KR20030031467A - 트랜스진의 유전을 감소 또는 제거하는 방법 및 조성물 - Google Patents

트랜스진의 유전을 감소 또는 제거하는 방법 및 조성물 Download PDF

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KR20030031467A
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마리아 에이. 모레노
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Abstract

꽃가루 또는 정자가 이계교배 될 수 있는 감수분열이 일어나는 트랜스제닉 진핵생물에서의 트랜스진의 생산, 유지 및 제어에 대한 유전구조 및 방법이 기술되어 있다. 여기에는 트랜스제닉 동물, 식물 세포, 식물 조직 및 전체 식물이 포함된다. 보다 구체적으로, 본 발명은 배우체 불임 형질(GST)를 사용하는 웅성 및/또는 자성 배우자 또는 배우체 의한 트랜스진 유전의 제어에 관한 것이다. 본 발명의 유전 구조 및 방법은 트랜스진의 원하지 않는 확산을 제어하는 능력을 제공한다. 게다가, 본 발명은 분산된 및/또는 안정한 전위를 위한 식물 또는 다른 진핵생물을 증가시키는 도구 및 방법을 또한 제공한다.

Description

트랜스진의 유전을 감소 또는 제거하는 방법 및 조성물{METHODS AND COMPOSITIONS TO REDUCE OR ELIMINATE TRANSMISSION OF A TRANSGENE}
여기의 모든 간행물 및 특허 출원서는 각 간행물 또는 특허 출원서가 참고문헌에 의해 구체적으나 개별적으로 구현되는 것을 나타내는 것처럼 동일한 정도로 참고문헌에 의해 구체화된다.
트랜스제닉 작물 및 생명공학의 활용은 전세계의 종자 및 농화학 산업을 급격하게 변화시키고 있다. 상업적으로 중요한 작물의 종자는 농약 및 전염병 특히, 곤충에 의한 전염병에 저항성을 갖도록 유전적으로 강화되어오고 있다. 미국 농업국의 조사(2000년 6월)에 의하면, 유전적으로 형질전환된 옥수수, 콩 및 목화는 2000년도의 각 작물에 대한 전체 미국 토지의 각각 약 25%, 54% 및 61%가 재배되었다.
상업적으로 중요한 작물의 이형 형질의 과도한 유전은 전세계적인, 특히 농업국가에서, 큰 대상사이다. 트랜스제닉 꽃가루의 원치않는 살포는 유익한 곤충에게 뜻하지 않게 해가 될 수 있고 식품의 오염 및 농약 및 살충제에 저항성을 가진 잡초의 재배를 유도하는 식물종과 관련된 트랜스진이 확산될 수 있다.
생명공학 산업은 가뭄, 곤충, 질병, 염분, 동상 및 제초제에 대한 저항성과 같은 형질을 야생 식물 보다 적응 장점을 부여할 수도 있는 재배 식물에 전이하는 것에 관심이 있다. 여러 작물들은 야생종들과 상호 호환되는 것으로 알려져 있고 이런 형질은 가능성 있는 경제적 및 생태학적 손해를 일으키는 성의 잡종을 통해서 야생 잡초류에 뜻하지 않게 전이될 수도 있다. 대부분의 사료 및 잔디는 상대적으로 재배하기가 어렵고 어떤 예(예를 들어, 버뮤다풀)에서는 잡초로 여겨지므로, 유전적으로 형질전환된 식물의 궁극적인 판매 및 사용에 있어 문제가 발생할 가능성이 높다. 일반적으로, 사료용 풀은 잘 재배되지 않고 , 잡초의 특성을 갖고, 이계교배가 잘되기 때문에, 트랜스제닉 사료용 풀의 궁극적인 판매에 있어 특별한 어려움에 직면할 수 있다.
상업적으로 중요한 작물에서의 이형 형질의 뜻하지 않은 유전을 방지하는 방법을 갖는 것이 매우 바람질할 것이다. 만일 이것이 실현되면, 이형형질의 유전적 연관을 제어할 수 있게되고 뜻하지 않게 수혜자에게 이런 형질이 확산되는 것을 억제할 수도 있다. 그래서, 전이 유전자를 포함하는 웅성 또는 자성 배우체를 선택하는 유전 방식에 대한 요구를 통해 뜻하지 않은 이형형질의 유전을 방지하고, 제거하거나 감소시킨다. 특히, 같은 식물의 비-트랜스제닉(예를 들어, 야생 형태)배우체의 유전을 가능하게 하는 반면에 트랜스제닉(예를 들어, 이형)배우체의 유전을 방지하는 유전 방식에 대한 요구가 있다.
본 발명의 목적은 상업적으로 중요한 작물에서 이형 형질의 뜻하지 않은 유전을 제어, 감소, 또는 제거하는 재조합된 핵산구조 및 방법을 제공하는 것이다.
본 발명은 꽃가루 또는 정자가 이계교배될 수 있는 감수분열이 일어나는 트랜스제닉 진핵생물에서의 트랜스진의 생산, 유지 및 제어와 관련된 것이다; 본 발명에는 트랜스제닉 동물, 식물 세포, 식물 조직 및 모든 식물을 포함한다. 보다 구체적으로, 본 발명은 웅성 및/또는 자성 배우자 또는 배우체에 의한 트랜스진 유전의 제어에 관한 것이다. 본 발명의 유전 구조 및 방법은 트랜스진의 뜻하지 않은 확산을 제어하는 능력을 제공한다. 게다가, 본 발명은 분산된 및/또는 안정한 전위를 위한 식물 게놈 또는 어떤 다른 진핵생물 게놈을 증가시키는 도구와 방법을 또한 제공한다.
본 출원과 관련된 상호 참고문헌
본 출원은 참고문헌에 의해 구체화되는 2000년 2월 28일에 출원된 가출원 60/185,524에 대해 우선권을 주장한다.
정부지원 연구하에 완성된 발명에 대한 권리서
본 발명은 Grant Nors. NIH GM R01 GM38148 및 NSF 61-2558의 정부 지원으로 부분적으로 완성되었다.
하기의 본 발명의 상세한 설명에 첨부된 도면과 연계해서 읽으면 더 잘 이해될 것이다. 본 발명을 설명할 목적으로 바람직하게 제공되는 도면이 있다. 그러나, 본 발명은 하기의 상세한 설명에 제한되지 않는다.
도 1A는 꽃가루-특이 프로모터가 자살유전자와 작동하도록 연관되는 GST(배우체 불임 형질)구조를 보여준다. GST 구조는 트랜스진 복합체를 형성하기 위한 대상 유전자에 물리적으로 연관될 수 있다. GST 구조는 대상 유전자의 유전을 방지하거나 제거하는데 사용될 수 있다.
도 1B는 전위유전단위 및 유전자전위효소 공급원과 연관된 GST 구조를 보여준다. 이 구조는 안정하게 분산된 트랜스포손을 위한 식물세포 자손의 개체군을 증가시키기 위해 사용될 수 있다.
도 2는 감수분열 생산물의 트랜스진 복합체를 제거 및 분산된 전위를 선택하는 일반적인 전략을 보여준다.
도 3A 및 도 3B는 GST 구조의 개략도이다.
도 4A 및 도4B는 각각 pYU904 및 pYU905dml 개략도이다.
도 5는 pYU846 유전자전이효소 구조의 개략도이다.
본 발명은 식물에서 이형 형질의 확산을 제어하는 유전 구조 및 방법에 관한것이다. 제어는 자살유전자를 함유하는 웅성 또는 자성 배우자를 선택하는 자살유전자와 작동하도록 연관된 성-특정 프로모터를 제공함으로써 성취된다. 상기 자살유전자 좌위는 "배우체 자살 형질"(GST)(도 1)로 불리운다. 대상의 트랜스진을 성-특이 프로모터의 제어하에 자살유전자와 연관시킴으로써, GST를 갖는 배우자가 생성되지 않기 때문에 자손에 대한 트랜스진의 유전은 효과적으로 제거되고, 감소 또는 방지된다.
한 가지 양상에서, 본 발명은 대상의 트랜스진과 연관된 꽃가루-특이 프로모터의 제어하의 자살 유전자의 다양한 구성이라고 할 수 있다. 트랜스진 복합체는 처녀 식물 게놈으로 유도될 수 있고 식물은 트랜스진 복합체를 위한 반접합체인 것이 선택될 수 있다. 반접합체 식물에 의해 생성된 꽃가루는 자살유전자와의 물리적 연관 때문에 트랜스제닉 복합체가 결여될 것이다. 트랜스진 복합체를 함유하는 꽃가루가 생성되지 않기 때문에 트랜스진 복합체에 의해 인코딩되는 이종 형질의 과도한 확산은 방지된다.
본 발명의 두 번째 양상은 GST 좌위가 결여된 배우자가 성장할 수 있기 때문에 GST를 자손 세포에서 분산된 전위의 선택적인 증가를 생성하는 트랜스포손과 가까운 부위에 놓는 것이다. 성장할 수 있는 배우자로부터 생성된 자손 세포 부분의 전위가 일어날 수 있기 때문에, 트랜스포손이 더 이상 GST(GST는 GST 유전자 좌위를 유전하는 배우자를 파괴한다)에 연관될 필요가 없으므로 분산된 전위의 선택적인 증가가 이루어진다.
본 발명은 트랜스제닉 복합체의 제거와 비연관된 전위를 선택하는데 사용될 수 있는 유전 방식을 제공한다. GST를 어떤 트랜스진과 함께 사용함으로써, GST 및 연합된 트랜스진 모두의 웅성(또는 자성 배우체-특정 프로모터:자살 구조의 경우의 자성)유전을 완벽하게 제거할 수 있다(도 2).
본 발명은 자살 유전자와 작동하도록 연관된 웅성 배우자 또는 자성 배우자-특정 프로모터를 구성하는 핵산구조를 제공하는데, 상기 프로모터 및 상기 자살유전자 조합은 대상 유전자와 연관된다. 본 발명은 상기 프로모터가 꽃가루-특정 프로모터 및 밑씨-특정 프로모터로 구성된 그룹으로부터 선택되는 핵산구조를 추가로 제공한다. 본 발명은 상기 자살유전자가 바나제(barnase), 수꽃대종자2(tasselseed2) 및 디프테리아 독소 A 유전자로 구성된 그룹으로부터 선택되는 핵산구조를 추가로 제공한다. 본 발명은 대상 유전자가 제초제 저항성, 항생물질 저항성, 살충제 저항성, 질소고정, 개선된 영양 및 셀룰로오스 성분을 인코딩하고는 핵산으로 구성된 그룹으로부터 선택되는 핵산구조를 제공한다.
본 발명은 바나제, 수꽃대종자2 및 디프테리아 독소 A 유전자로 구성된 그룹으로부터 선택된 자살유전자와 작동하도록 연관된 꽃가루-특이 프로모터 또는 밑씨-특이 프로모터로 이루어진 핵산구조를 제공한다; 상기 프로모터 및 상기 자살유전자 조합은 제초제 저항성, 항생물질 저항성, 살충제 저항성, 질소고정, 개선된 영양 및 셀룰로오스 성분 또는 대상의 다른 작물 형질을 인코딩하는 유전자를 구성하는 그룹으로부터 선택된 대상 형질에 연관된다.
본 발명은 a)웅성 배우자-특정 프로모터가 자살유전자와 작동하도록 연관된산구조를 가진 식물세포를 형질전환(상기 프로모터 및 상기 자살유전자의 조합은 이형 폴리뉴클레오티드와 연관된다.)시키는 단계; 및
b)상기 트랜스제닉 좌위가 결여된 웅성 배우자를 생산하기 위해서 감수분열을 통해 상기 형질전환 식물 세포를 증식시키는 단계를 포함하는 식물에서 트랜스제닉 좌위의 웅성 유전을 감소하거나 제거하는 방법을 제공한다.
본 발명은 a)꽃가루-특이 프로모터가 자살유전자와 작동하도록 연관되고 ⅰ)상기 자살유전자는 바나제, 수꽃대종자2 및 디프테리아 독소 A 유전자로부터 선택되고; ⅱ)상기 프로모터 및 상기 자살유전자 조합은 이형 폴리뉴클레오티드와 연관되고; ⅲ)상기 이형 폴리뉴클레오티드는 제초제 저항성, 항생물질 저항성, 살충제 저항성, 질소고정, 개선된 영양 및 셀룰로오스 성분을 인코딩하는 DNA로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 핵산구조를 가진 식물세포를 형질전환시키는 단계;
b)상기 트랜스제닉 좌위가 결여된 웅성 배우자를 생산하기 위해서 감수분열을 통해 상기 형질전환 식물 세포를 증식시키는 단계를 포함하는 식물에서 트랜스진 좌위의 웅성 유전을 감소하거나 제거하는 방법을 또한 제공한다.
본 발명은 a)자성 배우자-특이 프로모터가 자살유전자와 작동하도록 연관된 핵산구조를 가진 식물세포를 형질전환(상기 프로모터 및 상기 자살유전자 조합은 이형 폴리뉴클레오티드와 연관된다.)시키는 단계;
b)상기 트랜스제닉 좌위가 결여된 자성 배우자를 생산하기 위해서 감수분열을 통해 상기 형질전환 식물 세포를 증식시키는 단계를 포함하는 식물에서 트랜스제닉 좌위의 웅성 유전을 감소하거나 제거하는 방법을 제공한다.
본 발명은 a)밑씨-특이 프로모터가 자살유전자와 작동하도록 연관되고 ⅰ)상기 자살유전자는 바나제, 수꽃대종자2 및 디프테리아 독소 A 유전자로부터 선택되고; ⅱ)상기 프로모터 및 상기 자살유전자 조합은 이형 폴리뉴클레오티드와 연관되고; ⅲ)상기 이형 폴리뉴클레오티드는 제초제 저항성, 항생물질 저항성, 살충제 저항성, 질소고정, 개선된 영양 및 셀룰로오스 성분을 인코딩하는 DNA로 구성되는 그룹으로부터 선택되는 핵산구조를 가진 식물세포를 형질전환시키는 단계;
b)상기 트랜스제닉 좌위가 결여된 자성 배우자를 생산하기 위해서 감수분열을 통해 상기 형질전환 식물 세포를 증식시키는 단계를 포함하는 식물에서 트랜스제닉 좌위의 웅성 유전을 감소하거나 제거하는 방법을 또한 제공한다.
본 발명은 형질전환 식물세포가 핵산구조를 위한 반접합체인 본 발명의 방법에 의해 생산되는 형질전환 식물세포를 제공하는데, 형질전환 식물세포는 핵산구조를 위한 반접합체이다.
본 발명은 자살유전자와 작동하도록 연관된 웅성 배우자 또는 자성 배우자-특이 프로모터로 이루어진 핵산구조를 제공한다. 상기 프로모터 및 상기 자살유전자 조합은 전위유전단위와 연관된다. 본 발명은 하나 또는 그 이상의 유전자전위효소 유전자를 더 포함하는 핵산구조를 제공한다. 본 발명은 하나 또는 그 이상의 대상 유전자를 더 포함하는 핵산구조를 또한 제공한다. 본 발명은 대상 유전자가 전위유전단위와 연합된 핵산구조를 추가로 제공한다.
본 발명은 꽃가루-특이 프로모터 또는 밑씨-특이 프로모터가 바나제, 수꽃대종자2 및 디프테리아 독소 A 유전자로 구성된 그룹으로부터 선택된 자살유전자와 작동하도록 연관된 핵산구조를 제공한다. 상기 프로모터 및 상기 자살유전자 조합은 제초제 저항성, 항생물질 저항성, 살충제 저항성, 질소고정, 개선된 영양 및 셀룰로오스 성분을 인코딩하는 유전자를 구성하는 그룹으로부터 선택된 선택 마커로 이루어진 트랜스포손과 연관된다. 본 발명은 상기 프로모터가 꽃가루-특이 프로모터 및 밑씨-특이 프로모터를 구성하는 그룹으로부터 선택되는 핵산구조를 제공한다. 본 발명은 상기 자살유전자가 바나제, 수꽃대종자2 및 디프테리아 독소 A 유전자를 구성하는 그룹으로부터 선택되는 핵산구조를 제공한다.
본 발명은 a)형질전환 식물세포를 생산하는 상기의 핵산구조중 어느 하나를 갖는 식물세포를 형질전환시키는 단계;
b)분산된 전위가 증가하는 식물세포 자손을 생산하기 위해서 감수분열을 통해 상기 형질전환 식물세포를 증식시키는 단계를 포함하는 식물세포 자손의 개체군에서 분산된 전위를 증가시키는 방법을 제공한다.
본 발명은 분산된 전위가 증가되는 식물세포 자손을 분리하는 추가 단계를 포함하는 방법을 제공한다. 본 발명은 분산된 전위를 포함하는 식물세포 및 식물 특히, 핵산을 위해 반접합체 식물세포 및 식물을 제공한다.
본 발명은 제 1 프로모터가 자살유전자와 작동하도록 연관된 웅성 배우자 또는 자성 배우자-특이 프로모터인 제 1 프로모터로 이루어진 핵산구조를 제공하고 유전자전위효소 및 트랜스포손을 인코딩하는 핵산으로 이루어진 핵산을 더 포함하는 핵산구조를 제공한다. 본 발명은 트랜스포손이 자살 유전자가 아닌 선택 마커와 작동하도록 연관된 제 2 프로모터로 이루어진 핵산구조를 제공한다.
본 발명은 꽃가루-특이 프로모터 또는 밑씨-특이 프로모터가 바나제, 수꽃대종자2 및 디프테이라 독소 A 유전자로 구성된 그룹으로부터 선택된 자살유전자와 작동하도록 연관되는 핵산구조를 제공한다. 상기 프로모터 및 상기 자살유전자 조합은 트랜스로세이즈를 인코딩하는 핵산과 연관된다. 유전자전위효소를 인코딩하는 상기 핵산과 연관된 상기 프로모터 및 상기 자살유전자 조합은 트랜스포손을 더 포함하는 트랜스진 좌위로 이루어진다; 상기 트랜스포손은 제초제 저항성, 항생물질저항성, 살충제 저항성, 질소고정, 개선된 영양 및 셀룰로오스 성분으로 구성된 그룹으로부터 선택된 부분을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열로 이루어진다.본 발명은 프로모터가 꽃가루-특이 프로모터 및 밑씨-특이 프로모터로 구성되는 그룹으로부터 선택되는 핵산구조를 제공한다. 본 발명은 자살유전자가 바나제, 수꽃대종자2 및 디프테리아 독소 A 유전자로 구성된 그룹으로부터 선택되는 핵산구조를 추가로 제공한다. 본 발명은 트랜스포손이 제초제 저항성, 항생물질 저항성, 살충제 저항성, 질소고정, 개선된 영양 및 셀룰로오스 성분으로 구성된 그룹으로부터 선택되는 부분을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열로 이루어진 핵산구조를 제공한다.
본 발명은 a)형질전환 식물세포를 생산하기 위해서 본 발명의 핵산구조를 가진 식물세포를 형질전환 단계;
b)안정하게 분산된 전위가 증가되는 식물세포 자손을 생산하기 위해서 감수분열을 통해 상기 형질전환 식물세포를 증식시키는 단계를 포함하는 식물세포 자손의 개체에서 안정하게 분산된 전위를 증가시키는 방법을 제공한다.
본 발명은 안정하게 분산된 전위가 증가하는 식물세포로 자손을 분리하는 단계를 더 포함하는 방법을 제공한다. 본 발명은 상기 방법에 의해 분리된 식물세포 및 식물세포에서 생산되는 식물을 제공하는 방법을 제공한다.
본 발명은 본 발명의 벡터로 이루어진 숙주세포, 재조합 식물세포 및 유전자 형질전환 식물 뿐만 아니라 본 발명의 핵산구조로 이루어진 벡터를 제공한다. 특히, 본 발명은 핵산구조를 위한 반접합체인 세포 및 트랜스제닉 식물을 제공한다.
본 발명의 다른 목적, 장점 및 특징은 제공된 명세서 및 도면을 참고하면 당해 기술분야의 당업자에게 명확할 것이다.
다르게 정의하지 않으면, 여기서 사용된 모든 기술 및 과학 용어는 본 발명이 속하는 기술분야의 당업자가 통상 이해하는 것과 동일한 의미를 갖는다. 본 발명과 유사 또는 동일한 어떤 방법 및 물질이 본 발명의 실시 또는 실험에서 사용될 수 있으나 바람직한 방법 및 물질을 기술한다.
본 발명의 도구와 방법은 배우자를 생산하는 모든 식물에 대해 활용할 수 있다는 것을 상기로부터 알 수 있을 것이다. 이런 식물은 사료용 풀, 잔디용 풀, 사료용 콩, 채소, 논작물, 나무 및 관상식물을 포함하나 이에 제한되지 않는다.
정의
본 발명에서 사용되는 용어인 "대립유전자(allele)"는 여러개의 다른 유전자 형태를 의미한다.
본 발명에서 사용되는 용어인 "작물"은 종자생산, 건초생산, 관상용, 과일생산, 딸기생산, 채소생산, 기름생산, 단백질 생산, 사료생산, 동물사료, 골프코스, 잔디, 꽃재배, 조경, 풍식제어, 유기비료, 토양 상태/건강 개선, 약제품/약, 식품 첨가제, 흡연제품, 펄프생산 및 목재생산의 목적을 포함하나 이에 제한되지 않는 어떤 상업적 목적을 위해 재배되는 어떤 식물을 의미한다.
본 발명에서 사용되는 용어인 "이종교배수분" 또는 "이종교배"는 한 식물의 꽃의 꽃씨가 다른 식물의 꽃의 밑씨(암술머리)에 수정(인공적 또는 자연적으로)되는 과정을 의미한다.
본 발명에서 사용되는 용어인 "재배품종"은 원예학 또는 농경 기술에 의해생산되어오고 야생 개체에서는 일반적으로 발견되는 않는 식물의 변종, 계통 또는 품종을 의미한다.
용어 "분산된 전위"는 트랜스포손이 이동하여 트랜스포손 개시부위(도너 부위)에 더이상 연관(즉, 가까운 거리)되지않게 되는 것을 의미한다.
용어 "자성식물"은 밑씨를 생산하는 식물을 의미한다. 일반적으로, 자성 식물은 수정후에 종자를 생산한다. "자성 식물"로 지정된 식물은 웅성 및 자성 성 기관을 모두를 포함할 수 있다. 또한 "자성 식물"은 자연적으로(예를 들어, 자웅이주종)또는 제웅(예를 들어, 수꽃대 제거에 의함)에 의해서 자성 성 기관만을 포함할 수 있다.
본 발명에서 사용된 용어인 "잡종세대"는 특정 모체세대를 닮은 세포, 조직 또는 유기체의 세대들 중 어떤 것을 의미한다. 모체의 교배에 의한 세대는 잡종 제1세대(F1 또는 F1)인데 F1 개체의 교배에 의한 것은 잡종 제2세대(F2 또는 F2)이다.
용어 "배우자"는 유사한 기원 그러나 접합체를 형성하는 반대 성의 다른 배우자를 가진 핵(주로 세포질)조직을 가진 재생산 세포를 의미하는데, 이 세포는 새로운 개체로 성장하는 능력을 갖고 있다. 배우자는 반수체이며 웅성 및 자성으로 분화된다.
용어 "유전자"는 생물학적 작용과 관련된 DNA의 어느 절편을 의미한다. 그러므로, 유전자는 그들의 발현에 필요한 암호 서열 및/또는 조절 서열을 포함하나 이에 한정되지 않는다. 유전자는 예를 들어, 다른 단백질의 인식 서열을 형성하는 비발현 DNA 절편을 포함할 수 있다. 유전자는 대상 기원으로부터의 복제 또는 공지된 또는 예상된 서열정보로부터의 합성을 포함하는 다양한 공급원으로부터 얻을 수 있고 원하는 매개변수를 갖도록 설계된 서열을 포함할 수 있다.
본 발명에서 사용되는 용어인 "유전자형"은 개체세포, 세포배양, 조직, 식물 또는 식물군의 유전적 구성을 의미한다.
본 발명에서 사용되는 용어인 "반접합체"는 유전자가 반수체 세포 또는 유기체의 유전자, 이형배우자적 성의 성-연관 유전자 또는 이배체 세포 또는 그 대상 절편이 제거된 유기체의 염색체 절편의 유전자로 유전자형 안에 오직 한 번 존재하는 세포, 조직 및 유기체를 의미한다.
"이형 폴리뉴클레오티드" 또는 "이형 핵산" 또는 외인성 DNA 절편은 폴리뉴클레오티드, 핵산 또는 특정 숙주세포에 대한 외부공급원으로부터 기원한 DNA 절편 을 의미하는데, 만일 동일한 기원으로부터이면 DNA 절편은 그 원래형태로부터 형질전환된다. 그래서, 숙주세포의 이형 유전자는 특정 숙주세포에 내인성인 유전자를 포함하지만 형질전환된다. 그러므로 이형 유전자는 DNA 절편은 세포에 대해 이질 또는 이형 또는 동형, 그러나, 인자가 통상 발견되지 않는 숙주세포 핵산 안에 부위하는 DNA 절편을 의미한다. 외인성 DNA 절편은 외인성 폴리펩티드를 생산하도록 발현된다.
"이형 형질"은 형질전환 숙주세포 또는 외인성 DNA 절편, 이형 폴리뉴클레오티드 또는 이형 핵산에 의한 트랜스제닉 유기체에 부여된 유전자형을 의미한다.
본 발명에서 사용되는 용어인 "이형접합자"는 적어도 하나의 좌위에서 다른 대립유전자(주어진 유전자의 형태)를 갖는 이배체 또는 반수체 개체세포 또는 식물을 의미한다.
본 발명에서 사용되는 용어인 "이형접합"은 특정 유전자 좌위에서 다른 대립유전자의 존재를 의미한다.
본 발명에서 사용되는 용어인 "동형접합자"는 하나 또는 그 이상의 좌위에서 동일한 대립유전자를 갖는 개체세포 또는 식물을 의미한다.
본 발명에서 사용되는 용어인 "동형접합"은 동형 염색체 절편의 하나 또는 그 이상의 좌위에서의 동일한 대립유전자의 존재를 의미한다.
본 발명에서 사용되는 용어인 "잡종"은 하나 또는 그 이상의 유전자에서 다른 모체의 교배에 의한 어떤 개체 세포, 조직 또는 식물을 의미한다.
본 발명에서 사용되는 용어인 "근친의" 또는 "근친계통"은 상대적으로 순수한 종 계통을 의미한다.
본 발명에서 사용되는 "계통"은 조직배양 기술 또는 공통모체로부터 유전되었기 때문에 유전적으로 유사한 근친 식물계를 통해 단일 모체 식물로부터 무성적으로 증식되는 식물군을 넓게 포함하나 이에 한정되지 않는다. 만일(a)식물이 그 계통의 물질로부터 재생산된 식물 주 형질전환식물(T0)이고;(b)그 계의 T0 식물로 이루어진 혈통을 갖고;(c)공통 조상(예를 들어, 근친교배 또는 자가교배)에 의해 유전적으로 매우 유사하다면 특정 계통에 속한다고 한다. 상기에서, 용어 "혈통"은 예를 들어, 교배의 면에서 식물의 연관을 의미함으로 이형(반접합체)또는 동형조건의 유전자 또는 그 조합은 식물에 원하는 형질을 부여한다.
본 발명에서 사용되는 용어인 "좌위"는 유전적으로 정의되는 어떤 부위를 의미한다. 좌위는 유전자 또는 유전자의 부분 또는 제어역할을 가진 DNA 서열일 수 있고 다른 서열이 차지할 수 있다.
용어 "웅성식물"은 꽃가루를 생산하는 식물을 의미한다. 일반적으로 "웅성 식물"은 수정난에 대한 배우자를 생산하는 성을 의미한다. 웅성 식물로 지정된 식물은 웅성 및 자성 성 기관을 모두 포함할 수 있다. 또한, "웅성 식물"은 자연적으로나(예를 들어, 자웅이주종형태로)또는 제웅(예를 들어, 씨방제거에 의함)에 의한 웅성의 성 기관만을 포함할 수 있다.
본 발명에서 사용되는 용어인 "집단선택"은 개체식물이 선택되고 종자의 집합으로부터 증식되는 다음세대의 선택형태를 의미한다.
본 발명에서 사용되는 용어인 "핵산" 또는 "폴리뉴클레오티드"는 디옥시리보뉴클레오티드 또는 리보뉴클레오티드 및 단일 또는 이중 가닥형태의 중합체를 의미한다. 특정하게 한정하지 않는 한, 상기 용어는 참조 핵산과 유사한 결합특성을 갖는 자연 뉴클레오티드 및 자연적으로 발생하는 뉴클레오티드와 유사한 방법으로 대사되는 자연 뉴클레오티드의 공지된 유사체를 포함하는 핵산을 포함한다. 다르게 정의하지 않는다면, 특정 핵산 서열은 명시적으로 알려진 서열 뿐만 아니라 보존적으로 형질전환된 형질전환체(예를 들어, 퇴화된 코돈 치환체) 및 상보적 서열을 내포한다. 구체적으로, 퇴화된 코돈 치환체는 하나 또는 그 이상의 선택된(또는 모든)코돈의 세번째 부위가 혼합된-염기 및/또는 디옥시노신(deoxysinosine)잔여물(Batzer 등(1991) Nucletic Acid Res. 19:5081;Rossolini 등.(1994)Mol.Cell.Probes8:91-98)과 치환되는 코돈의 세번째 부위의 서열을 생성함으로써 얻어질 수 있다. 핵산은 유전자, cDNA 및 유전자에 의해 인코딩된 mRNA와 교환되어 사용된다.
본 발명에서 사용되는 DNA 절편은 다른 DNA 절편과 기능적인 관계로 위치할때 "작동하도록 연관"되는 것을 의미한다. 예를 들어, 신호 서열용 DNA는 폴리펩티드의 분비에 관여하는 전단백질으로 표현된다면, 폴리펩티드를 암호하하는 DNA와 작동하도록 연관된다; 프로모터 또는 인핸서가 서열의 전사를 자극한다면, 코돈 서열과 작동하도록 연관된다. 일반적으로, 작동하도록 연관된 DNA 서열은 연속적인데신호 서열의 경우에는 연속적이고 판독가능한 상태이다. 그러나, 인핸서는 이것이 제어하는 전사의 암호서열과 근접할 필요가 없다. 연관은 편한 제한 부위 또는 수용체 또는 대체하여 삽입된 연관자의 결합에 의해 완성된다.
본 발명에서 사용되는 용어인 "개방 수분"은 어떤 유전자 흐름에 자유롭게 노출된 식물개체군을 의미하는데 이와 반대로 폐쇄 수분은 유전자 흐름에 효과적인 장벽이다.
본 발명에서 사용되는 용어인 "개방-수분 개체군" 또는 "개방-수분 형질전환체"는 기준에 의해 선택된 어떤 교차수분 능력을 갖는 식물을 의미하는데 이 식물은 변이를 보이나 개체군 또는 형질전환체가 서로 분화될 수 있는 하나 또는 그 이상의 유전형적 또는 표현형적 특성을 갖는다. 교차수분에 장벽이 없는 잡종은 개방-수분 개체군 또는 개방-수분 형질전환체이다.
본 발명에서 사용되는 용어인 "밑씨"는 자성 배우체를 의미하고 "꽃가루"는 웅성 배우체를 의미한다.
본 발명에서 사용되는 용어인 "밑씨-특이 프로모터"는 밑씨 형성 및/또는 작용 및/또는 식물의 밑씨 형성 기간의 핵산 서열의 발현을 한정하는데 필수적인 식물의 세포 또는 조직에서 핵산 서열의 발현을 선택적으로 제어하는 핵산 서열을 넓게 의미한다.
본 발명에서 사용되는 용어인 "꽃가루-특이 프로모터"는 꽃가루 형성 및/또는 작용 및/또는 식물의 꽃가루 형성 기간의 핵산 서열의 발현을 한정하는데 필수적인 식물의 세포 또는 조직에서 핵산 서열의 발현을 선택적으로 제어하는 핵산 서열을 넓게 의미한다.
본 발명에서 사용되는 용어인 "표현형"은 개체세포, 세포배양, 식물 또는 개체의 유전 구성(즉, 유전자형)및 환경 사이의 상호작용으로부터 기인한 식물군의 관찰할 수 있는 특성을 의미한다.
본 발명에서 사용되는 용어인 "식물"은 전체 식물, 식물 기관(예를 들어, 잎,줄기,뿌리등), 종자, 식물세포 및 그 자손을 의미한다. 본 발명의 방법에 사용될 수 있는 식물강은 일반적으로 형질전환기술에 적응하는 외떡잎 및 쌍떡잎 식물을 포함하는 고식물강 만큼 폭넓다.
본 발명에서 사용되는 용어인 "프로모터"는 전사를 개시하는 RNA 폴리머라제를 결합하는데 관여하는 DNA 부분을 의미한다.
본 발명에서 사용되는 용어인 "재조합체"는 세포, 조직 또는 재조합체 DNA와형질전환되는 유기체를 의미한다. 최초의 재조합체는 R0 또는 R0로 지정된다.
본 발명에서 사용되는 용어인 "자가-비화합"은 교배 또는 수분에 이은 수분을 이루는 웅성 및 자성 배우체의 실패를 의미하고 각 배우체는 유사한 교배 또는수분 후에 품종군의 다른 배우체와 결합하는 능력을 갖는다(Mather,J.Genet. 25:215-235(1943)).
본 발명에서 사용되는 용어인 "자가 수분된" 또는 "자가 수분"은 동일한 식물의 동일한 또는 다른 꽃의 밑씨(암술머리)에 수분되는(인공적 또는 자연적으로)한 식물의 꽃의 꽃가루를 의미한다.
본 발명에서 사용되는 용어인 "안정하게 분산된 전위"는 제 2 전위와 같은 추가의 전위가 진행되지 않는 분산된 전위를 의미한다.
본 발명에서 사용되는 용어인 "자살 유전자"는 자살 유전자를 표현하는 세포에 치명적인 생성물을 발현하는 어떤 유전자를 의미한다.
본 발명에서 사용되는 용어인 "합성품"은 클론 또는 종자-증식 계통의 특이 세트의 잡종간교배에 의해서 유도되는 자손의 집단을 의미한다. 합성품은 교차, 자가 및 자매세포 수분에 기인한 종자의 혼합물을 포함한다.
본 발명에서 사용되는 용어인 "형질전환"은 핵산(즉 뉴클레오티드 중합체)의 세포 속으로의 전이를 의미한다. 본 발명에서 사용되는 용어인 "유전형질전환"은 DNA, 특히, 재조합체 DNA의 세포속으로의 전이 및 구현을 의미한다.
본 발명에서 사용되는 용어인 "형질전환체"는 형질전환이 일어난 세포, 조직또는 유기체를 의미한다. 최초의 형질전환체는 T0 또는 T0로 지정된다. 자가T0는 T1 또는 T1으로 지정되는 첫 번째 형질전환 세대를 생산한다.
본 발명에서 사용되는 용어인 "트랜스진"은 핵산이 기능하도록 유기체, 숙주세포 또는 벡터 안에 삽입되는 것을 의미한다.
본 발명에서 사용되는 용어인 "트랜스제닉"은 다양한 형질전환 방법의 하나에 의한 외부 및 형질전환 유전자를 받는 세포, 세포배양, 유기체, 식물 및 식물의 자손을 의미하는데, 외부 또는 형질전환 유전자는 외부 또는 형질전환 유전자를 받는 동일한 또는 다른 식물 또는 유기체로부터 얻는다.
본 발명에서 사용되는 용어인 "유전자전위효소"는 효소 또는 보다 일반적으로, 전위를 촉매하는 분자 또는 분자들을 의미한다.
본 발명에서 사용되는 용어인 "전위"는 도너 부위에서 대상 부위로의 트랜스포손의 이동을 의미한다.
본 발명에서 사용되는 용어인 "트랜스포손"은 유전 인자, 하나의 염색체 부위에서 다른 곳으로 이동할 수 있는 DNA 또는 RNA의 절편을 포함하지만 이에 한정되지 않는다.
본 발명에서 사용되는 용어인 "변종"은 개체의 유사한 배열로부터의 형태 또는 기능에서 구별되는 종들에서 개체군으로 구성되는 종의 아군을 의미한다.
본 발명에서 사용되는 용어인 "벡터"는 외인성 핵산을 인코딩하는 어떤 플라스미드 또는 바이러스를 넓게 의미한다. 상기 용어는 예를 들어, 폴리리신 화합물등과 같은 바이러스 또는 세포의 전이를 일으키는 비-플라스미드 및 비-바이러스 화합물을 포함하는 것으로 해석된다. 벡터는 핵산 또는 세포에 대한 돌연변이의 운반용 도구로 적당한 바이러스 벡터일 수 있고 동일한 목적에 적당한 비-바이러스 벡터가 될 수 있다. 세포 및 조직에 대한 DNA 운반용 바이러스 및 비 바이러스 벡터의 예는 당해기술분야에서 공지되었고 Ma 등에 기술되어 있다(1997,Proc. Natl.Acad.Sci.U.S.A. 94:12744-12746). 바이러스 벡터의 예는 재조합 우두 바이러스, 재조합 아데노바이러스, 재조합 리트로바이러스, 재조합 아데노-관련 바이러스, 재조합 조류 수두 바이러스 등을 포함하나 이에 제한되지 않는다(Cranage 등., 1986, EMBO J.5:3057-3063; 국제출원번호.WO94/23744, 1994,10,27일 발행). 비-바이러스 벡터의 예는 리포솜, DNA의 폴리아민 유도체 등을 포함하나 이에 제한되지 않는다.
트랜스제닉(대상 유전자)의 유전을 제거하기 위한 목적의 웅성 또는 자성 배우체(소포자 또는 대포자)의 파괴에 대한 구조와 방법이 기술되어 있다. 한 실시예에서, 소포자 파괴는 적당한 자살 유전자에 융합되는 꽃가루-특이 프로모터를 사용하거나 한쪽 성을 통해 유전되지 못하는 유전적 돌연변이의 사용하여 유전적으로 조작된다.
반접합체일 때, 트랜스진 좌위의 유전의 제거는 웅성 또는 자성-특이 프로모터의 제어하에서 대상 유전자를 자살 유전자와 연관시킴으로 이루어진다. 배우체 자살 형질(GST)라 불리는 이 구조는 소포자 또는 대포자에 한정되는 세포의 사망을 유도하는데 이를 통해 GST와 연관되어 있는 대상 유전자의 유전을 효과적으로 감소하거나 제거한다. GST/트랜스진 구조가 반접합체이기 때문에, 화분립의 50%는 성장할 것이고 비-트랜스제닉적일 것이다. 그래서, 수분을 성취하고 궁극적으로 재배용 또는 식용의 종자를 얻기 위해서 수분되는 동안 트랜스진의 유전은 제어될 수 있다. 많은 식물이 과잉의 꽃가루를 생산하기 때문에, 생산된 꽃가루의 50%가 손실되어도 모든 식물 종에 대한 종자세트에 악영향을 미치지 않을 것이다. 한 예로서, 옥수수(Zea mays)는 7일의 개화기의 최대점에서 107꽃가루 양과/일 만큼을 생산한다.(Coe 등., The Genetics of Corn,In:Corn and Corn Improvment. Third Edition. Editors:Sprague 등.,(1998)pp. 81-258).
트랜스진 좌위의 웅성 유전의 제거는 분산된 및/또는 안정한 전위를 증가시키는 새로운 전략으로 사용될 수 있다. 이 제거는 배우체 자살 유전자(GST)와 함께전이 인자 및/또는 유전자전위효소 유전자를 포함하는 트랜스진 복합체를 조작함으로써 달성된다. GST는 염색체 및 트랜스포손(도너 인자)및/또는 트랜스진 복합체 안의 트랜스포손 유전자를 포함하는 다른 트랜스제닉 근처의 웅성 유전을 심하게 감소시키는 소포체에 한정되는 세포 사망을 유도한다.
트랜스진 복합체가 웅성 모체에서 이형접합일 때, 약 50%의 소포자는 파괴될 것이고 이를 통해, 트랜스제닉 복합체의 웅성 유전을 방지하고 연관된 전이 인자의 웅성 유전을 상당히 감소시킨다. 트랜스포손 도너부위 및 근처 전위의 제거는 연관되지 않은 전위 및 도너 트랜스진 복합체와 재조합되는 전위유전단위를 포함하는 꽃가루를 증가시키는 최종효과를 갖는다.
잔존하는 전위는 전위유전단위 내의 제초제 선택 마커를 포함함으로써 자손에서 쉽게 선택될 수 있다. GST는 유전자전위효소의 공급원을 포함하는 배우자를 제거하는 유전자전위효소 공급원에 물리적으로 연관될 수 있다. 이 배열은 유전자전위효소 공급원의 배우자로의 유전을 방지할 수 있고 이를 통해 후손 세대 에서의삽입을 안정화한다.
자살 유전자 또는 돌연변이, 유전자전위효소 공급원 및 트랜스포손의 모든 3개의 구성성분은 분산되고, 안정한 전위를 생성하는 강력한 방법을 제공하는 단위로 조작될 수 있다. 소포자 파괴에 대한 대안적 전략은 트랜스진 복합체의 자성 유전을 제거하는 대포자 자살 형질을 사용하는 밑씨 반-불임성을 조작하는 것이다.
Ⅰ. 핵산
A.프로모터
식물의 꽃가루-특이 발현을 유도하는 적당한 프로모터의 우수한 예가 있다. 꽃가루-특이 프로모터는 옥수수, 토마토, 담배, 애기장대, 양배추류 및 다른 것과 같은 많은 식물종에서 발견되어오고 있다.(Odell,T.O.등.(1985)Nature313:810-812;Marrs,K.A.,등,(1993)Dev Genet,Vol.14/1;27-41;Kim,(1992)Transgenic Res,Vol.1/4:188-94;Carpenter,J.L.,등.(1992)Plant Cell Vol.11/1:157-66;Hamilton,D.A.등.,(1992),Plant Mol Biol,Vol.18/2:211-18; Kyozuka, J., 등.(1991),Mol.Gen Genet.,Vol.228/1-2:40-8;Albani,D.등(1991)Plant Mol Biol Vol.16/4:501-13;Twell,D.등(1991)Genes Dev.5/3:496-507;Thorsness,M.K.등(1991)Dev.Biol Vol.143/1:173-84;McCormick,S.등(1991)Symp Soc Exp Biol Vol.45:229-44;Guerrero,F.D.등(1990)Mol Gen Genet Vol 224/2:161-8;Twell,D 등(1990)Develpoment Vol.109/3:705-13;Bichler,J.등.(1990),Eur J Biochem Vol.190/2:415-26; van Tunen,등.(1990),Plant Cell Vol2/5:393-401;Siebertz,B.등.,(1989)Plant Cell Vol 1/10:961-8;Sullivan,T.D.등,(1989)Dev Genet Vol 10/6:412-24;Chen,J.등.(1987),Genetics Vol 116/3:467-77). 꽃가루 특이-프로모터의 여러 다른 예는 GenBank에서 발견할 수 있다. 추가의 프로모터는 미국특허번호. 5,086,169;5,756,324; 5,633,438;5,412,085;5,545,546 및 6,172,279에 나와있다.
본 발명에서 사용하기에 적당한 여러 다른 진핵생물의 성-특이 프로모터가 있다. 그 예는 쥐 정모세포-특이 Pgk-2 프로모터(Ando 등.(2000)Biochem.Biophys.Res.Comm.272/1:125-8);PACAP정소-특이 프로모터(Daniel 등.(2000)내분비학, 141/3:1218-27); 쥐 mSP-10 정세포-특이 프로모터(Reddi 등.(1999)Biology of Reproduction,61/5:1256-66); 쥐 정자-특이 프로모터(Ramara 등.(1998)J.Clin.Invest.102/2:371-8); 생쥐 및 쥐 H1t 프로모터(van Wert 등.(1996)J.Cell.Biochem.60/3:348-62);인간 PRM1,PRM2 및 TNP2 정세포-특이 프로모터(Nelson 등.(1995)DNA 서열5/6:329-37); 초파리 성-특이 프로모터(Crowley 등(1995)Dev.Genet.16/2:210-9); 쥐 GHRH 정자형성-특이 프로모터(Srivastava 등.(1995)내분비학136/4:1502-8);초파리 정소-특이 hst70 유전자 프로모터(Lankernau 등.(1994)Mol.Cell.Biol.14/3:1764-75); 정모세포-특이 hst70 유전자 프로모터(Widlak 등.(1994)Acta Biochim.Polonica 41/2:103-5); 및 쥐 Prm-1 정세포-특이 프로모터(Zambrowicz 등.(1993)Proc.Nat'l.Acad.Sci USA 90/11:5071-5).
본 발명을 위해서, 동형 염색체가 다른 세포로 분리되었을 때 만일 프로모터가 한 성(웅성 또는 자성)에 특이적이고 후기-제 1 감수분열의 유전자 발현을 특이적으로 유도한다면 어떤 프로모터도 적당할 것이다. 예를 들어, 제 2 감수분열의 4분 염색체 단계의 유전자 발현에서, 꽃가루 성숙을 이끄는 소포자의 유사분열후 부문, 성숙한 화분립 또는 싹이 튼 화분립이 본 발명에 적당할 것이다.
B. 자살 유전자
배우체 자살 유전자(GST)의 한 양상은 원하지 않는 감수분열 생산물을 죽이는 자살 유전자의 지시된 발현이다. 유전자의 발현이 세포 사망에 기인하는 예는 바나제(Custers,J.B.,등(1997)Plant Mol Biol Vol.35/6:689-99;Yazynin,S., 등,(1999)FEBS Lett Vol.452/3:351-4; Goldman,M.H,등.,(1994)Embo J Vol.13/13:2976-84, 1994), 수꽃대종자2(DeLong,A,등.,(1993)Cell Vol. 74/4:757-768) 및 디프테리아 독소 A 유전자(Day, C.D.,등.,(1995)Development Vol.121/9:2887-95)와 같은 문헌에 기술되고 있으나 이에 한정되는 것은 아니다. 자살 유전자 발현이 후기-제 1 감수분열에 한정되기 때문에, 트랜스진이 반접합체 및 통상 감수분열에서 분리될 때, 배우자의 50%만이 제거될 것이다. 성장할 수 있는 배우자는 자살 유전자를 유전받지 않을 것이다.
본 발명의 다른 양상에 따라, 반-불임은 꽃가루 또는 난자의 성장에 필수적인 유전자 또는 유전자들의 발현을 저해하는 안티센스 RNA 기술을 사용하여 성취될 수 있다. 이 기술은 하기에서 더 상세히 논의된다.
또한, 꽃가루 유전이 아닌 결실과 같이 한쪽 성을 통해서는 유전이 불가능한돌연변이 또한 반-불임을 성취하는데 사용될 수 있다.
자살 유전자의 특정예는 하기를 포함하지만 이에 제한되지 않는다:
수꽃대종자2( ts2 ).유전 및 분자 증거는ts2는 수꽃대 및 작은이삭의 암수꽃대제거가 필요하다는 것을 보여준다. 암술세포 안의ts2발현은 핵 보존성 및 세포 사망의 손실과 일치한다.ts2유전자 산물이 세포 사망 경로에서 어떻게 기능하는지 명확하지 않다. 짧은-고리 알콜 탈수소효소 특히, 수소스테로이드 탈수소효소의 유사성을 기초로할 때, 두가지 가능성이 만들어진다.ts2산물이 세포성장에 필요한 기질, 혹은 스테로이드를 대사시킬 수 있다. 또한, TS2작용은 세포 사망 반응을 활성화시키는 신호분자의 생성에 기인할 수 있다.(Calderon-Urrea 등.(1999)Development,126:435).
디프테리아 독소 A-사슬(DTA).디프테리아 독소 A-사슬(DTA)는 단백질 합성을 억제한다(Greenfield 등,Proc.Natl.,Sci.:USA,80:6853(1893);Palmeter 등,Cell,50:435(1987).
펙타아제 분해효소 pelE.Erwinia chrysanthemi EC16의 펙타아제 분해효소 pelE는 펙틴을 감소시키고 세포 분해를 일으킨다(Keen 등,J.Bacteriology,168:595(1986).
T-urf13(TURF-13).cms-T 옥수수 미토콘드리아 게놈의 T-urf13(TURF-13);
이 유전자는 미토콘드리아 또는 플라스마 막을 붕괴시키는 URF13을 지정하는 폴리펩티드를 인코딩한다(Braun 등, Plant Cell,2:153(1990);Deway 등,Proc.Natl.Acad.Sci.:USA,84:5374(1987);Deway 등,Cell,44:439(1986).
은행나무 재조합효소.파지 Mu 유전자의 은행나무 재조합효소는 게놈 재배열 및 식물세포가 발현되었을 때 세포성장의 손실을 일으키는 부위-특이 DNA 재조합효소를 인코딩한다(Maeser 등,Mol Gen. Genet.,230:170-176(1991).
인돌 아세트산-리신 합성효소(iaaL).슈도모나스 주입기의 인돌 아세트산-리신 합성효소는 리신을 인돌아세트산(IAA)에 접합시키는 효소를 인코딩한다. 식물세포에서 발현되었을 때, 이 합성효소는 접합을 통해 세포로부터 IAA를 제거함으로써 형질전환 성장을 일으킨다(Roamno 등, Genes and Development,5:438-446(1991);Spena 등.,Mol.Gen;Genet.,227:205-212(1991);Roberto등,Proc.Natl.Acad.Sci.:USA,87:5795-5801).
바나제(Barnase). Bacillus amyloliquefaciens의 리보핵산가수분해효소(또한 바나제로 알려짐)는 세포속에서 발현되었을 때 세포의 mRNA를 분해하고 세포의 사망을 이끈다(Mariani 등.,Nature 347:737-741(1990);Mariani 등.,Nature 357:384-387(1992).
CytA 독소 유전자.Bacillus thuringiensis israeliensis의 CytA 독소 유전자는 모기살충성 및 용혈성인 단백질을 인코딩한다. 식물세포에서 발현되었을 때, 이 유전자는 세포막을 붕괴시켜 세포의 사망을 일으킨다(McLean등,J.세균학,169:1017-1023(1987);Ellar 등.,U.S.Pat.No.4,918,006(1990).
다른 진핵생물에서 자살 유전자로 사용되는 적당한 세포 사망 유전자는 인간PDCD9(세포사망9를 프로그램했음) 및Gallus galluspro-apoptotic protein p52(Carim 등.(1999)Cytogenetics and Cell Genetics(스위스)87/1-2:85-8);세포 사망 유전자 CED-3 및 EGL-1를 프로그램한 the C,elegans(Hengartner 등.(1999)54:213-22);C, elegnasCED-3의 포유류 동족체를 인코딩하는 유전자:ICE(상호백혈구-1베타-전환 효소)(Kondo 등 .(1998)Investigative Ophthalmology & Visual Science39/13:2769-74);ICE 같은 단백질분해효소 Ich-1L,CPP32베타,Mch2알파 및 Mch3알파를 인코딩하는 유전자(Kondo 등.(1998)58/5:962-7); 또는 포유류 세포 사망 유전자 Nedd2(Kumar 등.(1997)백혈병 11 Suppl3:385-6).
C.트랜스진 및 이형 핵산
유전자는 하기를 포함하는 재조합 DNA 방법을 사용하여 식물 안에 성공적으로 유도되나 이에 한정되는 것은 아니다. 이 유전자는 다음의 형질을 인코딩한다: 형질전환 7S 콩과 저장 단백질을 포함하는 종자 저장 단백질(미국특허번호. 5,508,468, 5,559,223 및 5,576,203); 제초제 내성 또는 저항성(미국특허번호. 5,498,544 및 5,554,798;Powell 등., Science 232:738-743(1986);Kaniewski 등,Bio/Tech.8:750-754(1990);Day 등,Proc.Natl.Acad.Sci. 미국 88;6721-6725(1991)); 피타제(phytase)(미국특허번호. 5,593,963); 박테리아, 곰팡이, 선충류 및 곤충 페스트에 대한 저항성, Bt 유전자에 의해 부여된 나비목 곤충에 대한저항성을 포함한다(미국특허번호. 5,597,945 및 5,597,946; Hilder 등., Nature 330:160-163;Johson 등, Proc.Natl.Acad.Sci.USA,86;9871-9875(1989);Perlad 등, Bio/Tech.8:939-943(1990)); 렉틴(미국특허번호.5,276,269);및 꽃 색깔(Meyer 등,Nature 330:667-678(1987);Napoli 등,Plant Cell 2:279-289(1990); van der Krol 등, Plant Cell 2:291-299(1990)).
제초제에 저항성을 부여하는 유전자는 특히 중요하다. 그 예는 다음과 같지만 이에 한정되는 것은 아니다.
(ⅰ)복소환식 화합물 또는 술포닐인자와 같은 생장점 또는 분열조직을 억제하는 제초제. 이런 분류의 예시 유전자는 Lee 등., EMBO J.7:1241(1988)및 Miki 등., Theor.Appl.Genet.80:449(1990)에서 기술한 것과 같이 돌연변이 ALS 및 AHAS 효소를 인코딩한다.
(ⅱ)걸포시네이트(gulfosinate)(포스피노트리신 아세틸 트랜스페라제(PAT), 스트렙토미세스 히그로스코피쿠스(Streptomyces hygroscopics) 포스피노트리신 아세틸 트랜스페라제(bar)유전자), 피리디녹시 또는 페녹시 프로프리오닉산 및 시클로헥소논(ACCase 억제-암호 유전자)과 같은 제초제(돌연변이 5-이놀피루블-3-포스피키메이트 합성효소(EPSP)및 aro A 유전자에 의해 저항성을 부여받음)및 다른 포스포노 화합물. 제초제(glyphosate) 저항성을 부여하는 EPSP형태의 핵산 서열을 기술하는 Shah 등의 미국특허번호 4,940,835을 참조하라. 돌연변이 aroA 유전자를 인코딩하는 DNA 분자를 ATCC 승인번호.3956 하에서 얻을 수 있고 돌연변이 유전자의 핵산 서열이 Comai의 미국특허번호. 4,769,061에 기술되어 있다. Kumada 등의 유럽특허출원번호 0333 033 및 Goodman 등의 미국특허번호 4,975,374은 L-포스피노트리신과 같은 제초제에 저항성을 부여하는 글루타민 합성효소 유전자를 기술한다. 포스피노트리신-아세틸-유전효소 유전자의 핵산 서열이 Leemans 등의 유럽출원번호 0 242 246에 제공된다. De Greef 등., Bio/Technology 7:61(1989)은 포스피노트리신 아세틸 유전효소 활동을 인코딩하는 가공할 bar 유전자를 발현하는 트랜스제닉 식물의 생산을 기술한다. 세독시딤(sethoxydim) 및 할록시호프(haloxyfop)와 같은 페녹시 프로프리오닉산 및 시클로헥손에 대한 저항성을 부여하는 유전자의 예는 Marshall 등., Theor. Appl.Genet. 83:435(1992)에 의해 기술되는 Accl-S1, Accl-S2 및 Accl-S3 유전자이다. 옥수수 식물의 포스피노트리신 아세틸 유전효소를 인코딩하는 스트렙토미세스 bar 유전자의 발현은 제초제 포스피노트리신 또는 글루포시네이트에 대한 저항성에 기인한다.(U.S.Pat.No. 5,489,520, 참고문헌에 의해 구현된다.)
어떤 대상 종에 대해서는, 다른 항생제 또는 제초제 선택 마커가 선호될 수 있다. 일반적으로 형질전환되어 사용되는 선택 마커는 카나마이신 및 관련 항상제에 저항성을 부여하는 nptⅡ(Messing & Vierra, Gene 19:259-268(1982);Bevan 등,Nature 304:184-187(1983)), 제초제 포스피노트리신에 대한 저항성을 부여하는 bar 유전자(White 등,Nucl Acids Res 18:1062(1990), Spencer 등.Theor Appl Genet 79:625-631(1990)), 항상제 히그로마인신(hygromycin)에 대한 저항성을 부여하는 hph 유전자(Blochinger & Diggelmann,Mol Cell Biol 4:2929-2931) 및 메토트렉세이트(methotrexate)에 대한 저항성을 부여하는 dhfr 유전자를 포함한다(Bourouis등,EMBO J.2(7):1099-1104(1983)).
트랜스제닉 자주개자리(alfalfa) 식물은 다음을 포함하나 이에 한정되지 않는 자주개자리 및 비-자주개자리 종으로부터 분리된 다른 유전들을 사용하여 생산해오고 있다: 리포터 유전자 gusA에 융합된 초기 노들린(nodulin)유전자의 프로모터(Bauer 등,The Plant Journal 10(1):91-105(1996);초기 노들린 유전자 (Charon 등,Proc.Natl.Acad.of Sci.USA 94(16):8901-8906(1997);Bauer 등,Molecular Plant-Microbe Interactions 10(1):39-49(1997);NADH-독립 글루타민 합성효소(Gantt,The Plant Journal8(3):345-358(1995)); 3개의 레틴 유전자의 각각에 대한 프로모터-gusA 융합(Bauchrowitz 등,The Plant Journal 9(1):31-43(1996)); CaMV 프로모터에 융합된 해조 연 산호Renilla reniforms의 루시페라아제 효소(Mayerhofer 등, The Plant Journal 7(6): 1031-1038(1995));Mn-과산화물 불균등화효소 cDNA(McKersie 등, Plant Journal 111(4):1177-1181(1996)); 배추좀나방 델타-내독소를 인코딩하는 cryIC 유전자(Strizhov 등,Proc.Natl.Acad.Sci.USA93(26):15012-15017(1996));글루칸스(glucanse)(Dixon 등, Gene 179(1):61-71(1996);Masoud 등, Transgenic Reserch 5(5):313-323)); 및 입 노화 유전자(미국특허번호 5,689,042).
유전자는 다음을 포함하나 이에 한정되지 않는 재조합 DNA 기술에 의해 성공적으로 토끼풀속으로 전달된다: Bt 유전자(Voisey 등,supra);네오미신 포스포 유전효소Ⅱ(Quesbenberry 등, supra); 완두콩 렉틴 유전자(Diaz 등,Plant Physiology 109(4):1167-1177(1995);Eijsden 등,Plant Molecular Biology 29(3):413-439(1995));옥신-감응 프로모터 GH3(Larkin 등, Transgenic Research 5(5):325-335(1996); 해바라기의 종자 알부민 유전자(Khan 등, Transgenic Research 5(3):179-185(1996)); 및 Basta®제초제, 네오미신 포스포트랜스페라아제 및 알파-아밀라제 억제제에 대한 저항성을 인코딩하는 효소 포스피노트리신 아세틸 트랜스페라아제, 베타-글루크로디나제(glucuronidase)(GUS)를 인코딩하는 유전자(Khan 등,supra).
대상의 다른 트랜스진은 리그닌 성분, 셀룰로오스 성분, 질소고정, 영양개선, 색, 비타민 성분 및 재조합되어 생성되는 백신을 인코딩하거나 또는 관련된 유전자를 포함하나 이에 한정되지 않는다.
D.부위-특이 재조합 방식
형질전환 방법의 부산물로 발생하는 무작위로 삽입된 DNA 서열의 제거를 가능하게 하면서, DNA 서열을 특정 DNA 좌위로 삽입하기 위한 목표에 대한 방법 및 구조는 미국특허번호 5,527,695 및 6,114,600에 기술되어 있다. 무작위 삽입을 제거하는 한 방법은 부위-특이 재조합 방식을 이용하는 것이다. 일반적으로, 부위-특이 재조합 방식은 DNA 서열(부위-특이 재조합 서열)의 두쌍 및 특이 효소(부위-특이 재조합효소)의 3가지 인자로 이루어진다. 부위-특이 재조합효소는 단지 두 부위-특이 재조합 서열 사이의 재조합 반응에 촉매작용을 미칠 것이다.
박테리오파아지 P1의 Cre/lox 방식, 효모의 FLP/FRT 방식, 파아지Mu의 Gin재조합효소, E.coli의 Pin 재조합효소 및 pSR1 플라스미드의 R/RS 방식과 같은 상이한 많은 부위-특이 재조합효소 방식이 사용될 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다. 두개의 바람직한 부위-특이 재조합효소 방식은 박테리오파아지 P1 Cre/lox 및 효모 FLP/FRT 방식이다. 이런 방식에서 재조합효소(Cre 또는 FLP)는 개재 서열을 형질전환하거나 제거하기 위한 그것의 감응 부위-특이 재조합 서열(각각 lox 또는 FRT)과 특이적으로 반응한다. 이 두가지 방식의 각 서열은 상대적으로 짧다(lox에 대해서는 34bp 및 FRT에 대해서는 47bp). 일반적인 효모의 FLP/FRT 방식은 진핵생물(효모)에서 정상적으로 작용하기 때문에 바람직한 부위-특이 재조합효소 방식이고 특징이 뚜렸하다. FLP/FRT 방식의 진핵생물 기원은 FLP/FRT 방식이 원핵생물 부위-특이 재조합효소 방식 보다 진핵세포에서 더 효과적으로 기능하도록 한다.
FLP/FRT 재조합효소 방식은 식물 세포에서 효과적으로 기능하는 것으로 알려져오고 있다. 옥수수 및 쌀 원형질체에서의 FLP/FRT 방식의 성능에 대한 실험은 FRT 부위 구조 및 존재하는 FLP 단백질의 양을 나타내고 절제작용에 영향을 미친다. 일반적으로, 짧은 불완전 FRT 부위는 완전한 전체길이 FRT 부위보다 절제 생성물이 많이 축적되게 한다. 부위-특이 재조합 방식은 옥수수 원형질체에서 분자내 및 분자간의 반응 모두에 대해 촉매작용을 미치는데, 이것은 이 방식이 융합 반응 뿐만 아니라 DNA 절제용으로 사용될 수 있다는 것을 의미한다. 재조합 반응은 가역적이고 이 가역성은 각 방향에서의 반응의 효율을 조절할 수 있다. 부위-특이 재조합 서열의 구조를 형질전환하는 것은 이 상황을 개선하는 한 방법이다. 부위-특이 재조합 서열은 재조합 반응의 생성물이 역 반응에 대한 기질로서 더 이상 인식되지 않아서 융합 또는 제거 반응을 안정화하는 방식으로 형질전환될 수 있다.
E. 벡터
식물의 외인성 DNA를 발현하는 발현단위
상기와 같이, 본 발명의 여러 실시예는 식물에서 외인성으로 공급된 핵산 서열을 발현하는 발현단위(또는 발현 벡터 또는 방식)를 사용한다. 식물의 사용하는 발현단위/방식/벡터를 생성하는 방법은 당해기술분야에서 잘 공지되어 있고 본 발명에서 사용되도록 쉽게 적용될 수 있다. 당업자는 제공된 설명에 따라 본 방법에서 어떤 적당한 식물/벡터/발현 방식을 쉽게 사용할 수 있다.
단백질의 발현을 제어하는데 사용되는 발현 제어 인자는 일반적으로 암호 서열(동형 발현 인자)와 결합하는 것으로 발견되는 발현 제어 인자 또는 이형 발현 제어 인자일 수 있다. 다양한 동형 및 이형 발현 제어 인자가 당해기술분야에 공지되어 있고 본 발명에서 사용할 발현단위를 만드는데 사용될 수 있다. 예를 들어, 전사 개시 지역은 아그로박테륨 튜마파시안(tumafacians)의 Ti 플라스미드 안에서 발견되는 옥토핀(octopine), 마노핀(manopine), 노팔린(nopaline)등과 같은 오핀 개시 지역의 어떤 것이든 포함할 수 있다. 또한, 식물의 유전자 발현을 제어하는 꽃양배추 모자이크 바이러스 35S 프로모터와 같은 식물 바이러스 프로모터가 사용될 수 있다. 마지막으로, 증식 프로모터, 열매-특이 프로모터, Ap3 프로모터, 열 충격 프로모터, 종자-특이 프로모터 등과 같은 식물 프로모터가 사용될 수 있다. 가장 바람직한 프로모터는 웅성 또는 자성 배우자에서 가장 활동적일 것이다.
배우자-특이 프로모터, 구조성 프로모터(CaMV 또는 Nos 프로모터), 기관-특이 프로모터(토마토의 E8 프로모터)또는 유도성 프로모터는 일반적으로 당해기술분야에서 공지된 표준기술을 사용하여 단백질 또는 안티센스 암호 지역에 연관된다.발현단위는 전수 종결자 및/또는 인핸서 인자와 같은 보충 인자를 사용하여 더욱 최적화될 수 있다.
식물의 발현에 대해서, 발현단위는 일반적으로 단백질 서열, 식물 프로모터 지역, 전사 개시 부위 및 전사 종결서열을 포함할 것이다. 발현단위의 5' 및 3' 말단에서의 독특한 제한효소 부위는 일반적으로 미리존재하는 벡터 속으로 쉽게 삽입되게 하기 위해서 포함된다.
이형 프로모터/구조 유전자 또는 안티센스 조합의 구조에서, 프로모터는 그 자연구조의 전사 개시로부터의 거리에 위치하는 것과 동일하게 이형 전사 개시 부위로부터 바람직하게 위치한다. 그러나, 이 거리는 당해기술분야에서 공지된 대로 단백질 기능의 손실 없이 약간의 형질전환이 가해질 수 있다.
프로모터 서열과 더불어, 발현 용기는 효과적인 종결을 제공하는 구조 유전자의 전사 종결 부위 하류흐름을 포함할 수 있다. 종결 부위는 프로모터 서열과 동일한 유전자로부터 얻을 수 있거나 다른 유전자로부터 얻을 수 있다. 만일 구조 유전자에 의해 인코딩되는 mRNA가 효과적으로 가공된다면, RNA의 폴리아데닐화를 유도하는 DNA 서열은 일반적으로 벡터 구조에 첨가된다. 폴리아데닐화된 서열은 아그로박테륨 옥토핀 합성 신호(Gielen 등, EMBO J 3:835-846(1984))또는 노팔린 합성 신호(Depicker 등, Mol and Appl. Genet. 1:561-573(1982))을 포함하나 이에 한정되지 않는다.
얻어진 발현은 단위는 고식물 형질전환에 적합한 벡터와 결합되거나 벡터에 포함되도록 된다. 벡터는 일반적으로 형질전환 식물세포가 배양조직에서 동정될 수있는 선택마커 유전자를 포함한다. 일반적으로, 마커 유전자는 항상제 저항성을 엔코드할 것이다. 이런 마커는 G418, 히그로마이신(hygromycin), 블레오마이신(bleomycin), 카나마이신(kanamycin)및 젠타마이신(gentamicin)에 대한 저항성을 포함한다. 식물세포를 형질전환한 후에, 벡터를 가진 세포들은 특정 항상제를 포함하는 보존액에서 성장할 수 있는 능력에 의해서 동정될 것이다. 박테리아 또는 바이러스 기원의 복제서열들은 벡터가 박테리아 또는 파지 숙주 안에 클론되게 하는 것을 포함하는데, 바람직하게는 복제의 넓은 숙주 범위 원핵생물 기원이 포함된다. 박테리아용 선택마커는 원하는 구조를 갖는 박테리아 세포를 선택하도록 포함된다. 적당한 원핵생물 선택마커는 암피실린(ampicillin), 카나마이신(kanamycin) 또는 테트라시클린(tetracycline)과 같은 항상제에 대한 저항성을 포함한다.
추가 기능을 엔코딩하는 다른 DNA 서열이 벡터 안에 존재할 수 있다는 것은 당해기술분야에서 공지되어 있다. 예를 들어, 아그로박테륨 형질전환의 경우에, T-DNA 서열은 식물 염색체에 후속전이를 위해서 포함될 수 있다.
본 발명의 서열은 발현된 서열 태그(ETSs), 에피토프 또는 형광 단백질 마커와 같은 다양한 다른 핵산분자에 융합될 수 있다.
ETSs는 유전자 절편인데, 일반적으로 길이에서 300 내지 400 뉴클레오티드, 상보적-DNA(cDNA)클론의 3' 또는 5'말단으로부터 서열화된다. 거의 30,000 애기장대 ETSs가 프랑스 및 미국의 콘소시움에 의해 생산되어오고 있다(Delseny 등,FEBS Lett. 405(2):129-132(1997);애기장대 데이타베이스,http://genome.www.stanford.edu/Arabidopsis). 방대한 EST 데이타베이스로부터 유도된 유전자 발현 패턴의 분석을 논의하기 위해서는 M.R.Fannon, TIBTECH 14:294-298(1996).
생물학적으로 호환되는 형광 단백질 프로브, 특히 해파리Aequorea victoria의 자가-결합 녹색 형광 단백질(GFT)는 살아있는 세포 안에 생화학적인 사건의 실현을 가능하게 하였기 때문에, 세포, 분자 및 발전하는 생물학의 연구에 대변혁을 일으키고 있다.(Murpuy 등, Curr.Biol.7(11):870-876(1997);Grebenok 등, Plant J.11(3):573-586(1997); Pang 등, Plant Physiol.112(3)(1996);Chiu 등, Curr.Biol.6(3):325-330(1996);Plautz 등,Gene173(1):83-87(1996);Sheen 등, Plant J.8(5):777-784(1995)).
부위-지시 돌연변이유발은 가용-형질전환 GFP(smGFP)라고 불리는 코돈-형질전환 GFP의 더욱 안정한 형을 증가시키는데 사용되어오고 있다. smGSP가 애기장대(Arabidopsis)로 도입되었을 때, 코돈-형질전환 GFP와 비교해서 보다 강력한 형광이 관찰되었는데 이것은 smGSP의 더 많은 부분이 가용성이고 기능 형태로 존재하기 때문에 smGSP가 더욱 밝게 빛나는 것을 의미한다(Davis 등,Plant Mol.Biol.36(4):521-528(1998)). GFP 및 베타-글루크로니드효소(GUS)를 인코딩하는 유전자를 융합함으로써, 연구자들은 애기장대를 포함하는 식물의 한시적이고 안정한 발현 방식에서 사용되도록 최적화된 다기능 수용체 구조의 집단을 생성할 수 있었다(Quaedvlieg 등,Plant Mol.Biol.37(4):715-727(1998)).
버러(Berer)등(Dev. Biol.194(2):226-234(1998))은 애기장대 배축 표피세포를 위한 GSP 마커 계통의 분리에 대해 보고한다. GSP-융합 단백질은 geranyl geranyl pyrophosphate(GGPP)를 포함하는 많은 애기장대 유전자를 분산시키고 특성하는데 사용되어오고 있다.(Zhu 등, Plant Mol.Biol.35(3):331-341(1997).
비활성 유전자
효과적인 비활성 형질전환의 예는 판독 프레임시프트를 생산하는 유전자의 초기에 발생하는 단일 뉴클레오티드 결실일 수 있다. 이런 프레임시프트는 유전자를 비활성화시켜 비-발현 유전자를 만들고 이를 통해 그 유전자에 의한 기능성 단백질 생산을 중단시킨다. 예를 들어, 만일 비형질전환 유전자가 프로테아제를 인코딩하면,유전자에 의한 프로테아제의 생산 중단될 수 있고 프로테아제 유전자의 조절 부위 또는 코딩부위는 중단된다.
결실 뉴클레오티드에 의한 비활성 유전자와 더불어 판독 프레임시프트의 발생, 비활성 형질전환은 DNA에 의해 인코딩되는 단백질의 생성을 효과적으로 막는 유전자의 DNA 안의 뉴클레오티드의 삽입, 치환, 역위, 또는 교차형염기전이를 포함하는 다른 기술들에 의해 이루어질 수 있다.
덜 특이적인 방법을 사용함으로써 유전자를 비활성화하는 것은 당해기술분야의 당업자가 할 수 있다. 덜 특이적인 방법의 예는 하이드록시아민 또는 니트로소구나디닌(nitrosoguanidine)과 같은 돌연변이 유도물 또는 감마 방사선 또는 무질서하게 형질전환된 유전자자에 대한 자외 방사선을 사용하는 것일 수 있다. 이런 형질전환 가닥이 우연히 비활성 유전자를 포함하면 어떤 하나 또는 그 이상의 도파민에 대한 기능성 단백질을 생산할 능력을 상실한다. 원하는 비활성 유전자의 존재는 통상적인 검색 기술에 의해 관찰될 수 있다. 더 자세한 것은 미국특허번호 5,759,538을 참조하면 된다.
안티센스 암호 벡터
안티센스의 세대를 포함하는 안티센스 구조를 사용하여 식물의 발현을 억제하는 방법이 미국특허번호 5,107,065; 5,254,800; 5,356,799; 5,728,926 및 6,184,439에 기술되어 있다. 나중 두개의 특허는 "잡종 종자 생산에 대한 꽃가루 제어의 안티센스 유전자 방식"으로 명명된다.
식물의 내인성 유전자의 발현을 억제하는데 사용될 수 있는 방법은 본 방법에서 사용될 수 있다. 예를 들어, 2배 유전자의 필수 부위에서의 3중 나선 형태는 본 목적을 위해 사용된다. 적절한 단일 가닥 참가자의 구조를 허용하는 3중 코드는 당해기술분야에서 공지되어 있다.(H.E.Moser,등, Science 238:645-650(1987)및 M.Cooney, 등, Science 241:456-459(1988)). 퓨린 염기 가닥을 포함하는 조절 유전자의 부위는 특히 주목할 만한 대상이다. 광가교와 더불어 3중 나선 형태는 D.Praseuth, 등, Proc, Nat'l Acad. Sci.USA 85:1,349-1,353(1988)에 기술되어 있다.
Ⅱ. 형질전환
A. 식물 형질전환
일반적인 방법에 의해서 원하는 유전자 또는 유전자의 집단을 유도하는 것은 두 계통 사이의 성적 교배를 요하고 그런 다음, 원하는 특성을 가진 식물을 얻을 때까지 잡종 자손과 모체 한쪽 사이의 역교배를 반복한다. 그러나, 이 과정은 성적으로 잡종될 수 있는 식물에 한정되고 원하는 유전자이외의 유전자가 전이될 것이다.
재조합 DNA 기술은 식물 연구자가 곤충 페스트에 대한 저항성과 같은 원하는 형질에 대한 특이 유전자를 동정하고 클론하고 이런 유전자를 이미 유용한 다양한 식물에 도입하게 하는 식물 유전학을 사용함으로써 이런 한계를 극복할 수 있게 한다. 일단 외부 유전자가 식물 안에 도입되어지면, 이 식물은 대상 유전자를 포함하는 자손을 생산하는 통상적인 식물 육종 계획(예를 들어, 혈통 육종, 단일-종자-혈통 육종 계획, 상호 재발생 선택)에 사용될 수 있다.
유전자는 동형 재조합을 사용하는 부위 유도 형태로 유도될 수 있다. 동형 재조합은 내인성 유전자의 부위-특이 형질전환을 가능하게 하여 유전된 또는 획득된 형질전환이 수정될 수 있고 새로운 형질전환이 게놈 속에 가해질 수 있다.
식물에서의 동형 재조합 및 부위-유도 융합은 미국특허번호 5,451,513; 5,501,967 및 5,527,695에서 논의된다.
B.형질전환 방법
트랜스제닉 식물을 생산하는 방법은 당해기술분야의 기술자에게 잘 공지되어 있다. 트랜스제닉 식물은 전기천공법; 미세분사, 입자 가속 또는 바이오리스틱(biolistic) 충격(바이러스-조정 트랜스제닉 및 아그로박테륨-조정 형질전환)으로도 알려진 미세추진충격을 포함하는 다양한 다른 형질전환 방법에 의해 생산될 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다(미국특허번호 5,405,765; 5,472,869; 5,538,877; 5,538,880; 5,550,318; 5,641,664; 5,736,369 및 5,736369; Waston 등,재조합 DNA, Scientific American Books(1992); Hinchee 등, Bio/Tech. 6:915-922(1988); McCabe 등, Bio/Tech.6:923-926(1988); Toriyama 등,Bio/Tech.6:1072-1074(1988); Fromm 등, Bio/Tech.8:833-839(1990);Mullins 등,Bio/Tech.8:833-839(1990); 및 Raineri 등,Bio/Tech.8:33-38(1990)).
트랜스제닉 자주개자리 식물은 아그로박테륨-조정 트랜스제닉(Wang 등,Australian Journal of Plant Physiology 23(3):265-270(1996);Hoffman 등,Molecular Plant-Microbe Interactions 10(3):307-315(1997);Trieu 등,Plant Cell Report 16:6-11(1996)) 및 입자 가속(미국특허번호 5,324,646)을 포함하는 많은 방법에 의해 생성되어오고 있지만 이에 한정되는 것은 아니다.
형질전환은 아그로박테륨-조정 형질전환(Voisey 등, Biocontrol Sceince and Technlogy 4(4):475-481(1994);Quesbenberry 등, Crop Science 36(4):1045-1048(1996); Khan 등, Plant Physiology 105(1):81-88(1994); Voisey 등, Plant Cell Reports 13(6):309-314(1994))을 사용하여 토끼풀 안에 성공적으로 이루어져오고 있다.
유전자 형질전환은 많은 사료 및 잔디풀 종에 보고되어오고 있다(Conger B.V. 사료향상에 대한 분자 및 세포 기술에 의한 사료용 풀의 유전트랜스제닉, CSSA Special Publication No.26, Crop Science Society of America, Inc.E.C. Brummer 등 Eds. 1998, 페이지 49-58). 여기에는 과수원풀(Dactylis glomerata L.) 큰 목초(Festuca arundinaceaScherb) 붉은 목초(Festuca rubraL.) 초원목초(Festuca pratensisHuds.) 다년생 독보리(Lolium perenneL.) 포목 겨이삭띠(Agrostis palustrisHuds) 및 흰겨이삭(Agrostis albaL.)이 포함된다.
이런 사료 및 잔디풀 속으로의 성공적인 유전자 전이는 원형질 및 세포의 충격 또는 미크로추진으로 코팅된 DNA를 갖는 조직에 의한 DNA의 직접 섭취에 의해 성취되어오고 있다. 모든 경우에, 전이는 전체 식물 재생 후에 일어난다. 일의 대부분은 형질전환에 대한 프로토콜의 생장 및 향상에 촛점을 맞춰오고 있고 글루코로니다제(GUS) 및 포스피노트리신의 제초제에 대한 저항성을 부여하는 선택 마커 bar를 인코딩하는 수용체 유전자uidA를 이용해오고 있다. 형질전환의 증거는 폴리머라제 사슬 반응(PCR)기술, 전사된 RNA의 노던(notrhern)잡종 분석, 가용성 단백질(유전자 생산물)의 웨스턴 블럿 분석 및 전체 게놈 DNA의 서든 블럿 잡종화에 의해 제공되어오고 있다.
Ⅲ.반접합체
아그로박테륨 형질전환 방법을 사용하여 형성되는 트랜스제닉 식물은 일반적으로 염색체에 단일 유전자를 포함하나 복수 유전자도 가능하다. 이런 트랜스제닉 식물은 첨가된 유전자에 대해 반접합체인 것으로 불려질 수 있다. 이런 식물에 대한 보다 정확한 이름은 각 형질전환된 식물이 고유의 T-DNA 통합(미국특허번호 6,156,953)을 나타내기 때문에 독립 분리형이다. 일반적으로, 트랜스진 좌위는 트랜스진의 존재 및/또는 부존재가 특징이다. 트랜스진의 부존재와 상응하는 하나의 대립유전자의 이형 유전자형은 반접합체으로 정해진다(미국특허번호 6,008,437).
정상적인 반접합체을 고려할 때, 자가수정은 R1 또는 R1세대로 알려진 첫 번째 자가수정 재조합 세대 안에 최대 유전자형 분리를 초래할 것이다. R1 세대는 R0 또는 R0세대로 알려진 최조 재조합 계통의 자가수정에 의해서 생성된다. 각 삽입이 우성 대립유전자로 작동하기 때문에, 연관이 없다는 것과 단 하나의 반접합체 삽입은 저항성 발현을 요한다는 것을 가정하지 않는다면, 첫 번째 삽입은 3:1, 두 번째 삽입은 15:1, 세 번째 삽입은 63:1 등이 될 것이다. 그러므로, 상대적으로 적은 R1 식물은 적어도 하나의 저항성 표현형(미국특허번호 5,436,175 및 5,776,760)을 찾도록 성장될 필요가 있다.
상기에서 언급한대로, 반접합체 트랜스제닉 재생 식물의 자가수정은 약 25%가 동형 트랜스제닉 식물인 F2와 동일한 자손을 생산한다. 자가 수정 및 F2 자손 대 비형질전환 제어 식물의 검정교배가 동형 트랜스제닉 식물을 동정하고 계통을 유지하는데 사용될 수 있다. 재생된 식물에 대해 최초로 얻은 자손이 교차수정으로 얻어진 것이라면, 동형 트랜스제닉 식물의 동정은 자가수정의 추가 세대를 필요로 할 것이다(미국특허 5,545,545).
Ⅳ. 반-불임성 및 유전 불임성 여과기
A.배우체 불임성 형질(GST)
GST는 성-특이 프로모터, 자살 유전자 및 선택적으로, 전위유전단위 및/또는 유전자 전위효소를 인코딩하는 부위의 두개 또는 세개의 인자로 이루어질 수 있다. 일반적으로, GST구조는 전사 종결인자가 된다. 트랜스포손 또는 유전자전위효소 공급원의 봉입은 분산된 전위에 대한 선택법에 특이적이고 트랜스진의 유전을 제거할목적에 필수적으로 사용되는 것은 아니다.
성-특이 프로모터는 옥수수, 쌀, 토마토, 담배, 애기장대 및 브라시카속의 꽃가루-특이 프로모터를 포함할 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다. 여러 다른 예들은 GenBank에서 찾을 수 있다. 프로모터는 한쪽 성(웅성 또는 자성)에 반드시 특이적이어야 하고 상동 염색체가 다른 세포로 분리되었을 때 제 1 감수분열 후 특이적으로 유전자 발현을 유도한다.
자살 유전자는 원하지 않는 감수분열 생산물을 죽이는 데 사용된다. 자살 유전자는 바나제, 수꽃대종자2 및 디프테리아 독소 A 유전자를 포함하나 이에 한정되지 않는다. 자살 유전자 사용에 대한 두가지 대안은 1)꽃가루 또는 난자의 생장에 필수적인 유전자의 발현을 억제하는 안티센스 RNA 기술 또는 2)꽃가루-유전이 되지 않는 결실과 같은 한쪽 성을 통해 유전이 불가능한 돌연변이를 사용하는 것이다. 두가지 대안은 반-불임성을 얻기 위해 사용될 수 있다.
B. 반-불임성 및 유전자 불임 여과기
발명자에게 용어 "반-불임" 및 "유전자 불임 여과기"는 자살 유전자 발현이 후기-감수분열 Ⅰ에 한정되기 때문에, 일반적으로 GST좌위가 감수분열에서 반접합체이고 분리될 때 배우체의 50%만이 제거될 것이다. 이것은 GST 좌위가 단일본(반접합체 상태)의 게놈 안에 존재할 때, 자살 유전자가 감수분열의 생산물의 대략 반정도에 유전될 것이고 50%의 불임율을 가져오기 때문이다. 만일 꽃가루 특이 프로모터가 자살 유전자와 작동하도록 연관된다면, GST를 유전하는 꽃가루는 살아남지 못할 것이다.
50%의 생장할 수 있는 꽃가루의 생산은 분산된 전위를 회복하고 웅성 수정에 큰 영향 없이 트랜스진 유전을 막는데 필수적이다.
C.배우체 반-불임
본 발명은 특이 트랜스제닉 복합체를 유전시키는 배우자를 제거하는 유전자 불임성 여과기를 생산하는 꽃가루 반-불임과 같은 배우체 "반-불임"을 사용하는 기술의 사용에 대해 기술한다. 꽃가루-특이 프로모터의 GST로의 도입은 이런 트랜스제닉 복합체를 유전하는 꽃가루 안의 GST와 연관된 트랜스제닉의 유전을 방지한다.
이 트랜스제닉 복합체는 전위유전단위 및/또는 유전자전위효소 유전자에 대한 개시부위를 포함할 수 있다. 이런 경우에, 트랜스포손 도너 부위 및/또는 유전자전위효소와 더불어 트랜스진 복합체의 제거는 트랜스진 복합체와 결합하는 전위 또는 게놈을 통해 분산(더 이상 GST에 연관되지 않음)되는 전위를 활성화하는 반면 전위 주위를 제거하는 최종의 효과를 갖는다. 본 방법은 주로 분산된 전위에 한정되는 것을 선호하는 트랜스포손 돌연변이 전략의 통상의 여러 한계를 극복한다. 본 발명은 트랜스포손 분산(Sandaresan,V.등,(1995) Genes Dev. 9/14:179-810; Tisser, A.F.등,(1999) The Plant Cell Vol. 11:1841-1852)을 이루는 음성 선택 마커의 통상의 사용을 매우 향상시켰다. 게다가, 유전자전위효소 공급원의 유전을 제거하는 유전자 불임 여과기의 사용은 자손의 새로 전이된 인자를 안정화시켜 돌연변이 동정을 방해하는 체세포 또는 제 2 전위를 제거하게 된다.
반-불임성 형질 및 그 관련 트랜스포손 및/또는 유전자전위효소의 성질은 자살 유전자, 프로모터, 트랜스포손 방식 및 종의 선택에 따라 달라질 수 있다. 그러나, 반-불임성의 동일한 기본 기술은 옥수수, 쌀, 콩, 밀, 귀리, 보리와 같은 외떡잎 및 쌍떡잎의 많은 식물 및 동물 및 곰팡이와 같이 성적으로 증식될 수 있는 비-식물 방식에서의 전위를 회복하는데 사용될 수 있다. 또한, 소포자 제거에 대한 대안은 대포자 자살 형질을 조작함으로써 트랜스진 복합체의 자성 유전을 제거하는 것이다.
반-불임 형질은 트랜스포손 개시 부위 및/또는 유전자전위효소 유전자와 같은 특정 염색체 지역을 운반하는 감수분열(배우자)의 생산물을 제거하는데 사용된다. 이 "유전자 불임 여과기"는 트랜스진 복합체의 웅성 또는 자성 유전을 제거하는데 사용된다. 이 제거방법은 비연관된(분산된)전위유전단위 또는 개시부위로부터 재결합된 인자를 증가시키는 최종 효과를 갖는다; 이 방법은 유전자전위효소 유전자와 같은 다른 유전자의 유전을 제거하는데 동시에 사용되어 자손의 전위를 안정화 시킨다. 반-불임성을 얻기 위해서, 본 발명에 의해 많은 바람직한 방법이 고려된다. 한가지 방법은 원하지 않는 소포자를 죽이는 자살 유전자의 소포자-특이 발현을 유도하는데 달려있다. 이 방법은 꽃가루-특이 유전자와 같이 적당한 자살 유전자와 융합하여 유전자 융합을 유전하는 감수분열의 생산물만을 죽이는 특이 프로모터를 활용함으로써 달성된다. 반접합체 조건의 단일본 트랜스진에 대해, 배우체의 50%를 나타낸다. 꽃가루가 다량으로 생산되기 때문에, 꽃가루 수정을 50%까지 감소시키는 것은 후속 종자 생산에 큰 영향을 미치지 않는다.
잡종 종자 생산에 대한 전체 웅성-불임을 달성할 목적을 가진 전 방법과 다른 반-불임을 생산하는 것과 관련된 본 발명의 양상은 당해기술분야에서 공지되어있다. 이런 방법에서, 목적은 잡종종자의 양산을 돕는 완전 웅성 불임을 이루는 것이다. 이것은 주로 포자체 또는 모든 소포자의 자살 유전의 발현을 포함한다. 예를 들어, 타펫세포의 바나제 발현은 완전 웅성 불임(Beals, T.P 등(1997)The Plant Cell.Vol.9:1527-45)을 초래한다. 잡종 종자 생산에서, 꽃가루 반-불임은 원하는 결과(웅성-불임(자성)모체의 이계교배)를 얻기에 불충분하다. 단일본(반접합체 조건)의 게놈 안에 소포자-특이 자살 유전자 및 그 관련 인자가 존재하는 경우에, 자살 유전자는 감수분열 생산물의 약 절반에 유전될 것이고 잡종 종자 생산에 대해 상업적으로 수용할 수 없는 비율인 생장가능한 꽃가루 생산의 평균 50% 반-불임을 초래한다. 본 발명에 대해, 생장가능한 꽃가루 50%의 생산은 분산된 전위를 회복하고/또는 유전자전위효소 유전을 방지하는데 필수적이고 중요하다. 따라서, 배우체 불임 형질은 원하지 않는 게놈을 제거하는 여과기로 사용되는 것과 동시에 다른 게놈(비-트랜스제닉 및 도너인자 및/또는 유전자전위효소 유전자 없이 유전자전위효소를 포함하는 게놈)이 유전되게 한다. 한 실시예에서, 본 발명은 트랜스포손 개시부위 및/또는 유전자전위효소 공급원을 포함하는 트랜스진 복합체를 제거하는 "유전자 불임 여과기"를 만든다.
V. 육종 방법
개방-수분 개체군.호밀, 많은 옥수수 및 근대, 초본류, 자주개자리와 같은 콩과류 및 토끼풀 및 카카오, 코모넛, 오일팜과 같은 열대 나무 과실 및 고무의 개방-수분 개체군의 증가는 높은(최대는 아님)이형접합성도를 유지하는 반면 바람직한 대립유전자의 고정에 대한 유전자-주기의 변화에 주로 의존한다. 이런 개체군의동일성은 불가능하고 개방-수분 다양성 안의 truness-to-type은 전체로서 개체의 통계적인 형태이고 개체 식물의 특성은 아니다. 그래서, 개방-수분 개체의 이형접합성은 근친교배 계통, 클론 및 잡종의 동형접합성(또는 거의 동형접합성)과 대조된다.
게체 증가 방법은 두 그룹으로 나뉘는데, 이것은 일반적으로, 대량 선택이라고 불리는 순수 표현형 선택 및 자손 검사에 의한 선택에 기초한다. 내부개체 증가는 개방 육종 개체의 개념을 사용한다; 유전자가 한 개체에서 다른 개체로의 흐르도록 한다. 한 개체 안의 식물(재배변종, 균주, 생태형 또는 어떤 세포질)은 자연적으로(예를 들어, 바람에 의해)또는 손 또는 벌(통상Apis melliferaL. 또는Megachile rotundataF.)에 의해 다른 개체의 식물과 교배된다. 선택은 양쪽 공급원으로부터 원하는 형질을 가진 식물을 분리함으로써 한(또는 때로는 양쪽)개체(들)를 증가시키도록 이루어진다.
개방-수분 개체 증가의 기본적인 두가지 주요한 방법이 있다. 첫 번째로, 개체는 정해진 선택과정에 의해 대량으로 변화되는 상태가 있다. 결과물은 분리된 자체 내의 무작위 교배에 의해 무한히 증식되는 증가된 개체이다. 두번째로, 합성 변종은 개체 증가와 동일한 최종결과를 얻지만 자체적으로 증식되는 것은 아니다; 이것은 모체 계통 또는 클론으로부터 재구성된다. 개방-수분 개체를 향상기키는 식물 육종 방법은 당해기술분야의 당업자에게 공지되어 있고 교배-수분 식물을 증가시키기 위해 사용되는 육종 방법의 포괄적인 설명은 Allard,Principles of Plant Breeding, John Wiley & Sons,Inc.(1960); Simmonds,Princeple of CropImprovement,Longman Group Limited(1979); Hallauer and Mirand,Quantitive Genetics in Maize Breeding, Iowa State University Press(1981);and, Jenson,Plant Breeding Methodoloy, John Wiley & Sons,Inc(1998)를 포함하는 많은 문서 및 기사에 제공되어 있다.
집단선택.집단선택에서, 원하는 개체 식물이 선택되고, 수확되고, 종자는 다음 세대를 생산하는 자손 검사없이 합성된다. 선택이 모계에 기초하기 때문에, 수분 및 선택과 무작위로 교배하는 형태의 집단선택에 대한 제어가 없다. 상기와 같이, 집단선택의 목적은 개체에서 우수한 유전자형의 비율은 증가시키는 것이다.
합성품.합성 변종은 모든 가능한 잡종 조합에서의 우수한 결합력을 위해서 선택된 많은 유전자형을 내부적으로 교배함으로써 생성되고 개방 수분에 의한 변종이 계속 유지된다. 모체(다소 근친교배된)가 근대 및 콩(Vicia)또는 클론, 목초,토끼풀 및 알파파에서와 같은 종자 증식 계통이라면 대체로 차이가 없다. 모체는 일반적인 결합 능력에 의해 선택되나, 검정교배 또는 품종계통간 교배, 보다 일반적으로는 집단교배에 의해 선택된다. 비록 모체 종자 계통은 의도적으로 근친교배(예를 들어, 자가수분 또는 근친교배)일 수 있다. 그러나, 비록 모체가 의도적으로 근친교배되지는 않치만, 계통이 유지되는 동안의 계통 내의 선택은 약간의 근친교배가 발생할 것이다. 물론, 클론모체는 변하지 않고 남아있고 이형접합성이 강하게 남아있다.
합성품이 모체 종자 생산 계획에서부터 농부로 바로 갈 수 있는지 하나 또는두개의 증식주기를 거쳐야 하는지는 종자 생산 및 종자 수요량에 달려있다. 실제로, 풀 또는 토끼풀은 일반적으로 한 두번 증식되고 최초 합성품으로부터 상당히 제거된다.
때때로 집단선택이 사용되는 동안, 자손 검사는 일반적으로 작동의 단순함 및 목표에 대한 뚜렷한 관련성(즉, 합성품에서 일반적인 결합능력의 활용)때문에 집단교배에 바람직하다.
모체계통의 수 또는 합성품에 관여하는 클론의 수는 매우 다양하다. 실제로, 10 내지 수백의 모체계통의 수는 평균적으로 100-200을 갖는다. 100 또는 그 이상의 클론까지 형성되는 넓은 합성품은 종자가 증식되는 동안 좁은 합성품 보다 더욱 안정할 것으로 예상된다.
잡종.잡종은 현재 다른 유전자형의 모체 사이의 교배로 얻어진 개체 식물이다. 상업용 잡종은 옥수수, 수수, 근대, 해바라기 및 브로콜리를 포함하는 많은 작물에서 폭넓게 사용된다. 잡종은 두 모체와 직접 교배(단일 교배 잡종)하거나 단일 교배 잡종을 다른 모체(3가지 방식 또는 3중 교배 잡종) 또는 두개의 다른 잡종(4가지 방식 또는 이중 교배 잡종)을 교배하는 것을 포함하는 많은 다른 방법으로 형성될 수 있다.
엄격히 말하자면, 외부 육종(즉, 개방-수분)개체군 안의 대부분의 개체는 잡종이나, 기간은 주로 모체가 다른 종 또는 하부 종으로 인식되기에 충분하게 뚜렷한 게놈을 가진 개체인 경우에 대비해서 남겨둔다. 잡종은 두 모체의 게놈의 정성적 및/또는 정량적 차이에 따라 임성 또는 불임일 수 있다. 잡종강세 또는 잡종 생장력은 주로 성장능력, 생존능력 및 잡종을 형성하는데 사용된 모체계통과 비교한잡종의 임성능력을 증가시키는 향상된 이형접합성과 관련되어 있다. 최대 잡종강세는 주로 두개의 유전적으로 상이하고 고도로 근친교배된 계통을 교배함으로써 달성된다.
잡종의 생산은 모체계통 및 그 계통의 교배에 기인한 잡종의 분리 생산을 포함하는 잘 발달된 산업이다. 잡종 생산 과정의 보다 상세한 논의에 대해서는 예를 들어, Wright, 상업용 잡종 종자 생산 8:161-176 상기의 In Hybridization of Corp Plant를 참조하라.
Ⅵ.트랜스포손 및 유전자전위효소 인자
트랜스포손은 도너 염색체 부위에서 같은 염색체 또는 다른 염색체에 대한 대상 부위로의 전위(이동)할 능력이 있는 유전인자이다. 암호 서열, 인트론 및 프로모터 속으로 삽입함으로써 돌연변이를 일으키는 트랜스포손은 주로 대상 유전자 활동을 완전하게 제거한다. 트랜스포손에 의해 발생된 돌연변이는 그 후에 유전자로부터 트랜스포손을 제거함으로써 약화될 수 있다. 전체적으로 유전자전위효소를 언급하는 하나 또는 그 이상의 단백질은 트랜스포손의 제거 및 융합에 필요하다. 유전자전위효소의 자신의 공급원을 인코딩하는 트랜스포손은 자율인자라고 한다.
유전자전위효소를 트랜스에 공급하는 것은 유전자전위효소를 인코딩하지 않치만 전위를 요하는 말단서열(주로 형질전환 반복단위)을 포함하는 트랜스포손(비-자율 인자)을 전위한다..
A. Ds 인자
바람직한 실시예중의 하나에서,Ds인자가 전위에 필요한 말단서열을 포함하기 때문에 고려된다(Coupland,G. 등,(1989)Proc Natl Acad Sci USA 86:9385-8; Chatterjee, S. 등,(1995)Mol Gen Genet.249:281-8), 인핸서 감지를 위한 GUS 수용체 유전자에 융합되는 최소 프로모터(47 CaMV 35S 프로모터); 반대방향으로, 유전자를 묶을 목적으로 강화된 형광물질, 복수-스펙트럼 GFP 유전자(Haseloff, J, 등,(1997)Proc Natl Acad Sci USA.94:2122-7; Haseloff, J. 등,(1999) Methods Mol Biol.122:241-59; Haseloff,J.(1999)Methods Cell Biol. 58:139-51)에 융합되는 결합 수용체 부위. 이Ds인자는 대상 유전자 전사에 대하여 한 삽입 방향의 인핸서 트랩 또는 다른 방향의 유전자 트랩을 찾아내는데 사용될 수 있다.Ds를 사용하는 두번째 실시예는 기능획득 돌연변이를 생성하기 위해서Ds인자의 한 말단의 전사 활성제를 치환한다. 각 인자는 부위-특이 재결합(Dsborne, B.I.등,(1995)7:687-701; Medberry,S.L.등,(1995)Nucletic Acids Res.23:485-90; Qin, M.등,(1994)7:687-701; Medberry,S.L.등,(1995)Nucletic Acid Res.23:485-90; Qin,M., 등,(1994)Proc Natl Acad Sci USA 91:1706-10)을 위한lox P부위 및 조직 배양 및 토양 선택용 제초제(Finale®)에 대한 bar 유전자(Thompson,C.J., 등,(1986)EMBO J.6:2519-23)를 포함한다. Finale®는 글루포시네이트 제초제의 등록된 상표이다.
B.식물에서 트랜스포손 및 삽입 돌연변이의 유용성
트랜스포손은 유전자 분석과 박테리아, 곰팡이, 식물 및 동물 게놈의 기능성 게놈 분석에 매우 유용하다. 식물에서, 유전적으로 강화된 트랜스포손은쌀(Izawa,T. 등,(1997)Plant Mol Biol Vol.35/1-2:219-29), 토마토, 애기장대, 상추 및 기타의 여러 종들(Sundaresan, V,(1996) Trends Plant Sci.Vol. 1:184-190)에 성공적으로 도입되었다. 여러 연구자들이 전위(Fedoroff,N.V. 등,(1993)Plant J.Vol.:3:273-289; Honma,M.A. 등,(1993)Proc Natl Acad Sci USA Vol.90/13:6242-6), 비연관된 인자에 대한 선택(Tisser 등, (1999)The Plant Cell Vol. 11:1841-1852; W.R.;Sundaresan, 등,(1995)Gene Dev. 9/14:1797-810), 게놈 도처에 분산된 개시 부위 (Cooley,M.B.등,(1996)Mol Gen Genet Vol.252/1:184-94, Knapp,S. 등,(1994)Mol Gen Genet Vol.243/6:666-73;Osborne,B.I. 등,(1991)Genetics Vol. 129/3:833-44; Takken,F.L. 등,(1998)Plant J Vol.14/4:401-11,Thomas,C.M, 등,(1994)Mol Gen Genet Vol.242/5:573-85;Van der Biezen, E.A. 등, 1996 Mol Gen Genet Vol.251/3:267-80)및 인핸서 및 유전자 트랩과 같은 인자속으로 특징 첨가(Sharknes,W.C.,(1990)Biothechnology 8:827-831;W.R.;Sundaresan, 등(1995)GEnnnes Dev 9/14:1797-810)및 전사 활성화(Fritze,K. 등(1995)Methods Mol Biol Vol.44:281-94;Kakimoto,T.,(1996)Science Vol.274/5289:982-5; Kardailsky, I.; 등,(1999)Science Vol.286/5446:1962-5)에 대한 양성 선택을 위한 방법을 포함하는 전위회복의 효율을 증가하기 위한 수많은 방법을 만들어내고 있다.
트랜스포손의 활용에서의 큰 발전을 고려할 때, 기능성 게놈 분석에 대한 한계를 가지고 있다. 전위는 주로 도너 및 대상 부위(Moreno,M.A 등,(1992)Genetics Vol. 131:939-956;Athma,P. 등,(1992)Genetics Vol.131:199-209)사이의 짧은 물리적 거리내에서 염색체 상호간에 일어난다. 이런 한계는 적게 발견되는 인자를 갖는 도너부위(개시부위)주위의 지역 안에서 발생하는 모든 새로운 삽입은 게놈 도처에서 무작위로 분산된다는 것을 의미한다. 두번째로, 전위과정은 자손에게 유전되지 않는 매우 많은 체세포 삽입이 일어나도록 조절되지 않고 배상태로 유전되는 불일치를 유도할 수 있는 발육상의 초기 전위이다.
C. 분산된 전위를 회복하는 최신의 방법
현재 비분산된 전위의 한계를 부분적으로 극복하기 위해서 두가지 방법이 사용된다. 한 가지는 게놈 도처의 첫 번째로 분산되는 트랜스포손 개시부위를 사용하는 것이다. 그러나, 이 방법은 넓게 확산된 게놈 범위를 얻기 위해 많은 수의 트랜스제닉 개시 계통을 필요로 한다. 전위를 분산시키는 두 번째 방법은iaaH, PEHa, r404, 또는 시토신 탈아미노효소와 같은 트랜스포손 및/또는 유전자전위효소를 포함하는 도너부위를 선택하는 음성 선택 마커(들)를 사용하는 것이다. 도너인자에 대한 선택은 (연관된)전위 근처를 선택하여 비연관된 전위를 증가시킨다. 음성선택이 비연관된Ds및Spm전위(W.R.;Sundaresan, 등,(1995)Genes Dev.9/14:1797-810;Tisser,A.F.,등,(1999)The Plant Cell Vol. 11:1841-1852)를 회복하기 위해서 애기장대에 사용되어오고 있고 2개의 음성 선택 마커는 친제초제 전환(O'keefe,D.P.등,(1994)Plant Physiol Vol. 105:473-482;Doston,S.B. 등,(1996)The Plant Journal Vol.10/2:383-392)을 기초로 하는데, 방법은 토양선택에 이론적으로 일치한다.
그럼에도 불구하고, 음성 선택마커의 사용은 많은 수의 독립 전위의 회복에심각한 한계를 부여한다. 첫째, 여러개의 음성 선택마커는 많은 수의 분산된 전위의 회복과정에 많은 비용 및 시간을 요하는 노동집약적인 과정에 기초한 조직-배양(W.R.;Sundaresan, 등,(1995)Genes Dev. 9/14:1797-810; 전위(Fedoroff,N.V.등,(1993)Plant J.Vol.:3:273-289)의 사용을 필요로 한다. 둘째, 음성 선택은 화학약품(Tissier,A.F.,등,(1999)The Plant Cell Vol.11:1841-1852; W.R.;Sundaresan, 등,(1995)Genes Dev. 9/14:1797-810)에 의해 비연관된 인자 또는 유전자전위효소 또는 모두를 갖는 자손의 제거에 기초한다. 자손 제거는 종자수가 한정될 때는 문제가 발생할 수 있다. 예를 들어, 주로 자가 수분 종인 쌀(Orza sativa)과 같은 식물에서, 이계교배는 단조롭고 시간이 소비되는 것이라서 쉽게 얻을 수 있는 자손의 수를 심각하게 제한한다. 따라서, 만일 전위 비율이 낮고 비연관된 전위가 소수의 전위를 나태낸다면, 분산된 전위를 회복하기 위해서 음성 선택을 사용하는 것은 고가이고 비실용적이다. 예를 들면, 이계교배에 의해 10,000전위를 회복하기 위해서 1-5% 전위, 50% 감수분열성 분리 및 단 30%의 비연관된 전위의 비율을 차지하는 것은 대략 수백만의 자손 식물을 필요로 한다. 마지막으로, 친제초제와 같은 음성선택 약품은 심각한 환경적 영향을 갖을 수 있고 분산된 전위를 갖는 많은 수의 자손을 선택하기 위해 필요할 수 있는 화학약품을 사용하기 때문에 고가일 수 있다. 게다가, 이런 화학약품의 대부분은 전답에 대한 사용이 허가되지 않는다.
Ⅶ. 유전자전위효소
식물군으로 발현된 유전자전위효소
돌연변이 유발, 유전자-발굴법 및 기능성 게놈 분석용 트랜스포손의 사용과 관련한 추가의 제약은 전위방법에 대한 발전적이고 순간적인 제어가 없다는 것이다. 대부분의 유전자전위효소 유전자 발현에서, 원래의 프로모터 또는 구조 프로모터의 제어는 식물이 무성성장하는 동안 발생한다. 유전자전위효소 공급원의 무성 발현은 체세포 전위를 유도한다. 이런 전위는 체세포 혈통이 대포자 또는 소포자를 생산할 때만 자손(배의 전위)으로 유전된다. 이것은 두가지 이유에 의해 문제된다. 첫 번째는, 무성 또는 초기 재생산 성장하는 동안 발생하는 전위는 무성적으로 증식될 수 있고 그 후에 많은 배우자에 유전되어 자손에서 회복된 비-독립 인자가 많이 생기게 한다. 이것은 기능성 게놈 분석 또는 유전자-발굴법에 많은 수의 독립 전위가 필요하다면 바람직하지 않다. 두 번째는, 체세포 전위는 주로 표피성 혈통 또는 말단 무성 구조에서 발생하는 배우자를 초래하는 혈통을 포함하지 않는다. 이런 전위는 결코 감수분열성으로 유전되지 않으며 그래서 자손에서 발견되지 않는다. 이것은 이런 체세포는 조직 DNA 샘플에서 돌연변이로 잘못 동정될 수 있으나 자손에서 결코 발견되지 않기 때문에 문제가 된다. 이것은 돌연변이 선별이 실시예 화학약품에 의한 PCR이라면 특히 문제가 된다(Tisser,A.F., 등,(1999)The Plant Cell Vol.11:1841-1852;McKinney,E.C., 등,(1995)Plant J.Vol.8:613-622; Krysan,P.J 등,(1996)Proc.Natl.Acad.Sci.USA Vol.93:8145-8150;Fery,M 등,(1997)Science Vol.277:696-699).
본 발명의 추가 실시예에서, 체세포 전위의 문제를 감소하기 위해, 유전자전위효소 유전자는 소포자 및 대포자의 생산을 유도하는 꽃의 하부표피성 혈통에서유전자 발현을 유도하는 꽃-특이 프로모터의 제어하에 놓인다. 이런 프로모터는 무성이고, 꽃이 없고(apetala1, apetala2, apetala3), 암술과 같은 유전자에서 발견되는 것과 옥수수 및 쌀과 같은 다른 식물 종에서 발견되는 그들의 동족체를 포함한다. 예를 들어, apetala3 프로모터는 성장 꽃 분열조직의 꽃잎 및 꽃받임 조각 시원세포 에서의 수용체 유전자의 발현을 유도한다. ap3 프로모터의 제어하의 유전자전위효소 발현은 꽃의 성장에 한정되고 소포자를 발생시키는 혈통에서 발생될 때, 이 일은 다음세대에 유전된다. 이 방법에 의한 전위의 제어는 두가지 효과를 갖는다: 1) 소포체 전위를 중단시키고; 2)꽃가루가 많은 다른 꽃 분열조직에서 유도될 때 많은 수의 독립전위를 만든다. 따라서, 체세포 조직은 체세포 또는 제 2 전위의 고려없이 실험될 수 있고 각 꽃 분열조직은 전위의 독립 공급원이 된다.
Ⅷ. 쌀-모델 식물 방식
A. 미국 및 전세계에서의 쌀 농업
대략 전세계 인구의 반이 주로 쌀에서 칼로리를 섭취한다. 1년간 전세계 생산 수준은 4억㎏이상이고, 2억 헥타에서 재배된다(익명(2000)의 USDA 세계 농업 공급 및 수요 평가. USDA 농업 마케팅 서비스. 간행물 WASDE-362).
현재, 미국은 140만 헥타에 심어서 1년에 750만㎏의 쌀을 생산하고 170억불의 무역수지를 얻는다(익명(2000)의 USDA 세계 농업 공급 및 수요 평가. USDA 농업 마케팅 서비스. 간행물 WASDE-362). 미국에서 생산되는 쌀의 3분의 2이상은 주로 아시아 및 남미 시장에 수출되어, 미국을 세계3위의 수출국으로 만들고 있다.
대략 현재 재배되는 쌀 변종의 99%는 International Rice RearchInstitute(IRRI) 및 International Center for Tropical Agriculture(CIAT)와 같은 CGIAR 국제적 연구센타 (http://www.cigar.org/irri/crucial.htm)에 의해 지원되는 육종 프로그램으로부터 많이 기인한 공공 육종 프로그램의 결과이다. 미국 쌀 변종의 대부분은 알라스카,루이지아나, 미시시피, 텍사스 및 캘리포니아 주에서 재배된다. 농업생물공학은 현대 형질전환 쌀 혈통을 개발하는데 매우 중요해지고 있다; 생물공학의 발전은 이 세계시장에서의 경쟁하는 미국 쌀 재배자에게 큰 힘이 될 것으로 기대된다.
B.외떡잎 식물 개발용 모델 방식으로서의 쌀
곡류는 세계에서 가장 중요한 식용작물을 포함하고 6500만년전의 공통조상에서 진화된 비교적 최근의 분류군으로 여겨진다(Martin, W.,등,(1989)Nature 339:46-48; Moore, G., 등,(1995)Trends Genet. 11:81-82). 이런 짧은 역사는 비록 상이함이 반복 서열 조성에서의 게놈 크기, 반수체 염색체 수 및 변종에서 나타나지만 유전자 구조 및 순서에서 상당한 정도의 보존에서 반영된다(Moore,G., 등,(1993)Bio/technology.11:584-589). 예를 들어, 옥수수 게놈은 쌀(Ahn, S.등,(1993)Genetics 90:7980-7984)의 게놈 보다 8배가 크고 다른 수의 염색체 속에 유기화되나 비교 분자 분석은 광범위한 신테니(synteny)유전자가 그 게놈들의 대부분 사이에서 동정될 수 있다는 것을 보여주고 있다(Ahn, S. 등,(1993)Genetics.90:7980-7984; Bennetzen, J.L.등,(1993)Trends Genet.9:259-261).
쌀은 곡초에 대한 뛰어난 모델 식물이다. 쌀은 기본적인 생물학적 문제를 조사하고 생산력, 잡종력 및 단일 및 복수 유전자 질병 저항성과 같은 작물의 형질을 배우는데 시용될 수 있다. 쌀의 다른 종은 열대성 홍수부터 온대 건조 토양까지의 다양한 환경요인에 적응함으로써 실제 적응 반응에 대한 모델이 된다.
쌀은 상대적으로 짧은 세대 기간(90-120일)을 갖기 때문에, 1년에 3 또는 그 이상의 세대를 얻는 것을 가능하게 한다. 많은 형질전환 집단이 쌀에서 발견되어오고 있고 특징화되고 있다.
트랜스제닉 쌀은 아그로박테륨-조정(Hiei,Y.,등,(1994)Plant J.6:271-82;Hiei,Y., 등,(1997)Plant Molec Bio.35:205-218;Zhang,J.,등,(1997)Mol Biotechnol.8:223-31)또는 바이오리스틱(biolistic)방법(Christou,P.,etal.,(1991)
Biotechnology.9:957-962;Buchholz,W.G.,등,(1998)Mothods Mol Biol.81:383-96)에 의해 효과적으로 생성된다. 매우 중요하게도, 쌀은 약 500메가베이스(Mb)의 게놈크기(Arumanagathan,K.등,(1991)Plant Mol.Biol.Report.9: 208-218)를 갖기 때문에, 애기장대 게놈의 크기 보다 약 3배 크고, 2004년 정도에 서열화될 예정이다. 대나무 및 다른 중요한 작물의 하나로서 식물 생물학의 중요한점에 대한 풍부한 기초 정보는 쌀 게놈(McCouch, S.(1998)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 95:1983-5;Wilson,W.A.,등,(1991)Genetics.153:453-73)으로부터 습득할 수 있다.
C. 쌀 게놈
쌀은 가장 촘촘하게 지도화된 식물 게놈 중의 하나이다(McCouch,S.R.,등,(1997)Plant Mol Biol.35:89-99;Panaud,O.,등,(1996)Mol Gen Genet.252:597-607). 두개의 가장-발전된 재조합 지도는코넬(http://genome.cornell.edu/rice/) 및 일본의 쌀 게놈 프로젝트(RGP)(http://www.dna.affrc.go.jp)에서 개발된 것인데, 여기에 3,000개이상의 RFLP 및 SSR 마커가 지도화되고 있다. 쌀의 YAC-기초 물리 지도는 게놈의 64%이상을 차지하고 4,000개의 지도화된 ESTs를 포함한다(Ashikawa,I.,등,(1999)Genome.42:330-7). 71,000 클론의 PAC 라이브러리는 STSs 및 ESTs로 지도화되었고 지도화된 클론은 대략 게놈의 30%를 차지한다. 37,000 및 55,000의 구성원을 가진 두개의 BAC 라이브러리는 BAC-말단 서열화되어오고 신원이 조회되어오고 BAC-기초 물리 지도는 완성되어오고 있다(http://www.genome.clemson. edu/projects/rice/).
쌀 게놈은 500Mb(Arumanagathan,K.등,(1991)Plant Mol.Bio.Repoet.9:208-218) 및 340,000유전자를 포함하는 것으로 추정되고 있다. 국제 쌀 게놈 서열 프로젝트는Oryza sativa ssp.japonica cvNipponbare의 완전 게놈 서열을 얻기 위해서 1998년에 결성되었다. 이를 위해 10개국이 협력하고 있다. 현재 10Mb가 GenBank에 유전되었다.
D.트랜스포손-기초 게놈 프로그램의 유용성
트랜스포손의 사용에 대한 주요 이유는 기능성 게놈 연구용 돌연변이의 다른 유형 보다 분명한 장점이 있다는 것이다. 쌀에서, T-DNA 및 리트로트랜스포손 돌연변이 유발은 심각한 한계를 갖고 있다. 현재, 두 방법은 연속적인 삽입을 회복하기 위한 세포 배양 선택 및 체세포 재생산을 필요로 하고, 과정은 비효율적이고, 시간이 소비되며 체세포영양계 변이(Bao,P.H.,등(1996)Transgenic Res.5:97-103;Evans,D.A.(1989)Trends Genet.5:46-50)가 유도되기 쉽다. 두 방법은 단지 안정한 삽입을 일으키는데, 이를 통해 어떤 돌연변이체 대립유전자의 유용성을 실질적으로 제한한다. 보다 복잡한 문제에 대해, T-DNA 삽입은 주로 크고, 복잡한 세로 연관형이어서, 돌연변이 대립유전자의 분자 분석에 어려움을 일으킨다(McKinney,E.C,등,(1995)Plant J.8:613-622;Krysan,P.J.,등,(1996)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 93:8145-8150;Krysan,P.J.,등,(1999)Plant Cell. 11:2283-2290; Galbaiati,등,(2000)Functional & Intergrative Genomics,in Press).
많은 실시예에서, T-DNA 또는 리트로트랜스포손-유도 대립유전자와 같은 단일 기능상실 돌연변이는 유전자 기능을 유도하는 충분한 정보를 제공하지 않을 것이다. 예를 들어, 지금까지의 제한된 연구에 의하면, 많은 유전자 파괴는 쉽게 식별할 수 있는 표현형을 생산하지 못한다(McKinney, E.C.,등,(1995)Plant J.8:613-622;Krysan,P.J., 등,(1996)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 93:8145-8150). 이것은 유전자 중요성의 부족을 의미하는 것은 아니나, 이런 많은 유전자들이 부분적으로 과잉이기 때문에, 중복 또는 특이 기능은 돌연변이 계통의 형태 또는 발달 검사에 기초해서 식별되지 않는다. 발현 분석 및 추가 대립유전자와 같은 보다 상세한 정보는 필수적일 것이다.
반면에,Ac/Dc방식과 같은 2개 인자 트랜스포손 돌연변이 유발은 간단한 삽입에 의해 안정한 유전자 파괴를 생성할 수 있다. 유전적으로 강화된Ds인자는 쌀(Izawa,T.,등(1997)Plant Mol Biol.35:219-29)을 포함하여 여러 식물 종에 성공적으로 도입되어오고 있다.(Martienssen,R.A.(1998)Proc.Natl.Acad. Sci.USA 95:2021-6;Sundaresan, V.(1996)Trends Plant Sci. 1:184-190).
기능성 게놈용 트랜스포손의 유용성은 형질을 인핸서 및 유전자 트랩(Martienssen,R.A.(1998)Proc.Natl.Acad. Sci.USA 95:2021-6;Sharkens, W.C.(1990)Biotechnology 8:827-831; Sundaresan,V., Spinger,등,(1995)Genes Dev. 9:1797-810) 및 전사 활성화(Fritze,K.등,(1995)Methods Mol Biol.44:281-94;Kakimoto,T.(1996)Science.274:982-5;Kardailsky,I.,등,(1999)Science.286:1962-5)와 같은 합성 트랜스포손 속에 형성함으로써 크게 향상되어오고 있다. 이런 형질을 구현함으로써, 유전적으로 과잉인 유전자도 기능적으로 분석될 수 있다. 가장 중요하게도, 트랜스포손을 재가동하는 능력은 대립유전자 유도체를 효과적으로 생산하고 이런 인자의 국부적인 전위 성질에 의해 유전자 근처를 효과적으로 돌연변이 시키는 유일한 기회를 만든다(Long,D., 등,(1997)plant J.11:145-8;Jones,J.D.G., 등(1990)Plant Cell. 2:701-707; Osborne, B.I.,등,(1991)Genetics.129:833-44). 적은 수를 갖고 시작해서, 잘-특성화된 트랜스제닉 계통 및 적절한 유전 전략, 분산된 전위의 막대한 집단이 후속 조직 배양 또는 재생 없이 효과적으로 재생한다.
E. 쌀 게놈 도처에 무작위로 분산된 Ds
본 발명은 쌀 게놈을 포함하는 특이 게놈에 적용될 수 있는 방법을 포함하지만 이에 한정되는 것은 아니다. 쌀은 곡초의 우수한 모델 식물이다. 본 발명의 방법을 쌀 게놈에 적용하는 방법에서, 한 목표는 쌀 게놈 도처에 분산된 안정한Ds삽입의 막대한 집단을 생산하는 것이다. 이 임무를 달성하기 위해서, 비독립 전위, 쌀 게놈 도처에 분산된Ds전위 및 자손에서 안정화된 트랜스포손 인자를 감소하려는 주 목적과 함께 여러개의 유전 전략이 고려되고 있다. 본 발명의 방법에 사용할 특이 형질은 IRGSP에 의해 서열화되고 있는Oryza sativa ssp.japonica cvNipponbare이다.
본 발명의 한 실시예에서, 쌀 게놈 도처에 무작위로 분산된Ds고려된다.Ds는 주로 짧은 유전자 거리에 국부적으로 전이되는 경향 때문에, 유전 전략은 이런 성향을 극복해야 한다. 지금까지는, 이것은 자손의Ds개시 부위에 대해 선택하는 것을 기본적으로 포함하는 다양한 방법을 사용하거나(Sundaresan,V.,등,(1995)Gene Dev.9:1791-810;Tisser,A.F.등,(1999)The Plant Cell 11:1841-1852)처음에 많은 개시 부위를 게놈 도처에 분산함으로써 달성되었다(osborne,B.I.,등,(1991)Genetics.129:833-44; Cooley,M.B.,등,(1996)Mol Gen Genet.252:184-94;Knapp,S.,등,(1994)Mol Gen Genet. 243;666-73;Takken,F.L.,등,(1998)Plant J.14:401-11;Thomas,C.M.,등,(1994)Mol Gen Genet.242;573-85; van der Biezen,E.A.,등,(1996)Mol Gen Genet.251:267-80).
Ds전위를 분산시키기 위한 두 가지 전략이 고려된다. 첫 번째 방법은 어느 연관된 전이된 인자와 함께 개시 부위의 유전을 제거하는Ds개시 부위의 꽃가루-특이 자살 형질을 포함하도록 유도하는 것이다. 자살 형질은 적절한 세포 사망 유전자의 발현을 유도하는 꽃가루-특이 프로모터를 구현함으로써 강화된다. 개시 부위구조는 모주(stock Plant)에서 단일본 및 반접합체이기 때문에, 감수분열 생산물의 50%는 T-DNA를 유전하고 유전자 자살이 진행된다; 잔존하는 생산물은 성장하는 꽃가루를 생산한다. 개시부위와 염색체 내에서 또는 상호간에 재결합하는 전이된Ds는 꽃가루를 유전한다. 이런 인자는 제초제 마커(bar 유전자)를Ds인자 속에 구현시킴으로 자손에서 쉽게 감지된다. 제초제 마커는 쌀 트랜스제닉에 대한 초기 조직-배양 선택 마커 및 비연관된Ds인자를 포함하는 자손에 대한 토양-기초 선발의 이중목적으로 사용된다.
꽃가루 자살 방법은 비연관 전위를 선택하는 이전의 전략 보다 분명한 장점을 갖는다. 이것은 주요 장점은 꽃가루가 대량생산된다는 것, 꽃가루 반-불임이 환경적으로 안정한 것, 만일 있다면, 종자 생산에 약간의 타격을 줄 수 있을 것이라는 것이다. 자손에서, 검정교배 자손의 50%(또는 자기수분때 75%)는 이들이 개시부위(및/또는 유전자전위효소 유전자, 하기 참조)를 유전하기 때문에 음성 선택에 의해 도태된다. 쌀에서, 전위를 회복하기 위해서 이계교배가 필요할 때, 종자 생산은 제한요인이 될 수 있다. 게다가, 음성선택용으로 사용되는 친제초제와 같은 화학약품(Tisser,A.F.,등,(1999)The Plant Cell.11:1841-1852;Doston,S.B.,등(1996)The Plant Journal. 10:383-392)는 상업적으로 사용되지도 않고 전답용으로 승인되지 않았다. 음성 선택에 기초한 조직배양(Sundaresan,V.,등,(1995)Genes Dev.9:1797-810;Kobayashi,T.,등,(1995)Jpn J.Genet.70:409-22)은 쌀에서는 비실용적이다.
본 발명의 한 실시예에서, 꽃가루-특이 자살 형질은 자살 유전자의 발현을 유도하는 적절한 프로모터를 사용하여 강화된다. 바나제유전자(Goldman,M.H.,등,(1994)EMBO J,13:2976-84), 관련 RNases(Fedorova,N.D.,등,(1994)Mol Biol(Mosk).28:468-71), 디프테리아 독소 A 사슬 유전자(Tusgeki,R.등,(1999)Proc Natl Acad Sci USA.96:12941-6;Nilsson,O.,등,(1998)Plant J.15:799-804;Uk Kim,등,(1998)Mol Cells.8:310-7;Day,C.D.,등,(1995)Development 121:2887-95) 및 다른 것(DeLong,A.,등,(1993)Cell.74:757-768)을 포함하는 여러 자살 유전자를 사용할 수 있다. 바나제 유전자의 사용은 꽃가루-특이 프로모터에 융합되었을 때 소포자-자율 세포 사망을 일으키는 효과적인 방법인 것으로 알려져 오고 있다(Custer,J.B.,등,(1997)Plant Mol Biol.35:689-99). 이전 방법과 대조해서, 본 발명의 방법은 ,완전 웅성 불임과 반대로, 반-불임의 생성에 의존하는데, 이것은 특히 소포자 내의 바나제 발현을 조작함으로써 본 발명의 한 양상으로 성취될 수 있다. 본 목적을 위해 쌀(Zou,J.T.,등(1994)Amer.J.Botany.81:552-561), 옥수수 꽃가루-특이 프로모터(Hamilton,D.A.,등,(1992)Plant Mol Biol.18:211-8) 및 여러 쌍떡잎 종의 꽃가루-특이 프로모터(Twell,D.,등,(1991)Genes Dev.5:496-507;Kulikauskas,R.등,(1997)Plant Mol Biol.34:809-14;Custers,J.B.,등,(1997)Plant Mol Biol.35:689-99; Albani,D.,등,(1990)Development.109:705-13;van Tunen,A.J.,등,(1990)Plant Cell.2:393-401)를 포함하는 여러 프로모터를 사용할 수 있다. 바람직한 실시예에서, 옥수수 프로모터(Hamilton,D.A.,등,(1992)Plant Mol Biol.18:211-8)와 같은 이형 꽃가루-특이 프로모터가 유전자 발현억제의 가능성을 감소시키는 것으로 생각된다.
T-DNA(개시 부위)를 제거하는 꽃가루 자살 메카니즘의 효율성 평가는 예를 들어, 자살 유전자 및 아그로박테륨-조절 T-DNA 형질전환을 거치는 쌀과 같은 유기체 속으로 전환되는 bar 유전자를 포함하는 구조를 사용함으로써 성취될 수 있다(Hiei,Y.,등,(1994)Plant J.6:271-82;Hiei,Y.,등,(1997)Plant Molec Biothechnol.8:223-31). 여러 단일본 T-DNA 계통(SCTLs)은 서든 분석에 의해 동정될 것이다(Ausebel,F.M.,등,(1987)In:Current protocols in molecular biology,ed.Chanda,V.B.Boston:John Wiley & Sons,Inc.). T-DNA 제거의 효율성을 검사하기 위해서, PCR실험이 T-DNA의 유전 감지를 위한 비선택된 이계교배 자손에 실행될 것이다. 이 분석은 비선택된 자손(예를 들어, 384 DNA풀의 최소, 12식물을 포함하는 각 풀)의 DNA풀에 대해 실행될 것이다. 이 평가 방법의 사용은, 유전자전위효소 공급원(하기 참조), 꽃가루 자살 유전자 및Ds-bar인자와 같은 다른 구조가 실험될 수 있다.
F.유전자전위효소 발현
본 발명의 추가 실시예는 비독립 전위를 감소시키는 반면 독립 전위를 증가시키도록 유도된다. 이것을 달성하는 한 방법은 초기 클론증식 및 비-독립성의 감수분열 유전을 막기 위해서 성장하는 전위를 지연시키는 것이다. 전위의 증식 시기에 대한 제어는Ac유전자전위효소 유전자(Rommens,C.M.,등,(1992)Mol Gen Genet.231:433-41;Balcells,L.등,(1994)Plant Mol Biol.24:789-98;Scofield,S.R.,등,(1992)Plant Cell.4:573-82;Swinburne,J.,등,(1992)Plant Cell.4:583-95;Gervelding,C.,등,(1992)Proc Natl Acad Sci USA.89:6085-9)를 유도하는 이형프로모터를 사용함으로써 성취된다. 여러 이형 프로모터가 본 실시예에서 고려된다.
독립 전위를 증가시키는 바람직한 실시예 전략은 무성 전위를 막는 유전자전위효소 발현을전적으로, 가급적이면 암술 발현을 제거(하기의 이유 때문에)한 꽃 생장에 한정하는 것이다. 꽃-특이 프로모터는 수술 발이체가 형성되는 동안 유전자전위효소 발현을 유도하는데 사용될 수 있고 쌀(Moon,Y.H.,등,(1999)Plant Mol Biol.40:167-77;Kang,H.,G.,등,(1998)Plant Mol Biol.38:1021-9;Greco,R.,등,(1997)Mol Gen Genet.253:615-23) 또는 옥수수 MADS-box 유전자 프로모터(Mena,M.,등,(1996)Sceince 274:1537-40;Mena,M.,등,(1995)Plant J.8:845-54)와 같이 암술 발현을 배제하는 것들이 사용될 수 있다. 전위 주기를 증가시키기 위해서, 전체-길이 cDNA 및 Ac 유전자전위효소의 절단형 모두가 쌀에서 사용될 수 있다. 상기 절두형(ORF103-807)는 이형 식물 종에서 전위의 주기를 증기시키는 것으로 보여지고 있다(Houba-Herin,등,(1990)Mol Gen Genet.224:17-23;Li,M.G.등,(1990)Proc Natl Acad Sci USA.87:6044-8).
유전자전위효소 발현을 꽃 생장에 한정시키는 것은 각 작은 두상화가 전위의독립공급원이라는 것을 의미한다. 통계적으로, 비독립 전위의 회복은 낮다-만일 각 꽃밥의 꽃가루가 독립 전위의 공급원이라면 동일한 꽃밥의 꽃가루에서 얻은 자손 종자의 주기 비독립 전위의 회복은 일어나지 않을 것이다-종자(작은 이삭 당 1개)보다 적어도 6배가 많은 꽃밥(작은 이삭 당 6개)이 생산될 것이다. 본 발명의실시예는 35S-유도 유전자전위효소(전체길이 및 절단형) 및 bar 유전자의 5'UTR 속으로 삽입되는 간단한Ds인자와 함께 쌀 속으로 형질전환되는 꽃-발현 유전자전위효소 구조를 포함한다. 단일본 삽입 계통은 서든 분석에 의해 동정되고 이런 식물들은 야생형태, 웅성-불임IR36 자성식물과 이계교배된다. 자손 묘목들은Ds가 잘려진 자손을 선택하기 위한 Finale®(하기 참조)의 쌍잎활용이 필요하다. Ac/Ds 전위의 메카니즘에 의하면(Chen,J.,er al.,(1987)Genetics. 117:109-116;Chen, J.,등,(1992)Genetics 130:665-676;Greenblatt,I.M.등,(1962)Geentics.47:487-501), 50%의 이상의 자손이 연관된 또는 비연관된Ds인자를 포함한다. 각 혈통으로부터의 Final®-저항성 자손은 독립 전위의 회복의 유효성을 결정하기 위해서 서든 분석에 의해 분석된다.
일단 전위되면,Ds인자는 안정화될 필요가 있으나, 재유동시킬 능력을 여전히 가지고 있다. 전위된Ds인자를 안정화시키키 위해서, 적절한 유전자전위효소 유전자는Ds개시 부위를 포함하는 최종 T-DNA 구조 안에 포함된다. 꽃가루 자살 방법 또는 bar 안티센스 전략은 T-DNA와 함께 유전자전위효소 공급원을 제거하는데, 이를 통해 자손의 전위된 어떤Ds인자를 안정화시킨다. 후속 세대에 유전자전위효소를 재도입하는 것은Ds인자를 쉽게 불안정하게 할 수 있고, 주변 유전자의 국부적인 돌연변이유발(Long, D.,등(1997)Plant J.11:145-8;Ito, T.,등,(1999)Plant J.17:433-44)또는 어떤 단일 유전자의 재구성(포화)돌연변이유발(Moreno,M.A.,등,(1995)Plant Cell.7:287-94)을 가져온다.
예 1. 유전적 구조
pYU904-합성 Ds 인자
합성 Ds 인자는 전위에 필요한 Ac의 5'과 3' 말단을 조합함으로써 구성되었다. 프라이머 P643(aagctttggccatattgcagtcatcc)(SEQ ID No:1) 및 P644(aagcttgctcgagcagggatgaaagtaggatggga)(SEQ ID No:2)는 HindⅢ 클로닝 부위를 3'말단에 추가하고 HindⅢ 및 XhoⅠ지역 둘 다를 단편의 5'말단에 추가하면서 좌표 4312bp에서 4565bp까지 조절자인자(Ac)의 5'말단을 확대시키기 위해 사용된다 (진뱅크(GenBank) 접속 X01380)(SEQ ID NO:3). 프라이머 P645(gaattccctcgagtagggatgaaaacggtcggtaac)(SEQ ID NO:4) 및 프라이머 P646(gaattcgaatatatgttttcatgtgtgat)(SEQ ID NO:5)는 단편의 3' 말단에 추가된 부가적인 EcoRI 및 XhoI 제한지역과 함께 좌표 1bp에서 221bp까지 Ac 인자의 3'말단을 확대시키기 위해 사용되며 부가적인 EcoRI 제한지역은 확대된 단편의 5'말단에 추가되어졌다. 이들 단편은 벡터 pCR2.1-TOPO(인비트로젠, Invitrogen)에서 각각 클론되었다.
플라스미드 pYU890은 Ac인자의 5'말단 단편을 포함하고, 플라스미드 pYU892는 Ac인자의 3'말단 단편을 포함하였다.
pYU892는 EcoRI(New England Biolabs)으로 분해되었고, 230염기쌍(bp)의 EcoRI 삽입이 pYU899를 생성하기 위해 pUC19의 EcoRI 지역에 클론되었다(진뱅크 접속 M77789).
pYU890은 HindⅢ(뉴잉글랜드 바이오랩)로 분해되었고, 250bp 삽입이 플라스미드 pYU902을 초래하는 플라스미드 pYU899의 HindⅢ 지역에 아클론(subclone)되었다. 이러한 플라스미드는 전위에 필요한 Ac의 5'과 3' 말단과 순차적인 클로닝 목적을 위해 내부 폴리링커(polylinker) 지역을 포함한다.
pBLUESCRPIPT Ⅱ K/S(스트라진, Stragene)의 결손 유도체(pYU903)는 SacⅠ과 SalⅠ으로 먼저 분해됨으로써 구성되고 클레나우(Klenow)로 채워져 재결찰된다. 그런 후 플라스미드는 Asp718 및 ApaⅠ으로 분해되고 클레나우(Klenow)로 채워지고 재결찰된다. 유도 플라스미드는 KpnⅠ-SacⅠ폴리링커의 제한지역의 결손을 나타내지만 완전한 XhoI 클로닝 지역을 가져야 한다.
pYU902는 XhoI(뉴잉글랜드 바이오랩)으로 분해되었고, 내부 571bp 단편은 pYU904를 초래하는 플라스미드 pYU903의 XhoI 지역에 클론되었다. 이러한 플라스미드는 Ac의 5'과 3'말단 및 현재 플라스미드에 독특한 Ds인자내에 다수의 클로닝 지역을 포함한다. 이러한 Ds인자는 "Ds-폴리링커"라고 한다.
선택가능한 마커 유전자를 포함한 pYU905-Ds 인자
스트렙토미케스 하이크로스코피쿠스(Streptomyces hygroscopicus)(진뱅크 접속 X17220)(SEQ ID NO:6)로부터의 바(bar) 유전자를 포함한 1.1 kb SmaI 단편은 플라스미드 pYU117을 생성하기 위해 0.6kb CaMV 35S 프로모터 단편(벤페이와 츄아(Benfey and Chua), 1990)과 3' 아데닐중합체형성(polyadenylation) 신호인자(좌표 514-813)(진뱅크 접속 V00090)(SEQ ID NO:7)에 융합되어 진다.
플라스미드 pYU117은 HindⅢ와 SnaBI(뉴잉글랜드 바이오랩)으로 분해되었으며, CaMV 35S 프로모터-바 유전자-종결자(terminator) 유전자를 포함한 1.8kb 단편은 클레나우 단편 DNA 중합효소(뉴잉글랜드 바이오랩)로 채워졌다. 변경된 단편은pYU905을 생성하기 위해 pYU904의 SmaI 부위에서 클론되었다(도 4B).
pYU905는 Ds-폴리링커 전위가능 인자내에 CaMV 35S-유도된 바 유전자를 포함한다. 이러한 합성 Ds 인자는 "Ds-바(bar)"라고 한다.
pYU846-유전자전위효소(transposase) 공급원
플라스미드 pKU108A는 NcoⅠ과 BamHⅠ(뉴잉글랜드 바이오랩)으로 분해된 잘려진 리딩프레임(reading frame)(ORFa103-807)(Lee and Stralinger), PNAS 87:6044-6048, 1990)을 갖는 유전자전위효소 cDNA를 포함한다. 내부 2.1kb 단편은 불순물이 제거되고 동일 효소로 앞서 분해된 pRTL2(레스트레포-하트위그와 캐링톤(Restrepo-Hartwig and Carrington), J. Virology 66:5662)에 아클론되었다. 생성된 플라스미드, pYU846(도 5)는 CaMV 35S 프로모터 사이의 전사융합과, 잘려진 Ac 유전자전위효소 cDNA(아미노산103-807)와 35S 아데닐중합효소 서열을 포함하였다.
GST 구조
바실루스 아마일로리퀘파씨엔스(Bacillus amyloliquefaciens)의 바나제 유전자(barnase gene)에 기초한 GST 구성의 2개 예가 표 1(SEQ ID NO:15) 및 표 2(SEQ ID NO:16)에 도시되어 있다. 이들 구성은 타펫-특정 담배 프로모터 TA29(tapetal-specific tobacco promoter)(진뱅크 접속 A18052)(SEQ ID NO:8)를 애기장대(Arabidopsis thaliana)(At59)로부터의 쌍떡잎 꽃가루-특이 프로모터(dicot pollen-specific promoter) 또는 오리자 사티바(Oryza sativa)(벼)로부터의 외떡잎(monocot) 꽃가루-특이 프로모터(진뱅크 접속 Z16402)(SEQ IDNO:9)로 대치함으로써 유도되었다.
At59 프로모터 및 5'URT는 프라이머 P755(acccatgtgagttttctttcttctccat)(SEQ ID NO:10) 및 P756(ttataggaaaattccagcagctcagcat)(SEQ ID NO:11)을 이용한 A.thaliana Col-O 유전자 DNA로부터 증폭된다. 이들 프라이머는 번역시작시에 위치하고 있는 5'PstⅠ클로닝 지역과 3'NcoⅠ지역을 도입하면서 동시에 상기 프로모터와 5'UTR 서열을 증폭시킨다. 이 NcoⅠ부위는 At59PSP:바나제:노스 트랜스진(Nos transgene)을 생성하기 위해 3'말단에서 노팔린(nopaline) 합성효소 아데닐중합효소 신호인자를 포함한 바나제 유전자의 0.74kb NcoⅠ-Eco RⅠ부위에 융합된다(표 1)(도 3A).
마찬가지로, 벼 꽃가루-특이 프로모터(진뱅크 접속 Z16402)(SEQ ID NO:9)는 번역시작시에 5'EcoRⅠ지역에 도입하고 3'NcoⅠ지역을 포함하면서 프로모터와 5'UTR 단편을 증폭시키는 프라이머 P731(gaattccgggccatggcatcctttag)(SEQ ID NO:12) 및 P732(ccatggatgatgtggctgcaaatg)(SEQ ID NO:13)을 이용한 오리자 사티바 에스에스피. 인디카(Orza sativa ssp. indica)(벼) 유전자 DNA로부터 증폭된다. 이 0.74kb Eco RⅠ-NcoⅠ단편은 OsPSP:바나제:노스 트랜스진(Nos transgene)(표 2)(도 3B)을 생성하기 위해 3'말단에서 노팔린 합성효소 아데닐중합효소 신호인자를 포함한 바나제 유전자의 NcoⅠ부위에 결합된다.
T-DNA 구조
T-DNA 구성 벡터 pPZ200(진뱅크 접속 U10460)(SEQ ID NO:14)은 pYU846에서 pYU1001까지 3.2kb PstⅠ단편에 결합된 PstⅠ으로 분해된다. pYU1001은 클레나우로채운 Asp718로 분해되었고, T4DNA 중합효소처리된 1.2kb PstⅠ-EcoRⅠAt59:바나제:노스 트랜스진 단편(pYU1002) 또는 1.3kb 클레나우처리된 EcoRⅠOsPSP:바나제:노스 트랜스진 단편(pYU1003)에 결합되어 있다.
pYU1002 또는 pYU1003은 SalⅠ으로 분해되며, GST, 유전자전위효소 공급원 및 Ds-바 인자를 포함한 플라스미드 pYU1004를 발생하게 pYU905로부터 파생된 2.3kb XhoⅠDs-바 인자에 결합되어 있다.
AT59:바나제:노스 GST 구조의 서열 및 단편
특징 위치/제한자(qualifier)
misc_ 특징 840..1245/주의="아그로박테륨(agrobaceterium) T-DNA로부터 노팔린 합성효소 유전자로부터 유도된 아데닐중합효소 지역을 포함한 3'조절서열"
5'UTR 393..503NcoⅠ지역을 생성하기 위해 3'말단에서 AA가 CC로 변경
TATA_신호 364..368
프라이머_바인드(bind) 1..30CCAT에서 TGCA로 변경
프라이머_바인드 보체(480..501)At59 프라이머를 증폭시키고 NcoⅠ지역을 도입하기 위한 프라이머
CDS 540..839/주의="바나제 유전자의 인코딩서열"
프로모터 1..392 At59 프로모터 부위
misc_ 특징 1241..1246 EcoRⅠ클로닝 부위
misc_ 특징 1..6 PstⅠ클로닝 부위
OsPSP:바나제:노스 GST 구조의 서열 및 단편
특징 위치/제한자(qualifier)
misc_ 특징 1028..1213/주의="EcoRⅠ클로닝 부위"
misc_ 특징 807..1212/주의="아그로박테륨(agrobaceterium) T-DNA로부터 노팔린 합성효소 유전자로부터 유도된 아데닐중합효소를 포함한 3'조절서열"
CDS 471..806/주의="바나제 유전자의 인코딩서열"
misc_ 특징 1..6 "EcoRⅠ클로닝 부위"
프로모터 6..470/주의="OsPSP 프로모터 부위"
예 2. 트랜스진의 유전 방지 또는 제거
반접합체(hemizygous)일 때, 트랜스진 좌위의 유전 제거는 웅성-특이 프로모터 또는 암성-특이 프로모터의 제어하에 자살유전자에 대한 대상 유전자를 연관시킴으로써 이루어진다. "배우체 자살형질(gametophytic suicide trait, GST)"이라고 하는 이러한 구조는 GST를 받는 소포자 또는 대포자(megaspores)에 제한되는 세포사망을 유도함으로써, 상기 GST에 연결된 대상 유전자의 유전을 효과적으로 감소시키거나 제거한다.
트랜스제닉 꽃가루로부터 제거하고 싶은 특정형질(즉, 대상 트랜스진)을 전달하는 유전자는 GST에 대한 물리적 접근이 있는 한 어디에서나 위치될 수 있다. 상기 GST 트랜스진 복합체는 반접합체이기 때문에, 상기 GST 트랜스진 복합체에서 완전히 연결되고 상기 GST와 다른 유전자 및/또는 트랜스진이 재결합되는 것에 관여하지 않는다.
본 발명의 방법은 배양 또는 재생을 필요로하지 않는 인 플란타(in planta) 또는 종자 형질변환 기술과 함께 사용될 수 있다. 이들 기술의 예는(Bechtold, N., 등.)(1993) CR Acad.Sci.Paris/Life Sciences 316:1 118-93; (Chang, S.S 등.)(1990) Abstracts of the Fourth International Conference on Arabidopsis Research, Vienna, p.28;(Feldmann, K.A. and Marks, D.M)(1987) Mol.Gen.Genet.208:1-9;(Ledoux, L 등.)(1985) Arabidopsis Inf Serv. 22:1-11; (Feldmann, K.A.)(1992)In: Methods in Arabidopsis Research(Eds)(Koncz, C., Chua, N-H, Schell, J.)pp. 274-289; (Chee 등.), 미국특허번호 제5,376,543호(U.S. Pat.Ser.No. 5,376,543)에 기술되어 있다.
애기장대(Arabidopsis)
바 트랜스진에 연결된 GST 구성(즉, At59PSP:바나제:노스 또는 OsPSP:바나제:노스)을 포함한 플라스미드는 진공침투법(vacuum infiltration method)(베츠톨드 등,(Bechtold, N., 등)(1993) CR Acad.Sci.Paris/Life Science 316:1 118-93)을 이용하여 아그로박테륨(agrobacterium)에서 전기천공에 의해 변환된 후 애기장대에서 전기천공(electroporation)에 의해 변환된다. 전술한 바와 같이, 상기 바 유전자는 포피노트리씬(phophinothricin, PPT)에 대해 저항성을 제공하도록 CaMV 35S 프로모터에 의해 유도된 포스피노트리씬 아세틸 전이효소(phosphinothricin acetyl transferase, PAT))에 대한 코드를 구성한다.
형질전환주(transformants)는 PPT에 대한 저항성에 기초하여 선택되고, T2 종자는 다수의 독립주로부터 생성된다. 이러한 종자는 다양한 농도의 제초제를 포함한 GM 배지상에 이식되고 발아 및 생존에 대해 평가된다. 야생형이거나 저항성 돌연변이를 과도발현시킨 다수의 트랜스제닉 계통(transgenic lines)은 공 벡터 콘트롤(empty vector control)에 치명적인 제초제 농도로 상당한 수의 녹색 묘목(seedlings)을 생산한다.
트랜스진 복합체 및 초기 트랜스제닉 계통에 포함된 트랜스진 또는 대상 유전자는 단일-본, 비-반복적으로 복제된 삽입으로 계통을 동정하기 위해 트랜스제닉 좌위의 수와 트랜스진 삽입의 복합체에 대해서만 특징적인 것을 필요로 한다. 초기 트랜즈제닉스(transgenics)의 특징은 PCR 및/또는 서든분석(Southern anaysis)에 의해 수행되며, 두 방법은 모두 DNA 증폭 및 젤 전기영동의 당해기술분야의 당업자에게 공지되어 있다.
이러한 실시예인 바 유전자에서, GST/대상 트랜스진에 대한 반접합체 형질전환된 식물은 대상 트랜스진만에 대해(즉, 어떤 GST도 트랜스진과 같이 존재하지 않는다) 동종접합(homozygous)/이종접합(heterozygous)의 형질전환된 식물과 적당한 통계처리를 이용하여(예를 들면, 불규칙한 완전한 블록 디자인 또는 격자 디자인) 대조식물, 야생형 식물(즉, GST와 대상 트랜스진 둘 다가 결여된 식물)과 함께 동일한 성장조건하에 재배된다.
GST/트랜스진 복합체에 대한 동종접합 식물과 야생형 식물은 대상 트랜스진을 함유하지 못한 모든 꽃가루 및/또는 종자/식물을 생산한다. 대조적으로, 트랜스진에 대한 이종접합 식물은 대상 트랜스진에 대한 정상적인 분리를 보이는 꽃가루 및/또는 종자/식물을 생산한다. 대상 트랜스진에 대한 동종접합 식물은 대상 트랜스진을 함유한 모든 꽃가루를 생산한다. 야생형 식물에 대해 교배될 때 대상 트랜스진에 대한 동형접합 식물은 대상 트랜스진에 대한 정상적인 분리패턴을 보이는 F2 종자/식물을 생산한다. 따라서, 상기 트랜스진에 대한 동형접합 또는 이형접합 식물 만으로도 대상 트랜스진을 포함한 약간의 일부 꽃가루를 생산한 반면 GST/트랜스진 복합체에 대한 반접합체 식물은 트랜스진으로 꽃가루를 생산하지 못한다.
이는 본 발명의 분산된 전위를 위한 동일한 상황이다. 초기 트랜스진 복합체는 GST와 트랜스포손 및/또는 유전자전위효소 둘 다를 운반한다. 트랜스제닉 계통이 발생한 후, 트랜스제닉 계통은 분산된 전위에 대해 선택된다. 즉, 하나 또는 2개의 트랜스제닉 계통은 모두 순차적인 선택을 필요로 한다. 어떤 다른 형질전환도 필요로하지 않는다. 부가적인, CaMV 35S 프로모터/바 유전자 구성과 같은 선택적 트랜스진은 형질전환의 선택에 도움이 필요하다면 추가될 수 있다.
잔디(turfgrass)
옥수수로부터의 꽃가루특정 프로모터의 제어하에 바나제를 인인코딩하는 유전자는 라운드업®(Roundup®)저항성 유전자가 GST에 연결되도록 만들어진 핵산 구성(GST). 순수한(즉, 야생형) 잔디 유전자는 합성 트랜스제닉 식물이 트랜스진 복합체에 대해 반접합체이도록 3 인자(옥수수 꽃가루특정 프로모터, 바나제유전자, 라운드업®저항성 유전자)를 포함한 트랜스진 복합체로 형질전환된다.
트랜스제닉 식물은 트랜스진 복합체에 대해 또한 반접합체인 자손(progeny) 식물을 산출하기 위해 무성으로 증식된다. 비록 모든 식물이 라운드업®치료에 대해 저항성이 있지만, 생육할 수 있는 트랜스제닉 어떤 꽃가루도 생산되지 않기 때문에 교차수분(cross-pollination)을 통해 라운드업®저항성 유전은 제거된다.
상기 GST 구조은 웅성식물(male)-특이이므로, 반접합체 트랜스제닉 계통은 야생형 꽃가루에 대해 교배함으로써 유지될 수 있다. 트랜스진 제거가 필요하다면(예를 들면, 분산된 전위에 대한 선택에서), 상기 반접합체 트랜스제닉 계통은 웅성식물(꽃가루 제공자)으로서 이용되고 야생형 자성식물에 대해 교배된다. 이러한 예에서, 단지 비-트랜스제닉 꽃가루 또는 분산된 전위를 포함한 꽃가루가 증식될 수 있다. 트랜스진의 원치않는 꽃가루 전달을 제거하기 위해(예를 들면, 잔디에서의 제초제 저항성), 반접합체 트랜스제닉 계통이 이식될 수 있고 단지 야생형 꽃가루만이 생존할 것이다.
자주개자리(Alfalfa)
벼로부터의 꽃가루-특이 프로모터의 제어하에 바나제를 인인코딩하는 유전자는 Bt 유전자가 GST에 연결되어지게 만드는 핵산 구성(GST). 동정(즉, 야생형) 자주개자리 유전자는 합성 트랜스제닉 식물이 트랜스진 복합물에 대해 반접합체이도록 3 인자(벼 꽃가루특정 프로모터, 바나제유전자, Bt 유전자)를 포함한 트랜스진 복합체로 변환된다.
반접합체 트랜스제닉 식물은 트랜스진 복합체에 대해 또한 반집합성 자손(progeny) 식물을 산출하기 위해 무성으로 증식된다. 비록 상기 식물이 어떤 레피도프테란(lepidopteran) 곤충 페스트에 저항성/내약성이 있지만, 생존가능한 트랜스제닉 어떤 꽃가루가 생성되지 않기 때문에 교배 수분을 통해 상기 Bt 유전자의 전달이 제거된다.
형질전환된 옥수수(corn).
옥수수의 경우, GST/트랜스진 복합체는 옥수수 유전자에 삽입되고 "자성식물" 모체가 상기 트랜스진 복합체를 운반한다. 야생형 꽃가루로의 혼성화에 대해, (기능적 유전학적 응용에 대한 문제가 아니라) 단지 자손 잡종 종자의 1/2만이 트랜스진 복합체를 운반할 것이다. 이러한 제한은 상기 GST 형질이 잡종이 생성될 때까지 비활성적이고 동종접합으로 있는 flp 또는 lox 재조합효소(recombinase) 시스템을 이용함으로써 우회된다. 이점에서, frt-또는 cre-중개 재조합은 1/2 대신 모든 잡종자손에 있는 상기 GST 형질(예를 들면, 전사(transcription)를 위해 DNA 블록을 제거함으로써 또는 전사를 활성화 시킴으로써)을 활성화한다. 활성화된 GST를 포함한 이들 트랜스진 복합체는 상기 트랜스진 복합체를 물려받은 어떠한 꽃가루로부터 제거된다(예를 들면, 감수분열 산물의 50%).
예 3. 분산된 전위의 증가
물리적으로 불임형질을 트랜스포손 개시부위 및/또는 유전자전위효소 공급원에 연결시킴으로써, "유전자 불임필터(gentic sterility filter)"는 화학제품을 이용하지 않고 연결된 전위 및/또는 유전자전위효소 공급원를 포함한 자손에 반하여 선택할 필요없이 분산된 전위 및/또는 안정된 전위을 증가시키는데 사용된다.
예를 들어, 50% 꽃가루 불임이 달성된다면, 나머지 생존가능한 반수체 유전자는 정상 상동염색체 분리 때문에 상기 트랜스포손 개시부위 및/또는 유전자전위효소 유전자와 같은, 조합과 감수분열 재조합에 무관한 자살유전자와 이에 연관된 인자를 물려받지 않는다. 이들 생존가능한 유전자 비율은 새롭게 전위유전단위를포함하며, 특히 이들 인자는 개시부위 및 이와 연관된 자살유전자로부터 무관하게 조합되거나 재조합된다. 그러므로, "유전자 불임필터"는 개시부위에 연결된채 유지되어 있는 전위유전단위를 포함한 생식세포(gametes) 및/또는 유전자전위효소 유전자를 포함한 생식세포를 제거한다.
만일 나머지 생존가능한 꽃가루가 밑씨(ovules)를 멸균하는데 이용된다면, 제어된 수분작용에 의해서나 풍매(風媒)에 의해서, 일부 합성 자손은 전위유전단위를 포함할 것이다. 이들 자손은 글리포세이트(라운드업®)(glyphosate(Roundup®)) 저항성을 인인코딩한(맬릭, 제이.등(Malik,J. 등)(1994) Mol Gen Genet Vol.:243/2:178-84) 피튜니아(petunia), 애기장대arabidopsis), 또는 아그로박테륨(Agrobacterium) CP4 EPSPS 유전자(Pedgette,S.R 등.)(1987) Arch Biochem Biophys Vol. 258/2:564-73;(Klee, H.J 등.)1987 Mol Gen Genet Vol. 210/3:437-42;(Hoef,A. 등.)(1998) Food Addit Contam Vol. 15/7:767-74; (Harrison, L.A., 등.)(1996) J Nutr Vol.126/3:728-40); 또는 포스피노트리씬(피날레®) (phosphinothricin(Finlae®))과, 몇 가지 명에 대한 저항성을 인인코딩한, 애기장대 다수 제초제-저항성 유전자, csr1-4((Mourad, G. 등.)(1994) Mol Gen Genet Vol.:243/2:178-84), 또는 스트렙토미케스(Streptomyces)로부터의 바 유전자(Thompson, C.J 등.)(1986) EMBO J. Vol.6:2519-2523)와 같은 술포닐우레아(sulfonylurea) 제초제에 대한 저항성(휘트콤브 씨.이. (Whitcomb, C.E.)(1999) Toxicol Ind Health Vol. 15/1-2:231-9)을 인코딩한 다양한 아세토락테이트(acetolactate) 합성효소(ALS) 유전자와 같이 전위유전단위 내부의 선택가능하거나 차단가능한 마커의 포함으로 인해 용이하게 동정된다.
Ac와 같은 자율적 인자의 전달의 경우, 분산 전위된 Ac 인자를 포함한 자손은 Ds 유도된 리포터 유전자의 트랜스액티베이션(transactivation)과 같은 고전적인 유전학적 수단에 의해 동정된다. 본 발명의 일 실시예에서, 전위유전단위는 전위유전단위를 포함한 생존가능한 꽃가루만을 허락하는 꽃가루 생존 유전자로 구성됨으로써, 화학적 선택 또는 차단의 필요성을 완전히 제거한다.
만일 GST 복합체가 전위가능한 인자를 부가적으로 포함한다면, 전위빈도(연결된 부위 및 연결되지 않은 부위 모두)는 유전자전위효소와 다른 요인의 공급원에 따라 높아질 수 있다. 5%의 전위빈도를 가정한다면, 그 중 70%는 연결되고 30%는 연결되지 않으며 (GST 염색체를 갖는 전위유전단위의 불규칙한 독립적 조합)이들 중 15%는 자손에서 복구될 것이며 전위가능한 인자에 포함된 제초제 저항성에 의해 용이하게 동정될 것이다. 만일 우리가 100,000개의 독립 삽입물을 복구하려고 한다면, 필요한 종자 수에 대한 개산은 (100,000×2/3)/0.05=13,333,333 F1 종자가 요구된다. 이들은 3년이내에 발아되고 선별(개별 식물로서 회복)될 수 있다.
예 4. 안정하게 분산된 전위의 증가
본 발명의 또 다른 실시예는 트랜스진 복합체에서 전위유전단위 개시부위과 자살 유전자이외에도 유전자전위효소 공급원와 같은 다른 유전자 포함에 대한 것이다. 이 실시예에서, "유전자 불임필터"는 자손에게로 유전자전위효소 공급원의 전달을 또한 제거한 한편 분산된 인자를 풍부하게 한다.
전위유전단위 도너부위와 유전자전위효소 유전자의 동시 제거는 안정화된(즉, 유전자전위효소 유전자의 손실에 기인하여 더이상 전위하지 않는) 전위유전단위의 유전에 잇점을 더함으로써 부가적인 전위(제 2 전위)의 발생을 방지한다.
본 발명의 다른 실시예는 분리 트랜스진 복합체에서 유전자전위효소 공급원와 전위유전단위 개시부위의 위치지정을 포함한다. 예를 들면, 상기 개시부위 및 유전자전위효소 공급원는 분산된 전위에 대해 동일한 풍부함을 달성하기 위해 분리 인자상의 한 유전자에 함께 발생할 수 있다. 더욱이, 국소화된 전위가 필요한 경우, 즉, 특정 염색체 지역을 삽입물로 포화시키거나 인접한 대상 유전자에 삽입물을 복구하기 위해, 상기 유전자전위효소 공급원는 연결된 전위를 필수적으로 제거하지 않고도 불임필터방법에 의해 제거된다.
예 5. 벼- 식물시스템 모델
A. 벼 형질전환
벼 트랜스제닉스(transgenics)는 고효율 트랜스제닉 산물을 허용하는 24웰 마이크로티터(microtiter)에 기초한 방법을 이용하여 생성된다. 상기 방법은 간행된 프로토콜(Heiei, Y. 등.)(1994) Plant J. 6:271-82; Heiei, Y 등(1997) Plant Molec Bio. 35:205-218; (Zhang, J. 등)(1997) Mol Biotechnol. 8:223-31)의 응용이며 스쿠텔라 캘러스(scutellar callus) 유도, 아그로박테륨 공동배양, 티멘틴(Timentin) 치료, 및 싹 재생(shoot regeneration)으로부터 트랜스제닉의 생산을 허용하는 완전한 액체배양과 형질전환방식을 포함한다. 이러한 시스템은 매달 ca. 50-100개의 독립 트랜스제닉 계통을 생성하는데 사용된다.
각 트랜스제닉 계통으로부터 조직샘플이 수집되고, DNAs는 단일 복사 T-DNA삽입물(SCTLs)을 포함한 계통을 동정하기 위해 서든(Southern)으로 추출되고 분석된다. SCTLs로부터의 싹은 당해기술분야의 당업자에게 공지된 방법에 따라 토양에 미소증식되고, 뿌리내려 이식된다.
B. 유전적 방법
넓은 범위에 걸친, 큰용량의 교배 프로그램이 줄기, 종자 및 전위유전단위 계통의 발생을 위해 CIAT에 사용가능하다. 전형적으로, 약 1000개의 제어된(수동) 교배가 단일교배, 이중교배, 톱교배(top crosses) 및 역교배(back crosses)를 포함한 각 주기로 이루어진다. 획득된 F1 종자의 수는 교배형태 및 육종 목적에 따른다.
교배는 승인된 생물학적 안정성(Biosafety)의 스크린하우스 조건(screenhouse condition)하에 일년내내 이루어질 수 있다. 7에서 10일 간격으로 3 모체체의 플랜팅(planting)은 동시 개화를 보장하기 위해 만들어진다. 모체는 웅성불임 자성식물계통을 사용한다면 혼성화 블록에서 큰 화분에 또는 들판에 재배되어 진다.
인공수분(hand pollination)에 대해, 교배방법은 모체체 식물의 선택과 원추화서(panicle)의 제거(emasculation)(모체에 대한 꽃밥의 제거), 글라신(glassine)봉투로 제거된 작은꽃(florets)의 덮음, 모체체로부터 수집된 꽃가루로 모체의 수분작용, 글라신 봉투로 수분된 원추화서의 덮음과 모체, 날짜, 및 교배한 사람의 이름에 대한 관련 정보를 포함한 교배 태그(tag)로 교배에 사용된 원추화서의 동정이다. 벼의 혼성화 대한 상세 정보에 대해, 예를 들면, 코프만 더블유. 알.과 알.엠. 헬레라(Coffman, W.R. and R.M. Herrera(1980) Rice,In: Hybridization of Crop Plants),(W.R. Fehr and H.H. Hadley, 편집자, 36장, 511-522, American Society of Agronomists.)를 참조하라.
선택된 F1 및 T1 식물은 F2 종자를 생산하기 위해 각각 수확된다. 수분후 약 25일에 잡종종자가 수확되고 타작되어 세척되며 동전봉투에 담아진다. 이러한 종자는 낮은 습도 및 온도하에 저장된다. T1 종자는 플래트(flat)에 재배되고 발아후 25일과 35일에 0.05%의 쌍잎 도포제 피날레®에 의해 제초제 저항성에 대해 선택된다.
C. 샘플 추적
상관적인, 바코드 샘플 추적 데이터베이스는 워크플로우를 통해 식물, 종자, 및 DNA 샘플을 추적하는데 이용될 수 있다. 생성된 각 트랜스제닉은 독특한(문자숫자식의) 식별자(identifier)가 할당되어 있다. 트랜스제닉으로부터 파생된 줄기 식물은 이러한 식별자와 제 2의 독특한 줄기 식별자를 운반한다. 생산 배양실에 들어간 모든 줄기는 트랜스제닉/줄기 식별자를 운반하고 각 줄기로부터 파생된 검정교배 종자는 각 교배에 대해 독특한 식별자를 할당받는다(T1 종자 품목번호).
피날레®선택후, 각 저항성 식물은 독특한 계통 식별자를 할당받는다. 이 정보는 2개의 절취선이 있어 떼어낼 수 있는 라벨로 식물 라벨상에 코드된다; 각각 라벨은 동일한 문자숫자의 식별자와 연관된 바코드를 포함한다. 한 떼어낼 수 있는 라벨은 조직 샘플에 붙여지고 나머지는 식물에 남아 있어 결국 종자 패키지에 고정된다. 소형 바코드 판독기는 조직 샘플을 DNA 추출 열을 통해 샘플을 추적하는 데이터베이스에 기록하고 최종적으로 PCR 증폭 및 DNA 서열분석에 이용되는 384-마이크로티터 플레이트의 위치에 기록한다.
D. 고효율 DNA 분리 및 규격화
조직 샘플은 DNA 추출전에 동결건조된다. 플라스틱 가방에 쌓기위해 동결건조된 조직은 건조제로 밀봉된다. 조직은 상업용 10gal 페인트 세이커(paint shaker)(플루이드 다이나믹스사, Fluide Dynamics, Inc)에 재빨리 96-384관을 흔듬으로써 지르코늄 실리카 비드(zirconium silica bead)(에이티지씨사, ATGC, Inc.)에 놓여진다.
상기 DNA는 이전 간행된 방법(Galbiati, M. 등.)(2000) Functional & Integrative Genomics, in press)으로부터 채택된 고효율, 평행 병렬방법을 이용하여 추출되고 정화된 DNA는 96포맷 마이크로티터 플레이트에 저장된다. DNA 농도는 스펙트로플루오르 플레이트(Spectrofluor plate)와 제네시스 로보틱스 워크스테이션(Genesis robotics workstation)(테칸사, Tecan,Inc.)을 이용하여 피코그린 방법(Pecogreen Method)에 의해 로봇을 이용하여 측정된다.
PCR 분석을 위한 제 2 워킹 플레이트(waliking plate)를 만들기 위해, DNA는 고정된 양의 DNA를 적절한 양의 완충용액과 함께 각 웰로부터 기계적으로 제거함로써 제 2 마이크로티터 플레이트에 규격화된다. 이들 규격화된 워킹 플레이트의 모녀 복제는 기계적으로 만들어지며 샘플은 증폭과 염기서열분석을 위해 쌓여진다.
조직 추출로부터 규격화까지 사본을 포함한 이러한 전체 공정의 용이성은 옥수수와 애기장대 둘다에 가능하다.
E. 트랜스포손 계통의 선택
트랜스포손 계통의 선택은 단일 복사 계통(SCLs)의 복구, 크기확대, 샘플 추적, 생산 상(phase)에 의해 잇따른 공정 및 쌓음을 위한 트랜스제닉 산물과 유전학적 검사를 포함한다. 아그고박테륨 접종물 및 주요 벼 트랜스제닉 둘 다에서 T-DNA의 DNA 지문을 포함한 방법과 아그로박테륨 매개의 형질변환 프로토콜과 벼 재생산, 미소증식 및 토양이식 방법이 이용될 수 있다.
조직은 단일 복사 T-DNA 계통(SCLs)을 동정하기 위해 각 트랜스제닉 계통으로부터 수집되며 DNA는 추출되고 서든 분석에 의해 분석된다. 모든 SCLs는 싹 조직에 유지되고 미소증식을 위해 쌓아진다. 뿌리가 내린 작은식물(rooted plantlets)은 토양에 이식되고 전위비율에 대해 테스트된다.
F. 줄기 생산
전위빈도에 대한 유전학적 데이터는 연속적인 줄기 생산을 위한 최상의 트랜스제닉 계통에 대해 선택하는데 사용된다. 뿌리가 내린 싹은 토양에 이식되고 생산 배양실에서 웅성 식물의 수를 증가시키기 위해 단순히 나눔으로써 더 증식된다.
일 실시예로, 만일 전위가 수술성장에 제한적이다면, 줄기 증식의 상호 배타적인 방법이 아닌 다른 방안으로서 야생형 꽃가루를 자성 트랜스제닉 식물에 교배하는 것이며, T-DNA 제거 및 전위는 이러한 방향으로 발생하지 않는다. 그러므로, 이러한 종자는 새로운 전위 선택을 위해 추가적인 줄기를 생산하기 위해 각 계절마다 단순히 재이식된다.
벼 변종 니폰베어(Nipponbare)에 대한 개화시간은 적도에서 또는 근처에서일때 60일이다. 적도위치를 이용함으로써 매년 4모작 생산이 이루어질 수 있다. 멕시코의 칼리(Calli)에서 단축된 생산시간 및 일정한 1년 내내 재배조건은 벼 유전특징을 거의 애기장대 만큼 능률적이게 한다.
G. 기초종자생산
본 발명의 일 실시예에서, 목적은 단일의 분산된 전위를 위해 선택하는 것과, 반접합체 조건에서 이들 삽입물을 복구하는 것이다. 이는 비치명적이고, 열성 치명적(recessive lethal)인 암꽃 불충분 돌연변이(haplo-insufficient mutations)의 복구를 가능하게한다.
T1 종자를 생산하기 위해, 줄기식물은 배양실에서 웅성식물과 웅성 불임의 암꽃으로 교배된다. 벼에서 능률적인 이계교배(outcrossing)는 웅성식물과 웅성 불임의 암꽃에 의해 달성될 수 있다. 니폰베어에서 웅성 불임은 현재 이용가능하지 않으므로 핵(nuclear) 웅성 불임(ms) 변이가 배양실에서 벼(O. sativa ssp. indica.) 균주로부터 니폰베어로 유전자침투된다. 유전자침투(introgression) 공정은 ms 변이와 니폰베어 마커에 대한 보조지표 맵핑과 생육 및 역교배 자손 선택에 의해 크게 가속된다.
상기 ms 좌위는 이전의 특징적인 단순 서열반복(SSR) 마커를 이용하여 먼저 지도로 나타낸다((McCouch, S.R. 등)(1997) Plant Mol Biol. 35:89-99; Panaud, O.,등.(1996) Mol Gen Genet. 252:597-607). 7000SSR 서열은 몬산토(Monsanto) 대략적인 초안(www.rece-research.org)으로부터 이용가능하다. 연결된 SSRs는 유전자침투동안 ms 대립형질에 뒤이어 일어나게하는데 사용되는 반면, 유전자를 전체를통한 연결되지 않은 SSRs는 기증자 생식질(germplasm)에 대항해서 선택하기 위해 사용된다.
2개의 역교배 및 1개의 자가수분은 상기 ms 대립형질을 상기 니폰베어 바탕으로 전이하기에 충분해야 한다. F1교배가 이루어지고 F2 자손이 발생된다. 상기 유전자침투된 ms 계통은 T1 종자 생산에 이용가능하게 만들어진다. ms 표현형을 위한 1:1 계통 분리는 배양실에서 이용되고, SSR분석에 의해 유전자형이 분석되며, 웅성 불임 식물이 추려진다. 전이인자 줄기는 Ds 계통 선택을 위해 T1 종자를 생성하기 위해 ms/ms 자성 식물에 혼성된다.
H. 트랜스포손 계통 선택
T1 종자는 플래트에 심어지고 25일 묘목은 10-15일 후 2차 치료에 잇따라 0.05%의 피날레®의 잎 도포제에 의해 선택된다. 피날레®저항식물은 바코드되어지고 배양실로 이식되어 T2 종자가 생성되도록 자가수분하게 된다.
각 식물로부터의 조직샘플(ca. 1-2그램 입조직)은 수집되고, 바코드된 관에 위치되며 DNA 추출을 위해 동결건조되어 준비된다.
각 계통으로부터의 T2 종자는 수집되고, 타작되어, 바코드된 봉투에 넣어지고 저장 또는 대중유통을 위해 준비된다.
본 발명은 구체적인 실시예를 참조하여 기술되고 있으나, 본 발명의 다른 실시예 및 형질전환이 본 발명의 진정한 취지 및 범위에 벗어남이 없이 당해기술분야의 당업자에 의해 고안될 수 있다는 것은 명백하다. 첨부된 청구의 범위는 모든 이러한 실시예 및 균등한 형질전환을 포함하도록 의도되어 있다.
내용중에 포함되어 있음.

Claims (56)

  1. 자살 유전자와 작동하도록 연관된 웅성 배우자 또는 자성 배우자-특이 프로모터를 포함하는 핵산구조로서, 상기 프로모터 및 상기 자살 유전자 조합이 대상 유전자와 연관되어진 핵산구조.
  2. 바나제(barnase), 수꽃대종자2 및 디프테리아 독소 A 유전자로 이루어진 그룹으로부터 선택된 자살 유전자와 작동하도록 연관된 꽃가루-특이 프로모터 또는 밑씨-특이 프로모터를 포함하는 핵산구조로서, 상기 프로모터 및 상기 자살 유전자 조합이 제초제 저항성, 항생물질 저항성, 살충제 저항성, 질소고정, 개선된 영양 및 셀룰로오스 성분을 코딩하는 유전자로 이루어진 그룹으로부터 선택된 대상 유전자와 또는 대상 작물 형질과 연관된 핵산구조.
  3. 제 1 항에 있어서,
    상기 프로모터가 꽃가루-특이 프로모터 및 밑씨-특이 프로모터로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 핵산구조.
  4. 제 1 항에 있어서,
    상기 자살 유전자가 바나제(barnase), 수꽃대종자2 및 디프테리아 독소 A 유전자로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 핵산구조.
  5. 제 1 항에 있어서,
    상기 대상의 유전자가 제초제 저항성, 항생물질 저항성, 살충제 저항성, 질소고정, 개선된 영양 및 셀룰로오스 성분을 인코딩하는 핵산으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 핵산구조.
  6. 제 1 항의 핵산구조를 포함하는 벡터.
  7. 제 2 항의 핵산구조를 포함하는 벡터.
  8. 제 6 항의 벡터를 포함하는 숙주세포.
  9. 제 7 항의 벡터를 포함하는 숙주세포.
  10. 제 6 항 또는 제 7 항의 벡터를 포함하는 재조합 식물세포.
  11. 제 6 항 또는 제 7 항의 벡터를 포함하는 트랜스제닉 식물.
  12. 제 11 항에 있어서,
    트랜스제닉 식물이 핵산 구조를 위한 반접합체인 트랜스제닉 식물.
  13. a)웅성 배우자-특이 프로모터가 자살 유전자와 작동하도록 연관되고 상기 프로모터 및 상기 자살 유전자 조합이 이형 폴리뉴클레오티드와 연관되어 있는 핵산구조를 갖는 식물세포를 형질전환시키는 단계; 및
    b)상기 트랜스진 좌위가 결여된 웅성 배우자를 생산하기 위해서 상기 형질전환 식물세포를 감수분열을 통해 증식시키는 단계를 포함하는 식물에서 트랜스진 좌위의 웅성 유전을 감소시키거나 제거하는 방법.
  14. a)꽃가루-특이 프로모터가 자살 유전자와 작동하도록 연관되고 ⅰ)상기 자살 유전자는 바나제, 수꽃대종자2 및 디프테리아 독소 A 유전자로 이루어진 그룹으로부터 선택되며; ⅱ)상기 프로모터 및 상기 자살 유전자 조합은 이형 폴리뉴클레오티드와 연관되어지고; ⅲ)상기 이형 폴리뉴클레오티드가 제초제 저항성, 항생물질 저항성, 살충제 저항성, 질소고정, 개선된 영양 및 셀룰로오스 성분을 인코딩하는 DNA로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 핵산구조를 갖는 식물세포를 형질전환시키는 단계; 및
    b)상기 트랜스진 좌위가 결여된 웅성 배우자를 생산하기 위해 상기 형질전환 식물세포를 감수분열을 통해 증식시키는 단계를 포함하는 식물에서 트랜스진 좌위의 웅성 유전을 감소시키거나 제거하는 방법.
  15. a)자성 배우자-특이 프로모터가 자살 유전자와 작동하도록 연관되고 상기 프로모터 및 상기 자살 유전자 조합은 이형 뉴클레오티드와 연관된 핵산구조를 갖는 식물을 형질전환시키는 단계; 및
    b) 상기 트랜스진 좌위가 결여된 자성 배우자를 생산하기 위해 상기 형질전환 식물세포를 감수분열을 통해 증식시키는 단계를 포함하는 식물에서 트랜스진 좌위의 자성 유전을 감소시키거나 제거하는 방법.
  16. a)밑씨-특이 프로모터가 자살 유전자와 작동하도록 연관되고 ⅰ)상기 자살 유전자는 바나제, 수꽃대종자2 및 디프테리아 독소 A 유전자로 이루어진 그룹으로부터 선택되며; ⅱ)상기 프로모터 및 상기 자살 유전자 조합은 이형 폴리뉴클레오티드와 연관되어지고; ⅲ)상기 이형 폴리뉴클레오티드가 제초제 저항성, 항생물질 저항성, 살충제 저항성, 질소고정, 개선된 영양 및 셀룰로오스 성분을 인코딩하는 DNA로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 핵산구조를 갖는 식물세포를 형질전환시키는 단계; 및
    b)상기 트랜스진 좌위가 결여된 자성 배우자를 생산하기 위해 상기 형질전환 식물세포를 감수분열을 통해 증식시키는 단계를 포함하는 식물 에서 트랜스진 좌위의 자성 유전을 감소시키거나 제거하는 방법.
  17. 제 13 내지 제 16항 중 어느 한 항에 있어서,
    형질전환된 식물세포가 핵산구조를 위한 반접합체인 형질전환된 식물세포.
  18. 자살 유전자와 작동하도록 연관된 웅성 배우자 또는 자성 배우자-특이 프로모터를 포함하는 핵산구조로서, 상기 프로모터와 상기 자살 유전자 조합이 전위유전단위에 연관된 핵산구조.
  19. 제 18 항에 있어서,
    유전자전위효소 유전자를 더 포함하는 핵산구조.
  20. 제 18 항 또는 제 19 항에 있어서,
    대상의 유전자를 더 포함하는 핵산구조.
  21. 제 20 항에 있어서,
    상기 대상의 유전자가 전위유전단위와 결합된 핵산구조.
  22. 꽃가루-특이 프로모터 또는 밑씨-특이 프로모터가 바나제, 꽃가루종자2 및 디프테리아 독소 A 유전자로 이루어진 그룹으로부터 선택된 자살 유전자와 작동하도록 연관된 핵산구조로서, 상기 프로모터 및 상기 자살 유전자 조합은 트랜스포손과 연관되고, 상기 트랜스포손은 제초제 저항성, 항생물질 저항성, 살충제 저항성, 질소고정, 개선된 영양 및 셀룰로오스 성분을 인코딩하는 유전자로 이루어진 그룹으로부터 선택된 선택마커를 포함하는 핵산구조.
  23. 제 22 항에 있어서,
    상기 프로모터가 꽃가루-특이 프로모터 및 밑씨-특이 프로모터로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 핵산구조.
  24. 제 22 항에 있어서,
    상기 자살 유전자가 바나제, 수꽃대종자2 및 디프테리아 독소 A 유전자로부터 선택되는 핵산구조.
  25. 제 18 항의 핵산구조를 포함하는 벡터.
  26. 제 22 항의 핵산구조를 포함하는 벡터.
  27. 제 18 항의 벡터를 포함하는 숙주세포.
  28. 제 22 항의 벡터를 포함하는 숙주세포.
  29. 제 18 항 또는 제 22 항의 벡터를 포함하는 재조합 식물세포.
  30. 제 29 항에 있어서,
    재조합 식물세포가 핵산구조를 위한 반접합체인 재조합 식물세포.
  31. 제 18 항 또는 제 22 항의 벡터를 포함하는 트랜스제닉 식물.
  32. 제 31 항에 있어서,
    재조합식물세포가 핵산구조를 위한 반접합체인 트랜스제닉 식물.
  33. a)형질전환 식물세포를 생산하기 위해서 제 18 항 내지 24 중 어느 한 항의 핵산구조를 갖는 식물세포를 형질전환시키는 단계;
    b)분산된 전위가 증가된 식물세포 자손을 생산하기 위해서 상기 형질전환 식물세포를 감수분열을 통해서 증식시키는 단계를 포함하는 식물세포 자손의 개체군에서 분산된 전위를 증가시키는 방법.
  34. 제 33 항에 있어서,
    c)분산된 전위가 증가된 상기 식물세포 자손을 분리하는 단계를 더 포함하는 방법.
  35. 제 34 항의 방법에 의해 분리된 식물세포.
  36. 제 35 항의 식물세포로부터 생산된 식물
  37. 제 33 내지 제 35항 중 어느 한 항에 있어서,
    식물세포가 핵산구조를 위한 반접합체인 식물세포.
  38. 자살 유전자와 작동하도록 연관된 웅성 배우자 또는 자성 배우자-특이 프로모터인 제 1 프로모터를 포함하고 유전자전위효소를 인코딩하는 핵산 및 트랜스포손을 인코딩하는 핵산을 더 포함하는 핵산구조.
  39. 제 38 항에 있어서,
    트랜스포손이 자살 유전자가 아닌 선택 마커와 작동하도록 연관된 제 2 프로모터를 포함하는 핵산구조.
  40. 꽃가루-특이 프로모터 및 밑씨-특이 프로모터가 바나제, 수꽃대종자2 및 디프테리아 독소 A 유전자로 이루어진 그룹으로부터 선택된 자살 유전자와 작동하도록 연관되는 핵산구조로서, 상기 프로모터 및 상기 자살 유전자 조합은 유전자전위효소를 인코딩하는 핵산과 연관되어지고; 상기 프로모터 및 상기 자살 유전자 조합은 트랜스포손을 더 포함하는 트랜스진 좌위를 포함하는 유전자전위효소를 인코딩하는 핵산과 연관되고; 상기 트랜스포손은 제초제 저항성, 항생물질 저항성, 살충제 저항성, 질소고정, 개선된 영양 및 셀룰로오스 성분으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 하나를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열를 포함하는 핵산구조.
  41. 제 40 항에 있어서,
    상기 프로모터가 꽃가루-특이 프로모터 및 밑씨-특이 프로모터로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 핵산구조.
  42. 제 40 항에 있어서,
    상기 자살 유전자가 바나제, 수꽃대종자2 및 디프테리아 독소 A 유전자로 이루어지는 그룹으로부터 선택되는 핵산구조.
  43. 제 40 항에 있어서,
    상기 트랜스포손이 제초제 저항성, 항생물질 저항성, 살충제 저항성, 질소고정, 개선된 영양 및 셀룰로오스 성분으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 하나를 인코딩하는 폴리뉴클리오티드 서열을 포함하는 핵산구조.
  44. 제 38 항의 핵산구조를 포함하는 벡터.
  45. 제 40 항의 핵산구조를 포함하는 벡터.
  46. 제 44 항의 벡터를 포함하는 숙주세포.
  47. 제 45 항의 벡터를 포함하는 숙주세포.
  48. 제 46 항 또는 제 47 항에 있어서, 핵산구조가 반접합체인 숙주세포.
  49. 제 44 항 또는 제 45 항의 벡터를 포함하는 재조합 식물세포.
  50. 제 49 항에 있어서,
    핵산구조가 반접합체인 재조합 식물세포.
  51. 제 44 항 또는 제 45 항의 벡터를 포함하는 트랜스제닉 식물.
  52. 제 51 항에 있어서,
    핵산이 반접합체인 트랜스제닉 식물.
  53. a)형질전환 식물세포를 생산하기 위해서 제 38 항 내지 제 43 항 중 어느 한 항의 핵산구조를 갖는 식물세포를 형질전환시키는 단계; 및
    b)안정하게 분산된 전위가 증가되는 식물세포 자손을 생산하기 위해서 감수분열을 통해 상기 형질전환형질전환세포를 증식시키는 단계를 포함하는 식물세포 자손의 개체군에서 안정하게 분산된 전위를 증가시키는 방법.
  54. 제 53 항에 있어서,
    c)안정하게 분산된 전위가 증가되는 상기 식물세포 자손을 분리하는 단계를 더 포함하는 방법.
  55. 제 54 항의 방법에 의해 분리된 식물세포.
  56. 제 55 항의 식물세포로부터 생산된 식물.
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