JPH09500013A

JPH09500013A - カチオン性脂質による遺伝子免疫

Info

Publication number: JPH09500013A
Application number: JP7501040A
Authority: JP
Inventors: ジェシー，ジョエル・エイ; ハール，ウイリアム・ジー
Original assignee: ライフ・テクノロジーズ・インコーポレイテッド
Priority date: 1993-06-01
Filing date: 1994-05-31
Publication date: 1997-01-07
Also published as: US20050124039A1; EP1624068A1; EP0702516A4; US7166298B2; US20070141677A1; JP2006006336A; US20020077305A1; US6890554B2; WO1994027435A1; EP0702516A1

Abstract

(57)【要約】遺伝子材料を用いた免疫法が開示される。カチオン性脂質およびポリヌクレオチドを含む遺伝子免疫のための組成物もまた開示される。ポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体を産生させるための遺伝子免疫の使用方法も開示される。エピトープのマッピング法もまた開示される。

Description

【発明の詳細な説明】カチオン性脂質による遺伝子免疫発明の技術分野本発明は、免疫学の技術分野に関する。さらに詳しくは、本発明は、カチオン性脂質および免疫原をコードするポリヌクレオチド分子からなる組成物を用いた免疫方法に関する。本発明はまた、遺伝子で免疫した動物からポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体を製造する方法にも関する。本発明はさらに、タンパク質エピトープのマッピングのための遺伝子免疫の使用に関する。発明の背景従来の免疫法は、侵入してきた病原体と免疫反応する抗体の混合物を注射するか（すなわち受動免疫）、免疫系を刺激して病原体特異的な抗体を産生させるワクチンによって行われている。外来性の抗体は受容者によって排除されるので、受動免疫は一時的な防御を提供するにすぎない。ワクチンは一層長期間持続する能動免疫を与える。ワクチンが有効であるためには、ワクチンによって体液性および／または細胞媒体性の免疫が生起され、その後の対応病原体への暴露による疾患の発症を防ぐことができなければならない。関連抗原決定基が天然の感染を擬態するような仕方で免疫系に呈示される必要がある。従来のウイルスワクチンは、不活化ビルレント株かまたは生きた弱毒化株からなる（オールド（Ｏld）ら、「遺伝子操作の原理：遺伝子工学入門（Ｐrinciples of Ｇene Ｍanipulation：Ａn Ｉntroduct ion to Ｇenetic Ｅngineering）、ブラックウエル・サイエンティフィック・パブリケーションズ」第４版、１９８９）。ウイルスを含むワクチンを用いることの一般的問題点は、多くのウイルス（Ｂ型肝炎ウイルスなど）は組織培養液中で高力価まで増殖するように適合することができず、そのため充分な量で産生することができないことである（同上）。加えて、不活化ウイルスの使用は、増殖の結果としてのワクチン関連疾患の潜在的可能性を提起する、すなわちコンピーテントなウイルスが接種物中に残存しているかもしれない。ヨーロッパにおける口蹄疫の発症は、このことが原因である（同上）。一方、弱毒化ウイルス株は、ワクチン中で複製する間にビルレントな表現型に逆戻りする可能性がある。この問題は、生ポリオワクチンを受けた１００万人当たりおよそ１回または２回生じていることが報告されている（同上）。さらに、弱毒化ウイルスによる麻疹免疫の後に脳炎が発症することがある（ロワ（Ｒoit,Ｉ.Ｍ.）、免疫学概論（Ｅssential Ｉmmunology）、ブラックウエル・サイエンティフィック・パブリケーションズ、第６版、１９８８）。弱毒化株を用いることの他の欠点は、適当な冷貯蔵装置を維持するのが困難で費用がかかることである（同上）。生ウイルスワクチンを使用することに伴う主要な欠点は、先天的または後天的な免疫不全を有する個体が重篤な感染症への危険にさらされることである。そのような個体には、栄養不良および／またはウイルスもしくは寄生虫感染のためにしばしば免疫不全である開発途上国の子供が含まれる（同上、オールドら、上記文献）。分子生物学およびペプチド合成における近年の進歩の結果、免疫予防に使用するために精製ウイルスタンパク質または合成ペプチドを製造することが可能である（ウイルス学（Ｖirology）、フィールズ（Ｆields）ら編、レーブン・プレス、ニューヨーク、３４９〜３７０頁（１９８５）中、マーフィー（Ｍurphy）ら、「ウイルスに対する免疫（Ｉmmunization against Ｖiruses）」）。精製抗原の製造は、当該病原体の表面抗原の免疫学的に重要なドメインを呈示するペプチドを合成することにより行うことができる。合成ペプチド法は、上記口蹄疫ウイルスの抗原決定基に用いられて成功している（同上）。この方法の一つの問題は、合成ペプチドの抗原性が不充分であるため、実験動物において免疫応答を促進するためにフロイントのアジュバントを使用する必要があることである（同上）。フロイントのアジュバントはヒトには使用できないため、ヒトへの使用にも有効なアジュバントを開発する必要がある（同上）。加えて、単一の抗原性部位は耐性を誘発するには充分ではない。というのは、大きな表面の抗原は、通常、体液性および／または細胞媒体性応答を引き起こす幾つかの異なる免疫学的ドメインを含むからである（ブラシアル（Ｂraciale）ら、Ｊ.Ｅxp.Ｍed.１５３：９１０〜９２３（１９８１）；ウイリー（Ｗiley）ら、Ｎature、２８９：３７３〜３７８（１９８１））。線状タンパク質分子の隣接しない部分によって形成されるエピトープに対する免疫応答を剌激することもまた困難である（マーフィーら、上記文献）。タンパク質決定基の大部分は不連続であって一次アミノ酸配列では遠隔の位置にあるアミノ酸残基が関与するが、ペプチドの折り畳みによって隣接して併置されるようになるという証拠が存在する（ロワ、上記文献）。ワクチン用タンパク質の製造の別法には、適当なベクター中に挿入したクローニングウイルスＤＮＡを使用することによって原核または真核細胞中でウイルスタンパク質を産生させることが含まれる（アルドビニ（Ａldovini）ら、Ｔhe Ｎ ew Ｖaccines、Ｔechnology Ｒeview、２４〜３１頁、１９９２年１月）。この方法もまた幾つかの制限を有する。たとえば、組換え宿主細胞によって目的組換えタンパク質を最適に産生させるための適当な条件を考案する必要がある。産生されたタンパク質は培養系から単離および精製する必要があり、ワクチンとして使用するために充分な量で得る必要がある。最後に、精製タンパク質の翻訳後修飾（グリコシル化および／または融合タンパク質の開裂など）を行う必要があるかもしれない。インビトロで組換え抗原を製造するための別法は、抗原をコードする核酸配列をワクチンの細胞中に導入することである。この方法では、抗原はワクチンの細胞によってインビボで産生され、免疫応答を引き起こす。タング（Ｔang）らは、ヒト成長ホルモンのゲノム配列を含有するプラスミドをコーティングした金のマイクロ投射物（microprojectiles）を投射する（propelling）ことにより、ヒト成長ホルモンに対する免疫応答をマウスで起こさせることが可能であることを示している（Ｎature、３５６：１５２〜１５４（１９９２））。その結果得られる抗体産生の変動性は、マイクロ投射装置の操作またはマイクロ投射物へのＤＮＡのコーティングによるものであると仮定された。さらに最近では、ウルマー（Ｕlmer）らは、インフルエンザＡ核タンパク質の遺伝子を有するプラスミドをマウスの四頭筋中に注射した（Ｓcience、２５９：１７４５〜１７４９（１９９３））。このマウスは核タンパク質抗体を産生したので該遺伝子がマウス細胞中で発現されたことが示された。このマウスはまた核タンパク質に特異的な細胞毒性のＴリンパ球をも産生したが、該リンパ球はインフルエンザＡウイルスの異種株によるその後の攻撃からマウスを防御するのに有効なものであった。同様に、ワング（Ｗang）らは、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）１型のエンベロープＤＮＡ構築物のマウスへの筋肉内注射が抗原特異的な細胞性および体液性の免疫応答を生じさせることを観察した（Ｐroc.Ｎatl.Ａca d.Ｓci.ＵＳＡ）９０：４１５６〜４１６０（１９９３））。加えて、接種したマウスからの脾臓リンパ球はＨＩＶ−エンベロープ−特異的な増殖性の応答を示した。それゆえ、病原体抗原をコードするＤＮＡの直接接種は、ウイルス、タンパク質またはペプチドの使用にとって代わることができるものである。接種のために裸のＤＮＡを使用することの一つの問題点は、細胞による取り込みの効率が低いことである。たとえば、上記ワングらのプロトコールによれば、１００μｇのＤＮＡ構築物の２週間毎の注射を全部で４回接種する必要がある。本明細書に記載するように、ＤＮＡ構築物の担体としてのカチオン性脂質の使用は遺伝子免疫の一層効率的な手段を提供する。本発明によれば、遺伝子免疫はわずかに５μｇのＤＮＡ構築物（カチオン性脂質と複合体を形成）を用いて達成することができる。リポソームは、組織培養細胞のトランスフェクションにおいて遺伝情報の担体として用いられている。中性またはアニオン性の脂質を含むリポソームを用いたリポソーム媒体トランスフェクションの基本的な問題点は、そのようなリポソームが一般に標的細胞表面と融合しないということである。融合する代わりにリポソームは食作用によって取り込まれ、ポリヌクレオチドはその後リソゾーム画分の分解酵素の作用に供される（ストラウビンガー（Ｓtraubinger）ら、Ｍethods Ｅnzymol.１０１：５１２〜５２７（１９８３）；マニーノ（Ｍannino）ら、Ｂ iotechniques、６：６８２〜６９０（１９８８））。従来のリポソーム法の他の問題点は、ＤＮＡやＲＮＡのような大きな巨大分子を収容するには通常のリポソームの水性空間では小さ過ぎることである。その結果、通常のリポソームは捕捉効率が低い（フェルグナー（Ｆelgner）、「リポフェクチン^TM試薬を用いたカチオン性リポソーム媒体トランスフェクション（Ｃationic Ｌiposome−Ｍediated Ｔransfection with Ｌipofectin^TM Ｒeagent）」、Ｇene Ｔransfer and Ｅxpr ession Ｐrotocols Ｖｏｌ.７、マレイ（Ｍurray,Ｅ.Ｊ.）編、ヒューマナ・プレス、ニュージャージー、８１〜８９頁（１９９１））。カチオン性脂質を含むリポソームはＤＮＡやＲＮＡなどのポリアニオンと自発的かつ迅速に相互作用し、その結果、該ポリヌクレオチドを１００％取り込んだリポソーム／核酸複合体を生成する（フェルグナーら、Ｐroc.Ｎatl.Ａcad.Ｓci .ＵＳＡ、８４：７４１３〜７４１７（１９８７）；フェルグナーら、Ｆocus、１１：２１〜２５（１９８９））。さらに、生成したポリカチオン性複合体は、負に荷電したまたは中性のリポソームに比べて約１０倍から１００倍の効率で組織培養細胞のアニオン性表面によって取り込まれる（フェルグナーら、「リポフェクチン^TM試薬を用いたカチオン性リポソーム媒体トランスフェクション」、Ｇ ene Ｔransfer and Ｅxpression Ｐrotocols Ｖｏl.７、マレイ編、ヒューマナ・プレス、ニュージャージー、８１〜８９頁（１９９１））。加えて、このポリカチオン性複合体は細胞表面と融合し、その結果、ポリヌクレオチドが細胞内に送達され、リソゾーム画分の分解酵素を回避することができる（デュツギュネスルグナーら、Ｎature、３３７：３８７〜３８８（１９８９））。インビトロで細胞をトランスフェクションするためにカチオン性脂質の種々の調合物が用いられている（ＷＯ９１／１７４２４；ＷＯ９１／１６０２４；米国特許第４,８９７,３５５号；米国特許第４,９４６,７８７号；米国特許第５, ０４９,３８６号；および米国特許第５,２０８,０３６号）。カチオン性脂質はまた、外来ポリヌクレオチドをカエルまたはラット細胞中にインビボで導入するのにも用いられている（ホルト（Ｈolt）ら、Ｎeuron、４：２０３〜２１４（１９９０）；ハジンスキー（Ｈazinski）ら、Ａm.Ｊ.Ｒespr.Ｃell.Ｍol.Ｂiol.４：２０６〜２０９（１９９１））。それゆえ、カチオン性脂質は一般に生物学的活性物質を送達するための医薬担体として用いることができる（たとえば、ＷＯ９１／１７４２４；ＷＯ９１／１６０２４；およびＷＯ９３／０３７０９参照）。それゆえ、カチオン性リポソームは、遺伝子免疫のために宿主細胞中に外来ポリヌクレオチドを導入するための効率的な担体を提供する。種々のカチオン性脂質が当該技術分野でよく知られている。よく知られたカチオン性脂質の一つはＮ−［１−（２,３−ジオレオイルオキシ）プロピル］−Ｎ, Ｎ,Ｎ−トリメチルアンモニウムクロライド（ＤＯＴＭＡ）である。ＤＯＴＭＡの構造は、下記の通りである。ＤＯＴＭＡは、単独またはジオレオイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）と１：１で組み合わせて標準法によりリポソームに調合することができる。フェルグナーらは、かかるリポソームが培養細胞への核酸の効率的な送達を可能とすることを示している（Ｐroc.Ｎatl.Ａcad.Ｓci.ＵＳＡ、８４：７４１３〜７４１７（１９８７））。ＤＯＴＭＡ：ＤＯＰＥ（１：１）調合物はリポフェクチン^TM（ＬＩＰＯＦＥＣＴＩＮ^TM）（ＧＩＢＣＯ／ＢＲＬ：ライフ・テクノロジーズ・インコーポレイテッド、ゲイサーバーグ、メリーランド州）の商品名で販売されている。他の市販のカチオン性脂質は１,２−ビス（オレオイルオキシ）−３−３−（トリメチルアンモニア）プロパン（ＤＯＴＡＰ）であり、これはオレオイル残基がプロピルアミンにエーテル結合ではなくエステル結合で結合している点がＤＯＴＭＡと異なっている。ＤＯＴＡＰは標的細胞によって一層容易に分解されると思われる。関連する公知化合物群は、トリメチルアンモニウム基のメチル基の一つがヒドロキシエチル基で置換されている点がＤＯＴＭＡおよびＤＯＴＡＰと異なっている。このタイプの化合物は、プロピルアミン核にステアロイルエステルが結合したホスホリパーゼＡのローゼンタールインヒビター（ローゼンタール（Ｒosenth al）ら、Ｊ.Ｂiol.Ｃhem.２３５：２２０２〜２２０６（１９６０））と類似している。ローゼンタールインヒビター（ＲＩ）のジオレオイル類似体は一般に、プロピルアミン核への脂肪酸残基の結合に応じてＤＯＲＩ−エーテルおよびＤＯＲＩ−エステルと略する。ヒドロキシ基は、たとえばカルボキシスペルミンへのエステル結合による官能化などのような、さらなる官能化のための部位として用いることができる。他のクラスの公知化合物は、ベール（Ｂehr）らによって記載されており（Ｐr oc.Ｎatl.Ａcad.Ｓci.ＵＳＡ、８６：６９８２〜６９８６（１９８９）；ＥＰＯ公開第０３９４１１１号）、これはカルボキシスペルミンが２つのタイプの脂質に結合したものである。５−カルボキシルスペルミルグリシンジオクタデシルアミド（ＤＯＧＳ）の構造は下記の通りである。ジパルミトイルホスファチジルエタノールアミン５−カルボキシスペルミルアミド（ＤＤＰＥＳ）の構造は下記の通りである。ＤＯＧＳおよびＤＤＰＥＳの両者とも、プラスミドをコーティングし、効率的なトランスフェクションを提供する脂質凝集複合体を形成させるのに用いられている。これら化合物は、ある種の細胞株をトランスフェクションするのにＤＯＴＭＡより効率的であり、毒性も低いとされている。ＤＯＧＳはトランスフェクタム^TM（ＴＲＡＮＳＦＥＣＴＡＭ^TM）（プロメガ、マジソン、ウイスコンシン州）の商品名で市販されている。カチオン性コレステロール誘導体（ＤＣ−Ｃｈｏｌ）が合成され、ＤＯＰＥと組み合わせてリポソームに調合されている（ガオ（Ｇao）ら、Ｂiochim.Ｂiophy s.Ｒes.Ｃomm.１７９：２８０〜２８５（１９９１））。この化合物の構造は下記の通りである。ＤＣ−Ｃｈｏｌを用いて調合したリポソームは、ＤＯＴＭＡ含有リポソームに比べ、ある種の細胞株において一層効率的なトランスフェクションが可能であり、毒性も低い。リポポリリシンは、ポリリシンをＤＯＰＥに結合させることによって生成される。この化合物は、血清の存在下でのトランスフェクションに特に有効であると報告されている（ゾウ（Ｚhou）ら、Ｂiochim.Ｂiophys.Ｒes.Ｃomm.１６５：８〜１４（１９９１））。それゆえ、リポポリリシンは免疫のための有効な担体である。加えて、ゲベイフ（Ｇebeyhu）らは、下記一般式で示される新規カチオン性脂質を開発した（継続中の米国特許出願第０７／９３７,５０８号；１９９２年８月２８日出願）：（式中、Ｒ₁およびＲ₂は、それぞれ、または両者とも、Ｃ_1〜23アルキルまたは −ＣＯ−Ｃ_1〜23アルキルまたはアルケニル、ｑは１〜６、Ｚ₁およびＺ₂は、それぞれ、または両者とも、Ｈまたは非分枝鎖アルキルＣ_1〜6 、Ｘ₁は−（ＣＨ₂）_nＢｒ、Ｃｌ、ＦまたはＩ、ｎ＝０〜６またはＸ₂は−（ＣＨ₂）_n−ＮＨ₂、ｎ＝０〜６またはＸ₃は−ＮＨ−（ＣＨ₂）_m−ＮＨ₂、ｍ＝２〜６またはＸ₄は−ＮＨ−（ＣＨ₂）₃−ＮＨ−（ＣＨ₂）₄−ＮＨ₂またはＸ₅は−ＮＨ−（ＣＨ₂）₃−ＮＨ−（ＣＨ₂）₄−ＮＨ−（ＣＨ₂）₃−ＮＨ₂または（式中、ｐは２〜５、ＹはＨ、またはアミドもしくはアルキルアミノ基により結合した他の基）またはＸ₉はポリアミン、たとえば、ポリリシン、ポリアルギニン、ポリブレン、ヒストンまたはプロタミン、またはＸ₁₀はリポーター分子、たとえば、−ＮＨＣＯ−フルオレセイン、ビオチン、葉酸またはＰＰＤ、またはＸ₁₁は多糖または置換多糖、またはＸ₁₂はタンパク質、またはＸ₁₃は抗体、またはＸ₁₄はアミンまたはハライド反応性基、またはＸ₁₅は−（ＣＨ₂）_r−ＳＨ（式中、ｒは０〜６），またはＸ₁₆は−（ＣＨ₂）−Ｓ−Ｓ−（ＣＨ₂）_t−ＮＨ₂（式中、ｓは０〜６、ｔは２〜６））。これら化合物は、単独または他の脂質凝集体形成成分（ＤＯＰＥまたはコレステロールなど）と組み合わせてリポソームまたは他の脂質凝集体に調合するのに有用である。そのような凝集体はカチオン性であり、ＤＮＡやＲＮＡなどのアニオン性巨大分子と複合体を形成することができる。発明の要約本発明は、（ａ）少なくとも１種のカチオン性脂質を抗原決定基をコードするポリヌクレオチドと混合してカチオン性脂質−ポリヌクレオチド複合体を形成させ、ついで（ｂ）該脂質−ポリヌクレオチド複合体を動物に投与することを特徴とする、動物において免疫応答を引き起こさせる方法に関する。本発明はまた、（ａ）少なくとも１種のカチオン性脂質を、感染性疾患の病原体である微生物の抗原決定基をコードするポリヌクレオチドと混合してカチオン性脂質−ポリヌクレオチド複合体を形成させ、ついで（ｂ）該脂質−ポリヌクレオチド複合体を動物に投与して該感染性疾患に対する能動免疫を生じさせることを特徴とする、動物における感染性疾患に対する能動免疫を生じさせる方法に関する。本発明はまた、ポリヌクレオチドが免疫原をコードするＤＮＡ配列を含む発現ベクターであり、該ＤＮＡ配列の転写がプロモーターの制御下にある、遺伝子免疫法に関する。本発明はまた、ポリヌクレオチドが免疫原をコードするＲＮＡ分子である遺伝子免疫法に関する。本発明はまた、上記遺伝子免疫法を使用し、免疫した動物からポリクローナル抗体を単離することを特徴とする、ポリクローナル抗体の製造方法に関する。本発明はまた、（ａ）少なくとも１種のカチオン性脂質を、免疫原をコードするＤＮＡ配列を含むポリヌクレオチドと混合して脂質−ポリヌクレオチド複合体を形成させ、（ｂ）該脂質−ポリヌクレオチド複合体を少なくとも１のマウスに投与し、（ｃ）該免疫したマウスからＢリンパ球を取り出し、（ｄ）該免疫したマウスからのＢリンパ球をミエローマ細胞と融合させてハイブリドーマを生成させ、（ｅ）これらハイブリドーマをクローニングし、（ｆ）抗免疫原抗体を産生する陽性クローンを選択し、（ｇ）該抗免疫原抗体を産生するクローンを培養し、ついで（ｈ）抗免疫原抗体を培養液から単離することを特徴とする、モノクローナル抗体の製造方法に関する。本発明はまた、タンパク質分子のエピトープをマッピングする方法であって、（ａ）該タンパク質分子をコードするＤＮＡ分子をランダムに断片化し、（ｂ）これらＤＮＡ断片を発現ベクター中にサブクローニングし、（ｃ）少なくとも一つのカチオン性脂質を各発現ベクターサブクローンと混合して各発現ベクターサブクローンとのカチオン性脂質−発現ベクター複合体を生成させ、（ｄ）該カチオン性脂質−発現ベクター複合体をマウスに投与し、ついで（ｄ）どのＤＮＡ断片がマウスにおいて抗体を産生させることができるかを決定することを特徴とする方法に関する。定義以下の記載において、組換えＤＮＡ法において使用される多数の術語が広範に利用されている。そのような術語によって与えられるべき範囲を含め、明細書および請求の範囲の明確かつ一貫した理解が得られるよう、下記に定義を記載する。クローニングベクター：宿主細胞中で自律複製することができ、ベクターの本質的な生物学的機能を損なうことなく決定しうる仕方でＤＮＡ配列を切断しうるような１または少数の制限エンドヌクレアーゼ認識部位を有することを特徴とし、ＤＮＡ断片の複製およびクローニングのためにＤＮＡ断片をスプライスしうる、プラスミドまたはファージＤＮＡまたは他のＤＮＡ配列。クローニングベクターはまた、クローニングベクターで形質転換された細胞の同定に使用するのに適したマーカーを含んでいてもよい。マーカーは、たとえば、テトラサイクリン耐性またはアンピシリン耐性をもたらす。発現ベクター：クローニングベクターと類似のベクターであるが、クローニングされた遺伝子の発現を宿主中に形質転換した後に促進しうるベクター。クローニングされた遺伝子は、通常、プロモーター配列などのある種の制御配列の制御下に置かれる（すなわち、機能的に連結している）。プロモーター配列は、構成的または誘導的であってよい。組換え宿主：一般に、組換え宿主とは、発現ベクターまたはクローニングベクター上の所望のクローニング遺伝子を含む原核または真核微生物または細胞をいう。この術語はまた、染色体またはゲノム中に所望の遺伝子を含むように遺伝子操作した微生物をも包含する。組換えベクター：所望のクローニング遺伝子を含むクローニングベクターまたは発現ベクター。宿主：複製可能な発現ベクターまたはクローニングベクターの受容者である原核または真核微生物または細胞。本明細書において使用する「宿主」なる語はまた、染色体またはゲノム上に所望の遺伝子を含むように、よく知られた方法によって遺伝子操作されうる原核または真核微生物または細胞をも包含する。そのような宿主の例としては、マニアチス（Ｍaniatis）らのモレキュラー・クローニング：ア・ラボラトリー・マニュアル（Ｍolecular Ｃloning：ＡＬaboratory Ｍanua l）、コールドスプリングハーバーラボラトリー、コールドスプリングハーバー、ニューヨーク（１９８２）を参照。プロモーター：開始コドンに近接して位置する、遺伝子の５’領域として一般に記載されるＤＮＡ配列。隣接する遺伝子の転写はプロモーター領域で開始される。プロモーターが誘導性プロモーターである場合には、転写速度は誘導因子に応答して増加する。対照的に、プロモーターが構成的プロモーターである場合には、転写速度は誘導因子によって制御されない。遺伝子：ポリペプチドまたはタンパク質を発現するのに必要な情報を含有するＤＮＡ配列。構造遺伝子：メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）に転写され、ついで特定のポリペプチドに特徴的なアミノ酸の配列に翻訳されるＤＮＡ配列。発現：発現とは、ポリペプチドが構造遺伝子から製造されるプロセスである。このプロセスには、該遺伝子のｍＲＮＡへの転写、および該ｍＲＮＡのポリペプチドへの翻訳が含まれる。トランスフェクション：トランスフェクションとは、ＤＮＡによる宿主細胞の形質転換をいう。組換え宿主細胞は、トランスフェクションされたＤＮＡによってコードされるタンパク質を発現する。エピトープ：非免疫グロブリン抗原のうち抗体の可変領域が結合する部分。抗原決定基：１または２以上のエピトープを含むタンパク質またはペプチド。免疫原：１または２以上のエピトープの存在のために免疫応答を引き起こしうるタンパク質またはペプチド。発明の詳細な説明本発明は、カチオン性脂質−ポリヌクレオチド複合体（該ポリヌクレオチドは抗原決定基をコードする）を投与することによる、動物において免疫応答を引き起こさせる方法に関する。本発明はまた、カチオン性脂質−ポリヌクレオチド複合体（該ポリヌクレオチドは感染性疾患の病原体である微生物の抗原決定基をコードする）を投与することによる、動物における感染性疾患に対する能動免疫を生じさせる方法に関する。本発明はまた、ポリヌクレオチドが免疫原をコードするＤＮＡ配列を含む発現ベクターであり、該ＤＮＡ配列の転写がプロモーターの制御下にある、遺伝子免疫法に関する。本発明はまた、ポリヌクレオチドが免疫原をコードするＲＮＡ分子である遺伝子免疫法に関する。本発明はまた、上記遺伝子免疫法を使用し、免疫した動物からポリクローナル抗体を単離することを特徴とする、ポリクローナル抗体の製造方法に関する。本発明はまた、遺伝子免疫後のマウスからのＢリンパ球を用いたモノクローナル抗体の製造方法に関する。本発明はまた、遺伝子免疫を用いたエピトープのマッピング方法に関する。Ｉ．カチオン性脂質：従来より知られているいかなるカチオン性脂質も本発明の実施に用いることができる。たとえば、フェルグナーら（Ｐroc.Ｎatl.Ａcad.Ｓci.ＵＳＡ８４：７４１３〜７４１７（１９８７））；フェルグナーら（Ｆocus１１：２１〜２５（１９８９））；フェルグナー（「リポフェクチン^TM試薬を用いたカチオン性リポソーム媒体トランスフェクション」、Ｇene Ｔransfer and Ｅxpression Ｐroto cols Ｖｏｌ．７、マレイ編、ヒューマナ・プレス、ニュージャージー、８１〜８９頁（１９９１））；ＷＯ９１／１７４２４；ＷＯ９１／１６０２４；米国特許第４,８９７,３５５号；米国特許第４,９４６,７８７号；米国特許第５,０４９,３８６号；米国特許第５,２０８,０３６号；ベールら（Ｐroc.Ｎatl.Ａcad .Ｓci.ＵＳＡ８６：６９８２〜６９８６（１９８９）；ＥＰＯ公開０３９４１１１号）；ガオら（Ｂiochim.Ｂiophys.Ｒes.Ｃomm.１７９：２８０〜２８５（１９９１））；ゾウら（Ｂiochim.Ｂiophys.Ｒes.Ｃomm.１６５：８〜１４（１９９１））；およびゲベイチュ（Ｇebeychu）ら（継続中の米国特許出願第０７／９３７,５０８号；１９９２年８月２８日出願）（これらすべての文献を参照のため本明細書中に引用する）を参照。好ましいカチオン性脂質としては、Ｎ−［１−（２,３−ジオレオイルオキシ）プロピル］−Ｎ,Ｎ,Ｎ−トリメチルアンモニウムクロライド（ＤＯＴＭＡ）が挙げられる。ＤＯＴＭＡの構造は、下記の通りである。ＤＯＴＭＡは、単独またはジオレオイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）と１：１で組み合わせて標準法によりリポソームに調合することができる。ＤＯＴＭＡ：ＤＯＰＥ（１：１）調合物はリポフェクチン^TM （ＬＩＰＯＦＥＣＴＩＮ^TM）（ＧＩＢＣＯ／ＢＲＬ：ライフ・テクノロジーズ・インコーポレイテッド、ゲイサーバーグ、メリーランド州）の商品名で販売されている。他の好ましい市販のカチオン性脂質は１,２−ビス（オレオイルオキシ）−３ −３−（トリメチルアンモニア）プロパン（ＤＯＴＡＰ）であり、これはオレオイル残基がプロピルアミンにエーテル結合ではなくエステル結合で結合している点がＤＯＴＭＡと異なっている。関連する好ましいカチオン性脂質群は、トリメチルアンモニウム基のメチル基の一つがヒドロキシエチル基で置換されている点がＤＯＴＭＡおよびＤＯＴＡＰと異なっている。このタイプの化合物は、プロピルアミン核にステアロイルエステルが結合したホスホリパーゼＡのローゼンタールインヒビター（ローゼンタールら、上記文献）と類似している。ローゼンタールインヒビター（ＲＩ）のジオレオイル類似体は一般に、プロピルアミン核への脂肪酸残基の結合に応じてＤＯＲＩ−エーテルまたはＤＯＲＩ−エステルと略する。ヒドロキシ基は、たとえばカルボキシスペルミンへのエステル結合による官能化などのような、さらなる官能化のための部位として用いることができる。他のクラスの好ましいカチオン性脂質では、カルボキシスペルミンが２つのタイプの脂質に結合している。５−カルボキシルスペルミルグリシンジオクタデシルアミド（ＤＯＧＳ）の構造は下記の通りである。ジパルミトイルホスファチジルエタノールアミン５−カルボキシスペルミルアミド（ＤＤＰＥＳ）の構造は下記の通りである。ＤＯＧＳはトランスフェクタム^TM（ＴＲＡＮＳＦＥＣＴＡＭ^TM）（プロメガ、マジソン、ウイスコンシン州）の商品名で市販されている。他の好ましいカチオン性脂質は、ＤＯＰＥと組み合わせてリポソームに調合されているコレステロール誘導体（ＤＣ−Ｃｈｏｌ）である。この化合物の構造は下記の通りである。他の好ましいカチオン性脂質はリポポリリシンであり、これはポリリシンをＤＯＰＥに結合させることによって生成される。他の好ましいカチオン性脂質は、一般式：（式中、Ｒ₁およびＲ₂は、それぞれ、または両者とも、Ｃ_1〜23アルキルまたは −ＣＯ−Ｃ_1〜23アルキルまたはアルケニル、ｑは１〜６、Ｚ₁およびＺ₂は、それぞれ、または両者とも、Ｈまたは非分枝鎖アルキルＣ_1〜6 、Ｘ₁は−（ＣＨ₂）_nＢｒ、Ｃｌ、ＦまたはＩ，ｎ＝０〜６またはＸ₂は−（ＣＨ₂）_n−ＮＨ₂、ｎ＝０〜６またはＸ₃は−ＮＨ−（ＣＨ₂）_m−ＮＨ₂、ｍ＝２〜６またはＸ₄は−ＮＨ−（ＣＨ₂）₃−ＮＨ−（ＣＨ₂）₄−ＮＨ₂またはＸ₅は−ＮＨ−（ＣＨ₂）₃−ＮＨ−（ＣＨ₂）₄−ＮＨ−（ＣＨ₂）₃−ＮＨ₂または（式中、ｐは２〜５、ＹはＨ、またはアミドもしくはアルキルアミノ基により結合した他の基）またはＸ₉はポリアミン、たとえば、ポリリシン、ポリアルギニン、ポリブレン、ヒストンまたはプロタミン、またはＸ₁₀はリポーター分子、たとえば、−ＮＨＣＯ−フルオレセイン、ビオチン、葉酸またはＰＰＤ、またはＸ₁₁は多糖または置換多糖、またはＸ₁₂はタンパク質、またはＸ₁₃は抗体、またはＸ₁₄はアミンまたはハライド反応性基、またはＸ₁₅は−（ＣＨ₂）_r−ＳＨ（式中、ｒは０〜６），またはＸ₁₆は−（ＣＨ₂）−Ｓ−Ｓ−（ＣＨ₂）_t−ＮＨ₂（式中、ｓは０〜６、ｔは２〜６））。これら化合物は、単独または他の脂質凝集体形成成分（ＤＯＰＥまたはコレステロールなど）と組み合わせてリポソームまたは他の脂質凝集体に調合するのに有用である。そのような凝集体はカチオン性であり、ＤＮＡやＲＮＡなどのアニオン性巨大分子と複合体を形成することができる。 II．発現ベクター遺伝子免疫のために用いることのできるポリヌクレオチドの一つの形態は、真核細胞中で免疫原タンパク質を発現させるためのプラスミド発現ベクターである。真核発現ベクターは４つの主要な成分を含む。第一に、プラスミドは細菌複製起点および抗生物質耐性マーカーをコードする原核細胞配列を含んでいなければならない。これら原核細胞配列は、細菌宿主内でのプラスミドの増殖および選択を可能にする。第二に、プラスミドは転写の開始を制御する真核細胞要素を含んでいなければならない。これら要素にはプロモーターおよびおそらくエンハンサー配列が含まれる。第三に、プラスミドはポリアデニル化配列などの転写物のプロセシングに関与する配列を含んでいなければならない。第四に、プラスミドは免疫原をコードするＤＮＡ配列を含んでいなければならない。これらＤＮＡは、ゲノムＤＮＡ配列であるか、または相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）配列のいずれかであってよい（発現ベクターの概説としては、オールドらの上記文献；サンブルックら、モレキュラー・クローニング：ア・ラボラトリー・マニュアル、第２版、コールドスプリングハーバーラボラトリープレス、１９８９；ゴーマン（Ｇorma n）、「哺乳動物細胞中への高効率遺伝子導入（Ｈigh Ｅfficiency Ｇene Ｔran sfer into Ｍammalian Ｃells）」、ＤＮＡＣloning、ＶolumeII、グロバー（Ｇlover,Ｄ.Ｍ.）編、ＩＲＬプレス、ワシントンＤＣ、１４３〜１９０頁（１９８５））。免疫原をコードするＤＮＡまたはｃＤＮＡ分子は発現ベクター中に機能的に連結させることができる。２つのＤＮＡ配列（プロモーター領域配列と免疫原コード配列など）の間の連結の性質が、（１）フレームシフト変異の導入をもたらさないか、（２）免疫原コード遺伝子配列の転写を指令するプロモーター領域配列の能力を妨げないか、または（３）免疫原遺伝子配列がプロモーター領域配列によって転写される能力を妨げない場合に、これら２つのＤＮＡ配列は機能的に連結しているということができる。免疫原分子をコードするＤＮＡ配列は、通常の技術（ライゲーションのための平滑末端化または粘着末端化した末端、適当な末端を提供するための制限消化、所望の場合の粘着末端の充填、望ましくない結合を回避するためのアルカリホスファターゼ処理、および適当なリガーゼによるライゲーションを含む）に従ってベクターＤＮＡと組み換えることができる。宿主の性質に応じて広範囲の種々の転写および翻訳制御配列を用いることができる。哺乳動物宿主に対しては、転写および翻訳制御シグナルは、ウイルス源、たとえばアデノウイルス、ウシパピローマウイルス、シミアンウイルスなどに由来するものであってよく、その際、制御シグナルは高発現レベルを有する特定の遺伝子を伴う。加えて、アクチン、コラーゲン、ミオシンなどの哺乳動物発現生成物からのプロモーターを用いることができる。別法として原核細胞プロモーター（バクテリオファージＴ３ＲＮＡポリメラーゼプロモーターなど）を用いることができ、その際、原核細胞プロモーターは真核細胞プロモーターによって制御される（たとえば、ゾウら、Ｍol.Ｃell.Ｂiol.１０：４５２９〜４５３７（１９９０）；カウフマン（Ｋaufman）ら、Ｎucl．Ａcids Ｒes.１９：４４８５〜４４９０（１９９１）参照）。遺伝子の発現を調節することができるように、抑制または活性化を可能とする転写開始制御シグナルを選択することができる。動物中で所望の免疫原分子を発現させるためには、真核細胞制御領域を用いる必要がある。そのような領域には、一般に、ＲＮＡ合成の開始を指令するに充分なプロモーター領域が含まれるであろう。好ましい真核細胞プロモーターとしては、マウスメタロチオネインＩ遺伝子のプロモーター（ハマー（Ｈamer）ら、Ｊ .Ｍol.Ａppl.Ｇen.１：２７３〜２８８（１９８２））；ヘルペスウイルスのＴＫプロモーター（マックナイト（ＭcＫnight,Ｓ.）、Ｃell３１：３５５〜３６５（１９８２））；ＳＶ４０初期プロモーター（ベノイスト（Ｂenoist）ら、Ｎ ature（ロンドン）２９０：３０４〜３１０（１９８１））；ラウス肉腫ウイルスプロモーター（ゴーマンら、上記文献）；およびサイトメガロウイルスプロモーター（フェッキング（Ｆoecking）ら、Ｇene４５：１０１（１９８０））が挙げられる。広く知られているように、真核細胞のｍＲＮＡの翻訳は最初のメチオニンをコードするコドンから開始される。この理由から、真核細胞プロモーターと所望の免疫原分子をコードするＤＮＡ配列との間の連結部はいかなる介在配列（メチオニン（すなわち、ＡＵＧ）をコードしうる）も含まないのが好ましい。そのようなコドンが存在すると、融合タンパク質が生成されるか（もしも該ＡＵＧコドンが所望のレセプター分子をコードするＤＮＡ配列と同じ読み取り枠にあるなら）、またはフレームシフト変異（もしも該ＡＵＧコドンが所望のレセプター分子をコードする配列と同じ読み取り枠にないなら）のいずれかをきたす。所望の免疫原分子をコードする配列および機能的に連結したプロモーターは、非複製性のＤＮＡ（またはＲＮＡ）分子としてワクチンの細胞中に導入されてよく、該分子は線状分子であるか、または一層好ましくは閉じた共有環状分子のいずれかであってよい。そのような分子は自律複製することができないので、所望のレセプター分子の発現は導入配列の一過性の発現によって起こる。別法として、導入配列を宿主染色体中に組み込むことによって永久的な発現とすることができる。導入配列は、受容細胞中で自律複製しうるプラスミドベクターまたはウイルスベクター中に組み込むのが好ましい。この目的のために幾つかの可能なベクター系が利用できる。かかるベクターの１クラスは、ウシパピローマウイルス、ポリオーマウイルス、アデノウイルスまたはＳＶ４０ウイルスなどの動物ウイルス由来の、自律複製しうる染色体外プラスミドを提供するＤＮＡ要素を利用する。第二のクラスのベクターは、所望の遺伝子配列の宿主染色体中への組み込みに基づく。ｍＲＮＡの最適合成のためには別の要素も必要となるかもしれない。これら要素には、スプライスシグナル、並びに転写プロモーター、エンハンサー、および終止シグナルが含まれる。これら要素を組み込んだｃＤＮＡ発現ベクターには、オカヤマ（Ｏkayama）ら（Ｍol.Ｃell.Ｂiol.３：２８０（１９８３））その他に記載されているものが含まれる。別法として、ポリヌクレオチド分子は所望の免疫原をコードするＲＮＡ分子であってもよい。そのようなＲＮＡ分子は、インビトロ転写の後にＲＮＡ精製を行うことによって充分な量で得ることができる。ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼを用いてクローニングＤＮＡ配列を転写する技術は当該技術分野でよく知られている（たとえば、サンブルックらの上記文献参照）。本発明ではあらゆる免疫原コード配列を用いることができる。たとえば、そのような免疫原としては、単純ヘルペスウイルス糖タンパク質Ｄ、Ｂ型肝炎表面抗原、インフルエンザウイルス赤血球凝集素、およびヒト免疫不全ウイルスエンベロープ抗原が挙げられる。加えて本発明はまた、以下に記載するように、同定されていないポリヌクレオチド配列のタンパク質産物を特徴付けるのにも用いることができる。 III．脂質／ポリヌクレオチド複合体の使用本発明によれば、脂質／ポリヌクレオチド複合体を用いてインビボトランスフェクションを行う。トランスフェクションした細胞は該ポリヌクレオチドによってコードされるタンパク質を発現し、細胞表面上に該外来タンパク質を呈示する。その結果、宿主動物は該外来タンパク質、すなわち免疫原に対する免疫応答が増大する。それゆえ、脂質／ポリヌクレオチド複合体は能動免疫を誘発するためのワクチンとして用いることができる。そのような能動免疫はヒトにおいて誘発するのが好ましいが、本発明はそのように限定されるものではない。本発明のワクチンの有利な効果を受ける動物はすべて本発明に従って処置しうる動物の範囲に包含される。遺伝子免疫は、カチオン性脂質およびポリヌクレオチドを広範囲の投与量および広範囲の比率にて投与することによって行うことができる。有効投与量および調合形態は種々の因子（ワクチンの被接種体の種など）に依存するであろうが、当業者によって決定することができる。投与量、調合形態および投与方法の例については以下に記載する。カチオン性脂質−ポリヌクレオチド複合体の調製は、カチオン性脂質溶液を等容量のポリヌクレオチド溶液と混合することによって行う。カチオン性脂質およびポリヌクレオチドは、滅菌した生理学的に許容しうる水性担体中に溶解することができる。カチオン性脂質およびポリヌクレオチドは滅菌食塩水（１５０ｍＭＮａＣｌ）中に溶解するのが好ましい。これら溶液を周囲温度にて混合する。これら溶液は２５℃にて混合するのが好ましい。混合後、カチオン性脂質−ポリヌクレオチド複合体を室温にて好ましくは１５〜４５分間インキュベートする。本発明の脂質／ポリヌクレオチド複合体の投与は、非経口、静脈内、筋肉内、皮下、鼻内、または他の適当な手段により行うことができる。投与する特定の投与量は、年齢、体重、もしあれば現在行っている治療の種類、および発現されるであろう免疫原の性質に依存する。免疫原応答を促進させるため、最初の投与から約４週間後にブースター投与を行うことができる。遺伝子免疫はまたワクチンの受容者において免疫原特異的な抗体の産生を生じさせるので、本発明はまた免疫原特異的な抗体の産生方法にも関する。当該技術分野でよく知られた手順を用い、ワクチンを施した動物からポリクローナル抗体を単離および精製することができる（たとえば、ハーロウ（Ｈarlow）ら、アンチボディーズ：ア・ラボラトリー・マニュアル（Ａntibodies：ＡＬaboratory Ｍannual）、コールドスプリングハーバーラボラトリープレス（１９８８）を参照）。本発明はまた、モノクローナル抗体を産生させるための遺伝子免疫の使用にも関する。この方法によれば、マウスにカチオン性脂質／ポリヌクレオチド複合体を注射し、該免疫マウスからＢリンパ球を単離する。モノクローナル抗体は、ケ６：４９５〜４９７（１９７５））に従って産生させる（たとえば、ハーロウらの上記文献参照）。簡単に説明すると、マウスをカチオン性脂質−ポリヌクレオチド複合体で免疫し、血清試料を採取することによって抗体産生の存在を確認し、脾臓を取り出してＢリンパ球を得、該Ｂリンパ球をミエローマ細胞と融合させてハイブリドーマを得、該ハイブリドーマをクローニングし、抗免疫原抗体を産生する陽性クローンを選択し、該抗免疫原抗体産生クローンを培養し、該ハイブリドーマ培養液から抗免疫原抗体を単離ことによってモノクローナル抗体を産生させることができる。既知の免疫原に対するモノクローナル抗体を産生させる代わりに、遺伝子免疫はエピトープマッピングによってタンパク質中の抗原決定基を同定するのに用いることができる。この方法によれば、該脂質／ポリヌクレオチド複合体中のポリヌクレオチドはタンパク質分子の一部をコードする。完全なタンパク質分子をコードするＤＮＡのランダム断片を超音波処理（デイニンガー（Ｄeininger）ら、Ａnal.Ｂiochem.１２９：２１６〜２２３（１９８３））または部分ＤＮＡアーゼＩ消化（アンダーソン（Ａnderson）ら、Ｎucleic Ａcids Ｒes.９：３０１５〜３０２７（１９８１））によって生成させ、ついで発現ベクターの適当な部位に平滑末端ライゲーションによってクローニングするのが好ましい。別法として、エピトープマッピングのためのＤＮＡ断片はまた、１または２以上の制限エンドヌクレアーゼで処理するか、または複製連鎖反応でＤＮＡ分子を合成することによって得ることができる。免疫したマウスからの細胞によるモノクローナル抗体の生成は、該タンパク質分子のどの部分が免疫原であるかを示すであろう。加えて、本発明は、同定されていないＤＮＡまたはＲＮＡ配列によってコードされるタンパク質産物を特徴付けるのにも用いることができる。たとえば、コスミドベクター中でゲノムライブラリーを構築することができ、その際、クローニングされたＤＮＡ断片の発現はプロモーターによって制御される。ついで、サブクローニングしたゲノム断片のタンパク質産物の免疫学的特徴付けを遺伝子免疫法を用いて行うことができる。上記で記載したように、裸のＤＮＡを投与する遺伝子免疫プロトコールでは接種当たり１００μｇのＤＮＡ構築物が必要である。対照的に、本発明に従ってカチオン性脂質をＤＮＡ担体として用いると、わずか５μｇのＤＮＡ構築物で遺伝子免疫を行うことが可能となる。それゆえ、本発明は遺伝子免疫の一層効率的な手段を提供するものである。以上、本発明を一般的に記載したが、本発明は下記実施例を参照することによって一層容易に理解されるであろう。これら実施例は例示のために掲げたものであり、特に断らない限り本発明を限定するものではない。実施例１免疫プロトコールの評価この一連の実験ではｐＳＶ２ＣＡＴプラスミドを用いるが、該プラスミドはシミアンウイルス４０プロモーターの制御下に細菌性クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）遺伝子を有する（ゴーマン（ＳＶ；Ｇorman）、「哺乳動物細胞中への高効率遺伝子導入」、ＤＮＡＣloning、ＶolumeII、グロバー編、ＩＲＬプレス、ワシントンＤＣ、１４３〜１９０頁（１９８５））。プラスミドＤＮＡをアルカリ溶解法によって細菌細胞から単離し、セシウムクロライド／エチジウムブロマイド勾配中での等密度遠心分離によって精製する（マニアチスら、上記文献）。これら実験ではカチオン性脂質としてリポフェクタミン^TM（ＬＩＰＦＥＣＴＡＭＩＮＥ^TM）（ＢＲＬ）を用いた。リポフェクタミン^TM は２,３−ジオレイルオキシ−Ｎ−［２（スペルミンカルボキサミド）エチル］ −Ｎ,Ｎ−ジメチル−１−プロパンアンモニウムトリフルオロアセテート（ＤＯＳＰＡ）からなり、これをジオレオイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）と水中で３：１（Ｗ：Ｗ）の比率で調合する。これらカチオン性脂質およびプラスミドを滅菌食塩水（１５０ｍＭＮａＣｌ）中に溶解した。脂質／ＤＮＡ複合体をマウスに腹腔内（ＩＰ）または鼻内（ＩＮ）投与した。ＩＮ投与用には、２５μｌのＤＮＡ溶液を２５μｌの脂質溶液と混合することによって脂質／ＤＮＡ混合物を調製した。ＩＰ投与用には、２００μｌのＤＮＡ溶液を２００μｌの脂質溶液と混合することによって脂質／ＤＮＡ混合物を調製した。これら実験において、５μｇのｐＳＶ２ＣＡＴを０μｇ、１５μｇ、３０μ ｇ、４５μｇ、または６０μｇの脂質と混合した。混合後、投与前に脂質／ＤＮＡ複合体を室温にて１５〜４５分間静置した。コントロールとして、幾匹かのマウスに完全フロイントアジュバント中のＣＡＴタンパク質（２５μｇ）を皮下（ＳＣ）注射した。マウス血清試料中のＣＡＴ抗体の存在を決定するため、ＣＡＴ酵素結合イムノアッセイ（ＥＬＩＳＡ）を用いた。マイクロウエルタイタープレートの各ウエルを０.１Ｍ炭酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ９.５）中の１μｇ／ｍｌのＣＡＴとともにインキュベートすることによって該プレートを調製した。これらプレートを４ ℃にて１８時間インキュベートした。０.１％トゥイーン２０を含有するリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）（希釈緩衝液）中に溶解した０.２％卵アルブミンでウエルをブロックした。試料を希釈緩衝液中に希釈し、その２００μｌをプレート上のウエルに加えた。プレートを密封し、ついで３７℃で６０分間インキュベートした。洗浄後、プレートを０.１μｇ／ｍｌのヤギ抗マウスＩｇＧ−西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）コンジュゲートとともにインキュベートした。プレートを密封し、ついで３７℃で３０分間インキュベートした。２回目の洗浄を行った後、プレートを３,３',５,５'−テトラメチルベンジジン基質で室温にて発色させた。２Ｎ硫酸を加えて反応を停止させた。完全フロイントアジュバント中のＣＡＴタンパク質を投与することによって得られる応答ほど大きくはなかったが、脂質／ＣＡＴタンパク質で免疫したマウスは免疫応答を発色した。脂質／ｐＳＶ２ＣＡＴをＩＰ注射した何匹かのマウスは、弱いがバックグラウンドを明らかに上回る免疫応答を生じた。鼻内投与による免疫で得られた結果はマウスによって変化したが、応答はＩＰ投与で得られたものよりも大きかった。実施例２ＤＮＡ複合体形成剤としてのカチオン性脂質の比較これらの実験では下記カチオン性脂質を比較した：リポフェクタミン^TM、リポフェクテース^TM（ＬＩＰＯＦＥＣＴＡＣＥ^TM）（ＢＲＬ）、ＤＯＲＩ−エーテル（バイカル（ＶＩＣＡＬ,Ｉnc.）、サンジエゴ、カリフォルニア州）、ＤＯＲＩ −エーテル／リゾ脂質（バイカル、サンジエゴ、カリフォルニア州）、およびブロモ脂質（１−プロパンアンモニウム,Ｎ−［２（２−ブロモ）エチル］−Ｎ,Ｎ −ジメチル−２,３−ビス（９−オクタデセニルオキシ）ブロマイド）。リポフェクテース^TMは、ジメチルジオクタデシルアンモニウムブロマイド（ＤＤＡＢ）およびジオレオイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）の１：２.５（Ｗ／Ｗ）リポソーム調合物である。このブロモ脂質は、継続中の米国特許出願第０７／９３７,５０８号（１９９２年８月２８日出願）（参照のために本明細書中に引用する）の記載に従って調製した。免疫は、５μｇ、１０μｇ、２０μｇ、４０μｇまたは８０μｇのｐＳＶ２ＣＡＴをカチオン性脂質と１：４の比（Ｗ／Ｗ；ｐＳＶ２ＣＡＴ／カチオン性脂質）で複合体を形成させてＩＰ投与することによって行った。１匹のマウスにはｐＳＶ２ＣＡＴのみを与え、１匹のマウスにはＣＡＴタンパク質のみを与え、さらに１匹のマウスには完全フロイントアジュバント中のＣＡＴタンパク質のみを与えた。約１４日の時点で選択したマウスにブースター投与を行った。得られた結果をウエスタンブロット分析により分析した。精製ＣＡＴタンパク質をニトロセルロースに適用することにより（０.１μｇＣＡＴタンパク質／ｃｍニトロセルロース）ニトロセルロースシートを調製した。血清試料を希釈緩衝液中に希釈し、その２ｍｌを各ニトロセルロースストリップに加えた。これらストリップを室温にて振動させながら９０分間インキュベートした。洗浄後、ストリップを０.１μｇ／ｍｌのヤギ抗マウスＩｇＧ−アルカリホスファターゼコンジュゲートとともにインキュベートした。ついで、ストリップを室温にて３０分間インキュベートした。１ｍｌのニトロブル−テトラゾリウム／５−ブロモ−４ −クロロ−３−インドリルホスフェートの安定な混合基質でストリップを発色させた。発色後にストリップを蒸留水で洗浄し、乾燥させた。これら結果は、ＤＮＡおよび脂質で免疫したマウスが抗ＣＡＴ抗体を産生することを示していた。ブースター投与は応答を大きく促進するとは思えなかった。ウエスタンブロット分析は、ＥＬＩＳＡの結果が免疫応答の強度が異なることを示しはしたが、脂質−ＤＮＡ複合体を注射したすべての動物で抗ＩｇＧが産生されたことを示した。実施例３免疫応答に対する異なるプロモーターの効果これら実験ではカチオン性脂質としてブロモ脂質（実施例２に記載のもの）またはリポフェクテースTMを用いた。ＣＡＴプラスミドには、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター（フェッキングら、Ｇene４５：１０１（１９８０））、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）プロモーター（ゴーマン、「哺乳動物細胞中への高効率遺伝子導入」、ＤＮＡＣloning、ＶolumeII、グロバー編、ＩＲＬプレス、ワシントンＤＣ、１４３〜１９０頁（１９８５））、またはＳＶ４０プロモーター（上記）のいずれかが含まれていた。マウスを下記プロトコールに従って上記のようにＩＰ免疫した。１セット（すなわち、２匹のマウス）を用いて各プロモーターを試験した。コントロールとして、マウスに脂質なしでＤＮＡのみを与えるか、完全フロイントアジュバント中のＣＡＴタンパク質を与えるか、または接種をしなかった。ＥＬＩＳＡ分析の結果によると、ＳＶ４０プロモーターが最良で、ついでＣＭＶプロモーター、ついでＲＳＶプロモーターの順であった。ブロモ脂質ではリポフェクテース^TMに比べて免疫応答の生成において一層一定した結果が得られた。ＥＬＩＳＡで観察された陽性結果をウエスタンブロット分析により確認した。両アッセイ形態とも、ＤＮＡ−脂質免疫で得られた結果はＤＮＡ単独で観察された結果よりも良好であった。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号庁内整理番号ＦＩＡ６１Ｋ 48/00 8615−4ＣＣ０７Ｈ 21/04 Ｂ // Ｃ０７Ｈ 21/04 8517−4ＨＣ０７Ｋ 16/44 Ｃ０７Ｋ 16/44 9358−4ＢＣ１２Ｐ 21/08 Ｃ１２Ｐ 21/08 8310−2ＪＧ０１Ｎ 33/53 ＳＧ０１Ｎ 33/53 9455−4ＣＡ６１Ｋ 37/22 ＡＢＤ (72)発明者ハール，ウイリアム・ジーアメリカ合衆国21044メリーランド、コロンビア、シーダー・レイン5728番

Claims

【特許請求の範囲】１．（ａ）少なくとも１種のカチオン性脂質を抗原決定基をコードするポリヌクレオチドと混合してカチオン性脂質−ポリヌクレオチド複合体を形成させ、ついで（ｂ）該脂質−ポリヌクレオチド複合体を動物に投与することを特徴とする、動物において免疫応答を引き起こさせる方法。２．該カチオン性脂質がリポフェクタミン^TMである請求項１に記載の方法。３．該カチオン性脂質がリポフェクテース^TMである請求項１に記載の方法。４．該カチオン性脂質が１−プロパンアンモニウム,Ｎ−［２（２−ブロモ）エチル］−Ｎ,Ｎ−ジメチル−２,３−ビス（９−オクタデセニルオキシ）ブロマイドである請求項１に記載の方法。５．該カチオン性脂質がＤＯＲＩ−エーテルである請求項１に記載の方法。６．該カチオン性脂質がＤＯＲＩ−エーテルリゾ脂質である請求項１に記載の方法。７．該ポリヌクレオチドがＲＮＡ分子であり、該ＲＮＡ分子が免疫原をコードする請求項１に記載の方法。８．該ポリヌクレオチドが、（ａ）プロモーター、および（ｂ）免疫原をコードするＤＮＡ配列、その際、該ＤＮＡ配列の転写は該プロモーターの制御下にある、を含む組換えＤＮＡ分子である請求項１に記載の方法。９．該ポリヌクレオチドが、（ａ）プロモーター、および（ｂ）免疫原をコードするＲＮＡ配列、その際、該ＲＮＡ配列の発現は該プロモーターの制御下にある、を含む組換えＲＮＡ分子である請求項１に記載の方法。１０．該組換えＤＮＡ分子が発現ベクターである請求項８に記載の方法。１１．該プロモーターがＳＶ４０プロモーターである請求項１０に記載の方法。１２．該プロモーターがＲＳＶプロモーターである請求項１０に記載の方法。１３．該プロモーターがＣＭＶプロモーターである請求項１０に記載の方法。１４．（ａ）少なくとも１種のカチオン性脂質を免疫原をコードするポリヌクレオチドと混合してカチオン性脂質−ポリヌクレオチド複合体を形成させ、（ｂ）該脂質−ポリヌクレオチド複合体を動物に投与し、ついで（ｃ）該動物からポリクローナル抗体を単離することを特徴とする、動物において免疫原に対するポリクローナル抗体を製造する方法。１５．（ａ）少なくとも１種のカチオン性脂質を、免疫原をコードするＤＮＡ配列を含むポリヌクレオチドと混合して脂質−ポリヌクレオチド複合体を形成させ、（ｂ）該脂質−ポリヌクレオチド複合体を少なくとも１のマウスに投与し、（ｃ）該免疫したマウスからＢリンパ球を取り出し、（ｄ）該免疫したマウスからのＢリンパ球をミエローマ細胞と融合させてハイブリドーマを生成させ、（ｅ）該ハイブリドーマをクローニングし、（ｆ）抗免疫原抗体を産生する陽性クローンを選択し、（ｇ）該抗免疫原抗体を産生するクローンを培養し、ついで（ｈ）抗免疫原抗体を培養液から単離することを特徴とする、モノクローナル抗体の製造方法。１６．タンパク質分子のエピトープをマッピングする方法であって、（ａ）該タンパク質分子をコードするＤＮＡ分子をランダムに断片化し、（ｂ）これらＤＮＡ断片を発現ベクター中にサブクローニングし、（ｃ）少なくとも一つのカチオン性脂質を各発現ベクターサブクローンと混合して各発現ベクターサブクローンとのカチオン性脂質−発現ベクター複合体を生成させ、（ｄ）該カチオン性脂質−発現ベクター複合体をマウスに投与し、ついで（ｅ）どのＤＮＡ断片がマウスにおいて抗体を産生させることができるかを決定することを特徴とする方法。１７．（ａ）少なくとも１種のカチオン性脂質を、感染性疾患の病原体である微生物の抗原決定基をコードするポリヌクレオチドと混合してカチオン性脂質− ポリヌクレオチド複合体を形成させ、ついで（ｂ）該脂質−ポリヌクレオチド複合体を動物に投与して該感染性疾患に対する能動免疫を生じさせることを特徴とする、動物における感染性疾患に対する能動免疫を生じさせる方法。