JPH11504215A - 免疫原性の高められた修飾ポリペプチド - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本発明は、グリコシル−ホスファチジルイノシトール構造を含む、高められた免疫原性を示す組換えポリペプチドに関する。該ポリペプチドは、たとえば、寄生体ポリペプチドなどの抗原、とりわけ、サーカムスポロゾイトタンパク質（ＣＳＰ）などのプラスモジウム・ファルシパルムポリペプチドである。本発明はさらに、該ポリペプチドを発現させるための組換えＤＮＡベクター、該ポリペプチドの１またはそれ以上のエピトープに対して向けられた免疫応答を誘発する方法、および該ポリペプチドを含む修飾ポリペプチドワクチンの製造方法に関する。

Description

【発明の詳細な説明】 免疫原性の高められた修飾ポリペプチド 本発明は、高められた免疫原性を示す修飾ポリペプチド、とりわけ脂質構造に より修飾されたポリペプチドに関する。とりわけ、本発明は脂質構造により修飾 された寄生体ポリペプチド、さらに詳しくは、かかる脂質構造により修飾された プラスモジウム・ファルシパルム（Ｐlasmodium falciparum）のサーカムスポロ ゾイト（circumsporozoite）タンパク質に関する。本発明はさらに、該修飾ポリ ペプチドに対する免疫応答を誘発する方法、該ポリペプチドを製造するための方 法、ベクターおよび宿主、および該ポリペプチドを含むワクチンに関する。 免疫系は複雑であり、完全には理解されていない。外来免疫原が宿主免疫系に より認識される仕方は部分的にしか解明されていない。外来タンパク質に暴露さ れた哺乳動物の免疫応答は非常に様々である。それゆえ、免疫原性の増大したポ リペプチドの調製方法は極めて関心が高く、さもなければ免疫原性の弱いエピト ープ部位を克服するものである。 組換えタンパク質を用いたワクチン接種を改善する一つの方法は、１または複 数の感染性因子由来の１を越えるタンパク質から複数のエピトープ部位を製造す ることであった。このアプローチは、より安価で多価でより効率的なワクチンを 得ることを可能とし、より簡単でより安全な免疫療法（regimens）へと導く。し かしながら、そのようなアプローチは各ポリペプチドが充分な量で産生されるこ とを意味しており、最適な量を確実にするために免疫に用いる各ポリペプチドの 特別の精製プロトコールが必要となる。特定のエピトープに対する強い免疫応答 は誘発されるが、ある種のインビボ状況下で観察されるように免疫原は非常に少 量であるかまたは他のポリペプチドの混合物中に存在するようなアプローチを見 出すことは、意欲をかきたてることである。 プラスモジウム・ファルシパルムは最もしばしばマラリアを引き起こす病因で あるが、昆虫およびヒト宿主中において種々の形態で見出されている。不活化し た寄生体の形態を哺乳動物でワクチンとして使用することは、有望な結果を示し ている。しかしながら、主たる限界は、スポロゾイトを培養することができず、 蚊の唾液腺から単離しなければならないという事実にあり、保護を得るための不 活化寄生体の使用が制限されている。 この問題を回避するために、種々のプラスモジウム形態の特定のタンパク質を コードしている遺伝子を異種組換え系で発現させ、潜在的な宿主保護抗原として 使用されているが、その成功は限られている。別のやり方として、該抗原の定め られた領域に対応するペプチドを保護試験に用いられているが、そのような免疫 の限界が示されている。サーカムスポロゾイトタンパク質（ＣＳＰ）は、昆虫が 噛んで移した後に生物中に認められるプラスモジウム・ファルシパルムスポロゾ イトの表面に存在する抗原の一つである。このタンパク質は、プロセシング後に 除去されるアミノ末端のシグナル配列、種々のプラスモジウム種の間での保存配 列を含む領域Ｉおよび領域IIと称する領域によって両側でフランキングされた中 央の大きな繰り返しドメイン、および疎水性の末端カルボキシドメインからなる ポリペプチド前駆体として合成される。アミノ酸クラスター、アスパラギン−ア ラニン−アスパラギン−プロリンのタンデムリピート（（ＡＳＮ−ＡＬＡ−ＡＳ Ｎ−ＰＲＯ）_n）からなる繰り返しドメインＮＡＮＰは、プラスモジウム・ファ ルシパルムＣＳＰの有効なＢ細胞エピトープであることが示されている。かかる 繰り返し配列を含む合成ペプチドが保護試験においてサブユニットワクチンとし て用いられているが、その成功は限られている。ＣＳＰタンパク質上のＴ細胞応 答配列は該繰り返しセグメントの外側にマッピングされている。これまでになさ れているいかなる実験も、多量の精製抗原を用いて免疫実験が行われている。 本発明の目的は、修飾タンパク質（プラスモジウム・ファルシパルムタンパク 質など）を提供することにあり、該修飾タンパク質はたとえ寄生体抗原が精製さ れていなくとも強い免疫応答を引き起こすことができる。このアプローチは、よ り安価だが有効な免疫療法を可能とする全細胞ワクチンを将来開発するうえで興 味深い。 本発明によれば、グリコシルホスファチジルイノシトール（ＧＰＩ）アンカー を抗原に付加することにより、該アンカーを用いない対応抗原に比べて一層高い 免疫応答が引き起こされることが今やわかった。 それゆえ、本発明は、アンカーを用いない対応ポリペプチドに比べて増大した 免疫応答を引き起こすためのグリコシル−ホスファチジルイノシトール構造を含 む、高められた免疫原性を示す組換えポリペプチドを提供する。このポリペプチ ドは、抗原、好ましくは寄生体抗原、たとえばプラスモジウム・ファルシパルム サーカムスポロゾイトタンパク質（ＣＳＰ）またはその修飾形などのプラスモジ ウム・ファルシパルム抗原であってよい。 本明細書および請求の範囲において、「またはその修飾形」なる表現は、免疫 応答を誘発するに充分な免疫原性を示すサーカムスポロゾイトタンパク質のあら ゆる誘導体を包含する。それゆえ、完全なタンパク質のみならず、そのフラグメ ントまたは変異態様も包含される。 本発明をプラスモジウム・ファルシパルムのＣＳＰタンパク質を参照しながら 説明する。しかしながら、本発明は、この特定の抗原に限られるものではない。 当業者であれば、ＣＳＰを他の所望の抗原と置き換えることによって不当な実験 を行うことなく本発明の利点を得ることは造作もないことであろう。本発明は、 ＧＰＩ−アンカーをいかなるポリペプチドに付加しても該ポリペプチドの免疫原 性が高められるという考察に基づくものである。 ＣＳＰの発現は、異種組換え系（大腸菌、酵母、ワクシニアウイルス、バキュ ロウイルス、サルモネラ、ジクチオステリウム・ジスコイデウム（Ｄictyosteli um discoideum））で得られている。粘菌の種、ジクチオステリウムを組換えタ ンパク質の産生のための有効な真核発現系として用いることができることがわか った。さらに、他の発現系に比べ、完全で安定なＣＳＰポリペプチドをジクチオ ステリウム中で産生することができる（ファセル（Ｆasel,Ｎ.）、ベクダディー ライス（Ｂegdadi−Ｒais,Ｃ.）、バーナード（Ｂernard,Ｍ.）、ブロン（Ｂron ,Ｃ.）、コラディン（Ｃorradin,Ｇ.）、およびレイモンド（Ｒeymond,Ｃ.Ｄ.） 、（１９９２）Ｇene １１１、１５７−１６３）。それゆえ、この系では一層強 力で一層長期にわたる免疫保護を得ることができる。なぜなら、完全なＣＳＰは Ｂ−細胞およびＴ−細胞の各エピトープを有するからである。 さらに、ジクチオステリウムはバイオテクノロジーにおける可能性を有する。 ジクチオステリウムは固定せずに生活する生物であり、容易に増殖および維持さ れる。この株は、細菌ローン（bacterial Iawns）上では約３時間の倍増時間で 、細菌浮遊液中では高密度に（１リットル当たり１０¹⁰細胞まで）、またはグル コース、ペプトンおよび酵母エキスを含有する半合成培地中では倍増時間が約１ ２時間で増殖する。 ジクチオステリウムの生活環は、増殖期（growth phase）および発育期（deve lopmental phase）からなる。発育期は飢餓状態によって誘発され、以前は単一 の細胞であったものが凝集して多細胞生物を形成し、ついで該生物が分化して胞 子を形成することを特徴とする。細菌または富培地（rich medium）の存在下で は胞子は発芽して新たに増殖する。この発育サイクルの間に拡散性の因子が産生 され、該因子の少なくとも一つ（ｃＡＭＰ）について、その受容体への結合が一 連の特定遺伝子の転写を誘発する（ルーミス（Ｌoomis）、ジクチオステリウム ・ジスコイデウムの発育（Ｔhe Ｄevelopment of Ｄictyostelium discoideum） 、アカデミックプレス、１９８２）。ジクチオステリウム・ジスコイデウムの増 殖特性および形質転換能は外来タンパク質を発現する可能性を付与する。なぜな ら、細胞は細菌上で低コストで増殖でき、特定タンパク質の発現は簡単な培地中 での飢餓により厳密に制御されうるからである。最後に、ジクチオステリウム・ ジスコイデウムは、安全で非毒性で非病原性の固定して生活しない生物であり、 ヒトに対しては適用できなくとも少なくとも獣医学的用途のために全細胞ワクチ ンの開発の候補である。 それゆえ、ジクチオステリウム・ジスコイデウムは、該細胞を適当なベクター で形質転換し、該細胞を本発明の修飾ポリペプチドの発現を可能とする条件下で 培養し、ついで場合により該ポリペプチドを単離することによって、本発明の修 飾ポリペプチドを製造するために用いることができる。適当なベクターは該ポリ ペプチドをコードするＤＮＡ配列を含んでおり、該ＤＮＡ配列は該配列の下流に 位置する糖脂質アンカー付加配列、およびそれに作動可能に連結した適当な転写 開始配列および転写停止配列に作動可能に連結している。該ＤＮＡ配列は、寄生 体抗原、たとえばプラスモジウム・ファルシパルムサーカムスポロゾイトタンパ ク質（ＣＳＰ）またはその修飾態様などのプラスモジウム・ファルシパルム抗原 をコードするのが好ましい。 種々の生物における多くの細胞表面タンパク質がグリコシルホスファチジルイ ノシトール（ＧＰＩ）構造により膜の脂質二重層中に係留されている（anchored ）。この複合構造は前駆体糖脂質として合成され、小胞体中の糖タンパク質に移 される。この前以て形成されたＧＰＩアンカーの特定ポリペプチドへの移行は、 適当なシグナル配列（以下、「糖脂質アンカー付加配列」という）が標的タンパ ク質のＣ末端領域中に含まれている場合にのみ可能である。このシグナル配列は 、疎水性Ｃ末端配列の上流の一群の１０〜１２残基からなることが示されている 。ジクチオステリウムの場合は、特定のタンパク質がＧＰＩによって係留される ことが示されている。Ｃ末端配列の抗原決定基がこれらタンパク質の一つについ て定められている、すなわちコンタクト部位Ａ（Ｃontact site Ａ）（ノエゲル （Ｎoegel,Ａ.）、ゲリッシュ（Ｇerisch,Ｇ.）、スタッドラー（Ｓtadler,Ｊ. ）およびウェストファル（Ｗestphal,M.）（１９８６）ＥＭＢＯ Ｊ.５、１４７ ３−１４７６）。ポリペプチドに一旦移されたＧＰＩアンカーは特定のホスホリ パーゼ（ＧＰＩ−ホスホリパーゼＣまたはＤ）により開裂することができ、特定 の界面活性剤、ＴＸ−１１４中での異なる分配によって検出されるように該タン パク質の疎水性の性質の修飾となる。 それゆえ、本発明によれば、組換えＤＮＡベクターはジクチオステリウム・ジ スコイデウムコンタクト部位Ａ由来の糖脂質アンカー付加配列を含む。 本発明はさらに、ポリペプチドの１またはそれ以上のエピトープに向けられた 抗体の製造方法を提供するものであり、該方法は適当な（たとえば、哺乳動物） 宿主を本発明のポリペプチドで免疫し、その後、製造された抗体を任意に単離す ることを含む。別法として全血清を用いることができる。免疫のためのポリペプ チドは、該ポリペプチドを発現する宿主細胞の全細胞溶解液の形態を取るのが好 ましい。 本発明において、一例として、グリコシルホスファチジルイノシトール係留 ＣＳＰを発現するジクチオステリウムの全細胞溶解液を注射することにより、マ ウスにおいて免疫応答が引き起こされた。さらに、ＣＳＰエピトープがＧＰＩに 連結されている場合にのみ特異的な免疫応答が得られることから、免疫応答の強 化が示された。 さらに、本発明は、哺乳動物宿主の免疫のためのワクチンに関する。このワク チンは、適当な賦形剤とともに免疫保護量の本発明の修飾ポリペプチドを含む。 免疫保護量は、たとえば、該ポリペプチドおよび糖脂質アンカー付加配列をコー ドするベクターで形質転換した約１〜５×１０⁷、とりわけ２×１０⁷の宿主細胞 のポリペプチド含量を含む。 以下の実施例は本発明を説明するものであるが、本発明の範囲を制限すること を意図したものではない。実施例 １．導入 以下の実施例は、糖脂質アンカーの付加により修飾したプラスモジウム・ファ ルシパルムＣＳＰのジクチオステリウム・ジスコイデウムでの製造および免疫療 法におけるその使用を教示する。さらに詳細には、リーダーペプチドおよびジク チオステリウムコンタクト部位Ａ由来のグリコシル−ホスファチジルイノシトー ル（ＧＰＩ）付加シグナル配列を融合することにより、ＣＳＰポリペプチドを粘 菌ジクチオステリウム・ジスコイデウム中で発現させた。 このＧＰＩ修飾ポリペプチドを発現するジクチオステリウム全細胞溶解液でマ ウスを免疫した。産生された抗体は、該ポリペプチドの２つの異なる領域を認識 した。それゆえ、ＧＰＩ修飾ポリペプチドはジクチオステリウム細胞中で発現さ せることができる。単離形態のポリペプチドおよび該ポリペプチドを含む細胞の 両者とも、ワクチン接種、診断試験または基礎研究のための可能性を有する免疫 プロトコールに用いることができる。２．材料および方法 以下の実験においては、分子生物学、タンパク質化学および免疫学の分野にお ける当業者によく知られ利用可能な多くの技術を用いている。そのような方法は 、 必ずしも詳細には記載していない。 酵素は市販のものを入手し、供給者のプロトコールに従って用いた。 細菌培地および最近のクローニング技術はサンブルック（Ｓambrook）らによ って記載されている（モレキュラー・クローニング：ア・ラボラトリー・マニュ アル（Ｍolecular Ｃloning：Ａ Ｌaboratory Ｍanual）、ＣＳＨプレス１９８ ９）。 モノクローナル抗体およびＮＡＮＰ₅₀はシナグリア（Ｆ.Ｓinaglia）（ホフマ ン・ラ・ロシュ（Ｈoffman Ｌa Ｒoche Ｌtd）、バーゼル）から得た。３．ＣＳ含有プラスミドの構築 ３.１.ｐＥＤＩＩ−ＣＳ４９ 発現ベクターｐＥＤＩ−ＣＳは、ジクチオステリウムアクチン１５転写単位の 制御下、原核細胞宿主中での増殖および維持に重要な要素（複製起点およびアン ピシリン耐性遺伝子）を含むｐＶＥＩＩベクター（マニアク（Ｍaniak）および ネレン（Ｎellen）、（１９９０）Ｎucl.Ａcids Ｒes.１８、５３７５）、およ び真核細胞にジェネチシン（Ｇ４１８）耐性を付与するネオマイシン耐性遺伝子 をコードするＴｎ９０３から構成される。ジスコイジン（Ｄicoidin）１プロモ ーターの存在により下流配列の発現の発生制御（developmental control）が可 能となり、アクチン８配列はＲＮＡの適切な停止を確実にする。 ｐＥＤＩ−ＣＳ発現ベクターの構築のため、まず、ＣＳ ＮＦ５４遺伝子（カ スパーズ（Ｃaspers,Ｐ.）、ゲンツ（Ｇentz,Ｒ.）、マチル（Ｍatile,Ｈ.）、 ピンク（Ｐink,Ｊ.Ｒ.）、およびシニガグリア（Ｓinigaglia,Ｆ.）（１９８９ ）Ｍol.Ｂiochem.Ｐarisitol.３５、１８５〜１８９）の１１６１ｂｐのＨａｅI II＋ＲｓａＩ制限断片をｐＶＥＩＩのＡｓｐ７１８＋ＢａｍＨＩ部位中に、クレ ノウＤＮＡポリメラーゼにより充填した後に挿入した。ついで、コンタクト部位 Ａ（ＣｓＡ）リーダーペプチドと３アミノ酸をコードする配列の両ＤＮＡ鎖を、 アプライド・バイオシステム・モデル（Ａpplied Ｂiosystem Ｍodel）、３８０ Ｂ ＤＮＡ合成機で合成した。この合成リーダーペプチドのヌクレオチド配列は 以下の通りであり、 平滑末端断片をＭ１３ｍｐ１８複製可能形態中にＳｍａＩ部位にて導入した後、 ＤＮＡ配列決定することにより確認した。 ついで、このＣｓＡリーダーペプチドを含むＸｂａＩ／ＢａｍＨＩ制限断片を 単離し、該ベクター中に存在するＸｂａＩ／ＢａｍＨＩ部位に挿入して発現ベク ターｐＥＤＩＩ−ＣＳを生成した。このｐＥＤＩＩ−ＣＳ発現ベクターでは、Ｃ ＳＰの天然のＵＡＧ停止コドンをＵＡＡ停止コドンで置換した。このことは、以 下の特定のオリゴヌクレオチド： ５'アンプリマー（amplimer）（ＣｓＡリーダーペプチドの下流に位置し、Ｂａ ｍＨＩ部位を含有）： ３'アンプリマー（ＣＳＰ遺伝子の最後のコドンに対応するが、ＵＡＡ停止コド ンおよびＳａｃＩ部位を含有）： を用いて増幅したＤＮＡ断片によりＣＳＰコード領域の殆どを置換することによ り行った。これらオリゴヌクレオチドは特定の制限部位、ＢａｍＨＩおよびＳａ ｃＩ、を有しており、これら制限部位はｐＥＤＩＩ−ＣＳ中にも存在するためｐ ＥＤＩＩ−ＣＳのＣＳＰ遺伝子セグメントを置換するために用いた。この戦略を 用い、本発明者らは、元のＣ末端ポリペプチドを有するＣＳＰタンパク質を産生 する発現ベクターｐＥＤＩＩ−ＣＳ４９を得た。 ３.２.ｐＥＲＩＶ−ＣＳ ＣＳＰのＧＰＩ修飾形態を発現させるため、プラスミドｐＥＲＩＶ−ＣＳを構 築した。このプラスミドはｐＥＲＩＶに由来し、ｐＥＲＩＶ自体はｐＥＲＩＩ（ ｐＧＥＭ３ベクター中のジクチオステリウムｒａｓプロモーター断片、ＣｓＡシ グナルペプチド、アクチン６停止配列およびｎｅｏＲカセットの組み合わせであ るプラスミド）に由来する。ｎｅｏＲカセット（ジクチオステリウムアクチン１ ５プロモーター、細菌のＴｎ９０３耐性遺伝子およびジクチオステリウムアクチ ン１５停止配列を含む）は、ＥｃｏＲＶを用いてｐＤｎｅｏ２（ウィトク（Ｗit ke,Ｗ.）、ネレン（Ｎellen,Ｗ.）、およびノエゲル（Ｎoegel,Ａ.） （１９８７）、ＥＭＢＯ Ｊ.６、４１４３〜４１４８）から単離し、ｐＧＥＭ３ （プロメガ（Ｐromega corp.））中に挿入した。ついで、ｐＥＲＩ−ＣＳ（ファ セルら、上掲）からのジクチオステリウムｒａｓプロモーター−ＣｓＡシグナル ペプチド断片をＥｃｏＲＩ部位およびＢａｍＨＩ部位の間に挿入した。ｐＤｎｅ ｏ２から取り出したアクチン６停止配列は、まず、ｐＧＥＭ４（プロメガ）のＨ ｉｎｄIII部位中にクローニングして第二のＢａｍＨＩ部位を提供させ、ついで 再単離し、ＣｓＡシグナルペプチドの隣に位置するＢａｍＨＩ部位に挿入する必 要があった。アクチン６停止配列を適切な方向で含む構築物をｐＥＲＩＩと称し た。このプラスミドをＥｃｏＲＶ＋ＸｈｏＩにより消化し、グリコシルホスファ チジルイノシトールアンカー付加配列をコードする領域の増幅により得られたＤ ＮＡ断片を適当な部位を用いて挿入した。この増幅に用いた２つのオリゴヌクレ オチドは以下の配列を有している： ５'アンプリマー（ＥｃｏＲＶ部位を含有）： ３'アンプリマー（ＸｈｏＩ部位を含有）： ｐＥＲＩＶプラスミドをＡｓｐ７１８＋ＥｃｏＲＶにより消化し、ＣＳＰ ＮＦ ５４アレルを挿入した。ＣＳＰ遺伝子を含むがＮ末端のシグナルペプチドおよび Ｃ末端の疎水性ＣＳＰコードセグメントを含まないＣＳＰ ＤＮＡは、以下のア ンプリマーを用いて増幅することにより得た： ５'アンプリマー（Ａｓｐ７１８部位を含有）： ３'アンプリマー（ＥｃｏＲＶ部位に融合しうるＨａｅIII部位を含有）： 増幅したＤＮＡを、Ａｓｐ７１８およびＨａｅIIIで消化した後にｐＥＲＩＶの Ａｓｐ７１８とＥｃｏＲＶ部位との間に挿入した。４．ジクチオステリウム細胞の培養、形質転換および発現 ジクチオステリウム細胞をＨＬ−５培地中で振盪浮遊培養により５×１０⁶細 胞／ｍｌまで培養し、ＰＤＦ（パッド希釈液（Ｐad Ｄilution Ｆluid））（サ スマン（Ｓussman,Ｍ.）（１９８７）Ｍethods in Ｃell Ｂiology（スプーディ チ（Ｓpudich,Ｊ.Ａ.）編）ｐｐ９〜２９、アカデミックプレス、オーランド、 フロリダ）中で飢渇させた。種々のベクターをエレクトロポレーションにより導 入し、発現細胞を記載に従って選択した（ネレンおよびファーテル（Ｆirtel,Ｒ .Ａ.（１９８５）Ｇene３９、１５５〜１６３；ハワード（Ｈoward,Ｐ.Ｋ.）、 アハーン（Ａhern,Ｋ.Ｇ.）、およびファーテル（１９８８）Ｎucleic Ａcids Ｒes .１６、２６１３〜１６２３）。 ジスコイジンＩプロモーターに依存した発現のためには、特に指示のない限り 、ジスコイデウム細胞をＰＤＦ中で振盪浮遊培養により４時間、５×１０⁶細胞 ／ｍｌの密度にて飢渇させた（ファセルら、上掲）。 ｒａｓプロモーター構築物のためには、特に断らない限り、細胞をＰＤＦ中で 約５×１０⁶／ｍｌにて６時間飢渇させ、２００μＭ ｃＡＭＰおよび１０ｎＭＤ ＩＦ（分化誘導因子）（モリス（Ｍorris,Ｈ.Ｒ.）、テーラー（Ｔaylor,Ｇ.Ｗ. ）、マセント（Ｍassento,Ｍ.Ｓ.）、ジャーミン（Ｊermyn,Ｋ.Ａ.）、ケイ（Ｋ ay,Ｒ.Ｒ.）（１９８７）Ｎature３２８、８１１〜８１４）を加えて１時間、転 写を誘発させた（ルビオン（Ｌouvion,Ｊ.Ｆ.）、ショルダー（Ｓcholder,Ｊ.Ｃ .）、ピノー（Ｐinaud,Ｓ.）、およびレイモンド（Ｒeymond,Ｃ.Ｄ.）（１９９ １）Ｎucleic Ａcids Ｒes.１９、６１３３〜６１３８）。５．タンパク質分析 １×レムリ緩衝液中で５分間沸騰させた２×１０⁶細胞（４ｍｍ幅スロット当 たり）からのタンパク質を１０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（サンブルック（Ｓambrook, Ｊ.）、フリッチュ（Ｆritsch,Ｅ.Ｆ.）、およびマニアチス（Ｍaniatis,Ｔ.） （１９８８）モレキュラー・クローニング：ア・ラボラトリー・マニュアル、第 ２版、コールドスプリングハーバーラボラトリー、コールドスプリングハーバー 、ニューヨーク）により分離した。タンパク質をニトロセルロース（イムノブロ ッツ（Ｉmmunoblots））に電気的に移した。フィルターに１ｍｌ当たり５０μｇ の抗ＮＡＮＰモノクローナル抗体（Ｓｐ３Ｅ９）（ブランガー（Ｂoulanger,Ｎ. ）、 マチル（Ｍatile,Ｈ.）、およびベッチャート（Ｂetschart,Ｂ.）（１９８８）Ａcta.Ｔropica ４５、５５〜６５）を加え、室温にて一夜インキュベートした。 プロテインＡにコンジュゲートしたアルカリホスファターゼおよび化学ルミネセ ンス反応（アマーシャム（Ａmersham））を用いて抗ＮＡＮＰ結合を検出した。６．ＧＰＩ−ホスホリパーゼＤアッセイ 凍結と解凍のサイクルを４回繰り返してｐＥＲＩＶ−ＣＳ細胞を２０ｍＭトリ ス／ＨＣｌ ｐＨ７.５、０.１Ｍ ＣａＣｌ₂、０.００８％ＴＸ−１００中で溶解 することにより、ＧＰＩで修飾したＣＳＰのＧＰＩ−ＰＬＤ感受性を試験した。 １または５単位のＧＰＩ−ＰＬＤ酵素（ベーリンガー・マンハイム（Ｂoehrsing er Ｍannheim））を加え、抽出物を３７℃にて１時間インキュベートした。つい で、１ｍＭ ＥＤＴＡを含有する１×ＴＢＳ中のＴＸ−１１４を最終濃度１％に て加え、水相と界面活性剤相とを分離した。試料を１０％ＳＤＳポリアクリルア ミドゲル上で解離し、上記Ｓｐ３Ｅ９モノクローナル抗体を用いたイムノブロッ ティングにより分析した。７．ＥＬＩＳＡ Ｎ末端（アミノ酸２２〜１２５）、ＮＡＮＰ繰り返しペプチド、またはＣ末端 （アミノ酸２８９〜３９０）セグメントペプチドに対して産生された血清および モノクローナル抗体をＥＬＩＳＡによりアッセイした。簡単に説明すると、ビニ ルプレートを種々のペプチドでコーティングし、洗浄し、ＰＢＳ中の１％ＢＳＡ でブロックした。モノクローナル抗体または血清抗体を０.０５％トゥイーン２ ０を含有する１％ＢＳＡ／ＰＢＳ中で系列希釈した。希釈した血清を抗原をコー ティングしたウエルに加え、室温にて１時間インキュベートした。プレートを０ .０５％トゥイーン２０を含有するＰＢＳで洗浄し、ペルオキシダーゼをコンジ ュゲートした種特異的抗ＩｇＧの適当な希釈液を加え、室温にて１時間インキュ ベートした。各ウエルに１００μｌのペルオキシダーゼ基質溶液を加え、Ａ４１ ０を測定した。マウス血清のＥＬＩＳＡ力価の終点は、対照マウスの平均に比べ て吸光度の値が２ＳＤ大きい血清希釈となるように設計した。８．動物の免疫および抗血清の分析 不完全フロイントアジュバントと２×１０⁷細胞との１：１混合物で超音波処 理したものを、２５μｌで２回かまたは５０μｌで１回にてＢａｌｂ／ｃマウス にそれぞれ皮下または腹腔内のいずれかにて注射した。４週間後、同じ物質でブ ースター投与を行い、それから１０日後に血清を回収し、ＥＬＩＳＡにより分析 した。９．結果 生ワクチンの開発のため、または診断試験のため、ＧＰＩにより修飾したＣＳ Ｐを発現させた。それゆえ、ＣＳＰ−末端疎水性セグメント（最後の２３アミノ 酸）は、ＧＰＩ係留ドメインを含むコンタクト部位Ａ（ＣｓＡ）ポリペプチド（ ノエゲルら、上掲）（図１Ａおよび図１Ｂ）の少なくとも４９アミノ酸により置 換されていた。ＣＳＰ／ＣｓＡ融合遺伝子をｒａｓプロモーター（ルビオンら、 上掲、ファセルら、上掲）の制御下で挿入した。この構築物をジクチオステリウ ム・ジスコイデウム細胞（ｐＥＲＩＶ−ＣＳ）中に導入した。抗ＣＳＰ抗体を用 いたイムノフルオレセンスを用い、ｐＥＲＩＶ−ＣＳ細胞の表面のＣＳＰの存在 を確認した（データは示していない）。ｒａｓプロモーターを使用しているため 、２０〜４０％の誘導細胞のみが発現を示し、これら細胞はプレストーク（pres talk）細胞に分化した細胞であった（レイモンド（Ｒeymond,Ｃ.Ｄ.）、ゴマー （Ｇomer,Ｒ.Ｈ.）、メーディ（Ｍehdy,Ｃ.）、およびファーテル（Ｆirtel,Ｒ. Ａ.）（１９８４）Ｃell３９、１４１〜１４８）。 ジクチオステリウム・ジスコイデウム中に産生されたＣＳＰ／ＣｓＡ融合タン パク質は、ＧＰＩ修飾タンパク質に期待されるように両親媒性を有する（ボーデ ィエ（Ｂordier,Ｃ.）（１９８１）Ｊ.Ｂiol.Ｃhem.２５６、１６０４〜１６０ ７、コンツェルマン（Ｃonzelmann,Ａ.）、スピアッツィ（Ｓpiazzi,Ａ.）、ハ イマン（Ｈyman,Ｒ.）、およびブロン（Ｂron,Ｃ.）（１９８６）ＥＭＢＯ Ｊ. ５、３２９１〜３２９６）。なぜなら、この融合タンパク質はＴＸ−１１４界面 活性剤相に分配されるからである（図２）。ＣＳＰ−ＣｓＡ融合タンパク質上に ＧＰＩアンカーが存在することを確認するため、細胞を０.００８％ＴＸ−１０ ０中で凍結と解凍のサイクルを３回繰り返すことにより溶解し、細胞溶解液を１ または ５単位のＧＰＩ−ＰＬＤで１時間処理した。５単位のＧＰＩ−ＰＬＤによるＣＳ Ｐ／ＣｓＡの脂質部分の除去はその疎水性特性を変え、水相への分配を引き起こ したが（図２）、一方、１単位のインキュベーションでは効果は限られていた。 これら結果はジクチオステリウム細胞中で発現されたＣＳＰ上にＧＰＩ構造が存 在することを示しており、それゆえ、ジクチオステリウム・ジスコイデウムが異 種寄生体タンパク質を産生し、プロセシングし、ＧＰＩアンカーを付加すること により修飾しうることを示している。 ＧＰＩ修飾したＣＳＰが免疫応答を誘発する能力を評価するため、８匹のＢａ ｌｂ／ｃマウスを不完全フロイントアジュバントを混合した２×１０⁷全細胞で 皮下または腹腔内にて免疫した。第二の注射から１０日後に、ＣＳＰの種々の領 域からの合成ペプチドに対するＥＬＩＳＡにより体液免疫応答を分析した（表１ ）。抗体は、免疫優勢な（immunodominant）ＮＡＮＰ繰り返し領域に対して、お よびＣ末端の非繰り返し領域（アミノ酸２８９〜３９０）に対しては検出された が、Ｎ末端の２２〜１２５合成ペプチドに対しては検出されなかった。興味深い ことに、特定の抗体の存在および抗体力価は注射の経路により影響されなかった （表１）。対照実験として、ｐＥＤＩＩ−ＣＳ４９により合成されたＣＳＰを発 現するジクチオステリウム細胞でマウスを注射した。この場合、ＣＳＰは元のペ プチドＣ末端セグメントを有しており、ＧＰＩアンカーにより修飾されていない 。ＣＳＰの種々のセグメントに対して向けられた抗体はＥＬＩＳＡにおいて検出 されなかった（表２）。１０．図面の説明 図１ サーカムスポロゾイトタンパク質（ＣＳＰ）発現ベクター Ａ．これら２つのベクターの作成の詳細な説明は本明細書中に記載してある。簡 単に説明すると、最初の１８アミノ酸を欠くＣＳＰをＣｓＡリーダーペプチドに インフレームで融合させてｐＥＤＩＩ−ＣＳとし、元のプラスモジウム・ファル シパルムＵＡＧをＵＡＡに置換して構築物ｐＥＤＩＩ−ＣＳ４９とした。 ｐＥＲＩＶ−ＣＳは、アクチン１５プロモーターと停止配列との間にＴｎ５ｎｅ ｏＲ遺伝子を含むｐＥＲＩＩ（本明細書を参照）から得た。ＣｓＡタンパク質の ＧＰＩ 係留ドメインをＣＳＰのＣ末端にインフレームにて置いた（パネルＢ参照）。符 号：「ジスコイジンＩ」および「ｒａｓ」はジクチオステリウムにおける転写を 促進する配列である。矢印は転写の開始部位を示す。Ｉ、IIおよびIIIはＣＳＰ の高度に保存されたドメインを示す。 Ｂ．ｐＥＲＩＶ−ＣＳにおいて、ＣＳＰ疎水性ドメインをＣｓＡタンパク質の最 後の４９アミノ酸で置換した。クローニングの間に余分のプロリン（Ｐ）をＣＳ Ｐ配列（下線を引いてある）とＣｓＡ配列との間に加えた。 図２．ジスコイデウム細胞中で発現したＣＳＰのリン脂質修飾 約２×１０⁶細胞から抽出したタンパク質を１単位（レーン１）または５単位 （レーン５）のＧＰＩ−ＰＬＤにより１時間処理し、ＴＸ−１１４相分離（ボル ディエ、上掲）に供し、イムノブロッティングにより分析した。簡単に説明する と、安定に形質転換した細胞を溶解し、ＳＤＳ ＰＡＧＥにより分離し、タンパ ク質をニトロセルロースに移した。（ＮＡＮＰ）₅₀モノクローナル抗体Ｓｐ３Ｅ ９を用いた免疫検出によりＣＳＰを検出した。ＣＳＰの見かけの分子量（６２ｋ Ｄａ）を分子量標準を用いて推定した。分子量標準は以下の通りであった：ホス ホリラーゼｂ（９７ｋＤａ）、ウシ血清アルブミン（６６ｋＤａ）、卵白アルブ ミン（４２.７ｋＤａ）。Ａｑ：水相、Ｔｘ：ＴＸ−１１４界面活性剤相。０： ＧＰＩ−ＰＬＤで処理しなかった試料。１１．表

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 ＦＩ //(Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:91） (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，Ｌ Ｕ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ， ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，Ｓ Ｚ，ＵＧ)，ＵＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＺ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＨＵ，Ｉ Ｓ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ，ＬＲ ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ， ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，Ｓ Ｄ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．グリコシル−ホスファチジルイノシトール構造を含む、高められた免疫原性 を示す組換えポリペプチド。 ２．抗原である請求項１に記載のポリペプチド。 ３．該抗原が寄生体ポリペプチドである、請求項２に記載のポリペプチド。 ４．該寄生体抗原がプラスモジウム・ファルシパルムポリペプチドである、請求 項３に記載のポリペプチド。 ５．該プラスモジウム・ファルシパルム抗原がサーカムスポロゾイトタンパク質 （ＣＳＰ）またはその修飾形である、請求項４に記載のポリペプチド。 ６．請求項１〜５のいずれかに記載のポリペプチドを発現させるための組換えＤ ＮＡベクターであって、該ポリペプチドをコードするＤＮＡ配列であって該配列 の下流に位置する糖脂質アンカー付加配列に作動可能に連結したもの、適当な転 写開始配列および転写停止配列および任意にリーダーペプチド配列を含み、これ ら配列がすべて作動可能に連結されているベクター。 ７．該ＤＮＡ配列が寄生体抗原をコードする、請求項６に記載の組換えＤＮＡベ クター。 ８．該寄生体抗原がプラスモジウム・ファルシパルム抗原である、請求項７に記 載の組換えＤＮＡベクター。 ９．該プラスモジウム・ファルシパルム抗原がサーカムスポロゾイトタンパク質 （ＣＳＰ）またはその修飾形である、請求項８に記載の組換えＤＮＡベクター。 １０．該糖脂質アンカー付加配列がジクチオステリウム・ジスコイデウムコンタ クト部位Ａに由来するものである、請求項６〜９のいずれかに記載の組換えＤＮ Ａベクター。 １１．請求項６〜１０のいずれかに記載の組換えＤＮＡベクターを含む組換え宿 主細胞。 １２．ジクチオステリド宿主である、請求項１１に記載の組換え宿主細胞。 １３．該ジクチオステリド宿主がジクチオステリウム種、とりわけジクチオステ リウム・ジスコイデウムである、請求項１２に記載の組換え宿主細胞。 １４．ポリペプチドの１またはそれ以上のエピトープに対して向けられた免疫応 答の誘発方法であって、哺乳動物宿主を請求項１〜５のいずれかに記載のポリペ プチドで免疫し、ついで、かくして産生された抗体を分離することを含む方法。 １５．免疫のためのポリペプチドが、該ポリペプチドを発現する宿主細胞の全細 胞溶解液の形態である、請求項１４に記載の方法。 １６．請求項１〜５に記載の修飾ポリペプチドの製造方法であって、請求項６〜 １０に記載の適当なベクターで適当な宿主細胞を形質転換し、該細胞を該ポリペ プチドの発現が可能となる条件下で培養し、ついで場合により該ポリペプチドを 単離することによる方法。 １７．適当な賦形剤とともに免疫保護量の請求項１〜５のいずれかに記載のポリ ペプチドを含むワクチン。 １８．該免疫保護量が、約１〜５×１０⁷細胞、とりわけ２×１０⁷細胞の請求項 １１〜１３に記載の宿主細胞のポリペプチド含量を含む、請求項１７に記載のワ クチン。