 예를 들어 WO 2013/045632, WO 2014/055782, WO 2016/069774, 및 EP2877490에서 찾아볼 수 있으며, 이들 각각의 내용은 본원에 참조로 포함된다.
또한, 생체내 및 시험관내 트랜스로의 단백질 스플라이싱이 기재되어 있으며 (Shingledecker, et al., Gene 207:187 (1998), Southworth, et al., EMBO J. 17:918 (1998); Mills, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 95:3543-3548 (1998); Lew, et al., J. Biol. Chem., 273:15887-15890 (1998); Wu, et al., Biochim. Biophys. Acta 35732:1 (1998b), Yamazaki, et al., J. Am. Chem. Soc. 120:5591 (1998), Evans, et al., J. Biol. Chem. 275:9091 (2000); Otomo, et al., Biochemistry 38:16040-16044 (1999); Otomo, et al., J. Biolmol. NMR 14:105-114 (1999); Scott, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96:13638-13643 (1999)), 이는 예를 들어 2개의 개별적으로-발현된 절반으로부터 완전한 PE 융합 단백질의 형성에 관하여 도 66 및 67에 제시된 바와 같이, 기능적 생성물을 형성하기 위해 후속적으로 라이게이션을 거치는 2개의 불활성 단편에 대해 단백질로서의 발현 기회를 제공한다.
(v) RNA-단백질 동원 시스템
다양한 실시양태에서, 2개의 별개의 단백질 도메인 (예를 들어, Cas9 도메인 및 폴리머라제 도메인)은 "RNA-단백질 동원 시스템", 예컨대 "MS2 태그부착 기술"을 사용함으로써 서로 공동국재화되어 기능적 복합체 (2개의 별개의 단백질 도메인을 포함하는 융합 단백질의 기능과 유사함)를 형성할 수 있다. 이러한 시스템은 일반적으로 하나의 단백질 도메인은 "RNA-단백질 상호작용 도메인" (일명 "RNA-단백질 동원 도메인")으로, 다른 것은 RNA-단백질 상호작용 도메인, 예를 들어 특정 헤어핀 구조를 특이적으로 인식하고 그에 결합하는 "RNA-결합 단백질"로 태그부착한다. 이들 유형의 시스템은 프라임 편집제의 도메인을 공동국재화하기 위해서뿐만 아니라 프라임 편집제, 예컨대 UGI 도메인에 추가의 기능성을 동원하기 위해 활용될 수 있다. 한 예에서, MS2 태그부착 기술은 MS2 박테리오파지 코트 단백질 ("MCP" 또는 "MS2cp")과 파지의 게놈에 존재하는 스템-루프 또는 헤어핀 구조, 즉 "MS2 헤어핀"의 자연 상호작용에 기초한다. MS2 헤어핀의 경우에, 이는 MS2 박테리오파지 코트 단백질 (MCP)에 의해 인식되고 결합된다. 따라서, 하나의 예시적인 시나리오에서 데아미나제-MS2 융합체는 Cas9-MCP 융합체를 동원할 수 있다.
다른 모듈 RNA-단백질 상호작용 도메인의 검토는 관련 기술분야에, 예를 들어 문헌 [Johansson et al., "RNA recognition by the MS2 phage coat protein," Sem Virol., 1997, Vol. 8(3): 176-185; Delebecque et al., "Organization of intracellular reactions with rationally designed RNA assemblies," Science, 2011, Vol. 333: 470-474; Mali et al., "Cas9 transcriptional activators for target specificity screening and paired nickases for cooperative genome engineering," Nat. Biotechnol., 2013, Vol.31: 833-838; 및 Zalatan et al., "Engineering complex synthetic transcriptional programs with CRISPR RNA scaffolds," Cell, 2015, Vol.160: 339-350]에 기재되어 있고, 이들 각각은 그 전문이 본원에 참조로 포함된다. 다른 시스템은 PCP 단백질을 특이적으로 동원하는 PP7 헤어핀, 및 Com 단백질을 특이적으로 동원하는 "com" 헤어핀을 포함한다. 문헌 [Zalatan et al.]을 참조한다.
MS2 헤어핀 (또는 동등하게 "MS2 압타머"로 지칭됨)의 뉴클레오티드 서열은 GCCAACATGAGGATCACCCATGTCTGCAGGGCC (서열식별번호: 1361679)이다.
MCP 또는 MS2cp의 아미노산 서열은:
GSASNFTQFVLVDNGGTGDVTVAPSNFANGVAEWISSNSRSQAYKVTCSVRQSSAQNRKYTIKVEVPKVATQTVGGEELPVAGWRSYLNMELTIPIFATNSDCELIVKAMQGLLKDGNPIPSAIAANSGIY (서열식별번호: 1361680)이다.
(vi) UGI 도메인
다른 실시양태에서, 본원에 기재된 프라임 편집제는 1개 이상의 우라실 글리코실라제 억제제 도메인을 포함할 수 있다. 본원에 사용된 용어 "우라실 글리코실라제 억제제 (UGI)" 또는 "UGI 도메인"은 우라실-DNA 글리코실라제 염기-절제 복구 효소를 억제할 수 있는 단백질을 지칭한다. 일부 실시양태에서, UGI 도메인은 야생형 UGI 또는 서열식별번호: 1361681에 제시된 바와 같은 UGI를 포함한다. 일부 실시양태에서, 본원에 제공된 UGI 단백질은 UGI의 단편 및 UGI 또는 UGI 단편에 상동인 단백질을 포함한다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, UGI 도메인은 서열식별번호: 1361681에 제시된 아미노산 서열의 단편을 포함한다. 일부 실시양태에서, UGI 단편은 서열식별번호: 1361681에 제시된 바와 같은 아미노산 서열의 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 적어도 99.5%를 포함하는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, UGI는 서열식별번호: 1361681에 제시된 아미노산 서열과 상동인 아미노산 서열, 또는 서열식별번호: 1361681에 제시된 아미노산 서열의 단편과 상동인 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, UGI 또는 UGI의 단편 또는 UGI 또는 UGI 단편의 상동체를 포함하는 단백질은 "UGI 변이체"로 지칭된다. UGI 변이체는 UGI 또는 그의 단편에 대해 상동성을 공유한다. 예를 들어, UGI 변이체는 야생형 UGI 또는 서열식별번호: 1361681에 제시된 바와 같은 UGI와 적어도 70% 동일하거나, 적어도 75% 동일하거나, 적어도 80% 동일하거나, 적어도 85% 동일하거나, 적어도 90% 동일하거나, 적어도 95% 동일하거나, 적어도 96% 동일하거나, 적어도 97% 동일하거나, 적어도 98% 동일하거나, 적어도 99% 동일하거나, 적어도 99.5% 동일하거나, 또는 적어도 99.9% 동일하다. 일부 실시양태에서, UGI 변이체는 단편이 야생형 UGI 또는 서열식별번호: 1361681에 제시된 바와 같은 UGI의 상응하는 단편과 적어도 70% 동일하거나, 적어도 80% 동일하거나, 적어도 90% 동일하거나, 적어도 95% 동일하거나, 적어도 96% 동일하거나, 적어도 97% 동일하거나, 적어도 98% 동일하거나, 적어도 99% 동일하거나, 적어도 99.5% 동일하거나, 또는 적어도 99.9% 동일한 UGI의 단편을 포함한다. 일부 실시양태에서, UGI는 하기 아미노산 서열을 포함한다:
우라실-DNA 글리코실라제 억제제:
>sp|P14739|UNGI_BPPB2
MTNLSDIIEKETGKQLVIQESILMLPEEVEEVIGNKPESDILVHTAYDESTDENVMLLTSDAPEYKPWALVIQDSNGENKIKML (서열식별번호: 1361681).
본원에 기재된 프라임 편집제는 본원에 기재된 바와 같은 1개 이상의 링커에 의해 분리될 수 있는 1개 초과의 UGI 도메인을 포함할 수 있다.
(vii) 추가의 PE 요소
특정 실시양태에서, 본원에 기재된 프라임 편집제는 염기 복구 억제제를 포함할 수 있다. 용어 "염기 복구 억제제" 또는 "IBR"은 핵산 복구 효소, 예를 들어 염기 절제 복구 효소의 활성을 억제할 수 있는 단백질을 지칭한다. 일부 실시양태에서, IBR은 OGG 염기 절제 복구 억제제이다. 일부 실시양태에서, IBR은 염기 절제 복구 억제제 ("iBER")이다. 예시적인 염기 절제 복구 억제제는 APE1, 엔도 III, 엔도 IV, 엔도 V, 엔도 VIII, Fpg, hOGG1, hNEIL1, T7 엔도I, T4PDG, UDG, hSMUG1, 및 hAAG의 억제제를 포함한다. 일부 실시양태에서, IBR은 엔도 V 또는 hAAG의 억제제이다. 일부 실시양태에서, IBR은 촉매 불활성 글리코실라제 또는 촉매 불활성 디옥시게나제, 또는 옥시다제의 소분자 또는 펩티드 억제제, 또는 그의 변이체일 수 있는 iBER이다. 일부 실시양태에서, IBR은 TDG 억제제, MBD4 억제제 또는 AlkBH 효소의 억제제일 수 있는 iBER이다. 일부 실시양태에서, IBR은 촉매 불활성 TDG 또는 촉매 불활성 MBD4를 포함하는 iBER이다. 예시적인 촉매 불활성 TDG는 서열식별번호: 3872 (인간 TDG)의 N140A 돌연변이체이다.
일부 예시적인 글리코실라제가 하기 제공된다. 이들 글리코실라제 도메인 중 임의의 것의 촉매적으로 불활성화된 변이체는 본 개시내용에 제공된 프라임 편집제의 napDNAbp 또는 폴리머라제 도메인에 융합될 수 있는 iBER이다.
OGG (인간)
Figure pct00085
MPG (인간)
Figure pct00086
MBD4 (인간)
Figure pct00087
TDG (인간)
Figure pct00088
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 융합 단백질은 1개 이상의 이종 단백질 도메인 (예를 들어, 프라임 편집제 성분에 더하여 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10개 또는 그 초과의 도메인 또는 약 그보다 더 많음)을 포함할 수 있다. 융합 단백질은 임의의 추가의 단백질 서열, 및 임의로 임의의 2개의 도메인 사이의 링커 서열을 포함할 수 있다. 존재할 수 있는 다른 예시적인 특색은 국재화 서열, 예컨대 세포질 국재화 서열, 유출 서열, 예컨대 핵 유출 서열, 또는 다른 국재화 서열, 뿐만 아니라 융합 단백질의 가용화, 정제, 또는 검출에 유용한 서열 태그이다.
프라임 편집제 또는 그의 성분 (예를 들어, napDNAbp 도메인, 폴리머라제 도메인, 또는 NLS 도메인)에 융합될 수 있는 단백질 도메인의 예는 비제한적으로 에피토프 태그 및 리포터 유전자 서열을 포함한다. 에피토프 태그의 비제한적 예는 히스티딘 (His) 태그, V5 태그, FLAG 태그, 인플루엔자 헤마글루티닌 (HA) 태그, Myc 태그, VSV-G 태그, 및 티오레독신 (Trx) 태그를 포함한다. 리포터 유전자의 예는 글루타티온-5-트랜스퍼라제 (GST), 양고추냉이 퍼옥시다제 (HRP), 클로람페니콜 아세틸트랜스퍼라제 (CAT), 베타-갈락토시다제, 베타-글루쿠로니다제, 루시페라제, 녹색 형광 단백질 (GFP), HcRed, DsRed, 시안 형광 단백질 (CFP), 황색 형광 단백질 (YFP), 및 청색 형광 단백질 (BFP)을 포함한 자가형광 단백질을 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 프라임 편집제는 말토스 결합 단백질 (MBP), S-태그, Lex A DNA 결합 도메인 (DBD) 융합체, GAL4 DNA 결합 도메인 융합체, 및 단순 포진 바이러스 (HSV) BP16 단백질 융합체를 포함하나 이에 제한되지는 않는, DNA 분자에 결합하거나 또는 다른 세포 분자에 결합하는 단백질 또는 단백질의 단편을 코딩하는 유전자 서열에 융합될 수 있다. 프라임 편집제의 일부를 형성할 수 있는 추가의 도메인은 2011년 3월 10일에 공개된 미국 특허 공개 번호 2011/0059502에 기재되어 있으며, 그 전문은 본원에 참조로 포함된다.
개시내용의 한 측면에서, 글루타티온-5-트랜스퍼라제 (GST), 양고추냉이 퍼옥시다제 (HRP), 클로람페니콜 아세틸트랜스퍼라제 (CAT) 베타-갈락토시다제, 베타-글루쿠로니다제, 루시페라제, 녹색 형광 단백질 (GFP), HcRed, DsRed, 시안 형광 단백질 (CFP), 황색 형광 단백질 (YFP), 및 청색 형광 단백질 (BFP)을 포함한 자가형광 단백질을 포함하나 이에 제한되지는 않는 리포터 유전자는 유전자 생성물의 발현의 변경 또는 변형을 측정하기 위한 마커로서 작용하는 유전자 생성물을 코딩하도록 세포 내로 도입될 수 있다. 개시내용의 특정 실시양태에서, 유전자 생성물은 루시페라제이다. 본 개시내용의 추가 실시양태에서, 유전자 생성물의 발현이 감소된다.
본원에 제공된 적합한 단백질 태그는 비오틴 카르복실라제 담체 단백질 (BCCP) 태그, myc-태그, 칼모듈린-태그, FLAG-태그, 헤마글루티닌 (HA)-태그, 히스티딘 태그 또는 His-태그로도 지칭되는 폴리히스티딘 태그, 말토스 결합 단백질 (MBP)-태그, nus-태그, 글루타티온-S-트랜스퍼라제 (GST)-태그, 녹색 형광 단백질 (GFP)-태그, 티오레독신-태그, S-태그, 소프태그 (예를 들어, 소프태그 1, 소프태그 3), 스트렙-태그, 비오틴 리가제 태그, FlAsH 태그, V5 태그, 및 SBP-태그를 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 추가의 적합한 서열은 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 명백할 것이다. 일부 실시양태에서, 융합 단백질은 1개 이상의 His 태그를 포함한다.
본 개시내용의 일부 실시양태에서, 프라임 편집 시스템의 활성은 PE 시스템의 발현된 성분의 체류 시간, 양, 및/또는 활성을 조정함으로써 일시적으로 조절될 수 있다. 예를 들어, 본원에 기재된 바와 같이, PE는 PE의 세포내 반감기를 변형시킬 수 있는 단백질 도메인과 융합될 수 있다. 2개 이상의 벡터 (예를 들어, 본원에 기재된 성분이 2개 이상의 별개의 벡터 상에 코딩된 벡터 시스템)를 수반하는 특정 실시양태에서, PE 시스템의 활성은 벡터가 전달되는 시기를 제어함으로써 일시적으로 조절될 수 있다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, 뉴클레아제 시스템을 코딩하는 벡터는 주형을 코딩하는 벡터 전에 PE를 전달할 수 있다. 다른 실시양태에서, PEgRNA를 코딩하는 벡터는 PE 시스템을 코딩하는 벡터 전에 가이드를 전달할 수 있다. 일부 실시양태에서, PE 시스템 및 PEgRNA를 코딩하는 벡터는 동시에 전달된다. 특정 실시양태에서, 동시에 전달된 벡터는 예를 들어 PE, PEgRNA, 및/또는 제2 가닥 가이드 RNA 성분을 일시적으로 전달한다. 추가 실시양태에서, 벡터 상의 코딩 서열로부터 전사된 RNA (예컨대, 예를 들어 뉴클레아제 전사체)는 RNA의 세포내 반감기를 변형시키고/거나 번역 제어를 조정할 수 있는 적어도 1개의 요소를 추가로 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, RNA의 반감기는 증가될 수 있다. 일부 실시양태에서, RNA의 반감기는 감소될 수 있다. 일부 실시양태에서, 요소는 RNA의 안정성을 증가시킬 수 있다. 일부 실시양태에서, 요소는 RNA의 안정성을 감소시킬 수 있다. 일부 실시양태에서, 요소는 RNA의 3' UTR 내에 있을 수 있다. 일부 실시양태에서, 요소는 폴리아데닐화 신호 (PA)를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 요소는 캡, 예를 들어 상류 mRNA 또는 PEgRNA 단부를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, RNA는 전사 후 세포에서 보다 빠르게 분해되도록 PA를 포함하지 않을 수 있다. 일부 실시양태에서, 요소는 적어도 1개의 AU-풍부 요소 (ARE)를 포함할 수 있다. ARE는 조직 유형, 세포 유형, 시기, 세포 국재화, 및 환경에 의존하는 방식으로 ARE 결합 단백질 (ARE-BP)에 의해 결합될 수 있다. 일부 실시양태에서, 탈안정화 요소는 RNA 붕괴를 촉진하거나, RNA 안정성에 영향을 미치거나, 또는 번역을 활성화시킬 수 있다. 일부 실시양태에서, ARE는 50 내지 150개 뉴클레오티드 길이를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, ARE는 서열 AUUUA의 적어도 1개의 카피를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 적어도 1개의 ARE가 RNA의 3' UTR에 부가될 수 있다. 일부 실시양태에서, 요소는 우드척 간염 바이러스 (WHP)일 수 있다.
전사체로부터의 발현을 증진시키기 위한 3차 구조를 생성하는 전사후 조절 요소 (WPRE). 추가 실시양태에서, 요소는, 예를 들어 문헌 [Zufferey et al., J Virol, 73(4): 2886-92 (1999) and Flajolet et al., J Virol, 72(7): 6175-80 (1998)]에 기재된 바와 같이, 전사체로부터의 발현을 증진시킬 수 있는 변형된 및/또는 말단절단된 WPRE 서열이다. 일부 실시양태에서, WPRE 또는 등가물은 RNA의 3' UTR에 부가될 수 있다. 일부 실시양태에서, 요소는 신속- 또는 저속-붕괴 전사체가 풍부한 다른 RNA 서열 모티프로부터 선택될 수 있다.
일부 실시양태에서, PE 또는 PEgRNA를 코딩하는 벡터는 PE 시스템에 의한 벡터 상에 존재하는 표적 서열의 절단을 통해 자기-파괴될 수 있다. 절단은 벡터로부터 PE 또는 PEgRNA의 지속적인 전사를 막을 수 있다. 전사가 어느 정도의 시간 동안 선형화된 벡터 상에서 일어날 수 있지만, 세포내 분해에 적용되는 발현된 전사체 또는 단백질은 코딩 벡터의 발현으로부터의 지속적인 공급의 부재 하에 오프-타겟 효과를 생성하는 시간을 덜 가질 것이다.
F. PE 복합체
다양한 실시양태에서, 본원에 개시된 프라임 편집제 융합 단백질은 본원에 개시된 PEgRNA와 복합체화될 수 있다. 따라서, (i) 본원에 제공된 PE 융합 단백질 중 임의의 것, 및 (ii) PE 융합 단백질의 napDNAbp (예를 들어, Cas9 도메인)에 결합된 PEgRNA (예를 들어, 서열 목록의 치료 PEgRNA)를 포함하는 복합체가 본원에 추가로 제공된다. 어떠한 특정한 이론에 얽매이는 것을 원하지는 않지만, PE 융합 단백질은 PE 융합 단백질을 목적하는 게놈 표적 부위에 특이적이고 효율적으로 표적화하여 목적하는 돌연변이 또는 달리 유전자 변형을 설치하도록 적합한 PEgRNA를 설계함으로써 프로그램가능한 방식으로 목적하는 표적 부위로 지시될 수 있다. 그러나, 일부 경우에 프라임 편집을 위한 표적 부위의 적합성은 적합하게 위치하는 PAM의 존재에 좌우될 수 있다. 본원에 제공된 Cas9 도메인의 광범위한 PAM 상용성은 염기 편집제의 표적화 범주를 정규 5'-NGG-3' PAM 서열의 대략 15개 뉴클레오티드 내에 있지 않은 표적 부위까지 확장시키는 잠재력을 갖는다. 관련 기술분야의 통상의 기술자는 본 개시내용 및 관련 기술분야의 지식에 기초하여 목적하는 게놈 서열을 표적화하는데 적합한 PEgRNA 서열을 설계할 수 있을 것이다.
일부 실시양태에서, PE1은 PEgRNA와 복합체화되고, 하기 조성을 갖는다: [NLS]-[Cas9(H840A)]-[링커]-[MMLV_RT (wt)]. 구조는 하기와 같이 제시된다:
Figure pct00089
일부 실시양태에서, PE2는 PEgRNA와 복합체화된다. 이러한 복합체는 "PE3"으로 지칭될 수 있고, 하기 구조를 갖는다: [NLS]-[Cas9(H840A)]-[링커]-[MMLV_RT(D200N)(T330P)(L603W)(T306K)(W313F)] + PEgRNA . PE3은 하기 구조를 갖는다:
Figure pct00090
일부 실시양태에서, PEgRNA는 약 15-100개 뉴클레오티드 길이이고, 표적 서열에 상보적인 적어도 10개의 인접 뉴클레오티드의 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 가이드 RNA는 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 또는 50개 뉴클레오티드 길이이다. 일부 실시양태에서, 가이드 RNA는 표적 서열에 상보적인 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 또는 40개의 인접 뉴클레오티드의 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 표적 서열은 DNA 서열이다. 일부 실시양태에서, 표적 서열은 유기체의 게놈 내에 있다. 일부 실시양태에서, 유기체는 원핵생물이다. 일부 실시양태에서, 원핵생물은 박테리아이다. 일부 실시양태에서, 박테리아는 이. 콜라이이다. 일부 실시양태에서, 유기체는 진핵생물이다. 일부 실시양태에서, 유기체는 식물 또는 진균이다. 일부 실시양태에서, 유기체는 척추동물이다. 일부 실시양태에서, 척추동물은 포유동물이다. 일부 실시양태에서, 포유동물은 인간이다. 일부 실시양태에서, 유기체는 세포이다. 일부 실시양태에서, 세포는 인간 세포이다. 일부 실시양태에서, 세포는 HEK293T 또는 U2OS 세포이다.
일부 실시양태에서, 표적 서열은 질환 또는 장애와 연관된 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 표적 서열은 질환 또는 장애와 연관된 점 돌연변이를 포함한다. 일부 실시양태에서, 표적 서열은 T→C 점 돌연변이를 포함한다. 일부 실시양태에서, 복합체는 표적 C 점 돌연변이를 탈아미노화하며, 여기서 탈아미노화는 질환 또는 장애와 연관되지 않은 서열을 발생시킨다. 일부 실시양태에서, 표적 C 점 돌연변이는 가이드 RNA에 상보적이지 않은 DNA 가닥에 존재한다. 일부 실시양태에서, 표적 서열은 T→A 점 돌연변이를 포함한다. 일부 실시양태에서, 복합체는 표적 A 점 돌연변이를 탈아미노화하며, 여기서 탈아미노화는 질환 또는 장애와 연관되지 않은 서열을 발생시킨다. 일부 실시양태에서, 표적 A 점 돌연변이는 가이드 RNA에 상보적이지 않은 DNA 가닥에 존재한다.
일부 실시양태에서, PE 복합체는 비편집된 가닥 상의 제1 닉 (즉, 가이드 RNA의 연장된 부분 상의 리버스 트랜스크립타제의 프라이밍에 사용하기 위한 유리 3' 단부를 제공하는 초기 닉 부위)의 하류 위치에서의 제2 닉의 도입을 지칭하는 제2 가닥 닉킹을 수행하기 위한 가이드 RNA를 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 제1 닉 및 제2 닉은 대향 가닥 상에 있다. 다른 실시양태에서, 제1 닉 및 제2 닉은 대향 가닥 상에 있다. 또 다른 실시양태에서, 제1 닉은 비-표적 가닥 (즉, R-루프의 단일 가닥 부분을 형성하는 가닥) 상에 있고, 제2 닉은 표적 가닥 상에 있다. 제2 닉은 제1 닉의 적어도 5개 뉴클레오티드 하류, 또는 제1 닉의 적어도 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 또는 30개 또는 그 초과의 뉴클레오티드 하류에 위치한다. 이론에 얽매이지는 않지만, 제2 닉은 목적하는 편집된 가닥의 대체보다는, 비편집된 가닥의 대체쪽으로 세포의 내인성 DNA 복구 및 복제 과정을 유도한다. 일부 실시양태에서, 편집된 가닥은 비-표적 가닥이고, 비편집된 가닥은 표적 가닥이다. 다른 실시양태에서, 편집된 가닥은 표적 가닥이고, 비편집된 가닥은 비-표적 가닥이다.
제2 가닥 닉은 제2 가이드 RNA를 사용하여 설치될 수 있으며, 이는 제2이지만 프로토스페이서 서열 근처에서 PE 융합 단백질과 복합체화되어 닉을 설치한다.
일부 실시양태에서, 제2 가닥 닉의 삽입은 목적하는 편집의 설치 후에 일어날 수 있다. 이러한 개념은 "시간적 제2-가닥 닉킹"을 지칭한다. 이는 이중 가닥 DNA 파괴로 이어질 수 있는 양쪽 가닥 상의 공동 닉을 피한다. 시간적 제2 가닥 닉킹은 목적하는 편집이 이루어진 후에 제2 가이드 RNA를 도입하는 것을 포함하는 다양한 방식으로 도입될 수 있다.
한 실시양태에서, 본 개시내용은 PE3 복합체 플러스 제2 가닥 닉킹을 위한 가이드 RNA를 지칭하는 "PE3b" 복합체를 제공한다. 이 복합체는 하기 구조를 갖는다: [NLS]-[Cas9(H840A)]-[링커]-[MMLV_RT(D200N)(T330P)(L603W)(T306K)(W313F)] + PEgRNA + 제2 가닥 닉킹 가이드 RNA. PE3b는 하기 구조를 갖는다:
Figure pct00091
PE 복합체는 무손상 융합 복합체로서 세포에 전달될 수 있다. PE 복합체는 또한 1개 이상의 발현 벡터 (예를 들어, 렌티바이러스 벡터 또는 아데노-연관 바이러스 벡터)를 사용하여 세포에 전달될 수 있다. 예를 들어, 목적하는 PE 복합체의 전달은 동일한 또는 상이한 프로모터로부터의 PE 융합 단백질 및 PEgRNA 및 임의적인 제2 가닥 가이드 RNA를 코딩하는 단일 발현 벡터를 포함할 수 있다. 또 다른 예에서, 목적하는 PE 복합체의 전달은 제1 발현 벡터로부터 PE 융합 단백질 및 제2 발현 벡터로부터 PEgRNA 및/또는 임의적인 제2 가닥 가이드 RNA를 코딩하는 2개 이상의 발현 벡터를 포함할 수 있다.
이들 복합체의 일부로서 포함될 수 있는 PEgRNA는 서열 목록에 포함된 치료 PEgRNA, 예를 들어 서열식별번호: 1-135514 또는 813085-880462의 전체 PEgRNA 서열 중 임의의 것을 포함한다.
IV. PE 방법 및 치료
또 다른 측면에서, 본 명세서는 "프라임 편집제"로 표적 DNA 서열을 편집하는 방법을 제공한다. 본원에 사용된 용어 "프라임 편집"은 본 출원에 기재되고 도 1a-1h의 실시양태에 예시된 바와 같은 napDNAbp, 폴리머라제, 및 특수화된 가이드 RNA를 사용한 유전자 편집을 위한 신규 접근법을 지칭한다. 프라임 편집은 또한 표적 DNA 분자가 폴리머라제 (예를 들어, 리버스 트랜스크립타제)에 의한 DNA의 가닥의 합성을 프라이밍하는데 사용되기 때문에 "표적-프라이밍된 역전사" (TPRT)로서 기재될 수 있다. 명칭 "표적-프라이밍된 역전사"에서 용어 "역전사"의 사용은 프라임 편집을 리버스 트랜스크립타제의 사용으로 제한하는 것으로 의도되지 않고, 오히려 TPRT 또는 프라임 편집제는 임의의 폴리머라제 (예를 들어, DNA-의존성 DNA 폴리머라제 또는 RNA-의존성 DNA 폴리머라제)를 포함할 수 있다. 다양한 실시양태에서, 프라임 편집은 표적 DNA 분자 (뉴클레오티드 서열에서 변화가 도입되는 것이 목적됨)를 프라임 편집제 가이드 RNA와 복합체화된 핵산 프로그램가능한 DNA 결합 단백질 (napDNAbp)과 접촉시킴으로써 작동한다. 도 1e를 참조하면, 프라임 편집제 가이드 RNA는 가이드 RNA의 3' 또는 5' 단부에, 또는 가이드 RNA 내의 분자내 위치에 연장부를 포함하고, 목적하는 뉴클레오티드 변화 (예를 들어, 단일 뉴클레오티드 변화, 삽입, 또는 결실)를 코딩한다. 단계 (a)에서, napDNAbp/연장된 gRNA 복합체는 DNA 분자와 접촉하고, 연장된 gRNA는 napDNAbp가 표적 유전자좌에 결합하도록 가이드한다. 단계 (b)에서, 표적 유전자좌의 DNA의 가닥 중 하나에 닉을 도입하여 (예를 들어, 뉴클레아제 또는 화학적 작용제에 의함), 표적 유전자좌의 가닥 중 하나에 이용가능한 3' 단부를 생성한다. 일부 실시양태에서, 닉은 R-루프 가닥, 즉 가이드 RNA 서열에 혼성화되지 않은 가닥, 즉 "비-표적 가닥"에 상응하는 DNA의 가닥에서 생성된다. 그러나, 닉은 가닥 중 어느 하나에 도입될 수 있다. 즉, 닉은 R-루프 "표적 가닥" (즉, 연장된 gRNA의 프로토스페이서에 혼성화된 가닥) 또는 "비-표적 가닥" (즉, R-루프의 단일 가닥 부분을 형성하고 표적 가닥에 상보적인 가닥) 내로 도입될 수 있다. 단계 (c)에서, DNA 가닥의 3' 단부 (닉에 의해 형성됨)는 역전사를 프라이밍하기 위해 (즉, "표적-프라이밍된 RT") 가이드 RNA의 연장된 부분과 상호작용한다. 일부 실시양태에서, 3' 단부 DNA 가닥은 가이드 RNA의 연장된 부분 상의 특이적 프라이머 결합 부위, 즉 "리버스 트랜스크립타제 프라이밍 서열"에 혼성화한다. 단계 (d)에서, 프라이밍된 부위의 3' 단부로부터 프라임 편집제 가이드 RNA의 3' 단부쪽으로 DNA의 단일 가닥을 합성하는 리버스 트랜스크립타제가 도입된다. 이는 목적하는 뉴클레오티드 변화 (예를 들어, 단일 염기 변화, 삽입, 또는 결실, 또는 그의 조합)를 포함하고, 그 외에는 닉 부위의 또는 그와 인접한 내인성 DNA와 상동성인 단일 가닥 DNA 플랩을 형성한다. 단계 (e)에서, napDNAbp 및 가이드 RNA가 방출된다. 단계 (f) 및 (g)는 목적하는 뉴클레오티드 변화가 표적 유전자좌 내로 혼입되도록 하는 단일 가닥 DNA 플랩의 분해에 관한 것이다. 이러한 과정은 3' 단일 가닥 DNA 플랩이 내인성 DNA 서열에 침입하고 혼성화하면 형성되는 상응하는 5' 내인성 DNA 플랩을 제거함으로써 목적하는 생성물 형성쪽으로 구동될 수 있다. 이론에 얽매이지는 않지만, 세포 내인성 DNA 복구 및 복제 과정은 미스매칭된 DNA를 분해하여 뉴클레오티드 변화(들)를 혼입시켜 목적하는 변경된 생성물을 형성한다. 과정은 또한 도 1d에 예시된 바와 같이 "제2 가닥 닉킹"에 의해 생성물 형성쪽으로 구동될 수 있다. 이 과정은 하기 유전자 변화: 전환, 전이, 결실 및 삽입 중 적어도 하나 이상을 도입할 수 있다.
용어 "프라임 편집제 (PE)" 또는 "프라임 편집제"는 napDNAbp, 리버스 트랜스크립타제, 융합 단백질 (예를 들어, napDNAbp 및 리버스 트랜스크립타제를 포함함), 프라임 편집제 가이드 RNA, 및 융합 단백질 및 프라임 편집제 가이드 RNA를 포함하는 복합체, 뿐만 아니라 프라임 편집 과정을 편집된 생성물 형성쪽으로 구동하는 것을 돕기 위한 보조 요소, 예컨대 제2 가닥 닉킹 성분 및 5' 내인성 DNA 플랩 제거 엔도뉴클레아제를 포함하나 이에 제한되지는 않는, 본원에 기재된 표적-프라이밍된 역전사 (TPRT)를 사용하는 게놈 편집 방법에 수반되는 조성물을 지칭한다.
다양한 실시양태에서, 프라임 편집제 (PE) 시스템은 표적화된 돌연변이유발을 수행하기 위해, 즉, 게놈 내의 DNA 또는 세포 내의 다른 DNA 요소의 잘-규정된 스트레치만을 돌연변이시키기 위해 오류-유발 리버스 트랜스크립타제의 사용을 포함할 수 있다. 도 22는 프라임 편집제 가이드 RNA와 복합체화된 핵산 프로그램가능한 DNA 결합 단백질 (napDNAbp)을 사용하여 표적 유전자좌 상에서 오류-유발 리버스 트랜스크립타제로 표적화된 돌연변이유발을 도입 및 수행하는 예시적인 과정의 개략도를 제공한다. 이 과정은 표적화된 돌연변이유발을 위한 프라임 편집의 실시양태로서 지칭될 수 있다. 프라임 편집제 가이드 RNA는 가이드 RNA의 3' 또는 5' 단부에, 또는 가이드 RNA 내의 분자내 위치에 연장부를 포함한다. 단계 (a)에서, napDNAbp/gRNA 복합체는 DNA 분자와 접촉하고, gRNA는 napDNAbp가 돌연변이유발될 표적 유전자좌에 결합하도록 가이드한다. 단계 (b)에서, 표적 유전자좌의 DNA의 가닥 중 하나에 닉을 도입하여 (예를 들어, 뉴클레아제 또는 화학적 작용제에 의함), 표적 유전자좌의 가닥 중 하나에 이용가능한 3' 단부를 생성한다. 특정 실시양태에서, 닉은 R-루프 가닥, 즉 가이드 RNA 서열에 혼성화되지 않은 가닥에 상응하는 DNA의 가닥에서 생성된다. 단계 (c)에서, 3' 단부 DNA 가닥은 역전사를 프라이밍하기 위해 가이드 RNA의 연장된 부분과 상호작용한다. 일부 실시양태에서, 3' 단부 DNA 가닥은 가이드 RNA의 연장된 부분 상의 특이적 프라이머 결합 부위에 혼성화한다. 단계 (d)에서, DNA의 돌연변이유발된 단일 가닥을 프라이밍된 부위의 3' 단부로부터 가이드 RNA의 3' 단부쪽으로 합성하는 오류-유발 리버스 트랜스크립타제가 도입된다. 예시적인 돌연변이는 별표 "*"로 표시된다. 이는 목적하는 돌연변이유발된 영역을 포함하는 단일 가닥 DNA 플랩을 형성한다. 단계 (e)에서, napDNAbp 및 가이드 RNA가 방출된다. 단계 (f) 및 (g)는 목적하는 돌연변이유발된 영역이 표적 유전자좌 내로 혼입되도록 하는 단일 가닥 DNA 플랩 (돌연변이유발된 영역을 포함함)의 분해에 관한 것이다. 이러한 과정은 3' 단일 가닥 DNA 플랩이 다른 가닥 상의 상보적 서열에 침입하고 혼성화하면 형성되는 상응하는 5' 내인성 DNA 플랩을 제거함으로써 목적하는 생성물 형성쪽으로 구동될 수 있다. 과정은 또한 도 1d에 예시된 바와 같이 제2 가닥 닉킹에 의해 생성물 형성쪽으로 구동될 수 있다. 내인성 DNA 복구 및/또는 복제 과정 후에, 돌연변이유발된 영역은 DNA 유전자좌의 DNA의 양쪽 가닥 내로 혼입된다.
다른 실시양태에서, PEgRNA는 표적 DNA 서열에 유전자 변화를 설치하기 위해 본원에 기재된 프라임 편집 시스템에 사용될 수 있다. 예시적인 이러한 과정이 도 29에 도시된다. 도면은 전형적인 PEgRNA와 이중 가닥 DNA의 표적 부위의 상호작용의 개략도를 제공한다. 이중 가닥 DNA는 상단 가닥이 3'에서 5' 배향으로, 하단 가닥이 5'에서 3' 방향으로 제시된다. 상단 가닥은 "프로토스페이서" 및 PAM 서열을 포함하고, "표적 가닥"으로 지칭된다. 상보적 하단 가닥은 "비-표적 가닥"으로 지칭된다. 제시되지 않았지만, 도시된 PEgRNA는 Cas9 또는 등가물과 복합체화될 것이다. 개략도에 제시된 바와 같이, PEgRNA의 스페이서는 PAM 서열의 바로 하류에 위치하는 프로토스페이서로 지칭되는 표적 가닥 상의 상보적 영역에 어닐링되며, 이는 대략 20개 뉴클레오티드 길이이다. 이러한 상호작용은 스페이서 RNA와 프로토스페이서 DNA 사이에 DNA/RNA 하이브리드로서 형성되고, 프로토스페이서 대향 영역에서 R 루프의 형성을 유도한다. 본원의 다른 곳에 교시된 바와 같이, Cas9 단백질 (제시되지 않음)은 이어서, 제시된 바와 같이 비-표적 가닥에서 닉을 유도한다. 이어서, 이는 3' ssDNA 플랩 영역의 형성으로 이어지며, 이는 *z*에 따르면 프라이머 결합 부위에서 PEgRNA의 3' 단부와 상호작용한다. ssDNA 플랩 (즉, 리버스 트랜스크립타제 프라이머 서열)의 3' 단부는 PEgRNA 상의 프라이머 결합 부위 (A)에 어닐링하여, 리버스 트랜스크립타제를 프라이밍한다. 이어서, 리버스 트랜스크립타제 (예를 들어, Cas9 구축물에 부착된, 융합 단백질로서 트랜스로 제공되거나 또는 시스로 제공됨)는 편집 주형 (B) 및 상동성 아암 (C)에 의해 코딩된 DNA의 단일 가닥을 중합한다. 중합은 연장 아암의 5' 단부쪽으로 계속된다. ssDNA의 중합된 가닥은, 다른 곳에 기재된 바와 같이 (예를 들어, 도 1e에 제시된 바와 같이), 내인성 DNA를 침입하고, 상응하는 내인성 가닥 (이는 내인성 DNA의 5' DNA 플랩으로서 제거됨)을 대체하고, 자연 발생 DNA 복구/복제 라운드를 통해 목적하는 뉴클레오티드 편집 (단일 뉴클레오티드 염기 쌍 변화, 결실, 삽입 (전체 유전자 포함))을 설치하는 ssDNA 3' 단부 플랩을 형성한다.
본 개시내용은 본원에 제공된 프라임 편집제 (PE) 시스템에 의해 교정될 수 있는 점 돌연변이와 연관되거나 또는 그에 의해 유발된 질환으로 진단된 대상체의 치료 방법을 제공한다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, 이러한 질환, 예를 들어 상기 기재된 바와 같은 점 돌연변이와 연관된 암을 갖는 대상체에게, 목적하는 유전자 변화를 포함하는 공여자 DNA 분자의 존재 하에 상동성-지정 복구에 의해 매개되는 바와 같은, 점 돌연변이를 교정하거나 또는 탈활성화 돌연변이를 질환-연관 유전자 내로 도입하는 본원에 기재된 프라임 편집제 (PE) 시스템의 유효량을 투여하는 것을 포함하는 방법이 제공된다. 일부 실시양태에서, 이러한 질환, 예를 들어 상기 기재된 바와 같은 점 돌연변이와 연관된 암을 갖는 대상체에게, 점 돌연변이를 교정하거나 또는 탈활성화 돌연변이를 질환-연관 유전자 내로 도입하는 본원에 기재된 프라임 편집제 (PE) 시스템의 유효량을 투여하는 것을 포함하는 방법이 제공된다. 일부 실시양태에서, 질환은 증식성 질환이다. 일부 실시양태에서, 질환은 유전 질환이다. 일부 실시양태에서, 질환은 신생물성 질환이다. 일부 실시양태에서, 질환은 대사 질환이다. 일부 실시양태에서, 질환은 리소솜 축적 질환이다. 점 돌연변이를 교정하거나 또는 탈활성화 돌연변이를 질환-연관 유전자 내로 도입함으로써 치료될 수 있는 다른 질환은 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 공지되어 있을 것이며, 개시내용은 이와 관련하여 제한되지 않는다.
본 개시내용은 추가의 질환 또는 장애, 예를 들어 TPRT-매개된 유전자 편집에 의해 교정될 수 있는 점 돌연변이와 연관되거나 그에 의해 유발되는 질환 또는 장애의 치료 방법을 제공한다. 일부 이러한 질환은 본원에 기재되어 있고, 본원에 제공된 전략 및 융합 단백질에 의해 치료될 수 있는 추가의 적합한 질환은 본 개시내용에 기초하여 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 명백할 것이다. 예시적인 적합한 질환 및 장애가 하기 열거된다. 각각의 서열 내의 특정 위치 또는 잔기의 넘버링은 사용되는 특정한 단백질 및 넘버링 스킴에 좌우됨을 이해할 것이다. 넘버링은, 예를 들어 성숙 단백질의 전구체 및 성숙 단백질 자체에서 상이할 수 있고, 종마다의 서열의 차이는 넘버링에 영향을 미칠 수 있다. 관련 기술분야의 통상의 기술자는 관련 기술분야에 널리 공지된 방법에 의해, 예를 들어 서열 정렬 및 상동 잔기의 결정에 의해 임의의 상동 단백질 및 각각의 코딩 핵산에서 각각의 잔기를 확인할 수 있을 것이다. 예시적인 적합한 질환 및 장애는 제한 없이 다음을 포함한다: 2-메틸-3-히드록시부티르산뇨; 3 베타-히드록시스테로이드 데히드로게나제 결핍; 3-메틸클루타콘산뇨; 3-옥소-5 알파-스테로이드 델타 4-데히드로게나제 결핍; 46,XY 성별 반전, 유형 1, 3, 및 5; 5-옥소프롤리나제 결핍; 6-피루보일-테트라히드로프테린 신타제 결핍; 아르스코그 증후군; 아즈 증후군; 연골무발생증 유형 2; 완전색맹 2 및 7; 후천성 긴 QT 증후군; 뇌량무형성 증후군, 쉰젤 유형; 아크로카피토페모랄 이형성증; 선단이골증 2, 호르몬 저항성 동반 또는 비동반; 말단홍색각피증; 말단왜소 이형성증; ACTH-비의존성 거대결정성 부신 증식증 2; 활성화된 PI3K-델타 증후군; 급성 간헐성 포르피린증; 아실-CoA 데히드로게나제 패밀리, 구성원 9의 결핍; 아담스-올리버 증후군 5 및 6; 아데닌 포스포리보실트랜스퍼라제 결핍; 아데닐레이트 키나제 결핍; 아데닐로숙시네이트 리아제 결핍으로 인한 용혈성 빈혈; 청소년 신결석증; 신장-간-췌장 이형성증; 멕켈 증후군 유형 7; 부신백질이영양증; 성인 접합부 수포성 표피박리증; 수포성 표피박리증, 접합부, 국소 변이형; 성인 신경 세로이드 리포푸신증; 성인 신경 세로이드 리포푸신증; 안구운동 실행증을 동반한 성인 발병 운동실조; 성인 증후군; 무섬유소혈증 및 선천성 무섬유소혈증; 상염색체 열성 무감마글로불린혈증 2; 연령-관련 황반 변성 3, 6, 11, 및 12; 에카르디 구티에레스 증후군 1, 4, 및 5; 동창 루푸스 1; 알라질 증후군 1 및 2; 알렉산더병; 알캅톤뇨증; 알란-헌던-두들리 증후군; 범발성 탈모증 선천성; 알퍼스 뇌병증; 알파-1-항트립신 결핍; 상염색체 우성, 상염색체 열성, 및 X-연관 열성 알포트 증후군; 알츠하이머병, 가족성, 3, 경직성 하반신부전마비 및 실행증 동반; 알츠하이머병, 유형, 1, 3, 및 4; 저석회화 유형 및 저성숙 유형, IIA1 불완전 사기질형성증; 아미노아실라제 1 결핍; 아미시 영아 간질 증후군; 아밀로이드생성 트랜스티레틴 아밀로이드증; 아밀로이드 심근병증, 트랜스티레틴-관련; 심근병증; 근위축성 측삭 경화증 유형 1, 6, 15 (전두측두엽 치매 동반 또는 비동반), 22 (전두측두엽 치매 동반 또는 비동반), 및 10; TDP43 함유물을 동반한 전두측두엽 치매, TARDBP-관련; 앤더만 증후군; 안데르센 타윌 증후군; 선천성 긴 QT 증후군; 빈혈, 비구상 용혈성, G6PD 결핍으로 인함; 안젤만 증후근; 소두증을 동반한 중증 신생아-발병 뇌병증; 자폐증에 감수성, X-연관 3; 혈관병증, 유전성, 신병증, 동맥류 및 근육 경련 동반; 안지오텐신 i-전환 효소, 양성 혈청 증가; 무홍채증, 소뇌 운동실조, 및 정신 지체; 손발톱결여증; 항트롬빈 III 결핍; 생식기 기형 및 장애성 스테로이드생성을 동반한 앤틀리-빅슬러 증후군; 대동맥류, 가족성 흉부 4, 6, 및 9; 흉부 대동맥류 및 대동맥 박리; 전신성 평활근 기능장애 증후군; 모야모야병 5; 재생불량성 빈혈; 겉보기 미네랄로코르티코이드 과잉; 아르기나제 결핍; 아르기니노숙시네이트 리아제 결핍; 아로마타제 결핍; 부정맥유발성 우심실 심근병증 유형 5, 8, 및 10; 원발성 가족성 비대성 심근병증; 선천성 다발성 관절만곡증, 원위, X-연관; 관절만곡증 신장 기능장애 담즙정체 증후군; 관절만곡증, 신장 기능장애, 및 담즙정체 2; 아스파라긴 신테타제 결핍; 뉴런 이동의 이상; 비타민 E 결핍을 동반한 운동실조; 운동실조, 감각, 상염색체 우성; 운동실조-모세혈관확장증 증후군; 유전성 암-소인 증후군; 무트랜스페린혈증; 심방 세동, 가족성, 11, 12, 13, 및 16; 심방 중격 결손 2, 4, 및 7 (방실 전도 결함 동반 또는 비동반); 심방 정지 2; 방실 중격 결손 4; 유전성 안구 위축증; ATR-X 증후군; 귓바퀴관절융기 증후군 2; 자가면역 질환, 다기관, 영아-발병; 자가면역 림프증식성 증후군, 유형 1a; 상염색체 우성 발한저하성 외배엽 이형성증; 미토콘드리아 DNA 결실을 동반한 상염색체 우성 진행성 외안근마비 1 및 3; 상염색체 우성 염전 이상긴장증 4; 상염색체 열성 중심핵성 근병증; 상염색체 열성 선천성 어린선 1, 2, 3, 4A, 및 4B; 상염색체 열성 이완성 피부증 유형 IA 및 1B; 상염색체 열성 발한저하성 외배엽 이형성증 증후군; 외배엽 이형성증 11b; 발한저하성/모발/치아 유형, 상염색체 열성; 상염색체 열성 저인산혈증 골 질환; 악센펠트-리거 증후군 유형 3; 베인브리지-로퍼스 증후군; 바나얀-릴리-루발카바 증후군; PTEN 과오종 종양 증후군; 바레이처-윈터 증후군 1 및 2; 바라카트 증후군; 바르데-비들 증후군 1, 11, 16, 및 19; 무표지 림프구 증후군 유형 2, 상보군 E; 바터 증후군 산전 유형 2; 바터 증후군 유형 3, 저칼슘뇨 동반 3, 및 4; 기저 신경절 석회화, 특발성, 4; 염주털; 양성 가족성 혈뇨; 양성 가족성 신생아 발작 1 및 2; 발작, 양성 가족성 신생아, 1 및/또는 근파동; 발작, 조기 영아 간질성 뇌병증 7; 양성 가족성 신생아-영아 발작; 양성 유전성 무도병; 심근병증을 동반한 양성 견갑비골 근육 이영양증; 버나드-술리에 증후군, 유형 A1 및 A2 (상염색체 우성); 베스트로핀병증, 상염색체 열성; 베타 지중해빈혈; 베스렘 근병증 및 베스렘 근병증 2; 비에티 결정질 각막망막 이영양증; 담즙산 합성 결함, 선천성, 2; 비오티니다제 결핍; 버크 바렐 정신 지체 이형 증후군; 실눈증, 안검하수증, 및 역내안각주름; 블룸 증후군; 보제슨-포스만-레만 증후군; 보우셔 노이하우저 증후군; 단지증 유형 A1 및 A2; 고혈압을 동반한 단지증; 출혈을 동반한 뇌 소혈관 질환; 분지형-쇄 케토산 데히드로게나제 키나제 결핍; 아가미귀 증후군 2 및 3; 유방암, 조기 발병; 유방-난소암, 가족성 1, 2, 및 4; 취약 각막 증후군 2; 브로디 근병증; 땀 염화물 상승 동반 또는 비동반 기관지확장증 3; 브라운-비알레토-반 라에레 증후군 및 브라운-비알레토-반 라에레 증후군 2; 브루가다 증후군; 브루가다 증후군 1; 심실 세동; 발작성 가족성 심실 세동; 브루가다 증후군 및 브루가다 증후군 4; 긴 QT 증후군; 심장 돌연사; 과녁 황반 이영양증; 스타르가르트병 4; 추체-간체 이영양증 12; 수포성 어린선형 홍피증; 번-맥코운 증후군; 칸디다증, 가족성, 2, 5, 6, 및 8; 탄수화물-결핍 당단백질 증후군 유형 I 및 II; 탄산 안히드라제 VA 결핍, 이에 기인한 고암모니아혈증; 결장의 암종; 심장 부정맥; 긴 QT 증후군, LQT1 하위유형; 심뇌근병증, 치명성 영아, 시토크롬 c 옥시다제 결핍으로 인함; 심장얼굴피부 증후군; 심근병증; 다논병; 비대성 심근병증; 좌심실 비치밀 심근병증; 카네발 증후군; 카니 복합증, 유형 1; 카르니틴 아실카르니틴 트랜스로카제 결핍; 카르니틴 팔미토일트랜스퍼라제 I, II, II (후기 발병), 및 II (영아) 결핍; 백내장 1, 4, 상염색체 우성, 상염색체 우성, 다중 유형, 소각막 동반, 코폭-유사, 소아, 소각막 및 글루코스뇨 동반, 및 핵 미만성 비진행성; 카테콜아민성 다형성 심실성 빈맥; 미측 퇴행 증후군; Cd8 결핍, 가족성; 중심핵병; 염색체 1,9 및 16의 동원체 불안정성 및 면역결핍; 진행성 외안근마비를 동반한 영아 소뇌 운동실조 및 소뇌 운동실조, 정신 지체, 및 평형이상 증후군 2; 뇌 아밀로이드 혈관병증, APP-관련; 피질하 경색 및 백질뇌병증 동반 뇌 상염색체 우성 및 열성 동맥병증; 뇌 해면 기형 2; 뇌안구안면골격 증후군 2; 뇌-안구-안면-골격 증후군; 석회화 및 낭을 동반한 대뇌망막 미세혈관병증; 세로이드 리포푸신증 뉴런 2, 6, 7, 및 10; 체디악-히가시 증후군, 체디악-히가시 증후군, 성인 유형; 샤르코-마리-투스병 유형 1B, 2B2, 2C, 2F, 2I, 2U (축삭), 1C (탈수초성), 우성 중간체 C, 열성 중간체 A, 2A2, 4C, 4D, 4H, IF, IVF, 및 X; 견갑비골 척수성 근육 위축; 원위 척수성 근육 위축, 선천성 비진행성; 척수성 근육 위축, 원위, 상염색체 열성, 5; CHARGE 연합증; 소아기 저포스파타제증; 성인 저포스파타제증; 담낭염; 진행성 가족성 간내 담즙정체 3; 담즙정체, 간내, 임신중 3; 콜레스타놀 축적 질환; 콜레스테롤 모노옥시게나제 (측쇄 절단) 결핍; 연골이형성증 블롬스트랜드 유형; 점상 연골이형성증 1, X-연관 열성 및 2 X-연관 우성; CHOPS 증후군; 만성 육아종성 질환, 상염색체 열성 시토크롬 b-양성, 유형 1 및 2; 추들리-맥쿨로우 증후군; 섬모 이상운동증, 원발성, 7, 11, 15, 20 및 22; 시트룰린혈증 유형 I; 시트룰린혈증 유형 I 및 II; 쇄골두개 이골증; C-유사 증후군; 코케인 증후군 유형 A; 조효소 Q10 결핍, 원발성 1, 4, 및 7; 코핀 시리스/지적 장애; 코핀-로우리 증후군; 코헨 증후군; 감기-유발 발한 증후군 1; 콜-카펜터 증후군 2; 육아종을 동반한 복합 세포성 및 체액성 면역 결함; 복합 d-2- 및 l-2-히드록시글루타르산뇨; 복합 말론산 및 메틸말론산뇨; 복합 산화성 인산화 결핍 1, 3, 4, 12, 15, 및 25; 복합 부분 및 완전 17-알파-히드록실라제/17,20-리아제 결핍; 공통 가변성 면역결핍 9; 보체 성분 4, 이의 부분 결핍, 기능장애성 c1 억제제로 인함; 보체 인자 B 결핍; 추체 단색형색각; 추체-간체 이영양증 2 및 6; 추체-간체 이영양증 불완전 사기질형성증; 선천성 부신 증식증 및 선천성 부신 저형성증, X-연관; 선천성 무거핵구성 혈소판감소증; 선천성 무홍채증; 선천성 중앙 저환기; 히르쉬스프룽 질환 3; 선천성 구축성 거미가락증; 선천성 사지 및 안면 구축, 저긴장증, 및 발달 지체; 선천성 글리코실화 장애 유형 1B, 1D, 1G, 1H, 1J, 1K, 1N, 1P, 2C, 2J, 2K, IIm; 선천성 적혈구생성이상 빈혈, 유형 I 및 II; 선천성 안면 외배엽 이형성증; 선천성 적혈구생성 포르피린증; 선천성 전신 지방이영양증 유형 2; 선천적 심장 질환, 다중 유형, 2; 선천적 심장 질환; 단속 대동맥궁; 선천성 지방종성 과도성장, 혈관 기형, 및 표피 모반; 비소세포 폐암; 난소의 신생물; 심장 전도 결손, 비특이적; 선천성 미세융모 위축; 선천성 근육 이영양증; 부분 LAMA2 결핍으로 인한 선천성 근육 이영양증; 뇌 및 안구 기형을 동반한 선천성 근육 이영양증-디스트로글리칸병증, 유형 A2, A7, A8, A11, 및 A14; 정신 지체를 동반한 선천성 근육 이영양증-디스트로글리칸병증, 유형 B2, B3, B5, 및 B15; 정신 지체를 비동반한 선천성 근육 이영양증-디스트로글리칸병증, 유형 B5; 선천성 근육 비대-뇌 증후군; 선천성 근무력 증후군, 아세타졸아미드-반응성; 섬유 유형 불균등을 동반한 선천성 근병증; 선천성 안구 결손증; 선천성 비진행성 야맹증, 유형 1A, 1B, 1C, 1E, 1F, 및 2A; 코프로포르피린증; 납작각막 2; 각막 이영양증, 푸크스 내피, 4; 각막 내피 이영양증 유형 2; 각막 취약성 구형각막, 청색 공막 및 관절 과운동성; 코넬리아 드 랑쥐 증후군 1 및 5; 관상 동맥 질환, 상염색체 우성 2; 관상동맥 심장 질환; 고알파지단백혈증 2; 피질 이형성증, 복합체, 다른 뇌 기형 동반 5 및 6; 피질 기형, 후두; 코르티코스테로이드-결합 글로불린 결핍; 코르티코스테론 메틸옥시다제 유형 2 결핍; 코스텔로 증후군; 코우덴 증후군 1; 편평고; 두개골간 이형성증, 상염색체 우성; 두개골유합증 1 및 4; 두개골유합증 및 치아 기형; 크레아틴 결핍, X-연관; 크루존 증후군; 잠복안구 증후군; 잠복고환, 일측 또는 양측; 쿠싱 지절유합증; 피부 악성 흑색종 1; 골이영양증 및 중증 폐, 위장, 및 뇨 이상을 동반한 이완성 피부증; 청색증, 일과성 신생아 및 비정형 신병증성; 낭성 섬유증; 시스틴뇨; 시토크롬 c 옥시다제 i 결핍; 시토크롬-c 옥시다제 결핍; D-2-히드록시글루타르산뇨 2; 다리에병, 분절성; 미로 무형성 소이증 및 소치증 (LAMM)을 동반한 난청; 난청, 상염색체 우성 3a, 4, 12, 13, 15, 상염색체 우성 비증후군성 감각신경성 17, 20, 및 65; 난청, 상염색체 열성 1A, 2, 3, 6, 8, 9, 12, 15, 16, 18b, 22, 28, 31, 44, 49, 63, 77, 86, 및 89; 난청, 와우, 근시 및 지적 손상 동반, 전정 침범 비동반, 상염색체 우성, X-연관 2; 2-메틸부티릴-CoA 데히드로게나제의 결핍; 3-히드록시아실-CoA 데히드로게나제의 결핍; 알파-만노시다제의 결핍; 방향족-L-아미노산 데카르복실라제의 결핍; 비스포스포글리세레이트 뮤타제의 결핍; 부티릴-CoA 데히드로게나제의 결핍; 페록시다제의 결핍; 갈락토키나제의 결핍; 구아니디노아세테이트 메틸트랜스퍼라제의 결핍; 히알루로노글루코사미니다제의 결핍; 리보스-5-포스페이트 이소머라제의 결핍; 스테로이드 11-베타-모노옥시게나제의 결핍; UDP글루코스-헥소스-1-포스페이트 우리딜트랜스퍼라제의 결핍; 크산틴 옥시다제의 결핍; 데제린-소타스병; 샤르코-마리-투스병, 유형 ID 및 IVF; 데제린-소타스 증후군, 상염색체 우성; 수지상 세포, 단핵구, B 림프구, 및 자연 킬러 림프구 결핍; 드뷔쿠아 이형성증 2; 드뷔쿠아 증후군; DFNA 2 비증후군성 청각 상실; 시신경 위축 및 난청을 동반한 당뇨병 및 요붕증; 당뇨병, 유형 2, 및 인슐린-의존성, 20; 다이아몬드-블랙판 빈혈 1, 5, 8, 및 10; 설사 3 (분비 나트륨, 선천성, 증후군성) 및 5 (터프팅 장병증 동반, 선천성); 디카르복실산 아미노산뇨증; 미만성 수장족저 각피증, 보트니안 유형; 수족지신장뇌 증후군; 디히드로프테리딘 리덕타제 결핍; 확장성 심근병증 1A, 1AA, 1C, 1G, 1BB, 1DD, 1FF, 1HH, 1I, 1KK, 1N, 1S, 1Y, 및 3B; 좌심실 비치밀 3; 시토크롬 p450 옥시도리덕타제 결핍으로 인한 장애성 스테로이드생성; 원위 관절만곡증 유형 2B; 원위 유전성 모터 뉴런병증 유형 2B; 원위 근병증 마르케스베리-그릭스 유형; 원위 척수성 근육 위축, X-연관 3; 첩모중생증-림프부종 증후군; 피부의 부재를 동반한 우성 이영양성 수포성 표피박리증; 우성 유전성 시신경 위축; 돈나이 바로우 증후군; 도파민 베타 히드록실라제 결핍; 도파민 수용체 d2, 감소된 뇌 밀도; 다울링-데고스병 4; 도인 벌집형 망막 이영양증; 말라티아 레벤티네스; 듀안 증후군 유형 2; 두빈-존슨 증후군; 뒤시엔느 근육 이영양증; 베커 근육 이영양증; 이상피브리노겐혈증; 선천성 이상각화증 상염색체 우성 및 상염색체 우성, 3; 선천성 이상각화증, 상염색체 열성, 1, 3, 4, 및 5; 선천성 이상각화증 X-연관; 이상운동증, 가족성, 안면 근파동 동반; 이상플라스미노겐혈증; 이상긴장증 2 (염전, 상염색체 열성), 3 (염전, X-연관), 5 (도파-반응성 유형), 10, 12, 16, 25, 26 (근간대성); 발작, 양성 가족성 영아, 2; 조기 영아 간질성 뇌병증 2, 4, 7, 9, 10, 11, 13, 및 14; 비정형 레트 증후군; 초기 T 세포 전구세포 급성 림프모구성 백혈병; 외배엽 이형성증 피부 취약성 증후군; 외배엽 이형성증-합지증 증후군 1; 수정체 편위, 고립성 상염색체 열성 및 우성; 가락결손증, 외배엽 이형성증, 및 구순열/구개 증후군 3; 엘러스-단로스 증후군 유형 7 (상염색체 열성), 전형적 유형, 유형 2 (조로), 히드록시리신-결핍, 유형 4, 유형 4 변이형, 및 테나신-X 결핍으로 인함; 아이흐스펠트 유형 선천성 근육 이영양증; 내분비-뇌골이형성증; 증진된 s-추체 증후군; 비대 전정 수도관 증후군; 엔테로키나제 결핍; 사마귀양 표피이형성증; 단순 수포성 표피박리증 및 지대 근육 이영양증, 얼룩덜룩한 색소침착을 동반한 단순 수포성 표피박리증, 유문 폐쇄증을 동반한 단순 수포성 표피박리증, 상염색체 열성 및 유문 폐쇄증을 동반한 단순 수포성 표피박리증; 표피박리성 수장족저 각피증; 가족성 열성 발작 8; 간질, 소아기 부재 2, 12 (특발성 전신, 이에 감수성) 5 (야간 전두엽), 야간 전두엽 유형 1, 부분, 가변성 초점 동반, 진행성 근간대성 3, 및 X-연관, 가변성 학습 불능 및 행동 장애 동반; 간질성 뇌병증, 소아기-발병, 초기 영아, 1, 19, 23, 25, 30, 및 32; 골단 이형성증, 다중, 근시 및 전도성 난청 동반; 간헐성 운동실조 유형 2; 간헐성 통증 증후군, 가족성, 3; 엡스타인 증후군; 펙트너 증후군; 적혈구생성 프로토포르피린증; 에스트로겐 저항성; 삼출성 유리체망막병증 6; 파브리병 및 심장 변이형 파브리병; 인자 H, VII, X, v 및 인자 VIII, 2의 복합 결핍, xiii, 서브유닛, 결핍; 가족성 선종성 폴립증 1 및 3; 두드러기 및 난청을 동반한 가족성 아밀로이드 신병증; 가족성 한랭 두드러기; 충부의 가족성 무형성증; 가족성 양성 천포창; 가족성 유방암; 유방암, 이에 감수성; 골육종; 췌장암 3; 가족성 심근병증; 가족성 한랭 자가염증성 증후군 2; 가족성 결장직장암; 가족성 삼출성 유리체망막병증, X-연관; 가족성 편마비성 편두통 유형 1 및 2; 가족성 고콜레스테롤혈증; 가족성 비후성 심근병증 1, 2, 3, 4, 7, 10, 23 및 24; 가족성 저칼륨혈증-저마그네슘혈증; 가족성 형성부전성, 사구체낭성 신장; 가족성 영아 근무력증; 가족성 소아 통풍; 가족성 지중해열 및 가족성 지중해열, 상염색체 우성; 가족성 공뇌증; 가족성 만발성 피부 포르피린증; 가족성 폐 모세혈관종증; 가족성 신장 글루코스뇨; 가족성 신장 저요산혈증; 가족성 제한성 심근병증 1; 가족성 유형 1 및 3 고지단백혈증; 판코니 빈혈, 상보군 E, I, N, 및 O; 판코니-빅켈 증후군; 잠두중독증, 이에 감수성; 열성 발작, 가족성, 11; 페인골드 증후군 1; 태아성 헤모글로빈 정량적 형질 유전자좌 1; FG 증후군 및 FG 증후군 4; 외안근의 섬유증, 선천성, 1, 2, 3a (안외 침범 동반 또는 비동반), 3b; 피쉬-아이 질환; 반점 각막 이영양증; 플로팅-하버 증후군; 정신 지체 동반 또는 비동반 언어 장애를 동반한 초점성 간질; 초점성 분절성 사구체경화증 5; 전뇌 결함; 프랭크 테르 하르 증후군; 보론 디 로코 크로바토 증후군; 프레이저 증후군; 윌름스 종양 1; 프리만-쉘돈 증후군; 전두골간단 이형성증 1 및 3; 전두측두엽 치매; 전두측두엽 치매 및/또는 근위축성 측삭 경화증 3 및 4; 전두측두엽 치매 염색체 3-연관 및 전두측두엽 치매 유비퀴틴-양성; 프룩토스-비포스파타제 결핍; 푸르만 증후군; 감마-아미노부티르산 트랜스아미나제 결핍; 감스토르프-볼파르트 증후군; 고셔병 유형 1 및 아급성 뉴런병증성; 주시 마비, 가족성 수평, 진행성 척추측만증 동반; 전신 우성 이영양성 수포성 표피박리증; 열성 발작을 동반한 전신 간질 플러스 3, 유형 1, 유형 2; 간질성 뇌병증 레녹스-가스토 유형; 거대 축삭 신경병증; 글라즈만 혈소판무력증; 녹내장 1, 개방각, e, F, 및 G; 녹내장 3, 원발성 선천성, d; 녹내장, 선천성 및 녹내장, 선천성, 결손증; 녹내장, 원발성 개방각, 소아-발병; 신경교종 감수성 1; 글루코스 수송체 유형 1 결핍 증후군; 글루코스-6-포스페이트 수송 결함; GLUT1 결핍 증후군 2; 간질, 특발성 전신, 이에 감수성, 12; 글루타메이트 포름이미노트랜스퍼라제 결핍; 글루타르산혈증 IIA 및 IIB; 글루타르산뇨, 유형 1; 글루타티온 신테타제 결핍; 글리코겐 축적 질환 0 (근육), II (성인 형태), IXa2, IXc, 유형 1A; 유형 II, 유형 IV, IV (복합 간 및 근병증성), 유형 V, 및 유형 VI; 골드만-파브르 증후군; 고돈 증후군; 골린 증후군; 완전전뇌증 서열; 완전전뇌증 7; 육아종성 질환, 만성, X-연관, 변이형; 난소의 과립막 세포 종양; 회색 혈소판 증후군; 그리셀리 증후군 유형 3; 그뢰노우브 각막 이영양증 유형 I; 성장 및 정신 지체, 하악안면 이골증, 소두증, 및 구개열; 뇌하수체 기형을 동반한 성장 호르몬 결핍; 면역결핍을 동반한 성장 호르몬 무감응; GTP 시클로히드롤라제 I 결핍; 하쥬-체니 증후군; 수족 자궁 증후군; 청각 장애; 혈관종, 모세관 영아; 혈액 신생물; 혈색소증 유형 1, 2B, 및 3; 당뇨병의 미세혈관 합병증 7; 트랜스페린 혈청 수준 정량적 형질 유전자좌 2; 헤모글로빈 H 질환, 비결실; 용혈성 빈혈, 비구상, 글루코스 포스페이트 이소머라제 결핍으로 인함; 혈구포식성 림프조직구증식증, 가족성, 2; 혈구포식성 림프조직구증식증, 가족성, 3; 헤파린 보조인자 II 결핍; 유전성 장병성 말단피부염; 유전성 유방 및 난소암 증후군; 운동실조-모세혈관확장증-유사 장애; 유전성 미만성 위암; 타원체를 동반한 유전성 미만성 백질뇌병증; 유전성 인자 II, IX, VIII 결핍 질환; 유전성 출혈성 모세혈관확장증 유형 2; 무한증을 동반한 유전성 무통각증; 유전성 림프부종 유형 I; 시신경 위축을 동반한 유전성 운동 및 감각 신경병증; 초기 호흡 부전을 동반한 유전성 근병증; 유전성 신경통 근위축; 유전성 비폴립증 결장직장 신생물; 린치 증후군 I 및 II; 유전성 췌장염; 췌장염, 만성, 이에 감수성; 유전성 감각 및 자율 신경병증 유형 IIB 및 IIA; 유전성 철적혈모구성 빈혈; 헤르만스키-푸들라크 증후군 1, 3, 4, 및 6; 착위, 내장, 2, 4, 및 6, 상염색체; 착위, 내장, X-연관; 이소증; 조직구성 수질성 망상증; 조직구증-림프절병증 플러스 증후군; 홀로카르복실라제 신테타제 결핍; 완전전뇌증 2, 3,7, 및 9; 홀트-오람 증후군; MTHFR 결핍으로 인한 호모시스테인혈증, CBS 결핍으로 인한 호모시스틴뇨증, 및 호모시스틴뇨증, 피리독신-반응성; 코발라민 대사에서의 결함으로 인한 호모시스틴뇨증-거대적모구성 빈혈, cblE 보완 유형; 호웰-에반스 증후군; 후를러 증후군; 허친슨-길포드 증후군; 수두증; 고암모니아혈증, 유형 III; 고콜레스테롤혈증 및 고콜레스테롤혈증, 상염색체 열성; 과도놀람증 2 및 과도놀람증 유전성; 고페리틴혈증 백내장 증후군; 고글리신뇨증; 주기열을 동반한 고이뮤노글로불린 D; 메발론산뇨증; 고이뮤노글로불린 E 증후군; 고인슐린혈증성 저혈당증 가족성 3, 4, 및 5; 고인슐린증-고암모니아혈증 증후군; 고리신혈증; 이상긴장증, 다혈구혈증 및 간경변증을 동반한 고망가니즈혈증; 고오르니틴혈증-고암모니아혈증-호모시트룰린뇨증 증후군; 부갑상선기능항진증 1 및 2; 부갑상선기능항진증, 신생아 중증; 고페닐알라닌혈증, bh4-결핍, a, 부분 pts 결핍으로 인함, BH4-결핍, D, 및 비-pku; 정신 지체 증후군을 동반한 고포스파타제증 2, 3, 및 4; 털감소증성 골연골이형성증; 저베타지단백혈증, 가족성, apob32 연관; 저칼슘혈증, 상염색체 우성 1; 저칼슘뇨 고칼슘혈증, 가족성, 유형 1 및 3; 저연골형성; 철 과부하를 동반한 저색소성 소구성 빈혈; 간 내 글리코겐 신테타제의 결핍을 동반한 저혈당증; 후각결여 동반 또는 비동반 저생식선자극 생식선기능저하증 11; 면역 결핍을 동반한 발한저하성 외배엽 이형성증; 발한저하성 X-연관 외배엽 이형성증; 저칼륨혈성 주기성 마비 1 및 2; 저마그네슘혈증 1, 장; 저마그네슘혈증, 발작, 및 정신 지체; 저수초형성 백질이영양증 7; 형성부전성 좌심 증후군; 방실 중격 결손 및 공통 방실 접합부; 요도하열 1 및 2, X-연관; 갑상선기능저하증, 선천성, 비갑상선종성, 1; 털감소증 8 및 12; 털감소증-림프부종-모세혈관확장증 증후군; I 혈액형 시스템; 지멘스 수포성 어린선; 박탈성 어린선; 어린선 조숙 증후군; 특발성 기저 신경절 석회화 5; 특발성 섬유화 폐포염, 만성 형태; 선천성 이상각화증, 상염색체 우성, 2 및 5; 영아기의 특발성 고칼슘혈증; 칼슘 유입 결함으로 인한 T-세포 불활성화를 동반한 면역 기능장애 2; 면역결핍 15, 16, 19, 30, 31C, 38, 40, 8, cd3-제타에서의 결함으로 인함, 과다 IgM 동반 유형 1 및 2, 및 X-연관, 마그네슘 결함, 엡스타인-바르 바이러스 감염 및 신생물 동반; 면역결핍-동원체 불안정성-안면 기형 증후군 2; 봉입체 근병증 2 및 3; 노나카 근병증; 영아 경련 및 발작성 무도무정위운동증, 가족성; 영아 피질 과골증; 영아 GM1 강글리오시드증; 영아 저포스파타제증; 영아 신결석증; 영아 안진, X-연관; 영아 파킨슨증-이상긴장증; 다중-꼬리 정자 및 과도한 DNA와 연관된 불임; 인슐린 저항성; 인슐린-저항성 당뇨병 및 흑색 극세포증; 인슐린-의존성 당뇨병 분비성 설사 증후군; 간질성 신염, 거대세포핵; 자궁내 성장 지연, 골간단 이형성증, 선천성 부신 저형성증, 및 생식기 기형; 아이오도티로실 커플링 결함; IRAK4 결핍; 이리도전방각이발생증 우성 유형 및 유형 1; 뇌 내 철 축적; 좌골슬개골 이형성증; 도세포 증식증; 고립성 17,20-리아제 결핍; 고립성 루트로핀 결핍; 이소발레릴-CoA 데히드로게나제 결핍; 잔코빅 리베라 증후군; 제벨 랑쥐-닐슨 증후군 2; 주버트 증후군 1, 6, 7, 9/15 (이유전자), 14, 16, 및 17, 및 구안지 증후군 xiv; 헬리츠 중증 접합부 수포성 표피박리증; 소아 GM>1< 강글리오시드증; 소아 폴립증 증후군; 소아 폴립증/유전성 출혈성 모세혈관확장증 증후군; 소아 망막층간분리; 가부키 메이크업 증후군; 칼만 증후군 1, 2, 및 6; 지연된 사춘기; 칸자키병; 카라크 증후군; 카르타게너 증후군; 케니-카페이 증후군 유형 2; 케펜-루빈스키 증후군; 원추각막 1; 모낭 각화증; 선상 수장족저 각화증 1; 킨틀러 증후군; L-2-히드록시글루타르산뇨; 라슨 증후군, 우성 유형; 격자 각막 이영양증 유형 III; 레베르 흑암시; 젤베거 증후군; 퍼옥시솜 생물발생 장애; 젤베거 증후군 스펙트럼; 레베르 선천성 흑암시 11, 12, 13, 16, 4, 7, 및 9; 레베르 시신경 위축; 아미노글리코시드-유발 난청; 난청, 비증후군성 감각신경성, 미토콘드리아; 좌심실 비치밀 5; 좌우축 기형; 리병; 미토콘드리아 단쇄 에노일-CoA 히드라타제 1 결핍; 미토콘드리아 복합체 I 결핍으로 인한 리 증후군; 라이너병; 레리 웨일 이상연골골형성증; 치사 선천성 구축 증후군 6; 백혈구 부착 결핍 유형 I 및 III; 백질이영양증, 저수초형성, 11 및 6; 백질뇌병증, 운동실조 동반, 뇌간 및 척수 침범 및 락테이트 상승 동반, 소멸 백질 동반, 및 진행성, 난소 부전 동반; 전체 백색손발톱; 루이 소체 치매; 리히텐스타인-노르 증후군; 리-프라우메니 증후군 1; Lig4 증후군; 지대 근육 이영양증, 유형 1B, 2A, 2B, 2D, C1, C5, C9, C14; 뇌 및 안구 기형을 동반한 선천성 근육 이영양증-디스트로글리칸병증, 유형 A14 및 B14; 리파제 결핍 복합; 지질 단백증; 지방이영양증, 가족성 부분, 유형 2 및 3; 활택뇌증 1, 2 (X-연관), 3, 6 (소두증 동반), X-연관; 피질하 층형 이소증, X-연관; 간부전 급성 영아; 로이스-디에츠 증후군 1, 2, 3; 긴 QT 증후군 1, 2, 2/9, 2/5, (이유전자), 3, 5 및 5, 후천성, 이에 감수성; 폐암; 림프부종, 유전성, id; 림프부종, 원발성, 골수이형성증 동반; 림프증식성 증후군 1, 1 (X-연관), 및 2; 리소솜 산 리파제 결핍; 대두증, 거구증, 안면 이형 증후군; 황반 이영양증, 난황상, 성인-발병; 악성 고온요법 감수성 유형 1; 악성 림프종, 비-호지킨; 악성 흑색종; 전립선의 악성 종양; 하악말단 이골증; 유형 A 또는 B 지방이영양증을 동반한 하악말단 이형성증, 비정형; 하악안면 이골증, 트리처 콜린스 유형, 상염색체 열성; 만노스-결합 단백질 결핍; 메이플 시럽뇨 질환 유형 1A 및 유형 3; 마르덴 워커 유사 증후군; 마르팡 증후군; 마린스코-쇼그렌 증후군; 마트솔프 증후군; 청소년의 성숙기-발병 당뇨병, 유형 1, 유형 2, 유형 11, 유형 3, 및 유형 9; 메이-헤글린 기형; MYH9 관련 장애; 세바스티안 증후군; 맥쿤-올브라이트 증후군; 소마토트로프 선종; 성별 코드-기질 종양; 쿠싱 증후군; 맥쿠식 카우프만 증후군; 맥레오드 신경유극적혈구증가증 증후군; 멕켈-그루버 증후군; 중간쇄 아실-조효소 A 데히드로게나제 결핍; 수모세포종; 피질하 낭을 동반한 거대뇌성 백질뇌병증 1 및 2a; 거대뇌증 선천성 모세혈관확장 대리석 피부증; PIK3CA 관련 과도성장 스펙트럼; 거대뇌증-다소뇌회증-다지증-수두증 증후군 2; 거대적모구성 빈혈, 티아민-반응성, 당뇨병 및 감각신경성 난청 동반; 마이어-골린 증후군 1 및 4; 멜닉-니들스 증후군; 수막종; 정신 지체, X-연관, 3, 21, 30, 및 72; 정신 지체 및 뇌교 및 소뇌 저형성증을 동반한 소두증; 정신 지체 X-연관 증후군 5; 정신 지체, 전방 상악 돌출, 및 사시; 정신 지체, 상염색체 우성 12, 13, 15, 24, 3, 30, 4, 5, 6,및 9; 정신 지체, 상염색체 열성 15, 44, 46, 및 5; 정신 지체, 상동증적 운동, 간질 및/또는 뇌 기형; 정신 지체, 증후군성, 클라에스-젠슨 유형, X-연관; 정신 지체, X-연관, 비특이적, 증후군성, 헤데라 유형, 및 증후군성, wu 유형; 메로신 결핍 선천성 근육 이영양증; 이염성 백질이영양증 소아, 후기 영아, 및 성인 유형; 이염성 백질이영양증; 영양위축성 이형성증; 메트헤모글로빈혈증 유형 I 및 2; 메티오닌 아데노실트랜스퍼라제 결핍, 상염색체 우성; 호모시스틴뇨증을 동반한 메틸말론산혈증; 메틸말론산뇨 cblB 유형; 메틸말로닐-CoA 뮤타제 결핍으로 인한 메틸말론산뇨; 메틸말론산뇨, mut(0) 유형; 소두 골이형성 원발 왜소증 유형 2; 맥락망막병증, 림프부종 또는 정신 지체 동반 또는 비동반 소두증; 소두증, 열공 헤르니아 및 신증후군; 소두증; 뇌량의 저형성증; 경직성 하반신마비 50, 상염색체 열성; 전반적 발달 지연; CNS 저수포형성증; 뇌 위축; 소두증, 정상 지능 및 면역결핍; 소두증-모세관 기형 증후군; 소구성 빈혈; 소안구증 증후군성 5, 7, 및 9; 소안구증, 고립성 3, 5, 6, 8, 및 결손증 동반 6; 구형소수정체증; 편두통, 가족성 뇌기저; 밀러 증후군; 외안근마비를 동반한 미니코어 근병증; 근병증, 코어 동반 선천성; 미첼-릴리 증후군; 미토콘드리아 3-히드록시-3-메틸글루타릴-CoA 신타제 결핍; 미토콘드리아 복합체 I, II, III, III (핵 유형 2, 4, 또는 8) 결핍; 미토콘드리아 DNA 고갈 증후군 11, 12 (심근병증 유형), 2, 4B (MNGIE 유형), 8B (MNGIE 유형); 미토콘드리아 DNA-고갈 증후군 3 및 7, 간뇌 유형, 및 13 (뇌근병증 유형); 미토콘드리아 포스페이트 담체 및 피루베이트 담체 결핍; 미토콘드리아 삼중기능성 단백질 결핍; 긴-쇄 3-히드록시아실-CoA 데히드로게나제 결핍; 미요시 근육 이영양증 1; 근병증, 원위, 전경골 발병 동반; 모어-트라네뱌예르크 증후군; 몰리브데넘 보조인자 결핍, 상보군 A; 모와트-윌슨 증후군; 점액지질증 III 감마; 뮤코폴리사카라이드증 유형 VI, 유형 VI (중증), 및 유형 VII; 뮤코폴리사카라이드증, MPS-I-H/S, MPS-II, MPS-III-A, MPS-III-B, MPS-III-C, MPS-IV-A, MPS-IV-B; 색소성 망막염 73; 강글리오시드증 GM1 유형1 (심장 침범 동반) 3; 다중심성 골용해 신병증; 다중심성 골용해, 소결절증 및 관절병증; 다발성 선천성 기형; 심방 중격 결손 2; 다발성 선천성 기형-저긴장증-발작 증후군 3; 다중 피부 및 점막 정맥 기형; 다발성 내분비 신생물, 유형 1 및 4; 다중 골단 이형성증 5 또는 우성; 다중 위장 폐쇄증; 다중 익상편 증후군 에스코바르 유형; 다중 술파타제 결핍; 다중 익상편 증후군 3; 근육 AMP 구아닌 옥시다제 결핍; 근육 안구 뇌 질환; 근육 이영양증, 선천성, 메가코니알 유형; 근무력증, 가족성 영아, 1; 근무력 증후군, 선천성, 11, 아세틸콜린 수용체 결핍 연관; 근무력 증후군, 선천성, 17, 2A (느린-채널), 4B (빠른-채널), 및 관상 응집체 부재; 미엘로퍼옥시다제 결핍; MYH-연관 폴립증; 자궁내막 암종; 심근경색 1; 근간대성 이상긴장증; 근간대성-무긴장성 간질; 불균일 적색 근섬유를 동반한 간질을 동반한 근간대성경련; 근원섬유성 근병증 1 및 ZASP-관련; 미오글로빈뇨, 급성 재발성, 상염색체 열성; 근신경 위장 뇌병증 증후군; 진행성 외안근마비를 동반한 영아 소뇌 운동실조; 미토콘드리아 DNA 고갈 증후군 4B, MNGIE 유형; 근병증, 중심핵성, 1, 선천성, 과량의 근육 스핀들 동반, 원위, 1, 락트산 산증, 및 철적혈모구성 빈혈 1, 미토콘드리아 진행성, 선천성 백내장, 청각 상실 및 발달 지체 동반, 및 관상 응집체, 2; 근시 6; 근경화증, 상염색체 열성; 선천성 근긴장증; 선천성 근긴장증, 상염색체 우성 및 열성 형태; 손발톱-슬개골 증후군; 난스-호란 증후군; 소안구증 2; 나바호 신경간병증; 네말린 근병증 3 및 9; 신생아 저긴장증; 지적 장애; 발작; 지연된 말 및 언어 발달; 정신 지체, 상염색체 우성 31; 시트린 결핍에 의해 유발된 신생아 간내 담즙정체; 신원성 요붕증, 신원성 요붕증, X-연관; 신석증/골다공증, 저인산혈증, 2; 신결석증 13, 15 및 4; 불임; 뇌-안구-신장 증후군 (신결석증, 안구운동 실행증 및 소뇌 이상); 신증후군, 유형 3, 유형 5, 안구 이상 동반 또는 비동반, 유형 7, 및 유형 9; 네스토르-기예르모 조로증 증후군; 노이-락소바 증후군 1; 뇌 철 축적을 동반한 신경변성 4 및 6; 신경계페리틴병증; 신경섬유종증, 유형 1 및 유형 2; 신경섬유육종; 신경뇌하수체 요붕증; 신경병증, 유전성 감각, 유형 IC; 중성 1 아미노산 수송 결함; 근병증을 동반한 중성 지질 축적 질환; 호중구 면역결핍 증후군; 니콜라이데스-바라이처 증후군; 니만-픽병 유형 C1, C2, 유형 A, 및 유형 C1, 성인 형태; 비-케톤성 고글리신혈증; 누난 증후군 1 및 4, 레오파드 증후군 1; 소아 골수단핵구성 백혈병 동반 또는 비동반 누난 증후군-유사 장애; 정상칼륨혈성 주기성 마비, 칼륨-감수성; 노룸병; 간질, 청각 상실, 및 정신 지체 증후군; 정신 지체, X-연관 102 및 증후군성 13; 비만; 안구 백색증, 유형 I; 눈피부 백색증 유형 1B, 유형 3, 및 유형 4; 눈코치아골격 이형성증; 치아저포스파타제증; 오돈토트리코멜릭 증후군; 오구치병; 치아부족증-결장직장암 증후군; 오피츠 G/BBB 증후군; 시신경 위축 9; 구강-안면-수족지 증후군; 오르니틴 아미노트랜스퍼라제 결핍; 구강안면열 11 및 7, 구순열/구개-외배엽 이형성증 증후군; 오르스타빅 린데만 솔베르크 증후군; 경도 연골이형성증을 동반한 골관절염; 박리성 골연골염; 골형성 부전증 유형 12, 유형 5, 유형 7, 유형 8, 유형 I, 유형 III, 정상 공막 동반, 우성 형태, 열성 주산기 치사; 두개 경화증을 동반한 선상 골병증; 골화석증 상염색체 우성 유형 1 및 2, 열성 4, 열성 1, 열성 6; 가성신경교종을 동반한 골다공증; 귀-구개-수족지 증후군, 유형 I 및 II; 난소 이발생증 1; 난소백질이영양증; 선천성 손발톱비대증 4 및 유형 2; 골의 파제트병, 가족성; 팔리스터-홀 증후군; 수장족저 각피증, 비표피박리성, 초점성 또는 미만성; 췌장 무발생증 및 선천성 심장 질환; 파피용-르페브르 증후군; 부신경절종 3; 폰 오일렌부르크의 선천성 이상근긴장증; 부갑상선 암종; 파킨슨병 14, 15, 19 (소아-발병), 2, 20 (조기 발병), 6, (상염색체 열성 조기 발병, 및 9; 부분 백색증; 부분 하이포크산틴-구아닌 포스포리보실트랜스퍼라제 결핍; 망막 색소 상피의 패턴화된 이영양증; PC-K6a; 펠리제우스-메르츠바허병; 펜드레드 증후군; 말초 탈수초성 신경병증, 중앙 이상수초화; 히르쉬스프룽 질환; 영속성 신생아 당뇨병; 당뇨병, 영속성 신생아, 신경계 양상 동반; 신생아 인슐린-의존성 당뇨병; 청소년의 성숙기-발병 당뇨병, 유형 2; 퍼옥시솜 생물발생 장애 14B, 2A, 4A, 5B, 6A, 7A, 및 7B; 페라울트 증후군 4; 페리 증후군; 영아기의 지속성 고인슐린혈증성 저혈당증; 가족성 고인슐린증; 표현형; 페닐케톤뇨; 크롬친화세포종; 유전성 부신경절종-크롬친화세포종 증후군; 부신경절종 1; 장의 카르시노이드 종양; 코우덴 증후군 3; 포스포글리세레이트 데히드로게나제 결핍; 포스포글리세레이트 키나제 1 결핍; 감광성 모발유황이영양증; 피탄산 축적 질환; 픽병; 피어슨 증후군; 색소성 망막 이영양증; 색소침착 결절성 부신피질 질환, 원발성, 1; 모기질세포종; 피트-홉킨스 증후군; 뇌하수체 의존성 고코르티솔증; 뇌하수체 호르몬 결핍, 복합 1, 2, 3, 및 4; 플라스미노겐 활성인자 억제제 유형 1 결핍; 플라스미노겐 결핍, 유형 I; 혈소판-유형 출혈 장애 15 및 8; 다형피부증, 유전성 섬유화성, 건 구축, 근병증 및 폐 섬유증 동반; 다낭성 신장 질환 2, 성인 유형, 및 영아 유형; 경화성 백질뇌병증을 동반한 다낭성 지질막성 골이형성증; 면역결핍 동반 또는 비동반 폴리글루코산체 근병증 1; 다소뇌회증, 비대칭, 양측 전두두정; 다발신경병증, 청각 상실, 운동실조, 색소성 망막염, 및 백내장; 교뇌소뇌 저형성증 유형 4; 슬와 익상편 증후군; 공뇌증 2; 한공각화증 8, 파종성 표재성 광선 유형; 포르포빌리노겐 신타제 결핍; 만발성 피부 포르피린증; 색소성 망막염을 동반한 척수후 기둥 운동실조; 후방 극성 백내장 유형 2; 프라더-윌리-유사 증후군; 조기 난소 부전 4, 5, 7, 및 9; 원발성 상염색체 열성 소두증 10, 2, 3, 및 5; 원발성 섬모 이상운동증 24; 원발성 확장성 심근병증; 좌심실 비치밀 6; 4, 좌심실 비치밀 10; 발작성 심방 세동; 원발성 고옥살산뇨, 유형 I, 유형, 및 유형 III; 원발성 비대성 골관절병증, 상염색체 열성 2; 원발성 저마그네슘혈증; 원발성 개방각 녹내장 소아 발병 1; 원발성 폐고혈압; 프림로즈 증후군; 진행성 가족성 심장 차단 유형 1B; 진행성 가족성 간내 담즙정체 2 및 3; 진행성 간내 담즙정체; 운동실조를 동반한 진행성 근간대성경련 간질; 진행성 가성류마티스 이형성증; 진행성 경화성 회백질위축증; 프롤리다제 결핍; 프롤린 데히드로게나제 결핍; 정신분열증 4; 프로페르딘 결핍, X-연관; 프로피온산혈증; 전구단백질 컨버타제 1/3 결핍; 전립선암, 유전성, 2; 적색각이상 결함; 단백뇨; 핀란드 선천성 신증후군; 프로테우스 증후군; 유방 선암종; 가연골무형성 척추골단 이형성증 증후군; 제1형 가성저알도스테론증 상염색체 우성 및 열성 및 유형 2; 가성부갑상선기능저하증 유형 1A, 가가성부갑상선기능저하증; 가성신생아 부신백질이영양증; 가성원발성 고알도스테론증; 탄성섬유 가성황색종; 영아기의 전신 동맥 석회화 2; 다중 응고 인자 결핍을 동반한 탄성섬유 가성황색종-유사 장애; 건선 감수성 2; PTEN 과오종 종양 증후군; 유전성 출혈성 모세혈관확장증 관련 폐동맥 고혈압; 폐 섬유증 및/또는 골수 부전, 텔로미어-관련, 1 및 3; 폐고혈압, 원발성, 1, 유전성 출혈성 모세혈관확장증 동반; 퓨린-뉴클레오시드 포스포릴라제 결핍; 피루베이트 카르복실라제 결핍; 피루베이트 데히드로게나제 E1-알파 결핍; 적혈구의 피루베이트 키나제 결핍; 레인 증후군; RAS병증; 열성 이영양성 수포성 표피박리증; 손발톱 장애, 비증후군성 선천성, 8; 라이펜스타인 증후군; 신장 이형성증; 신장 카르니틴 수송 결함; 신장 결손증 증후군; 신장 이형성증; 신장 이형성증, 망막 색소성 이영양증, 소뇌 운동실조 및 골격 이형성증; 신세관성 산증, 원위, 상염색체 열성, 후기-발병 감각신경성 청각 상실 동반, 또는 용혈성 빈혈 동반; 신세관성 산증, 근위, 안구 이상 및 정신 지체 동반; 망막 원추 이영양증 3B; 색소성 망막염; 색소성 망막염 10, 11, 12, 14, 15, 17, 및 19; 색소성 망막염 2, 20, 25, 35, 36, 38, 39, 4, 40, 43, 45, 48, 66, 7, 70, 72; 망막모세포종; 레트 장애; 횡문근양 종양 소인 증후군 2; 열공성 망막 박리, 상염색체 우성; 근형부 점상 연골이형성증 유형 2 및 유형 3; 로버츠-SC 해표지증 증후군; 로비노 소라우프 증후군; 로비노 증후군, 상염색체 열성, 상염색체 열성, 단지-신-다지증 동반; 로트문드-톰슨 증후군; 라파딜리노 증후군; RRM2B-관련 미토콘드리아 질환; 루빈스타인-테이비 증후군; 살라병; 샌드호프병, 성인 및 영아 유형; 사르코이드증, 조기 발병; 블라우 증후군; 쉰들러병, 유형 1; 분열뇌증; 정신분열증 15; 슈네켄베켄 이형성증; 슈반세포종증 2; 슈바르츠 얌펠 증후군 유형 1; 공막화각막, 상염색체 열성; 경화협착; 속발성 갑상선기능저하증; 세가와 증후군, 상염색체 열성; 시니어-로켄 증후군 4 및 5; 감각 실조 신경병증, 구음장애, 및 안근부전마비; 세피아프테린 리덕타제 결핍; 참깨 증후군; ADA 결핍으로 인한 중증 복합 면역결핍, 소두증, 성장 지연 및 이온화 방사선에 대한 감수성 동반, 비정형, 상염색체 열성, T 세포-음성, B 세포-양성, NK 세포-음성 또는 NK-양성; 중증 선천성 호중구감소증; 중증 선천성 호중구감소증 3, 상염색체 열성 또는 우성; 중증 선천성 호중구감소증 및 6, 상염색체 열성; 영아기에서의 중증 근간대성 간질; 열성 발작을 동반한 전신 간질 플러스, 유형 1 및 2; 중증 X-연관 근세관성 근병증; 짧은 QT 증후군 3; 비특이적 골격 이상을 동반한 저신장; 저신장, 이도 폐쇄증, 하악 저형성증, 골격 이상; 저신장, 손발톱이형성증, 안면 이형, 및 털감소증; 원발 왜소증; 다지증 동반 또는 비동반 짧은-늑골 흉부 이형성증 11 또는 3; 시알산증 유형 I 및 II; 은 경직성 하반신마비 증후군; 느려진 신경 전도 속도, 상염색체 우성; 스미스-렘리-오피츠 증후군; 스나이더 로빈슨 증후군; 소마토트로프 선종; 프로락틴선종; 가족성, 뇌하수체 선종 소인; 소토스 증후군 1 또는 2; 경직성 운동실조 5, 상염색체 열성, 샤를부아-사기네이 유형, 1, 10, 또는 11, 상염색체 열성; 근위축성 측삭 경화증 유형 5; 경직성 하반신마비 15, 2, 3, 35, 39, 4, 상염색체 우성, 55, 상염색체 열성, 및 5A; 담즙산 합성 결함, 선천성, 3; 정자발생 실패 11, 3, 및 8; 구상적혈구증 유형 4 및 5; 타원체 근병증; 척수성 근육 위축, 하지 우세형 2, 상염색체 우성; 척수성 근육 위축, 유형 II; 척수소뇌성 운동실조 14, 21, 35, 40, 및 6; 척수소뇌성 운동실조 상염색체 열성 1 및 16; 비장 저형성증; 척추손목발목 유합증 증후군; 스폰딜로케이로디스플라시아, 엘러스-단로스 증후군-유사, 면역 조절이상 동반, 아그레칸 유형, 선천성 관절 탈구 동반, 짧은 사지-손 유형, 세다가티안 유형, 추체-간체 이영양증 동반, 및 코즐로우스키 유형; 파라스트렘마틱 왜소증; 스타르가르트병 1; 추체-간체 이영양증 3; 스티클러 증후군 유형 1; 니스트 이형성증; 스티클러 증후군, 유형 1 (비증후군성 안구) 및 4; 자상-연관 혈관병증, 영아-발병; 스토르모르켄 증후군; 스터지-웨버 증후군, 모세관 기형, 선천성, 1; 숙시닐-CoA 아세토아세테이트 트랜스퍼라제 결핍; 수크라제-이소말타제 결핍; 영아 돌연사 증후군; 술파이트 옥시다제 결핍, 고립성; 판막위 대동맥 협착; 계면활성제 대사 기능장애, 폐, 2 및 3; 지절유합증, 근위, 1b; 합지증 세나니 렌즈 유형; 합지증 유형 3; 증후군성 X-연관 정신 지체 16; 내반첨족; 탄지에르병; TARP 증후군; 테이-삭스병, B1 변이형, Gm2-강글리오시드증 (성인), Gm2-강글리오시드증 (성인-발병); 템타미 증후군; 테노리오 증후군; 말단 골 이형성증; 테스토스테론 17-베타-데히드로게나제 결핍; 사지절단증, 상염색체 열성; 팔로 사징증; 형성부전성 좌심 증후군 2; 동맥간증; 심장 및 대혈관의 기형; 심실 중격 결손 1; 티엘-벤케 각막 이영양증; 흉부 대동맥류 및 대동맥 박리; 마르파노이드 체형; 3 M 증후군 2; 혈소판감소증, 혈소판 기능장애, 용혈, 및 불균형 글로빈 합성; 혈소판감소증, X-연관; 혈전성향증, 유전성, 단백질 C 결핍으로 인함, 상염색체 우성 및 열성; 갑상선 무발생증; 갑상선암, 여포성; 갑상선 호르몬 대사, 비정상적; 갑상선 호르몬 저항성, 전신, 상염색체 우성; 갑상선중독성 주기성 마비 및 갑상선중독성 주기성 마비 2; 티로트로핀-방출 호르몬 저항성, 전신; 티모시 증후군; TNF 수용체-연관 주기성 발열 증후군 (TRAPS); 치아 무발생증, 선택적, 3 및 4; 토르사드 드 포인트; 타운즈-브룩스-아가미귀신장-유사 증후군; 신생아의 일과성 수포성 피부박리증; 트리처 콜린스 증후군 1; 정신 지체, 왜소증 및 색소성 망막 변성을 동반한 긴속눈썹증; 모발비지절 이형성증 유형 I; 모발비지절 증후군 유형 3; 트리메틸아민뇨; 결절성 경화증 증후군; 림프관근종증; 결절성 경화증 1 및 2; 티로시나제-음성 눈피부 백색증; 티로시나제-양성 눈피부 백색증; 티로신혈증 유형 I; UDP글루코스-4-에피머라제 결핍; 울리히 선천성 근육 이영양증; 중증 사지 결핍을 동반한 척골 및 비골 부재; 업쇼-슐만 증후군; 우로카네이트 히드라타제 결핍; 어셔 증후군, 유형 1, 1B, 1D, 1G, 2A, 2C, 및 2D; 색소성 망막염 39; UV-감수성 증후군; 반더우드 증후군; 반 말데르겜 증후군 2; 헤네캄 림프관확장증-림프부종 증후군 2; 혼합 포르피린증; 낭성 신장 질환을 동반한 뇌실확장증; 베르헤이즈 증후군; 초장쇄 아실-CoA 데히드로게나제 결핍; 방광요관 역류 8; 내장 착위 5, 상염색체; 내장 근병증; 비타민 D-의존성 구루병, 유형 1 및 2; 난황상 이영양증; 폰 빌레브란트 질환 유형 2M 및 유형 3; 바르덴부르크 증후군 유형 1, 4C, 및 2E (신경계 침범 동반); 클라인-바르덴베르크 증후군; 바커-바르부르크 선천성 근육 이영양증; 바르부르크 마이크로 증후군 2 및 4; 사마귀, 저감마글로불린혈증, 감염, 및 골수배출장애; 위버 증후군; 바일-마르케사니 증후군 1 및 3; 바일-마르케사니-유사 증후군; 바이센바허-즈베이뮬러 증후군; 베르드니히-호프만병; 샤르코-마리-투스병; 베르너 증후군; WFS1-관련 장애; 비데만-스타이너 증후군; 윌슨병; 볼프람-유사 증후군, 상염색체 우성; 워스병; 반 부헴병 유형 2; 색소성 건피증, 상보군 b, D군, E군, 및 G군; X-연관 무감마글로불린혈증; X-연관 유전성 운동 및 감각 신경병증; 스테릴-술파타제 결핍을 동반한 X-연관 어린선; X-연관 뇌실주위 이소증; 귀-구개-수족지 증후군, 유형 I; X-연관 중증 복합 면역결핍; 짐메르만-라반트 증후군 및 짐메르만-라반트 증후군 2; 및 층판 분말상 백내장 3.
특정한 측면에서, 본 개시내용은 확장 반복 장애 (또한 반복부 확장 장애 또는 트리뉴클레오티드 반복 장애로도 공지됨)로 진단된 대상체의 치료를 위한 TPRT-기반 방법을 제공한다. 확장 반복 장애는 미소위성체 반복부가 한계 길이를 넘어 확장되는 경우에 발생한다. 현재, 적어도 30종의 유전 질환이 반복부 확장에 의해 유발되는 것으로 여겨진다. 이러한 다양한 장애 군의 과학적 이해는 1990년대 초반에 트리뉴클레오티드 반복부가 유약 X, 척수성 및 연수성 근육 위축, 근긴장성 이영양증, 및 헌팅톤병 (문헌 [Nelson et al., "The unstable repeats - three evolving faces of neurological disease," Neuron, March 6, 2013, Vol.77; 825-843], 이는 본원에 참조로 포함됨), 뿐만 아니라 하우 리버 증후군, 야콥센 증후군, 치상핵적핵-담창구시상하핵 위축 (DRPLA), 마차도-요셉병, 합다지증 (SPD II), 수족 생식기 증후군 (HFGS), 쇄골두개 이형성증 (CCD), 완전전뇌증 장애 (HPE), 선천성 중추성 과다호흡 증후군 (CCHS), ARX-비증후군성 X-연관 정신 지체 (XLMR), 및 안인두 근육 이영양증 (OPMD)을 포함한 여러 주요 유전성 상태의 기저를 이룬다는 발견으로 인해 이루어졌다 (참조). 미소위성체 반복부 불안정성은 이들 상태의 특징인 것으로 밝혀졌으며, 이는 예상된 바와 같이 - 반복부 확장은 각각의 연속 세대에서 발생할 수 있는 현상이며, 이는 자손에서 보다 중증의 표현형 및 보다 이른 발병 연령으로 이어진다. 반복부 확장은 여러 상이한 메카니즘을 통해 질환을 유발하는 것으로 여겨진다. 즉, 확장은 유전자, mRNA 전사체, 및/또는 코딩된 단백질의 수준에서 세포 기능을 방해할 수 있다. 일부 조건에서, 돌연변이는 반복부-함유 유전자를 침묵시킴으로써 기능 상실 메카니즘을 통해 작용한다. 다른 실시양태에서, 질환은 기능 획득 메카니즘으로 인해 발생하며, 그에 의해 mRNA 전사체 또는 단백질은 새로운 이상 기능을 갖는다.
한 실시양태에서, 트리뉴클레오티드 반복 장애를 치료하는 방법이 도 23에 도시된다. 일반적으로, 접근법은 프라임 편집 과정의 메카니즘을 통해 내인성 이환 트리뉴클레오티드 반복부 서열을 대체하도록 의도된 목적하는 건강한 대체 트리뉴클레오티드 반복부 서열을 코딩하는 영역을 포함하는 연장된 gRNA와 조합하여 TPRT 게놈 편집을 사용하는 것을 수반한다. TPRT 게놈 편집에 의한 트리뉴클레오티드 반복 서열 및 트리뉴클레오티드 반복부 축소를 위한 예시적인 gRNA 설계의 개략도가 도 23에 제시된다.
트리뉴클레오티드 반복부 확장은 헌팅톤병, 유약 X 증후군, 및 프리드라이히 운동실조를 포함한 다수의 인간 질환과 연관된다. 가장 흔한 트리뉴클레오티드 반복부는 CAG 트리플렛을 함유하지만, GAA 트리플렛 (프리드라이히 운동실조) 및 CGG 트리플렛 (유약 X 증후군)이 또한 발생한다. 확장에 대한 소인을 유전하거나, 또는 이미 확장된 모 대립유전자를 획득하는 것은 질환을 획득할 가능성을 증가시킨다. 트리뉴클레오티드 반복부의 병원성 확장은 가설상 프라임 편집을 사용하여 교정될 수 있다.
반복 영역의 상류 영역은 RNA-가이드된 뉴클레아제에 의해 닉킹될 수 있고, 이는 이어서 도 1e 또는 도 22에 요약된 일반적 메카니즘에 따라 건강한 수의 반복부 (이는 특정한 유전자 및 질환에 의존함)를 함유하는 새로운 DNA 가닥의 합성을 프라이밍하는데 사용될 수 있다. 반복 서열 후에, 반복부의 다른 단부 (적색 가닥)에 인접한 서열의 정체와 매칭되는 짧은 상동성 스트레치가 부가된다. TPRT 시스템에 의한 새로 합성된 가닥의 침입, 및 내인성 DNA의 새로 합성된 플랩으로의 후속 대체는 축소된 반복 대립유전자로 이어진다. 용어 "축소된"은 뉴클레오티드 반복 영역의 길이를 단축시켜 트리뉴클레오티드 반복 영역을 복구하는 것을 지칭한다.
다양한 실시양태에서, 목적하는 뉴클레오티드 변화는 단일 뉴클레오티드 치환 (예를 들어, 및 전이 또는 전환 변화), 결실, 또는 삽입일 수 있다. 예를 들어, 목적하는 뉴클레오티드 변화는 (1) G에서 T로의 치환, (2) G에서 A로의 치환, (3) G에서 C로의 치환, (4) T에서 G로의 치환, (5) T에서 A로의 치환, (6) T에서 C로의 치환, (7) C에서 G로의 치환, (8) C에서 T로의 치환, (9) C에서 A로의 치환, (10) A에서 T로의 치환, (11) A에서 G로의 치환, 또는(12) A에서 C로의 치환일 수 있다.
다른 실시양태에서, 목적하는 뉴클레오티드 변화는 (1) G:C 염기쌍을 T:A 염기쌍으로, (2) G:C 염기쌍을 A:T 염기쌍으로, (3) G:C 염기쌍을 C:G 염기쌍으로, (4) T:A 염기쌍을 G:C 염기쌍으로, (5) T:A 염기쌍을 A:T 염기쌍으로, (6) T:A 염기쌍을 C:G 염기쌍으로, (7) C:G 염기쌍을 G:C 염기쌍으로, (8) C:G 염기쌍을 T:A 염기쌍으로, (9) C:G 염기쌍을 A:T 염기쌍으로, (10) A:T 염기쌍을 T:A 염기쌍으로, (11) A:T 염기쌍을 G:C 염기쌍으로, 또는 (12) A:T 염기쌍을 C:G 염기쌍으로 전환시킬 수 있다.
또 다른 실시양태에서, 방법은 삽입인 목적하는 뉴클레오티드 변화를 도입한다. 특정 경우에, 삽입은 적어도 1, 적어도 2, 적어도 3, 적어도 4, 적어도 5, 적어도 6, 적어도 7, 적어도 8, 적어도 9, 적어도 10, 적어도 11, 적어도 12, 적어도 13, 적어도 14, 적어도 15, 적어도 16, 적어도 17, 적어도 18, 적어도 19, 적어도 20, 적어도 30, 적어도 40, 적어도 50, 적어도 60, 적어도 70, 적어도 80, 적어도 90, 적어도 100, 적어도 200, 적어도 300, 적어도 400, 또는 적어도 500개 뉴클레오티드 길이이다.
다른 실시양태에서, 방법은 결실인 목적하는 뉴클레오티드 변화를 도입한다. 특정의 다른 경우에, 결실은 적어도 1, 적어도 2, 적어도 3, 적어도 4, 적어도 5, 적어도 6, 적어도 7, 적어도 8, 적어도 9, 적어도 10, 적어도 11, 적어도 12, 적어도 13, 적어도 14, 적어도 15, 적어도 16, 적어도 17, 적어도 18, 적어도 19, 적어도 20, 적어도 30, 적어도 40, 적어도 50, 적어도 60, 적어도 70, 적어도 80, 적어도 90, 적어도 100, 적어도 200, 적어도 300, 적어도 400, 또는 적어도 500개 뉴클레오티드 길이이다.
다양한 실시양태에서, 목적하는 뉴클레오티드 변화는 질환-연관 유전자를 교정한다. 질환-연관 유전자는 아데노신 데아미나제 (ADA) 결핍; 알파-1 항트립신 결핍; 낭성 섬유증; 뒤시엔느 근육 이영양증; 갈락토스혈증; 혈색소증; 헌팅톤병; 메이플 시럽뇨 질환; 마르팡 증후군; 제1형 신경섬유종증; 선천성 손발톱비대증; 페닐케톤뇨; 중증 복합 면역결핍; 겸상 적혈구 질환; 스미스-렘리-오피츠 증후군; 및 테이-삭스병으로 이루어진 군으로부터 선택된 단일유전자 장애와 연관될 수 있다. 다른 실시양태에서, 질환-연관 유전자는 심장 질환; 고혈압; 알츠하이머병; 관절염; 당뇨병; 암; 및 비만으로 이루어진 군으로부터 선택된 다유전자 장애와 연관될 수 있다.
표적 뉴클레오티드 서열은 질환, 장애, 또는 상태와 연관된 표적 서열 (예를 들어, 점 돌연변이)을 포함할 수 있다. 표적 서열은 질환, 장애, 또는 상태와 연관된 T에서 C로의 (또는 A에서 G로의) 점 돌연변이를 포함할 수 있고, 여기서 돌연변이체 C 염기의 탈아미노화는 질환, 장애, 또는 상태와 연관되지 않은 서열에 대한 미스매치 복구-매개된 교정을 발생시킨다. 표적 서열은 질환, 장애, 또는 상태와 연관된 G에서 A로의 (또는 C에서 T로의) 점 돌연변이를 포함할 수 있고, 여기서 돌연변이체 A 염기의 탈아미노화는 질환, 장애, 또는 상태와 연관되지 않은 서열에 대한 미스매치 복구-매개된 교정을 발생시킨다. 표적 서열은 단백질을 코딩할 수 있고, 여기서 점 돌연변이는 코돈 내에 있고, 야생형 코돈과 비교하여 돌연변이체 코돈에 의해 코딩된 아미노산에서 변화를 발생시킨다. 표적 서열은 또한 스플라이스 부위에 있을 수 있고, 점 돌연변이는 야생형 전사체와 비교하여 mRNA 전사체의 스플라이싱에서 변화를 발생시킨다. 또한, 표적은 유전자의 비-코딩 서열, 예컨대 프로모터에 있을 수 있고, 점 돌연변이는 유전자의 증가된 또는 감소된 발현을 발생시킨다.
따라서, 일부 측면에서, 돌연변이체 C의 탈아미노화는 돌연변이체 코돈에 의해 코딩된 아미노산의 변화를 발생시키며, 이는 일부 경우에 야생형 아미노산의 발현을 발생시킬 수 있다. 다른 측면에서, 돌연변이체 A의 탈아미노화는 돌연변이체 코돈에 의해 코딩된 아미노산의 변화를 발생시키며, 이는 일부 경우에 야생형 아미노산의 발현을 발생시킬 수 있다.
세포를 조성물 또는 rAAV 입자와 접촉시키는 것을 수반하는 본원에 기재된 방법은 시험관내, 생체외, 또는 생체내에서 이루어질 수 있다. 특정 실시양태에서, 접촉 단계는 대상체에서 이루어진다. 특정 실시양태에서, 대상체는 질환, 장애, 또는 상태로 진단되었다.
일부 실시양태에서, 본원에 개시된 방법은 포유동물 세포를 조성물 또는 rAAV 입자와 접촉시키는 것을 수반한다. 특정한 실시양태에서, 방법은 망막 세포, 피질 세포 또는 소뇌 세포를 접촉시키는 것을 수반한다.
본원에 기재된 방법을 사용하여 전달된 분할 Cas9 단백질 또는 분할 프라임 편집제는 바람직하게는 원래의 Cas9 단백질 또는 프라임 편집제 (즉, 세포에 전달되거나 또는 전체로서 세포에서 발현된 비분할 단백질)와 비교하여 대등한 활성을 갖는다. 예를 들어, 분할 Cas9 단백질 또는 분할 프라임 편집제는 원래의 Cas9 단백질 또는 프라임 편집제의 활성의 적어도 50% (예를 들어, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100%)를 보유한다. 일부 실시양태에서, 분할 Cas9 단백질 또는 분할 프라임 편집제는 원래의 Cas9 단백질 또는 프라임 편집제의 것보다 더 활성이다 (예를 들어, 2배, 5배, 10배, 100배, 1000배, 또는 그 초과).
본원에 기재된 조성물은 대상체가 앓고 있는 질환 또는 장애를 치료 및/또는 예방하기 위한 치료 유효량으로 그를 필요로 하는 대상체에게 투여될 수 있다. CRISPR/Cas9-기반 게놈-편집 기술을 사용하여 치료 및/또는 예방될 수 있는 임의의 질환 또는 장애는 본원에 기재된 분할 Cas9 단백질 또는 분할 프라임 편집제에 의해 치료될 수 있다. 분할 Cas9 단백질 또는 프라임 편집제를 코딩하는 뉴클레오티드 서열이 gRNA를 추가로 코딩하지 않는 경우에, gRNA를 코딩하는 개별 핵산 벡터가 본원에 기재된 조성물과 함께 투여될 수 있는 것으로 이해되어야 한다.
예시적인 적합한 질환, 장애 또는 상태는, 제한 없이, 낭성 섬유증, 페닐케톤뇨, 표피박리성 과다각화증 (EHK), 만성 폐쇄성 폐 질환 (COPD), 샤르코-마리-투스병 유형 4J, 신경모세포종 (NB), 폰 빌레브란트병 (vWD), 선천성 근긴장증, 유전성 신장 아밀로이드증, 확장성 심근병증, 유전성 림프부종, 가족성 알츠하이머병, 프리온 질환, 만성 영아 신경계 피부 관절 증후군 (CINCA), 선천성 난청, 니만-픽병 유형 C (NPC) 질환, 및 데스민-관련 근병증 (DRM)으로 이루어진 군으로부터 선택된 질환 또는 장애를 포함한다. 특정한 실시양태에서, 질환 또는 상태는 니만-픽병 유형 C (NPC) 질환이다.
일부 실시양태에서, 질환, 장애 또는 상태는 NPC 유전자, DNMT1 유전자, PCSK9 유전자, 또는 TMC1 유전자에서의 점 돌연변이와 연관된다. 특정 실시양태에서, 점 돌연변이는 NPC에서의 T3182C 돌연변이이며, 이는 I1061T 아미노산 치환을 발생시킨다.
특정 실시양태에서, 점 돌연변이는 TMC1에서의 A545G 돌연변이이며, 이는 Y182C 아미노산 치환을 발생시킨다. TMC1은 내이의 감각 유모 세포에서 기계감수성 이온 채널을 형성하고 정상적인 청각 기능에 요구되는 단백질을 코딩한다. Y182C 아미노산 치환은 선천성 난청과 연관된다.
일부 실시양태에서, 질환, 장애 또는 상태는 유전자의 코딩 영역 내에 정지 코돈, 예를 들어 조기 정지 코돈을 생성하는 점 돌연변이와 연관된다.
추가의 예시적인 질환, 장애 및 상태는 낭성 섬유증 (예를 들어, 문헌 [Schwank et al., Functional repair of CFTR by CRISPR/Cas9 in intestinal stem cell organoids of cystic fibrosis patients. Cell stem cell. 2013; 13: 653-658; 및 Wu et al., Correction of a genetic disease in mouse via use of CRISPR-Cas9. Cell stem cell. 2013; 13: 659-662] 참조, 이들 중 어느 것도 유전적 결함을 교정하기 위해 데아미나제 융합 단백질을 사용하지 않음); 페닐케톤뇨 - 예를 들어, 페닐알라닌 히드록실라제 유전자에서의 위치 835 (마우스) 또는 240 (인간) 또는 상동 잔기에서 페닐알라닌에서 세린으로의 돌연변이 (T>C 돌연변이) - 예를 들어, 문헌 [McDonald et al., Genomics. 1997; 39:402-405] 참조; 버나드-술리에 증후군 (BSS) - 예를 들어, 혈소판 막 당단백질 IX에서의 위치 55 또는 상동 잔기에서 페닐알라닌에서 세린으로의 돌연변이, 또는 잔기 24 또는 상동 잔기에서 시스테인에서 아르기닌으로의 돌연변이 (T>C 돌연변이) - 예를 들어, 문헌 [Noris et al., British Journal of Haematology. 1997; 97: 312-320, 및 Ali et al., Hematol. 2014; 93: 381-384] 참조; 표피박리성 과다각화증 (EHK) - 예를 들어, 케라틴 1에서의 위치 160 또는 161 (개시인자 메티오닌을 카운팅하는 경우) 또는 상동 잔기에서 류신에서 프롤린으로의 돌연변이 (T>C 돌연변이) - 예를 들어, 문헌 [Chipev et al., Cell. 1992; 70: 821-828] 참조, 또한 www[dot]uniprot[dot]org에서 유니프롯 데이터베이스에서 수탁 번호 P04264 참조; 만성 폐쇄성 폐 질환 (COPD) - 예를 들어, α1-항트립신의 프로세싱된 형태에서의 위치 54 또는 55 (개시인자 메티오닌을 카운팅하는 경우) 또는 상동 잔기에서, 또는 비프로세싱된 형태에서의 잔기 78 또는 상동 잔기에서 류신에서 프롤린으로의 돌연변이 (T>C 돌연변이) - 예를 들어, 문헌 [Poller et al., Genomics. 1993; 17: 740-743] 참조, 또한 유니프롯 데이터베이스에서 수탁 번호 P01011 참조; 샤르코-마리-투스병 유형 4J - 예를 들어, FIG4에서의 위치 41 또는 상동 잔기에서 이소류신에서 트레오닌으로의 돌연변이 (T>C 돌연변이) - 예를 들어, 문헌 [Lenk et al., PLoS Genetics. 2011; 7: e1002104] 참조; 신경모세포종 (NB) - 예를 들어, 카스파제-9에서의 위치 197 또는 상동 잔기에서 류신에서 프롤린으로의 돌연변이 (T>C 돌연변이) - 예를 들어, 문헌 [Kundu et al., 3 Biotech. 2013, 3:225-234] 참조; 폰 빌레브란트병 (vWD) - 예를 들어, 폰 빌레브란트 인자의 프로세싱된 형태에서의 위치 509 또는 상동 잔기에서, 또는 폰 빌레브란트 인자의 비프로세싱된 형태에서의 위치 1272 또는 상동 잔기에서 시스테인에서 아르기닌으로의 돌연변이 (T>C 돌연변이) - 예를 들어, 문헌 [Lavergne et al., Br. J. Haematol. 1992] 참조, 또한 유니프롯 데이터베이스에서 수탁 번호 P04275 참조; 82: 66-72; 선천성 근긴장증 - 예를 들어, 근육 클로라이드 채널 유전자 CLCN1에서의 위치 277 또는 상동 잔기에서 시스테인에서 아르기닌으로의 돌연변이 (T>C 돌연변이) - 예를 들어, 문헌 [Weinberger et al., The J. of Physiology. 2012; 590: 3449-3464] 참조; 유전성 신장 아밀로이드증 - 예를 들어, 아포지단백질 AII의 프로세싱된 형태에서의 위치 78 또는 상동 잔기에서, 또는 비프로세싱된 형태에서의 위치 101 또는 상동 잔기에서 정지 코돈에서 아르기닌으로의 돌연변이 (T>C 돌연변이) - 예를 들어, 문헌 [Yazaki et al., Kidney Int. 2003; 64: 11-16] 참조; 확장성 심근병증 (DCM) - 예를 들어, FOXD4 유전자에서의 위치 148 또는 상동 잔기에서 트립토판에서 아르기닌으로의 돌연변이 (T>C 돌연변이), 예를 들어, 문헌 [Minoretti et al., Int. J. of Mol. Med. 2007; 19: 369-372] 참조; 유전성 림프부종 - 예를 들어, VEGFR3 티로신 키나제에서의 위치 1035 또는 상동 잔기에서 히스티딘에서 아르기닌으로의 돌연변이 (A>G 돌연변이), 예를 들어, 문헌 [Irrthum et al., Am. J. Hum. Genet. 2000; 67: 295-301] 참조; 가족성 알츠하이머병 - 예를 들어, 프레세닐린1에서의 위치 143 또는 상동 잔기에서 이소류신에서 발린으로의 돌연변이 (A>G 돌연변이), 예를 들어, 문헌 [Gallo et al., J. Alzheimer's disease. 2011; 25: 425-431] 참조; 프리온 질환 - 예를 들어, 프리온 단백질에서의 위치 129 또는 상동 잔기에서 메티오닌에서 발린으로의 돌연변이 (A>G 돌연변이) - 예를 들어, 문헌 [Lewis et al., J. of General Virology. 2006; 87: 2443-2449] 참조; 만성 영아 신경학적 피부 관절 증후군 (CINCA) - 예를 들어, 크리오피린에서의 위치 570 또는 상동 잔기에서 티로신에서 시스테인으로의 돌연변이 (A>G 돌연변이) - 예를 들어, 문헌 [Fujisawa et al., Blood. 2007; 109: 2903-2911] 참조; 및 데스민-관련 근병증 (DRM) - 예를 들어, αβ 크리스탈린에서의 위치 120 또는 상동 잔기에서 아르기닌에서 글리신으로의 돌연변이 (A>G 돌연변이) - 예를 들어, 문헌 [Kumar et al., J. Biol. Chem. 1999; 274: 24137-24141] 참조를 포함한다. 모든 참고문헌 및 데이터베이스 엔트리의 전체 내용은 본원에 참조로 포함된다.
V. 제약 조성물
본 개시내용의 다른 측면은 본원에 기재된 프라임 편집제 (PE) 시스템의 다양한 성분 중 임의의 것 (예를 들어, napDNAbp, 리버스 트랜스크립타제, 융합 단백질 (예를 들어, napDNAbp 및 리버스 트랜스크립타제를 포함함), 프라임 편집제 가이드 RNA, 제2 가닥 닉킹 가이드RNA 및 융합 단백질 및 프라임 편집제 가이드 RNA를 포함하는 복합체, 뿐만 아니라 프라임 편집 과정을 편집된 생성물 형성쪽으로 구동하는 것을 돕기 위한 보조 요소, 예컨대 제2 가닥 닉킹 성분 및 5' 내인성 DNA 플랩 제거 엔도뉴클레아제를 포함하나 이에 제한되지는 않음)을 포함하는 제약 조성물에 관한 것이다. 이러한 조성물은 PE1, PE2, PE3, 또는 PE3b를 포함할 수 있다.
본원에 사용된 용어 "제약 조성물"은 제약 용도를 위해 제제화된 조성물을 지칭한다. 일부 실시양태에서, 제약 조성물은 제약상 허용되는 담체를 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 제약 조성물은 추가의 작용제 (예를 들어, 특이적 전달, 반감기 증가, 또는 다른 치료 화합물을 위함)를 포함한다.
본원에 사용된 용어 "제약상 허용되는 담체"는 신체의 한 부위 (예를 들어, 전달 부위)로부터 또 다른 부위 (예를 들어, 신체의 기관, 조직 또는 부분)로 화합물을 운반 또는 수송하는데 수반되는 제약상 허용되는 물질, 조성물 또는 비히클, 예컨대 액체 또는 고체 충전제, 희석제, 부형제, 제조 보조제 (예를 들어, 윤활제, 활석, 스테아르산마그네슘, 스테아르산칼슘 또는 스테아르산아연, 또는 스테아르산), 또는 용매 캡슐화 물질을 의미한다. 제약상 허용되는 담체는 제제의 다른 성분과 상용성이고 대상체의 조직에 유해하지 않다는 의미에서 "허용되는" 것이다 (예를 들어, 생리학상 상용성, 멸균, 생리학적 pH 등). 제약상 허용되는 담체로서의 역할을 할 수 있는 물질의 일부 예는 다음을 포함한다: (1) 당, 예컨대 락토스, 글루코스 및 수크로스; (2) 전분, 예컨대 옥수수 전분 및 감자 전분; (3) 셀룰로스 및 그의 유도체, 예컨대 소듐 카르복시메틸 셀룰로스, 메틸셀룰로스, 에틸 셀룰로스, 미세결정질 셀룰로스 및 셀룰로스 아세테이트; (4) 분말화 트라가칸트; (5) 맥아; (6) 젤라틴; (7) 윤활제, 예컨대 스테아르산마그네슘, 소듐 라우릴 술페이트 및 활석; (8) 부형제, 예컨대 코코아 버터 및 좌제 왁스; (9) 오일, 예컨대 땅콩 오일, 목화씨 오일, 홍화 오일, 참깨 오일, 올리브 오일, 옥수수 오일 및 대두 오일; (10) 글리콜, 예컨대 프로필렌 글리콜; (11) 폴리올, 예컨대 글리세린, 소르비톨, 만니톨 및 폴리에틸렌 글리콜 (PEG); (12) 에스테르, 예컨대 에틸 올레에이트 및 에틸 라우레이트; (13) 한천; (14) 완충제, 예컨대 수산화마그네슘 및 수산화알루미늄; (15) 알긴산; (16) 발열원-무함유 물; (17) 등장성 염수; (18) 링거액; (19) 에틸 알콜; (20) pH 완충 용액; (21) 폴리에스테르, 폴리카르보네이트 및/또는 폴리무수물; (22) 벌킹제, 예컨대 폴리펩티드 및 아미노산 (23) 혈청 성분, 예컨대 혈청 알부민, HDL 및 LDL; (22) C2-C12 알콜, 예컨대 에탄올; 및 (23) 제약 제제에 사용되는 다른 비-독성 상용성 물질. 습윤제, 착색제, 이형제, 코팅제, 감미제, 향미제, 퍼퓸제, 보존제 및 항산화제가 또한 제제에 존재할 수 있다. "부형제", "담체", "제약상 허용되는 담체" 등과 같은 용어는 본원에서 상호교환가능하게 사용된다.
일부 실시양태에서, 제약 조성물은 대상체에게 전달하기 위해, 예를 들어 유전자 편집을 위해 제제화된다. 본원에 기재된 제약 조성물의 적합한 투여 경로는 제한 없이 국소, 피하, 경피, 피내, 병변내, 관절내, 복강내, 방광내, 경점막, 치은, 치아내, 와우내, 경고실, 기관내, 경막외, 척수강내, 근육내, 정맥내, 혈관내, 골내, 안구주위, 종양내, 뇌내, 및 뇌실내 투여를 포함한다.
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 제약 조성물은 이환 부위 (예를 들어, 종양 부위)에 국부로 투여된다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 제약 조성물은 주사에 의해, 카테터에 의해, 좌제에 의해, 또는 이식물에 의해 대상체에게 투여되며, 이식물은 막, 예컨대 시알라스틱 막, 또는 섬유를 포함한 다공성, 비-다공성, 또는 젤라틴성 물질이다.
다른 실시양태에서, 본원에 기재된 제약 조성물은 제어 방출 시스템으로 전달된다. 한 실시양태에서, 펌프가 사용될 수 있다 (예를 들어, 문헌 [Langer, 1990, Science 249:1527-1533; Sefton, 1989, CRC Crit. Ref. Biomed. Eng. 14:201; Buchwald et al., 1980, Surgery 88:507; Saudek et al., 1989, N. Engl. J. Med. 321:574] 참조). 또 다른 실시양태에서, 중합체 물질이 사용될 수 있다. (예를 들어, 문헌 [Medical Applications of Controlled Release (Langer and Wise eds., CRC Press, Boca Raton, Fla., 1974); Controlled Drug Bioavailability, Drug Product Design and Performance (Smolen and Ball eds., Wiley, New York, 1984); Ranger and Peppas, 1983, Macromol. Sci. Rev. Macromol. Chem. 23:61] 참조. 또한 문헌 [Levy et al., 1985, Science 228:190; During et al., 1989, Ann. Neurol. 25:351; Howard et al., 1989, J. Neurosurg. 71:105] 참조). 다른 제어 방출 시스템은, 예를 들어 상기 문헌 [Langer]에 논의되어 있다.
일부 실시양태에서, 제약 조성물은 대상체, 예를 들어 인간에게 정맥내 또는 피하 투여하기에 적합화된 조성물로서 상용 절차에 따라 제제화된다. 일부 실시양태에서, 주사에 의한 투여를 위한 제약 조성물은 멸균 등장성 수성 완충제 중의 용액이다. 필요한 경우에, 제약은 또한 가용화제 및 주사 부위에서의 통증을 완화시키기 위한 국부 마취제, 예컨대 리그노카인을 포함할 수 있다. 일반적으로, 성분은 단위 투여 형태로, 예를 들어 활성제의 양을 나타내는 기밀 용기, 예컨대 앰플 또는 사쉐 내의 건조 동결건조 분말 또는 무수 농축물로서 개별적으로 또는 함께 혼합되어 공급된다. 제약이 주입에 의해 투여되는 경우에, 이는 멸균 제약 등급 물 또는 염수를 함유하는 주입 병으로 분배될 수 있다. 제약 조성물이 주사에 의해 투여되는 경우에, 성분이 투여 전에 혼합될 수 있도록 주사용 멸균수 또는 염수의 앰플이 제공될 수 있다.
전신 투여를 위한 제약 조성물은 액체, 예를 들어 멸균 염수, 락테이트화 링거 또는 행크 용액일 수 있다. 또한, 제약 조성물은 고체 형태일 수 있고, 사용 직전에 재용해 또는 현탁될 수 있다. 동결건조 형태가 또한 고려된다.
제약 조성물은 지질 입자 또는 소포, 예컨대 리포솜 또는 미세결정 내에 함유될 수 있으며, 이는 또한 비경구 투여에 적합하다. 입자는 조성물이 그 안에 함유되는 한, 임의의 적합한 구조, 예컨대 단층 또는 다층일 수 있다. 화합물은 융합생성 지질 디올레오일포스파티딜에탄올아민 (DOPE), 낮은 수준 (5-10 mol%)의 양이온성 지질을 함유하는 "안정화된 플라스미드-지질 입자" (SPLP)에 포획될 수 있고, 폴리에틸렌글리콜 (PEG) 코팅에 의해 안정화될 수 있다 (Zhang Y. P. et al., Gene Ther. 1999, 6:1438-47). 양으로 하전된 지질, 예컨대 N-[1-(2,3-디올레오일옥시)프로필]-N,N,N-트리메틸-암모늄메틸술페이트, 또는 "DOTAP"가 이러한 입자 및 소포에 특히 바람직하다. 이러한 지질 입자의 제조는 널리 공지되어 있다. 예를 들어, 미국 특허 번호 4,880,635; 4,906,477; 4,911,928; 4,917,951; 4,920,016; 및 4,921,757을 참조하고; 이들 각각은 본원에 참조로 포함된다.
본원에 기재된 제약 조성물은, 예를 들어 단위 용량으로서 투여 또는 패키징될 수 있다. 용어 "단위 용량"은 본 개시내용의 제약 조성물과 관련하여 사용되는 경우에 대상체에 대한 단일 투여량으로서 적합한 물리적 이산 단위를 지칭하며, 각각의 단위는 요구되는 희석제; 즉, 담체 또는 비히클과 함께 목적하는 치료 효과를 생성하도록 계산된 미리 결정된 양의 활성 물질을 함유한다.
추가로, 제약 조성물은 (a) 동결건조 형태의 본 발명의 화합물을 함유하는 용기 및 (b) 주사용 제약상 허용되는 희석제 (예를 들어, 멸균수)를 함유하는 제2 용기를 포함하는 제약 키트로서 제공될 수 있다. 제약상 허용되는 희석제는 본 발명의 동결건조 화합물의 재구성 또는 희석에 사용될 수 있다. 인간 투여를 위한 제조, 사용 또는 판매의 정부 기관에 의한 승인을 반영하는, 제약 또는 생물학적 제품의 제조, 사용 또는 판매를 규제하는 정부 기관에 의해 규정된 형태의 통지서가 이러한 용기(들)와 임의로 회합될 수 있다.
또 다른 측면에서, 상기 기재된 질환의 치료에 유용한 물질을 함유하는 제조 물품이 포함된다. 일부 실시양태에서, 제조 물품은 용기 및 라벨을 포함한다. 적합한 용기는, 예를 들어 병, 바이알, 시린지 및 시험 튜브를 포함한다. 용기는 다양한 물질, 예컨대 유리 또는 플라스틱으로 형성될 수 있다. 일부 실시양태에서, 용기는 본원에 기재된 질환을 치료하는데 효과적인 조성물을 보유하고, 멸균 접근 포트를 가질 수 있다. 예를 들어, 용기는 피하 주사 바늘로 뚫을 수 있는 마개를 갖는 정맥내 용액 백 또는 바이알일 수 있다. 조성물 중 활성제는 본 발명의 화합물이다. 일부 실시양태에서, 용기 상의 또는 용기와 회합된 라벨은 조성물이 선택된 질환을 치료하는데 사용된다는 것을 표시한다. 제조 물품은 제약상 허용되는 완충제, 예컨대 포스페이트 완충 염수, 링거액 또는 덱스트로스 용액을 포함하는 제2 용기를 추가로 포함할 수 있다. 이는 다른 완충제, 희석제, 필터, 바늘, 시린지, 및 사용에 대한 지침서를 갖는 패키지 삽입물을 포함한, 상업적 및 사용자 관점에서 바람직한 다른 물질을 추가로 포함할 수 있다.
VI. 바이러스 전달 방법
일부 측면에서, 본 발명은 1개 이상의 폴리뉴클레오티드, 예컨대 또는 본원에 기재된 프라임 편집제 (PE) 시스템의 1개 이상의 성분을 코딩하는 본원에 기재된 바와 같은 1개 이상의 벡터, 그의 1개 이상의 전사체, 및/또는 그로부터 전사된 1개 이상의 단백질을 숙주 세포에 전달하는 것을 포함하는 방법을 제공한다. 일부 측면에서, 본 발명은 이러한 방법에 의해 생산된 세포, 및 이러한 세포를 포함하거나 또는 그로부터 생산된 유기체 (예컨대 동물, 식물, 또는 진균)를 추가로 제공한다. 일부 실시양태에서, 가이드 서열과 조합된 (및 임의로 그와 복합체화된) 본원에 기재된 바와 같은 염기 편집제가 세포에 전달된다. 통상적인 바이러스 및 비-바이러스 기반 유전자 전달 방법이 핵산을 포유동물 세포 또는 표적 조직에 도입하는데 사용될 수 있다. 이러한 방법은 염기 편집제의 성분을 코딩하는 핵산을 배양물 또는 숙주 유기체 내의 세포에 투여하는데 사용될 수 있다. 비-바이러스 벡터 전달 시스템은 DNA 플라스미드, RNA (예를 들어, 본원에 기재된 벡터의 전사체), 네이키드 핵산, 및 전달 비히클, 예컨대 리포솜과 복합체화된 핵산을 포함한다. 바이러스 벡터 전달 시스템은 DNA 및 RNA 바이러스를 포함하며, 이는 세포로 전달된 후에 에피솜 또는 통합된 게놈을 갖는다. 유전자 요법 절차의 검토를 위해, 문헌 [Anderson, Science 256:808-813 (1992); Nabel & Felgner, TIBTECH 11:211-217 (1993); Mitani & Caskey, TIBTECH 11:162-166 (1993); Dillon, TIBTECH 11:167-175 (1993); Miller, Nature 357:455-460 (1992); Van Brunt, Biotechnology 6(10):1149-1154 (1988); Vigne, Restorative Neurology and Neuroscience 8:35-36 (1995); Kremer & Perricaudet, British Medical Bulletin 51(1):31-44 (1995); Haddada et al., in Current Topics in Microbiology and Immunology Doerfler and Bihm (eds) (1995); 및 Yu et al., Gene Therapy 1:13-26 (1994)]을 참조한다.
핵산의 비-바이러스 전달 방법은 리포펙션, 뉴클레오펙션, 미세주사, 바이오리스틱, 비로솜, 리포솜, 이뮤노리포솜, 다가양이온 또는 지질:핵산 접합체, 네이키드 DNA, 인공 비리온, 및 DNA의 작용제-증진된 흡수를 포함한다. 리포펙션은 예를 들어 미국 특허 번호 5,049,386, 4,946,787; 및 4,897,355에 기재되어 있고, 리포펙션 시약은 상업적으로 판매된다 (예를 들어, 트랜스펙탐(Transfectam)™ 및 리포펙틴(Lipofectin)™). 폴리뉴클레오티드의 효율적인 수용체-인식 리포펙션에 적합한 양이온성 및 중성 지질은 파이너(Feigner), WO 91/17424; WO91/16024의 것을 포함한다. 전달은 세포 (예를 들어, 시험관내 또는 생체외 투여) 또는 표적 조직 (예를 들어, 생체내 투여)에 대한 것일 수 있다.
표적화된 리포솜, 예컨대 면역지질 복합체를 포함한 지질:핵산 복합체의 제조는 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 널리 공지되어 있다 (예를 들어, 문헌 [Crystal, Science 270:404-410 (1995); Blaese et al., Cancer Gene Ther. 2:291-297 (1995); Behr et al., Bioconjugate Chem. 5:382-389 (1994); Remy et al., Bioconjugate Chem. 5:647-654 (1994); Gao et al., Gene Therapy 2:710-722 (1995); Ahmad et al., Cancer Res. 52:4817-4820 (1992)]; 미국 특허 번호 4,186,183, 4,217,344, 4,235,871, 4,261,975, 4,485,054, 4,501,728, 4,774,085, 4,837,028, 및 4,946,787 참조).
핵산의 전달을 위한 RNA 또는 DNA 바이러스 기반 시스템의 사용은 바이러스를 신체 내의 특이적 세포에 표적화하고 바이러스 페이로드를 핵으로 트래픽킹하기 위한 고도로 진화된 과정을 이용한다. 바이러스 벡터는 환자에게 직접 투여될 수 있거나 (생체내), 또는 시험관내에서 세포를 처리하는데 사용될 수 있고, 변형된 세포는 임의로 환자에게 투여될 수 있다 (생체외). 통상적인 바이러스 기반 시스템은 유전자 전달을 위한 레트로바이러스, 렌티바이러스, 아데노바이러스, 아데노-연관 및 단순 포진 바이러스 벡터를 포함할 수 있다. 숙주 게놈에서의 통합은 레트로바이러스, 렌티바이러스, 및 아데노-연관 바이러스 유전자 전달 방법에 의해 가능하며, 이는 종종 삽입된 트랜스진의 장기간 발현을 발생시킨다. 추가적으로, 많은 상이한 세포 유형 및 표적 조직에서 높은 형질도입 효율이 관찰되었다.
바이러스의 향성은 외래 외피 단백질을 혼입하여 표적 세포의 잠재적 표적 집단을 확장시킴으로써 변경될 수 있다. 렌티바이러스 벡터는 비-분열 세포를 형질도입 또는 감염시킬 수 있고 전형적으로 높은 바이러스 역가를 생산할 수 있는 레트로바이러스 벡터이다. 따라서, 레트로바이러스 유전자 전달 시스템의 선택은 표적 조직에 좌우될 것이다. 레트로바이러스 벡터는 최대 6-10 kb의 외래 서열에 대한 패키징 능력을 갖는 시스-작용성 긴 말단 반복부로 구성된다. 최소 시스-작용성 LTR은 벡터의 복제 및 패키징에 충분하며, 이는 이어서 치료 유전자를 표적 세포 내로 통합시켜 영구적 트랜스진 발현을 제공하는데 사용된다. 널리 사용되는 레트로바이러스 벡터는 뮤린 백혈병 바이러스 (MuLV), 긴팔원숭이 유인원 백혈병 바이러스 (GaLV), 원숭이 면역 결핍 바이러스 (SIV), 인간 면역 결핍 바이러스 (HIV), 및 그의 조합을 기반으로 하는 것을 포함한다 (예를 들어, 문헌 [Buchscher et al., J. Virol. 66:2731-2739 (1992); Johann et al., J. Virol. 66:1635-1640 (1992); Sommnerfelt et al., Virol. 176:58-59 (1990); Wilson et al., J. Virol. 63:2374-2378 (1989); Miller et al., J. Virol. 65:2220-2224 (1991)]; PCT/US94/05700 참조). 일시적 발현이 바람직한 적용에서는, 아데노바이러스 기반 시스템이 사용될 수 있다. 아데노바이러스 기반 벡터는 많은 세포 유형에서 매우 높은 형질도입 효율을 가질 수 있고, 세포 분열을 필요로 하지 않는다. 이러한 벡터에 의해, 높은 역가 및 발현 수준이 수득되었다. 이 벡터는 비교적 간단한 시스템에서 대량으로 생산될 수 있다. 아데노-연관 바이러스 ("AAV") 벡터는 또한, 예를 들어 핵산 및 펩티드의 시험관내 생산에서, 그리고 생체내 및 생체외 유전자 요법 절차를 위해, 세포를 표적 핵산으로 형질도입하는데 사용될 수 있다 (예를 들어, 문헌 [West et al., Virology 160:38-47 (1987)]; 미국 특허 번호 4,797,368; WO 93/24641; [Kotin, Human Gene Therapy 5:793-801 (1994); Muzyczka, J. Clin. Invest. 94:1351 (1994)] 참조). 재조합 AAV 벡터의 구축은 미국 특허 번호 5,173,414; 문헌 [Tratschin et al., Mol. Cell. Biol. 5:3251-3260 (1985); Tratschin, et al., Mol. Cell. Biol. 4:2072-2081 (1984); Hermonat & Muzyczka, PNAS 81:6466-6470 (1984); 및 Samulski et al., J. Virol. 63:03822-3828 (1989)]을 포함한 다수의 간행물에 기재되어 있다.
패키징 세포는 전형적으로 숙주 세포를 감염시킬 수 있는 바이러스 입자를 형성하는데 사용된다. 이러한 세포는 아데노바이러스를 패키징하는 293 세포, 및 레트로바이러스를 패키징하는 ψ2 세포 또는 PA317 세포를 포함한다. 유전자 요법에 사용되는 바이러스 벡터는 통상적으로, 핵산 벡터를 바이러스 입자 내로 패키징하는 세포주를 생산함으로써 생성된다. 벡터는 전형적으로 패키징 및 숙주 내로의 후속 통합에 요구되는 최소 바이러스 서열을 함유하고, 다른 바이러스 서열은 발현될 폴리뉴클레오티드(들)에 대한 발현 카세트에 의해 대체된다. 누락된 바이러스 기능은 전형적으로 패키징 세포주에 의해 트랜스로 공급된다. 예를 들어, 유전자 요법에 사용되는 AAV 벡터는 전형적으로 숙주 게놈 내로의 패키징 및 통합에 요구되는 AAV 게놈으로부터의 ITR 서열만을 보유한다. 바이러스 DNA는 다른 AAV 유전자, 즉 rep 및 cap를 코딩하지만 ITR 서열은 결여되어 있는 헬퍼 플라스미드를 함유하는 세포주 내에 패키징된다. 세포주는 또한 헬퍼로서 아데노바이러스로 감염될 수 있다. 헬퍼 바이러스는 헬퍼 플라스미드로부터 AAV 벡터의 복제 및 AAV 유전자의 발현을 촉진한다. 헬퍼 플라스미드는 ITR 서열의 결여로 인해 유의한 양으로 패키징되지 않는다. 아데노바이러스에 의한 오염은, 예를 들어 아데노바이러스가 AAV보다 더 감수성인 열 처리에 의해 감소될 수 있다. 핵산을 세포에 전달하기 위한 추가의 방법은 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 공지되어 있다. 예를 들어, 본원에 참조로 포함된 US20030087817을 참조한다.
VII. 키트, 벡터, 세포, 및 전달
본 개시내용의 일부 측면은 본원에 기재된 프라임 편집제 (PE) 시스템의 다양한 성분 (예를 들어, napDNAbp, 리버스 트랜스크립타제, 융합 단백질 (예를 들어, napDNAbp 및 리버스 트랜스크립타제를 포함함), 프라임 편집제 가이드 RNA, 및 융합 단백질 및 프라임 편집제 가이드 RNA를 포함하는 복합체, 뿐만 아니라 프라임 편집 과정을 편집된 생성물 형성쪽으로 구동하는 것을 돕기 위한 보조 요소, 예컨대 제2 가닥 닉킹 성분 및 5' 내인성 DNA 플랩 제거 엔도뉴클레아제를 포함하나 이에 제한되지는 않음)을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산 구축물을 포함하는 키트를 제공한다. 일부 실시양태에서, 뉴클레오티드 서열은 프라임 편집제 (PE) 시스템 성분의 발현을 구동하는 이종 프로모터를 포함한다.
본 개시내용의 일부 측면은 본원에 기재된 프라임 편집제 (PE) 시스템의 다양한 성분을 코딩하는 1개 이상의 핵산 구축물을 포함하는, 예를 들어 표적 DNA 서열을 변형시킬 수 있는 프라임 편집제 (PE) 시스템의 성분을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 키트를 제공한다. 일부 실시양태에서, 뉴클레오티드 서열은 프라임 편집제 (PE) 시스템 성분의 발현을 구동하는 이종 프로모터를 포함한다.
본 개시내용의 일부 측면은 (a) 리버스 트랜스크립타제에 융합된 napDNAbp (예를 들어, Cas9 도메인)를 코딩하는 뉴클레오티드 서열 및 (b) (a)의 서열의 발현을 구동하는 이종 프로모터를 포함하는 핵산 구축물을 포함하는 키트를 제공한다.
키트
본 개시내용의 조성물은 키트로 조립될 수 있다. 일부 실시양태에서, 키트는 본원에 기재된 프라임 편집제의 발현을 위한 핵산 벡터를 포함한다. 다른 실시양태에서, 키트는 Cas9 단백질 또는 프라임 편집제를 목적하는 표적 서열에 표적화하기 위해, 적절한 가이드 뉴클레오티드 서열 (예를 들어, PEgRNA 및 제2-부위 gRNA) 또는 이러한 가이드 뉴클레오티드 서열의 발현을 위한 핵산 벡터를 추가로 포함한다.
본원에 기재된 키트는 본원에 기재된 방법을 수행하기 위한 성분을 수용하는 1개 이상의 용기 및 임의로 사용에 대한 지침서를 포함할 수 있다. 본원에 기재된 키트 중 임의의 것은 검정 방법을 수행하는데 필요한 성분을 추가로 포함할 수 있다. 키트의 각각의 성분은, 적용가능한 경우에, 액체 형태 (예를 들어, 용액) 또는 고체 형태 (예를 들어, 건조 분말)로 제공될 수 있다. 특정 경우에, 성분 중 일부는, 예를 들어 키트와 함께 제공될 수 있거나 또는 제공되지 않을 수 있는 적합한 용매 또는 다른 종 (예를 들어, 물)의 첨가에 의해 (예를 들어, 활성 형태로) 재구성가능하거나 또는 달리 가공가능할 수 있다.
일부 실시양태에서, 키트는 제공된 성분의 사용에 대한 지침서 및/또는 홍보물을 임의로 포함할 수 있다. 본원에 사용된 "지침서"는 지침서 및/또는 홍보물의 성분을 규정할 수 있고, 전형적으로 개시내용의 패키징 상의 또는 그와 회합된 서면 지침서를 수반할 수 있다. 지침서는 또한 사용자가 지침서를 키트와 연관된 것으로 명확하게 인식하게 할 임의의 방식, 예를 들어 시청각 (예를 들어, 비디오테이프, DVD 등), 인터넷 및/또는 웹-기반 통신 등으로 제공되는 임의의 구두 또는 전자 지침서를 포함할 수 있다. 서면 지침서는 제약 또는 생물학적 제품의 제조, 사용, 또는 판매를 규제하는 정부 기관에 의해 규정된 형태일 수 있으며, 이는 또한 동물 투여를 위한 제조, 사용 또는 판매에 대한 정부 기관의 승인을 반영할 수 있다. 본원에 사용된 "홍보된"은 개시내용와 연관된, 교육, 병원 및 다른 임상 지침, 과학적 탐구, 약물 발견 또는 개발, 학술 연구, 제약 판매를 포함한 제약 산업 활동, 및 임의의 형태의 서면, 구두 및 전자 커뮤니케이션을 포함한 임의의 광고 또는 다른 홍보 활동의 방법을 포함한 영업을 수행하는 모든 방법을 포함한다. 추가적으로, 키트는 본원에 기재된 바와 같은 구체적 적용에 따라 다른 성분을 포함할 수 있다.
키트는 1개 이상의 용기에 본원에 기재된 성분 중 임의의 1종 이상을 함유할 수 있다. 성분은 멸균 제조되고, 시린지 내에 패키징되고, 냉장 운송될 수 있다. 대안적으로, 이는 저장을 위해 바이알 또는 다른 용기에 수용될 수 있다. 제2 용기는 멸균 제조된 다른 성분을 가질 수 있다. 대안적으로, 키트는 바이알, 튜브 또는 다른 용기 내에서 예비혼합되고 운송된 활성제를 포함할 수 있다.
키트는 다양한 형태, 예컨대 블리스터 파우치, 수축 랩핑된 파우치, 진공 밀봉가능한 파우치, 밀봉가능한 열성형된 트레이, 또는 파우치 내에 느슨하게 패킹된 부속품을 갖는 유사한 파우치 또는 트레이 형태, 1개 이상의 튜브, 용기, 박스 또는 백을 가질 수 있다. 키트는 부속품이 첨가된 후에 멸균될 수 있고, 이에 의해 용기 내의 개별 부속품을 달리 꺼내는 것이 가능하다. 키트는 임의의 적절한 멸균 기술, 예컨대 방사선 멸균, 가열 멸균, 또는 관련 기술분야에 공지된 다른 멸균 방법을 사용하여 멸균될 수 있다. 키트는 또한 특정한 적용에 따라 다른 성분, 예를 들어, 용기, 세포 배지, 염, 완충제, 시약, 시린지, 바늘, 소독제를 적용 또는 제거하기 위한 직물, 예컨대 거즈, 일회용 장갑, 투여 전의 작용제를 위한 지지체 등을 포함할 수 있다. 본 개시내용의 일부 측면은 본원에 기재된 프라임 편집 시스템의 다양한 성분 (예를 들어, napDNAbp, 리버스 트랜스크립타제, 폴리머라제, 융합 단백질 (예를 들어, napDNAbp 및 리버스 트랜스크립타제 (또는 보다 넓게는, 폴리머라제)를 포함함), 연장된 가이드 RNA, 및 융합 단백질 및 연장된 가이드 RNA를 포함하는 복합체, 뿐만 아니라 프라임 편집 과정을 편집된 생성물 형성쪽으로 구동하는 것을 돕기 위한 보조 요소, 예컨대 제2 가닥 닉킹 성분 (예를 들어, 제2 가닥 닉킹 gRNA) 및 5' 내인성 DNA 플랩 제거 엔도뉴클레아제를 포함하나 이에 제한되지는 않음)을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산 구축물을 포함하는 키트를 제공한다. 일부 실시양태에서, 뉴클레오티드 서열(들)은 프라임 편집 시스템 성분의 발현을 구동하는 이종 프로모터 (또는 단일 초과의 프로모터)를 포함한다.
본 개시내용의 다른 측면은 본원에 기재된 프라임 편집 시스템의 다양한 성분을 코딩하는 1개 이상의 핵산 구축물을 포함하는, 예를 들어 표적 DNA 서열을 변형시킬 수 있는 프라임 편집 시스템의 성분을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 키트를 제공한다. 일부 실시양태에서, 뉴클레오티드 서열은 프라임 편집 시스템 성분의 발현을 구동하는 이종 프로모터를 포함한다.
본 개시내용의 일부 측면은 (a) 리버스 트랜스크립타제에 융합된 napDNAbp (예를 들어, Cas9 도메인)를 코딩하는 뉴클레오티드 서열 및 (b) (a)의 서열의 발현을 구동하는 이종 프로모터를 포함하는 핵산 구축물을 포함하는 키트를 제공한다.
세포
본원에 기재된 조성물 중 임의의 것을 함유할 수 있는 세포는 원핵 세포 및 진핵 세포를 포함한다. 본원에 기재된 방법은 Cas9 단백질 또는 프라임 편집제를 진핵 세포 (예를 들어, 포유동물 세포, 예컨대 인간 세포) 내로 전달하는데 사용된다. 일부 실시양태에서, 세포는 시험관내의 것 (예를 들어, 배양된 세포)이다. 일부 실시양태에서, 세포는 생체내 (예를 들어, 대상체, 예컨대 인간 대상체 내)의 것이다. 일부 실시양태에서, 세포는 생체외의 것 (예를 들어, 대상체로부터 단리되고, 동일한 또는 상이한 대상체에게 다시 투여될 수 있는 것)이다.
본 개시내용의 포유동물 세포는 인간 세포, 영장류 세포 (예를 들어, 베로 세포), 래트 세포 (예를 들어, GH3 세포, OC23 세포) 또는 마우스 세포 (예를 들어, MC3T3 세포)를 포함한다. 제한 없이, 인간 배아 신장 (HEK) 세포, HeLa 세포, 국립 암 연구소의 60 암 세포주 (NCI60)로부터의 암 세포, DU145 (전립선암) 세포, Lncap (전립선암) 세포, MCF-7 (유방암) 세포, MDA-MB-438 (유방암) 세포, PC3 (전립선암) 세포, T47D (유방암) 세포, THP-1 (급성 골수성 백혈병) 세포, U87 (교모세포종) 세포, SHSY5Y 인간 신경모세포종 세포 (골수종으로부터 클로닝됨) 및 Saos-2 (골암) 세포를 포함한 다양한 인간 세포주가 존재한다. 일부 실시양태에서, rAAV 벡터는 인간 배아 신장 (HEK) 세포 (예를 들어, HEK 293 또는 HEK 293T 세포) 내로 전달된다. 일부 실시양태에서, rAAV 벡터는 줄기 세포 (예를 들어, 인간 줄기 세포), 예컨대, 예를 들어, 만능 줄기 세포 (예를 들어, 인간 유도된 만능 줄기 세포 (hiPSC)를 포함한 인간 만능 줄기 세포) 내로 전달된다. 줄기 세포는 배양 시 무한 기간 동안 분열하고 특화 세포를 생성하는 능력을 갖는 세포를 지칭한다. 만능 줄기 세포는 유기체의 모든 조직으로 분화할 수 있지만, 단독으로는 완전한 유기체 발생을 지속할 수 없는 줄기 세포의 유형을 지칭한다. 인간 유도된 만능 줄기 세포는 배아 줄기 세포의 정의 특성을 유지하는데 중요한 유전자 및 인자를 발현하도록 강제됨으로써 배아 줄기 세포-유사 상태로 재프로그램화된 체세포 (예를 들어, 성숙 또는 성체)를 지칭한다 (예를 들어, 본원에 참조로 포함된 문헌 [Takahashi and Yamanaka, Cell 126 (4): 663-76, 2006] 참조). 인간 유도된 만능 줄기 세포 세포는 줄기 세포 마커를 발현하고, 모든 3가지 배엽층 (외배엽, 내배엽, 중배엽)의 세포 특징을 생성할 수 있다.
본 개시내용에 따라 사용될 수 있는 세포주의 추가의 비제한적 예는 293-T, 293-T, 3T3, 4T1, 721, 9L, A-549, A172, A20, A253, A2780, A2780ADR, A2780cis, A431, ALC, B16, B35, BCP-1, BEAS-2B, bEnd.3, BHK-21, BR 293, BxPC3, C2C12, C3H-10T1/2, C6, C6/36, Cal-27, CGR8, CHO, CML T1, CMT, COR-L23, COR-L23/5010, COR-L23/CPR, COR-L23/R23, COS-7, COV-434, CT26, D17, DH82, DU145, DuCaP, E14Tg2a, EL4, EM2, EM3, EMT6/AR1, EMT6/AR10.0, FM3, H1299, H69, HB54, HB55, HCA2, Hepa1c1c7, 하이 파이브 세포, HL-60, HMEC, HT-29, HUVEC, J558L 세포, Jurkat, JY 세포, K562 세포, KCL22, KG1, Ku812, KYO1, LNCap, Ma-Mel 1, 2, 3....48, MC-38, MCF-10A, MCF-7, MDA-MB-231, MDA-MB-435, MDA-MB-468, MDCK II, MG63, MONO-MAC 6, MOR/0.2R, MRC5, MTD-1A, MyEnd, NALM-1, NCI-H69/CPR, NCI-H69/LX10, NCI-H69/LX20, NCI-H69/LX4, NIH-3T3, NW-145, OPCN/OPCT Peer, PNT-1A/PNT 2, PTK2, Raji, RBL 세포, RenCa, RIN-5F, RMA/RMAS, S2, Saos-2 세포, Sf21, Sf9, SiHa, SKBR3, SKOV-3, T-47D, T2, T84, THP1, U373, U87, U937, VCaP, WM39, WT-49, X63, YAC-1 및 YAR 세포를 포함한다.
본 개시내용의 일부 측면은 본원에 개시된 구축물 중 임의의 것을 포함하는 세포를 제공한다. 일부 실시양태에서, 숙주 세포는 본원에 기재된 1개 이상의 벡터로 일시적으로 또는 비-일시적으로 형질감염된다. 일부 실시양태에서, 세포는 대상체에서 자연 발생하는 바와 같이 형질감염된다. 일부 실시양태에서, 형질감염된 세포는 대상체로부터 채취된다. 일부 실시양태에서, 세포는 대상체로부터 채취한 세포, 예컨대 세포주로부터 유래된다. 조직 배양을 위한 매우 다양한 세포주가 관련 기술분야에 공지되어 있다. 세포주의 예는 C8161, CCRF-CEM, MOLT, mIMCD-3, NHDF, HeLa-S3, Huh1, Huh4, Huh7, HUVEC, HASMC, HEKn, HEKa, MiaPaCell, Panc1, PC-3, TF1, CTLL-2, C1R, Rat6, CV1, RPTE, A10, T24, J82, A375, ARH-77, Calu1, SW480, SW620, SKOV3, SK-UT, CaCo2, P388D1, SEM-K2, WEHI-231, HB56, TIB55, Jurkat, J45.01, LRMB, Bcl-1, BC-3, IC21, DLD2, Raw264.7, NRK, NRK-52E, MRC5, MEF, Hep G2, HeLa B, HeLa T4, COS, COS-1, COS-6, COS-M6A, BS-C-1 원숭이 신장 상피, BALB/3T3 마우스 배아 섬유모세포, 3T3 스위스, 3T3-L1, 132-d5 인간 태아 섬유모세포; 10.1 마우스 섬유모세포, 293-T, 3T3, 721, 9L, A2780, A2780ADR, A2780cis, A 172, A20, A253, A431, A-549, ALC, B16, B35, BCP-1 세포, BEAS-2B, bEnd.3, BHK-21, BR 293. BxPC3. C3H-10T1/2, C6/36, Cal-27, CHO, CHO-7, CHO-IR, CHO-K1, CHO-K2, CHO-T, CHO Dhfr -/-, COR-L23, COR-L23/CPR, COR-L23/5010, COR-L23/R23, COS-7, COV-434, CML T1, CMT, CT26, D17, DH82, DU145, DuCaP, EL4, EM2, EM3, EMT6/AR1, EMT6/AR10.0, FM3, H1299, H69, HB54, HB55, HCA2, HEK-293, HeLa, Hepa1c1c7, HL-60, HMEC, HT-29, Jurkat, JY 세포, K562 세포, Ku812, KCL22, KG1, KYO1, LNCap, Ma-Mel 1-48, MC-38, MCF-7, MCF-10A, MDA-MB-231, MDA-MB-468, MDA-MB-435, MDCK II, MDCK 11, MOR/0.2R, MONO-MAC 6, MTD-1A, MyEnd, NCI-H69/CPR, NCI-H69/LX10, NCI-H69/LX20, NCI-H69/LX4, NIH-3T3, NALM-1, NW-145, OPCN/OPCT 세포주, Peer, PNT-1A/PNT 2, RenCa, RIN-5F, RMA/RMAS, Saos-2 세포, Sf-9, SkBr3, T2, T-47D, T84, THP1 세포주, U373, U87, U937, VCaP, 베로 세포, WM39, WT-49, X63, YAC-1, YAR, 및 그의 트랜스제닉 변종을 포함하나 이에 제한되지는 않는다.
세포주는 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 공지된 다양한 공급원으로부터 입수가능하다 (예를 들어, 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션 (ATCC) (버지니아주 마나사스) 참조). 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 1개 이상의 벡터로 형질감염된 세포는 1개 이상의 벡터-유래 서열을 포함하는 새로운 세포주를 확립하는데 사용된다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 바와 같은 CRISPR 시스템의 성분으로 일시적으로 형질감염되고 (예컨대 1개 이상의 벡터의 일시적 형질감염, 또는 RNA로의 형질감염에 의함), CRISPR 복합체의 활성을 통해 변형된 세포는 변형을 함유하지만 임의의 다른 외인성 서열은 결여된 세포를 포함하는 새로운 세포주를 확립하는데 사용된다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 1개 이상의 벡터로 일시적으로 또는 비-일시적으로 형질감염된 세포, 또는 이러한 세포로부터 유래된 세포주는 1개 이상의 시험 화합물을 평가하는데 사용된다.
벡터
본 개시내용의 일부 측면은 본원에 기재된 프라임 편집제 또는 그의 성분, 예를 들어 분할 Cas9 단백질 또는 분할 핵염기 프라임 편집제를 세포 내로 전달하기 위해 재조합 바이러스 벡터 (예를 들어, 아데노-연관 바이러스 벡터, 아데노바이러스 벡터, 또는 단순 포진 바이러스 벡터)를 사용하는 것에 관한 것이다. 분할-PE 접근법의 경우, PE 융합 단백질의 N-말단 부분 및 PE 융합체의 C-말단 부분은 별개의 재조합 바이러스 벡터 (예를 들어, 아데노-연관 바이러스 벡터, 아데노바이러스 벡터, 또는 단순 포진 바이러스 벡터)에 의해 동일한 세포 내로 전달되는데, 이는 전장 Cas9 단백질 또는 프라임 편집제가 다양한 바이러스 벡터, 예를 들어 rAAV의 패키징 한계 (~4.9 kb)를 초과하기 때문이다.
따라서, 한 실시양태에서, 개시내용은 분할 프라임 편집제 융합 단백질 또는 그의 분할 성분을 전달할 수 있는 벡터를 고려한다. 일부 실시양태에서, 분할 Cas9 단백질 또는 분할 프라임 편집제를 세포 (예를 들어, 포유동물 세포, 인간 세포) 내로 전달하기 위한 조성물이 제공된다. 일부 실시양태에서, 본 개시내용의 조성물은 (i) Cas9 단백질 또는 프라임 편집제의 C-말단에서 인테인-N에 융합된 Cas9 단백질 또는 프라임 편집제의 N-말단 부분을 코딩하는 제1 뉴클레오티드 서열을 포함하는 제1 재조합 아데노-연관 바이러스 (rAAV) 입자; 및 (ii) Cas9 단백질 또는 프라임 편집제의 C-말단 부분의 N-말단에 융합된 인테인-C를 코딩하는 제2 뉴클레오티드 서열을 포함하는 제2 재조합 아데노-연관 바이러스 (rAAV) 입자를 포함한다. 본 개시내용의 rAAV 입자는 바이러스 캡시드 단백질 내에 캡시드화된 rAAV 벡터 (즉, rAAV의 재조합 게놈)를 포함한다.
일부 실시양태에서, rAAV 벡터는 (1) 본원에 기재된 바와 같은 임의의 형태의 분할 Cas9 단백질 또는 분할 프라임 편집제의 N-말단 부분 또는 C-말단 부분을 코딩하는 제1 또는 제2 뉴클레오티드 서열을 포함하는 이종 핵산 영역, (2) 이종 핵산 영역의 발현을 용이하게 하는 서열 (예를 들어, 프로모터)을 포함하는 1개 이상의 뉴클레오티드 서열, 및 (3) 세포의 게놈 내로의 이종 핵산 영역의 통합을 용이하게 하는 서열을 포함하는 1개 이상의 핵산 영역을 (임의로 발현을 용이하게 하는 서열을 포함하는 1개 이상의 핵산 영역과 함께) 포함한다. 일부 실시양태에서, 통합을 용이하게 하는 바이러스 서열은 역전된 말단 반복부 (ITR) 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 분할 Cas9 단백질 또는 분할 프라임 편집제의 N-말단 부분 또는 C-말단 부분을 코딩하는 제1 또는 제2 뉴클레오티드 서열은 ITR 서열이 각 측면에 플랭킹된다. 일부 실시양태에서, 핵산 벡터는 ITR이 플랭킹된 영역 내에 또는 영역 외부에 함유된, 본원에 기재된 바와 같은 AAV Rep 단백질을 코딩하는 영역을 추가로 포함한다. ITR 서열은 임의의 AAV 혈청형 (예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10)으로부터 유래될 수 있거나 또는 1종 초과의 혈청형으로부터 유래될 수 있다. 일부 실시양태에서, ITR 서열은 AAV2 또는 AAV6으로부터 유래된다.
따라서, 일부 실시양태에서, 본원에 개시된 rAAV 입자는 적어도 1개의 rAAV2 입자, rAAV6 입자, rAAV8 입자, rPHP.B 입자, rPHP.eB 입자, 또는 rAAV9 입자, 또는 그의 변이체를 포함한다. 특정한 실시양태에서, 개시된 rAAV 입자는 rPHP.B 입자, rPHP.eB 입자, rAAV9 입자이다.
ITR 서열 및 ITR 서열을 함유하는 플라스미드는 관련 기술분야에 공지되어 있고, 상업적으로 입수가능하다 (예를 들어, 펜실베니아주 필라델피아 소재의 벡터 바이오랩스(Vector Biolabs); 캘리포니아주 샌디에고 소재의 셀바이오랩스(Cellbiolabs); 캘리포니아주 산타 클라라 소재의 애질런트 테크놀로지스(Agilent Technologies); 및 매사추세츠주 캠브리지 소재의 애드진(Addgene)으로부터 입수가능한 제품 및 서비스; 및 문헌 [Gene delivery to skeletal muscle results in sustained expression and systemic delivery of a therapeutic protein. Kessler PD, Podsakoff GM, Chen X, McQuiston SA, Colosi PC, Matelis LA, Kurtzman GJ, Byrne BJ. Proc Natl Acad Sci USA. 1996 Nov 26;93(24):14082-7; 및 Curtis A. Machida. Methods in Molecular Medicine™. Viral Vectors for Gene Therapy Methods and Protocols. 10.1385/1-59259-304-6:201 ⓒ Humana Press Inc. 2003. Chapter 10. Targeted Integration by Adeno-Associated Virus. Matthew D. Weitzman, Samuel M. oung Jr., Toni Cathomen and Richard Jude Samulski]; 미국 특허 번호 5,139,941 및 5,962,313 참조, 이들은 모두 본원에 참조로 포함됨).
일부 실시양태에서, 본 개시내용의 rAAV 벡터는 이종 핵산 영역의 발현을 제어하기 위한 1개 이상의 조절 요소 (예를 들어, 프로모터, 전사 종결인자, 및/또는 다른 조절 요소)를 포함한다. 일부 실시양태에서, 제1 및/또는 제2 뉴클레오티드 서열은 1개 이상 (예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5개 또는 그 초과)의 전사 종결인자에 작동가능하게 연결된다. 본 개시내용에 따라 사용될 수 있는 전사 종결인자의 비제한적 예는 소 성장 호르몬 유전자 (bGH), 인간 성장 호르몬 유전자 (hGH), SV40, CW3, φ, 또는 그의 조합의 전사 종결인자를 포함한다. 여러 전사 종결인자의 효율은 분할 Cas9 단백질 또는 분할 프라임 편집제의 발현 수준에서의 그의 각각의 효과를 결정하기 위해 시험되었다. 일부 실시양태에서, 본 개시내용에 사용된 전사 종결인자는 bGH 전사 종결인자이다. 일부 실시양태에서, rAAV 벡터는 우드척 간염 바이러스 전사후 조절 요소 (WPRE)를 추가로 포함한다. 특정 실시양태에서, WPRE는 말단절단된 WPRE 서열, 예컨대 "W3"이다. 일부 실시양태에서, WPRE는 전사 종결인자의 5'에 삽입된다. 이러한 서열은 전사되는 경우에, 특히 바이러스 벡터로부터의 발현을 증진시키는 3차 구조를 생성한다.
일부 실시양태에서, 본원에 사용된 벡터는 PE 융합 단백질, 또는 그의 성분 중 임의의 것 (예를 들어, napDNAbp, 링커, 또는 폴리머라제)을 코딩할 수 있다. 또한, 본원에 사용된 벡터는 PEgRNA, 및/또는 제2 가닥 닉킹을 위한 보조 gRNA를 코딩할 수 있다. 벡터는 세포에서 1개 이상의 코딩 서열의 발현을 구동할 수 있다. 일부 실시양태에서, 세포는 원핵 세포, 예컨대, 예를 들어, 박테리아 세포일 수 있다. 일부 실시양태에서, 세포는 진핵 세포, 예컨대, 예를 들어 효모, 식물, 곤충, 또는 포유동물 세포일 수 있다. 일부 실시양태에서, 진핵 세포는 포유동물 세포일 수 있다. 일부 실시양태에서, 진핵 세포는 설치류 세포일 수 있다. 일부 실시양태에서, 진핵 세포는 인간 세포일 수 있다. 상이한 유형의 세포에서 발현을 구동하기에 적합한 프로모터는 관련 기술분야에 공지되어 있다. 일부 실시양태에서, 프로모터는 야생형일 수 있다. 다른 실시양태에서, 프로모터는 보다 효율적이거나 효과적인 발현을 위해 변형될 수 있다. 또 다른 실시양태에서, 프로모터는 말단절단되어도 그의 기능을 보유할 수 있다. 예를 들어, 프로모터는 벡터를 바이러스 내로 적절히 패키징하는데 적합한 정상 크기 또는 감소된 크기를 가질 수 있다.
일부 실시양태에서, 프라임 편집제 벡터에 사용될 수 있는 프로모터는 구성적, 유도성, 또는 조직-특이적일 수 있다. 일부 실시양태에서, 프로모터는 구성적 프로모터일 수 있다. 비제한적인 예시적인 구성적 프로모터는 시토메갈로바이러스 극초기 프로모터 (CMV), 원숭이 바이러스 (SV40) 프로모터, 아데노바이러스 주요 후기 (MLP) 프로모터, 라우스 육종 바이러스(RSV) 프로모터, 마우스 유방 종양 바이러스 (MMTV) 프로모터, 포스포글리세레이트 키나제 (PGK) 프로모터, 신장 인자-알파 (EFla) 프로모터, 유비퀴틴 프로모터, 액틴 프로모터, 튜불린 프로모터, 이뮤노글로불린 프로모터, 그의 기능적 단편, 또는 상기 중 임의의 것의 조합을 포함한다. 일부 실시양태에서, 프로모터는 CMV 프로모터일 수 있다. 일부 실시양태에서, 프로모터는 말단절단된 CMV 프로모터일 수 있다. 다른 실시양태에서, 프로모터는 EFla 프로모터일 수 있다. 일부 실시양태에서, 프로모터는 유도성 프로모터일 수 있다. 비제한적인 예시적인 유도성 프로모터는 열 쇼크, 광, 화학물질, 펩티드, 금속, 스테로이드, 항생제, 또는 알콜에 의해 유도가능한 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, 유도성 프로모터는 낮은 기저 (비-유도된) 발현 수준을 갖는 것, 예컨대, 예를 들어, 테트-온(Tet-On)® 프로모터 (클론테크)일 수 있다. 일부 실시양태에서, 프로모터는 조직-특이적 프로모터일 수 있다. 일부 실시양태에서, 조직-특이적 프로모터는 간 조직에서 독점적으로 또는 우세하게 발현된다. 비제한적인 예시적인 조직-특이적 프로모터는 B29 프로모터, CD14 프로모터, CD43 프로모터, CD45 프로모터, CD68 프로모터, 데스민 프로모터, 엘라스타제-1 프로모터, 엔도글린 프로모터, 피브로넥틴 프로모터, Flt-1 프로모터, GFAP 프로모터, GPIIb 프로모터, ICAM-2 프로모터, INF-β 프로모터, Mb 프로모터, Nphsl 프로모터, OG-2 프로모터, SP-B 프로모터, SYN1 프로모터, 및 WASP 프로모터를 포함한다.
일부 실시양태에서, 프라임 편집제 벡터 (예를 들어, 프라임 편집제 융합 단백질 및/또는 PEgRNA, 및/또는 보조 제2 가닥 닉킹 gRNA를 코딩하는 임의의 벡터를 포함함)는 표적 세포에 전달된 후에만 발현을 시작하는 유도성 프로모터를 포함할 수 있다. 비제한적인 예시적인 유도성 프로모터는 열 쇼크, 광, 화학물질, 펩티드, 금속, 스테로이드, 항생제, 또는 알콜에 의해 유도가능한 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, 유도성 프로모터는 낮은 기저 (비-유도된) 발현 수준을 갖는 것, 예컨대, 예를 들어, 테트-온® 프로모터 (클론테크)일 수 있다.
추가의 실시양태에서, 프라임 편집제 벡터 (예를 들어, 프라임 편집제 융합 단백질 및/또는 PEgRNA, 및/또는 보조 제2 가닥 닉킹 gRNA를 코딩하는 임의의 벡터를 포함함)는 특정 조직 내로 전달된 후에만 발현을 시작하기 위해 조직-특이적 프로모터를 포함할 수 있다. 비제한적인 예시적인 조직-특이적 프로모터는 B29 프로모터, CD14 프로모터, CD43 프로모터, CD45 프로모터, CD68 프로모터, 데스민 프로모터, 엘라스타제-1 프로모터, 엔도글린 프로모터, 피브로넥틴 프로모터, Flt-1 프로모터, GFAP 프로모터, GPIIb 프로모터, ICAM-2 프로모터, INF-β 프로모터, Mb 프로모터, Nphsl 프로모터, OG-2 프로모터, SP-B 프로모터, SYN1 프로모터, 및 WASP 프로모터를 포함한다.
일부 실시양태에서, PEgRNA (또는 프라임 편집과 관련하여 사용되는 임의의 가이드 RNA)를 코딩하는 뉴클레오티드 서열은 적어도 1개의 전사 또는 번역 제어 서열에 작동가능하게 연결될 수 있다. 일부 실시양태에서, 가이드 RNA를 코딩하는 뉴클레오티드 서열은 적어도 1개의 프로모터에 작동가능하게 연결될 수 있다. 일부 실시양태에서, 프로모터는 RNA 폴리머라제 III (Pol III)에 의해 인식될 수 있다. Pol III 프로모터의 비제한적 예는 U6, HI 및 tRNA 프로모터를 포함한다. 일부 실시양태에서, 가이드 RNA를 코딩하는 뉴클레오티드 서열은 마우스 또는 인간 U6 프로모터에 작동가능하게 연결될 수 있다. 다른 실시양태에서, 가이드 RNA를 코딩하는 뉴클레오티드 서열은 마우스 또는 인간 HI 프로모터에 작동가능하게 연결될 수 있다. 일부 실시양태에서, 가이드 RNA를 코딩하는 뉴클레오티드 서열은 마우스 또는 인간 tRNA 프로모터에 작동가능하게 연결될 수 있다. 1개 초과의 가이드 RNA를 갖는 실시양태에서, 발현을 구동하는데 사용되는 프로모터는 동일하거나 상이할 수 있다. 일부 실시양태에서, 가이드 RNA의 crRNA를 코딩하는 뉴클레오티드 및 가이드 RNA의 tracr RNA를 코딩하는 뉴클레오티드는 동일한 벡터 상에 제공될 수 있다. 일부 실시양태에서, crRNA를 코딩하는 뉴클레오티드 및 tracr RNA를 코딩하는 뉴클레오티드는 동일한 프로모터에 의해 구동될 수 있다. 일부 실시양태에서, crRNA 및 tracr RNA는 단일 전사체로 전사될 수 있다. 예를 들어, crRNA 및 tracr RNA는 단일 전사체로부터 프로세싱되어 이중-분자 가이드 RNA를 형성할 수 있다. 대안적으로, crRNA 및 tracr RNA는 단일-분자 가이드 RNA로 전사될 수 있다.
일부 실시양태에서, 가이드 RNA를 코딩하는 뉴클레오티드 서열은 PE 융합 단백질을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 동일한 벡터 상에 위치할 수 있다. 일부 실시양태에서, 가이드 RNA 및 PE 융합 단백질의 발현은 그의 상응하는 프로모터에 의해 구동될 수 있다. 일부 실시양태에서, 가이드 RNA의 발현은 PE 융합 단백질의 발현을 구동하는 동일한 프로모터에 의해 구동될 수 있다. 일부 실시양태에서, 가이드 RNA 및 PE 융합 단백질 전사체는 단일 전사체 내에 함유될 수 있다. 예를 들어, 가이드 RNA는 Cas9 단백질 전사체의 비번역 영역 (UTR) 내에 있을 수 있다. 일부 실시양태에서, 가이드 RNA는 PE 융합 단백질 전사체의 5' UTR 내에 있을 수 있다. 다른 실시양태에서, 가이드 RNA는 PE 융합 단백질 전사체의 3' UTR 내에 있을 수 있다. 일부 실시양태에서, PE 융합 단백질 전사체의 세포내 반감기는 가이드 RNA를 그의 3' UTR 내에 함유시켜 그의 3' UTR의 길이를 단축시킴으로써 감소될 수 있다. 추가의 실시양태에서, 가이드 RNA는 PE 융합 단백질 전사체의 인트론 내에 있을 수 있다. 일부 실시양태에서, 가이드 RNA가 전사체로부터 적절하게 스플라이싱되도록 가이드 RNA가 위치하는 인트론에 적합한 스플라이스 부위가 부가될 수 있다. 일부 실시양태에서, 동일한 벡터 상에서의 아주 근접한 Cas9 단백질 및 가이드 RNA의 발현은 CRISPR 복합체의 보다 효율적인 형성을 용이하게 할 수 있다.
프라임 편집제 벡터 시스템은 1개의 벡터, 또는 2개의 벡터, 또는 3개의 벡터, 또는 4개의 벡터, 또는 5개의 벡터, 또는 그 초과를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 벡터 시스템은 PE 융합 단백질 및 PEgRNA 둘 다를 코딩하는 1개의 단일 벡터를 포함할 수 있다. 다른 실시양태에서, 벡터 시스템은 2개의 벡터를 포함할 수 있고, 여기서 하나의 벡터는 PE 융합 단백질을 코딩하고, 다른 벡터는 PEgRNA를 코딩한다. 추가의 실시양태에서, 벡터 시스템은 3개의 벡터를 포함할 수 있고, 여기서 제3 벡터는 본원의 방법에 사용되는 제2 가닥 닉킹 gRNA를 코딩한다.
일부 실시양태에서, rAAV 입자 (본원에서 고려되는 임의의 형태)를 포함하는 조성물은 제약상 허용되는 담체를 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 조성물은 인간 또는 동물 대상체에게 투여하기 위한 적절한 제약 비히클 중에 제제화된다.
제약상 허용되는 담체로서의 역할을 할 수 있는 물질의 일부 예는 다음을 포함한다: (1) 당, 예컨대 락토스, 글루코스 및 수크로스; (2) 전분, 예컨대 옥수수 전분 및 감자 전분; (3) 셀룰로스 및 그의 유도체, 예컨대 소듐 카르복시메틸 셀룰로스, 메틸셀룰로스, 에틸 셀룰로스, 미세결정질 셀룰로스 및 셀룰로스 아세테이트; (4) 분말화 트라가칸트; (5) 맥아; (6) 젤라틴; (7) 윤활제, 예컨대 스테아르산마그네슘, 소듐 라우릴 술페이트 및 활석; (8) 부형제, 예컨대 코코아 버터 및 좌제 왁스; (9) 오일, 예컨대 땅콩 오일, 목화씨 오일, 홍화 오일, 참깨 오일, 올리브 오일, 옥수수 오일 및 대두 오일; (10) 글리콜, 예컨대 프로필렌 글리콜; (11) 폴리올, 예컨대 글리세린, 소르비톨, 만니톨 및 폴리에틸렌 글리콜 (PEG); (12) 에스테르, 예컨대 에틸 올레에이트 및 에틸 라우레이트; (13) 한천; (14) 완충제, 예컨대 수산화마그네슘 및 수산화알루미늄; (15) 알긴산; (16) 발열원-무함유 물; (17) 등장성 염수; (18) 링거액; (19) 에틸 알콜; (20) pH 완충 용액; (21) 폴리에스테르, 폴리카르보네이트 및/또는 폴리무수물; (22) 벌킹제, 예컨대 폴리펩티드 및 아미노산 (23) 혈청 성분, 예컨대 혈청 알부민, HDL 및 LDL; (22) C2-C12 알콜, 예컨대 에탄올; 및 (23) 제약 제제에 사용되는 다른 비-독성 상용성 물질. 습윤제, 착색제, 이형제, 코팅제, 감미제, 향미제, 퍼퓸제, 보존제 및 항산화제가 또한 제제에 존재할 수 있다. "부형제", "담체", "제약상 허용되는 담체" 등과 같은 용어는 본원에서 상호교환가능하게 사용된다.
전달 방법
일부 측면에서, 본 발명은 1개 이상의 폴리뉴클레오티드, 예컨대 본원에 기재된 바와 같은 1개 이상의 벡터, 그의 1개 이상의 전사체, 및/또는 그로부터 전사된 1개 이상의 단백질을 숙주 세포에 전달하는 것을 포함하는 방법을 제공한다. 일부 측면에서, 본 발명은 이러한 방법에 의해 생산된 세포, 및 이러한 세포를 포함하거나 또는 그로부터 생산된 유기체 (예컨대 동물, 식물, 또는 진균)를 추가로 제공한다. 일부 실시양태에서, 가이드 서열과 조합된 (및 임의로 그와 복합체화된) 본원에 기재된 바와 같은 염기 편집제가 세포에 전달된다.
예시적인 전달 전략은 본원의 다른 곳에 기재되어 있으며, 이는 벡터-기반 전략, PE 리보핵단백질 복합체 전달, 및 mRNA 방법에 의한 PE의 전달을 포함한다.
일부 실시양태에서, 제공된 전달 방법은 뉴클레오펙션, 미세주사, 바이오리스틱, 비로솜, 리포솜, 이뮤노리포솜, 다가양이온 또는 지질:핵산 접합체, 네이키드 DNA, 인공 비리온, 및 DNA의 작용제-증진된 흡수를 포함한다.
핵산의 예시적인 전달 방법은 리포펙션, 뉴클레오펙션, 전기천공, 안정한 게놈 통합 (예를 들어, 피기백), 미세주사, 바이오리스틱, 비로솜, 리포솜, 이뮤노리포솜, 다가양이온 또는 지질:핵산 접합체, 네이키드 DNA, 인공 비리온, 및 DNA의 작용제-증진된 흡수를 포함한다. 리포펙션은, 예를 들어 미국 특허 번호 5,049,386, 4,946,787; 및 4,897,355에 기재되어 있고, 리포펙션 시약은 상업적으로 판매된다 (예를 들어, 트랜스펙탐(Transfectam)™, 리포펙틴(Lipofectin)™ 및 SF 세포주 4D-뉴클레오펙터 X 키트™ (론자(Lonza))). 폴리뉴클레오티드의 효율적인 수용체-인식 리포펙션에 적합한 양이온성 및 중성 지질은 파이너(Feigner), WO 91/17424; WO91/16024의 것을 포함한다. 전달은 세포 (예를 들어, 시험관내 또는 생체외 투여) 또는 표적 조직 (예를 들어, 생체내 투여)에 대한 것일 수 있다. 전달은 RNP 복합체의 사용을 통해 달성될 수 있다.
표적화된 리포솜, 예컨대 면역지질 복합체를 포함한 지질:핵산 복합체의 제조는 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 널리 공지되어 있다 (예를 들어, 문헌 [Crystal, Science 270:404-410 (1995); Blaese et al., Cancer Gene Ther. 2:291-297 (1995); Behr et al., Bioconjugate Chem. 5:382-389 (1994); Remy et al., Bioconjugate Chem. 5:647-654 (1994); Gao et al., Gene Therapy 2:710-722 (1995); Ahmad et al., Cancer Res. 52:4817-4820 (1992)]; 미국 특허 번호 4,186,183, 4,217,344, 4,235,871, 4,261,975, 4,485,054, 4,501,728, 4,774,085, 4,837,028, 및 4,946,787 참조).
다른 실시양태에서, 본원에 제공된 전달 방법 및 벡터는 RNP 복합체이다. 융합 단백질의 RNP 전달은 염기 편집의 DNA 특이성을 현저하게 증가시킨다. 융합 단백질의 RNP 전달은 온- 및 오프-타겟 DNA 편집의 탈커플링으로 이어진다. RNP 전달은 플라스미드 전달과 대등한 온-타겟 편집을 유지시키면서 비-반복 부위에서의 오프-타겟 편집을 제거하고, 심지어 고도로 반복적인 VEGFA 부위에서도 오프-타겟 DNA 편집을 크게 감소시킨다 2. 문헌 [Rees, H.A. et al., Improving the DNA specificity and applicability of base editing through protein engineering and protein delivery, Nat. Commun. 8, 15790 (2017)], 2016년 12월 27일에 허여된 미국 특허 번호 9,526,784, 및 2017년 8월 22일에 허여된 미국 특허 번호 9,737,604를 참조하며, 이들 각각은 본원에 참조로 포함된다.
핵산을 세포에 전달하기 위한 추가의 방법은 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 공지되어 있다. 예를 들어, 본원에 참조로 포함된 US 2003/0087817을 참조한다.
본 개시내용의 다른 측면은 프라임 편집제 구축물을 세포 내로 전달하여 세포 내에서 완전하고 기능적인 프라임 편집제를 형성하는 방법을 제공한다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, 세포는 본원에 기재된 조성물 (예를 들어, 분할 Cas9 또는 분할 프라임 편집제를 코딩하는 뉴클레오티드 서열 또는 이러한 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산 벡터를 함유하는 AAV 입자를 포함하는 조성물)과 접촉된다. 일부 실시양태에서, 접촉은 이러한 뉴클레오티드 서열의 세포 내로의 전달을 발생시키며, 여기서 Cas9 단백질 또는 프라임 편집제의 N-말단 부분 및 Cas9 단백질 또는 프라임 편집제의 C-말단 부분은 세포에서 발현되고, 연결되어, 완전한 Cas9 단백질 또는 완전한 프라임 편집제를 형성한다.
본원에 제공된 임의의 rAAV 입자, 핵산 분자 또는 조성물은 임의의 적합한 방식으로, 안정적으로 또는 일시적으로 세포 내로 도입될 수 있음을 인지하여야 한다. 일부 실시양태에서, 개시된 단백질은 세포를 형질감염시킬 수 있다. 일부 실시양태에서, 세포는 핵산 분자로 형질도입 또는 형질감염될 수 있다. 예를 들어, 세포는 (예를 들어, 분할 단백질을 코딩하는 바이러스로) 형질도입될 수 있거나, 또는 분할 단백질을 코딩하는 핵산 분자로 (예를 들어, 분할 단백질을 코딩하는 플라스미드로), 또는 1개 이상의 핵산 분자를 코딩하는 바이러스 게놈을 함유하는 rAAV 입자로 형질감염될 수 있다. 이러한 형질도입은 안정한 또는 일시적 형질도입일 수 있다. 일부 실시양태에서, 분할 단백질을 발현하거나 또는 분할 단백질을 함유하는 세포는, 예를 들어 분할 Cas9 (예를 들어, nCas9) 단백질의 전달 시 1개 이상의 가이드 RNA 서열로 형질도입 또는 형질감염될 수 있다. 일부 실시양태에서, 분할 단백질을 발현하는 플라스미드는 전기천공, 일시적 (예를 들어, 리포펙션) 및 안정한 게놈 통합 (예를 들어, 피기백) 및 바이러스 형질도입 또는 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 공지된 다른 방법을 통해 세포 내로 도입될 수 있다.
특정 실시양태에서, 본원에 제공된 조성물은 지질 및/또는 중합체를 포함한다. 특정 실시양태에서, 지질 및/또는 중합체는 양이온성이다. 이러한 지질 입자의 제조는 널리 공지되어 있다. 예를 들어, 미국 특허 번호 4,880,635; 4,906,477; 4,911,928; 4,917,951; 4,920,016; 4,921,757; 및 9,737,604를 참조하고; 이들 각각은 본원에 참조로 포함된다.
가이드 RNA 서열은 15-100개 뉴클레오티드 길이일 수 있고, 표적 뉴클레오티드 서열에 상보적인 적어도 10, 적어도 15, 또는 적어도 20개의 인접 뉴클레오티드의 서열을 포함한다. 가이드 RNA는 표적 뉴클레오티드 서열에 상보적인 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 또는 40개의 인접 뉴클레오티드의 서열을 포함할 수 있다. 가이드 RNA는 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 또는 50개 뉴클레오티드 길이일 수 있다.
일부 실시양태에서, 표적 뉴클레오티드 서열은 게놈, 예를 들어 진핵 게놈 내의 DNA 서열이다. 특정 실시양태에서, 표적 뉴클레오티드 서열은 포유동물 (예를 들어, 인간) 게놈 내에 있다.
본 개시내용의 조성물은 예를 들어 단위 용량으로서 투여 또는 패키징될 수 있다. 용어 "단위 용량"은 본 개시내용의 제약 조성물과 관련하여 사용되는 경우에 대상체에 대한 단일 투여량으로서 적합한 물리적 이산 단위를 지칭하며, 각각의 단위는 요구되는 희석제, 즉, 담체 또는 비히클과 함께 목적하는 치료 효과를 생성하도록 계산된 미리 결정된 양의 활성 물질을 함유한다.
질환 또는 장애의 치료는 질환의 발생 또는 진행의 지연, 또는 질환 중증도의 감소를 포함한다. 질환을 치료하는 것은 반드시 치유적 결과를 요구하는 것은 아니다.
본원에 사용된 질환의 발생의 "지연"은 질환의 진행을 연기, 방해, 둔화, 지체, 안정화, 및/또는 늦추는 것을 의미한다. 이러한 지연은 치료될 질환 및/또는 개체의 병력에 따라 다양한 시간 길이일 수 있다. 질환의 발생을 "지연" 또는 완화시키거나, 또는 질환의 발병을 지연시키는 방법은, 방법을 사용하지 않는 것과 비교하여, 주어진 시간 프레임에서 질환의 1종 이상의 증상이 발생할 확률을 감소시키고/거나 주어진 시간 프레임에서 증상의 정도를 감소시키는 방법이다. 이러한 비교는 전형적으로 통계적으로 유의한 결과를 제공하기에 충분한 다수의 대상체를 사용하는 임상 연구에 기초한다.
질환의 "발생" 또는 "진행"은 질환의 초기 징후 및/또는 뒤이은 진행을 의미한다. 질환의 발생은 관련 기술분야에 널리 공지된 바와 같은 표준 임상 기술을 사용하여 검출가능하고 평가될 수 있다. 그러나, 발생은 또한 검출불가능할 수 있는 진행을 지칭한다. 본 개시내용의 목적상, 발생 또는 진행은 증상의 생물학적 과정을 지칭한다. "발생"은 출현, 재발, 및 발병을 포함한다.
본원에 사용된 질환의 "발병" 또는 "출현"은 초기 발병 및/또는 재발을 포함한다. 치료될 질환의 유형 또는 질환의 부위에 따라, 의약 분야의 통상의 기술자에게 공지된 통상적인 방법을 사용하여 단리된 폴리펩티드 또는 제약 조성물을 대상체에게 투여할 수 있다.
추가의 상술 없이, 관련 기술분야의 통상의 기술자는 상기 설명에 기초하여 본 개시내용을 그의 최대 정도로 이용할 수 있는 것으로 여겨진다. 따라서, 하기 구체적 실시양태는 단지 예시적이며, 어떠한 방식으로도 나머지 개시내용을 제한하지 않는 것으로 해석되어야 한다. 본원에 인용된 모든 공개물은 본원에 언급된 목적 또는 주제를 위해 참조로 포함된다.
서열
본 출원은 전반적으로 예시적인 Cas9 서열, 리버스 트랜스크립타제 서열, 융합 단백질 서열, 링커, 가이드 RNA, 및 다른 서열을 포함한, 본 개시내용의 다양한 측면과 관련된 다양한 아미노산 및 뉴클레오티드 서열을 기재한다. 또한, 실시예 2 (및 본원의 다른 곳)는 클린바 데이터베이스로부터의 예시적인 서열을 복구하기 위한 수천개의 예시적인 프라임 편집제 가이드 RNA (PEgRNA)의 서열을 설계 및/또는 결정하기 위한 과정 및 알고리즘을 기재한다.
본 출원은 서열 목록과 함께 출원된다. 서열 목록은 실시예 2에 따라 결정된 각각의 PEgRNA의 설명을 포함한다. 전체로서, 실시예 2는 133515개의 예시적인 PEgRNA 완전 서열의 서열을 결정한다. 각각의 이들 서열은 서열 목록에 제시/포함되고, 서열식별번호: 1-135514 및 813085-880462로서 확인된다. 또한, 다른 곳에 기재된 바와 같이, PEgRNA는 각각 스페이서 (서열식별번호: 135515 - 271028 및 880463-947840) 및 연장 아암 (서열식별번호: 271029 - 406542 및 947841-1015218)으로 구성된다. 또한, 각각의 PEgRNA는, 예를 들어 서열식별번호: 1361579-1361580에 의해 규정된 바와 같은 gRNA 코어를 포함한다. 서열식별번호: 271029 - 406542 및 947841-1015218의 연장 아암은 추가로 각각 프라이머 결합 부위 (서열식별번호: 406543 - 542056 및 1015219-1082596), 편집 주형 (서열식별번호: 542057 - 677570 및 1082597-1149974), 및 상동성 아암 (서열식별번호: 677571 - 813084 및 1149975-1217352)으로 구성된다. PEgRNA는 임의로 5' 단부 변형제 영역 및/또는 3' 단부 변형제 영역을 포함할 수 있다. PEgRNA는 또한 PEgRNA의 3'에 역전사 종결 신호 (예를 들어, 서열식별번호: 1361560-1361566)를 포함할 수 있다.
서열 목록에 제공된 각각의 전장 PEgRNA 서열 (서열식별번호: 1 - 135514)에 대해, 서열 목록은 5개의 상응하는 하위서열 세트: 즉, (1) 스페이서, (2) 연장 아암, (3) 프라이머 결합 부위, (4) 편집 주형, 및 (5) 상동성 아암을 포함한다. 임의의 주어진 PEgRNA 전장 서열에 대한 하위서열의 세트는 하기 수학적 연산에 의해 결정될 수 있다.
각각의 PEgRNA에 대한 하위서열의 세트의 결정
서열 목록의 각각의 PEgRNA 서열 (예를 들어, 서열식별번호: 1)에 대해, 서열 목록의 하기 서열은 상응하는 하위서열의 세트를 구성한다:
서열식별번호: 1-813084의 경우: (1) 스페이서, (2) 연장 아암, (3) 프라이머 결합 부위, (4) 편집 주형, 및 (5) 상동성 아암은 다음과 같이 관련된다:
스페이서: 각각의 주어진 PEgRNA 서열에 대해, 상응하는 스페이서 서열은 인자 135514에 부가된 PEgRNA 서열 식별자의 숫자 (예를 들어, 서열식별번호: 1의 경우 숫자 "1")로서 확인된다. 예를 들어, 서열식별번호: 1의 PEgRNA에 상응하는 스페이서는 서열식별번호: 135515이다.
연장 아암: 각각의 주어진 PEgRNA 서열에 대해, 상응하는 연장 아암은 인자 271028 (135514 X 2)에 부가된 PEgRNA 서열 식별자의 숫자 (예를 들어, 서열식별번호: 1의 경우 숫자 "1")로서 확인된다. 예를 들어, 서열식별번호: 1의 PEgRNA에 상응하는 연장 아암은 서열식별번호: 271029이다.
프라이머 결합 부위: 각각의 주어진 PEgRNA 서열에 대해, 상응하는 프라이머 결합 부위는 인자 406542 (135514 X 3)에 부가된 PEgRNA 서열 식별자의 숫자 (예를 들어, 서열식별번호: 1의 경우 숫자 "1")로서 확인된다. 예를 들어, 서열식별번호: 1의 PEgRNA에 상응하는 프라이머 결합 부위는 서열식별번호: 406542이다.
편집 주형: 각각의 주어진 PEgRNA 서열에 대해, 상응하는 편집 주형은 인자 542056 (135514 X 4)에 부가된 PEgRNA 서열 식별자의 숫자 (예를 들어, 서열식별번호: 1의 경우 숫자 "1")로서 확인된다. 예를 들어, 서열식별번호: 1의 PEgRNA에 상응하는 편집 주형은 서열식별번호: 542057이다.
상동성 아암: 각각의 주어진 PEgRNA 서열에 대해, 상응하는 상동성 아암은 인자 677570 (135514 X 5)에 부가된 PEgRNA 서열 식별자의 숫자 (예를 들어, 서열식별번호: 1의 경우 숫자 "1")로서 확인된다. 예를 들어, 서열식별번호: 1의 PEgRNA에 상응하는 편집 주형은 서열식별번호: 677571이다.
다른 PEgRNA 서열 세트 (즉, 각각 SpCas9 (NG) (서열식별번호: 1361594) 또는 SpCas9 (NGG) (서열식별번호: 1361593)에 대해 설계된 서열 1-813084로부터의 임의의 주어진 PEgRNA, 및 상응하는 스페이서, 연장 아암, 프라이머 결합 부위, 편집 주형, 및 상동성 아암을 포함함)의 예를 하기 표에 제시한다:
Figure pct00092
...
Figure pct00093
칼럼 "완전 PEgRNA" 서열을 참조하여, SpCas9 (NG)에 대해 하기 서열을 설계하였다: 서열식별번호: 1 - 5647, 11805 - 16732, 22103 - 25050, 28363 - 29187, 30093 - 32319, 35189 - 36933, 38922 - 39997, 41226 - 42469, 43878 - 44208, 44586 - 46456, 48645 - 49697, 50844 - 52070, 53532 - 54670, 55949 - 57576, 59335 - 60913, 62672 - 64332, 66233 - 67299, 68520 - 69273, 70195 - 72171, 74385 - 74390, 74398 - 77256, 80717 - 81275, 81899 - 81962, 82033 - 82033, 82036 - 82044, 82057 - 82063, 82072 - 82075, 82080 - 82084, 82090 - 82092, 82096 - 82100, 82106 - 82110, 82117 - 82122, 82129 - 82405, 82715 - 84431, 86323 - 86687, 87092 - 87715, 88417 - 88800, 89256 - 89791, 90405 - 92752, 95411 - 98661, 102329 - 103777, 105393 - 107009, 108826 - 109348, 109932 - 110356, 110863 - 111265, 111744 - 112224, 112822 - 113854, 115060 - 115952, 116995 - 117667, 118418 - 118426, 118436 - 119980, 121698 - 121921, 122175 - 122445, 122774 - 124123, 125657 - 126486, 127395 - 127872, 128428 - 128931, 129509 - 130164, 130892 - 131784, 132784 - 134059.
칼럼 "완전 PEgRNA" 서열을 참조하여, SpCas9 (NGG)에 대해 하기 서열을 설계하였다: 서열식별번호: 5648 - 11804, 16733 - 22102, 25051 - 28362, 29188 - 30092, 32320 - 35188, 36934 - 38921, 39998 - 41225, 42470 - 43877, 44209 - 44585, 46457 - 48644, 49698 - 50843, 52071 - 53531, 54671 - 55948, 57577 - 59334, 60914 - 62671, 64333 - 66232, 67300 - 68519, 69274 - 70194, 72172 - 74384, 74391 - 74397, 77257 - 80716, 81276 - 81898, 81963 - 82032, 82034 - 82035, 82045 - 82056, 82064 - 82071, 82076 - 82079, 82085 - 82089, 82093 - 82095, 82101 - 82105, 82111 - 82116, 82123 - 82128, 82406 - 82714, 84432 - 86322, 86688 - 87091, 87716 - 88416, 88801 - 89255, 89792 - 90404, 92753 - 95410, 98662 - 102328, 103778 - 105392, 107010 - 108825, 109349 - 109931, 110357 - 110862, 111266 - 111743, 112225 - 112821, 113855 - 115059, 115953 - 116994, 117668 - 118417, 118427 - 118435, 119981 - 121697, 121922 - 122174, 122446 - 122773, 124124 - 125656, 126487 - 127394, 127873 - 128427, 128932 - 129508, 130165 - 130891, 131785 - 132783, 134060 - 135514.
서열식별번호: 813085-1217352의 경우: (1) 스페이서, (2) 연장 아암, (3) 프라이머 결합 부위, (4) 편집 주형, 및 (5) 상동성 아암은 다음과 같이 관련된다:
스페이서: 각각의 주어진 PEgRNA 서열에 대해, 상응하는 스페이서 서열은 인자 67378에 부가된 PEgRNA 서열 식별자의 숫자 (예를 들어, 서열식별번호: 813085의 경우 숫자 "813085")로서 확인된다. 예를 들어, 서열식별번호: 813085의 PEgRNA에 상응하는 스페이서는 서열식별번호: 880463이다.
연장 아암: 각각의 주어진 PEgRNA 서열에 대해, 상응하는 연장 아암은 인자 134756 (67378 X 2)에 부가된 PEgRNA 서열 식별자의 숫자 (예를 들어, 서열식별번호: 813085의 경우 숫자 "813085")로서 확인된다. 예를 들어, 서열식별번호: 813085의 PEgRNA에 상응하는 연장 아암은 서열식별번호: 947841이다.
프라이머 결합 부위: 각각의 주어진 PEgRNA 서열에 대해, 상응하는 프라이머 결합 부위는 인자 202134 (67378 X 3)에 부가된 PEgRNA 서열 식별자의 숫자 (예를 들어, 서열식별번호: 813085의 경우 숫자 "813085")로서 확인된다. 예를 들어, 서열식별번호: 813085의 PEgRNA에 상응하는 프라이머 결합 부위는 서열식별번호: 1015219이다.
편집 주형: 각각의 주어진 PEgRNA 서열에 대해, 상응하는 편집 주형은 인자 269512 (67378 X 4)에 부가된 PEgRNA 서열 식별자의 숫자 (예를 들어, 서열식별번호: 813085의 경우 숫자 "813085")로서 확인된다. 예를 들어, 서열식별번호: 813085의 PEgRNA에 상응하는 편집 주형은 서열식별번호: 1082597이다.
상동성 아암: 각각의 주어진 PEgRNA 서열에 대해, 상응하는 상동성 아암은 인자 336890 (67378 X 5)에 부가된 PEgRNA 서열 식별자의 숫자 (예를 들어, 서열식별번호: 813085의 경우 숫자 "813085")로서 확인된다. 예를 들어, 서열식별번호: 813085의 PEgRNA에 상응하는 편집 주형은 서열식별번호: 1149975이다.
서열 목록에 제공된 서열의 총 수는 1217352개이다. 총 202892개의 PEgRNA 완전 서열 (각각 적어도 스페이서, gRNA 코어, 및 연장 아암을 포함함)이 존재한다. 동일한 수의 (1) 스페이서, (2) 연장 아암, (3) 프라이머 결합 부위, (4) 편집 주형, 및 (5) 상동성 아암이 존재하며, 각각의 세트는 상기와 같이 규정된다.
다른 PEgRNA 서열 세트 (즉, 서열 813085-1217352로부터의 임의의 주어진 PEgRNA, 및 상응하는 스페이서, 연장 아암, 프라이머 결합 부위, 편집 주형, 및 상동성 아암을 포함함)의 예를 하기 표에 제시한다:
Figure pct00094
...
Figure pct00095
서열식별번호: 813,085 - 1,217,352의 각각의 서열을 SaCas9-KKH (서열식별번호: 1361596)에 대해 설계하였다.
본원과 함께 제출된 서열 목록은 원래 제출된 바와 같은 본 명세서의 일부를 형성하는 것으로 의도되고 이를 형성한다.
서열 목록 (즉, 일람표)의 내용의 요약은 하기 표 XY에서와 같다:
Figure pct00096
Figure pct00097
PAM 인식 부위
각각의 PEgRNA의 경우, Cas9는 그와 연관된 PAM 인식 부위를 가질 수 있다. 일부 실시양태에서, PAM 인식 부위는 NGG이다. 일부 실시양태에서, PAM 인식 부위는 NG이다. 일부 실시양태에서, PAM 인식 부위는 KKH이다. 하기 표는 본 개시내용의 PEgRNA에 의해 표적화되는 연관 PAM 부위를 예시한다:
표 XX: PAM 연관물
Figure pct00098
Figure pct00099
Figure pct00100
실시예
실시예 1. 게놈 내 정확한 뉴클레오티드 변화의 설치를 위한 프라임 편집 (PE)
목적은 포유동물 게놈에서 단일 뉴클레오티드 변화의 정확하고 일반적인 설치를 위해 형질전환 게놈 편집 기술을 개발하는 것이다. 이 기술은 조사자가 사실상 임의의 포유동물 유전자에서 단일 뉴클레오티드 변경의 효과를 연구할 수 있게 하고, 인간 환자에서 병원성 점 돌연변이를 교정하기 위한 치료적 개입을 잠재적으로 가능하게 할 것이다.
게놈 편집을 위한 클러스터링된 규칙적 간격의 짧은 회문식 반복부 (CRISPR) 시스템의 채택은 생명 과학을 혁신시켰다1-3. CRISPR을 사용한 유전자 파괴가 현재 일상적이지만, 단일 뉴클레오티드 편집의 정확한 설치는 다수의 질환-원인 돌연변이를 연구 또는 교정하는데 필요함에도 불구하고 주요 도전과제로 남아있다. 상동성 지정 복구 (HDR)는 이러한 편집을 달성할 수 있지만, 낮은 효율 (종종 <5%), 공여자 DNA 복구 주형에 대한 요건, 및 이중 가닥 DNA 파괴 (DSB) 형성의 유해 효과를 겪는다. 최근에, 리우(Liu) 실험실은 염기 편집을 개발하였고, 이는 DSB 없이 효율적인 단일 뉴클레오티드 편집을 달성한다. 염기 편집제 (BE)는 CIRSPR 시스템을 염기-변형 데아미나제 효소와 조합하여 표적 C
Figure pct00101
G 또는 A
Figure pct00102
T 염기 쌍을 각각 A
Figure pct00103
T 또는 G
Figure pct00104
C로 전환시킨다4-6. 전세계 연구원들에 의해 이미 널리 사용되기는 하였지만 (애드진에 의해 > 5,000개의 리우 실험실 BE 구축물이 배포됨), 현재의 BE는 12개의 가능한 염기 쌍 전환 중 단지 4개만을 가능하게 하고, 작은 삽입 또는 결실은 교정할 수 없다. 더욱이, 염기 편집의 표적화 범주는 표적 염기에 인접한 비-표적 C 또는 A 염기의 편집 ("방관자 편집")에 의해, 그리고 PAM 서열이 표적 염기로부터 15±2 bp에 존재해야 한다는 요건에 의해 제한된다. 따라서, 이들 제한을 극복하는 것은 게놈 편집의 기본 연구 및 치료 용도를 크게 확장시킬 것이다.
여기서, 염기 편집의 주요 제한을 극복하면서 그의 많은 이익-즉, 이중 가닥 파괴 및 공여자 DNA 복구 주형의 회피-을 제공하는 새로운 정밀 편집 접근법을 개발하는 것이 제안된다. 이러한 자명한 목적을 달성하기 위해, 표적-프라이밍 역전사 (TPRT)를 사용하여 표적 게놈 부위에 편집된 DNA 가닥을 직접 설치하는 것을 목표로 한다. 본원에 논의된 설계에서, CRISPR 가이드 RNA (gRNA)는 회합된 리버스 트랜스크립타제 (RT) 효소에 의해 실행될, 돌연변이유발 DNA 가닥 합성을 코딩하는 주형을 운반하도록 조작될 것이다. CRISPR 뉴클레아제 (Cas9)-닉킹된 표적 부위 DNA는 역전사를 위한 프라이머로서의 역할을 하여, 임의의 목적하는 뉴클레오티드 편집의 직접 혼입을 가능하게 할 것이다.
실험 1
돌연변이유발 DNA 가닥의 가이드 RNA-주형화된 역전사를 확립한다. 이전의 연구는 DNA 절단 후에 그러나 복합체 해리 전에, Cas9가 비-표적 DNA 가닥을 방출하여 유리 3' 말단을 노출시킨다는 것을 보여주었다. 이 DNA 가닥은 폴리머라제 효소에 의해 연장부에 접근가능하고, gRNA는 DNA 합성을 위한 주형으로서의 역할을 하도록 그의 5' 또는 3' 말단의 연장부를 통해 조작될 수 있는 것으로 가설화된다. 예비 시험관내 연구에서, Cas9:gRNA-결합된 복합체 내의 닉킹된 DNA 가닥은 주형으로서 결합된 gRNA를 사용하여 역전사를 실제로 프라이밍할 수 있다는 것이 확립되었다 (RT 효소는 트랜스로). 다음으로, 상이한 gRNA 링커, 프라이머 결합 부위, 및 편집 주형을 연구하여 시험관내에서 최적 설계 규칙을 결정할 것이다. 이어서, 트랜스로 또는 Cas9에 대한 융합체로서 작용하는 상이한 RT 효소가 시험관내에서 평가될 것이다. 마지막으로, 세포에서 효율적인 결합 및 절단 활성을 보유하는 조작된 gRNA 설계가 확인될 것이다. 이러한 목표의 성공적인 입증은 세포에서 돌연변이유발 가닥 합성을 수행하기 위한 토대를 제공할 것이다.
실험 2
인간 세포에서 프라임 편집을 확립한다. DNA 프로세싱 및 복구 메카니즘에 기초하여, 돌연변이유발 DNA 가닥 (단일 가닥 플랩)이 표적 뉴클레오티드의 특이적이고 효율적인 편집을 지시하는데 사용될 수 있는 것으로 가설화된다. 예비 연구를 장려함에 있어서, 이러한 전략에 대한 실행가능성은 돌연변이유발 플랩을 함유하는 모델 플라스미드 기질에 의한 편집을 입증함으로써 확립되었다. 실험 1과 공동으로, 돌연변이유발 플랩의 길이, 서열 조성, 표적 뉴클레오티드 정체, 및 3' 말단을 체계적으로 변화시킴으로써 복구 결과를 추가로 평가할 것이다. 작은 1 내지 3개의 뉴클레오티드 삽입 및 결실이 또한 시험될 것이다. 병행하여, 그리고 실험 1로부터 구축하여, 융합 단백질 및 비-공유 동원 전략을 포함한 Cas9-RT 아키텍처가 평가될 것이다. Cas9-RT 아키텍처 및 연장된 gRNA는 인간 게놈 내의 다중 표적 부위에서 세포 편집에 대해 검정될 것이고, 이어서 높은 효율을 위해 최적화될 것이다. 성공적인 경우에, 이 목표는 기초 과학 적용을 위한 TPRT 게놈 편집을 즉시 확립할 것이다.
실험 3
배양된 인간 세포에서 병원성 돌연변이의 부위-특이적 편집을 달성한다. 이러한 기술의 잠재적 일반성은 BE에 의해 현재 교정가능하지 않은 전환 돌연변이 및 indel의 편집을 가능하게 할 수 있다. 실험 1 및 실험 2의 결과에 따라, 베타 글로빈에서의 겸상 적혈구 질환 창시자 돌연변이 (교정을 위해 A·T에서 T·A로의 전환이 필요함) 및 ATP7B에서의 가장 보편적인 윌슨병 돌연변이 (교정을 위해 G·C에서 T·A로의 전환이 필요함)를 포함한 병원성 전환 돌연변이가 배양된 인간 세포에서 표적화될 것이다. 낭성 섬유증을 유발하는 CFTR에서의 3-뉴클레오티드 ΔF508 결실을 포함한 작은 삽입 및 결실 돌연변이의 교정을 또한 검사할 것이다. 성공적인 경우에, 이는 이들 중요한 인간 질환을 다루는 강력한 치료 접근법을 개발하는 토대를 마련할 것이다.
접근법
목적은 표적화된 게놈 부위에 점 돌연변이를 직접 설치하는 게놈 편집 전략을 개발하는 것이다. 기술 개발 단계에서, 노력은 TPRT 기능성을 CRISPR/Cas 시스템 내로 혼입시키기 위한 단백질 및 RNA 조작에 포커스를 맞출 것이다. 시험관내 검정을 사용하여 기초부터 구축되는 TPRT의 각각의 단계의 기능을 주의깊게 프로빙할 것이다 (실험 1). 제2 포커스 영역은 모델 기질 및 조작된 CRISPR/Cas 시스템의 조합을 사용하여 포유동물 세포에서의 편집 결과를 평가할 것이다 (실험 2). 마지막으로, 적용 단계는 다른 방법에 의한 게놈 편집에 난치성인 돌연변이를 교정하기 위해 기술을 사용할 것이다 (실험 3).
일반적 편집 설계가 도 1a-1b에 제시된다. Cas9 닉카제는 HNH 뉴클레아제 도메인에 대한 불활성화 돌연변이를 함유하여 (Spy Cas9 H840A 또는 N863A), DNA 절단을 PAM 함유 가닥 (비-표적 가닥)으로 제한한다. 가이드 RNA (gRNA)는 역전사를 위한 주형을 함유하도록 조작된다. gRNA의 5' 연장부가 제시되지만, 3' 연장부가 또한 구현될 수 있다. Cas9 닉카제는 C-말단 또는 N-말단을 통해 리버스 트랜스크립타제 (RT) 효소에 융합된다. gRNA:Cas9-RT 복합체는 관심 DNA 영역을 표적화하고, 비-표적 가닥을 대체한 후에 R 루프를 형성한다. Cas9는 비-표적 DNA 가닥을 닉킹한다. 닉킹된 가닥의 방출은 주형으로서 연장된 gRNA를 사용하여 역전사를 프라이밍하는데 적격인 유리 3'-OH 말단을 노출시킨다. 이러한 DNA 합성 반응은 융합된 RT 효소에 의해 수행된다. gRNA 주형은 편집을 위해 표적화된 뉴클레오티드를 제외하고는, 원래의 DNA 듀플렉스와 상동인 DNA 서열을 코딩한다. 역전사의 생성물은 목적하는 편집을 코딩하는 단일 가닥 DNA 플랩이다. 유리 3' 말단을 함유하는 이 플랩은 인접한 DNA 가닥과 평형화되어 5' 플랩 종을 생성할 수 있다. 후자의 종은 지체 가닥 DNA 합성 동안 오카자키 단편으로부터 5' 플랩을 자연적으로 절제하고, 긴-패치 염기 절제 복구 동안 발생하는 가닥 대체 합성 후에 5' 플랩을 제거하는 효소인 FEN1 (플랩 엔도뉴클레아제1)에 대한 효율적인 기질로서의 역할을 하는 것으로 가설화된다. 닉킹된 DNA의 라이게이션은 미스매치된 염기 쌍을 생성한다. 이 중간체는 원래의 염기 쌍으로의 복귀 또는 미스매치 복구 (MMR) 과정을 통한 목적하는 편집된 염기 쌍으로의 전환을 겪을 수 있다. 대안적으로, 반보존적 DNA 복제는 각각의 복귀 및 편집의 1개의 카피를 생성할 수 있다.
1. 돌연변이유발 DNA 가닥의 가이드 RNA-주형화된 역전사를 확립한다.
배경 및 근거
제안된 게놈 편집 전략에서, Cas9-닉킹된 비표적 DNA 가닥 (R-루프를 형성하는 PAM-함유 가닥)은 DNA 합성을 위한 프라이머로서 작용한다. 이는 생화학적 및 구조적 데이터의 여러 조각에 기초하여 가능한 것으로 가설화된다. 뉴클레아제 보호 실험32, 결정학적 연구33, 및 염기 편집 윈도우4,24는 Cas9-결합된 복합체의 소위 R-루프 내에서 비표적 가닥 뉴클레오티드 -20 내지 -10에 대한 큰 정도의 유연성 및 불규칙성을 입증하였다 (넘버링은 제1 PAM 뉴클레오티드로부터 5' 거리를 나타냄). 또한, 절단된 비표적 가닥의 PAM-원위 부분은 상보적 ssDNA가 트랜스로 부가될 경우 치밀하게 결합된 3원 복합체로부터 대체될 수 있다20. 이들 연구는 비표적 가닥이 고도로 유연하고, 효소에 접근가능하고, 닉킹 후에 PAM-원위 단편의 3' 말단이 Cas9 해리 전에 방출된다는 것을 지지한다. 또한, gRNA는 DNA 합성의 주형화를 위해 연장될 수 있는 것으로 가설화된다. 선행 연구는 SpCas9, SaCas9, 및 LbCas12a (이전에 Cpf1)에 대한 gRNA가 RNA 압타머34, 리간드-유도성 자기-절단 리보자임35, 및 긴 비-코딩 RNA36를 갖는 gRNA 연장부를 용인한다는 것을 제시하였다. 이 문헌은 이용될 2가지 주요 특색에 대한 선례를 확립한다. 이 전략을 평가하는데 있어서, 여러 CRISPR-Cas 시스템은 시험관내 및 세포 검정의 조합을 사용하여 5' 및 3' 연장된 gRNA 설계와 함께 평가될 것이다 (도 2a-2c).
프라임 편집을 위한 조작된 gRNA에 대한 설계는 도 3a-3b에 제시된다. DNA 합성은 5'에서 3'으로 진행되고, 따라서 RNA 주형을 3'에서 5' 방향으로 카피한다. 5' 연장부를 위한 설계는 링커 영역, 닉킹된 DNA 가닥이 어닐링되는 프라이머 결합 부위, 및 역전사에 의한 DNA 합성을 위한 주형을 함유한다. 3' 연장된 gRNA는 프라이머 결합 부위 및 역전사 주형을 함유한다. 일부 경우에, gRNA 코어의 3' RNA 헤어핀은 DNA 표적 서열과 매칭되도록 변형되는데, 이는 시험관내 실험이 역전사가 3' 연장된 gRNA 구축물의 경우에 gRNA 코어 내로 ~3개의 뉴클레오티드를 연장시킨다는 것을 보여주었기 때문이다 (헤어핀 RNA 구조를 유지하는 보상적 변화가 이루어지는 한, 헤어핀 서열의 변형은 잘 용인되는 것으로 보임). DNA 합성은 5'에서 3'으로 진행되고, 뉴클레오티드는 성장하는 DNA 가닥의 3' OH에 부가된다.
예비 결과
Cas9 닉킹된 DNA는 gRNA 주형의 역전사를 프라이밍한다. 닉킹된 비표적 DNA 가닥의 접근성을 평가하기 위해, 에스. 피오게네스로부터의 Cas9 뉴클레아제 (SpCas9) 및 Cy5 형광 표지된 듀플렉스 DNA 기질 (51개 염기 쌍)을 사용하여 시험관내 생화학적 검정을 수행하였다. 먼저, 다양한 편집 주형 길이를 갖는 5' 연장부를 함유하는 일련의 gRNA를 시험관내 전사에 의해 제조하였다 (전체 설계는 도 2b에 제시됨). 뉴클레아제 기능상실 Cas9 (dCas9)를 사용한 전기영동 이동성 변화 검정 (EMSA)은 5' 연장된 gRNA가 표적 결합 친화도를 유지한다는 것을 확립하였다 (데이터는 제시되지 않음). 다음으로, dCas9, 5'-연장된 gRNA, 및 몰로니-뮤린 백혈병 바이러스 (M-MLV) 리버스 트랜스크립타제 (슈퍼스크립트 III)를 사용하여 사전-닉킹된 Cy5-표지된 듀플렉스 DNA 기질 상에서 TPRT 활성을 시험하였다. 37℃에서 1시간 인큐베이션 후에, 변성 폴리아크릴아미드 겔 전기영동 (PAGE)에 의해 생성물을 평가하고, Cy5 형광을 사용하여 영상화하였다 (도 4a). 각각의 5'-연장된 gRNA 변이체는 유의한 생성물 형성으로 이어졌고, 관찰된 DNA 생성물 크기는 연장부 주형의 길이와 일치하였다 (도 4b). 중요한 것으로, dCas9의 부재 하에, 사전-닉킹된 기질이 DNA 기질의 전장 51-bp 길이까지 연장되었으며, 이는 gRNA가 아닌 상보적 DNA 가닥이 dCas9가 존재하지 않는 경우에 DNA 합성을 위한 주형으로서 사용되었음을 강하게 시사한다 (도 4c). 시스템은 새로 합성된 DNA 가닥이 표적 부위 편집에 요구될 생성물 (단일 뉴클레오티드 변화를 갖는 상동 가닥)을 반영하도록 설계되었음에 주목한다. 이 결과는 Cas9:gRNA 결합이 닉킹된 비표적 가닥의 3' 단부를 노출시키고, 비표적 가닥이 역전사에 접근가능하다는 것을 확립한다.
다음으로, 비표적 DNA 가닥을 닉킹하는 Cas9(H840A) 돌연변이체를 사용하여 비닉킹된 dsDNA 기질을 평가하였다. 먼저, 5'-연장된 gRNA와 함께 Cas9(H840A) 닉카제 활성을 시험하기 위해, 이전에 기재된 바와 같이 시험관내 절단 검정을 수행하였다37. 닉킹은 표준 gRNA와 비교하여 손상되었지만, 상당한 절단 생성물이 형성되었다 (도 4d). 중요한 것으로, 5'-연장된 gRNA 및 Cas9(H840A)를 이용하여 TPRT 반응을 수행한 경우에도, 아마도 감소된 닉킹 활성에 의해 설명될 비록 보다 낮은 수율이기는 하지만, RT 생성물이 관찰되었다 (도 4d). 이 결과는 5'-연장된 gRNA:Cas9(H840A) 복합체가 DNA를 닉킹하고 역전사의 주형이 될 수 있다는 것을 확립한다.
마지막으로, 3' gRNA 연장부를 Cas9(H840A) 닉킹 및 TPRT에 대해 평가하였다. 5'-연장된 gRNA와 비교하여, 3'-연장된 gRNA에 의한 DNA 절단은 표준 gRNA와 비교하여 어떠한 검출가능한 정도로 손상되지 않았다. 유의하게, 3'-연장된 gRNA 주형은 또한 M-MLV RT가 트랜스로 공급된 경우에 사전-닉킹된 것 및 무손상 듀플렉스 DNA 기질 둘 다에 의한 효율적인 역전사를 지지하였다 (도 4e). 놀랍게도, 3'-연장된 주형에 대해 단일 생성물만이 관찰되었으며, 이는 역전사가 gRNA 스캐폴드를 따라 특정 위치에서 종결된다는 것을 나타낸다. 말단 트랜스퍼라제에 의한 생성물의 단독중합체 테일링에 이은 클레나우 연장 및 생어 서열분석은 전장 gRNA 편집 주형이 gRNA 코어의 말단 3개 뉴클레오티드에 더하여 카피되었음을 밝혀내었다. 향후, 플랩 말단은 말단 gRNA 서열을 변형시키는 것에 의해 재프로그램화될 것이다38,39. 이러한 결과는 3'-연장된 gRNA가 효율적인 뉴클레아제 표적화 가이드로서의 역할을 할 수 있고, 역전사의 주형이 될 수 있다는 것을 입증한다.
Cas9-TPRT는 닉킹된 DNA 및 gRNA를 시스로 사용한다. 이중 색상 실험을 사용하여 RT 반응이 gRNA와 시스로 (동일한 복합체에서 결합됨) 우선적으로 발생하는지 결정하였다 (도 8 참조). 5'-연장된 gRNA 및 3'-연장된 gRNA에 대해 2개의 별개의 실험을 수행하였다. 주어진 실험을 위해, dCas9, gRNA, 및 DNA 기질의 3원 복합체를 별개의 튜브에서 형성하였다. 하나의 튜브에서, gRNA는 긴 RT 생성물을 코딩하고, DNA 기질은 Cy3 (적색)으로 표지되고; 다른 튜브에서, gRNA는 짧은 RT 생성물을 코딩하고, DNA 기질은 Cy5 (청색)로 표지된다. 짧은 인큐베이션 후에, 복합체를 혼합한 다음, RT 효소 및 dNTP로 처리하였다. 생성물을 우레아-변성 PAGE에 의해 분리하고, Cy3 및 Cy5 채널에서 형광에 의해 가시화하였다. 반응 생성물은 DNA 기질과 사전-복합체화된 gRNA 주형을 사용하여 우선적으로 형성되는 것으로 확인되었고, 이는 RT 반응이 시스로 발생할 가능성이 있음을 나타낸다. 이러한 결과는 단일 Cas9:gRNA 복합체가 DNA 부위를 표적화하고, 돌연변이유발 DNA 가닥의 역전사의 주형이 될 수 있음을 지지한다.
(viii) 다른 Cas 시스템을 사용한 TPRT 시험
에스. 아우레우스로부터의 Cas9 및 엘. 박테리움(L. bacterium)으로부터의 Cas12a를 포함한 다른 Cas 시스템을 사용하여 이전 섹션에 제시된 것과 유사한 실험을 수행할 것이다 (도 2a-2c 참조). TRPT가 또한 이들 Cas 변이체에 대해 입증될 수 있는 경우에, 세포에서의 잠재적 편집 범주 및 전반적 성공 가능성은 증가할 것이다.
(ix) RT-Cas9 융합 단백질을 사용한 TPRT 시험
일련의 상업적으로 입수가능하거나 정제가능한 RT 효소는 먼저 TPRT 활성에 대해 트랜스로 평가될 것이다. M-MLV로부터의 이미 시험된 RT에 더하여, 조류 골수모구증 바이러스 (AMV), 게오바실루스 스테아로써모필루스 군 II 인트론 (GsI-IIC)41,42, 및 유박테리움 렉탈레 군 II 인트론 (Eu.re.I2)43,44으로부터의 RT가 평가될 것이다. 유의하게, 후자의 2개의 RT는 그의 천연 생물학적 상황에서 TPRT를 수행한다. 관련된 경우에, RNAse 불활성화 돌연변이 및 다른 잠재적으로 유익한 RT 효소 변형이 시험될 것이다. 기능적 RT가 트랜스로 공급된 경우에 확인되면, 각각은 Cas9 변이체에 대한 융합 단백질로서 평가될 것이다. N-말단 및 C-말단 융합 배향 둘 다가 다양한 링커 길이 및 아키텍처와 함께 시험될 것이다. RT 효소를 시스로 사용하여 TPRT가 발생할 수 있는지를 동역학적 시간 경과 실험을 사용하여 결정할 것이다. 효율적인 TPRT 화학을 가능하게 하는 RT-Cas9 융합 아키텍처가 구축될 수 있는 경우에, 이는 세포와 관련하여 기능적 편집의 가능성을 크게 증가시킬 것이다.
(x) 세포에서 조작된 gRNA를 사용한 Cas9 표적화
이전의 하위-목표에서 개발된 후보 조작된 gRNA를 인간 세포 배양 실험 (HEK293)에서 평가하여 Cas9 표적화 효율을 확인할 것이다. 야생형 SpCas9를 사용하는 확립된 indel 형성 검정을 사용하여45, 조작된 gRNA를 인간 게놈 내의 5개 이상의 부위에 걸쳐 표준 gRNA와 나란히 비교할 것이다. 게놈 편집 효율은 실험실에 수용된 일루미나 MiSeq 플랫폼을 사용하여 멀티플렉스에서의 앰플리콘 서열분석에 의해 특징화될 것이다. 본 섹션 및 선행 섹션으로부터의 결과는 설계-구축-시험 주기의 후속 반복에 대한 정보를 제공하는 통찰을 생성할 것으로 예상되며, 여기서 gRNA는 세포에서 역전사의 주형이 되는 것 및 효율적인 Cas9 표적화 둘 다에 대해 최적화될 수 있다.
시험관내 검증의 결과를 도 5-7에 제시한다. 시험관내 실험은 닉킹된 비-표적 DNA 가닥이 유연하고, DNA 합성을 프라이밍하는데 이용가능하며, gRNA 연장부가 역전사를 위한 주형으로서의 역할을 할 수 있음을 입증하였다 (도 5 참조). 이 실험 세트는 다양한 길이의 편집 주형 (좌측에 열거됨)을 갖는 5'-연장된 gRNA (도 3a-3b에 제시된 바와 같이 설계됨)를 사용하였다. 형광 표지된 (Cy5) DNA 표적을 기질로서 사용하였고, 이 실험 세트에서 사전-닉킹하였다. 이들 실험에 사용된 Cas9는 촉매 기능상실 Cas9 (dCas9)이므로, DNA를 절단할 수 없지만, 여전히 효율적으로 결합할 수 있다. 몰로니-뮤린 백혈병 바이러스 (M-MLV)로부터 유래된 상업적 RT인 슈퍼스크립트 III은 트랜스로 공급되었다. 먼저, 정제된 성분으로부터 dCas9:gRNA 복합체를 형성하였다. 이어서, 형광 표지된 DNA 기질을 dNTP 및 RT 효소와 함께 첨가하였다. 37℃에서 1시간 인큐베이션 후에, 변성 우레아-폴리아크릴아미드 겔 전기영동 (PAGE)에 의해 반응 생성물을 분석하였다. 겔 영상은 역전사 주형의 길이와 일치하는 길이까지의 원래의 DNA 가닥의 연장을 보여준다. dCas9의 부재 하에 수행된 반응은 사용된 gRNA와 상관없이 길이 51개 뉴클레오티드의 DNA 생성물을 생산하였음에 주목한다. 이 생성물은 RNA가 아닌 DNA 합성을 위한 주형으로서의 상보적 DNA 가닥의 사용에 상응한다 (데이터는 제시되지 않음). 따라서, Cas9 결합은 DNA 합성을 RNA 주형으로 지시하는데 요구된다. 이러한 세트의 시험관내 실험은, DNA 기질이 사전-닉킹되지 않고 Cas9 닉카제 (SpyCas9 H840A 돌연변이체)가 사용된 것을 제외하고, 도 5에 제시된 것과 밀접하게 대응한다. 겔에 제시된 바와 같이, 닉카제는 표준 gRNA가 사용된 경우에 (gRNA_0, 레인 3) DNA 가닥을 효율적으로 절단한다. 다중 절단 생성물이 관찰되며, 이는 SpyCas9의 이전의 생화학적 연구와 일치한다. 5' 연장부는 닉킹 활성을 손상시키지만 (레인 4-8), 일부 RT 생성물은 여전히 관찰된다. 도 7은 3' 연장부가 DNA 합성을 지지하고 Cas9 닉카제 활성에 유의하게 영향을 미치지 않는다는 것을 보여준다. 사전-닉킹된 기질 (흑색 화살표)은 dCas9 또는 Cas9 닉카제가 사용된 경우 RT 생성물로 거의 정량적으로 전환된다 (레인 4 및 5). RT 생성물 (적색 화살표)로의 50% 초과의 전환이 전장 기질에 의해 관찰된다 (레인 3). RT 생성물의 길이 및 서열을 결정하기 위해, 겔로부터 생성물 밴드를 절제하고, 추출하고, 서열분석하였다. 이는 RT가 gRNA 코어의 3' 말단 헤어핀 내로 3개의 뉴클레오티드를 연장시켰음을 밝혀내었다. 후속 실험은 헤어핀 RNA 구조를 유지하는 상보적 변화가 이루어지는 한, 이들 3개의 뉴클레오티드는 표적 DNA 서열과 매칭되도록 변화될 수 있다는 것을 입증하였다.
(xi) 잠재적 어려움 및 대안
(1) RT는 융합체로서 기능하지 않는다: 분자 밀집 및/또는 불리한 기하구조는 Cas9-융합된 RT 효소에 의한 폴리머라제 연장을 방해할 수 있다. 먼저, 링커 최적화를 시험할 수 있다. DNA 프라이머, gRNA, 및 RT 효소 사이의 공간적 관계를 재배향시킬 수 있는 Cas9의 원형 순열 변이체를 평가할 것이다. 실험 2에 상술된 바와 같은 비-공유 RT 동원 전략을 시험할 수 있다. (2) 연장된 gRNA 변이체에 의한 감소된 Cas 표적화 효율: 이는 5'-연장된 gRNA에 대한 이슈일 가능성이 가장 크다. 구조적 데이터에 기초하여24, Cas9 돌연변이체를 설계하고 스크리닝하여 gRNA 연장부를 보다 크게 용인하는 변이체를 확인할 수 있다. 또한, gRNA 라이브러리는 표적화 활성을 개선시키는 링커에 대해 세포에서 스크리닝될 수 있다.
유의성
이들 예비 결과는 Cas9 닉카제 및 연장된 gRNA가 트랜스로 공급된 리버스 트랜스크립타제를 사용하여 결합된 DNA 표적 상에서 표적-프라이밍된 역전사를 개시할 수 있다는 것을 확립한다. 중요한 것으로, Cas9 결합은 생성물 형성에 결정적으로 중요한 것으로 밝혀졌다. 아마도 세포에서의 게놈 편집을 위한 절대 요건은 아니지만, RT 효소 기능을 시스로 혼입시키는 시스템의 추가의 개발은 세포-기반 적용에서 성공 가능성을 유의하게 증가시킬 것이다. 이러한 목표의 나머지 측면의 달성은 인간 게놈과 관련하여 정밀 게놈 편집을 수행하기 위한 분자적 토대를 제공할 것이다.
2. 인간 세포에서 프라임 편집을 확립한다.
배경 및 근거
제안된 전략에서, 조작된 RT-Cas9:gRNA 복합체는 게놈 표적 부위에 돌연변이유발 3' DNA 플랩을 도입할 것이다. 단일 미스매치를 함유하는 돌연변이유발 3' 플랩은 우선적으로 제거될 인접한 5' 플랩과의 에너지적으로 접근가능한 평형을 통해 DNA 복구 기구에 의해 혼입될 것으로 가설화된다 (도 1b). DNA 복제 및 복구 기구는 오카자키 단편을 프로세싱할 때46 및 긴-패치 염기 절제 복구 (LP-BER) 동안47 5' ssDNA 플랩과 마주친다. 5' 플랩은 동종삼량체 슬라이딩 클램프 복합체 PCNA에 의해 DNA 복구 부위로 동원되는, 광범위하게 발현되는 플랩 엔도뉴클레아제 FEN1에 대한 바람직한 기질이다48. PCNA는 또한 DNA 리가제 Lig1을 포함한 다른 복구 인자의 동시 동원을 위한 스캐폴드로서의 역할을 한다49. '툴벨트'로서 작용하여, PCNA는 모든 세포 분열 동안 생성된 수백만개의 오카자키 단편을 프로세싱하는데 필수적인 연속 플랩 절단 및 라이게이션을 가속화한다50,51. 이들 천연 DNA 중간체에 대한 유사성에 기초하여, 돌연변이유발 가닥은 5' 플랩과의 평형을 통해 혼입된 다음, 배위된 5' 플랩 절제 및 라이게이션이 이어질 것으로 가설화된다. 이어서, 미스매치 복구 (MMR)가 어느 하나의 가닥 상에서 동등한 확률로 발생하여, 편집 또는 복귀로 이어질 것이다 (도 1b). 대안적으로, DNA 복제가 먼저 일어날 수 있고, 새롭게 합성된 딸 가닥에서의 편집의 혼입으로 직접 이어질 수 있다. 이 과정으로부터의 최고 예상 수율은 50%이지만, 다중 기질 편집 시도는 편집 복구의 비가역성으로 인해 반응을 완료쪽으로 구동할 수 있다.
예비 결과
DNA 플랩은 효모 및 HEK 세포에서 플라스미드 모델 기질에서 부위-특이적 돌연변이유발을 유도한다. 제안된 편집 전략을 시험하기 위해, TPRT의 생성물과 유사한 돌연변이유발 3' 플랩을 함유하는 모델 플라스미드 기질을 사용하여 연구를 개시하였다. GFP와 mCherry 사이의 정지 코돈을 코딩하는 이중 형광 단백질 리포터를 생성하였다. 돌연변이유발 플랩은 정지 코돈에 대한 교정을 코딩하여 (도 9a), mCherry 합성을 가능하게 한다. 따라서, 돌연변이유발 효율은 GFP:mCherry 비에 의해 정량화될 수 있다. 플라스미드 기질을 시험관내에서 제조하고, 효모 (에스. 세레비지아에) 또는 인간 세포 (HEK293) 내로 도입하였다. 둘 다의 시스템에서 높은 빈도의 돌연변이유발이 관찰되었고 (도 9b), 단리된 효모 콜로니는 복귀된 염기, 돌연변이된 염기, 또는 둘 다의 생성물의 혼합물을 함유하였다 (도 9c). 후자의 검출은 이들 경우에 플라스미드 복제가 MMR 전에 일어났음을 시사하고, 추가로 플랩 절제 및 라이게이션이 MMR에 선행함을 시사한다. 이 결과는 3' 돌연변이유발 가닥을 사용한 DNA 편집의 실행가능성을 확립한다.
(i) 모델 플랩 기질을 이용한 체계적인 연구
상기 기재된 예비 결과에 기초하여, 효율적인 편집의 원리를 추론하기 위해 보다 넓은 스펙트럼의 플랩 기질이 HEK 세포에서 평가될 것이다. 3' ssDNA 플랩은 미스매치 쌍 형성의 영향, 플랩을 따른 돌연변이유발 뉴클레오티드의 위치, 및 말단 뉴클레오티드의 정체를 결정하기 위해 체계적으로 달라질 것이다 (도 9d). 단일 뉴클레오티드 삽입 및 결실이 또한 시험될 것이다. 앰플리콘 서열분석은 편집 정밀도를 분석하기 위해 사용될 것이다. 이들 결과는 gRNA 역전사 주형의 설계에 대한 정보를 제공하는 것을 도울 것이다.
플라스미드 기질 상의 시험관내 TPRT는 효율적인 편집 결과로 이어진다. 실험 1에서 개발된 TPRT 반응을 사용하여 플라스미드 기질 내에서 돌연변이유발을 유도하였다. 반응을 원형 DNA 플라스미드 기질 상에서 수행하였다 (도 10 참조). 이는 이전의 시험관내 실험에서 RT 연장을 위한 메카니즘으로서 DNA 가닥 해리의 가능성을 배제한다. 이는 또한 세포에서 플랩 기질의 DNA 복구의 시험을 가능하게 하였다. 효모 (에스. 세레비지아에) 발현을 위해 이중-형광 리포터 플라스미드를 구축하였다. 이 플라스미드는 개재 정지 코돈 (TGA)을 갖는 GFP (녹색 형광 단백질) 및 mCherry (적색 형광 단백질)를 코딩한다. 효모에서의 이러한 구축물의 발현은 GFP만을 생산한다. 플라스미드를 시험관내 TRT [Cas9(H840A) 닉카제, 조작된 gRNA, MLV RT 효소, dNTPS]에 대한 기질로서 사용하였다. gRNA 연장부는 정지 코돈에 대한 돌연변이를 코딩한다. 플랩 가닥은 정지 코돈의 복구에 사용되고, 융합 단백질로서 GFP 및 mCherry 둘 다를 발현하는 플라스미드를 생산할 것으로 예상된다. 효모 이중-FP 플라스미드 형질전환체를 도 10에 제시한다. 모 플라스미드 또는 시험관내 Cas9(H840A) 닉킹된 플라스미드의 형질전환은 녹색 GFP 발현 콜로니만을 생성한다. 5'-연장된 또는 3'-연장된 gRNA와의 TRT 반응은 녹색 및 황색 콜로니의 혼합물을 생산한다. 후자는 GFP 및 mCherry 둘 다를 발현한다. 보다 많은 황색 콜로니가 3'-연장된 gRNA에 의해 관찰된다. 정지 코돈을 함유하지 않는 양성 대조군이 또한 제시된다.
이 결과는 긴 이중 가닥 기질이 TPRT를 겪을 수 있고, TPRT 생성물이 진핵 세포에서 편집을 유도한다는 것을 확립한다.
상기 프라임 편집 실험과 유사한 또 다른 실험을 수행하였지만, 정지 코돈에 점 돌연변이를 설치하는 대신, 프라임 편집은 프레임시프트 돌연변이를 복구하고 하류 mCherry의 합성을 가능하게 하는 단일 뉴클레오티드 삽입 (좌측) 또는 결실 (우측)을 설치한다 (도 11 참조). 둘 다의 실험은 3' 연장된 gRNA를 사용하였다. TRT 형질전환으로부터의 개별 콜로니를 선택하고, 생어 서열분석에 의해 분석하였다 (도 12 참조). 녹색 콜로니는 원래의 DNA 서열을 갖는 플라스미드를 함유한 반면, 황색 콜로니는 프라임 편집 gRNA에 의해 설계된 정확한 돌연변이를 함유하였다. 다른 점 돌연변이 또는 indel은 관찰되지 않았다.
(ii) RT-Cas9 아키텍처를 사용한 HEK 세포에서의 프라임 편집의 확립
이전의 목표로부터 최적화된 구축물은 인간 게놈 내의 표적화된 부위에서 포유동물 발현 및 편집을 위해 적합화될 것이다. 2차 gRNA (닉킹을 방지하기 위해 말단절단됨)로의 인접한 표적화에 더하여, 다중 RT 효소 및 융합 아키텍처가 시험될 것이다. 비-공유 RT 동원이 또한 선-태그 시스템52 및 MS2 압타머 시스템53을 사용하여 평가될 것이다. 표준 gRNA 및 RT-Cas9 융합체 (상기와 같음)를 사용한 표적화 효율을 평가하기 위해 Indel 형성 검정이 사용될 것이다. 이어서, 각각의 게놈 부위에 대해, 연장된 gRNA 및 RT-Cas9 쌍을 단일 뉴클레오티드 편집에 대해 검정할 것이다. 편집 결과는 MiSeq로 평가될 것이다.
HEK 세포에서의 초기 실험을 Cas9-RT 융합체를 사용하여 수행하였다. 세포 내에서 발현된 성분에 의한 편집은 Cas9(H840A) 닉카제, 리버스 트랜스크립타제 (융합체로서 발현되거나 또는 트랜스로 공급됨), 및 3' 연장부를 갖는 조작된 gRNA를 필요로 한다 (도 14 참조). 예비 연구는 gRNA 연장부 내의 프라이머 결합 부위의 길이가 인간 세포에서 편집 효율을 증가시키는데 중요함을 나타내었다. (도 15 참조).
(iii) HEK 세포에서의 프라임 편집 파라미터의 최적화
세포에서 프라임 편집을 수행할 수 있는 Cas9-RT 아키텍처를 확인한 후에, 고효율 편집을 달성하도록 성분 및 설계가 최적화될 것이다. 코딩된 점 돌연변이의 위치 및 뉴클레오티드 정체, 및 새로 합성된 DNA 가닥의 총 길이는 편집 범주 및 잠재적 제한을 평가하기 위해 달라질 것이다. 짧은 삽입 및 결실 돌연변이가 또한 평가될 것이다. 단백질 발현 구축물은 코돈 최적화될 것이다. 성공적인 경우에, 이는 포유동물 세포에서의 효율적인 프라임 편집을 확립할 것이다.
예비 결과. 융합된 RT 효소에 의한 분자내 역전사가 가능하지 않은 경우에, 편집 유전자좌에서 RT 효소를 보다 높은 국부 농도로 만들기 위해 추가의 gRNA를 설계하였다. 이들 보조 가이드는 5' 단부 (14-15 nt 스페이서)에서 말단절단되며, 이는 이전에 Cas9 절단을 방지하지만 결합은 보유하는 것으로 제시된 바 있다 (도 16 참조). HEK3 유전자좌를 선택하여 이 전략을 연구하였다.
(iv) 잠재적 어려움 및 대안
1) 세포에서의 gRNA 분해: 연장된 gRNA 말단이 세포에서 말단절단된 경우에, 안정화 2차 구조가 설치될 수 있거나, 또는 안정화 변형을 갖는 합성 gRNA가 시험될 수 있다. (2) 인간 세포에서 관찰된 편집 없음: 인접한 게놈 부위에 대한 RT-Cas9 융합체의 2차 표적화를 포함한 추가의 전략이 연구될 것이다54. 또한, 이. 콜라이 또는 에스. 세레비지아에에서 잠재적 방향적 진화 전략이 연구될 수 있다.
유의성
프라임 편집이 실험 세포주에서 확립될 수 있다면, 이는 인간 유전자에서 다수의 점 돌연변이의 신속한 생성 및 특징화를 가능하게 함으로써 기초 생의학 연구에 즉각적인 영향을 미칠 것이다. 방법의 일반성, 및 염기 편집제에 관한 그의 직교 편집 윈도우는 많은 현재의 접근불가능한 돌연변이를 설치하기 위한 접근법을 제공할 것이다. 더욱이, 프라임 편집이 높은 효율 및 생성물 순도를 위해 최적화될 수 있다면, 다른 인간 세포 유형에서 질환 돌연변이를 교정하는 그의 잠재적 적용가능성은 유의할 것이다.
3. 배양된 인간 세포에서 병원성 돌연변이의 부위-특이적 편집을 달성한다.
배경 및 근거.
다수의 병원성 돌연변이는 PAM 제한, 또는 전환 또는 indel 돌연변이 교정에 대한 필요로 인해 현재의 염기 편집제에 의해 교정될 수 없다. 프라임 편집에 의하면, 모든 전이 및 전환은 작은 삽입 및 결실일 수 있기 때문에 이론적으로 가능하다. 더욱이, PAM과 관련하여, 프라임 편집 윈도우 (예상 -3 내지 +4)는 염기 편집제의 것 (-18 내지 -12)과 구별된다 (도 13). 염기 편집제에 의해 현재 교정가능하지 않은 멘델 상태는 (1) 헤모글로빈 베타에서의 겸상 적혈구 질환 Glu6Val 창시자 돌연변이 (A·T에서 T·A로의 전환을 필요로 함); (2) ATP7B에서의 가장 흔한 윌슨병 변이체 His1069Gln (G·C에서 T·A로의 전환을 필요로 함); 및 (3) 낭성 섬유증을 유발하는 CFTR에서의 ΔPhe508 돌연변이 (3-뉴클레오티드 삽입을 필요로 함)를 포함한다. 이들 표적 각각은 SpCas9 표적화 및 프라임 편집을 위해 적절하게 위치한 PAM을 함유한다.
예비 결과.
(i) HEK3 세포에서의 T에서 A로의 편집은 현행 염기 편집에 의해 달성가능하지 않지만, TRPT 편집에 의해서는 달성가능하다 (도 17a-17c 참조).
도 17a는 인간 배아 신장 (HEK) 세포에서의 성분의 형질감염 후 표적 뉴클레오티드에서의 % T에서 A로의 전환을 나타내는 그래프를 보여준다. 이 데이터는 Cas9(H840A) 닉카제 (32-아미노산 링커)에 대한 야생형 MLV 리버스 트랜스크립타제의 N-말단 융합을 사용한 결과를 제시한다. 편집 효율은 프라이머 결합 부위의 길이가 7개 뉴클레오티드에서 11 또는 12개 뉴클레오티드로 연장된 경우에 현저하게 개선되었다. 추가적으로, 편집 유전자좌의 바로 상류에 위치하는 보조 가이드 A (도 16 참조)는, 특히 보다 짧은 길이의 프라이머 결합 부위에 대해 편집 활성을 유의하게 개선시킨다. 편집 효율을 일루미나 MiSeq 플랫폼을 사용하여 앰플리콘 서열분석에 의해 정량화하였다. 도 17b도 또한 인간 배아 신장 (HEK) 세포에서의 성분의 형질감염 후 표적 뉴클레오티드에서의 % T에서 A로의 전환을 보여주지만, 이 데이터는 RT 효소의 C-말단 융합을 사용한 결과를 제시한다. 여기서, 보조 가이드 A는 그만큼의 효과를 갖지 않고, 편집 효율이 전체적으로 더 높다. 도 17c는 도 17a에서 사용된 것과 유사한 Cas9(H840A) 닉카제에 대한 야생형 MLV 리버스 트랜스크립타제의 N-말단 융합을 사용한 결과를 제시하는 데이터를 보여주지만; MLV RT와 Cas9 사이의 링커는 32개 아미노산 대신 60개 아미노산 길이이다.
(ii) TRPT 편집 결과에 의한 HEK3 부위에서의 T에서 A로의 편집은 높은 순도를 나타낸다.
도 18은 고처리량 앰플리콘 서열분석에 의한 서열 분석의 산출을 보여준다. 산출은 편집된 세포의 가장 풍부한 유전자형을 나타낸다. 어떠한 주요 indel 생성물도 수득되지 않고, 목적하는 점 돌연변이 (T에서 A로)는 방관자 편집 없이 깔끔하게 설치됨에 주목한다. 제1 서열은 참조 유전자형을 보여준다. 상단의 2개의 생성물은 내인성 다형성 (G 또는 A)을 함유하는 출발 유전자형이다. 하단의 2개의 생성물은 정확하게 편집된 유전자형을 나타낸다.
(iii) MLV RT 돌연변이체는 편집을 개선시킨다.
문헌 [Baranauskas, et al., (doi:10.1093/protein/gzs034)]에 기재된 돌연변이체 리버스 트랜스크립타제를 인간 배아 신장 (HEK) 세포에서 표적 뉴클레오티드 편집을 위한 Cas9(H840A) 닉카제에 대한 c-말단 융합체로서 시험하였다. Cas9-RT 편집제 플라스미드를 역전사의 주형이 되는 3'-프라임 편집제 가이드 RNA를 코딩하는 플라스미드와 함께 공동-형질감염시켰다. 표적 뉴클레오티드에서의 편집 효율 (청색 막대)을 도 19에서 indel 비율 (오렌지색 막대)과 함께 제시한다. WT는 야생형 MLV RT 효소를 지칭한다. 돌연변이체 효소 (M1 내지 M4)는 우측에 열거된 돌연변이를 함유한다. 편집 속도를 게놈 DNA 앰플리콘의 고처리량 서열분석에 의해 정량화하였다.
(iv) 제2 gRNA에 의한 상보적 가닥 닉킹은 편집을 개선시킨다.
이 실험은 단일 가닥 닉이 표적 뉴클레오티드에 근접한 상보적 DNA 가닥에 도입되는 경우의 표적 뉴클레오티드의 편집 효율을 평가하며, 이는 미스매치 복구를 지시하여 원래의 뉴클레오티드를 우선적으로 제거하고 염기 쌍을 목적하는 편집으로 전환시킬 것으로 가설화된다. Cas9(H840A)-RT 편집 구축물을 2개의 가이드 RNA 코딩 플라스미드와 함께 공동-형질감염시켰고, 그 중 하나는 역전사 반응의 주형이 되고, 다른 것은 닉킹을 위한 상보적 DNA 가닥을 표적화한다. 표적 뉴클레오티드로부터 다양한 거리에서 닉킹을 시험하였다 (오렌지색 삼각형) (도 20 참조). 표적 염기 쌍 (청색 막대)에서의 편집 효율은 indel 형성 속도 (오렌지색 막대)와 함께 제시된다. "부재" 예는 상보적 가닥 닉킹 가이드 RNA를 함유하지 않는다. 편집 속도를 게놈 DNA 앰플리콘의 고처리량 서열분석에 의해 정량화하였다.
도 21은 목적하는 T에서 A로의 전환 돌연변이 및 다른 주요 게놈 편집 부산물의 일반적 부재를 보여주는 프로세싱된 고처리량 서열분석 데이터를 보여준다.
범주. 새로운 편집 기술에 대한 잠재적 범주를 도 13에 제시하며, 이를 데아미나제-매개된 염기 편집제 기술과 비교한다. 이전에 개발된 염기 편집제는 PAM의 ~15 ± 2 bp 상류 영역을 표적화한다. 표적 C 또는 A 뉴클레오티드를 각각 T 또는 G로 전환시킴으로써, 이전에 개발된 염기 편집제는 모든 전이 돌연변이 (A:T에서 G:C로의 전환)를 가능하게 한다. 그러나, 이전에 개발된 염기 편집제는 전환 돌연변이 (A에서 T로, A에서 C로, G에서 T로, G에서 C로, T에서 A로, T에서 G로, C에서 A로, C에서 G로)를 설치할 수 없다. 더욱이, 편집 윈도우에 다중 표적 뉴클레오티드가 존재하는 경우에, 추가의 바람직하지 않은 편집이 발생할 수 있다.
새로운 프라임 편집 기술은 이론적으로 임의의 뉴클레오티드 및 염기 쌍 전환, 및 또한 잠재적으로 작은 삽입 및 결실 편집을 설치할 수 있다. PAM과 관련하여, 프라임 편집 윈도우는 DNA 닉킹 부위 (PAM의 3개 염기 상류)에서 시작하고, PAM의 아직 결정되지 않은 위치 하류에서 끝난다. 이러한 편집 윈도우는 데아미나제 염기 편집제의 편집 윈도우와 구별됨에 주목한다. TPRT 시스템은 DNA 폴리머라제 효소를 사용하여 편집을 수행하기 때문에, 이는 잠재적으로 일반성, 정밀도, 및 충실도를 포함한 모든 그의 이익을 갖는다.
(v) 환자-유래 세포주에서 병원성 돌연변이를 교정한다.
관련 돌연변이를 보유하는 세포주 (겸상 적혈구 질환: CD34+ 조혈 줄기 세포; 윌슨병: 배양된 섬유모세포; 낭성 섬유증: 배양된 기관지 상피)는 ATCC, 코리엘 바이오뱅크(Coriell Biobank), 또는 협력 하버드/브로드(Harvard/Broad) 제휴 실험실로부터 입수할 것이다. 편집 효율은 고처리량 서열분석에 의해 평가될 것이고, 교정된 유전자형의 효능은 표현형 검정 (헤모글로빈 HPLC, ATP7B 면역염색, 및 CFTR 막 전위 검정)을 사용하여 시험될 것이다.
(vi) 오프-타겟 편집 활성을 특징화한다.
잠재적 오프-타겟 편집은 야생형 Cas9와 쌍형성된 표적 gRNA를 사용하여 확립된 방법, 예컨대 가이드-seq(GUIDE-seq)55 및 서클-seq(CIRCLE-seq)56에 의해 스크리닝될 것이다. 잠재적 오프-타겟이 확인되는 경우에, 이들 유전자좌는 진정한 오프-타겟 편집 사건을 확인하기 위해 TPRT 편집된 세포에서 프로빙될 것이다.
(vii) 잠재적 어려움 및 대안.
(1) 낮은 편집 효율: 프라임 편집제는 각각의 표적에 대한 최적화를 필요로 할 수 있다. 이러한 경우에, gRNA 라이브러리는 특정한 적용을 위한 가장 높은 기능적 변이체를 확인하기 위해 시험될 수 있다. RT-Cas 융합체 발현 및 핵 국재화가 최적화될 수 있다. 리포솜 RNP 전달은 오프-타겟 편집을 제한하는데 사용될 수 있다.
(viii) 앞으로의 실험.
gRNA 설계의 최적화는 프라이머 결합 부위 길이 및 편집 주형의 연장의 추가의 연구에 의해 달성될 수 있다. 시험 범주 및 일반성은 상이한 뉴클레오티드 전환, 작은 삽입 및 결실, 뿐만 아니라 PAM에 관한 상이한 편집 위치, 및 인간 게놈 내의 다중 부위를 포함할 것이다. RT 성분의 최적화는 활성을 증진시키기 위한 MLV RT에서의 돌연변이 (Rnase H 불활성화, 프라이머-주형 결합 친화도 증가, 프로세싱성에 대한 조정), 및 새로운 RT 효소 (군 II 인트로 RT, 다른 레트로바이러스 RT)를 연구하는 것을 포함할 것이다.
유의성.
수많은 유전 장애는 개별 유전자에서의 단일 뉴클레오티드 변화로부터 발생한다. 본원에 기재된 게놈 편집 기술을 개발하고, 이를 질환-관련 세포 유형에 적용하는 것은 임상으로의 번역을 위한 토대를 확립할 것이다. 일부 질환, 예컨대 겸상 적혈구 질환의 경우, 단일 점 돌연변이는 집단 전반에 걸쳐 우성 유전자형을 나타낸다. 그러나, 많은 다른 유전 장애의 경우, 단일 유전자 내의 상이한 점 돌연변이의 큰 이질성이 환자 집단 전반에 걸쳐 관찰되고, 이들 각각은 유사한 질환 표현형을 발생시킨다. 따라서, 이론상 다수의 이러한 돌연변이를 표적화할 수 있는 일반적 게놈 편집 방법으로서, 본 기술은 많은 이들 환자 및 그의 가족에게 막대한 잠재적 이익을 제공할 수 있다. 이들 적용에 대한 원리의 증명이 세포에서 확립될 수 있다면, 이는 질환의 동물 모델에서의 연구에 대한 기반을 확립할 것이다.
이점
정밀도: 목적하는 편집은 핵산 서열에서 코딩되고 지시된다. 일반성: 이론상, 전환 편집 뿐만 아니라 작은 삽입 또는 결실을 포함한 임의의 염기 쌍 전환을 만드는 것이 가능할 수 있다. Cas9 프로토스페이서 인접 모티프 (PAM) 서열과 관련하여 염기 편집제의 것과 별개의 편집 윈도우가 존재한다. 이 방법은 상동성-지정 복구 (HDR)의 편집 능력 중 많은 것을 달성하지만, HDR의 주요 제한 (대부분의 세포 유형에서 비효율적이고, 통상적으로 과량의 바람직하지 않은 부산물 예컨대 indel을 동반함)은 받지 않는다. 또한, 이는 이중 가닥 DNA 파괴 (DSB)를 일으키지 않고, 따라서 indel, 전위, 큰 결실, p53 활성화 등을 거의 일으키지 않는다.
실시예 2. 치료 프라임 편집제 가이드 RNA (PEgRNA)의 설계 방법 및 프라임 편집을 사용하여 병원성 인간 유전자 변이체를 교정하기 위한 잠재적 표적 및 PEgRNA
도입
프라임 편집은 게놈 편집을 위한 형질전환 도구이다. 그의 많은 가능한 적용 중에서, 프라임 편집은 잠재적 치료 이익을 갖는, 병원성 돌연변이를 교정하기 위한 신규 전략을 나타낸다. 클린바는 질환과 연관될 수 있는 보고된 인간 돌연변이의 공개적으로 접근가능한 데이터베이스이다.
본 실시예는 간단한 절차를 사용하여 PEgRNA 서열을 결정하고 이를 436,042개의 고유한 클린바 돌연변이에 적용하는 컴퓨터 프로그램 / 알고리즘의 설계를 입증한다. 본 실시예는 먼저 PEgRNA 구조 및 기능적 요소를 기재하고, 이어서 정의를 포함한 설계 절차를 기재하고, 잠재적으로 치유적인 PEgRNA를 설계하기 위해 간단한 절차를 사용하는 컴퓨터 프로그램 / 알고리즘의 하기 기여 설명, 및 PEgRNA 설계의 변경에 대한 논의를 제공한다.
또한, 본 실시예는 클린바로부터 잠재적으로 병원성 돌연변이를 교정하기 위한 예시적인 PEgRNA 서열을 포함하는, 본원과 함께 출원된 서열 목록을 제공한다. 서열 목록의 설명은 상기 제공된다.
PEgRNA 구조
도 27 및 도 28은 본 실시예에 따라 설계될 수 있는 PEgRNA의 2가지의 가능한 구성의 개략도를 제공한다.
도 27은 본원에서 고려되고 실시예 2에 규정된 방법론에 따라 설계될 수 있는 PEgRNA의 실시양태의 구조를 제공한다. PEgRNA는 5'에서 3' 방향으로 정렬된 3개의 주요 성분 요소, 즉 스페이서, gRNA 코어, 및 3' 단부의 연장 아암을 포함한다. 연장 아암은 5'에서 3' 방향으로 하기 구조적 요소, 즉: 프라이머 결합 부위 (A), 편집 주형 (B), 및 상동성 아암 (C)으로 추가로 나뉠 수 있다. 또한, PEgRNA는 임의적인 3' 단부 변형제 영역 (e1) 및 임의적인 5' 단부 변형제 영역 (e2)을 포함할 수 있다. 또한, PEgRNA는 PEgRNA의 3' 단부에 전사 종결 신호를 포함할 수 있다 (도시되지 않음). 이들 구조적 요소는 본원에서 추가로 정의된다. PEgRNA의 구조의 도시는 제한적인 것으로 의도되지 않고, 요소의 배열에서의 변경을 포괄한다. 예를 들어, 임의적인 서열 변형제 (e1) 및 (e2)는 제시된 다른 영역 중 임의의 것 내에 또는 그 사이에 위치할 수 있고, 3' 및 5' 단부에 위치하는 것으로 제한되지는 않는다.
도 28은 본원에서 고려되고 실시예 2에 규정된 방법론에 따라 설계될 수 있는 PEgRNA의 또 다른 실시양태의 구조를 제공한다. PEgRNA는 5'에서 3' 방향으로 정렬된 3개의 주요 성분 요소, 즉 스페이서, gRNA 코어, 및 3' 단부의 연장 아암을 포함한다. 연장 아암은 5'에서 3' 방향으로 하기 구조적 요소, 즉: 프라이머 결합 부위 (A), 편집 주형 (B), 및 상동성 아암 (C)으로 추가로 나뉠 수 있다. 또한, PEgRNA는 임의적인 3' 단부 변형제 영역 (e1) 및 임의적인 5' 단부 변형제 영역 (e2)을 포함할 수 있다. 또한, PEgRNA는 PEgRNA의 3' 단부에 전사 종결 신호를 포함할 수 있다 (도시되지 않음). 이들 구조적 요소는 본원에서 추가로 정의된다. PEgRNA의 구조의 도시는 제한적인 것으로 의도되지 않고, 요소의 배열에서의 변경을 포괄한다. 예를 들어, 임의적인 서열 변형제 (e1) 및 (e2)는 제시된 다른 영역 중 임의의 것 내에 또는 그 사이에 위치할 수 있고, 3' 및 5' 단부에 위치하는 것으로 제한되지는 않는다.
PEgRNA 구조적 요소는 하기와 같이 기재될 수 있다:
스페이서: 게놈 내의 표적 DNA 서열에 상보적인, 전형적으로 20-nt 길이의 gRNA의 부분. 스페이서는 DNA 내의 프로토스페이서에 상보적이다. 스페이서는 다양한 비제한적 방식으로 변형될 수 있다. 예를 들어, 스페이서는 5'-최말단 뉴클레오티드가 G가 아닌 경우에, 5'-G를 부가하여 21-nt 스페이서를 형성하도록 변형될 수 있다. 이러한 변형은 U6 프로모터로부터의 전사를 개선시킨다.
gRNA 코어 또는 "gRNA 백본": gRNA의 부분은 일반적으로 스페이서의 3' 측면 상에 위치하고, Cas9 단백질과 상호작용하는 여러 헤어핀을 포함한다. 예시적인 gRNA 코어는 예를 들어 하기를 포함할 수 있다:
gRNA 백본 서열식별번호: 1:
GTTTAAGAGCTATGCTGGAAACAGCATAGCAAGTTTAAATAAGGCTAGTCCGTTATCAACTTGAAAAAGTGGCACCGAGTCGGTGC (86 nt) (서열식별번호: 1361579).
gRNA 백본 서열식별번호: 2:
GTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAGTTAAAATAAGGCTAGTCCGTTATCAACTTGAAAAAGTGGCACCGAGTCGGTGC (76 nt) (서열식별번호: 1361580).
본원에서 고려되는 PEgRNA는 Cas9에 결합하는 gRNA의 능력을 동일하거나 유사하게 유지시키는 다른 gRNA 코어 서열을 사용할 수 있다.
연장 아암: 본원에서 고려되는 PEgRNA는 프라이머 결합 부위, 편집 주형, 및 상동성 아암을 포함한 다양한 기능적 요소를 포함하는 연장 아암을 포함한다. 연장 아암은 gRNA 코어의 3' 단부에 위치할 수 있다. 다른 실시양태에서, 연장 아암은 스페이서의 5' 단부에 위치할 수 있다. 연장 아암은 게놈 서열 콘텍스트에 거의 상보적이고, 목적하는 편집은 비-상보적 섹션을 나타낸다. 연장 아암의 서열은 하기 변경을 포함하도록 달라질 수 있다: 프라이머 결합 부위의 길이의 변경 (하기 참조); 코딩된 영역의 길이의 변경.
프라이머 결합 부위: 프라이머 결합 부위는 PEgRNA 연장 아암의 3' 단부에 있고, Cas-매개된 닉 다음에 스페이서에 의해 대체되는 ssDNA 플랩에 상보적이다. ssDNA:RNA 하이브리드는 나머지 PEgRNA 연장부를 5'에서 3' 중합 방향으로 역전사시키기 위한 프라이머로서의 역할을 한다. SpCas9의 경우, RuvC 닉은 프로토스페이서 위치 -4와 -3 사이에 위치하며, 여기서 -1은 20-nt 스페이서의 3'-최말단 뉴클레오티드이고 -20은 5'-최말단 뉴클레오티드이다. 길이 X의 프라이머 결합 부위는 스페이서 위치 -4의 3'에서 시작하여 스페이서 위치 -4까지를 포함하는 X 뉴클레오티드로서 설계된다. 통상적인 변경은 약 8 nt 내지 약 20 nt (예를 들어, 8 내지 17 nt) 범위의 상이한 길이를 포함한다.
편집 주형: 편집 주형은 프라이머 결합 부위의 5' 단부에 인접하고, 목적하는 편집된 서열 (예를 들어, 단일 뉴클레오티드 변화, 결실, 또는 삽입)을 코딩한다.
상동성 아암: 상동성 아암은 편집 주형의 5' 단부 상에 위치하고, 천연 게놈 콘텍스트에 상보적이다.
역전사 주형 또는 내인성 DNA 내로 혼입되는 ssDNA 플랩을 코딩하는 영역: (프라이머 결합 부위는 리버스 트랜스크립타제에 의한 ssDNA 중합을 위한 주형이 되지 않기 때문에) 프라이머 결합 부위를 제외한 PEgRNA 연장부. 리버스 트랜스크립타제 주형은 편집 주형 및 상동성 아암을 함유한다. 스페이서가 프로토스페이서로부터 비결합된 후에, 리버스 트랜스크립타제 프라이머 ssDNA 서열은 그의 천연 게놈 콘텍스트에 재결합하여, 리버스 트랜스크립타제 주형을 3' ssDNA 플랩으로서 남긴다. 통상적인 변경은 다음을 포함한다: 플랩 길이는, 예를 들어 7 nt 내지 34 nt로 다양할 수 있고 (그러나 본원에 기재된 바와 같이 광범위한 플랩 길이가 고려됨); 플랩 내의 편집의 위치는 다양할 수 있다. 성공적인 편집은 2 nt만큼 짧은 상동성 아암 길이에 의해 관찰되었다. 편집은 전형적으로 가능한 한 닉 가까이에 위치하지만, 반드시 그래야하는 것은 아니다.
전사 종결인자 서열: 예를 들어 U6 프로모터 또는 다른 프로모터로부터 발현될 때 PEgRNA의 생산 동안 전사를 종결시키는 PEgRNA의 3' 단부의 서열. 예시적인 종결인자 서열은 TTTTTTGTTTT (서열식별번호: 1361581)이다.
PEgRNA 설계에 대한 추가의 변경이 실현가능하고, 본원에서 고려된다. 예를 들어, PEgRNA는, 예를 들어 키싱 루프 상호작용을 형성하거나 또는 RNA 안정성을 위한 보호 헤어핀으로서 작용하도록, 상동성 아암의 5' 또는 프라이머 결합 부위의 3' 또는 둘 다의 비-상보적 서열을 함유하는 PEgRNA 연장 아암으로 설계될 수 있는 것으로 고려될 수 있다. 이들 서열은 도 27 및 28에서 서열 요소 e1 및 e2에 제시되고, "임의적인 3' 또는 5' 단부 변형제 영역"으로 지칭된다. 또한, PEgRNA는 다수의 설계 후보 사이를 우선시하는 전략 및 방법을 사용하여 설계될 수 있는 것으로 고려될 수 있다. 예는 sgRNA:Cas9 복합체에서 천연 뉴클레오티드-단백질 상호작용을 방해함으로 인해 5'-최말단 뉴클레오티드가 시토신인 PEgRNA 연장부를 피하는 것, 또는 스페이서 및 목적하는 편집을 고려하여 바람직한 PBS 길이 및 플랩 길이를 선택하기 위해 RNA 2차 구조 예측 도구를 사용하는 것을 포함한다.
PEgRNA 설계 알고리즘
투입 대립유전자, 산출 대립유전자, 및 프라임 편집을 위한 CRISPR 시스템 (중요하게는, PAM 모티프 및 프라임 편집제의 닉의 상대 위치)을 고려하여, 알고리즘은 투입 대립유전자를 산출 대립유전자로 편집할 수 있는 PEgRNA 또는 PEgRNA의 목록을 설계한다. 산출 및 투입 대립유전자 사이의 서열 차이는 목적하는 편집으로 지칭된다. 이의 한 실시양태는 병원성 돌연변이를 나타내는 투입 대립유전자 및 교정된 야생형 서열을 나타내는 산출 대립유전자일 수 있다.
단일 PEgRNA에 의해 유도될 수 있는 편집의 부류는 단일 뉴클레오티드 치환, 1 nt 내지 대략 40 nt까지의 삽입, 1 nt 내지 대략 30 nt까지의 결실, 및 상기 모두의 조합 또는 혼합을 포함한다. 프라임 편집은 이들 유형의 편집을 주로 스페이서 위치 -3 (닉의 바로 3')으로부터 스페이서 위치 +27 (투입 대립유전자에서 닉의 3'의 30 nt)까지 지지하는 것으로 공지되어 있다. 각각의 이들 명시된 수는 프라임 편집에 대한 지식이 증가함에 따라 시간 경과에 따라 변화할 수 있는 알고리즘의 파라미터를 나타낸다. 한편, SpCas9 시스템을 사용한 프로토스페이서 위치 -4에서의 편집은 아마도 프로토스페이서 위치 -5와 -4 사이에서 때때로의 RuvC 절단에 의해 유발되었을 프라임 편집에 의해 관찰되었다.
알고리즘은 투입 대립유전자의 양쪽 가닥 상에서 선택된 CRISPR 시스템의 PAM 모티프와 상용성인 모든 스페이서를 열거한 다음, 닉이 가닥 상의 목적하는 편집의 3' 측면 상에 있기 때문에 또는 닉과 목적하는 편집 사이의 거리가 너무 멀기 때문에 (사용자-규정 한계값 초과, 예를 들어 30 nt) 연관된 닉 위치가 산출 대립유전자로의 프라임 편집과 비상용성인 프로토스페이서를 필터링한다.
각각의 스페이서에 대해, 알고리즘은 투입 대립유전자의 서열, 닉의 위치, 및 목적하는 편집의 서열을 사용하여 스페이서 및 편집 주형 서열을 구축한다. 이어서, 알고리즘은 8 nt 내지 17 nt로 다양할 수 있는 프라이머 결합 부위 길이; 2 nt 내지 33 nt로 다양할 수 있는 상동성 아암 길이; 및 GTTTAAGAGCTATGCTGGAAACAGCATAGCAAGTTTAAATAAGGCTAGTCCGTTATCAACTTGAAAAAGTGGCACCGAGTCGGTGC (서열식별번호: 1361579) 또는 GTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAGTTAAAATAAGGCTAGTCCGTTATCAACTTGAAAAAGTGGCACCGAGTCGGTGC (서열식별번호: 1361580)일 수 있는 gRNA 백본 서열 또는 야생형 RNA 2차 구조를 보유하는 또 다른 gRNA 백본 서열에 대한 1개 이상의 값을 선택한다. 선택된 각각의 파라미터 조합에 대해, 알고리즘은 주어진 파라미터를 사용하여 상동성 아암, 프라이머 결합 부위 서열, 및 gRNA 백본을 구축한다. 이어서, 알고리즘은 프로토스페이서, gRNA 백본, PEgRNA 연장부, 및 종결인자 서열을 연쇄시킴으로써 PEgRNA 서열을 형성한다.
병원성으로서 또는 아마도 병원성일 것으로서 주석이 달린 배선 돌연변이에 대한 기본 필터링 후에, Cas9-NG를 사용하는 프라임 편집에 상용성인 72,020개의 고유한 클린바 돌연변이 및 NGG PAM과 함께 SpCas9를 사용하는 프라임 편집에 상용성인 63,496개의 고유한 클린바 돌연변이를 확인하였다. 상이한 PAM 상용성을 갖는 상이한 Cas9 변이체를 함유하는 프라임 편집제를 사용하는 경우에 추가의 돌연변이가 교정가능할 것임에 주목한다.
이들 돌연변이를 부차 대립유전자 빈도, 제출자의 수, 제출자의 그의 해석에서의 상충 여부, 및 돌연변이가 전문가 패널에 의해 검토되었는지 여부를 사용하여 4가지 부류의 임상 유의성으로 분류하였다.
63,496개의 SpCas9-상용성 돌연변이 중에서:
Figure pct00105
4,627개의 돌연변이는 가장 유의한 수준 (4)에서 확인되고
Figure pct00106
13,943개의 돌연변이는 유의성 수준 3 또는 4에서 확인되고
Figure pct00107
44,385개의 돌연변이는 유의성 수준 2, 3, 또는 4에서 확인된다.
제공된 서열 목록은 닉과 편집 사이의 거리가 가장 짧은 PEgRNA로서 선택된, 고유한 돌연변이당 단일 PEgRNA를 열거한다. PEgRNA를 상동성 아암 길이 13 및 프라이머 결합 부위 길이 13으로 설계하였다. 편집에 대해 20 nt보다 더 먼 닉 부위를 갖는 스페이서는 무시하였다. 사용된 gRNA 백본 서열은 GTTTAAGAGCTATGCTGGAAACAGCATAGCAAGTTTAAATAAGGCTAGTCCGTTATCAACTTGAAAAAGTGGCACCGAGTCGGTGC (서열식별번호: 1361579)였다. 사용된 종결인자 서열은 TTTTTTGTTTT (서열식별번호: 1361581)였다.
서열 목록은 실시예 2에 따라 결정된 각각의 PEgRNA의 설명을 포함한다. 전체로서, 실시예 2는 133515개의 예시적인 PEgRNA 완전 서열의 서열을 결정한다. 각각의 이들 서열은 서열 목록에 제시/포함되고, 서열식별번호: 1-135514로서 확인된다. 또한, 다른 곳에 기재된 바와 같이, PEgRNA는 각각 스페이서 (서열식별번호: 135515 - 271028) 및 연장 아암 (서열식별번호: 271029 - 406542)으로 구성된다. 또한, 각각의 PEgRNA는, 예를 들어 서열식별번호: 1361579-1361580에 의해 규정된 바와 같은 gRNA 코어를 포함한다. 서열식별번호: 271029 - 406542의 연장 아암은 추가로 각각 프라이머 결합 부위 (서열식별번호: 406543 - 542056), 편집 주형 (서열식별번호: 542057 - 677570), 및 상동성 아암 (서열식별번호: 677571 - 813084)으로 구성된다. PEgRNA는 임의로 5' 단부 변형제 영역 (서열식별번호: EE-EE) 및/또는 3' 단부 변형제 영역 (서열식별번호: FF-FF)을 포함할 수 있다. PEgRNA는 또한 PEgRNA의 3'에 역전사 종결 신호 (예를 들어, 서열식별번호: 1361560-1361565)를 포함할 수 있다.
서열 목록에 제공된 각각의 전장 PEgRNA 서열 (서열식별번호: 1 - 135514)에 대해, 서열 목록은 5개의 상응하는 하위서열 세트: 즉, (1) 스페이서, (2) 연장 아암, (3) 프라이머 결합 부위, (4) 편집 주형, 및 (5) 상동성 아암을 포함한다. 임의의 주어진 PEgRNA 전장 서열에 대한 하위서열의 세트는 하기 수학적 연산에 의해 결정될 수 있다.
서열 목록의 각각의 PEgRNA 서열 (예를 들어, 서열식별번호: 1)에 대해, 서열 목록의 하기 서열은 하기와 같은 상응하는 하위서열의 세트: (1) 스페이서, (2) 연장 아암, (3) 프라이머 결합 부위, (4) 편집 주형, 및 (5) 상동성 아암을 구성한다:
스페이서: 각각의 주어진 PEgRNA 서열에 대해, 상응하는 스페이서 서열은 인자 135514에 부가된 PEgRNA 서열 식별자의 숫자 (예를 들어, 서열식별번호: 1의 경우 숫자 "1")로서 확인된다. 예를 들어, 서열식별번호: 1의 PEgRNA에 상응하는 스페이서는 서열식별번호: 135515이다.
연장 아암: 각각의 주어진 PEgRNA 서열에 대해, 상응하는 연장 아암은 인자 271028 (135514 X 2)에 부가된 PEgRNA 서열 식별자의 숫자 (예를 들어, 서열식별번호: 1의 경우 숫자 "1")로서 확인된다. 예를 들어, 서열식별번호: 1의 PEgRNA에 상응하는 연장 아암은 서열식별번호: 271029이다.
프라이머 결합 부위: 각각의 주어진 PEgRNA 서열에 대해, 상응하는 프라이머 결합 부위는 인자 406542 (135514 X 3)에 부가된 PEgRNA 서열 식별자의 숫자 (예를 들어, 서열식별번호: 1의 경우 숫자 "1")로서 확인된다. 예를 들어, 서열식별번호: 1의 PEgRNA에 상응하는 프라이머 결합 부위는 서열식별번호: 406542이다.
편집 주형: 각각의 주어진 PEgRNA 서열에 대해, 상응하는 편집 주형은 인자 542056 (135514 X 4)에 부가된 PEgRNA 서열 식별자의 숫자 (예를 들어, 서열식별번호: 1의 경우 숫자 "1")로서 확인된다. 예를 들어, 서열식별번호: 1의 PEgRNA에 상응하는 편집 주형은 서열식별번호: 542057이다.
상동성 아암: 각각의 주어진 PEgRNA 서열에 대해, 상응하는 상동성 아암은 인자 677570 (135514 X 5)에 부가된 PEgRNA 서열 식별자의 숫자 (예를 들어, 서열식별번호: 1의 경우 숫자 "1")로서 확인된다. 예를 들어, 서열식별번호: 1의 PEgRNA에 상응하는 편집 주형은 서열식별번호: 677571이다.
서열 목록에 제공된 서열의 총 수는 813084개이다. 총 135514개의 PEgRNA 완전 서열 (각각 적어도 스페이서, gRNA 코어, 및 연장 아암을 포함함)이 존재한다. 동일한 수의 (1) 스페이서, (2) 연장 아암, (3) 프라이머 결합 부위, (4) 편집 주형, 및 (5) 상동성 아암이 존재하며, 각각의 세트는 상기와 같이 규정된다.
다른 PEgRNA 서열 세트 (즉, 임의의 주어진 PEgRNA, 및 상응하는 스페이서, 연장 아암, 프라이머 결합 부위, 편집 주형, 및 상동성 아암을 포함함)의 예를 하기 표에 제시한다:
Figure pct00108
...
Figure pct00109
제공된 PEgRNA 설계에 대한 변경은 gRNA 백본 서열, 프라이머 결합 부위 길이, 플랩 길이 등을 다르게 하는 것을 포함하여 이전에 논의된 모든 변경을 포함한다.
참고문헌 (실시예 2)
Figure pct00110
실시예 3. 프라임 편집을 위한 PEgRNA의 설계 및 조작
요약
프라임 편집 (PE) 효율을 개선시킬 수 있는 일련의 PEgRNA 설계 및 전략이 본원에 기재된다.
배경기술
프라임 편집 (PE)은 프라임 편집제 가이드 RNA (PEgRNA) 내에 코딩된 정보를 사용하여 표적화된 유전자좌 내의 규정된 DNA 서열을 대체, 삽입, 또는 제거할 수 있는 게놈 편집 기술이다. 프라임 편집제 (PE)는 리버스 트랜스크립타제 (RT) 효소에 융합된 뉴클레아제 활성을 갖는 서열-프로그램가능한 DNA 결합 단백질 (Cas9)로 이루어진다. PE는, 그의 스페이서 서열 내에 특정 DNA 유전자좌를 표적화하기 위한 정보, 뿐만 아니라 표준 sgRNA 스캐폴드 내로 구축된 조작된 연장부 내에 목적하는 편집을 명시한 정보를 함유하는 PEgRNA와 복합체를 형성한다. PE:PEgRNA 복합체는 프로그램화된 표적 DNA 유전자좌에 결합하고 닉킹하여, 닉킹된 DNA 가닥이 PEgRNA의 조작된 프라이머 결합 서열 (PBS)에 혼성화하도록 한다. 이어서, 리버스 트랜스크립타제 도메인은 DNA 중합을 위한 프라이머로서 닉킹된 게놈 DNA를 사용하여 PEgRNA의 RT 주형 부분 내의 편집-코딩 정보를 카피한다. 후속 DNA 복구 과정은 새롭게 합성된 편집된 DNA 가닥을 게놈 유전자좌 내로 혼입시킨다. 프라임 편집의 다재다능성은 연구 도구 및 잠재적 치료제로서 큰 유망성을 보유하지만, 편집에 요구되는 다단계 과정으로 인해 효율 및 범주에서 여러 제한이 존재한다. 예를 들어, PEgRNA 내에서 형성되는 불리한 RNA 구조는 PEgRNA로부터 게놈 유전자좌로의 DNA 편집의 카피를 억제할 수 있다. PE 기술을 개선시키기 위한 하나의 잠재적인 방법은 중요한 PEgRNA 성분의 재설계 및 조작을 통한 것이다. 이들 PEgRNA의 설계에 대한 개선은 개선된 PE 효율을 위해 필요할 뿐만 아니라, 게놈 내로 보다 긴 삽입된 서열의 설치를 가능하게 할 가능성이 있다.
설명
PE의 효능을 개선시키기 위해 고려되는 일련의 PEgRNA 설계를 본원에 기재한다. 이들 설계는 sgRNA 효능 및/또는 안정성을 개선시키기 위한 다수의 이전에 공개된 접근법을 이용할 뿐만 아니라 다수의 신규한 전략을 활용한다. 이들 개선은 i) 부담스러운 서열 요건 없이 보다 긴 PEgRNA의 발현을 가능하게 할, 비-폴리머라제 III (pol III) 프로모터로부터의 기능적 PEgRNA의 효율적인 발현을 가능하게 하는 설계; ii) 효능을 개선시킬 수 있는 코어, Cas9-결합 PEgRNA 스캐폴드에 대한 개선; iii) RT 프로세싱성을 개선시켜 표적화된 게놈 유전자좌에서 보다 긴 서열의 삽입을 가능하게 하는, PEgRNA에 대한 변형; 및 iv) PEgRNA 안정성을 개선시키거나, RT 프로세싱성을 증진시키거나, PEgRNA의 미스폴딩을 방지하거나, 또는 게놈 편집에 중요한 추가의 인자를 동원하는, PEgRNA의 5' 또는 3' 말단에 대한 RNA 모티프의 부가의, 다수의 상이한 카테고리 중 하나 이상에 속할 수 있다. 각각의 카테고리 내의 다수의 잠재적인 이러한 PEgRNA 설계가 본원에 기재된다. 이들 설계 중 몇몇은 Cas9에 의한 sgRNA 활성을 개선시키는 것에 관하여 이전에 기재되었고, 이는 그대로 표시된다. 또한, PEgRNA 스캐폴드의 폴리싱을 가능하게 하고 PE 활성을 증진시킬, 주어진 서열 표적에 대한 PEgRNA의 진화를 위한 플랫폼이 본원에 기재된다 (v). 특히, 이들 설계는 또한 임의의 Cas9 또는 그의 진화된 변이체에 의해 인식되는 PEgRNA를 개선시키기 위해 쉽게 적용될 수 있다.
(i) 비-pol III 프로모터로부터의 PEgRNA의 발현
sgRNA는 전형적으로 U6 snRNA 프로모터로부터 발현된다. 이러한 프로모터는 pol III을 동원하여 회합된 RNA를 발현시키고, 이는 핵 내에 보유된 짧은 RNA의 발현에 유용하다. 그러나, pol III은 고도로 프로세싱성이 아니고, 수백개의 뉴클레오티드 길이보다 더 긴 RNA를 효율적인 게놈 편집에 요구되는 수준으로 발현할 수 없다183. 추가적으로, pol III은 U 스트레치에서 멈추거나 종결될 수 있으며, 이는 잠재적으로 PEgRNA를 사용하여 삽입될 수 있는 서열 다양성을 제한한다. 여분의 서열폴리머라제 II (예컨대 pCMV) 또는 폴리머라제 I (예컨대 U1 snRNA 프로모터)을 동원하는 다른 프로모터를 보다 긴 sgRNA를 발현하는 그의 능력에 대해 검사하였다183. 그러나, 이들 프로모터는 전형적으로 부분적으로 전사되고, 이는 발현된 PEgRNA에서 스페이서의 5'의 여분의 서열을 생성할 것이며, 이는 부위-의존성 방식으로 현저하게 감소된 Cas9:sgRNA 활성을 생성하는 것으로 제시되었다. 추가적으로, pol III-전사된 PEgRNA는 단순히 연속 6-7개 U에서 종결될 수 있지만, pol II 또는 pol I로부터 전사된 PEgRNA는 상이한 종결 신호를 필요로 할 것이다. 종종 이러한 신호는 또한 폴리아데닐화를 발생시키며, 이는 핵으로부터 PEgRNA의 바람직하지 않은 수송을 발생시킬 것이다. 유사하게, pol II 프로모터, 예컨대 pCMV로부터 발현된 RNA는 전형적으로 5'-캡핑되며, 이는 또한 그의 핵 유출을 발생시킨다.
이전에, 린 및 동료들은 긴-비코딩 RNA- (lncRNA) 태그부착된 sgRNA의 생산을 위해 다양한 발현 플랫폼을 스크리닝하였다183. 이들 플랫폼은 pCMV로부터 발현되고 인간으로부터의 MALAT1 ncRNA로부터의 ENE 요소184, KSHV로부터의 PAN ENE 요소185, 또는 U1 snRNA로부터의 3' 박스186에서 종결하는 RNA를 포함한다. 특히, MALAT1 ncRNA 및 PAN ENE는 폴리A-테일을 보호하는 삼중 나선을 형성한다184, 187. RNA의 발현을 가능하게 하는 것에 더하여, 이들 구축물은 또한 RNA 안정성을 증진시킬 수 있을 것으로 예상된다 (섹션 iv 참조). U1 snRNA로부터의 프로모터를 사용하여 이들 보다 긴 sgRNA의 발현을 가능하게 하는 것183을 또한 연구하였다. 이들 발현 시스템은 또한 보다 긴 PEgRNA의 발현을 가능하게 할 것으로 예상된다. 또한, 자기-절단 리보자임, 예컨대 해머헤드188, 피스톨189, 해체트189, 헤어핀190, VS191, 트위스터192, 또는 트위스터 시스터192 리보자임, 또는 전사된 가이드를 프로세싱하기 위한 다른 자기-절단 요소, 또는 Csy4193에 의해 인식되고 또한 가이드의 프로세싱으로 이어지는 헤어핀을 부가하는, PEgRNA의 일부로서 전사될 pol II 프로모터의 부분의 절단을 위한 일련의 방법이 설계되었다. 또한, 다중 ENE 모티프의 혼입은 KSHV PAN RNA 및 요소에 대해 이전에 입증된 바와 같이 개선된 PEgRNA 발현 및 안정성으로 이어질 수 있는 것으로 가설화된다185. 또한, PEgRNA를 원형 인트론 RNA (ciRNA)의 형태로 원형화하는 것은 또한 증진된 RNA 발현 및 안정성, 뿐만 아니라 핵 국재화로 이어질 수 있는 것으로 예상된다194.
서열:
pCMV, Csy4 헤어핀, PEgRNA, 및 MALAT1 ENE로 이루어진 PEgRNA 발현 플랫폼
Figure pct00111
pCMV, Csy4 헤어핀, PEgRNA, 및 PAN ENE로 이루어진 PEgRNA 발현 플랫폼
Figure pct00112
pCMV, Csy4 헤어핀, PEgRNA, 및 3xPAN ENE로 이루어진 PEgRNA 발현 플랫폼
Figure pct00113
pCMV, Csy4 헤어핀, PEgRNA, 및 3' 박스로 이루어진 PEgRNA 발현 플랫폼
Figure pct00114
pU1, Csy4 헤어핀, PEgRNA, 및 3' 박스로 이루어진 PEgRNA 발현 플랫폼
Figure pct00115
(ii) PEgRNA 스캐폴드의 개선
코어, Cas9-결합 PEgRNA 스캐폴드는 PE 활성을 증진시키기 위해 개선될 가능성이 있다. 여러 이러한 접근법은 이미 입증되었다. 예를 들어, 스캐폴드의 제1 쌍형성 요소 (P1)는 GTTTT-AAAAC 쌍형성 요소를 함유한다. 이러한 연속 T는 pol III 일시정지 및 RNA 전사체의 조기 종결을 발생시키는 것으로 밝혀졌다. P1의 이러한 부분에서 T-A 쌍 중 1개의 G-C 쌍으로의 합리적 돌연변이는 sgRNA 활성을 증진시키는 것으로 밝혀졌고, 이는 이러한 접근법이 또한 PEgRNA에 대해 실행가능할 것임을 시사한다195. 추가적으로, P1의 길이를 증가시키는 것은 또한 sgRNA 폴딩을 증진시키고 개선된 활성으로 이어지는 것으로 밝혀졌고195, 이는 이것이 PEgRNA 활성의 개선을 위한 또 다른 방안임을 시사한다. 마지막으로, 주어진 DNA 표적 상에서의 PEgRNA의 방향적 진화를 통한 PEgRNA 스캐폴드의 폴리싱이 또한 개선된 활성을 발생시킬 가능성이 있다. 이는 섹션 (v)에 기재되어 있다.
서열:
P1에 대해 6 nt 연장부를 함유하는 PEgRNA
Figure pct00116
P1 내에 T-A에서 G-C로의 돌연변이를 함유하는 PEgRNA
Figure pct00117
(iii) PEgRNA의 주형 영역에 대한 변형을 통한 RT 프로세싱성의 개선
PEgRNA에 의해 주형화되는 삽입의 크기가 증가함에 따라, 엔도뉴클레아제에 의해 분해되거나, 자발적 가수분해를 겪거나, 또는 RT에 의해 역전사될 수 없거나 또는 PEgRNA 스캐폴드의 폴딩 및 후속 Cas9-RT 결합을 파괴하는 2차 구조로 폴딩될 가능성이 더 크다. 따라서, 전체 유전자의 삽입과 같은 대규모 삽입에 영향을 미치기 위해서는 PEgRNA의 주형에 대한 변형이 필요할 가능성이 있다. 이를 위한 일부 전략은 RNA를 분해 또는 가수분해에 대해 보다 저항성이게 하거나 또는 억제성 2차 구조를 채택할 가능성을 낮추는, 합성 또는 반합성 PEgRNA 내의 변형된 뉴클레오티드의 혼입을 포함한다196. 이러한 변형은 G-풍부 서열에서 RNA 2차 구조를 감소시킬 8-아자-7-데아자구아노신; 분해를 감소시키고 특정 종류의 RNA 2차 구조를 증진시키는 잠금 핵산 (LNA); RNA 안정성을 증진시키는 2'-O-메틸, 2'-플루오로, 또는 2'-O-메톡시에톡시 변형을 포함할 수 있다. 이러한 변형은 또한 안정성 및 활성을 증진시키기 위해 PEgRNA의 다른 곳에 포함될 수 있다. 대안적으로 또는 추가적으로, PEgRNA의 주형은 목적하는 단백질 생성물을 코딩하고 또한 RT에 의해 언폴딩될 수 있는 간단한 2차 구조를 채택할 가능성이 더 크도록 설계될 수 있다. 이러한 단순한 구조는 열역학적 싱크로서 작용할 것이며, 이는 역전사를 막을 보다 복잡한 구조가 발생할 가능성을 줄인다. 마지막으로, 또한 주형을 2개의 별개의 PEgRNA로 분할하는 것을 상상할 수 있다. 이러한 설계에서, PE는 전사를 개시하고 또한 Cas9에 융합된 RNA-결합 단백질 또는 PEgRNA 자체 상의 RNA 인식 요소, 예컨대 MS2 압타머를 통해 표적화된 부위에 별개의 주형 RNA를 동원하는데 사용될 것이다. RT는 이러한 별개의 주형 RNA에 직접 결합할 수 있거나, 또는 제2 주형으로 스와핑하기 전에 원래의 PEgRNA 상에서 역전사를 개시할 수 있다. 이러한 접근법은 긴 주형의 부가 시 PEgRNA의 미스폴딩을 방지함으로써, 또한 아마도 PE-기반 긴 삽입을 억제할 수 있는, 긴 삽입이 이루어지는 게놈으로부터 Cas9의 해리를 필요로 하지 않음으로써 긴 삽입을 가능하게 할 수 있다.
(iv) 5' 또는 3' 말단에의 추가의 RNA 모티프의 설치
PEgRNA 설계는 또한 RNA의 말단의 어느 하나의 단부에 추가의 모티프를 설치하는 것을 통해 개선될 수 있다. 여러 이러한 모티프 - 예컨대 KSHV로부터의 PAN ENE 및 MALAT1로부터의 ENE는 비-pol III 프로모터로부터의 보다 긴 PEgRNA의 발현을 종결시키기 위한 가능한 수단으로서 앞서 파트 (i)184,185에서 논의되었다. 이들 요소는 폴리A 테일을 에워싸는 RNA 삼중 나선을 형성하여, 이들이 핵 내에 보유되게 한다184,187. 그러나, 말단 뉴클레오티드를 폐쇄하는 PEgRNA의 3' 말단에 복합체 구조를 형성함으로써, 이들 구조는 또한 아마도 PEgRNA의 엑소뉴클레아제-매개된 분해를 방지하는 것을 도울 것이다. 3' 말단에 삽입된 다른 구조적 요소도 또한 RNA 안정성을 증진시킬 수 있지만, 비-pol III 프로모터로부터의 종결은 가능하게 하지 않는다. 이러한 모티프는 3' 말단을 폐쇄할 헤어핀 또는 RNA 쿼드로플렉스197, 또는 3' 말단에서 2'-3'-시클릭 포스페이트의 형성을 발생시키고 또한 잠재적으로 PEgRNA가 엑소뉴클레아제에 의해 분해될 가능성을 낮출 자기-절단 리보자임, 예컨대 HDV198를 포함할 수 있다. PEgRNA를 불완전한 스플라이싱을 통해 고리화하도록 유도하여 - ciRNA를 형성하는 것은 - 또한 PEgRNA 안정성을 증가시키고 PEgRNA가 핵 내에 보유되도록 할 수 있다194.
추가의 RNA 모티프는 또한 RT 프로세싱성을 개선시키거나 또는 DNA-RNA 듀플렉스에 대한 RT 결합을 증진시킴으로써 PEgRNA 활성을 증진시킬 수 있다. 그의 동족 레트로바이러스 게놈에서 RT에 의해 결합된 천연 서열의 부가는 RT 활성을 증진시킬 수 있다199. 이는 레트로바이러스 게놈 이량체화 및 전사의 개시에 수반되는 천연 프라이머 결합 부위 (PBS), 폴리퓨린 트랙 (PPT), 또는 키싱 루프를 포함할 수 있다199. PEgRNA의 5' 및 3' 말단에서의 이량체화 모티프 - 예컨대 키싱 루프 또는 GNRA 테트라루프/테트라루프 수용체 쌍200 - 의 부가는 또한 PEgRNA의 효과적인 원형화를 발생시켜 안정성을 개선시킬 수 있다. 추가적으로, 이들 모티프의 부가가 PEgRNA 스페이서 및 프라이머의 물리적 분리를 가능하게 하여, PE 활성을 방해할 스페이서의 폐쇄를 방지할 수 있는 것으로 고려된다. 스페이서 영역에서 작은 토홀드 헤어핀을 형성하는 PEgRNA에 대한 짧은 5' 연장부는 또한 스페이서에 결합하는 PEgRNA의 어닐링 영역과 유리하게 경쟁할 수 있다. 마지막으로, 키싱 루프는 또한 다른 주형 RNA를 게놈 부위로 동원하고 RT 활성을 하나의 RNA로부터 다른 것으로 스와핑하는 것을 가능하게 하는데 사용될 수 있다 (섹션 iii).
서열
PEgRNA -HDV 융합체
Figure pct00118
PEgRNA -MMLV 키싱 루프
Figure pct00119
PEgRNA -VS 리보자임 키싱 루프
Figure pct00120
PEgRNA -GNRA 테트라루프/테트라루프 수용체
Figure pct00121
PEgRNA 주형 스위칭 2차 RNA-HDV 융합체
Figure pct00122
(v) PEgRNA의 진화
PEgRNA 스캐폴드는 SpCas9 및 염기 편집제가 개선되는 방법201과 유사한 방식으로 방향적 진화를 통해 추가로 개선될 수 있을 가능성이 있다. 방향적 진화는 Cas9 또는 진화된 Cas9 변이체에 의한 PEgRNA 인식을 증진시킬 수 있다. 추가적으로, 상이한 PEgRNA 스캐폴드 서열은 상이한 게놈 유전자좌에서 최적이어서, 해당 부위에서 PE 활성을 증진시키거나, 오프-타겟 활성을 감소시키거나, 또는 둘 다일 가능성이 있다. 마지막으로, 다른 RNA 모티프가 부가된 PEgRNA 스캐폴드의 진화는 비진화된 융합 RNA에 비해 융합된 PEgRNA의 활성을 거의 확실히 개선시킬 것이다. 예를 들어, c-디-GMP-I 압타머 및 해머헤드 리보자임으로 구성된 알로스테릭 리보자임의 진화는 현저하게 개선된 활성으로 이어졌고202, 이는 진화가 해머헤드-PEgRNA 융합체의 활성을 또한 개선시킬 것임을 시사한다. 또한, Cas9는 현재 일반적으로 sgRNA의 5' 연장을 용인하지 않지만, 방향적 진화는 아마도 이러한 불용인을 완화시켜 추가의 RNA 모티프가 이용되도록 하는 돌연변이를 생성할 수 있을 것이다.
경쟁 접근법
본원에 기재된 바와 같이, Cas9:sgRNA 복합체와 함께 사용하기 위한 다수의 이들 접근법이 이미 기재되었지만, PEgRNA 활성을 개선시키기 위한 어떠한 설계도 보고되지 않았다. 게놈 내로의 프로그램가능한 돌연변이의 설치를 위한 다른 전략은 염기-편집, 상동성-지정 재조합 (HDR), 정확한 미세상동성-매개된 단부-연결 (MMEJ), 또는 트랜스포사제-매개된 편집을 포함한다. 그러나, 이들 접근법은 모두 PE와 비교 시 유의한 결점을 갖는다. 현행 염기 편집제는 기존 PE보다 더 효율적이지만, 단지 특정 부류의 게놈 돌연변이만을 설치할 수 있고, 관심 부위에서 추가의 바람직하지 않은 뉴클레오티드 전환을 발생시킬 수 있다. HDR은 단지 매우 소수의 세포 유형에서만 실현가능하며, 비교적 높은 비율의 무작위 삽입 및 결실 돌연변이 (indel)를 발생시킨다. 정확한 MMEJ는 이중 가닥 파괴의 예측가능한 복구로 이어질 수 있지만, 주로 결실의 설치로 제한되고, 매우 부위-의존성이고, 또한 비교적 높은 비율의 바람직하지 않은 indel을 가질 수 있다. 트랜스포사제-매개된 편집은 지금까지 박테리아에서만 기능하는 것으로 밝혀졌다. 이에 따라, PE에 대한 개선은 아마도 광범위한 게놈 돌연변이의 치료적 교정을 위한 최선의 경로를 나타낸다.
실시예 4. 프라이머 결합 부위 (PBS)에의 3' 토 루프의 혼입은 PEgRNA 활성을 개선시킨다
PE 활성을 추가로 개선시키기 위해, 본 발명자들은 3' 연장 아암을 갖는 PEgRNA의 3' 단부에 토루프 서열을 부가하는 것을 고려하였다. 도 37a는 3' 연장 아암을 갖는 일반적인 SpCas9 PEgRNA의 예를 제공한다 (상단 분자). 3' 연장 아암은 차례로 RT 주형 (목적하는 편집을 포함함) 및 분자의 3' 단부에 프라이머 결합 부위 (PBS)를 포함한다. 분자는 3개의 U 핵염기를 포함하는 폴리(U) 서열로 종결된다 (즉, 5'-UUU-3').
대조적으로, 도 37a의 하단 부분은 도 37a의 상단 부분과 동일한 PEgRNA 분자를 제시하지만, 여기서 프라이머 결합 부위의 3' 단부와 말단 폴리(U) 서열의 5' 단부 사이에 5'-GAAANNNNN-3'의 9-핵염기 서열이 삽입되었다. 이 구조는 그 자체를 180°만큼 뒤로 폴딩시켜 "토루프" RNA 구조를 형성하며, 여기서 9-핵염기 삽입 중 5'-NNNNN-3' 서열은 프라이머 결합 부위의 상보적 서열과 어닐링하고, 5'-GAAA-3' 부분은 180° 턴을 형성한다. 도 37a에 도시된 토루프 서열의 특색은 그 자리에 사용될 수 있는 가능한 토루프의 범주를 제한하거나 좁히도록 의도되지 않는다. 추가로, 토루프의 서열은 프라이머 결합 부위의 상보적 서열에 좌우될 것이다. 본질적으로, 다양한 실시양태에서, 토루프 서열은 180°를 형성하는 제1 서열 부분, 및 프라이머 결합 부위의 일부에 상보적인 서열을 갖는 제2 서열 부분을 가질 수 있다.
이론에 얽매이지는 않지만, 토루프 서열은 달리 가능한 것보다 더욱 더 긴 프라이머 결합 부위를 갖는 PEgRNA의 사용을 가능하게 하는 것으로 생각된다. 더 긴 PBS 서열은 다시, PE 활성을 개선시키는 것으로 생각된다. 보다 특히, 토루프의 가능한 기능은 PBS가 스페이서와 상호작용하는 것을 폐쇄하거나 또는 적어도 최소화하는 것이다. PBS와 스페이서 사이의 안정한 헤어핀 형성은 불활성 PEgRNA로 이어질 수 있다. 토루프의 부재 하에, 이러한 상호작용은 PBS의 길이를 제한하는 것을 필요로 할 수 있다. 3' 단부 토루프를 사용하여 스페이서와 PBS 사이의 상호작용을 차단하거나 최소화하는 것은 PE 활성의 개선으로 이어질 수 있다.
도 37b는 실시예 4의 결과를 보여주며, 이는 HEK 세포 또는 EMX 세포에서의 프라임 편집의 효율이 토루프 요소를 함유하는 PEgRNA를 사용하면 증가되는 반면, indel 형성의 퍼센트는 크게 변화되지 않는다는 것을 입증한다.
실시양태
하기 실시양태는 본 개시내용의 범주 내에 있다. 추가로, 본 개시내용은 열거된 실시양태 중 하나 이상으로부터의 하나 이상의 제한, 요소, 조항 및 서술적 용어를 본 섹션에서의 또 다른 열거된 실시양태에 도입하는 이들 실시양태의 모든 변형, 조합 및 순열을 포괄한다. 예를 들어, 또 다른 실시양태에 종속하는 임의의 열거된 실시양태는 동일한 기본 실시양태에 종속하는 본 섹션에서의 임의의 다른 열거된 실시양태에서 발견된 하나 이상의 제한을 포함하도록 변형될 수 있다. 요소가 목록으로서, 예를 들어 마쿠쉬 군 포맷으로 제시되는 경우에, 요소의 각각의 하위군이 또한 개시되고, 임의의 요소(들)는 군으로부터 제거될 수 있다. 일반적으로, 본 개시내용 또는 본 개시내용의 측면이 특정한 요소 및/또는 특색을 포함하는 것으로 언급되는 경우에, 본 발명의 특정 실시양태 또는 본 발명의 특정 측면은 이러한 요소 및/또는 특색으로 이루어지거나 또는 본질적으로 이루어지는 것으로 이해되어야 한다. 또한, 용어 "포함하는" 및 "함유하는"은 개방적인 것으로 의도되고, 추가의 요소 또는 단계의 포함을 허용한다는 것이 주목된다. 범위가 주어지는 경우, 종점이 포함된다. 추가로, 달리 나타내지 않는 한 또는 달리 문맥 및 관련 기술분야의 통상의 기술자의 이해로부터 명백하지 않는 한, 범위로서 표현된 값은 본 발명의 상이한 실시양태에서 언급된 범위 내의 임의의 구체적 값 또는 하위-범위를, 문맥이 달리 명확하게 지시하지 않는 한 그러한 범위의 하한치 단위의 1/10까지 가정할 수 있다.
1. 스페이서, gRNA 코어 및 연장 아암을 포함하며, 서열식별번호: 1-135514 또는 서열식별번호: 1-135514 중 어느 것과 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 서열로 이루어진 군으로부터 선택된 서열을 포함하는 가이드 RNA.
2. 스페이서, gRNA 코어 및 연장 아암을 포함하며, 여기서 스페이서는 서열식별번호: 135515-271028로 이루어진 군으로부터 선택된 뉴클레오티드 서열 또는 서열식별번호: 135515-271028 중 어느 것과 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열을 갖는 스페이서를 포함하는 것인 가이드 RNA.
3. 스페이서, gRNA 코어 및 연장 아암을 포함하며, 여기서 연장 아암은 서열식별번호: 271029-406542로 이루어진 군으로부터 선택된 뉴클레오티드 서열 또는 서열식별번호: 271029-406542 중 어느 것과 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열을 갖는 연장 아암을 갖는 것인 가이드 RNA.
4. 스페이서, gRNA 코어 및 연장 아암을 포함하며, 여기서 연장 아암은 (i) 프라이머 결합 부위, (ii) 편집 주형 및 (iii) 상동성 아암을 포함하는 것인 가이드 RNA.
5. 스페이서, gRNA 코어 및 연장 아암을 포함하며, 여기서 연장 아암은 서열식별번호: 406543-542056으로 이루어진 군으로부터 선택된 뉴클레오티드 서열을 갖는 프라이머 결합 부위 또는 서열식별번호: 406543-542056 중 어느 것에 대해 적어도 90% 서열 동일한 뉴클레오티드 서열을 갖는 프라이머 결합 부위를 포함하는 것인 가이드 RNA.
6. 스페이서, gRNA 코어 및 연장 아암을 포함하며, 여기서 연장 아암은 서열식별번호: 542057-677570으로 이루어진 군으로부터 선택된 뉴클레오티드 서열을 포함하는 편집 주형 또는 서열식별번호: 542057-677570 중 어느 것에 대해 적어도 90% 동일한 뉴클레오티드 서열을 갖는 편집 주형을 포함하는 것인 가이드 RNA.
7. 스페이서, gRNA 코어 및 연장 아암을 포함하며, 여기서 연장 아암은 서열식별번호: 677571-813084로 이루어진 군으로부터 선택된 뉴클레오티드 서열을 갖는 상동성 아암 또는 서열식별번호: 677571-813084 중 어느 것에 대해 적어도 90% 동일한 뉴클레오티드 서열을 갖는 상동성 아암을 포함하는 것인 가이드 RNA.
8. (i) 서열식별번호: 135515-271028로 이루어진 군으로부터 선택된 뉴클레오티드 서열을 갖는 스페이서 또는 서열식별번호: 135515-271028 중 어느 것과 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열을 갖는 스페이서, 및
(ii) 서열식별번호: 271029-406542로 이루어진 군으로부터 선택된 연장 아암 또는 서열식별번호: 271029-406542와 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열을 갖는 연장 아암
을 포함하는 가이드 RNA.
9. (i) 서열식별번호: 135515-271028로 이루어진 군으로부터 선택된 뉴클레오티드 서열을 갖는 스페이서 또는 서열식별번호: 135515-271028 중 어느 것에 대해 적어도 90% 동일한 뉴클레오티드 서열을 갖는 스페이서, 및
(ii) 서열식별번호: 406543-542056으로 이루어진 군으로부터 선택된 프라이머 결합 부위 또는 서열식별번호: 406543-542056 중 어느 것에 대해 적어도 90% 동일한 뉴클레오티드 서열을 갖는 프라이머 결합 부위
를 포함하는 가이드 RNA.
10. (i) 서열식별번호: 135515-271028로 이루어진 군으로부터 선택된 뉴클레오티드 서열을 갖는 스페이서 또는 서열식별번호: 135515-271028 중 어느 것과 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열을 갖는 스페이서, 및
(ii) 서열식별번호: 542057-677570으로 이루어진 군으로부터 선택된 뉴클레오티드 서열을 갖는 편집 주형 또는 서열식별번호: 542057-677570 중 어느 것에 대해 적어도 90% 동일한 뉴클레오티드 서열을 갖는 편집 주형
을 포함하는 가이드 RNA.
11. (i) 서열식별번호: 135515-271028로 이루어진 군으로부터 선택된 뉴클레오티드 서열을 갖는 스페이서 또는 서열식별번호: 135515-271028 중 어느 것에 대해 적어도 90% 동일한 뉴클레오티드 서열을 갖는 스페이서, 및
(ii) 서열식별번호: 677571-813084로 이루어진 군으로부터 선택된 뉴클레오티드 서열을 갖는 상동성 아암 또는 서열식별번호: 677571-813084 중 어느 것에 대해 적어도 90% 동일한 뉴클레오티드 서열을 갖는 스페이서
를 포함하는 가이드 RNA.
12. 실시양태 1-11 중 어느 것에 있어서, 서열식별번호: 813086의 종결 신호 또는 서열식별번호: 813086과 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 종결 신호를 추가로 포함하는 가이드 RNA.
13. 실시양태 1-12 중 어느 것에 있어서, 헤어핀 서열, 스템/루프 서열 또는 토루프 서열을 포함하는 5' 단부 변형제 영역을 추가로 포함하는 가이드 RNA.
14. 실시양태 1-13 중 어느 것에 있어서, 헤어핀 서열, 스템/루프 서열 또는 토루프 서열을 포함하는 3' 단부 변형제 영역을 추가로 포함하는 가이드 RNA.
15. 실시양태 1-14 중 어느 것에 있어서, 서열식별번호: 813085를 포함하는 gRNA 코어 또는 서열식별번호: 813085와 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 gRNA 코어를 추가로 포함하는 가이드 RNA.
16. 실시양태 1-15 중 어느 것에 있어서, 프라임 편집에 적합한 napDNAbp에 결합할 수 있고 napDNAbp를 표적 DNA 서열로 지시할 수 있는 가이드 RNA.
17. 실시양태 16에 있어서, 표적 핵산 서열이 표적 가닥 (또는 PAM 가닥) 및 상보적 비-표적 가닥 (또는 비-PAM 가닥)을 포함하며, 여기서 가이드 RNA의 스페이서가 상보적 비-표적 가닥 (비-PAM 가닥)에 혼성화하여 RNA-DNA 하이브리드 및 R-루프를 형성하는 것인 가이드 RNA.
18. 실시양태 1-17 중 어느 것에 있어서, 프라이머 결합 부위가 대략 8 내지 대략 20개 뉴클레오티드 길이인 가이드 RNA.
19. 실시양태 1-18 중 어느 것에 있어서, 프라이머 결합 부위가 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 또는 20개 뉴클레오티드 길이인 가이드 RNA.
20. 상기 실시양태 중 어느 것에 있어서, 프라이머 결합 부위가 적어도 7개 뉴클레오티드, 적어도 8개 뉴클레오티드, 적어도 9개 뉴클레오티드, 적어도 10개 뉴클레오티드, 적어도 11개 뉴클레오티드, 적어도 12개 뉴클레오티드, 적어도 13개 뉴클레오티드, 적어도 14개 뉴클레오티드, 적어도 15개 뉴클레오티드, 적어도 16개 뉴클레오티드, 적어도 17개 뉴클레오티드, 적어도 18개 뉴클레오티드, 적어도 19개 뉴클레오티드 또는 적어도 20개 뉴클레오티드 길이인 가이드 RNA.
21. 실시양태 1-19 중 어느 것에 있어서, 상동성 아암이 표적 DNA의 가닥에 상보적인 가이드 RNA.
22. 실시양태 1-10 중 어느 것에 있어서, 연장 아암이 대략 7 내지 대략 500개 뉴클레오티드 길이인 가이드 RNA.
23. 상기 실시양태 중 어느 것에 있어서, 연장 아암이 적어도 7개 뉴클레오티드, 적어도 8개 뉴클레오티드, 적어도 9개 뉴클레오티드, 적어도 10개 뉴클레오티드, 적어도 11개 뉴클레오티드, 적어도 12개 뉴클레오티드, 적어도 13개 뉴클레오티드, 적어도 14개 뉴클레오티드, 적어도 15개 뉴클레오티드, 적어도 16개 뉴클레오티드, 적어도 17개 뉴클레오티드, 적어도 18개 뉴클레오티드, 적어도 19개 뉴클레오티드, 적어도 20개 뉴클레오티드, 적어도 21개 뉴클레오티드, 적어도 22개 뉴클레오티드, 적어도 23개 뉴클레오티드, 적어도 24개 뉴클레오티드, 적어도 25개 뉴클레오티드, 적어도 26개 뉴클레오티드, 적어도 27개 뉴클레오티드, 적어도 28개 뉴클레오티드, 적어도 29개 뉴클레오티드, 적어도 30개 뉴클레오티드, 적어도 31개 뉴클레오티드, 적어도 32개 뉴클레오티드, 적어도 33개 뉴클레오티드, 적어도 34개 뉴클레오티드, 적어도 35개 뉴클레오티드, 적어도 36개 뉴클레오티드, 적어도 37개 뉴클레오티드, 적어도 38개 뉴클레오티드, 적어도 39개 뉴클레오티드, 적어도 40개 뉴클레오티드 또는 적어도 100개 뉴클레오티드 길이인 가이드 RNA.
24. 상기 실시양태 중 어느 것에 있어서, 편집 주형이 적어도 1개 뉴클레오티드, 적어도 2개 뉴클레오티드, 적어도 3개 뉴클레오티드, 적어도 4개 뉴클레오티드, 적어도 5개 뉴클레오티드, 적어도 6개 뉴클레오티드, 적어도 7개 뉴클레오티드, 적어도 8개 뉴클레오티드, 적어도 9개 뉴클레오티드, 적어도 10개 뉴클레오티드, 적어도 11개 뉴클레오티드, 적어도 12개 뉴클레오티드, 적어도 13개 뉴클레오티드, 적어도 14개 뉴클레오티드, 적어도 15개 뉴클레오티드, 적어도 16개 뉴클레오티드, 적어도 17개 뉴클레오티드, 적어도 18개 뉴클레오티드, 적어도 19개 뉴클레오티드, 적어도 20개 뉴클레오티드, 적어도 21개 뉴클레오티드, 적어도 22개 뉴클레오티드, 적어도 23개 뉴클레오티드, 적어도 24개 뉴클레오티드, 적어도 25개 뉴클레오티드, 적어도 26개 뉴클레오티드, 적어도 27개 뉴클레오티드, 적어도 28개 뉴클레오티드, 적어도 29개 뉴클레오티드, 적어도 30개 뉴클레오티드, 적어도 31개 뉴클레오티드, 적어도 32개 뉴클레오티드, 적어도 33개 뉴클레오티드, 적어도 34개 뉴클레오티드, 적어도 35개 뉴클레오티드, 적어도 36개 뉴클레오티드, 적어도 37개 뉴클레오티드, 적어도 38개 뉴클레오티드, 적어도 39개 뉴클레오티드, 적어도 40개 뉴클레오티드 또는 적어도 100개 뉴클레오티드 길이인 가이드 RNA.
25. 상기 실시양태 중 어느 것에 있어서, 상동성 아암이 적어도 1개 뉴클레오티드, 적어도 2개 뉴클레오티드, 적어도 3개 뉴클레오티드, 적어도 4개 뉴클레오티드, 적어도 5개 뉴클레오티드, 적어도 6개 뉴클레오티드, 적어도 7개 뉴클레오티드, 적어도 8개 뉴클레오티드, 적어도 9개 뉴클레오티드, 적어도 10개 뉴클레오티드, 적어도 11개 뉴클레오티드, 적어도 12개 뉴클레오티드, 적어도 13개 뉴클레오티드, 적어도 14개 뉴클레오티드, 적어도 15개 뉴클레오티드, 적어도 16개 뉴클레오티드, 적어도 17개 뉴클레오티드, 적어도 18개 뉴클레오티드, 적어도 19개 뉴클레오티드, 적어도 20개 뉴클레오티드, 적어도 21개 뉴클레오티드, 적어도 22개 뉴클레오티드, 적어도 23개 뉴클레오티드, 적어도 24개 뉴클레오티드, 적어도 25개 뉴클레오티드, 적어도 26개 뉴클레오티드, 적어도 27개 뉴클레오티드, 적어도 28개 뉴클레오티드, 적어도 29개 뉴클레오티드 또는 적어도 30개 뉴클레오티드인 가이드 RNA.
26. 상기 실시양태 중 어느 것에 있어서, 편집 주형 및 상동성 아암이 3' 단부를 갖는 상응하는 단일 가닥 DNA 플랩의 합성을 위한 주형 서열로서 리버스 트랜스크립타제에 의해 사용될 수 있으며, 여기서 DNA 플랩은 닉 부위에 인접한 내인성 표적 DNA 서열의 가닥에 상보적이고, 단일 가닥 DNA 플랩은 편집 주형에 의해 코딩된 뉴클레오티드 변화를 포함하는 것인 가이드 RNA.
27. 실시양태 25에 있어서, 단일 가닥 DNA 플랩이 닉킹된 표적 DNA 서열에서 5' 단부를 갖는 내인성 단일 가닥 DNA를 대체하는 것인 가이드 RNA.
28. 실시양태 26에 있어서, 유리 5' 단부를 갖는 내인성 단일 가닥 DNA가 세포에 의해 절제되는 것인 가이드 RNA.
29. 실시양태 27에 있어서, 단일 가닥 DNA 플랩의 세포 복구가 뉴클레오티드 변화의 설치를 유발함으로써, 목적하는 생성물을 형성하는 것인 가이드 RNA.
30. 실시양태 28에 있어서, 목적하는 뉴클레오티드 변화가 삽입인 가이드 RNA.
31. 실시양태 29에 있어서, 삽입이 적어도 1개 뉴클레오티드, 적어도 2개 뉴클레오티드, 적어도 3개 뉴클레오티드, 적어도 4개 뉴클레오티드, 적어도 5개 뉴클레오티드, 적어도 6개 뉴클레오티드, 적어도 7개 뉴클레오티드, 적어도 8개 뉴클레오티드, 적어도 9개 뉴클레오티드, 적어도 10개 뉴클레오티드, 적어도 11개 뉴클레오티드, 적어도 12개 뉴클레오티드, 적어도 13개 뉴클레오티드, 적어도 14개 뉴클레오티드, 적어도 15개 뉴클레오티드, 적어도 16개 뉴클레오티드, 적어도 17개 뉴클레오티드, 적어도 18개 뉴클레오티드, 적어도 19개 뉴클레오티드, 적어도 20개 뉴클레오티드, 적어도 21개 뉴클레오티드, 적어도 22개 뉴클레오티드, 적어도 23개 뉴클레오티드, 적어도 24개 뉴클레오티드, 적어도 25개 뉴클레오티드, 적어도 26개 뉴클레오티드, 적어도 27개 뉴클레오티드, 적어도 28개 뉴클레오티드, 적어도 29개 뉴클레오티드, 적어도 30개 뉴클레오티드, 적어도 31개 뉴클레오티드, 적어도 32개 뉴클레오티드, 적어도 33개 뉴클레오티드, 적어도 34개 뉴클레오티드, 적어도 35개 뉴클레오티드, 적어도 36개 뉴클레오티드, 적어도 37개 뉴클레오티드, 적어도 38개 뉴클레오티드, 적어도 39개 뉴클레오티드, 적어도 40개 뉴클레오티드 또는 적어도 100개 뉴클레오티드 길이인 가이드 RNA.
32. 실시양태 29에 있어서, 삽입이 폴리펩티드를 코딩하는 서열인 가이드 RNA.
33. napDNAbp, 리버스 트랜스크립타제 및 실시양태 1-32 중 어느 하나의 가이드 RNA를 포함하는 프라임 편집 복합체.
34. 실시양태 32에 있어서, napDNAbp 및 리버스 트랜스크립타제가 융합 단백질로서 형성된 것인 프라임 편집 복합체.
35. 실시양태 32에 있어서, napDNAbp가 Cas9인 프라임 편집 복합체.
36. 실시양태 34에 있어서, Cas9가 Cas9 닉카제 또는 그의 변이체로 이루어진 군으로부터 선택된 것인 프라임 편집 복합체.
37. 실시양태 34에 있어서, Cas9가 서열식별번호: 1-135514로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 갖는 것인 프라임 편집 복합체.
38. 실시양태 33에 있어서, 융합 단백질이 서열식별번호: 1-135514로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 갖는 것인 프라임 편집 복합체.
39. 실시양태 33에 있어서, 융합 단백질이 napDNAbp와 리버스 트랜스크립타제를 연결하는 링커를 포함하는 것인 프라임 편집 복합체.
40. 실시양태 38에 있어서, 링커가 서열식별번호: 1-135514로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 갖는 것인 프라임 편집 복합체.
41. 실시양태 32-39 중 어느 것의 프라임 편집 복합체를 코딩하는 1개 이상의 폴리뉴클레오티드.
42. 실시양태 41의 폴리뉴클레오티드 및 프라임 편집 복합체의 가이드 RNA 및 융합 단백질의 발현을 구동하는 1개 이상의 프로모터를 포함하는 벡터.
43. 실시양태 41의 벡터를 포함하는 세포.
44. 실시양태 32-39 중 어느 것의 프라임 편집 복합체를 포함하는 세포.
45. (i) 실시양태 1-31 중 어느 것의 가이드 RNA, 실시양태 32-39의 프라임 편집 복합체, 실시양태 40의 폴리뉴클레오티드 또는 실시양태 41의 벡터; 및 (ii) 제약상 허용되는 부형제를 포함하는 제약 조성물.
46. 핵산 서열을 실시양태 1-31 중 어느 것 또는 실시양태 83-85 중 어느 것의 가이드 RNA 및 융합 단백질을 포함하는 복합체와 접촉시키는 단계이며, 여기서 융합 단백질은 napDNAbp 및 폴리머라제를 포함하고, 여기서 가이드 RNA는 스페이서, gRNA 코어 및 뉴클레오티드 변화를 코딩하는 편집 주형을 포함하는 연장 아암을 포함하는 것인 단계; 이로써
(i) 이중 가닥 DNA 서열을 표적 가닥 (또는 PAM 가닥) 상에서 닉킹하고, 3' 단부를 갖는 유리 단일 가닥 DNA를 생성하는 단계;
(ii) 유리 단일 가닥 DNA의 3' 단부를 가이드 RNA의 프라이머 결합 부위에 혼성화시킴으로써, 폴리머라제를 프라이밍하는 단계;
(iii) 3' 단부로부터 DNA의 가닥을 중합시킴으로써, 뉴클레오티드 변화를 포함하는 단일 가닥 DNA 플랩을 생성하는 단계; 및
(iv) 표적 가닥 (또는 PAM 가닥) 상의 절단 부위의 하류에 바로 인접한 내인성 DNA 가닥을 단일 가닥 DNA 플랩으로 대체함으로써, 이중 가닥 DNA 서열에 목적하는 뉴클레오티드 변화를 설치하는 단계
를 포함하는, 핵산 서열에 뉴클레오티드 변화를 설치하는 방법.
47. 실시양태 46에 있어서, 뉴클레오티드 변화가 단일 뉴클레오티드 치환, 결실, 삽입 또는 그의 조합인 방법.
48. 실시양태 46에 있어서, 단일 뉴클레오티드 치환이 전이 또는 전환인 방법.
49. 실시양태 46에 있어서, 뉴클레오티드 변화가 (1) G에서 T로의 치환, (2) G에서 A로의 치환, (3) G에서 C로의 치환, (4) T에서 G로의 치환, (5) T에서 A로의 치환, (6) T에서 C로의 치환, (7) C에서 G로의 치환, (8) C에서 T로의 치환, (9) C에서 A로의 치환, (10) A에서 T로의 치환, (11) A에서 G로의 치환 또는 (12) A에서 C로의 치환인 방법.
50. 실시양태 46에 있어서, 뉴클레오티드 변화가 (1) G:C 염기쌍을 T:A 염기쌍으로, (2) G:C 염기쌍을 A:T 염기쌍으로, (3) G:C 염기쌍을 C:G 염기쌍으로, (4) T:A 염기쌍을 G:C 염기쌍으로, (5) T:A 염기쌍을 A:T 염기쌍으로, (6) T:A 염기쌍을 C:G 염기쌍으로, (7) C:G 염기쌍을 G:C 염기쌍으로, (8) C:G 염기쌍을 T:A 염기쌍으로, (9) C:G 염기쌍을 A:T 염기쌍으로, (10) A:T 염기쌍을 T:A 염기쌍으로, (11) A:T 염기쌍을 G:C 염기쌍으로 또는 (12) A:T 염기쌍을 C:G 염기쌍으로 전환시키는 것인 방법.
51. 실시양태 46에 있어서, 뉴클레오티드 변화가 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 또는 25개 뉴클레오티드의 삽입 또는 결실인 방법.
52. 실시양태 46에 있어서, 뉴클레오티드 변화가 폴리펩티드-코딩 서열의 삽입인 방법.
53. 실시양태 46에 있어서, 뉴클레오티드 변화가 질환-연관 유전자를 교정하는 것인 방법.
54. 실시양태 46에 있어서, 질환-연관 유전자가 아데노신 데아미나제 (ADA) 결핍; 알파-1 항트립신 결핍; 낭성 섬유증; 뒤시엔느 근육 이영양증; 갈락토스혈증; 혈색소증; 헌팅톤병; 메이플 시럽뇨 질환; 마르팡 증후군; 제1형 신경섬유종증; 선천성 손발톱비대증; 페닐케톤뇨; 중증 복합 면역결핍; 겸상 적혈구 질환; 스미스-렘리-오피츠 증후군; 및 테이-삭스병으로 이루어진 군으로부터 선택된 단일유전자 장애와 연관된 것인 방법.
55. 실시양태 46에 있어서, 질환-연관 유전자가 심장 질환; 고혈압; 알츠하이머병; 관절염; 당뇨병; 암; 및 비만으로 이루어진 군으로부터 선택된 다유전자 장애와 연관된 것인 방법.
56. 적어도 1개의 컴퓨터 하드웨어 프로세서를 사용하여 하기 단계를 수행하는 것을 포함하는, 프라임 편집제 가이드 RNA (PEgRNA) 구조를 결정하기 위한 컴퓨터화 방법:
투입 대립유전자;
산출 대립유전자; 및
핵산 프로그램가능한 DNA 결합 단백질 및 폴리머라제 (예를 들어, 리버스 트랜스크립타제)를 포함하는 융합 단백질
을 나타내는 데이터에 액세스하는 단계; 및
투입 대립유전자, 산출 대립유전자 및 융합 단백질에 기초하여 PEgRNA 구조를 결정하는 단계이며, 여기서 PEgRNA 구조는 투입 대립유전자를 산출 대립유전자로 변화시키기 위해 융합 단백질과 회합되도록 설계되고, 이 단계는 PEgRNA 구조에 대해 하기 특색:
투입 대립유전자 내의 표적 뉴클레오티드 서열에 상보적인 스페이서;
융합 단백질과 상호작용하기 위한 gRNA 백본; 및
투입 대립유전자를 산출 대립유전자로 변화시키기 위한 목적하는 뉴클레오티드 변화를 포함하는 DNA 합성 주형 서열;
프라이머 결합 부위;
임의로, DNA 합성 주형에 인접한 종결 신호;
임의로, 종결 신호에 인접한 제1 변형제; 및
임의로, 프라이머 결합 부위에 인접한 제2 변형제
중 하나 이상을 포함하는 연장부
중 하나 이상을 결정하는 것을 포함하는 것인 단계.
57. 실시양태 56에 있어서, 스페이서 및 연장부를 결정하는 단계 및 스페이서가 PEgRNA 구조의 5' 단부에 있고 연장부가 PEgRNA 구조의 3' 단부에 있는 것으로 결정하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
58. 실시양태 56에 있어서, 스페이서 및 연장부를 결정하는 단계를 추가로 포함하며, 여기서 스페이서는 PEgRNA 구조의 5' 단부에 있고 연장부는 스페이서에 대해 3'인 방법.
59. 실시양태 56에 있어서, 투입 대립유전자 및 산출 대립유전자를 나타내는 데이터에 액세스하는 단계가 투입 대립유전자 및 연관된 산출 대립유전자의 세트를 포함하는 데이터베이스에 액세스하는 것을 포함하는 것인 방법.
60. 실시양태 59에 있어서, 데이터베이스에 액세스하는 단계가 복수의 엔트리를 포함하는 클린바 데이터베이스에 액세스하는 것을 포함하며, 여기서 각각의 엔트리는 투입 대립유전자의 세트로부터의 투입 대립유전자 및 산출 대립유전자의 세트로부터의 산출 대립유전자를 포함하는 것인 방법.
61. 실시양태 59에 있어서, PEgRNA 구조를 결정하는 단계가 세트 내의 각각의 투입 대립유전자 및 연관된 산출 대립유전자에 대한 1개 이상의 PEgRNA 구조를 결정하는 것을 포함하는 것인 방법.
62. 실시양태 56에 있어서, 융합 단백질을 나타내는 데이터에 액세스하는 단계가 복수의 융합 단백질로부터 융합 단백질을 결정하는 것을 포함하는 것인 방법.
63. 실시양태 56에 있어서, 융합 단백질이 Cas9 단백질을 포함하는 것인 방법.
64. 실시양태 63에 있어서, 융합 단백질이 Cas9-NG 단백질 또는 SpCas9 단백질을 포함하는 것인 방법.
65. 실시양태 56에 있어서, 투입 대립유전자를 산출 대립유전자로 변화시키는 것이 단일 뉴클레오티드 변화, 1개 이상의 뉴클레오티드의 삽입, 1개 이상의 뉴클레오티드의 결실 또는 그의 조합을 포함하는 것인 방법.
66. 실시양태 56에 있어서, 스페이서를 결정하는 것을 추가로 포함하며, 여기서 스페이서는 대략 20개 뉴클레오티드의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 것인 방법.
67. 실시양태 66에 있어서, 상응하는 프로토스페이서 뉴클레오티드 서열 내의 변화의 위치에 기초하여 스페이서를 결정하는 것을 추가로 포함하는 방법.
68. 실시양태 67에 있어서, 변화가 약 프로토스페이서 위치 -3 내지 프로토스페이서 위치 +27인 편집 윈도우에 설치되는 것인 방법.
69. 실시양태 67에 있어서,
투입 대립유전자 및 융합 단백질에 기초하여 초기 후보 프로토스페이서의 세트를 결정하는 단계이며, 여기서 각각의 초기 후보 프로토스페이서는 투입 대립유전자 내의 융합 단백질의 PAM을 포함하는 것인 단계;
초기 후보 프로토스페이서의 세트로부터 1개 이상의 초기 후보 프로토스페이서를 결정하는 단계이며, 여기서 각각은 비상용성 닉 위치를 포함하는 것인 단계;
결정된 1개 이상의 초기 후보 프로토스페이서를 세트로부터 제거하여 나머지 후보 프로토스페이서의 세트를 생성하는 단계
를 추가로 포함하며;
여기서 PEgRNA 구조를 결정하는 단계는 복수의 PEgRNA 구조를 결정하는 것을 포함하고, 여기서 각각의 PEgRNA 구조는 나머지 후보 프로토스페이서의 세트로부터의 상응하는 프로토스페이서에 기초하여 결정된 상이한 스페이서를 포함하는 것인 방법.
70. 실시양태 55에 있어서, 연장부 및 DNA 합성 주형 (예를 들어, RT 주형 서열)을 결정하는 단계를 추가로 포함하며, 여기서 DNA 합성 주형 (예를 들어, RT 주형 서열)은 대략 7개 뉴클레오티드 내지 대략 34개 뉴클레오티드를 포함하는 것인 방법.
71. 실시양태 56에 있어서, PEgRNA를 결정하는 단계가
투입 대립유전자 및/또는 융합 단백질에 기초하여 스페이서를 결정하는 것; 및
스페이서에 기초하여 DNA 합성 주형 (예를 들어, RT 주형 서열)을 결정하는 것을 포함하는 것인 방법.
72. 실시양태 56에 있어서, DNA 합성 주형 (예를 들어, RT 주형 서열)이 닉 부위에 인접한 내인성 DNA 서열에 상보적인 단일 가닥 DNA 플랩을 코딩하며, 여기서 단일 가닥 DNA 플랩은 목적하는 뉴클레오티드 변화를 포함하는 것인 방법.
73. 실시양태 72에 있어서, 단일 가닥 DNA 플랩이 닉 부위에 인접한 내인성 DNA 서열에 혼성화함으로써, 목적하는 뉴클레오티드 변화의 설치를 유도할 수 있는 것인 방법.
74. 실시양태 72에 있어서, 단일 가닥 DNA 플랩이 닉 부위에 인접한 내인성 DNA 서열을 대체할 수 있는 것인 방법.
75. 실시양태 72에 있어서, 단일 가닥 DNA 플랩의 세포 복구가 목적하는 뉴클레오티드 변화의 설치를 유발함으로써, 목적하는 생성물을 형성하는 것인 방법.
76. 실시양태 56에 있어서, 융합 단백질이 PEgRNA와 복합체화된 경우에 표적 DNA 서열에 결합할 수 있는 것인 방법.
77. 실시양태 76에 있어서, 표적 DNA 서열이 변화가 발생하는 표적 가닥 및 상보적 비-표적 가닥을 포함하는 것인 방법.
78. 실시양태 56에 있어서, 투입 대립유전자가 병원성 DNA 돌연변이를 포함하고, 산출 대립유전자가 교정된 DNA 서열을 포함하는 것인 방법.
79. 실시양태 56에 있어서, 투입 대립유전자가 서열식별번호: 1217353-1289387의 질환 대립유전자 중 어느 하나인 방법.
80. 실시양태 56에 있어서, 산출 대립유전자가 서열식별번호: 1289388-1361420의 건강한 대립유전자 중 어느 하나인 방법.
81. 적어도 1개의 프로세서; 및
실행되는 경우에 적어도 1개의 프로세서로 하여금 실시양태 56-81 중 어느 것의 방법을 수행하도록 하는 명령이 코딩된 적어도 1개의 컴퓨터-판독가능 저장 매체
를 포함하는 시스템.
82. 실행되는 경우에 적어도 1개의 프로세서로 하여금 실시양태 56-81 중 어느 것의 방법을 수행하도록 하는 명령이 코딩된 적어도 1개의 컴퓨터-판독가능 저장 매체.
83. 실시양태 56-81 중 어느 것의 방법에 따라 결정된 PEgRNA 구조를 사용하는 염기 편집 방법.
84. 실시양태 56-81 중 어느 하나의 방법에 따라 결정된 PEgRNA.
85. 스페이서, gRNA 코어 및 연장 아암을 포함하며, 여기서 스페이서는 서열식별번호: 1217353-1289387 또는 그의 상보체 가닥 내의 ~20개 뉴클레오티드 영역에 결합할 수 있는 것인, 표적 DNA 서열에서 질환 대립유전자를 교정하여 건강한 대립유전자를 형성하는 프라임 편집에 사용하기 위한 가이드 RNA.
86. 스페이서, gRNA 코어 및 연장 아암을 포함하며, 여기서 연장 아암은 DNA 합성 주형 및 프라임 편집을 수행하는데 효과적인 프라이머 결합 부위를 포함하는 것인 가이드 RNA.
87. 실시양태 85에 있어서, 서열식별번호: 1217353-1289387의 뉴클레오티드 서열 중 어느 것에서의 편집 부위가 5'에서 3' 배향으로 위치 201에서 시작하는 것인 가이드 RNA.
88. 스페이서, gRNA 코어 및 연장 아암을 포함하며, 여기서 연장 아암은 프라이머 결합 부위 및 DNA 합성 주형을 포함하는 것인, 프라임 편집을 위한 가이드 RNA.
89. 실시양태 88에 있어서, 프라이머 결합 부위가 서열식별번호: 406543-542056 (프라이머 결합 부위)으로 이루어진 군으로부터 선택된 뉴클레오티드 서열 또는 서열식별번호: 406543-542056 중 어느 것과 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열을 갖는 것인 가이드 RNA.
90. 실시양태 88에 있어서, DNA 합성 주형이 서열식별번호: 542057-677570 (편집 주형)의 뉴클레오티드 서열 또는 서열식별번호: 542057-677570 중 어느 것과 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 것인 가이드 RNA.
91. 실시양태 88에 있어서, DNA 합성 주형이 서열식별번호: 677571-813084 (상동성 아암)의 뉴클레오티드 서열 또는 서열식별번호: 677571-813084 중 어느 것과 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 것인 가이드 RNA.
92. 실시양태 88에 있어서, DNA 합성 주형이 편집 주형 및 상동성 아암을 포함하며, 여기서 편집 주형은 서열식별번호: 542057-677570의 뉴클레오티드 서열을 포함하고, 상동성 아암은 서열식별번호: 677571-813084의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 것인 가이드 RNA.
93. 실시양태 86-92 중 어느 것에 있어서, 서열식별번호: 813086의 종결 신호 또는 서열식별번호: 813086과 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 종결 신호를 추가로 포함하는 가이드 RNA.
94. 실시양태 86-93 중 어느 것에 있어서, 헤어핀 서열, 스템/루프 서열 또는 토루프 서열을 포함하는 5' 단부 변형제 영역을 추가로 포함하는 가이드 RNA.
95. 실시양태 86-94 중 어느 것에 있어서, 헤어핀 서열, 스템/루프 서열 또는 토루프 서열을 포함하는 3' 단부 변형제 영역을 추가로 포함하는 가이드 RNA.
96. 실시양태 86-95 중 어느 것에 있어서, 서열식별번호: 813085를 포함하는 gRNA 코어 또는 서열식별번호: 813085와 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 gRNA 코어를 추가로 포함하는 가이드 RNA.
97. 실시양태 86-96 중 어느 것에 있어서, 프라임 편집에 적합한 napDNAbp에 결합할 수 있고 napDNAbp를 표적 DNA 서열로 지시할 수 있는 가이드 RNA.
98. 실시양태 97에 있어서, 표적 핵산 서열이 표적 가닥 (또는 PAM 또는 편집 가닥) 및 상보적 비-표적 가닥 (또는 비-PAM 또는 비-편집 가닥)을 포함하며, 여기서 가이드 RNA의 스페이서가 비-PAM 가닥에 혼성화하여 RNA-DNA 하이브리드 및 R-루프를 형성하는 것인 가이드 RNA.
99. 실시양태 86-98 중 어느 것에 있어서, 프라이머 결합 부위가 대략 8 내지 대략 20개 뉴클레오티드 길이인 가이드 RNA.
100. 실시양태 86-99 중 어느 것에 있어서, 프라이머 결합 부위가 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 또는 20개 뉴클레오티드 길이인 가이드 RNA.
101. 실시양태 86-100 중 어느 것에 있어서, 연장 아암이 적어도 7개 뉴클레오티드, 적어도 8개 뉴클레오티드, 적어도 9개 뉴클레오티드, 적어도 10개 뉴클레오티드, 적어도 11개 뉴클레오티드, 적어도 12개 뉴클레오티드, 적어도 13개 뉴클레오티드, 적어도 14개 뉴클레오티드, 적어도 15개 뉴클레오티드, 적어도 16개 뉴클레오티드, 적어도 17개 뉴클레오티드, 적어도 18개 뉴클레오티드, 적어도 19개 뉴클레오티드, 적어도 20개 뉴클레오티드, 적어도 21개 뉴클레오티드, 적어도 22개 뉴클레오티드, 적어도 23개 뉴클레오티드, 적어도 24개 뉴클레오티드, 적어도 25개 뉴클레오티드, 적어도 26개 뉴클레오티드, 적어도 27개 뉴클레오티드, 적어도 28개 뉴클레오티드, 적어도 29개 뉴클레오티드, 적어도 30개 뉴클레오티드, 적어도 31개 뉴클레오티드, 적어도 32개 뉴클레오티드, 적어도 33개 뉴클레오티드, 적어도 34개 뉴클레오티드, 적어도 35개 뉴클레오티드, 적어도 36개 뉴클레오티드, 적어도 37개 뉴클레오티드, 적어도 38개 뉴클레오티드, 적어도 39개 뉴클레오티드, 적어도 40개 뉴클레오티드, 적어도 100개 뉴클레오티드 길이인 가이드 RNA.
102. 실시양태 86-101 중 어느 것에 있어서, 프라이머 결합 부위가 적어도 7개 뉴클레오티드, 적어도 8개 뉴클레오티드, 적어도 9개 뉴클레오티드, 적어도 10개 뉴클레오티드, 적어도 11개 뉴클레오티드, 적어도 12개 뉴클레오티드, 적어도 13개 뉴클레오티드, 적어도 14개 뉴클레오티드, 적어도 15개 뉴클레오티드, 적어도 16개 뉴클레오티드, 적어도 17개 뉴클레오티드, 적어도 18개 뉴클레오티드, 적어도 19개 뉴클레오티드 또는 적어도 20개 뉴클레오티드 길이인 가이드 RNA.
103. 실시양태 86-102 중 어느 것에 있어서, DNA 합성 주형이 적어도 1개 뉴클레오티드, 적어도 2개 뉴클레오티드, 적어도 3개 뉴클레오티드, 적어도 4개 뉴클레오티드, 적어도 5개 뉴클레오티드, 적어도 6개 뉴클레오티드, 적어도 7개 뉴클레오티드, 적어도 8개 뉴클레오티드, 적어도 9개 뉴클레오티드, 적어도 10개 뉴클레오티드, 적어도 11개 뉴클레오티드, 적어도 12개 뉴클레오티드, 적어도 13개 뉴클레오티드, 적어도 14개 뉴클레오티드, 적어도 15개 뉴클레오티드, 적어도 16개 뉴클레오티드, 적어도 17개 뉴클레오티드, 적어도 18개 뉴클레오티드, 적어도 19개 뉴클레오티드, 적어도 20개 뉴클레오티드, 적어도 21개 뉴클레오티드, 적어도 22개 뉴클레오티드, 적어도 23개 뉴클레오티드, 적어도 24개 뉴클레오티드, 적어도 25개 뉴클레오티드, 적어도 26개 뉴클레오티드, 적어도 27개 뉴클레오티드, 적어도 28개 뉴클레오티드, 적어도 29개 뉴클레오티드, 적어도 30개 뉴클레오티드, 적어도 31개 뉴클레오티드, 적어도 32개 뉴클레오티드, 적어도 33개 뉴클레오티드, 적어도 34개 뉴클레오티드, 적어도 35개 뉴클레오티드, 적어도 36개 뉴클레오티드, 적어도 37개 뉴클레오티드, 적어도 38개 뉴클레오티드, 적어도 39개 뉴클레오티드, 적어도 40개 뉴클레오티드, 적어도 100개 뉴클레오티드 길이인 가이드 RNA.
104. 실시양태 86-103 중 어느 것에 있어서, DNA 합성 주형이 3' 단부를 갖는 상응하는 단일 가닥 DNA 플랩의 합성을 위한 주형으로서 RNA-의존성 DNA 폴리머라제 (예를 들어, 리버스 트랜스크립타제)에 의해 사용될 수 있으며, 여기서 DNA 플랩은 닉 부위에 인접한 내인성 표적 DNA 서열의 가닥에 상보적이고, 단일 가닥 DNA 플랩은 DNA 합성 주형에 의해 코딩된 목적하는 뉴클레오티드 변화를 포함하는 것인 가이드 RNA.
105. 실시양태 104에 있어서, 단일 가닥 DNA 플랩이 닉킹된 표적 DNA 서열에서 5' 단부를 갖는 내인성 단일 가닥 DNA를 대체하는 것인 가이드 RNA.
106. 실시양태 105에 있어서, 유리 5' 단부를 갖는 내인성 단일 가닥 DNA가 세포에 의해 절제되는 것인 가이드 RNA.
107. 실시양태 105에 있어서, 단일 가닥 DNA 플랩의 세포 복구가 뉴클레오티드 변화의 설치를 유발함으로써, 편집된 DNA 생성물을 형성하는 것인 가이드 RNA.
108. 실시양태 107에 있어서, 뉴클레오티드 변화가 삽입인 가이드 RNA.
109. 실시양태 108에 있어서, 삽입이 적어도 1개 뉴클레오티드, 적어도 2개 뉴클레오티드, 적어도 3개 뉴클레오티드, 적어도 4개 뉴클레오티드, 적어도 5개 뉴클레오티드, 적어도 6개 뉴클레오티드, 적어도 7개 뉴클레오티드, 적어도 8개 뉴클레오티드, 적어도 9개 뉴클레오티드, 적어도 10개 뉴클레오티드, 적어도 11개 뉴클레오티드, 적어도 12개 뉴클레오티드, 적어도 13개 뉴클레오티드, 적어도 14개 뉴클레오티드, 적어도 15개 뉴클레오티드, 적어도 16개 뉴클레오티드, 적어도 17개 뉴클레오티드, 적어도 18개 뉴클레오티드, 적어도 19개 뉴클레오티드, 적어도 20개 뉴클레오티드, 적어도 21개 뉴클레오티드, 적어도 22개 뉴클레오티드, 적어도 23개 뉴클레오티드, 적어도 24개 뉴클레오티드, 적어도 25개 뉴클레오티드, 적어도 26개 뉴클레오티드, 적어도 27개 뉴클레오티드, 적어도 28개 뉴클레오티드, 적어도 29개 뉴클레오티드, 적어도 30개 뉴클레오티드, 적어도 31개 뉴클레오티드, 적어도 32개 뉴클레오티드, 적어도 33개 뉴클레오티드, 적어도 34개 뉴클레오티드, 적어도 35개 뉴클레오티드, 적어도 36개 뉴클레오티드, 적어도 37개 뉴클레오티드, 적어도 38개 뉴클레오티드, 적어도 39개 뉴클레오티드, 적어도 40개 뉴클레오티드, 적어도 100개 뉴클레오티드 길이인 가이드 RNA.
110. 실시양태 108에 있어서, 삽입이 폴리펩티드를 코딩하는 서열인 가이드 RNA.
111. napDNAbp, RNA-의존성 DNA 폴리머라제 및 실시양태 86-110 중 어느 하나의 가이드 RNA를 포함하는 프라임 편집 복합체.
112. 실시양태 111에 있어서, napDNAbp 및 RNA-의존성 DNA 폴리머라제가 융합 단백질로서 형성된 것인 프라임 편집 복합체.
113. 실시양태 111에 있어서, napDNAbp가 Cas9인 프라임 편집 복합체.
114. 실시양태 113에 있어서, Cas9가 Cas9 닉카제 또는 그의 변이체인 프라임 편집 복합체.
115. 실시양태 113에 있어서, Cas9가 서열식별번호: 1-135514로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 갖는 것인 프라임 편집 복합체.
116. 실시양태 112에 있어서, 융합 단백질이 서열식별번호: 1-135514로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 갖는 것인 프라임 편집 복합체.
117. 실시양태 112에 있어서, 융합 단백질이 napDNAbp와 RNA-의존성 DNA 폴리머라제를 연결하는 링커를 포함하는 것인 프라임 편집 복합체.
118. 실시양태 117에 있어서, 링커가 서열식별번호: 1-135514로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 갖는 것인 프라임 편집 복합체.
119. 실시양태 111-118 중 어느 것의 프라임 편집 복합체를 코딩하는 1개 이상의 폴리뉴클레오티드.
120. 실시양태 119의 폴리뉴클레오티드 및 프라임 편집 복합체의 가이드 RNA 및 융합 단백질의 발현을 구동하는 1개 이상의 프로모터를 포함하는 벡터.
121. 실시양태 120의 벡터를 포함하는 세포.
122. 실시양태 111-118 중 어느 것의 프라임 편집 복합체를 포함하는 세포.
123. (i) 실시양태 84-110 중 어느 것의 가이드 RNA, 실시양태 111-118의 프라임 편집 복합체, 실시양태 119의 폴리뉴클레오티드 또는 실시양태 120의 벡터; 및 (ii) 제약상 허용되는 부형제를 포함하는 제약 조성물.
124. 핵산 서열을 실시양태 109-116 중 어느 것의 가이드 RNA 및 융합 단백질을 포함하는 복합체와 접촉시키는 단계이며, 여기서 융합 단백질은 napDNAbp 및 RNA-의존성 DNA 폴리머라제를 포함하고, 여기서 가이드 RNA는 스페이서, gRNA 코어, 및 DNA 합성 주형 및 프라이머 결합 부위를 포함하는 연장 아암을 포함하고, 상기 DNA 합성 주형은 뉴클레오티드 변화를 코딩하고, 여기서 스페이서는 이용가능한 PAM 및 프로토스페이서에 근접한 비-PAM 가닥에 어닐링할 수 있는 것인 단계; 이로써
(i) 이중 가닥 DNA 서열을 PAM 가닥 상에서 닉킹함으로써, 3' 단부를 갖는 유리 단일 가닥 DNA를 생성하는 단계;
(ii) 유리 단일 가닥 DNA의 3' 단부를 가이드 RNA의 프라이머 결합 부위에 혼성화시킴으로써, RNA-의존성 DNA 폴리머라제를 프라이밍하는 단계;
(iii) DNA 합성 주형으로부터 코딩되도록 DNA의 3' 단부로부터 DNA 가닥을 중합시킴으로써, DNA의 3' 단부로부터 연장된 단일 가닥 DNA 플랩을 생성하는 단계이며, 여기서 플랩은 뉴클레오티드 변화를 포함하는 것인 단계;
(iv) PAM 가닥 상의 절단 부위의 하류에 바로 인접한 내인성 DNA 가닥을 단일 가닥 DNA 플랩으로 대체함으로써, 이중 가닥 DNA 서열에 뉴클레오티드 변화를 설치하는 단계
를 포함하는, 핵산 서열에 뉴클레오티드 변화를 설치하는 방법.
125. 실시양태 124에 있어서, 단계 (v)가 세포 내에서 완료되는 경우에, 세포가 세포 DNA 복구 및/또는 복제를 통해 비-편집된 가닥을 복구하는 것인 방법.
126. 실시양태 124에 있어서, 뉴클레오티드 변화가 단일 뉴클레오티드 치환, 결실, 삽입 또는 그의 조합인 방법.
127. 실시양태 124에 있어서, 단일 뉴클레오티드 치환이 전이 또는 전환인 방법.
128. 실시양태 124에 있어서, 단일 뉴클레오티드 치환이 (1) G에서 T로의 치환, (2) G에서 A로의 치환, (3) G에서 C로의 치환, (4) T에서 G로의 치환, (5) T에서 A로의 치환, (6) T에서 C로의 치환, (7) C에서 G로의 치환, (8) C에서 T로의 치환, (9) C에서 A로의 치환, (10) A에서 T로의 치환, (11) A에서 G로의 치환 또는 (12) A에서 C로의 치환인 방법.
129. 실시양태 124에 있어서, 단일 뉴클레오티드 치환이 (1) G:C 염기쌍을 T:A 염기쌍으로, (2) G:C 염기쌍을 A:T 염기쌍으로, (3) G:C 염기쌍을 C:G 염기쌍으로, (4) T:A 염기쌍을 G:C 염기쌍으로, (5) T:A 염기쌍을 A:T 염기쌍으로, (6) T:A 염기쌍을 C:G 염기쌍으로, (7) C:G 염기쌍을 G:C 염기쌍으로, (8) C:G 염기쌍을 T:A 염기쌍으로, (9) C:G 염기쌍을 A:T 염기쌍으로, (10) A:T 염기쌍을 T:A 염기쌍으로, (11) A:T 염기쌍을 G:C 염기쌍으로 또는 (12) A:T 염기쌍을 C:G 염기쌍으로 전환시키는 것인 방법.
130. 실시양태 124에 있어서, 뉴클레오티드 변화가 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 또는 25개 뉴클레오티드의 삽입 또는 결실인 방법.
131. 실시양태 124에 있어서, 뉴클레오티드 변화가 폴리펩티드-코딩 서열의 삽입인 방법.
132. 실시양태 124에 있어서, 뉴클레오티드 변화가 질환-연관 유전자를 교정하는 것인 방법.
133. 실시양태 132에 있어서, 질환-연관 유전자가 아데노신 데아미나제 (ADA) 결핍; 알파-1 항트립신 결핍; 낭성 섬유증; 뒤시엔느 근육 이영양증; 갈락토스혈증; 혈색소증; 헌팅톤병; 메이플 시럽뇨 질환; 마르팡 증후군; 제1형 신경섬유종증; 선천성 손발톱비대증; 페닐케톤뇨; 중증 복합 면역결핍; 겸상 적혈구 질환; 스미스-렘리-오피츠 증후군; 및 테이-삭스병으로 이루어진 군으로부터 선택된 단일유전자 장애와 연관된 것인 방법.
134. 실시양태 132에 있어서, 질환-연관 유전자가 심장 질환; 고혈압; 알츠하이머병; 관절염; 당뇨병; 암; 및 비만으로 이루어진 군으로부터 선택된 다유전자 장애와 연관된 것인 방법.
135. 표적 DNA 분자의 뉴클레오티드 서열을 삽입, 결실, 역위, 치환 또는 그의 조합으로 변경시켜 상응하는 편집된 DNA 분자를 생산하는 프라임 편집에 사용하기 위한 가이드 RNA이며, 여기서
(i) 가이드 RNA는 napDNAbp 및 RNA-의존성 DNA 폴리머라제 활성을 포함하는 도메인을 포함하는 융합 단백질과 복합체를 형성할 수 있고;
(ii) 가이드 RNA는 (a) 표적 DNA 분자 상의 PAM 가닥 상의 이용가능한 PAM 및 프로토스페이서에 근접한 비-PAM 가닥에 어닐링할 수 있는 스페이서 및 (b) gRNA 코어를 포함하고;
(iii) 가이드 RNA는 가이드 RNA의 5' 또는 3' 단부에 연장 아암을 추가로 포함하고;
(iv) 연장 아암은 (a) 프라이머 결합 부위 및 (b) DNA 합성 주형을 포함하며, 여기서 DNA 합성 주형은 PAM 가닥 상의 절단 부위의 바로 하류의 내인성 가닥 대신에 통합될 편집을 포함하는 단일 가닥 DNA 플랩을 코딩하고;
(v) 표적 DNA 분자는 서열식별번호: 1217353-1289387로 이루어진 군으로부터 선택되고;
(vi) 상응하는 편집된 DNA 분자는 서열식별번호: 1289388-1361420으로 이루어진 군으로부터 선택된 것인 가이드 RNA.
136. 실시양태 135에 있어서, 표적 DNA 분자가 클린바 변이체 서열인 가이드 RNA.
137. 실시양태 135에 있어서, napDNAbp가 Cas9, Cas12e, Cas12d, Cas12a, Cas12b1, Cas13a, Cas12c 또는 아르고노트, 또는 Cas9, Cas12e, Cas12d, Cas12a, Cas12b1, Cas13a, Cas12c 또는 아르고노트의 변이체인 가이드 RNA.
138. 실시양태 135에 있어서, napDNAbp 도메인이 닉카제 활성을 포함하는 것인 가이드 RNA.
139. 실시양태 135에 있어서, napDNAbp가 Cas9 또는 그의 변이체인 가이드 RNA.
140. 실시양태 135에 있어서, napDNAbp가 뉴클레아제 활성 Cas9, 뉴클레아제 불활성 Cas9 (dCas9) 또는 Cas9 닉카제 (nCas9)인 가이드 RNA.
141. 실시양태 135에 있어서, napDNAbp가 Cas9 닉카제 (nCas9)인 가이드 RNA.
142. 실시양태 135에 있어서, napDNAbp가 아미노산을 포함하는 것인 가이드 RNA.
143. 실시양태 135에 있어서, napDNAbp가 아미노산 서열 1361421-1361428 중 어느 하나 또는 서열식별번호: 1361421-1361428 중 어느 것과 적어도 80% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열의 SpCas9 야생형 또는 그의 변이체인 가이드 RNA.
144. 실시양태 135에 있어서, napDNAbp가 아미노산 서열 1361429-1361442 중 어느 하나 또는 서열식별번호: 1361429-1361442 중 어느 것과 적어도 80% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열의 SpCas9 오르토로그인 가이드 RNA.
145. 실시양태 135에 있어서, napDNAbp가 아미노산 서열 1361421-1361484 중 어느 하나 또는 서열식별번호: 1361421-1361484 중 어느 것과 적어도 80% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열인 가이드 RNA.
146. 실시양태 135에 있어서, RNA-의존성 DNA 폴리머라제 활성을 포함하는 도메인이 리버스 트랜스크립타제인 가이드 RNA.
147. 실시양태 146에 있어서, 리버스 트랜스크립타제가 서열식별번호: 1361485-1361496 중 어느 하나의 아미노산 서열 또는 서열식별번호: 1361485-1361496 중 어느 것과 적어도 80% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 갖는 자연 발생 야생형 리버스 트랜스크립타제인 가이드 RNA.
148. 실시양태 146에 있어서, 리버스 트랜스크립타제가 서열식별번호: 1361497-1361514 중 어느 하나의 아미노산 서열 또는 서열식별번호: 1361497-1361514 중 어느 것과 적어도 80% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 갖는 변이체 리버스 트랜스크립타제인 가이드 RNA.
149. 실시양태 135에 있어서, 융합 단백질이 서열식별번호: 1361515-1361519 중 어느 하나의 아미노산 서열 또는 서열식별번호: 1361515-1361519 중 어느 것과 적어도 80% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 것인 가이드 RNA.
150. 실시양태 135에 있어서, 융합 단백질이 서열식별번호: 1361515 (PE1) 또는 1361516 (PE2)의 아미노산 서열 또는 서열식별번호: 1361515 또는 1361516 중 어느 것과 적어도 80% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 것인 가이드 RNA.
151. 실시양태 135에 있어서, 이용가능한 PAM 서열이 단계 (i)에서 사용된 napDNAbp의 함수인 가이드 RNA.
152. 실시양태 135에 있어서, 이용가능한 PAM 서열이 (a) 5'-NGG-3' (정규 PAM 서열), (b) 5'-NNG-3', (c) 5'-NNA-3', (d) 5'-NNC-3', (e) 5'-NNT-3', (f) 5'-NGT-3', (g) 5'-NGA-3', (h) 5'-NGC-3', (i) 5'-NAA-3', (j) 5'-NAC-3', (k) 5'-NAG-3' 및 (l) 5'-NAT-3'로 이루어진 군으로부터 선택되며, 이의 선택이 napDNAbp의 선택의 함수인 가이드 RNA.
153. 실시양태 135에 있어서, 단계 (v)의 서열식별번호: 1217353-1289387의 뉴클레오티드 서열 중 어느 것에서의 편집 부위가 5'에서 3' 배향으로 위치 201에서 시작하는 것인 가이드 RNA.
154. 실시양태 135에 있어서, 뉴클레오티드 변화가 뉴클레오티드 치환, 결실, 삽입 또는 그의 조합인 가이드 RNA.
155. 실시양태 135에 있어서, 뉴클레오티드 치환이 전이 또는 전환인 가이드 RNA.
156. 실시양태 135에 있어서, 단일 뉴클레오티드 치환이 (1) G에서 T로의 치환, (2) G에서 A로의 치환, (3) G에서 C로의 치환, (4) T에서 G로의 치환, (5) T에서 A로의 치환, (6) T에서 C로의 치환, (7) C에서 G로의 치환, (8) C에서 T로의 치환, (9) C에서 A로의 치환, (10) A에서 T로의 치환, (11) A에서 G로의 치환 또는 (12) A에서 C로의 치환인 가이드 RNA.
157. 실시양태 135에 있어서, 단일 뉴클레오티드 치환이 (1) G:C 염기쌍을 T:A 염기쌍으로, (2) G:C 염기쌍을 A:T 염기쌍으로, (3) G:C 염기쌍을 C:G 염기쌍으로, (4) T:A 염기쌍을 G:C 염기쌍으로, (5) T:A 염기쌍을 A:T 염기쌍으로, (6) T:A 염기쌍을 C:G 염기쌍으로, (7) C:G 염기쌍을 G:C 염기쌍으로, (8) C:G 염기쌍을 T:A 염기쌍으로, (9) C:G 염기쌍을 A:T 염기쌍으로, (10) A:T 염기쌍을 T:A 염기쌍으로, (11) A:T 염기쌍을 G:C 염기쌍으로 또는 (12) A:T 염기쌍을 C:G 염기쌍으로 전환시키는 것인 가이드 RNA.
158. 실시양태 135에 있어서, 목적하는 뉴클레오티드 변화가 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 또는 25개 뉴클레오티드의 삽입 또는 결실인 가이드 RNA.
159. 실시양태 135에 있어서, 뉴클레오티드 변화가 폴리펩티드-코딩 서열의 삽입인 가이드 RNA.
160. 실시양태 135에 있어서, 뉴클레오티드 변화가 질환-연관 유전자를 교정하는 것인 가이드 RNA.
161. 실시양태 160에 있어서, 질환-연관 유전자가 아데노신 데아미나제 (ADA) 결핍; 알파-1 항트립신 결핍; 낭성 섬유증; 뒤시엔느 근육 이영양증; 갈락토스혈증; 혈색소증; 헌팅톤병; 메이플 시럽뇨 질환; 마르팡 증후군; 제1형 신경섬유종증; 선천성 손발톱비대증; 페닐케톤뇨; 중증 복합 면역결핍; 겸상 적혈구 질환; 스미스-렘리-오피츠 증후군; 및 테이-삭스병으로 이루어진 군으로부터 선택된 단일유전자 장애와 연관된 것인 가이드 RNA.
162. 실시양태 160에 있어서, 질환-연관 유전자가 심장 질환; 고혈압; 알츠하이머병; 관절염; 당뇨병; 암; 및 비만으로 이루어진 군으로부터 선택된 다유전자 장애와 연관된 것인 가이드 RNA.
163. 핵산 서열을 실시양태 1-32 또는 135-162 중 어느 것의 가이드 RNA 및 융합 단백질을 포함하는 복합체와 접촉시키는 단계를 포함하는, 핵산 서열에 뉴클레오티드 변화를 설치하는 방법.
164. 실시양태 163에 있어서, 융합 단백질이 napDNAbp 및 RNA-의존성 DNA 폴리머라제를 포함하는 것인 방법.
165. 실시양태 163에 있어서, 가이드 RNA가 스페이서, gRNA 코어, 및 DNA 합성 주형 및 프라이머 결합 부위를 포함하는 연장 아암을 포함하는 것인 방법.
166. 실시양태 165에 있어서, DNA 합성 주형이 뉴클레오티드 변화를 코딩하는 것인 방법.
167. 실시양태 163-166 중 어느 것에 있어서, 가이드 RNA가 프라임 편집에 적합한 napDNAbp에 결합할 수 있고 napDNAbp를 표적 DNA 서열로 지시할 수 있는 것인 방법.
168. 실시양태 167에 있어서, 표적 핵산 서열이 표적 가닥 (또는 PAM 또는 편집 가닥) 및 상보적 비-표적 가닥 (또는 비-PAM 또는 비-편집 가닥)을 포함하며, 여기서 가이드 RNA의 스페이서가 비-PAM 가닥에 혼성화하여 RNA-DNA 하이브리드 및 R-루프를 형성하는 것인 방법.
169. 실시양태 165에 있어서, 프라이머 결합 부위가 대략 8 내지 대략 20개 뉴클레오티드 길이인 방법.
170. 실시양태 165에 있어서, 프라이머 결합 부위가 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 또는 20개 뉴클레오티드 길이인 방법.
171. 실시양태 165에 있어서, 연장 아암이 적어도 7개 뉴클레오티드, 적어도 8개 뉴클레오티드, 적어도 9개 뉴클레오티드, 적어도 10개 뉴클레오티드, 적어도 11개 뉴클레오티드, 적어도 12개 뉴클레오티드, 적어도 13개 뉴클레오티드, 적어도 14개 뉴클레오티드, 적어도 15개 뉴클레오티드, 적어도 16개 뉴클레오티드, 적어도 17개 뉴클레오티드, 적어도 18개 뉴클레오티드, 적어도 19개 뉴클레오티드, 적어도 20개 뉴클레오티드, 적어도 21개 뉴클레오티드, 적어도 22개 뉴클레오티드, 적어도 23개 뉴클레오티드, 적어도 24개 뉴클레오티드, 적어도 25개 뉴클레오티드, 적어도 26개 뉴클레오티드, 적어도 27개 뉴클레오티드, 적어도 28개 뉴클레오티드, 적어도 29개 뉴클레오티드, 적어도 30개 뉴클레오티드, 적어도 31개 뉴클레오티드, 적어도 32개 뉴클레오티드, 적어도 33개 뉴클레오티드, 적어도 34개 뉴클레오티드, 적어도 35개 뉴클레오티드, 적어도 36개 뉴클레오티드, 적어도 37개 뉴클레오티드, 적어도 38개 뉴클레오티드, 적어도 39개 뉴클레오티드, 적어도 40개 뉴클레오티드, 적어도 100개 뉴클레오티드 길이인 방법.
172. 실시양태 165에 있어서, 프라이머 결합 부위가 적어도 7개 뉴클레오티드, 적어도 8개 뉴클레오티드, 적어도 9개 뉴클레오티드, 적어도 10개 뉴클레오티드, 적어도 11개 뉴클레오티드, 적어도 12개 뉴클레오티드, 적어도 13개 뉴클레오티드, 적어도 14개 뉴클레오티드, 적어도 15개 뉴클레오티드, 적어도 16개 뉴클레오티드, 적어도 17개 뉴클레오티드, 적어도 18개 뉴클레오티드, 적어도 19개 뉴클레오티드 또는 적어도 20개 뉴클레오티드 길이인 방법.
173. 실시양태 165에 있어서, DNA 합성 주형이 적어도 1개 뉴클레오티드, 적어도 2개 뉴클레오티드, 적어도 3개 뉴클레오티드, 적어도 4개 뉴클레오티드, 적어도 5개 뉴클레오티드, 적어도 6개 뉴클레오티드, 적어도 7개 뉴클레오티드, 적어도 8개 뉴클레오티드, 적어도 9개 뉴클레오티드, 적어도 10개 뉴클레오티드, 적어도 11개 뉴클레오티드, 적어도 12개 뉴클레오티드, 적어도 13개 뉴클레오티드, 적어도 14개 뉴클레오티드, 적어도 15개 뉴클레오티드, 적어도 16개 뉴클레오티드, 적어도 17개 뉴클레오티드, 적어도 18개 뉴클레오티드, 적어도 19개 뉴클레오티드, 적어도 20개 뉴클레오티드, 적어도 21개 뉴클레오티드, 적어도 22개 뉴클레오티드, 적어도 23개 뉴클레오티드, 적어도 24개 뉴클레오티드, 적어도 25개 뉴클레오티드, 적어도 26개 뉴클레오티드, 적어도 27개 뉴클레오티드, 적어도 28개 뉴클레오티드, 적어도 29개 뉴클레오티드, 적어도 30개 뉴클레오티드, 적어도 31개 뉴클레오티드, 적어도 32개 뉴클레오티드, 적어도 33개 뉴클레오티드, 적어도 34개 뉴클레오티드, 적어도 35개 뉴클레오티드, 적어도 36개 뉴클레오티드, 적어도 37개 뉴클레오티드, 적어도 38개 뉴클레오티드, 적어도 39개 뉴클레오티드, 적어도 40개 뉴클레오티드, 적어도 100개 뉴클레오티드 길이인 방법.
174. 실시양태 165에 있어서, DNA 합성 주형이 3' 단부를 갖는 상응하는 단일 가닥 DNA 플랩의 합성을 위한 주형으로서 RNA-의존성 DNA 폴리머라제 (예를 들어, 리버스 트랜스크립타제)에 의해 사용될 수 있으며, 여기서 DNA 플랩은 닉 부위에 인접한 내인성 표적 DNA 서열의 가닥에 상보적이고, 단일 가닥 DNA 플랩은 DNA 합성 주형에 의해 코딩된 목적하는 뉴클레오티드 변화를 포함하는 것인 방법.
175. 실시양태 174에 있어서, 단일 가닥 DNA 플랩이 닉킹된 표적 DNA 서열에서 5' 단부를 갖는 내인성 단일 가닥 DNA를 대체하는 것인 방법.
176. 실시양태 175에 있어서, 유리 5' 단부를 갖는 내인성 단일 가닥 DNA가 세포에 의해 절제되는 것인 방법.
177. 실시양태 175에 있어서, 단일 가닥 DNA 플랩의 세포 복구가 뉴클레오티드 변화의 설치를 유발함으로써, 편집된 DNA 생성물을 형성하는 것인 방법.
178. 실시양태 177에 있어서, 뉴클레오티드 변화가 삽입인 방법.
179. 실시양태 178에 있어서, 삽입이 적어도 1개 뉴클레오티드, 적어도 2개 뉴클레오티드, 적어도 3개 뉴클레오티드, 적어도 4개 뉴클레오티드, 적어도 5개 뉴클레오티드, 적어도 6개 뉴클레오티드, 적어도 7개 뉴클레오티드, 적어도 8개 뉴클레오티드, 적어도 9개 뉴클레오티드, 적어도 10개 뉴클레오티드, 적어도 11개 뉴클레오티드, 적어도 12개 뉴클레오티드, 적어도 13개 뉴클레오티드, 적어도 14개 뉴클레오티드, 적어도 15개 뉴클레오티드, 적어도 16개 뉴클레오티드, 적어도 17개 뉴클레오티드, 적어도 18개 뉴클레오티드, 적어도 19개 뉴클레오티드, 적어도 20개 뉴클레오티드, 적어도 21개 뉴클레오티드, 적어도 22개 뉴클레오티드, 적어도 23개 뉴클레오티드, 적어도 24개 뉴클레오티드, 적어도 25개 뉴클레오티드, 적어도 26개 뉴클레오티드, 적어도 27개 뉴클레오티드, 적어도 28개 뉴클레오티드, 적어도 29개 뉴클레오티드, 적어도 30개 뉴클레오티드, 적어도 31개 뉴클레오티드, 적어도 32개 뉴클레오티드, 적어도 33개 뉴클레오티드, 적어도 34개 뉴클레오티드, 적어도 35개 뉴클레오티드, 적어도 36개 뉴클레오티드, 적어도 37개 뉴클레오티드, 적어도 38개 뉴클레오티드, 적어도 39개 뉴클레오티드, 적어도 40개 뉴클레오티드, 적어도 100개 뉴클레오티드 길이인 방법.
180. 실시양태 178에 있어서, 삽입이 폴리펩티드를 코딩하는 서열인 방법.
참고문헌
하기 참고문헌은 각각 그 전문이 본원에 참조로 포함된다.
Figure pct00123
Figure pct00124
Figure pct00125
Figure pct00126
Figure pct00127
등가물 및 범주
청구범위에서 단수형은 달리 나타내지 않는 한 또는 달리 문맥으로부터 명백하지 않는 한 하나 또는 하나 초과를 의미할 수 있다. 군의 1개 이상의 구성원들 사이에 "또는"을 포함하는 청구범위 또는 기재는 달리 나타내지 않는 한 또는 달리 문맥으로부터 명백하지 않는 한 군 구성원 중 하나, 하나 초과 또는 모두가 주어진 생성물 또는 방법에 존재하거나, 그에 사용되거나 또는 달리 그와 관련되는 경우에 충족된 것으로 간주된다. 본 발명은 군의 정확히 하나의 구성원이 주어진 생성물 또는 방법에 존재하거나, 그에 사용되거나 또는 달리 그와 관련되는 실시양태를 포함한다. 본 발명은 군 구성원 중 하나 초과 또는 모두가 주어진 생성물 또는 방법에 존재하거나, 그에 사용되거나 또는 달리 그와 관련되는 실시양태를 포함한다.
추가로, 본 발명은 열거된 청구항 중 하나 이상으로부터의 하나 이상의 제한, 요소, 조항 및 서술적 용어를 또 다른 청구항에 도입하는 모든 변형, 조합 및 순열을 포괄한다. 예를 들어, 또 다른 청구항에 종속하는 임의의 청구항은 동일한 기본 청구항에 종속하는 임의의 다른 청구항에서 발견된 하나 이상의 제한을 포함하도록 변형될 수 있다. 요소가 목록으로서, 예를 들어 마쿠쉬 군 포맷으로 제시되는 경우에, 요소의 각각의 하위군이 또한 개시되고, 임의의 요소(들)는 군으로부터 제거될 수 있다. 일반적으로, 본 발명 또는 본 발명의 측면이 특정한 요소 및/또는 특색을 포함하는 것으로 언급되는 경우에, 본 발명의 특정 실시양태 또는 본 발명의 특정 측면은 이러한 요소 및/또는 특색으로 이루어지거나 또는 본질적으로 이루어지는 것으로 이해되어야 한다. 단순성의 목적을 위해, 이들 실시양태는 본원에 구체적으로 제시되지 않았다. 또한, 용어 "포함하는" 및 "함유하는"은 개방적인 것으로 의도되고, 추가의 요소 또는 단계의 포함을 허용한다는 것이 주목된다. 범위가 주어지는 경우, 종점이 포함된다. 추가로, 달리 나타내지 않는 한 또는 달리 문맥 및 관련 기술분야의 통상의 기술자의 이해로부터 명백하지 않는 한, 범위로서 표현된 값은 본 발명의 상이한 실시양태에서 언급된 범위 내의 임의의 구체적 값 또는 하위-범위를, 문맥이 달리 명확하게 지시하지 않는 한 그러한 범위의 하한치 단위의 1/10까지 가정할 수 있다.
본 출원은 다양한 허여된 특허, 공개된 특허 출원, 학술지 논문 및 다른 공개물을 언급하며, 이들 모두는 본원에 참조로 포함된다. 임의의 포함된 참고문헌과 본 명세서 사이에 상충이 존재하는 경우, 본 명세서가 우선할 것이다. 추가로, 선행 기술에 속하는 본 발명의 임의의 특정한 실시양태는 청구항들 중 어느 하나 이상으로부터 명백하게 배제될 수 있다. 이러한 실시양태는 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 공지된 것으로 간주되기 때문에, 이들은 배제가 본원에 명백하게 제시되지 않더라도 배제될 수 있다. 본 발명의 임의의 특정한 실시양태는 선행 기술의 존재와 관련되든 관련되지 않든 임의의 이유로 임의의 청구항으로부터 배제될 수 있다.
관련 기술분야의 통상의 기술자는 상용 실험만을 사용하여 본원에 기재된 구체적 실시양태에 대한 많은 등가물을 인식하거나 확인할 수 있을 것이다. 본원에 기재된 본 실시양태의 범주는 상기 설명에 제한되는 것으로 의도되지 않으며, 오히려 첨부된 청구범위에 제시된 바와 같다. 관련 기술분야의 통상의 기술자는 하기 청구범위에 정의된 바와 같은 본 발명의 취지 또는 범주로부터 벗어나지 않으면서 본 설명에 대한 다양한 변화 및 변형이 이루어질 수 있음을 인지할 것이다.

Claims (151)

  1. 스페이서, gRNA 코어 및 연장 아암을 포함하며, 서열식별번호: 1-135514 또는 서열식별번호: 1-135514 중 어느 것과 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 서열로 이루어진 군으로부터 선택된 서열을 포함하는 가이드 RNA.
  2. 스페이서, gRNA 코어 및 연장 아암을 포함하며, 여기서 스페이서는 서열식별번호: 135515-271028로 이루어진 군으로부터 선택된 뉴클레오티드 서열 또는 서열식별번호: 135515-271028 중 어느 것과 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열을 갖는 스페이서를 포함하는 것인 가이드 RNA.
  3. 스페이서, gRNA 코어 및 연장 아암을 포함하며, 여기서 연장 아암은 서열식별번호: 271029-406542로 이루어진 군으로부터 선택된 뉴클레오티드 서열 또는 서열식별번호: 271029-406542 중 어느 것과 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열을 갖는 연장 아암을 갖는 것인 가이드 RNA.
  4. 스페이서, gRNA 코어 및 연장 아암을 포함하며, 여기서 연장 아암은 (i) 프라이머 결합 부위, (ii) 편집 주형 및 (iii) 상동성 아암을 포함하는 것인 가이드 RNA.
  5. 스페이서, gRNA 코어 및 연장 아암을 포함하며, 여기서 연장 아암은 서열식별번호: 406543-542056으로 이루어진 군으로부터 선택된 뉴클레오티드 서열을 갖는 프라이머 결합 부위 또는 서열식별번호: 406543-542056 중 어느 것에 대해 적어도 90% 서열 동일한 뉴클레오티드 서열을 갖는 프라이머 결합 부위를 포함하는 것인 가이드 RNA.
  6. 스페이서, gRNA 코어 및 연장 아암을 포함하며, 여기서 연장 아암은 서열식별번호: 542057-677570으로 이루어진 군으로부터 선택된 뉴클레오티드 서열을 포함하는 편집 주형 또는 서열식별번호: 542057-677570 중 어느 것에 대해 적어도 90% 동일한 뉴클레오티드 서열을 갖는 편집 주형을 포함하는 것인 가이드 RNA.
  7. 스페이서, gRNA 코어 및 연장 아암을 포함하며, 여기서 연장 아암은 서열식별번호: 677571-813084로 이루어진 군으로부터 선택된 뉴클레오티드 서열을 갖는 상동성 아암 또는 서열식별번호: 677571-813084 중 어느 것에 대해 적어도 90% 동일한 뉴클레오티드 서열을 갖는 상동성 아암을 포함하는 것인 가이드 RNA.
  8. (i) 서열식별번호: 135515-271028로 이루어진 군으로부터 선택된 뉴클레오티드 서열을 갖는 스페이서 또는 서열식별번호: 135515-271028 중 어느 것과 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열을 갖는 스페이서, 및
    (ii) 서열식별번호: 271029-406542로 이루어진 군으로부터 선택된 연장 아암 또는 서열식별번호: 271029-406542와 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열을 갖는 연장 아암
    을 포함하는 가이드 RNA.
  9. (i) 서열식별번호: 135515-271028로 이루어진 군으로부터 선택된 뉴클레오티드 서열을 갖는 스페이서 또는 서열식별번호: 135515-271028 중 어느 것에 대해 적어도 90% 동일한 뉴클레오티드 서열을 갖는 스페이서, 및
    (ii) 서열식별번호: 406543-542056으로 이루어진 군으로부터 선택된 프라이머 결합 부위 또는 서열식별번호: 406543-542056 중 어느 것에 대해 적어도 90% 동일한 뉴클레오티드 서열을 갖는 프라이머 결합 부위
    를 포함하는 가이드 RNA.
  10. (i) 서열식별번호: 135515-271028로 이루어진 군으로부터 선택된 뉴클레오티드 서열을 갖는 스페이서 또는 서열식별번호: 135515-271028 중 어느 것과 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열을 갖는 스페이서, 및
    (ii) 서열식별번호: 542057-677570으로 이루어진 군으로부터 선택된 뉴클레오티드 서열을 갖는 편집 주형 또는 서열식별번호: 542057-677570 중 어느 것에 대해 적어도 90% 동일한 뉴클레오티드 서열을 갖는 편집 주형
    을 포함하는 가이드 RNA.
  11. (i) 서열식별번호: 135515-271028로 이루어진 군으로부터 선택된 뉴클레오티드 서열을 갖는 스페이서 또는 서열식별번호: 135515-271028 중 어느 것에 대해 적어도 90% 동일한 뉴클레오티드 서열을 갖는 스페이서, 및
    (ii) 서열식별번호: 677571-813084로 이루어진 군으로부터 선택된 뉴클레오티드 서열을 갖는 상동성 아암 또는 서열식별번호: 677571-813084 중 어느 것에 대해 적어도 90% 동일한 뉴클레오티드 서열을 갖는 스페이서
    를 포함하는 가이드 RNA.
  12. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 서열식별번호: 813086의 종결 신호 또는 서열식별번호: 813086과 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 종결 신호를 추가로 포함하는 가이드 RNA.
  13. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 헤어핀 서열, 스템/루프 서열 또는 토루프 서열을 포함하는 5' 단부 변형제 영역을 추가로 포함하는 가이드 RNA.
  14. 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 헤어핀 서열, 스템/루프 서열 또는 토루프 서열을 포함하는 3' 단부 변형제 영역을 추가로 포함하는 가이드 RNA.
  15. 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 서열식별번호: 813085를 포함하는 gRNA 코어 또는 서열식별번호: 813085와 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 gRNA 코어를 추가로 포함하는 가이드 RNA.
  16. 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 프라임 편집에 적합한 napDNAbp에 결합할 수 있고 napDNAbp를 표적 DNA 서열로 지시할 수 있는 가이드 RNA.
  17. 제16항에 있어서, 표적 핵산 서열이 표적 가닥 (또는 PAM 가닥) 및 상보적 비-표적 가닥 (또는 비-PAM 가닥)을 포함하며, 여기서 가이드 RNA의 스페이서가 상보적 비-표적 가닥 (비-PAM 가닥)에 혼성화하여 RNA-DNA 하이브리드 및 R-루프를 형성하는 것인 가이드 RNA.
  18. 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 프라이머 결합 부위가 대략 8 내지 대략 20개 뉴클레오티드 길이인 가이드 RNA.
  19. 제1항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, 프라이머 결합 부위가 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 또는 20개 뉴클레오티드 길이인 가이드 RNA.
  20. 제1항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, 프라이머 결합 부위가 적어도 7개 뉴클레오티드, 적어도 8개 뉴클레오티드, 적어도 9개 뉴클레오티드, 적어도 10개 뉴클레오티드, 적어도 11개 뉴클레오티드, 적어도 12개 뉴클레오티드, 적어도 13개 뉴클레오티드, 적어도 14개 뉴클레오티드, 적어도 15개 뉴클레오티드, 적어도 16개 뉴클레오티드, 적어도 17개 뉴클레오티드, 적어도 18개 뉴클레오티드, 적어도 19개 뉴클레오티드 또는 적어도 20개 뉴클레오티드 길이인 가이드 RNA.
  21. 제1항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서, 상동성 아암이 표적 DNA의 가닥에 상보적인 가이드 RNA.
  22. 제1항 내지 제21항 중 어느 한 항에 있어서, 연장 아암이 대략 7 내지 대략 500개 뉴클레오티드 길이인 가이드 RNA.
  23. 제1항 내지 제22항 중 어느 한 항에 있어서, 연장 아암이 적어도 7개 뉴클레오티드, 적어도 8개 뉴클레오티드, 적어도 9개 뉴클레오티드, 적어도 10개 뉴클레오티드, 적어도 11개 뉴클레오티드, 적어도 12개 뉴클레오티드, 적어도 13개 뉴클레오티드, 적어도 14개 뉴클레오티드, 적어도 15개 뉴클레오티드, 적어도 16개 뉴클레오티드, 적어도 17개 뉴클레오티드, 적어도 18개 뉴클레오티드, 적어도 19개 뉴클레오티드, 적어도 20개 뉴클레오티드, 적어도 21개 뉴클레오티드, 적어도 22개 뉴클레오티드, 적어도 23개 뉴클레오티드, 적어도 24개 뉴클레오티드, 적어도 25개 뉴클레오티드, 적어도 26개 뉴클레오티드, 적어도 27개 뉴클레오티드, 적어도 28개 뉴클레오티드, 적어도 29개 뉴클레오티드, 적어도 30개 뉴클레오티드, 적어도 31개 뉴클레오티드, 적어도 32개 뉴클레오티드, 적어도 33개 뉴클레오티드, 적어도 34개 뉴클레오티드, 적어도 35개 뉴클레오티드, 적어도 36개 뉴클레오티드, 적어도 37개 뉴클레오티드, 적어도 38개 뉴클레오티드, 적어도 39개 뉴클레오티드, 적어도 40개 뉴클레오티드 또는 적어도 100개 뉴클레오티드 길이인 가이드 RNA.
  24. 제1항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서, 편집 주형이 적어도 1개 뉴클레오티드, 적어도 2개 뉴클레오티드, 적어도 3개 뉴클레오티드, 적어도 4개 뉴클레오티드, 적어도 5개 뉴클레오티드, 적어도 6개 뉴클레오티드, 적어도 7개 뉴클레오티드, 적어도 8개 뉴클레오티드, 적어도 9개 뉴클레오티드, 적어도 10개 뉴클레오티드, 적어도 11개 뉴클레오티드, 적어도 12개 뉴클레오티드, 적어도 13개 뉴클레오티드, 적어도 14개 뉴클레오티드, 적어도 15개 뉴클레오티드, 적어도 16개 뉴클레오티드, 적어도 17개 뉴클레오티드, 적어도 18개 뉴클레오티드, 적어도 19개 뉴클레오티드, 적어도 20개 뉴클레오티드, 적어도 21개 뉴클레오티드, 적어도 22개 뉴클레오티드, 적어도 23개 뉴클레오티드, 적어도 24개 뉴클레오티드, 적어도 25개 뉴클레오티드, 적어도 26개 뉴클레오티드, 적어도 27개 뉴클레오티드, 적어도 28개 뉴클레오티드, 적어도 29개 뉴클레오티드, 적어도 30개 뉴클레오티드, 적어도 31개 뉴클레오티드, 적어도 32개 뉴클레오티드, 적어도 33개 뉴클레오티드, 적어도 34개 뉴클레오티드, 적어도 35개 뉴클레오티드, 적어도 36개 뉴클레오티드, 적어도 37개 뉴클레오티드, 적어도 38개 뉴클레오티드, 적어도 39개 뉴클레오티드, 적어도 40개 뉴클레오티드 또는 적어도 100개 뉴클레오티드 길이인 가이드 RNA.
  25. 제1항 내지 제24항 중 어느 한 항에 있어서, 상동성 아암이 적어도 1개 뉴클레오티드, 적어도 2개 뉴클레오티드, 적어도 3개 뉴클레오티드, 적어도 4개 뉴클레오티드, 적어도 5개 뉴클레오티드, 적어도 6개 뉴클레오티드, 적어도 7개 뉴클레오티드, 적어도 8개 뉴클레오티드, 적어도 9개 뉴클레오티드, 적어도 10개 뉴클레오티드, 적어도 11개 뉴클레오티드, 적어도 12개 뉴클레오티드, 적어도 13개 뉴클레오티드, 적어도 14개 뉴클레오티드, 적어도 15개 뉴클레오티드, 적어도 16개 뉴클레오티드, 적어도 17개 뉴클레오티드, 적어도 18개 뉴클레오티드, 적어도 19개 뉴클레오티드, 적어도 20개 뉴클레오티드, 적어도 21개 뉴클레오티드, 적어도 22개 뉴클레오티드, 적어도 23개 뉴클레오티드, 적어도 24개 뉴클레오티드, 적어도 25개 뉴클레오티드, 적어도 26개 뉴클레오티드, 적어도 27개 뉴클레오티드, 적어도 28개 뉴클레오티드, 적어도 29개 뉴클레오티드 또는 적어도 30개 뉴클레오티드인 가이드 RNA.
  26. 제1항 내지 제25항 중 어느 한 항에 있어서, 편집 주형 및 상동성 아암이 3' 단부를 갖는 상응하는 단일 가닥 DNA 플랩의 합성을 위한 주형 서열로서 리버스 트랜스크립타제에 의해 사용될 수 있으며, 여기서 DNA 플랩은 닉 부위에 인접한 내인성 표적 DNA 서열의 가닥에 상보적이고, 단일 가닥 DNA 플랩은 편집 주형에 의해 코딩된 뉴클레오티드 변화를 포함하는 것인 가이드 RNA.
  27. 제26항에 있어서, 단일 가닥 DNA 플랩이 닉킹된 표적 DNA 서열에서 5' 단부를 갖는 내인성 단일 가닥 DNA를 대체하는 것인 가이드 RNA.
  28. 제27항에 있어서, 유리 5' 단부를 갖는 내인성 단일 가닥 DNA가 세포에 의해 절제되는 것인 가이드 RNA.
  29. 제27항에 있어서, 단일 가닥 DNA 플랩의 세포 복구가 뉴클레오티드 변화의 설치를 유발함으로써, 목적하는 생성물을 형성하는 것인 가이드 RNA.
  30. 제29항에 있어서, 목적하는 뉴클레오티드 변화가 삽입인 가이드 RNA.
  31. 제30항에 있어서, 삽입이 적어도 1개 뉴클레오티드, 적어도 2개 뉴클레오티드, 적어도 3개 뉴클레오티드, 적어도 4개 뉴클레오티드, 적어도 5개 뉴클레오티드, 적어도 6개 뉴클레오티드, 적어도 7개 뉴클레오티드, 적어도 8개 뉴클레오티드, 적어도 9개 뉴클레오티드, 적어도 10개 뉴클레오티드, 적어도 11개 뉴클레오티드, 적어도 12개 뉴클레오티드, 적어도 13개 뉴클레오티드, 적어도 14개 뉴클레오티드, 적어도 15개 뉴클레오티드, 적어도 16개 뉴클레오티드, 적어도 17개 뉴클레오티드, 적어도 18개 뉴클레오티드, 적어도 19개 뉴클레오티드, 적어도 20개 뉴클레오티드, 적어도 21개 뉴클레오티드, 적어도 22개 뉴클레오티드, 적어도 23개 뉴클레오티드, 적어도 24개 뉴클레오티드, 적어도 25개 뉴클레오티드, 적어도 26개 뉴클레오티드, 적어도 27개 뉴클레오티드, 적어도 28개 뉴클레오티드, 적어도 29개 뉴클레오티드, 적어도 30개 뉴클레오티드, 적어도 31개 뉴클레오티드, 적어도 32개 뉴클레오티드, 적어도 33개 뉴클레오티드, 적어도 34개 뉴클레오티드, 적어도 35개 뉴클레오티드, 적어도 36개 뉴클레오티드, 적어도 37개 뉴클레오티드, 적어도 38개 뉴클레오티드, 적어도 39개 뉴클레오티드, 적어도 40개 뉴클레오티드 또는 적어도 100개 뉴클레오티드 길이인 가이드 RNA.
  32. 제30항에 있어서, 삽입이 폴리펩티드를 코딩하는 서열인 가이드 RNA.
  33. napDNAbp, 리버스 트랜스크립타제 및 제1항 내지 제32항 중 어느 한 항의 가이드 RNA를 포함하는 프라임 편집 복합체.
  34. 제33항에 있어서, napDNAbp 및 리버스 트랜스크립타제가 융합 단백질로서 형성된 것인 프라임 편집 복합체.
  35. 제33항에 있어서, napDNAbp가 Cas9인 프라임 편집 복합체.
  36. 제35항에 있어서, Cas9가 Cas9 닉카제 또는 그의 변이체로 이루어진 군으로부터 선택된 것인 프라임 편집 복합체.
  37. 제35항에 있어서, Cas9가 서열식별번호: 1-135514로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 갖는 것인 프라임 편집 복합체.
  38. 제34항에 있어서, 융합 단백질이 서열식별번호: 1-135514로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 갖는 것인 프라임 편집 복합체.
  39. 제34항에 있어서, 융합 단백질이 napDNAbp와 리버스 트랜스크립타제를 연결하는 링커를 포함하는 것인 프라임 편집 복합체.
  40. 제39항에 있어서, 링커가 서열식별번호: 1-135514로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 갖는 것인 프라임 편집 복합체.
  41. 제33항 내지 제40항 중 어느 한 항의 프라임 편집 복합체를 코딩하는 1개 이상의 폴리뉴클레오티드.
  42. 제41항의 폴리뉴클레오티드 및 프라임 편집 복합체의 가이드 RNA 및 융합 단백질의 발현을 구동하는 1개 이상의 프로모터를 포함하는 벡터.
  43. 제42항의 벡터를 포함하는 세포.
  44. 제33항 내지 제40항 중 어느 한 항의 프라임 편집 복합체를 포함하는 세포.
  45. (i) 제1항 내지 제32항 중 어느 한 항의 가이드 RNA, 제33항 내지 제40항 중 어느 한 항의 프라임 편집 복합체, 제41항의 폴리뉴클레오티드 또는 제42항의 벡터; 및 (ii) 제약상 허용되는 부형제를 포함하는 제약 조성물.
  46. 핵산 서열을 제1항 내지 제32항 및 제56항 내지 제81항 중 어느 한 항의 가이드 RNA 및 융합 단백질을 포함하는 복합체와 접촉시키는 단계이며, 여기서 융합 단백질은 napDNAbp 및 폴리머라제를 포함하고, 여기서 가이드 RNA는 스페이서, gRNA 코어 및 뉴클레오티드 변화를 코딩하는 편집 주형을 포함하는 연장 아암을 포함하는 것인 단계; 이로써
    (i) 이중 가닥 DNA 서열을 표적 가닥 (또는 PAM 가닥) 상에서 닉킹하고, 3' 단부를 갖는 유리 단일 가닥 DNA를 생성하는 단계;
    (ii) 유리 단일 가닥 DNA의 3' 단부를 가이드 RNA의 프라이머 결합 부위에 혼성화시킴으로써, 폴리머라제를 프라이밍하는 단계;
    (iii) 3' 단부로부터 DNA의 가닥을 중합시킴으로써, 뉴클레오티드 변화를 포함하는 단일 가닥 DNA 플랩을 생성하는 단계; 및
    (iv) 표적 가닥 (또는 PAM 가닥) 상의 절단 부위의 하류에 바로 인접한 내인성 DNA 가닥을 단일 가닥 DNA 플랩으로 대체함으로써, 이중 가닥 DNA 서열에 목적하는 뉴클레오티드 변화를 설치하는 단계
    를 포함하는, 핵산 서열에 뉴클레오티드 변화를 설치하는 방법.
  47. 제46항에 있어서, 뉴클레오티드 변화가 단일 뉴클레오티드 치환, 결실, 삽입 또는 그의 조합인 방법.
  48. 제46항에 있어서, 단일 뉴클레오티드 치환이 전이 또는 전환인 방법.
  49. 제46항에 있어서, 뉴클레오티드 변화가 (1) G에서 T로의 치환, (2) G에서 A로의 치환, (3) G에서 C로의 치환, (4) T에서 G로의 치환, (5) T에서 A로의 치환, (6) T에서 C로의 치환, (7) C에서 G로의 치환, (8) C에서 T로의 치환, (9) C에서 A로의 치환, (10) A에서 T로의 치환, (11) A에서 G로의 치환 또는 (12) A에서 C로의 치환인 방법.
  50. 제46항에 있어서, 뉴클레오티드 변화가 (1) G:C 염기쌍을 T:A 염기쌍으로, (2) G:C 염기쌍을 A:T 염기쌍으로, (3) G:C 염기쌍을 C:G 염기쌍으로, (4) T:A 염기쌍을 G:C 염기쌍으로, (5) T:A 염기쌍을 A:T 염기쌍으로, (6) T:A 염기쌍을 C:G 염기쌍으로, (7) C:G 염기쌍을 G:C 염기쌍으로, (8) C:G 염기쌍을 T:A 염기쌍으로, (9) C:G 염기쌍을 A:T 염기쌍으로, (10) A:T 염기쌍을 T:A 염기쌍으로, (11) A:T 염기쌍을 G:C 염기쌍으로 또는 (12) A:T 염기쌍을 C:G 염기쌍으로 전환시키는 것인 방법.
  51. 제46항에 있어서, 뉴클레오티드 변화가 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 또는 25개 뉴클레오티드의 삽입 또는 결실인 방법.
  52. 제46항에 있어서, 뉴클레오티드 변화가 폴리펩티드-코딩 서열의 삽입인 방법.
  53. 제46항에 있어서, 뉴클레오티드 변화가 질환-연관 유전자를 교정하는 것인 방법.
  54. 제46항에 있어서, 질환-연관 유전자가 아데노신 데아미나제 (ADA) 결핍; 알파-1 항트립신 결핍; 낭성 섬유증; 뒤시엔느 근육 이영양증; 갈락토스혈증; 혈색소증; 헌팅톤병; 메이플 시럽뇨 질환; 마르팡 증후군; 제1형 신경섬유종증; 선천성 손발톱비대증; 페닐케톤뇨; 중증 복합 면역결핍; 겸상 적혈구 질환; 스미스-렘리-오피츠 증후군; 및 테이-삭스병으로 이루어진 군으로부터 선택된 단일유전자 장애와 연관된 것인 방법.
  55. 제46항에 있어서, 질환-연관 유전자가 심장 질환; 고혈압; 신경계 질환; 자가면역 장애; 관절염; 당뇨병; 암; 및 비만으로 이루어진 군으로부터 선택된 다유전자 장애와 연관된 것인 방법.
  56. 스페이서, gRNA 코어 및 연장 아암을 포함하며, 여기서 스페이서는 서열식별번호: 1217353-1289387 또는 그의 상보체 가닥 내의 ~20개 뉴클레오티드 영역에 결합할 수 있는 것인, 표적 DNA 서열 내의 편집 부위에서 질환 대립유전자를 교정하여 건강한 대립유전자를 형성하는 프라임 편집에 사용하기 위한 가이드 RNA.
  57. 스페이서, gRNA 코어 및 연장 아암을 포함하며, 여기서 연장 아암은 DNA 합성 주형 및 프라임 편집을 수행하는데 효과적인 프라이머 결합 부위를 포함하는 것인 가이드 RNA.
  58. 제56항에 있어서, 서열식별번호: 1217353-1289387의 뉴클레오티드 서열 중 어느 것에서의 편집 부위가 5'에서 3' 배향으로 위치 201에서 시작하는 것인 가이드 RNA.
  59. 스페이서, gRNA 코어 및 연장 아암을 포함하며, 여기서 연장 아암은 프라이머 결합 부위 및 DNA 합성 주형을 포함하는 것인, 프라임 편집을 위한 가이드 RNA.
  60. 제59항에 있어서, 프라이머 결합 부위가 서열식별번호: 406543-542056 (프라이머 결합 부위)으로 이루어진 군으로부터 선택된 뉴클레오티드 서열 또는 서열식별번호: 406543-542056 중 어느 것과 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열을 갖는 것인 가이드 RNA.
  61. 제59항에 있어서, DNA 합성 주형이 서열식별번호: 542057-677570 (편집 주형)의 뉴클레오티드 서열 또는 서열식별번호: 542057-677570 중 어느 것과 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 것인 가이드 RNA.
  62. 제59항에 있어서, DNA 합성 주형이 서열식별번호: 677571-813084 (상동성 아암)의 뉴클레오티드 서열 또는 서열식별번호: 677571-813084 중 어느 것과 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 것인 가이드 RNA.
  63. 제59항에 있어서, DNA 합성 주형이 편집 주형 및 상동성 아암을 포함하며, 여기서 편집 주형은 서열식별번호: 542057-677570의 뉴클레오티드 서열을 포함하고, 상동성 아암은 서열식별번호: 677571-813084의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 것인 가이드 RNA.
  64. 제56항 내지 제63항 중 어느 한 항에 있어서, 서열식별번호: 813086의 종결 신호 또는 서열식별번호: 813086과 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 종결 신호를 추가로 포함하는 가이드 RNA.
  65. 제56항 내지 제64항 중 어느 한 항에 있어서, 헤어핀 서열, 스템/루프 서열 또는 토루프 서열을 포함하는 5' 단부 변형제 영역을 추가로 포함하는 가이드 RNA.
  66. 제56항 내지 제65항 중 어느 한 항에 있어서, 헤어핀 서열, 스템/루프 서열 또는 토루프 서열을 포함하는 3' 단부 변형제 영역을 추가로 포함하는 가이드 RNA.
  67. 제56항 내지 제66항 중 어느 한 항에 있어서, 서열식별번호: 813085를 포함하는 gRNA 코어 또는 서열식별번호: 813085와 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 gRNA 코어를 추가로 포함하는 가이드 RNA.
  68. 제56항 내지 제67항 중 어느 한 항에 있어서, 프라임 편집에 적합한 napDNAbp에 결합할 수 있고 napDNAbp를 표적 DNA 서열로 지시할 수 있는 가이드 RNA.
  69. 제68항에 있어서, 표적 핵산 서열이 표적 가닥 (또는 PAM 또는 편집 가닥) 및 상보적 비-표적 가닥 (또는 비-PAM 또는 비-편집 가닥)을 포함하며, 여기서 가이드 RNA의 스페이서가 비-PAM 가닥에 혼성화하여 RNA-DNA 하이브리드 및 R-루프를 형성하는 것인 가이드 RNA.
  70. 제56항 내지 제69항 중 어느 한 항에 있어서, 프라이머 결합 부위가 대략 8 내지 대략 20개 뉴클레오티드 길이인 가이드 RNA.
  71. 제56항 내지 제70항 중 어느 한 항에 있어서, 프라이머 결합 부위가 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 또는 20개 뉴클레오티드 길이인 가이드 RNA.
  72. 제56항 내지 제71항 중 어느 한 항에 있어서, 연장 아암이 적어도 7개 뉴클레오티드, 적어도 8개 뉴클레오티드, 적어도 9개 뉴클레오티드, 적어도 10개 뉴클레오티드, 적어도 11개 뉴클레오티드, 적어도 12개 뉴클레오티드, 적어도 13개 뉴클레오티드, 적어도 14개 뉴클레오티드, 적어도 15개 뉴클레오티드, 적어도 16개 뉴클레오티드, 적어도 17개 뉴클레오티드, 적어도 18개 뉴클레오티드, 적어도 19개 뉴클레오티드, 적어도 20개 뉴클레오티드, 적어도 21개 뉴클레오티드, 적어도 22개 뉴클레오티드, 적어도 23개 뉴클레오티드, 적어도 24개 뉴클레오티드, 적어도 25개 뉴클레오티드, 적어도 26개 뉴클레오티드, 적어도 27개 뉴클레오티드, 적어도 28개 뉴클레오티드, 적어도 29개 뉴클레오티드, 적어도 30개 뉴클레오티드, 적어도 31개 뉴클레오티드, 적어도 32개 뉴클레오티드, 적어도 33개 뉴클레오티드, 적어도 34개 뉴클레오티드, 적어도 35개 뉴클레오티드, 적어도 36개 뉴클레오티드, 적어도 37개 뉴클레오티드, 적어도 38개 뉴클레오티드, 적어도 39개 뉴클레오티드, 적어도 40개 뉴클레오티드, 적어도 100개 뉴클레오티드 길이인 가이드 RNA.
  73. 제56항 내지 제72항 중 어느 한 항에 있어서, 프라이머 결합 부위가 적어도 7개 뉴클레오티드, 적어도 8개 뉴클레오티드, 적어도 9개 뉴클레오티드, 적어도 10개 뉴클레오티드, 적어도 11개 뉴클레오티드, 적어도 12개 뉴클레오티드, 적어도 13개 뉴클레오티드, 적어도 14개 뉴클레오티드, 적어도 15개 뉴클레오티드, 적어도 16개 뉴클레오티드, 적어도 17개 뉴클레오티드, 적어도 18개 뉴클레오티드, 적어도 19개 뉴클레오티드 또는 적어도 20개 뉴클레오티드 길이인 가이드 RNA.
  74. 제56항 내지 제73항 중 어느 한 항에 있어서, DNA 합성 주형이 적어도 1개 뉴클레오티드, 적어도 2개 뉴클레오티드, 적어도 3개 뉴클레오티드, 적어도 4개 뉴클레오티드, 적어도 5개 뉴클레오티드, 적어도 6개 뉴클레오티드, 적어도 7개 뉴클레오티드, 적어도 8개 뉴클레오티드, 적어도 9개 뉴클레오티드, 적어도 10개 뉴클레오티드, 적어도 11개 뉴클레오티드, 적어도 12개 뉴클레오티드, 적어도 13개 뉴클레오티드, 적어도 14개 뉴클레오티드, 적어도 15개 뉴클레오티드, 적어도 16개 뉴클레오티드, 적어도 17개 뉴클레오티드, 적어도 18개 뉴클레오티드, 적어도 19개 뉴클레오티드, 적어도 20개 뉴클레오티드, 적어도 21개 뉴클레오티드, 적어도 22개 뉴클레오티드, 적어도 23개 뉴클레오티드, 적어도 24개 뉴클레오티드, 적어도 25개 뉴클레오티드, 적어도 26개 뉴클레오티드, 적어도 27개 뉴클레오티드, 적어도 28개 뉴클레오티드, 적어도 29개 뉴클레오티드, 적어도 30개 뉴클레오티드, 적어도 31개 뉴클레오티드, 적어도 32개 뉴클레오티드, 적어도 33개 뉴클레오티드, 적어도 34개 뉴클레오티드, 적어도 35개 뉴클레오티드, 적어도 36개 뉴클레오티드, 적어도 37개 뉴클레오티드, 적어도 38개 뉴클레오티드, 적어도 39개 뉴클레오티드, 적어도 40개 뉴클레오티드, 적어도 100개 뉴클레오티드 길이인 가이드 RNA.
  75. 제56항 내지 제74항 중 어느 한 항에 있어서, DNA 합성 주형이 3' 단부를 갖는 상응하는 단일 가닥 DNA 플랩의 합성을 위한 주형으로서 RNA-의존성 DNA 폴리머라제 (예를 들어, 리버스 트랜스크립타제)에 의해 사용될 수 있으며, 여기서 DNA 플랩은 닉 부위에 인접한 내인성 표적 DNA 서열의 가닥에 상보적이고, 단일 가닥 DNA 플랩은 DNA 합성 주형에 의해 코딩된 목적하는 뉴클레오티드 변화를 포함하는 것인 가이드 RNA.
  76. 제75항에 있어서, 단일 가닥 DNA 플랩이 닉킹된 표적 DNA 서열에서 5' 단부를 갖는 내인성 단일 가닥 DNA를 대체하는 것인 가이드 RNA.
  77. 제76항에 있어서, 유리 5' 단부를 갖는 내인성 단일 가닥 DNA가 세포에 의해 절제되는 것인 가이드 RNA.
  78. 제77항에 있어서, 단일 가닥 DNA 플랩의 세포 복구가 뉴클레오티드 변화의 설치를 유발함으로써, 편집된 DNA 생성물을 형성하는 것인 가이드 RNA.
  79. 제78항에 있어서, 뉴클레오티드 변화가 삽입인 가이드 RNA.
  80. 제79항에 있어서, 삽입이 적어도 1개 뉴클레오티드, 적어도 2개 뉴클레오티드, 적어도 3개 뉴클레오티드, 적어도 4개 뉴클레오티드, 적어도 5개 뉴클레오티드, 적어도 6개 뉴클레오티드, 적어도 7개 뉴클레오티드, 적어도 8개 뉴클레오티드, 적어도 9개 뉴클레오티드, 적어도 10개 뉴클레오티드, 적어도 11개 뉴클레오티드, 적어도 12개 뉴클레오티드, 적어도 13개 뉴클레오티드, 적어도 14개 뉴클레오티드, 적어도 15개 뉴클레오티드, 적어도 16개 뉴클레오티드, 적어도 17개 뉴클레오티드, 적어도 18개 뉴클레오티드, 적어도 19개 뉴클레오티드, 적어도 20개 뉴클레오티드, 적어도 21개 뉴클레오티드, 적어도 22개 뉴클레오티드, 적어도 23개 뉴클레오티드, 적어도 24개 뉴클레오티드, 적어도 25개 뉴클레오티드, 적어도 26개 뉴클레오티드, 적어도 27개 뉴클레오티드, 적어도 28개 뉴클레오티드, 적어도 29개 뉴클레오티드, 적어도 30개 뉴클레오티드, 적어도 31개 뉴클레오티드, 적어도 32개 뉴클레오티드, 적어도 33개 뉴클레오티드, 적어도 34개 뉴클레오티드, 적어도 35개 뉴클레오티드, 적어도 36개 뉴클레오티드, 적어도 37개 뉴클레오티드, 적어도 38개 뉴클레오티드, 적어도 39개 뉴클레오티드, 적어도 40개 뉴클레오티드, 적어도 100개 뉴클레오티드 길이인 가이드 RNA.
  81. 제79항에 있어서, 삽입이 폴리펩티드를 코딩하는 서열인 가이드 RNA.
  82. napDNAbp, RNA-의존성 DNA 폴리머라제 및 제56항 내지 제81항 중 어느 한 항의 가이드 RNA를 포함하는 프라임 편집 복합체.
  83. 제82항에 있어서, napDNAbp 및 RNA-의존성 DNA 폴리머라제가 융합 단백질로서 형성된 것인 프라임 편집 복합체.
  84. 제82항에 있어서, napDNAbp가 Cas9인 프라임 편집 복합체.
  85. 제84항에 있어서, Cas9가 Cas9 닉카제 또는 그의 변이체인 프라임 편집 복합체.
  86. 제84항에 있어서, Cas9가 서열식별번호: 1-135514로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 갖는 것인 프라임 편집 복합체.
  87. 제83항에 있어서, 융합 단백질이 서열식별번호: 1-135514로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 갖는 것인 프라임 편집 복합체.
  88. 제83항에 있어서, 융합 단백질이 napDNAbp와 RNA-의존성 DNA 폴리머라제를 연결하는 링커를 포함하는 것인 프라임 편집 복합체.
  89. 제88항에 있어서, 링커가 서열식별번호: 1-135514로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 갖는 것인 프라임 편집 복합체.
  90. 제82항 내지 제89항 중 어느 한 항의 프라임 편집 복합체를 코딩하는 1개 이상의 폴리뉴클레오티드.
  91. 제90항의 폴리뉴클레오티드 및 프라임 편집 복합체의 가이드 RNA 및 융합 단백질의 발현을 구동하는 1개 이상의 프로모터를 포함하는 벡터.
  92. 제91항의 벡터를 포함하는 세포.
  93. 제82항 내지 제89항 중 어느 한 항의 프라임 편집 복합체를 포함하는 세포.
  94. (i) 제56항 내지 제81항 중 어느 한 항의 가이드 RNA, 제82항 내지 제89항 중 어느 한 항의 프라임 편집 복합체, 제90항의 폴리뉴클레오티드 또는 제91항의 벡터; 및 (ii) 제약상 허용되는 부형제를 포함하는 제약 조성물.
  95. 핵산 서열을 제56항 내지 제81항 중 어느 한 항의 가이드 RNA 및 융합 단백질을 포함하는 복합체와 접촉시키는 단계이며, 여기서 융합 단백질은 napDNAbp 및 RNA-의존성 DNA 폴리머라제를 포함하고, 여기서 가이드 RNA는 스페이서, gRNA 코어, 및 DNA 합성 주형 및 프라이머 결합 부위를 포함하는 연장 아암을 포함하고, 상기 DNA 합성 주형은 뉴클레오티드 변화를 코딩하고, 여기서 스페이서는 이용가능한 PAM 및 프로토스페이서에 근접한 비-PAM 가닥에 어닐링할 수 있는 것인 단계; 이로써
    (i) 이중 가닥 DNA 서열을 PAM 가닥 상에서 닉킹함으로써, 3' 단부를 갖는 유리 단일 가닥 DNA를 생성하는 단계;
    (ii) 유리 단일 가닥 DNA의 3' 단부를 가이드 RNA의 프라이머 결합 부위에 혼성화시킴으로써, RNA-의존성 DNA 폴리머라제를 프라이밍하는 단계;
    (iii) DNA 합성 주형으로부터 코딩되도록 DNA의 3' 단부로부터 DNA 가닥을 중합시킴으로써, DNA의 3' 단부로부터 연장된 단일 가닥 DNA 플랩을 생성하는 단계이며, 여기서 플랩은 뉴클레오티드 변화를 포함하는 것인 단계;
    (iv) PAM 가닥 상의 절단 부위의 하류에 바로 인접한 내인성 DNA 가닥을 단일 가닥 DNA 플랩으로 대체함으로써, 이중 가닥 DNA 서열에 뉴클레오티드 변화를 설치하는 단계
    를 포함하는, 핵산 서열에 뉴클레오티드 변화를 설치하는 방법.
  96. 제95항에 있어서, 단계 (v)가 세포 내에서 완료되는 경우에, 세포가 세포 DNA 복구 및/또는 복제를 통해 비-편집된 가닥을 복구하는 것인 방법.
  97. 제95항에 있어서, 뉴클레오티드 변화가 단일 뉴클레오티드 치환, 결실, 삽입 또는 그의 조합인 방법.
  98. 제97항에 있어서, 단일 뉴클레오티드 치환이 전이 또는 전환인 방법.
  99. 제97항에 있어서, 단일 뉴클레오티드 치환이 (1) G에서 T로의 치환, (2) G에서 A로의 치환, (3) G에서 C로의 치환, (4) T에서 G로의 치환, (5) T에서 A로의 치환, (6) T에서 C로의 치환, (7) C에서 G로의 치환, (8) C에서 T로의 치환, (9) C에서 A로의 치환, (10) A에서 T로의 치환, (11) A에서 G로의 치환 또는 (12) A에서 C로의 치환인 방법.
  100. 제97항에 있어서, 단일 뉴클레오티드 치환이 (1) G:C 염기쌍을 T:A 염기쌍으로, (2) G:C 염기쌍을 A:T 염기쌍으로, (3) G:C 염기쌍을 C:G 염기쌍으로, (4) T:A 염기쌍을 G:C 염기쌍으로, (5) T:A 염기쌍을 A:T 염기쌍으로, (6) T:A 염기쌍을 C:G 염기쌍으로, (7) C:G 염기쌍을 G:C 염기쌍으로, (8) C:G 염기쌍을 T:A 염기쌍으로, (9) C:G 염기쌍을 A:T 염기쌍으로, (10) A:T 염기쌍을 T:A 염기쌍으로, (11) A:T 염기쌍을 G:C 염기쌍으로 또는 (12) A:T 염기쌍을 C:G 염기쌍으로 전환시키는 것인 방법.
  101. 제97항에 있어서, 뉴클레오티드 변화가 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 또는 25개 뉴클레오티드의 삽입 또는 결실인 방법.
  102. 제97항에 있어서, 뉴클레오티드 변화가 폴리펩티드-코딩 서열의 삽입인 방법.
  103. 제97항에 있어서, 뉴클레오티드 변화가 질환-연관 유전자를 교정하는 것인 방법.
  104. 제103항에 있어서, 질환-연관 유전자가 아데노신 데아미나제 (ADA) 결핍; 알파-1 항트립신 결핍; 낭성 섬유증; 뒤시엔느 근육 이영양증; 갈락토스혈증; 혈색소증; 헌팅톤병; 메이플 시럽뇨 질환; 마르팡 증후군; 제1형 신경섬유종증; 선천성 손발톱비대증; 페닐케톤뇨; 중증 복합 면역결핍; 겸상 적혈구 질환; 스미스-렘리-오피츠 증후군; 및 테이-삭스병으로 이루어진 군으로부터 선택된 단일유전자 장애와 연관된 것인 방법.
  105. 제103항에 있어서, 질환-연관 유전자가 심장 질환; 고혈압; 알츠하이머병; 관절염; 당뇨병; 암; 및 비만으로 이루어진 군으로부터 선택된 다유전자 장애와 연관된 것인 방법.
  106. 표적 DNA 분자의 뉴클레오티드 서열을 삽입, 결실, 역위, 치환 또는 그의 조합으로 변경시켜 상응하는 편집된 DNA 분자를 생산하는 프라임 편집에 사용하기 위한 가이드 RNA이며, 여기서
    (i) 가이드 RNA는 napDNAbp 및 RNA-의존성 DNA 폴리머라제 활성을 포함하는 도메인을 포함하는 융합 단백질과 복합체를 형성할 수 있고;
    (ii) 가이드 RNA는 (a) 표적 DNA 분자 상의 PAM 가닥 상의 이용가능한 PAM 및 프로토스페이서에 근접한 비-PAM 가닥에 어닐링할 수 있는 스페이서 및 (b) gRNA 코어를 포함하고;
    (iii) 가이드 RNA는 가이드 RNA의 5' 또는 3' 단부에 연장 아암을 추가로 포함하고;
    (iv) 연장 아암은 (a) 프라이머 결합 부위 및 (b) DNA 합성 주형을 포함하며, 여기서 DNA 합성 주형은 PAM 가닥 상의 절단 부위의 바로 하류의 내인성 가닥 대신에 통합될 편집을 포함하는 단일 가닥 DNA 플랩을 코딩하고;
    (v) 표적 DNA 분자는 서열식별번호: 1217353-1289387로 이루어진 군으로부터 선택되고;
    (vi) 상응하는 편집된 DNA 분자는 서열식별번호: 1289388-1361420으로 이루어진 군으로부터 선택된 것인 가이드 RNA.
  107. 제106항에 있어서, 표적 DNA 분자가 클린바(Clinvar) 변이체 서열인 가이드 RNA.
  108. 제106항에 있어서, napDNAbp가 Cas9, Cas12e, Cas12d, Cas12a, Cas12b1, Cas13a, Cas12c 또는 아르고노트, 또는 Cas9, Cas12e, Cas12d, Cas12a, Cas12b1, Cas13a, Cas12c 또는 아르고노트의 변이체인 가이드 RNA.
  109. 제106항에 있어서, napDNAbp 도메인이 닉카제 활성을 포함하는 것인 가이드 RNA.
  110. 제106항에 있어서, napDNAbp가 Cas9 또는 그의 변이체인 가이드 RNA.
  111. 제106항에 있어서, napDNAbp가 뉴클레아제 활성 Cas9, 뉴클레아제 불활성 Cas9 (dCas9) 또는 Cas9 닉카제 (nCas9)인 가이드 RNA.
  112. 제106항에 있어서, napDNAbp가 Cas9 닉카제 (nCas9)인 가이드 RNA.
  113. 제106항에 있어서, napDNAbp가 아미노산을 포함하는 것인 가이드 RNA.
  114. 제106항에 있어서, napDNAbp가 아미노산 서열 1361421-1361428 중 어느 하나 또는 서열식별번호: 1361421-1361428 중 어느 것과 적어도 80% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열의 SpCas9 야생형 또는 그의 변이체인 가이드 RNA.
  115. 제106항에 있어서, napDNAbp가 아미노산 서열 1361429-1361442 중 어느 하나 또는 서열식별번호: 1361429-1361442 중 어느 것과 적어도 80% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열의 SpCas9 오르토로그인 가이드 RNA.
  116. 제106항에 있어서, napDNAbp가 아미노산 서열 1361421-1361484 중 어느 하나 또는 서열식별번호: 1361421-1361484 중 어느 것과 적어도 80% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열인 가이드 RNA.
  117. 제106항에 있어서, RNA-의존성 DNA 폴리머라제 활성을 포함하는 도메인이 리버스 트랜스크립타제인 가이드 RNA.
  118. 제117항에 있어서, 리버스 트랜스크립타제가 서열식별번호: 1361485-1361496 중 어느 하나의 아미노산 서열 또는 서열식별번호: 1361485-1361496 중 어느 것과 적어도 80% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 갖는 자연 발생 야생형 리버스 트랜스크립타제인 가이드 RNA.
  119. 제117항에 있어서, 리버스 트랜스크립타제가 서열식별번호: 1361497-1361514 중 어느 하나의 아미노산 서열 또는 서열식별번호: 1361497-1361514 중 어느 것과 적어도 80% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 갖는 변이체 리버스 트랜스크립타제인 가이드 RNA.
  120. 제106항에 있어서, 융합 단백질이 서열식별번호: 1361515-1361519 중 어느 하나의 아미노산 서열 또는 서열식별번호: 1361515-1361519 중 어느 것과 적어도 80% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 것인 가이드 RNA.
  121. 제106항에 있어서, 융합 단백질이 서열식별번호: 1361515 (PE1) 또는 1361516 (PE2)의 아미노산 서열 또는 서열식별번호: 1361515 또는 1361516 중 어느 것과 적어도 80% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 것인 가이드 RNA.
  122. 제106항에 있어서, 이용가능한 PAM 서열이 단계 (i)에서 사용된 napDNAbp의 함수인 가이드 RNA.
  123. 제106항에 있어서, 이용가능한 PAM 서열이 (a) 5'-NGG-3' (정규 PAM 서열), (b) 5'-NNG-3', (c) 5'-NNA-3', (d) 5'-NNC-3', (e) 5'-NNT-3', (f) 5'-NGT-3', (g) 5'-NGA-3', (h) 5'-NGC-3', (i) 5'-NAA-3', (j) 5'-NAC-3', (k) 5'-NAG-3' 및 (l) 5'-NAT-3'로 이루어진 군으로부터 선택되며, 이의 선택이 napDNAbp의 선택의 함수인 가이드 RNA.
  124. 제106항에 있어서, 단계 (v)의 서열식별번호: 1217353-1289387의 뉴클레오티드 서열 중 어느 것에서의 편집 부위가 5'에서 3' 배향으로 위치 201에서 시작하는 것인 가이드 RNA.
  125. 제106항에 있어서, 뉴클레오티드 변화가 뉴클레오티드 치환, 결실, 삽입 또는 그의 조합인 가이드 RNA.
  126. 제106항에 있어서, 뉴클레오티드 치환이 전이 또는 전환인 가이드 RNA.
  127. 제106항에 있어서, 단일 뉴클레오티드 치환이 (1) G에서 T로의 치환, (2) G에서 A로의 치환, (3) G에서 C로의 치환, (4) T에서 G로의 치환, (5) T에서 A로의 치환, (6) T에서 C로의 치환, (7) C에서 G로의 치환, (8) C에서 T로의 치환, (9) C에서 A로의 치환, (10) A에서 T로의 치환, (11) A에서 G로의 치환 또는 (12) A에서 C로의 치환인 가이드 RNA.
  128. 제106항에 있어서, 단일 뉴클레오티드 치환이 (1) G:C 염기쌍을 T:A 염기쌍으로, (2) G:C 염기쌍을 A:T 염기쌍으로, (3) G:C 염기쌍을 C:G 염기쌍으로, (4) T:A 염기쌍을 G:C 염기쌍으로, (5) T:A 염기쌍을 A:T 염기쌍으로, (6) T:A 염기쌍을 C:G 염기쌍으로, (7) C:G 염기쌍을 G:C 염기쌍으로, (8) C:G 염기쌍을 T:A 염기쌍으로, (9) C:G 염기쌍을 A:T 염기쌍으로, (10) A:T 염기쌍을 T:A 염기쌍으로, (11) A:T 염기쌍을 G:C 염기쌍으로 또는 (12) A:T 염기쌍을 C:G 염기쌍으로 전환시키는 것인 가이드 RNA.
  129. 제106항에 있어서, 목적하는 뉴클레오티드 변화가 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 또는 25개 뉴클레오티드의 삽입 또는 결실인 가이드 RNA.
  130. 제106항에 있어서, 뉴클레오티드 변화가 폴리펩티드-코딩 서열의 삽입인 가이드 RNA.
  131. 제106항에 있어서, 뉴클레오티드 변화가 질환-연관 유전자를 교정하는 것인 가이드 RNA.
  132. 제131항에 있어서, 질환-연관 유전자가 아데노신 데아미나제 (ADA) 결핍; 알파-1 항트립신 결핍; 낭성 섬유증; 뒤시엔느 근육 이영양증; 갈락토스혈증; 혈색소증; 헌팅톤병; 메이플 시럽뇨 질환; 마르팡 증후군; 제1형 신경섬유종증; 선천성 손발톱비대증; 페닐케톤뇨; 중증 복합 면역결핍; 겸상 적혈구 질환; 스미스-렘리-오피츠 증후군; 및 테이-삭스병으로 이루어진 군으로부터 선택된 단일유전자 장애와 연관된 것인 가이드 RNA.
  133. 제131항에 있어서, 질환-연관 유전자가 심장 질환; 고혈압; 알츠하이머병; 관절염; 당뇨병; 암; 및 비만으로 이루어진 군으로부터 선택된 다유전자 장애와 연관된 것인 가이드 RNA.
  134. 핵산 서열을 제56항 내지 제81항 중 어느 한 항의 가이드 RNA 및 융합 단백질을 포함하는 복합체와 접촉시키는 단계를 포함하는, 핵산 서열에 뉴클레오티드 변화를 설치하는 방법.
  135. 제134항에 있어서, 융합 단백질이 napDNAbp 및 RNA-의존성 DNA 폴리머라제를 포함하는 것인 방법.
  136. 제134항에 있어서, 가이드 RNA가 스페이서, gRNA 코어, 및 DNA 합성 주형 및 프라이머 결합 부위를 포함하는 연장 아암을 포함하는 것인 방법.
  137. 제136항에 있어서, DNA 합성 주형이 뉴클레오티드 변화를 코딩하는 것인 방법.
  138. 제134항 내지 제137항 중 어느 한 항에 있어서, 가이드 RNA가 프라임 편집에 적합한 napDNAbp에 결합할 수 있고 napDNAbp를 표적 DNA 서열로 지시할 수 있는 것인 방법.
  139. 제138항에 있어서, 표적 핵산 서열이 표적 가닥 (또는 PAM 또는 편집 가닥) 및 상보적 비-표적 가닥 (또는 비-PAM 또는 비-편집 가닥)을 포함하며, 여기서 가이드 RNA의 스페이서가 비-PAM 가닥에 혼성화하여 RNA-DNA 하이브리드 및 R-루프를 형성하는 것인 방법.
  140. 제136항에 있어서, 프라이머 결합 부위가 대략 8 내지 대략 20개 뉴클레오티드 길이인 방법.
  141. 제136항에 있어서, 프라이머 결합 부위가 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 또는 20개 뉴클레오티드 길이인 방법.
  142. 제136항에 있어서, 연장 아암이 적어도 7개 뉴클레오티드, 적어도 8개 뉴클레오티드, 적어도 9개 뉴클레오티드, 적어도 10개 뉴클레오티드, 적어도 11개 뉴클레오티드, 적어도 12개 뉴클레오티드, 적어도 13개 뉴클레오티드, 적어도 14개 뉴클레오티드, 적어도 15개 뉴클레오티드, 적어도 16개 뉴클레오티드, 적어도 17개 뉴클레오티드, 적어도 18개 뉴클레오티드, 적어도 19개 뉴클레오티드, 적어도 20개 뉴클레오티드, 적어도 21개 뉴클레오티드, 적어도 22개 뉴클레오티드, 적어도 23개 뉴클레오티드, 적어도 24개 뉴클레오티드, 적어도 25개 뉴클레오티드, 적어도 26개 뉴클레오티드, 적어도 27개 뉴클레오티드, 적어도 28개 뉴클레오티드, 적어도 29개 뉴클레오티드, 적어도 30개 뉴클레오티드, 적어도 31개 뉴클레오티드, 적어도 32개 뉴클레오티드, 적어도 33개 뉴클레오티드, 적어도 34개 뉴클레오티드, 적어도 35개 뉴클레오티드, 적어도 36개 뉴클레오티드, 적어도 37개 뉴클레오티드, 적어도 38개 뉴클레오티드, 적어도 39개 뉴클레오티드, 적어도 40개 뉴클레오티드, 적어도 100개 뉴클레오티드 길이인 방법.
  143. 제136항에 있어서, 프라이머 결합 부위가 적어도 7개 뉴클레오티드, 적어도 8개 뉴클레오티드, 적어도 9개 뉴클레오티드, 적어도 10개 뉴클레오티드, 적어도 11개 뉴클레오티드, 적어도 12개 뉴클레오티드, 적어도 13개 뉴클레오티드, 적어도 14개 뉴클레오티드, 적어도 15개 뉴클레오티드, 적어도 16개 뉴클레오티드, 적어도 17개 뉴클레오티드, 적어도 18개 뉴클레오티드, 적어도 19개 뉴클레오티드 또는 적어도 20개 뉴클레오티드 길이인 방법.
  144. 제136항에 있어서, DNA 합성 주형이 적어도 1개 뉴클레오티드, 적어도 2개 뉴클레오티드, 적어도 3개 뉴클레오티드, 적어도 4개 뉴클레오티드, 적어도 5개 뉴클레오티드, 적어도 6개 뉴클레오티드, 적어도 7개 뉴클레오티드, 적어도 8개 뉴클레오티드, 적어도 9개 뉴클레오티드, 적어도 10개 뉴클레오티드, 적어도 11개 뉴클레오티드, 적어도 12개 뉴클레오티드, 적어도 13개 뉴클레오티드, 적어도 14개 뉴클레오티드, 적어도 15개 뉴클레오티드, 적어도 16개 뉴클레오티드, 적어도 17개 뉴클레오티드, 적어도 18개 뉴클레오티드, 적어도 19개 뉴클레오티드, 적어도 20개 뉴클레오티드, 적어도 21개 뉴클레오티드, 적어도 22개 뉴클레오티드, 적어도 23개 뉴클레오티드, 적어도 24개 뉴클레오티드, 적어도 25개 뉴클레오티드, 적어도 26개 뉴클레오티드, 적어도 27개 뉴클레오티드, 적어도 28개 뉴클레오티드, 적어도 29개 뉴클레오티드, 적어도 30개 뉴클레오티드, 적어도 31개 뉴클레오티드, 적어도 32개 뉴클레오티드, 적어도 33개 뉴클레오티드, 적어도 34개 뉴클레오티드, 적어도 35개 뉴클레오티드, 적어도 36개 뉴클레오티드, 적어도 37개 뉴클레오티드, 적어도 38개 뉴클레오티드, 적어도 39개 뉴클레오티드, 적어도 40개 뉴클레오티드, 적어도 100개 뉴클레오티드 길이인 방법.
  145. 제136항에 있어서, DNA 합성 주형이 3' 단부를 갖는 상응하는 단일 가닥 DNA 플랩의 합성을 위한 주형으로서 RNA-의존성 DNA 폴리머라제 (예를 들어, 리버스 트랜스크립타제)에 의해 사용될 수 있으며, 여기서 DNA 플랩은 닉 부위에 인접한 내인성 표적 DNA 서열의 가닥에 상보적이고, 단일 가닥 DNA 플랩은 DNA 합성 주형에 의해 코딩된 목적하는 뉴클레오티드 변화를 포함하는 것인 방법.
  146. 제145항에 있어서, 단일 가닥 DNA 플랩이 닉킹된 표적 DNA 서열에서 5' 단부를 갖는 내인성 단일 가닥 DNA를 대체하는 것인 방법.
  147. 제146항에 있어서, 유리 5' 단부를 갖는 내인성 단일 가닥 DNA가 세포에 의해 절제되는 것인 방법.
  148. 제145항에 있어서, 단일 가닥 DNA 플랩의 세포 복구가 뉴클레오티드 변화의 설치를 유발함으로써, 편집된 DNA 생성물을 형성하는 것인 방법.
  149. 제148항에 있어서, 뉴클레오티드 변화가 삽입인 방법.
  150. 제149항에 있어서, 삽입이 적어도 1개 뉴클레오티드, 적어도 2개 뉴클레오티드, 적어도 3개 뉴클레오티드, 적어도 4개 뉴클레오티드, 적어도 5개 뉴클레오티드, 적어도 6개 뉴클레오티드, 적어도 7개 뉴클레오티드, 적어도 8개 뉴클레오티드, 적어도 9개 뉴클레오티드, 적어도 10개 뉴클레오티드, 적어도 11개 뉴클레오티드, 적어도 12개 뉴클레오티드, 적어도 13개 뉴클레오티드, 적어도 14개 뉴클레오티드, 적어도 15개 뉴클레오티드, 적어도 16개 뉴클레오티드, 적어도 17개 뉴클레오티드, 적어도 18개 뉴클레오티드, 적어도 19개 뉴클레오티드, 적어도 20개 뉴클레오티드, 적어도 21개 뉴클레오티드, 적어도 22개 뉴클레오티드, 적어도 23개 뉴클레오티드, 적어도 24개 뉴클레오티드, 적어도 25개 뉴클레오티드, 적어도 26개 뉴클레오티드, 적어도 27개 뉴클레오티드, 적어도 28개 뉴클레오티드, 적어도 29개 뉴클레오티드, 적어도 30개 뉴클레오티드, 적어도 31개 뉴클레오티드, 적어도 32개 뉴클레오티드, 적어도 33개 뉴클레오티드, 적어도 34개 뉴클레오티드, 적어도 35개 뉴클레오티드, 적어도 36개 뉴클레오티드, 적어도 37개 뉴클레오티드, 적어도 38개 뉴클레오티드, 적어도 39개 뉴클레오티드, 적어도 40개 뉴클레오티드, 적어도 100개 뉴클레오티드 길이인 방법.
  151. 제149항에 있어서, 삽입이 폴리펩티드를 코딩하는 서열인 방법.
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