CN1426475A - 减少或消除转基因传播的方法和组合物 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了用于在进行减数分裂且其中花粉或精子可异型杂交的转基因真核生物中生产，维持和控制转基因的遗传构建体和方法；该转基因生物包括：转基因动物，植物细胞，植物组织和整株植物。更具体的说，本发明涉及使用配子体不育性状(GST)通过雄性和/或雌性配子或配子体控制转基因传播。本发明的遗传构建体和方法学提供了控制转基因不希望的传播的能力。另外，本发明还提供了富集分散的和/或稳定的转座事件的植物或其它真核生物基因组的工具和方法学。

Description

减少或消除转基因传播的方法和组合物
相关申请的互相参考
本申请要求2000年2月28日申请的临时申请60/185,524的优先权，特此以其整体引用该申请以供参考。
对联邦政府赞助研究作出的发明的权利声明
本发明部分以批准号NIH GM R01 GM38148和NSF 61-2558的政府支持作出。
发明领域
本发明一般涉及在进行减数分裂且其中花粉或精子可异型杂交的转基因真核生物中转基因的生产，维持和控制；该生物包括：转基因动物，植物细胞，植物组织和整株植物。更具体的说，本发明涉及通过雄性和/或雌性配子或配子体控制转基因传播。本发明的遗传构建体和方法学提供了控制转基因不希望的传播的能力。另外，本发明还提供了富集分散的和/或稳定的转座事件的植物基因组或任何其它真核生物基因组的工具和方法学。
发明背景
所有出版物和专利申请在此作为参考文献引用，其程度相同于各单独的出版物或专利申请作为参考文献引用时具体和单独所示的程度。
转基因农作物和生物技术的应用显著改变着全世界的种子和农用化学品贸易。商业上重要的农作物的种子已被遗传改造成对除草剂和害虫，特别是昆虫害虫有抗性。根据美国农业部的调查(2000年6月)，2000年遗传改良的玉米，大豆和棉花分别在大约25％，54％和61％的各农作物的总美国田地上生长。
在商业上重要的农作物植物中异源性性状的自由传播是目前全世界且特别是农业社会内的主要忧虑。转基因花粉不希望的散播无意中伤害了有益的昆虫且可能导致转基因传播到亲缘植物种类中引起食品污染和产生除草剂及杀虫剂抗性的杂草种类。
生物技术工业的兴趣在于将诸如对干旱，昆虫，疾病，盐度，霜冻和除草剂的耐受性的性状转移进栽培植物中，它可赋予优于野生型植物的适应优势。已知一些农作物种类与野生型种类具有杂交亲和性且很可能这些性状会通过有性杂交无意中转移到野生杂草近亲中，导致可能的经济和生态学危害。由于大多数饲料和草皮草类进行了相对较小的驯化且在某些情况下甚至可认为是杂草(例如，百慕大草(bermudagrass))，这种遗传转化的植物的最终释放和使用存在较大问题的可能性很高。一般来说，由于饲料草类不是高度驯化的，具有杂草特性，且具有高度异型杂交力，在转基因饲料草类的最终释放中可能遇到具体困难。
在商业上重要的农作物植物中防止异源性状发生不希望的传播的方法将会是非常需要的。如果可以实现这点，异源性状的遗传泄露将得到控制且可消减这些性状向不希望的受体的传播。因此，存在对这样的遗传系统的需要，即它对含有转基因的雄性或雌性配子体进行选择，从而防止，消除或减少异源性状的不希望的传播。具体来说，需要的遗传系统允许非转基因(即，野生型)配子体传播而防止来自相同植物的转基因(即，异源性)配子体传播。
因此，本发明的目的是提供在商业上重要的农作物植物中控制，减少或消除异源性状发生不希望的传播的重组核酸构建体和方法。
发明概述
本发明涉及用于控制植物中异源性状传播的遗传构建体和方法。通过提供对含有自杀基因的雄性或雌性配子进行选择的与自杀基因可操作相连的性别-特异性启动子实现控制。自杀基因座称为“配子体自杀性状”(GST)(图1A)。通过将目的转基因与在性别-特异性启动子控制下的自杀基因相连，有效地消除，减少或防止转基因向后代传播，因为不会产生携带GST的配子。
在一个方面，本发明可以说广义地由与目的转基因连接的在花粉特异性启动子控制下的自杀基因组成。可将转基因复合体导入初始植物基因组中且可选择转基因复合体半合子的植物。只有半合子植物产生的花粉缺乏转基因复合体，因为它与自杀基因物理连锁。由于不产生含有转基因复合体的花粉从而防止了由转基因复合体编码的异源性状的自由传播。
本发明的第二个方面是基于将GST放在紧邻转座子以产生在子代细胞中选择性富集分散转座事件，因为只有那些缺乏GST基因座的配子有活力。由于从活配子产生的子代细胞部分将发生了转座事件，因此实现了分散转座事件的选择性富集，因为转座子必须不再与GST连锁(GST破坏了那些遗传GST基因座的配子)(图1B)。
因此，本发明提供了可用于排除GST转基因复合体和用于选择未连锁的转座的遗传系统。通过使用GST与任意转基因，可完全排除GST与相连的转基因两者的雄性传播(或在雌性配子体特异性启动子：自杀基因构建体的情况下的雌性传播)(图2)。
本发明提供了含有与自杀基因可操作相连的雄性配子或雌性配子特异性启动子的核酸构建体，其中所述启动子和所述自杀基因组合与目的基因相连。
本发明提供了含有与自杀基因可操作相连的雄性配子或雌性配子特异性启动子的核酸构建体，其中启动子和自杀基因的组合与目的基因相连。本发明还提供了这样的核酸构建体，其中启动子选自花粉特异性启动子和胚珠特异性启动子。本发明还提供了这样的核酸构建体，其中自杀基因选自芽孢杆菌RNA酶，雄花穗种子2(tasselseed2)和白喉毒素A基因。本发明也提供了这样的核酸构建体，其中目的基因选自编码除草剂抗性，抗生素抗性，杀虫剂抗性，固氮，改进营养和纤维素含量的核酸。
本发明提供的核酸构建体含有与选自芽孢杆菌RNA酶，雄花穗种子2(tasselseed2)和白喉毒素A基因的自杀基因可操作相连的花粉特异性启动子或胚珠特异性启动子；其中该启动子和自杀基因的组合与选自编码除草剂抗性，抗生素抗性，杀虫剂抗性，固氮，改进营养和纤维素含量或其它感兴趣的农学性状的基因的目的基因相连。
本发明提供了减少或消除植物中转基因座的雄性传播的方法，包括：
a)用雄性配子特异性启动子与自杀基因可操作相连的核酸构建体转化植物细胞，其中所述启动子和所述自杀基因组合与异源多核苷酸相连；
b)繁殖所述转化植物细胞，通过减数分裂产生缺乏所述转基因座的雄性配子。
本发明还提供了减少或消除植物中转基因座的雄性传播的方法，包括：
a)用花粉特异性启动子与自杀基因可操作相连的核酸构建体转化植物细胞；
i)其中所述自杀基因选自芽孢杆菌RNA酶，雄花穗种子2(tasselseed2)和白喉毒素A基因；
ii)其中所述启动子和所述自杀基因组合与异源多核苷酸相连；
iii)其中所述异源多核苷酸选自编码除草剂抗性，抗生素抗性，杀虫剂抗性，固氮，改进营养和纤维素含量的DNA；
b)繁殖所述转化植物细胞，通过减数分裂产生缺乏所述转基因座的雄性配子。
本发明还提供了减少或消除植物中转基因座的雌性传播的方法，包括：
a)用雌性配子特异性启动子与自杀基因可操作相连的核酸构建体转化植物细胞，其中所述启动子和所述自杀基因组合与异源多核苷酸相连；
b)繁殖所述转化植物细胞，通过减数分裂产生缺乏所述转基因座的雌性配子。
本发明还提供了减少或消除植物中转基因座的雌性传播的方法，包括：
a)用胚珠特异性启动子与自杀基因可操作相连的核酸构建体转化植物细胞；
i)其中所述自杀基因选自芽孢杆菌RNA酶，雄花穗种子2(tasselseed2)和白喉毒素A基因；
ii)其中所述启动子和所述自杀基因组合与异源多核苷酸相连；
iii)其中所述异源多核苷酸选自编码除草剂抗性，抗生素抗性，杀虫剂抗性，固氮，改进营养和纤维素含量的DNA；
b)繁殖所述转化植物细胞，通过减数分裂产生缺乏所述转基因座的雌性配子。
本发明还提供了由本发明的方法产生的转化植物细胞，其中转化的植物细胞是核酸构建体半合子。
本发明提供的核酸构建体含有与自杀基因可操作相连的雄性配子或雌性配子特异性启动子，其中所述启动子和所述自杀基因组合与一个转座因子相连。本发明还提供了这样的核酸构建体，它进一步包含一个和多个转座酶基因。本发明还提供了这样的核酸构建体，它进一步包含一个或多个目的基因。本发明还进一步提供了这样的核酸构建体，其中目的基因与转座因子相连。
本发明提供了核酸构建体，其中花粉特异性启动子或胚珠特异性启动子与选自芽孢杆菌RNA酶，雄花穗种子2(tasselseed2)和白喉毒素A基因的自杀基因可操作相连；其中所述启动子和所述自杀基因组合与转座子相连，其中所述转座子含有选自编码除草剂抗性，抗生素抗性，杀虫剂抗性，固氮，改进营养和纤维素含量的基因的选择标记。本发明还提供了这样的核酸构建体，其中启动子选自花粉特异性启动子和胚珠特异性启动子。本发明还提供了这样的核酸构建体，其中自杀基因选自芽孢杆菌RNA酶，雄花穗种子2(tasselseed2)和白喉毒素A基因。
本发明提供了在植物细胞子代群体中富集分散转座事件的方法，包括：
a)用上述核酸构建体的任意一种核酸构建体转化植物细胞以产生转化的植物细胞；
b)繁殖所述转化植物细胞，通过减数分裂产生富集分散转座事件的植物细胞子代。
本发明还提供了这样的方法，它包括分离富集分散转座事件的植物细胞子代的附加步骤。本发明还提供了含有分散转座事件的植物细胞和植物，特别是该植物细胞和植物是该核酸为半合子。
本发明提供的核酸构建体含有第一启动子，其中第一启动子是与自杀基因可操作相连的雄性配子或雌性配子特异性启动子，且还含有编码转座酶的核酸和编码转座子的核酸。本发明还提供了这样的核酸构建体，其中该转座子包含与选择标记可操作连接的第二启动子，其中选择标记不是自杀基因。
本发明提供了核酸构建体，其中花粉特异性启动子或胚珠特异性启动子与选自芽孢杆菌RNA酶，雄花穗种子2(tasselseed2)和白喉毒素A基因的自杀基因可操作相连；其中所述启动子和所述自杀基因组合与编码转座酶的核酸相连，其中与编码转座酶的所述核酸相连的所述启动子和所述自杀基因组合包含一个转基因座，该基因座还包含一个转座子；其中所述转座子含有编码选自除草剂抗性，抗生素抗性，杀虫剂抗性，固氮，改进营养和纤维素含量的一个成员的多核苷酸序列。本发明提供了这样的核酸构建体，其中启动子选自花粉特异性启动子和胚珠特异性启动子。本发明还提供了这样的核酸构建体，其中自杀基因选自芽孢杆菌RNA酶，雄花穗种子2(tasselseed2)和白喉毒素A基因。本发明还提供了这样的核酸构建体，其中该转座子含有编码选自除草剂抗性，抗生素抗性，杀虫剂抗性，固氮，改进营养和纤维素含量的一个成员的多核苷酸序列。
本发明还提供了在植物细胞子代群体中富集稳定分散的转座事件的方法，包括：
a)用本发明的核酸构建体转化植物细胞以产生转化的植物细胞；
b)繁殖所述转化植物细胞，通过减数分裂产生富集稳定分散的转座事件的植物细胞子代。
本发明还提供了这样的方法，它还包括分离富集稳定分散的转座事件的植物细胞子代的步骤。本发明还提供了由该方法分离的植物细胞和由该植物细胞产生的植物。
本发明提供了含有本发明的核酸构建体的载体以及含有本发明的载体的宿主细胞，重组植物细胞和转基因植物。更具体的说，本发明提供了该核酸构建体为半合子的细胞和转基因植物。
通过阅读本文提供的说明书和附图，本发明的其它目的，优点和特征对本领域的技术人员将是显而易见的。
附图的简要描述
结合附图阅读时，将会更好地理解前面的概述以及下面的本发明的详细描述。为了举例说明本发明，在附图中显示了目前优选的实施方案。然而，应理解本发明不限于所示的精确排列和工具。
在附图中：
图1A显示了例证性的GST(配子体不育性状)构建体，其中花粉特异性启动子与自杀基因可操作相连。GST构建体可以与目的基因物理相连以形成转基因复合体。GST构建体用于防止或消除目的基因的传播。
图1B显示了例证性的与转座因子和转座酶源连接的GST构建体。该构建体可用于富集稳定分散的转座子的植物细胞子代群体。
图2显示了从减数分裂产物排除转基因复合体和选择分散型转座的一般化策略。
图3A和3B显示了GST构建体的示意图。
图4A和4B分别显示了pYU904和pYU905构建体的示意图。
图5显示了pYU846转座酶构建体的示意图。
详细描述
除非另有说明，本文使用的所有技术和科学术语与本发明所属领域的普通技术人员通常的理解具有相同的含义。尽管相似于或相当于本文所述任何方法和材料可在本发明的实践或试验中使用，但仍然描述了优选的方法和材料。
从上面所述可预料到本发明的工具和方法可应用于产生配子的所有植物。该植物包括，但不限于，饲料草类，草皮草类，饲料豆类，蔬菜，田间农作物，树和观赏花卉。
定义
本文使用的术语“等位基因”是指一种基因的几种替代形式中的任意一种。
本文使用的术语“农作物植物”是指为任何商业目的而生长的任意植物，包括，但不限于下列目的：种子生产，干草生产，观赏用途，水果生产，浆果生产，蔬菜生产，油类生产，蛋白质生产，饲料生产，动物放牧，高尔夫球场，草坪，花卉生产，风景美化，侵蚀控制，绿色肥料，改良土壤耕作/健康，生产药品/药物，生产食品添加剂，烟草产品，纸浆生产和木材生产。
本文使用的术语“杂交授粉”或“杂交育种”是指将一株植物上的一朵花的花粉施加(人工或自然)到另一株植物花的胚珠(柱头)上的方法。
本文使用的术语“栽培种”是指由园艺或农学技术产生的且正常情况下在野生群体中没有发现的植物变种，株系或品种。
术语“分散的转座事件”是指转座子发生移动使得它不再与转座子送出位点(供体位点)相连(即紧邻)。
术语“雌性”是指产生胚珠的植物。雌性植物一般在受精后产生种子。称为“雌性植物”的植物可含有雄性和雌性性器官。另外，“雌性植物”可天然(例如，雌雄异体种类)或由于去雄(例如，经过去掉雄蕊)而仅含有雌性性器官。
本文使用的术语“子代”是指在特定亲代之后的任何细胞，组织或生物体世代。亲本交配产生的世代是第一子代(称为“F1”和“F1”)，而F1个体杂交产生的世代是第二子代(称为“F2”和“F2”)。
术语“配子”是指生殖细胞，其细胞核(通常和细胞质)与相似来源但性别相反的另一配子的细胞核融合形成合子，该合子具有发育成新个体的潜力。配子是单倍体且分化成雄性和雌性。
术语“基因”是指与生物学功能相关的任意DNA片断。因此，基因包括但不限于编码序列和/或其表达所需的调控序列。基因也可包括不表达的DNA片断，例如形成其它蛋白质的识别序列的DNA片断。基因可从各种来源获得，包括从感兴趣的来源克隆或根据已知的或推测的序列信息合成，且可包括设计成具有所需参数的序列。
本文使用的术语“基因型”是指单个细胞，细胞培养物，组织，植物，或植物群体的遗传组成。
本文使用的术语“半合子”是指与单倍体细胞或生物中的基因，异配性别中的性连锁基因，或二倍体细胞或生物中其配对片断已缺失的染色体片断上的基因一样，基因仅在基因型中存在一次的细胞，组织或生物体。
“异源多核苷酸”或“异源核酸”或“外源性DNA片断”是指从特定宿主细胞之外的来源产生的多核苷酸，核酸或DNA片断，或者，如果来自相同来源，从其原始形式进行了修饰。因此，宿主细胞中的异源基因包括对特定宿主细胞是内源性的但进行了修饰的基因。因此，该术语是指对该细胞是外源的或异源的，或者对该细胞是同源的但在宿主细胞核酸内通常没有发现该元件的位置上的DNA片断。表达外源DNA片断产生外源多肽。
“异源性状”是指由外源性DNA片断，异源多核苷酸或异源核酸赋予转化的宿主细胞或转基因生物的表型。
本文使用的术语“杂合子”是指至少在一个基因座上存在不同等位基因(给定基因的类型)的二倍体或多倍体的个体细胞或植物。
本文使用的术语“杂合的”是指在特定基因座上存在不同的等位基因(给定基因的类型)。
本文使用的术语“纯合子”是指在一个或多个基因座上具有相同等位基因的个体细胞或植物。
本文使用的术语“纯合的”是指在同源染色体片断的一个或多个基因座上存在相同等位基因。
本文使用的术语“杂种”是指一个或多个基因有区别的亲本之间杂交产生的任何个体细胞，组织或植物。
本文使用的术话“近交”或“近交系”是指相对纯种的品系。
本文使用的术语“品系”用于广泛包括，但不限于从单亲植物经过组织培养技术无性繁殖的一群植物或者由于家系来自共同的亲本而在遗传上非常相似的一群近交植物。如果植物是(a)从该品系的材料再生的初级转化体(T0)植物；(b)具有由该品系的T0植物组成的家系；或(c)由于共同的祖先而在遗传上非常相似(例如，经过近交或自交)，那么该植物称为“属于”该特定品系。在这种情况下，术语“家系”表示植物的谱系，例如，对于实行的有性杂交，使得在杂合子(半合子)或纯合子情况下的一种基因或基因组合可赋予该植物所需的性状。
本文所用的术语“基因座”(复数：“多基因座”)是指遗传上限定的任何位点。基因座可以是一个基因，部分基因，或具有某些调控作用且可被不同序列占据的DNA序列。
术语“雄性”是指产生花粉粒的植物。“雄性植物”一般是指产生配子用于受精卵的性别。称为“雄性植物”的植物可含有雄性和雌性性器官。另外，“雄性植物”可天然(例如，在雌雄异体种类中)或由于去雌(例如，经过去掉子房)而仅含有雄性性器官。
本文使用的术语“大量选择”是指选择个体植物且从其种子集合繁殖下一代的选择形式。
本文使用的术语“核酸”或“多核苷酸”是指单链或双链形式的脱氧核苷酸或核糖核苷酸和其聚合物。除非另有限定，该术语包括含有与对照核酸具有相似的结合特性且与天然存在的核苷酸以相似的方式进行代谢的天然核苷酸的已知类似物的核酸。除非另有说明，特定的核酸序列也隐含包括其保守修饰的变异体(例如，简并密码子取代)和互补序列以及详细表示的序列。具体地说，通过产生用混合碱基和/或脱氧肌苷残基取代一个或多个选定的(或全部)密码子的第三个位置的序列可实现简并密码子取代(Batzer等，(1991)，Nucleic Acid Res.19：5081；Ohtsuka等，(1985)J.Biol.Chem.260：2605-2608；Cassol等，(1992)；Rossolini等，(1994)Mol.Cell.Probes 8：91-98)。术语核酸可与基因，cDNA，和基因编码的mRNA互换使用。
如本文所用，一个DNA片断当放在与另一DNA片断具有功能关系的位置时称为“可操作相连”。例如，信号序列的DNA如果作为参与多肽分泌的蛋白前体表达时与编码该多肽的DNA可操作相连；启动子或增强子如果刺激序列的转录时与该编码序列可操作相连。一般来说，可操作相连的DNA序列是连续的，对于信号序列，连续的和在阅读相中都需要。然而，增强子不必与其控制转录的编码序列连续。通过以方便的限制性位点或以插入其位置的衔接子或接头进行连接反应可实现连接。
本文使用的术语“开放传粉”是指自由接触一些基因流的植物群体，相反，封闭传粉存在对基因流的有效屏障。
本文使用的术语“开放传粉种群”或“开放传粉变种”是指正常情况下能进行至少一些异花授粉的植物，选择的标准是它们可表现出变异但也具有一个或多个该种群或变种区别于其它的种群或变种的基因型或表型特征。对异花传粉无障碍的杂种是开放传粉种群或开放传粉变种。
本文使用的术语“胚珠”是指雌性配子体，而术语“花粉”是指雄性配子体。
本文使用的术语“胚珠特异性启动子”广义上是指在胚珠形成和/或发挥功能必须的植物细胞或组织中选择性调控核酸序列的表达和/或在植物胚珠形成期间限制核酸序列的表达的核酸序列。
本文使用的术语“花粉特异性启动子”广义上是指在花粉形成和/或发挥功能必须的植物细胞或组织中选择性调控核酸序列的表达和/或在植物花粉形成期间限制核酸序列的表达的核酸序列。
本文使用的术语“表型”是指个体遗传组成(即，基因型)与环境之间相互作用产生的个体细胞，细胞培养物，植物，或植物群体的可观察的特征。
本文使用的术语“植物”是指整株植物，植物器官(例如，叶，茎，根，等)，种子和植物细胞及其后代。可在本发明方法中使用的植物种类一般与适合于转化技术的高等植物种类一样广泛，包括单子叶植物和双子叶植物。
本文使用的术语“启动子”是指涉及结合RNA聚合酶以启动转录的DNA区域。
本文使用的术语“重组体”是指用重组DNA进行了转化的细胞，组织或生物体。原始重组体命名为“R0”或“R0”。R0自交产生的第一转化世代命名为“R1”或“R1”。
本文使用的术语“自交不亲和”是指交配或授粉后，雄性配子和雌性配子不能实现受精，而它们分别能够与繁殖群体的其它配子在相似的交配和授粉后结合(Mather，J.Genet.25：215-235(1943))。
本文使用的术语“自花传粉”或“自花受粉”是指将一株植物的一朵花上的花粉(人工或天然)施加到相同植物的相同或不同花上的胚珠(柱头)上。
本文使用的术语“稳定分散的转座事件”是指不再进行进一步的转座，例如第二次转座事件的分散的转座。
本文使用的术语“自杀基因”是指表达产物对于表达该自杀基因的细胞是致死的任何基因。
本文使用的术语“综合种”是指特定的一组无性系或种子繁殖的品系互交产生的一组后代。综合种可含有杂交，自交和近交受精产生的种子的混合物。
本文使用的术语“转化”是指将核酸(即，核苷酸多聚体)转移进细胞。本文使用的术语“遗传转化”是指将DNA，特别是重组DNA转移并掺入细胞中。
本文使用的术语“转化体”是指进行了转化的细胞，组织或生物体。原始转化体命名为“T0”或“T0”。T0的自交产生第一转化的世代，命名为“T1”或“T1”。
本文使用的术语“转基因”是指以保证其功能的方式插入生物体，宿主细胞或载体中的核酸。
本文使用的术语“转基因体”是指通过各种转化方法之一接受了外源或修饰基因的细胞，细胞培养物，生物体，植物，和植物子代，其中外源或修饰基因来自与接受该外源或修饰基因的植物或生物体种类相同或不同的种类。
本文使用的术语“转座酶”是指催化转座事件的一种酶或多种酶，或者更一般地说，是一种分子或多种分子。
本文使用的术语“转座事件”是指转座子从供体位点向靶位点的移动。
本文使用的术语“转座子”是指一种遗传因子，包括但不限于可从一个染色体位点移动到另一位点的DNA或RNA片断。
本文使用的术语“变种”是指种的亚分类，由该种内在形态或功能上不同于其它相似的一批个体的一群个体组成。
本文使用的术语“载体”广义上是指编码外源核酸的任何质粒或病毒。该术语也应解释为包括帮助将核酸转移进病毒粒体或细胞中的非质粒和非病毒复合物，例如，聚赖氨酸复合物等。载体可以是适合于作为传递载体用于将核酸或其突变体传递给细胞的病毒载体，或者载体可以是适合于相同目的的非病毒载体。用于将DNA传递给细胞和组织的病毒和非病毒载体的例子是本领域熟知的且在例如，Ma等，(1997，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.94：12744-12746)中已有描述。病毒载体的例子包括，但不限于重组牛痘病毒，重组腺病毒，重组逆转录病毒，重组腺伴随病毒，重组鸟类痘病毒等(Cranage等，1986，EMBO J.5：3057-3063；1994年8月18日公开的国际专利申请号WO94/17810，1994年10月27日公开的国际专利申请号WO94/23744)。非病毒载体的例子包括但不限于脂质体，DNA的多胺衍生物等。
本发明的综述
本发明描述了为了消除转基因座(目的基因)的传播破坏雄性或雌性配子体(小孢子或大孢子)的构建体和方法。在一个实施方案中，小孢子的破坏使用与合适的自杀基因融合的花粉特异性启动子或通过使用不能通过一种性别传播的遗传突变进行遗传改造。
当是半合子时，通过将目的基因与在雄性或雌性特异性启动子控制下的自杀基因连接实现消除转基因座的传播。该构建体称为“配子体自杀性状”(GST)，它诱导局限于小孢子或大孢子的细胞死亡，从而有效减少或消除与GST连接的目的基因的传播。由于GST/转基因构建体是半合子的，所以50％的花粉粒是有活力且无转基因的。因此可控制转基因的传播而允许发生授粉以便实现受精并最终获得种子供应种植或食品应用。由于许多植物产生过度充足的花粉，因此对于大多数植物种类而言损失50％所产生的花粉不会对结实结果有不利影响。例如，玉米(Zea mays)在7天的花期中高峰期一株植物每天产生107个之多的花粉粒(Coe等，玉米遗传性，见：玉米和玉米改良。第3版，编辑：Sprague等，(1988)，第81-258页)。
消除转基因座的雄性传播也可用作富集分散的和/或稳定的转座事件的新策略。通过构建含有转座因子和/或转座酶基因以及“配子体自杀性状”(GST)的“转基因复合体”可实现这点。GST诱导局限于小孢子的细胞死亡，严重减少邻近染色体区域和其它转基因，包括转基因复合体内的转座子(供体因子)和/或转座酶基因的雄性传播。
当雄性亲本中的转基因复合体是杂合体时，大约50％的小孢子受到破坏，从而防止转基因复合体的雄性传播和极大地减少了连锁的转座因子的雄性传播。转座子供体位点和附近转座的消除对于含有未连锁的转座和与供体转基因复合体重组的转座因子的花粉具有富集净效应。
通过在转座因子内包括除草剂选择标记基因可容易地在后代中选择依然存在的转座事件。GST也可与转座酶源物理连接以消除含有转座酶源的配子。这种排列可防止转座酶源传播到配子中，从而稳定在后代中的插入。
所有这三种成分，即自杀基因或突变，转座酶源和转座子可构建成一个单元以提供产生分散的，稳定转座的有效方法。破坏小孢子的一个替代策略是使用大孢子自杀性状改造胚珠半不育性以消除转基因复合体的雌性传播。I.核酸
A.启动子
有许多合适启动子的杰出例子可在植物中启动花粉特异性表达。在诸如玉米，水稻，西红柿，烟草，拟南芥属，芸苔属及其它的许多植物种类中已经鉴定了花粉特异性启动子(Odell，T.O.等，(1985)，自然，313：810-812；Marrs，K.A.等，(1993)Dev Genet，Vol.14/1：27-41；Kim，(1992)Transgenic Res，Vol.1/4：188-94；Carpenter，J.L.，等，(1992)Plant Cell Vol.4/5：557-71；Albani，D.等，(1992)Plant J.2/3：331-42；Rommens，C.M.，等，(1992)，Mol.Gen.Genet.，Vol.231/3：433-41；Kloeckener-Gruissem，等，(1992)Embo J，Vol.11/1：157-66；Hamilton，D.A.等，(1992)，Plant Mol Biol，Vol.18/2：211-18；Kyozuka，J.，等，(1991)，Mol.Gen.Genet.，Vol.228/1-2：40-8；Albani，D.等，(1991)Plant Mol Biol Vol.16/4：501-13；Twell，D.等，(1991)Genes Dev.5/3：496-507；Thorsness，M.K.等，(1991)Dev.Biol Vol.143/1：173-84；McCormick，S.等，(1991)Symp Soc Exp Biol Vol.45：229-44；Guerrero，F.D.等，(1990)MolGen Genet Vol 224/2：161-8；Twell，D.等，(1990)Development Vol.109/3：705-13；Bichler，J.等，(1990)，Eur J Biochem Vol.190/2：415-26；van Tunen，等，(1990)，Plant Cell Vol 2/5：393-401；Siebertz，B.等，(1989)Plant Cell Vol 1/10：961-8；Sullivan，T.D.等，(1989)Dev Genet Vol 10/6：412-24；Chen，J.等，(1987)，Genetics Vol 116/3：469-77)。花粉特异性启动子的一些其它例子可在GenBank中找到。还有一些启动子在美国专利号5,086,169；5,756,324；5,633,438；5,412,085；5,545,546和6,172,279中提供。
也有一些其它的真核性别特异性启动子适用于本发明。该例子包括：小鼠精母细胞特异性Pgk-2启动子(Ando等，(2000)Biochem.Biophys.Res.Comm.272/1：125-8)；PACAP睾丸特异性启动子(Daniel等，(2000)Endocrinology，141/3：1218-27)；小鼠mSP-10精细胞特异性启动子(Reddi等，(1999)Biology of Reproduction，61/5：1256-66)；小鼠精子特异性启动子(Ramara等，(1998)J.Clin.Invest.102/2：371-8)；小鼠和大鼠Hlt启动子(vanWert等，(1996)J.Cell.Biochem.60/3：348-62)；人PRM1，PRM2和TNP2精细胞特异性启动子(Nelson等，(1995)DNA Sequence 5/6：329-37)；果蝇属exu性别特异性启动子(Crowley等，(1995)Molec.Gen.Genet.248/3：370-4)；小鼠睾丸ACE启动子(Zhou等，(1995)Dev.Genet.16/2：201-9)；大鼠GHRH精子发生特异性启动子(Srivastava等，(1995)Endocrinology 136/4：1502-8)；果蝇属精巢特异性启动子(Lankenau等(1994)Mol.Cell.Biol.14/3：1764-75)；精母细胞特异性hst70基因启动子(Widlak等，(1994)Acta Biochim.Polonica41/2：103-5)；和小鼠Prm-1精细胞特异性启动子(Zambrowicz等，(1993)Proc.Nat′l.Acad.Sci.USA 90/11：5071-5)。
对于本发明，如果任何启动子对一种性别(雄性或雌性)具有特异性且在减数分裂I期后当同源染色体分离进不同细胞时能特异性启动基因表达，那么该启动子是合适的。例如，在减数分裂II的四分体时期，导致花粉成熟的小孢子有丝分裂后，成熟花粉粒，或在萌发花粉粒时的基因表达将适合于本发明。
B.自杀基因
配子体自杀性状(GST)的一个方面是直接表达自杀基因以杀死不需要的减数分裂产物。其表达导致细胞死亡的基因的例子包括，但不限于，已在文献中描述的那些基因，包括芽孢杆菌RNA酶(Custers，J.B.，等，(1997)PlantMol Biol Vol.35/6：689-99；Yazynin，S.，等，(1999)FEBS Lett Vol.452/3：351-4；Goldman，M.H，等，(1994)Embo J Vol.13/13：2976-84，1994)，雄花穗种子2(tasselseed2)(DeLong，A，等，(1993)Cell Vol.74/4：757-768)，和白喉毒素A基因(Day，C.D.，等，(1995)Development Vol.121/9：2887-95)。由于自杀基因的表达局限于减数分裂I期后，因此当转基因是半合子且正常情况下在减数分裂中分离时仅可剔除50％的配子。活配子不会遗传自杀基因。
根据本发明的另一方面，使用反义RNA技术抑制花粉或卵的发育能力所必需的一个或多个基因的表达也可实现半不育。该技术在下面进行更详细的讨论。
另外，也可使用不能通过一种性别传播的突变，例如花粉不传播的缺失以实现半不育。
自杀基因的具体例子包括，但不限于下列基因：
雄花穗种子2(ts2)，遗传和分子证据显示ts2是雄花穗和小穗中消除雌蕊所必需的。ts2在雌蕊细胞中的表达与核完整性丧失和细胞死亡同时发生。还不清楚ts2基因产物在细胞死亡途径中如何发挥作用。根据其与短链醇脱氢酶的相似性，特别是与羟基类固醇脱氢酶的相似性，建立了两种可能的理论。ts2产物可能代谢一种细胞活力必需的底物，也许是类固醇。另外，TS2的作用可能导致形成激活细胞死亡反应的信号分子。(Calderon-Urrea等，(1999)Development，126：435)。
白喉毒素A链(DTA).白喉毒素A链(DTA)抑制蛋白质合成，Greenfield等，Proc.Natl.Acad.，Sci.：USA，80：6853(1983)；Palmiter等，Cell，50：435(1987)。
果胶酸裂解酶pelE.来自菊欧文氏菌EC16的果胶酸裂解酶pelE降解果胶，引起细胞裂解。Keen等，J.Bacteriology，168：595(1986)。
T-urf13(TURF-13).T-urf13(TURF-13)来自cms-T玉米线粒体基因组；该基因编码破碎线粒体或原生质膜的称为URF13的多肽。Braun等，Plant Cell，2：153(1990)；Dewey等，Proc.Natl.Acad.Sci.：USA，84：5374(1987)；Dewey等，Cell，44：439(1986)。
Gin重组酶.Gin重组酶来自噬菌体Mu，该基因编码在植物细胞中表达时引起基因组重排和细胞活力丧失的位点特异性DNA重组酶。Maeser等，Mol.Gen.Genet.，230：170-176(1991)。
吲哚乙酸-赖氨酸合成酶(iaaL).来自丁香假单胞菌的吲哚乙酸-赖氨酸合成酶(iaaL)编码将赖氨酸偶联到吲哚乙酸(IAA)上的酶。当它在植物细胞中表达时，由于经过偶连从细胞中去掉了IAA而引起发育改变。Romano等，Genes and Development，5：438-446(1991)；spena等，Mol.Gen.Genet.，227：205-212(1991)；Roberto等，Proc.Natl.Acad.Sci.：USA，87：5795-5801。
芽孢杆菌RNA酶.来自解淀粉芽孢杆菌的核糖核酸酶，也称为芽孢杆菌RNA酶，它消化表达它的那些细胞中的mRNA，导致细胞死亡。Mariani等，Nature 347：737-741(1990)；Mariani等，Nature 357：384-387(1992)。
CytA毒素基因.来自苏芸金芽孢杆菌以色列亚种的CytA毒素基因编码一种杀蚊的和溶血的蛋白质。当它在植物细胞中表达时，由于细胞膜破裂而引起细胞死亡。McLean等，J.Bacteriology，169：1017-1023(1987)；E11ar等，美国专利号4,918,006(1990)。
在其它真核生物中用作自杀基因的合适的细胞死亡基因包括：人PDCD9(程序性细胞死亡9)和Gallus gallus编程性细胞死亡蛋白前体p52(Carim等，(1999)Cytogenetics and Cell Genetics(瑞士)87/1-2：85-8)；C.Elegans程序性细胞死亡基因CED-3和EGL-1(Hengartner等，(1999)54：213-22)；编码C.elegans CED-3：ICE的哺乳动物同源物的基因(白介素-1β-转化酶)(Kondo等，(1998)Investigative Ophthalmology & Visual Science 39/13：2769-74)；编码ICE-样蛋白酶Ich-1L，CPP32β，Mch2α和Mch3α的基因(Kondo等，(1998)58/5：962-7)；或哺乳动物细胞死亡基因Nedd2(Kumar等，(1997)Leukemia 11 Suppl 3：385-6)。
C.转基因和异源核酸
使用重组DNA方法学成功导入植物的基因包括，但不限于那些编码下列性状的基因：种子贮存蛋白，包括修饰的7S豆类种子贮存蛋白(美国专利号5,508,468，5,559,223和5,576,203)；除草剂耐受性或抗性(美国专利号5,498,544和5,554,798；Powell等，Science 232：738-743(1986)；Kaniewski等，Bio/Tech.8：750-754(1990)；Day等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 88：6721-6725(1991))；植酸酶(美国专利号5,593,963)；对细菌，真菌，线虫和昆虫害虫的抗性，包括由Bt基因赋予的对鳞翅目昆虫的抗性(美国专利号5,597,945和5,597,946；Hilder等，Nature 330：160-163；Johnson等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，86：9871-9875(1989)；Perlak等，Bio/Tech.8：939-943(1990))；凝集素(美国专利号5,276,269)；和花色(Meyer等，Nature 330：677-678(1987)；Napoli等，Plant Cell 2：279-289(1990)；van der Krol等，Plant Cell 2：291-299(1990))。
其中特别感兴趣的是赋予对除草剂抗性的基因。其例子包括，但不限于下列基因：
(i)抑制生长点或分生组织的除草剂，例如imidazalinone或磺酰脲类。在这一类型中举例性的基因编码突变的ALS和AHAS酶，例如，分别参见Lee等，EMBO J.7：1241(1988)，和Miki等，Theor.Appl.Genet.80：449(1990)。
(ii)草甘膦(glyphosate)(分别由突变的5-enolpyruvl-3-phosphikimate合成酶(EPSP)和aroA基因赋予抗性)和诸如glufosinate的其它膦酰基化合物(phosphinothricin乙酰转移酶(PAT)和吸水链霉菌phosphinothricin乙酰转移酶(bar)基因赋予抗性)，和pyridinoxy或phenoxy proprionic acids和cycloshexones(ACCase抑制剂的编码基因赋予抗性)。参见例如，Shah等的美国专利号4,940,835，它公开了可赋予草甘膦抗性的EPSP类型的核苷酸序列。编码突变的aroA基因的DNA分子可按ATCC保藏号39256获得，且该突变基因的核苷酸序列在Comai的美国专利号4,769,061中公开。Kumada等的欧洲专利申请号No.0 333 033和Goodman等的美国专利号4,975,374公开了赋予对诸如L-phosphinothricin的除草剂的抗性的谷酰胺合成酶基因的核苷酸序列。phosphinothricin-乙酰转移酶基因的核苷酸序列在Leemans等的欧洲申请号No.0 242 246中提供。De Greef等，Bio/Technology7：61(1989)描述了表达编码phosphinothricin乙酰转移酶活性的嵌合bar基因的转基因植物的生产。赋予对phenoxy proprionic acids和诸如稀禾定(sethoxydim)和haloxyfop的cycloshexones的抗性的基因的例子有Marshall等，Theor.Appl.Genet.83：435(1992)所述Acc1-S1，Acc1-S2和Acc1-S3基因。编码phosphinothricin乙酰转移酶的链霉菌属bar基因在玉米植物中的表达导致对除草剂phosphinothricin或glufosinate具有耐受性(美国专利号5,489,520，本文引用以供参考)。
对于某些目标种类，优选不同的抗生素或除草剂选择标记。常规用于转化的选择标记包括赋予对卡那霉素和相关抗生素抗性的nptII基因(Messing & Vierra，Gene 19：259-268(1982)；Bevan等，Nature 304：184-187(1983))，赋予对除草剂phosphinothricin抗性的bar基因(White等，Nucl AcidsRes 18：1062(1990)，Spencer等，Theor Appl Genet 79：625-631(1990))，赋予对抗生素潮霉素抗性的hph基因(Blochinger & Diggelmann，Mol Cell Biol 4：2929-2931)，和赋予对氨甲蝶呤抗性的dhfr基因(Bourouis等，EMBO J.2(7)：1099-1104(1983))。
使用从苜蓿和非苜蓿种类分离的许多不同基因已经产生了转基因苜蓿植物，这些基因包括但不限于下列基因：与报道基因gusA融合的早期结瘤素基因的启动子(Bauer等，The Plant Journal 10(1)：91-105(1996)；早期结瘤素基因(Charon等，Proc.Natl.Acad.of Sci.USA 94(16)：8901-8906(1997)；Bauer等，Molecular Plant-Microbe Interactions 10(1)：39-49(1997))；NADH-依赖型谷氨酸合酶(Gantt，The Plant Journal 8(3)：345-358(1995))；三种凝集素基因之一的启动子-gusA融合体(Bauchrowitz等，The Plant Journal 9(1)：31-43(1996))；与CaMV启动子融合的海洋软体珊瑚Renilla reniforms的萤光素酶(Mayerhofer等，The Plant Journal 7(6)：1031-1038(1995))；Mn-过氧化物歧化酶cDNA(McKersie等，Plant Physiology 111(4)：1177-1181(1996))；编码苏芸金芽孢杆菌δ-内毒素的合成cryIC基因(Strizhov等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 93(26)：15012-15017(1996))；葡聚糖酶(Dixon等，Gene 179(1)：61-71(1996)；Masoud等，Transgenic Research 5(5)：313-323))；和叶衰老基因(美国专利号5,689,042)。
使用重组DNA技术成功转移进三叶草的基因包括，但不限于下列基因：Bt基因(Voisey等，出处同上)；新霉素磷酸转移酶II(Quesbenberry等，出处同上)；豌豆凝集素基因(Diaz等，Plant Physiology 109(4)：1167-1177(1995)；Eijsden等，Plant Molecular Biology 29(3)：431-439(1995))；植物激素应答启动子GH3(Larkin等，Transgenic Research 5(5)：325-335(1996)；来自向日葵的种子白蛋白基因(Khan等，Transgenic Research 5(3)：179-185(1996))；编码酶phosphinothricin乙酰转移酶的基因，编码对Basta除草剂抗性的β-葡糖醛酸糖苷酶(GUS)，新霉素磷酸转移酶和α-淀粉酶抑制剂(Khan等，出处同上)。
感兴趣的其它转基因包括，但不限于那些编码木质素含量，纤维素含量，固氮作用，改良的营养，颜色，维生素含量和重组产生的疫苗或与其相关的基因。
D.位点特异性重组系统
将DNA序列定向插入特定DNA座位而得以排除作为转化过程副产品发生的DNA序列随机插入的方法和构建体在美国专利号5,527,695和6,114,600中描述。排除这些随机插入的一种方式是使用位点特异性重组酶系统。一般来说，位点特异性重组酶系统由三个元件组成：两对DNA序列(位点特异性重组序列)和一种特异性酶(位点特异性重组酶)。位点特异性重组酶仅能催化两个位点特异性重组序列之间的重组反应。
可使用许多不同的位点特异性重组酶系统，包括但不限于噬菌体P1的Cre/lox系统，酵母的FLP/FRT系统，噬菌体Mu的Gin重组酶，大肠杆菌的Pin重组酶，和pSR1质粒的R/RS系统。两个优选的位点特异性重组酶系统是噬菌体P1的Cre/lox和酵母的FLP/FRT系统。在这些系统中，重组酶(Cre或FLP)与其各自的位点特异性重组序列(分别为lox或FRT)特异性相互作用以颠倒或切除插入序列。用于这两个系统之一的序列相对较短(lox为34bp且FRT为47bp)。目前酵母的FLP/FRT系统是优选的位点特异性重组酶系统，因为正常情况下它在真核生物(酵母)中发挥功能且已被充分鉴定。据认为FLP/FRT系统的真核来源允许FLP/FRT系统在真核细胞中比原核位点特异性重组酶系统更有效地发挥功能。
已证实FLP/FRT重组酶系统在植物细胞中有效地发挥功能。在玉米和水稻原生质体中对FLP/FRT系统性能进行的实验表明FRT位点结构和存在的FLP蛋白的量影响切除活性。一般来说，短的不完全FRT位点导致切除产物的累积比全长FRT位点更高。位点特异性重组系统在玉米原生质体中催化分子内和分子间反应，表明该系统可用于DNA切除以及整合反应。重组反应是可逆的且该可逆性损害了以任一方向反应的效率。改变位点特异性重组序列的结构是一种补救该情况的方法。位点特异性重组序列可按这样的方式进行突变，即重组反应产物不再作为逆反应的底物被识别，从而稳定整合或切除事件。
E.载体
在植物中表达外源DNA的表达单元
如上所述，本发明的一些实施方案使用表达单元(或表达载体或系统)在植物中表达外源性提供的核酸序列。产生用于植物的表达单元/系统/载体的方法在本领域中是熟知的且可容易地适用于本发明。按照本文提供的概要技术人员可容易地在本方法中使用任何合适的植物/载体/表达系统。
用于调控蛋白质表达的表达控制元件可以是正常情况下发现与该编码序列相连的表达控制元件(同源表达元件)或者可以是异源表达控制元件。同源和异源表达控制元件的种类在本领域中是已知的且可容易地用于制备在本发明中使用的表达单元。例如，转录起始区可包括各种冠瘿氨基酸起始区的任一种，例如，在根癌土壤杆菌Ti质粒中发现的章鱼氨酸，甘露氨酸，胭脂氨酸等。另外，也可使用植物病毒启动子，例如花椰菜花叶病毒35S启动子以控制植物中的基因表达。最后，也可使用诸如prolifera启动子，果实特异性启动子，Ap3启动子，热休克启动子，种子特异性启动子，等的植物启动子。最优选的启动子是在雄性或雌性配子中最具有活性的启动子。
配子特异性启动子，组成型启动子(例如CaMV或Nos启动子)，器官特异性启动子(例如西红柿的E8启动子)或诱导型启动子的任一种一般可使用本领域已知的标准技术与蛋白质或反义分子的编码区相连。经过使用诸如转录终止子和/或增强子元件的补充元件可进一步优化表达单元。
因此，为了在植物中表达，除了蛋白质序列外，表达单元一般还含有植物启动子区，转录起始位点和转录终止序列。在表达单元的5’和3’端一般包含单一限制酶位点以便允许容易地插入先前存在的载体中。
在异源启动子/结构基因或反义组合的构建中，启动子优选位于离异源转录起始位点的距离与在其天然环境中它离转录起始位点的距离大约相同。然而，正如本领域已知的，容许在该距离上有一些变化而不丧失启动子功能。
除了启动子序列外，表达盒也可含有结构基因下游的转录终止区以提供有效终止。终止区可从与启动子序列相同的基因获得或者可从不同基因获得。如果由结构基因编码的mRNA需要进行有效加工，通常也可向载体构建体中加入指导RNA多聚腺苷化的DNA序列。多聚腺苷化序列包括但不限于土壤杆菌属章鱼氨酸合成酶信号(Gielen等，EMBO J，3：835-846(1984))或胭脂氨酸合成酶信号(Depicker等，Mol.and Appl.Genet.1：561-573(1982))。
所得的表达单元连接进适合于高等植物转化的载体中或者包含在该载体中。该载体一般也可含有选择标记基因，可由此在培养基中鉴定转化的植物细胞。通常，标记基因编码抗生素抗性。这些标记包括对G418，潮霉素，博莱霉素，卡那霉素和庆大霉素的抗性。转化植物细胞后，以其在含有特定抗生素的培养基中生长的能力可鉴定具有该载体的那些细胞。一般也可包含细菌或病毒来源的复制序列以允许将该载体克隆进细菌或噬菌体宿主中，优选包含广谱宿主范围的原核复制原点。也应包含细菌选择标记以允许选择携带所需构建体的细菌细胞。合适的原核选择标记也可包括对诸如氨苄青霉素，卡那霉素或四环素的抗性。
正如本领域已知的，在该载体中也可存在编码附加功能的其它DNA序列。例如，在土壤杆菌属转化中，也可包含T-DNA序列用于随后转移进植物染色体中。
本发明的序列也可与诸如表达序列标签(ESTs)，表位或荧光蛋白标记各种等其它核酸分子融合。
ESTs是基因片断，一般长300至400个核苷酸，从互补-DNA(cDNA)克隆的3’或5’端测序。由一个法国人和一个美国人的合作组已经产生了接近30,000个拟南芥的ESTs(Delseny等，FEBS Lett.405(2)：129-132(1997)；拟南芥数据库，http：//genome.www.stanford.edu/Arabidopsis)。对于来自大型EST数据库的基因表达模式分析的讨论可参见，例如，M.R.Fannon，TIBTECH 14：294-298(1996)。
生物学上相容的荧光蛋白探针，特别是来自水母Aequorea victoria的自身组装绿色荧光蛋白(GFP)改革了对细胞，分子和发育生物学的研究，因为它们允许在活细胞中看见生化事件(Murphy等，Curr.Biol.7(11)：870-876(1997)；Grebenok等，Plant J.11(3)：573-586(1997)；Pang等，Plant Physiol.112(3)(1996)；Chiu等，Curr.Biol.6(3)：325-330(1996)；Plautz等，Gene 173(1)：83-87(1996)；Sheen等，Plant J.8(5)：777-784(1995))。
使用定点诱变已经形成了一种密码子修饰的GFP的更可溶的形式，称为可溶性修饰的GFP(smGFP)。当导入拟南芥属时，与密码子修饰的GFP相比观察到更强的荧光，暗示smGFP‘更亮’，因为它更多地以可溶性和有功能的形式存在(Davis等，Plant Mol.Biol.36(4)：521-528(1998))。经过融合编码GFP和β-葡糖醛酸糖苷酶(GUS)的基因，研究者可产生一组双功能报道基因构建体，可优化该构建体用于在包括拟南芥属的植物中的瞬时和稳定表达系统中(Quaedvlieg等，Plant Mol.Biol.37(4)：715-727(1998))。
Berger等(Dev.Biol.194(2)：226-234(1998))报道了拟南芥属下胚轴表皮细胞的GFP标记系的分离。GFP-融合蛋白已被用于定位和鉴定了许多拟南芥属基因，包括狔脚6孖犪脚6嫪沽姿(GGPP)(Zhu等，Plant Mol.Biol.35(3)：331-341(1997)。
失能基因
有效的失能修饰的一个例子是在基因的起始处出现的产生翻译阅读移码的单核苷酸缺失。该移码使基因失能，导致无表达的基因产物，从而破坏该基因的功能性蛋白质生产。例如，如果未修饰的基因编码一种蛋白酶，如果破坏该蛋白酶基因的调控区或编码区则可能破坏该基因的蛋白酶生产。
除了通过缺失核苷酸引起翻译阅读移码的失能基因外，通过可有效防止DNA编码的蛋白质形成的包括在基因DNA内进行核苷酸的插入，取代，倒位或易位的其它技术进行失能修饰也是可能的。
通过使用特异性较小的方法失能基因也在本领域的技术人员的能力范围内。特异性较小的方法的例子是使用诸如羟胺或亚硝基胍的化学诱变剂或使用诸如γ射线或紫外照射的放射诱变随机突变基因。该突变株可能意外含有失能基因以致该基因不再能够产生在任何一个或多个结构域有功能的蛋白质。通过常规筛选技术可检测所需失能基因的存在。对于进一步的指导，参见美国专利号5,759,538。
反义编码载体
使用反义构建体，包括原位产生反义序列抑制植物中的表达的方法在例如，美国专利号5,107,065；5,254,800；5,356,799；5,728,926；和6,184,439中描述。后两个专利的标题是“用于杂交种子生产的授粉控制的反义基因系统”。
可用于抑制植物中内源基因表达的其它方法也可在本方法中使用。例如，在双螺旋基因的必需区形成三股螺旋可用于该目的。允许设计合适的单链参与者的三联体密码在本领域中也是已知的。(参见H.E.Moser，等，Science 238：645-650(1987)和M.Cooney，等，Science 241：456-459(1988))。含有嘌呤碱基链的控制序列中的区域是特别有吸引力的靶。伴随光致交联形成的三股螺旋在例如，D.Praseuth，等，Proc.Natl Acad.Sci.USA 85：1,349-1,353(1988)中描述。II.转化
A.植物转化
为了用常规方法导入一个所需基因或一组基因，需要进行两个品系之间的有性杂交，然后重复杂种后代与一个亲本之间的回交直到获得具有所需特性的植物。然而，该方法局限于可有性杂交的植物且转移除了所需基因之外的基因。
重组DNA技术通过允许植物遗传学家鉴定和克隆诸如对昆虫害虫抗性的所需性状的特定基因并将这些基因导入已经有用的植物品种中使得植物研究人员可以绕过这些限制。一旦将外源基因导入植物中，那么该植物可在常规植物育种计划中使用(例如，谱系繁殖，单种子家系育种计划，交互反复选择)以产生还含有目的基因的后代。
基因可使用同源重组以定点方式导入。同源重组允许在内源基因上进行定点修饰，因此可改正遗传性或获得性突变，和/或可将新改变设计进基因组中。
植物中的同源重组和定点整合在美国专利号5,451,513；5,501,967和5,527,695中讨论。
B.转化方法
生产转基因植物的方法是本领域的普通技术人员所熟知的。现在转基因植物可通过各种不同的转化方法生产，该方法包括但不限于电穿孔；显微注射；微粒轰击，也称为粒子加速或生物导弹(biolistic)轰击；病毒介导的转化；和土壤杆菌属介导的转化(参见，例如美国专利号5,405,765；5,472,869；5,538,877；5,538,880；5,550,318；5,641,664；5,736,369和5,736369；Watson等，Recombinant DNA，Scientific American Books(1992)；Hinchee等，Bio/Tech.6：915-922(1988)；McCabe等，Bio/Tech.6：923-926(1988)；Toriyama等，Bio/Tech.6：1072-1074(1988)；Fromm等，Bio/Tech.8：833-839(1990)；Mullins等，Bio/Tech.8：833-839(1990)；和Raineri等，Bio/Tech.8：33-38(1990))。
通过许多这类方法已经生产了转基因苜蓿植物，该方法包括但不限于土壤杆菌属介导的转化(Wang等，Australian Journal of Plant Physiology 23(3)：265-270(1996)；Hoffman等，Molecular Plant-Microbe Interactions 10(3)：307-315(1997)；Trieu等，Plant Cell Reports 16：6-11(1996))和粒子加速(美国专利号5,324,646)。
使用土壤杆菌属介导的转化在三叶草中已经成功地实现了转化(Voisey等，Biocontrol Science and Technology 4(4)：475-481(1994)；Quesbenberry等，Crop Science 36(4)：1045-1048(1996)；Khan等，Plant Physiology 105(1)：81-88(1994)；Voisey等，Plant Cell Reports 13(6)：309-314(1994))。
在许多饲料和草皮草类中也已经报道了遗传转化(Conger B.V.GeneticTransformation of Forage Grasses in Molecular and Cellular Technologies forForage Improvement，CSSA Special Publication No.26，Crop Science Society ofAmerica，Inc.E.C.Brummer等编辑，1998，第49-58页)。它们包括鸭茅(Dactylisglomerata L.)，苇状羊茅(Festuca arundinacea Schreb.)，红羊茅(Festuca rubraL.)，草地羊茅(Festuca pratensis Huds.)，多年生黑麦草(Lolium perenne L.)，爬行翦股颖(Agrostis palustris Huds.)和小糠草(Agrostis alba L.)。
通过原生质体直接吸收DNA和通过用DNA包裹的微粒轰击细胞或组织在这些饲料和草皮草类中实现了成功的基因转移。在两种情况下，转移后进行整体植物再生。大量研究聚焦在开发和改进转化方法上且使用了编码葡糖醛酸糖苷酶(GUS)的报道基因uidA和赋予对基于phosphinothricin的除草剂的耐受性的选择标记bar。通过聚合酶链式反应(PCR)技术，对转录的RNA的Northern杂交分析，对可溶性蛋白质(基因产物)的Western印迹分析，和对总基因组DNA的Southern印迹杂交已经提供了转化的证据。III.半合子性
使用土壤杆菌属转化方法形成的转基因植物一般在一个染色体上含有单个基因，尽管多个拷贝是可能的。该转基因植物称为对于加入的基因是半合子的。这种植物更精确的名称是独立的分离子，因为各转化的植物代表了单个T-DNA整合事件(美国专利号6,156,953)。转基因座一般通过存在和/或不存在转基因来鉴定。一个等位基因相应于不存在转基因的杂合子基因型也命名为半合子(美国专利号6,008,437)。
假定是正常的半合子，自交导致在第一代自交重组体，也称为R1或R1代中最大程度的基因型分离。R1代是由自交原始重组体株系，也称为R0或R0代产生的。由于各插入基因作为显性等位基因起作用，在不存在连锁且假定对于耐受性表达只需要一个半合子插入时，一个插入将分离成3∶1，两个插入分离成15∶1，三个插入分离成63∶1，等。因此，需要繁殖相当少的R1植物以发现至少一种抗性表型(美国专利号5,436,175和5,776,760)。
如上所述，半合子转基因再生植物的自花授粉应产生相当于F2的子代，其中大约25％应是纯合子转基因植物。自花授粉和F2代与未转化的对照植物的测交可用于鉴定纯合子转基因植物和维持该品系。如果起始获得的用于再生植物的后代来自异花传粉，那么，纯合子转基因植物的鉴定需要另外产生自体授粉(美国专利法5,545,545)。IV.半不育和遗传性不育过滤
A.配子体不育性状(GST)
GST可由两个或三个元件组成：性别特异性启动子，自杀基因和任选的转座子和/或转座酶的编码区。正常情况下，GST构建体以转录终止子元件终止。包含转座子或转座酶源对于选择分散转座的应用是特有的且对于消除转基因传播的目的不是必须使用的。
可使用的性别特异性启动子包括但不限于：来自玉米，水稻，西红柿，烟草，拟南芥属和芸苔属的花粉特异性启动子。一些其它的例子可在GenBank中找到。启动子必须对一种性别(雄性或雌性)是特异性的且在同源染色体分离进不同细胞的减数分裂I期后特异性地启动基因表达。
自杀基因用于杀死不需要的减数分裂产物。自杀基因包括但不限于：芽孢杆菌RNA酶，雄花穗种子2(tasselseed2)和白喉毒素A基因。使用自杀基因的两个选择包括1)使用反义RNA技术抑制对花粉或卵活力所必需的基因的表达；或2)不能通过一种性别传播的突变，例如不进行花粉传播的缺失。这两种选择都可用于实现半不育。
B.半不育和遗传性不育过滤
本发明人使用术语“半不育”和“遗传性不育过滤”表达这样的概念，即由于自杀基因表达局限于减数分裂I期后，当GST基因座是半合子且在减数分裂中正常分离时只有50％的配子被清除。这是由于这样的事实，即当GST基因座以单个拷贝存在于基因组中(半合子状态)时，自杀基因将传播到大约一半的减数分裂产物中，导致50％的不育率。如果花粉特异性启动子与自杀基因可操作地相连，那么遗传GST的花粉将不能存活。
产生50％的活花粉对于分散转座的回收和/或防止转基因传播而不显著影响雄性生育力是必需的。
C.配子体半不育
本发明描述了使用诸如花粉半不育的配子体“半不育”技术产生消除遗传了特定转基因复合体的配子的“遗传性不育过滤”。将花粉特异性启动子插入GST中防止了在遗传该转基因复合体的花粉中与GST连接的转基因的传播。
该转基因复合体也可含有转座因子和/或转座酶基因的发送位点。在这种情况下，转基因复合体伴随着转座子供体位点和/或转座酶的清除对消除邻近的转座同时富集与转基因复合体重组或在整个基因组中分散(不再与GST相连)的转座事件具有净效应。该方法学克服了有助于大多数分散转座定位的转座子诱变策略的一些通常的局限。本发明极大地改进了通常使用的实现转座子分散的负选择标记(Sundaresan，V.，等，(1995)Genes Dev.9/14：1797-810；Tissier，A.F.等，(1999)The Plant Cell Vol.11：1841-1852)。而且，使用遗传性不育过滤来消除转座酶源的传播可稳定子代中新转座的元件，从而排除了妨碍突变鉴定的体细胞的或第二次的转座事件。
半不育性状及其相关的转座子和/或转座酶的特性依赖于自杀基因，启动子，转座子系统，和物种的选择而详细区别。然而应强调半不育性的相同基础技术可用于在可以有性繁殖的单子叶植物和双子叶植物的许多植物中，在诸如玉米，水稻，大豆，小麦，燕麦，大麦的物种中和在诸如动物和真菌的非植物系统中回收转座。另外，清除小孢子的一个替代策略是通过构建大孢子自杀性状消除转基因复合体的雌性传播。
半不育性状用于消除携带诸如转座子发送位点和/或转座酶基因的特定染色体区的减数分裂产物(配子)。这种“遗传性不育过滤”用于消除转基因复合体的雄性或雌性传播。该消除方法对富集未连锁的(分散的)转座因子或从发送位点重组的元件具有净效应；也可用于同时消除诸如转座酶基因的其它基因的传播，从而稳定子代中的转座。为了实现半不育，本发明包含许多优选的方法。一种方法依赖于指导自杀基因的小孢子特异性表达以杀死不需要的小孢子。通过使用与合适自杀基因融合的诸如花粉特异性启动子的特异性启动子，从而仅杀死遗传了该基因融合体的减数分裂产物可完成该方法。对于半合子状态中的单拷贝转基因，这代表了50％的配子。由于花粉的生产极大地过量，因此将花粉生育力降低50％对随后的种子生产没有严重影响。
本发明与产生半不育相关的方面不同于本领域已知的致力于实现全部雄性不育用于杂交种子生产的早先方法。在这些方法中，目标是实现完全雄性不育以有利于杂交种子的商业生产。这通常涉及在孢子体中或在所有小孢子中表达自杀基因。例如，在绒毡层细胞中表达芽孢杆菌RNA酶导致全部雄性不育(Beals，T.P.等，(1997)The Plant Cell.Vol.9：1527-45)。在杂交种子生产中，花粉半不育不足以实现所需结果，即雄性不育(雌性)亲本的异型杂交。如果小孢子特异性自杀基因及其相关元件以单拷贝存在于基因组中(半合子状态)，那么自杀基因将遗传给大约一半的减数分裂产物，导致平均50％的半不育，一种商业上不能接受的杂交种子生产的活花粉生产率。对于本发明，50％的活花粉生产对于回收分散转座和/或防止转座酶传播是必须和重要的。因此，配子体不育性状用作清除不需要的基因组而同时允许其它基因组(非转基因和含有转座因子而不存在供体元件和/或转座酶基因的基因组)传播的过滤器。在一个实施方案中，本发明利用这种“遗传不育性过滤器”消除含有转座子发送位点和/或转座酶源的转基因复合体。V.育种方法
开放性传粉群体.诸如黑麦的农作物，许多种玉米和甜菜，草本草类，诸如苜蓿和三叶草的豆类，和诸如可可树，椰子，油棕榈和一些橡胶的热带树农作物的开放性传粉群体的改良基本上依赖于改变基因频率以固定良好的等位基因而维持高度(但远没有达到最大)杂合性。在该群体中均一性是不可能的且在开放性传粉品种中纯合类型(trueness-to-type)是该群体作为一个整体的统计学特征而不是单个植物的特性。因此，开放性传粉群体的异质性与近交系，克隆和杂种的同质性(或基本上同种)形成对照。
种群改良方法自然分成两类，基于纯表型选择，正常情况下称为混合选择的方法，和基于测试后代的选择方法。种群间改良利用了开放性繁殖种群的概念；它允许基因从一个种群漂移到另一种群。一个种群(栽培种，株系，生态型，或任何生殖质源)中的植物与来自其它种群的植物通过天然(例如，风媒)或者通过人工或者通过蜜蜂(通常是Apis mellifera L.或Megachilerotundata F.)杂交。通过从两种来源分离具有所需性状的植物进行选择以改良一种(或者有时是两种)种群。
基本上有两种主要的开放性传粉种群的改良方法。第一种是通过选定的选择程序全体改变种群的情况。结果是改良的种群通过以分离状态在其自身群体内随机交配可无限繁殖。第二种方法中，综合品种达到与种群改良相同的最终结果但其自身不能进行类似的繁殖；它必须从亲本株系或克隆重新构建。用于改良开放性传粉种群的这些植物育种方法是本领域的技术人员熟知的且常规用于改良异花传粉植物的育种方法的综述在许多课文和文章中提供，包括：Allard， Principles of Plant Breeding，John Wiley & Sons，Inc.(1960)；Simmonds， Principles of Crop Improvement，Longman GroupLimited(1979)；Hallauer和Miranda， Quantitative Genetics in Maize Breeding，Iowa State University Press(1981)；和Jensen， Plant Breeding Methodology.John Wiley & Sons，Inc.(1988)。
混合选择.在混合选择中，选择所需的个体植物，收获，种子不经过子代测试被混合以产生下一代。由于选择仅基于母系亲本，对传粉不作控制，混合选择等同于有选择的随机交配形式。如上所述，混合选择的目的是增加种群中优等基因型的比例。
合成型.综合品种通过在许多基因型之间杂交选择在所有可能的杂种组合中较好的结合能力来产生，随后通过开放性传粉维持该品种。不论亲本是否是(或多或少是近交的)种子繁殖的品系，在一些糖甜菜和菜豆(Vicia)或克隆中，在草本草类，三叶草和苜蓿中，原则上没有区别。根据一般结合能力选择亲本，有时通过测交或顶交，更通常地是通过多向杂交。亲本种子株系可以有意地进行近交(例如，通过自交或近亲杂交)。然而，即使亲本不有意近交，在品系维持期间品系内的选择保证了发生一些近交。当然，克隆亲本保持不变和高度杂合。
合成型是直接从亲本种子生产划分给农场主还是必须首先进行一个或两个循环的增殖依赖于种子生产和种子所需的等级。在实践中，草类和三叶草一般增殖一次或两次且因此与原始合成型隔了相当多的世代。
尽管有时使用混合选择，后代测试一般优选多向杂交，因为其操作简单且与目标明显关联，即在合成型中利用一般组合能力。
进入合成型的亲本株系或克隆的数目可广泛变化。在实践中，亲本株系的数目从10到几百，平均100-200。预期从100或更多克隆形成的广谱合成型在种子繁殖期间比窄谱合成型更稳定。
杂种.杂种是不同基因型的亲本之间杂交产生的个体植物。商品杂种现在广泛用于许多农作物，包括玉米(玉蜀黍)，高梁，糖甜菜，向日葵和花椰菜。杂种可用许多不同的方法形成，包括两个亲本的直接杂交(单交杂种)，单交杂种与另一亲本的杂交(三方或三重杂交杂种)，或者两个不同杂种的杂交(四方或双杂交杂种)。
严格地说，野外繁殖(即，开放性传粉)的群体中的大多数个体都是杂种，但该术语通常专用于这样的情况，即亲本是其基因组对于将它们确定为不同的种或亚种为足够清楚的个体。杂种可以是可育或者是不可育的，这取决于两个亲本基因组中的定性和/或定量区别。杂种优势，或杂种活力通常与杂合性增加相关，它导致杂种的生长，存活，和生育的活力比用于形成该杂种的亲本品系增大。最大杂种优势通常通过杂交两个遗传上不同的高度近交系来实现。
杂种的生产是一种开发成熟的工业，它涉及亲本株系和杂交这些品系产生的杂种的分离生产。对于杂种生产方法的详细讨论，参见例如，Wright，Commercial Hybrid Seed Production 8：161-176， In Hybridization of Corp Plants，出处同上。VI.转座子和转座因子
转座子是能从供体染色体位点向相同染色体或不同染色体上的靶位点转座(移动)的遗传元件。转座子通过插入编码序列，内含子和启动子中引起突变，通常完全消除靶基因的活性。转座子引起的突变通常由随后从基因中切除该转座子而不稳定。转座子的切除和整合需要一种或多种蛋白质，统称为“转座酶”。编码其自身转座酶源的转座子称为自主因子。提供另一位置的转座酶可转座不编码转座酶但含有终止序列，通常是转座所需的反向重复序列的转座子(非自主因子)。
A.Ds元件
在一个优选的实施方案中，包含Ds元件以便含有转座必需的终止序列(Coupland，G.，等，(1989)Proc Natl Acad Sci USA 86：9385-8；Chatterjee，S.等，(1995)Mol Gen Genet.249：281-8)，用于增强子缺失的与GUS报道基因融合的最小启动子(-47 CaMV 35S启动子)；在相反方向上，含有与增强荧光的，二元光谱GFP基因融合的剪接受体位点(Haseloff，J.，等，(1997)ProcNatl Acad Sci USA.94：2122-7；Haseloff，J.，等，(1999)Methods Mol Biol.122：241-59；Haseloff，J.(1999)Methods Cell Biol.58：139-51)用于基因捕获目的。该Ds元件可用于筛选相对于靶基因转录在一个插入方向的增强子陷阱或者在另一方向的基因陷阱。使用Ds的第二个实施方案取代了在Ds元件一端的转录激活物以产生获得功能的突变。两种元件都含有位点特异性重组的lox P位点(Osborne，B.I.，等，(1995)7：687-701；Medberry，S.L.，等，(1995)Nucleic Acids Res.23：485-90；Qin，M.，等，(1994)Proc Natl Acad Sci USA 91：1706-10)和用于除草剂(Finale)的bar基因(Thompson，C.J.，等，(1986)EMBOJ.6：2519-23)用于组织培养和土壤选择。Finale是glufosinate除草剂的注册商标。
B.植物中的转座子和插入突变的用途
转座子在细菌，真菌，植物和动物基因组的遗传分析和功能性基因组分析中具有巨大实用性。在植物中，遗传改造的转座子已被成功导入一些物种中(作为综述，参见Sundaresan，V.(1996)Trends Plant Sci.Vol.1：184-190)，包括水稻(Izawa，T.等，(1997)Plant Mol Biol Vol.35/1-2：219-29)，烟草，拟南芥属，莴苣和一些其它物种。一些研究者提出了巧妙的方法以增强回收转座事件的效率，包括对转座的正选择方法(Fedoroff，N.V.等，(1993)PlantJ.Vol.：3：273-289；Honma，M.A.等，(1993)Proc Natl Acad Sci USA Vol.90/13：6242-6)，对未连锁的元件的选择(Tissier等，(1999)The Plant Cell Vol.11：1841-1852；W.R.Sundaresan，等，(1995)Genes Dev.9/14：1797-810)，在整个基因组中分散的发送位点(Cooley，M.B.等，(1996)Mol Gen Genet Vol.252/1-2：1 84-94，Knapp，S.等，(1994)Mol Gen Genet Vol.243/6：666-73；Osborne，B.I.等，(1991)Genetics Vol.129/3：833-44；Takken，F.L.等，(1998)Plant J Vol.14/4：401-11，Thomas，C.M.等，(1994)Mol Gen Genet Vol.242/5：573-85；van der Biezen，E.A.等，1996 Mol Gen Genet Vol.251/3：267-80)和向元件中加入诸如增强子和基因陷阱的特征(作为综述，参见Sharknes，W.C.，(1990)Biotechnology 8：827-831；W.R.；Sundaresan，等，(1995)Genes Dev 9/14：1797-810)和转录激活(Fritze，K.等，(1995)Methods Mol Biol Vol.44：281-94；Kakimoto，T.，(1 996)Science Vol.274/5289：982-5；Kardailsky，I.，等，(1999)Science Vol.286/5446：1962-5)。
尽管在转座子应用中产生了巨大进展，但它们仍然局限于功能性基因组分析。转座通常发生在染色体内，且通常发生在供体和靶位点之间的短物理距离内(Moreno，M.A.等，(1992)Genetics Vol.131：939-956；Athma，P.等，(1992)Genetics Vol.131：199-209)。这种限制意味着大多数新插入发生在围绕具有许多发现在整个基因组中随机分散的较小元件的供体位点(发送位点)的区域。其次，转座过程通常不受控制，导致出现很多不遗传给后代的体细胞插入，和与生殖遗传事件不一致的发育早期转座。不能控制在体细胞中和暂时性的转座可导致由于体细胞和生殖突变事件之间不相符而产生的目的基因假阳性插入的高背景。
C.目前回收分散转座的背景技术方法
目前可利用两种方法部分克服非分散转座的限制。一个方法利用了遍及基因组的第一分散转座子发送位点。然而，该方法需要大量转基因起始品系以实现广泛的基因组覆盖度。分散转座事件的第二种方法是采用负选择标记，例如iaaH，pehA，R404，或胞嘧啶脱氨酶基因以对含有转座子和/或转座酶的供体位点进行选择。对供体元件的选择也对邻近(连锁的)的转座进行了选择导致富集未连锁的转座。在拟南芥属中已使用负选择以回收未连锁的Ds和Spm转座(W.R.；Sundaresan，等，(1995)Genes Dev.9/14：1797-810；Tissier，A.F.，等，(1999)The Plant Cell Vol.11：1841-1852)且两个负选择标记以除草剂前体的转化为基础(O′keefe，D.P.等，(1994)Plant Physiol Vol.105：473-482；Dotson，S.B.等，(1996)The Plant Journal Vol.10/2：383-392)，它是一种理论上适用于土壤选择的方法。
然而，使用负选择标记对大量独立转座的回收强加了严重的限制。首先，一些这类标记需要使用以组织培养为基础(W.R.；Sundaresan，等，(1995)Genes Dev.9/14：1797-810)的转座(Fedoroff，N.V.等，(1993)Plant J.Vol.：3：273-289)，它是一种给回收大量分散转座的方法增加了大量的花费和时间的劳动密集型过程。第二，负选择以化学试剂排除携带连接元件或转座酶或者两者的后代为基础(Tissie r，A.F.，等，(1999)The Plant Cell Vol.11：1841-1852；W.R.；Sundaresan，等，(1995)Genes Dev.9/14：1797-810)。当种子数量有限时，后代排除可能会成问题。例如，在诸如水稻(Orza sativa)的一种主要自花传粉物种的植物中，异型杂交单调且耗时，极大地限制了容易获得的后代数目。因此，如果转座率低且未连锁的转座代表了少数转座事件时，使用负选择回收分散转座将是昂贵且不现实的。例如，由于转座率为1-5％，50％发生减数分裂分离，且仅30％是未连锁转座，因此通过异型杂交回收10,000个转座需要评估几百万株后代植物。最后，使用诸如除草剂前体的负选择试剂具有严重的环境影响且由于使用化学试剂需要选择大量携带分散转座的后代而花费昂贵。而且，大多数这类化学试剂未批准野外使用。VII.转座酶
花表达的转座酶
与使用转座子进行诱变，基因标记和功能性基因组分析相关的另一限制是对转座过程缺乏发育上和时间上的控制。在大多数情况下，在其自身启动子控制下或在组成型启动子控制下的转座酶基因表达发生在植物的生长发育期间。转座酶源的营养性表达导致体细胞转座。只有当这些体细胞谱系随后产生大孢子或小孢子时才将这些转座遗传给后代(生殖性转座)。由于两个原因这是有问题的。一个原因是发生在生长性或早期生殖性发育期间的转座可以进行克隆繁殖且随后传递进许多配子中，导致在后代中回收到大量非独立性元件。当功能基因组分析或基因标记需要大量独立转座时这是不希望的。第二，体细胞转座通常不包括产生配子的谱系，例如发生在表皮细胞谱系或终端营养性结构中的那些转座。这些转座从未进行减数分裂遗传且因此在后代中回收不到。这样是有问题的，因为这些体细胞事件可在组织DNA样品中作为突变被假性鉴定，而在后代中回收不到。当突变筛选是基于样品化学的PCR时尤其有问题(Tissier，A.F.，等，(1999)ThePlant Cell Vol.11：1841-1852；McKinney，E.C.，等，(1995)Plant J.Vol.8：613-622；Krysan，P.J.等，(1996)Proc.Natl.Acad.Sci.USA Vol.93：8145-8150；Frey，M.等，(1997)Science Vol.277：696-699)。
在本发明的另一实施方案中，为了最小化体细胞转座的问题，将转座酶基因置于花特异性启动子的控制下，该启动子在花的表皮下细胞谱系中启动基因表达导致产生小孢子和大孢子。该启动子包括在诸如隐花基因(agamous)，无花瓣基因(apetala)1，无花瓣基因2，无花瓣基因3，雌蕊基因(pistillate)的基因中发现的那些启动子，和在诸如玉米和水稻的其它植物物种中发现的其同系物。例如，无花瓣基因3的启动子启动发育中的花分生组织的花瓣和萼片原基细胞中报道基因的表达。在ap3启动子控制下的转座酶表达导致转座局限于花发育，且当在产生小孢子的细胞谱系中发生时，这些事件将遗传给下一代。以该方法控制转座具有两种效应：1)它关闭体细胞转座；和2)当从许多不同的花分生组织产生花粉时它导致大量独立的转座。因此，可取样体细胞组织而不需考虑体细胞转座或二级转座，各花分生组织变成转座事件的独立来源。VIII.水稻-一种模式植物系统
A.美国和全世界的水稻农业
大约一半的世界人口主要从水稻获取热量。全世界每年的生产水平超过4亿公吨，在超过2亿公顷的土地上生长(不记名的(2000)美国农业部世界农业供给和需求估计。美国农业部农业市场服务处。公开号WASDE-362)。
目前，美国每年生产7.5百万公吨的水稻，种植在1.4百万公顷的土地上，产生17亿美元的贸易额(不记名的(2000)美国农业部世界农业供给和需求估计。美国农业部农业市场服务处。公开号WASDE-362)。在本国生产的超过三分之二的水稻出口到主要在亚洲和拉丁美洲的市场，使美国成为世界上第三大出口国。
现在生长的大约99％的水稻品种是公共育种计划的结果，许多来自诸如国际水稻研究所(IRRI)和国际热带农业中心(CIAT)的CGIAR国际研究中心(http：//www.cgiar.org/irri/crucial.htm)发起的育种计划。大多数美国水稻品种在阿肯色州，路易斯安娜州，密西西比州，德克萨斯州和加利福尼亚州形成。农业生物技术对于形成现代变种的水稻品系变得越来越重要；生物技术发展预期极大地帮助美国水稻农场主在全球市场中竞争。
B.水稻作为单子叶植物发育的模式系统
谷类植物包括世界上大多数重要的食品农作物，且认为是相对近代的分类单位，从仅65百万年前的共同祖先进化而来(Martin，W.，等，(1989)Nature 339：46-48；Moore，G.，等，(1995)Trends Genet.11：81-82)。这种年轻的历史反映在基因结构和次序的显著保守程度上，尽管在基因组大小，单倍体染色体数目上和在重复序列组成的变化上出现了区别(Moore，G.，等，(1993)Bio/technology.11：584-589)。例如，玉米基因组比水稻大8倍(Ahn，S.等，(1993)Genetics 90：7980-7984)且组织成不同数目的染色体，另外比较分子分析显示在其许多基因组之间可鉴定到广泛的同线性(Ahn，S.等，(1993)Genetics.90：7980-7984；Bennetzen，J.L.等，(1993)Trends Genet.9：259-261)。
水稻是谷类禾本植物出色的模式植物。水稻可用于研究基础生物学问题和了解诸如产量，杂种活力和单基因或多基因疾病抗性的农学性状。不同的水稻品种适应从热带水田到温带旱地的大范围的环境情况，因此，它是现实生活适应性反应的模型。
水稻具有相对较短的世代时间(90-120天)，使其每年可获得三代或更多代。在水稻中已发现和鉴定了大量突变标本。
通过土壤杆菌属介导(Hiei，Y.，等，(1994)Plant J.6：271-82；Hiei，Y.，等，(1997)Plant Molec Bio.35：205-218；Zhang，J.，等，(1997)Mol Biotechnol.8：223-31)或生物导弹方法(Christou，P.，等，(1991)Biotechnology.9：957-962；Buchholz，W.G.，等，(1998)Methods Mol Biol.81：383-96)可有效地产生转基因水稻。最重要的是，水稻具有大约500兆碱基(Mb)的基因组大小(Arumanagathan，K.等，(1991)Plant Mol.Biol.Reporr.9：208-218)，比拟南芥属基因组大仅约3倍，且预定在2004年左右测序。作为禾本科的一个成员和一种重要的农作物植物，从水稻基因组可了解到关于植物生物学重要方面的丰富基础信息(McCouch，S.(1998)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 95：1983-5；Wilson，W.A.，等，(1999)Genetics.153：453-73)。
C.水稻基因组
水稻是定位最密集的植物基因组之一(McCouch，S.R.，等，(1997)PlantMol Biol.35：89-99；Panaud，O.，等，(1996)Mol Gen Genet.252：597-607)。两个绘制最好的重组图谱是在Cornell( http：//genome.cornell.edu/rice/)和日本水稻基因组计划(RGP)( http：//www.dna.affrc.go.jp)绘制的图谱，其中定位了超过3,000个RFLP和SSR标记。以YAC为基础的水稻物理图谱覆盖了超过64％的基因组且含有4,000个定位的ESTs(Ashikawa，I.，等，(1999)Genome.42：330-7)。用STSs和ESTs已经定位了71,000个克隆的PAC文库且定位的克隆覆盖了大约30％的基因组。具有37,000个和55,000个成员的两个BAC文库已被进行了BAC-末端测序和指纹分析并绘制了基于BAC的物理图谱( http：//www.genome.clemson.edu/projects/rice/)。
估计水稻基因组含有500 Mb(Arumanagathan，K.等，(1991)Plant Mol.Biol.Report.9：208-218)和340,000个基因。在1998年形成了国际水稻基因组测序计划以便获得Oryza sativa ssp.japonica cv.Nipponbare的全部基因组序列。10个国家在这项工作中进行合作。目前大约有10Mb已经提交进GenBank。
D.基于转座子的基因组计划的用途
使用转座子的主要理由是其相对于功能性基因组研究的其它类型的诱变剂有明显的优点。在水稻中，T-DNA和反转录转座子诱变具有严重的局限性。目前，两种方法都需要连续的组织培养选择和体细胞再生以回收插入，这些过程无效率，耗时和倾向于诱导体细胞克隆变异(Bao，P.H.，等，(1996)Transgenic Res.5：97-103；Evans，D.A.(1989)Trends Genet.5：46-50)。这两种因素仅产生稳定的插入，随后限制了任何突变等位基因的应用。至于更复杂的原因，T-DNA插入通常是大量的，复杂的串连排列，引起突变等位基因的分子分析产生困难(McKinney，E.C.，等，(1995)Plant J.8：613-622；Krysan，P.J.，等，(1996)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 93：8145-8150；Krysan，P.J.，等，(1999)Plant Cell.11：2283-2290；Galbiati，等，(2000)Functional &Integrative Genomics，in press)。
在许多场合下，诸如T-DNA或反转录转座子诱导的等位基因的单个功能丧失突变不能提供得出基因功能的足够信息。例如，根据迄今的有限研究，许多基因破坏不能产生容易识别的表型(McKinney，E.C.，等，(1995)PlantJ.8：613-622；Krysan，P.J.，等，(1996)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 93：8145-8150)。然而，这并不意味着缺乏基因重要性，因为许多这类基因具有部分多余，重叠或者基于形态学或发育筛选突变品系不能检测特定功能。诸如表达分析和另外的等位基因的更详细的信息将是必需的。
另一方面，诸如Ac/Ds系统的双元件转座子诱变通过简单插入可产生稳定的基因破坏。遗传改造的Ds元件已被成功导入一些植物种类中(作为回顾，参见Martienssen，R.A.(1998)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 95：2021-6；Sundaresan，V.(1996)Trends Plant Sci.1：184-190)，包括水稻(Izawa，T.，等，(1997)Plant Mol Biol.35：219-29)。
通过将一些特征构建进合成转座子中已极大地增强了转座子在功能性基因组学中的应用，例如增强子和基因陷阱(traps)(作为回顾，参见Martienssen，R.A.(1998)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 95：2021-6；Sharknes，W.C.(1990)Biotechnology 8：827-831；Sundaresan，V.，Springer，等，(1995)GenesDev.9：1797-810)和转录激活(Fritze，K.等，(1995)Methods Mol Biol.44：281-94；Kakimoto，T.(1996)Science.274：982-5；Kardailsky，I.，等，(1999)Science.286：1962-5)。通过插入这些特征，即使是遗传上多余的基因也可进行功能分析。最重要的是，重新移动转座子的能力创造了通过定位这些元件的转座特性有效产生衍生等位基因和有效突变邻近基因的唯一机会(Long，D.，等，(1997)Plant J.11：145-8；Jones，J.D.G.，等，(1990)Plant Cell.2：701-707；Osborne，B.I.，等，(1991)Genetics.129：833-44)。用一些充分鉴定的转基因品系和合适的遗传策略开始，可有效产生分散转座的广泛标本而不需随后的组织培养选择或再生。
E.在整个水稻基因组中随机分散的Ds
本发明包括可应用于特定基因组，包括但不限于水稻基因组的方法。水稻是谷类禾本植物的杰出模式植物。本发明的方法应用到水稻基因组时，一个目标是产生在整个水稻基因组中分布的稳定Ds插入的广泛标本。为了实现该任务，设计了一些遗传策略，主要目标是最小化非独立转座，在整个水稻基因组中的分散Ds转座，和稳定子代中的转座因子。设计用于本发明方法中的具体品系是Oryza sativa ssp.japonica cv.Nipponbare，即被IRGSP测序的品系。
在本发明的一个实施方案中，包含在整个水稻基因组中随机分散的Ds。由于Ds倾向于局部转座，通常跨越较短的遗传距离，因此必须使用遗传策略逆转这种偏向。过去，使用基本上包含选择后代中的Ds发送位点的各种方法(Sundaresan，V.，等，(1995)Genes Dev.9：1797-810；Tissier，A.F.等，(1999)The Plant Cell 11：1841-1852)，或者通过在整个基因组中起始分散许多发送位点(Osborne，B.I.，等，(1991)Genetics.1 29：833-44；Cooley，M.B.，等，(1996)Mol Gen Genet.252：184-94；Knapp，S.，等，(1994)Mol Gen Genet.243：666-73；Takken，F.L.，等，(1998)Plant J.14：401-11；Thomas，C.M.，等，(1994)Mol Gen Genet.242：573-85；van der Biezen，E.A.，等，(1996)Mol GenGenet.251：267-80)可实现这点。
设计了两种分散Ds转座的策略。第一种方法广义上涉及包括在Ds发送位点上的花粉特异性自杀性状基因以消除伴随任何连锁的转座因子的发送位点的传播。通过插入启动合适细胞死亡基因表达的花粉特异性启动子构建自杀性状。由于发送位点构建体是单拷贝且在起始植物中是半合子，因此50％的减数分裂产物遗传T-DNA且经历遗传性自杀；剩余产物产生活花粉。在染色体内或染色体之间与发送位点重组的那些转座Ds通过花粉传播。通过将除草剂标记(bar基因)插入Ds元件中可容易地在后代中检测这些元件。除草剂标记用于双重目的，即开始作为水稻转化的组织培养选择标记，随后作为对含有未连锁的Ds元件的后代进行基于土壤的选择。
花粉自杀方法相对于以前选择未连锁的转座的策略具有显著的优势。其主要优势在于花粉生产大量过剩且花粉半不育对环境是合理的以及对种子生产如果有影响的话，影响也很小。在后代中，简单地通过负选择可拣出50％的测交后代(或者75％的自交后代)，因为它们遗传了发送位点(和/或转座酶基因，如下所述)。在水稻中，当需要异型杂交回收转座时，种子生产可能是一个限制因素。而且用于负选择的诸如除草剂前体的化学试剂(Tissier，A.F.，等，(1999)The Plant Cell.11：1841-1852；Dotson，S.B.，等，(1996)The Plant Journal.10：383-392)既不能从商业途径获得也未获联邦政府批准野外使用。基于负选择的组织培养(Sundaresan，V.，等，(1995)Genes Dev.9：1797-810；Kobayashi，T.，等，(1995)Jpn J.Genet.70：409-22)在水稻中是不现实的。
在本发明的一个实施方案中，使用启动自杀基因表达的合适启动子构建花粉特异性自杀性状。一些自杀基因是可获得的，包括芽孢杆菌RNA酶基因(Goldman，M.H.，等，(1994)EMBO J.13：2976-84)，相关RNases(Fedorova，N.D.，等，(1994)Mol Biol(Mosk).28：468-71)，白喉毒素A链基因(Tsugeki，R.等，(1999)Proc Natl Acad Sci U S A.96：12941-6；Nilsson，O.，等，(1998)Plant J.15：799-804；Uk Kim，等，(1998)Mol Cells.8：310-7；Day，C.D.，等，(1995)Development 121：2887-95)及其它(DeLong，A.，等，(1993)Cell.74：757-768)。已经表明当与花粉特异性启动子融合时使用芽孢杆菌RNA酶基因是产生小孢子自主细胞死亡的有效方法(Custers，J.B.，等，(1997)Plant MolBiol.35：689-99)。与以前的方法相反，本发明的方法依赖于产生半不育，与完全的雄性不育相反，可以通过构建在小孢子中特异性表达芽孢杆菌RNA酶在本发明的一个方面实现半不育。用于该目的的一些启动子是可获得的，包括水稻(Zou，J.T.，等，(1994)Amer.J.Botany.81：552-561)和玉米花粉特异性启动子(Hamilton，D.A.，等，(1992)Plant Mol Biol.18：211-8)，和来自一些双子叶物种的花粉特异性启动子(Twell，D.，等，(1991)Genes Dev.5：496-507；Kulikauskas，R.等，(1997)Plant Mol Biol.34：809-14；Custers，J.B.，等，(1997)Plant Mol Biol.35：689-99；Albani，D.，等，(1991)Plant Mol Biol.16：501-13；Kim，Y.等，(1992)Transgenic Res.1：188-94；Twell，D.，等，(1990)Development.109：705-13；van Tunen，A.J.，等，(1990)Plant Cell.2：393-401)。在一个优选的实施方案中，诸如玉米启动子(Hamilton，D.A.，等，(1992)Plant Mol Biol.18：211-8)的异源性花粉特异性启动子预期可最小化基因沉默的可能性。
在T-DNA(发送位点)消除中花粉自杀机制效力的评估可通过例如，采用含有自杀基因和bar基因的构建体通过土壤杆菌属介导的T-DNA转化法转化进诸如水稻的生物体中来实现(Hiei，Y.，等，(1994)Plant J.6：271-82；Hiei，Y.，等，(1997)Plant Molec Bio.35：205-218；Zhang，J.，等，(1997)Mol Biotechnol.8：223-31)。然后通过Southern分析可鉴定一些单拷贝的T-DNA品系(SCTLs)(Ausebel，F.M.，等，(1987)In：Current protocols in molecular biology，ed.Chanda，V.B.Boston：John Wiley & Sons，Inc.)。为了检测T-DNA消除的效力，然后对未选择的异型杂交后代进行PCR实验以检测T-DNA的传播。这种分析在来自未选择的后代的DNA集合体上进行(例如，最小384个DNA集合体，每个集合体含有12株植物)。使用该评估方法，预期可检测其它构建体，例如包含转座酶源(下文解释)，花粉自杀基因和Ds-bar元件的那些构建体。
F.转座酶表达
本发明的另一实施方案涉及富集独立转座而最小化非独立转座的回收。实现这点的一个方法是通过延迟发育中的转座以防止非独立事件的早期克隆繁殖和减数分裂传播。通过使用异源性启动子启动Ac转座酶基因实现对转座的发育时间选择的控制(Rommens，C.M.，等，(1992)Mol Gen Genet.231：433-41；Balcells，L.等，(1994)Plant Mol Biol.24：789-98；Scofield，S.R.，等，(1992)Plant Cell.4：573-82；Swinburne，J.，等，(1992)Plant Cell.4：583-95；Grevelding，C.，等，(1992)Proc Natl Acad Sci USA.89：6085-9)。在本实施方案中设想了一些异源性启动子。
在一个优选的实施方案中，富集独立转座的策略是将转座酶表达特异性地限制在花发育期间，优选排除雌蕊表达(原因在下文解释)，以防止营养性转座。可使用花特异性启动子启动雄蕊原基形成期间的转座酶表达，排除雌蕊表达的一些启动子是可获得的，例如水稻(Moon，Y.H.，等，(1999)PlantMol Biol.40：167-77；Kang，H.G.，等，(1998)Plant Mol Biol.38：1021-9；Greco，R.，等，(1997)Mol Gen Genet.253：615-23)或玉米MADS-盒基因启动子(Mena，M.，等，(1996)Science 274：1537-40；Mena，M.，等，(1995)Plant J.8：845-54)。为了增强转座频率，在水稻中可使用Ac转座酶的全长cDNA和截短形式。已经表明截短形式(ORF 103-807)在异种植物物种中增强转座频率(Houba-Herin，等，(1990)Mol Gen Genet.224：17-23；Li，M.G.等，(1990)Proc NatlAcad Sci USA.87：6044-8)。
将转座酶表达限制在花发育期间意味着各小花代表一个独立的转座源。统计学上，非独立转座的回收率低(如果来自各花药的花粉当作一个独立转座源，那么来自同一花药的花粉产生后代种子的几率是不太可能的)，产生的花药(每个小穗6个)比种子(每个小穗1个)至少多6倍。本发明的实施方案包括使用35S-启动的转座酶(全长和截短形式)和花表达的转座酶构建体与插入bar基因5’UTR中的单Ds元件一起转化进水稻。然后通过Southern分析鉴定单拷贝插入品系且将这些植物与野生型雄性不育IR36雌性植株进行异型杂交。然后对后代幼苗进行二叶期施用Finale(见下文)以选择切除Ds的后代。根据Ac/Ds转座的机制(Chen，J.，等，(1987)Genetics.117：109-116；Chen，J.，等，(1992)Genetics 130：665-676；Greenblatt，I.M.等，(1962)Genetics.47：489-501)，这些后代超过50％含有连锁或未连锁的转座Ds元件。以Southern分析法分析来自各原种的Finale-抗性后代以测定 独立转座回收的效率。
一旦转座，需要稳定Ds元件，它还具有重新移动的能力。为了稳定转座的Ds元件，在含有Ds发送位点的最终T-DNA构建体内包含合适的转座酶基因。花粉自杀方法或bar反义策略可消除转座酶源与T-DNA，从而稳定后代中任何转座的Ds元件。在后代中重新导入转座酶可容易地使Ds元件去稳定，允许局部诱变邻近基因(Long，D.，等，(1997)Plant J.11：145-8；Ito，T.，等，(1999)Plant J.17：433-44)或任意单基因的重组(饱和状态)诱变(Moreno，M.A.，等，(1992)Genetics.131：939-956；Athma，P.，等，(1992)Genetics.131；Das，L.等，(1995)Plant Cell.7：287-94)。
                                 实施例
实施例1.遗传构建体
pYU904-合成Ds元件
通过组合转座所需的Ac5’和3’端构建合成Ds元件。使用引物P643(aagctttggccatattgcagtcatcc)(SEQ ID NO：1)和P644(aagcttgctcgagcagggatgaaagtaggatggga)(SEQ ID NO：2)扩增激活物元件(Ac)5’端从位置4312到4565bp(GenBank登记号X01380)(SEQ ID NO：3)，同时向该片断3’端加入一个Hind III克隆位点，5’端加入Hind III和Xho I位点。使用引物P645(gaattccctcgagtagggatgaaaacggtcggtaac)(SEQ ID NO：4)和P646(gaattcgaatatatgttttcatgtgtgat)(SEQ ID NO：5)扩增Ac元件3’端从位置1到221bp，同时向该片断3’端加入另一EcoRI和XhoI限制性位点和向扩增片断的5’端加入另一EcoRI限制性位点。将这些片断逐个克隆进载体pCR2.1-TOPO(Invitrogen)中。
质粒pYU890含有Ac元件的5’端片断，质粒pYU892含有Ac元件的3’端片断。
pYU892用EcoRI(New England Biolabs)消化，将230个碱基对(bp)的EcoRI插入片断克隆进pUC19(GenBank登记号M77789)的EcoRI位点以产生pYU899。
pYU890用HindIII(New England Biolabs)消化，将250bp的插入片断亚克隆进质粒pYU899的HindIII位点产生质粒pYU902。该质粒含有转座所需的Ac的5’和3’端，和内部的多接头位点用于随后的克隆目的。
通过首先用SacI和SalI消化，用Klenow补齐并重新连接构建pBLUESCRIPT II K/S(Stratagene)的缺失衍生物(pYU903)。然后用Asp 718和Apa I消化该质粒，用Klenow补齐并重新连接。衍生的质粒代表缺失了KpnI-SacI多接头的限制性位点但具有完整的XhoI克隆位点。
用XhoI(New England Biolabs)消化pYU902，并将内部的571bp片断克隆进pYU903的XhoI位点产生pYU904(图4A)。该质粒含有Ac的5’和3’端，和Ds元件内的多克隆位点，该位点现在是该质粒特有的。这种Ds元件称为“Ds-多接头”。
含有选择标记基因的pYU905-Ds元件
含有吸水链霉菌bar基因的1.1kb SmaI片断(Genbank登记号X17220)(SEQ ID NO：6)与0.6kb CaMV 35S启动子片断(Benfey和Chua，1990)和3’多聚腺苷化信号元件(位置514-813)(GenBank登记号V00090)(SEQ IDNO：7)融合以产生质粒pYU117。
质粒pYU117用HindIII和SnaBI(new England Biolabs)消化且含有CaMV 35S启动子-bar基因-终止子基因的1.8kb的片断用Klenow片断DNA聚合酶(New England Biolabs)补齐。将该修饰的片断克隆进pYU904的SnaBI位点以产生pYU905(图4B)。
pYU905含有在Ds-多接头转座因子内的CaMV 35S-启动的bar基因。这种合成的Ds元件称为“Ds-bar”。
pYU846-转座酶源
质粒pKU108A含有阅读框截短的转座酶cDNA(ORFa103-807)(Lee和Starlinger，PNAS 87：6044-6048.1990)，用NcoI和BamHI(New EnglandBiolabs)消化该质粒。纯化内部的2.1kb片断并亚克隆进预先用相同酶消化的pRTL2(Restrepo-Hartwig和Carrington.J.Virology 66：5662)中。所得的质粒pYU846(图5)含有CaMV 35S启动子，截短的Ac转座酶cDNA(氨基酸103-807)和35S多聚腺苷化序列的转录融合体。
GST构建体
GST构建体的两个例子以表1(SEQ ID NO：15)和表2(SEQ ID NO：16)所示的解淀粉芽孢杆菌的芽孢杆菌RNA酶基因为基础。通过用来自拟南芥(Arabidopsis thaliana)的双子叶植物花粉特异性启动子(At59)或来自Oryzasativa(水稻)的单子叶植物花粉特异性启动子(GenBank Accession Z 16402)(SEQ ID NO：9)替换绒毡层特异性的烟草启动子TA29(Genbank AccessionA18052)(SEQ ID NO：8)产生这些质粒。
使用引物P755(acccatgtgagttttctttcttctccat)(SEQ ID NO：10)和P756(ttataggaaaattccagcagctcagcat)(SEQ ID NO：11)从拟南芥Col-O基因组DNA扩增At59启动子和5’UTR。这些引物同时扩增该启动子和5’UTR序列，同时在翻译起始位置导入一个5’PstI克隆位点和一个3’NcoI位点。该NcoI位点与在3’端含有胭脂氨酸合成酶多聚腺苷化信号元件的芽孢杆菌RNA酶基因的0.74kb NcoI-EcoRI位点融合以产生At59PSP：芽孢杆菌RNA酶：nos转基因(表1)(图3A)。
同样，使用引物P731(gaattccgggccatggcatcctttag)(SEQ ID NO：12)和P732(ccatggatgatgtggctgcaaatg)(SEQ ID NO：13)从Orza sativa ssp.indicaIR36基因组DNA扩增水稻花粉特异性启动子(GenBank Accession Z16402)(SEQ ID NO：9)，这些引物扩增启动子和5’UTR片断，同时在翻译起点导入5’EcoRI位点且包含3’NcoI位点。将该0.74kb EcoRI-NcoI片断与在3’端含有胭脂氨酸合成酶多聚腺苷化信号元件的芽孢杆菌RNA酶基因的NcoI位点连接以产生OsPSP：芽孢杆菌RNA酶：Nos转基因(表2)(图3B)。
T-DNA构建体
T-DNA载体pPZP200(GenBank Accession U10460)(SEQ ID NO：14)用PstI消化，连接到pYU846的3.2kb PstI片断上以产生pYU1001。用Asp718消化pYU1001，用Klenow补齐，并连接到T4 DNA聚合酶处理的1.2kb PstI-EcoRI At59：芽孢杆菌RNA酶：nos基因片断(pYU1002)上或者连接到1.3kb的Klenow-处理的Eco RI OsPSP：芽孢杆菌RNA酶：nos基因片断(pYU1003)上。
用SalI消化pYU1002或pYU1003并连接到来自pYU905的2.3kb XhoIDs-bar元件上以产生含有GST，转座酶源和Ds-bar元件的质粒pYU1004。
  表1.AT59：芽孢杆菌RNA酶：Nos GST构建体的序列和特征
特征         位置/限定词
新特征       840..1245
             /注解＝“含有来自土壤杆菌属T-DNA的胭脂氨酸合成
             酶基因多聚腺苷化位点的3’调节序列”
5’UTR       393..503
             在3’端AA变成CC产生NcoI位点
TATA_信号    364..368
引物_结合    1..30
             从CCAT变成TGCA
引物_结合    互补(480..501)
             扩增At59启动子并导入NcoI位点的引物
CDS          504..839
             /注解＝“芽孢杆菌RNA酶基因的编码序列”
启动子       1..392 At59启动子区
新特征       1241..1246 EcoRI克隆位点
新特征       1..6 PstI克隆位点
碱基计数     400a  232c  235g  375t
原始数据
   1  ctgcagggga  tttttttaat  tacttgtatg  ataattattt  tcaatagacc  tagagacttg
  61  atatatacta  cgtttaataa  tcatatgtag  tatgtatgat  taattaagta  aatacaaaaa
 121  tagttacctc  aagttttaaa  ggtgctattg  ggtaattatc  tcagtaaaaa  taatattaga
 181  tcaaggcaaa  aataactgaa  aatatccaga  aaagaaggat  taaacaaagg  catccaaaat
 241  ctataattgg  gttttttgga  gaaatgacca  tagagattta  aatcaatggt  tgtctaatct
 301  atgttaattc  tcaatcctct  attgactctt  ctcatctcct  tttctctctc  cccagttcct
 361  ggttattaaa  gcaatcaggt  gattcaaatc  tttaatcttt  taatcccggc  aggcctatct
 421  gaaacaacaa  cctccgtttg  aggttttgcc  gggaaaatat  aaagttcaca  ggctttggtc
 481  tctgcatttg  caatatattt  accatggtac  cggttatcaa  cacgtttgac  ggggttgcgg
 541  attatcttca  gacatatcat  aagctacctg  ataattacat  tacaaaatca  gaagcacaag
 601  ccctcggctg  ggtggcatca  aaagggaacc  ttgcagacgt  cgctccgggg  aaaagcatcg
 661  gcggagacat  cttctcaaac  agggaaggca  aactcccggg  caaaagcgga  cgaacatggc
 721  gtgaagcgga  tattaactat  acatcaggct  tcagaaattc  agaccggatt  ctttactcaa
 781  gcgactggct  gatttacaaa  acaacggacc  attatcagac  ctttacaaaa  atcagataac
 841  gaaaaaaacg  gcttcctgcg  gaggccgttt  ttttcagctt  tacataaagt  gtgtaataaa
 901  tttttcttca  aactctgatc  ggtcaatttc  actttcccgn  nnnctctaga  ggatccgaag
 961  cagatcgttc  aaacatttgg  caataaagtt  tcttaagatt  gaatcctgtt  gccggtcttg
1021  cgatgattat  catataattt  ctgttgaatt  acgttaagca  tgtaataatt  aacatgtaat
1081  gcatgacgtt  atttatgaga  tgggttttta  tgattagagt  cccgcaatta  tacatttaat
1141  acgcgataga  aaacaaaata  tagcgcgcaa  actaggataa  attatcgcgc  gcggtgtcat
1201  ctatgttact  agatcgggaa  gatccccggg  taccgagctc  gaattc (SEQ ID NO：15)
  表2.OsPSP：芽孢杆菌RNA酶：Nos GST构建体的序列和特征
特征         位置/限定词
新特征       1208..1213
             /注解＝“EcoRI克隆位点”
新特征       807..1212
             /注解＝“含有来自土壤杆菌属T-DNA胭脂氨酸合成
             酶基因多聚腺苷化位点的3’调节序列”
CDS          471..806
             /注解＝“芽孢杆菌RNA酶基因的编码序列”
新特征       1..6
             /注解＝“EcoRI克隆位点”
启动子       6..470
             /注解＝“OsPSP启动子区”
碱基计数     374a  279c  239g  317t
原始数据
   1  gaattccggg  ccatggcatc  ctttagaatg  gaggaattta  agtgaaattg  agctaaacta
  61  tgtgaacatc  ctatgaagtt  actgcattca  aggcgcccaa  catgaaatct  attcaggttc
 121  ccaagttgtg  ggcttccgta  acgtcaaaat  tcgacagatt  tctggctggc  taaaacaccc
 181  acaacggcaa  taatagcctc  gctcgtcaaa  acattcaccc  atttttagct  tggtcatcat
 241  caaaagtagg  atcaaatcaa  caatctgcct  tctcttcagc  cactcgatcc  caacggcatc
 301  tccaacgatt  cctacttgaa  ggacagccat  ggaaatcctc  caggttcccc  aggttactta
 361  taccacagct  cgaatccgtt  ccaaaccagg  ccatttcagt  accctcctct  cacattttcc
 421  ccaaataata  atagaggaag  gggaaaaaca  catttgcagc  cacatcatcc  atggtaccgg
 481  ttatcaacac  gtttgacggg  gttgcggatt  atcttcagac  atatcataag  ctacctgata
 541  attacattac  aaaatcagaa  gcacaagccc  tcggctgggt  ggcatcaaaa  gggaaccttg
 601  cagacgtcgc  tccggggaaa  agcatcggcg  gagacatctt  ctcaaacagg  gaaggcaaac
 661  tcccgggcaa  aagcggacga  acatggcgtg  aagcggatat  taactataca  tcaggcttca
 721  gaaattcaga  ccggattctt  tactcaagcg  actggctgat  ttacaaaaca  acggaccatt
 781  atcagacctt  tacaaaaatc  agataacgaa  aaaaacggct  tcctgcggag  gccgtttttt
 841  tcagctttac  ataaagtgtg  taataaattt  ttcttcaaac  tctgatccgt  caatttcact
 901  ttccggnnnn  ctctagagga  tccgaagcag  atcgttcaaa  catttggcaa  taaagtttct
 961  taagattgaa  tcctgttgcc  ggtcttgcga  tgattatcat  ataatttctg  ttgaattacg
1021  ttaagcatgt  aataattaac  atgtaatgca  tgacgttatt  tatgagatgg  gtttttatga
1081  ttagagtccc  gcaattatac  atttaatacg  cgatagaaaa  caaaatatag  cgcgcaaact
1141  aggataaatt  atcgcgcgcg  gtgtcatcta  tgttactaga  tcgggaagat  ccccgggtac
1201  cgagctcgaa  ttc  (SEQ ID NO：16)
实施例2.防止或消除转基因的传播
当为半合子时，通过将目的基因与在雄性或雌性特异性启动子控制下的自杀基因连接可实现消除转基因座的传播。称为“配子体自杀性状”(GST)的该构建体诱导局限于得到了GST的小孢子或大孢子的细胞死亡，从而有效减少或消除与GST连接的目的基因的传播。
携带需要从转基因花粉消除的特定性状(即，目的转基因)的基因可置于任何位置，只要它与GST物理上邻近。因为GST转基因复合体是半合子的，GST转基因复合体将完全连锁且不必顾虑GST与其它基因和/或转基因会重组。
可在不需培养或再生的植株或者种子转化技术中使用本发明的方法。这些技术的例子在Bechtold，N.，等，(1993)CR Acad.Sci.Paris/Life Sciences316：1118-93；Chang，S.S.，等，(1990)拟南芥属研究第四届国际会议摘要，维也纳，第28页；Feldmann，K.A.和Marks，D.M(1987)Mol.Gen.Genet.208：1-9；Ledoux，L.，等，(1985)Arabidopsis Inf Serv.22：1-11；Feldmann，K.A.(1992)见：Methods in Arabidopsis Research(Eds.Koncz，C.，Chua，N-H，Schell，J.)第274-289页；Chee，等，美国专利系列号5,376,543中描述。
拟南芥属
含有与bar转基因连接的GST构建体(即，At59PSP：芽孢杆菌RNA酶：nos或者OsPSP：芽孢杆菌RNA酶：Nos)的质粒经电穿孔转化进土壤杆菌属，然后使用真空渗入法导入拟南芥属植物中(Bechtold等，1993，出处同上)。如以前所述，bar基因构建体编码由CaMV 35S启动子启动的phosphinothricin乙酰转移酶(PAT)以提供对phophinothricin(PPT)的抗性。
根据对PPT的抗性选择转化体，从许多独立的品系产生T2种子。该种子种植在含有各种浓度除草剂的GM培养基中并评价发芽和存活。过量表达野生型或抗性突变体之一的多转基因品系在对空载体对照致死的除草剂浓度上产生大量绿色幼苗。
对于许多转基因座和转基因插入的复杂性仅需鉴定包含在转基因复合体和起始转基因品系中的转基因或目的基因以鉴别具有单拷贝，非串联重复插入的品系。起始转基因的鉴定通过PCR和/或Southern分析实现，这两种方法对于DNA扩增和凝胶电泳领域的技术人员是熟知的。
使用合适的统计学方法(例如，随机化完全区组(block)设计或点阵设计)在与单独的目的转基因(即，转基因中不存在GST)纯合子/杂合子的转化植物和对照，野生型植物(即，GST和目的转基因都没有的植物)相同的生长条件下生长GST/目的转基因(本实施例中是bar基因)半合子的转化植物。从个体植物中分别收集花粉并分析转基因和/或进行与野生型植物的控制杂交，以每株植物为基础收集种子并分析所得的种子/植物的转基因。
GST/转基因复合体半合子的植物和野生型植物产生花粉和/或种子/植物，它们都不含目的转基因。相反，转基因杂合子植物产生的花粉和种子/植物显示出正常的目的转基因分离。目的转基因纯合子植物产生的花粉都含有目的转基因。当与野生型植物杂交时目的转基因纯合子植物产生显示出目的转基因正常分离模式的F2种子/植物。因此，GST/转基因复合体半合子的植物不能产生具有转基因的花粉，而单独的转基因纯合子或杂合子植物产生至少一些含有目的基因的花粉。
对于本发明的分散转座方面情况相同。起始转基因复合体携带GST和转座子和/或转座酶。产生转基因品系后，选择它们的分散转座。即，一个或两个转基因品系都是随后的选择所需要的。不需进一步转化。另外，如果需要辅助转化体的选择可加入诸如CaMV 35S启动子/bar基因构建体的任选转基因。
草坪草
构建在玉米花粉特异性启动子控制下的编码芽孢杆菌RNA酶的基因的核酸构建体(GST)使得Roundup抗性基因与GST相连。初始(即，野生型)草坪草基因组用含有三个元件(玉米花粉特异性启动子，芽孢杆菌RNA酶基因，Roundup抗性基因)的转基因复合体转化以便所得的转基因植物是转基因复合体半合子。
转基因植物无性繁殖产生对于转基因复合体也是半合子的后代植物。尽管从转基因植物无性产生的所有植物对Roundup处理有抗性，但由于不能产生活的转基因花粉而排除了通过异花传粉传播Roundup抗性基因。
由于GST构建体是雄性特异性，通过与野生型花粉杂交可维持半合子转基因品系。当需要消除转基因时(例如，在对分散转座的选择中)，使用半合子转基因品系作为雄性(花粉供体)并与野生型雌性杂交。在这种情况下，只有非转基因花粉或含有分散转座的花粉可繁殖。为达到消除不需要的转基因(例如，草坪草中的除草剂抗性)花粉传播的目的，可种植半合子转基因品系且只有野生型花粉存活。
苜蓿
构建在水稻花粉特异性启动子控制下的编码芽孢杆菌RNA酶基因的核酸构建体(GST)以便Bt基因与GST相连。初始(即，野生型)苜蓿基因组用含有三个元件(水稻花粉特异性启动子，芽孢杆菌RNA酶基因，Bt基因)的转基因复合体转化以便所得的转基因植物是转基因复合体半合子。
该半合子转基因植物无性繁殖产生对于转基因复合体也是半合子的后代植物。尽管该植物对某些鳞翅目昆虫害虫有抗性/耐受性，但由于不能产生活的转基因花粉而排除了通过异花传粉传播Bt基因。
转化的玉米
对于玉米，将GST/转基因复合体插入玉米基因组且“雌性”亲本携带转基因复合体。与野生型花粉杂交时，只有1/2的后代杂种种子携带转基因复合体(对于功能性基因组应用无问题)。通过使用flp或lox重组酶系统绕过该限制，即GST性状保持无活性且为纯合子，直到产生杂种。在这点上，frt-或cre-介导的重组激活GST性状(例如，通过去掉DNA转录抑制或通过激活转录)，现在存在于所有杂种后代中而不是1/2后代中。从遗传了该转基因复合体的任何花粉中(例如，50％的减数分裂产物)排除含有激活GST的转基因复合体。
实施例3.富集分散的转座事件
通过物理连接不育性状与转座子发送位点和/或转座酶源，使用“遗传不育过滤”高度富集分散和/或稳定转座事件而不使用化学试剂且不需对含有连锁转座事件和/或转座酶源的后代进行选择。
例如，当实现50％的雄性不育时，剩下的活单倍体基因组由于正常同源染色体分离，独立分配和减数分裂重组而没有遗传自杀基因及其相连的诸如转座子发送位点和/或转座酶基因的元件。这些活的基因组中部分将含有新转座的元件，特别是具有独立分配或从发送位点及其相连自杀基因重组的那些元件。因此，“遗传不育过滤”消除了含有与发送位点保持连锁的转座元件的配子和/或含有转座酶基因的配子。
如果剩下的活花粉用于通过控制授粉或者通过风媒传粉受精胚珠，所得的后代部分含有转座元件。通过在转座子内包含可选择的或者可筛选的标记容易鉴定这些后代，例如，列举了一些标记，有矮牵牛，拟南芥属或土壤杆菌属CP4 EPSPS基因(Padgette，S.R.等，(1987)Arch Biochem BiophysVol.258/2：564-73；Klee，H.J.等，1987 Mol Gen Genet Vol.210/3：437-42；Hoef，A.，等，(1998)Food Addit Contam Vol.15/7：767-74；Harrison，L.A.，等，(1996)J Nutr Vol.126/3：728-40)，编码草甘膦(Roundup)抗性的基因(Malik，J.，等，(1989)Biofactors Vol.2/1：17-25)；或者各种乙酰乳酸合成酶(ALS)基因，编码对磺酰脲类除草剂抗性的基因(Whitcomb，C.E.(1999)Toxicol Ind HealthVol.15/1-2：231-9)，例如拟南芥属多除草剂抗性基因csrl-4(Mourad，G.等，(1994)Mol Gen Genet Vol.：243/2：178-84)，或者来自链霉菌属的bar基因(Thompson，C.J等，(1986)EMBO J.Vol.6：2519-2523)，编码对phosphinothricin(Finale)的抗性的基因。
对于诸如Ac的自主元件的传播，含有分散转座的Ac元件的后代通过诸如Ds-诱导型报道基因的转激活的传统遗传方法来鉴定。在本发明的一个实施方案中，用仅允许活花粉含有转座因子的花粉存活基因构建转座子，从而完全排除对化学选择或筛选的需要。
如果GST复合体还含有转座因子，那么，转座频率(连接的和未连接的位点)就高，这取决于转座酶源和其它因子。假定转座频率为5％，那么其中70％可能是连接的，30％是未连接的，其中15％(随机独立分配转座子与GST染色体)可在后代中回收且容易通过在转座因子上所含的除草剂抗性来鉴定。如果我们希望回收100,000个独立插入，估计需要的种子数是：需要(100,000×2/.3)/0.05＝13,333,333个F1种子。可在不超过3年内产生和筛选这些种子(作为单个植物回收)。
实施例4.富集稳定分散的转座事件
本发明的另一实施方案涉及在转基因复合体中除了转座子发送位点和自杀基因外还包含诸如转座酶源的其它基因。在该实施方案中，“遗传不育过滤”富集分散元件同时也排除将转座酶源遗传给后代。
同时排除转座子供体位点和转座酶基因有利于传播稳定的转座因子(即由于丢失转座酶基因而不再转座)，从而防止发生另外的转座(第二次转座)。
本发明的其它实施方案包括将转座酶源和转座子发送位点放在分离的转基因复合体中。例如，发送位点和转座酶源可在分离的元件中组合在一个基因组中以实现与分散转座相同的富集。而且，如果希望定位转座，即用插入片断充满特定染色体区域或者回收在邻近目的基因的插入，通过不育过滤方法消除转座酶源而不需消除连锁转座。
实施例5.水稻-模式植物系统
A.水稻转化
采用允许高产量转基因生产的基于24-孔微量滴定板的方法产生水稻转基因。该方法是公开方法(Hiei，Y.，等，(1994)Plant J.6：271-82；Hiei，Y.等，(1997)Plant Molec Bio.35：205-218；Zhang，J.，等，(1997)Mol Biotechnol.8：223-31)的改编形式且包括完全液体培养和允许从盾片愈伤组织诱导，与土壤杆菌属的共培养，用Timentin处理产生转基因的转化系统，和苗再生。该系统用于每月产生大约50-100个独立转基因品系。
收集来自各转基因品系的组织样品，提取DNA并通过Southern分析鉴定含有单拷贝T-DNA插入片断(SCTLs)的品系。按照本领域的技术人员熟知的方法微量繁殖来自SCTLs的苗，生根并移植到土壤中。
B.遗传方法学
为了产生原种，种子和转座子品系在CIAT可获得广泛的高容量的杂交计划。一般来说，每个循环进行大约1000个控制的(手工)杂交，包括单交，双杂交，顶交和回交。获得的F1种子数取决于杂交类型和育种目标。
杂交可在生物安全许可的筛选室条件下全年进行。以7到10天的间隔三次种植亲本以确保同时开花。当采用雄性不育的雌性品系时亲本在大盆中生长或者在杂交隔离的野外生长。
对于手工授粉，杂交方法是：亲本植物的选择，圆锥花序去雄(去掉雌性亲本的花药)，用玻璃纸袋遮盖去雄的小花，用从雄性亲本收集的花粉对雌性亲本授粉，用玻璃纸袋遮盖授粉的圆锥花序，用含有关于亲本，日期，杂交操作人姓名的相关信息的杂交标签识别用于杂交的圆锥花序。对于水稻杂交的详细信息，参见，例如Coffman，W.R.和R.M.Herrera(1980)水稻，见：农作物植物的杂交，W.R.Fehr和H.H.Hadley，编辑，第36章：511-522，美国农艺师协会。
逐个收获选择的F1和T1植物以产生F2种子。授粉后大约25天收获杂交种子，脱粒，清理，放入谷袋中。该种子在低湿度和温度条件下贮存。T1种子在平地上生长并在发芽后25天和35天时通过两叶施用0.05％Finale选择除草剂抗性。
C.样品跟踪
可使用相关的条形码(barcode)样品跟踪数据库通过流程跟踪植物，种子和DNA样品。产生的各转基因指定一个独特(字母数字)标识符。来自转基因的原种植物携带该标识符和第二个特有的原种标识符。进入生产苗圃的所有原种携带转基因/原种标识符，来自各原种的测交种子每次杂交指定一个特有的标识符(T1种子标签)。
Finale选择后，各抗性植物指定一个独特的品系标识符。该信息在带有两个速记(tearoff)标签的植物标签上编码；每个标签含有相同的字母数字标识符和相关条形码。一个速记标签附着在组织样品上，另一个保留在植物上，最终钉在种子包装上。产品条形码阅读器将组织样品记录进数据库，然后通过DNA提取物排队并最终放入384-微量滴定板的一个位置用于PCR扩增和DNA测序来跟踪样品。
D.高通量DNA分离和标准化
在DNA提取前冻干组织样品。在塑料袋中装运的冻干组织用干燥剂密封。组织用锆硅珠(ATGC，Inc.)通过在商品10伽油漆混合器(FluidDynamics，Inc.)上迅速摇动96-384管进行研磨。
使用从以前公开的方法(Galbiati，M.，等，(2000)Functional & IntegrativeGenomics，in press)改编的高通量，平行方法提取DNA且纯化的DNA贮存在96-式微量滴定板上。使用Spectrofluor平板阅读器和Genesis机器人工作站(Tecan，Inc.)通过Picogreen方法(Molecular Probes，Inc.)机器测量DNA浓度。
为了制备第二工作平板用于PCR分析，通过从各孔中取出固定量的DNA与合适量的缓冲液一起放入第二微量滴定板中机器标准化DNA。机器制备这些标准化工作平板的母-女复制品并运送样品用于扩增和测序。
全部程序的可行性，包括从组织提取到标准化的程序对于玉米和拟南芥属都是可行的。
E.转座子品系的选择
转座子品系的选择包括转基因生产和为回收单拷贝品系(SCLs)进行的遗传测试，扩增，样品跟踪，加工和运送及随后的生产期。可采用的方法包括在土壤杆菌属接种物和原始水稻转基因中T-DNA的DNA指纹法，土壤杆菌属介导的转化方法，和水稻再生，微量繁殖和移植进土壤的方法。
从各转基因品系收集组织，提取DNA并通过Southern分析法进行分析以鉴定单拷贝T-DNA品系(SCLs)。所有SCLs可在幼苗培养基中维持和装运用于微量繁殖。生根的小植株可移植进土壤和测试转座率。
F.原种生产
使用关于转座频率的遗传数据选择用于连续原种生产的最好转基因品系。生根的幼苗移植进土壤并通过简单分开进一步繁殖以增加生产苗圃中雄性植物的数目。
在一个实施方案中，如果转座局限于雄蕊发育，原种繁殖的一种选择，但不是互相排斥的方法是将野生型花粉与雌性转基因植物杂交，在这种设计中将不发生T-DNA排除和转座。因此，该种子可在每个季节中简单地重复种植以产生更多的原种用于新转座选择。
当生长在赤道或接近赤道时，水稻品种Nipponbare的花期是60天。通过使用赤道位置，每年可实现几乎4代植物生产。在墨西哥Cali减短的世代时间和恒定的全年生长条件使得水稻遗传学几乎与拟南芥属一样有效率。
G.基础种子生产
在本发明的一个实施方案中，目标是选择单一的，分散转座和回收半合子状态的插入。这样允许回收非致死的，隐性致死和雌性单独无能的突变(haplo-insufficient mutation)。
为了产生T1种子，将原种植物作为雄性与雄性不育的雌性植物在苗圃中杂交。通过套种雄性和雄性不育雌性可实现水稻的有效异型杂交。Nipponbare中的雄性不育目前不存在，因此核的雄性不育(ms)突变在苗圃中从O.sativa ssp.indica品系渐渗进入Nipponbare。通过标记辅助定位和育种，选择回交后代的ms突变和Nipponbare标记可极大地加速渐渗过程。
使用以前鉴定的简单序列重复(SSR)标记(McCouch，S.R.，等，(1997)Plant Mol Biol.35：89-99；Panaud，O.，等，(1996)Mol Gen Genet.252：597-607)首先定位ms基因座。从孟山都的草图( www.rice-research.ore)可获得7000个SSR序列。连锁的SSRs用于跟踪渐渗期间的ms等位基因，而在整个基因组中未连锁的SSRs用于选择供体种质。
两次回交和一次自花传粉应足以将ms等位基因转移到Nipponbare背景。进行F1杂交且产生F2后代。制备的渐渗ms品系可用于T1种子生产。在苗圃中使用ms表型1∶1分离的品系，通过SSR分析确定基因型，收集雄性可育的植物。转座子原种与ms/ms雌性植物杂交以产生T1种子用于Ds品系选择。
H.转座子品系选择
T1种子种植在平地上，通过叶上施用0.05％Finale并在10-15天后接着第二次处理选择25-日龄幼苗。对Finale抗性植物进行条形码编码并移植进苗圃中，使其自花传粉以产生T2种子。
收集来自各植物的组织样品(大约1-2gm叶组织)，放入有条形码的试管中，冻干并准备用于DNA提取。
收集来自各品系的T2种子，脱粒，放入带条形码的袋中，准备用于贮存或向公众发放。
尽管参照具体实施方案已经公开了本发明，很明显本领域的其它技术人员可设计本发明的其它实施方案和变化而不偏离本发明的真正实质和范围。所附的权利要求书打算解释为包括所有这些实施方案和等同变化形式。
                               序列表<110>斯蒂芬.L.德拉波塔(Dellaporta，Stephen L.)
  玛丽亚.A.莫雷诺(Moreno，Maria A.)
  耶鲁大学(Yale University)<120>减少或消除转基因传播的方法和组合物<130>44574-5078-WO<140><141><150>US 60/185,524<151>2000-02-28<160>16<170>PatentIn Ver.2.1<210>1<211>26<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述：5′PCR引物<400>1aagctttggc catattgcag tcatcc                                      26<210>2<211>35<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述：5′PCR引物<400>2aagcttgctc gagcagggat gaaagtagga tggga                            35<210>3<211>4565<212>DNA<213>玉米(Zea mays)<220><223>转座因子Ac<400>3tagggatgaa aacggtcggt aacggtcggt aaaatacctc taccgttttc attttcatat 60ttaacttgcg ggacggaaac gaaaacggga tataccggta acgaaaacga acgggataaa 120tacggtaatc gaaaaccgat acgatccggt cgggttaaag tcgaaatcgg acgggaaccg 180gtatttttgt tcggtaaaat cacacatgaa aacatatatt caaaacttaa aaacaaatat 240aaaaaattgt aaacacaagt cttaattaaa catagataaa atccatataa atctggagca 300cacatagttt aatgtagcac ataagtgata agtcttgggc tcttggctaa cataagaagc 360catataagtc tactagcaca catgacacaa tataaagttt aaaacacata ttcataatca 420cttgctcaca tctggatcac ttagcatgca taaactatta caaccaaggc tcatctgtca 480acaaacataa gacacattgc tcatggagag gagccacttg ctacatcttc attattctta 540gaaaattcta ttgcgtcttc atcctgttaa tacacaaaaa taagtcagtt ttggataaat 600aaatacatat agaagaacat gaattgatat gcagggagta taaataaata catataggag 660aacatgaatc tgtgaactaa cacggctggg agctaggcag ctagcagcta gcgcctaaca 720gctgggagcc taacagctag cagctagcag ccaatcaaaa caaggcgaca aggcgcatgc 780agtgagatca aaaatctgtt aatgccagcc atgcagggag tataacacgg ctgggcagca 840aggcgcatgc atcaaaacaa ggcgacagca aacagcccat gcatcaaaac agtagtgaat 900aatagcaaat taatagccca tgcacgaagt aaataataat ctttaaatac ctcatccata 960tgattctcat gatttgttgc agcagcaata acagagtcta gcacctcgag atcaccaatc 1020attgttggaa aatatgtagc accttgaatg acacaaatat gcatcaatat aagtaaaata 1080attgttgaat aactataaat tggaacttca ttataacata tatgcattca ccttttctag 1140atgctgctac ccaatctttt gtgcatatca aagcttcaac aatctccgaa ccaagacgat 1200tgcggtaagg atcaacaaca cgaccaccag cactgaacgc agactcagaa gcaacagttg 1260acacttgtat tgctagcaca tcccttgcaa tttgggtgag aataggatat tctgcaaccc 1320ttcccctcca ccatgataaa atatcaaact gaccactatg cttcaaaagg ggttcagaca 1380tatatttatc caattcattt gactctactt gatcataatc cttcaactca tgcaaatagt 1440tttgaaattc atcatcttca ttttccatca aggtatcatc catactatca ttagtagttg 1500tctttgtctt tggagctgaa ggactacaac tagaatagaa ttgatacaat tttctaatga 1560ccctaacaaa gtcatctaca tgaactttgt atgaatcacc atgaaatttt ttcatataga 1620actcaatcaa tattttcttg tacctagggt caaggaagca tgctacagct agtgcaatat 1680tagacacttt ccaatatttc tcaaactttt cactcattgc aacggccatt ctcctaatga 1740caaatttttc atgaacacac cattggtcaa tcaaatcctt tatctcacag aaacctttgt 1800aaaataaatt tgcagtggaa tattgagtac cagataggag ttcagtgaga tcaaaaaact 1860tcttcaaaca cttaaaaaga gttaatgcca tcttccactc ctcggcttta ggacaaattg 1920catcgtacct acaataattg acatttgatt aattgagaat ttataatgat gacatgtaca 1980acaattgaga caaacatacc tgcgaggatc acttgtttta agccttatta gtgcaggctt 2040ataatataag gcatccctca acatcaaata ggttgaattc catctagttg agacatcata 2100tgagatccct ttagatttat ccaagtcaca ttcactagca cacttcatta gttcttccca 2160ctgcaaagga gaagatttta cagcaagaac aatcgctttg attttctcaa ttgttcctgc 2220aattacagcc aagccatcct ttgcaaccaa gttcagtatg tgacaagcac acctcacatg 2280aaagaaagca ccatcacaaa ctagatttga atcagtgtcc tgcaaatcct caattatatc 2340gtgcacagct acttcatttg cactagcatt atccaaagac aaggcaaaca attttttctc 2400aatgttccac ttaaccatga ttgcagtgaa ggtttgtgat aacctttggc cagtgtggcg 2460cccttcaaca tgaaaaaagc caacaattct tttttggaga caccaatcat catcaatcca 2520atggatggtg acacacatgt atgacttatt ttgacaagat gtccacatat ccatagttgt 2580actgaagcga gactgaacat cttttagttt tccatacaac ttttcttttt cttccaaata 2640caaatccatg atatattttc tagcagtgac acgggacttt attggaaagt gagggcgcag 2700agacttaaca aactcaacaa agtactcatg ttctacaata ttgaaaggat attcatgcat 2760gattattgcc aaatgaagct tctttaggct aaccacttca tcgtacttat aaggctcaat 2820gagatttatg tctttgccat gatccttttc actttttaga cacaactgac ctttaactaa 2880actatgtgat gttctcaagt gatttcgaaa tccgcttgtt ccatgatgac cctcagccct 2940atacttagcc ttgcaattag gaaagttgca atgtccccat acctgaacgt atttctttcc 3000atcgacctcc acttcaattt ccttcttggt gaaatgctgc catacatccg atgtgcactt 3060ctttgccctc ttctgtggtg cttcttcttc gggttcaggt tgtggctgtg gttgtggttc 3120tggttgtggt tgtggttgtg gttgtggttc atgaacaata gccatatcat cttgactcgg 3180atctgtagct gtaccatttg cattactact gcttacactc tgaataaaat gcctctcggc 3240ctcagctgtt gatgatgatg gtgatgtgcg gccacatcca tgcccacgcg cacgtgcacg 3300tacattctga atccgactag aagaggcttc agcttttctt ttcaaccctg ttataaacag 3360atttttcgta ttattctaca gtcaatatga tgcttcccaa tctacaacca attagtaatg 3420ctaatgctat tgctactgtt tttctaatat ataccttgag catatgcaga gaatacggaa 3480tttgttttgc gagtagaagg cgctcttgtg gtagacatca acttggccaa tcttatggct 3540gagcctgagg gaggattatt tccaaccgga ggcgtcatct gaggaatgga gtcgtagccg 3600gctagccgaa gtggagagca gagccctgga cagcaggtgt tcagcaatca gcttggtgct 3660gtactgctgt gacttgtgag cacctggacg gctggacagc aatcagcagg tgttgcagag 3720cccctggaca gcacacaaat gacacaacag cttggtgcaa tggtgctgac gtgctgtact 3780gctaagtgct gtgagcctgt gagcagccgt ggagacaggg agaccgcgga tggccggatg 3840ggcgagcgcc gagcagtgga ggtctggagg accgctgacc gcagatggcg gatggcggat 3900gggcggaccg cg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Claims (56)

1.一种核酸构建体，其含有与自杀基因可操作相连的雄性配子-或雌性配子-特异性启动子，其中所述启动子和所述自杀基因的组合与目的基因相连。
2.一种核酸构建体，其含有与选自芽孢杆菌RNA酶，雄花穗种子2和白喉毒素A基因的自杀基因可操作相连的花粉特异性启动子或胚珠特异性启动子；其中所述启动子和所述自杀基因的组合与目的基因相连，所述目的基因选自编码除草剂抗性，抗生素抗性，杀虫剂抗性，固氮，改进营养和纤维素含量或其它感兴趣的农学性状的基因。
3.权利要求1的核酸构建体，其中所述启动子选自花粉特异性启动子和胚珠特异性启动子。
4.权利要求1的核酸构建体，其中所述自杀基因选自芽孢杆菌RNA酶，雄花穗种子2和白喉毒素A基因。
5.权利要求1的核酸构建体，其中所述目的基因选自编码除草剂抗性，抗生素抗性，杀虫剂抗性，固氮，改进营养和纤维素含量的核酸。
6.含有权利要求1的核酸构建体的载体。
7.含有权利要求2的核酸构建体的载体。
8.含有权利要求6的载体的宿主细胞。
9.含有权利要求7的载体的宿主细胞。
10.含有权利要求6-7任一项的载体的重组植物细胞。
11.含有权利要求6-7任一项的载体的转基因植物。
12.权利要求11的转基因植物，其中该转基因植物是该核酸构建体的半合子型。
13.一种减少或消除植物中转基因座的雄性传播的方法，包括：
a)用核酸构建体转化植物细胞，该核酸构建体中雄性配子特异性启动子与自杀基因可操作相连，其中所述启动子和所述自杀基因的组合与异源多核苷酸相连；
b)繁殖所述转化的植物细胞，通过减数分裂产生缺乏所述转基因座的雄性配子。
14.一种减少或消除植物中转基因座的雄性传播的方法，包括：
a)用核酸构建体转化植物细胞，该核酸构建体中花粉特异性启动子与自杀基因可操作相连；
i)其中所述自杀基因选自芽孢杆菌RNA酶，雄花穗种子2和白喉毒素A基因；
ii)其中所述启动子和所述自杀基因的组合与异源多核苷酸相连；
iii)其中所述异源多核苷酸选自编码除草剂抗性，抗生素抗性，杀虫剂抗性，固氮，改进营养和纤维素含量的DNA；
b)繁殖所述转化的植物细胞，通过减数分裂产生缺乏所述转基因座的雄性配子。
15.一种减少或消除植物中转基因座的雌性传播的方法，包括：
a)用核酸构建体转化植物细胞，该核酸构建体中雌性配子特异性启动子与自杀基因可操作相连，其中所述启动子和所述自杀基因的组合与异源多核苷酸相连；
b)繁殖所述转化的植物细胞，通过减数分裂产生缺乏所述转基因座的雌性配子。
16.一种减少或消除植物中转基因座的雌性传播的方法，包括：
a)用核酸构建体转化植物细胞，该核酸构建体中胚珠特异性启动子与自杀基因可操作相连；
i)其中所述自杀基因选自芽孢杆菌RNA酶，雄花穗种子2和白喉毒素A基因；
ii)其中所述启动子和所述自杀基因的组合与异源多核苷酸相连；
iii)其中所述异源多核苷酸选自编码除草剂抗性，抗生素抗性，杀虫剂抗性，固氮，改进营养和纤维素含量的DNA；
b)繁殖所述转化的植物细胞，通过减数分裂产生缺乏所述转基因座的雌性配子。
17.权利要求13，14，15或16的转化的植物细胞，其中转化的植物细胞是该核酸构建体的半合子型。
18.一种核酸构建体，含有与自杀基因可操作相连的雄性配子-或雌性配子-特异性启动子，其中所述启动子和所述自杀基因的组合与转座因子相连。
19.权利要求18的核酸构建体，还包含转座酶基因。
20.权利要求18或19的核酸构建体，还包含目的基因。
21.权利要求20的核酸构建体，其中目的基因与转座因子相连。
22.一种核酸构建体，其中花粉特异性启动子或胚珠特异性启动子与选自芽孢杆菌RNA酶，雄花穗种子2和白喉毒素A基因的自杀基因可操作相连；其中所述启动子和所述自杀基因的组合与转座子相连，其中所述转座子含有选自编码除草剂抗性，抗生素抗性，杀虫剂抗性，固氮，改进营养和纤维素含量的基因的选择标记。
23.权利要求22的核酸构建体，其中所述启动子选自花粉特异性启动子和胚珠特异性启动子。
24.权利要求22的核酸构建体，其中所述自杀基因选自芽孢杆菌RNA酶，雄花穗种子2和白喉毒素A基因。
25.含有权利要求18的核酸构建体的载体。
26.含有权利要求22的核酸构建体的载体。
27.含有权利要求18的载体的宿主细胞。
28.含有权利要求22的载体的宿主细胞。
29.含有权利要求18或22的载体的重组植物细胞。
30.权利要求29的重组植物细胞，其中该重组植物细胞是该核酸构建体的半合子型。
31.含有权利要求18或22的载体的转基因植物。
32.权利要求31的转基因植物，其中该重组植物细胞是该核酸构建体的半合子型。
33.一种在植物细胞子代群体中富集分散转座事件的方法，包括：
a)用权利要求18-24中任一项的核酸构建体转化植物细胞以产生转化的植物细胞；
b)繁殖所述转化的植物细胞，通过减数分裂产生富集分散转座事件的植物细胞子代。
34.权利要求33的方法，还包括：
c)分离所述富集分散转座事件的植物细胞子代。
35.由权利要求34的方法分离的植物细胞。
36.从权利要求35的植物细胞产生的植物。
37.权利要求33，34，或35任一项的植物细胞，其中该植物细胞是该核酸的半合子型。
38.含有第一启动子的核酸构建体，其中第一启动子是与自杀基因可操作相连的雄性配子-或雌性配子-特异性启动子，且还含有编码转座酶的核酸和编码转座子的核酸。
39.权利要求38的核酸构建体，其中该转座子包含与选择标记可操作连接的第二启动子，其中选择标记不是自杀基因。
40.一种核酸构建体，其中花粉特异性启动子或胚珠特异性启动子与选自芽孢杆菌RNA酶，雄花穗种子2和白喉毒素A基因的自杀基因可操作相连，其中所述启动子和所述自杀基因的组合与编码转座酶的核酸相连；其中与编码转座酶的所述核酸相连的所述启动子和所述自杀基因的组合包含一个转基因座，该基因座还包含一个转座子；其中所述转座子含有编码选自除草剂抗性，抗生素抗性，杀虫剂抗性，固氮，改进营养和纤维素含量中的一种的多核苷酸序列。
41.权利要求40的核酸构建体，其中所述启动子选自花粉特异性启动子和胚珠特异性启动子。
42.权利要求40的核酸构建体，其中所述自杀基因选自芽孢杆菌RNA酶，雄花穗种子2和白喉毒素A基因。
43.权利要求40的核酸构建体，其中所述转座子含有编码选自除草剂抗性，抗生素抗性，杀虫剂抗性，固氮，改进营养和纤维素含量中的一种的多核苷酸序列。
44.含有权利要求38的核酸构建体的载体。
45.含有权利要求40的核酸构建体的载体。
46.含有权利要求44的载体的宿主细胞。
47.含有权利要求45的载体的宿主细胞。
48.权利要求46或47的宿主细胞，其中该核酸构建体是半合子。
49.含有权利要求44-45任一项的载体的重组植物细胞。
50.权利要求49的重组植物细胞，其中该核酸构建体是半合子。
51.含有权利要求44-45任一项的载体的转基因植物。
52.权利要求51的转基因植物，其中该核酸是半合子。
53.在植物细胞子代群体中富集稳定的分散转座事件的方法，包括：
a)用权利要求38-43任一项的核酸构建体转化植物细胞以产生转化的植物细胞；
b)繁殖所述转化的植物细胞，通过减数分裂产生富集稳定的分散转座事件的植物细胞子代。
54.权利要求53的方法，还包括：
c)分离所述的富集稳定分散转座事件的植物细胞子代。
55.由权利要求54的方法分离的植物细胞。
56.由权利要求55的植物细胞产生的植物。
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