KR102128248B1 - Mrna 전달을 위한 지질 나노입자 조성물 및 방법 - Google Patents

Mrna 전달을 위한 지질 나노입자 조성물 및 방법 Download PDF

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Abstract

본 명세서에서 표적 세포내 단백질의 생산을 조절하기 위한 조성물 및 방법이 개시된다. 본 명세서에 개시된 조성물 및 방법은 단백질 또는 효소 결핍과 연관된 질병을 호전시킬 수 있다.

Description

MRNA 전달을 위한 지질 나노입자 조성물 및 방법{LIPID NANOPARTICLE COMPOSITIONS AND METHODS FOR MRNA DELIVERY}
신규한 기법 및 치료법이 단백질 및 효소 결핍의 치료를 위해 여전히 요구된다. 예를 들어, 리소좀 축적 질병은 주로 대사에 요구되는 효소의 결핍 때문에, 리소좀 기능에서의 결핍이 원인이 되는 대략 50가지의 희귀한 유전성 대사 질환의 그룹이다. 파브리(Fabry) 질병은 효소 알파 갈락토시다아제 (GLA)의 결핍이 원인이 되는 리소좀 축적 질병이며, 이는 혈관 및 다른 조직에서 축적되는 글로보트리아오실세라미드(globotriaosylceramide)로서 공지된 당지질을 야기하며, 이는 다양한 통증 징후를 야기한다. 파브리 병과 같은 특정한 질병의 경우, 혈류 내로 세포에 의해 정상적으로 분비되는 단백질 또는 효소의 대체에 대한 필요성이 있다. 병든 단백질 또는 효소의 수준 또는 생산을 증가시키는, 유전자 치료와 같은 치료법은 이러한 질환에 대한 치료 또는 심지어 치유를 제공할 수 있다. 하지만, 이 목적을 위해 기존의 유전자 치료법을 이용하는 것에 대한 여러 가지 제한이 있었다.
기존의 유전자 치료법은 숙주 세포 내로 바람직한 유전 정보의 삽입을 위한 DNA의 용도를 수반한다. 세포 내로 도입된 DNA는 하나 이상의 형질감염된 세포의 게놈 내로 특정한 정도까지 주로 통합되며, 이는 숙주내 도입된 유전 물질의 오래-지속되는 작용을 허용한다. 이러한 지속된 작용에 대한 실질적인 혜택이 있을 수 있는 반면에, 숙주 게놈 내로 외인성 DNA의 통합은 유해한 영향을 또한 가질 수 있다. 예를 들어, 도입된 DNA는 완전한 유전자 내로 삽입될 것이라는 점이 가능하며, 이는 내인성 유전자의 기능을 방해하거나 또는 심지어 완전히 제거하는 돌연변이를 야기한다. 따라서, DNA를 이용한 유전자 치료법은 치료되는 숙주내 생명 관련된 유전자 기능의 손상, 가령 필수 효소의 제거 또는 유해하게 감소된 생산 또는 세포 성장의 조절에 중요한 유전자의 방해를 야기할 수 있으며, 이는 조절되지 않는 또는 암 세포 증식을 야기한다. 추가적으로, 기존의 DNA 기반 유전자 치료법으로, 바람직한 유전자 산물의 효과적인 발현을 위해 강한 프로모터 서열을 포함하는 것이 필수적인데, 이는 세포내 정상적인 유전자 발현의 조절에서 바람직하지 않은 변화를 또한 야기시킬 수 있다. DNA 기반 유전 물질은 바람직하지 않은 항-DNA 항체의 도입을 야기하는 것이 또한 가능하며, 이는 결국, 치명적일 수도 있는 면역 반응을 유발할 수 있다. 바이러스 벡터를 이용한 유전자 치료 기법은 부정적인 면역 반응을 또한 야기할 수 있다. 몇 가지 환경에서, 바이러스 벡터는 심지어 숙주 게놈 내로 통합할 수 있다. 추가적으로, 임상 단계 바이러스 벡터의 생산은 또한 비싸고 시간 소모적이다. 바이러스 벡터를 이용한 도입된 유전 물질의 표적화 전달은 또한 제어하기 어려울 수 있다. 따라서, DNA 기반 유전자 치료법이 바이러스 벡터를 이용하여 분비 단백질의 전달을 위해 평가되어 왔지만 (미국 특허 번호 제6,066,626호; US2004/0110709), 이들 기법은 이들의 여러 가지 이유로 제한될 수 있다.
분비 단백질을 인코딩하는 핵산의 전달의 이들 사전 기법에서 명백한 또 다른 장애물은 궁극적으로 생산되는 단백질의 수준에 있다. 혈액내 바람직한 단백질의 유의적인 수준을 성취하는 것은 어려우며, 그리고 그 양은 시간이 지남에 따라 지속되지 않는다. 예를 들어, 핵산 전달에 의해 생산된 단백질의 양은 정상적인 생리학적 수준에 도달하지 않는다. 가령, US2004/0110709를 참조.
DNA와 대조적으로, 유전자 치료제로서 RNA의 용도는 실질적으로 더 안전한데, 그 이유는 (1) RNA는 형질감염된 세포의 게놈 내로 안정하게 통합되는 위험을 수반하지 않으며, 따라서 도입된 유전 물질이 필수 유전자의 정상적인 기능을 방해하거나, 또는 유해한 또는 발암 효과를 야기하는 돌연변이를 초래할 것이라는 우려를 없애고; (2) 이질적인 프로모터 서열은 인코딩된 단백질의 효과적인 번역을 위해 요구되지 않고, 이는 또한 가능성 있는 유해한 부작용을 회피하고; (3) 플라스미드 DNA (pDNA)와는 대조적으로, 전령 RNA (mRNA)는 항-RNA 항체가 발생되지 않도록 면역성 CpG 모티프(motif)가 없고; 그리고 (4) 유전자 치료법에 기반한 mRNA가 원인이 되는 임의의 유해한 영향은 RNA의 상대적으로 짧은 반감기 때문에 지속기간이 제한될 것이기 때문이다. 추가적으로, mRNA의 경우 이의 기능을 수행하기 위해 세포핵으로 들어가는 것이 필수적이지 않지만, DNA는 이 주요 장벽을 극복해야만 한다.
mRNA 기반 유전자 치료가 과거에 더 많이 이용되지 않았다는 한 가지 이유는 mRNA가 특히 세포의 세포질에 도달하고 분해 효소에 노출될 때, DNA보다 훨씬 덜 안정하다는 점이다. mRNA내 당 모이어티(moiety)의 2차 탄소 상에 하이드록실 기의 존재는 DNA의 더욱 안정한 이중 나선 구조를 형성하는 것으로부터 mRNA를 방지하는 따라서 더욱 가수분해성 붕해되기 쉬운 mRNA를 만드는 입체 장애(steric hinderance)를 야기한다. 결과적으로, 최근까지, mRNA가 형질감염 프로토콜을 견뎌내기에는 너무 불안정하다는 것으로 널리 간주되었다. RNA 안정화 변형에서의 진전은 유전자 치료법에서 플라스미드 DNA를 대신하여 mRNA의 용도에서 더 많은 관심을 유발하였다. 특정한 전달 비히클(delivery vehicle), 가령 양이온 지질 또는 폴리머(polymer) 전달 비히클은 내인성 RNase로부터 형질감염된 mRNA를 보호하는 것을 또한 보조할 수 있다. 하지만, 변형된 mRNA의 증가된 안정도에도 불구하고, 치료학적 수준의 단백질 생산을 허용하는 방식으로 생체내 세포에 mRNA의 전달은 특히 전장 단백질을 인코딩하는 mRNA에 대해 여전히 도전적이다. 분비 단백질을 인코딩하는 mRNA의 전달이 고려되었지만 (US2009/0286852), 생체내 mRNA 전달을 통해 실제로 생산될 전장 분비 단백질의 수준은 공지되지 않고 상기 수준이 DNA 기반 유전자 치료법으로 관찰된 것들을 능가할 것이라는 점을 예상하는 근거가 없다.
지금까지, mRNA 유전자 치료법을 이용한 유의적인 진전은 오로지 낮은 수준의 번역이 제한 요인이 아니었다는 적용, 가령 항원을 인코딩하는 mRNA를 이용한 면역화에서 이루어졌다. 나출(naked) 또는 프로타민-복합 mRNA의 피내 주사에 의한 종양 항원에 대항하는 백신접종을 수반한 임상 시험은 실생가능성, 독성의 결여, 및 조짐이 좋은 결과을 입증하였다. X. Su et al., Mol. Pharmaceutics 8:774-787 (2011). 불행하게도, 낮은 수준의 번역은 단백질이 인코딩된 mRNA의 더 높은 수준의 지속적 발현이 생물학적 또는 치료학적 효과에 영향을 미치도록 요구하는 다른 적용에서 mRNA 기반 유전자 치료의 활용을 크게 한정하였다.
본 발명은 "저장고 효과(depot effect)"를 통하여 치료학적으로 효과적인 수준의 분비 단백질의 생산을 야기하는 mRNA 유전자 치료제의 전달을 위한 방법을 제공한다. 본 발명의 구체예에서, 분비 단백질을 인코딩하는 mRNA는 지질 나노입자 안에 로딩되고 생체내 표적 세포에 전달된다. 이후 표적 세포는 치료학적 수준으로 순환 시스템 내로 용해성의, 분비 단백질의 생산을 위한 저장고 공급원(depot source)으로서 작용한다. 몇몇 구체예에서, 생산된 분비 단백질의 수준은 정상적인 생리학적 수준을 넘는다.
본 발명은 치료학적 수준의 분비된 기능적 단백질의 생산을 위해 하나 이상의 표적 세포에 리포좀 수송 비히클(transfer vehicle)내 mRNA의 세포내 전달을 위한 조성물 및 방법을 제공한다.
본 발명의 조성물 및 방법은 다수 질병, 특히 단백질 및/또는 효소 결핍이 원인이 되는 질병의 관리 및 치료에서 유용하며, 여기서 단백질 또는 효소는 정상적으로 분비된다. 이런 질병을 앓고 있는 개체는 예를 들어, 분비 단백질의 비-합성, 분비 단백질의 감소된 합성, 또는 생물학적 활성도가 결핍되거나 감소된 분비 단백질의 합성을 포함하여, 단백질 또는 효소의 약화된 발현을 야기하는 내재성 유전적 결함을 가질 수 있다. 특히, 본 발명의 방법 및 조성물은 리소좀 축적 질환 및/또는 요소 회로(urea cycle)에 관여하는 분비 효소의 생합성내 하나 이상의 결함의 결과로서 발생하는 요소 회로 대사 질환의 치료를 위해 유용하다.
본 발명의 조성물은 mRNA, 수송 비히클 그리고, 선택적으로, 표적 세포와의 접촉, 및 표적 세포의 차후 형질감염을 촉진하는 물질을 포함한다. mRNA는 임상학적으로 유용한 분비 단백질을 인코딩할 수 있다. 예를 들어, mRNA는 리소좀 축적 질환과 관련된 기능적인 분비 요소 회로 효소 또는 분비 효소를 인코딩할 수 있다. mRNA는 예를 들어, 에리트로포이에틴 (가령, 인간 EPO) 또는 α-갈락토시다아제 (가령, 인간 α-갈락토시다아제 (인간 GLA))를 인코딩할 수 있다.
몇몇 구체예에서, mRNA는 mRNA에 안정도를 부여하는 하나 이상의 변형을 포함할 수 있고 (가령, 야생형 또는 원래 버전의 mRNA와 비교) 그리고 단백질의 연관된 비정상적인 발현과 관련된 결함을 보정하는 야생형에 비해 하나 이상의 변형을 또한 포함할 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 핵산은 5' 및 3' 비번역 영역 중 하나 또는 둘 모두에 대한 변형을 포함할 수 있다. 이러한 변형은 거대세포 바이러스 (CMV) 즉시-초기 1 (IE1) 유전자의 부분적인 서열, 폴리 A 꼬리, Cap1 구조 또는 인간 성장 호르몬 (hGH))을 인코딩하는 서열의 함유를 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 몇몇 구체예에서, mRNA는 변형되어 mRNA 면역원성을 감소시킨다.
본 발명의 조성물을 투여하는 단계를 포함하는 대상을 치료하는 방법이 또한 고려된다. 예를 들어, 특정한 분비 단백질의 생산 및/또는 특정한 분비 단백질의 이용이 부적절하거나 약화되는 질환을 치료하거나 예방하는 방법이 제공된다. 한 가지 구체예에서,　본 명세서에서 제공된 방법은 하나 이상의 요소 회로 효소 또는　리소좀 축적 질환에서 결핍되는 것으로 나타나는 하나 이상의 효소가 결핍된 대상을 치료하는 데에 이용될 수 있다.
바람직한 구체예에서, 본 발명의 조성물내 mRNA는 표적 세포로의 전달을 촉진하기 위한 리포좀 수송 비히클로 조제된다. 고려되는 수송 비히클은 하나 이상의 양이온 지질, 비-양이온 지질, 및/또는 PEG-변형 지질을 포함할 수 있다. 예를 들어, 수송 비히클은 다음 양이온 지질 중 적어도 하나를 포함할 수 있다: C12-200, DLin-KC2-DMA, DODAP, HGT4003, ICE, HGT5000, 또는 HGT5001. 구체예에서, 수송 비히클은 콜레스테롤 (chol) 및/또는 PEG-변형 지질을 포함한다. 몇몇 구체예에서, 수송 비히클은 DMG-PEG2K를 포함한다. 특정한 구체예에서, 수송 비히클은 다음 지질 제제 중 하나를 포함한다: C12-200, DOPE, chol, DMG-PEG2K; DODAP, DOPE, 콜레스테롤, DMG-PEG2K; HGT5000, DOPE, chol, DMG-PEG2K, HGT5001, DOPE, chol, DMG-PEG2K.
본 발명은　"저장고 효과"를 나타낼 수 있는 표적 세포에 하나 이상의　mRNA　분자의　전달 및 형질감염을 촉진하기 위해 유용한 조성물 및 방법을 또한 제공한다. 예를 들어, 본 발명의 조성물 및 방법은 하나 이상의 표적 세포에 대한 조성물의 친화성을 증진시킬 수 있는 표적화 리간드의 용도를 고려한다. 한 가지 구체예에서, 표적화 리간드는 아포리포단백질-B 또는 아포리포단백질-E이고 그리고 상응하는 표적 세포는 저-밀도 리포단백질 수용체를 발현하며, 그렇게 함으로써 표적화 리간드의 인식을 촉진한다. 본 발명의 방법 및 조성물은 매우 많은 표적 세포를 바람직하게 표적하는 데에 이용될 수 있다. 예를 들어, 고려되는 표적 세포는 간세포, 상피세포, 조혈세포, 상피세포, 내피세포, 폐세포, 골세포, 줄기세포, 간엽세포, 신경세포, 심장세포, 지방세포, 혈관 평활근 세포, 심근세포, 골격근 세포, 베타 세포, 뇌하수체 세포, 활액 내층 세포, 난소세포, 고환세포, 섬유아세포, B 세포, T 세포, 망상적혈구, 백혈구, 과립구 및 종양 세포를 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.
구체예에서, 분비 단백질은 지속되는 시간량 동안 표적 세포에 의해 생산된다. 예를 들어, 분비 단백질은 투여 후 1시간 이상, 4시간 이상, 6시간 이상, 12시간 이상, 24시간 이상, 48시간 이상, 또는 72시간 이상 동안 생산될 수 있다. 몇몇 구체예에서, 폴리펩티드는 투여 후 약 6 시간에 최고치로 발현된다. 몇몇 구체예에서, 폴리펩티드의 발현은 적어도 치료학적 수준으로 지속된다. 몇몇 구체예에서, 폴리펩티드는 투여 후 1시간 이상, 4시간 이상, 6시간 이상, 12시간 이상, 24시간 이상, 48시간 이상, 또는 72시간 이상 동안 적어도 치료학적 수준으로 발현된다. 몇몇 구체예에서, 폴리펩티드는 환자 혈청 또는 조직 (가령, 간, 또는 폐)내 수준으로 탐지가능하다. 몇몇 구체예에서, 탐지가능한 폴리펩티드의 수준은 투여 후 1시간 이상, 4시간 이상, 6시간 이상, 12시간 이상, 24시간 이상, 48시간 이상, 또는 72시간 이상의 시간 기간에 걸쳐 mRNA 조성물로부터의 지속적인 발현에서 나온다.
특정한 구체예에서, 분비 단백질은 정상적인 생리학적 수준을 넘는 수준으로 생산된다. 분비 단백질의 수준은 대조군과 비교하여 증가될 수 있다.
몇몇 구체예에서, 대조군은 정상 개체내 또는 정상 개체의 모집단내 기저선 생리학적 수준의 폴리펩티드이다. 다른 구체예에서, 대조군은 관련 단백질 또는 폴리펩티드가 결핍된 개체내 또는 관련 단백질 또는 폴리펩티드가 결핍된 개체의 모집단내 기저선 생리학적 수준의 폴리펩티드이다. 몇몇 구체예에서, 대조군은 조성물이 투여된 개체내 정상적인 수준의 관련 단백질 또는 폴리펩티드일 수 있다. 다른 구체예에서, 대조군은 다른 치료학적 개입시, 가령 하나 이상의 비교가능한 시점에, 상응하는 폴리펩티드의 직접 주사시 발현 수준의 폴리펩티드이다.
특정한 구체예에서, 폴리펩티드는 대조군보다 적어도 1.5-배, 적어도 2-배, 적어도 5-배, 적어도 10-배, 적어도 20-배, 30-배, 적어도 100-배, 적어도 500-배, 적어도 5000-배, 적어도 50,000-배 또는 적어도 100,000-배 더 큰 수준으로 표적 세포에 의해 발현된다. 몇몇 구체예에서, 대조군보다 큰 발현의 배수 증가는 투여 후 1시간 이상, 4시간 이상, 6시간 이상, 12시간 이상, 24시간 이상, 또는 48시간 이상, 또는 72시간 이상 동안 지속된다. 예를 들어, 한 가지 구체예에서, 분비 단백질의 수준은 혈청에서 적어도 48시간 또는 2일 동안 대조군보다 적어도 1.5-배, 적어도 2-배, 적어도 5-배, 적어도 10-배, 적어도 20-배, 30-배, 적어도 100-배, 적어도 500-배, 적어도 5000-배, 적어도 50,000-배 또는 적어도 100,000-배 더 크게 탐지된다. 특정한 구체예에서, 분비 단백질의 수준은 투여 후 3일, 4일, 5일, 또는 1주에 또는 그 이상 탐지가능하다. 증가된 수준의 분비 단백질은 혈청에서 및/또는 조직 (가령 간, 폐)에서 관찰될 수 있다.
몇몇 구체예에서, 방법은 바람직한 분비 단백질의 지속되는 순환 반감기를 초래한다. 예를 들어, 분비 단백질은 분비 단백질의 피하 주사를 통해 관찰된 반감기보다 길게 수시간 또는 수일 동안 탐지될 수 있다. 구체예에서, 분비 단백질의 반감기는 1일, 2일, 3일, 4일, 5일 이상 또는 1주 이상 동안 지속된다.
몇몇 구체예에서, 투여는 단일 또는 반복된 용량을 포함한다. 특정한 구체예에서, 용량은 정맥내로, 또는 폐 전달로 투여된다.
폴리펩티드는 예를 들어, 에리트로포이에틴, α-갈락토시다아제, LDL 수용체, 인자 VIII, 인자 IX, α-L-이듀로니다아제 (MPS I에 대해), 이듀로네이트 설파타아제 (MPS II에 대해), 헤파린-N-설파타아제 (MPS IIIA에 대해), α-N-아세틸글루코사미니다아제 (MPS IIIB에 대해), 갈락토오스 6-설타타아제 (MPS IVA에 대해), 리소좀 산 리파아제, 아릴설파타아제-A 중 하나 이상일 수 있다.
특정한 구체예는 세포 또는 대상에 mRNA, 여기서 이의 적어도 일부는 기능적 분비 폴리펩티드를 인코딩함,를 그 mRNA로부터 발생된 상응하는 기능적 단백질의 양보다 실질적으로 더 적은 양으로 제공하는 조성물 및 방법과 관련된다. 다시 말해, 특정한 구체예에서, 세포에 전달된 mRNA는 세포에 전달된 mRNA 양보다 실질적으로 더 많은 단백질 양을 생산할 수 있다. 예를 들어, 주어진 시간량, 예를 들어 세포 또는 대상에 mRNA의 투여로부터 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 12, 15, 20, 또는 24시간 안에, mRNA에 의해 발생된 상응하는 단백질의 양은 세포 또는 대상으로 실제로 투여된 mRNA의 양보다 적어도 1.5, 2, 3, 5, 10, 15, 20, 25, 50, 100, 150, 200, 250, 300, 400, 500배, 또는 그 이상 더 많을 수 있다. 이것은 질량-대-질량 기초(mass-by-mass basis), 몰-대-몰 기초(mole-by-mole basis), 및/또는 분자-대-분자 기초(molecule-by-molecule basis)로 측정될 수 있다. 단백질은 다양한 방식으로 측정될 수 있다. 예를 들어, 세포의 경우, 측정된 단백질은 세포내 단백질, 세포외 단백질, 또는 이들 두 개의 조합으로서 측정될 수 있다. 대상의 경우, 측정된 단백질은 혈청에서; 특정 조직 또는 조직들, 가령 간, 신장, 심장, 또는 뇌에서; 특정 세포 유형, 가령 간 또는 뇌의 다양한 세포 유형 중 하나에서; 또는 혈청, 조직, 및/또는 세포 유형의 임의의 조합에서 측정된 단백질일 수 있다. 더욱이, 내인성 단백질의 기저선 양은 mRNA의 투여에 앞서 세포 또는 대상에서 측정될 수 있고 이후 mRNA의 투여 후 측정된 단백질로부터 공제되어 mRNA로부터 발생된 상응하는 단백질 양을 산출할 수 있다. 이러한 방식으로, mRNA는 예를 들어, 세포 또는 대상에 전달된 mRNA의 양과 비교하여, 많은 양의 치료학적 물질의 저장소(reservoir) 또는 저장고 공급원을 세포 또는 대상에 제공할 수 있다. 저장고 공급원은 지속되는 시간 기간에 걸쳐 mRNA로부터의 폴리펩티드 발현을 위한 지속적인 공급원으로서 작용할 수 있다.
상기 논의된 그리고 많은 기타 특징 및 본 발명의 수반되는 이점은 첨부된 실시예와 접합하여 취해질 때 본 발명의 다음 상세한 설명에 대한 참조로서 더 잘 이해될 것이다. 본 명세서에서 설명된 다양한 구체예는 본 명세서에서 포함된 교시를 고려하여 당업자에 의해 이해되는 방식으로 함께 결합되거나 또는 이용될 수 있다.
도면의 간단한 설명
도 1은 5' CMV 서열의 뉴클레오티드 서열 (서열번호:1)을 보여주고, 여기서 X는, 존재한다면 GGA이다.
도 2는 3' hGH 서열의 뉴클레오티드 서열 (서열번호:2)을 보여준다.
도 3은 인간 에리트로포이에틴 (EPO) mRNA의 뉴클레오티드 서열 (서열번호:3)을 보여준다. 이 서열은 5' 말단에서 서열번호: 1과 그리고 3' 말단에서 서열번호:2와 측면을 접할 수 있다.
도 4는 인간 알파-갈락토시다아제 (GLA) mRNA의 뉴클레오티드 서열 (서열번호:4)을 보여준다. 이 서열은 5' 말단에서 서열번호: 1과 그리고 3' 말단에서 서열번호:2와 측면을 접할 수 있다.
도 5는 인간 알파-1 항트립신 (A1AT) mRNA의 뉴클레오티드 서열 (서열번호:5)을 보여준다. 이 서열은 5' 말단에서 서열번호: 1과 그리고 3' 말단에서 서열번호:2와 측면을 접할 수 있다.
도 6은 인간 인자 IX (FIX) mRNA의 뉴클레오티드 서열 (서열번호:6)을 보여준다. 이 서열은 5' 말단에서 서열번호: 1과 그리고 3' 말단에서 서열번호:2와 측면을 접할 수 있다.
도 7은 ELISA를 통해 측정된 바와 같은 분비된 hEPO 단백질 수준의 정량화를 보여준다. 탐지된 단백질은 단일 용량의 다양한 지질 나노입자 제제를 통해 정맥내로 전달된 hEPO mRNA로부터 이의 생산의 결과이다. 제제 C12-200 (30 ug), HGT4003 (150 ug), ICE (100 ug), DODAP (200 ug)는 검사 항목 (제제1-4) 각각의 양이온/이온화 지질 성분으로 나타난다. 값은 투여-후 4시간의 혈액 샘플에 기반한다.
도 8은 단일 IV 용량의 인간 EPO mRNA-로딩된 지질 나노입자 (제제 1-4)로 처리된 생쥐의 헤마토크리트(hematocrit) 측정을 보여준다. 전체 혈액 샘플은 투여-후 4 시간 (제1일), 24 시간 (제2일), 4 일, 7 일, 및 10 일에 채취되었다.
도 9는 단일 IV 용량 또는 3회 주사 (제1일, 제3일, 제5일) 중 하나의 인간 EPO-mRNA-로딩된 지질 나노입자로 처리된 생쥐의 헤마토크리트 측정을 보여준다. 전체 혈액 샘플은 주사 (제-4일)에 앞서, 제7일, 및 제15일에 채취되었다. 제제 1이 투여되었다: (30 ug, 단일 용량) 또는 (3 x 10 ug, 투약 제1일, 제3일, 제5일); 제제 2가 투여되었다: (3 x 50 ug, 투약 제1일, 제3일, 제5일).
도 10는 ELISA를 통해 측정된 바와 같은 분비 인간 α-갈락토시다아제 (hGLA) 단백질 수준의 정량화를 보여준다. 탐지된 단백질은 지질 나노입자 (제제 1; 캡슐화 mRNA에 기반하여, 30 ug 단일 정맥내 용량)를 통해 전달된 hGLA mRNA로부터의 생산의 결과이다. hGLA 단백질은 48시간 내내 탐지된다.
도 11은 혈청내 hGLA 활성도를 보여준다. hGLA 활성도는 37℃에서 기질 4-메틸움벨리페릴-α-D-갈락토피라노시드 (4-MU-α-gal)를 이용하여 측정되었다. 데이터는 6 내지 9회의 개별적인 측정의 평균이다.
도 12는 ELISA를 통해 측정된 바와 같은 혈청내 hGLA 단백질 수준의 정량화를 보여준다. 단백질은 C12-200-기반 지질 나노입자 (C12-200:DOPE:Chol:DMGPEG2K, 40:30:25:5 (제제 1); 캡슐화 mRNA에 기반하여 30 ug mRNA, 단일 IV 용량)를 통해 전달된 hGLA mRNA로부터 생산된다. hGLA 단백질은 캡슐화 mRNA에 기반하여, 단일 정맥내 용량 당 72시간 내내 모니터링된다. hGLA 단백질은 72시간 내내 모니터링된다.
도 13은 ELISA를 통해 측정된 바와 같은 간, 신장, 및 비장내 hGLA 단백질 수준의 정량화를 보여준다. 단백질은 C12-200-기반 지질 나노입자 (제제 1; 캡슐화 mRNA에 기반하여 30 ug mRNA, 단일 IV 용량)를 통해 전달된 hGLA mRNA로부터 생산된다. hGLA 단백질은 72시간 내내 모니터링된다.
도 14는 혈청 (A) 및 간 (B)내 분비 MRT-파생 인간 GLA 단백질과 같은 hGLA의 단백질 생산을 모니터링한 용량 반응 연구를 보여준다. 샘플은 투여-후 (제제 1; 단일 용량, IV, N=4 생쥐/그룹) 24시간에 측정되었고 그리고 ELISA를 통해 정량화되었다.
도 15는 무흉선 누드 생쥐(nude mice)에서의 ERT-기반 알파-갈락토시다아제 (40 ug/kg 용량) 및 MRT로부터 생산된 hGLA 단백질 (제제 1; 1.0 mg/kg mRNA 용량)의 약동학적 프로필을 보여준다.
도 16은 ELISA를 이용하여 측정된 바와 같은 MRT-처리 파브리 생쥐내 분비 hGLA 단백질 수준의 정량화를 보여준다. hGLA 단백질은 C12-200-기반 지질 나노입자 (제제 1; 캡슐화 mRNA에 기반하여, 단일 정맥내 용량 당 10 ug mRNA)를 통해 전달된 hGLA mRNA로부터 생산된다. 혈청은 72시간 내내 모니터링된다.
도 17은 ELISA를 통해 측정된 바와 같은 MRT-처리 파브리 KO 생쥐의 간, 신장, 비장, 및 심장내 hGLA 단백질 수준의 정량화를 보여준다. 단백질은 C12-200-기반 지질 나노입자 (제제 1; 캡슐화 mRNA에 기반하여 30 ug mRNA, 단일 IV 용량)를 통해 전달된 hGLA mRNA로부터 생산된다. hGLA 단백질은 72시간 내내 모니터링된다. 정상적인 생리학적 수준을 나타내는 문헌 값은 파선으로 그래프화된다.
도 18은 ELISA를 이용하여 측정된 바와 같은 MRT 및 알파-갈락토시다아제-처리 파브리 생쥐내 분비 hGLA 단백질 수준의 정량화를 보여준다. 두 가지 치료법 모두 단일 1.0 mg/kg 정맥내 용량으로 투약되었다.
도 19는 ELISA를 통해 측정된 바와 같은 MRT 및 ERT (알파-갈락토시다아제)-처리 파브리 KO 생쥐의 간, 신장, 비장, 및 심장내 hGLA 단백질 수준의 정량화를 보여준다. 단백질은 지질 나노입자 (제제 1; 캡슐화 mRNA에 기반하여 1.0 mg/kg mRNA, 단일 IV 용량)를 통해 전달된 hGLA mRNA로부터 생산되었다.
도 20은 처리된 및 비처리된 생쥐의 신장내 글로보트리오아실세라미드(globotrioasylceramide) (Gb3) 및 리소-Gb3의 상대적인 정량화를 보여준다. 수컷 파브리 KO 생쥐는 1.0 mg/kg의 GLA mRNA-로딩된 지질 나노입자 또는 알파-갈락토시다아제 중 하나의 단일 용량으로 처리되었다. 양은 투여-후 1주의 Gb3/리소-Gb3의 양을 나타낸다.
도 21은 처리된 및 비처리된 생쥐의 심장내 글로보트리오아실세라미드 (Gb3) 및 리소-Gb3의 상대적인 정량화를 보여준다. 수컷 파브리 KO 생쥐는 1.0 mg/kg의 GLA mRNA-로딩된 지질 나노입자또는 알파-갈락토시다아제 중 하나의 단일 용량으로 처리되었다. 양은 투여-후 1주의 Gb3/리소-Gb3의 양을 나타낸다.
도 22는 혈청내 분비 MRT-파생 인간 GLA 단백질로서 GLA의 단백질 생산을 모니터링한 용량 반응 연구를 보여준다. 샘플은 HGT4003 (제제 3) 또는 HGT5000-기반 지질 나노입자 (제제 5) 중 하나의 투여-후 (단일 용량, IV, N=4 생쥐/그룹) 24시간에 측정되었고 그리고 ELISA를 통해 정량화되었다.
도 23은 혈청 (A)에서 또는 간, 신장, 및 비장 (B)에서 측정된 바와 같은 hGLA 단백질 생산을 보여준다. 샘플은 HGT5001-기반 지질 나노입자 (제제 6)의 투여-후 (단일 용량, IV, N=4 생쥐/그룹) 6시간 및 24시간에 측정되었고 그리고 ELISA를 통해 정량화되었다.
도 24는 ELISA를 이용하여 측정된 분비 인간 인자 IX 단백질 수준의 정량화를 보여준다 (평균 ng/mL ± 표준 편차). FIX 단백질은 C12-200-기반 지질 나노입자 (C12-200:DOPE:Chol:DMGPEG2K, 40:30:25:5 (제제 1); 캡슐화 mRNA에 기반하여, 단일 정맥내 용량 당 30 ug mRNA)를 통해 전달된 FIX mRNA로부터 생산된다. FIX 단백질은 72시간 내내 모니터링된다. (n=24 생쥐)
도 25는 ELISA를 이용하여 측정된 분비 인간 α-1-항트립신 (A1AT) 단백질 수준의 정량화를 보여준다. A1AT 단백질은 C12-200-기반 지질 나노입자 (C12-200:DOPE:Chol:DMGPEG2K, 40:30:25:5 (제제 1); 캡슐화 mRNA에 기반하여, 단일 정맥내 용량 당 30 ug mRNA)를 통해 전달된 A1AT mRNA로부터 생산된다. A1AT 단백질은 24시간 내내 모니터링된다.
도 26은 hEPO mRNA-로딩된 나노입자 (측정된 mIU) (C12-200, HGT5000, 또는 HGT5001-기반 지질 나노입자; 각각 제제 1, 5, 6)의 기관내(intratracheal) 투여 후 처리된 생쥐의 폐 및 혈청에서 탐지된 hEPO 단백질의 ELISA-기반 정량화를 보여준다. 동물은 투여-후 6시간에 희생되었다 (그룹 당 n=4 생쥐).
예시적인 구체예의 설명
본 발명은 분비 기능적 단백질의 치료학적 수준의 생산을 위해 하나 이상의 표적 세포에 리포좀 수송 비히클내 RNA의 세포내 전달을 위한 조성물 및 방법을 제공한다.
단백질 또는 효소를 수식하는 데에 본 명세서에서 사용된 바와 같은 용어 "기능적"은 단백질 또는 효소가 생물학적 활성도를 가지거나, 대안으로 원래의 또는 정상적으로-기능하는 단백질 또는 효소와 동일하거나, 유사한 기능을 수행할 수 있다는 점을 의미한다. 본 발명의 mRNA 조성물은 다양한 대사 또는 유전 질환, 그리고 특히 단백질 또는 효소의 비-발현, 잘못된 발현 또는 결핍을 수반하는 이들 유전 또는 대사 질환의 치료를 위해 유용하다. 용어 "치료학적 수준"은 대조군 수준을 넘는 혈액 또는 조직에서 탐지되는 단백질 수준을 나타내며, 여기서 대조군은 정상적인 생리학적 수준이거나, mRNA 조성물의 투여에 앞서 대상내 수준일 수 있다. 용어 "분비된"은 세포외 공간에서, 표적 세포 밖에서 탐지된 단백질을 나타낸다. 단백질은 혈액 또는 조직에서 탐지될 수 있다. 본 발명의 맥락에서, 용어 "생산된"은 단백질 또는 효소 내로 적어도 하나의 mRNA의 번역을 나타내는 데에 가장 넓은 의미에서 사용된다. 본 명세서에서 제공된 바와 같이, 조성물은 수송 비히클을 포함한다. 본 명세서에서 사용된 바와 같이, 용어 "수송 비히클"은 핵산을 포함한, 생물학적으로 활성인 물질의 투여와 관련하여 이용하기 위해 일반적으로 의도되는 표준 제약학적 담체, 희석제, 부형제 등 중 어느 하나를 포함한다. 본 명세서에서 설명된 조성물 그리고 특히 수송 비히클은 표적 세포에 mRNA를 전달할 수 있다. 구체예에서, 수송 비히클은 지질 나노입자이다.
mRNA
본 발명의 조성물내 mRNA는 예를 들어, 분비 호르몬, 효소, 수용체, 폴리펩티드, 펩티드 또는 정상적으로 분비되는 다른 관심 단백질을 인코딩할 수 있다. 본 발명의 구체예에서, mRNA는 예를 들어, 이러한 mRNA의 안정도 및/또는 반감기를 개선하는 또는 단백질 생산을 개선하거나 그렇지 않으면 촉진시키는 화학적 또는 생물학적 변형을 선택적으로 가질 수 있다.
본 발명의 방법은 예를 들어, 2개의 특유의 mRNA를 단일 수송 비히클 내로 결합시킴으로써, 표적 세포에 하나 이상의 특유의 mRNA의 선택적 공동-전달에 대해 제공한다. 본 발명의 한 가지 구체예에서, 치료학적 1차 mRNA, 및 치료학적 2차 mRNA는 단일 수송 비히클로 제조되고 투여될 수 있다. 본 발명은 치료학적 1차 mRNA의 기능 또는 전달을 촉진시키고 및/또는 증진시키기 위해 치료학적 1차 mRNA와 2차 핵산의 공동-전달 및/또는 공동-투여를 또한 고려한다. 예를 들어, 이러한 2차 핵산 (가령, 외인성 또는 합성 mRNA)은 발현 (가령, 외인성 또는 합성 mRNA의 번역)시 1차 mRNA의 전달을 촉진시키고 또는 이의 생물학적 활성도를 증진시키는 막 수송 단백질을 인코딩할 수 있다. 대안으로, 치료학적 1차 mRNA는 치료학적 1차 mRNA 어느 하나의 접힘을 유도하기 위해 예를 들어, "샤페론(chaperone)"으로서 기능하는 2차 핵산과 함께 투여될 수 있다.
본 발명은 단일 질환 또는 결핍을 치료하기 위해 하나 이상의 치료학적 핵산의 전달에 대해 또한 제공하며, 여기서 이러한 치료학적 핵산 각각은 상이한 작용 메커니즘에 의해 기능한다. 예를 들어, 본 발명의 조성물은 예를 들어, 내인성 단백질 또는 효소 결핍을 보정하기 위해 투여되는, 그리고 기능부전의 내인성 핵산 및 이의 단백질 또는 효소 산물을 비활성시키거나 "넉-다운(knock-down)"시키기 위해 투여되는 2차 핵산을 수반하는 치료학적 1차 mRNA를 포함할 수 있다. 이러한 "2차" 핵산은 예를 들어 mRNA 또는 siRNA를 인코딩할 수 있다.
형질감염시, 본 발명의 조성물내 천연 mRNA는 30분 내지 여러 날의 반감기로 분해될 수 있다. 본 발명의 조성물내 mRNA는 번역될 적어도 어느 정도의 능력을 바람직하게 보유하고, 그렇게 함으로써 기능적 분비 단백질 또는 효소를 생산한다. 따라서, 본 발명은 안정화된 mRNA를 투여하는 방법 및 이를 포함하는 조성물을 제공한다. 본 발명의 몇몇 구체예에서, mRNA의 활성도는 연장된 시간 기간에 걸쳐 지속된다. 예를 들어, mRNA의 활성도는 본 발명의 조성물이 매주 2회 또는 2주 마다, 또는 더욱 바람직하게는 월마다, 2개월마다, 매년 4회 또는 매년 대상에게 투여되도록 지속될 수 있다. 본 발명의 mRNA의 연장된 또는 지속된 활성도는 이러한 mRNA로부터 생산된 분비된 기능적 단백질 또는 효소의 양과 직접적으로 관련된다. 유사하게도, 본 발명의 조성물의 활성도는 mRNA의 번역을 개선하거나 증진시키도록 만들어진 변형에 의해 추가로 연장되거나 지속될 수 있다. 추가적으로, 표적 세포에 의해 생산된 기능적 단백질 또는 효소의 양은 표적 세포에 전달된 mRNA의 양 그리고 이러한 mRNA의 안정도의 함수이다. 본 발명의 mRNA의 안정도가 개선되거나 증진될 수 있는 정도까지, 반감기, 생산된 분비 단백질 또는 효소의 활성도 및 조성물의 투약 빈도가 추가로 연장될 수 있다.
이에 따라, 몇몇 구체예에서, 본 발명의 조성물내 mRNA는 예를 들어, 생체내 뉴클레아제 소화에 대한 개선된 저항을 포함하여, 핵산에 대한 개선된 또는 증진된 안정도를 부여하는 적어도 한 가지 변형을 포함한다. 본 명세서에서 사용된 바와 같이, 용어 "변형" 및 "변형된"은 이러한 용어가 본 명세서에서 제공된 핵산과 관련되므로, 바람직하게는 안정도를 증진시키고 야생형 또는 자연적으로 발생하는 버전의 mRNA보다 더욱 안정한 mRNA (가령, 뉴클레아제 소화에 대한 저항)를 만드는 적어도 하나의 변경을 포함한다. 본 명세서에서 사용된 바와 같이, 용어 "안정한" 및 "안정도"는 이러한 용어가 본 발명의 핵산과 관련, 특히 mRNA와 관련되므로, 예를 들어 이러한 mRNA을 정상적으로 분해할 수 있는 뉴클레아제 (즉, 엔도뉴클레아제 또는 엑소뉴클레이제)에 의한 분해에 대한 증가된 또는 증진된 저항을 나타낸다. 증가된 안정도는 예를 들어, 가수분해 또는 내인성 효소 (가령, 엔도뉴클레아제 또는 엑소뉴클레아제)에 의한 다른 파괴에 대한 더 적은 민감도 또는 표적 세포 또는 조직 내의 상태를 포함할 수 있고, 그렇게 함으로써 표적 세포, 조직, 대상 및/또는 세포질내 이러한 mRNA의 저항을 증가시키거나 증진시킨다. 본 명세서에서 제공된 안정화된 mRNA 분자는 그들의 자연적으로 발생하고, 비변형 상대물 (가령, 야생형 버전의 mRNA)에 비해 더 긴 반감기를 입증한다. 예를 들어,　단백질 번역의 개시에서 기능하는 서열　(가령, Kozac 공통 서열)의 함유를 포함하여, mRNA　핵산의 번역을 개선하거나 증진시키는 변경이 본 발명의　mRNA와 관련된 용어로서 용어 "변형"　및　 "변형된"에 의해 또한 고려된다. (Kozak, M., Nucleic Acids Res 15 (20): 8125-48 (1987)).
몇몇 구체예에서, 본 발명의 mRNA는 그들을 더 안정하게 만들기 위해 화학적 또는 생물학적 변형을 겪었다. mRNA에 대한 예시적인 변형은 염기의 소모 (가령, 고갈에 의해 또는 하나의 뉴클레오티드로 다른 것을 치환함으로써) 또는 염기의 변형, 예를 들어 염기의 화학적 변형을 포함한다. 본 명세서에서 사용된 바와 같은 구절 "화학적 변형"은 자연적으로 발생하는 mRNA에서 관찰되는 것들과 상이한 화학물을 도입한 변형, 예를 들어 변형된 뉴클레오티드 (가령, 뉴클레오티드 유사체, 또는 이러한 mRNA 분자에서 자연적으로 발견되지 않는 펜던트 기(pendant group)의 함유)의 도입과 같은 공유적 변형을 포함한다.
추가적으로, 적합한 변형은 코돈(codon)이 야생형 버전의 mRNA에서 발견된 코돈과 동일한 아미노산을 인코딩하지만 상기 발견된 코돈보다 더욱 안정하도록 코돈의 뉴클레오티드 하나 이상에서의 변경을 포함한다. 예를 들어, RNA의 안정도와 더 높은 수의 시티딘 (C's) 및/또는 우리딘 (U's) 잔기 사이의 역관계가 입증되었고, 그리고 C와 U 잔기가 없는 RNA가 대부분의 RNase에 대해 안정한 것으로 밝혀졌다 (Heidenreich, et al. J Biol Chem 269, 2131-8 (1994)). 몇몇 구체예에서, mRNA 서열내 C 및/또는 U 잔기 수는 감소된다. 또 다른 구체예에서, C 및/또는 U 잔기 수는 특정한 아미노산을 인코딩하는 하나의 코돈으로 동일한 또는 관련된 아미노산을 인코딩하는 다른 코돈을 치환함으로써 감소된다. 본 발명의 mRNA 핵산에 대한 고려되는 변형은 유사우리딘의 편입을 또한 포함한다. 본 발명의 mRNA 핵산 내로 유사우리딘의 편입은 안정도 및 전사 능력을 증진시킬 수 있고 그리고 생체내 면역원성을 감소시킬 수 있다. 가령, Kariko, K., et al., Molecular Therapy 16 (11): 1833-1840 (2008)을 참조. 본 발명의 mRNA에 대한 치환 및 변형은 당분야의 당업자에게 쉽게 공지된 방법에 의해 수행될 수 있다.
서열내 C 및 U 잔기 수를 감소시키는 것의 제약은 비번역된 영역과 비교하여 mRNA의 코딩 영역 내에서 더 클 가능성이 있을 것이다, (즉, 메시지(message)에 존재하는 모든 C 및 U 잔기를 제거하는 반면에 바람직한 아미노산 서열을 인코딩하기 위해 메시지의 능력을 여전히 보유하는 것이 가능하지 않을 것이다). 하지만, 유전자 코드의 축퇴(degeneracy)는 서열내 존재하는 C 및/또는 U 잔기 수가 감소되도록 하는 반면에, 동일한 코딩 능력을 유지시키도록 하는 기회를 제시한다 (즉, 어느 아미노산이 코돈에 의해 인코딩되는 지에 따라서, RNA 서열의 변형에 대한 여러 가지 상이한 가능성이 가능할 수 있다). 예를 들어, Gly에 대한 코돈은 GGU 또는 GGC 대신 GGA 또는 GGG로 변경될 수 있다.
용어 변형은 예를 들어, 본 발명의 mRNA 서열 내로 비-뉴클레오티드 연결 또는 변형된 뉴클레오티드의 편입을 또한 포함한다 (가령, 기능적 분비 단백질 또는 효소를 인코딩하는 mRNA 분자의 3' 및 5' 말단 중 하나 또는 둘 모두에 대한 변형). 이러한 변형은 mRNA 서열에 염기의 첨가 (가령, 폴리 A 꼬리 또는 더 긴 폴리 A 꼬리의 함유), 물질 (가령, 단백질 또는 상보적인 핵산 분자)과 mRNA를 복합시켜, 3' UTR 또는 5' UTR의 변형, 및 mRNA 분자의 구조를 변화시키는 (가령, 2차 구조를 형성하는) 요소의 함유를 포함한다.
폴리 A 꼬리는 천연 전령을 안정화하기 위한 것으로 간주된다. 따라서, 한 가지 구체예에서, 긴 폴리 A 꼬리는 mRNA 분자에 첨가되어 mRNA를 더 안정하게 만들 수 있다. 폴리 A 꼬리는 여러 가지 당분야에서-공지된 기술을 이용하여 첨가될 수 있다. 예를 들어, 긴 폴리 A 꼬리는 폴리 A 폴리머라아제를 이용하여 합성 또는 시험관내 전사된 mRNA에 첨가될 수 있다 (Yokoe, et al. Nature Biotechnology. 1996; 14: 1252-1256). 전사 벡터는 긴 폴리 A 꼬리를 또한 인코딩할 수 있다. 추가적으로, 폴리 A 꼬리는 PCR 산물로부터 직접적으로 전사에 의해 첨가될 수 있다. 한 가지 구체예에서, 폴리 A 꼬리의 길이는 적어도 약 90, 200, 300, 400 적어도 500개 뉴클레오티드이다. 한 가지 구체예에서, 본 발명의 변형된 mRNA 분자의 안정도를 제어하고, 따라서, 단백질의 전사를 제어하기 위해 폴리 A 꼬리의 길이가 조정된다. 예를 들어, 폴리 A 꼬리의 길이가 mRNA 분자의 반감기에 영향을 줄 수 있기 때문에, 뉴클레아제에 대한 mRNA의 저항의 수준을 변형하고 따라서 세포내 단백질 발현의 시간 경과를 제어하기 위해 폴리 A 꼬리의 길이가 조정될 수 있다. 한 가지 구체예에서, 안정화된 mRNA 분자는 그들이 수송 비히클 없이 표적 세포에 전달될 수 있도록, 생체내 분해 (가령, 뉴클레아제에 의해)에 대해 충분히 저항이 있다.
한 가지 구체예에서, mRNA는 야생형 mRNA에서 자연적으로 발견되지 않는 3' 및/또는 5' 비번역 (UTR) 서열의 편입에 의해 변형될 수 있다. 한 가지 구체예에서, 자연적으로 mRNA 측면에 있는 및 2차, 비관련 단백질을 인코딩하는 3' 및/또는 5' 인접 서열(flanking sequence)은 이를 변형시키기 위하여 치료학적 또는 기능적 단백질을 인코딩하는 mRNA 분자의 뉴클레오티드 서열 내로 편입될 수 있다. 예를 들어, 안정한 mRNA 분자 (가령, 글로빈, 액틴, GAPDH, 튜불린, 히스톤, 또는 시트르산 회로 효소)로부터의 3' 또는 5' 서열은 센스 mRNA 분자의 안정도를 증가시키기 위해 센스 mRNA 핵산 분자의 3' 및/또는 5' 영역 내로 편입될 수 있다. 가령, US2003/0083272를 참조.
몇몇 구체예에서, 본 발명의 조성물내 mRNA는 뉴클레아제 저항을 개선하고 및/또는 mRNA의 반감기를 개선하기 위해 CMV 즉시-초기 1 (IE1) 유전자의 부분적인 서열, 또는 이의 단편 (가령, 서열번호:1)을 포함하기 위한 mRNA의 5' 말단의 변형을 포함한다. mRNA 핵산 서열의 안정도를 증가시키는 것 외에도, CMV 즉시-초기 1 (IE1) 유전자의 부분적인 서열의 함유가 mRNA의 번역 및 기능적 단백질 또는 효소의 발현을 증진시킨다는 점이 놀랍게도 발견되었다. mRNA를 추가로 안정화시키기 위해 핵산의 3' 말단 (가령, mRNA)에 인간 성장 호르몬 (hGH) 유전자 서열, 또는 이의 단편 (가령, 서열번호:2)의 함유가 또한 고려된다. 일반적으로, 바람직한 변형은 그들의 비변형 상대물에 비해 mRNA의 안정도 및/또는 약동학적 특성 (가령, 반감기)을 개선하고, 그리고 예를 들어, 생체내 뉴클레아제 소화에 대한 이러한 mRNA의 저항을 개선하도록 하는 변형을 포함한다.
서열번호:1 및/또는 서열번호:2의 핵산 서열의 변이체가 추가로 고려되며, 여기서 변이체는 mRNA의 안정화 및 약동학적 특성 (가령, 반감기)을 포함하여 핵산의 기능적인 특성을 유지한다. 변이체는 서열번호:1 또는 서열번호:2과 90% 초과, 95% 초과, 98% 초과, 또는 99% 초과의 서열 동일성을 가질 수 있다.
몇몇 구체예에서, 조성물은 안정화 시약을 포함할 수 있다. 조성물은 mRNA에 직접적으로 또는 간접적으로 결합하고, 안정화하는, 따라서 표적 세포내 체류 시간을 증진시키는 하나 이상의 제제 시약을 포함할 수 있다. 이러한 시약은 바람직하게 표적 세포내 mRNA의 개선된 반감기를 야기한다. 예를 들어, mRNA의 안정도 및 번역의 효능은 세포 내에서 자연적으로 발생하는 mRNA와의 복합체를 형성하는 "안정화 시약"의 편입에 의해 증가될 수 있다 (가령, 미국 특허 번호 제5,677,124호를 참조). 안정화 시약의 편입은 예를 들어, 수송 비히클 내로 mRNA를 로딩하거나 캡슐화하기 전 시험관 내에서 안정화되도록 mRNA를 폴리 A 및 단백질과 결합시킴으로써 성취될 수 있다. 예시적인 안정화 시약은 하나 이상의 단백질, 펩티드, 압타머, 번역 부속 단백질, mRNA 결합 단백질, 및/또는 번역 개시 인자를 포함한다.
조성물의 안정화는 전형적으로 수송 비히클에 화학적으로 또는 생리학적으로 결합 (가령, 스스로 막 내로 지질-용해성 앵커(anchor)의 층간삽입(intercalation)에 의해, 또는 막 지질의 활성기에 직접적으로 결합함으로써)된 거대 친수성 폴리머인, 옵소닌화-저해 모이어티의 용도에 의해 또한 개선될 수 있다. 이들 옵소닌화-저해 친수성 폴리머는 대식세포-단핵구 시스템 및 세망-내피 시스템에 의한 리포좀의 흡수를 상당히 감소시키는 보호 표면 층을 형성한다 (가령, 미국 특허 번호 제4,920,016호에서 설명된 바와 같이, 이의 전체 개시는 참조로서 본 명세서 편입됨). 따라서 옵소닌화-저해 모이어티로 변형된 수송 비히클은 그들의 비변형 상대물보다 훨씬 더 오래 순환에서 남아있다.
RNA가 상보적인 핵산 분자 (가령, DNA 또는 RNA)와 하이브리드화 될 때 이는 뉴클레아제로부터 보호될 수 있다. (Krieg, et al. Melton. Methods in Enzymology. 1987; 155, 397-415). 하이브리드화된 mRNA의 안정도는 대부분의 RNase의 고유 단일 가닥 특이성에 기인한 것일 수 있다. 몇몇 구체예에서, mRNA를 복합시키기 위해 선택된 안정화 시약은 진핵생물 단백질(eukaryotic protein) (가령, 포유류 단백질)이다. 또 다른 구체예에서, mRNA는 2차 핵산 분자와의 하이브리드화에 의해 변형될 수 있다. 전체 mRNA 분자가 상보적인 핵산 분자와 하이브리드화된다면, 번역 개시가 감소될 수 있다. 몇몇 구체예에서, mRNA 분자의 5' 비번역 영역 및 AUG 시작 영역은 선택적으로 하이브리드화되지 않은 채로 남아있을 수 있다. 번역 개시 후, 리보솜 복합체의 풀림(unwinding) 활성도는 번역이 진행될 수 있게 하기 위하여 고 친화성 이중복합체에서도 기능할 수 있다. (Liebhaber. J. Mol. Biol. 1992; 226: 2-13; Monia, et al. J Biol Chem. 1993; 268: 14514-22.)
mRNA의 안정도를 증진시키기 위한 상기 설명된 방법 중 어느 하나가 단독으로 또는 다른 상기-설명된 방법 및/또는 조성물 중 어느 하나 이상과 조합하여 이용될 수 있다는 점이 이해될 것이다.
본 발명의 mRNA는 예를 들어, 표적 세포 또는 조직으로의 mRNA 전달의 결정을 촉진시키는 리포터 유전자(reporter gene) (가령, mRNA의 코딩 영역의 업스트림 또는 다운스트림)와 선택적으로 결합될 수 있다. 적합한 리포터 유전자는 예를 들어, 녹색 형광 단백질 mRNA (GFP mRNA), 레닐라(Renilla) 루시퍼라아제 mRNA (Luciferase mRNA), 반딧불이 루시퍼라아제 mRNA, 또는 이들의 임의의 조합을 포함할 수 있다. 예를 들어, GFP mRNA는 단백질 생산을 위한 저장고로서 작용할 표적 세포내 mRNA 국소화(localization)의 확정을 촉진시키기 위해 분비가능한 단백질을 인코딩하는 mRNA와 융합될 수 있다.
본 명세서에서 사용된 바와 같이, 용어 "형질감염하다" 또는 "형질감염"은 세포 내로, 또는 바람직하게는 표적 세포내로 mRNA의 세포내 도입을 의미한다. 도입된 mRNA는 표적 세포에서 안정하게 또는 일시적으로 유지될 수 있다. 용어 "형질감염 효능"은 형질감염에 대한 대상인 표적 세포에 의해 흡수된 mRNA의 상대적인 양을 나타낸다. 실시에서, 형질감염 효능은 형질감염 후 표적 세포에 의해 발현된 리포터 핵산 산물의 양에 의해 추정된다. 바람직한 구체예는 높은 형질감염 효능을 가진 조성물 그리고 특히 비-표적 세포의 형질감염에 의해 매개되는 부작용을 최소화하는 이들 조성물을 포함한다. 높은 형질감염 효능을 입증하는 본 발명의 조성물은 적당한 투여량의 mRNA가 표적 세포에 전달되고 한편으로는, 잠재적인 전신성 부작용을 최소화할 가능성을 개선한다. 본 발명의 한 가지 구체예에서, 본 발명의 수송 비히클은 거대 mRNA 서열 (가령, 적어도 1kDa, 1.5kDa, 2 kDa, 2.5kDa, 5kDa, 10kDa, 12kDa, 15kDa, 20kDa, 25kDa, 30kDa, 또는 그 이상의 mRNA)을 전달할 수 있다. mRNA는 표적 세포에 이러한 mRNA을 전달하기 위한 비히클을 제공하는, 하나 이상의 허용가능한 시약을 이용하여 제조될 수 있다. 적절한 시약은 다른 것들 중에서도, mRNA의 생물학적 또는 화학적 특성, 투여의 의도된 경로, 이러한 mRNA가 노출될 것으로 예상되는 생물학적 환경 및 의도된 표적 세포의 특이적인 특성을 포함한 다수의 요인과 관련하여 일반적으로 선택된다. 몇몇 구체예에서, 수송 비히클, 가령 리포좀은 생물학적 활성도를 약화시킴 없이 mRNA를 캡슐화한다. 몇몇 구체예에서, 수송 비히클은 비-표적 세포에 비해 표적 세포와의 바람직한 및/또는 실질적인 결합을 입증한다. 바람직한 구체예에서, 수송 비히클은 mRNA가 적절한 세포하 구획, 가령 세포질에 전달되도록 상기 비히클의 함유물을 표적세포에 전달한다.
수송 비히클
구체예에서, 본 발명의 조성물내 수송 비히클은 리포좀 수송 비히클, 가령 지질 나노입자이다. 한 가지 구체예에서, 수송 비히클은 표적 세포에 mRNA의 전달을 최적화하도록 선택 및/또는 제조될 수 있다. 예를 들어, 표적 세포가 간세포라면, 수송 비히클의 특성 (가령, 크기, 전하 및/또는 pH)은 표적 세포에 이러한 수송 비히클을 효과적으로 전달하기 위해, 면역 클리어런스(immune clearance)를 감소시키기 위해 및/또는 그 표적 세포에서의 잔류를 촉진시키기 위해 최적화될 수 있다. 대안으로, 표적 세포가 중추 신경계라면 (가령, 신경퇴행성 질병의 치료를 위해 투여된 mRNA는 뇌 또는 척추 신경을 특이적으로 표적할 수 있음), 수송 비히클의 선택 및 제조는 혈액 뇌 장벽(blood brain barrier)의 침투 및 혈액 뇌 장벽 내에서의 잔류 및/또는 이러한 표적 세포에 이러한 수송 비히클을 직접적으로 전달하는 대안적인 수단의 용도를 고려해야 한다. 한 가지 구체예에서, 본 발명의 조성물은 외인성 mRNA의 수송을 촉진시키는 물질 (가령, 혈관 뇌 장벽의 투과성을 방해하거나 개선하고 그렇게 함으로써 표적 세포로 외인성 mRNA의 수송을 증진시키는 물질)과 결합될 수 있다.
표적 세포에 핵산의 전달을 촉진시키기 위한 리포좀 수송 비히클의 용도가 본 발명에 의해 고려된다. 리포좀 (가령, 리포좀 지질 나노입자)은 연구, 산업 및 의약내 여러 가지 적용에서, 특히 생체내 진단적 또는 치료학적 화합물의 수송 비히클로서 그들의 용도를 위해 일반적으로 유용하고 (Lasic, Trends Biotechnol., 16: 307-321, 1998; Drummond et al., Pharmacol. Rev., 51: 691-743, 1999) 그리고 하나 이상의 이중층의 막에 의해 바깥쪽 배지로부터 격리된 내부 아쿠아(aqua) 공간을 가진 미시적인 소포체로서 주로 특징된다. 리포좀의 이중층 막은 공간적으로 분리된 친수성 및 소수성 도메인을 포함하는 양쪽친매성 분자, 가령 합성 또는 천연 기원의 지질에 의해 전형적으로 형성된다 (Lasic, Trends Biotechnol., 16: 307-321, 1998). 리포좀의 이중층 막은 양쪽친매성 폴리머 및 계면활성제 (가령, 폴리머로좀, 니오좀 등)에 의해 또한 형성될 수 있다.
본 발명의 맥락에서, 리포좀 수송 비히클은 전형적으로 표적 세포에 mRNA를 수송하는 역할을 한다. 본 발명의 목적을 위하여, 리포좀 수송 비히클은 바람직한 핵산을 함유하도록 제조된다. 리포좀 내로 바람직한 실체(entity) (가령, 핵산)의 편입 공정은 종종 "로딩"으로서 언급된다 (Lasic, et al., FEBS Lett., 312: 255-258, 1992). 리포좀-편입 핵산은 리포좀의 내부 공간 안에, 리포좀의 이중층 막 내에, 또는 리포좀 막의 외부 표면과 연관되어 완전하게 또는 부분적으로 위치될 수 있다. 리포좀 내로 핵산의 편입은 "캡슐화"로서 본 명세서에서 또한 언급되며 여기서 핵산은 리포좀의 내부 공간 내에 완전히 함유된다. 수송 비히클, 가령 리포좀 내로 mRNA를 편입시키는 목적은 종종, 핵산을 분해하는 효소 또는 화학 물질 및/또는 핵산의 빠른 배출을 야기하는 시스템 또는 수용체를 함유할 수 있는 환경으로부터 핵산을 보호하기 위함이다. 이에 따라, 본 발명의 바람직한 구체예에서, 선택된 수송 비히클은 그 안에 함유된 mRNA의 안정도를 증진시킬 수 있다. 리포좀은 캡슐화 mRNA를 표적 세포에 도달하도록 할 수 있고 및/또는 캡슐화 mRNA가 표적 세포에 도달하도록 바람직하게 할 수 있고, 또는 대안으로, 투여된 mRNA의 존재가 쓸모 없거나 바람직하지 않을 수 있는 다른 부위 또는 세포로의 이러한 mRNA의 전달을 제한할 수 있다. 추가적으로, 수송 비히클, 가령 양이온 리포좀 내로 mRNA를 편입시키는 것은 표적 세포 내로 이러한 mRNA의 전달을 또한 촉진시킨다.
이상적으로, 리포좀 수송 비히클은 조성물이 높은 형질감염 효능과 증진된 안정도를 입증하도록 하나 이상의 바람직한 mRNA를 캡슐화하기 위해 제조된다. 리포좀은 표적 세포 내로 핵산의 도입을 촉진시킬 수 있으며 한편으로, 코폴리머(copolymer)로서, 폴리양이온 (가령, 폴리 L-리신 및 프로타민)의 첨가는 시험관내 및 생체내 둘 모두의 많은 세포주에서 2-28배까지 여러 가지 유형의 양이온 리포좀의 형질감염 효능을 촉진시키고, 그리고 예를 들어 상기 효능을 두드러지게 증진시킬 수 있다. (N.J. Caplen, et al., Gene Ther. 1995; 2: 603; S. Li, et al., Gene Ther. 1997; 4, 891을 참조.)
지질 나노입자
본 발명의 바람직한 구체예에서, 수송 비히클은 지질 나노입자로서 조제된다. 본 명세서에서 사용된 바와 같이, 구절 "지질 나노입자"는 하나 이상의 지질 (가령, 양이온 지질, 비-양이온 지질, 및 PEG-변형 지질)을 포함한 수송 비히클을 나타낸다. 바람직하게, 지질 나노입자는 하나 이상의 표적 세포에 하나 이상의 mRNA를 전달하도록 조제된다. 적합한 지질의 예시는 예를 들어, 포스파티딜 화합물 (가령, 포스파티딜글리세롤, 포스파티딜콜린, 포스파티딜세린, 포스파티딜에탄올아민, 스핑고지질, 세레브로사이드, 및 갱글리오사이드)을 포함한다. 단독으로 또는 다른 수송 비히클과 조합할지에 대해, 수송 비히클로서 폴리머의 용도가 또한 고려된다. 적합한 폴리머는 예를 들어, 폴리아크릴레이트, 폴리알킬시아노아크릴레이트, 폴리락타이드, 폴리락타이드-폴리글리콜라이드 코폴리머, 폴리카프로락톤, 덱스트란, 알부민, 젤라틴, 알기네이트, 콜라겐, 키토산, 사이클로덱스트린, 덴드리머 및 폴리에틸렌이민을 포함할 수 있다. 한 가지 구체예에서, 수송 비히클은 표적 세포에 mRNA의 형질감염을 촉진시키는 이의 능력에 기반하여 선택된다.
본 발명은 단백질 생산을 위한 저장고로서 작용할 표적 세포 내로 mRNA의 전달을 캡슐화 및/또는 증진시키기 위해 양이온 지질을 포함하는 수송 비히클로서 지질 나노입자의 용도를 고려한다. 본 명세서에서 사용된 바와 같이, 구절 "양이온 지질"은 선택된 pH, 가령 생리학적 pH에서 순 양전하(net positive charge)를 지니는 다수의 지질 종류 중 어느 하나를 나타낸다. 고려되는 지질 나노 입자는 하나 이상의 양이온 지질, 비-양이온 지질 및 PEG-변형 지질을 이용하여 가변비 (varying ratio)의 다수-성분 지질 혼합물을 포함함으로써 제조될 수 있다. 여러 가지 양이온 지질은 문헌에서 설명되었으며, 이들 중 다수는 상업적으로 이용가능하다.
본 발명의 조성물 및 방법에서 이용하기 위해 특정하게 적합한 양이온 지질은 참조로서 본 명세서에 편입된, 국제 특허 공개공보 WO 2010/053572에서 설명된 것들, 그 중 가장 특히, WO 2010/053572의 문단 [00225]에서 설명된 C12-200을 포함한다. 특정한 구체예에서, 본 발명의 조성물 및 방법은 2012년 3월 29일에 제출된, 미국 가특허 출원 61/617,468 (참조로서 본 명세서에 편입됨)에서 설명된 이온화 양이온 지질, 가령 (15Z,18Z)-N,N-디메틸-6-(9Z,12Z)-옥타데카-9,12-디엔-1-일)테트라코사-15,18-디엔-1-아민 (HGT5000), (15Z,18Z)-N,N-디메틸-6-((9Z,12Z)-옥타데카-9,12-디엔-1-일)테트라코사-4,15,18-트리엔-1-아민 (HGT5001), 및 (15Z,18Z)-N,N-디메틸-6-((9Z,12Z)-옥타데카-9,12-디엔-1-일)테트라코사-5,15,18-트리엔-1-아민 (HGT5002)을 포함하는 지질 나노입자를 이용한다.
몇몇 구체예에서, 양이온 지질 N-[1-(2,3-디올레일옥시)프로필]-N,N,N-트리메틸암모늄 클로라이드 또는 "DOTMA"가 이용된다. (Felgner et al. (Proc. Nat'l Acad. Sci. 84, 7413 (1987); 미국 특허 번호 제4,897,355호). DOTMA는 단독으로 제조될 수 있거나 리포좀 수송 비히클 또는 지질 나노입자 내로 중성 지질, 디올레오일포스파티딜-에탄올아민 또는 "DOPE" 또는 다른 양이온 또는 비-양이온 지질과 조합될 수 있고, 그리고 이러한 리포좀은 표적 세포 내로 핵산의 전달을 증진시키는 데에 이용될 수 있다. 다른 적합한 양이온 지질은 예를 들어, 5-카르복시스페르밀글리신디옥타데실아미드 또는 "DOGS", 2,3-디올레일옥시-N-[2(스페르민-카르복사미도)에틸]-N,N-디메틸-1-프로판아미늄 또는 "DOSPA" (Behr et al. Proc. Nat.'l Acad. Sci. 86, 6982 (1989); 미국 특허 번호 제5,171,678호; 미국 특허 번호 제5,334,761호), 1,2-디올레오일-3-디메틸암모늄-프로판 또는 "DODAP", 1,2-디올레오일-3-트리메틸암모늄-프로판 또는 "DOTAP"를 포함한다. 고려되는 양이온 지질은 또한, 1,2-디스테아릴옥시-N,N-디메틸-3-아미노프로판 또는 "DSDMA", 1,2-디올레일옥시-N,N-디메틸-3-아미노프로판 또는 "DODMA", 1,2-디리놀레일옥시-N,N-디메틸-3-아미노프로판 또는 "DLinDMA", 1,2-디리놀레닐옥시-N,N-디메틸-3-아미노프로판 또는 "DLenDMA", N-디올레일-N,N-디메틸암모늄 클로라이드 또는 "DODAC", N,N-디스테아릴-N,N-디메틸암모늄 브로마이드 또는 "DDAB", N-(1,2-디미리스틸옥시프로프-3-일)-N,N-디메틸-N-하이드록시에틸 암모늄 브로마이드 또는 "DMRIE", 3-디메틸아미노-2-(콜레스트-5-엔-3-베타-옥시부탄-4-옥시)-1-(시스,시스-9,12-옥타데카디엔옥시)프로판 또는 "CLinDMA", 2-[5'-(콜레스트-5-엔-3-베타-옥시)-3'-옥사펜톡시)-3-디메틸-1-(시스,시스-9', 1-2'-옥타데카디엔옥시)프로판 또는 "CpLinDMA", N,N-디메틸-3,4-디올레일옥시벤질아민 또는 "DMOBA", 1,2-N,N'-디올레일카르바밀-3-디메틸아미노프로판 또는 "DOcarbDAP", 2,3-디리놀레오일옥시-N,N-디메틸프로필아민 또는 "DLinDAP", 1,2-N,N'-디리놀레일카르바밀-3-디메틸아미노프로판 또는 "DLincarbDAP", 1,2-디리놀레오일카르바밀-3-디메틸아미노프로판 또는 "DLinCDAP", 2,2-디리놀레일-4-디메틸아미노메틸-[1,3]-디옥솔란 또는 "DLin-K-DMA", 2,2-디리놀레일-4-디메틸아미노에틸-[1,3]-디옥솔란 또는 "DLin-K-XTC2-DMA", 및 2-(2,2-디((9Z,12Z)-옥타데카-9,12-디엔-1-일)-1,3-디옥솔란-4-일)-N,N-디메틸에탄아민 (DLin-KC2-DMA)) (WO 2010/042877; Semple et al., Nature Biotech. 28:172-176 (2010)을 참조), 또는 이들의 혼합물을 포함한다. (Heyes, J., et al., J Controlled Release 107: 276-287 (2005); Morrissey, DV., et al., Nat. Biotechnol. 23(8): 1003-1007 (2005); PCT 공개공보 WO2005/121348A1).
본 발명에 의해 콜레스테롤-기반 양이온 지질의 용도가 또한 고려된다. 이러한 콜레스테롤-기반 양이온 지질은 단독으로 또는 다른 양이온 또는 비-양이온 지질과 조합하여 이용될 수 있다. 적합한 콜레스테롤-기반 양이온 지질은 예를 들어, DC-Chol (N,N-디메틸-N-에틸카르복사미도콜레스테롤), 1,4-비스(3-N-올레일아미노-프로필)피페라진 (Gao, et al. Biochem. Biophys. Res. Comm. 179, 280 (1991); Wolf et al. BioTechniques 23, 139 (1997); 미국 특허 번호 제 5,744,335호), 또는 ICE를 포함한다.
추가적으로, 여러 가지 시약은 형질감염 효능을 증진시키기 위해 상업적으로 이용가능하다. 적합한 예시는 LIPOFECTIN (DOTMA:DOPE) (Invitrogen, Carlsbad, Calif.), LIPOFECTAMINE (DOSPA:DOPE) (Invitrogen), LIPOFECTAMINE2000. (Invitrogen), FUGENE, TRANSFECTAM (DOGS), 및 EFFECTENE을 포함한다.
또한 고려되는 것은 양이온 지질, 가령 디알킬아미노-기반, 이미다졸-기반, 및 구아니디니움-기반 지질이다. 예를 들어, 특정한 구체예는 하나 이상의 이미다졸-기반 양이온 지질, 예를 들어, 하기 구조 (I)로 나타난 바와 같이, 이미다졸 콜레스테롤 에스테르 또는 "ICE" 지질 (3S, 10R, 13R, 17R)-10, 13-디메틸-17-((R)-6-메틸헵탄-2-일)-2, 3, 4, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17-테트라데카하이드로-1H-사이클로펜타[a]페난트렌-3-일 3-(1H-이미다졸-4-일)프로파노에이트를 포함하는 조성물에 대한 것이다. 바람직한 구체예에서, mRNA의 전달을 위한 수송 비히클은 하나 이상의 이미다졸-기반 양이온 지질, 예를 들어, 구조 (I)로 나타난 바와 같이, 이미다졸 콜레스테롤 에스테르 또는 "ICE" 지질 (3S, 10R, 13R, 17R)-10, 13-디메틸-17-((R)-6-메틸헵탄-2-일)-2, 3, 4, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17-테트라데카하이드로-1H-사이클로펜타[a]페난트렌-3-일 3-(1H-이미다졸-4-일)프로파노에이트를 포함할 수 있다.
Figure 112014000539556-pct00001
특정한 이론에 한정됨 없이, 이미다졸-기반 양이온 지질 ICE의 융합생성 유발성(fusogenicity)은 종래의 양이온 지질에 비해 더 낮은 pKa를 갖는 이미다졸 기에 의해 촉진되는 엔도좀 파괴와 관련된다. 엔도좀 파괴는 차례로 삼투성 팽윤 및 리포좀 막의 파괴, 그 다음 표적 세포 내로 그 안에 로딩된 핵산(들) 함유물의 형질감염 또는 세포내 방출을 촉진한다.
이미다졸-기반 양이온 지질은 다른 양이온 지질에 비해 그들의 감소된 독성으로 또한 특징된다. 이미다졸-기반 양이온 지질 (가령, ICE)은 지질 나노입자내 유일한 양이온 지질로서 이용될 수 있거나, 대안으로 종래의 양이온 지질, 비-양이온 지질, 및 PEG-변형 지질과 조합될 수 있다. 양이온 지질은 수송 비히클내 존재하는 총 지질의 약 1% 내지 약 90%, 약 2% 내지 약 70%, 약 5% 내지 약 50%, 약 10% 내지 약 40%, 또는 바람직하게는 수송 비히클내 존재하는 총 지질의 약 20% 내지 약 70%의 분자비를 포함할 수 있다.
유사하게, 특정한 구체예는 하기 구조 (II)로 나타난 바와 같이, 그리고 2011년 6월 8일에 제출된, 미국 가출원 번호: 61/494,745에서 추가 설명된 바와 같이, HGT4003 양이온 지질 2-((2,3-비스((9Z,12Z)-옥타데카-9,12-디엔-1-일옥시)프로필)디설파닐)-N,N-디메틸에탄아민을 포함하는 지질 나노입자에 관한 것이며, 상기 가출원의 전체 교시는 이들 전체로 참조로서 본 명세서에 편입된다.
Figure 112014000539556-pct00002
다른 구체예에서, 본 명세서에서 설명된 조성물 및 방법은 하나 이상의 절단가능 지질, 가령, 미국 가출원 번호: 61/494,745에서 추가로 설명된 바와 같이, 절단가능 디설파이드 (S-S) 작용기 (가령, HGT4001, HGT4002, HGT4003, HGT4004 및 HGT4005)를 포함하는 하나 이상의 양이온 지질 또는 화합물을 포함하는 지질 나노입자에 관한 것이며, 상기 가출원의 전체 교시는 이들 전체로 참조로서 본 명세서에 편입된다.
폴리에틸렌 글리콜 (PEG)-변형 인지질 및 유도체화 지질, 가령 N-옥타노일-스핑고신-1-[석시닐(메톡시 폴리에틸렌 글리콜)-2000] (C8 PEG-2000 세라미드)을 포함하는 유도체화 세라미드 (PEG-CER)의 용도가 단독으로 또는 바람직하게는 수송 비히클 (가령, 지질 나노입자)을 포함하는 다른 지질과 함께 조합하여, 본 발명에 의해 또한 고려된다. 고려되는 PEG-변형 지질은 C6-C20 길이의 알킬 사슬(들)을 가진 지질과 공유결합으로 부착된 길이 최대 5 kDa까지의 폴리에틸렌 글리콜 사슬을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 이러한 성분의 첨가는 복합체 응집을 방지할 수 있고 그리고 순환 수명을 증가시키고 표적 세포에 지질-핵산 조성물의 전달을 증가시키기 위한 수단을 또한 제공할 수 있고, (Klibanov et al. (1990) FEBS Letters, 268 (1): 235-237), 또는 그들은 생체내 제제 밖으로 신속하게 교환시키기 위해 선택될 수 있다 (미국 특허 번호 제5,885,613호를 참조). 특히 유용하고 교환가능한 지질은 더 짧은 아실 사슬 (가령, C14 또는 C18)을 갖는 PEG-세라미드이다. 본 발명의 PEG-변형 인지질 및 유도체화 지질은 리포좀 수송 비히클내 존재하는 총 지질의 약 0% 내지 약 20%, 약 0.5% 내지 약 20%, 약 1% 내지 약 15%, 약 4% 내지 약 10%, 또는 약 2%의 분자비를 포함할 수 있다.
본 발명은 비-양이온 지질의 용도를 또한 고려한다. 본 명세서에서 사용된 바와 같이, 구절 "비-양이온 지질"은 임의의 중성, 쌍성 이온 또는 음이온 지질을 나타낸다. 본 명세서에서 사용된 바와 같이, 구절 "음이온 지질"은 선택된 pH, 가령 생리학적 pH에서 순 음전하(net negative charge)를 지니는 다수의 지질 종류 중 어느 하나를 나타낸다. 비-양이온 지질은 디스테아로일포스파티딜콜린 (DSPC), 디올레오일포스파티딜콜린 (DOPC), 디팔미토일포스파티딜콜린 (DPPC), 디올레오일포스파티딜글리세롤 (DOPG), 디팔미토일포스파티딜글리세롤 (DPPG), 디올레오일포스파티딜에탄올아민 (DOPE), 팔미토일올레오일포스파티딜콜린 (POPC), 팔미토일올레오일-포스파티딜에탄올아민 (POPE), 디올레오일-포스파티딜에탄올아민 4-(N-말레이미도메틸)-사이클로헥산-1-카르복실레이트 (DOPE-mal), 디팔미토일 포스파티딜 에탄올아민 (DPPE), 디미리스토일포스포에탄올아민 (DMPE), 디스테아로일-포스파티딜-에탄올아민 (DSPE), 16-O-모노메틸 PE, 16-O-디메틸 PE, 18-1-트랜스 PE, 1-스테아로일-2-올레오일-포스파티딜에탄올아민 (SOPE), 콜레스테롤, 또는 이들의 혼합물을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 이러한 비-양이온 지질은 단독으로 이용될 수 있지만, 바람직하게는 다른 부형제, 가령 양이온 지질과 조합하여 이용된다. 양이온 지질과 조합하여 이용될 때, 비-양이온 지질은 수송 비히클내 존재하는 총 지질의 5% 내지 약 90%, 또는 바람직하게 약 10% 내지 약 70%의 분자비를 포함할 수 있다.
바람직하게, 수송 비히클 (가령, 지질 나노입자)는 다수의 지질 및/또는 폴리머 성분을 조합함으로써 제조된다. 예를 들어, 수송 비히클은 40:30:25:5의 분자비로 C12-200, DOPE, chol, DMG-PEG2K, 또는 18:56:20:6의 분자비로 DODAP, DOPE, 콜레스테롤, DMG-PEG2K, 또는 40:20:35:5의 분자비로 HGT5000, DOPE, chol, DMG-PEG2K, 또는 40:20:35:5의 분자비로 HGT5001, DOPE, chol, DMG-PEG2K를 이용하여 제조될 수 있다. 지질 나노입자를 포함하는 양이온 지질, 비-양이온 지질 및/또는 PEG-변형 지질의 선택, 그리고 이러한 지질 대 서로 간의 상대적인 분자비는 선택된 지질(들)의 특성, 의도된 표적 세포의 성질, 전달되어야 할 mRNA의 특성에 기반한다. 추가적인 고려사항은 예를 들어, 알킬 사슬의 포화, 그리고 선택된 지질(들)의 크기, 전하, pH, pKa, 융합생성 유발성 및 독성을 포함한다. 따라서 분자비는 이에 따라 조정될 수 있다. 예를 들어, 구체예에서, 지질 나노입자내 양이온 지질의 퍼센트는 10% 초과, 20% 초과, 30% 초과, 40% 초과, 50% 초과, 60% 초과, 또는 70% 초과일 수 있다. 지질 나노입자내 비-양이온 지질의 퍼센트는 5% 초과, 10% 초과, 20% 초과, 30% 초과, 또는 40% 초과일 수 있다. 지질 나노입자내 콜레스테롤 퍼센트는 10% 초과, 20% 초과, 30% 초과, 또는 40% 초과일 수 있다. 지질 나노입자내 PEG-변형 지질의 퍼센트는 1% 초과, 2% 초과, 5% 초과, 10% 초과, 또는 20% 초과일 수 있다.
특정한 바람직한 구체예에서, 본 발명의 지질 나노입자는 다음 양이온 지질 중 적어도 하나를 포함한다: C12-200, DLin-KC2-DMA, DODAP, HGT4003, ICE, HGT5000, 또는 HGT5001. 구체예에서, 수송 비히클은 콜레스테롤 및/또는 PEG-변형 지질을 포함한다. 몇몇 구체예에서, 수송 비히클은 DMG-PEG2K를 포함한다. 특정한 구체예에서, 수송 비히클은 다음 지질 제제 중 하나를 포함한다: C12-200, DOPE, chol, DMG-PEG2K; DODAP, DOPE, 콜레스테롤, DMG-PEG2K; HGT5000, DOPE, chol, DMG-PEG2K, HGT5001, DOPE, chol, DMG-PEG2K.
본 발명의 조성물에서 이용하기 위한 리포좀 수송 비히클은 당분야에 현재 공지된 다양한 기술에 의해 제조될 수 있다. 다중-라멜라 소포체(Multi-lamellar vesicle) (MLV)는 기존의 기술로, 예를 들어 적절한 용매에서 지질을 용해시켜 적합한 컨테이너(container) 또는 용기(vessel)의 안쪽 벽에 선택된 지질을 퇴적시킴으로써, 그리고 이후 용기의 안쪽에 얇은 필름을 남기도록 용매를 증발시키거나 분무 건조시킴으로써 제조될 수 있다. 이후 MLV의 형성을 야기하는 와동 운동(vortexing motion)을 하면서 용기에 수성상이 첨가될 수 있다. 이후 단일-라멜라 소포체 (Uni-lamellar vesicle) (ULV)가 다중-라멜라 소포체의 균질화, 초음파처리 또는 압출에 의해 형성될 수 있다. 추가적으로, 단일라멜라 소포체는 세제 제거 기술에 의해 형성될 수 있다.
본 발명의 특정한 구체예에서, 본 발명의 조성물은 수송 비히클을 포함하며 여기서 mRNA는 수송 비히클의 표면 및 동일한 수송 비히클 내에 캡슐화된 표면 둘 모두와 연관된다. 예를 들어, 본 발명의 조성물의 제조 동안에, 양이온 리포좀 수송 비히클은 정전기 상호작용을 통해 mRNA와 연관시킬 수 있다.
특정한 구체예에서, 본 발명의 조성물은 진단 방사성핵종, 형광 물질 또는 시험관내 및 생체내 적용 둘 모두에서 탐지가능한 다른 물질을 이용하여 로딩된다. 예를 들어, 본 발명에서 이용하기 위해 적합한 진단 물질은 로다민-디올레오일포스파티딜에탄올아민(Rh-PE), 녹색 형광 단백질 mRNA (GFP mRNA), 레닐라 루시퍼라아제 mRNA 및 반딧불이 루시퍼라아제 mRNA를 포함할 수 있다.
리포좀 수송 비히클의 적절한 크기 선택은 표적 세포 또는 조직의 부위를 고려해야하고 그리고 리포좀이 만들어지기 위한 적용을 어느 정도까지 고려해야한다. 몇몇 구체예에서, 특정한 세포 또는 조직에 mRNA의 형질감염을 제한하는 것이 바람직할 수 있다. 예를 들어, 표적 간세포에 대해 리포좀 수송 비히클은 이의 치수가 간내 내피 층 내벽 간 동양혈관(endothelial layer lining hepatic sinusoid)의 천공보다 더 작도록 크기를 바꿀 수 있고; 이에 따라서 리포좀 수송 비히클은 표적 간세포에 도달하기 위해 이러한 내피 천공을 쉽게 관통할 수 있다. 대안으로, 리포좀 수송 비히클은 리포좀의 치수가 특정한 세포 또는 조직 내로 제한하거나 또는 명확하게 분포를 피하는 데에 충분한 지름이 되도록 크기를 바꿀 수 있다. 예를 들어, 리포좀 수송 비히클은 이의 치수가 내피 층 내벽 간 동양혈관의 천공보다 더 크도록 크기를 바꾸어 그렇게 함으로써 간세포에 대한 리포좀 수송 비히클의 분포를 제한할 수 있다. 일반적으로 수송 비히클의 크기는 약 25 내지 250 nm의 범위 내에 있고, 바람직하게는 약 250nm, 175nm, 150nm, 125nm, 100nm, 75nm, 50nm, 25nm 또는 10nm 미만이다.
당분야에 공지된 다양한 대안적인 방법은 리포좀 수송 비히클의 모집단의 크기순 배열을 위해 이용가능하다. 이러한 크기순 배열 방법 하나는 참조로서 본 명세서에 편입되는, 미국 특허 번호 제4,737,323호에서 설명된다. 리포좀 현탁액을 욕조(bath) 또는 프로브(probe) 초음파처리 중 하나로 초음파 처리하는 것은 지름 약 0.05 미만 마이크론의 작은 ULV에 이르기까지 점진적인 크기 감소를 초래한다. 균질화는 거대 리포좀을 더 작은 것으로 분열시키기 위해 에너지를 전단하는 것에 의존하는 또 다른 방법이다. 전형적인 균질화 절차에서, MLV는 선택된 리포좀 크기가 전형적으로 약 0.1 내지 0.5 마이크론에서 관찰될 때까지 표준 에멀젼 균질기를 통해 재순환된다. 리포좀 소포체의 크기는 참조로서 본 명세서에 편입되는, Bloomfield, Ann. Rev. Biophys. Bioeng., 10:421-450 (1981)에서 설명된 바와 같은 준-전광 산란(quasi-electric light scattering) (QELS)에 의해 측정될 수 있다. 평균 리포좀 지름은 형성된 리포좀의 초음파처리에 의해 감소될 수 있다. 간헐적인 초음파처리 주기는 효율적인 리포좀 합성을 유도하기 위해 QELS 평가와 번갈아가며 나타날 수 있다.
표적 세포
본 명세서에서 사용된 바와 같이, 용어 "표적 세포"는 본 발명의 조성물이 지향되거나 표적되는 세포 또는 조직을 나타낸다. 몇몇 구체예에서, 표적 세포는 관심 단백질 또는 효소가 결핍된다. 예를 들어, 간세포에 핵산을 전달하는 것이 바람직한 경우, 간세포는 표적 세포에 해당한다. 몇몇 구체예에서, 본 발명의 조성물은 차별적인 기준에서 표적 세포를 형질감염시킨다 (즉, 비-표적 세포는 형질감염시키지 않음). 본 발명의 조성물은 또한 다양한 표적 세포를 바람직하게 표적하도록 제조될 수 있으며, 상기 표적 세포는 간세포, 상피세포, 조혈세포, 상피세포, 내피세포, 폐세포, 골세포, 줄기세포, 간엽세포, 신경세포 (가령, 뇌척수막, 성상교세포, 운동 뉴런, 배근 신경절의 세포 및 전각 운동 뉴런), 빛수용체 세포 (가령, 간상체 및 추상체), 망막 색소 상피세포, 분비 세포, 심장세포, 지방세포, 혈관 평활근 세포, 심근세포, 골격근 세포, 베타 세포, 뇌하수체 세포, 활액 내층 세포, 난소세포, 고환세포, 섬유아세포, B 세포, T 세포, 망상적혈구, 백혈구, 과립구 및 종양 세포를 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 조성물은 표적 세포, 가령 심장, 폐, 신장, 간, 및 비장에 바람직하게 분포하도록 제조될 수 있다. 몇몇 구체예에서, 본 발명의 조성물은 간의 세포 (가령, 간세포)에 의한 조성물 안에 포함된 mRNA의 전달 및 차후 발현을 촉진시키기 위해 간의 세포 내로 분포된다. 표적 된 간세포는 기능적인 단백질 또는 효소를 생산하고, 그리고 전신적으로 배출할 수 있는 생물학적 "저장소" 또는 "저장고"로서 기능할 수 있다. 이에 따라, 본 발명의 한 가지 구체예에서, 리포좀 수송 비히클은 표적 간세포를 표적할 수 있고 및/또는 바람직하게는 전달시 간의 세포로 분포될 수 있다. 표적 간세포의 형질감염 후, 리포좀 비히클내 로딩된 mRNA는 번역되고, 기능적 단백질 산물이 생산되고, 배출되고 그리고 전신적으로 분포된다. 다른 구체예에서, 간세포 외의 세포 (가령, 폐, 비장, 심장, 안구, 또는 중추 신경계 세포)가 단백질 생산을 위한 저장고 위치로서 역할을 할 수 있다.
한 가지 구체예에서, 본 발명의 조성물은 하나 이상의 기능적 단백질 및/또는 효소의 대상 내인성 생산을, 특히 그들의 재조합적으로-제조된 상대물에 비해 더 적은 면역원성을 입증하는 단백질 및/또는 효소의 생산을 촉진시킨다. 본 발명의 바람직한 구체예에서, 수송 비히클은 결핍된 단백질 또는 효소를 인코딩하는 mRNA를 포함한다. 표적 조직에 이러한 조성물의 분포 그리고 이러한 표적 세포의 차후 형질감염 시, 리포좀 수송 비히클 (가령, 지질 나노입자) 내에 로딩된 외인성 mRNA는 외인성으로 투여된 mRNA에 의해 인코딩된 기능적인 단백질 또는 효소 (가령, 대상에서 결핍된 단백질 또는 효소)를 생산하기 위해 생체 내에서 번역될 수 있다. 이에 따라, 본 발명의 조성물은 내인성으로-번역된 단백질 또는 효소를 생산하기 위해 외인성으로- 또는 재조합적으로-제조된 mRNA를 번역하는 대상의 능력을 활용하고, 그리고 그렇게 함으로써 기능적인 단백질 또는 효소를 생산 (및 적용가능한 경우 배출)한다. 발현된 또는 번역된 단백질 또는 효소는 재조합적으로-제조된 단백질 또는 효소에서 종종 부재할 수 있는 원래의 번역-후 변형의 생체내 포함에 의해 또한 특징될 수 있으며, 그렇게 함으로써 번역된 단백질 또는 효소의 면역원성을 추가로 감소시킬 수 있다.
결핍된 단백질 또는 효소를 인코딩하는 mRNA의 투여는 표적 세포 내에서 특정 세포기관 (가령, 미토콘드리아)에 핵산을 전달해야 하는 요구를 피한다. 그 대신, 표적 세포의 형질감염 및 표적 세포의 세포질에 핵산의 전달시 수송 비히클의 mRNA 함유물은 번역되고 기능적인 단백질 또는 효소가 발현될 수 있다.
본 발명은 수동 및 능동 표적화 수단 둘 모두에 의한 표적 세포 및 조직의 차별적인 표적화를 또한 고려한다. 수동 표적화의 현상은 추가적인 부형제의 용도 또는 표적 세포에 의한 수송 비히클의 인식을 증진시키는 수단에 의존하지 않고 생체내 수송 비히클의 자연적인 분포 패턴을 활용한다. 예를 들어, 세망-내피계의 세포에 의해 식세포작용을 받는 수송 비히클은 간 또는 비장에 축적될 가능성이 있으며, 이에 따라 이러한 표적 세포에 조성물의 전달을 수동적으로 유도하는 수단이 제공될 수 있다.
대안으로, 본 발명은 수송 비히클에 결합 (공유결합으로 또는 비-공유결합으로)하여 특정한 표적 세포 또는 표적 조직에서 이러한 수송 비히클의 국소화를 조장할 수 있는 "표적화 리간드"로서 본 명세서에서 언급되는 능동 표적화를 고려하며, 상기 표적화는 추가적인 부형제의 이용을 수반한다. 예를 들어, 표적화는 표적 세포 또는 조직에 분포를 조장하기 위해 수송 비히클 안에 또는 상기 비히클 상에 하나 이상의 내인성 표적화 리간드 (가령, 아포리포단백질 E)의 함유에 의해 매개될 수 있다. 표적 조직에 의한 표적화 리간드의 인식은 수송 비히클 및/또는 표적 세포 및 조직내 이의 함유물의 조직 분포 및 세포 흡수를 활발하게 촉진시킨다 (가령, 수송 비히클 안에 또는 상기 비히클 상에 아포리포단백질-E 표적화 리간드의 함유는 간세포에 의해 발현되는 내인성 저밀도 리포단백질 수용체와의 수송 비히클의 결합 및 인식을 조장함). 본 명세서에서 제공된 바와 같이, 조성물은 표적 세포에 대한 조성물의 친화성을 증진시킬 수 있는 리간드를 포함할 수 있다. 표적화 리간드는 조제 동안 또는 조제-후 지질 입자의 바깥 이중층에 연결될 수 있다. 이들 방법은 당분야에서 잘 공지된다. 추가적으로, 몇 가지 지질 입자 제제는 융합생성 폴리머, 가령 PEAA, 헤마글루티닌, 다른 리포펩티드 (미국 특허 출원 일련번호 제08/835,281호, 및 제60/083,294호를 참조하며, 이는 참조로서 본 명세서에 편입됨), 및 생체내 및/또는 세포내 전달을 위해 유용한 다른 특징을 이용할 수 있다. 다른 몇몇 구체예에서, 본 발명의 조성물은 개선된 형질감염 효능을 입증하고, 및/또는 관심 표적 세포 또는 조직에 대한 증진된 선택성을 입증한다. 따라서 표적 세포 또는 조직에 대하여 조성물 및 그들의 핵산 함유물의 친화성을 증진시킬 수 있는 하나 이상의 리간드 (가령, 펩티드, 압타머, 올리고뉴클레오티드, 비타민 또는 기타 분자)를 포함하는 조성물이 고려된다. 적합한 리간드는 수송 비히클의 표면에 선택적으로 결합되거나 또는 연결될 수 있다. 몇몇 구체예에서, 표적화 리간드는 수송 비히클의 표면에 걸쳐있거나 수송 비히클 내에 캡슐화될 수 있다. 적합한 리간드는 그들의 물리적, 화학적 또는 생물학적 특성 (가령, 표적 세포 표면 마커 또는 특징의 선별적인 친화성 및/또는 인식)에 기반하여 선택된다. 세포-특이적 표적 부위 및 그들의 상응하는 표적화 리간드는 광범위하게 다양할 수 있다. 적합한 표적화 리간드는 표적 세포의 특유의 특성이 활용되도록 선택되고, 따라서 조성물이 표적 및 비-표적 세포 사이를 구별하도록 한다. 예를 들어, 본 발명의 조성물은 간세포의 인식 또는 간세포에 대한 친화성을 선별적으로 증진 (가령, 이러한 표면 마커의 수용체-매개 인식 및 상기 마커와의 결합에 의해)시키는 표면 마커 (가령, 아포리포단백질-B 또는 아포리포단백질-E)를 포함할 수 있다. 추가적으로, 표적화 리간드로서 갈락토오스의 용도는 실질(parenchymal) 간세포로 본 발명의 조성물을 보내는 것으로 예상될 것이고, 또는 대안으로 표적화 리간드로서 당 잔기를 함유한 만노오스의 용도는 간 내피세포로 본 발명의 조성물을 보내는 것으로 예상될 것이다 (가령, 간세포내 존재하는 아시알로글리코단백질 수용체에 바람직하게 결합할 수 있는 당 잔기를 함유한 만노오스). (Hillery AM, et al. "Drug Delivery and Targeting: For Pharmacists and Pharmaceutical Scientists" (2002) Taylor & Francis, Inc.를 참조) 따라서 수송 비히클 (가령, 지질 나노입자)내 존재하는 모이어티와 접합된 이러한 표적화 리간드의 제공은 표적 세포 및 조직내 본 발명의 조성물의 인식 및 흡수를 촉진시킨다. 적합한 표적화 리간드의 예시는 하나 이상의 펩티드, 단백질, 압타머, 비타민 및 올리고뉴클레이티드를 포함한다.
적용 및 투여
본 명세서에서 사용된 바와 같이, 용어 "대상"은 본 발명의 조성물이 투여되고 방법이 시행되는, 인간, 비-인간 영장류, 설치류 등을 포함하지만, 이에 제한되지 않는, 임의의 동물 (가령, 포유류)을 나타낸다. 전형적으로, 용어 "대상" 및 "환자"는 인간 대상과 관련하여 본 명세서에서 상호교환적으로 사용된다.
본 발명의 조성물 및 방법은 다수의 질환을 치료하기 위한 mRNA의 전달에 대해 제공한다. 특히, 본 발명의 조성물 및 방법은 주변의 세포외액 내로 표적 세포에 의해 배출되거나 분비되는 단백질 및/또는 효소 (가령, 호르몬 및 신경전달물질을 인코딩하는 mRNA)의 결핍에 관한 질병 또는 질환의 치료에 적합하다. 구체예에서, 질병은 분비 단백질의 결함 또는 결핍을 수반한다 (가령 파브리 병, 또는 ALS). 특정한 구체예에서, 질병은 분비 단백질의 결함 또는 결손에 의해 야기되지 않을 수도 있지만, 분비 단백질을 제공하는 것으로부터 혜택을 받을 수 있다. 예를 들어, 질병의 증상은 본 발명의 조성물을 제공함으로써 개선될 수 있다 (가령 낭포성 섬유증). 본 발명이 유용한 질환은 헌팅턴(Huntington) 병; 파키슨(Parkinson) 병; 근이영양증 (가령, 듀시엔(Duchenne) 및 베커(Becker)); 혈우병 (가령, 혈우병 B (FIX), 혈우병 A (FVIII); SMN1-관련 척수 근위축증 (SMA); 근위축성 측삭 경화증 (ALS); GALT-관련 갈락토오스혈증; 낭포성 섬유증 (CF); 시스틴뇨증을 포함한 SLC3A1-관련 질환; 알포트(Alport) 증후군을 포함한 COL4A5-관련 질환; 갈락토세레브로시다아제 결핍증; X-연관 부신백질이영양증 및 부신척수신경병증; 프리드라이히(Friedreich) 운동실조; 펠리체우스-메르츠바허(Pelizaeus-Merzbacher) 병; TSC1 및 TSC2-관련 결절성 경화증; 산필리포(Sanfilippo) B 증후군 (MPS IIIB); CTNS-관련 시스틴증; 취약 X 증후군, 취약 X-연관 진전/운동실조 증후군 및 취약 X 조기폐경 증후군을 포함하는 FMR1-관련 질환; 프래더-윌리(Prader-Willi) 증후군; 유전성 출혈성 모세혈관확장증 (AT); 니만-피크(Niemann-Pick) 병 유형 C1; 소아 신경 세로이드 리포푸신증 (JNCL), 소아 바텐(Batten) 병, 산타부오리-할티아(Santavuori-Haltia) 병, 얀스키-비엘슈보스키(Jansky-Bielschowsky) 병, 및 PTT-1과 TPP1 결핍증을 포함한 신경 세로이드 리포푸신-관련 질병; 중추 신경계 수초형성부전증/소멸 백질을 동반하는 EIF2B1, EIF2B2, EIF2B3, EIF2B4 및 EIF2B5-관련 유아기 운동실조; CACNA1A 및 CACNB4-관련 발작적 운동실조 유형 2; 전형적인 레트(Rett) 증후군, MECP2-관련 중증 신생아 뇌병증 및 PPM-X 증후군을 포함한 MECP2-관련 질환; CDKL5-관련 비정형 레트 증후군; 케네디(Kennedy) 병 (SBMA); 피질하부 경색증 및 백질뇌증을 동반하는 Notch-3 관련 지적 상염색체성 우성 동맥질환 (CADASIL); SCN1A 및 SCN1B-관련 발작 질환; 알퍼스-후텐로셔(Alpers-Huttenlocher) 증후군, POLG-관련 감각성 운동실조 신경병증, 구음장애, 및 안운동 마비, 그리고 미토콘드리아 DNA 결실을 동반한 상염색체성 우성 및 열성 진행성 외안근 마비를 포함하는 폴리머라아제 G-관련 질환; X-연관 부신 발육부전; X-연관 무감마글로불린혈증; 윌슨(Wilson) 병; 및 파브리 병과 같은 질환을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 한 가지 구체예에서, 본 발명의 핵산, 특히 mRNA는 세포외 공간으로 분비되는 기능적 단백질 또는 효소를 인코딩할 수 있다. 예를 들어, 분비된 단백질은 응고 인자, 보체 경로의 성분, 사이토카인, 케모카인, 화학유인물질, 단백질 호르몬 (가령 EGF, PDF), 혈청의 단백질 성분, 항체, 분비가능한 톨-유사 수용체 등을 포함한다. 몇몇 구체예에서, 본 발명의 조성물은 에리트로포이에틴, α1-항트립신, 카르복시펩티다아제 N 또는 인간 성장 호르몬을 인코딩하는 mRNA를 포함할 수 있다.
구체예에서, 본 발명은 하나 이상의 유전자에 의해 인코딩되는 하부단위(subunit)로 구성된 분비 단백질을 인코딩한다. 예를 들어, 분비 단백질은 이종이합체일 수 있으며, 여기서 이의 사슬 또는 하부단위 각각은 분리 유전자에 의해 인코딩된다. 하나 이상의 mRNA 분자가 수송 비히클 내로 전달되고 mRNA가 분비 단백질의 분리된 하부단위를 인코딩한다는 점이 가능하다. 대안으로, 단일 mRNA는 하나 이상의 하부단위를 인코딩하도록 조작될 수 있다 (가령, 단일-사슬 Fv 항체의 경우). 특정한 구체예에서, 개별적인 하부단위를 인코딩하는 분리 mRNA 분자는 분리된 수송 비히클 내로 투여될 수 있다. 한 가지 구체예에서, mRNA는 대상에게 면역력을 부여하기 위해 전장 항체 (가변부 및 불변부의 중쇄 및 경쇄 둘 모두) 또는 항체의 단편 (가령 Fab, Fv, 또는 단일 사슬 Fv (scFv))을 인코딩할 수 있다. 본 발명의 한 가지 구체예는 대상에게 면역력을 부여 (가령, 기능적 항체를 인코딩하는 mRNA의 번역을 통해)하기 위해 유용한 방법 및 조성물과 관련되지만, 본 명세서에서 개시되고 본 명세서에 의해 고려되는 본 발명은 광범위하게 적용가능하다. 대안적인 구체예에서, 본 발명의 조성물은 대상내 기능 반응에 일시적으로 또는 만성적으로 영향을 주는 데에 이용될 수 있는 항체를 인코딩한다. 예를 들어, 본 발명의 mRNA는 번역 및 표적 세포로부터의 분비시 생물학적 표적 (가령, 종양 괴사인자와 같은 자극성 사이토카인)을 표적화하고 및/또는 비활성화시키기 위해 유용할 수 있는 기능적인 단일클론 또는 다클론 항체를 인코딩할 수 있다. 유사하게, 본 발명의 mRNA 핵산은 예를 들어, 막성증식성 사구체신염 II 또는 급성 용혈성 요독 증후군의 치료를 위해 유용한 기능적인 항-신염 인자를 인코딩할 수 있고, 또는 대안으로 VEGF-매개 질병의 치료를 위해 유용한 항-혈관 내피 성장인자 (VEGF) 항체를 인코딩할 수 있다. 다른 구체예에서, 분비 단백질은 사이토카인 또는 하나 이상의 하부단위로 구성된 다른 분비 단백질일 수 있다 (가령 IL-12, 또는 IL-23).
본 발명의 조성물은 대상에게 투여될 수 있다. 몇몇 구체예에서, 조성물은 하나 이상의 추가적인 핵산, 담체, 표적화 리간드 또는 안정화 시약과 조합하여, 또는 적합한 부형제와 혼합되는 약리학적 조성물로 조제된다. 예를 들어, 한 가지 구체예에서, 본 발명의 조성물은 2개 이상의 별개의 단백질 또는 효소를 인코딩하는 mRNA를 전달하도록 제조될 수 있다. 약물의 조제 및 투여를 위한 기술은 "Remington's Pharmaceutical Sciences", Mack Publishing Co., Easton, Pa., 최신판에서 찾을 수 있다.
제약학적 또는 치료학적 효과를 발휘할 수 있는 다양한 분자가 본 발명의 조성물 및 방법을 이용하여 표적 세포 내로 전달될 수 있다. 분자는 유기성 또는 무기성일 수 있다. 유기 분자는 펩티드, 단백질, 탄수화물, 지질, 스테롤, 핵산 (펩티드 핵산을 포함), 또는 이들의 임의의 조합일 수 있다. 표적 세포 내로 전달하기 위한 제제는 하나 이상의 분자 유형, 예를 들어 2개의 상이한 뉴클레오티드 서열, 또는 단백질, 효소 또는 스테로이드를 포함할 수 있다.
본 발명의 조성물은 대상의 임상 조건, 투여 부위 및 방법, 투여 일정관리, 대상의 연령, 성별, 체중 및 당분야에서 숙련된 임상 의사와 관련된 기타 요인을 고려하여, 현재 의료 행위에 따라서 투여 및 투약될 수 있다. 본 명세서의 목적을 위한 "유효량"은 실험 임상 연구, 약리학, 임상학 및 의학 분야의 당업자에게 공지된 바와 같은 이러한 관련된 고려사항에 의해 결정될 수 있다. 몇몇 구체예에서, 투여되는 양은 적어도 몇 가지 안정화, 증상의 개선 또는 제거 및 당분야의 당업자에 의한 질병의 경과, 퇴행 또는 개선의 적절한 척도로서 선택되는 바와 같은 기타 지표를 성취하는 데에 효과적이다. 예를 들어, 적합한 양 및 투약 섭생은 적어도 일시적인 단백질 생산을 야기하는 양 및 섭생이다.
투여의 적합한 경로는 예를 들어, 경구, 직장, 질, 경점막, 기관내 또는 흡입을 포함한 폐, 또는 장 투여; 근육내, 피하, 골수내 주사, 그리고 척추강내, 직접적인 심실내, 정맥내, 복강내, 비강내, 또는 안내 주사를 포함한 비경구 전달을 포함한다.
대안으로, 본 발명의 조성물은 전신적인 방식보다는 국부적인 방식으로, 예를 들어 표적된 조직 내로 직접 제약학적 조성물의 주사를 통해, 바람직하게는 서방형 제제로 투여될 수 있다. 국부적인 전달은 표적되는 조직에 따라서, 다양한 방식으로 영향을 받을 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 조성물을 함유한 에어로졸(aerosol)은 흡입될 수 있다 (코, 기관(tracheal), 또는 기관지 전달을 위해); 본 발명의 조성물은 예를 들어, 손상, 질병 징후, 또는 통증의 부위 내로 주사될 수 있다; 조성물은 경구, 기관, 또는 식도 투여를 위해 로젠지(lozenge)로 제공될 수 있고; 위 또는 장에 투여를 위해 액체, 정제, 또는 캡슐 형태로 공급될 수 있고, 직장 또는 질 투여를 위해 좌약 형태로 공급될 수 있고; 또는 크림, 점적약, 또는 심지어 주사의 용도로 눈에도 전달될 수 있다. 치료학적 분자 또는 리간드와 복합된 본 발명의 조성물을 함유한 제제는 예를 들어,　조성물이 주입 부위로부터 주변 세포로 확산되도록 할 수 있게 하는　폴리머 또는 기타 구조 또는 물질과 공동으로 외과적으로도 투여될 수 있다. 대안으로, 그들은 폴리머 또는 지지체의 이용 없이 외과적으로 적용될 수 있다.
한 가지 구체예에서, 본 발명의 조성물은 그들이 그 안에 함유된 mRNA의 서방에 적합하도록 조제된다. 이러한 서방형 조성물은 연장된 투약 간격으로 대상에게 편리하게 투여될 수 있다. 예를 들어, 한 가지 구체예에서, 본 발명의 조성물은 대상에게 하루 두 번, 매일 또는 격일로 투여된다. 바람직한 구체예에서, 본 발명의 조성물은 대상에게 주 2회, 주1회, 매 10일마다, 매 2주마다, 매 3주마다, 또는 더욱 바람직하게는 매 4주마다, 월 1회, 매 6주마다, 매 8주마다, 격월로, 매 3개월마다, 매 4개월마다, 매 6개월마다, 매 8개월마다, 매9개월마다 또는 매년 투여된다. 연장된 시간 기간에 걸쳐 mRNA를 전달하거나 방출시키는 저장고 투여 (가령, 근육내, 피하, 유리체내)를 위해 조제되는 조성물 및 리포좀 비히클이 또한 고려된다. 바람직하게, 이용되는 서방형 수단은 안정도를 증진시키기 위해 mRNA에서 일어난 변형과 조합된다.
본 명세서에서 개시된 하나 이상의 리포좀 나노입자를 포함하는 동결건조된 제약학적 조성물 및 예를 들어, 2011년 6월 8일에 제출된, 미국 가출원 번호 제61/494,882호에서 개시된 바와 같은 이러한 동결건조된 조성물의 용도를 위한 관련 방법이 또한 본 명세서에서 고려되며, 상기 가출원의 교시는 이들 전체로 참조로서 본 명세서에 편입된다. 예를 들어, 본 발명에 따른 동결건조된 제약학적 조성물은 투여에 앞서 복원될 수 있고 또는 생체 내에서 복원될 수 있다. 예를 들어, 동결건조된 제약학적 조성물은 적절한 제형 (가령, 원판, 막대 또는 막과 같은 피내 제형)으로 조제될 수 있고 제형이 개체의 체액에 의해 생체 내에서 시간이 지남에 따라 재수화되도록 투여될 수 있다.
본 발명의 특정한 화합물, 조성물 및 방법이 특정한 구체예에 따라 특정하게 설명되었지만, 다음 실시예는 단지 본 발명의 화합물을 설명하기 위해 제공되고 본 발명을 제한하는 것으로 의도되지 않는다. 본 발명의 배경을 설명하고 이의 실시에 관련하여 추가적인 상세사항을 제공하기 위해 본 명세서에서 참조된 공개공보, 참고 자료, 기탁 번호 각각은 이들 전체로 참조로서 본 명세서에 편입된다.
명확하게 달리 명시되지 않는 한, 본 명세서에서 그리고 청구범위에서 사용된 바와 같은 관사 "a" 및 "an"은 복수의 지시대상을 포함하는 것으로 이해되어야 한다. 달리 명시되지 않는 한 또는 문맥에서 달리 명확하지 않는 한, 하나, 하나 이상의, 또는 모든 그룹 구성원이 주어진 산물 또는 공정에서 존재하고, 이용되고, 또는 그렇지 않으면 상기 산물 및 공정에 관련된다면, 하나 이상의 그룹 구성원 사이의 "또는"을 포함하는 청구범위 또는 상세한 설명이 충족되는 것으로 간주된다. 본 발명은 정확히 하나의 그룹 구성원이 주어진 산물 또는 공정에서 존재하고, 이용되고, 또는 그렇지 않으면 상기 산물 및 공정에 관련되는 구체예를 포함한다. 본 발명은 하나 이상의 또는 전체 그룹 구성원이 주어진 산물 또는 공정에서 존재하고, 이용되고, 또는 그렇지 않으면 상기 산물 및 공정에 관련되는 구체예를 또한 포함한다. 추가적으로, 본 발명은　달리 명시되지 않는 한 또는 모순 또는 불일치가 발생할 것으로 당업계의 당업자에게 명백하지 않는 한, 열거된 청구항 중 하나 이상으로부터의　하나 이상의 한정,　요소,　항목,　서술적 용어 등이　동일한 기본 청구항에　의존하는 또 다른 청구항　　(또는 관련된 바와 같은,　임의의 기타 청구항) 내로 도입되는 모든 변형,　조합,　및 순열을 포함한다는 것으로 이해된다. 요소가 목록 (가령, Markush 그룹 또는 유사한 구성형식으로)으로 제시되는 경우, 요소의 하위그룹 각각이 또한 개시되고, 그리고 임의의 요소(들)이 그룹으로부터 제거될 수 있다는 점이 이해된다. 일반적으로, 본 발명, 또는 본 발명의 측면이 특정한 요소, 특징 등을 포함하는 것으로서 나타나는 경우, 본 발명의 특정한 구체예 또는 본 발명의 측면은 이러한 요소, 특징 등으로 구성되거나, 본질적으로 구성된다는 점이 이해되어야 한다. 간결성의 목적을 위하여, 이들 구체예는 모든 경우에 본 명세서에서 글자 그대로 특정하게 제시되지 않았다. 본 발명의 임의의 구체예 또는 측면은 특정한 배제가 명세서에서 상술되는지에 상관 없이, 청구범위로부터 명백하게 배제될 수 있다는 점이 또한 이해되어야 한다. 본 발명의 배경을 설명하고 이의 실시에 관련하여 추가적인 상세사항을 제공하기 위해 본 명세서에서 참조된 공개공보 및 기타 참고 자료는 참조로서 본 명세서에 편입된다.
실시예
실시예 1: 폴리뉴클레오티드 조성물의 정맥내 전달을 통한 단백질 생산 저장고
전령 RNA
유전자를 인코딩하는 플라스미드 DNA 주형으로부터의 시험관내 전사에 의해 인간 에리트로포이에틴 (EPO) (서열번호: 3; 도 3), 인간 알파-갈락토시다아제 (GLA) (서열번호: 4; 도 4), 인간 알파-1 항트립신 (A1AT) (서열번호: 5; 도 5), 및 인간 인자 IX (FIX) (서열번호: 6; 도 6)가 합성되었고, 그 다음 겔 전기영동에 의해 측정된 바와 같은 대략 200개 뉴클레오티이드 길이의 5' 캡 구조 (Cap1) (Fechter & Brownlee, J. Gen. Virology 86:1239-1249 (2005)) 및 3' 폴리(A) 꼬리가 첨가되었다. 5' 및 3' 비번역 영역이 다음 실시예의 mRNA 산물 각각에 존재하였고 각각 서열번호: 1 및 2 (도 1 및 도 2)로 정의된다.
지질 나노입자 제제
제제 1: C12-200, DOPE, Chol 및 DMG-PEG2K의 50 mg/mL 에탄올 용액 분취량 (40:30:25:5)을 혼합하고 3ml 최종 부피까지 에탄올로 희석하였다. 별도로, mRNA의 수성 완충 용액 (10 mM 시트레이트/150 mM NaCl, pH 4.5)을 1 mg/mL 스톡(stock)으로부터 제조하였다. 지질 용액을 수성 mRNA 용액 내로 신속하게 주사하였고 진탕하여 20% 에탄올에서 최종 현탁액을 수득하였다. 결과적 나노입자 현탁액을 여과시키고, 1x PBS (pH 7.4)로 정용여과시키고, 농축시키고 그리고 2-8℃에서 저장하였다.
제제2: DODAP, DOPE, 콜레스테롤 및 DMG-PEG2K의 50 mg/mL 에탄올 용액 분취량 (18:56:20:6)을 혼합하고 3 mL 최종 부피까지 에탄올로 희석하였다. 별도로, EPO mRNA의 수성 완충 용액 (10 mM 시트레이트/150 mM NaCl, pH 4.5)을 1 mg/mL 스톡으로부터 제조하였다. 지질 용액을 수성 mRNA 용액 내로 신속하게 주사하였고 진탕하여 20% 에탄올에서 최종 현탁액을 수득하였다. 결과적 나노입자 현탁액을 여과시키고, 1x PBS (pH 7.4)로 정용여과시키고, 농축시키고 그리고 2-8℃에서 저장하였다. 최종 농도 = 1.35 mg/mL EPO mRNA (캡슐화). Z평균 = 75.9 nm (Dv(50) = 57.3 nm; Dv(90) = 92.1 nm).
제제 3: HGT4003, DOPE, 콜레스테롤 및 DMG-PEG2K의 50 mg/mL 에탄올 용액 분취량 (50:25:20:5)을 혼합하고 3 mL 최종 부피까지 에탄올로 희석하였다. 별도로, mRNA의 수성 완충 용액 (10 mM 시트레이트/150 mM NaCl, pH 4.5)을 1 mg/mL 스톡으로부터 제조하였다. 지질 용액을 수성 mRNA 용액 내로 신속하게 주사하였고 진탕하여 20% 에탄올에서 최종 현탁액을 수득하였다. 결과적 나노입자 현탁액을 여과시키고, 1x PBS (pH 7.4)로 정용여과시키고, 농축시키고 그리고 2-8℃에서 저장하였다.
제제4: ICE, DOPE 및 DMG-PEG2K의 50 mg/mL 에탄올 용액 분취량 (70:25:5)을 혼합하고 3 mL 최종 부피까지 에탄올로 희석하였다. 별도로, mRNA의 수성 완충 용액 (10 mM 시트레이트/150 mM NaCl, pH 4.5)을 1 mg/mL 스톡으로부터 제조하였다. 지질 용액을 수성 mRNA 용액 내로 신속하게 주사하였고 진탕하여 20% 에탄올에서 최종 현탁액을 수득하였다. 결과적 나노입자 현탁액을 여과시키고, 1x PBS (pH 7.4)로 정용여과시키고, 농축시키고 그리고 2-8℃에서 저장하였다.
제제5: HGT5000, DOPE, 콜레스테롤 및 DMG-PEG2K의 50 mg/mL 에탄올 용액 분취량 (40:20:35:5)을 혼합하고 3 mL 최종 부피까지 에탄올로 희석하였다. 별도로, EPO mRNA의 수성 완충 용액 (10 mM 시트레이트/150 mM NaCl, pH 4.5)을 1 mg/mL 스톡으로부터 제조하였다. 지질 용액을 수성 mRNA 용액 내로 신속하게 주사하였고 진탕하여 20% 에탄올에서 최종 현탁액을 수득하였다. 결과적 나노입자 현탁액을 여과시키고, 1x PBS (pH 7.4)로 정용여과시키고, 농축시키고 그리고 2-8℃에서 저장하였다. 최종 농도 = 1.82 mg/mL EPO mRNA (캡슐화). Z평균 = 105.6 nm (Dv(50) = 53.7 nm; Dv(90) = 157 nm).
제제6: HGT5001, DOPE, 콜레스테롤 및 DMG-PEG2K의 50 mg/mL 에탄올 용액 분취량 (40:20:35:5)을 혼합하고 3 mL 최종 부피까지 에탄올로 희석하였다. 별도로, EPO mRNA의 수성 완충 용액 (10 mM 시트레이트/150 mM NaCl, pH 4.5)을 1 mg/mL 스톡으로부터 제조하였다. 지질 용액을 수성 mRNA 용액 내로 신속하게 주사하였고 진탕하여 20% 에탄올에서 최종 현탁액을 수득하였다. 결과적 나노입자 현탁액을 여과시키고, 1x PBS (pH 7.4)로 정용여과시키고, 농축시키고 그리고 2-8℃에서 저장하였다.
정맥내 전달된 mRNA-로딩된 나노입자를 통해 생산된 단백질의 분석
주사 프로토콜
달리 명시되지 않는 한, 실험 각각의 초반에 대략 6-8 주령의 수컷 CD-1 생쥐를 이용하여 연구를 수행하였다. 30-200 마이크로그램의 캡슐화 mRNA의 등가 총 용량의 단일 볼러스(bolus) 꼬리-정맥 주사로 샘플을 도입하였다. 생쥐를 희생하였고 지정된 시점에 식염수로 관류하였다.
분석을 위한 기관(organ) 조직의 단리
생쥐 각각의 간 및 비장을 수확하고, 세 부분으로 나누고, 그리고 10% 중성 완충 포르말린 또는 급속-냉동(snap-frozen) 중 하나로 저장하였고 그리고 분석을 위해 -80℃로 저장하였다.
분석을 위한 혈청의 단리
모든 동물을 용량 투여 후 48시간에 CO2 질식으로 안락사시켰고 (± 5%) 그 다음 개흉하고 말단 심장 혈액을 수집하였다. 전체 혈액 (최대 얻을 수 있는 부피)을 안락사된 동물의 심장 천자를 통해 혈청 분리관 내로 수집하였고, 적어도 30분 동안 실온에서 응고되도록 하였고, 10분 동안 9300 g으로 22℃ ± 5℃에서 원심분리하였고, 그리고 혈청을 추출하였다. 중간 혈청 수집을 위해, 대략 40-50μL의 전체 혈액을 안면 정맥 천자 또는 꼬리 자르기를 통해 수집하였다. 동물을 연구하기 위한 비교를 위해 비처리 동물로부터 수집된 샘플을 기저선으로서 이용하였다.
효소-결합 면역흡착 어세이 (ELISA) 분석
EPO ELISA: EPO 단백질의 정량화를 인간 EPO ELISA 키트 (Quantikine IVD, R&D Systems, Catalog # Dep-00)에 대해 보고된 절차에 따라 수행하였다. 이용된 양성 대조군은 초고순도 및 조직 배양 등급 재조합 인간 에리트로포이에틴 단백질 (R&D Systems, 각각, Catalog # 286-EP 및 287-TC)로 구성되었다. Molecular Device Flex Station 기구 상에서 흡수 (450 nm)를 통해 탐지를 모니터링하였다.
GLA ELISA: 포획 항체로서 양 항-알파-갈락토시다아제 G-188 IgG와 2차 (탐지) 항체로서 토끼 항-알파-갈락토시다아제 TK-88 IgG를 이용하여 표준 ELISA 절차를 이후에 수행하였다 (Shire Human Genetic Therapies). 3,3',5,5'-테트라메틸벤지딘 (TMB) 기질 용액의 활성화를 위해 겨자무 과산화수소 (HRP)-접합 염소 항-토끼 IgG를 이용하였다. 20분 후 2N H2SO4를 이용하여 반응을 퀀칭하였다. Molecular Device Flex Station 기구 상에서 흡수 (450 nm)를 통해 탐지를 모니터링하였다. 비처리된 생쥐 혈청 및 인간 알파-갈락토시다아제 단백질을 각각, 음성 및 양성 대조군으로서 이용하였다.
FIX ELISA: 인간 FIX ELISA 키트 (AssayMax, Assay Pro, Catalog # EF1009-1)에 대해 보고된 절차에 따라 FIX 단백질의 정량화를 수행하였다.
A1AT ELISA: 인간 A1AT ELISA 키트 (Innovative Research, Catalog #IRAPKT015)에 대해 보고된 절차에 따라 A1AT 단백질의 정량화를 수행하였다.
웨스턴 블롯 분석
(EPO): 대조군으로서 항-hEPO 항체 (R&D Systems #MAB2871) 및 초고순도 인간 EPO 단백질 (R&D Systems #286-EP)을 이용하여 웨스턴 블롯 분석을 수행하였다.
결과
이 실시예에서 설명된 연구는 단백질 생산을 위한 저장고 공급원으로서 mRNA-캡슐화 지질 나노입자의 용도를 입증한다. 이러한 저장고 효과는 신체내 다수 부위 (즉, 간, 신장, 비장, 및 근육)에서 성취될 수 있다. 리포좀 나노입자를 통해 전달된 전령 RNA로부터 파생된 바람직한 외인성-기반 단백질의 측정을 성취하고 정량화하였고, 그리고 인간 에리트로포이에틴 (hEPO), 인간 알파-갈락토시다아제 (hGLA), 인간 알파-1 항트립신 (hA1AT), 및 인간 인자 IX (hFIX) mRNA를 이용하여 저장고로부터 단백질의 분비를 입증하였다.
1A. 생체내 인간 EPO 단백질 생산 결과
다양한 지질 나노입자 제제로 hEPO 단백질의 생산을 입증하였다. 4 가지 상이한 양이온 지질 시스템 중, C12-200-기반 지질 나노입자는 ELISA에 의해 측정된 바와 같이 정맥내 투여 후 4시간 후에 가장 높은 양의 hEPO 단백질을 생산하였다 (도 7). 이 제제 (제제 1)는 혈류 내로 분비되는 18.3 ug/mL hEPO 단백질을 야기하였다. 인간에 대한 혈청내 정상적인 hEPO 단백질 수준은 3.3-16.6 mIU/mL였다 (NCCLS Document C28-P; Vol. 12, No. 2). 120,000 IU/mg의 EPO 단백질의 특이적 활성도에 기반하여, 그것은 정상적인 인간 개체에서 27.5-138 pg/mL hEPO 단백질의 양을 산출한다. 따라서, hEPO mRNA를 캡슐화한 단일 30 ug 용량의 C12-200-기반 양이온 지질 제제는 100,000-배 초과의 생리학적 수준의 단백질 각각에서의 증가를 초래하였다.
검사된 지질 시스템 중, DODAP-기반 지질 나노입자 제제는 가장 덜 효과적이었다. 하지만, EPO mRNA를 캡슐화한 DODAP-기반 지질 나노입자를 통한 전달로부터 파생된 인간 EPO 단백질의 관찰된 양은 4.1 ng/mL이었으며, 이는 EPO 단백질의 정상적인 생리학적 수준에 비해 30-배보다 여전히 더 크다 (표 1).
Figure 112014000539556-pct00003
추가적으로, 결과적 단백질을 이것이 활성이었는지 그리고 제대로 기능하였는지 확인하기 위해 검사하였다. hEPO mRNA를 이용한 mRNA 대체 요법 (MRT)의 경우에, 단백질 활성도를 평가하기 위해 5 가지 상이한 지질 나노입자 제제에 대해 10일 기간에 걸쳐 헤마토크리트 변화를 모니터링하였다 (도 8, 표 1). 이 시간 기간 동안에, 5개 제제 중 2개는 헤마토크리트에서의 증가 (≥15%)를 입증하였으며, 이는 이러한 시스템으로부터 생산되는 활성 hEPO 단백질을 나타낸다.
또 다른 실험에서, 15-일 기간에 걸쳐 헤마토크리트 변화를 모니터링하였다 (도 9, 표 2). 지질 나노입자 제제 (제제 1)는 단일 30 μg 용량이거나, 제1일, 제3일 그리고 제5일에 3회의 더 적은 10 μg 용량으로 투여하였다. 유사하게, 제제 2는 제1일, 제3일, 그리고 제5일에 3회 용량의 50 μg으로 투여하였다. C12-200은 헤마토크리트에서의 유의적인 증가를 초래하였다. 전반적으로, 최대 ~25%까지의 변화의 증가가 관찰되었으며, 이는 이러한 시스템으로부터 생산되는 활성 인간 EPO를 나타낸다.
Figure 112014000539556-pct00004
1B. 생체내 인간 GLA 단백질 생산 결과
mRNA-로딩된 지질 나노입자를 이용할 때, "저장고 효과"를 입증하기 위해 2차 외인성-기반 단백질 시스템을 탐구하였다. C12-200-기반 지질 나노입자 시스템을 이용하여 동물에게 단일 30 마이크로그램 용량의 캡슐화 인간 알파-갈락토시다아제 (hGLA) mRNA를 정맥내로 주사하였고 그리고 6시간 후 상기 동물을 희생시켰다 (제제 1). ELISA를 통해 분비 hGLA 단백질의 정량화를 수행하였다. 비처리된 생쥐 혈청 및 인간 알파-갈락토시다아제 단백질을 대조군으로서 이용하였다. 인간 알파-갈락토시다아제 단백질의 탐지를 48시간 기간에 걸쳐 모니터링하였다.
6시간의 2.0 ug/mL hGLA 단백질의 최대 수준으로 실험의 시간 경과 내내 측정가능한 수준의 hGLA 단백질이 관찰되었다 (도 10). 표 3은 혈청에서 발견된 hGLA의 특정량을 열거한다. 건강한 인간 남성에서의 정상적인 활성도가 대략 3.05 나노몰/시간/mL인 것으로 보고되었다. 알파-갈락토시다아제, 재조합 인간 알파-갈락토시다아제 단백질에 대한 활성도는 3.56 x 106 나노몰/시간/mg이다. 이들 값의 분석은 정상적인 건강한 남성 개체에서 대략 856 pg/mL의 hGLA 단백질의 양을 산출한다. hGLA mRNA-로딩된 지질 나노입자를 투약하고 6시간 후 관찰된 2.0 ug/mL hGLA 단백질의 양은 정상적인 생리학적 수준보다 2300-배를 초과하여 더 컸다. 추가적으로, 48시간 후, 당업자는 상당한 수준의 hGLA 단백질 (86.2 ng/mL)을 여전히 탐지할 수 있다. 이 수준은 48시간에 여전히 존재하는 생리학적 양에 비해 거의 100-배 더 큰 hGLA 단백질의 양을 나타낸다.
Figure 112014000539556-pct00005
추가적으로, 0.2 mg/kg으로 투여될 때 알파-갈락토시다아제의 반감기는 대략 108분이었다. GLA mRNA-로딩된 지질 나노입자를 투여할 때 "저장고 효과"를 통한 GLA 단백질의 생산은 나출 재조합 단백질의 직접적인 주사와 비교하여 혈액 체류 시간에서의 실질적인 증가를 보여준다. 상기 설명된 바와 같이, 48시간 후 단백질의 유의적인 양이 존재한다.
GLA mRNA-로딩된 지질 나노입자로부터 생산된 α-갈락토시다아제 단백질의 활성도 프로필을 4-메틸움벨리페릴-α-D-갈락토피라노시드 (4-MU-α-gal) 대사의 기능으로서 측정하였다. 도 11에서 나타난 바와 같이, 이들 나노입자 시스템으로부터 생산된 단백질은 꽤 활성이었고 그리고 이용가능한 단백질 수준을 나타낸다 (도 12, 표 3). 생쥐 및 인간내 mRNA 요법-기반 hGLA 생산 대 효소 대체 요법 (ERT)의 AUC 비교는 각각, 182-배 및 30-배 증가를 보여준다 (표 4).
Figure 112014000539556-pct00006
바람직한 단백질의 생산을 위한 저장고로서 작용할 수 있는 기관을 표적하는 mRNA 캡슐화 지질 나노입자의 능력이 입증되었다. 관찰된 분비 단백질의 수준은 정상적인 생리학적 수준을 몇 십 배 넘었다. "저장고 효과"는 반복가능하다. 도 12는 단일 30 ug 용량의 hGLA mRNA-로딩된 C12-200-기반 지질 나노입자 (제제 1)를 야생형 (CD-1) 생쥐에 투약시 활발한 단백질 생산이 관찰되었다는 점을 다시 보여준다. 이 실험에서, 72시간 기간에 걸쳐 hGLA 수준을 평가하였다. 4.0 ug 인간 hGLA 단백질/mL 혈청의 최대 평균이 투여-후 6시간에 탐지된다. 정상적인 생리학적 수준에 대한 ~1 ng/mL hGLA 단백질의 값에 기반하여, hGLA MRT는 대략 4000-배 더 높은 단백질 수준을 제공한다. 전과 같이, 투여-후 48시간까지 hGLA 단백질이 탐지될 수 있었다 (도 12).
이 동일한 실험으로부터 단리된 조직의 분석은 hGLA MRT-처리 생쥐내 hGLA 단백질의 분포에 대한 통찰력을 제공하였다 (도 13). 투여-후 12 내지 24시간에 관찰된 최대로 처리된 모든 생쥐의 간, 비장, 및 신장에서 과생리학적 수준의 hGLA 단백질이 탐지되었다. hGLA-로딩된 지질 나노입자의 단일 주사 후 3일에 탐지가능한 수준의 MRT-파생 단백질이 관찰될 수 있었다.
추가적으로, hGLA mRNA 로딩된 C12-200 나노입자의 투여시 hGLA의 생산은 혈청내 (도 14A), 그리고 간내 (도 14B) 용량 반응을 나타내는 것으로 나타났다.
지질 나노입자-매개 mRNA 대체 요법의 한 가지 고유 특성은 생산된 각각의 단백질의 약동학적 프로필일 것이다. 예를 들어, 알파-갈락토시다아제를 이용한 생쥐의 ERT-기반 처리는 대략 100분의 혈장 반감기를 야기한다. 대조적으로, MRT-파생 알파-갈락토시다아제는 6시간의 피크(peak) 시간을 포함하여 대략 72시간의 혈액 체류 시간을 갖는다. 이것은 바람직한 단백질의 가능한 지속적 흡수에 관여하기 위해 기관에 대한 훨씬 더 많은 노출을 감안한다. PK 프로필의 비교는 도 15에서 나타나고 클리어런스율에서의 극명한 차이를 입증하고 그리고 궁극적으로 면적하 곡선 (AUC)에서의 주요 변화는 MRT-기반 처리를 통해 성취될 수 있다.
분리된 실험에서, hGLA MRT를 생쥐 질병 모델인, hGLA KO 생쥐 (파브리 생쥐)에 적용시켰다. 0.33 mg/kg 용량의 hGLA mRNA-로딩된 C12-200-기반 지질 나노입자 (제제 1)를 단일, 정맥내 주사로 암컷 KO 생쥐에게 투여하였다. 정상적인 생리학적 수준보다 대략 600-배 더 높은 6시간의 피크 (~560 ng/mL 혈청)를 포함하여 실질적인 양의 MRT-파생 hGLA 단백질이 생산되었다. 추가적으로, hGLA 단백질은 투여-후 72시간에 여전히 탐지가능하였다 (도 16).
생명유지 기관내 MRT-파생 GLA 단백질의 정량화는 도 17에서 나타난 바와 같은 실질적인 축적을 입증하였다. 주요 기관에서 발견되는 보고된 정상적인 생리학적 수준과 관찰된 MRT-파생 hGLA 단백질의 비교를 플롯팅하였다 (파선으로 플롯팅된 정상적인 수준). 투여-후 72시간에서보다 24시간에서의 단백질 수준이 더 높은 반면에, 처리된 파브리 생쥐의 간, 신장, 비장 그리고 심장에서 탐지된 hGLA 단백질 수준은 야생형 수준과 같았다. 예를 들어, 단일 MRT 처리 후 3일에 처리된 생쥐의 신장에서 3.1 ng hGLA 단백질/mg 조직이 발견되었다.
차후 실험에서, 수컷 파브리 KO 생쥐의 ERT-기반 알파-갈락토시다아제 처리 대 hGLA MRT-기반 처리의 비교를 수행하였다. 1.0 mg/kg의 단일, 정맥 용량을 각각의 요법을 위해 제공하였고 생쥐를 투여-후 1주에 희생시켰다. hGLA 단백질의 혈청 수준을 주사-후 6시간에 그리고 1주에 모니터링하였다. 투여-후 1주에 hGLA 단백질에 대해 간, 신장, 비장, 그리고 심장을 분석하였다. 생분포(biodistribution) 분석 외에도, 신장 및 심장내 글로보트리오아실세라미드 (Gb3) 및 리소-Gb3 감소의 측정을 통해 효능의 척도를 결정하였다. 도 18은 수컷 파브리 생쥐내 알파-갈락토시다아제 또는 GLA mRNA 로딩된 지질 나노입자 (제제 1) 중 하나로 처리 후 hGLA 단백질의 혈청 수준을 보여준다. 투여-후 6시간 및 1주에 혈청 샘플을 분석하였다. ~4.0 ug/mL의 hGLA 단백질 혈청 수준과 함께, 6시간 후 MRT-처리 쥐에 대해 강한 신호가 탐지되었다. 대조적으로, 이 시간에 혈류내 남아있는 탐지가능 알파-갈락토시다아제는 없었다.
이 실험내 파브리 생쥐를 초기 주사 후 1주에 희생시켰고 기관을 수확 및 분석하였다 (간, 신장, 비장, 심장). 도 19는 hGLA MRT 또는 알파-갈락토시다아제 ERT 처리 후 각각의 기관에서 발견된 인간 GLA 단백질의 비교를 보여준다. 수준은 투여-후 1주에 존재하는 hGLA와 상응한다. hGLA 단백질은 분석된 모든 기관에서 탐지되었다. 예를 들어, MRT-처리 생쥐는 2.42 ng hGLA 단백질/mg 단백질의 신장내 hGLA 단백질 축적을 야기한 반면에, 알파-갈락토시다아제-처리 생쥐는 단지 잔류 수준만 가졌다 (0.37 ng/mg 단백질). 이것은 hGLA MRT를 통해 처리될 때 ~6.5-배 더 높은 수준의 hGLA 단백질과 상응한다. 심장 분석 시, 단지 1.0 ng/mg의 단백질 알파-갈락토시다아제와 비교하여 MRT-처리 코호트(cohort)에 대해 11.5 ng hGLA 단백질/mg 단백질이 발견되었다. 이것은 ERT-기반 치료에 비해 hGLA MRT-처리 생쥐의 심장내 ~11-배 더 높은 축적에 상응한다.
수행된 생분포 분석 외에도, 주요 기관내 글로보트리오아실세라미드 (Gb3) 및 리소-Gb3 수준의 측정을 통해 효능의 평가를 결정하였다. 단일, 정맥내 1.0 mg/kg GLA MRT 처리 후 Gb3 감소의 직접적인 비교는 등가 용량의 알파-갈락토시다아제 ERT-기반 요법과 비교하여 신장 그리고 심장내 Gb3의 수준에서 상당한 차이를 초래하였다. 예를 들어, GLA MRT 대 알파-갈락토시다아제에 대한 Gb3 수준은 각각, 60.2% 대 26.8%의 감소를 초래하였다 (도 20). 추가적으로, 심장내 Gb3 수준은 MRT 및 알파-갈락토시다아제에 대해, 각각 92.1% 대 66.9%로 감소되었다 (도 21).
효능의 측정을 위한 2차 관련 바이오마커는 리소-Gb3이다. GLA MRT는 알파-갈락토시다아제보다 그리고 신장 및 심장에서도 더욱 효율적으로 리소-Gb3을 감소시켰다 (각각, 도 20 및 도 21). 특히, MRT-처리된 파브리 생쥐는 신장 및 심장에서, 각각, 47.8% 및 61.3%의 감소를 초래한 알파-갈라톡시다아제-처리 생쥐와 비교하여, 86.1% 및 87.9%의 리소-Gb3의 감소를 입증하였다.
C12-200 기반 지질 나노입자내 hGLA에 대한 결과는 다른 지질 나노입자 제제에까지 확장된다. 예를 들어, 단일 용량 IV으로 투여된 hGLA mRNA 로딩된 HGT4003 (제제 3) 또는 HGT5000-기반 (제제 5) 지질 나노입자는 투여 후 24시간에 hGLA의 생산을 야기하였다 (도 22). hGLA의 생산은 용량 반응을 나타내었다. 유사하게, 단일 용량 IV로 투여된 hGLA mRNA 로딩된 HGT5001-기반 (제제 6) 지질 나노입자의 투여 후 6시간 및 24시간에 hGLA 생산이 관찰되었다. 혈청에서 (도 23A), 그리고 기관 (도 23B)에서 hGLA 생산이 관찰되었다.
전반적으로, 단백질 생산을 위한 저장고로서 적용되는 mRNA 대체 요법은 과생리학적 수준으로, 대량의 활성인, 기능적으로 치료학적인 단백질을 생산한다. 이 방법은 바람직한 단백질의 지속되는 순환 반감기를 초래하는 것으로 입증되었고 그리고 이 MRT-파생 단백질은 파브리 생쥐내 알파-갈락토시다아제 효소로 입증된 바와 같은 요법에 대해 매우 효과적이다.
1C. 생체내 인간 FIX 단백질 생산 결과
야생형 생쥐 (CD-1)에 인자 IX (FIX) mRNA-로딩된 지질 나노입자를 투여하고 혈류 내로 분비되는 FIX 단백질을 측정하여 연구를 수행하였다. 단일 용량의 30 ug C12-200-기반 (40:30:25:5의 비의 C12-200:DOPE:Chol:PEG) FIX mRNA-로딩된 지질 나노입자 (캡슐화 mRNA에 기반한 용량) (제제 1)의 정맥내 주사시, 활발한 단백질 생산이 관찰되었다 (도 24).
72시간에 걸친 약동학적 분석은 MRT-파생 FIX 단백질이 검사된 모든 시점에서 탐지될 수 있다는 점을 보여주었다 (도 24). ~3 ug (2995±738 ng/mL) FIX 단백질/mL 혈청의 값으로 주사-후 24시간에 피크 혈청 농도가 관찰되었다. 이것은 저장고 효과의 또 다른 성공적인 예시를 나타낸다.
1D. 생체내 인간 A1AT 단백질 생산 결과
야생형 생쥐 (CD-1)에 알파-1-항트립신 (A1AT) mRNA-로딩된 지질 나노입자를 투여하고 혈류 내로 분비되는 A1AT 단백질을 측정하여 연구를 수행하였다. 단일 용량의 30 ug C12-200-기반 A1AT mRNA-로딩된 지질 나노입자 (캡슐화 mRNA에 기반한 용량) (제제 1)의 정맥내 주사 시, 활발한 단백질 생산이 관찰되었다 (도 25).
도 25에서 나타난 바와 같이, A1AT MRT로부터 파생된, 탐지가능한 수준의 인간 A1AT 단백질이 투여-후 24시간 기간에 걸쳐 관찰될 수 있었다. ~48 ug A1AT 단백질/mL 혈청의 최대 혈청 수준이 주사 후 12시간에 탐지되었다.
실시예 2: 폴리뉴클레오티드 조성물의 폐 전달을 통한 단백질 생산 저장고
주사 프로토콜
실험 각각의 초반에 대략 7-10 주령의 암컷 CD-1 또는 BALB/C 생쥐를 이용하여 모든 연구를 수행하였다. 단일 기관내 에어로졸화된 투여를 통해 검사 항목을 도입하였다. 생쥐를 희생시켰고 그리고 지정된 시점에 식염수로 관류하였다. 생쥐 각각의 폐를 수확하고, 두 부분으로 나누고, 그리고 10% 중성 완충 포르말린 또는 급속 냉동 중 하나로 저장하였고 그리고 분석을 위해 -80℃로 저장하였다. 실시예 1에서 설명된 바와 같이 혈청을 단리시켰다. EPO ELISA: 실시예 1에서 설명된 바와 같음.
결과
폐 전달 (가령 비강내, 기관내, 분무화)을 통해 저장고 효과를 성취할 수 있다. 나노입자 시스템을 통해 전달된 전령 RNA로부터 파생된 바람직한 외인성-기반 단백질의 측정을 성취하고 정량화하였다.
hEPO mRNA-로딩된 지질 나노입자를 통한 인간 EPO 단백질의 생산을 단일 기관내 투여 (MicroSprayer®)를 통해 CD-1 생쥐에서 검사하였다. 다양한 양이온 지질을 이용하여 여러 가지 제제를 검사하였다 (제제 1, 5, 6). 모든 제제는 인간 EPO mRNA의 높은 캡슐화를 야기하였다. 투여 시, 동물을 투여-후 6시간에 희생시켰고 폐 그리고 혈청을 수확하였다.
에어로졸 전달을 통한 처리 시 투여 부위 (폐)에서 인간 EPO 단백질을 탐지하였다. 투여-후 6시간에 혈청의 분석은 순환내 탐지가능한 양의 hEPO 단백질을 보여 주었다. 이들 데이터 (도 26에서 나타남)는 hEPO 단백질의 생산 (및 분비)을 위한 "저장고"로서 작용하는 폐의 능력을 입증한다.
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Claims (81)

  1. 대상의 파브리병 치료에 사용하기 위한 조성물로서,
    (a)　적어도 일부가 기능적 분비 폴리펩티드를 인코딩하는 적어도 하나의 mRNA 분자;　및　(b)　지질 나노입자를 포함하는 수송 비히클(transfer vehicle)을 포함하고,
    이 때 상기 지질 나노입자는 하나 이상의 PEG-변형 지질을 포함하고,
    이 때 상기 mRNA는 서열 번호: 4를 포함하며 인간 알파-갈락토시다아제 (hGLA) 단백질을 인코딩하고, hGLA 단백질이 발현 이후 세포밖으로 분비되어 전신에 분포되며, 혈청 hGLA 단백질 수준은 처리 전 기저선 혈청 hGLA 수준과 비교하여 적어도 72시간 동안 증가되고,
    상기 mRNA는 정맥내 또는 폐 투여를 통해 투여되는, 조성물.
  2. 청구항 1에 있어서, 상기 대상은 리소좀 축적 질환을 가진 개체이고 hGLA가 비정상적으로 결핍됨을 특징으로 하는 조성물.
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  68. 청구항 1에 있어서, 지질 나노입자는 리포좀임을 특징으로 하는 조성물.
  69. 청구항 69에 있어서, 리포좀은 하나 이상의 양이온 지질, 및 하나 이상의 비-양이온 지질을 포함함을 특징으로 하는 조성물.
  70. 청구항 1에 있어서, mRNA는 비-자연 발생 뉴클레오티드를 포함함을 특징으로 하는 조성물.
  71. 청구항 71에 있어서, 상기 비-자연 발생 뉴클레오티드는 유사우리딘임을 특징으로 하는 조성물.
  72. 청구항 1에 있어서, 상기 조성물은 대상에게 정맥내 주사에 의해 투여되도록 제형(adapt)됨을 특징으로 하는 조성물.
  73. 청구항 73에 있어서, mRNA의 투여는 인간 대상에서의 글로보트리오아실세라미드(globotrioasylceramide, Gb3) 수준을 처리 전 Gb3 수준에 비해 감소시킴을 특징으로 하는 조성물.
  74. 시험관내 (in vitro) 표적 세포에서 인간 알파-갈락토시다아제(hGLA) 단백질을 생산하는 방법에 있어서,
    (a) 서열 번호: 4를 포함하는 적어도 하나의 mRNA, 여기서 이의 적어도 일부는 인간 알파-갈락토시다아제(hGLA) 단백질을 인코딩함; 및 (b) 지질 나노입자를 포함하는 수송 비히클을 포함하는 조성물을 투여하는 단계를 포함하며,
    이 때 상기 지질 나노입자는 하나 이상의 PEG-변형 지질을 포함하고,
    여기서 상기 조성물의 투여 후 상기 mRNA는 투여 후 72시간 이상 적어도 탐지가능한 수준으로 분비된 인간 알파-갈락토시다아제(hGLA) 단백질을 생산하기 위해 표적 세포에서 번역되는 방법.
  75. 청구항 75에 있어서, 상기 표적 세포는 간세포, 상피세포, 조혈세포, 내피세포, 폐세포, 골세포, 줄기세포, 간엽세포, 신경세포, 심장세포, 지방세포, 혈관 평활근 세포, 심근세포, 골격근 세포, 베타 세포, 뇌하수체 세포, 활액 내층 세포, 난소세포, 고환세포, 섬유아세포, B 세포, T 세포, 망상적혈구, 백혈구, 과립구 및 종양 세포로 구성된 그룹에서 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
  76. 청구항 75 또는 76에 있어서, 상기 지질 나노입자는 하나 이상의 양이온 지질 및 하나 이상의 비-양이온 지질을 포함함을 특징으로 하는 방법.
  77. 청구항 75 또는 76 중 어느 한 항에 있어서, 상기 mRNA는 서열 번호: 4를 포함함을 특징으로 하는 방법.
  78. 청구항 75 또는 76 중 어느 한 항에 있어서, 상기 mRNA는 리포좀 내 캡슐화됨을 특징으로 하는 방법.
  79. 청구항 79에 있어서, 상기 리포좀은 하나 이상의 양이온 지질, 하나 이상의 비-양이온 지질 및 하나 이상의 콜레스테롤-기반 지질을 포함함을 특징으로 하는 방법.
  80. 청구항 75 또는 76 중 어느 한 항에 있어서, 상기 mRNA는 비-자연 발생 뉴클레오티드를 포함함을 특징으로 하는 방법.
  81. 청구항 81에 있어서, 상기 비-자연 발생 뉴클레오티드는 유사우리딘임을 특징으로 하는 방법.
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