NL9100869A - Dictyostelide expressievector en werkwijze voor het tot expressie brengen van een gewenst eiwit. - Google Patents

Description

Dictyostelide expressievector en werkwijze voor het tot expressie brengen van een gewenst eiwit

De onderhavige uitvinding heeft betrekking op recombinante DNA-moleculen en een werkwijze voor het tot expressie brengen van gewenste DNA-sequenties in dictyoste-liden. Meer in het bijzonder heeft de uitvinding betrekking op een recombinant plasmide en werkwijze voor het tot expressie brengen van een gewenst enzym of parasiet-antigeen in dictyosteliden en meer in het bijzonder op het tot expressie brengen van circumsporozoiet antigeen van Plasmodium falciparum en chloramphenicol acetyl transferase in Dictvos-telium discoideum.

Produktie van funktionele of immunogene recombinante polypeptiden is in verschillende organismen verkregen. In het bijzonder werd het van belang zijnde gen geïsoleerd en tot expressie gebracht onder de controle van specifieke DNA-elementen die expressie in de specifieke gastheer toestonden. Bacteriën, lagere en hogere eukaryotische cellen en virale vectoren bevinden zich onder de meest toegepaste systemen.

Plasmodium falciparum, de meest frequent humane malaria veroorzakende parasiet, wordt in verschillende vormen gevonden in insekten en humane gastheren. Het gebruik van geïnactiveerde parasietvormen als vaccin in zoogdieren heeft veelbelovende resultaten getoond. Hierbij was echter de lage hoeveelheid materiaal, die beschikbaar was, door de moeilijkheden van het kweken van parasieten een beperking. Van de genen die coderen voor een aantal celoppervlakte-eiwitten van de verschillende vormen is de sequentie bepaald, waardoor het mogelijk was gastheerbeschermende antigenen, die mogelijk bruikbaar zouden kunnen zijn als vaccin, te identificeren. Expressie van dergelijke antigenen of andere P. falciparum-eiwitten in heterologe recombinante systemen (bijv. E. coli. gist, vacciniavirus, baculovirus, Salmonella) is moeilijk gebleken en in de meeste gevallen werden slechts kleine hoeveelheden van complete eiwitten verkregen.

Het oppervlak van de eerste vorm van Plasmodium falciparum, die in het organisme gevonden wordt na transmissie door middel van een insektebeet, is bedekt door het circumsporozoieteiwit (CS). Dit eiwit wordt gesynthetiseerd in de vorm van een polypeptide-voorlopermolecuul dat samengesteld is uit een amino-uiteinde-signaalsequentie, die verwijderd wordt na verwerking, uit een groot centraal repeat-domein aan beide zijden geflankeerd door gebieden, waarnaar naar verwezen wordt als gebied I en II, die sequenties bevatten die geconserveerd zijn tussen verschillende Plasmodia speciës en uit een terminaal carboxy-ankerdomein. Van het repeatdomein, dat bestaat uit (ASN-ALA-ASN-PRO)n, is aangetoond dat het het B-cel immunodominante gebied van het P. falciparum CS is. Synthetische peptiden die een dergelijke repeat bevatten zijn met beperkt succes gebruikt als subeenheidvaccin in beschermingsstudies. De T-cel-respon-selementen op het CS-eiwit zijn gelocaliseerd buiten de repeatsegmenten. Deze resultaten suggereren dat het gehele CS-eiwit gebruikt zou kunnen worden teneinde een sterkere en langer durende immunobescherming te verkrijgen. Deze experimentele data geven verder de vereiste van een eiwit met zijn B- en T-cel-epitopen aan teneinde een efficiënt malariavac-cin te verkrijgen.

Moeilijkheden in het produceren van hoge hoeveelheden CS-eiwit werden omzeild door het slechts tot expressie brengen.van segmenten van het CS-eiwit in vivo welke echter niet een voldoende immuunrespons opwekten als vaccins. Expressie van het volledige eiwit werd verkregen door gebruikmaking van vaccinia en baculovirus-expressiesysternen. Een onstabiele expressie van eiwitten evenals de hoge pro-duktiekosten maken dergelijke systemen echter onaantrekkelijk.

Het is daarom een doel van de onderhavige uitvinding een expressiesysteem te verschaffen voor verschillende soorten eiwitten, zoals Plasmodium falciparum-eiwitten. dat in staat is tot stabiele expressie van eiwitten met lage kosten.

Gevonden is dat speciës van de slijmzwam Dictvoste-lium gebruikt kunnen worden als een efficiënt eukaryotisch expressiesysteem voor de produktie van de recombinante eiwitten.

De cellulaire slijmzwam Dictyostelium discoideum (Dd) is een vrijlevend organisme, eenvoudig te kweken en in stand te houden. Dd-stammen kunnen gegroeid worden op bacte-rievelden met een verdubbelingstijd van ongeveer 3 uur, in bacteriële suspensies tot hoge dichtheden (tot lO10/cellen per liter) of in een semisynthetisch medium dat glucose, pepton en gistextract bevat waarin de verdubbelingstijd ongeveer 12 uur is. De levenscyclus van Dictyostelium bestaat uit een groei- en een ontwikkelingsfase. De ontwikkelingsfase wordt aangeschakeld door verhongering en wordt gekarakteriseerd door aggregatie van in eerste instantie enkele cellen teneinde een multicellulair organisme te vormen dat vervolgens differentieert teneinde sporen te produceren welke gedurende een lange tijdsperiode opgéslagen kunnen worden. Ontkieming van sporen in de aanwezigheid van bacteriën of een rijk medium zal hernieuwde groei toestaan. Gedurende deze ontwikkelingscyclus worden diffundeerbare faktoren geproduceerd en voor tenminste één van hen (cAMP) induceert binding aan zijn receptor transcriptie van een set van specifieke genen (zie Loomis, The development of Dictv-ostelium discoideum. Acad. Press, 1982).

Groei-eigenschappen en transformatie-capaciteit van Dictyostelium discoideum bieden de mogelijkheid vreemde eiwitten tot expressie te brengen aangezien cellen tegen lage kosten gekweekt kunnen worden op bacteriën en de expressie van specifieke eiwitten nauw gecontroleerd kan worden door verhongering in een eenvoudig medium.

In een uitvoeringsvorm van deze uitvinding is het homologe promotergebied de Discoidine I promoter van Dictv-ostelium discoideum welke onder ontwikkelingscontrole staat. Transcriptie vanaf deze promoter wordt geïnduceerd door verhongering van de Dictyostelium celcultuur.

Verder wordt een leader-peptidesequentie verschaft in de expressievector. Fusie van dit leader-peptide staat het transport van het recombinante eiwit naar het celopper-vlak toe, waardoor op deze wijze recombinante eiwit-identi-ficatie vergemakkelijkt wordt.

In een andere uitvoeringsvorm verschaft de uitvinding een induceerbare expressievector. De Pd ras promoter van Dictvostelium discoideum wordt daar gebruikt als het homologe promotergebied. Expressie van genen onder de controle van de Pd ras promoter wordt aangezet door cAMP-toe-voeging aan de celcultuur. Gedurende celgroei is het trans-criptieniveau vanaf de Pd ras promoter niet detecteerbaar, waardoor het mogelijk is genen te introduceren die coderen voor mogelijk toxische eiwitten in Dictvostelium. De produk-tie van deze eiwitten wordt aangezet door cAMP-toevoeging gedurende de ontwikkeling.

De uitvinding wordt verder geïllustreerd door de volgende voorbeelden welke niet beschouwd moeten worden als beperkend voor het doel van de onderhavige uitvinding.

VOORBEELDEN

De volgende voorbeelden maken gebruik van verschillende technieken die wel bekend zijn voor degene die deskundig zijn op het gebied van de moleculaire biologie. Dergelijke methoden worden niet altijd in detail beschreven.

Enzymen worden verkregen uit commerciële bronnen en gebruikt volgens de protocollen van de leveranciers.

Bacteriële media en gangbare kloneringstechnieken worden beschreven in Sambrook et al. (Molecular cloning: A laboratory manual, CSH Press, 1989).

Monoklonale antilichamen en NANP50-peptide werden verkregen van H. Matile (Hoffman La Roche Ltd.).

VOORBEELD 1

De volgende voorbeelden leren de expressie van het circumsporozoiet-antigeen CS van Plasmodium falciparum in Dictyostelium discoideum onder de controle van de Discoidine I promoter.

1.1. Constructie van CS-bevattende plasmiden.

Expressievector pEDI-CS is samengesteld uit de pVEII-vector (Maniak and Nellen, Nucl. Acids Res., 18, 5375, 1990), welke de elementen bevat die belangrijk zijn voor de vermeerdering en instandhouding in een prokaryotische gastheer (replicatie-origin en ampicilline-resistentie), en van een door Tn903 gecodeerd neomycine-resistentiegen dat resistentie tegen geneticine (G418) overdraagt aan eukaryotische cellen onder de controle van een Dictvostelium-actine 15 transcriptie-eenheid. De aanwezigheid van een Discoidine I promoter staat de ontwikkelingscontrole van expressie van stroomafwaartsgelegen sequenties toe en actine 8 sequenties verzekeren de juiste terminatie van het RNA.

Voor de constructie van de pEDI-CS-expressievector werd allereerst het HaelII + Rsal-restrictiefragment van 1161 bp van het CS NF54 gen (Caspers et al., Mol. and Bio-chem. Parasitol. 35» 185, 1989) geïnsereerd in de Asp718-+BamHI-plaatsen van pVEII, die opgevuld waren door Klenow DNA polymerase.

Vervolgens werden beide DNA-strengen van een sequentie die voor het contactsite A (CsA) leader peptide codeerde plus 3 aminozuren gesynthetiseerd op een Applied Biosystem Model 380B DNA synthesizer. De nucleotidesequentie van het synthetische leader peptide (fig. 1) werd bevestigd door het introduceren van het fragment met stompe uiteinden in de van replicatieve vorm M13mpl8 op de Smal-plaats, gevolgd door DNA-sequentie-analyse.

Het Xbal+BamHI-restrictiefragment dat het CsA leader peptide bevatte werd vervolgens geïsoleerd en geïnsereerd op de Xbal+BamHI-plaatsen, die aanwezig waren in de vector, teneinde expressievector pEDII-CS te vormen.

1.2. Transformatie van Dictvostelium discoideum

Dictvolstelium-cellen werden gekweekt in schuddende suspensies van HL-5 media tot een concentratie van 2-5x-106/ml, gecentrifugeerd bij 300 g en gewassen in gedistilleerd water. 5 μg van het gewenste DNA werd geëlectroporeerd in 107 cellen in 100 μΐ gedestilleerd water bij 670 V en 3 jliF door gebruikmaking van Gene Pulser apparatuur van BioRad, waardoor een puls van ongeveer 1,5 msec geleverd werd.

Voortgaande G418 selectie werd toegepast op de cellen tot een concentratie van 50 μg/ml, waardoor de aanwezigheid van 100 tot 200 kopieën van tandemrepeats van het geïnsereerde DNA verzekerd werd.

1.3. CS-expressie na verhongering op het RNA-niveau.

RNA werd bereid uit cellen die opgegroeid waren in HL-5 medium (vegetatieve stadium) of na resp. 4, 8 of 15 uur verhongering in PDF. Daarvoor werden 107 cellen gelyseerd in 50 mM Tris (pH 8,5), 0,1% SDS, 1 mM vanadylcomple en 3 maal geëxtraheerd met fenol-chloroform 1:1.

15 μg RNA werd behandeld met glyoxaal en onderworpen aan elektroforese op een 0,8% agarosegel. De monsters werden overgebracht naar Genescreen-plus-filters met een vacugene-apparaat. Anti-sense RNA probes werden gevormd door het insereren van DNA-fragmenten in de vector pGEM-1 en het uitvoeren van Sp6-RNA polymerase-reacties. De filters werden gedurende 48 uur bij 55°C gehybridiseerd in een oplossing die 50% formamide, 5 x SSC (1 x SSC = 0,15 M NaCl, 15 mM natriumcitraat), 0,2% runderserumalbumine, 0,2% Ficoll, 0,2% polyvinylpyrrolidon, 25 mM Na2HP04, 25 mM NaH2P04, 02% SDS,

ImM EDTA, 250 jug/ml gedenatureerd DNA en 500 jug/ml gist-RNA bevatte. De filters werden gewassen gedurende 5 x 15 minuten in 0,1 x SSC, 0,12% SDS bij 65°C.

Op de Northern blots werd een RNA-speciës van 1,4 kb gedetecteerd in pEDII-CS getransfecteerde cellen, terwijl geen signaal gedetecteerd werd in pVEII-getransfecteerde cellen. De hoeveelheid steady-state CS RNA neemt na 4 uren verhongering toe gevolgd door een afname in expressie na 15 uur.

1.4. CS-expressie na verhongering op het eiwit-niveau.

Eiwitten werden bereid uit dezelfde monsters die gebruikt werden in voorbeeld 1.3. voor de analyse van CS-expressie na verhongering op het eiwitniveau.

Cellen werden gelyseerd in 1 x Laemmli's buffer bij 100°C gedurende 5 minuten en eiwitten werden gescheiden op een 10% SDS-PAGE. Eiwitten werden overgebracht door middel van elektro-overdracht op een nitrocellullosefilter. 0,2 mg/ml van het anti-NANP-monoclonale antilichaam werd toegevoegd aan het filter voor een overnacht incubatie bij kamertemperatuur. 125I-proteïne A werd gebruikt voor het aantonen van de anti-NANP-reactie.

De Western blots toonden geen CS-expressie in pVEII-cellen en een maximale expressie in pEDII-CS-cellen na vier uur verhongering. Een enkele band met een molecuulgewicht van 62 kDa werd gedetecteerd. Geen ander kruisreagerend speciës werd waargenomen. Deze inductie van de expressie volgt het profiel dat verwacht wordt voor Discoidine I genregulatie.

1.5. Herkenning van het NANP-epitoop op het CS-eiwit.

Teneinde herkenning van het NANP-epitoop, dat aanwezig is op het CS-eiwit, te bevestigen liet men de binding van een anti-NANP-monoclonaal antilichaam aan het door Dd tot expressie gebrachte CS-eiwit concurreren met een NANP50 peptide. Cellen, die het CS-polypeptide tot expressie brachten, werden gelyseerd, eiwitten gescheiden op SDS-PAGE en overgebracht naar een nitrocellulosefilter. Voor incubatie werd het anti-NANP50 monoclonale antilichaam geïncubeerd met verschillende hoeveelheden van een NANP50-peptide, welke overeenkomen met het aantal NANP50 repeats dat aanwezig is op het CS-eiwit. Een tiende equimolaire hoeveelheid NANP50 peptide was voldoende voor het waarnemen van een belangrijke vermindering in de binding van het monoclonale antilichaam aan het CS-eiwit.

1.6. Herkenning van verschillende Plasmodium falciparum CS epitopen door monoklonale antilichamen.

Verschillende monoclonale antilichamen tegen CS-eiwitten of synthetische peptiden werden gebruikt in de immunoblottest. Dd-cellen werden gelyseerd, eiwitten gescheiden door SDS-PAGE en overgebracht naar een nitrocellu- losefilter. Filterstrips werden geïncubeerd met verschillende monoclonale antilichamen van verschillende categoriën (SP3B4, SP3.E9, CT3.3, CT3.1, SP3.H3, SP3,E6, SP3.C6). Herkenning van epitopen was slechts zichtbaar met de verwachte antilichamen. In geen gevallen werd een specifiek signaal waargenomen in de cellen die slechts de pVEII-vector tot expressie brachten.

1.7. Zuivering van CS-eiwit geproduceerd in Dictvostelium disoidum.

Op het aminozuurniveau bevat het CS-eiwit een hydrofoob segment aan het carboxy-uiteinde, dat een rol zou kunnen spelen als een signaal voor de additie van een glyco-syl-fosfatidylinositol-anker (GPI). Dit C-terminale peptide-segment voor een posttranslationeel toegevoegd GPI-anker zou een hydrofoob karakter overdragen aan het CS-eiwit waardoor zijn scheiding in Triton X-114 toegestaan zou worden.

Eiwitten werden geëxtraheerd uit de cellen met 1% Triton X-114 en gescheiden in water- en detergens-fasen. De eiwitten die oplosbaar zijn in het detergent werden geanalyseerd door Western blot. Tenminste 10 maal meer eiwitten waren aanwezig in de water-fase dan in de TX-114 fase, geschat door middel van een Biorad eiwittest en eveneens beoordeeld door middel van Ponceau-kleuring. Een sterk signaal wordt waargenomen in de TX-114 fase van cellen die CS tot expressie brengen, zelfs hoewel een bepaalde hoeveelheid ewit in de water-fase achterblijft. Geen signaal wordt gevonden in het pVEII-monster. Behandeling met Triton X-114 staat daarom een eerste gedeeltelijke zuivering van het recombinante eiwit toe.

Teneinde het CS-eiwit dat tot expressie gebracht wordt in Dictyostelium verder te zuiveren werden CS-cellen gepulslabeld met [35S]-methionine gedurende 2 uur na een aanvangsverhongeringsperiode van 2 uur. De cellen werden verwijderd door centrifugatie, gelyseerd in Crumpton lyse-buffer en voorgezuiverd met proteïne-A Sepharose. TX-114 oplosbare eiwitten werden geladen op een affiniteitskolom, die anti-NANP-antilichamen gecrosslinkt aan Sepharose bevat te. Na elutie van de kolom in de aanwezigheid van 0,1 M glycine (pH 2,5) werd methionine gelabeld eiwit met een schijnbaar molecuulgewicht van 62 kDA gedetecteerd door SDS-PAGE en fluorografie. Hetzelfde experiment uitgevoerd op pVEII bevattende cellen vertoonden slechts kleinere banden van verschillende molecuulgewichten (fig. 3).

1.8. Celoppervlakexpressie

Indien op de juiste wijze verwerkt zal het CS-eiwit aanwezig moeten zijn op het celoppervlak. Analyse van het door fluorescentie geactiveerd sorteren van cellen met gebruikmaking van anti-NANP-antilichamen toonde dat het CS-eiwit tot expressie gebracht wordt op het oppervlak van Dictyostelium discoideum-cellen.

1.9. Sequentiebepaling van het uiteinde

Teneinde vast te stellen of het tot expressie gebrachte CS-eiwit volledig was, werd het CS-eiwit geïsoleerd met gebruikmaking van Triton TX-114 fasescheiding en immunoaffiniteitchromatografie, teneinde de sequentie te bepalen van zijn N-uiteinde.

Geen sequentie kon verkregen worden uit het volledige eiwit, hetgeen een waarschijnlijke blokkade aan het amino-uiteinde aangeeft. Wanneer de zuivering uitgevoerd wordt in aanwezigheid van minder proteaseremmers werd een aminozuursequentie die de eerste 25 aminozuren miste verkregen. Wanneer slechts benzamidine gebruikt werd waren maximaal 33 aminozuren van het N-uiteinde afwezig hetgeen suggereert dat endogene proteasen het CS-eiwit zouden kunnen aanvallen gedurende zijn zuivering. Zoals getoond kan dit probleem opgelost worden door gebruik te maken van proteaseremmers en wordt beperkt tot de eerste 20 aminozuren.

VOORBEELD 2

De volgende voorbeelden leren de expressie van chlooramphenicol acetyl transferase in Dictvostelium discoi-deum met gebruikmaking van een induceerbare expressievector.

2.1. DNA-sequentie van de Pd ras-promoter.

Het Rsal-restrictiefragment van de genoomkloon van Pd ras werd geïnsereerd op de Smal-plaats van pGEM-1. Sequent iebepa ling werd uitgevoerd door gebruikmaking van specifieke primers op dubbelstrengs PNA.

Fig. 4 toont de PNA-sequentie van het Rsal-fragment. Pijlen geven de transcriptiestartplaatsen aan. Pe dikke pijl komt overeen met het belangrijkste transcript dat gedetecteerd werd na de toevoeging van extern cAMP. Gestippelde pijlen geven verder RNA-startplaatsen aan, die gebruikt worden gedurende normale Pd-ontwikkeling. "Met" is het Pd ras-eiwitstartcodon. Het gebied essentieel voor promoter-funkties wordt onderstreept. * komt overeen met het breekpunt van een 3'-deletie dat een PNA-fragment verschaft dat bestaat uit de nucleotiden 1 tot 434; ** geven het breekpunt aan van een 3'-deletie dat een PNA-fragment verschaft dat bestaat uit nucleotiden 1 tot 401; *** komen overeen met het breekpunt van een 5'-deletie dat een PNA-fragment bevat dat bestaat uit de nucleotiden 418-630.

2.2 Constructié van de CAT-bevattende vector.

Delen van Pd ras promoter sequenties werden in een pAV-CAT-vector geplaatst (May et al., Mol Cell Biol. 9, 4653, 1989). De resulterende constructen lijken op pEDII-CS waarbij CS en het\ leaderpeptide vervangen zijn door een chlooramphenicol acetyl transferasegen (CAT), de Discoidine I promoter vervangen is door Pd ras promoter en het G418 resistentiegen onder de controle van de aktine 15 promoter en terminatorgebieden in tegenovergestelde oriëntie geplaatst zijn.

2.3. Expressie van chlooramphenicol acetyl trasnferase in Dictvostelium discoideum op het RNA-niveau.

De constructen uit voorbeeld 2.2. werden opnieuw geïntroduceerd in Dietvoste1ium en cellen werden geanalyseerd voor CAT-expressie op het RNA-niveau.

RNA werd bereid uit Dd-cellen. die getransformeerd waren met een recombinant pAV-CAT-vector, die delen van het

Rsal-fragment van de Pd ras-promoter bevatten. RNA werd geïsoleerd uit cellen die gedurende 7 uren uitgehongerd waren. De helft van de cellen ontving cAMP (0,2 mM) gedurende een uur vóór RNA-bereiding. Na scheiding op agarosegel (MES-glyoxaal) en overdracht naar Genesereen werd het RNA getest met pAV-CAT volledige vector, die gelabeld was door middel van nick-translatie.

CAT-transcripten werden gedetecteerd na cAMP-induc-tie met Pd ras-promoterfraomenten. die tenminste de sequentie die onderstreept is in fig. 4, bevatten. Verdere deleties beëindigden CAT-RNA ophoping. Optimale CAT-transcript ophoping trad op met een DNA, die de sequentie 1 tot 401 (** in fig. 4) had.

2.4. Expressie van chlooramphenicol acetyl transferease in Dictvostelium discoideum op het enzymniveau.

107 Dd-cellen die pAV-CAT-vectoren bevatten met resp. nucleotiden 1 tot 434, 1 tot 401 en 418 tot 630 werden gelyseerd door 3 cycli van invriezen en ontdooien. Na cen-trifugatie bij 12000 rpm gedurende 5 min. werd CAT-activi-teit in het supernatant getest gedurende 30 minuten door beschreven technieken (Gorman et al., Mol. Cell. Biol. 2, 1044, 1982). Door de grote hoeveelheden CAT-activiteit in de extracten, werd slechts 1 μΐ van de 50 van het supernatant gebruikt teneinde te verzekeren dat de reaktie in de lineaire fase was.

CAT-activiteittests toonden niet alleen de aanwezigheid van een funktioneel enzym in Dd-extracten aan, maar eveneens cAMP-inductie met de juiste constructen.

Claims (34)

1. Recombinant DNA-molecuul dat geschikt is voor de expressie van een gewenst funktioneel polypeptide of intermediair daarvan in een dictyostelide gastheer, met het kenmerk, dat het recombinante DNA-molecuul een Dictvostelium discoideum-homolooa promotergebied omvat, een heterologe DNA-sequentie en een Dictvostelium discoideum homoloog terminatiegebied, waarbij de heterologe DNA-sequentie codeert voor het gewenste funktionele polypeptide of intermediair daarvan, de DNA-sequentie stroomafwaarts van het promotergebied gepositioneerd is en het terminatiegebied stroomafwaarts van de DNA-sequentie gepositioneerd is .

2. Recombinant DNA-molecuul volgens conclusie 1, met het kenmerk, dat de dictyostelide gastheer Dictvostelium discoideum is.

3. Recombinant DNA-molecuul volgens conclusie 1-2, met het kenmerk, dat de homologe terminatiesequentie de actine 8 terminatiesequentie van Dictvostelium discoideum of een gemuteerde versie daarvan is.

4. Recombinant DNA-molecuul volgens conclusie 1-3, met het kenmerk, dat het promotergebied de Discoidine I promoter van Dictyostelium discoideum of een gemuteerde versie daarvan is.

5. Recombinant DNA-molecuul volgens conclusie 1-3, met het kenmerk, dat het promotergebied de Pd ras-promoter van Dictyostelium discoideum of een gemuteerde versie daarvan is.

6. Recombinant DNA-molecuul volgens conclusie 1-3, met het kenmerk, dat het promotergebied samengesteld is uit de nucleotiden l tot 401 van de Pd ras-promoter zoals weergegeven in fig. 4.

7. Recombinant DNA-molecuul volgens conclusie 1-6, met het kenmerk, dat de heterologe DNA-sequentie codeert voor een eiwit met enzymatische aktiviteit.

8. Recombinant DNA-molecuul volgens conclusie 1-7, met het kenmerk, dat de heterologe DNA-sequentie codeert voor een parasieteiwit.

9. Recombinant DNA-molecuul volgens conclusie 8, met het kenmerk, dat het parasieteiwit een humane of dierepara-siet-eiwit is.

10. Recombinant DNA-molecuul volgens conclusie 9, met het kenmerk, dat het eiwit een Plasmodium spec, eiwit is.

11. Recombinant DNA-molecuul volgens conclusie 10, met het kenmerk, dat het Plasmodium spec, eiwit een Plasmodium falciparum eiwit is.

12. Recombinant DNA-molecuul volgens conclusie 11, met het kenmerk, dat het Plasmodium falciparum-eiwit het circumsporozoiet antigeen is.

13. Recombinant DNA-molecuul volgens conclusie 1-12, waarin een peptidesequentie, die in staat is om te funktio-neren als een leaderpeptidesequentie is opgenomen, en die in het juiste readingframe met de heterologe DNA-sequentie geplaatst is.

14. Recombinant DNA-molecuul volgens conclusie 13, met het kenmerk, dat het leaderpeptide een dictyostelide leaderpeptide is.

15. Recombinant DNA-molecuul volgens conclusie 13, met het kenmerk, dat de DNA-sequentie van het Dictvostelium discoideum leaderpeptide de sequentie uit fig. 1 is of een gemuteerde versie daarvan.

16. Dictyostelidestam omvattende een recombinant DNA-molecuul volgens één der voorgaande conclusies.

17. Dictyostelidestam die het circumsporozoiet antigeen van Plasmodium falciparum tot expressie brengt.

18. Dictyostelidestam die een enzymatisch aktief eiwit tot expressie brengt verkregen door middel van een recombinant DNA-molecuul volgens één der voorgaande conclusies.

19. Dictyostelium discoideum (pEDII-CS) met het depottoegangsnummer CBS 238.91.

20. Werkwijze voor het produceren van een recombinant DNA-molecuul voor de expressie van een gewenst polypeptide in dictyosteliden omvattende: Λ a) het lineariseren van een DNA-molecuul dat Dictv-ostelium-homologe promoter en terminatorsequenties bevat teneinde een lineair DNA-molecuul te verkrijgen; b) het isoleren van een heterologe DNA-sequentie die codeert voor het gewenste polypeptide; en c) het legeren van het gelineariseerde DNA-molecuul en de geïsoleerde DNA-sequentie teneinde een recombinant DNA-molecuul te verkrijgen voor transformatie van dictyoste-liden.

21. Werkwijze volgens conclusie 20 voor het produceren van recombinant plasmide pEDI-CS, met het kenmerk, dat het plasmide dat Dictvostelium discoideum-homoloae promoter en terminatorsequenties bevat pVEII is, en de heterologe DNA-sequentie het CS NF54 gen van Plasmodium falciparum is.

22. Werkwijze volgens conclusie 20, met het kenmerk, dat naast stap c) de stappen opgenomen zijn van: d) het synthetiseren van een leaderpeptidesequentie volgens fig. 1; e) het lineariseren van het recombinante plasmide van stap c) teneinde gelineariseerd plasmide DNA te verkrijgen ; en f) het legeren van het lineaire recombinante plasmide en de gesynethetiseerde leaderpeptidesequentie teneinde een ander recombinant DNA-molecuul te verkrijgen.

23. Werkwijze volgens conclusie 22 voor het produceren van recombinant plasmide pEDII-CD, met het kenmerk, dat het recombinante plasmide pEDI-CS is, en de leaderpeptidesequentie de sequentie volgens fig. 1.

24. Werkwijze voor het produceren van recombinante polypeptiden, welke werkwijze omvat: a) het bereiden van een expressievector volgens één van de conclusies 1-14, die codeert voor een gewenste poly-peptidesequentie; b) het transformeren van een dictyostelide gastheer-celcultuur met de expressievector teneinde een recombinante dictyostelide gastheercel te verkrijgen; c) het kweken van de recombinante dictyostelide gastheercel onder condities die expressie van de DNA-sequen- tie die codeert voor het gewenste recombinante polypeptide toestaan; d) het isoleren van het recombinante polypeptide.

25. Werkwijze volgens conclusie 24, waarin het gewenste polypeptide een parasieteiwit is.

26. Werkwijze volgens conclusie 25, met het kenmerk, dat het gewenste polypeptide een humaan- of diereparasietei-wit is.

27. Werkwijze volgens conclusie 26, met het kenmerk, dat het gewenste parasietpolypeptide een Plasmodium spec, eiwit is.

28. Werkwijze volgens conclusie 27, met het kenmerk, dat het Plasmodium spec, eiwit een Plasmodium falciparum eiwit is.

29. Werkwijze volgens conclusie 28, met het kenmerk, dat het Plasmodium falcioarum-eiwit het circumsporozoiet antigeen is.

30. Werkwijze volgens conclusie 24, met het kenmerk, dat het gewenste polypeptide enzymatische aktiviteit heeft.

31. Werkwijze volgens conclusie 24-30, met het kenmerk, dat de dictyostelide gastheercelcultuur Dictvoste-lium discoideum is.

32. Werkwijze volgens conclusies 24-31, met het kenmerk, dat de omstandigheden die expressie van de DNA-sequentie toestaan het uithongeren van de Dictvostelium celcultuur omvatten.

33. Circumsporozoiet antigeen van Plasmodium falciparum geproduceerd volgens de werkwijze van één van de conclusies 24-29 en conclusies 31 en 32.

34. Werkwijze volgens conclusie 24, met het kenmerk, dat de expressievector een vector is, die een Dictvostelium discoideum Pd ras promotergebied, een heterologe DNA-sequen-tie, die codeert voor een gewenst polypeptide en een Dicty-ostelium discoideum-actine 8 terminatiegebied bevat, waarbij de heterologe DNA-sequentie stroomafwaarts van het Pd ras-promotergebied geplaatst is, en het actine 8 terminatiegebied stroomafwaarts van het heterologe DNA geplaatst is, waarbij de heterologe DNA-sequentie tot expressie gebracht wordt in een uithongerde Dictyostelium discoideum gastheer-celcultuur na toevoeging van cAMP.