DE69033772T2

DE69033772T2 - Verbesserte plasmidvektoren für zelluläre schleimpilze der gattung dictyostelium

Info

Publication number: DE69033772T2
Application number: DE69033772T
Authority: DE
Inventors: Chin Chang; Basil Slade; Leslie Williams
Original assignee: DICTYTECH Pty Ltd
Current assignee: DICTYTECH Pty Ltd
Priority date: 1989-11-02
Filing date: 1990-11-02
Publication date: 2002-06-20
Anticipated expiration: 2010-11-03
Also published as: WO1991006644A1; EP0498827B1; EP0498827A4; DE69033772D1; US5389526A; EP0498827A1

Description

Gegenstand der Erfindung

Die gegenwärtige Erfindung bezieht sich allgemein auf das Gebiet der Molekularbiologie und der Herstellung von rekombinanten Proteinen durch die biotechnologische Industrie. Im engeren Sinne bezieht sich die Erfindung auf neue Stämme des Genus Dictyostelium, auf in Stämmen des Genus Dictyostelium anwendbare rekombinante Plasmid Vectoren, und Polpypetide, die die extrachromosomale Replikation solcher Plasmide in Stämmen des Genus Dictyostelium ermöglichen. Solche extrachromosomal replizierende Plasmide, die auf die in der Erfindung offenbarten Art und Weise hergestellt werden, sind geeignet, eine große Vielfalt von Genen und Promotor Sequenzen für die kontrollierte Produktion von rekombinanten Proteinen durch die biotechnologische Industrie zu übertragen.

Stand der Technik

Wie in dem Fachgebiet bekannt, ist die genetische Information in doppelsträngigen DNA Molekülen codiert entsprechend der Sequenz von vier Nucleotiden, die unterschiedliche Basen enthalten, nämlich Adenin (A), Thymin (T), Cytosin (C) und Guanin (G). Blöcke von DNA Sequenzen, die Gene flankieren, kontrollieren oft Genaktivität, indem sie Regulator- Proteine binden und als Erkennungssignale für Enzyme der Zell-Biosynthese-Maschinerie fungieren. So enthält jede Zelle eine Vielzahl von Regulator Molekülen, die zur Kontrolle der Genaktivitäten dienen, indem sie spezifische DNA-Sequenzen binden. Andere DNA- Sequenzen haben entscheidende Funktionen bezüglich der Kontrolle der DNA-Synthese und der Verteilung der DNA auf Tochter Zellen während der Zellteilung. Diese Funktionen müssen in jedem DNA Molekül in jeder Zelle vorhanden sein oder die DNA geht innerhalb weniger Zell-Generationen verloren.
Plasmide sind im Regelfall zirkulare DNA-Moleküle, die bestimmte DNA-Sequenzen aufweisen, welche diesen DNA-Molekülen eine von der chromosomalen DNA unabhängige Replikation ermöglichen. Der eine DNA-Sequenz umfassende Block, in dem die Replikation der Plasmid-DNA initiiert wird, nennt man im allgemeinen "Ursprung der Replikation" (engl.: "origin of replication"), und die Fähigkeit, unabhängig von der chromosomalen DNA zu replizieren, wird als "extrachromosomale Replikation" bezeichnet.
Molekular Biologen haben Techniken für das Zerschneiden von DNA-Molekülen in Fragmente entwickelt, indem sie sequenz-spezifische Restriktions-Enzyme verwenden, die Fragmente reinigen und sie in unterschiedlicher Ordnung wieder verknüpfen. Wenn eines der verwendeten DNA-Fragmente einen Ursprung der Replikation eines E. coli Plasmids enthält, kann die die DNA in ein E. coli eingebracht (transformiert) werden, wo es wie ein Plasmid repliziert wird und in relativ großen Mengen produziert werden kann. Diese Technik bedeutet, daß Gene eines Organismus, beispielsweise ein menschliches Gen, von Regulator-DNA eines anderen Organismusses, beispielsweise Bakterium E. coli, flankiert werden, was dazu führt, daß das menschliche Gen in einem E. coli unter gänzlich verschiedener regulatorischer Kontrolle aktiv wird. Wenn das betreffende Plasmid so konstruiert ist, daß es einen zweiten Ursprung der Replikation enthält, der die Replikation in einer anderen Wirtszelle erlaubt, beispielsweise einer Maus-Zellinie, so kann das Gen leicht in die zweite Wirtszelle eingebracht werden. Solch ein Molekül, das Ursprünge der Replikation für mehr als eine Wirtszelle enthält, wird üblicher Weise "shuttle vector" genannt. Plasmide sind normalerweise so konstruiert, daß sie selektionsfähige Marker enthalten, welche gewöhnlich Gene sind, die eine antibiotische Resistenz oder einen metabolischen Vorteil in der Wirtszelle bewirken. Diese Marker ermöglichen es solche Zellen, die das Plasmid enthalten, von Zellen zu unterscheiden, die kein Plasmid während der Transformation erhalten haben. Selektionsfähige Marker-Gene müssen durch entsprechende DNA-Sequenzen flankiert werden, die die Aktivierung der Gene in der entsprechenden Wirtszelle ermöglichen. Es ist möglich ein Plasmid in eine Wirtszelle einzubringen, wo das Plasmid nicht repliziert werden kann, sodaß nur solche Zellen den Selektionsprozess überleben, in denen das Plasmid in die chromosomale DNA eingebaut wurde. Ein solches Plasmid, das keinen funktionsfähigen Ursprung der Replikation enthält, wird "integrierendes Plasmid" genannt.
Eine Zelle stellt Polypeptides und Proteine her, indem es zunächst eine Kopie des Gens in Form einer Boten-RNA (engl. Messenger RNA) herstellt. Dieser Prozess wird als Transkription bezeichnet und steht unter der Kontrolle der oben erläuterten flankierenden DNA-Sequenzen. Der Biosynthese Apparat der Zelle liest (translatiert) dann die RNA- Sequenz in Blöcken von jeweils drei Nucleotiden. Diese Blöcke werden Codons genannt werden, welche bestimmten in eine Polypeptidkette einzubauenden Aminosäuren spezifisch zugeordnet sind. Der genetische Code und der Mechanismus der Proteinsynthese ist in allen Organismen sehr ähnlich, was es ermöglicht mittels molekularbiologischer Methoden Plasmidvektoren herzustellen, die die Produktion von rekombinanten Proteinen in vielen verschiedenen Wirtszellen erlauben unabhängig davon woher das entsprechende Gen ursprünglich stammte. Allerdings können verschiedene Wirtszellen Unterschiede in der Prozessierung der produzierten Proteine aufweisen, sodaß diese zum Beispiel unkorrekt gefaltet vorliegen oder durch proteolytische Enzyme gespalten werden. Insbesondere unterscheiden sich eukaryontische Zellen von Bakterien darin, dass sie häufig weitere chemische Strukturen an ihre Proteine binden, ein Vorgang, den man "posttranslationelle Modifikation" nennt. Solche an eukaryontische Proteine gebundenen chemischen Strukturen mögen verschiedene Arten von Oligosaccharid-Ketten, Glykolipide, Lipide, Sulphat- und Phosphat-Gruppen sein, die alle die physikalischen und biologischen Eigenschaften des Moleküls beeinflussen können. Übliche Effekt dieser posttranslationellen Modifikationen sind verstärkte Resistenz gegenüber Proteolyse, veränderte immunogene Eigenschaften, veränderter in vivo Abbau und veränderte Aufnahme durch unterschiedliche Zelltypen.
Posttranslationelle Modifikationen erfolgen häufig bei Proteinen, die von Zellen sekretiert werden oder auf die Oberfläche von Zellmebranen gebunden sind. Solche Proteine bilden eine Vielzahl von Varianten löslicher Proteine, die inter-zellulare Wechselwirkungen vermitteln, Blutproteine und Oberflächenrezeptoren von Zellen, und sind somit von beträchtlichem Interesse für die pharmazeutische Industrie sowohl als Zielmoleküle in der Wirkstoff-Forschung als auch für die direkte in vivo Verabreichung als therapeutisch wirksame Medikamente. Da die posttranslationelle Modifikation die biologische Aktivität solcher Proteine (zum Beispiel. Gewebe-Plasminogen-Aktivator (Ezzell, 1988, Nature 333, 383)) wesentlich ändern kann, bemüht sich die biotechnologische Industrie jedes Protein in einer Reihe von verschiedenen Modifikationen herzustellen, sei es, daß sie natürlich vorkommen oder neue Modifikationen sind, etwa als reduzierte Oligosaccharid-Ketten. Allerdings können posttranslationelle modifizierte Proteine nur in eukaryontischen Wirten gewonnen werden und nur wenige Arten von Eukaryonten werden dazu industriell verwendet. In Gewebe-Kulturen von Säugetier Zellen, wie zum Beispiel den Ovar-Zellen des Chinesischen Hamsters, ist es häufig möglich rekombinante Proteine mit posttranslationellen Modifikationen zu gewinnen, die denen der natürlichen Proteine ähnlich sind, was aber sehr kostenaufwendig ist, da diese Zellen häufig Serum-Komponenten in ihrem Wachstumsmedium erfordern, eine geringe Wachstumsrate haben und nur relativ schwierig in großen Fermentatoren kultiviert werden können. Demzufolge ist die Verwendung von einfachen Eukaryonten gebräuchlich, wie zum Beispiel mit Baculoviren infizierte Insekten- Zellen oder Hefezellen, die es ermöglichen Proteine, die einige posttranslationelle Modifikationen aufweisen, zu beträchtlich geringeren Kosten herzustellen. Jedoch ist kein Wirt für die Herstellung aller rekombinanter Proteine geeignet oder kann mehr als als einige wenige der Vielzahl von erwünschten post-translationalen Modifikation herstellen.
Dictyostelium hat einige Vorteile als Wirt zur Herstellung von kostengünstigen rekombinanten Proteinen mit post-translationalen Modifikationen (s. Review von Glenn & Williams, 1988, Australian J. Biotech. 1 (4), 46-56). Diese schließt die N-gebundene Glykosylierung ein, die von der in Säugetier Proteinen auftretende "high mannose form" (deut.: Mannosereiche Form) nicht unterschieden werden kann sowie eine grosse Anzahl anderer Strukturen wie zum Beispiel die Phosphatidylinositol Anker von Membranproteinen. Man kann die posttranslationalen Modifikationen, die durch Dictyostelium hergestellt werden, dadurch verändern, in dem man entweder Kulturen einer Reihe von Mutanten verwendet, die veränderte Glycan-Strukturen produzieren, verwendet oder indem man die Dictyostelium Zellen in unterschiedlichen Stadien des Lebencyclus erntet. Über Kultivierung und Genetik von Dictyostelium ist eine beträchtliche Menge wissenschaftlicher Literatur verfügbar (Spudich J. Ed. (1987) Methods in Cell Biology Vol. 28, Academic Press, London). Dictyostelium weist einige charakteristische Eigenschaften auf, die es für die Gewinnung von rekombinanten Proteinen in Fermentern geeignet machen. Dictyostelium besitzt eine vergleichbar kurze Generationszeit (4-10 stündige Zell-Cylen) und wächst in einem geeigneten Nährmedium zu einer hohen Zelldichte (ungefähr 50 Millionen Zellen pro ml Kultur). Für einige Verwendungszwecke ist die Fähigkeit des Dictyostelium, auf einem Bakterienrasen in einem billigen Nährmedium zu wachsen, eine bemerkenswert einfache und billige Kultivierungstechnik verglichen mit Säugetier- oder Insektengewebekulturen.
Dictyostelium Stämme besitzt mindestens dreizehn verschiedene Plasmide (Farrar & Williams (1988) Trends in Genetics 4, 343-348), jedoch wurden nur die Plasmide Ddp1, Ddp2 und pDG1 im Detail studiert. Plasmid pDG1 ist sehr unstabil, wenn es in E. coli geklont wird (Orii et al. (1989) Nucleic Acids Research 17, 1395-1408), weshalb die meisten Konstruktionen von shuttle Vectoren Sequencen von entweder Ddp1 oder Ddp2 verwendet haben. Plasmid Ddp1 ist 12.3 Kb groß, aber Ahern et al. (Nucleic Acids Research (1988) 16, 6825-6837) zeigten, daß ein Vectorkonstrukt bestehend aus 2.2 Kb des Ddp1 Plasmids sowie einem selektionsfähigen Resistenzmarker (G418) ausreichte, um in D. discoideum extrachromosomal zu replizieren. Allerdings erniedrigte sich die Kopienzahl pro Zelle dieses verkürzten Plasmids von der 150 Charakteristik des parentalen Plasmids zu nur 10-15 Kopien pro Zelle. Es ist anzunehmen, dass dieses Plasmid aufgrund der gegebenen niedrigen Kopienzahl bei der Zellteilung nicht effizient seggregiert und so in der Abwesenheit von kontinuierlicher Selektion durch das Antibiotikum G418 instabil ist. Die Einfügung von zusätzlicher Dictyostelium DNA in solche Plasmide, die einen von Plasmid Ddp1 abgeleiteten Ursprung der Replikation aufweisen, verhindert deren stabile extrachromosomale Replikation (Gurniak et al., (1990) Current Genetics 17, 321-325.) und daher unbrauchbar für die Verwendung in der biotechnologischen Industrie.
Die praktische Anwendung von Plasmiden, die auf Sequenzbereichen des Plasmids Ddp2 aufgebaut sind, ist durch technische Schwierigkeiten begrenzt. Die Mehrzahl der in der Molekularbiologie angewendeten Klonierungs Techniken sind auf die Anwendung im E. coli Bakterien zugeschnitten. Für die gentechnische Manipulation von Dictyostelium DNA muss diese daher notwendiger Weise in einen in E. coli replizierenden Vector geclont werden. Infolgedessen hat sich die Forschung an Ddp2 auf die Konstruktion von recombinanten "shuttle Vectoren" konzentriert, die Sequenzen enthalten, die eine Replication sowohl in E. coli als auch Dictyostelium spp. ermöglicht. Plasmid pMUW111 repräsentiert einen solchen von den Erfindern konstruierten shuttle Vector (Fig. 4), der ein 4.139 Kb HindIII-ScaI Restriktions Fragment von Ddp2 enthält. Dies ist nahe an der Minimalmenge von Ddp2, die eine extrachromosomale Replikation in Wildtypstämmen von Dictyostelium aufrechterhalten kann. Leiting und Noegel (1988, Plasmid 20, 241-248) haben ein ähnliches 4.0 Kb Fragment des Ddp2 Plasmids verwendet, wobei ungefähr 300bp nahe der XhoI Restriktionsstelle deletiert wurden, um einen 9.6 Kb shuttle Vektor herzustellen, der pnDe1 genannt wurde. Obwohl die shuttle Vektoren pMUW111 und pnDE1 nur Minimalsektionen für die extrachromosomale Replikation von Ddp2 enthalten ergeben sich mit beiden Vektoren Probleme mit deren relativen Instabilität in E. coli Klonierungen. Dies ist in Übereinstimmung mit der beobachteten Instabilität von Sequenzbereichen des Ddp2 Plasmids in E. coli. Das Problem kann durch die Verwendung von Wirtsstämmen gemildert werden, die keine Exonuklease I besitzen und die eine niedere Plasmid-Kopienzahl aufweisen (z. B. Strang CES 201), jedoch bereiten solche Wirte häufig Probleme in der Herstellung genügender Plasmid DNA für Gen Klonieriungs-Experimente oder für eine anschliessende Transformation von Dictyostelium.
Die Notwendigkeit, Stücke von Ddp2 DNA von ungefähr 4 Kb Länge zu verwenden, um shuttle Vektoren herzustellen führt auch zu Problemen hinsichtlich der Endgröße des Plasmids. Der shuttle Vektor muß selektionsfähige Marker für beide Wirte enthalten zusammen mit entsprechenden Promoter und Endsequenzen. Diese Sequenzen machen nahezu 50% der Größe der Plasmide pMUW111 und pnDe1 aus. Um praktischen Wert zu haben muß sich in den shuttle Vektor zusätzliche DNA einbauen lassen, welche das in Dictyostelium zu exprimierende Gen sowie entsprechende Kontrollsequenzen enthält. Es ist anzunehmen, dass diese zusätzlichen Sequenzen bis zu 2 Kb DNA ausmachen, wodurch die ganze Plasmid-Größe ungefähr 12 Kb würde. Bei einer Grösse von mehr als 10 Kb nimmt die Stabilität des Plasmids ab, ein Faktor von beträchtlicher Bedeutung für die kommerzielle Produktion von rekombinanten Proteinen, bei der um eine Verunreinigung des Produktes zu vermeiden, die verantwortlichen Behörden es nicht erlauben, zur Erhaltung des Plasmids während eines Zellwachstums über längere Perioden Antibiotika Selektion vorzunehmen. Mit zunehmender Grösse des Plasmids ergibt sich zudem die Schwierigkeit, daß weniger Restriktionsenzyme zur Auswahl stehen, die das Plasmid an nur einer Stelle schneiden, wobei gerade diese für genetische Manupilationen wichtige Stellen darstellen.
Shuttle Vektoren, die in E. coli leicht manipuliert und zurück in Dictyostelium spp. übertragen werden können sind eine wichtige Vorraussetzung, um das Potential von Dictyostelium in der Biotechnologie ausschöpfen zu können. Die Erfinder hierin haben Mittel entdeckt, durch die Sequenzabschnitte des Ddp2 enthaltende Vektoren mit einer Grösse von weniger als 4 Kb hergestellt werden können.
Die Erfinder hier haben die gesamte Nucleotid-Sequenz des Plasmids Ddp2 aufgeklärt und herausgefunden, daß ein Teil dieser Sequenz ein bestimmtes Gen codiert. Die Erfinder bezeichnen dieses Gen als das Rep Gen. Die Erfinder haben gezeigt, daß die Gegenwart eines Polypeptides, das durch das Rep Gen codiert ist, wesentlich ist für die extrachromosomale Replikation des Ddp2 Plasmids.

Offenlegung der Erfindung

Demzufolge ist ein erster Aspekt der Erfindung hierin die Angabe eines Rep Polypeptids, das die extrachromosomale Replikation eines rekombinanten Plasmids in Dictyostelium spp. ermöglicht, wobei das rekombinante Plasmid einen von den Plasmiden Ddp2 oder pDG1 abgeleiteten Ursprung der Replikation aufweist, dem rekombinanten Plasmid aber Gene, die für die extrachromosomale Replikation in Wildtyp Dictyostelium spp. notwendig sind, fehlen. Die Aminosäuresequenz von besagtem Rep Polypeptid entspricht weitestgehend der in Fig. 2.
Das Polypeptid kann durch ein DNA-Sequenz codiert sein, wie in Fig. 1 von Nucleotid 2378 bis Nucleotid 5038 gezeigt.
In einem zweiten Aspekt sieht die gegenwärtige Erfindung einen rekombinanten Plasmid Vektor vor, der einen von Plasmid Ddp2 und pDG1 abeleiteten Ursprung der Replikation aufweist sowie mindestens eine heterologe DNA-Sequenz, wobei diese heterologe DNA-Sequenz eine für ein gewünschtes Polypeptide codierende Sequenz aufweist sowie eine Promotor Sequenz, welche die Expression des genannten gewünschten Polypeptides kontrolliert. Besagter Plasmid Vector ist desweiteren dadurch gekennzeichnet, dass diesem DNA-Sequenzen, die ein für die extrachromosomale Replikation in Wildtyp Dictyostelium spp benötigtes Polypeptid codieren, fehlen.
In einem dritten Aspekl. betrifft die Erfindung einen rekombinanten Plamid Vektor, der eine DNA Sequenz enthält, die im wesentlichen der in Fig. 1 aufgeführten Sequenz von Nukleotid 1 bis Nukleotid 2436 oder eines Teiles davon entspricht, wobei diese Sequenz einen funktionsfähigen Ursprung der Replikation aufweist, aber funktionsfähige Gene, die eine extrachromosomale Replikation in Wildtyp Dictyostelium spp ermöglichen, fehlen.
In einem vierten Aspekt betrifft die gegenwärtige Erfindung einen rekombinanten Plasmid Vektor, der eine DNA Sequenz enthält, die im wesentlichen der Fig. 1 von Nucleotid 1153 bis Nucleotid 1775 aufgezeigten oder eines Teiles davon entspricht, wobei diese einen funktionsfähigen Ursprung der Replikation einschließt, aber funktionsfähige Gene, die eine extrachromosomale Replikation in Wildtyp Dictyostelium spp ermöglichen, fehlen.
In einem fünften Aspekt betrifft die gegenwärtige Erfindung einen rekombinanten Plasmid Vektor, der eine DNA Sequenz enthält, die im wesentlichen der in Fig. 1 von Nucleotid 1 bis Nucleotid 3241 dargestellten oder eines Teiles davon entspricht, wobei diese einen funktionsfähigen Ursprung der Replikation einschließt, aber funktionsfähige Gene, die eine extrachromosomale Replikation in Wildtyp Dictyostelium spp ermöglichen, fehlen.
Gegenwärtig wird ein rekombinanter Plasmid Vektor bevorzugt, der für gewünschtes Polypeptid codierende heterologe DNA Sequenz(en) enthält, eine die Expression der heterologen DNA Sequenz(en) kontrollierende Promotor Sequenz aufweist sowie vorzugsweise einen Sequenz(en), die einen selektionsfähigen Marker einschliesst.
In einer vorzugsweisen Anwendung der gegenwärtigen Erfindung schließt der rekombinante Plasmid Vektor eine DNA Sequenz ein, die ein gewünschtes Polypeptid codiert sowie Regulator Sequenzen für die Sekretion des Polypeptides.
In einer weiteren vorzugsweisen Anwendung der gegenwärtigen Erfindung schliesst der rekombinante Plasmid Vektor eine Expressions Kassette ein, die eine von dem Dictyostelium Actin 15 Gen abgeleitete Promotor Sequenz aufweist, desweiteren eine DNA Sequenz aufweist, die die Sekretions Signalpeptid Sequenz des für das Protein PsA codierenden D 19 Gens enthält sowie eine von dem Actin 15 abgeleitete DNA-Sequenz für ein RNA Polyadenylierung Signal.
In einer weiteren vorzugsweisen Anwendung der gegenwärtigen Erfindung weist der rekombinante Vector die Sequenz des Plasmids pMUW102, des Plasmids pMUW130 oder des Plasmids pMUW1530 auf sowie eine für ein gewünschtes Polypeptid codierende heterologe DNA Sequenz zusammen mit DNA-Sequenzen, die die Expression der Sequenz zulassen, die das gewünschte Polypeptid codieren.
In einem sechsten Aspekt betrifft die vorliegende Erfindung einen rekombinanten Stamm von Dictyostelium spp, dadurch gekennzeichnet, dass dieser ein rekombinantes Plasmid aufweist, welches einen von Plasmid Ddp2 oder Plasmid pDG1 abgeleiteten Ursprung der Replikation besitzt, dem rekombinanten Plasmid jedoch eine funktionsfähiges Rep Gen fehlt, das für die extrachromosomale Replikation in Wildtyp Dictyostelium spp erforderlich ist und wobei desweiteren der genannte rekombinante Stamm ein Gen enthält, das ein Rep Polypeptid codiert, welches die extrachromosomale Replikation von besagtem rekombinanten Plasmid ermöglicht.
In einer bevorzugten Anwendung der vorliegenden Erfindung weist das rekombinante Plasmid einen Ursprung der Replikation ein, der vom Plasmid Ddp2 abgeleitet ist, und entspricht bevorzugter Weise einem der in den Aspekten zwei bis fünf der vorliegenden Erfindung aufgeführten Plasmide.
Das Gen, welches das Polypeptid codiert, das die extrachromosomale Replikation des rekombinanten Plamids ermöglicht kann in einem Chromosom des rekombinanten Stammes von Dictyostelium integriert sein oder auf einem zweiten Plasmid enthalten sein, wobei dem zweiten Plasmid ein von Plasmid Ddp2 abgeleitetem Ursprung de Replikation fehlt.
Es ist jedoch gegenwärtig bevorzugt, daß das Rep Gen in einem Chromosom des rekombinanten Stammes von Dictyostelium integriert vorliegt.
In einer weiteren vorzugsweisen Anwendung der vorliegenden Erfindung weist ein Chromosom des rekombinanten Stammes von Dictyostelium eine Sequenz auf, die im wesentlichen der in Fig. 1 von Nucleotid 1885 bis Nucleotid 5292 gezeigten Sequenz entspricht.
In einem siebten Aspekt betrifft die vorliegende Erfindung eine Methode zur Herstellung eines gewünschten Polypeptides, die folgende Stufen umfaßt:
1. Die Transformation eines rekombinanten Stammes von Dictyostelium spp mit einem rekombinanten Plasmid Vector, der eine DNA-Sequenz enthält, die das gewünschte Polypeptid codiert sowie des weiteren Sequenzen, die die Expression der das gewünschte Polypeptid codierenden DNA Sequenzen ermöglicht.
2. Die Kultivierung des rekombinanten Stammes von Dictyostelium unter Bedingungen, die die Expression der das gewünschte Polypeptid codierenden DNA Sequenz erlauben und es desweiteren erlauben, dass gewünschte Polypeptid entweder in zellgebundener oder sekretierter Form herzustellen;
3. Die Gewinnung des gewünschten Polypeptides, dadurch gekennzeichnet, daß der rekombinate Plasmid Vector einen von Plasmid Ddp2 oder Plasmid pDG1 abgeleiteten Ursprung der Replikation enthält, dem rekombinanten Plasmid aber funktionsfähige, für eine extrachromosomale Replikation in Wildtyp Dictyostelium spp benötigte Gene fehlen und des weiteren dadurch gekennzeichnet, dass der rekombinante Stamm von Dictyostelium ein Gen enthält, welches für ein Rep Polypeptide codiert, das die extrachromosomale Replikation des rekombinanten Plasmids ermöglicht.
Der Ausdruck "zellgebundene Form" meint, daß Proteine entweder im Innern der Zelle oder auf der Zellmembran lokalisiert vorliegen.
In einer bevorzugten Anwendung dieses Aspektes der vorliegenden Erfindung ist das Gen, das ein die extrachromosomale Replikation des rekombinanten Plasmids ermöglichendes Polypeptid codiert, in einem Chromosom des rekombinanten Stamms integriert. Alternativ kann das Gen in einem zweiten rekombinanten Plasmid enthalten sein, das in dem rekombinanten Stamm vorhanden ist.
In einem achten Aspekt besteht die vorliegende Erfindung in einem DNA Molekül, das eine Nucleotid Sequenz aufweist, die ein Polypeptid codiert gemäß der Erfindung und das fähig ist Dictyostelium Stämme zu transformieren, so daß rekombinante Plasmid Vectoren der vorliegenden Erfindung zur extrachromosomalen Replikation in dem transformierten Dictyostelium Stamm fähig sind.
In einer bevorzugten Ausführung dieses Aspektes der vorliegenden Erfindung enthält das DNA-Molekül eine Sequenz, die im wesentlichen der in Fig. 1 von Nucleotid 2378 bis Nucleotid 5038 gezeigten oder eines Teiles davon entspricht.
Wie oben ausgeführt betrifft die vorliegende Erfindung die Konstruktion von extrachromosomalen Plasmid Vectoren für Dictyostelium, wobei viel kleinere Abschnitte des Plasmids Ddp2 verwendet werden als das bisher möglich war. Die vorliegende Erfindung macht die Herstellung von Plasmid Vektoren möglich, die einen von Ddp2 abgeleiteten Ursprung der Replikation enthalten, wobei dieser auf einem Abschnitt der Ddp2 DNA von weniger als 3.0 Kb enthalten ist, wobei dabei Bereiche der Ddp2 DNA ausschlossen sind, die Gene für Polypeptide enthalten, welche für eine Replikation wesentlich sind sowie DNA Sequenzen, die bei Klonierung in E. coli Instabilität aufweisen. Die Replikation solcher Plasmide kann dadurch erzielt werden, indem man sie in rekombinanten Stämmen von Dictyostelium kloniert, wo Polypeptide, die man für die Plasmid Replikation benötigt werden durch Gene codiert werden, die in der chromosomalen DNA der Wirtszelle integriert vorliegen oder alternativ in einen anderen kompatiblen Plasmid Vektor enthalten sind. Die vorliegende Erfindung ermöglicht die Herstellung einer grossem Vielfalt von Plasmid Vektoren, die mit im Fachgebiet üblichen Methoden hergestellt werden können und, wie hier offenbart, Plasmide einschließen, die zur Expression von rekombinanten Protein Produkten in Dictyostelium spp verwendet werden können.
Die vorliegende Erfindung umfaßt ferner den Gebrauch dieser rekombinanten Dictyostelium Stämme für die Stabilerhaltung von rekombinanten, von dem Plasmid Ddp2 abgeleiteten Plasmiden, denen aber funktionsfähige Gene für Replikations-Proteine fehlen. Die Stabilerhaltung von rekombinanten Plasmiden in Wirten, die genetisch so modifiziert wurden, so dass diese für die Plasmid Replikation benötigte Polypeptide herstellen, ist wahrscheinlich ein entscheidender Faktor in der Herstellung von rekombinanten Proteinen unter Verwendung von Dictyostelium spp.

Kurze Beschreibung der Zeichnungen

Dami die vorliegende Erfindung besser verstanden werden kann, werden hier besondere Formen davon beschrieben mit Verweis auf die folgenden Beispiele und begleitenden Figuren, bei denen Fig. 1 die Nucleotid Sequenz von Dityostelium Plasmid Ddp2 ist. Die Sequenz eines 1DNA Stranges ist gezeigt, im Uhrzeigersinn numeriert von der Schnittstelle des Restrictionsenzyms SalI ausgehend. Die Position der Erkennungssequenzen der Restriktionsenzyme SalI, HindIII, BglII, NdeI, ClaI, EcoRI, EcoRV, PstI, BclI, XbaI, XhoI, AccI, HindII und ScaI sind angezeigt. START und STOP zeigt die Postion des ersten beziehungsweise letzten Codons des Rep Gens an.
Schlüssel: A = Adenin, C = Cytosin, G = Guanin, T = Thymin;
Fig. 2 ist die Aminosäure Sequenz des Polypeptides, das durch das von der DNA Sequenz des Plasmids Ddp2 abgeleiteten Rep Gen codiert ist. Die Nucleotid Sequenz des codierenden Strangs des Rep (Jens, im Uhrzeigersinn numeriert von der Schnittstelle des SalI Restriktions Enzyms aus, ist in gleicher Linie begleitet von der entsprechenden Aminosäuresequenz, wie sie nach dem Standard des Genetischen Codes vorherzusagen ist.
Schlüssel: A = Adenin C = Cytosin. G = Guanin. T = Thymin.
a = Alanin. c = Cystein. d = Asparaginsäure.
e = Glutaminsäure. f = Phenylalanin.
g = Glycin. h = Histidin. i = Isoleucin
k = Lysin. l = Leucin. m = Methionin.
n = Asparagin. p = Prolin.
q = Glutamin. r = Arginin. s = = Serin.
t = Threonin. v = Valin, w = Tryptophan;
Fig. 3 ist eine schematische Repräsentation der Haupt-Strukturmerkmale von Ddp2 zusammen mit eine Karte der Schnittstellen einiger Restriktionsenzyme;
Fig. 4 ist eine schematische Repräsentation der Konstruktion des Plasmid pMUW111;
Fig. 5 ist eine schematische Repräsentation der Konstruktion des Plasmids pMUW110;
Fig. 6 ist eine schematische Repräsentation der Konstruktion des Plasmids pMUW102;
Fig. 7 ist eine schematische Repräsentation der Konstruktion des Plasmids pMUW130;
Fig. 8 ist eine schematische Repräsentation, die die Ddp2 Sequenzen, die für die Konstruktion der Plasmide pMUW111, pMUW102, pMUW110 und pMUW130 verwendet werden, zusammenfaßt;
Fig. 9 ist eine schematische Repräsentation der Konstruktion der shuttle Vetoren pMUW1530 und pMUW1580;
Fig. 10 ist die Nucleotid Sequenz des shuttle Vectors pMUW1530. Die Sequenz eines DNA Stranges ist gezeigt, im gegenläufigen Uhrzeigersinn numeriert von der Schnittstelle des Restriktionsenzyms ausgehend. Die Position der Erkennungssequenzen der Restriktionsenzyme ClaI, ScaI, BamHI, BglII und NdeI sind angezeigt.
Schlüssel: A = Adenin. C = Cytosin. G = Guanin. T = Thymin;
Fig. 11 ist eine schematische Repräsentation der Konstruktion des Promotors und von Abschnitten der Sekretions Signalsequenz auf einer Expressions Kassette in Plasmid pMUW1594;
Fig. 12 ist eine schematische Repräsentation der Klonierung der Polyadenylierungs- Sequenz des Dictyostelium Actin 15 Gens in das Plasmid pMUW1560;
Fig. 13 ist eine schematische Repräsentation der Konstruktion der Expressions Kassette in pMUW1621;
Fig. 14 ist eine schematische Repräsentation der Konstruktion eines Expressions Vectors pMUW1630 und pMUW1633 durch Einfügung der Expressions Kassette in den shuttle VectorpMUW1580; und
Fig. 15 ist die Nucleotid Sequenz des Experessions Vectors pMUW1630. Die Sequenz eines DNA Stranges ist gezeigt, entgegen dem Uhrzeigersinn numeriert von der Schnittstelle des Restriktionsenzyms ClaI ausgehend. Die Positionen der Schnittstellen der Restriktionsenzyme ClaI, ScaI, NsiI, HindIII, SmaI und KpnI sind angezeigt. START bezeichnet die Stelle des ersten Codons des Sekretions Signalpeptides in der Expressions Kassette.
Schlüssel: A = Adenin,. C = Cytosin. G = Guanin. T = ihymin.

Beste Art, die Erfindung auszuführen

Die Erfinder hier haben zum ersten Mal die volle Nucleotid Sequenz des Dictyostelium Plasmids Ddp2 festgestellt, wie in Fig. 1 gezeigt. Die Nucleotid Sequenz ist numeriert im Uhrzeigersinn entlang dem DNA Ringmolekül, angefangen an der einzigen Schnittstelle des Restriktionsenzyms SalI. Detaillierte Prüfung der DNA Sequenz von Ddp2 erlaubte verschiedene funktionelle Regionen des Plasmids zu unterscheiden, wie in Fig. 3 gezeigt, und Regionen zu identifizieren, die wahrscheinlich bei Klonierung in E. coli unstabil sind. Die Aufklärung dieser verschiedenen funktionellen Regionen erlaubte den Erfindern eine Reihe von technischen Problemen zu überwinden, die bisher die Verwendung von extrachromosomalen Vektoren in Dictyostelium begrenzt hatten.
Die DNA Sequenz von Ddp2 zwischen Nucleotid 2378 und 5038 codiert ein Gen, das hier als Rep beschrieben wird. Dieser Abschnitt von Ddp2 enthält einen großen "offenen Leserahmen", bei dem einer der sechs möglichen Wege, die Tripletts von Nucleotiden nach dem genetischen Code (bekannt als Codons) zu lesen, einen langen Abschnitt ergibt ohne das eines derjenigen codons auftritt, welche als Stoppsignale für die Translation von Proteinen agieren. Solch ein "offener Leserahmen " zusammen mit dem Auftreten von flankierenden Sequenzen, die den Promotor- und Polyadenylierungs-Signalen von bisher beschriebenen Dictyostelium Genen (Kimmel & Firtel, 1982 in The Development of Dictyostelium discoideum, Academic Press., New York, pp 234-324) entsprechen, ist ein starkes Anzeichen dafür, daß das Rep Gen in RNA transkribiert und in ein Polypeptid translatiert werden kann, welches die in Fig. 2 gezeigten 887 Aminosäuren enthält. Ein weiteres Argument dafür, daß das Rep Gen translatiert in ein Polypeptid translatiert wird, ist die Unfähigkeit von Plasmiden, welche mit Unterbrechungen in dem Rep Gen konstruiert wurden, zum Beispiel pMUW102, in Wildtyp Stämmen von Dictyostelium discoideum zu replizieren. Die RNA und das Polypeptid Produkt des Rep Gens sind noch nicht entdeckt worden und es wird angenommen, dass nur geringe Mengen hergestellt werden, um die Initiation der Plasmid Replikation durch jene Wirts Enzyme, die normaler Weise chromosomale DNA replizieren, positiv zu regulieren. Es sollte jedoch wahrgenommen werden, daß entweder die messenger RNA oder die translatierten Polypeptide, die von dem Rep Gen abgeleitet wurden, durch den zellulären Biosyntheseapperat so prozessiert werden könnte, dass eine oder mehrere kurze Polypeptidketten entstehen. Es ist zudem wahrscheinlich, daß die Polypeptide weitere Abschnitte enthalten, die die Plasmid Kopienzahl negativ regulieren. Keine dieser Unklarheiten vermindern die primäre Entdeckung, daß mindestens Teile des offenen Leserahmens für ein für die Replikation von Ddp2 wesentliches Polypeptid codieren. Diese Feststellung erklärt die schon früher erkannte Notwendigkeit, daß shuttle Vectoren einen großen Abschnitt von Ddp2 DNA benötigen, da solche Vectoren sowohl den Ursprung der Replikation als auch zusätzliche 2.66 Kilobasenpaare für das Rep Gen zusammen mit flankierenden Kontroll-Sequenzen enthalten müssen.
Plasmid Vectoren, die auf dem Plasmid Ddp2 basieren, müssen DNA vom Abschnitt des Ddp2 zwischen der Schnittstelle des HindIII Restrictionsenzyms bei 1153 Basenpaaren und der Schnittstelle des BgIII Restriktionsenzym bei 1885 Basenpaaren enthalten.
Dieses zeigt sich durch die Unfähigkeit von Plasmiden in Wildtyp Stämmen von Dictyostelium zu replizieren, wenn ihnen dieser DNA Abschnitt fehlt, zum Beispiel pMUW110 (Fig. 5). Plasmid pMUW110 enthält das komplette Rep Gen sowie zuzüglich flankierende Sequenzen einschließlich der Polyadenylierungs Sequenzen und weiterer 483 Nucleotide, die die Promotor Region umfassen. Somit enthält pMUW110 die Sequenzen, die für die Herstellung des Polypeptides notwendig sind, das für die Replikation vorhanden sein muß, es fehlt ihm aber einen funktionsfähgiger Ursprung der Replikation. Daraus folgt, dass ein Ddp2 Ursprung der Replikation oder assoziierte Kontroll Sequenzen vor der Schnittstelle des BgIII Restriktionenzyms bei Basenpaar 1885 liegen müssen. Diese Region von Ddp2 ist in Plamid pMUW102 enthalten, welcher den Abschnitt von Ddp2 zwischen der Schnittstelle von Restriktionsenzym HindIII bei Pasenpaar 1153 und der Schnittstelle des Restriktionsenzyms XhoI bei Basenpaar 3242 aufweist (Fig. 6). Dem Plasmid pMUW102 fehlt jedoch ein funktionsfähiges Rep Gen, wodurch es nicht in der Lage ist in Wildtyp Strängen von Dictyostelium zu replizieren. Die Gegenwart eines funktionsfähigen Ursprungs der Replikation in Plasmid pMUW102 wird demonstriert durch die Transformation von Dictyostelium Stämmen zusammen mit dem Plasmid pMUW110, welches das notwendige Replikations Polypeptid des Ddp2 Rep Gens bereitstellt. Die experimentellen Resultate der Erfinder hierin zeigen eindeutig, daß das Plasmid pMUW110 in die chromosomale DNA integriert wird um einen stabillen rekombinanten Stamm von Diclyostelium zu bilden und, in derselben Zelle das Plasmid pMUW102 dauerhaft als ein extrachromosomales Plasmid erhalten bleibt. Diese Demonstration eines extrachromosomalen Plasmids, das einen Ursprung der Replikation von Plasmid Ddp2 enthält und seine Erhaltung in einem Dictyostelium Stamm aufgrund einer chromosomalen DNA, die ein Rep Gen enthält, das Polypeptide codiert, die notwendig für die Plasmid Replikation sind, bedeutet einen signifikanten technischen Fortschritt. Es ist für jemanden, der die Technik beherrscht, offensichtlich, daß ähnliche Techniken für die Konstruktion von einer Reihe von Plasmid Vektoren für Dictyostelium verwendet werden können.
Es ist angemessen, kurz die Mechanismen zur Selektion von Zellen zu untersuchen, die erfolgreich sowohl mit pMUW102 als auch mit pMUW110 transformiert wurden. Beide Vektoren enthalten einen sei ektierfähigen Marker, der eine Resistenz gegen das Antibioticum G418 bewirkt, jedoch konnten andere Gene verwendet werden, um dieselbe Wirkung zu erreichen. Tatsächlich haben die Erfinder hier ein anderes Resistenzgen Bleomycin entwickelt zur Verwendung als selektierfähigen Marker in Dictyostelium. Das G418 Resistenzgen ist under der Kontrolle des Dictyostelium Actin 6 Promotors und des Actin 83'- Polyadenylisierungs Signals um sicherzustellen, das es in Dictyostelium Zellen exprimiert wird, um eine Methode zu erstellen, die wenigen Zellen, die die Plasmid DNA aufnehmen, zu selektieren. Das Plasmid pMUW110, dem ein Ursprung der Replikation fehlt, kann nur in den wenigen Zellen erhalten bleiben, in denen das Plasmid in die chromosomale DNA intergriert wird. Jedwede Zellen, die nur mit Plasmid pMUW102 transformiert werden, können nur resistent gegen G418 sein, wenn das Plasmid in die chromosomale DNA integriert wird, da dieses Plasmid nicht replizieren kann ohne das Polypeptid, dass durch das Rep Gen codiert wird. Jedoch können einige der Zellen, die beide Plasmide erhalten, das Plasmid pMUW110 in die chromosomale DNA integriert erhalten in einer Art und Weise, die die Funktion des Rep Genes bewahrt, sodass diese Zellen zur Erhaltung von vielen extrachromosomalen Kopien des Plasmids pMUW102 fähig sind. Sind die Zellen, die mit beiden Plasmiden pMUW102 und pMUW110 transformiert wurden, einmal selektiert durch Resistenz gegenüber G418, können sie stabil gehalten werden in der Abwesenheit von Antibiotica.
Plasmid pMUW102 enthält 2089 Basenpaare of Ddp2; ein beträchtlich kleinerer Abschnitt von Ddp2, der der extrachromosomalen Replikation fähig ist, als bisher bekannt. Diese Sequenz wurde wesentlich verkürzt durch Entfernung von Ddp2 DNA Sequenzen, die nicht wesentlich sind für die Replikation von Plasmid pMUW102 in rekombinanten Stämmen von Dictyostelium. Die Ergebnisse mit Plasmid pMUW130 bestätigen, daß all die DNA Sequenzen, die für eine stabile extrchromosomale Replikation bei hoher Kopienzahl notwendig sind, in einem 622 Basenpaar HindIII-ClaI Fragment von Ddp2 enthalten sind. Im Lichte der gegenwärtigen Kenntnis, wie sie hier offenbart wird, ist es auch relativ einfach, die wesentlichen Sequenzen innerhalb des Abschnittes von Ddp2 zwischen der HindIII Restriktionsenzym Schnittstelle bei 1153 Basenpaaren und der ClaI Restriktionsenzym Schnittstelle bei 1885 Basenpaaren zu ermitteln, indem man Standard molekularbiologische Techniken verwendet, wie zum Beispiel Deletionen und Insertionen. Experimente, um den Minimalabschnitt der Ddp2 DNA Sequenz zu bestimmen, der für die Herstellung des Plasmid Vectors notwendig ist, wurden ausgeführt. Mehrere Kopien einer TGTCATGACA Sequenz sind wesentlich für die Funktionsfähigkeit des Ddp2 Ursprungs der Replikation.
Die Verwendung von kleineren Abschnitten des Ddp2 für die Herstellung von Vectoren als früher möglich erlaubt den Ausschluß einiger der Sequenzen, die wahrscheinlich für die Plasmid-Instabilität in E. coli verantwortlich sind. Plasmid pMUW130 enthält nur eine Kopie von Sequenzen in dem 501 Basenpaar inverted repeat (dt.: umgekehrte Wiederholungssequenz) von Ddp2 und enthält nicht die langen Strecken von Polyadenin oder Polythymidin, die sich zwischen dem Ende des offenen Leserahmens und der Schnittstelle für das Restriktionsenzym SalI befinden. Solche inverted repeats und Polyadenin oder Polythymidin Sequenzen sind bekannter Weise instabil in E. coli. Plasmid pMUW130 schließt auch die (GATGAA)11 Wiederholung aus, die sich am Ende des Rep Gen befindet, und das ebenso wahrscheinlich in E. coli instabil ist. Aus diesem Grunde scheinen die kleineren Abschnitte von Ddp2, die zur Herstellung von Plasmid Vectoren im Sinne dieser Erfindung verwendet werden, weniger Stabilitäts-Probleme in E. coli zu haben, als früher bei der Verwendung größerer Abschnitte von Ddp2 DNA festgestellt wurde.
Das integrierende Plasmid pMUW110 enthält all die Information, die für die kontrollierte Expression von Ddp2 Rep Gen notwendig ist, welche benötigt wird, um die Kopienzahl von Plasmid pMUW102 aufrecht zu erhalten. Diese Kontrolle der Plasmid- Kopienzahl konnte nicht vorhergesehen werden, da keine augenscheinliche direkte Verbindung zwischen der Zahl von Kopien des Plasmids und des Rep Gen wie im Original Plasmid vorliegt. Man nimmt an, daß diese Kontrolle der Kopienzahl wahrscheinlich durch einen autoregulatorischen Meschanismus hervorgerufen wird, wobei das Produkt des Rep Gens die weitere Trankription vom Rep Gen unterdrückt und so eine konstante zelluläre Konzentration des Polypeptides aufrechterhalten wird, welches die Plasmid-Replikation reguliert. Die Lokalisation der Promotor Sequenzen zum Abschnitt der Ddp2 DNA zwischen der BgIII Restriktionsenzym Schnittstelle und dem Start des Rep Gens, wie hier offenbart, erlaubt zukünftige Experimente, um den Regulationsmechanismus zu bestimmen, der die Transkription des offenen Leserahmens und die Kontrolle der Plasmid-Kopienzahl bestimmt. Man kann voraussehen, daß dieses Vorhaben zu einer experimentellen Kontrolle der Plasmid- Replikation und Kopienzahl führt, und zwar durch angemessene Modifikation oder Duplizierung der Kontrollsequenzen.
In den hier beschriebenen Experimenten wurde das Plasmid pMUW110 stabil in die chromosomale DNA von Dictyostelium integriert, indem derselbe selektive Marker, G418 Resistenz, wie auf dem extrachromosomalen Plasmid pMUW102 vorhanden, verwendet wurde. Allerdings wäre es vorteilhaft einen anderen selektiven Marker auf dem invtegrierenden Vector zu verwenden von dem, der für das extrachromosomale Plasmid verwendet wird. Die Erfinder hier haben ein Thymidylat-Synthase Gen entwickelt als einen zweiten Marker für Selektionen in einem Dictyostelium discoideum Stamm, der Thymidin nicht synthetisieren kann (Chang et al., 1989, Nucleic Acids Research 17,3655-3661). Die Thymidylat Synthase Selektion hat den Vorteil für biotechnologische Anwendungen darin, daß die Selektion in der Abwesenheit von irgendwelchem Antibiotikum aufrechterhalten wird. Offensichtlich kann jedwelche Kombination von selektionsfähigen Markern auf den integrierenden oder extrachromosomalen Vektoren verwendet werden, aber die vorzuziehende Kombination besteht darin, den Thymidylat Synthase Marker auf dem extrachromosomalen Plasmid zu haben und diesen in dem Dictyostelium Stamm zu halten, dem das Enzym fehlt. Fies bedeutet, daß in Abwesenheit von irgendeiner antibiotischen Selektion, jede Wirts Zelle, die entweder das extrachromosomale Plasmid oder den funktionsfähigen integrierten Vektor verliert, unfähig wäre zu wachsen, da jede Zelle, der die Produktion des die Plasmid Replikation ermöglichenden Polypeptids fehlt, auch die Funktionen fehlen würden, die auf dem extrachromosomalen Plasmid codiert sind.
Beispiele für die Anwendung der Erfindung sind die Konstruktion einer Reihe von shuttle Vektoren und die Produktion eines rekombinanten Proteins in Dictyostelium discoideum. In den neuen shuttle Vektoren pMUW1530, pMUW1570 und pMUW1580 wurde der Ddp2 Ursprung der Replikation auf einem 600 Basenpaaren XbaI-ClaI Restriktionsfragment (1175-1775 bp) von Ddp2 in ein kleines E. coli Plasmid (pMUW1510) inkoorperiert, welches eine Sequenz aufweist, die nahe dem minimalen Betrag der Sequenz von pBR322 entspricht, die für die Replikation in E. coli benötigt wird. Dies erfolgte, um eine möglichen adversen Effekt dieser pBR322 Sequenzen auf die Funktionsfähigkeit des shuttle Vektors in D. discoideum zu vermindern. Andere nützliche Eigenschaften dieser shuttle Vektoren bestehen darin, daß sie sehr wenige Schnittstellen für sechs Baasenpaare erkennende Restriktionsenzyme enthalten, abgesehen jeweils einer Schnittstelle für die Restriktionsenzyme BamHI und ClaI, die die Einfügung von zusätzlicher DNA erlauben ohne essentielle Funktionen zu unterbrechen. Sequenzen, die in solche Stellen eingefügt werden können, schließen Gene für die Produktion von rekombinanten Proteinen ein oder Selektionsmarker, Promotorsequenzen, um Genfunktionen zu kontrollieren und Signalsequenzen für das korrekte Prozessieren von messenger RNA Molekülen and deren tranlatierter Proteine. Dies wird aufgezeigt durch die Konstruktion einer neuartigen "Expressionskassette", die die Produktion und Sekretion von einem rekombinanten Proteinen von Dictyostelium Zellen ermöglicht. Diese Expressionskassette enthält den Promotor des D. discoideum Actin 15 Gens, einen Abschnitt des D 19 Gens, das ein Sekretionssignal-Peptid codiert, den Polylinker des E. coli Plasmids pGEM3Z (für die Insertion von Genen zur Expression) und letztlich das Polyadenylierungssignal des D. discoideum Actin 15 Gens. Es wird jedoch für jemand Fachkundigen offensichtlich sein, daß durch Verwendung von DNA Sequenzen anderer Gene oder sogar vollständig synthetischer Sequenzen, die denselben Funktionen dienen, eine weite Reihe von ähnlichen Konstrukten gemacht werden könnte.
Die Anwendung des shuttle Vektors, basierend auf der in diesem Dokument offenbarten Technologie, wurde gezeigt durch die Produktion eines rekombinanten Proteins von einem E. coli Gen für das Enzym B-Glucuronidase in D. discoideum Zellen, die einen Expressionsvektor enthalten, der durch Einfügung der Expressionskassette in den shuttle Vektor pMUW1580 hergestellt wurde.
Von Plasmid Ddp2 nimmt man an, daß es das erste funktionell charakterisierte einer neuen Gruppe von strukturell und funktionell ähnlichen Plasmiden ist. Diese neue Gruppe von Plasmiden kann dadurch definiert werden, daß alle ihre Plasmide ein einzelnes Polypeptid von 700-1000 Aminosäuren codieren, welches wesentlich ist für die Plasmid Replikation und welches Sequenzhomologien aufzeigt mit dem Ddp2 Rep Gen, was auf einen gemeinsamen evolutionären Ursprung hinweist. Ferner ist der Ursprung der Replikation dieser Plasmide verbunden mit einem Arm einer inversen Wiederholungssequenz, die vom Re Gen unterschieden ist. Die Erfinder sagen zuversichtlich voraus, daß die Techniken, die sie in dieser Anmeldung offengelegt haben, für die Herstellung weiterer extrachromosomaler Plasmid Vektoren verwendet werden können, die in der biotechnologischen Industrie benutzt werden können, ausgehend von den funktionell analogen Abschnitten jeder dieser breiteren Gruppe von Plasmiden, die "Ddp2-ähnlich" sind.
Das einzige andere Mitglied dieser "Ddp2-ähnlichen" Gruppe von Plasmiden, das bis jetzt sequenziert worden ist, ist Plasmid pDG1, isoliert von einer nicht identifizierten Dictyostelium Spezies (Orii et al. (1987) Nucleic Acids Res. 15, 1097-1107). Plasmid pDG1 hat eine sehr ähnliche Struktur wie Ddp2 und besitzt umfänglich ähnliche invertierte Wiederholungen und einem einzelnen offenen Leserahmen analog zum Rep Gen von Ddp2. Obwohl Plasmid pDG1 voll sequenziert wurde ist nichts bekannt hinsichtlich der Funktionen dieser Merkmale oder der Lokalisierung des Ursprungs der Replikation (Orii et al. (1989) Nucleic Acids Res. 17, 1395-1408). Der einzige rekombinante, von pDG1 abgeleitete shuttle Vektor, der bisher hergestellt wurde, verfügt über ein langes 4.2 Kb ClaI Fragment von pDG1, wobei nur 0.2 Kb des ganzen Plasmids ausgelassen wurden (Orü et al. (1989) Nucleic Acids Res. 17, 1395-1408). Solche pDG1 basierten Plasmiden sind sehr instabil in E. coli (Saing et al. (1988) Mol. Gen. Genet. 214, 1-5) und sind somit für die Herstellung von rekombinanten Proteinen ungeeignet.
Das Plasmid pDG1 ist erkannt als der "Ddp2-ähnlichen" Gruppe von Plasmiden zugehörig, weil es eine ähnliche Struktur besitzt und Sequenzhomologien im Bereich des offenen Leserahmens aufweist mit Ddp2 sowohl auf den DNA, wie auch der Aminosäure Ebene. Die nichtcodierenden Abschnitte dieser beiden Plasmide haben geringe Sequenzhomologie, offensichtlich deshalb, weil sie im Zuge dler Evolution keinem Selektionsdruck unterlagen. Die Anwesenheit von großen invertierten Wiederholungen sowohl in pDG1 als auch Ddp2 ist wahrscheinlich kein entscheidendes Merkmal der Gruppe "Ddp2-ähnlicher" Plasmide, da nur eine Kopie wesentlich ist für die Replikation von Ddp2.
Im Lichte der Funktionsdaten der analogen Region von Ddp2, wie in dieser Anmeldung beschrieben, ist es möglich die pDG1 Sequenzdaten erneut zu bewerten und vorauszusagen, daß der pDG1 Ursprung der Replikation außerhalb des operierenden offenen Leserahmens liegt und mit einer der invertierten Wiederholungen überlappt. Zusätzlich ist die Spekulation (Ori et al. (1989) Nucleic Acids Res. 17, 1395-1408) betreffend der schwachen Homologien des Rep Gens mit Reverser Transcriptase wahrscheinlich unkorrekt, da die Homologie in Ddp2 nicht konserviert ist. Das Rep Gen von Ddp2 kann mit dem offenen Leserahmen von pDG1 aneinandergereiht werden wobei 35% Aminosäuren in identischer Position auftreten, was eine beträchtliche evolutionäre Homologie anzeigt. Die Proteine, die durch die beiden Plasmide codiert werden, weisen ebenfalls ähnliche Strukturen auf, in dem beide zwei Domänen ähnlicher Grösse aufweisen, die durch eine Threonin-reiche Sequenz getrennt werden, und haben am Carboxyterminus beider Proteine Glutaminsäure und Asparaginsäure-reiche Sequenzen. Dem Fachmann zeigen die Ähnlichkeiten zwischen den Proteinen, die durch diese beiden Plasmide produziert werden, daß sie sehr ähnliche Funktionen haben, während die Abschnitte mit hoher Sequenzhomologie sehr wahrscheinlich darauf hindeuten, das sie wesentlich sind für die Protein Funktion. Wahrend es unwahrscheinlich ist, daß die Proteine von pDG1 ausreichen würden um die Replikation des Ddp2 Ursprungs der Replikation zu verursachen (und vice versa), weil die Sequenz, die durch das Protein erkannt wird, wahrscheinlich spezifisch für den individuellen Ursprung der Replikation ist, ist es aber sehr wahrscheinlich, daß neue Proteine, konstruiert von Abschnitten beider Proteine, korrekt funktionieren. Beispielsweise sollte der Ersatz des Carboxyterminus von Ddp2 Rep Protein durch den Carboxyterminus von pDG1 Protein die Fähigkeit des Moleküls nicht beeinflussen, die Replikation vom Ddp2 Ursprung der Replikation aus zuzulassen. Ferner sollte es möglich sein, die Spezifität des Ddp2 Rep Gens einfach dadurch zu verändern, daß man den Protein-Abschnitt, der den Ddp2 Ursprung der Replikation erkennt, austauscht durch einen Abschnitt, der den Ursprung der Replikation bei einem anderen Plasmid der "Ddp2-ähnlichen" Gruppe erkennt. Es ist klar, daß die grundlegende Technologie, die in dieser Anmeldung offenbart wird, nach der das Replikations-Protein und der Ursprung der Replikation getrennt auf verschiedenen Vektoren lokalisiert sind, auf vielfältige Art und Weise zur Konstruktion von Plasmid-Vektoren angewendet werden kann durch die Inkorporation von Abschnitten der breiten Gruppe der "Ddp2-ähnlichen" Plasmide.

Beispiel 1

Sequenzierung von Plasmid Ddp2

Unser Laboratorium in der Macquarie-Universität sequenzierte Ddp2, indem Ddp2 DNA in kleine Fragmente zerschnitten und diese getrennt in ein kommerziell erhältliches Plasmid, genannt pGEM3Z (Promega Corporation, Madison, USA), kloniert wurden. In diesem Vector waren kleine Abschnitte von Ddp2 DNA stabil und konnten sequenziert werden, indem eine Technik, genannt "Doppelstrang Sequenzierung" angewendet wurde, wobei ein kleines Oligonucleotid verwendet wird, um eine Synthese eines radiomarkierten DNA Stranges auf einem Template von denaturierter Plasmid DNA auszulösen. Der Oligonucleotid Primer kann die komplementäre Sequenz zu dem SP6 oder T7 Abschnitt sein, der die klonierte Sequenz flankiert oder er kann ein gewöhnlich synthetisiertes Oligonucleotid sein mit einer Sequenz, die zu einem Teil der klonierten Ddp2 DNA paßt.
Ddp2 DNA wurde mit den Restriktionsenzymen ClaI, Sau3A, AluI oder RsaI verdaut und an den Schnittstellen der Restriktionsenzyme AccI, BamHI oder SmaI in das Plasmid pGEM3Z kloniert unter Anwendung von üblichen molekularbiologischen Techniken und anschliessend in den E. coli Strang JM109 transformiert. Klone, die Ddp2 DNA enthalten, wurden zufällig ausgewählt und in einer Brühe, die 15% Glycerin enthält, bei -80 Grad gelagert.
Plasmid DNA der Klone wurde gewonnen durch alkalische Lysis und eine RNAse Enzym Behandlung, wie durch die Promega Literatur für pGEM3Z empfohlen. Vor der Verwendung in der Sequenzierungsreaktion wurde 4 ug jedes Plasmids alkalisch denaturiert durch kurze Behandlung mit 0.4 m Natriumhydroxyd-Lösung, mit Äthanol niedergeschlagen und mit 10 picomol von Oligonucleotid-Primer hybridisiert, gemäß der Empfehlung von Pharmacia LKB Biotechnology (Uppsala, Schweden) für ihr T7 DNA Polymerase Sequenzierungs Anwendungsprodukt empfohlen wird, welches für die Sequenzierungsreaktion verwendet wurde. Die Sequenzierungsreaktion wurde mit ³&sup5;S radioaktiv markiertem ATP durchgeführt. Die radioaktiv markierte DNA wurde auf 6% Acrylamid/8M Harnstoff-Gelen getrennt und dann in 10% Methanol plus 10% Essigsäure fixiert, getrocknet und autoradiographiert. Die durch die Autoradiographie-Filme erkannten Sequenzen wurden in einen Computer eingegeben, überlappende Sequenzen automatisch abgeglichen und zu einer kompletten DNA Sequenz von Ddp2 zusammengebaut.
Die ganze Sequenz von Ddp2 ist von der EMBL Datenbank erfahrbar, Zugangsnummer X51478.

Beispiel 2

Lokalisierung des Ursprungs der Replikation von Ddp2

In weiteren Experimenten wurde der Ursprung der Replikation von Ddp2 lokalisiert innerhalb des HindIII-ClaI Fragmentes (1153-1775 bp) von Ddp2 wie in Plasmid pMUW130.
pMUW111
Das Plasmid pMUW11 wurde hergestellt durch Einbau des 4.1 Kb HindIII-ScaI Fragments von Ddp2 in die Sah Schnittstelle von BIOSX. BIOSX ist ein integrierender D. discoideum/E. coli shuttle Vektor, hergestellt von Nellen et al. (Gene. 39 (1985) 155-163) und enthält das Ampicilin und Kanamycin/G418 Antibiotika. Resistenz Gen.
Ddp2 Plasmid wurde zunächst mit den Restriktionsenzymen HindIII und ScaI verdaut. Nach vollständigem Verdau wurden die HindIII 5' überhängenden Enden zu glatten Enden aufgefüllt unter Verwendung des Enzyms DNA Polymerase I "Klenow Fragment". Nachdem diese Reaktion vollzogen war, wurde in einem 0.8% TBE Agarose Gel franktioniert. Das 4.1 Fragment wurde dann vom Gel ausgeschnitten und gereinigt unter Verwendung eines kommerziellen Anwendungsprodukts, "Gen-Clean" (BIO101, Inc., USA). Die gereinigte DNA wurde dann mit SalI verdautem BIOSX ligiert und endgefüllt. Nach der Ligation wurde die Mischung in den E. coli Stamm CES201 transformiert (Leach, D. R. F. und Stahl, F. W. (1983) Nature 305, 448-451). CES201 wurde für die Transformation kompetent gemacht entsprechend dem von Hanahan, D. (J. Mol. Biol. (1983) 166, 557-580) publizierten Verfahren. Die Transformations Mischung wurde dann auf Luria-Agar plattiert, das 50 u/ml Ampicillin enthielt. Ampicillin resistente E. coli Transformante, die das pMUW111 Plasmid enthielten, wurden durch Kartierung von Restriktionsfragmenten isolierter Plasmide und zudem durch radioaktive Hybridisierung bestätigt, wobei Ddp2 als Sonde verwendet wurde.
10 ug von pMUW111 wurde dann verwendet, um den axenisch wachsenden Dictyostelium Stamm, AX3K, zu transformieren, unter Anwendung einer von Nellen W. et al. (Mol. Cell. Biol. (1984) 4, 2890-2898) entwickelten Standard Calcium Phosphat Niederschlag Prozedur und mit G418 Selektion. Um zu bestimmen, ob pMUW111 fähig war zur autonomen Replikation, wurde Kern-DNA isoliert von G418 resistenten Transformanten und dann gescreent auf einer "Lyse auf dem Gel", wie beschrieben bei Noegel A. et al. (J. Mol. Biol. (1985) 185, 447-450). Das Gel wurde dann auf mittels Southern blotting auf eine Zeta Membran übertragen (Bio-RAD) mit 32p-markierter Ddp2 DNA hybridisiert. Die Autoradiographie zeigte, daß pMUW111 eine höhere Beweglichkeit hatte als eine Gesamtchromosomale DNA, was darauf hinweist, daß es als ein autonomes Replikations Plasmid existiert.

pMUW102

Das Plasmid pMUW102 wurde konstruiert, indem das 3.2 Kb SalI bis XhoI Fragment von Ddp2 an der SalI Schnittstelle von BIOSX eingefügt wurde. Dieses Fragment enthielt nur einen Teil des offenen Leserahmens. Deshalb wurde nicht erwartet, daß vollständig funktionsfähige Proteine durch dieses Konstrukt produziert würden.
Ddp2 wurde zunächst mit den Restriktionsenzymen SalI und XhoI verdaut. Die Probe wurde dann in einem 0.8%igen TBE Agarose Gel fraktioniert. Das 3.2 Kb Fragment wurde daraufhin vom Gel ausgeschnitten und gereinigt, indem ein kommerzielles Anwendungsprodukt, "Gen-Clean" verwendet wurde. Die gereinigte DNA wurde dann mit BIOSX ligiert, das mit SalI verdaut worden war. Nach der Ligation wurde die Mischung in den zuständigen kompetenten E. coli Stamm transformiert. Die Transformations-Mischung wurde dann auf Luria-Agar plattiert, das 50 ug/ml Ampicillin enthielt. Ampicillin resistente E. coli Transformanten, die das pMUW102 enthielten, wurden durch Restriktionsfragment Kartierung isolierter Plasmide wie auch durch radioaktive Hybridisierung unter Verwendung von Ddp2 als Sonde bestätigt.
Daraufhin wurden 10 ug pMUW102 verwendet, um den axenischen D. discoideum Stamm AX3K zu transformieren, wobei eine Standard Calcium Phosphat Niederschlagmethode mit G418 Selektion angewendet wurde.
Um das Schicksal des pMUW Vektors zu erfahren, wurde die ganze Kern-DNA von G418 resistenten Transformanten isoliert und dann getestet durch "Lyse im Gel". Das Gel wurde mittels Southern-Transfer auf eine Zeta Membran übertragen und hybridisiert unter Verwendung von 32P markierter Ddp2 DNA. Autoradiographie zeigte, daß pMUW102 dieselbe Mobilität wie die Hauptfraktion der chromosomalen DNA hatte, was darauf hinwies, daß es in die chromosomale DNA integriert war und es nicht fähig war, als ein freies Plasmid zu existieren. Dieses Experiment demonstrierte, daß ein intakter offener Leserahmen wesentlich ist für die Existenz als ein autonom replizierendes Plasmid.

pMUW110

Das Plasmid pMUW110 wurde durch Einfügen des 3.4 Kb BglII-ScaI Fragmentes von Ddp2 in die SalI Stelle von BIOSX hergestellt. Dieses Fragment enthielt den ganzen offenen Leserahmen "RepGen" und die 5' und 3' flankierenden Sequenzen, die die Produktion von Protein(en) kontrollieren spezifiziert durch den offenen Leserahmen. Ddp2 Plasmid wurde zuerst mit den Restriktionsenzymen ScaI und BglII verdaut.
Nach vollständigem Verdau wurden die BglII 5' überhängenden Enden geglättet durch eine Auffüllreaktion unter Verwendung des Enzyms DNA Polymerase I "Klenow Fragment".
Nachdem diese Reaktion eriblgt war, wurde die Probe fraktioniert in einem 0.8% TEE Agarose Gel. Das 3.4 Kb Fragment wurde dann vom Gel ausgeschnitten und mit einem kommerziellen Anwendungsprodukt "Gene-Clean" gereinigt. Die gereinigte DNA wurde dann mit BIOSX ligiert, das mit SalI verdaut und endgefüllt worden war. Nach der Ligation wurde die Mischung in den E. coli Strang CES201 transformiert, der für die Transformation kompetent gemacht worden war. Die Transformations Mischung wurde dann auf Luria-Agar plattiert, der 50 ug/ml Ampicillin enthielt. Ampicillin resistente E. coli Transformante, die das pMUW110 enthielten wurden durch Kartieren der Restriktionsfragmente und zudem durch radioaktive Hybridisierung der isolierten Plasmide überprüft, wobei Ddp2 als Sonde diente.
Anschliessend wurden 10 ug pMUW110 verwendet, um den axenischen D. discoideum Stamm AX3K zu transformieren, wobei eine Standard Calcium Phosphat Niederschlagsprozedur angewendet wurde mit G418 Selektion. Um das Schicksal von pMUW110 zu bestimmten, wurde die gesamte Kern-DNA von G418 resistenten Transformanten isoliert und dann mittels "Lysis im Gel" getestet. Das Gel wurde anschliessend mittels Southern auf eine Zeta Membran übertragen und mit ³²P-markierter Ddp2 DNA hybridisiert. Autoradiographie zeigte, daß pMUW110 dieselbe Beweglichkeit hatte wie die Hauptfraktion der chromosomalen DNA, was zeigte, daß es in die chormosomale DNA integriert wurde und nicht fähig war, als ein freies Plasmid zu existieren. Der Unterschied zwischen pMUW111 und pMUW110 besteht darin, daß in pMUW110 732 Nucleotide zwischen der HindIII Restriktionsenzym Schnittstelle bei Position 1153 bp und der BgIII Restriktionsenzym Schnittstelle bei Position 1885 bp fehlen. Folglich kann die Unfähigkeit von pMUW110, als ein Plasmid in AX3K zu existieren, durch eines des Folgenden erklärt werden: Die 732 bp Sequenz enthält einen Teil des Ursprungs der Replikation (ORI) des Plasmids Ddp2. Die 732 bp Sequenz enthält cis agierende(s) Element(e), die die Produktion von Protein(en) kontrollieren, welche durch den offenen Leserahmen spezifiziert sind. Die erste Erklärung wurde als richtig befunden durch ein nachfolgendes Experiment, das die Cotransformation von AX3K sowohl mit pMUW102 als auch mit pMUW110 einschloß. Das Testen von G418-resistenten Transformanten ergab, daß pMUW102 eine höhere Mobilität hatte als die chromosomale DNA. Dies bewies, daß pMUW102 nur in Gegenwart von pMUW110 als extrachromosomales Plasmid existieren konnte, da pMUW110 den intakten offenen Leserahmen enthielt und somit fähig war, die trans-agierenden Protein, die für pW102 notwendig sind, um als ein Plasmid zu replizieren, zur Verfügung zu stellen.

pMUW130

Die Herstellung des Plasmids pMUW130 erfolgte durch Einfügung des 622 Basenpaare HindIII-ClaI Fragmentes von Ddp2 (also von Basenpaar 1153 bis 1775) in das kommerzielle E. coli PlasmidpGEM3 (Promega Corporation, Madison, USA), welches mit Restriktionsenzymen AccI und HindIII verdaut worden war.
Die Konstruktion des Plasmids erfolgte gemäss derselben Prozedur wie zur Konstruktion des pMUW102 (siehe oben) angewendet mit dem Unterschied, das der E. coli Stamm HB101 verwendet wurde. Plasmid pMUW130 enthält den grössten Teil der 732 Basenpaaren Sequenz, die in Plasmid pMUW102, aber nicht in Plasmid pMUW110, enthalten ist und von der angenommen wird, dass sie für die extrachromosomale Replikation benötigt wird. Ein Experiment, in welchem pMUW130 und pMUW110 in D. discoideum Stamm AX3K cotransformiert wurde, zeigte, daß pMUW130 in der Gegenwart von pMUW110, das in die chromosmale DNA integriert wurde, extrachromosomal replizieren kann. Dies bestätigt, daß ein Ursprung der DNA Replikation auf diesem kleinen HindIII-ClaI Fragment von Ddp2 DNA lokalisiert ist. Mit einer Grösse von 3.3 kb DNA, war pMUW130 wesentlich kleiner als bisherige shuttle Vectoren, die für Dictyostelium sspp herstgetellt wurden. Die Lokalisierung eines Ursprungs der Replikation auf dem HindIII-ClaI Fragment, das in das Plasmid pMUW130 inkorporiert worden war, erhebt interessante wissenschaftliche Fragen, ob ähnliche Sequenzen, die in dem kleinen HindIII Fragment (66-1153 bp) auftreten, ebenfalls fähig sind als ein Ursprung der Replikation zu wirken. Um dies zu untersuchen wurde das kleinen HindIII Fragmentes (66- 1153 bp) in die HindIII Stelle des Plasmids B105X kloniert, woraus Plasmid pMUW105 resultierte. Jedoch war Plasmid. pMUW105 unfähig, extrachromosomal zu replizieren, wenn es in einer Mischung mit pMUW110 (welches das Rep Gen bereitstellte) in den D. discoideum Stamm AX3K transformiert wurde. Das kleine HindIII Fragment in pMUW105 enthält eine vollständigen, nahezu perfekte Kopie der 501 Basenpaaren umgekehrten Wiederholungssequenz welches den grössten Teil des Ddp2 Ursprungs der Replikation in pMUW130 darstellt. Die Unfähigkeit des pMUW105 extrachromosomal zu replizieren zeigt auf dass entweder die Sequenzen direkt ausserhalb der 501 Basenpaaren umgekehrten Wiederholungssequenz für die Replikation essentiell sind oder das die Subtitution der 11 Nukleotide zwischen den zwei Kopien der 501 Basenpaaren umgekehrten Wiederholungssequenz dazu geführt hat, dass die Kopie des kleinen HindIII Fragments in pMUW105 nicht als ein Ursprung der Replikation fungieren konnte. Beider Möglichkeiten führen zur Abwesenheit oder zu Veränderungen von Kopien der DNA Sequenz TTTTTTGTCATGACACTTTTTTTTTTTTGTCATGACA, von der eine Kopie gerade außerhalb der 501 bp umgekehrten Wiederholung in pMUW130 liegt, während eine zweite Kopie verändert ist in pMUW105. Diese Sequenz enthält zwei Kopien eines 10 bp Palindroms TGTCATGACA (d. h. die zwei Hälften sind symmetrisch, weshalb der komplementäre DNA Strang die selbe Sequenz in gegensätzlicher Orientierung hat). Solche palindromischen Sequenzen sind typisch für viele Stellen, die durch DNA bindende Proteine erkannt werden, was in Übereinstimmung damit steht, dass diese Sequenz für die Regulation des Ursprungs der Replikation wichtig ist.
Der Ddp2 Ursprung der Replikation in Plasmid pMUW130 enthält zwei Kopien der oben gezeigten oligo T Sequenz und jedes von diesen enthält jeweils zwei Palindrom Sequenzen.
Das Entfernung einer Kopie dieser Sequenz durch Ausschneiden des HindIII-BglII Restriktions Fragmentes (Basenpaare 1153-1369, nummeriert entsprechend Ddp2) von Plasmid pMUW130 produzierte das Plasmid pMUW138, welches nicht extrachromosomal in D. discoideum replizieren kann, was die Wichtigkeit dieser Sequenz für die Funktion des Ursprungs der Replikation demonstriert. Jedoch ist es unwahrscheinlich, dass diese Sequenz den tatsächlichen Ursprung der Replikation darstellt, von dem angenommen wird, dass er in flankierenden Sequenzen lokalisiert ist.

Beispiel 3

Konstruktion des SmaI shuttle Vektors

Eine Liste der Oligonucleotid Sequenzen, die für die Konstruktion der Vektoren verwendet wurden, ist in Tabelle I aufgeführt. Obwohl das Plasmid pMUW130 eine grosse Verbesserung gegenüber allen übrigen shuttle Vektoren, die bisher für Dictyostelium erhältlich waren, darstellt, hat es einige Nachteile für die Verwendung in der biotechnologischen Industrie. Plasmid pMUW130 weist einen unterbrochenen Polylinker auf (eine Region, in der Schnittstellen für Restriktionsenzyme konzentriert vorliegen) und zudem von dem Lac Operon sowie dem parentalen pBR322 Plasmid abstammende Sequenzen, welche nicht in einem Dictyostelium Vektor benötigt werden.
Idealer Weise, jegliche Restriktionsenzym Schnittstellen in einem Expressions- Plasmid sollten nur in Positionen vorliegen, die für die Manipulation von dem zu exprimierenden Gen geeignet sind und der Gehalt an unnötiger DNA sollte bestmöglichst minimiert werden. Shuttle Plasmid pMUW1530 wurde insbesondere für die einfache Manipulation eingefügter Sequenzen konstruiert. Das Plasmid enthält die minimalen Menge der vom Plasmid pBR322 abstammende Sequenzen, die eine Replikation in E. coli ermöglichen, sowie zusäzlich die Ampicillin Resistenz Selektions Marker.
Die "Gift Sequenzen", die bekannter Weise störend mit der Replikation des SV40 Ursprungs der Replikation wechselwirken (Lusky & Botchan (1981) Nature 293, 79-81) und mit der Expression von Genen in Säugetier Zellen (Peterson et al. (1987) Mol. Cell. Biol. 7, 1563-1567) wurden ausgeschlossen, obwohl bis jetzt deren Einfluss auf D. discoideum Plasmide unbekannt ist. Andere Eigenschaften des Plasmids beinhalten die Herstellung von zwei einzigartigen sechs Basenpaare Restriktions Schnittstellen (BamHI und ClaI), Stellen, die für die Einfügung von Expressions Kassetten oder selektiven Markern geeignet sind.

Tabelle 1

LISTE DER ZUR KONSTRUKTION DER VEKTOREN VERWENDETEN OLIGONUCLEOTID SEQUENZEN

Die Sequenzen (5' zu 3') der an der Macquarie Universität synthetisierten Oligonucleotide sind gezeigt mit den ungefähren Positionen von Restriktionsenzym Schnittstellen.

pMUW1410

Plasmid pMUW1410 ist ein E. coli Plasmid, das hergestellt wurde, um die Basis zur Konstruktion einer Serie von shuttle Vektoren zu sein, einschließlich pMUW1530.
Plasmid pMUW1410 wurde hergestellt, indem zwei synthetische Oligonucleotide GA179 und GA181 als Primer verwendet wurden, um die erforderliche pGEM3Z Sequenz in einer Polymerase Kettenreaktion (PCR) zu amplifizieren. Die zwei Oligonucleotid-Primer wurden jeweils mit zwei Abschnitte konstruiert, wobei das 5'-Ende der Sequenzen Schnittstellen für Restriktionsenzyme enthielten, die für die Klonierung benötigt wurden, und das 3'Ende der Primer spezifisch zu den Sequenzen des Plasmid pGEM3Z passende Sequenzen aufwies. Das 3'-Ende des Oligonucleotids GA179 ist dasselbe wie die pGEM3Z Nucleotide Basenpaare 452-472 (Promega Corp, Numerierungs System), während das 3'- Ende des Oligonucleotides GA181 komplementär ist zu den pGEM3Z Nucleotiden Basenpaare 2254-2240, d. h. sie binden an gegenständig Stränge der pGEM3Z DNA während der PCR Reaktion.
Die PCR Reaktion wurde ausgeführt, indem 10 ng des pGEM3Z Restriktionsenzym PvuII geschnitten wurden, um das Plasmid zu linearisieren, 20 pico Mol jedes Oligonucleotides, 0.03 mM von jedem der vier Desoxynucleotid Triphosphate dATP, dTTP, dCTP und dGTP, Taq Polymerase Puffer (Biores) zu einem Endvolumen von 50 ul und 1.25 Einheiten von Taq Polymerase (Biores). Die Reaktion wurde ausgeführt für acht Cyclen, indem 120 Sekunden Inkubationen bei 95 Grad zur Denaturierung, 50 Grad zur Bindung der Primer und 72 Grad für die Kettenverlängerung. Die Polymerase wurde vom Produkt der PCR Reaktion entfernt durch Extraktion mit Phenol, dann Chloroform, und die DNA wurde mit Ethanol bei -20 Grad niedergeschlagen. Das Produkt der PCR (welches aus der pGEM3Z Sequenz Basenpaare 452-2254 bestand, flankiert durch die Sequenzen der beiden Oligonucleotide GA179 und GA181) wurde dann verdaut mit dem Restriktionsenzym BamHI, um die BamHI Schnittstellen am 5'-Ende der zwei Oligonucleotide zu spalten, worauf das Enzym durch Extraktion mit 50% Phenol/Chloroform entfernt wurde, und dann die DNA niedergeschlagen wurde mit drei Volumen Ethanol bei -70 Grad. Schließlich wurde das DNA Produkt der PCR Reaktion selbstligiert, indem die BamHI "sticky" Enden verwendet wurden, um die intakten Plasmide zu bilden und die Plasmide in den E. coli Stamm Dh5a (Bethesda Research Laboratories) durch Elektroporation transformiert, indem die von Biorad, dem Hersteller der "Gen Pulser" Ausrüstung, empfohlene Procedur angewendet wurde. Die transformierten Zellen wurden auf LB Agar, das 100 ug Ampicillin per ml enthielt, plattiert. E. coli Klone, die resistent gegenüber Ampicillin waren, wurden selektiert, ihre Plasmide (zum Beispiel pMUW1410) durch alkalische Lyse präpariert und hinsichtlich ihrer Größe und die gewünschten Muster der Restriktionsenzym Schnittstellen durch Agar Elektrophorese überprüft.
Das Plasmid pMUW410 war ungefähr 1.8 Kb groß wie erwartet für die gewünschte Portion von pGEM3Z (Basenpaare452-2254) und enthielt den pBR332 Ursprung der Replikation und das Ampicillin Gen. In der Tat bedeutet die Fähigkeit des E. coli Klons, der pMUW1410 enthält, auf Ampicillin Agar zu replizieren, daß das Plasmid einen funktionierenden Ursprung der Replikation und das Ampicillin Resistenz Gen enthalten muß. Plasmid pMUW1410 enthält auch Restriktions Schnittstellen für ClaI, BamHI und NheI, die von den synthetischen Oligonucleotiden stammen. Die Sequenz des Plasmids pMUW1410 in dem Abschnitt der BamHI Schnittstelle wurde durch Verwendung eine T7 Polymerase Anwendungsprodukts (Pharmacia) und eines synthetischen Oligonucleotides GA220 überprüft, welches so konstruiert wurde, dass es in dem Ampicillin Gen (Basenpaare 2149- 2164, pGEM3Z Numerierung) bindet, so daß die Sequenzierungs-Reaktion die Sequenz abdeckt, die vom Oligonucleotid GA179 und GA181 abgeleitet ist. Die Sequenzierungsreaktion bestätigte, daß die Oligonucleotide GA179 und GA181, die zur Herstellung des pMUW1410 verwendet wurden, in der Tat an die erwartete Position in pGEM3Z gebunden waren und schliesst mögliche Fehler aus, die durch falsches Priming an anderer Position verursacht ein könnten.

PMUW1530

Der shuttle Vector pMUW1530 wurde hergestellt, indem das XbaI-ClaI Fragmentes (1175-1775 bp) von Ddp2, das den Ursprung der Replikation enthält, in die NheI und ClaI Schnittstelle des Plasmides pMUW1410 eingefügt wurde.
Plasmid pMUW1015, das das große AluI (Basenpaare 1155-3223) Fragment von Ddp2 enthält, wurde als die Quelle des Ddp2 Ursprungs der Replikation verwendet. 10 ug von pMUW1015 wurden mit den Restriktionsenzymen XbaI und EcoRI verdaut und ein 1.2 Kb DNA Fragment (Basenpaare 1175-2436 von Ddp2), isoliert durch Agarose Gel Reinigung. Der passende DNA Streifen wurde vom Elektrophorese Gel ausgeschnitten und gefroren, um die Gelmatrix zu zerreißen. Das DNA wurde extrahiert mittels der Zentrifugierungsmethode von Heery et al. ((1990) TIG 6, 17: 3.), Phenol/Chloroform extrahiert und durch Ethanol niedergeschlagen, um Spuren von Ethidium-bromide zu entfernen. Ferner wurde die DNA mit dem Restriktionsenzym ClaI verdaut und das 0.6 Kb XbaI-ClaI Fragment (Basenpaare 1175-1775 Ddp2 Numerierung) Gel-gereinigt wie oben beschrieben.
Plasmid pMUW1410 wurde mit dem Restriktionsenzym NheI verdaut und daraufhin mit dem Enzym ClaI, da die NheI Schnittstelle zu nahe zu der ClaI Stelle ist um efficient zu schneiden nachdem das ClaI Enzym geschnitten hat. Der Verdau wurde dann dephosphoryliert, indem 1/40 Volumen 20% SDS, 1/6 Volumen 1M Tris Puffer pH 9.0 und dann 1 Einheit von Calf intestinal alkalische Phosphatase (Boehringer) zugefügt und anschliessend bei 37 Grad für eine Stunde inkubiert wurde. Das Enzym wurde dann entfernt durch Extraktion mit 50% Phenol/Chloroform und anschliessend die DNA niedergeschlagen mit Ammoniumacetat und zwei Volumen Ethanol.
Das XbaI-ClaI Fragment des Plasmids pMUW105 (d. h. der Ddp2 Ursprung der Replikation), wie oben prepariert, wurde in das Plasmid pMUW1415 ligiert (mit NheI und ClaI geschnitten und mit alkalischer Phosphatase behandelt) transformiert in den E. coli Stamm "Sure (Statagene) und auf LB Agar platiert, das 100 ug Ampicillin per ml enthielt. Gegen Ampicillin resistente Ei coli Klone wurden ausgewählt, ihre Plasmide (z. B. pMUW1530) durch alkalische Lyse präpariert und auf Größe und die gewünschten Muster von Restriktionsenzymstellen durch Agar Elektrophorese geprüft.
Plasmid pMUW1530 ist ein 2.4 Kb shuttle Plasmid, das den Ddp2 Ursprung der Replikation enthält, welcher in die NheI und ClaI Stellen des Plasmids pMUW1410 eingefügt ist. Bestätigung dafür ist die Gegenwart der BgIII und NdeI Schnittstellen des Ddp2 Ursprungs der Replikation in der erwarteten Distanz von den BamHI und ClaI Schnittstellen, wie sie in pMUW1410 gefunden werden. PMUW 1 S30 enthält die XbaI oder NheI Restriktions Schnittstellen nicht, die für die Klonierung verwendet werden, da die kompatiblen "sticky ends" durch die Ligation zerstört wurden.
5 ug von pMUW1530, vermischt mit 5 ug von Plasmid pMUW110, wurden dann verwendet, um den axenischen D. discoideum Stamm AS3K zu transformieren, wobei die Standard Calcium Phosphat Niederschlagmethode mit G418 Selektion verwendet wurde. G418 resistente Transformante wurden ermittelt durch "Lyse im Gel", Übertragung mittels Southern auf eine Zeta Membran und getestet mit 32P markiertem pGEM3Z. Dies zeigte die Gegenwart eines extrachromosomalen Plasmids mit der Größe des Plasmids pMUW1530, das pGEM3Z DNA Sequenzen enthielt.

pMUW1570

Shuttle Vector pMUW1570 entspricht dem pMUW1530, wobei die NdeI Restriktionsenzym Schnittstelle entfernt wurde, um es zu ermöglichen NdeI für die Manipulation von Genen zu verwenden, die in das Plasmid kloniert sind.
Plasmid pMUW1530 wurde mit dem Restriktionsenzym NdeI verdaut in 11 ul von 10 mM Tris Puffer pH 7.5, 10 mM MgCl&sub2; und 50 mM NaCl. Die Enden der DNA wurden dann durch Hinzufügen von 1 Einheit von T7 Polymerase und 3 ul der Deoxynukleotidmischung "C long", welche in dem Pharmacia T7 Polymerase Sequenzierungs Anwendungsprodukt enthalten ist, endgefüllt und bei Raumtemperatur für fünf Minuten inkubiert. Das Plasmid wurde dann religiert durch hinzufügen von 2 ul Ligationspuffer (Boehringer). einer Einheit von T4 Ligase und Auffüllung des Volumens auf 20 ul sowie anschliessender Inkubation über Nacht bei 4ºC. Das religierte Plasmid wurde transformiert in den E. coli Stamm "Sure" (Statagene) und plattiert auf LB Agar, der 100 ug Ampicillin per ml enthielt. Ampicillin resistente E. coli Klone wurden selektiert, ihre Plasmide (z. B. pMUW1570) durch alkalische Lysis präpariert und auf Größe und Abwesenheit der NdeI Restriktions Schnittstelle überprüft.

PMUW1580

Shuttle Vektor pMUW1580 entspricht dem pMUW1570, aber mit der BglII Restriktions Schnittstelle entfernt, um zu ermöglichen, daß BglII für die Manupilation von in das Plasmid geklonten Genen verwendet wird.
Plasmid pMUW1530 wurde mit dem NdeI Restriktionsenzym verdaut, mit T7 Polymerase endgefüllt, selbst ligiert und transformiert in E. coli unter Verwendung derselben Prozeduren wie für pMUW1570. Ampicillin resistente E. coli Klone wurden selektiert, ihre Plasmide (z. B. pMUW1580) durch alkalische Lyse präpariert und auf Größe und Abwesenheit von BglII Restriktions-Schnittstellen überprüft.
Plasmid pMUW158C1 enthält eine zweite ClaI Stelle, die durch Endfüllung der BglII- Stelle geschaffen wurde. Jedoch ist in den meisten Stämmen von E. coli diese Sequenz methyliert, so daß das ClaI Enzym die neue ClaI-Stelle nicht schneiden wird.
5 ug von pMUW1580 wurde vermischt mit 5 ug Plasmid pMUW110 und benutzt um den axenischen D. discoideum Stamm AX3K zu transformieren, indem die Standard Calcium Phosphat Niederschlag Methode mit G418 Selektion verwendea wurde. G418 resistente Transformante wurden durch "Lyse im Gel" ermittelt, mittels Southern auf eine Zeta Membran übertragen und mit 32P markiertem pGEM3Z getestet. Dies zeigte ein extrachromosomales Plasmid mit der Größe von Plasmid pMUW1580, das pGEM3Z DNA Sequenzen enthielt. Somit ist Plasmid pMUW1580 ein kleiner, 2.4 Kb shuttle Vector, der eine minimale Zahl von 6 Basenpaar Restriktionsenzym Schnittstellen enthält, was besonders geeignet ist für die Verwendung in der Konstruktion von Expressionsvektoren.

Beispiel 4

Konstruktion einer Expressions Kassette

Eine "Expressionskassette" ist ein einzelnes, leicht zu klonierendes Stück DNA, das in ihren korrekten relativen Positionen all die Sequenzen enthält, die erforderlich sind, um die Expression eines Gens zu garantieren und das korrekte Prozessieren der messenger RNA und des Protein Produktes. Gewöhnlich enthält die Kassette eine Anzahl von Restriktions Schnittstellen (Polylinker) hinter dem Promotor in einer guten Position für das Einfügen des Gens, das exprimiert werden soll. Die Verwendung einer gut entworfenen Expressionskassette erleichtert die Exprimierung einer Reihe von Genen sehr und wird der alternativen Klonierung all der notwendigen DNA Sequenzen auf einer adhoc Basis bei weitem vorgezogen.
Wir haben eine neuartige Expressionskassette entworfen, die spezifisch für die Einfügung in die BamHI Stelle der shuttle Vektoren pMUW1530, pMUW1570 und pMUW1580 angewendet werden kann. Die Expressionskassette wurde entworfen zur Minimierung des Betrages von unnötigen DNA Sequenzen und Restriktionsstellen. Dies wurde erreicht durch Klonierung der erforderlichen Kontroll- und Signal-Sequenzen unter Anwendung von PCR Techniken, um an Schlüssel Positionen Restriktions Schnittstellen einzubringen, die für das Klonieren erforderlich sind, wobei Schnittstellen gewählt wurden, die während der Konstruktionsprozedur zerstört werden können. Die Kassette enthält einen Promotor vom D. discoideum Aktin 15 Gen, eine Sequenz, die für ein Sekretions Signalpeptid kodiert, einen Polylinker, der Restriktions Schnittstellen enthält, die die Insertion von zu exprimierenden Genen erlauben, und eine Polyadenylations Signalsequenz vom D. discoideum Aktin 15 Gen.
Jeder Komponentenabschnitt der Expressionskassette wurde separat kloniert und dann vereinigt zur kompletten Kassette innerhalb des Polylinkers von pGEM3Z.

Klonierung des Aktin 15 Promotors, Plasmid pMUW1480

Der Aktin 15 Promotor wurde ausgewählt, weil er gut charakterisiert und bekannt dafür ist, nach Einsetzen des Hungerzustandes auf einem relativ hohen Niveau exprimiert zu werden (Cohen et al. (1986) EMBO J. 5, 3361-3366). Für die Herstellung von rekombinanten Proteinen ist diese Abfolge der Expression wünschenswert, um zu vermeiden, daß Protein während aktiven Wachstums produziert wird, wobei der resultierende metabolische Aufwand einen selektiven Vorteil für irgendwelche nichtsekretierende Mutanten verursachen könnte.
Die zwei synthetischen Oligonucleotide GA190 und GA188 wurden als Primer verwendet, um die erforderliche Aktin 15 Promotor Sequenz in einer Polymerase Kettenreaktion (PCR) zu amplifizieren. Die zwei Oligonucleotid Primer wurden beide mit zwei Abschnitten entworfen, wobei das 5'Ende der Sequenzen Restriktions Schnittstellen aufwies, die für die Klonierung erforderlich waren, und das 3'Ende Sequenzen aufwies, die spezifisch zu der Sequenz des Aktin 15 Gens in Plasmid pTS1 (Chang et al. (1989) Nucleic Acids Res. 17, 3655-3661) passten. Das 3'Ende des Oligonucleotides GA190 entspricht den Promotor Nucleotiden zwischen -247 und -230 (Numerierung rückwärts von A des ATG Startcodons ab), während das 3' des Oligonucleotides GA188 komplementär ist zu Nucleotiden zwischen +3 und -13, d. h. sie primen gegenläufige Stränge der Aktin 15 DNA während der PCR Reaktion.
Die PCR Reaktion wurde ausgeführt, indem 30 ng von pTS1 verwendet wurde, geschnitten mit Restriktionsenzym PvuII und ScaI, um sicherzustellen, daß das Plasmid unfähig ist während späterer Klonierungsstufen zu replizieren, 20 pico Mól von jedem Oligonucleotid, 0.03 mM von jedem der vier Desoxynucloeotidtriphosphate dATP, dTTP, dCTP und dGTP, Taq Polymerase Puffer (Biores) zu einem Endvolumen von 50 ul und 1.25 Einheiten von Taq Polymerase (Biores). Die Reaktion wurde ausgeführt für zehn Cyclen mit 120 Sekunden Inkubation bei 95 Grad, um zu denaturieren, 40 Grad für die Bindung der Primer und 72 Grad für die Kettenverlängerung. Zum Ende der PCR Reaktion wurde 1 Einheit von T4 Polymerase zugesetzt und bei Raumtemperatur 15 Minuten lang inkubiert, um sicherzustellen, daß die Enden der DNA geglättet vorlagen. 20 ug Glycogen in 1 ul (Boehringer) wurden zugesetzt sowie 2 ul Acetat-Puffer (um die Präcipitation der kleinen DNA Fragmente zu unterstützen) bevor die Polymerase durch Extraktion mit 50% Phenol in Chloroform sowie nachfolgend mit Chloroform entfernt wurde und die DNA niedergeschlagen wurde mit drei Volumen Ethanol bei -70 Grad.
Das Produkt der PCR Reaktion (bestehend aus der Actin 15 Promotor Sequenz zwischen -247 und +3 relativ zum Startcodon, flankiert durch die Sequenzen der zwei Oligonucleotide GA190 und GA188) ergab die erwartete Größe von angenähert 300 Basenpaaren, gezeigt durch Elektrophorese in 1.6% Agarose gegen Größenmarker (BRESA) des Phagen SPP-1, verdaut mit dem Restriktionsenzym EcoRI.
Das DNA Produkt der PCR Reaktion wurde vermischt mit 100 ng von pGEM3Z, das mit dem Restriktionsenzym SmaI geschnitten wurde um geglättete Enden zu schaffen. Die Mischung wurde zwei Stunden lang bei Raumtemperatur ligiert mit 3 Einheiten T4 Ligase in Ligationspuffer und dann niedergeschlagen mit Ammoniumacetat und zwei Volumen Ethanol. Die religierten Plasmide wurde in den E. coli Stamm Dh5a transformiert (Bethesda Research Laboratories) durch Elektroporation nach den von Biorad empfohlenen Prozeduren, dem Hersteller der "Gen Pulser" Ausrüstung. Die transformierten Zellen wurden auf LB Agar plattiert, das 100 ug/ml Ampicillin, 0.5 mM IPTG (Isopropyl-B-d-thiogalactopyanosid) und 50 ug/ml X-Gal (5-Bromo-4-chloro-3-indolyl-β-galactosid) enthielt. Ampicillin resistente E. coli Klone, die große weiße Kolonien produzierten (was darauf hinwies, daß das Plasmid DNA in den Polylinker eingefügt war) wurden ausgewählt, ihre Plasmide (d. h. pMUW1480) durch alkalische Lyse präpariert und auf Größe und die gewünschten Muster von Restriktionsenzym Schnittstellen geprüft, indem Agar Elektrophorese verwendet wurde.
Das mit dem Restriktionsenzym PvuII geschnittene Plasmid produzierte ein Fragment mit ungefähr 700 Basenpaaren und umfasste 379 Basenpaare von pGEM3Z Sequenzen, die ungefähr 300 Basenpaare eingefügte Sequenz enthielten, was der erwarteten Grösse für den gewünschten Aktin 15 Promotor (250 bp) zusammen mit den flankierenden Sequenzen, die von den synthetischen Oligonucleotiden GA190 und GA188 stammten, entsprach. Plasmid pMUW1480 enthält auch Restriktions Schnittstellen für HindIII, BglII, NsiI und FokI, die von den synthetischen Oligonucleotiden stammen. Die Identität des in das Plasmid pMUW1480 eingefügten Promotors wurde durch Sequenzieren bestätigt, wobei ein T7 Polymerase-Sequenzierungs Anwendungsprodukt (Pharmacia) verwendet wurde sowie kommerziell gelieferte Oligonucleotide (Promega), die zu Sp6 und T7 Abschnitten, die den Polylinker flankieren, binden. Die Sequenzierung schließt jede Möglichkeit von Irrtümern in der Sequenz aus.

Klonierung einer Sequenz für ein Sekretionssignal, Plasmid pMUW1450

Sekretion eines Proteins erfordert eine Signalsequenz am Aminoterminus eines Polypeptides. Dieses Signalpeptid ist der erste Teil des Proteins, der zu transcribieren ist, und veranlaßt das Ribosom an die Endoplasmatische Reticulum Membranen zu binden und veranlasst den Transport des entstehenden Polypeptids durch die Membran in das Lumen des Endoplasmatischen Reticulums. Anschliessend wird das Signalpeptid vom Rest des Proteins abgespalten.
Das D. dicoideum Protein PsA besitzt ein 20 Aminosäuren Signalpeptid, welches Charakteristiken hat, die typisch für viele eukaryotischen Signalpeptide sind (Perlman & Halvorson (1983) J. Mol. Bio 167, 391-409) und so sollte es ein zuverläßliches Signal sein für die Sekretion von rekombinanten Proteinen.
Die zwei synthetischen Oligonucleotide GA187 und GA182 wurden als Primer in einer PCR Reaktion verwendet, um die für das PsA Signalpeptid codierende DNA Sequenz des D19 Gens, welches für PsA Protein codiert, (Early et al (1988) Mol. Cell, Biol. 8, 3458- 3466) zu amplifizieren. Die verwendeten Methoden waren dieselben, wie sie für die Klonierung des Aktin 15 Promotors beschrieben wurden (siehe oben). Jedoch gab es einige Schwierigkeiten beim klonieren des korrekten Produktes der PCR Reaktion.
Das Plasmid mit dem Restriktionsenzym PvuII verdaute pMUW1450 ergab ein Fragment in korrekter Größe, aber wenn die eingefügte Sequenz sequenziert wurde, zeigte sich, daß das Oligonucleotid GA182 nicht an die D19 DNA in der erwarteten Position am 3' Ende der Signalsequenz gebunden hatte. Die in Plamid pMUW1450 klonierte DNA enthielt das erste Oligonucleotid GA187 in der korrekten Position 5' zum D19 Start-Codon, aber die DNA Sequenz setzte sich am Ende des Signalpeptides so weit fort wie die PwII Stelle nahe dem Zentrum des Gens. Nachforschungen über den Grund des Fehlschlages des Oligonucleotides GA182, die PCR Reaktion korrekt zu primen, ergaben, daß diese Sequenz eine Haarnadel Struktur formt, so daß es unwahrscheinlich war, sie für eine Bindung an das D19 Gen zur Verfügung zu haben.
Einen alternativen Zugang zur Modifizierung des 3'Endes der DNA, die für das PsA Signalpeptid codiert, wird unten beschrieben.

Fusion des Promotors mit dem D19 (PsA) Gen, Plasmid pMUW1545

Plasmid pMUW1450 enthält die Restriktions Schnittstellen, die vom Oligonucleotid GA187 stammen, und die notwendig sind, um den Promotor und die D19 Gen-Sequenzen zu verbinden. Dies erfordert eine drei Wege Ligation, um die Klonierung der zwei DNA Fragmente in die NdeI und HindIII Stellen von pGEM3Z zu erzwingen.
Die zu verbindenden DNA Fragmente wurden durch Schneiden von 5 ug des Plasmids pMUW1450 mit den Restriktionsenzymen NdeI und ScaI gewonnen. Anschliessend wurde das größte (1.8 Kb) DNA Fragment, das die D 19 Sequenzen enthält, durch Gel-Reinigung, wie früher beschrieben, gereinigt. Die NdeI Schnittstelle am Ende dieses Fragmentes liegt innerhalb der D19 Sequenz, die für das Signalpeptid codiert. Die Promotor-Sequenz wurde gewonnen durch Schneiden von 5 ug des Plasmids pMUW1480 mit den Restriktionsenzymen HindIII und EcoRI, die an der HindIII Stelle in der vom Oligonucleotid GA190 stammenden Sequenz 5' zum Promotor und der EcoRI Stelle im Polylinker schneiden, was ein 0.3 Kb Fragment ergab, das dann durch Gelelektrophorese gereinigt wurde. Die DNA Fragmente, die die D 19 und die Promotor Fragmente enthalten, wurden zusammengemischt und mit dem FokI Restriktionsenzym verdaut, wodurch kompatible Enden an den ATG Startcodons in beiden Sequenzen erzeugt wurden. Die FokI verdauten Fragmente wurden mit 50% Phenol in Chloroform und anschliessend mit Chloroform extrahiert, danach mit drei Volumen Ethanol bei -70 Grad niedergeschlagen. Die FokI Fragmente wurden mit 0.5 ug pGEM3Z ligiert, welches mit HindIII und NdeI geschnitten, mit alkalischer Phosphatase behandelt und durch Gelelektrophorese gereinigt worden war wie für Plasmid pMUW1410 beschrieben. Die religierten Plasmide wurden transformiert in den E. coli "Sure" Strang wie oben beschrieben und plattiert auf LB Agar, der 100 ug Ampicillin per ml enthielt. Ampicillin resistente E. coli Klone wurden selektiert, ihre Plasmide (d. h. pMUW1545) durch alkalische Lyse präpariert und geprüft auf Anwesenheit der BglII Restriktions-Stelle vom Oligonucleotid GA190 und Abwesenheit der NsiI Restriktionsstellen, die von beiden der eingefügten Fragmente entfernt worden sein sollten.

Konstruktion der ganzen Promotor/Signal Sequenz, pMUW1594

Um das 3'Ende der D19 Sequenz, die für das Signalpeptid codiert, zu ersetzen, wurde eine synthetische DNA Sequenz in die NdeI Restriktionsstelle des Plasmids pMUW1545 kloniert. Die synthetische DNA Sequenz setzt sich zusammen aus zwei synthetischen Oligonucleotiden GA297 (+ve Strang) und einer komplementären Sequenz GA296 (-ve Strang), welche binden um doppelt-strängige DNA zu bilden mit Enden, die mit der NdeI Restriktionsstelle kompatibel sind. Beim Entwerfen dieser Oligonucleotide wurde die Gelegenheit genutzt, die DNA Sequenzen zu verändern, um die Codon Nutzung für hoch exprimierte Gene zu optimieren, die Möglichkeit zur Bildung von Haarnadel Strukturen zu entfernen und die NdeI Restriktionsstelle zu entfernen, die für die Einfügung der Oligonucleotide verwendet wurde wodurch eine einzige NdeI Stelle verblieb, die für die Klonierung an der Signalpeptid-Spaltungsstelle verwendet werden kann. Die Veränderungen der DNA Sequenz ändern nicht die codierte Aminosäuresequenz des Signalpeptides.
Die Oligonucleotide GA297 and GA296 wurden mit T4 Kinase phosphoryliert. 50 Picomol jedes Oligonucleotides in 50 ul "One-for-all" Puffer (Pharmacia) und 2 uM dATP wurden 30 Minuten lang mit 20 Einheiten T4 Ligase bei 37 Grad inkubiert, und dann wurde das Enzym durch Erhitzen auf 100 Grad zerstört.
Plasmid pMUW1545 wurde linearisiert mit NdeI Restriktionsenzym und ligiert mit 1 Picomol phosphoryliertem Oligonucleotid GA 297 und GA296 unter Verwendung von 0.5 Einheiten T4 Ligase bei 4 Grad übernacht. Die religierten Plasmide wurden transformiert in den E. coli Stamm "Sure" (Statagene) und nach einer Stunde Inkubation bei 37 Grad wurden die Organismen inoculiert in 500 ml LB Broth, der 100 ug/mi Ampicillin enthielt. Nach 18 stündigem Schütteln bei 37 Grad wurden die Zellen geerntet und die Mischpopulation von Plasmiden durch alkalische Lyse gereinigt. 5 ug der resultierenden Mischung von Plasmiden wurde mit dem HindIII Restriktionsenzym verdaut und ein DNA Fragment von angenähert 0.3 Kb wurde durch Gel-Elektrophorese gereinigt wie oben beschrieben. Dieses 0.3 Kb DNA Fragment konnte nur von Plasmiden kommen, die in dem Polylinker geschnitten waren und auch die synthetische DNA Sequenz (die eine zweite HindIII Stelle enthält) in die NdeI Restriktionsstelle von pMUW1545 eingefügt enthielten. Somit enthält dieses 0.3 Kb Fragment das volle Promotor-Signalsequenz-Konstrukt.
Die 0.3 Kb Promotor-Signalsequenz wurde in mit HindIII geschnittenem pGEM3Z ligiert, mit alkalischer Phophatase behandelt und mittels Gel-Elektrophorese gereinigt. Das religierte Plasmid wurde in den E. coli Stamm "Sure" (Statagene) transformiert und auf LB Agar plattiert, der 100 mg ml Amicillin per ml enthielt. Ampicillin resistente E. coli wurden selektiert und ihre Plasmide (d. h. pMUW1594) wurden durch alkalische Lyse präpariert. Die Plasmide wurden auf Größe und korrekte Orientierung des Promotor (d. h. 5' zum Polylinker) überprüft unter Verwendung der Position der BglII Stelle 5' zum Promotor. Ferner wurden die Klone durch T7 Polymerase-Sequenzierung (Pharmacia) getestet, wobei das Oligonucloetid GA187 verwendet wurde, um die Orientierung der eingefügten Sequenz der synthetischen DNA zu überprüfen. Plasmid pMUW1594 hatte den erforderlichen Promotor und die Signal-Sequenz im Rahmen mit der das Lac Operon codierenden Sequenz des pGEM3Z Polylinker.

Klonierung des Actin 15 Polyadenylierungs-Signals, Plasmid pMUW1512

Die zwei synthetischen Oligonucleotide GA189 und GA186 wurden als Primer verwendet, um die Actin 15 Polyadenylierungs-Sequenz in einer Polymerase Kettenreaktion (PCR) zu amplifizieren. Die zwei Oligonucleotid-Primer wurden jeweils mit zwei Abschnitten entworfen, wobei die 5'Enden der Sequenzen Restriktions Schnittstellen enthielt, die für das Klonieren erforderlich waren, und die 3'Enden der Sequenzen speziell zu der Sequenz des Actin 15 Gens in Plasmid pTS1 (Chang et al. (1989) Nucleic Acids Res. 17, 3655-3661) paßten. Das 3'Ende des Oligonucleotids GA189 wurde so entworfen, dass es am Stop-Codon des Actin 15 Gens bindet und weist ein zusätzliches Basenpaar auf gegenüber der ursprünglichen Sequenz, um Stop-Codons in alle drei offenen Leserahmen zu plazieren, während das 3'Ende des Oligonucleotides GA186 komplementär zu der Sequenz ist, die ungefähr 305 Basenpaare vom 3'Ende entfernt ist und die unmittelbar einer EcoRV Restriktions Schnittstelle vorausgeht. Das Oligonucleotid GA186 ersetzt die EcoRV Restriktions Schnittstelle mit BglII und EcoRI Schnittstellen für den Gebrauch beim Klonieren.
Die PCR Amplifizierung der Polyadenylierungs-Sequenz wurde ausgeführt unter Verwendung von identischen DNA Preparationen und Methoden wie für die Klonierung des Actin 15 Promotors, wie oben beschrieben, abgesehen von der Verwendung eines unterschiedlichen Paares von Oligonucleotiden und der Transformation der Plasmide in den "Sure" Stamm von E. coli. Die hergestellten Plasmide (z. B. pMUW1512) wurden mit dem Restriktionsenzym PwII verdaut und auf die Gegenwart eines Fragmentes von angenähert 800 Basenpaaren getestet, welches 379 Basenpaare von der pGEM3Z Sequenz und ungefähr 400 Basenpaare der eingefügten Sequenz enthielten. Die Plasmide wurden anschliessend mit den Restriktionsenzymen BglII, EcoRI oder KpnI verdaut (jeweils) um die Gegenwart der Restriktions Schnittstellen in den zwei Oligonucleotiden zu überprüfen. Die Plasmide pMUW1512 und pMUW1515 (entgegengesetzte Orientierung der eingefügten Sequenz) wurden sequenziert, um sicherzustellen, daß das Polyadenylierungssignal keine Fehler enthielt unter Verwendung einer T7 Polymerase Sequenzierungs Anwendungsprodukts (Pharmacia) und kommerziell erhältlicher Oligonucleotide (Promega), die an die Sp6 und T7 Abschnitte binden, welche den Polylinker flankieren.
5 ug des Plasmids pMUW1512 wurden mit den Restriktionsenzymen KpnI und nachfolgend mit EcoRI verdaut, und anschliessend ein nahezu 0.4 Kb Fragment, das das Polyadenylierungs-Signal enthielt, durch Gelelektrophorese gereinigt, wie oben beschrieben. Dieses 0.4 Kb Fragment wurde ligiert in 1 ug des Plasmids pGEM32, das ebenfalls mit KpnI und EcoRI verdaut wurde, behandelt mit alkalischer Phosphatase und dann gereinigt durch Gelelektrophorese. Die Plasmide wurden in den E. coli Stamm "Sure" transformiert, plattiert auf LB Agar, der Ampicillin wie oben beschrieben enthielt. Plasmide (d. h. pMUW1560) von den Ampicillin resistenten Klonen wurden hinsichtlich des Inserts von korrekter Größe (0.4 Kb) und der Gegenwart von einer BglII Stelle, die vom Oligonucleotid GA186 stammte, getestet. Plasmid pMUW1560 enthält das Actin 15 Polyadenylierungs-Signal in der richtigen Position und Orientierung für die endgültige Expressionskassette.

Herstellung der kompletten Expressionskassette, Plasmid pMUW1621

Die Expressionskassette wurde vervollständigt in einer einzigen Klonierungsstufe, die die fusionierte Promotor-/Signal-Sequenz vom Plasmid pMUW1594 mit der Polyadenylierungs-Sequenz vom Plasmid pMUW1560 kombinierte.
Plasmid pMUW1560 wurde mit den Restriktionsenzymen SalI und ScaI verdaut, und das kleinere 1.2 Kb Fragment, das das Polyadenylierungssignal enthielt, wurde durch Gelelektrophorese wie früher beschrieben gereinigt. Plasmid pMUW1594 wurde auch mit SalI und ScaI Enzymen verdaut und das größere 2 Kb Fragment, das den Promotor und die Signalsequenz enthielt, wurde durch Gelelektrophorese gereinigt. Die zwei Fragmente wurden vereinigt, ligiert und transformiert in den "Sure" Stamm von. E. coli. Die Identität des isolierten Plasmids (z. B. pMUW1621) wurde bestätigt durch Schneiden mit dem Restriktionsenzym BgIII, um ein 0.7 Kb Fragment herzustellen. Dieses Fragment kann nur hergestellt werden durch Plasmide, die zwei BglII Stellen enthalten, eine von dem Oligonucleotid GA190 abgeleitete, die zur Klonierung des Promotors diente, und eine zweite, die vom Oligonucleotid GA86 stammt, verwendet für die Klonierung des Polyadenylierungs-Signals.

Einfügung der Expressionskassette in den shuttle Vektor

Der shuttle Vektor pMUW1580 wurde linearisiert mithilfe des Restriktionsenzyms BamHII, behandelt mit alkalischer Phosphatase und gereinigt durch Gelelektrophorese wie bereits beschrieben. Die Expressionskassette in dem 0.7 Kb BglII Fragment von Plasmid pMUW1621 wurde ebenfalls gereinigt durch Gelelektrophorese und in das linearisierte Plasmid pMUW1580 ligiert. Die Enden der DNA Fragmente, hergestellt durch die BglII und BamHI Enzyme, sind kompatibel, sodaß beide Restriktions Schnittstellen während der Ligation zerstört werden. Die resultierenden Plasmide, hergestellt im E. coli Stamm "Sure", wurden mit ClaI und HindIII Enzymen verdaut, um die Gegenwart des Polylinker in der Expressionskassette und die Orientierung der Expressionskassette im Plasmid zu testen. Die Plasmide pMUW1630 und 1633 wiesen dabei gegensätzliche Orientierung der Expressionskassette auf.

Einfügung des GUS Gens in den Expressions-Vektor

Das GUS Gen ist das E. coli Gen für das Enzym β-Glucuronidase, welches modifiziert worden war durch die Einfügung von SalI und NcoI Restriktionsenzym Schnittstellen am Startcodon des Gens, einer EcoRI-Stelle am 3'-Ende des Gens und die Entfernung einer BamHI-Stelle aus dem Zentrum des Gens (Jefferson et al. (1986) PNAS 83, 8447). Plasmid pRAJ275, das dieses Konstrukt enthält, wurde von den Clontech Laboratories Inc., California, USA, gekauft.
Um die leichte Sequenzierung des GUS Gen zu ermöglichen, wurde es in den pGEM3Z eingefügt. Das GUS Gen wurde aus Plasmid pRAJ275 mit den Restriktionsenymen SalI und EcoRI ausgeschnitten, gereinigt durch Gelelektrophorese und in das Plasmid pGEM3Z ligiert, welches mit denselben Enzymen geschnitten worden war, anschliessend behandelt mit alkalischer Phophatase und Gel-gereinigt. Das Plasmid mit dem eingefügten GUS Gen war pMUW1550.
Eine SmaI Restriktions Schnittstelle wurde in die EcoRI Schnittstelle des Plasmids pMUW1550 eingefügt unter Verwendung des Oligonucleotides GA310 als Linker. Oligonucleotid GA310 war phosphoryliert, wie oben beschrieben in der Sektion über die Konstruktion der vollen Promotor-/Signal-Sequenz. 1 Picomol von phosphoryliertem GA130 wurde vermischt mit 0.5 ug Plasmid pMUW1550, das mit denn EcoRI Restriktionsenzym geschnitten worden war, und durch Gelelektrophorese gereinigt. Die Mischung wurde bei 4 Grad übernacht ligiert und dann transformiert in den E. coli "Sure" Stamm. Die Transformanten wurden eine Stunde lang in SOC Medium inkubiert und dann inoculiert in 50 ml LB Broth, welches 100 ug Ampicillin pro ml enthielt. Nach Schütteln bei 37 Grad, 18 Stunden lang, wurden die Zellen geerntet, die Plasmide wurden gereinigt und geschnitten mit Restriktionsenzym SmaI. Nur die Plasmide, die das Oligonucleotid GA130 enthalten, haben eine SmaI-Schnittstelle, weshalb die linearisierten Plasmide durch Gelelektrophorese gereinigt wurden, religiert und wieder in den E, coli Stamm "Sure" transformiert wurden.
1 ug von Plasmid pMUW1558, das das GUS Gen mit der SmaI Restriktionsschnittstelle enthielt, welche in die EcoRI Schnittstelle am 3'Ende des Gens eingefügt worden war, wurde mit den Restriktionsenzymen SalI und SmaI verdaut und das 1.9 Kb Gen durch Gelelektrophorese gereinigt. Der Polylinker im Expressionsvektor pMUW1630 wurde ebenfalls geschnitten mit den Restriktionsenzymen SalI und SmaI, behandelt mit alkalischer Phosphatase und durch Gelelektrophorese gereinigt. Die zwei gereinigten DNA Fragmente wurden ligiert, in den "Sure" Stamm von E. coli transformiert und anschliessend von Ampicillin resistenten Klonen die Plasmide isoliert. Plasmid pMUW1653 enthielt das GUS Gen, welches im Leserahmen in die SalI Stelle des Expressionsvectors kloniert vorlag. Dieses wurde bestätigt durch Restriktionskartierung unter Verwendung der Schnittstellen für die Restriktionsenzyme NcoI und EcoRI an den 5' bzw. 3'Enden des GUS Gens. Der Stelle der Verknüpfung von der Sequenz, die das Sekretionssignal codiert und dem 5'Ende des GUS Gen-Sequenzier Plasmids wurde durch DNA Sequenzierung sichergestellt unter Verwendung eines T7 Polymerase Anwendungsprodukts (Pharmacia) und des Oligonucleotides GA187.

Expression des GUS Gens in EL discoideum

Die Verwendungsmöglichkeit des Expressionsvektors für die Expression von rekombinanten Genen wurde bestätigt durch Transformierung von 5 ug des Expressionsplasmides pMUW1653 (das das E. coli β-Glucuronidase Gen enthält) und 5 ug des Plasmides pMUW110 (das das Ddp2 Rep Gen und einen G418 Resistenzmarker enthält) in den D. discoideum Stamm AX3K unter Verwendung der Calcium Phosphat Niederschlagsmethode, wie oben beschrieben. Nach einer Woche unter G418 Selektion wurde der Kulturüberstand der Transformanten auf das Vorhandensein der GUS Enzym- Aktivität getestet, unter Verwendung von 1 mM p-Nitrophenyl-B-D-Glucuronid-Substrat in 50 mM Natriumphosphat von pH7.0, 10 mM 2-Mercaptoethanol und 0.1% Triton X-100. Eine Grünverfärbung deutete auf die Anwesenheit des von D. discoideum sekretierten Enzyms β- Glucuronidase hin. Kulturüberstände von transformierten Zellen mit dem Expressionsvektor pMUW1630 enthielten keine B-Glucuronidase.
Es wird von Personen, die diese Technik kennen, anerkannt werden, daß zahlreiche Variationen und/oder Modifikationen dieser Erfindung erbracht werden können entsprechend den in den spezifischen Abschnitten aufgezeigt, ohne dabei vom Geiste oder Grundgedanken der Erfindung abzuweichen, wie in aller Breite beschrieben. Die hier aufgeführten Darstellungen sind deshalb in jeder Beziehung als illustrativ und nicht restriktiv zu betrachten.

Claims

1. Ein Rep Polypeptid, das in Dicytostelium spp die extrachromosomale Replikation eines rekombinanten Plasmids ermöglicht, wobei dieses einen von Plasmiden Ddp2 oder pDG1 abgeleiteten Replikationsursprung enthält, dem Plasmid aber funktionale Gene, die für eine extrachromosomale Replikation in Wildtyp Dictyostelium spp erforderlich sind, fehlen und wobei des weiteren die Aminosaeuresequenz des Rep Polypeptids im wesentlichen der in Fig. 2 gezeigten entspricht.

2. Rekombinanter Plasmid-Vektor, dadurch gekennzeichnet, a) dass der Vektor einen von Plasmid Ddp2 oder Plasmid pDG1 abgeleiteten Replikationsursprung sowie mindestens eine heterologe DNA Sequenz aufweist, wobei diese DNA Sequenz eine für ein gewünschtes Polypeptid codierende Sequenz sowie eine Promotor-Sequenz für die kontrollierte Expression dieses Polypeptids umfasst und b) dem Plasmid-Vektor DNA Sequenzen fehlen, die ein für eine extrachromosomale Replikation in Dictyostelium erforderliches Polypeptid codieren.

3. Rekombinanter Plasmid Vektor, gekennzeichnet durch eine DNA Sequenz, die im wesentlichen der in Fig. 1 gezeigten Sequenz von Nucleotid I bis Nucleotid 2436 oder eines Teils derjenigen entspricht, wobei diese Sequenz einen funktionsfähigen Replikationsursprung umfasst und der Sequenz funktionale Gene zur extrachromosomalen Replikation in Wildtyp Dictyostelium spp fehlen.

4. Rekombinanter Plasmid-Vektor, gekennzeichnet durch eine DNA Sequenz, die im wesentlichen der in Fig. 1 gezeigten Sequenz von Nucleotid 1153 bis Nucleotid 1775 oder eines Teiles derjenigen entspricht, wobei diese Sequenz einen funktionsfähigen Replikationsursprung umfasst und der Sequenz funktionale Gene zur extrachromosomalen Replikation in Wiltyp Dictyostelium spp fehlen.

255. Rekombinanter Plasmid-Vektor, gekennzeichnet durch eine DNA Sequenz, die im wesentlichen der in Fig. I gezeigten Sequenz von Nucleotid 1 bis Nucleotid 3241 oder eines Teiles derjenigen entspricht, wobei diese Sequenz einen funktionsfähigen Replikationsursprung umfasst und der Sequenz funktionale Gene zur extrachromosomalen Replikation in Wiltyp Dictyostelium spp fehlen.

6. Rekombinanter Plasmid-Vektor nach einem der Ansprüche 3 bis 5, dadurch gekennzeichnet, dass das rekombinante Plasmid eine oder mehrere heterologe DNA Sequenzen enthält, die für gewünschte Polypeptide codieren und des weiteren eine oder mehrere Promotorsequenzen aufweist, die die Expression jener heterologen DNA Sequenzen kontrollieren.

7. Rekombinantes Plasmid nach einem der Ansprüche 2 bis 6, wobei das Plasmid eine DNA Sequenz aufweist, die ein Signalpolypeptid codiert, welches die Sekretion des gewünschten Polypeptids bewirkt.

8. Rekombinanter Plasmid-Vektor nach einem der Ansprüche 2 bis 6, dadurch gekennzeichnet, dass der Plasmid Vektor folgende Elemente enthält: a) eine Expressions Kassette, die eine von dem Dictyostelium Actin 1 S Gen abgeleitete Promoter DNA Sequenz umfasst, b) eine für das Sekretions-Signalpeptid codierende DNA Sequenz des D19 Gens von dem Protein PsA und c) eine von dem Actin 15 Gen abgeleitete DNA Signalsequenz zur Polyadenylierung von RNA.

9. DNA Molekül, dadurch gekennzeichnet, dass dieses eine für ein Polypeptid nach Anspruch 1 codierende Nucleotidsequenz umfasst, wobei das DNA Molekül die Eigenschaft aufweist, Dictyostelium Stämme so zu transformieren, dass jeder der rekombinanten Plasmid-Vektoren nach Ansprüchen 2 bis 8 in dem transformierten Dictyostelium Stamm extrachromosomal replizieren kann.

10. DNA Molekül nach Anspruch 9, welches eine Sequenz umfasst, die im wesentlichen der in Fig. 1 gezeigten Sequenz von Nucleotid 2378 bis Nucleotid 5038 oder eines Teils derjenigen entspricht und diese Sequenz ein Polypeptid codiert, das die extrachromosomale Replikation eines rekombinanten Plasmids in Dictyostelium spp ermöglicht, wobei das rekombinante Plasmid einen von den Plasmiden Ddp2 oder pDG1 abgeleiteten Replikationsursprung aufweist, aber funktionale, für eine extrachromosomale Replikation in Wildtyp Dictyostelium spp erforderliche Gene fehlen.

11. Rekombinanter Stamm von Dictyostelium spp, dadurch gekennzeichnet, dass dieser ein rekombinantes Plasmid enthält, welches einen von den Plasmiden Ddp2 und pDG1 abgeleiteten Replikationsursprung aufweist, und diesem Plasmid ein funktionales, für die extrachromosomale Replikation in Wildtyp Dictyostelium spp essentielles Rep Gen fehlt und wobei des weiteren der betreffende rekombinante Stamm ein Gen enthält, das für ein Rep Polypeptid codiert, welches die extrachromosomale Replikation des beschriebenen rekombinanten Plasmids gewährleistet.

12. Rekombinanter Stamm von Dictyostelium nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, dass das Gen, welches ein die extrachomosomale Replikation des rekombinanten Plasmids gewährleistendes Rep Protein codiert, auf einem der Chromosome des rekombinanten Dictyostelium Stamms vorhanden ist.

13. Ein rekombinanter Stamm von Dictyostelium nach einem der Ansprüche 11 oder 12, dadurch gekennzeichnet, dass das codierende Gen des Rep Proteins, welches die extrachromosomale Replikation des rekombinanten Plasmids gewährleistet, eine DNA Sequenz aufweist, die im wesentlichen der in Fig. 1 von Nucleotid 2378-5038 gezeigten Sequenz entspricht.

14. Ein rekombinanter Stamm von Dictyostelium nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, dass das codierende Gen des Rep Proteins, das die extrachromosomale Replikation des rekombinanten Plasmids gewährleistet, eine DNA Sequenz aufweist, die im wesentlichen der in Fig. 1 von Nucleotid 1885-5292 entspricht.

15. Rekombinanter Stamm von Dictyostelium nach einem der Ansprüche 11 bis 12, wobei das rekombinante Plasmid einem der in Ansprüche 2 bis 8 entspricht.

16. Verfahren zur Produktion eines gewünschten Polypeptids, dass die folgenden Schritte beinhaltet:

1. Transformation eines rekombinanten Stammes von Dictyostelium spp mit einem Plasmid Vektor, der eine das gewünschte Polypeptid codierende DNA Sequenz sowie weitere DNA Sequenzen umfasst, die die Expression dieser für ein gewünschtes Polypeptid codierenden Sequenz gewährleisten;

2. Kultivierung des rekombinanten Stamms von Dictyostelium unter Bedingungen, die die Expression der für das gewünschte Polypeptid codierenden DNA Sequenz gewährleisten und die Produktion des gewünschten Polypeptids in zellgebundener oder sekretierter Form ermöglichen;

3. Gewinnung des gewünschten Polypeptids; und wobei das Verfahren ferner dadurch charakterisiert ist, dass a) der rekombinante Plasmid Vektor einen von den Plasmiden Ddp2 und pDG1 abgeleiteten Replikationsursprung enthält, diesem aber funktionale, für die extrachromosomale Replikation in Wildtyp Dictyostelium spp benötigte Gene fehlen und b) der rekombinante Stamm von Dictyostelium ein Gen enthält, das ein Rep Protein codiert, welches die extrachromosomale Replikation des rekombinanten Plasmid gewährleist.

17. Verfahren entsprechend dem nach Anspruch 16, dadurch gekennzeichnet, dass das codierende Gen für ein Rep Protein, welches die extrachomosomale Replikation des rekombinanten Plasmids gewährleistet, auf einem der Chromosome des rekombinanten Dictyostelium Stammes vorhanden ist.

18. Rekombinante Plasmid-Vektoren pMUW102, pMUW111, pMUW110, pMUW130, pMUW1530, pMUW1580, pMUW1594, pMUW1560, pMUW1621, pMUW1630 und pMUW1633 entsprechend den schematischen Vektorkarten gezeigt in Fig. 4-7, 9 und 11-14.

19. Rekombinanter Plasmid-Vektor pMUW1570, der dem Plasmid pMUW1530 nach Anspruch 18 entspricht, dadurch gekennzeichnet, dass die NdeI Restriktionsschnittstelle abwesend ist, so dass NdeI für die Manipulation von in den Vektor klonierten Genen 30 verwendet werden kann.