DE69033957T2

DE69033957T2 - Herstellung von hybridem saatgut

Info

Publication number: DE69033957T2
Application number: DE69033957T
Authority: DE
Inventors: Ian George Bridges; Simon William Jonathan Bright; Andrew James Greenland; Wolfgang Walter Schuch
Original assignee: Syngenta Ltd
Current assignee: Syngenta Ltd
Priority date: 1989-01-26
Filing date: 1990-01-26
Publication date: 2002-11-28
Anticipated expiration: 2010-01-27
Also published as: BR9007061A; WO1990008830A1; HU215090B; GB8901677D0; EP0455665B1; EP0455665A1; DE69033957D1; RO112642B1; JP2001086987A; AU621195B2; DK0455665T3; ZA90608B; HU912484D0; ES2176175T3; CA2008700C; CA2008700A1; US5808034A; US6172279B1; JPH04504500A; AU4945690A

Description

Diese Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von hybriden Pflanzen. Genauer betrifft die Erfindung die molekulare Kontrolle der Fertilität in Erntepflanzen.
In der Landwirtschaft werden viele Erntepflanzen zur Herstellung von Nahrungsmitteln für den menschlichen Verbrauch, für kommerzielle Verfahren, die Produkte für den menschlichen Verbrauch liefern, zur Herstellung von Tiernahrungsmitteln, zur Entwicklung industrieller Produkte und für andere Zwecke verwendet. Das Verfahren beinhaltet immer die Pflanzung von Saatgut, das von einem Saatguthersteller gekauft wurde, durch den Landwirt. Das von der Erntepflanze produzierte Produkt, sei es die ganze Pflanze, die Samen oder die Früchte der Pflanze, wird geerntet und dann für die verschiedenen vorstehend erwähnten Nahrungsmittelanwendungen verwendet. Zusätzlich zum Kauf von Saatgut von einer Saatgutfirma kann der Landwirt auch aus einer Ernte eines vorhergehenden Jahres aufbewahrtes Saatgut wieder auspflanzen. Das ist jedoch ökonomisch nur für Feldfrüchte sinnvoll, die als Inzucht- oder ausgekreuztes Saatgut verwendet werden. Es ist ökonomisch nicht vorteilhaft für Hybridfeldfrüchte, die gepflanzt werden, um die durch Heterosis erreichte erhöhte Produktivität zu erhalten. Die Hauptfeldfrüchte, die in den wichtigen landwirtschaftlichen Regionen gepflanzt werden, werden als Hybridfeldfrüchte gepflanzt, die dem Landwirt beträchtlichen Ertragszuwachs garantieren.
Die Herstellung von hybridem Saatgut durch spezialisierte Saatgutfirmen ist ein kostspieliges und kompliziertes Verfahren. Das Verfahren schließt die Züchtung und Auswahl von elterlichen Inzuchtlinien ein, die in geeigneten Kombinationen Nachkommen erzeugen, die eine maximale Anpassung an Umgebungsbedingungen bei maximalem Ertrag zeigen. Zur Herstellung von hybridem Saatgut werden Inzuchtlinien entweder als männlicher oder weiblicher Elternteil in einer Kreuzung gewählt, die F1-Hybridsaatgut ergibt. Da die meisten Feldfrüchte Zwitter sind, muss der weibliche Elternteil in einer Kreuzung männlich sterilisiert werden, um eine Selbstbestäubung während der Saatgutherstellung zu vermeiden. Für offen bestäubende Pflanzen wie Mais wird ein spezielles Pflanzschema verwendet, um die Selbstbestäubung des weiblichen Elternteils zu minimieren. Das schließt die Trennung der Pflanzen, die als männliche Elternteile verwendet werden sollen, von den weiblichen Elternteilen ein. Das erlaubt die leichte Trennung des F1-Hybridsaatguts am Ende der Saison.
Die männliche Sterilisation kann entweder mechanisch, wie es für Mais durchgeführt wird, manuell, wie es für Tomaten durchgeführt wird, oder chemisch, wie es für Weizen oder Reis durchgeführt wird, und genetisch unter Verwendung von cytoplasmatischer männlicher Sterilität (CMS) oder genetischer Inkompatibilität, wie es für Ölsamenraps, Zuckerrüben und andere durchgeführt wird, erreicht werden. Diese Verfahren variieren in ihrer Komplexität der landwirtschaftlichen Praxis oder der Manipulation der Pflanzen, aber ihnen ist gemeinsam, dass ihr Einsatz kostspielig, ihre Durchführung komplex und relativ ineffizient ist, abhängig vom verwendeten System. Diese Ineffizienz resultiert aus der Tatsache, dass fruchtbare Pflanzen zur Saatgutherstellung sterilisiert werden müssen, was auf sehr großen Anbauflächen, abhängig von der Feldfrucht, stattfindet. Daher muss eine Manipulation der weiblichen Elternteile in großem Maßstab durchgeführt werden. Die Behandlungen müssen auch Saatgut ergeben, das in der nächsten Generation, die der Landwirt pflanzt, lebensfähig ist.
Wir haben jetzt eine Möglichkeit gefunden, die vorstehend erwähnten Nachteile zu umgehen oder zu mildern.
Gemäß der vorliegenden Erfindung wird ein rekombinantes DNA-Konstrukt für die Insertion in das Genom einer Pflanze bereitgestellt, um dieser wiederherstellbare männliche Sterilität zu verleihen, umfassend:
(a) eine erste Genpromotorsequenz, die auf die Anwesenheit oder Abwesenheit eines exogenen chemischen Induktors anspricht,
(b) ein Gen, das ein Repressorprotein unter der Kontrolle der ersten Promotorsequenz codiert;
(c) eine Operatorsequenz für das Repressorprotein;
(d) eine zweite Genpromotorsequenz, die nur in männlichen Teilen einer Pflanze exprimierbar ist; und
(e) ein Gen, das einen Proteininhibitor einer Pflanzeneigenschaft codiert, die für die Produktion von lebensfähigem Pollen wichtig ist;
wobei die Anwesenheit oder Abwesenheit des exogenen chemischen Induktors die Selektion von männlicher Fertilität oder Sterilität ermöglicht.
Die Erfindung liefert auch transformierte Pflanzen und Pflanzenteile wie Zellen, Protoplasten und Saatgut, die das Konstrukt der Erfindung enthalten.
Daher wird gemäß einer Ausführungsform der Erfindung eine Pflanze bereitgestellt, die wiederherstellbar männlich steril ist, wobei die Pflanze das vorstehend definierte rekombinante DNA-Konstrukt stabil in ihr Genom eingebaut enthält.
Es wird bevorzugt, dass der erste Promotor die Expression des Repressorproteins auf die Stimulation durch den exogenen chemischen Induktor hin unterstützt, wobei in Abwesenheit des chemischen Induktors kein Repressorprotein exprimiert wird, das mit dem Operator interagiert, so dass die Expression des Gens, das den Inhibitor der männlichen Ferilität codiert, erlaubt wird, und in der Anwesenheit des chemischen Induktors Repressorprotein exprimiert wird, wodurch die Expression des Gens, das den Inhibitor männlicher Fertilität codiert, verhindert wird und der fertile Zustand der Pflanze wiederhergestellt wird. So enthält das Konstrukt der Erfindung mehrere funktionell verbundene Sequenzen (a) vorstehend der Einfachheit halber als "chemischer Schalter" bezeichnet: (b) als "die Repressorsequenz" (c) als "der Operator" (d) als "die MFS-Kontrolle" (d. h. für männliche Blüten spezifische Kontrolle) und (e) als das Unterbrechungsgen. Die wichtigen Elemente von jeder der Sequenzen und ihre Interaktion werden nachstehend beschrieben mit Bezug auf die begleitenden Zeichnungen.
Diese Erfindung ermöglicht die Herstellung von Inzuchtlinien, die mit verschiedenen molekularen Techniken und Vorgehensweisen männlich steril gemacht werden. Diese Pflanzen erfordern ein chemisches Schaltersystem für die Aufhebung der Fertilität (reversible männliche Sterilität; RMS). Beide Aspekte des System werden nach Mendel vererbt. Das wird über die Insertion der für kontrollierte Funktion von RMS erforderlichen molekularen Elemente in das Pflanzengenom erreicht werden.
Die Erfindung kann auf alle mono- oder dikotylen Pflanzen angewendet werden, die der Züchter oder Anbauer als F1-Hybridsaatgut produzieren -möchte, und für die geeignete Transformationstechniken verfügbar sind oder verfügbar werden, insbesondere Mais, Weizen, Sonnenblumen, Ölsamenraps, Tomaten und anderes Gemüse, Zuckerrüben und Zierblatt- und Blütenpflanzen. Sie besitzt große Vorteile in der Senkung der mit der Herstellung von F1- Hybridsaatgut verbundenen Ernteverwaltungskosten, der Einfachheit der Reinheitskontrolle des hybriden Saatguts, der Erhaltung von RMS-Linien und -Populationen, dem Transfer von RMS zwischen Linien und Populationen usw..
In einer spezifischen Anwendung werden wir die Herstellung von Pflanzen, insbesondere von Inzuchtpflanzen, die mit molekulartechnischen Vorgehensweisen steril gemacht wurden, beschreiben. Die Fertilität dieser Pflanzen kann mit einem chemischen Spray, das zur Wiederherstellung der Fertilität über eine molekulare Kontrollkaskade führt, wiederhergestellt werden. Das hier vorgestellte Verfahren besteht aus einer Reihe von Einzelbestandteilen, die Gegenstand getrennter Patentanmeldungen sind, die breitere Anwendungen der Bestandteile offenbaren.

1. DAS GESAMTE VERFAHREN

Fig. 1 der Zeichnungen ist ein Blockdiagramm des DNA-Konstrukts der Erfindung im "männlich sterilen" Zustand. In der Abwesenheit des exogenen chemischen Induktors ist der chemische Schalter inaktiv, und es wird kein Repressorprotein durch die Repressorsequenz exprimiert. In der Abwesenheit des Repressorproteins erlaubt die Operatorsequenz die Expression des Unterbrechungsproteins in männlich spezifischem Gewebe, wobei die Expression spezifisch auf männliche Teile der Pflanze durch die Anwesenheit der MFS- Kontrollsequenz ausgerichtet ist. Die Folge ist daher, dass die Pflanze männlich steril ist, unfähig ist, lebensfähigen Pollen zu bilden und daher unfähig, sich selbst zu bestäuben. Der praktische Nutzen dieses Effekts ist, dass, wenn solche Pflanzen, die den weiblichen Teil einer beabsichtigten Kreuzung darstellen, dem beabsichtigten männlichen Elternteil einer Kreuzung benachbart gepflanzt werden, sie durch den Pollen des beabsichtigten männlichen Teils bestäubt werden.
Fig. 2 zeigt die Arbeitsweise des Konstrukts im "männlich fertilen" Zustand. Wenn der chemische Induktor in Kontakt mit der Pflanze gebracht wird, wird der chemische Schalter aktiviert, was zur Expression des Repressorproteins führt. Das Repressorprotein bindet dann den Operator, wobei die Expression des Unterbrechungsproteins inhibiert und die männliche Fertilität wiederhergestellt wird. Der praktische Nutzen dieser Art von Arbeitsweise des Konstrukts ist, dass es die Produktion von lebensfähigem Pollen und Selbstbestäubung der Pflanze, die das Konstrukt enthält, erlaubt, so dass die Linie für zukünftigen Gebrauch erhalten wird.

2. DER CHEMISCHE SCHALTER

Es wird angenommen, dass eine große Zahl von Pflanzenpromotoren unter Verwendung von chemischen Signalen induziert wird. Es ist jedoch nur in wenigen Beispielen gezeigt worden, dass die spezifischen Chemikalien die Genexpression im für dieses Modell erforderlichen Gewebe anschalten. Das Gen von besonderem Interesse ist das Gen, das die 27K- Untereinheit der Glutathion-S-Transferase II (GSTII) codiert. Dieses Gen wird spezifisch bei Behandlung von Pflanzengeweben, die vor allem Antheren entwickeln, mit chemischen Safenern induziert. Ein solcher Safener ist N,N-Diallyl-2,2-dichloracetamid, aber es gibt verwandte Verbindungen, die verbesserte Mobilitätseigenschaften in Pflanzengeweben, verbunden mit einem verbesserten Fortbestehen für diese Anwendung und mit verbesserter Wirkung und Sicherheit, besitzen. Diese Verbindungen sind in der Literatur beschrieben worden.
Es ist klar, dass zusätzliche chemisch induzierte Promotoren in diesem Zusammenspiel verwendet werden können. Einige von diesen können pflanzlichen Ursprungs sein, andere können von Pilzen oder Hefen stammen. Die vorliegende Anwendung beinhaltet, dass diese Promotoren und für das RMS-Verfahren geeignete chemische Kombinationen im Fall von GSTII und Safenern verwendet werden können.

3. DIE REPRESSOR- UND OPERATORSEQUENZEN

In einer ersten Ausführungsform schlagen wir vor, die gut charakterisierte Interaktion zwischen bakteriellen Operatoren mit ihren Repressoren zu verwenden, um die Expression der 'Killer'-Genfunktion zu kontrollieren. Bakterielle Repressoren, vor allem der Lac-Repressor, oder Repressoren, die von 434, P22 und Lambda-Bakteriophagen verwendet werden, können verwendet werden, um die Expression in Pflanzenzellen sehr wirksam zu kontrollieren.
In einer zweiten Ausführungsform ist es möglich, 'Pseudooperatoren', Operatoren, die den normalerweise in einer speziellen Operator-Repressor-Kombination verwendeten Operatoren ähnlich, aber nicht identisch sind, zu verwenden. Wir haben gezeigt, dass unter Verwendung eines geeigneten Selektionssystems mutierte Repressoren erzeugt werden können, die in Pflanzengenen vorkommende Pseudooperatoren erkennen. Wir beschreiben nachstehend die Selektion mutierter Repressoren, die Pseudooperatoren erkennen, die in Pflanzengenen vorkommen.
Eine andere Vorgehensweise für die Herunterregulierung der 'Killer'-Gene, die in Betracht gezogen werden kann, ist die Verwendung von Antisense-RNA. Es ist gezeigt worden, dass diese gut für die Regulation der Polygalacturonase, die während der Tomatenfruchtreife exprimiert wird, arbeitet, und sie ist in der Literatur beschrieben.

4. FÜR MÄNNLICHE BLÜTEN SPEZIFISCHE EXPRESSIONSKASSETTE

Wie schon erwähnt muss die Expression der 'Killer'-Gene in für männliche Blüten spezifischen Geweben (MFS) stattfinden. Das können Gewebe sein, die in den sich entwickelnden Antheren gefunden werden, in Geweben, die mit den sich entwickelnden Antheren und dem Pollen verbunden sind.
DNA-Promotorsequenzen, die die Expression von Genen in MFS-Geweben unterstützen, können mit etablierten Protokollen zur Identifikation von Genen, die in MFS-Geweben exprimiert werden, über differentielles Absuchen von cDNA-Genbanken, die in verschiedene Vektorsysteme cloniert wurden, die Isolierung von Genen, die diese cDNAs codieren, aus genomischen Genbanken mit Bakteriophage Lambda-Vektoren und die Charakterisierung ihrer Promotorsequenzen durch DNA-Sequenzierung und analytische Pflanzentransformationsexperimente erhalten werden.

5. UNTERBRECHUNGSGEN

Die Inhibition der Pollenbildung wird unter Verwendung neuer 'Killer'-Gene erreicht, die, wenn sie spezifisch in männlichen Blüten während der Pollenbildung exprimiert werden (für Details vgl. vorstehend), zum Zelltod von Antheren und verbundenem Gewebe, Pollenmutterzellen, Pollen und verbundenen Geweben führen. Das führt zum Abbruch der Pollenbildung und zu männlich sterilen Pflanzen. Der Ursprung der 'Killer'-Gene kann eine Vielzahl natürlich vorkommender Quellen sein, z. B. menschliche Zellen, Hefezellen, Pflanzenzellen, Pilzzellen, oder sie können völlig synthetische Gene sein, die aus DNA- Sequenzen bestehen können, von denen einige in der Natur vorkommen, andere normalerweise nicht in der Natur zu finden sind oder eine Mischung von beiden. Die 'Killer'-Gene werden bevorzugt einen Effekt auf den mitochondrialen Metabolismus haben, und es ist ganz klar gezeigt worden, dass reichliche Energieversorgung ein absolutes Erfordernis für die Herstellung von fruchtbarem Pollen ist. Es wird jedoch auch ins Auge gefasst, dass die 'Killer'-Funktion wirksam auf andere wichtige biochemische Ziele wie DNA-Metabolismus, Proteinsynthese und andere metabolische Wege gerichtet werden kann. Zwei solche DNA-Konstrukte bestehen aus solchen Sequenzen, die das Entkopplungsprotein des braunen Fettgewebes von Säugern oder Varianten davon codieren, oder einem synthetischen Gen, das aus einer mitochondrialen Zielrichtungsdomäne und einer lipophilen Domäne, die die Insertion des Proteins in die mitochondriale Membran erlaubt, besteht.

6. HERSTELLUNG EINER EXPRESSIONSEINHEIT, BESTEHEND AUS MFS- PROMOTORSEQUENZEN UND 'KILLER'-GENEN

Die Herstellung einer Expressionseinheit, die aus dem für die männliche Blüte spezifischen Genkontrollsequenzen (MFS-Kontrolle) und den 'Killer'-Genen besteht, wird mit etablierten molekularen Techniken durchgeführt. Die Expression dieser Einheit in Eliteinzuchtlinien wird zur Herstellung des 'Killer'-Genprodukts nur in für männliche Blüten spezifischen Geweben führen. Das wird zur Herstellung von männlich sterilen Pflanzen führen.

7. TRANSFORMATION

Transgene Pflanzen werden durch Insertion der beschriebenen Konstrukte in das Genom der Pflanzen erhalten. Das für die Insertion der Genkonstrukte dieser Erfindung in das Pflanzengenom verwendete spezifische Transformationsverfahren gehört nicht eigens zu dieser Erfindung. Zahlreiche Verfahren sind aus der Literatur bekannt, wie Agroinfektion mit Agrobacterium tumefaciens oder seinem Ti-Plasmid, Elektroporation, Mikroinjektion von Pflanzenzellen und Protoplasten, mikroprojektile Transformation und Pollenschlauchtransformation, um nur einige zu nennen. Für alle Details der bekannten Verfahren wird auf die Literatur verwiesen.

8. AUFHEBUNG DER STERILITÄT

Es ist offensichtlich, dass Pflanzen, die mittels der vorstehenden Techniken und Verfahren steril gemacht wurden, nicht per se wünschenswert sind. Daher schlugen wir vor, eine Kaskade mit molekularen Elementen zu verwenden, die die Aufhebung der konstruierten Sterilität hin zur Fertilität erlauben, wobei auf diese Weise die Aufrechterhaltung dieser Pflanzen und ihre Verwendung in der Herstellung von F1-Hybridsaatgut erlaubt wird.

Planung des Aufhebungsmechanismus

Der hier vorgeschlagene Aufhebungsmechanismus besteht aus drei getrennten Elementen:
a. ein chemisch zu schaltender Promotor
b. eine bakterielle Operatorsequenz
c. ein bakterielles Repressorgen, das mit hoher Affinität an den vorstehend erwähnten Operator bindet.
Diese Elemente agieren auf folgende Weise: wenn die Wiederherstellung der Fertilität erforderlich ist (z. B. in den Aufrechterhaltungsbeeten der Inzuchtlinien), werden die Pflanzen mit einer Chemikalie besprüht. Diese Chemikalie induziert über einen chemisch-induzierbaren Promotor die Expression eines bakteriellen Repressormoleküls, das an Operator-DNA- Sequenzen in den MFS-Kontrollsequenzen bindet. Diese Bindung führt zur Inhibition der 'Killer'-Genfunktion, wobei auf diese Weise das Stattfinden der normalen Pollenbildung erlaubt wird.

9A. ANWENDUNG AUF DIE F1-HYBRIDHERSTELLUNG

Fig. 1 legt in Umrissen die molekularen Ereignisse dar, die stattfinden, wenn RMS in ausgewählten Pflanzen verwendet wird. Drei genetische Szenarios sind für die Expression der eingeführten Eigenschaften verfügbar, abhängig davon, ob sie dazu bestimmt sind, als dominante oder rezessive Gene zu agieren, und davon, ob die Expression derart geregelt ist, dass sie in den Geweben des elterlichen Sporophyten oder Gametophyten vorkommt. Diese Szenarios werden in Tabelle I nachstehend zusammengefasst. TABELLE 1 HERSTELLUNG VON F1-HYBRIDEN
Wenn zum Beispiel die RMS-Bestandteile, vor allem die "Killergen"-Funktionen, als dominante(s) Gen(e) exprimiert werden, ist es ratsam, RMS in einem heterozygoten Zustand zu verwenden (RMS/+ in der vorstehend erwähnten Klassifikation "Sphorophytisch dominant"). Es ist in diesem Fall eingeschlossen, dass während der F1-Hybridsaatgutherstellung die resultierenden Hybride entweder RMS/+ oder +/+ in ihrem Genotyp sind. Das bedeutet, dass nur 50% der Pflanzen (+/+) in der Lage sein werden, zu der Pollenerzeugung in F1, die für die Kornherstellung verwendet wird, beizutragen. Das wird für die meisten Ernten ausreichen, vor allem in Mais, wo eine große Menge Pollen erzeugt wird.
Wichtig ist, dass RMS auch in der Herstellung anderer Klassen von Hybriden wie Dreiwege- oder Vierwege-Kreuzungen verwendet werden kann. In der vorstehend erwähnten Ausführungsform unter Verwendung der sporophytisch dominanten Expression erzeugt die Verwendung des weiblichen Genotyps RMS/RMS in der ersten Kreuzung passend den Genotyp RMS/+ bei Kreuzung mit einem +/+-Pollenerzeuger. Der rms/+-Genotyp stellt dann den männlich sterilen weiblichen Elternteil zur Verwendung in der zweiten Kreuzung dar (vgl. Tabelle II nachstehend). TABELLE II HERSTELLUNG VON 3- UND 4-WEGE-KREUZUNGEN
* In diesen Ausführungsformen wird der erste Pollenerzeuger mit dem chemischen Schalter behandelt, um die männliche Fertilität wiederherzustellen.
** Der zweite Pollenerzeuger kann eine Inzuchtlinie (3-Wege) oder ein Hybrid (4-Wege) sein.

9B. ANWENDUNGEN IN ZÜCHTUNGSPROGRAMMEN

Zusätzlich zu seiner breiten Nützlichkeit in der Herstellung von hybridem Saatgut wird die RMS-Erfindung auch in Züchtungsprogrammen praktisch verwendet, zum Beispiel um Auskreuzungen in synthetischen Populationen, von denen neue Inzuchtlinien abgeleitet werden sollen, durchzuführen. Ähnliche Szenarios, aber nicht beschränkt auf die in der vorstehenden Tabelle gezeigten, für den ersten Zyklus in der Herstellung von 3- oder 4-Wege-Kreuzungen können angewendet werden. Die Verwendung des chemischen Schalters erleichtert folgende Runden eigener Zyklen, um neue und verbesserte Genotypen herzustellen. DNA-Sequenzen, die von den DNA-Sequenzen abstammen, die verwendet wurden, um die RMS-Erfindung zu ermöglichen, können praktischerweise zur molekularen Durchmusterung (RFLP-Analysen) als Sonden während der Inzucht verwendet werden, um sicherzustellen, dass die zu liefernden Nachkommen alle Elemente des RMS-Systems behalten haben. Diese Strategien bieten ein günstiges und effizientes Verfahren, um die RMS-Eigenschaft auf neues Keimplasma zu übertragen.
Die Erfindung wird jetzt illustrativ anhand der folgenden spezifischen Beschreibung verschiedener, aus Komponenten bestehender Geneinheiten, die verwendet werden können, beschrieben. Es wird auf die begleitenden Zeichnungen verwiesen.

DIE ZEICHUNGEN

Fig. 1 ist ein Blockdiagramm des Genkonstrukts dieser Erfindung mit den Pflanzen im männlich sterilen Zustand;
Fig. 2 ist ein Blockdiagramm des Genkonstrukts dieser Erfindung mit den Pflanzen im männlich fruchtbaren Zustand;
Fig. 3 zeigt die Ergebnisse für gesamte GST-Aktivität in Wurzeln und Trieben, die 23 und 44 Stunden nach Behandlung mit R25, wie nachstehend beschrieben, erhalten wurden;
Fig. 4 zeigt die chromatographische Trennung der Isozyme GSTI und GSTII;
Fig. 5 zeigt in unbehandeltem Antheren-Gewebe vorhandene GSTI-Aktivität;
Fig. 6 zeigt die Stimulation der GSTII-Aktivität nach Behandlung mit R25, wie nachstehend beschrieben;
Fig. 7 zeigt die Ergebnisse unter Verwendung einer Stengelreservoirtechnik;
Fig. 8 zeigt die Ergebnisse bei Anwendung von Spray; und
Fig. 9 ist ein Zeitverlaufsgraph, erzeugt auf die nachstehend beschriebene Weise;
Fig. 10 zeigt die Struktur des Vektors p35SlacI;
Fig. 11 zeigt die Grundstruktur von pCG 1 und pCG2;
Fig. 12 zeigt die Nucleotidsequenz des Mais-CAB-Promotors;
Fig. 13 ist eine Karte von pAD- und pPS1-Reihen von Plasmiden;
Fig. 14 zeigt das für die Isolation von Maisblüten-spezifischen Clonen verwendete Genbankdurchmusterungsverfahren;
Fig. 15 zeigt die Dot-Blot-Analyse von Gesamt-RNA (4 ug per Dot), extrahiert aus Narbenfäden von Mais zunehmender Länge;
Fig. 16 A, B, C zeigt eine in Situ-Hybridisierung von Maisährchenschnitten mit pMS14- Antisense-RNA-Sonden;
Fig. 17 zeigt die Nucleotid- und abgeleitete Aminosäuresequenz von MFS-cDNA-Clon pMS10;
Fig. 18 zeigt die Nucleotid- und abgeleitete Aminosäuresequenz von MFS-cDNA-Clon pMS14;
Fig. 19 zeigt die Nucleotid- und abgeleitete Aminosäuresequenz von MFS-cDNA-Clon pMS 18;
Fig. 20 ist eine Restriktionskarte des 9kb-EcoRI-Fragments von Clon 10/CT8-3;
Fig. 21 ist eine Restriktionskarte des 9kb-EcoRI-Fragments von Clon 14/17M;
Fig. 22 ist eine Restriktionskarte des 9kb-EcoRI-Fragments von Clon 18/CT3;
Fig. 23 ist eine Plasmidkarte von Clon pMS10-5;
Fig. 24 zeigt die Struktur von pTAK1, pTAK2 und pTAK3; und
Fig. 25 ist eine Karte von Clon pMS 10-6GUS;
Fig. 26 ist eine Karte von Plasmid pCGS 110-UCP;
Fig. 27 zeigt die mRNA-Sequenz des Entkopplungsproteingens von Säugern aus Plasmid pCGS 110-UCP (gezeigt in Fig. 24);
Fig. 28 ist eine Fließdiagramm-Darstellung der Erzeugung eines leu2, gal1- Hefestamms;
Fig. 29 ist eine Tabelle, die die Wirkung der Zugabe von Galactose auf das Wachstumvon BET9- und BET27-Transformanten zeigt;
Fig. 30 zeigt die Ergebnisse der Wachstumskurvenanalyse von BET9- (Fig. 28A) und BET27- (Fig. 28B) Transformanten, die auf gly/cas-Medium für einen Zeitraum von 65 Stunden in Anwesenheit oder Abwesenheit von Galactose wachsen gelassen wurden;
Fig. 31 ist eine Wachstumskurvenanalyse von Ratten-UCP in Stamm BET9, der auf gly/cas-Medium für einen Zeitraum von 50 Stunden in Anwesenheit oder Abwesenheit von Galactose wachsen gelassen wurde;
Fig. 32 ist die Wachstumskurvenanalyse von Ratten-UCP in Stamm BET9, der auf - Raffinose-Medium für einen Zeitraum von 45 Stunden in Anwesenheit oder Abwesenheit von Galactose wachsen gelassen wurde;
Fig. 33 veranschaulicht die Konstruktion des Plasmids-YIP/UCP von pKV49-UCP und YIp5;
Fig. 34 ist eine Karte von Plasmid pGR208 (Fig. 32A) und die Sequenz von Oligonucleotiden, die verwendet wurden, um das Gen der β-Untereinheit von F&sub1;-ATPase zu mutieren (Fig. 22B);
Fig. 35 zeigt Karten der Plasmide pKV49 (Fig. 33A) und pKV49-UCP (Fig. 33B);
Fig. 36 zeigt schematisch die Konstruktion eines β-Untereinheit/β-Galactosidase- Fusionsproteins;
Fig. 37 ist eine Plasmidkarte von pKV49/BLZ;
Fig. 38 ist eine Plasmidkarte von pMS10-5; und
Fig. 39 ist eine Plasmidkarte von pBin/MS10-UCP.

DIE PLASMIDE

Verschiedene Genkonstrukte werden in den folgenden Abschnitten beschrieben, und diese sind in der National Collection of Industrial & Marine Bacteria in Aberdeen, UK hinterlegt worden. Die Daten der Hinterlegung und die Hinterlegungsnummern werden in Tabelle III nachstehend zusammengefasst. TABELLE III

I. DER CHEMISCHE SCHALTER

Dieser Baustein wird durch eine chemisch induzierbare Genpromotorsequenz, isoliert von einer 27kd-Untereinheit des Glutathion-S-Transferase (GST II)-Gens aus Mais, veranschaulicht.
In der Praxis wird der chemisch induzierbare Promotor der Erfindung als eine Promotorsequenz in ein rekombinantes Genkonstrukt, das für die Verwendung in einer Pflanze bestimmt ist; eingefügt werden. Das Konstrukt wird dann in die Pflanze durch Transformation eingefügt werden. Die Expression von Protein-codierenden Genen in dem Konstrukt, die unter der Kontrolle des chemisch anschaltbaren Promotors der Erfindung stehen, kann durch die Anwendung eines chemischen Induktors bei der Pflanze kontrolliert werden.
Ein Beispiel wirksamer Promotor/Induktor-Kombinationen ist der vorstehend erwähnte GST II-Promotor, und der Induktor ist N,N-Diallyl-2,2-dichloracetamid (allgemeiner Name: Dichloramid) oder Benzyl-2-chlor-4-(trifluormethyl)-5-thiazol-carboxylat (allgemeiner Name: Flurazol).
Chemische Induktoren, die mögliche Induktoren der Expression der GSTII-27kd- Untereinheit sind, schließen Verbindungen ein wie:
1. Benzyl-2-chlor-4-(trifluormethyl)-5-thiazol-carboxylat;
2. Naphthalen-1,8-dicarboxylsäureanhydrid;
3. 2-Dichlormethyl-2-methyl-1,3-dioxolan;
4. 1-(Dichloracetyl)-hexahydro-3,3,8a-trimethylpyrrol (1,2-a)-pyrimidin-6(2H)-on;
5. 2,2,5-Trimethyl-N-dichloracetyloxazolidin;
6. 1,3-Dioxolan-2-ylmethoxyimono(phenyl)benzolacetonitril;
7. 4,6-Dichlor-2-phenyl-pyrimidin;
8. 2,2-Dichlor-[N-allyl-N(1,3-dioxalan-2-methyl)]acetamid;
9. 1-(Cyanmethoxyimino)benzacetonitril;
10. 4'-Chlor-2,2,2-trifluoracetophenon-O-1,3-dioxolan-2-ylmethyloxim;
11. 2,2-Dichlor-1-(3,4-dihydro-3-methyl-2H-1,4-benzoxazin-4-yl)ethanon;
12. 3-Dichloracetyl-2,2-dimethyloxazolidin;
13. 4-Methoxy-3,3-dimethylbenzophenon;
14. 1-Cyclohexyl-4,4-dimethyl-2-(1H-1,2,4-triazol-1-yl) pent-1-en-3-ol;
15. 2,2-Dichlor-N-(3-methyl-4-thiazolin-2-yliden) acetamid;
16. O,O-Diethyl-O-phenylphosphorothioat;
17. 2,2-Spirocyclohexyl-N-dichloracetyloxazolidin;
18. N-Benzyl-N-ethyl-dichloracetamid;
19. 3-Chloracetyl-4,4-cyclohexan-sniro-2,2-dimethyl-1,3-oxazolidin; und
20. Spirooxazolidinacetamid.
Glutathion-S-Transferasen (GST) sind eine Familie von Enzymen, die die Konjugation von Glutathion über die Sulfhydrylgruppe an eine große Gruppe von hydrophoben, elektrophilen Verbindungen katalysieren. Die Konjugation resultiert in der Entgiftung dieser Verbindungen - und der Entfernung aus dem Gewebe in Insekten und Tieren.
GST-Enzyme sind in einer Reihe von Feldfruchtpflanzen einschließlich Mais, Weizen, Hirse und Erbsen identifiziert worden. GSTs machen 1-2% des gesamten löslichen Proteins in etiolierten Maissämlingen aus.
Die große Isoform von GST kann in Maisgewebe unterschieden werden. GST I ist konstitutiv exprimiert und kann Glutathion mit den neu aufkommenden Herbiziden Alachlor und Atrazin konjugieren. Die Behandlung von Maisgeweben mit chemischen Safenern (zum Beispiel N,N-Diallyl-2,2-dichloracetamid) ruft die Aktivität von GST I hervor, die an der Entgiftung der neu aufkommenden Herbizide teilnimmt.

Safenerbehandlung von Korngewebe

Zur Behandlung von jungen Maissämlingen ließ man die Samen auf feuchtem Filterpapier keimen. Nach der Keimung und dem Wachstum (bis zu einer Woche) wurde der Safener N,N- Diallyl-2,2-dichloracetamid (hier nachstehend als R25 bezeichnet) zum Wasser auf dem Filterpapier zugegeben, um eine Reihe von Konzentrationen (0.003 bis 30 ppm) zu ergeben, und die Sämlinge wurden für weitere 33 bis 44 Stunden wachsen gelassen, bevor das Wurzel- und Triebgewebe geerntet wurde. Fig. 3 zeigt die Ergebnisse für die gesamte in Wurzeln und Trieben 23 und 44 Stunden nach Behandlung, wie beschrieben, erhaltene GST-Aktivität, und Fig. 4 zeigt die Trennung der Isozyme GST I und GST II.
Zur Behandlung von Maisnarbenfäden und Antherengewebe wurde eine Lösung von 800 ug R25 in den Knoten direkt unterhalb des sich entwickelnden Narbenfadens injiziert. Die Aufnahme dauerte dann weitere 48 bis 72 Stunden an. Fig. 5 zeigt, dass nur GST I-Aktivität in unbehandeltem Antherengewebe vorhanden war, und Fig. 6 zeigt die Stimulation der GST II- Aktivität nach Behandlung, wie beschrieben.
In einer anderen Ausführungsform wurde eine 100 ppm-Lösung von R25 aus einem am exponierten Stengel direkt unterhalb des sich entwickelnden Narbenfadens befestigten Glasreservoir geliefert. Fig. 7 zeigt die Ergebnisse einer Stengelreservoirtechnik. Zusätzlich wurde R25 als ein 100 ppm-Spray direkt auf den exponierten, sich entwickelnden Stengel angewendet. Fig. 8 zeigt die Ergebnisse der Sprayanwendung.
Beide GST-Proteine besitzen ein natives Molekulargewicht von etwa 50 kd. Wie in Säugern sind Mais-GSTs Dimere; GST I besitzt offensichtlich identische Untereinheiten von 29 kd, während GST II ein Heterodimer ist aus einer ähnlich zu der in GST I gefundenen 29 kd- Untereinheit und einer neuen 27 kd-Untereinheit, die nur in mit Safener behandeltem Gewebe vorhanden ist, mit Ausnahme der Sämlingswurzel, wo sie konstitutiv exprimiert wird, aber noch durch Safenerbehandlung induziert werden kann.
Eine cDNA und ein der 29 kd-Untereinheit von GST I-entsprechendes Gen sind früher cloniert und sequenziert worden. Zusätzlich ist eine cDNA, die einer 26 kd-Untereinheit einer dritten Nebenkomponente der GST-Aktivität in Maissämlingen (GST III) entspricht, früher cloniert und sequenziert worden.

Enzymtest

Die Enzymaktivität wurde spektrophotometrisch bei 340 nm mit 1-Chlor-2,4- dinitrobenzol (CDNB) als ein Substrat gemessen. Der Reaktionspuffer enthielt 0.1 M EDTA, 0.001 M CDNB und 0.0025 M Glutathion.

Herstellung von Extrakten und Enzymreinigung

Gewebe wurde in 0.05 M Tris.HCl, pH 7.8; 0.001 M EDTA; 0.001 M DTT; und 7.5% Polyvinylpyrrolidon mit Pistill und Mörser bei 4ºC homogenisiert und bei 30,000 g zentrifugiert, um einen Rohextrakt zu erhalten.
Die Abtrennung der GST-Isoformen aus dem Rohextrakt wurde wie folgt erreicht: der Rohextrakt wurde auf eine DEAE-Sepharose-Säule gegeben und mit 0.01 M Tris.HCl, pH 7.8; 0.001 M EDTA; und 0.001 M DTT gewaschen. Die gebundene GST wurde mit 0.3 M Kaliumchlorid eluiert. GST-Aktivität enthaltende Fraktionen wurden vereint und unter Verwendung von PD10-Gelfiltrationssäulen entsalzt. Die Auftrennung von GST I- und GST II- Isoformen wurde mittels FPLC auf einer Mono-Q-Säule und Kaliumchloridkonzentrationsgradienten von 0 bis 0.4 M erreicht.
Reine Proben von GST I und GST II wurden durch Auftragen entsalzter Fraktionen von GST I und GST II aus der FPLC auf eine mit 0.05 M Phosphatpuffer bei pH 7.3 äquilibrierte Glutathion-S-Sepharose-Affinitätssäule erhalten. Nach Waschen mit Puffer wurde gebundene GST mit 0.005 M Glutathion eluiert.
SDS-PAGE (17.5%, 30 : 0.174 Acrylamid : Bisacrylamid) von GST I oder GST II wurde durch Konzentrierung reiner GST-Proben mit Amicon Centricon 10 Microconcentrations (Warenzeichen), Denaturierung der Proben in Mercaptoethanol enthaltendem Laemmlipuffer und Färben der Gele mit Coomassie-Blau erreicht.

Erzeugung von Antikörpern gegen das Enzym

Ausreichend Protein, um die Immunisierung von Kaninchen zu ermöglichen, wird durch Vereinigung der isolierten Enzymuntereinheit, isoliert, wie vorstehend beschrieben, aus einer Reihe von separaten Experimenten erhalten. Das 27 kd-GST II-Polypeptid wird anschließend bis zur offensichtlichen Homogenität durch Elektroelution aus Polyacrylamidgelstücken gereinigt. Die Immunisierung von Kaninchen wird im wesentlichen nach Mayer und Walker (1987) durchgeführt.

N-terminale Sequenzanalyse

Die aminoterminale Sequenz der intakten 27 kd-Untereinheit von GST II oder partieller proteolytischer Spaltprodukte wurde mittels sequentiellem Edmanabbau und anschließender Aminosäureanalyse mittels HPLC bestimmt.

Zeitverlauf

Ein Zeitverlaufsexperiment wurde durchgeführt, um die Expression der GSTs nach Safenerbehandlung zu untersuchen. Eine 30 ppm-Lösung von R25 wurde zu 3 Tage alten Sämlingswurzeln gegeben, und Gewebe wurde nach verschiedenen Zeiträumen nach Safenerbehandlung geerntet. Die Proben wurden unter Verwendung des vorstehend beschriebenen Enzymtests auf GST-Aktivität getestet. Die Ergebnisse dieses Experiments sind graphisch in Fig. 9 dargestellt.

Synthese von cDNA-Genbanken

Die Zeitverlaufsexperimente deckten einen Peak der GST-Expression bei 48 Stunden nach Behandlung mit einem Safener auf. Daher wurden zwei cDNA-Genbanken aus RNA, extrahiert aus Gewebe 24 und 48 Stunden nach Safenerbehandlung, hergestellt. Um sicherzustellen, dass das Induktionsverfahren erfolgreich war, wurde eine Probe von 1 Gramm aus für 24 Stunden induziertem Gewebe entnommen und auf GST II getestet. Dieses Experiment deckte auf, dass das zur Herstellung der cDNA-Genbank verwendete Gewebe tatsächlich erfolgreich induziert worden war, da GST II 45.5% der gesamten GST-Aktivität ausmachte. Doppelsträngige cDNA wurde aus OligodT-Cellulose gereinigter RNA mittels eines Verfahrens mit RNaseH und E. coli-DNA-Polymerase I bei der Synthese des zweiten Stranges ohne vorherige Reinigung der einzelsträngigen cDNA hergestellt (Gubler und Hoffman, 1983).

Durchsuchen von cDNA-Genbanken mit Antiseren hegen GST I und GST II

Um einen cDNA-Clon, der ein GST-Enzym des Maisnarbenfadens codiert, zu identifizieren, werden Bacteriophagen aus der amplifizierten cDNA-Genbank mit anti-Mais- GST-Enzym-Serum durchsucht. Die Clone, die die stärksten Signale erzeugen, werden nochmals durchsucht.

Durchsuchen von cDNA-Genbanken mit Oligosonden

Gemische von synthetischen Oligonucleotiden auf der Grundlage der vorstehend bestimmten Aminosäuresequenz wurden mittels chemischer Phosphoamiditsynthese hergestellt Die 5'-Enden der Oligonucleotide wurden mit Polynucleotidkinase, wie in der Literatur beschrieben, markiert.
Etwa 40,000 cDNA enthaltende Phagen wurden auf Platten amplifiziert und auf Nitrocellulose transferiert. Die Filter wurden mit Oligonucleotidsonden bei Temperaturen von 2 bis 5ºC unter der für die Sonde in dem Gemisch mit der niedrigsten Schmelztemperatur berechneten Schmelztemperatur hybridisiert. Hybridisierende Plaques wurden ausgewählt und nochmals in zwei oder mehr Runden, genau wie vorstehend beschrieben, aber bei niedrigeren Dichten durchsucht.

Isolation von cDNA-Gensequenzen mittels PCR-Verfahren

cDNA- oder DNA-Sequenzen werden aus den beschriebenen Genbanken mit Oligoprimern auf der Grundlage der durch teilweise proteolytische Spaltung erhaltenen Aminosäuresequenz oder im Fall von genomischer DNA Primern auf der Grundlage der früher bestimmten cDNA-Sequenz isoliert.

Charakterisierung und Sequenzanalyse von GST-cDNA-Clonen

Die isolierte cDNA wird charakterisiert und der Sequenzierung mit einer oder mehreren verfügbaren Standardverfahren unterzogen.

Isolation genomischer Sequenzen

Eine bestehende genomische Genbank von Fragmenten von gesamter in λEMBL3 clonierter Mais-DNA wird verwendet, um Clone zu isolieren, die mit, wie vorstehend beschrieben, isolierten cDNA-Clonen hybridisieren.
In einer anderen Ausführungsform kann das vorstehend beschriebene PCR-Verfahren verwendet werden, um Genfragmente selektiv zu amplifizieren und zu clonieren. GST II-Gene und ihre Promotorsequenzen können dann isoliert werden und mit etablierten Techniken charakterisiert werden. Es kann gezeigt werden, dass die GST II-Promotorsequenzen Safenerinduzierte Genaktivität vermitteln, indem man sie mit Markergenen wie GUS und CAT verbindet und sie dann in transgenen Pflanzen testet.

II. DIE REPRESSOR- UND OPERATORSEOUENZEN

Diese Einheit reguliert die Pflanzengenexpression. Genauer reguliert die Einheit die Pflanzengenexpression, indem sie Repressormoleküle bakteriellen oder niedrigeren eukaryontischen Ursprungs verwendet.
Gebräuchlicherweise schließt die Verbesserung von Feldfruchtpflanzenarten die Einführung von gewünschten Merkmalen durch genetische Kreuzungen ein. Sie liefern jedoch keine Möglichkeit der Kontrolle der Expression der neu erworbenen Merkmale, obwohl diese Züchtungstechniken sehr erfolgreich sind. Kürzliche Fortschritte in der Technologie erlauben es jetzt, die für die Festlegung der Pflanzenstruktur und die Produktivität und Qualität der Feldfrüchte verantwortlichen Gene zu identifizieren und isolieren. Eine größeres Ziel im Gebiet der Verbesserung ist es daher, in der Lage zu sein, komplexe Entwicklungsvorgänge genetisch zu manipulieren, um die Effektivität der Feldfruchtpflanzen zu verbessern. Wichtig für dieses Ziel ist die Bestimmung von Strategien, die die Regulation der Expression spezifischer Pflanzengene nach Belieben erlauben.
Die Möglichkeit, die Expression von Merkmalen gemäss den Umständen zu kontrollieren, hat viele wichtige Anwendungen wie die Kontrolle von Insektenresistenzgenen, die Bestimmung der Pflanzengröße und die Wahl des Zeitpunkts der Blüte und die Kontrolle der Pflanzenfruchtbarkeit. Zusätzlich würde die Möglichkeit, Gene nach Belieben an- oder abzuschalten, ein unschätzbares Werkzeug zur Untersuchung der Pflanzengenetik per se sein, ohne die Pflanzenphysiologie oder die Umgebung zu stören.
Im Moment beinhaltet die Herstellung von Saatgut für hybride Feldfruchtpflanzen wie Mais das aufwendige und teure Verfahren der männlichen Sterilisierung der Elternpflanzen per Hand oder mechanisch, um die Selbstbestäubung zu verhindern. Solche männliche Sterilisation kann jedoch genetisch kontrolliert werden, indem man ein als cytoplasmatische männliche Sterilität (CMS) bekanntes Merkmal verwendet, das in einem breiten Spektrum von Feldfruchtarten beobachtet worden war. CMS stört die männliche Gametogenese, was in der Hemmung der Pollenbildung resultiert, aber normalerweise nicht die weibliche Fruchtbarkeit beeinflusst. Folglich sind "männlich-sterile" Pflanzen in der Lage, Saatgut zu produzieren, wobei dieses Saatgut nur aus der Kreuz-Bestäubung resultiert. Die Möglichkeit, die Expression dieser Gene zu kontrollieren, würde es erlauben, die männliche Gametogenese bei der Herstellung von hybridem Feldfruchtsaatgut ohne Notwendigkeit von teuren Sterilisationsverfahren zu hemmen, wobei die genetische Verbesserung des männlichen Elternteils mittels herkömmlicher Züchtungsprogramme immer noch möglich ist.
Die Kontrolle der Genexpression sowohl in Prokaryonten als auch in Eukaryonten basiert primär auf der Interaktion regulatorischer Proteine mit spezifischen DNA-Sequenzen. Abhängig von der Art dieser Interaktionen kann die Transkription von den verwandten Promotoren aus entweder unterdrückt oder aktiviert werden. In der Tat kann in einigen Fällen dasselbe Protein die Transkription entweder reduzieren oder verstärken, je nach der Natur der gemachten Kontakte. Weiter wird die Fähigkeit einiger regulatorischer Proteine, ihre Zielsequenzen zu binden, durch die Bindung von Liganden oder durch spezifische proteolytische Spaltung verändert. Solche Mechanismen können ausgenutzt werden, um die Induzierbarkeit in die Strategien zur Genregulation in Pflanzen einzuschließen.
Die am besten charakterisierten regulatorischen Systeme sind solche in Bakterien, in denen die Interaktionen zwischen den DNA-bindenen Proteinen (Repressoren) und den Ziel- DNA-Sequenzen (Operatoren) in genauen Einzelheiten verstanden werden. Ein Vergleich der am besten verstandenen Systeme, einschließlich Repressor und Cro-Proteine des Bakteriophagen λ und 434, des LacI-Repressors und des Katabolitgen-Aktivatorproteins (CAP), offenbart mehrere gemeinsame Faktoren. Diese regulatorischen Proteine binden als Dimere oder Tetramere an kurze Operatoren, die einen hohen Grad an zweifacher Rotationssymmetrie ("dyad symmetry") zeigen. In den meisten Fällen enthält die für die DNA-Erkennung verantwortliche Domäne, die getrennt von der ist, die für die Oligomerisierung der Monomere verantwortlich ist, eine konservierte Helix-Turn-Helix-Struktur. Eine spezifische Helix innerhalb dieser Struktur in jedem Monomer, die Erkennungshelix, lichtet sich nach der großen Grube der DNA aus, und nur, wenn spezifische Kontakte zwischen den Aminosäuren dieser Erkennungshelix und den Basen der benachbarten DNA gebildet werden, kann ein funktioneller Repressor/Operator- Komplex gebildet werden. Solche Interaktionen sind sehr spezifisch, und die hochaffinen Komplexe werden mit extrem schnellen Kinetiken gebildet.
Das Wissen der Mechanismen, durch die die Genexpression in Eukaryonten reguliert wird, ist viel weniger genau. In Hefe- und Säugetierzellen sind eine große Zahl von Bindungsstellen mutmaßlicher regulatorischer Proteine in Promotorsequenzen identifiziert worden, und in einigen Fällen sind die verantwortlichen Proteine auch isoliert worden. Jedoch nur in einigen Fällen sind die molekularen Details der Protein-DNA-Interaktionen und der Mechanismus der Regulation der Transkription bekannt.
In Pflanzen ist die Regulation der Genexpression nur auf einer elementaren Ebene verstanden. Mehrere regulatorische Elemente sind in Promotorsequenzen identifiziert worden, und einige regulatorische Proteine sind auf einer vorläufigen Ebene untersucht worden. Solche Proteine müssen jedoch noch isoliert werden und die Details der beteiligten Mechanismen aufgeklärt werden.
Eukaryontische regulatorische Systeme scheinen eine größere Vielfalt der Struktur und einen höheren Grad an Komplexität als ihre prokaryontischen Pendants aufzuweisen. Zum Beispiel wird angenommen, dass die Kontrolle der Transkription eukaryontischer Promotoren die Interaktion vieler Proteine (möglicherweise in einer Größenordnung von 10) mit der regulatorischen DNA beinhaltet. Darüberhinaus ist für mindestens drei verschiedene Proteinstrukturen (Helix-Turn-Helix, Zinkfinger und Leucinreißverschluß) eine Spezifität der DNA-Bindung durch verschiedene eukaryontische regulatorische Faktoren angenommen worden.
DNA-bindende Proteine bilden eine Klasse von Proteinen, die durch ihre Fähigkeit, an DNA von Genen zu binden, um die Wirkung entweder der Repression oder Aktivierung des Gens, an das sie binden, zu ergeben, charakterisiert sind. Solche DNA-bindenden Proteine werden hier nachstehend der Zweckmäßigkeit halber einfach als "Repressoren" bezeichnet, außer wenn es der Kontext anders erfordert.
Dieser Baustein ist dann ein rekombinantes Pflanzengen, umfassend ein Repressorgen bakteriellen Ursprungs und einen Promotor, der in Pflanzen als Antrieb der Expression des Repressorgens arbeitet, wobei das Gen ein Repressorprotein codiert, das mit einer Operatorsequenz interagieren kann, die mit einem ausgewählten pflanzlichen Zielgen verbunden ist, so dass bei Expression des Repressorproteins die Expression des pflanzlichen Zielgens gehemmt ist.
Ein Vektor mit der Bezeichnung p35SlacI, enthaltend die DNA wurde in einem E.coli- Wirt, Stamm TG-2, bei der National Collection of Industrial and Marine Bacteria Limited, Aberdeen, Großbritannien, am 12. Dezember 1988 unter der Hinterlegungsnummer NCIB 40092 hinterlegt.
Ein geeigneter pflanzlicher Transformationsvektor umfasst Agrobacterium tumefaciens, der das vorstehend erwähnte Plasmid enthält.
In einer spezifischen Ausführungsform dieses Bausteins wird ein bakterielles lacI- Operatorsystem verwendet, um die Genexpression zu regulieren. Die Lac-Repression kann durch Isopropylthiogalactosid (IPTG) und andere Zuckeranaloga aufgehoben werden.
Spezifische Beispiele, die sich auf diesen Baustein beziehen, werden jetzt gegeben.

BEISPIEL

1. Herstellung von Pflanzen, die den lac-Repressor exprimieren

Vektoren wurden hergestellt, die das lacI-Gen entweder vom konstitutiven CaMV 35S- Promotor im Vektor pJR1 oder vom für das grüne Gewebe spezifischen Promotor, dem Mais- CAB-Promotor, aus exprimieren. Der bakterielle Repressor kann jedoch von jedem in anderen Teilen der Pflanze exprimierten pflanzlichen Promotor aus exprimiert werden, wobei so die Kontrolle der pflanzlichen Genexpression in jedem spezifischen Teil der Pflanze erlaubt wird.

1.1 Modifikation und Insertion des lacI-Repressorgens in pJR1

Der lac-Repressor (lacIQ) ist im Plasmid pMJR 156 verfügbar. Um dieses Gen in Pflanzen zu exprimieren, musste das Translationsstartcodon (GTG) in ATG verändert werden. Darüberhinaus war es günstig, eine geeignete Restriktionsenzymschnittstelle zur Clonierung dieses Gens in einen pflanzlichen Expressionsvektor zu schaffen. Am 3'-Ende von lacI gibt es geeignete Restriktionsschnittstellen (Hindlil und Pstl) zur Insertion in pflanzliche Expressionsvektoren. Um geeignete Restriktionsschnittstellen am 5'-Ende zu schaffen, mussten die folgenden Experimente durchgeführt werden:
(a) Eine Cfr 10-Restriktionsschnittstelle liegt an Position 134. pMJR wurde mit Cfr 10 geschnitten, und ein synthetisches DNA-Fragment, das den N-Terminus des lacI-Gens wiederherstellt, das veränderte Translationsstartcodon ATG, eine pflanzliche Consensussequenz zur effizienten Translationsinitiation und eine BarnHI-Restriktionsschnittstelle wurden in pJR1 eingefügt. Die Sequenz dieses synthetischen Fragments war:
pJR1 wurde mit BamHI und PstI geschnitten. Das vorstehend beschriebene synthetische Fragment und das Cfr10-PstI-Fragment, enthaltend das lacI-Gen, wurden mit dem geschnittenen Vektor pJRl unter Standardbedingungen miteinander ligiert. Das Ligierungsgemisch wurde in E.coli TG-2 transformiert. Rekombinante wurden auf Kanamycin-enthaltenden Platten selektiert. Sie wurden durch DNA-Sequenzanalyse charakterisiert. Das Konstrukt wurde p35SlacI genannt. (b) Die PCR (Polymerasekettenreaktion), wie von Saiki et al., Science, 239, 487-491 beschrieben, wurde verwendet, um die Veränderungen am 5'-Ende des lacI-Gens einzuführen, während die Sequenz am 3'-Ende erhalten wurde. Zwei Oligonucleotide wurden mit pMJR 156 hybridisiert. Die Sequenz der Oligonucleotide war: (i) vom 5'-Ende des Gens (ii) vom 3'-Ende des Gens
Die PCR-Reaktion wurde unter den vorgeschriebenen Bedingungen durchgeführt. Das Produkt wurde mit BamHI (an der neu eingeführten Stelle) und PstI geschnitten. Das resultierende Fragment wurde in pJRI, geschnitten mit BamHI und PstI, cloniert. Rekombinante wurden durch Hybridisierung und Restriktionsanalyse unter Verwendung von Standardprotokollen identifiziert. Einer der resultierenden Clone wurde durch DNA- Sequenzanalyse charakterisiert.
Beide Verfahren (a) und (b) ergaben das gleiche Konstrukt mit der Bezeichnung p35SlacI. Fig. 10 zeigt die Struktur des Vektors-p35SlacI.

1.2 Ersatz des CaMV 35S-Promotors durch den Mais-CAB-Promotor

Um die allgemeine Brauchbarkeit des Lac-Repressor/Operator-Systems in Pflanzen zu zeigen, haben wir einen Expressionsvektor konstruiert, der eine induzierbare und gewebsspezifische lacI-Expression in Pflanzen erlaubt. Für diese Arbeit haben wir den Promotor des Gens, das das Licht-induzierbare Chlorophyll a/b bindende Protein (CAB) von Mais codiert, verwendet.
Die Herstellung dieses Vektors wurde durch Ersatz des CaMV-Promotors in p35SlacI durch den Mais-CAB-Promotor erreicht, dessen DNA-Sequenz in Fig. 12 hier dargestellt ist, die in Vektor pCAB48.1 gefunden wird. Der CaMV-Promotor wurde durch Restriktion von p35SlacI mit EcoRI und BamHI unter Standardbedingungen entfernt. Der CAB-Promotor wurde aus pCAB48.1 durch Restriktion mit XbaI und Sau3A unter Verwendung von partiellen Restriktionsbedingungen für Sau3A isoliert. Dieses Promotorfragment wurde dann in den Promotor-freien p35SlacI eingefügt. Dieser Vektor mit der Bezeichnung pCABlacI ist durch Restriktionskartierung und DNA-Sequenzanalyse charakterisiert worden.

1.3 Transformation von Tabakpflanzen

Die Expressionsbausteine von den vorstehend beschriebenen Vektoren wurden in BIN19 und dann in Tabak unter Verwendung der Blattscheibentransformation nach Standardprotokollen transferiert. Die Plasmide wurden in Agrobacterium mit triparentaler Paarung transferiert. Agrobacteria wurden gereinigt und in Blattscheibentransformationsexperimenten verwendet. 37 die CaMV-lacI-Expressionsbaustein enthaltende Pflanzen und 38 BAB-lacI-Konstrukt enthaltende Pflanzen wurden regeneriert und auf die relative Expression von lacI analysiert.

1.4 Anayse transgener Pflanzen auf lacI-Expression

Die Expression des kiel-Gens wurde mit Westernanalyse der extrahierten Proteine kontrolliert. Extrakte wurden hergestellt, Proteine auf Polyacrylamidgelen gewonnen und für die Westernanalyse vorbereitet. Die Analysen bestätigten die Expression des lacI-Genkonstrukts in den transformierten Pflanzen. Verschiedene Raten der lacI-Genexpression wurden in verschiedenen unabhängigen Transformanten beobachtet. Die Ergebnisse für mit dem CaMVlacI-Konstrukt transformierte Pflanzen sind in der folgenden Tabelle IV gegeben. TABELLE IV

2. Insertion des lac-Operators in Zielgene

(a) Der CAB-Promotor von Mais

Der CAB-Promotor von Mais kann in Plasmid pCAB48.1 gefunden werden, und wir haben gefunden, dass dieser Promotor die Expression fremder Gene in einem transienten Tabakexpressionssystem und in stabil transformierten Pflanzen steuern kann. Dieses Gen ist daher ein hervorragendes Ziel, um die Kontrolle durch lacI zu zeigen, da hohe Raten an Expression sowohl in vitro als auch in vivo erhalten werden können. Zweitens ist der CAB- Promotor aus anderen Systemen (Weizen, Erbse und Tabak) intensiv im Detail analysiert und in der Literatur beschrieben worden. Die veröffentlichte Information erleichtert die Auswahl geeigneter Stellen zur Insertion des Operators. Drittens ist pCAB48.1 ein Mais-Promotor, und der Gebrauch dieses Systems ist wichtig, um die Anwendbarkeit dieser Erfindung auf monokotyledone Pflanzen wie Mais, Weizen, Gerste und Hirse zu zeigen.

(b) Insertion des lac-Operators in den Mais-CAB-Promotor

Es gibt verhältnismässig wenig Literatur, die die Charakterisierung der wichtigen cis- wirkenden Elemente des CAB-Promotors betrifft. Daher wurde eine Computersuche durchgeführt, die stromaufwärts liegende regulatorische Elemente (UREs), die Consensuselemente darstellen, verschiedener Pflanzengene mit dem CAB-Promotor vergleicht. Wie angenommen, wurden zahlreiche mutmaßliche UREs in beiden Strängen des CAB- Promotors gefunden. Eine Anzahl möglicher Stellen für die Insertion des Operators wurde ausgewählt.
1. 5' der CAAT-Box;
2. Zwischen der CAAT- und der TATA-Box;
3. Um die TATA-Box herum;
4. Zwischen der TATA-Box und dem Transkriptionsstartpunkt; und
5. Zwischen dem Transkriptionsstartpunkt und dem Translationsstartpunkt.
Zwei Verfahren wurden verwendet, um dem lac-Operator in den Mais-CAB-Promotor einzufügen:
(1) Insertion in natürlich vorkommende Restriktionschnittstellen;
(2) mit PCR, um Operatoren in ausgewählte Stellen einzufügen.
Diese Verfahren wurden verwendet, um lacI-Operatoren in ausgewählte Stellen einzufügen.

Verfahren (1)

Die Analyse der Promotorsequenz zeigt, dass dieser Bereich nicht viele nur einmal vorkommende Restriktionsschnittstellen enthält. Zwei Stellen jedoch können verfügbar gemacht werden, indem man einfach den Promotorbereich wieder in verschiedene Vektoren cloniert.

(a) Insertion zwischen TATA und TSP

Das Restriktionsenzym PvuII erkennt eine einzelne Stelle innerhalb des 2.8 kb-PstI- Fragments, die das CAB-Gen enthält. Die Stelle liegt zwischen dem TATA-Element und dem Transkriptionsstartpunkt (TSP) des CAB-Promotors. Der Vektor pCAB48.1 enthält jedoch zahlreiche PvuII-Stellen (in pUC19). Daher wurde das 2.8 kb-PstI-Fragment in den Standardclonierungsvektor pAT153 (dem eine PvuII-Stelle fehlt) cloniert, um pCABP1 zu ergeben.
Operatorsequenzen wurden in die einmal vorkommende PvuII-Stelle in pCABP1 eingefügt. Nach Sequenzierung war es möglich, zu bestimmen, welche Clone einzelne und Tandern-Operatorinsertionen enthalten. Der für diese Arbeit erforderliche synthetische, symmetrische lac-Operator ist nachstehend gezeigt und ist ein 18 Basenpaare-Palindrom, das analog zu einem mutierten Operator ist, der den lac-Repressor achtmal stärker bindet als der Wildtyp-Operator. lac-Operator-1

(b) Insertion stromaufwärts der CAAT-Sequenz

Das verwendete Verfahren war wie folgt:
(i) pCAB48.1 wurde mit Hindlil, das ausserhalb des Promotorbereiches und in pUC18 spaltet, und BglII, das stromabwärts der einmal vorkommenden NcoI-Stelle und innerhalb des codierenden Bereichs spaltet, gespalten. Das ergab ein Fragment mit einer einmal vorkommenden SphI-Stelle stromaufwärts der CAAT-Einheit;
(ii) pUClB wurde mit Hindlil und BamHI gespalten, und das Promotorfragment von (i) vorstehend wurde eingefügt, um pCABP2 zu ergeben. Die Spaltung von pUC1 8 mit BamHI entfernt die einzelne Sphl-Stelle aus dem Polylinker. Daher enthält pCABP2 eine einmal vorkommende SphI-Stelle, in die Operatoren eingefügt werden können.
Der in diesem Verfahren verwendete Operator besaß die Sequenz: lac-Operator-2
Es ist wichtig anzumerken, dass in den Vorgehensweisen (a) und (b) die Operatorsequenzen nicht direkt in alle mutmaßlichen regulatorischen Elemente eingefügt sind, obwohl die Promotoraktivität wahrscheinlich beeinträchtigt ist, wenn die Sequenzen anderswo eingefügt sind.

Verfahren (2)

Wie vorstehend gezeigt, können Operatorsequenzen in zwei verfügbare Restriktionschnittstellen eingefügt werden. Eine Insertion in andere Stellen erfordert andere Verfahren.

Insertion zwischen TSP und ATG-Codon

Das kann mit PCR durchgeführt werden. Da eine einmal vorkommende PvuI-Stelle benachbart zum TSP-Bereich liegt, wird sie als ein Bezugspunkt für Subclonierungszwecke verwendet. Das Ausgangsmaterial für die PCR-Reaktion ist pCÄBPI, d. h. der wie vorstehend beschrieben hergestellte pAT153 CAB-Promotor-Vektor. Ein die PvuII-Stelle überspannendes und keine Veränderungen enthaltendes Oligonucleotid wurde verwendet, um die Reaktion von einem Ende aus zu primen: CAB-Oligonucleotid-1 PvuII
Das zweite Oligonucleotid überlappt die NcoI-Stelle und enthält die nachstehend gezeigte Operatorsequenz. CAB-Oligonucleotid-2 CAB-Oligdnucleotid-3
Nach den PCR-Reaktionen wird die neu synthetisierte DNA mit PvuII und NcoL gespalten. Das Fragment wird dann in ähnlich gespaltenen pCABP1 transferiert und sequenziert. Eine leicht andere Vorgehensweise, die den dazwischen liegenden Clonierungsschritt in pCABP1 eliminiert, kann auch verwendet werden. Das beinhaltet die Verwendung eines Oligonucleotids, das die einmal vorkommende XbaI-Stelle im CAB-Promotor zusammen mit den vorstehend skizzierten Operator-Nucleotiden überlappt. Spaltung von PCR-DNA mit XbaI/NcoI resultiert in einem Fragment, das direkt in pCG1 und pCG2 cloniert werden kann.
Das XbaI bis NcoI-Fragment aus der PCR-Reaktion ist jedoch viel größer als das durch die vorstehende Strategie erhaltende PvuII bis NcoI-Fragment.

Operator-Insertion zwischen CAAT und TATA

Das wird mit PCR durchgeführt. CAB-Nucleotid-4 CAB-Nucleotid-5 CAB-Nucleotid-6
Nach PCR wird die DNA mit XbaI und PvuI gespalten und in ähnlich gespaltenen pCABP1 cloniert. Die Clone werden wieder durch Sequenzierung charakterisiert, und alle geeigneten DNAs werden mit XbaI und NcoI gespalten und in pCG1 und pCG2 cloniert. Die Grundstruktur dieser Vektoren ist in Fig. 11 gezeigt.

Der CaMV 35S-Promotor

Wir haben gefunden, dass ein 35S-Vektor ohne Promotor ein hervorragender Rezeptor für die Insertion aktivierender Sequenzen ist. Der lac-Operator kann in diesen Vektor, p-Δ-35S, eingefügt werden, und wenn er einmal eingefügt ist, wird der 355-Enhancer stromaufwärts 5' des lac-Operators cloniert.

3. Kontrolle der Genexpression durch den lac-Reyressor

(a) Kontrolle der Expression des Zielgens in einem transienten Expressionssystem

Mit p351acI transformierte Pflanzen, die lacI konstitutiv exprimieren, können aus Protoplasten hergestellt werden und mit vorstehend beschriebenen Verfahren können sie auf die Expression des lacI-Proteins getestet werden. Die Zielgenkonstrukte können dann mit Standardverfahren und Standardprotokollen in die Protoplasten eingeführt werden. Die Protoplasten aus nicht transformierten Pflanzen können als Kontrolle dienen. Weitere Kontrolle kann durch Protoplasten aus Pflanzen geliefert werden, die das GUS-Markergen unter der Kontrolle des CAB-Promotors ohne die Operatorinsertionen exprimieren.

(b) Induktion der Genexpression mit IPTG

IPTG kann verwendet werden, um die Unterdrückung durch den lac-Repressor zu überwinden. So wird ein schaltbares Gensystem gebildet.

(c) Modulation der Expression des Zielgens

Lac-Repressor/Operator-Interaktionen können Markergenexpression in Pflanzen auf verschiedene Raten herunterregulieren. Das ist ein wichtiger Effekt derart, dass es Situationen geben kann, in denen ein unterschiedlicher Grad an Herunterregulation erforderlich ist.

(d) Kontrolle der Zielgenexpression in stabil transformierten Pflanzen

Nachdem wir gezeigt haben, wie vorstehend beschrieben, dass der lac-Repressor die CAB- Promotor gesteuerte GUS-Expression in Protoplasten herunterregulieren kann, können geeignete Operatorinsertionskonstrukte in Tabakpflanzen durch die vorstehend beschriebenen Verfahren übertragen werden. Die regenerierten Pflanzen können mit den vorstehend beschriebenen lacI- exprimierenden Pflanzen gekreuzt werden, die den lac-Repressor unter der Kontrolle des konstitutiven CaMV35S-Promotors exprimieren.
Pflanzen können auch hergestellt werden, die das lacI-Gen unter der Kontrolle des lichtinduzierbaren Mais-CAB-Promotors exprimieren. Die Expression des lacI-Gens in diesen Pflanzen wird dann lichtinduzierbar sein. Diese Pflanzen können mit Pflanzen gekreuzt werden, die das GUS-Markergen von dem CaMV-Promotor, enthaltend die lacI-Operatorinsertion, enthalten.

Insertion mehrfacher Operatoren in den CAB-Promotor

Unter Verwendung ähnlicher Techniken, wie für die Insertion von einzelnen Operatoren beschrieben, können mehrfache Operatoren in den Zielpromotor eingefügt werden. Das kann entweder durch die Insertion mehrfacher Kopien des Operators an einer Stelle oder die Kombination von Fragmenten des Promotors, in denen der Operator an verschiedenen Stellen im Promotor eingefügt ist, erfolgen, wobei dies Vektoren ergibt, in denen sich die mehrfachen Operatoren an mehrfachen Stellen im Promotor befinden.

ZWEITE AUSFÜHRUNGSFORM

In dieser Ausführungsform umfaßt das Verfahren der Regulation der Genexpression die Lokalisation einer Pseudo-Operatorsequenz innerhalb oder ihre Insertion in ein Gen und die Bereitstellung eines mutierten regulatorischen Gens, das einen Repressor mit einer Aminosäuresequenz codiert, die an den Pseudo-Operator bindet.
Zellen, die interagierende Repressor- und Operatorgene enthalten, können mittels eines Verfahrens isoliert werden, umfassend die Herstellung eines rekombinanten Plasmids, enthaltend (1) das Escherichia coli lac-Operon, das die lacZ-, lacY- und lacA-Gene einschließt, und (2) ein Gen, codierend ein Repressorprotein, Insertion des Plasmids in einen bakteriellen Wirt und Züchtung dieses Wirts in Anwesenheit von ortho- oder para-Nitrophenyl-1-thio-β-galactosid, wobei das Wachstum von Zellen, in denen die Expression des lac-Gens durch das Repressormolekül nicht reprimiert ist, gehemmt ist, während das Wachstum von Zellen, in denen Repressor/Operatorbindung vorkommt, nicht gehemmt ist, und Gewinnung der Zellen mit nicht gehemmten Wachstumseigenschaften.
Mutierte Repressoren können verwendet werden, oder ein exogener möglicher Pseudo- Operator kann in den Operatorbereich des lac-Operons eingefügt werden. Der exogene mögliche Pseudo-Operator ist bevorzugt pflanzlichen Ursprungs.
Ein günstiger bakterieller Wirt ist Escherichia coli.
Folglich haben wir ein Mittel zur Veränderung des Repressors der Genexpression, was die Inaktivierung von Genen ermöglicht. Pseudo-Operatoren sind DNA-Sequenzen, die die gesamte zweifache Rotationssymmetrie eines Operators aufrechterhalten, aber die verschiedene zusammensetzende Basen enthalten. Computeranalyse bekannter DNA-Sequenzen des GPAL2- Gens der grünen Bohne unter vielen anderen und des Promotors und der c-myc-Gene von Säugern enthüllte eine Reihe möglicher Pseudo-Operatoren für verschiedene bakterielle Repressoren.
[Das Plasmid pGAL2 ist in Escherichia coli, Stamm DH5α am 6. Dezember 1988 bei der National Collection of Industrial and Marine Bacteria, Aberdeen, Großbritannien, unter der Hinterlegungsnummer NCIB 40087 hinterlegt worden.]
Folglich ist es wahrscheinlich, dass 'Pseudo-Operator'-Sequenzen in allen Genen gefunden werden können. Allgemein ist eine Pseudo-Operatorsequenz dann eine DNA-Sequenz, die an einer geeigneten Stelle in einem Gen, einschließlich eines Pflanzengens, vorhanden ist, an der Repressorbindung zur Hemmung der Genexpression führen wird.
Das Plasmid pAD18 ist unter den Bedingungen des Budapester Vertrags in einem Escherichia coli-Wirt, Stamm DH5α, bei der National Collections of Industrial and Marine Bacteria Limited, Aberdeen, Großbritannien, am 21. Dezember 1988 unter der Hinterlegungsnummer 40096 hinterlegt worden.
Das Plasmid pPS1 ist unter den Bedingungen des Budapester Vertrags in einem Escherichia coli-Wirt, Stamm DH5α, bei der National Collection of Industrial and Marine Bacteria Limited, Aberdeen, Großbritannien, am 21. Dezember 1988 unter der Hinterlegungsnummer 40097 hinterlegt worden.
Dieses Verfahren ist auch auf Proteinmoleküle anwendbar, die zu einer Erhöhung der Genaktivität führen, besonders der Selektion von Repressor/Aktivator-Proteinen, die auf spezifische Chemikalien ansprechen. Bindungsdomänen für diese Chemikalien können ausgewählt und spezifisch manipuliert werden, um die Erzeugung chemischer Kombinationen mit spezifischem Protein/DNA-Effekt zu erlauben, die in der Biotechnologie zum Beispiel als chemische Schalterpackung nützlich sind, das die kontrollierte Regulation von Pflanzengenen durch Anwendung eines exogenen chemischen Induktors ermöglicht.
Mutationen, die sowohl Repressoren als auch Operatoren beeinflussen, kommen in vivo vor. Es ist gezeigt worden, dass Repressoren, die veränderte DNA-Erkennungsspeziiitäten besitzen, in vitro konstruiert werden können. Das Verfahren hängt dann von der Fähigkeit seltener Repressormutanten ab, ein konditionell letales Gen durch Bindung an Pseudo- Operatorsequenzen, die der native Repressor nicht erkennen kann, abzuschalten.
Eine Ausführungsform der Erfindung wird jetzt mittels Illustration im folgenden Beispiel beschrieben werden, mit Bezug auf die begleitende Abbildung, die eine Karte, darstellend zwei Reihen von Plasmiden mit der Bezeichnung pPS und pAD und Varianten, zeigt.

BEISPIEL

Wir zeigen das Selektionssystem der Erfindung mit dem Repressorphagen 434. Im Prinzip kann jedoch jeder andere Repressor für dieses Selektionssystem angepaßt werden.

1. Das Selektionssystem

Wir haben ein Selektionssystem entworfen, das für die Selektion von Mutanten in einem breiten Bereich von Repressor-Operator-Systemen verwendet werden kann. Das Selektionssystem umfaßt einen Satz von Plasmiden und die geeigneten E. coli-Wirte sowie ein Suizidsubstratselektionsprotokoll, angepaßt für die Plasmide und Wirte.
In seiner letzten Form hängt das System von der Fähigkeit seltener Repressormutanten ab, ein konditional letales Gen durch die Bindung an einen 'Pseudo-Operator', den der Wildtyprepressor nicht binden kann, abzuschalten. Das nachstehend beschriebene Selektionssystem enthält Merkmale, die die Häufigkeit solcher zu identifizierender Repressormutanten in der endgültigen Population von Zellen maximieren.
Das Selektionsverfahren basiert auf dem lac-Operon von Escherichia coli und der Verwendung des Suizidsubstrats para-Nitrophenyl-1-thio-β-D-galactosid (TPNPG). Das lac- Operon (das die drei Gene lacZ, lacY und lacA enthält) wird durch die Bindung des LacI- Repressors an eine Operatorsequenz, lacO, die zwischen der Transkriptionsstartstelle und dem lacZ-Gen liegt, kontrolliert. Das lacY-Genprodukt, Lactosepermease, ist für die aktive Aufnahme von Lactose und verwandter Substanzen in das Cytosol verantwortlich, wo sie durch β-Galactosidase (das lacZ-Genprodukt) hydrolysiert werden, um Galactose und Glucose zu bilden.
Das positive Selektionssystem nützt die Entdeckung, dass das Wachstum von Zellen, die das lacY-Gen exprimieren, selektiv in Gegenwart von TONPG oder TPNPG gehemmt wird, vermutlich durch die Verschwendung von metabolischer Energie bei seinem Transport. Es ist gezeigt worden, dass die Selektivität dieser Substanzen erhöht ist, wenn Succinat als Kohlenstoffquelle verwendet wird.
Der Gedanke hinter der Selektion basiert auf der Fähigkeit des 434-Repressors, die in den Promotor eingefügten Pseudo-Operatorsequenzen zu binden, die die Expression der lac- Genkassette steuern. In Abwesenheit eines 434-Repressor/Operatorkomplexes wird das lac- Operon exprimiert werden, und die Gegenwart von TPNPG wird zu Zelltod führen. Im Gegensatz dazu wird in Gegenwart eines Komplexes die LacY-Permease nicht exprimiert werden, und das Suizidsubstrat TPNPG wird nicht in die Zelle gelangen können. Folglich wird in der endgültigen Analyse ein Pseudo-Operator, ausgewählt aus der natürlichen Sequenz des pflanzlichen Zielgens, in die SaII-Stelle cloniert und mit einem Pool von Genen vereint werden, codierend 434-Repressoren, in denen bestimmte Aminosäuren in der α3-Helix zufällig ersetzt sind. Nur solche Zellen, die einen mutierten Repressor exprimieren, der den Pseudo-Operator binden und folglich die lacY-Expression reprimieren kann, wird in Gegenwart von TPNPG selektiert werden.

2. Die Plasmide

2.1. Konstruktion von pAD18 und Derivaten

Eine Reihe von Plasmiden ist zur Verwendung in diesen Versuchen entwickelt worden. Ihr Prototyp ist pAD18, von dem eine Karte in Fig. 13 gezeigt ist. Dieser Vektor basiert auf einem Replicon aus pSC101, das bekanntermaßen stabil in E. coli aufrechterhalten wird und eine niedrige Kopienzahl besitzt. Das ist wichtig, da die Überexpression DNA-bindender Proteine schädliche Wirkungen auf das Wachstum des Wirtes haben kann. Wenn das in einigen Versuchen ein Problem ist, ist es ratsam, auf pAD18 enthaltende Gene in einen Bakteriophagenvektor zur Insertion in das bakterielle Genom als ein Gen in einer einzelnen Kopie zu transferieren.
pAD 18 besitzt einen Kanamycin-selektierbaren Marker zur Aufrechterhaltung in E. coli- Stämmen.
pAD18 enthält auch das lac-Operon. Die lacZ- und lacY-Gene sind unter der Kontrolle des lac-Promotors/Operators vorhanden. In den lac-Operator oder in Derivate von pAD 18 mutierten 434-Operatoren oder selektierten 'Pseudo-Operatoren' ist eine SaII-Schnittstelle, die zur Insertion des 434-Operators verwendet wird, eingebaut worden. Diese Stelle ist derart positioniert worden, dass sie die Expression des lac-Operons vom lac-Promotor aus nicht durch sterische Hinderung stören wird, wenn genug Repressor zur Bindung an den in dieser Stelle clonierten Operator synthetisiert wird. Solche Basen wurden in SaII-Restriktionschnittstellen verändert, von denen bekannt ist, dass sie nicht in den Kontakt mit RNA-Polymerase involviert sind. Folglich wird die Expression des lac-Operons unter der Kontrolle des 434-Repressors beeinflußt werden. pAD18, das den Wildtyp-434-Operator enthält, ist folglich der Prototyp dieser Reihe von Plasmiden.
pAD18 enthält ein Tetracyclin-Resistenzgen, in das ein Wildtyp-434-Repressorgen unter der Kontrolle des lacUVS-Promotors für hohe Raten an Expression eingefügt werden kann. Dieser Vektor wird pPS1 genannt. Weitere Derivate werden nachstehend beschrieben.
In einem anderen Vektor ist der 434-Repressor derart verändert worden, dass eine KpnI- und eine NotI-Schnittstelle an jeder Seite der DNA-Bindungshelix eingeführt wurden, während die native Aminosäuresequenz in diesem Bereich erhalten wurde. Es ist so möglich, in dieses 434-Repressorgen zufällige Oligonucleotide einzufügen, die bei Expression 434- Repressormoleküle erzeugen werden, die veränderte DNA-Bindungsdomänen exprimieren. Dieses Selektionssystem wird unter Verwendung eines Suizidsubstrats dann die Selektion solcher mutierten 434-Repressoren erlauben, die an den 'Pseudo-Operator binden. Unter einigen Umständen kann dies auch den Selektionsdruck zur Isolation von Repressormutanten erhöhen. Das System ist jedoch, so wie es steht, von der ExpressionlRepression der lacY-Permease zur Isolation von Repressormutanten abhängig.
Folglich gibt es günstige Clonierungsstellen in pAD18 und seinen Derivaten zur Insertion von Operatoren oder Repressorgenen. Operatoren können in Vorläufervektoren von pAD18, vor allem pRW283, cloniert werden, aus denen der Operator, enthaltend das EcoRI- bis PstI- Fragment, anschließend ausgeschnitten werden und in EcoRI- und PstI gespaltenen pAD18 cloniert werden kann (vgl. Fig. 13).
Ein Ziel war zu zeigen, dass die Expression des lac-Operons auf den vorstehend beschriebenen Plasmiden durch 434-Repressor/Operator-Interaktionen kontrolliert werden kann. Um das zu zeigen, wurden drei Plasmide hergestellt, in denen die 434-Operatoren auf pAD16, 17 und 18 mit dem Wildtyp-434cI-Gen auf pAD15.2 vereint wurden. Das große XhoI/SstI- Fragment (9.4 kb) aus pAD 15.2 wurde gereinigt und mit dem kleinen aus pAD 16, 17 und 18 gereinigten XhoI/SstI-Fragment (3.7 kb) ligiert, um die Plasmide pPS2, pPS3 beziehungsweise pPS 1 zu bilden. Restriktionsanalyse der aus mehreren Transformanten isolierten Plasmid-DNA jeder Ligierung zeigte, dass alle pPSS-Plasmide die erwartete Gesamtstruktur besaßen. Die Struktur dieser Plasmide ist in Fig. 13 gezeigt.
Die Vollständigkeit der Operatoren auf den pAD- und pPS-Plasmiden wurde durch Sequenzierung nachgeprüft. Anfänglich wurde das durch Isolation des etwa 200 Basenpaare langen EcoRI/PstI-Fragments, das den gesamten lac-Promotor und das 5'-Ende des lacZ-Gens trägt, von jedem der pAD- und pPS-Plasmide und ihre Subclonierung in den Polylinker von M13mp18 erreicht. Einzelsträngige Matrize wurde gereinigt und gemäß Standardprotokollen sequenziert. In einer anderen Ausführungsform wurde dieses aufwendige Subclonierungsverfahren durch Sequenzierung der Plasmide umgangen. Diese Analysen zeigten, dass die geeignete 14mer-Operatorsequenz an der SaII-Stelle in allen relevanten Plasmiden vorhanden war. Die Anwesenheit anderer herausragender Merkmale des lac-Promotors wurde auch bestätigt.

2.2 pPS-Plasmide codieren funktionellen 434-Repressor

Um den von pAD15.2 und den pPS-Plasmiden hergestellten 434-Repressor sichtbar zu machen, wurden gesamte Proteinextrakte aus Kulturen in der Mitte der log-Phase, die unter selektiven Bedingungen wachsen gelassen wurden, hergestellt. Nach Polyacrylamidgelelektrophorese und Coomassie Brilliant Blue (G250)-Färbung konnten keine der Größe des Repressors entsprechenden Proteine spezifisch in Stämmen mit dem 434cI-Gen beobachtet werden. Andere Versuche haben jedoch gezeigt, dass 1 ug gereinigter Repressor mit dieser relativ unempfindlichen Technik gerade sichtbar ist. Daher wäre, um den 434-Repressor in der verwendeten Menge des Extraktes nachzuweisen, eine Expressionsmenge von mindestens 1% Gesamtzellprotein erforderlich. Der Hintergrund anderer Proteine mit ähnlicher Größe macht den Nachweis auch schwierig. Folglich wurde die viel empfindlichere Westernblot-Technik verwendet. Der primäre Antikörper, erforderlich, um den 434-Repressor durch die Western-Blot- Technik nachzuweisen, wurde durch Injektion von Kaninchen mit gereinigtem intaktem 434- Repressor hergestellt. Die Spezifität dieses polyclonalen Antiserums wurde mit gereinigtem Repressor und Extrakten von E. coli-Stämmen, die das 434cI-Gen enthalten, gezeigt. Bei niedrigen Verdünnungen von Antiserum wurden mehrere Proteine aus bakteriellen Extrakten, einschließlich des 434-Repressors, nachgewiesen. Weitere Verdünnung des Antiserums jedoch resultierte darin, dass nur 434-Repressor nachweisbar blieb, wobei das Maximum der Spezifität bei Verdünnungen von 1/10.000 bis 1/20.000 beobachtet wurde.
Die Sensivität der Westernblot-Technik mit dieser Antikörperherstellung und Meerrettichperoxidasekonjugat-Nachweistechnik wurde bestimmt durch "Zugabe eines Schußes" verschiedener Mengen an gereinigtem Repressor zu rohen Zellextrakten von 6300Δlac4169, der kein 434cI-Gen enthält. Unter Standardbedingungen konnten 5 ng des Repressors in 50 ug Extrakt leicht nachgewiesen werden, wobei diese Empfindlichkeit einer Expressionsmenge von 0.01% Gesamtzellprotein entspricht.
Verwendung des gleichen primären Antikörpers in Western-Blots von 6300Δlac4169- Stämmen, die die Testplasmide tragen, zeigte folglich, dass Zellen mit pAD15.2, pPS1, pPS2 und pPS3 alle 434-Repressor synthetisierten. Bestimmung der erhaltenen relativen Intensitäten der Banden mit einem Scanning-Densitometer zeigte, dass alle vier Stämme etwa 0.4% Gesamtzellprotein als 434-Repressor enthalten.
Zuletzt wurde die Fähigkeit des 434-Repressors, an Wildtyp-Operatorsequenzen zu binden, in einem funktionellen Test mit Bakteriophagen 434cI, 434vir und λcI bestimmt. Im Lebenszyklus dieser Phagen reprimiert die Bindung des geeignetes Repressors an Operatoren innerhalb des Promotors PR die Transkription der für die Zelllyse verantwortlichen Gene. Folglich sind Zellen, die endogen cI-Repressor synthetisieren, immun gegen Lyse durch den entsprechenden Phagen aufgrund der Hemmung der lytischen Genexpression durch den schon vorhandenen Repressor. Da der cI-mutierte Phage nicht in der Lage ist, Repressor zu synthetisieren, zeigt der lytische Phänotyp nach Infektion mit diesem Phagen die Abwesenheit des Repressors in der Wirtszelle an. Die PR-Operatoren von vir-mutiertem Phagen besitzen eine verminderte Affinität für den Repressor mit der Folge, dass bei niedrigen Mengen von endogenem Repressor dieser Phage lytisch ist, während bei höheren Repressorkonzentrationen die Superinfektion gehemmt ist.
Die Ergebnisse des kreuzweisen Ausplattierens dieser Phagen mit den Teststämmen zeigen, dass Zellen, die die pPS-Plasmide tragen, immun gegen Superinfektion durch sowohl 434cI als auch 434vir, aber empfindlich für λcI sind. Stämme, die andere pAD-Plasmide tragen, waren empfindlich für alle drei Phagen. Das zeigt deutlich, dass Zellen, die pPS-Plasmide tragen, hohe Mengen an 434-Repressor synthetisieren, der funktionell in der Lage ist, an den Operator zu binden und die Transkription von PR aus zu hemmen. Weiter wird die Spezifität dieser Repressor/Operator-Interaktion durch die Unfähigkeit des 434-Repressors gezeigt, die Operatoren von λcI, die eine andere Sequenz zu denen von 434 besitzen, zu binden, was in Zelllyse resultiert.
Zusammengefaßt wurden alle drei pPS-Plasmide als korrekte Konstrukte bestimmt, die die erwartete 434-Operatorsequenz tragen und funktionellen 434-Repressor synthetisieren.

2.3 Vektorverbesserung

Wie nachstehend angezeigt bildet ein Teil der Population von pAD- und pPS-Plasmid enthaltenden Stämmen weiße Kolonien nach Selektion. Weiter ist beobachtet worden, dass der Anteil weißer Kolonien in der Population erhöht ist, wenn Stämme, die diese Plasmide enthalten, mehrere Monate auf selektiven Medien gegebenenfalls unter Subkultivierung gehalten werden.
Es wird angenommen, dass diese weißen Kolonien Plasmide tragen, in denen ein Teil oder das gesamte lac-Operon mutiert oder deletiert ist. Das gewöhnliche Verfahren der Minimierung solcher Probleme besteht darin, einen Stamm zu verwenden, der nicht rekombinieren kann. Die Kombination von Δlac4169- und recA56-Allelen macht den Stamm jedoch nicht lebensfähig in Gegenwart von TPNPG, wobei der Grund dafür unklar ist. Daher ist die Aufmerksamkeit auf die wahrscheinliche Quelle rekombinatorischer Ereignisse gelenkt worden. Es wird angemerkt, dass die Promotoren, die das lac-Operon und das 434-Repressorgen in den pPS-Plasmiden exprimieren, beide vom lac-Promotor stammen und folglich die Sequenzen sehr ähnlich sind. Rekombination zwischen diesen Sequenzen würde in der Deletion des lac-Operons resultieren, wobei die ursprünglichen Sequenzen und das Kanamycin- Resistenzgen unter den auferlegten selektiven Bedingungen bleiben müssen.
Während der Herstellung von pAD 15.2 wurde das 434cI-Gen von Plasmid pRP42 auf ein 1 kb-Sau3A-Fragment transferiert. Das Stopcodon des 434-Repressorleserahmens fällt mit der Sau3A-Schnittstelle auf der rechten Seite des Fragments zusammen; daher trägt das in pAD15.2 clonierte Gen keine Transkriptionsterminationssignale. Weiter trägt dieses Sau3A-Fragment auch einen Rest von pBR322, einschließlich des Ampicillinresistenzgenpromotors. Daher wurden Sequenzen sowohl stromaufwärts als auch stromabwärts der 434cI codierenden Sequenz verändert, um diesen Problemen abzuhelfen. Der Bereich stromaufwärts wurde durch den Tryptophan-Promotor und eine Consensus-Shine-Dalgarno-Sequenz unter Verwendung geeigneter Oligonucleotide ersetzt. Das beides verhindert Rekombination im Plasmid und entfernt den Ampicillinresistenzgenpromotor.
Der rm-T1-Terminator wurde auch am 3'-Ende der 434cI codierenden Sequenz eingeführt, um die 434cI-Gentranskriptd zu terminieren. Dieser rho-unabhängige Terminator wurde gewählt, da seine berichtete bidirektionale Terminationsaktivität jede Unterbrechung der 434cI-Expression von irgendwo im Vektor initiierten, entgegengesetzten Transkripten als auch terminierenden 434cI-Transkripten aus vermeiden würde.

2.4 Konstruktion des Plasmids pTP1

Oligonucleotide wurden verwendet, um die Wildtyp-trp-Promotorsequenz zusammen mit der Consensus-Shine-Dalgarno-Sequenz (AGGAGGT) 5 Basenpaare stromaufwärts des Translationsstartpunkts des 434cI-Gens einzuführen. Dieser Abstand ergibt maximale translationale Aktivität des 434cI-Gens. Aufgrund des Mangels günstiger Restriktionsschnittstellen am Start des 434cI-Geris wurde die EcoRI-Stelle 33 Basenpaare innerhalb der codierenden Sequenz verwendet. Das erforderte den Einschluß des 5'-Endes des codierenden Bereiches im Oligonucleotid. Die erforderliche Sequenz ist 126 Basenpaare lang und wurde so aus vier überlappenden Oligonucleotiden hergestellt. Nach der Anlagerung dieser Oligonucleotide wurde das doppelsträngige 126 Basenpaar-Fragment isoliert und in EcoRI gespaltenen pUC19-Vektor cloniert. Nach Selektion von Transformanten auf Medien, enthaltend Ampicillin und BCIG, wurde DNA von mehreren weißen Kolonien unter Verwendung von Plasmidsequenzierungsprotokollen sequenziert. Das bestätigte die erwartete Struktur der Promotorsequenz.

2.5 Konstruktion von pTTI

Die Sequenz des rm-T1-Terminators besitzt eine lange G C-reiche Stammstruktur, flankiert durch lange A = T-reiche Bereiche, die aus ihr eine starken Terminator für Transkripte in beiden Orientierungen machen. Aufgrund der Natur der umgekehrten Wiederholung dieser Sequenz wurde sie unter Verwendung von vier Oligonucleotiden eingefügt, wobei dadurch alle Probleme der Selbstanlagerung innerhalb jedes Stranges vermieden wurden. Die Oligonucleotide wurden paarweise angelagert, und die resultierenden doppelsträngigen DNAs wurden separat isoliert und vor der Transformation der Zellen zur Ampicillinresistenz mit EcoRI/HindIII gespaltener pTP1-DNA ligiert. Die Sequenz der eingefügten Terminatorstruktur wurde bestätigt.

2.6 Konstruktion des Plasmids pTRT1

Die Quelle des 434cI-Gens, das hinter den trp-Promotor cloniert werden sollte, war Plasmid pRP42-76. Stille Mutationen sind unter Verwendung von in vitro-Mutagenese eingeführt worden, um Restriktionsschnittstellen für KpnI und XmaIII auf jeder Seite der die α3- Erkennungshelix codierenden Sequenz zu schaffen. Das wird anschließend die Einführung von Oligonucleotiden erlauben, in der bestimmte Codons in der α3-Helix zufällig mutiert wurden. Das EcoRI/Sau3A-Fragment (etwa 600 Basenpaare), das das 434cI-Gen trägt, wurde isoliert und in EcoRI/Bg1II gespaltenes pTP1 cloniert. Das gestaltet den offenen Leserahmen von 434cI genau um, und das Translationsstopcodon bleibt in der Sau3A/Bg1III-Verbindung erhalten. Einmal isoliert wurde die trpP-434cI-rmT1-Kassette mittels BamHI-Schnittstellen an den an jedem Ende der Kassette eingeführten Polylinkern herausgespalten und verwendet, um das vorhandene 434cI-Gen in pAD- und pPS-Plasmiden zu ersetzen.
Die Sequenz des zur Konstruktion von pTRT1 verwendeten trp-Promotors wird durch den trp-Repressor in Gegenwart von Tryptophan gebunden, um die Transkription zu hemmen. Die Bindungsstelle für diesen Repressor wurde absichtlich erhalten, damit die Expression des 434cI-Gens gegebenenfalls in zukünftigen Arbeiten kontrolliert werden kann. Um jedoch die Synthese des 434-Repressors auf bequeme Art zu erlauben, werden Stämme hergestellt, in denen das trpR-Gen vom Chromosom deletiert worden ist.

3. Selektionsprotokoll

3.1 Selektion mit TONPG

Ein TONPG (ortho-Nitrophenyl-b-thiogalactosid)-Selektionsprotokoll wurde entworfen, das die Selektion von Clonen erlaubt, in denen ein mutierter Repressor jetzt an den mutierten 434-Operator bindet, was in der Repression der lacY-Expression resultiert (d. h. der Selektion durch Repression der konditionalen Hemmung).
TONPG hemmt das Wachstum von E. coli-Zellen, die das lacY-Permeasegen exprimieren. Frühe Arbeiten mit lacY+-E. coli, wobei lacY in einer einzelnen Kopie vorhanden war, deuteten an, dass diese Zellen maximal empfindlich für TONPG bei 500 bis 1000 Mikrogramm/ml waren, wenn lacY in Succinat-Minimalmedium exprimiert wurde. Mischungsversuche zeigten, dass TONPG verwendet werden konnte, um lacY-Zellen aus einer gemischten lacY+/--Population zu selektieren. Diese Versuche wurden mit lacY+- und lacY- pAD-Plasmiden wiederholt. Die TONPG-Selektion wird nur in einem E. coli-Wirt ohne lac funktionieren. Der bevorzugte Wirt wird nachstehend beschrieben. Die Selektion wirkt besser in flüssigen Kulturen, aber auch auf Agarplatten. Selektion auf festem Medium wirkt besser mit einem anderen Galactosidanalog, para-Nitrophenyl-beta-thiogalactosid (TPNPG). Unter Verwendung von TONPG in flüssigen Kulturen und TPNPG auf Platten erreicht die Selektion normalerweise eine Anreicherung der lac-pAD-Plasmide, die in der anfänglichen Population vorhanden sind, von 6 log.

3.2 E. coli-Wirt

Der ausgewählte bakterielle Wirt war derart, dass er die Selektion durch TONPG erlaubte. Das erforderte die Fähigkeit des Wirts, in einem Succinat-Minimalmedium zu wachsen. Der in diesem Beispiel verwendete ausgewählte Wirt war einer, bei dem das gesamte lac- Operon, lacΔ4129, deletiert worden war. Andere geeignete mutierte Wirte können jedoch verwendet werden, zum Beispiel 1aci&supmin;, lacY&supmin;. Ein geeigneter Stamm wurde aus Derivat-Stamm W1485 (CGSC6300) unter Verwendung von Transposon-verbundener P1-Transduktion hergestellt, dem das gesamte lac-Operon fehlte.

3.3 Selektion mit TPNPG

Um die Fähigkeit von TPNPG zu testen, lac&supmin;-Zellen vor einem Hintergrund von lac&spplus;- Zellen zu selektieren, wurden Mischungsversuche mit Kulturen von 6300lac&spplus; und seinem Δlac4169-Derivat durchgeführt. Diese Stämme wurden bis zur mittleren log-Phase in Gegenwart von 1 mM IPTG wachsen gelassen, um die Expression des Lactose-Operons zu induzieren. Die zwei Kulturen wurden in verschiedenen Anteilen vor dem Plattieren geeigneter Verdünnungen auf Minimalsalz-Succinat-Platten, enthaltend 1 mM IPTG und 50 ug/l BCIG, beide mit und ohne TPNPG, gemischt.
Anfängliche Versuche zeigten, dass 500 ug/ml TPNPG das Wachstum von lac&spplus;-Zelleh nur verlangsamen konnten, was die Bildung von kleinen blauen Kolonien nach 48 h bei 28ºC erlaubte. Dieser Hintergrund wurde jedoch in Gegenwart von 1 mg/ml TPNPG eliminiert, was darin resultierte, dass keine der plattierten lac&spplus;-Zellen (bis zu 7 · 10&supmin;&sup7;) in der Lage war, blaue Kolonien zu bilden (Tabelle V). Im Gegensatz dazu beeinflusste diese TPNPG-Konzentration die Lebensfähigkeit der lac&supmin;-Zellen nicht merklich. Das zeigt die hohe Selektivitätskraft von TPNPG gegen lac&spplus;-Zellen, sogar wenn das lacY-Gen cbromosomal ist und so in kleiner Kopienzahl vorliegt. In dieser Hinsicht sollte die höhere Kopienzahl und daher erhöhte Expressionsrate der lac-Gene auf den pPS-Plasmiden in einem größeren Energieverbrauch nach TPNPG-Aufnahme resultieren, was das Abtöten von lac&spplus;-Zellen wirksamer macht. TABELLE V
N.D. = Nicht bestimmbar
Die Wirkung von TPNPG auf das Überleben von 6300Δlac4169-Zellen, die verschiedene pAD- und pPS-Plasmide tragen, wurde durch Plattieren geeigneter Verdünnungen von Kulturen auf den Medien, wie vorstehend beschrieben, getestet. Die Ergebnisse aus zwei Experimenten enthüllten, dass alle Plasmide in der Bildung von sowohl blauen als auch weißen Kolonien in Gegenwart von TPNPG resultierten, während keine weißen Kolonien in seiner Abwesenheit nachgewiesen wurden (Tabelle VI). TABELLE VI
N.D. = Nicht bestimmbar
Wie schon beobachtet, ergeben alle pAD- und pPS-Plasmide blaue Kolonien auf BCIG enthaltenden Medien, unabhängig von der Anwesenheit von 434-Repressor/Operator- Interaktionen. Vermutlich müssen die gebildeten weißen Kolonien daher aus Zellen resultieren, die Plasmide tragen, die mutiert oder deletiert worden sind, um die Zelle wirksam lac werden zu lassen. Die relativ geringe Häufigkeit, mit der diese weißen Kolonien vorkommen (etwa 10&supmin;&sup5; der plattierten Zellen), legt nahe, dass sie auf Medien ohne TPNPG nicht nachweisbar unter der Mehrheit blauer Kolonien sein würden. Die Analyse der Plasmide in den Zellen solcher weißen Kolonien enthüllte Deletionen (vgl. vorstehend).
In Anwesenheit von TPNPG war die Häufigkeit von von pAD tragenden Stämmen gebildeten blauen Kolonien um 10&sup5; bis 10&sup6; verringert. Das spiegelt das Abtöten der Mehrheit der Population, die ein nicht reprimiertes lac-Operon enthält, durch TPNPG wieder. Der pPS3 enthaltende Stamm wurde auch in ähnlichem Ausmaß in Gegenwart von TPNPG getötet, wie es erwartet werden würde, da schon gezeigt wurde, dass der 434-Repressor nicht in der Lage ist, die Transkription der lac-Gene in diesem Plasmid zu hemmen. In allen Fällen jedoch wurde eine restliche Anzahl von blauen Kolonien in Anwesenheit von TPNPG mit einer Häufigkeit von etwa 10&supmin;&sup5; der plattierten Zellen erhalten. Es wird angenommen, dass diese Kolonien primär Zellen darstellen, die mutierte lacY&supmin;-Plasmide tragen, da schon gezeigt wurde, dass die Selektionskraft von TPNPG ausreicht, um die große Mehrheit der plattierten Zellen zu töten, vorausgesetzt sie bleiben alle lac&spplus;. Da frühere Versuche keine hohe Mutationshäufigkeit für das chromosomale lacY-Gen andeuteten, wird angenommen, dass Rekombination innerhalb des Plasmids für die offenbar hohe Anzahl von Mutanten verantwortlich ist. Frühere Arbeiten zeigten, dass diese Plasmide zur Instabilität in rec&spplus;-Stämmen neigen und dass ein 6300Δlac4169 recA56-Stamm, der verwendet werden könnte, um solche Rekombinationen zu verhindern, auf TPNPG nicht lebensfähig ist.
In starkem Gegensatz zu den anderen Stämmen jedoch überlebt die große Mehrheit von Zellen, die pPS1 oder pPS2 enthalten, in Anwesenheit von TPNPG, wobei die Anzahl blauer Kolonien nur 2-Sfach verringert ist, wobei diese Verringerung für pPS1 am geringsten ist. Das korreliert klar mit der deutlichen Verringerung der β-Galactosidase-Aktivität und daher vermutlich auch der lacY-Expression, was für diese Plasmide schon gezeigt wurde. Daher kann die wichtige Schlußfolgerung gezogen werden, dass die Interaktion zwischen dem 434-Repressor und seinem zugehörigen Operator die lac-Genexpression ausreichend verringern kann, um der Mehrheit der Zellen zu erlauben, das Selektionsverfahren zu überleben.

4. Selektion von Repressoren mit veränderter Spezifität

4(a) Selektion von verändertem 434-Repressor

Ein 434-Gen, das verändert wurde, um zufällige Mutagenese der Bindungsdomäne des 434-Repressors durch Insertion zufälliger Oligonucleotide zu erleichtern, ist beschrieben worden (Wharton und Ptashane, Nature 316, 601-605). Das 434-Repressorgen ist mutagenisiert worden, um KpnI- und NotI-Restriktionsenzymschnittstellen auf jeder Seite der DNA-Erkennungshelix einzuführen, wobei die native Aminosäuresequenz erhalten bleibt. Serien von Oligonucleotideri sind mit den richtigen kohäsiven Enden und enthaltend verschiedene Häufigkeiten von zufällig über die alpha-Helix der DNA-Erkennungsαsequenz verteilten Mutationen synthetisiert worden. Diese Oligogemische sind zwischen die KpnI- und NotI-kohäsiven Enden des modifizierten 434- Repressorgens cloniert worden. In einem anderen Ansatz ist der "schmutzige Oligo"-Ansatz zur Herstellung gemischter Oligos mit Basensubstitutionen an geeigneten Positionen der DNA- Bindungsdomäne verwendet worden.

4 (b) Selektion von verändertem 434-Repressor, der einen in Pflanzengenen gefundenen Pseudo-Oyerator erkennt

Ein natürlich vorkommender Pseudo-Operator wurde zur Selektion eines veränderten Repressors verwendet. Das Ziel dieser Arbeit war das GPAL2-Gen aus Grüner Bohne, das Chorophyll a/b-bindende Proteingen aus Mais und andere. Wir haben mittels Computeranalyse identifiziert, dass mehrere mögliche 434-Pseudo-Operatoren im Bereich des GPAL2-Gens lokalisiert sind. Diese Bereiche des GPAL2-Promotors wurden verwendet, um einen 434- Repressor mit veränderter Spezifität zu selektieren. Die 'Pseudo-Operator'-Sequenzen wurden in den -10 bis -35-Bereich des lac-Pro notors, der die lacZ/lacY-Gene reguliert, eingefügt. Schmutzige Oligos wurden in das 434-Repressorgen eingefügt, und Gemische wurden in E. coli 6300 transformiert. Das Selektionsprotokoll wurde angewendet, und Kolonien wurden isoliert. Mit mikrobiologischen und molekularen Techniken haben wir gezeigt, dass auf mutierte Repressoren selektiert werden kann. Die Charakterisierung des Repressorgens ist mittels DNA- Sequenzanalyse und Bindungsstudien gemacht worden, um die Stärke der Repressorbindung zu bestimmen.
Zusammengefasst liefert die vorliegende Erfindung dann ein Selektionssystem, umfassend bevorzugt bakterielle Stämme und Plasmide und ein empfindliches Suizidsubstratselektionsprotokoll. Dieses Selektionssystem kann verwendet werden, um Repressoren mit veränderter Spezifität zu selektieren. Inbegriffen in dieser Erfindung ist die Bereitstellung der Kontrolle der Genexpression in Organismen mittels Repressoren mit veränderter Spezifität. Das einzige Erfordernis dieses Verfahrens der Kontrolle der Genexpression ist die DNA-Sequenz des Zielgens, die Identifizierung von 'Pseudo-Operatoren' als DNA-Sequenz, die der normalen Operatorsequenz ähnelt, und ein Selektionssystem, das die Selektion von Repressoren erlaubt, die an die 'Pseudo-Operatoren' binden können.

III. GENSEQUENZEN, SPEZIFISCH FÜR MÄNNLICHE BLÜTEN

Dieser Baustein enthält für männliche Blüten spezifische DNA-Sequenzen, umfassend die Polynucleotide, die in den Fig. 17, 18 und 19 hier gezeigt werden, die spezifisch in Gewebe männlicher Blüten exprimiert werden.
Plasmid pMS10 in einem Escherichia coli-Wirt, Stamm R1, enthaltend die in Fig. 17 hier gezeigte Sequenz, ist bei der National Collection of Industrial & Marine Bacteria am 9. Januar 1989 unter der Hinterlegungsnummer NCIB 40098 hinterlegt worden.
Plasmid pMS14 in einem Escherichia coli-Wirt, Stamm DH5α, enthaltend die in Fig. 18 hier gezeigte Genkontrollsequenz, ist bei der National Collection of Industrial & Marine Bacteria am 9. Januar 1989 unter der Hinterlegungsnummer NCIB 40099 hinterlegt worden.
Plasmid pMS 18 in einem Escherichia coli-Wirt, Stamm R1, enthaltend die hier in Fig. 19 gezeigte Genkontrollsequenz, ist bei der National Collection of Industrial & Marine Bacteria am 9. Januar 1989 unter der Hinterlegungsnummer NCIB 40100 hinterlegt worden.
Die Isolierung und Charakterisierung dieser cDNA-Sequenzen und die Verwendung dieser cDNA-Sequenzen als molekulare Sonden zur Identifizierung und Isolierung entsprechender genomischer Sequenzen wird jetzt beschrieben werden.
Die Clone, die die genomischen Sequenzen tragen, und die Herstellung einer Promotorkassette von einem der dargestellten Clone verwendeten einen Ansatz und Techniken, die auf jeden der Clone gleichermaßen angewendet werden können. Weiter wird die Herstellung einer Promotorfusion mit einem Reportergen und die Transformation dieses Konstrukts in eine Testart beschrieben.
Wenn nicht anders bemerkt sind alle Nucleinsäureveränderungen mit Standardverfahren durchgeführt worden, beschrieben in Sambrook, Fritsch und Maniatis, "Molecular Cloning: A Laboratory Manual", Zweite Ausgabe 1989.

BEISPIEL 1

1. Isolation und Charakterisierung für männliche Blüten spezifischer DNA aus Mais

Um cDNAs in Gene zu clonieren, die in den männlichen Blüten von Mais exprimiert werden, stellten wir zwei cDNA-Genbanken her. In Mais entstehen die männlichen Blüten in den Narbenfäden, die den Hauptstamm beenden. Genbank 1 wurde aus Poly[A]-RNA aus ganzen Maisnarbenfäden hergestellt, die frühe meiotische Antheren tragen (die meisten Meiocyten in der frühen meiotischen Prophase), und Genbank 2 aus Poly[A]+-RNA aus ganzen Narbenfäden, die späte meiotische Antheren tragen (vor allem Diaden- und frühe Tetradenstadien). Fig. 14 gibt einen Überblick über das verwendete Genbank- Durchmusterungsverfahren, und das ergab fünf einzigartige frühe meiotische MFS-cDNAs und eine einzigartige späte meiotische cDNA. Clon PMS3, eine partielle cDNA von 120 Basenpaaren, isoliert durch ein differentielles Durchmusterungsverfahren, wurde anschließend als eine Hybridisierungssonde verwendet, um den entsprechenden Anhang nahe dem Vollängen- Clon PMS 18 zu isolieren.
Tabelle VII nachstehend fasst einige der Merkmale jeder dieser cDNA-Clone zusammen. Expression der mRNAs der fünf aus der frühen meiotischen Genbank isolierten MFS-cDNAs wird sowohl bei aus frühen als auch späten meiotischen Narbenfadenproben isolierter RNA nachgewiesen. Die diesen cDNAs entsprechenden mRNAs sind nicht ganz spezifisch für männliche Blüten, und sie werden in beträchtlich geringerer Menge in Blättern (pMS 10 und pMS 18) oder in Blättern, Kolben und Wurzeln (pMS1, pMS2 und pMS4) nachgewiesen (Tabelle VII). Im Gegensatz dazu wird pMS 14-mRNA nur in später meiotischer RNA gefunden und wird nicht in Blättern, Kolben oder Wurzeln nachgewiesen (Tabelle VII).

Tabellenlegende

1 Isoliert aus cDNA-Genbank 1 (frühe meiotische) oder Genbank 2 (späte meiotische).
2 Ungefähre Größe in Basenpaaren.
3 Ungefähre Größe in Nucleotiden.
4 + = exprimiert in Narbenfäden und in viel geringerer Menge in Blättern, Kolben und Wurzeln.
++ = exprimiert nur in Narbenfäden und in viel geringerer Menge in Blättern.
+++ = exprimiert nur in Narbenfäden.
5 E/L = mRNA, vorhanden in RNA aus sowohl frühen als auch späten meiotischen Narbenfäden.
L = mRNA, vorhanden nur in RNA aus späten meiotischen Narbenfäden.
Wir untersuchten die Expression der Gene, die diesen cDNAs entsprechen, während der Narbenfadenentwicklung mit Dot Blot-Hybridisierung (Fig. 15). Die Dot Blot-Analyse wurde durch vollständige Bindung von RNA an Nitrocellulose, gefolgt von Hybridisierung an radiomarkierte pMS-cDNAs durchgeführt. Alle Filter wurden gegen einen Film für 48 h bei 70ºC exponiert, außer pMS10, der für 168 Stunden exponiert wurde. Die Narbenfadenlängen in jeder Probe waren wie folgt: A 2 cm; B = 2-5 cm; C = 5-10 cm; D = 10-15 cm; E = 15-20 cm; F = 20-30 cm und G = 20-30 cm. Die massiven Linien in Fig. 15 zeigen das Entwicklungsstadium in Bezug auf Microsporogenese in jeder Probe: PM = Prämeiose; M Meiose; IP = unreifer Pollen; und MP = reifer Pollen.
Die frühen meiotischen mRNAs (pMS1, 2, 4, 10 und 18) häufen sich sehr früh in der Entwicklung in Narbenfäden kürzer als 2 cm Länge an. Wir haben die Expression in Blütenmeristemen vor diesem Stadium nicht analysiert. Diese mRNAs bleiben durch die meiotischen Antherenstadien hindurch und nehmen dann ab, wenn die Pollenkörner reifen. Im Gegensatz dazu wird die späte meiotische RNA von pMS14 nicht in Narbenfäden kürzer als 5 cm nachgewiesen, aber sie steigt dramatisch an, wenn die sporogenen Zellen der Anthere in die Meiose kommen (Fig. 15). Wie mit den frühen meiotischen mRNAs nimmt pMS 14-mRNA plötzlich ab, wenn sich reifer Pollen in den Antheren ansammelt (Fig. 15).
Diese Daten zeigen, dass verschiedene zeitliche Kontrollen der Genexpression während der Entwicklung männlicher Blüten in Mais vorkommen. Die Kontrollen, die die Anhäufung der frühen meiotischen mRNAs programmieren, sind wahrscheinlich sehr ähnlich, aber sie stehen deutlich im Gegensatz zu denen, die das Auftreten und die Anhäufung der späten meiotischen mRNA, pMS14, regulieren. Sowohl frühe als auch späte meiotische mRNAs sind an Entwicklungsprozessen beteiligt, die vor der Anhäufung von reifen Pollenkörnern stattfinden. Sie sind eindeutig weder an den späteren Stadien der Antherenentwicklung wie Dehiszenz beteiligt, noch sind sie mRNAs, die sich in reifem Pollen anhäufen.
Die Technik der in situ-Hybridisierung ist verwendet worden, um die Gewebslokalisation von MFs-mRNAs in männlichen Blüten von Mais zu bestimmen. Die verwendeten Techniken werden in Wright und Greenland beschrieben (1990; SEB Semina Series, Bd. 43, herausgegeben von N. Harns und D. Wilkman. Cambridge University Press, Cambridge; im Druck). Die gezeigten Daten sind die für pMS 14-mRNA.
Fig. 16 A,B zeigt die in situ-Hybridisierung mit pMS14-Antisense-RNA-Sonden. Sense- und Antisense-Sonden wurden durch Subclonierung eines 300-Basenpaar-Fragments von pMS 14 in den Vektor, pBS, gefolgt von Herstellung von radiomarkierten T3- und T7- Polymerase-Transkripten unter Verwendung von Verfahren, die vorn Hersteller des Vektors vorgeschlagen werden (Stratagene, Warenzeichen) hergestellt. Diese Hybridisierungen zeigen, dass pMS14-mRNA in der Tapetalzellschicht um die sich entwickelnden Microsporen herum lokalisiert ist. Hybridisierung der pMS 14-Antisense-Sonde erfolgt nicht mit irgendwelchen anderen Zellen im Schnitt. Ähnlich zeigt die pMS14-Sense-Sonde keine spezifische Hybridisierung (Fig. 16C). Diese Schnitte wurden aus 15-20 cm Maisnarbenfäden in einem Stadium hergestellt, bei dem die Menge von pMS14-mRNA maximal ist (Fig. 15). In diesen Schnitten und in denen folgender Versuche erfolgt die Hybridisierung mit dem Tapetum der Antheren in einer Blüte, aber nicht in der anderen. In Fig. 16 A,B umgeben die Tapetalschichten, die pMS 14-mRNA enthalten, späte meiotische Microsporen im Tetradenstadium, während die Tapetalschichten, die keine pMS 14-mRNA enthalten, sporogene Zellen umgeben, die noch keine Meiose vollzogen haben. Es ist ein Merkmal von Mais, dass sich die Sätze von Antheren in den einzeinen Blüten des Ährchens nicht koordiniert entwickeln. Folglich zeigt in situ-Hybridisierung, dass die Ansammlung von pMS 14-mRNA gewebsspezifisch ist und bestätigt die Daten, die aus der Dot Blot-Analyse erhalten wurden (Fig. 15), dass die Expression von pMS14-mRNA stadiumsspezifisch ist, da sie zuerst in Tapetum, das die meiotischen Zellen umgibt, entdeckt wurde.

BEISPIEL 2

Bestimmung der DNA-Sequenz von pMS 10

DNA des cDNA-Clons, pMSlO, zur Sequenzanalyse wurde in M13mp18 mittels Standardverfahren subcloniert. Die Nucleotidsequenzen der Subclone wurden mit der Didesoxymethode mittels Standardverfahren bestimmt. Zusätzlich wurde ein Sequenzverfahren (Warenzeichen) verwendet, das vom Hersteller beschriebene Verfahren verwendet. Bereiche der Clone wurden durch Primen mit synthetischen Oligonucleotiden, synthetisiert aus der Sequenz früherer Gelablesungen sequenziert. Für das Priming verwendete Oligonucleotidkonzentrationen waren identisch zu denen, die bei universalen Primern verwendet wurden.
MFS, Clon pMS10-Vollängen-cDNA von 1353 Basenpaaren. Die vollständige Nucleotidsequenz und die vorausgesagte Aminosäuresequenz sind in Fig. 17 gezeigt. Die Sequenz enthält einen offenen Leserahmen von 1022 Nucleotiden, codierend ein Polypeptid von 341 Aminosäuren mit einem abgeleiteten Molekulargewicht von 37371 kd, wobei das Polypeptid reich an Glycinresten ist. Der offene Leserahmen wird flankiert durch untranslatierte 5'- und 3'- Bereiche von 129 beziehungsweise 201 Basen.

BEISPIEL 3

Bestimmung der DNA-Sequenz von pMS14

Verfahren zur Bestimmung der Nucleotidsequenz, wie in Beispiel 2 beschrieben.
Clon pMS14 ist eine unvollständige cDNA von 581 Basenpaaren; die vollständige Nucleotidsequenz und abgeleitete Aminosäuresequenz werden in Fig. 18 gezeigt. Die Sequenz enthält einen offenen Leserahmen, der sich von Nucleotid 1 bis 278 erstreckt, codierend ein partielles Polypeptid von 127 Aminosäuren. Das Polypeptid ist besonders reich an Alanin- und Argininresten. Der offene Leserahmen wird flankiert von einem nichtcodierenden 3'-Bereich von 203 Nucleotiden. Eine Consensus-Prozessierungsstelle und ein Polyadenylierungssignal- Hexanucleotid, AATAAA, liegt an Position 548.

BEISPIEL 4

Bestimmung der DNA-Sequenz von pMS18

Verfahren zur Bestimmung der Nucleotidsequenz, wie in Beispiel 2 beschrieben.
Clon pMS8 ist eine beinahe vollständige cDNA von 933 Basen. Die vollständige Nucleotidsequenz und abgeleitete Aminosäuresequenz sind in Fig. 19 gezeigt. pMS 18 fehlen 28 Nucleotide an seinem 3'-Ende. Die fehlenden Nucleotide kommen in Clon pMJ3 vor, der die Sequenz von pMS8 durch weitere 91 Nucleotide überlappt. pMS3 war der ursprüngliche Clon, der durch differentielle Durchmusterung der cDNA-Genbanken isoliert und anschließend als eine Hybridisierungssonde verwendet wurde, um pMS 18 zu isolieren. pMS 18 enthält einen offenen Leserahmen, der sich von Nucleotid 151 bis 813 erstreckt, und codiert ein Polypeptid von 221 Aminosäuren mit einem abgeleiteten Molekulargewicht von 25 Kilodalton. Das Polypeptid ist besonders reich an Argininresten. Der offene Leserahmen ist durch nichtcodiereride 5'- und 3'-Bereiche von 150 beziehungsweise 120 Nucleotiden flankiert.

BEISPIEL 5

Isolation genomischer Clone, die pMS10 entsprechen

Genomische DNA-Clone, die der cDNA, pMS 10, entsprechende Gene tragen, wurden aus einer EMBL3-Phagengenbank partieller Mb01-Fragmente von Mais-DNA isoliert. Die Genbank wurde mit radiomarkierten "lang-mer" Sonden, synthetisiert in einem in vitro Markierungssystem, durchsucht. Dieses System umfaßte 50 mg eines synthetischen 100 Basen- Oligonucleotids (Basenposition 452-551 in pMS10, Fig. 17), 500 mg eines synthetischen Primeroligonucleotids, Sequenz -TAGTTTCCT-CGGTAG, das mit dem 3'-Ende des langen Oligonucleotids basenpaaren wird, ein oder zwei radiomarkierte Oligonucleotide (gewöhnlich ³²P-dCTP und/oder ³²P-dGTP) und 5-10 Einheiten des Klenow-Fragments der DNA-Polymerase I. Die Reaktionen wurden bei 37ºC für 30 Minuten in einem Puffer, identisch zu dem durchgeführt, der für das "zufällige Priming"-Verfahren der DNA-Markierung verwendet wurde, mit der Ausnahme, dass die zufälligen Hexanucleotide weggelassen wurden. Fünf Millionen Phagen-Clone, immobilisiert auf Nylon "Hybaid" (Warenzeichen)-Filter, wurden bei 65ºC mit diesen Sonden mittels Prähybridisierungs- und Hybridisierungspuffern, empfohlen von den Herstellern der Filter (Amersham International), hybridisiert. Die Filter wurden gewaschen mit 3 x SSC, 0.1% SDS bei 65ºC, und mit diesen Verfahren wurden 50-60 EMBL3-Phagenclone, enthaltend entweder vollständige oder teilweise Bereiche eines pMS 10-Gens, erhalten. Die DNA der drei EMBL3-Phagenclone 10/CT8-1, 10/CT8-3 und 10/CT25-3, die vollständige pMSlO- Gene vereinten, wurde hergestellt und durch Restriktionsenzymspaltung analysiert. Es wurde gezeigt, dass jeder dieser Clone ein gemeinsames 9 kb-EcoRI-Fragment enthält, das sich vom dritten Intron des pMS 10-Gens in die nichtcodierenden 5'- und Promotor-Bereiche des Gens erstreckt. Eine partielle Restriktionskarte des 9 kb-EcoR1-Fragments ist in Fig. 20 gezeigt.

BEISPIEL 6

Isolierung pMS 14 entsprechender genomischer Clone

Um genomische DNA-Clone zu isolieren, die der cDNA pMS14 entsprechende Gene tragen, wurden zwei Ansätze unternommen. Im ersten Ansatz wurde das in Beispiel 5 gezeigte Verfahren angewendet, mit der Ausnahme, dass die 5 Millionen Phagenclone mit der vollständigen cDNA-Sequenz durchmustert wurden, und die Waschstringenz nach der Hybridisierungsprozedur zwei positive Clone 14/CTA und 14/CTD ergab. Im zweiten Ansatz wurde eine 12 kb EcoRI gespaltene Fraktion von genomischer DNA von Mais, von der mittels des Southern-Blotverfahrens gezeigt wurde, dass sie das pMS 14-Gen trägt, in EcoRI gespaltene λ-Phagen EMBL4-DNA ligiert, um eine Genbank von clonierten 17 kb-DNA-Fragmenten herzustellen. Gtob gesagt wurden 200,000 Clone, wie vorstehend beschrieben, durchmustert, und zwei positive Clone, 14/17 m und 14/17R, die ein 17 kb-EcoRI-Fragment vereinten, das mit pMS 14 hybridisierte, wurden isoliert. Bei weiterer Analyse wurde gefunden, dass die zwei aus der partiellen Genbank MboI/EMBL3 isolierten positiven Clone ein internes 17 kb-Fragment enthalten. Eine teilweise Restriktionskarte dieses allen Clonen gemeinsamen 17 kb-EcoRI- Fragments ist in Fig. 21 gezeigt.

BEISPIEL 7

Isolierung pMS 18 entsprechender genomischer Clone

Um genomische DNA-Clone, die der cDNA pMS 18 entsprechende Gene tragen, zu isolieren, wurde das in Beispiel 5 beschriebene Verfahren angewendet. Fünf Millionen EMBL3- Phagenclone wurden mit einer "lang-mer" Sonde hybridisiert, die von der Sequenz von pMS18, Position 133-222 abgeleitet ist. Die Sequenz des komplementären 3'-Oligonucleotids war 5'- GCCTCGGCGGTCGAC-3'. Zwei Clone, 18/CT3 und 18/CT23, die das pMS 18-Gen tragen, wurden aus dieser Durchmusterung isoliert. Restriktionskartierung dieser Clone zeigte, dass sie beide ein 4.5 kb-BamHI-SalI-Fragment, umfassend den 5'-Bereich der codierenden Sequenz von pMS 18 und etwa 4 kb des Promotors und des Bereiches stromaufwärts des Gens, enthielten. Eine partielle Restriktionskarte des Clons 18/CT3 ist in Fig. 22 gezeigt.

BEISPIEL 8

Konstruktion einer von 10/CT8-3 abgeleiteten Promotorkassette

Die folgenden Subclone des λEMBL3-Clons 10/CT8-3 wurden hergestellt. Das 4.5 kb- PstI-EcoRI-Fragment wurde in pUC18 cloniert, um pMS10 zu ergeben. Das 2.7 kb-XbaI- EcoRI-Fragment wurde in pUC18 cloniert, um pMS10 zu ergeben. Das 1.6 kb-HindIII- bis XbaI-Fragment wurde in pUC 18 cloniert, um pMS 10-4 zu ergeben.
Die Polymerasekettenreaktion (PCR) wurde verwendet, um ein 930 bp-Fragment aus pMS 10-3 zu amplifizieren. Die für die PCR-Reaktion verwendeten Primer waren wie folgt. Primer pUC/2 ist zu der pUC-Sequenz, die die Polylinker-Stelle flankiert, homolog. Primer 10/9 ist komplementär zu der Sequenz von pMS10 an Position 106-129, mit der Ausnahme, dass er einen zusätzlichen Thymidinrest zwischen den Basen 123 und 124 enthält. Die Sequenz dieser Primer ist:
pUC/2 5' CGACGTTGTAAAACGACGGCCAGT-3'
10/9 5' AGTCGGATCCCGCCCCGCGCAGCCG-3'
Nach der Amplifikation in der PCR-Reaktion wird ein DNA-Fragment hergestellt, in dem die flankierende XbaI-Stelle und die zu der in dem entsprechenden Bereich von Clon 10/CT8-3 bis zu der Base unmittelbar vor dem Translationsinitiator identische Sequenz genau wiederhergestellt werden, mit der Ausnahme, dass eine neue BamHI-Stelle durch die Einführung des Thymidinrestes eingeführt wird. Dieses 930 bp-Fragment wurde Gel-gereinigt und mit XbaI und BamHI gespalten. Es wurde dann in pMS 10-4, das zuvor mit XbaI und BamHI gespalten wurde, cloniert, um Clon pMS10 zu ergeben. In pMS10 werden die Sequenzen, die für die Promotoraktivität, assoziiert mit dem pMS 10-Gen, erforderlich sind, bearbeitet und verändert, so dass der Promotor jetzt mit jedem Gen über die BamHI-Stelle, die unmittelbar vor dem Translationsstartpunkt liegt, fusioniert werden kann. Dass diese und keine anderen Veränderungen erfolgten, wurde durch Sequenzanalyse bestätigt.

BEISPIEL 9

Konstruktion einer Promotorfusion zwischen dem MS10-Gen und dem Glucuronidase- Reportergen

Das 1830 bp-HindIII bis BamHI-Fragment aus pMS10-5 (Fig. 38) wurde in pTAK1 ligiert, das zuvor mit HindIII und BamHI gespalten wurde. pTAK1 basiert auf dem zweiteiligen pflanzlichen Transformationsvektor Bin19 (Bevan, 1984; Nucleic Acids Research 12, 8711) und trägt das Glucuronidase (GUS)-Reportergen und den Nos 3'-Terminator (Fig. 24). Das resultierende Plasmid wurde pMS10-6GUS genannt und bildet eine transkriptionale Genfusion zwischen dem Promotor des pMS 10-Gens und dem GUS-Reportergen.

BEISPIEL 10

Transformation von Tabakpflanzen mit MS10-Promotorgenkonstrukten

Der rekombinante Vektor pMS10-6GUS wird aus E. coli (TG-2) in Agrobacterium tumefaciens (LBA4404) in einer triparentalen Kreuzung auf L-Platten mit E. coli (HB101), das pRK2013 trägt, transferiert. Transkonjuganten wurden auf Minimalmedium, enthaltend Kanamycin (50 ug/cm³) und Streptomycin (500 ug/cm³), selektiert.
L-Nährlösung (5 cm³), enthaltend 50 ug/cm³ Kanamycin, wurde mit einer einzelnen Agrobacterium-Kolonie angeimpft. Die Kultur wurde über Nacht bei 30ºC unter Schütteln bei 150 UpM wachsen gelassen. Diese Kultur (500 ul) wurde in L-Nährlösung, enthaltend Kanamycin (50 ug/cm³), geimpft und wie vorher wachsen gelassen. Unmittelbar vör der Verwendung wurden die Agrobacteria durch Zentrifugieren bei 3000 UpM für 5 Minuten pelletiert und im gleichen Volumen flüssigem Murashige und Shoog (MS)-Medium suspendiert.
Nährplatten wurden in Petrischalen mit 9 cm Durchmesser wie folgt hergestellt. Festes MS-Medium, ergänzt mit 6-Benzyl-Aminopurin (6-BAP) (1 mg/l) und 1-Naphthalenessigsäure (NAA) (0.1 mg/l), wurde mit einer Suspensionskultur (1 cm³) von Nicotiana tabacum var. Samsun überschichtet. Eine 9 cm- und eine 6 cm-Filterpapierscheibe wurden auf die Oberfläche platziert.
Ganze Blätter aus in Gewebekultur gewachsenen Pflanzen wurden in den Nährplatten platziert. Die Platten wurden mit "Nescofilm" (Warenzeichen) versiegelt und über Nacht in einem Pflanzen-Wachstumsraum inkubiert (26ºC unter hellem Fluoreszenzlicht).
Blätter von den Nährplatten wurden in die Agrobacteria-Suspension in Petrischalen mit 12 cm Durchmesser gegeben und in 1-1.5 cm²-Schnitte geschnitten. Nach 20 Minuten wurden die Blattstücke wieder zu den Nährplatten zurückgegeben, die verschlossen und wieder in den Wachstumsraum gestellt wurden. Nach 48 Stunden Inkubation im Wachstumsraum wurde das Pflanzenmaterial in MS-Medium, ergänzt mit 6-BAP (1 mg/l), NAA (0.1 mg/l), Carbenicillin (500 ug/cm³) und Kanamycin (100 ug/cm³), in Petrischalen transferiert. Die Petrischalen wurden verschlossen und in den Wachstumsraum zurückgestellt.
Beginnend drei Wochen nach der Animpfung mit Agrobacterium wurden die Schößlinge von den Setzlingen entfernt und auf MS-Medium, ergänzt mit Carbenicillin (200 ug/cm³) und Kanamycin (100 ug/cm³), zum Wurzeltrieb gesetzt. Transformierte Pflanzen wurzelten 1-2 Wochen nach dem Transfer.
Nach dem Wurzeltrieb wurden die transformierten Pflanzen in Behälter mit Erde transferiert, und man ließ sie im Glashaus wachsen. Grob einen Monat nach dem Transfer blüten die Pflanzen.
Die Antheren der Tabakpflanzen, enthaltend das pMS10-6GUS-Konstrukt, wurden für die GUS-Aktivität nach Standardverfahren besprüht.

IV. UNTERBRECHUNGSPROTEINGEN

Dieser Baustein enthält ein in Pflanzen exprimierbares Gen, das die mitochondriale Funktion hemmt und so die volle Expression einer ausgewählten pflanzlichen Eigenschaft unterbricht.
Entsprechend liefern wir ein Verfahren der Hemmung der Genexpression in einem pflanzlichen Zielgewebe, umfassend die stabile Transformation einer pflanzlichen Zelle eines Typs, aus dem eine ganze Pflanze mit einem Genkonstrukt regeneriert werden kann, das einen gewebsspezifischen oder einen entwicklungsspezifischen Promotor, der in den Zellen des pflanzlichen Zielgewebes wirkt, und ein Unterbrechungsgen, das ein Protein codiert, das bei seiner Expression die Atmung in den Zellen des Zielgewebes hemmen kann, was zum Tod der Zellen führt, trägt.
Bevorzugt ist das Unterbrechungsgen ausgewählt aus:
(a) Dem Entkopplungsprotein (UCP) aus Säugern, cloniert aus braunem Fettgewebe vow Säugern (normalerweise Ratte).
(b) Einer mutierten Form des Gens für die β-Untereinheit der F&sub1;-ATPase, der Sequenzen zugefügt oder von der Sequenzen deletiert wurden, so dass diese Veränderungen in der Beibehaltung der Fähigkeit, sich mit anderen Untereinheiten zusammenzulagern, resultieren, aber mit der Funktion als eine ATP-Synthase interferieren. Die Fähigkeit dieser veränderten Untereinheiten, sich richtig zusammenzulagern, wird wichtig sein, da die erforderliche phänotypische Wirkung ihrer Expression von ihrer Kompetition mit Wildtyp-Untereinheiten um Bindungsstellen im Enzymkomplex abhängt. Folglich werden Komplexe, die nicht-funktionelle Untereinheiten enthalten, nur schwach aktiv sein, und Mitochondrien, die diese Komplexe enthalten, werden nicht-funktionell sein.
(c) Einer mutierten, synthetischen Form des oli 1-Gens, das die Untereinheit 9 der F&sub0;- ATPase codiert. Mutationen wurden, wie unter (b) vorstehend beschrieben, erzeugt.
(d) Einer mutierten Form einer mitochondrialen Transportpräsequenz, die während des Transfers fehlfunktioniert, was vermutlich durch Blockade von Rezeptorstellen in der Unterbrechung des Proteintransports zu den Mitochondrien resultiert.
(e) Genkonstrukte, die eine Fusion zwischen dem Gen der β-Untereinheit aus Hefe und dem β-Galactosidase-Gen aus E. coli beinhalten, was in der Expression eines unterbrechenden Fusionsproteins resultiert.
Bevorzugt ist der Promotor ein Tapetum-spezifischer Promotor oder ein Pollenspeziiischer Promotor, so dass bei Expression des Unterbrechungsproteins darin die regenerierte Pflanze männlich steril ist. Mehr bevorzugt besitzt der Tapetum-spezifische Promotor die in Fig. 17, 18 oder 19 der begleitenden Abbildungen gezeigte Sequenz.
Die Isolierung und Charakterisierung dieser Genkontrollsequenzen dieser Erfindung werden in Abschnitt III vorstehend beschrieben.
Dieser Baustein liefert daher ein Verfahren, das Wachstum oder die Entwicklung von Pflanzenzellen auf der Grundlage von Genkonstrukten, die die Atmungsfunktion hemmen, zu verhindern oder zu hemmen. Die Technik besitzt eine breite Anwendung in einer Reihe von Feldfruchtpflanzen, bei denen eine Hemmung spezieller Zellen oder speziellen Gewebes erforderlich ist.
Von besonderem Interesse ist die Hemmung männlicher Fertilität in Mais für die Herstellung von F&sub1;-Hybriden in situ. Das Konzept der Hemmung mitochondrialer Funktion als ein Mechanismus für männliche Sterilität entwickelte sich aus einigen früheren Forschungsarbeiten über cytoplasmatische Sterilität in Mais vom T-Typ (cms-T), die eine Verbindung zwischen dem männlich sterilen Phänotyp und mitochondrialer Mißfunktion gezeigt hat. Obwohl eine direkte ursächliche Verbindung zwischen mitochondrialer Mißfunktion und cms-T noch hergestellt werden muss, legen immer mehr Hinweise nahe, dass voll funktionsfähige Mitochondrien, besonders in den tapetalen Zellen, notwendig sind. Das ist besonders kritisch während der Microsporogenese, da die den tapetalen Zellen auferlegten Stoffwechselerfordernisse in einer 40fachen Erhöhung der Mitochondrienzahl resultieren.
Folglich liefern wir eine Reihe von negativen Mutationen, die auf Mitochondrien wirken, um die oxidative Phosphorylierung zu entkoppeln. Bei spezifischer Expression in Mais- Antherengewebe werden diese Mutationen in einem männlich sterilen Phänotyp resultieren.
Das vorgeschlagene Unterbrechungsgen, UCP, trägt zur Thermogenese von braunem Fettgewebe aus Säugern bei und kommt als ein Dimer in der inneren mitochondrialen Membran vor, wobei es einen Protonenkanal bildet und so die oxidative Phosphorylierung durch Zerstörung der elektrochemischen Protonenpotentialunterschiede über die Membran entkoppelt.
Eine Alternative ist die Verwendung chimärer Genkonstrukte, in denen Domänen getauscht werden, wodurch nicht-funktionelle Proteine geschaffen werden. Die Zielproteine hier sind die β-Untereinheit der F&sub1;-ATPase und Untereinheit 9 der F&sub0;-ATPase. Während der Zusammenlagerung der funktionellen ATPase-Komplexe werden die veränderten chimären Untereinheiten um Bindungsstellen kompetieren, die normalerweise von den natürlich vorkommenden Untereinheiten besetzt sind, besonders wenn die Chimären im Vergleich mit den endogenen Genen überexprimiert sind. Mitochondriale Funktion wird unterbrochen werden, da die mit veränderten Untereinheiten zusammengesetzten F&sub1;- und F&sub0;-ATPasen wahrscheinlich schwach aktiv oder nicht-funktionell sind.
Das zur Transformation der Pflanzenzellen verwendete Verfahren gehört nicht zu dieser Erfindung, und jedes für die Zielpflanze geeignete Verfahren kann angewendet werden. Transgene Pflanzen werden durch Regeneration aus den transformierten Zellen erhalten. Zahlreiche Transformationsverfahren sind aus der Literatur bekannt, wie Agroinfektion mit Agrobacterium tumefaciens oder seinem Ti-Plasmid, Elektorporation, Mikroinjektion von Pflanzenzellen und Protoplasten, microprojektile Transformation und Pollenschlauchtransformation, um nur einige zu nennen. Es kann sich für vollständige Details der bekannten Verfahren auf die Literatur bezogen werden.
Die Entwicklung und das Austesten dieser Genkonstrukte als Unterbrechungsgene der mitochondrialen Funktion im unizellulären Organismus Hefe werden jetzt beschrieben werden. Ein Mechanismus, der bei diesen Genkonstrukten verwendet werden kann, um das Wachstum und die Differenzierung pflanzlicher Zellen in transformierten Pflanzen zu hemmen, wird auch beschrieben werden. Der Gegenstand dieser Verfahren ist, Hefe als ein Modellsystem zur Identifikation und Optimierung von Genkonstrukten zur Expression von Proteinen, die die mitochondriale Funktion unterbrechen, zu verwenden. Pflanzenzellen werden dann mit den ausgewählten Konstrukten transformiert und ganze Pflanzen daraus regeneriert werden.
Spezifische Ausführungsformen des Bausteins werden jetzt durch das folgende Beispiel veranschaulicht werden.

BEISPIEL

Es ist aus Berichten in der Literatur bekannt, dass das in den Hefe/E. coli-Schaukelvektor eingefügte UCP-Gen aus Ratte nur geringe Mengen der Expression von UCP ergab. Die Hefe war Saccharomyces cerevisiae, Stamm YM147, und das UCP-Gen war auf dem Plasmid pCGS 110-UCP verfügbar.
Aufgrund des Fehlens brauchbarer Expressionsraten mit dem Wildtypgen wurde eine Veränderung des UCP-Gens der Ratte mittels ortsgerichteter Mutagenese durchgeführt. Die folgenden Veränderungen wurden gemacht:
1. Einführung einer BamHI-Stelle sieben Nucleotide 5' zum AUG-Methionin-Startcodon;
2. Modifikation der Sequenz um das AUG-Methionin-Startcodon, um mit der Consensus- Sequenz ATAATG von Hefe übereinzustimmen;
3. Deletion einer internen BamHI-Stelle; und,
4. Einführung einer BamHI-Stelle ein Nucleotid 3' zum TAG-Terminationscodon.
Diese Veränderungen resultieren in der Deletion der nicht-translatierten 5'- und 3'-UCP- Sequenzen der Ratte sowie der Einführung einer Consensus-Sequenz von Hefe am Methionin- Startcodon.
Das 1.9 kb-EcoRI/PstI-Fragment aus dem Plasmid pCGS110-UCP (eine Karte des Plasmids ist in Fig. 26 gezeigt, und die mRNA-Sequenz des UCP-Gens ist in Fig. 27 gezeigt), das den GAL10-Promotorbereich trägt, und die UCP-eDNA der Ratte wurden in die EcoRI/PstI- Stellen von Ml3mp19-DNA cloniert. Sequenzierung des resultierenden Konstrukts wurde durchgeführt, um die richtige Struktur sicherzustellen.
Ortsgerichtete Mutagenese wurde gemäß den Anweisungen des Amersham (Warenzeichen)-Mutagenesekits mit drei verschiedenen Oligonucleotiden wie folgt durchgeführt:
Oligonucleotid UCP-1 wurde verwendet, um die Consensus-Sequenz der Hefe (in Klammern), die um das Methionin-Startcodon herum vorkommt, sowie die BamHI-Spaltstelle (unterstrichen) einzuführen.
Oligonucleotid UCP-2 wurde verwendet, um eine interne BamHI-Stelle (unterstrichen) zu deletieren.
Oligonucleotid UCP-3 wurde verwendet, um eine BamHI-Stelle unmittelbar nach dem TAG-Stopcodon (unterstrichen) einzuführen.
Diese drei Mutationen erlaubten die Isolierung der gesamten UCP-codierenden Sequenz auf einem 0.93 kb-BamHI-Fragment.
Nach Selektion mutierter Clone wurde die veränderte DNA mit BamHI gespalten. Drei Clone von 20 ausgewählten ergaben Insertionen von 0.93 kb nach Spaltung mit BamHI.
Sequenzierung der Clone UCPS1 und UCPS4 enthüllte, dass das UCP-Gen richtig verändert wurde, ohne dass ungewollte Veränderungen vorhanden waren. Das UCP-Gen wurde dann in das Expressionsplasmid pKV49 der Hefe transferiert, das die Expression fremder Genein S. cerevisiae unter der Kontrolle des starken PGK-Promotors und der GAL1-10-UAS erlaubt, wobei die Induktion/Repression des fremden Gens, je nachdem ob Galactose im Wachstumsmedium anwesend ist, erlaubt wird. Das 0.93 kb-BamHI-Fragment, enthaltend das modifizierte UCP-Gen, wurde in pKV49 in die BglII-Restriktionsschnittstelle cloniert, was in dem Konstrukt pKV49-UCP resultiert.

TRANFORMATION VON HEFE MIT DEM PKV49-UCP-KONSTRUKT

a) Entwicklung eines geeigneten Hefestamms

Für einen Empfänger für das pKV49-UCP-Konstrukt brauchten wir einen Hefestamm, der die geeigneten Marker zur Transformation trägt und die Induktion der Genexpression von der GAL1-10-UAS erlaubt, während er Galactose nicht als eine Kohlenstoff und Energiequelle (GAL1, GAL2) verwenden kann. Solche Stämme wurden durch Paarung der Hefestämme YM147 und SF747 hergestellt. Nach Selektion von Diploiden auf Minimalplatten, enthaltend Uracil, wurden die Kolonien auf sporulierende Medien transferiert. Die resultierenden Sporen wurden auf YDP-Platten wachsen gelassen, bevor die resultierenden Hefekolonien charakterisiert wurden (Fig. 28). Zwei neue Hefestämme BET9 (ura3, trp1, leu2, his3, gal1) und BE27 (ura3, trp1, leu2, gal1) wurden isoliert, von denen beide mit auf pKV49-basierenden Konstrukten transformiert werden können.

b) Hefetransformation

Die Hefestämme BET9 und BE27 wurden mit pKV9 und pKV49-UCP-DNA transformiert; Transformanten wurden unter Verwendung der geeigneten auxotrophen Selektion (leu) selektiert und durch Plasmidisolierung gefolgt von Restriktionskartierung geprüft. Einzelne Kolonien von jeder der vier verschiedenen Transformanten BET9/pKV49, BET9/pKV49-UCP, BE27/pKV49 und BE27/pKV49-UCP wurden in sterilem Wasser resuspendiert, bevor sie auf Plattierungsmedien aufgetropft wurden, die eine Auswahl von Kohlenstoffquellen (Fig. 29) sowohl in Anwesenheit als auch Abwesenheit von Galactose enthielten. Ergebnisse von diesen Plattentests (Fig. 29) deuteten an, dass auf wenigen der verwendeten Kohlenstoffquellen die Anwesenheit von sowohl Galactose als auch des pKV49-UCP-Konstrukts in geringerem Wachstum der resultierenden Hefekolonien resultierte. Die größere Wirkung auf die Verlangsamung des Wachstums wurde mit Glycerin/Casamino (gly/cas)-Medium, enthaltend Galactose, für beide pKV49-UCP-Transformanten beobachtet. Transformanten, denen entweder das UCP-Gen fehlte oder die durch Galactose induziert wurden, wuchsen in der gleichen Geschwindigkeit wie nicht-transformierte BET9- und BE27-Stämme.

WACHSTUMKURVENANALYSE

Da Plattierungstests geringes Wachstum von pKV49-UCP-Transformanten auf gly/cas- Medium in Gegenwart von Galactose angedeutet hatten, wurde eine Wachstumskurvenanalyse in Flüssigkultur durchgeführt, um das Ausmaß des Wachstumsdefekts genauer zu bestimmen. Die Ergebnisse in Fig. 30 ersetzen die Ergebnisse von Plattierungstests und deuten an, dass weder die Anwesenheit von pKV49-UCP-DNA noch Galactose allein ausreichen, um irgendeine Wirkung auf die Wachstumsraten der Hefezellen zu haben, während die Anwesenheit von beiden das Wachstum stark verlangsamt. Da unsere anfänglichen Ergebnisse mit dem Hefestamm YM147, transformiert mit dem Konstrukt pCGS110-UCP, keinen bedeutenden Wachstumsdefekt bei irgendeiner der getesteten Kohlenstoffquellen in Anwesenheit von Galactose gezeigt hatten, schien es, dass die Veränderung des UCP-Gens und/oder die Verwendung eines anderen Vektors (pKV49) in einem beobachtbaren Wachstumsdefekt resultierten.

ANALYSE DER UCP-EXPRESSION

Da die Wachstumskurvenanalyse keine nachweisbaren Unterschiede zwischen BE27- und BET9-Transformanten angedeutet hatte (Fig. 30), wurde entschieden, nur die BET9- Transformanten in den folgenden Versuchen zu verwenden. Wiederholte Wachstumsanalyse auf gly/cas-Medium sowohl in Anwesenheit als auch in Abwesenheit von Galactose wurde mit den BET9-Transformanten durchgeführt. Die Kulturen wurden für 47 Stunden wachsen gelassen, um sicherzustellen, dass die gleichen zuvor beobachteten Wachstumskurvencharakteristika wiederholt wurden (Fig. 31). Die Zellen wurden dann geerntet, die gesamten Zellproteine wurden isoliert und mittels SDS-PAGE auf einem 10% Polyacrylamidgel fraktioniert (im Doppel). Ein Satz fraktionierter Proteine wurde mit Coomassie Blau gefärbt, um gleiche Ladungsmengen der Proteine sicherzustellen, während der andere Satz auf Nylonmembran transferiert und der Western Blot-Analyse mit dem UCP-Antikörper der Ratte unterworfen wurde. Der Western-Blot zeigte zwei wesentliche Merkmale:
1) Die Vergleichsrate der UCP-Expression zwischen der BET9/pKV49-UCP-Transformante und der VY147/pCGS 110-UCP-Transformante deckte auf, dass die UCP-Expression etwa 50- 100fach als eine Folge unserer Veränderungen erhöht war.
2) Die Hefetransformante, die defektes Wachstum auf gly/cas-Medium in Anwesenheit von Galactose zeigt, exprimiert auch wesentliche Mengen an UCP.
Es kann aus diesen Ergebnissen geschlossen werden, dass die Veränderung des UCP- Gens und/oder seine anschließende Clonierung in den pKV49-Vektor in der erhöhten Rate der UCP-Expression relativ zu den anfänglich mit dem pCGS 110-UCP-Konstrukt nachgewiesenen Raten resultierte. Die Wachstumskurvenanalyse zeigt, dass die Expression von UCP eine Wirkung auf die Wachstumsraten von unter bestimmten Bedingungen gewachsenen Hefezellen besitzt. Bis jetzt konnten wir die spezifische Wirkung nicht identifizieren, die die erhöhten Mengen der UCP-Expression auf die Hefezellwachstumsraten haben, aber vorläufige Ergebnisse deuten einen mitochondrialen Defekt an.
Wachstumskurvenanalyse, die im Raffinosemedium (eine fermentierbare Kohlenstoffquelle, die die Gal-Regulation nicht beeinflussen sollte) der BET9-Transformanten, die in Anwesenheit oder Abwesenheit von Galactose wuchsen, durchgeführt wurde, zeigt, dass die Anwesenheit sowohl des UCP-Gens als auch der Galactose keine Wirkung auf die Wachstumsraten besitzt (Fig. 32). Western-Blot-Analyse der Proteine, die aus Zellen isoliert wurden, die während dieser Wachstumskurven isoliert wurden, zeigt Raten an UCP-Expression, die ähnlich zu denen sind, die in Zellen gefunden werden, die in gly/cas-Medium in Anwesenheit von Galactose wuchsen.
Das in BET9/pKV49-UCP-Transformanten, die ohne zugegebene Galactose wuchsen, nachgewiesene UCP resultiert wahrscheinlich aus Galactoseresten, die ins Medium durch Hydrolyse von Raffinose abgegeben werden, wahrscheinlich während des Autoklavierens. Diese Beobachtungen deuten an, dass die Anwesenheit von UCP in Hefezellen, die auf einer fermentierbaren Kohlenstoffquelle (kein Bedarf für oxidative Phosphorylierung) wuchsen, keine Wirkung auf die Zellwachstumsraten hat, während Zellen, die auf gly/cas-Medium wuchsen (eine nicht-fermentierbare Kohlenstoffquelle) und UCP exprimierten, defektes Wachstum besitzen.

LOKALISIERUNG VON UCP IN HEFEZELLEN

UCP der Ratte ist ein Hauptbestandteil der mitochondrialen inneren Membran des braunen Fettgewebes. Im Gegensatz zu vielen anderen Polypeptiden, die in der inneren Membran gefunden werden, enthält es keine abspaltbare Signalsequenz, wobei die Information der Zielrichtung intern in der Aminosäuresequenz des Proteins codiert ist. Da unsere Ergebnisse andeuten, dass das exprimierte UCP eine Wirkung auf die Wachstumsrate von Hefezellen besitzt, ist es dann wichtig, die genaue Lokalisation des in Hefezellen exprimierten Proteins zu bestimmen. Anfängliche Western-Blot-Analyse von gesamten mitochondrialen Proteinen zeigt, das das durch die pKV49-UCP-Transformante exprimierte UCP in der mitochondrialen Fraktion - lokalisiert ist.
Anschließende mitochondriale Fraktionierung enthüllte, dass die Mehrheit des UCP in der inneren Membranfraktion von Hefemitochondrien lokalisiert ist. Obwohl ein kleiner Teil von UCP in dem inneren Membranzwischenraum lokalisiert zu sein scheint, ist diese Beobachtung wahrscheinlich auf die Verunreinigung dieser Fraktion mit der inneren Membranfraktion zurückzuführen. Ähnliche Ergebnisse sind bei der Lokalisierung der β-Untereinheit des F&sub1;- ATPase-Komplexes aus Hefezellmitochondrien erhalten worden. Die β-Untereinheit, die ein Bestandteil der inneren Membran ist, wird auch in unseren Präparationen im Membranzwischenraum nachgewiesen. Diese Ergebnisse zeigen jedoch, dass die Information der Zielrichtung in dem UCP der Ratte ausreicht, um das UCP in die innere Membran von Hefemitochondrien zu lenken, wo es als ein Entkopplungsprotein funktionieren könnte.

UCP-TRANSKRIPT-ANALYSE

Von vielen der zuvor beschriebenen Wachstumskurvenexperimente ist RNA isoliert worden. Wir führen im Moment eine Northern-Blot-Analyse durch, um zu bestimmen, ob sich die Muster der UCP-Expression in UCP-Transkript-Signalen widerspiegeln.

EFFEKT DER KOPIENZAHL AUF DIE UCP-EXPRESSION

Die Transformation von Hefezellen mit Schaukelvektoren, die den Replikationsursprung des Hefe-2 um-Rings enthalten, wie pKV49-UCP, resultiert in diesen Plasmiden, die in etwa 40- 50 Kopien pro Zelle vorhanden sind. Folglich wird jedes fremde Gen, das von dem Plasmid getragen wird, in der gleichen, relativ hohen Kopienzahl vorhanden sein, die in der Expression des fremden Proteins in einer höheren Menge resultieren kann, als es für ein Gen in einer niedrigen Kopienzahl der Fall sein würde. Wir haben daher versucht, die Kopienzahl des UCP- Gens durch seine Integration in das Hefechromosom an einer einzigen Stelle zu erniedrigen, resultierend in einer genetisch stabilen Einzelkopie-Transformante. Der Vektor YIp5 (Fig. 33) ist ein integrierender Hefevektor, der das ura3-Gen trägt; er kann sich nicht autonom in Hefe replizieren.
Das 1.8 kb-EcoRI/SaII-Fragment aus pKV49-UCP, enthaltend das UCP-Gen der Ratte zusammen mit dem PGK-Promotor und der GAL-UAS, wurde in die EcoRIISaII-Schnittstellen von YIp5-DNA cloniert. Das resultierende Plasmid UIP-UCP (Fig. 33) wurde durch Restriktionsenzymkartierung geprüft, um sicherzustellen, dass das UCP-Gen richtig inseriert worden ist. Das YIP-UCP-Plasmid wurde mit dem Restriktionsenzym EcoRV (das in der Mitte des URA3-Gens (Fig. 33) schneidet) geschnitten, und die linearisierte YIP/UCP-DNA wurde verwendet, um die Hefezelllinien BET9 und BE27 zu transformieren. Die Transformanten wurden anfänglich auf Minimalplatten durch Selektion auf Uracil-Prototrophie durchsucht, und nach 7-10 Tagen wurden zwei Transformanten jeder Zelllinie auf YPD-Platten (nicht-selektiv) ausgestrichen. Die Transformanten wurden dann vier aufeinanderfolgenden Wachstumsperioden auf nicht-selektivem Medium unterzogen. 100 Kolonien von jeder der ursprünglichen vier Transformanfen wurden dann auf sowohl nicht-selektiven (YPD) als auch selektiven Medien (Minimalplatten + ura) replikaplattiert. Alle Kolonien wuchsen auf den selektiven Medien, was andeutet, dass das URA3-Gen, das genetisch mit dem UCP-Gen verbunden ist (Fig. 33), in das Hefezellchromosom integriert worden ist. Chromosomale DNA wurde von jeder der vier Transformanten isoliert, mit dem Restriktionsenzym EcoRI gespalten und auf einem 0.08% Agarosegel fraktioniert. Southern-Blot-Analyse mit einer markierten UCP-Sonde zeigte, dass das UCP-Gen im Hefechromosom von allen vier Transformanten vorhanden ist. Western-Blot- Analyse mit dem UCP-Antikörper der Ratte wird die Rate der UCP-Expression in diesen Transformanten zeigen. Eine Wachstumskurvenanalyse dieser Transformanten, die in Anwesenheit von Galactose gewachsen sind, zeigt, dass sie eine Wachstumshemmung übereinstimmend mit einem mitochondrialen Defekt besitzen können.

BEISPIEL 3

Veränderung der β-Untereinheit der F&sub1;-ATPase

Der zweite Ansatz, den wir gemacht haben, um Mutationen einzuführen, die die mitochondriale Funktion beeinflussen, ist die direkte Veränderung der funktionellen mitochondrialen Proteine, von denen bei ihrer Expression in Hefe erwartet werden kann, dass sie mit der Bildung von ATP interferieren. Das für diesen Ansatz gewählte Protein ist die β- Untereinheit des F&sub1;-ATPase-Komplexes. Die DNA-Sequenz des Gens der β-Untereinheit der Hefe ist bekannt, und das Gen ist unabhängig cloniert und in unserem Labor 918 sequenziert worden.
Der F&sub1;-ATPase-Teil der ATP-Synthase katalysiert den letzten Schritt der oxidativen Phosphorylierung. F&sub1; ist aus fünf verschiedenen Polypeptiden mit der Bezeichnung α, β, γ, δ und &epsi; zusammengesetzt. Versuche, die von Parsonage et al. über die Modifikation der β-Untereinheit der F&sub1;-ATPase aus E. coli durchgeführt wurden, identifizierten spezifische Aminosäurereste der β-Untereinheit, die sehr wichtig für die Katalyse sowohl der ATP-Synthese als auch der ATP- Hydrolyse zu sein scheinen. Zwei Mutationen insbesondere wurden gezeigt, in stark beeinträchtigter Katalyse ohne große strukturelle Veränderung der F&sub1;-ATPase zu resultieren. Eine dieser Mutationen resultierte aus dem Austausch des stark konservierten Lysinrestes in der katalytischen Nucleotidbindungsdomäne an Position 155 zu einem Glutaminrest, während die andere Mutation aus dem Austausch des Methioninrestes an Position 209 zu einem Leucinrest resultierte. Von beiden dieser Mutationen ist berichtet worden, dass sie ihre Wirkung durch die Verhinderung von Konformationsveränderungen auszuüben, die von der katalytischen Kooperativität im F&sub1;-Komplex erfordert werden.
Da die Zusammenlagerung dieser mutierten β-Untereinheitproteine in die F&sub1;-ATPase nicht beeinträchtigt ist, wurde angenommen, dass ähnliche Mutanten der β-Untereinheit in Hefe um die Zusammenlagerung zur F&sub1;-ATPase kompetieren könnten. Es wurde überlegt, dass das Ergebnis, sowohl Wildtyp- als auch mutierte β-Untereinheiten in der gleichen F&sub1;-ATPase zu haben, vielleicht in beeinträchtigter Katalyse resultieren könnte, was in einer Abnahme der ATP- Produktion und verlangsamtem Zellwachstum resultiert.
Von der β-Untereinheit der F&sub1;-ATPase von einer breiten Vielfalt von Quellen ist gezeigt worden, dass sie in der Aminosäuresequenz hochkonserviert ist, und der Vergleich der Aminosäuresequenz der β-Untereinheit von S. cerevisiae mit der von E. coli bestätigt, dass die Lysin- und Methioninreste, die von Parsonage et al. als sehr wichtig für die katalytische Aktivität gezeigt wurden, mit den Lysin- und Methioninresten an Positionen 196 beziehungsweise 255 in der β-Untereinheitssequenz der Hefe konserviert sind.
Um SDM durchzuführen, wurde das Wildtyp-β-Untereinheitsgen aus Hefe aus dem Plasmid pGR208 (Fig. 34) als ein EcoRI/BamHI-Fragment isoliert, das in M13mp19 cloniert wurde. Zwei mutierte β-Untereinheitsgene wurden konstruiert: mutiertes BB 1 besitzt sowohl Met255 als auch Lys 196, ausgetauscht zu Isoleucin beziehungsweise Glutamin, während mutiertes BB2 nur die Lysin-Glutamin-Mutation (Fig. 34) besitzt. Nach Sequenzanalyse, um eine korrekte Mutagenese ohne nichtgewollte Mutationen sicherzustellen, wurden die mutierten β-Untereinheitsgene aus mp19 durch EcoRI/BamHI-Spaltungen entfernt. Die die Gene enthaltenden Fragmente wurden dann mit glatten Enden versehen und mit BglII-gespaltenem pKV49 (Fig. 35), das zuvor mit glatten Enden versehen worden war, ligiert. Wir haben beide mutierten β-Untereinheitsgene in pKV49 (pKV49-BB1 und pKV49-BB2) cloniert und haben den Hefestamm BET9 mit diesen beiden Konstrukten transformiert. Wachstumskurve und Plattenwachstum von beiden mutierten β-Untereinheits-Transformanten zeigen, dass die Transformanten veränderte Wachstumseigenschaften haben, die mit einem mitochondrialen Defekt übereinstimmen.
Gleichzeitig mit der Transformation des Stammes BET9 mit den mutierten β- Untereinheitsgenen kann Genunterbrechung verwendet werden, um ein Derivat von Stamm BET9 zu konstruieren, das die β-Untereinheit nicht synthetisieren kann. Der resultierende Stamm wird daher nicht auf nicht-fermentierbaren Kohlenstoffquellen wachsen können, obwohl er leicht auf einer fermentierbaren Kohlenstoffquelle wie Glucose aufrechterhalten werden kann. Transformation dieses Stammes mit Plasmiden, die mutierte β-Untereinheitsgene tragen, gefolgt von der Messung der Wachstumseigenschaften der Transformanten auf einer nichtfermentierbaren Kohlenstoffquelle, zeigt, dass die veränderte β-Untereinheit die oxidative Phosphorylierung nicht unterstützen kann.

BEISPIEL 4

Fusionsproteine

Eine alternative Strategie zur selektiven Störung der mitochondrialen Funktion ist die Expression eines Fusionsproteins, das in entweder geringem oder keinem Hefezellwachstum resultiert. Der Fusionsprotein-Kandidat, der aus diesem Projekt ausgewählt wurde, enthält den N-terminalen Bereich der β-Untereinheit der ATP-Synthase der Hefe, fusioniert mit dem größten Teil der β-Galactosidase von E. coli und ist durch Genfusion hergestellt worden (Fig. 36). Es ist schon gezeigt worden, dass dieses β-Untereinheit/β-Galactosidase-Fusionsprotein in die innere Membran von Hefemitochondrien 921) gelenkt wird, und Zellen, die dieses Fusionsprotein exprimieren, scheinen auf einer nicht-fermentierbaren Kohlenstoffquelle nicht wachsen zu können. In Anwesenheit des Fusionproteins beträgt die Umwandlungskapazität der mitochondrialen Membran, wie durch die ³²P-ATP-Austauschreaktion gemessen, nur 9% von der in Abwesenheit des Fusionsproteins gemessenen. Bis jetzt ist der Mechanismus in dieser 5 Beschreibung noch nicht aufgeklärt worden, aber es wird angenommen, dass die Genfusion ein Protein produziert, das in der inneren Membran eingeschlossen wird und störend auf (eine) wesentliche Funktion(en) des Atmungswachstums einwirkt.

KONSTRUKTION DER ATP2/LacZ-GENFUSION

Das Plasmid pGR208, das die ATP2-DNA der Hefe enthält, codierend das β- Untereinheitsgen der ATP-Synthase (Fig. 34), wurde mit EcoRI und BamHI gespalten, was in der Freisetzung eines 1.1-kb Fragmentes, codierend die ersten 350 Aminosäuren des β- Untereinheitsproteins, resultiert. pMUR1720 ist ein auf pUC8-basierendes Plasmid, das ein LacZ-Gen, enthalten innerhalb eines EcoRI/NarI-Fragments, enthält (Fig. 36). Clonierung des 1.1 -kb-EcoRI/BamHI-DNA-Fragments, codierend die ersten 350 Aminosäuren des β- Untereinheitsproteins der Hefe, in die EcoRI/BamHI-Stellen von pMUR1720 (Fig. 36A) resultiert in einer Fusion im Leserahmen zwischen den 350 Aminosäuren der β-Untereinheit und dem ganzen (minus den ersten acht Aminosäuren) LacZ-Protein (Fig. 36). Die ganze-β- Untereinheit/LacZ-Genfusion ist jetzt auf dem 4.3-kb EcoRI/NarI-Fragment in Konstrukt pMUR1720-BLZ enthalten (Fig. 36). Dieses 4.3 kb-EcoRI/NarI-Fragment wird zur Zeit in den pKV49-Vektor cloniert, was in dem pKV49-BLZ-Konstrukt resultiert (Fig. 37), das verwendet werden kann, um die Hefestämme BET9 und BE27 zu transformieren und zu zeigen, dass bei seiner Induktion durch Galactose Wachstumsdefekte übereinstimmend mit mitochondrialer Hemmung auftreten.

BEISPIEL 5

Konstruktion einer Promotorfusion zwischen dem MS 10-Gen und dem UCP-Gen

Das 1830 bp-HindIII bis BamHI-Fragment aus pMS 10 wurde in den zweiteiligen pflanzlichen Transformationsvektor Bin19, zuvor mit HindIII und BamHI geschnitten, ligiert. Nach der Ligierung wurde das resultierende Plasmid mit BamHI gespalten und mit dem 930 bp-UCP-BamHI-Fragment aus Plasmid pUC/UCP (Derivat von pUC19, enthaltend das modifizierte UCP-Gen, cloniert an der BamHI-Stelle) ligiert, um eine Fusion zwischen dem MS 10-Genpromotor und dem UCP-Gen herzustellen. Zuletzt wurde der nos-3'-Terminator, erhalten als ein 250 bp SstI-EcoRI-Fragment aus Vektor pTAK1, in das MS10-UCP-Konstrukt, das zuvor mit SstI und EcoRI gespalten wurde, ligiert. Das resultierende Plasmid wird pBinIMS10-UCP (Fig. 39) genannt und enthält den MS10-Promotor, das UCP-Gen, die nos-3'- Terminator-Expressionskassette, lokalisiert zwischen den rechten und linken Grenzsequenzen der Agrobacterium T-DNA, was eine wirksame Transformation in Tabakzellen erlaubt.

BEISPIEL 6

Transformation von Tabakpflanzen mit pBin/MS10-Promotorgenkonstrukten

Der rekombinante Vektor pBin/MS10-UCP wurde aus E. coli (TG-2) in Agrobacterium tumefaciens (LBA4404) in einer triparentalen Kreuzung auf L-Platten mit E. coli (HB 101), das pRK2013 trägt, übertragen. Transkonjuganten wurden auf Minimalmedium, enthaltend Kanamycin (50 ug/cm³) und Streptomycin (500 ug/cm³), selektiert.
L-Nährlösung (5 cm³), enthaltend Kanamycin zu 50 ug/cm³, wurde mit einer einzelnen Agrobacterium-Kolonie angeimpft. Die Kultur wurde über Nacht bei 30ºC unter Schütteln bei 150 UpM wachsen gelassen. Diese Kultur (500 ul) wurde in L-Nährlösung, enthaltend Kanamycin (50 ug/cm³), geimpft und wie zuvor wachsen gelassen. Unmittelbar vor der Verwendung wurden die Agrobacteria durch Zentrifugation bei 3000 UpM für 5 Minuten pelletiert und in einem gleichen Volumen von flüssigem Murashige und Skoog (MS)-Medium suspendiert.
Nährplatten wurden in Petrischalen mit 9 cm Durchmesser wie folgt hergestellt. Festes MS-Medium, ergänzt mit 6-Benzyl-aminopurin (6-BAP) (1 mg/l) und 1-Naphthalenessigsäure (NAA) (0.1 mg/l), wurde mit einer Suspensionskultur von Nicotiana tabacum var. Samsun (1 cm³) überschichtet. Eine 9 cm- und eine 7 cm-Filterpapierscheibe wurden auf die Oberfläche gelegt.
Ganze Blätter von in Gewebekultur gewachsenen Pflanzen wurden in die Nährplatten gelegt. Die Platten wurden mit "Nescofilm" (Warenzeichen) verschlossen und über Nacht in einem Pflanzenwachstumsraum (26ºC unter hellem Fluoreszenzlicht) inkubiert.
Blätter von den Nährplatten wurden in Agrobacteria-Suspension in Petrischalen mit 12 cm Durchmesser gelegt und in 1-1.5 cm²-Abschnitte geschnitten. Nach 20 Minuten wurden die Blattstücke in die Nährplatten zurückgelegt, die verschlossen und in den Wachstumsraum zurückgestellt wurden. Nach 48 Stunden Inkubation im Wachstumsraum wurde das Pflanzenmaterial in MS-Medium, ergänzt mit 6-BAP (1 mg/l), NAA (0.1 mg/l), Carbenicillin (500 ug/cm³) und Kanamycin (100 ug/cm³), in Petrischalen transferiert. Die Petrischalen wurden verschlossen und in den Wachstumsraum zurückgestellt.
Beginnend drei Wochen nach der Animpfung mit Agrobacterium wurden die Schößlinge von den Setzlingen entfernt und auf MS-Medium, ergänzt mit Carbenicillin (200 ug/cm³) und Kanamycin (100 ug/cm³), zum Wurzelaustrieb gesetzt. Transformierte Pflanzen trieben 1-2 Wochen nach dem Transfer Wurzeln aus.
Nach dem Wurzelaustrieb wurden transformierte Pflanzen in Behälter transferiert, die Erde enthielten, und man ließ sie im Glashaus wachsen. Grob einen Monat nach dem Transfer blüten die Pflanzen.
Die Antheren der Tabakpflanzen, enthaltend das pBin/MS 10-UCP-Konstrukt, wurden auf die Expression des UCP-Gens mit Nortliern-Blots der RNA-Proben getestet, und die Wirkung der UCP-Expression auf die Pollenentwicklung wurde bestimmt.

Claims

1. Pflanzen-Genkonstrukt, umfassend:

(a) eine Kontrollsequenz, die eine erste Genpromotorsequenz umfaßt, die auf die Anwesenheit oder Abwesenheit eines exogenen chemischen Induktors anspricht, wobei die Kontrollsequenz funktionell verbunden ist mit einem Gen, das ein Kontrollprodukt codiert;

(b) eine für männliche Blüten spezifische Genpromotorsequenz, die nur in männlichen Teilen einer Pflanze exprimierbar ist; und

(c) ein Gen, das ein Unterbrechungsprotein codiert, das in der Lage ist, die Biogenese von lebensfähigen Pollen zu unterbrechen, unter der Kontrolle des für männliche Blüten spezifischen Genpromotors;

wobei eine Expression des Kontrollprodukts in Abhängigkeit von der Anwesenheit oder Abwesenheit des exogenen chemischen Induktors in der Pflanze die Unterbrechung der Pollenbiogenese durch das Unterbrechungsprotein inhibiert, um die Selektion von männlicher Fertilität oder Sterilität zu ermöglichen.

2. Pflanzen-Genkonstrukt nach Anspruch 1, wobei das Gen, das ein Kontrollprodukt codiert, ein Gen ist, das ein Repressorprotein codiert, und das Konstrukt weiterhin umfaßt

(d) eine Operatorsequenz, die auf das Repressorprotein anspricht, wobei die Operatorsequenz die Expression des Gens kontrolliert, das ein Unterbrechungsprotein codiert.

3. Pflanzen-Genkonstrukt nach Anspruch 2, wobei das Repressorproteingen ein Gen für ein DNA-bindendes Protein ist, das unter der Kontrolle des chemisch induzierbaren Promotors steht, wobei das DNA-bindende Protein in der Lage ist, mit der mit dem Unterbrechungsgen verbundenen Operatorsequenz zu interagieren.

4. Pflanzen-Genkonstrukt nach Anspruch 3, wobei das Gen für ein DNA-bindendes Protein ein Repressorprotein codiert, so daß bei Expression des DNA-bindenden Proteins die Genexpression von Protein durch das Unterbrechungsgen inhibiert ist.

5. Pflanzen-Genkonstrukt nach Anspruch 3 oder 4, wobei sowohl das Gen für ein DNA-bindendes Protein als auch der Operator nicht-pflanzlichen Ursprungs sind.

6. Pflanzen-Genkonstrukt nach Anspruch 5, wobei sowohl das Gen für ein DNA- bindendes Protein als auch der Operator bakteriellen Ursprungs sind.

7. Pflanzen-Genkonstrukt nach Anspruch 6, wobei das Gen für ein DNA-bindendes Protein und der Operator von dem lacl-Gen von Escherichia coli abgeleitet sind.

8. Pflanzen-Genkonstrukt nach Anspruch 7, wobei das DNA-bindende Protein und der Operator aus dem Plasmid mit der Bezeichnung p35Slacl isoliert sind, das in einem Escherichia coli-Wirt, Stamm TG-2, bei der National Collection of Industrial and Marine Bacteria Limited, Aberdeen, United Kingdom am 12. Dezember 1988 unter der Hinterlegungsnummer NCIB 40092 hinterlegt wurde.

9. Pflanzen-Genkonstrukt nach einem der Ansprüche 1 bis 8, wobei die Operatorsequenz eine Pseudo-Operatorsequenz ist und das Repressorgen ein mutiertes regulatorisches Gen ist, das einen Repressor codiert, der eine Aminosäuresequenz aufweist, die den Pseudo-Operator bindet.

10. Pflanzen-Genkonstrukt nach einem der Ansprüche 1 bis 9, wobei die für männliche Blüten spezifische Sequenz das Polynucleotid ist, das in Fig. 17 gezeigt ist, das spezifisch in männlichem Blütengewebe exprimiert wird.

11. Pflanzen-Genkonstrukt nach Anspruch 10, wobei die für männliche Blüten spezifische Sequenz isoliert ist aus dem Plasmid pMS10, das in einem Escherichia coli-Wirt, Stamm R1, bei der National Collection of Industrial and Marine Bacteria am 9. Januar 1989 unter der Hinterlegungsnummer NCIB 40098 hinterlegt wurde.

12. Pflanzen-Genkonstrukt nach einem der Ansprüche 1 bis 9, wobei die für männliche Blüten spezifische Sequenz das Polynucleotid umfaßt, das in Fig. 18 gezeigt ist, das spezifisch in männlichem Blütengewebe exprimiert wird.

13. Pflanzen-Genkonstrukt nach Anspruch 12, wobei das für männliche Blüten spezifische Gen isoliert ist aus dem Plasmid pMS14, das in einem Escherichia coli-Wirt, Stamm DH5α, bei der National Collection of Industrial and Marine Bacteria am 9. Januar 1989 unter der Hinterlegungsnummer NCIB 40099 hinterlegt wurde.

14. Pflanzen-Genkonstrukt nach einem der Ansprüche 1 bis 9, wobei die für männliche Blüten spezifische Sequenz das Polynucleotid umfaßt, das in Fig. 19 gezeigt ist, das spezifisch in männlichem Blütengewebe exprimiert wird.

15. Pflanzen-Genkonstrukt nach Anspruch 14, wobei die für männliche Blüten spezifische Sequenz aus dem Plasmid pMS18 isoliert ist, das in einem Escherichia coli-Wirt, Stamm R1, bei der National Collection of Industrial and Marine Bacteria am 9. Januar 1989 unter der Hinterlegungsnummer NCIB 40100 hinterlegt wurde.

16. Transformierte Pflanze und Pflanzenteile wie z. B. Zellen, Protoplasten und Samen, enthaltend das in den vorgenannten Ansprüchen beanspruchte Konstrukt.

17. Pflanze, die wiederherstellbar männlich steril ist, wobei die Pflanze durch Transformation stabil in ihr Genom integriert das rekombinante Pflanzen- Genkonstrukt enthält, das in einem der vorgenannten Ansprüche beansprucht wird.

18. Pflanze oder Pflanzenteil nach Anspruch 16 oder 17, wobei die Pflanze dicotyl ist.

19. Pflanze oder Pflanzenteil nach Anspruch 16 oder 17, wobei die Pflanze monocotyl ist.