JP2001514856A - 植物における遺伝子の選択的発現 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本発明は商業的に価値があるがホスト細胞の発達に有害な合成物を産出する生合成方法に関する。本発明に拠り生成された形質転換植物はプロモータ（２）、阻止配列（ａ）および構造遺伝子（６）から成る新規な制御された発現系からなり、阻止配列（ａ）は一対の定方向反復した部位特異的組換え配列（４）によって側面配置されている。阻止配列（ａ）は部位特異的リコンビナーゼ遺伝子（１２）によってコード化された部位特異的リコンビナーゼ活性で阻止配列（ａ）が除去されるまで構造遺伝子（６）の発現を阻止する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】 《政府の権利》 本発明は米国政府の米国農務省基金第９１−３７３０１−６３７５号による後
援のもとで行われた。米国政府は本発明に若干の権利を有する。

【０００２】 《発明の技術分野》 本発明は商業的に所望の植物材料を生物触媒的に生産する方法に関する。より
詳細に述べるならば、本発明は、種子増殖中はサイレントであって、種子産生の
最後の世代に活性化される遺伝子を含む植物を遺伝子工学的に作り出す方法に関
する。

【０００３】 《発明の背景及び発明の概要》 組換えＤＮＡ技術を用いて所望の表現型特性およびタンパク質産物を発現する
トランスジェニック植物が生成される。しかし植物の種子における脂肪酸、アミ
ノ酸等の特別な化学物質、特別なプラスッチック様化合物、特殊なペプチドホル
モン類等の産生は、種子の生育性および発芽の喪失を起こすことがよくある。こ
のことは商業的に重要な植物産物を生産する生合成戦略の発達に重大な障害とな
る。なぜならば種子の増殖は大規模商業生産に必須だからである。本発明は種子
の増殖中はサイレントであるが、ひとたび十分な数のトランスジェニック植物が
生成した場合には活性化され、コードされた遺伝子産物を発現するという所望遺
伝子を有する遺伝子工学的植物の生産に向けられる。

【０００４】 遺伝子産物の十分な発現のためにはその他のＤＮＡ調節因子も必要であるとは
いえ、遺伝子の発現は概してそれ自体のプロモーターによって方向づけられる。
プロモーター配列因子はＴＡＴＡボックス・コンセンサス配列（ＴＡＴＡＡＴ）
を含む。これは普通は転写開始部位の上流２０ないし３０塩基対（ｂｐ）である
。大抵の場合、ＴＡＴＡボックスは正確な転写開始のために必要である。

【０００５】 プロモーターは構造性、または誘導性である。構造性プロモーターは或る細胞
の一生を通じて遺伝子の転写を一定速度にコントロールし、一方誘導性プロモー
ターの活性は変動し、特異的インデューサーの存在（または欠如）によって決ま
る。誘導性プロモーターの調節因子は転写開始部位のＴＡＴＡボックスよりさら
に上流にあるのが普通である。理想的には、実験的目的では誘導性プロモーター
は下記の各特性を有していなければならない：インデューサーが欠如しており発
現の基礎レベルが低い〜存在しない；インデューサーが存在し、発現レベルが高
い；およびこれら以外では細胞の生理学を変えない誘導スキーム。全てのプロモ
ーターの基礎的転写活性は"エンハンサー"配列の存在によって増加し得る。その
メカニズムは不明確であるとはいえ、明らかにされた若干のエンハンサー調節配
列は、その配列がプロモーターの近傍にある場合にはプロモーターの転写速度を
高めることが熟練せる当業者には知られている。

【０００６】 トランスフォームド細胞の作成には、ＤＮＡをホスト細胞内に物理的に置くこ
とが必要である。現在の形質転換法はＤＮＡを細胞に挿入する種々の技術を利用
している。形質転換の一つの形では、ＤＮＡをミクロピペットを用いて細胞内に
直接微量注入する。或いは、高速衝撃を用いて小さいＤＮＡ結合粒子を細胞内に
噴射する。その他の形では、細胞をポリエチレングリコールの存在によって透過
性にし、それによってＤＮＡを拡散によって細胞内に侵入させる。また、原形質
をＤＮＡを含む他の実体と融合させることによってＤＮＡを挿入することもでき
る。これらの実体としては、ミニ細胞、細胞、リソソームまたはその他の融合可
能の脂質−表面体がある。エレクトロポレーションもＤＮＡを細胞に挿入するた
めの容認できる方法である。この方法では、生体膜を可逆的に透過性にする高電
圧パルスを細胞に与え、外因性ＤＮＡ配列を侵入させることができる。

【０００７】 これらの"直接的"形質転換法に加えて、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍ
ａｆａｃｉｅｎｓまたはＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｒｈｉｚｏｇｅｎｅｓを
用いる細菌感染によって形質転換することができる。これらの細菌種は或るプラ
スミドを含み（それぞれＴｉまたはＲｉと呼ばれる）、このプラスミドがＡｇｒ
ｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ（癌腫菌）による感染後に植物細胞に伝達される。このプ
ラスミドの一部―転移ＤＮＡ（Ｔ−ＤＮＡ）と命名される―はその後植物細胞の
ゲノムＤＮＡに組込まれる。この系は文献に広く記載されており、異種遺伝子お
よびその他のＤＮＡ配列を植物細胞に導入できるように改良されている。

【０００８】 もしも挿入ＤＮＡ配列の一部に選択マーカー（または可視マーカー）が含まれ
ているならば、トランスフォームド細胞（ホスト細胞ＤＮＡに挿入されたＤＮＡ
を含む細胞）を非トランスフォームド細胞から選別することができる。選択マー
カー類には抗生物質耐性または殺草剤耐性を与える遺伝子類がある。これらの遺
伝子を含む細胞は非トランスフォームド細胞を殺す濃度の抗生物質または殺草剤
の存在下でも生存することができる。選択マーカーの例としては、殺草剤Ｂａｓ
ｔａに耐性を有するｂａｒ遺伝子、カナマイシン耐性を与えるｎｐｔＩＩ遺伝子
およびヒグロマイシン耐性を与えるｈｐｔ遺伝子がある。可視マーカー遺伝子は
ホスト細胞を目で確認できる産物を発現し、これによって可視マーカー遺伝子で
形質転換した細胞を確認することができる。

【０００９】 ひとたびトランスフォームド植物細胞が作られると、細胞培養技術によって全
植物が得られる。個々の培養細胞は分裂してカルス組織と呼ばれる未分化の細胞
塊を生ずる。カルス組織が生成すると、熟練せる当業者には公知の技術によって
そのカルスから苗条や根を誘導することができ、生成した小植物を植えることが
できる。或いはカルス組織において体胚形成を誘導できる。これらの体胚は天然
胚として発芽し、植物を形成する。

【００１０】 本発明により、植物細胞発育に有害な影響を有する商業上価値のある産物の発
現をコントロールし、植物に対するマイナスの影響を最小にする一方、産物の生
産を最大にすることができる。所望遺伝子産物のコントロールされた発現は、上
記遺伝子の規定配列を誘導性プロモーターに操作可能に結合することによって実
現する。例えば、化学的に誘導される遺伝子プロモーターを所望遺伝子に結合さ
せ、植物細胞をプロモーター／遺伝子構成物で形質転換し、トランスジェニック
植物を生成することができる。上記トランスジェニック植物に、その所望生育段
階中に、適した化学物質を噴霧し、遺伝子の発現を誘導することができる。

【００１１】 環境的にコントロールされた誘導性プロモーターの使用を基礎とする戦略は、
幾つかの欠点を有する：１）可能性のあるプロモーター（例えば加熱ショックプ
ロモーター、銅誘導性プロモーター）の数が限られる、２）天然環境における多
数の植物の処理に関係する諸問題。さらに多くの誘導可能遺伝子は"リーキー（ ｌｅａｋｙ）"となりがちである、すなわちそのプロモーターは上記インデュー サーが存在しない場合でも低レベルの遺伝子産物を発現する。本発明は選択的遺
伝子発現を誘導する外的処理の必要性を排除し、植物中に商業的に貴重な産物を
生産し、しかもその産物が植物発育に悪影響を与えないというコスト的に安い方
法を提供する。

【００１２】 本発明は部位特異的リコンビナーゼ系（ＦＬＰ／ＦＲＴ、Ｃｒｅ／Ｌｏｘ、等
）を利用して植物における組換え遺伝子産物の発現をコントロールする。特に、
所望遺伝子を含むトランスジェニック植物は生成するが、その遺伝子の発現は" 阻止配列（ｂｌｏｃｋｉｎｇ ｓｅｑｕｅｎｃｅ）"によって阻止される。一実 施態様により、上記阻止配列はその遺伝子の発現を阻止する１個以上の停止コド
ンを含む。上記部位特異的リコンビナーゼ系を利用して阻止配列を切除し、それ
によって上記遺伝子のコントロールされた発現を可能にする。

【００１３】 次のような多数の異なる部位特異的リコンビナーゼ系を用いることができる：
バクテリオファージＰ１のＣｒｅ／ｌｏｘ系、酵母のＦＬＰ／ＦＲＴ系、Ｍｕフ
ァージのＧｉｎリコンビナーゼ、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）のＰｉｎリコンビナー
ゼ、およびｐＳＲ１プラスミドのＲ／ＲＳ系等。ただしこれらに制限するもので
はない。二つの好ましい部位特異的リコンビナーゼ系はバクテリオファージＰ１
のＣｒｅ／ｌｏｘおよび酵母のＦＬＰ／ＦＲＴ系である。これらの系ではリコン
ビナーゼ（ＣｒｅまたはＦＬＰ）はそのそれぞれの部位特異的組換え配列（それ
ぞれｌｏｘまたはＦＲＴ）と特異的に相互作用し、介在配列を逆転させ、または
切除する。これら二つの各系のための配列は相対的に短い（ｌｏｘでは３４ｂｐ
、ＦＲＴでは４７ｂｐ）。現在、酵母のＦＬＰ／ＦＲＴが好適部位特異的リコン
ビナーゼ系である。なぜならばそれは通常、真核生物（酵母）において機能し、
よく特徴づけられているからである。出願人は、ＦＬＰ／ＦＲＴ系が真核生物起
源であるため、真核細胞においては前核生物部位特異的リコンビナーゼ系に比べ
て、ＦＬＰ／ＦＲＴ系がより効率的に機能し得ると信ずる根拠を有する。

【００１４】 部位特異的組換え配列の方向によって、介在配列は部位特異的リコンビナーゼ
の存在下で切除されるか逆転するかする。部位特異的組換え配列が互いに逆向き
構造を有する場合（すなわち逆方向反復）、そのゲノムにおいてあらゆる介在配
列が他の配列に対して逆向きである。しかし、もしも部位特異的組換え配列が互
いに同じ方向であるならば（すなわち直列反復）、上記部位特異的リコンビナー
ゼとの相互作用であらゆる介在配列は欠失する。

【００１５】 ＦＬＰ／ＦＲＴリコンビナーゼ系は植物細胞において効率的に機能することが
証明されている。トウモロコシおよび米の両方のプロトプラストのＦＬＰ／ＦＲ
Ｔ系の挙動に関する実験は、ＦＲＴ部位構造および存在するＦＬＰタンパク質量
が切除活性（ｅｘｃｉｓｉｏｎ ａｃｔｉｖｉｔｙ）に影響することを示した。
概して短い不完全なＦＲＴ部位は、完全な全長を有するＦＲＴ部位よりも多い切
除産物の蓄積をもたらす。部位特異的組換え系はトウモロコシのプロトプラスト
における分子内および分子間反応両方を触媒することができ、この系をＤＮＡ切
除並びに組込み（ｉｎｔｅｇｒａｔｉｏｎ）反応に使用できることを示した。上
記組換え反応は可逆的であり、この可逆性が各方向における反応効率を低下させ
得る。部位特異的組換え配列の構造を変えることはこの状況を改善する一方法で
ある。部位特異的組換え配列を、組換え反応の産物がもはや逆反応の基質として
認識されず、それによって切除事象を安定化するように、突然変異させることが
できる。

【００１６】 この系を操作するもう一つの方法は、単一分子反応（切除）が二分子（組込み
）反応よりエントロピー的に有利であることに基づく。リコンビナーゼ酵素の発
現を制限することによって、組込み型組換え（熱力学的に最も好ましくない事象
）の効率は低下し得る。トウモロコシのプロトプラストにおける実験は、より高
濃度のＦＬＰタンパク質が切除反応の効率を高めることを示している。

【００１７】 部位特異的リコンビナーゼ系を使用して遺伝子産物の発現をコントロールする
ことによって、環境的に容認される方法で有用な植物産物の経済的量を商業生産
することができる。本発明は、一部には、プロモーターを関心とする遺伝子から
分離しているＤＮＡ配列を、リコンビナーゼ系により切除できることを基礎とし
ている。切除事象によってプロモーターは遺伝子に操作可能に結合し、それによ
って遺伝子の発現が可能になる。このようにして遺伝子は幾世代もの間サイレン
ト状態に維持され、その後所望時にはいつでも、いかなる植物数でも、関心とす
る"阻止（ブロック）された"遺伝子を含む植物を部位特異的リコンビナーゼ（Ｆ
ＬＰ、Ｃｒｅ等）を発現する植物と交雑させることによって、ＤＮＡの阻止フラ
グメントを切除し、活性化することができる。

【００１８】 一実施態様によると、開示された方法は植物において、正常な植物または種子
生育に有害な濃度の天然産物（例えば脂肪酸または動物ペプチドホルモン）をコ
ードする一種類以上の遺伝子を発現させることができる。或いは、本発明の方法
は或る植物に、低濃度でも正常な植物または種子生育に有害である異種産物（例
えばプラスチック分子）をコードする一種類以上の遺伝子を発現させる。最後に
、本発明は、或る植物に、正常な植物代謝または生長を変化させ、その変化が正
常な植物または種子に有害である（例えば胚形成、種子発芽を阻止する）という
ような一種類以上の遺伝子を発現させ、親系とは異なる方法によってハイブリッ
ド植物を繁殖させることができる（例えばアポミクシス対生殖的、およびその逆
）。

【００１９】 《好適実施態様の詳細な説明》定義 プロモーターは、構造遺伝子の転写を方向づけるＤＮＡ配列である。一般的に
はプロモーターは構造遺伝子の転写開始部位に近い、遺伝子の５'領域に位置す る。プロモーターが誘導性プロモーターである場合、転写速度は誘導剤に応答し
て増加する。これに対して、プロモーターが構造性プロモーターである場合は、
転写速度は誘導剤によって調節されない。

【００２０】 エンハンサーとは、転写開始部位に対するエンハンサーの方向に関係なく、転
写効率を増加させ得るＤＮＡ調節因子である。

【００２１】 サイレンサーとは、転写開始部位に対するエンハンサーの方向に関係なく、転
写効率を減少させ得るＤＮＡ調節因子である。

【００２２】 用語"発現"とは遺伝子産物の生合成に関するものである。例えば、構造遺伝子
の場合、発現は構造遺伝子のメッセンジャーＲＮＡへの転写、およびメッセンジ
ャーＲＮＡの一種類以上のポリペプチドへの翻訳を含む。

【００２３】 発現ベクターとは挿入遺伝子をホスト細胞に発現するために必要な調節因子を
含むＤＮＡ分子である。一般的には、遺伝子発現は、構造性または誘導性プロモ
ーター類、組織特異的調節因子、およびエンハンサー因子等を含む若干の調節因
子のコントロール下に置かれる。このような遺伝子は調節因子に"操作可能に連 結する"と言われる。発現ベクターはこの発現ベクターを含む細胞を選択できる 真核生物および／または細菌性選択マーカーを含むのが普通である。

【００２４】 外因性ＤＮＡ配列とは、外的ソースからホスト細胞に挿入されたＤＮＡ配列を
言う。トランスジェニック植物とは、外因性ＤＮＡ配列を含む植物細胞を１個以
上有する植物である。用語"安定的に形質転換された"とは、外因性ＤＮＡ配列を
子孫に伝達することができるトランスフォームド細胞または植物を言う。一般に
は安定的に形質転換されたホストは、そのゲノムに組込まれた外因性ＤＮＡ配列
を有する。

【００２５】 可視マーカーとは、本発明では、ホスト細胞またはホスト生体に表現型の特徴
を作り出す産物をコードする遺伝子を含むと定義される。

【００２６】 選択マーカーとは、本発明では、或る細胞に挿入された後に選択できる核酸配
列または遺伝子産物を含むと定義される。

【００２７】 ポリリンカーは、互いに非常に近くに多数のエンドヌクレアーゼ制限酵素認識
配列を含むＤＮＡ配列である。

【００２８】 阻止配列または阻止領域とは、或る遺伝子に結合した際にその遺伝子の発現を
阻止するヌクレオチド配列を言う。

【００２９】 関心とするＤＮＡ配列とは、植物細胞に挿入したいＤＮＡ配列を言う。普通は
、関心とするＤＮＡ配列はタンパク質産物をコードする。

【００３０】 メインテナー植物系とは、関心とする遺伝子を含むＤＮＡ構成物で形質転換さ
れた植物細胞から再生したトランスジェニック植物およびその子孫である。その
際前記関心とする遺伝子は、部位特異的リコンビナーゼ活性がその細胞に導入さ
れて始めて発現する。

【００３１】 インデューサー植物系とは、部位特異的リコンビナーゼ遺伝子を含むＤＮＡ構
成物で形質転換された植物細胞から再生するトランスジェニック植物、およびそ
れらの子孫である。

【００３２】 用語"Ｆ１"は最初のトランスジェニック植物の繁殖後に生成した種子または植
物を言う。より詳細に述べれば、メインテナーおよびインデューサー植物系の交
雑受精から直接生産された種子または植物に関するものである。用語"Ｆ２"はＦ
１植物から直接生産された植物または種子を言う。

【００３３】 本発明は、種子増殖中はサイレントであるが、ひとたび十分な数のトランスジ
ェニック植物が作られると、活性化されてそのコードされた遺伝子産物を発現す
ることができる所望遺伝子を有する遺伝子工学的植物の生産に向けられている。
好ましい実施態様において、その遺伝子は最初のトランスジェニック植物の成長
および繁殖中は不活性のままである。好しくは、その最初のトランスジェニック
植物（そして生成したその子孫）は自家受精して、挿入されたサイレント遺伝子
に関して同型接合である多数の植物を生成する。ひとたび十分な数の植物が作ら
れたならば、繁殖した植物とリコンビナーゼ活性を発現する植物との交雑によっ
て、または繁殖植物にリコンビナーゼ活性の発現を誘導することによって、所望
遺伝子がＦ１トランスジェニック植物の組織に発現する。その後Ｆ１種子または
Ｆ１植物を収穫し、標準的方法を用いて遺伝子産物をその植物組織から抽出する
。

【００３４】 一実施態様によると、第一トランスジェニック植物（メインテナー系）は関心
とするＤＮＡ配列を含むＤＮＡ構成物で形質転換された植物細胞から再生し、そ
の際前記関心とするＤＮＡ配列は、部位特異的リコンビナーゼ活性が細胞に導入
されて始めて発現する。一実施態様において前記ＤＮＡ構成物はプロモーター、
阻止配列、および構造遺伝子を含んでなり、前記阻止配列には一対の部位特異的
組換え配列がフランク（ｆｌａｎｋ：側面配置する）している。構造遺伝子は上
記阻止配列が除去された後に始めてプロモーターに操作可能に結合する。

【００３５】 図１Ａに示す一実施態様において、阻止配列（ａ）にフランクする部位特異的
組換え配列（４）は互いに直列反復配列として方向づけられる。この実施態様に
おいて、それぞれの特異的リコンビナーゼとの相互作用は、２つの反復配列の間
に位置するＤＮＡ配列（すなわち阻止配列）の欠失を起こし、それによってプロ
モーター（２）は関心とするＤＮＡ配列（６）に操作可能に結合する。

【００３６】 或いは、プロモーター（２）と関心とするＤＮＡ配列との間に位置する配列に
フランクする部位特異的組換え配列（４）は図１Ｂに示すように互いに逆方向反
復配列として方向づけられる。この実施態様では関心とするＤＮＡ配列（６）お
よびプロモーター（２）は最初は互いに操作可能に結合せず、セグメント"ｂ"に
含まれるＤＮＡ配列は発現しない。しかし適切な特異的リコンビナーゼ活性が導
入されると、２つの反復配列の間にあるＤＮＡ配列が逆方向になり、こうしてプ
ロモーター（２）を関心とするＤＮＡ配列（６）に操作可能に結合させる。例え
ばメインテナー系（図１ＢのＤＮＡ構成物を有する）とインデューサー系（図１
ＤのＤＮＡ構成物を有する）との交雑によって生成したハイブリッド中のリコン
ビナーゼ活性はセグメント"ｂ"を逆方向にし、それによってプロモーター（２）
と関心とするＤＮＡ配列（６）とを操作可能に結合させ、関心とするＤＮＡ配列
（６）を発現させる。

【００３７】 或いは、部位特異的組換え配列（４）の逆方向反復の間に位置するＤＮＡ配列
は、関心とする遺伝子／ＤＮＡ配列のコーディング配列の逆方向領域を、プロモ
ーター領域と共に、またはプロモーター領域なしで、含むことができる。例えば
、逆方向反復配列は上記遺伝子の分離したイントロンに位置し、その介在エクソ
ンはその他の遺伝子エクソンに対して逆転しているかも知れない。

【００３８】 本発明の阻止配列は、上記遺伝子の転写または翻訳を阻止するＤＮＡ配列を含
む。好ましい一実施態様において上記阻止配列は、プロモーターを所望遺伝子の
コーディング配列から物理的に分離するＤＮＡ介在配列を含む。一実施態様にお
いて、上記介在配列は、対応するメッセンジャーＲＮＡの翻訳を阻止する停止コ
ドンを１つ以上含む。或いは、上記阻止配列は、上記遺伝子の転写を抑制する" サイレンサー"因子であってもよい。これらの実施態様によると、上記阻止配列 には１対の直列反復−部位特異的組換え配列がフランクし、部位特異的リコンビ
ナーゼ活性の導入が上記阻止配列を切除し、上記遺伝子を発現させるようにする
。

【００３９】 当業者に公知の標準的繁殖または形質転換技術を用いて、リコンビナーゼ活性
を植物細胞に導入し、阻止配列を切除または逆転させ、それによって上記プロモ
ーターを上記遺伝子に操作可能に結合させる。部位特異的組換え標的配列は阻止
配列の末端に結合しなければならないとはいえ、上記部位特異的リコンビナーゼ
をコードする遺伝子はどこに位置してもよい。例えば、上記リコンビナーゼ遺伝
子は既にその植物のＤＮＡに存在していてもよいし（誘導性プロモーターのコン
トロール下で）、または直接細胞に挿入されるかまたは交雑受粉を介して挿入さ
れるＤＮＡフラグメントによって後から供給してもよい。好ましい実施態様にお
いては、第二のトランスジェニック植物（インデューサー植物系）を用いて、交
雑受精によってリコンビナーゼ活性をメインテナー植物系に導入する。インデュ
ーサー植物系は、構造性プロモーターのコントロール下で部位特異的リコンビナ
ーゼ遺伝子を含む多機能ＤＮＡ配列を含む。上記インデューサー植物の多機能Ｄ
ＮＡ配列はその他に選択マーカー遺伝子または可視マーカー遺伝子を含むことが
できる。インデューサー植物系とメインテナー植物系との交雑は、所望タンパク
質産物を発現するＦ１子孫を作り出す。

【００４０】 本発明の好ましい一実施態様において、親系Ａ、好ましくは高度な純系または
変種の細胞を、プロモーター（２）、阻止配列（ａ）、および関心とするＤＮＡ
配列（６）を含む第一の多機能ＤＮＡ配列で形質転換する。図１Ａを参照された
い。阻止配列（ａ）には一対の直列反復−部位特異的組換え配列（４）がフラン
クする。関心とするＤＮＡ配列（６）は、リコンビナーゼ活性が細胞内に導入さ
れ、阻止配列（ａ）が除去されると発現する。阻止配列（ａ）が除去されるとプ
ロモーター（２）が関心とするＤＮＡ配列（６）に操作可能に結合し、遺伝子の
発現を誘発する。好ましい実施態様において、多機能ＤＮＡ配列はさらに可視マ
ーカー遺伝子または選択マーカー遺伝子を含み、一実施態様では（図１Ｃ参照）
、阻止配列がさらに、可視マーカー遺伝子または選択マーカー遺伝子（８）をコ
ードするＤＮＡ配列を含む。また別の実施態様では、選択マーカー遺伝子（８）
は阻止配列領域（ａ）の外側に位置する。またはそれは分離したプラスミド上に
位置してもよく、多機能ＤＮＡ配列と共に同時形質転換される。

【００４１】 トランスフォームド細胞を選択マーカー遺伝子を使用して（または可視マーカ
ーの使用によって）選択し、完全無傷の第一多機能ＤＮＡ配列の存在をＤＮＡ分
析によって証明できることが確認される。受精能力のある植物が上記トランスフ
ォームド植物細胞から再生し、再生植物の子孫（本発明においてはＡ（Ｔ）系と
命名される）を維持し、繁殖させる。

【００４２】 Ａ（Ｔ）およびその後の世代において、自家受粉したりまたは非インデューサ
ー植物系と交雑した場合、介在ＤＮＡ配列（阻止配列"ａ"、図１Ａを参照）が関
心とするＤＮＡ配列の発現を阻止する。植物Ａ（Ｔ）は、Ａ（Ｔ）がインデュー
サー系"Ｂ（Ｔ）"と交雑する時まで、正常な植物および種子生育を示す。

【００４３】 親系Ｂの細胞を部位特異的リコンビナーゼをコードする遺伝子を含む多機能Ｄ
ＮＡ配列（１２）で形質転換し（図１Ｄ参照）、インデューサー系Ｂ（Ｔ）を生
成する。例えば親系Ｂは高度な純系でもよいし、メインテナー系Ａと交雑した際
に雑種強勢を示す変種であってもよい。トランスフォームド細胞を選択マーカー
遺伝子の使用によって（または可視マーカーの使用によって）選択し、さらにＤ
ＮＡ分析によって、完全無傷第一多機能ＤＮＡ配列の存在が証明できることが確
認される。受精能力のある植物をトランスフォームド植物細胞から再生し、再生
した植物の子孫（本発明ではＢ（Ｔ）系と命名される）を維持し、増殖させる。 もう一つの実施態様において、メインテナー系Ａ（Ｔ）を雌とし、雄として
のインデューサー系Ｂ（Ｔ）と交雑し、Ａ（Ｔ）×Ｂ（Ｔ）のＦ１種子を植え、
成熟するまで生長させる。本発明の好ましい実施態様において、Ａ（Ｔ）を機械
的手段によって、または熟練せる当業者には公知の植物雄性不稔系を用いて雄性
不稔化し、Ｆ１種子を生成した。

【００４４】 一実施態様により、メインテナー系Ａ（Ｔ）を、細胞質遺伝子−雄性不稔系を
用いて雄性不稔化する。この実施態様において、雄性不稔Ａ（Ｔ）系は細胞質雄
性不稔系に少なくとも６回戻し交雑を行い、それによって雄性不稔変種、Ａ（Ｔ
）ｃｍｓを作成する。雄性稔性Ａ（Ｔ）系を雄として用いてＡ（Ｔ）ｃｍｓ系を
維持する。好ましい一実施態様において、Ａ（Ｔ）ｃｍｓをＢ（Ｔ）と交雑し、
ハイブリッド植物を作成する。この場合Ｂ（Ｔ）は受精回復遺伝子（不稔細胞質
中にこれが存在すると雄性稔性は回復する）を含む。

【００４５】 もう一つの実施態様において、メインテナー系Ａ（Ｔ）をトランスジェニック
ハイブリッド生産系によって雄性不稔化する。この実施態様において、図１Ｇに
示す阻止配列（ａ）は、構造的に発現する殺草剤耐性遺伝子などの選択マーカー
遺伝子（８）および葯（ａｎｔｈｅｒ）特異的プロモーターに操作可能に結合す
る自殺遺伝子（１６）（自殺遺伝子産物の発現は花粉粒の発育を阻止する）をコ
ードするＤＮＡ配列を含む。別の方法として、可視マーカー遺伝子を選択マーカ
ー遺伝子の代わりに用いることができる。この雄性不稔系を含む親系Ａ（Ｔ）の
再生植物［Ａ（Ｔ）ｔｍｓ植物］をトランスフォームドまたは非トランスフォー
ムドＡ植物によって同胞受粉（ｓｉｂ−ｐｏｌｌｉｎａｔｅｄ）させる。この交
配から生ずる子孫の半分は雄性稔性で、殺草剤感受性であり、半分は雄性不稔で
、殺草剤耐性である。このような交配からの子孫を殺草剤で処理し、雄性稔性植
物を破壊する。

【００４６】 耐性、雄性不稔植物を再びＡ植物によって同胞受粉する。このプロセスを反復
してＡ（Ｔ）ｔｍｓ系を維持し、その系統を商業的用途に必要な量だけ生産する
。Ａ（Ｔ）ｔｍｓ×Ａ植物をハイブリッド種子生産地で殺草剤で処理し、Ｂ（Ｔ
）植物によって受精する。Ｂ（Ｔ）からのリコンビナーゼ遺伝子はＡ（Ｔ）ｔｍ
ｓ×Ｂ（Ｔ）植物の交雑受精から生成した接合子およびＡ（Ｔ）ｔｍｓ×Ｂ（Ｔ
）Ｆ１植物の生育中の全ての細胞においては活性である。上記リコンビナーゼは
選択マーカー遺伝子（８）および自殺遺伝子（１６）を含む阻止配列（ａ）を切
除し、それによって雄性稔性を回復し、プロモーター（２）は関心とするＤＮＡ
（６）と操作可能に結合する。図１Ｇを参照されたい。こうして関心とするＤＮ
Ａ配列（６）はプロモーター（２）のコントロール下で、生育中のＦ１粒に発現
する。生育中のＦ１植物における関心とするＤＮＡ配列の発現は上記遺伝子プロ
モーターの選択性に依存する。もしも上記プロモーターが構造性プロモーターで
あるならば、関心とするＤＮＡ配列はＦ１粒（接合子）に発現する。もしもプロ
モーターが組織特異的または生育調節プロモーターであるならば、発現はさらに
調節されるかも知れない。例えば、もしプロモーターが種子特異的プロモーター
であるならば、遺伝子産物はＦ２種子が作り出されるまで発現しない。

【００４７】 そのため所望遺伝子産物の発現はメインテナー系では無期限に遅れることがあ
り、例えばメインテナー系とインデューサー系との交雑受精によって、リコンビ
ナーゼ活性が植物に導入されるまで、発現は誘発されない。一実施態様において
は、交雑受精した親系（ＡおよびＢ）は同一であり、Ｆ１植物（メインテナー系
Ａ（Ｔ）とインデューサー系Ｂ（Ｔ）―すなわちメインテナー系およびインデュ
ーサー系を作成するために必要なＤＮＡ構成物で形質転換された親系ＡとＢ―を
交雑させることによって生成された）に発現する関心とする遺伝子を用いて、ハ
イブリッド種子の商業的生産のための雌親を生成する。例えば、一実施態様にお
いて、Ｆ１植物（Ａ（Ｔ）×Ｂ（Ｔ））は雄性不稔であり、植物系Ｃと交雑させ
る。その際親系Ｃは高度な純系であるか、または親系Ａと交雑した際に雑種強勢
を示す変種であり、また親系Ｃは生成したハイブリド植物に稔性を回復すること
ができる。

【００４８】 一実施態様において、インデューサー植物は、構造性プロモーターに操作可能
に結合する部位特異的リコンビナーゼ遺伝子をコードするＤＮＡ構成物（１２）
を含む（図１Ｄ参照）。インデューサー植物の上記ＤＮＡ構成物は可視または選
択マーカー遺伝子も含むことができる。メインテナー植物は関心とするＤＮＡ配
列、阻止配列および誘導性または組織特異的プロモーターを含んでなるＤＮＡ配
列を含む。ここで上記阻止配列には一対の部位特異的リコンビナーゼ配列がフラ
ンクし、上記阻止配列はプロモーターと関心とするＤＮＡ配列との間に位置する
（図１Ａ参照）。インデューサー植物のＤＮＡ構成物は可視または選択マーカー
遺伝子も含むことができる。一実施態様において、可視または選択マーカー遺伝
子は上記の一対の部位特異的リコンビナーゼ配列の間に位置する。インデューサ
ーおよびメインテナー系の交雑受精で、上記リコンビナーゼ遺伝子はＡ（Ｔ）×
Ｂ（Ｔ）Ｆ１植物の接合子に発現し、阻止配列は除去される。阻止配列が除去さ
れると、関心とするＤＮＡ配列が上記誘導性または組織特異的プロモーターに操
作可能に結合し、インデューサーとの接触で、または組織特異的方法で、遺伝子
産物がＦ１植物に発現する。

【００４９】 好ましい一実施態様において、インデューサー植物系は図１ＤのＤＮＡ構成物
を含み、メインテナー植物系は図１Ａまたは１ＣのＤＮＡ構成物を含む。この場
合関心とするＤＮＡ配列（６）を発現するために用いるプロモーター（２）は、
その関連遺伝子産物を植物の種子にのみ発現する種子特異的プロモーターである
。例えば、本発明による一つの種子特異的プロモーターは、その操作可能結合遺
伝子を種子の内胚乳にのみ発現するプロモーターである。この実施態様によると
、インデューサー系とメインテナー系との交雑受精後、阻止配列は除去されるが
、関心とするＤＮＡ配列は生育中のＦ１粒にのみ発現する。こうして関心とする
ＤＮＡ配列（６）は種子産生の最後の世代にのみ、すなわち商業的種子生産段階
中にのみ活性化され、メインテナーおよびインデューサー植物系の繁殖中には活
性化されない。これらの種子をその後標準的収穫法および器具を用いて収穫し、
所望産物をこれら種子から抽出する。この実施態様において、Ｆ１種子、すなわ
ちメインテナーおよびインデューサー植物系の交雑直後に生成した種子、は所望
遺伝子を活性型で含む。トランスジェニック植物の多くは繁殖段階中に作り出さ
れるから、種子生育性および発芽のロスは問題の化合物の生産にはほとんど影響
ない。

【００５０】 或いは、関心とする遺伝子のプロモーターは、その関連遺伝子産物を植物の葉
にのみ発現する葉特異的プロモーターでもよい（例えば上記遺伝子は穀類または
草の葉片のみに発現する）。この実施態様においては、産物を、Ｆ１植物の刈り
取った草等、Ｆ１植物の葉から収穫することができる。

【００５１】 或いは、インデューサー植物系のリコンビナーゼ遺伝子を組織特異的プロモー
ターまたは誘導性プロモーターに操作可能に結合することができる。この実施態
様において、リコンビナーゼ遺伝子はインデューサーと接触した後のＦ１子孫に
のみ発現するか、または或る組織にのみ発現する。上記リコンビナーゼ遺伝子を
発現する細胞のみが、インデューサー系とメインテナー系（ここでメインテナー
系は図１Ａまたは１ＣのＤＮＡ構成物を含む）との交雑の子孫において、関心と
する遺伝子の発現を活性化する。例えばリコンビナーゼ遺伝子のプロモーターは
種子特異的プロモーターでもよく、したがってこのリコンビナーゼ遺伝子はＦ１
植物の生育中の種子のみに発現する。リコンビナーゼ活性はメインテナーおよび
インデューサー植物系の交雑の子孫のＦ１粒に限定され、所望遺伝子産物はＦ１
粒のみに発現する。Ｆ１粒を収穫し、関心とするＤＮＡ配列の発現から生成する
産物の抽出、分離、精製の処理、およびその他の処理を行う。

【００５２】 分子生物学および植物繁殖の熟練せる当業者は本発明を実施するためのその他
の手段を理解できよう。例えば所望遺伝子をコードする多機能ＤＮＡ配列にさら
に、ホスト植物の内因性配列に相同性（ｈｏｍｏｌｏｇｙ）を与えるＤＮＡ配列
を供給することができる。特に、多機能ＤＮＡ配列は、ホスト植物ＤＮＡへの挿
入を標的とする配列にフランクする２つの相同ＤＮＡ配列（１０）を含むことが
できる（図１Ｅ参照）。相同ＤＮＡ領域は、上記フランクド配列を、相同組換え
事象を介して植物細胞のＤＮＡに挿入することを促進し、上記配列の、植物細胞
ＤＮＡのあらかじめ決められた特異的標的への挿入を可能にする。一実施態様に
おいて、可視または選択マーカー遺伝子は上記一対の部位特異的リコンビナーゼ
配列の間に位置する。さらに図１Ｈに示す別の実施態様において、第一の可視ま
たは選択マーカー遺伝子（１８）は上記一対の部位特異的リコンビナーゼ配列の
間に位置し、第二の可視または選択マーカー遺伝子（２０）は、部位特異的リコ
ンビナーゼ配列（４）がフランクしている領域の外側、かつ相同ＤＮＡ配列（１
０）がフランクしている領域の内側に位置する。第一および第二の可視または選
択マーカー遺伝子が互いに異なり、そのため図１Ｈの構成物を含む最初のトラン
スフォームド植物Ｂ（Ｔ）を確認でき、その後に、阻止配列は除去されたがＤＮ
Ａ構成物の残りの因子は保持している生成ハイブリッド植物Ａ（Ｔ）×Ｂ（Ｔ）
を確認できるのが好ましい。一実施態様において、第一の可視または選択マーカ
ー遺伝子（１８）は可視マーカー遺伝子であり、第二の可視または選択マーカー
遺伝子（２０）は殺草剤耐性遺伝子等の選択マーカー遺伝子である。

【００５３】 本発明のトランスジェニック植物を生産するために用いる多機能ＤＮＡ配列は
選択マーカー遺伝子（８）またはポリリンカー領域（１４）をコードする配列を
含むことができる。図１Ｆ参照。ポリリンカーは多数の異なるエンドヌクレアー
ゼ制限部位を近隣に含む短いＤＮＡである。ポリリンカーの存在が好都合である
のは、それが種々の発現カセットの挿入および除去を容易にし、特定のＤＮＡフ
ラグメントを含む構成物の作成プロセスを簡単にすることができるからである。
本発明により、図１Ａ、１Ｂ、１Ｅ、１Ｇまたは１Ｈの構成物の遺伝因子を含む
ＤＮＡ構成物を作成することができ、その際関心とするＤＮＡ配列（６）は図１
Ｆに示されるポリリンカー領域を含む。

【００５４】 上記の形質転換構成物は、より大きい構成物の部分であってもよい。上記のよ
り大きい構成物の追加的配列は、細菌ホストにおいて全ＤＮＡ分子を複製できる
ＤＮＡ配列および細菌性選択マーカー（例えばアンピシリンまたはテトラサイク
リン耐性をコードする遺伝子）をコードするＤＮＡ配列を含む。このより大きい
構成物、理想的にはプラスミド、を用いて細菌細胞を形質転換することができる
。これらのトランスフォームド細菌細胞をその後培養して多量のプラスミドＤＮ
Ａを生産することができる。その後上記特異的形質転換構成物を熟練せる当業者
に公知の方法を用いて分離することができる。

【００５５】 図１Ａに示すような一実施態様において、真核細胞の形質転換に用いるための
多機能ＤＮＡ配列はプロモーター（２）、有害だが商業的には貴重な産物をコー
ドする関心とするＤＮＡ配列（６）および阻止配列（ａ）を含み、この阻止配列
には２つの直列反復−部位特異的組換え配列（４）がフランクしている。一実施
態様において、阻止配列は選択マーカー（８）をコードする遺伝子を含む。図１
Ｃを参照されたい。多機能ＤＮＡ配列には各末端にヌクレオチド配列がフランク
しており、これらのヌクレオチド配列は形質転換すべき真核細胞に存在するヌク
レオチド配列に相同性を与え、多機能ＤＮＡ配列のホスト細胞ＤＮＡのあらかじ
め決められた座への挿入を標的とする（図１Ｅ参照）。

【００５６】 本発明のまた別の実施態様において、真核細胞の形質転換に用いる多機能ＤＮ
Ａ配列はプロモーター（２）、ポリリンカー領域（１４）および阻止配列（ａ）
を含み、上記阻止配列には２つの直列反復−部位特異的組換え配列（４）がフラ
ンクしている（図１Ｆ参照）。好ましい実施態様において、阻止配列はプロモー
ターとポリリンカー領域の間に置かれる。ポリリンカー領域は関心とするＤＮＡ
配列の多機能ＤＮＡ配列への挿入を容易にする。関心とするＤＮＡ配列の挿入後
、そのＤＮＡ構成物を用いて植物細胞を形質転換し、種々のメインテナー植物系
を生成する。

【００５７】 例１ イネおよびトウモロコシでのプラスミドＦＲＴ部位間ＦＬＰ仲介部位特異
的組換え 試料および方法ＦＬＰ発現ベクタの合成 プラスミド構造体： ａｄｈＩ−Ｓ遺伝子を含むトウモロコシゲノムＤＮＡの
６．８ｋｂＢａｍＨＩ−ＸｈｏＩ断片をｐＢＲ３２２のＢａｍＨＩ−ＳａｃＩ部
位に挿入してｐＢｘ２６を得た。制御ベクタｐＡｅｉＧＵＳをｇｕｓＡコード配
列とｎｏｓ ｐｏｌｙＡ部位を含むＳｍａＩ−ＥｃｏＲＩ断片でｐＢＸ２６（殆
どのａｄｈＩコード配列を含む）のＰｖｕＩＩ断片を置換して構築した。したが
って、この構造体はｇｕｓＡコード配列にインフレーム融合したａｄｈＩ遺伝子
の第１エキソンとイントロンＡを持つａｄｈＩゲノムクローンからの１．５ｋｂ
ＢａｍＨＩ−ＰｖｕＩＩ断片を含むが、ｇｕｓＡコード配列は依然としてそれ自
体の出発コドンを完全な状態で保有する。プラスミドｐＡＨＣ２７はカリフォル
ニア大学バークレー校のピーター博士（Ｄｒ． Ｐｅｔｅｒ）から供給され、プ
ラスミドｐＮＥＯβＧＡＬとｐＯＧ４４はＳｔｒａｔａｇｅｎｅ， ＬａＪｏｌ
ｌａ， ＣＡから購入した。ｐＵｂｉＧＵＳはｐＡＨＣ２７のＸｂａＩ断片をｐ
３５ＳＧＵＳのＨｉｎｄＩＩＩ−ＢａｍＨＩ制限部位に連結させることによって
トウモロコシユビキチン遺伝子の５’制御因子をｇｕｓＡコード配列の前端に連
結させて構築した。ｐＡｅｉＦＬＰを構築するために、ｐＡｅｉＧＵＳとｐＯＧ
４４を共にＢｇｌＩＩおよびＳａｃＩで消化した。ｐＯＧ４４からのＦＬＰコー
ド配列を保持する１．５ｋｂ断片を溶離したｐＡｅｉＧＵＳの４．４ｋｂ断片中
に定方向連結させてｇｕｓＡコード配列を置換した。１．５ｋｂのＳａｃＩ−Ｈ ｉｎｄ ＩＩＩＦＬＰ断片をｐＯＧ４４から単離してｐＵｂｉＦＬＰを得、ｐＧＥ
Ｍ−７Ｚ（−）（Ｐｒｏｍｅｇａ， Ｍａｄｉｓｏｎ， ＷＩ）のそれぞれの部
位にサブクローニングした。得られたプラスミドをＳａｃＩおよびＳｍａＩで切
断し、次に１．５ｋｂＦＬＰ断片をＳａｃＩ−ＳｍａＩ消化ｐＵｂｉＧＵＳで定
方向連結させてｇｕｓＡ断片をＦＬＰ遺伝子で置換した。

【００５８】ＦＲＴを含むベクタの合成 二つのプライマー （５’−ＧＴＧＡＴＣＡＧＡＡＧＴＴＣＣＴＡＴＴＣＣＧＡＡＧＴＴＣＣＴＡＴ
ＴＣＴＣＴＡＧＡＡＡ−３’（ＳＥＱ ＩＤＮＯ：１）と（５’−ＣＴＧＡＴＣ
ＡＧＡＡＧＴＴＣＣＴＡＴＡＣＴＴＴＣＴＡＧＡ−３’（ＳＥＱ ＩＤＮＯ：２
）とをアニール（それぞれ４ｎｍｏｌ）し、Ｔ４ ＤＮＡポリメラーゼ５単位と
０．１ｍｌ中のｄＮＴＰそれぞれ６０ｎｍｏｌとで３時間、１１℃でインキュベ
ートして完全な４８ｂｐのＦＲＴ組換え部位を形成した。プライマー−拡張断片
はそれぞれの末端にＢｃｌＩ制限部位を包含していた。次にＴ４ ＤＮＡキナー
ゼ２０単位と１ｘキナーゼバッファー３０μｌ中のＡＴＰ１６ｎｍｏｌとでイン
キュベートして燐酸基を端末ヌクレオチドに付加した。得られた二重鎖ＤＮＡ断
片を平滑末端連結し、ＢｃｌＩ制限酵素で切断した。次に生成物をｐＵｂｉＧＵ
ＳのＢｇｌＩＩ部位に定方向連結してｐＵＦＲＴＧを生成した。ＦＲＴ部位（３
７ｂｐ）の最小バージョンを含むｐＵＦＲＴｍＧベクタを構築するために、プラ
イマー拡張生成物をｐＵｂｉＧＵＳのＢｇｌＩＩ部位に平滑末端連結した（Ｔ４
ＤＮＡポリメラーゼを用いてｐＵｂｉＧＵＳのＢｇｌＩＩ部位を埋めた）。最
小ＦＲＴ配列は二重鎖プラスミドＤＮＡを配列決定して確認された。ｐＵ２ＦＲ
ＴＧとｐＵ２ＦＲＴｍＧはｐＮＥＯＢＧＡＬの１．３ｋｂＸｂａＩ断片をｐＵＦ
ＲＴＧおよびｐＵＦＲＴｍＧにそれぞれ連結して構築した。分子間組換えのため
の検定プラスミドｐＵｂｉＦＲＴはｐＵ２ＦＲＴｍＧのＥｃｏＲＩ制限および得
られるプラスミドＤＮＡ断片の再結合によって構築された。分子間組換えのため
のその他の基質、ｐＦＲＴＧＵＳはＥｃｏＲＩとＢａｍＨＩとによるｐＵ２ＦＲ
ＴｍＧの消化、ｇｕｓＡコード配列とＦＲＴ部位とを含む断片の単離、得られる
断片をｐＧＥＭ−７（−）ｆ（Ｐｒｏｍｅｇａ， Ｍａｄｉｓｏｎ， ＷＩ）の
それぞれの部位へ連結することで得られた。

【００５９】ＤＮＡの分子解析 Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ Ｃｅｔｕｓ ＤＮＡ熱サイクラーでポリメラーゼ
連鎖反応（ＰＣＲ）を行なった。試薬とプロトコルをＰｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ
Ｃｅｔｕｓ ＧｅｎｅＡｍｐ ＰＣＲ Ｋｉｔ（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ
Ｃｅｔｕｓ， Ｎｏｒｗａｌｋ， ＣＴ）が概説するように用いて増幅を行なっ
た。プライマーの配列はユビキチン遺伝子の第１エキソンにつき５’−ＣＣＣＣ
ＡＡＣＣＴＣＧＴＧ−３’（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３）、ｇｕｓＡコード配列の
５’末端につき５’−ＧＧＧＧＴＴＴＣＴＡＣＡＧＧＡＣＧ−３’（ＳＥＱ Ｉ
Ｄ ＮＯ：４）であった。ＰＣＲ反応は鋳型ＤＮＡ５μｌ、プライマー溶液５μ
ｌ（それぞれ５０ｎｍｏｌ）、１０ｘＰＣＲバッファーＩＩ（２２）５μｌ、ｄ
ＮＴＰ混合物２．０μｌ（それぞれのヌクレオチドにつき最終濃度２００μＭ）
、最終容積５０μｌ中のＴａｑポリメラーゼ０．２５μｌ（２．５単位／１００
μｌ）を含有した。変性、アニーリング、拡張ステップはそれぞれ９４℃で１分
間、４５℃で１分、７２℃で２分行なった。拡張ステップを各サイクルにつき１
５秒増やした。１．０％アガロースゲル電気泳動を用いて増幅生成物それぞれの
５マイクロリットルを解析した。

【００６０】 Ｈｙｂｏｎｄ−Ｎ膜（Ａｍｅｒｓｈａｍ， Ａｒｌｉｎｇｔｏｎ Ｈｅｉｇｈ
ｔｓ， ＩＬ）への毛管転移を用いてＰＣＲ増幅ＤＮＡを含むアガロースゲルの
サザンブロットを行なった。ＵＶ照射を用いてＤＮＡを膜に固定し、プレハイブ
リッド形成溶液（５ｘＳＳＰＥ、５ｘＤｅｎｈａｒｄｔ溶液、０．５％ＳＤＳ）
中６５℃で４時間インキュベートした。製作者（Ａｍｅｒｓｈａｍ， Ａｒｌｉ
ｎｇｔｏｎ Ｈｅｉｇｈｔｓ， ＩＬ）の指導書にしたがってＭｕｌｔｉｐｒｉ
ｍｅｒ ＤＮＡ標識システムを用いて放射性プローブ（ｐＵｂｉＧＵＳから単離
したα^３２Ｐ−標識ＳｍａＩ−ＢｇｌＩＩ断片）を調製した。プローブは完全な
ユビキチンイントロンと第１エキソンの一部を含有した。ブロットを一晩プレハ
イブリッド形成溶液中６５℃でハイブリッドし、引き続き標準操作にしたがって
処理した。

【００６１】 Ｓｅｑｕｅｎａｓｅ Ｖｅｒｓｉｏｎ ２．０（Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｌｅｖｅｌａｎｄ， ＯＨ）を用いる修正ジデオ
キシ法でＦＲＴ部位のヌクレオチド配列を決定した。ＣｓＣｌ純化ｐＵＦＲＴＧ
およびｐＵ２ＦＲＴｍＧプラスミドＤＮＡを鋳型ＤＮＡとして用いた。使用した
プライマーはＰＣＲに用いたプライマーと同じであり、ユビキチン遺伝子第１エ
キソンの５’末端にアニールした。

【００６２】 形質転換の手順 トウモロコシ（Ｚｅａ ｍａｙｓ Ｌ．）の細胞懸濁培養をＡ１８８ｘＢＭＳ
タイプＩＩカラスから開始して維持した〔カモ（Ｋａｍｏ）ら、１９８７， Ｐ ｌａｎｔａ ， １７２， ２４５−２５１〕。プロトプラスト単離の７日前に懸
濁培養の２ｍｌ細胞充填容積（ＰＣＶ）を３７ｍｌのＭＳ培地〔ムラシゲ（Ｍｕ
ｒａｓｈｉｇｅ）ら、１９６２， Ｐｈｙｓｉｏｌ Ｐｌａｎｔ， １５， ４
７３−４９７〕に移し、３．５ｍｇ／ｌの２，４−Ｄを補足した。

【００６３】 懸濁細胞の約５ｍｌ ＰＣＶをマニトール０．２Ｍ、チアミン０．５ｍｇ／ｌ
、２，４−Ｄ ２ｍｇ／ｌ、ＣａＣｌ_２・２Ｈ２Ｏ ８０ｍＭ、セルラーゼ２％
、ペクチナーゼ０．２５％、ペクトリアーゼＹ−２３ ０．１％を含むＭＳ培地
２０ｍｌ中、ｐＨ６．０で３時間消化した。４８μｍナイロンメッシュスクリー
ンを通してプロトプラストを濾過し、５０ｘｇで１５分遠心してペレットとした
。プロトプラスト培地（９％フィコール４００を含み、形質転換培地（ＴＭ）４
ｍｌを被せたＰＣＭ）８ｍｌ中にペレットを懸濁させた。形質転換培地はＭＥＳ
バッファー１００ｍＭ、ｐＨ５．５、０．２Ｍマニトールおよび８０ｍＭのＣａ
Ｃｌ_２・Ｈ_２Ｏで構成した。７５ｘｇで１０分間遠心分離した後にプロトプラス
トのバンドを間期から収集し、ＴＭで濃度を１．０ｘ１０^７プロトプラスト／ｍ
ｌに調整した。

【００６４】 プラスミドＤＮＡの２０〜２５μｌ（１．０ｍｇ／ｍｌ）に続きプロトプラス
ト０．５ｍｌと５０％ＰＥＧ（ポリエチレングリコール、ＭＷ＝８０００；ファ
ルコン液に溶解）をピペットで採り１２ｍｌのファルコンポリスチレンチューブ
の中でプロトプラスト形質転換を行なった。プロトプラストを室温で２０分イン
キュベートした。インキュベートの後、ＰＣＭに２ｍｌの固化した０．８％低融
点アガロースを含む１２ウェルマイクロ培養皿にプロトプラスト溶液３３０μｌ
を移した。次にプレートをパラフィルム（Ｐａｒａｆｉｌｍ）で包み、２５℃で
約２４時間暗所インキュベートした。

【００６５】 ＧＵＳ活性およびタンパク質の決定 ２４時間のインキュベーションに後に、プロトプラストを収集して０．１％ト
リトンＸ−１００を含むＧＵＳ抽出バッファー３００μｌに再懸濁させた。１６
，０００ｘｇで５分遠心分離した後に、９６ウェルプレート内３７℃で２５μｌ
のプロトプラスト抽出物をＧＵＳ抽出バッファー中のＭＵＧ（４−メチル・ウン
ベリフェリルβ−Ｄ−グルクロン酸塩）１５０μｌでインキュベートした。種々
異なる時間で１２５μｌのＧＵＳ停止バッファー（０．２Ｍ ＣａＣＯ_３）を添
加して反応を停止させた。メチルウンベリフェロン標準で校正したＰｅｒｋｉｎ
Ｅｌｍｅｒ蛍光スペクトルメータＬＳ５０Ｂで蛍光（励起３６２λ、発光４５
５λ）を測定した。時間点から生じたラインの勾配からＧＵＳ活性を計算し、ブ
ラッドフォードの方法（Ｂｒａｄｆｏｒｄ， １９７６， Ａｎａｌ． Ｂｉｏ ｃｈｅｍ ， ７２， ２４８−２５４）で決定したタンパク質含量に規格化した
。

【００６６】 結果 この研究に用いたＦＬＰ／ＦＲＴ部位特異的組換え系は二つの因子、ＦＬＰ酵
素に関するプラスミドＤＮＡコード化およびＦＲＴ組換え部位を含む検定プラス
ミドから構成される。

【００６７】 標的ＦＲＴヌクレオチド配列はそれぞれが１３ｂｐの三つの再生されたＤＮＡ
配列、定方向配向の二つの反復と他の二つに対し逆方向の一つの反復とから成る
。さらに、ＦＲＴ組換え部位の配向を決定する反復と組換え事象を開始する配列
対合部位の役割をする反復の間に８ｂｐのスペーサ領域が存在する。ＦＬＰリコ
ンビナーゼは三つの反復全てに結合し、二つのＦＲＴ部位のスペーサ領域内でＤ
ＮＡ配列をアニールし、スペーサ境界で部位を切断し、ＤＮＡ鎖を交換する。組
換え部位の配向に依存して、ＦＲＴの間のＤＮＡ断片は逆方向になるか切除され
る。さらに、ＦＬＰリコンビナーゼは離れたＤＮＡ分子に位置した標的ＦＲＴ部
位で作用する。これらの分子間組換えは微生物およびマウスのゲノムにおける外
来ＤＮＡのＦＲＴ部位への組込に繋がる。

【００６８】 図２および３は植物プロトプラストにおける酵母ＦＬＰ／ＦＲＴ系の活性研究
に用いたＦＬＰ発現ベクタの線図と方策を示す。より詳細には、図２はＦＬＰタ
ンパク質で触媒されたＤＮＡ切除反応を検定するための組換え系の構成要素を示
す。ＦＬＰ酵素はｐＡｅｉＦＬＰまたはｐＵｂｉＦＬＰのいずれかによって産生
される。図３は始原ａｄｈＩクローン（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５）のスプライシ
ング部位の配列およびクローン化ＦＬＰコード配列とａｄｈＩ（ＳＥＱ ＩＤ
ＮＯ：６）またはユビキチントウモロコシ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７）プロモー
タとの間の結合部位の配列を示す。太線はｐＵｂｉＦＬＰベクタにおけるＦＬＰ
タンパク質合成のａｄｈＩ遺伝子のオープンリーディングフレームまたは翻訳開
始コドンを示す。トウモロコシユビキチン遺伝子の第１エキソンはａｄｈＩ第１
エキソンと対照的に翻訳されないことに留意されたい。

【００６９】 図４ＡはＦＲＴ部位含有ベクタの構造を示す。単点完全部位（ＳＥＱ ＩＤ
ＮＯ：８）または部分的ＦＲＴ部位（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９）をユビキチン第
１エキソンのＢｇｌＩＩ部位に連結した。星印はＦＬＰ結合部位を示す。矢印は
１３ｂｐ逆方向反復を示す。ベクタｐＵＦＲＴｍＧは一つの１３ｂｐ反復と短い
１１ｂｐ逆方向反復だけを含有した。このＦＲＴ部位は５個の追加ＦＬＰタンパ
ク質結合部位を欠失していた。ＦＲＴベクタのＸｂａＩ部位にｐＮＥＯβＧＡＬ
のＸｂａＩ断片を挿入して第２のＦＲＴ部位を付与してＧＵＳ発現の不活性化を
導いた。

【００７０】 ＦＬＰベクタから発現したＦＬＰリコンビナーゼはＦＲＴ標的部内で検定プラ
スミドＤＮＡを組換えてＧＵＭ酵素の発現を回復するはずである。ＦＬＰ遺伝子
の発現はｐＡｅｉＦＬＰのトウモロコシａｄｈＩプロモータおよびｐＵｂｉＦＬ
Ｐのトウモロコシユビキチンによって推進された（図３）。両構造体共にそれぞ
れの遺伝子の第１エキソンとイントロンを含んでいた。ｐＡｅｉＦＬＰの構造体
では、第１イントロンはＢｇｌＩＩ部位でｐＯＧ４４からの合成イントロンの８
１ｂｐに融合した第１ａｄｈＩイントロンの２９０ｂｐを含んでいた。両プロモ
ータはトウモロコシプロトプラストの過渡ＧＵＳ発現アッセイで決定されたよう
に極めて効果的であることが証明されたが、ユビキチンプロモータがより優れて
いた。

【００７１】 ＦＬＴ配列の挿入にｐＵｂｉＧＵＳユビキチンプロモータの第１エキソンのＢ ｇｌ ＩＩ部位を選び、引き続きその他の適切な挿入部位を初期スクリーニングし
た。二つの異なるＦＲＴ部位、一つはＦＲＴｍと呼ぶ最小３７ｂｐＦＲＴ、他の
一つはＦＲＴと呼ぶ完全な４８ｂｐＦＲＴ部位をＢｇｌＩＩ部位に連結した（図
４Ａ）。ＦＲＴｍ部位は５個の付加的ＦＲＰタンパク質結合部位を含む第３の反
復を欠失するが、類似なＦＲＴの欠失（一つの反復とＦＬＰタンパク質結合部位
の欠損）は野生型ＦＲＴ部位と同じように効果的であることがインビトロで判明
した。興味あることに、ｐＵｂｉＧＵＳにＦＲＴｍ部位を挿入するとＧＵＳ酵素
の発現が増加する結果になった。ＦＲＴ部位全長を挿入するとＧＵＳ発現は減少
した。

【００７２】 ｐＮＥＯβＧＡＬのＸｂａＩ断片をｐＵＦＲＴＧの単点ＸｂａＩ部位に挿入し
て検定プラスミドの分子間組換えのための第２のＦＲＴ部位を創作した。ｐＮＥ
ＯβＧＡＬ断片の挿入が補足配列を付与して付加的ＦＲＴ部位とユビキチンプロ
モータをｇｕｓＡコード配列から分離する１．３１ｋｂのスペーサＤＮＡを形成
した（図４Ｂ）。その結果、ｐＵ２ＦＲＴＧで形質転換されたトウモロコシプロ
トプラストにおけるＧＵＳ活性は顕著に減少した。ｐＮＥＯβＧＡＬの連結され
たＸｂａＩ断片の逆方向配位もＧＵＳ発現を不活性化するが、機能性ＦＲＴ部位
を形成することはない。図４Ｂに示したｐＵ２ＦＲＴｍＧｒｅｖとｐＵ２ＦＲＴ
Ｇｒｅｖベクタを用いて、ＦＬＰタンパク質によるＧＵＳ発現の活性化を得るた
めには完全な機能性ＦＲＴ部位が必用であることが実証された。

【００７３】 ＰＡｅｉＦＬＰとｐＵ２ＦＲＴｍＧで共形質転換したトウモロコシプロトプラ
ストにおける過渡ＧＵＳ活性はｐＵ２ＦＲＴｍＧだけで形質転換したプロトプラ
ストにおける活性よりも高かった。復元したＧＵＳ発現は制御ｐＵＦＲＴｍＧで
のプロトプラスト形質転換の後に観察された発現のほぼ１０％であった。ｐＡｅ
ｉＦＬＰで形質転換したトウモロコシプロトプラストのＧＵＳ発現はバックグラ
ンドＧＵＳ活性と同じであった。このように、ＦＬＰ／ＦＲＴ組換え系はトウモ
ロコシプロトプラストで機能すると思われた。このことは増加量のｐＡｅｉＦＬ
Ｐ ＤＮＡで共形質転換したトウモロコシプロトプラストにおけるＧＵＳ活性の
増加によってさらに実証された。これはＧＵＳ発現が存在するＦＬＰ酵素量に依
存するだけでなく、ＦＬＰタンパク質の量が組換えプロセスにおける限定因子で
あるかもしれないことを示す。検定プラスミドと共にｐＵｂｉＦＬＰをトウモロ
コシプラスミドに導入すると、ｐＵ２ＦＲＴｍＧとｐＵ２ＦＲＴＧの両方のＧＵ
Ｓ活性はそれぞれの制御処理の８１％および４５％に回復した。両ＦＲＴを含む
ベクタとｐＵｂｉＦＬＰとの存在下におけるＧＵＳの再活性化はＦＬＰタンパク
質が１．３１ｋｂ断片の切除を触媒することを示した。ＦＲＴを１．３１ｋｂ断
片の逆方向連結（ｐＵ２ＦＲＴｍＧｒｅｖおよびｐＵ２ＦＲＴＧｒｅｖで変異さ
せると、ＧＵＳ活性は回復しなかった。この事実はこれらのＦＲＴ部位がＦＬＰ
タンパク質によって認識されないことを示唆する。

【００７４】 ＦＲＴ部位での分子間組換えを観察するために、ユビキチンプロモータまたは
ｇｕｓＡコード配列をｐＵＦＲＴｍＧから除去してｐＵｂｉＦＲＴおよびｐＦＲ
ＴＧＵＳをそれぞれ生成した。二つの異なるＦＲＴ部位を二つの離れたＤＮＡ分
子上（ｐＵｂｉＦＲＴおよびｐＦＲＴＧＵＳ）でプロトプラストに導入すると、
ＧＵＳ活性はｐＦＲＴＧＵＳ単独で形質転換したプロトプラストにおけるバック
グランド活性の約４倍に増加した。この活性は正の制御（ｐＵＦＲＴｍＧで形質
転換したプロトプラスト）の１５％であった。このｐＦＲＴＧＵＳ形質転換プロ
トプラストにおける比較的高いＧＵＳのバックグランド発現（６±１単位）は第
１イントロンの全部とユビキチン第１エキソンの一部がこのベクタに存在する結
果であると思われる。

【００７５】 ＦＬＰ／ＦＲＴ組換え系をイネプロトプラストで検定した。ＤＮＡのリコンビ
ナーゼ仲介切除はイネにおいてトウモロコシプロトプラストにおけるのと同じよ
うに効果的であることが証明された。同じ応答パターンが異なる含ＦＲＴプラス
ミド構造体につき観察された。イネプロトプラストのｐＵｂｉＦＬＰとｐＵ２Ｆ
ＲＴｍＧまたはｐＵｂｉＦＬＰとｐＵ２ＦＲＴＧのいずれかとの共形質転換は制
御ＧＵＳ活性の７５％および３１％の回復を与えた。不活性ＦＲＴ部位を含むベ
クタは制御ＧＵＳ活性の１〜２％の回復を示しただけであった。

【００７６】 共形質転換トウモロコシプロトプラストから単離した全ＤＮＡのＰＣＲ解析は
組換えプラスミドＤＮＡ分子が存在することを示した。この解析に用いた二つの
プライマーはユビキチン転写開始とｇｕｓＡコード配列の５’末端との間の領域
を増幅した。この領域の長さはｐＵ２ＦＲＴｍＧとｐＵ２ＦＲＴＧにおいて２．
４９ｋｂであった。組換え反応の結果として１．３１ｋｂ断片が除去された後に
、増幅された領域は１．１８ｋｂに減少し、ｐＵＦＲＴＧ ＤＮＡの増幅生成物
に等しい筈である。ｐＵ２ＦＲＴｍＧとｐＵｂｉＦＬＰで共形質転換したトウモ
ロコシプロトプラストから単離した全ＤＮＡを鋳型として用いて、ＰＣＲ反応生
成物中に１．２８ｋｂ断片を同定した。この断片の素性はユビキチン遺伝子の第
１イントロンに特異的なプローブを用いるはハイブリッド形成を介して確認され
た。

【００７７】 考察 ここに示した結果は酵母のＦＬＰリコンビナーゼがトウモロコシおよびイネ両
細胞におけるＦＲＴ部位の間で部位特異的組換えを促進することを示す。この結
論は次の根拠に基づくものである。組換え検定ベクタからのＧＵＳ酵素の過渡的
発現は機能性ＦＬＰ発現ベクタで共形質転換したプロトプラストにおいて増加し
、この増加の大きさはＦＬＰ遺伝子を含む共形質転換プラスミドＤＮＡの量に依
存していた。さらに、強いプロモータをＦＬＰタンパク質の発現の推進に用いた
場合に、共形質転換プロトプラストにおけるＧＵＳタンパク質の発現が高かった
。ＧＵＳ発現の増加は検定ベクタのＦＲＴ部位が変異すると消滅した。最後に、
部位特異的組換え反応の生成物が共形質転換プロトプラスト中に同定された。

【００７８】 例２ 切除組換え 二つのＦＲＴ部位の間に位置する独特なＢａｍＨＩ制限部位を持つ１．３ｋｂ
ＤＮＡ断片を含むｐＵ２ＦＲＴＧＵＳ ＤＮＡ構造体を一連の切除組換え実験に
用いた。ＢａｍＨＩ制限部位は付加的ＤＮＡ配列の挿入に関し二つのＦＲＴ間の
距離を増加することを可能にする。過渡ＧＵＳ発現アッセイを用いて二つのＦＲ
Ｔ部位間の距離を基準にした切除反応の効率を評価する。

【００７９】 二つの異なる方法、すなわち再形質転換とリコンビナーゼ遺伝子の制御された
切除を用いて組み込まれた外部遺伝子の切除におけるＦＬＰリコンビナーゼの効
率を評価することができる。

【００８０】 再形質転換 最初の方法では、ｎｅｏ遺伝子をｇｕｓＡ遺伝子のプロモータ領域に挿入（ｐ
ＵＦＲＴＮｅｏＦＲＴＧｕｓ）することで不活性化したｇｕｓＡ遺伝子を含むＤ
ＮＡ構造体でトウモロコシプロトプラストを形質転換した。ｎｅｏ遺伝子は二つ
の定方向反復部位の間に位置して発現した（図５）。

【００８１】 カナマイシンを含む倍地上で形質転換プロトプラストを選択するとｎｅｏ＋ｇ
ｕｓ−表現型の形質転換カラスが得られる。これらのカラス（ｃａｌｌｉ）は新
しい懸濁培養を確立ための初期物質として働く。この懸濁培養から単離し、ｐＵ
ｂｉＦＬＰ ＤＮＡ構造体で再形質転換したプロトプラストはｎｅｏ遺伝子を切
除してｇｕｓ−表現型を生成し、過渡アッセイで検出することができる。これら
の比較的簡単な実験で植物細胞におけるＦＬＰタンパク質で触媒された切除反応
の存在に関する情報が得られる。

【００８２】 ＦＬＰ遺伝子の制御された発現 第二のアプローチでは、ＦＬＰ遺伝子の発現を制御して再形質転換ステップが
ＦＬＰリコンビナーゼ活性の制御に優先して除去されるように切除を実現する。
トウモロコシプロトプラストを大豆熱ショック誘導プロモータの制御下でｐＵＦ
ＲＴＮｅｏＦＲＴＧｕｓプラスミドＤＮＡおよびＦＬＰ遺伝子を含むプラスミド
構造体で再形質転換する。トウモロコシプロトプラストと細胞における大豆Ｇｍ
ｈｓｐ１７．５−Ｅ遺伝子プロモータの活性に関する研究で、このプロモータが
熱ショック処理への応答性能に優れていることが示された。バックグランド活性
は２４℃で低くかったが、４２℃で０．５〜１時間の熱ショックの後に数倍の活
性増加が観察された。この熱ショックプロモータの制御下でＦＬＰ遺伝子を含む
ＤＮＡ構造体（ｐＨＳＦＬＰ）を生成し、過渡アッセイで部位特異的組換えを検
定した（表１）。

【００８３】

【表１】 表１：

【００８４】 室温で残存するＦＬＰ活性が高すぎる可能性がまだ残っていて、これが結局熱
ショック処理前の切除反応に繋がる。低温での形質転換プロトプラストおよび細
胞の成長など形質転換操作の変更を必要に応じて行なう。

【００８５】 カナマイシンを含む倍地上で安定な形質転換カラスが選択されると、熱ショッ
ク処理がＦＬＰ遺伝子を活性化してｎｅｏ遺伝子の切除とｇｕｓＡ遺伝子の活性
化を導く。三種類の異なる表原型ｎｅｏ＋ｇｕｓ−，ｎｅｏ＋ｇｕｓ＋，ｎｅｏ
−ｇｕｓ＋が生じる。組み込まれたプラスミド分子の複写数の関連におけるこれ
ら表現型の相対的頻度が切除反応の効率の推定を与える。

【００８６】 例３ 次の遺伝子配列１．及び２．、即ち、 １．ＣａＭＶ３５Ｓプロモータ，ＦＲＴ，ｎｅｏ−耐性遺伝子，ＦＲＴ，ｇｕｓ
Ａ；第１多機能性ＤＮＡ配列、及び、 ２．ＣａＭＶ３５Ｓプロモータ， ｎｅｏ−耐性遺伝子， ＣａＭＶ３５Ｓプロ
モータＦＬＰ；第２多機能性ＤＮＡ配列、 を持つ二重ベクタを含むアグロバクテリア菌ツメファシエンス（Ａｇｒｏｂａｃ
ｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）でシロイヌナズナ・タリアナ（Ａｒａ
ｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ）植物を形質転換した。

【００８７】 構造体１または２を含むアグロバクテリア菌で植物を形質転換した。カナマイ
シン上で種子を成長させ想定される形質転換細胞を選択した。植物を自己受粉さ
せ種子を再度カナマイシン上で成長させて想定形質転換細胞を選択した。このサ
イクルをＴ３世代まで繰り返してカナマイシン耐性分離に基づきホモ接合性ライ
ンを得た。サザンブロットで植物が形質転換されていることを確認した。構造体
１のホモ接合性植物は、阻止ｎｅｏ−耐性遺伝子（停止コドンを持つ）とｇｕｓ
Ａ遺伝子が自身のプロモータを持っていないために、ｇｕｓＡ遺伝子を発現しな
かった。構造体２のホモ接合性植物はｇｕｓＡを発現しなかった。これはその遺
伝子を含有しないからである。構造体１のホモ接合性植物の花序から花粉を取り
除き、構造体２のホモ接合体植物の花序からの花粉で受粉させて植物を他家受精
させた。後代の９６植物をＧＵＳに関し解析したところすべてがＧＵＳを発現（
両親はＧＵＳ活性につき陰性）し、阻止ｎｅｏ−耐性遺伝子のＦＬＰ触媒化切除
がＣａＭＶ３５ＳプロモータをｇｕｓＡ遺伝子の近位に位置決めしてｇｕｓＡ遺
伝子を発現させることが確認された。したがって、ｇｕｓＡはＦＬＰリコンビナ
ーゼによる阻止ＤＮＡ断片の切除で活性化されるＴ４世代までサイレント遺伝子
であった。

【００８８】 例４ イネ（Ｏｒｙｚａ ｓａｔｉｖａ）植物を成熟種子から得たカラスのアグロバ
クテリア菌ツメファシエンス仲介処理を用いて形質転換した。形質転換植物は次
の遺伝子配列を含有した。

【００８９】 １．ＣａＭＶ３５Ｓプロモータ，ＬＯＸ，ハイグロマイシン−耐性遺伝子，ＬＯ
Ｘ，プロモータ欠失ｇｕｓＡ ２．ＣａＭＶ３５Ｓプロモータ，ＬＯＸ， ｂａｒ遺伝子， ＬＯＸ，プロモー
タ欠失ｇｕｓＡ ３．ＣａＭＶ３５Ｓ，Ｃｒｅ，ユビキチンプロモータ，ｂａｒ遺伝子 ４．ＣａＭＶ３５Ｓ，Ｃｒｅ，ユビキチンプロモータ， ハイグロマイシン−耐
性遺伝子 配列１〜４の一つにつき半接合性でＧＵＳ活性を発現しなかったＴ０植物を構
造体１または２を含む雌性と構造体３または４を含む雄性、或いはその逆の組合
せで交雑させた。後代種子を採って種を蒔いた。後代を抗生物質ハイグロマイシ
ンまたは除草剤Ｂａｓｔａの存在下でスクリーニングし、ＧＵＳ活性の存在につ
き後代を分析した。両親がｌｏｘ部位を含む構造体またはＣｒｅ遺伝子を含む構
造体につき半接合体であったために、後代植物に存在するこれら構造体の期待頻
度は、単遺伝子として存在し発現していれば、四つに一つすなわち２５％であっ
た。換言すれば、後代の２５％だけが阻止ＤＮＡ（ハイグロマイシン耐性遺伝子
をコード化する）を切除するリコンビナーゼの可能性を有し、これがＣａＭＶ３
５ＳプロモータをしてｇｕｓＡの発現を推進させる。表２は分析した７５植物中
１９（２５．３％）がＧＵＳを発現したことを示す。サザンブロット解析でＧＵ
Ｓ発現後代植物におけるＬＯＸ部位間の阻止ＤＮＡ片の除去が確認された。

【００９０】

【表２】 表２： 後代におけるＧＵＳ活性に基づき阻止ＤＮＡのＣｒｅ誘導切除を試験す
るために交雑させたイネ植物（Ｔａｉｐｅｉ ３０９）および得られたｇｕｓＡ
転写／翻訳

【００９１】 次の遺伝子配列を含む二重ベクタを持つ未成熟胚のアグロバクテリア菌ツメフ
ァシエンス仲介処理でイネ植物を形質転換した。

【００９２】 ５．ユビキチンプロモータ，ＦＲＴ，ネオマイシンホスホトランスファーゼ−耐
性遺伝子，ＦＲＴｍ，プロモータ欠失ｇｕｓＡ，ユビキチンプロモータ，ハイグ
ロマイシン−耐性遺伝子， ６．ユビキチンプロモータ，ＦＲＴ，ネオマイシンホスホトランスファーゼ−耐
性遺伝子，ＦＲＴｍ，プロモータ欠失ｇｕｓＡ，ユビキチンプロモータ，ｂａｒ
遺伝子， ７．ユビキチンプロモータ，ＦＬＰ，ＣａＭＶ３５Ｓプロモータ，ハイグロマイ
シン−耐性遺伝子， ８．ユビキチンプロモータ，ＦＬＰ，ＣａＭＶ３５Ｓプロモータ，ｂａｒ遺伝子
配列５〜８の一つにつき半接合性でＧＵＳ活性を発現しなかったＴ０植物を構
造体５または６を含む雌性と構造体７または８を含む雄性、或いはその逆の組合
せで交雑させた。後代種子を採って種を蒔いた。後代を抗生物質ハイグロマイシ
ンまたは除草剤Ｂａｓｔａの存在下でスクリーニングし、ＧＵＳ活性の存在につ
き後代を分析した。両親がＦＲＴ部位を含む構造体またはＦＬＰ遺伝子を含む構
造体につき半接合性であったために、後代植物に存在するこれら構造体の期待頻
度は、単遺伝子として存在し発現していれば、四つに一つすなわち２５％であっ
た。換言すれば、後代の２５％だけが阻止ＤＮＡ（ネオマイシンホスホトランス
フェラーゼ−耐性遺伝子をコード化する）を切除するリコンビナーゼの可能性を
有し、これがユビキチンプロモータをしてｇｕｓＡの発現を推進させる。ハイグ
ロマイシンまたはＰＰＴのいずれかに関する予備スクリーニングまたは選択の後
に、後代の５０％はＧＵＳ活性を示すはずであり、表３は分析した３１植物中１
９がＧＵＳを発現したことを示す。サザンブロット解析でＧＵＳ発現後代植物に
おけるＦＲＴ部位間の阻止ＤＮＡ片の除去が確認された。

【００９３】 表３：阻止ＤＮＡのＦＬＰ仲介切除を試験するためにＦＬＰ包含植物で交雑さ
せたＦＲＴ部位を含むイネ植物（Ｔａｉｐｅｉ ３０９）および後代植物におけ
る得られたＧＵＳ活性を示す。Ｈｙｂ：ハイグロマイシン、ＰＰＴ：除草剤ＢＡ
ＳＴＡ活性成分。ＦＬＰおよびＦＲＴ包含植物は半接合体、したがって後代の２
５％だけがこれらの形質転換構造体を持つ機会を持つと思われる。ＧＵＳ発現は
ハイグロマイシンまたはＰＰＴ選択後の後代の５０％に発生するはずである。試
料サイズが不十分なため統計的解析は行なわなかった。

【００９４】

【表３】

【配列表】

【図面の簡単な説明】

【図１】 図１（Ａ〜Ｈ）は、本発明によるＤＮＡ構成物の略図である。

【図２】 図２は、植物プロトプラストにおける酵母ＦＬＰ／ＦＲＴ系の活性
の研究に用いられるＦＬＰ発現ベクターの図である。

【図３】 図３は、植物プロトプラストにおける酵母ＦＬＰ／ＦＲＴ系の活性
の研究に用いられるＦＬＰ発現ベクターの図である。

【図４】 図４（Ａ及びＢ）は、ＦＲＴ部位含有ベクターの構造を説明する図
である。

【図５】 図５は切除組換えを試験するベクターの図である。

【手続補正書】

【提出日】平成１２年３月１４日（２０００．３．１４）

【手続補正１】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】請求項１６

【補正方法】変更

【補正内容】

【手続補正２】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】請求項１７

【補正方法】変更

【補正内容】

【手続補正３】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】請求項１８

【補正方法】変更

【補正内容】

【手続補正４】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】請求項１９

【補正方法】変更

【補正内容】

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ) ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ， ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，Ｄ Ｋ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ， ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，Ｌ Ｖ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ， ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，Ｕ Ｓ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＷ (72)発明者 ホッジズ，トーマス，ケー. アメリカ合衆国・インディアナ州 47906・ウェスト ラファイエット・ウェ スト 75 エヌ． 6038 (72)発明者 リズニック，レスゼック，エー. アメリカ合衆国・アイオワ州 50131・ジ ョンストン・シックスティセカンド アヴ ェニュー エヌ．ダブリュウ． 5960 Ｆターム(参考） 2B030 AA02 AB03 AD08 CA06 CA07 CA17 CA19 CD03 CD06 CD09 CD12 CD13 CG01 4B024 AA08 DA01 EA04 FA02 GA11 GA17 HA01 4B065 AA89X AA89Y AB01 BA02 CA27 CA53

Claims (19)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 プロモータ、阻止配列および構造遺伝子からなる植物発現ベ
   クタであって、前記阻止配列が一対の定方向反復したＦＲＴ組換え配列で側面配
   置されていて、前記構造遺伝子が前記阻止配列の除去後においてのみ前記プロモ
   ータに操作的に連結できるようになる、プロモータ、阻止配列および構造遺伝子
   からなる植物発現ベクタ。
2. 【請求項２】 前記構造遺伝子が正常な細胞機能を破壊する生成物をコード
   化する請求項１記載の発現ベクタ。
3. 【請求項３】 真核選択性マーカーをコード化する遺伝子をさらに有する請
   求項１記載の発現ベクタ。
4. 【請求項４】 前記真核選択性マーカー遺伝子が前記の一対の定方向反復し
   た部位特異的組換え配列によって側面配置されている請求項３記載の発現ベクタ
   。
5. 【請求項５】 プロモータ、阻止配列およびポリリンカー領域からなる植物
   発現ベクタであって、前記阻止配列が一対の定方向反復した部位特異的組換え配
   列で側面配置されていて、かつ前記プロモータと前記ポリリンカー領域の間に位
   置している、プロモータ、阻止配列およびポリリンカー領域からなる植物発現ベ
   クタ。
6. 【請求項６】 真核選択性マーカーをコード化する遺伝子をさらに有する請
   求項５記載の発現ベクタ。
7. 【請求項７】 微生物ホストでの前記発現ベクタの複製を可能とする核酸配
   列と微生物選択性マーカーをコード化する遺伝子をさらに有する請求項５記載の
   発現ベクタ。
8. 【請求項８】 植物実体またはその後代であって、本質的に植物細胞、種子
   または請求項１記載のＤＮＡ配列を植物細胞にインビトロ導入することによって
   生成された植物から成る、植物実体またはその後代。
9. 【請求項９】 商業的に価値のある合成物を産出する生合成方法であって、 プロモータ、阻止配列および構造遺伝子から成るＤＮＡ構造体を植物細胞に導
   入することで稔性形質転換植物を生成し、前記阻止配列が一対の定方向反復した
   部位特異的組換え配列で側面配置されていて、前記構造遺伝子が前記阻止配列の
   除去後においてのみ前記プロモータに操作的に連結できるようになる段階と、 前記の形質転換植物を他家受精させて、前記の生物学的に有害な合成物をコー
   ド化する遺伝子につきホモ接合性の形質転換植物を生成する段階と、 前記ホモ接合性形質転換植物を、前記の部位特異的組換え配列を認識する部位
   特異的リコンビナーゼをコード化する遺伝子から成るＤＮＡ配列を有する植物と
   交雑させる段階と、から成る商業的に価値のある合成物を生成する生合成方法。
10. 【請求項１０】 商業的に価値のある合成物を産出する生合成方法であって
    、 プロモータ、阻止配列および構造遺伝子から成り前記阻止配列が一対の定方向反
    復した部位特異的組換え配列で側面配置されているＤＮＡ構造体を有する維持系
    統植物ラインを、前記の部位特異的組換え配列を認識する部位特異的リコンビナ
    ーゼをコード化する遺伝子から成り構造遺伝子がＦ１後代植物で前記阻止配列の
    除去後においてのみプロモータに操作的に連結できるようになるＤＮＡ配列を有
    する誘導植物ラインと他家受粉させる段階と、から成る商業的に価値のある合成
    物を生成する生合成方法。
11. 【請求項１１】 前記構造遺伝子のプロモータが種子特異的プロモータであ
    る請求項１０記載の方法。
12. 【請求項１２】 前記構造遺伝子のプロモータが葉特異的プロモータである
    請求項１０記載の方法。
13. 【請求項１３】 前記阻止配列が一対の定方向反復したＦＲＴ組換え配列に
    よって側面配置されていて、前記リコンビナーゼ遺伝子が前記ＦＬＰリコンビナ
    ーゼをコードする請求項１０記載の方法。
14. 【請求項１４】 商業的に価値のある合成物を生成する生合成方法であって
    、 プロモータ、阻止配列および構造遺伝子から成り前記阻止配列が一対の定方向
    反復した部位特異的組換え配列によって側面配置されていて、前記構造遺伝子が
    前記阻止配列の除去後においてのみプロモータに操作的に連結できるようになる
    多機能性ＤＮＡ配列を植物細胞に導入することによって維持系統植物ラインを生
    成する段階と、 前記維持系統植物ラインまたは前記維持系統植物ラインの後代を、誘導植物ラ
    インと交雑させる段階であって、前記誘導植物ラインが前記の部位特異的組換え
    配列を認識する部位特異的リコンビナーゼをコード化する遺伝子から成るＤＮＡ
    配列を有する段階と、から成る商業的に価値のある合成物を産出する生合成方法
    。
15. 【請求項１５】 商業的に価値のある合成物を産出する生合成方法であり、 雄性不稔性維持植物ラインを誘導植物ラインと他家受粉させる段階からなり、 前記雄性不稔性維持植物ラインがプロモータ、阻止配列および構造遺伝子から
    成るＤＮＡ配列を有し、前記阻止配列が一対の定方向反復した部位特異的組換え
    配列によって側面配置されていて、かつ前記阻止配列が種子特異的プロモータの
    操作的に連結した自殺遺伝子から成り、 前記誘導植物ラインが、前記の部位特異的組換え配列を認識する部位特異的リ
    コンビナーゼをコード化する遺伝子から成るＤＮＡ配列を有し、前記構造遺伝子
    が前記雄性稔性Ｆ１後代植物で前記阻止配列を除去された後においてのみプロモ
    ータに操作的に連結される、商業的に価値のある合成物を産出する生合成方法。
16. 【請求項１６】 前記構造遺伝子のプロモータが種子特異的プロモータであ
    る請求項１６記載の方法。
17. 【請求項１７】 前記構造遺伝子のプロモータが葉特異的プロモータである
    請求項１６記載の方法。
18. 【請求項１８】 前記阻止配列が一対の定方向反復したＦＲＴ組換え配列に
    よって側面配置されていて、かつ前記リコンビナーゼ遺伝子がＦＬＰリコンビナ
    ーゼをコード化する請求項１６記載の方法。
19. 【請求項１９】 前記阻止配列がさらに選択性マーカー遺伝子を含む請求項
    １６記載の方法。