JP2018503392A - 遺伝子一過性発現により完全な植物において部位特異的改変を行うための方法 - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、植物遺伝子工学の分野に属し、遺伝子一過性発現により完全な植物を部位特異的に改変するための方法に関する。
遺伝子導入とは、分子生物学的手段により外来遺伝子を特定の生物に導入して、該生物の生物学的な特徴または機能を部分的に変化させるプロセスをいう。1983年に、世界初のトランスジェニック植物であるトランスジェニック抗ウイルスタバコの育種が米国で行われた。1986年には、トランスジェニック抗ウイルス綿花が米国で開発され、野外試験に供された。1987年には、耐虫性遺伝子および除草剤耐性遺伝子が作物に導入された。1992年には、トランスジェニックタバコが中国で栽培された。1995年には、カナダでトランスジェニック除草剤耐性アブラナ属(Brassica)の商業化が開始された。1996年には、トランスジェニック耐虫性綿花および除草剤耐性ダイズが米国で大規模に栽培された。現在、世界中には120種を超えるトランスジェニック植物が存在し、そのうちダイズ、綿花およびトウモロコシを含む51種のトランスジェニック作物が商業化されている。
本発明の目的は、遺伝子一過性発現により完全な植物を部位特異的に改変するための方法を提供することである。
a)前記配列特異的ヌクレアーゼまたは前記配列特異的ヌクレアーゼを発現させるための遺伝物質を前記植物に送達するステップ、および
b)ステップa)で得られた前記植物を選択圧の非存在下で生育させることにより、前記配列特異的ヌクレアーゼ、または前記植物の染色体に組み込まれていない前記遺伝物質を分解させるステップ
を含む。
ガイドRNAを転写しかつCas9タンパク質を発現させるための1つの組換えベクターもしくはDNA断片(またはcrRNAとtracrRNAとをそれぞれ転写しかつCas9タンパク質を発現させるための2つの組換えベクターもしくはDNA断片)から構成されるか、あるいは特に、
ガイドRNAを転写するための1つの組換えベクターもしくはDNA断片(またはcrRNAとtracrRNAとをそれぞれ転写するための2つの組換えベクターもしくはDNA断片)と、Cas9タンパク質を発現させるための1つの組換えベクターもしくはDNA断片もしくはRNAと、から構成されるか、あるいは特に、
ガイドRNA(またはcrRNAおよびtracrRNA)と、Cas9タンパク質を発現させるための1つの組換えベクターもしくはDNA断片もしくはRNAと、から構成される。前記ガイドRNAは、crRNAとtracrRNAとの間の部分的な塩基対形成により形成される回文構造を有するRNAであり、前記crRNAは、標的断片に相補的に結合しうるRNA断片を含む。
本発明の方法を用いて対象の植物における標的遺伝子の標的断片に対して部位特異的改変を行うことにより、該標的遺伝子の機能が喪失されておりかつ組み込まれた外来遺伝子をゲノムが含まない植物を得るステップ
を含む方法を提供する。
以下の実施例において用いた実験方法は、別段の記載がない限りいずれも従来の方法である。
1)(−80℃で保存した)コンピテントセルを氷上で解凍し、次いでプラスミドDNA 2μgを加えて混合し、この混合物を氷上に30分間置いた。
2)EP管を液体窒素中に1分間浸漬し、37℃の水浴に素早く移して解凍した(2分間)。
3)次いでLB液体培地1mlを加え、低速(150rpm)で振盪しながら28℃で4〜5時間インキュベートした。
4)10000rpmで30秒間遠心分離することにより細菌細胞を収穫し、上清を廃棄し、再懸濁させた細菌細胞100μlを、相応する抗生物質を含む選択プレートにプレーティングした。
5)白色コロニー(形質転換体)が出現するまで、プレートを上下逆にして28℃でインキュベートした。
I.標的断片:標的C1の設計
標的C1:5’−CCGAGCTCGACCACGCCGCCGAC−3’(GenBank登録番号AY172635で示される遺伝子ZmIPKの393〜415位)。
C1は、標的C1に相補的に結合しうるRNAのDNA配列である。
C1−1F:5’−AGCAGTCGGCGGCGTGGTCGAGCT−3’;
C1−2F:5’−GGCGGTCGGCGGCGTGGTCGAGCT−3’;
C1R:5’−AAACAGCTCGACCACGCCGCCGAC−3’。
pJIT163−Ubi−Cas9ベクターと、ステップIIで得られたpZmU3−gRNA−C1プラスミドを、トウモロコシプロトプラストのプロトプラストに導入した。具体的なプロセスは、以下のものを含む。
トウモロコシ交雑変種HiIIならびに近交系B73およびZheng58の種子を一晩水に浸漬させ、(水を加えた)吸収紙を入れたプレートに移し、明条件で3日間処理して発芽させた。発芽したトウモロコシ種子を土壌中で24℃で10〜11日間生育させて、トウモロコシ実生を得た。
1)トウモロコシの柔らかい葉を採取し、カッター刃を使用してこれらの葉の中央部分を切断して0.5〜1mmの糸状物とし、これらの糸状物を酵素分解溶液50ml中に5時間置いて消化させた(酵素分解を真空中で0.5時間行い、次いで10rmpでゆっくりと4.5時間振盪した)。
注釈:酵素分解時の温度を20〜25℃に保持することが望ましく、この反応を暗所で行うことが望ましく、また反応後に溶液を穏やかに振盪してプロトプラストを放出させることが望ましい。
2)30mlのW5を加えることによりこの酵素分解物を希釈し、75μmのナイロンろ過膜を用いてこれをろ過して、50ml丸底遠沈管に入れた。
注釈:ナイロンろ過膜を75%(体積%)エタノール中に沈め、水で洗浄し、次いで使用前にW5中に2分間浸漬させることが望ましい。
3)23℃で、150×gの遠心分離を3分間行い、上清を廃棄した。
4)このペレットを10mlのW5で懸濁させ、150×gで3分間遠心分離し、上清を廃棄した。
5)適量のMMG溶液を加えることによりこれらのプロトプラストを懸濁させ、形質転換を行うまでこれらを氷上に置いた。
注釈:これらのプロトプラストの濃度を顕微鏡検査(×100)により測定する必要がある。プロトプラストの量は、2×105/ml〜1×106/mlであった。
1)pJIT163−2NLSCas9ベクター10μgと、pZmU3−gRNA−C1プラスミド10μgとを、2ml遠沈管に加えた。ピペットを用いて200μlの上記プロトプラストを加え、次いで穏やかに叩くことにより混合し、3〜5分間静置した。次いで220μlのPEG4000溶液を加え、穏やかに叩くことにより混合した。形質転換を、暗所で15分間行った。
2)880μlのW5(室温)を加え、反転により混合し、100×gの遠心分離を3分間行い、かつ上清を廃棄した。
3)1mlのWI溶液を加え、反転により混合し、内容物を(予めWI溶液1mlを加えておいた)6ウェルプレートに穏やかに移し、次いで23℃で一晩培養した。
トウモロコシプロトプラストの形質転換の48時間後にゲノムDNAを抽出し、これをPCR/RE(ポリメラーゼ連鎖反応/制限消化)実験解析用の鋳型として使用した。同時に、野生型トウモロコシ変種HiIIのプロトプラストを対照として使用した。PCR/RE解析方法は、Shan, Q. et al. Rapid and efficient gene modification in rice and Brachypodium using TALENs. Molecular Plant(2013)に基づく。トウモロコシ内在性遺伝子ZmIPK(GenBank登録番号AY172635)の標的断片(GenBank登録番号AY172635の393〜415位)は、制限エンドヌクレアーゼSacI認識配列(5’−GAGCTC−3’)を含むため、PCR/RE試験を行うために実験において制限エンドヌクレアーゼSacIを使用した。PCR増幅に使用したプライマーは、以下の通りであった:
ZmIPK−1F:5’−TCGCAGCCCCTGGCAGAGCAA−3’;
ZmIPK−1R:5’−GAGACCTGGGAGAAGGAGACGGATCC−3’。
細胞透過性ペプチド(CPP)は、巨大分子(タンパク質および核酸を含む)を細胞に運びうる短鎖ペプチドの一クラスである。近年の研究から、細胞透過性ペプチドはDNAに結合すると酵素分解から該DNAを保護しうることが分かっている。したがって、効率を向上させるべく、一般的に花粉管法においては細胞透過性ペプチドが使用されている。
1)CPPを含むDNA溶液の調製:固体粉末CPP(アミノ酸配列:RKKRRQRRRRKKRRQRRR、Shanghai Bio−engineering Co., Ltd.により合成)に滅菌水を配合して、30mg/mlストック溶液とした。pZmU3−gRNA−C1プラスミドとpJIT163−Ubi−Cas9プラスミドとの混合物(この混合物におけるpZmU3−gRNA−C1とpJIT163−Ubi−Cas9との質量比は、1:1である)に、1:1の質量比でCPPを加えたところ、DNAおよびCPPの最終濃度は25〜30μg/mlであった(これらの2つのプラスミドの合計の最終濃度は25〜30μg/mlであり、CPPの最終濃度は25〜30μg/mlである)。
2)野外の強いトウモロコシ植物(HiII、B73およびZheng58)を、レシピエント材料として選択した。開花後、これらの植物の柱頭に袋をかけることにより、他家受精または自家受精を避けた。適切な時点で手動による受粉を実施した。受粉の18〜21時間後に袋を取り除き、穂軸の頂部から2〜3cmの長さを残して花糸および包葉を切断した。花糸の切断面は包葉の切断面よりもわずかに小さく、これらの花糸と包葉との間には小さな溝が形成され、この溝に、ステップ1)からのDNA溶液300〜400μlをピペットで素早く滴下した。花糸をDNA溶液に浸漬させ、柱頭に再び袋をかけた。各実験を、トウモロコシ穂軸40〜50本において行った。粒の成熟後にこれらのトウモロコシ穂軸を収穫し、個別に乾燥させた。
3)乾燥させた種子を成長させ、発芽後にPCR/RE法(具体的なステップおよび使用したプライマーはIVに示す)を用いてZmIPK遺伝子変異体を検出した。
1.トウモロコシ材料の調製
1)トウモロコシ近交系HiIIの種子を三角フラスコに入れ、70%(v/v)アルコールで5分間および5%(v/v)次亜塩素酸ナトリウムで30分間滅菌し、次いで滅菌水中で5回洗浄した。1.5体積の水を加え、このフラスコを密封し、28℃で4〜6時間インキュベートした。
2)2回目の滅菌。種子を5%(v/v)次亜塩素酸ナトリウムで30分間滅菌し、次いで滅菌水中で5回洗浄した。
3)滅菌したこれらの種子を、ろ紙を備えた滅菌プレート上に置き、暗所で28℃で3〜4日間インキュベートして発芽させた。発芽した種子を同期成長させたものをMS培地上に移し、実生が4〜5cmに達するまで暗所で28℃で3〜4日間培養した。
1)芽の切断:節の1.5〜2mm上方で横方向に茎を切断して、この茎の内側の芽を露出させた。その後、この芽を、節の0.2mm下方で(またはちょうど節を通るように)縦方向に中央で切断した。根を約0.8mm残した。
2)C1を含むpBUE411−C1プラスミドをアグロバクテリウムコンピテントセルAGL1に導入して形質転換させた。PCRおよび制限消化による検定を行った後、陽性株を使用してこれらの植物を感染させた。
3)陽性株をLB固体培地上にプレーティングし、暗所で28℃で2日間培養した。若干の細菌を掻き取って20mlのMS液体培地に入れ、28℃で培養してOD600を約0.8とした。その後、200μMのアセトシリンゴンを加えた。
4)これらの切った植物を、切り口を下方にしてプレートに入れた。このプレートを真空装置内に斜めに入れ(30〜45℃)、アグロバクテリウム溶液を加えてこれらの切り口を沈めて、20分間感染させた。感染の間、排気を0.05MPの圧力で10分間設定した。
5)感染後、これらの植物をアグロバクテリウム溶液から取り出し(ろ紙を用いて、これらの植物上のアグロバクテリウム溶液の余剰分を取り除き)、MS培地に導入して暗所で23℃で3日間培養した。
6)共培養後、これらの材料を取り出して洗浄して培地を除去し、次いでポット(4/5は通常の土壌であり、1/5は上方のバーミキュライトである)内で成長させた。移植後、実生を暗所で28℃で2日間培養し、次いで明所で7〜10日間培養し、次いで結実するまで通常の条件下で成長させた。得られたトウモロコシ種子を成長させ、発芽後にPCR/RE法によりZmIPK遺伝子変異に関して試験した。
pZmU3−gRNA−C1プラスミドとpJIT163−Ubi−Cas9プラスミドとをそれぞれ増幅するため、これら2つのプラスミドの配列にしたがって2つのプライマーセットを設計した。
ZmU3−F:5’−CTGCCAAGATCAACAGCAACCA−3’;
C1R:5’−AAACAGCTCGACCACGCCGCCGAC−3’。
理論的には、増幅される断片は約322bpであるはずであり、配列は、配列番号1の467〜788位に存在するはずである。配列番号1は、pZmU3−gRNA−C1の配列である。
Cas9−1F:5’−CTTCCCAAGCATTCCCTCCTGT−3’;
Cas9−1R:5’−CTTATGCCGTCCCATGACCTTC−3’。
理論的には、増幅される断片は約744bpであるはずであり、配列は、配列番号2の1573〜2316位に存在するはずである。配列番号2は、pJIT163−Ubi−Cas9におけるCas9の配列である。
OsU3pとCas9とをそれぞれ増幅するために、pBUE411−C1プラスミドの配列にしたがって2つのプライマーセットを設計した。
pBUE411−1F:5’−GACAGGCGTCTTCTACTGGTGCTAC−3’;
C1R:5’−AAACAGCTCGACCACGCCGCCGAC−3’
理論的には、増幅される断片は約289bpであるはずであり、配列は、配列番号3の174〜462位に存在するはずである。配列番号3は、pBUE411−C1のgRNA配列である。
CAS9−2F:5’−CTCCCTAAGCACTCGCTCCTGT−3’;
CAS9−2R:5’−TTCTGCGTGGTCTGATTCTCCC−3’
理論的には、増幅される断片は約794bpであるはずであり、配列は、配列番号4の1639〜2432位に存在するはずである。配列番号4は、pHSN411−C1のCas9配列である。
I.標的断片:標的C2の設計
標的C2:5’−CCGACGATATCCGCCGATTTCAC−3’(GenBank登録番号AF360133で示される遺伝子AtPTPAの351〜373位)。
C2は、標的C2に相補的に結合しうるRNAのDNA配列である。
C2F:5’−ATTGGTGAAATCGGCGGATATCGT−3’;
C2R:5’−AAACACGATATCCGCCGATTTCAC−3’。
ステップIIで得られたpHSN401−C2プラスミドを、アラビドプシス(Arabidopsis)生態型コロンビア(Columbia)のプロトプラストに導入した。具体的なプロセスは、以下のものを含む。
1)種子の処理:アラビドプシス(Arabidopsis)生態型コロンビア(Columbia)の種子を1.5mLの管に入れ、75%(v/v)アルコールに1分間および10%(v/v)次亜塩素酸ナトリウムに15分間浸漬させ、次いで滅菌水中で5〜6回洗浄した。
2)滅菌したこれらの種子を、マイクロピペットでMS培地上に個々にプレーティングした。これらのプレートを密閉し、4℃で3〜4日間置いて春化処理した。
3)春化処理後、これらのプレートをインキュベーターに移して以下の条件下で培養した:25±2℃、照度5500±300Lx、明所12時間/日。3週間成長させた後、実生を移植した。
4)これらの実生を土壌(泥炭土:バーミキュライト:パーライト=1:1:1)に慎重に移植し、3〜4日間フィルムで覆い、次いで21℃で6300±300Lxで培養した。
1)(約1ヶ月間成長させた)アラビドプシス(Arabidopsis)生態型コロンビア(Columbia)の柔らかい葉を採取し、カッター刃を使用して切断して0.5mmの糸状物とし、これらの糸状物を酵素分解溶液50ml中に5時間入れて消化した(酵素分解を真空中で0.5時間行い、次いで10rmpでゆっくりと4.5時間振盪した)。
注釈:酵素分解時の温度を20〜25℃に保持することが望ましく、この反応を暗所で行うことが望ましく、また反応後に溶液を穏やかに振盪してプロトプラストを放出させることが望ましい。
2)30mlのW5を加えることによりこの酵素分解物を希釈し、75μmのナイロンろ過膜を用いてこれをろ過して、50ml丸底遠沈管に入れた。
注釈:ナイロンろ過膜を75%(体積%)エタノール中に沈め、水で洗浄し、次いで使用前にW5中に2分間浸漬させることが望ましい。
3)23℃で、60×gの遠心分離を5分間行い、上清を廃棄した。
4)穏やかに振盪することによりこのペレットを10mlのW5で再懸濁させ、60×gの遠心分離を5分間行い、かつ上清を廃棄した。
5)適量のMMG溶液を加えることによりこれらのプロトプラストを懸濁させ、形質転換を行うまでこれらを氷上に置いた。
注釈:これらのプロトプラストの濃度を顕微鏡検査(×100)により測定する必要がある。プロトプラストの量は、2×105/ml〜1×106/mlであった。
1)pHSN401−C2プラスミド20μgを2ml遠沈管に加えた。ピペットを用いて、上記ステップ2で得られたプロトプラスト200μlを加え、次いで穏やかに叩くことにより混合した。次いで、250μlのPEG4000を加え、穏やかに叩くことにより混合した。形質転換を、暗所で15〜30分間行った。
2)880μlのW5(室温)を加え、反転により混合し、60×gの遠心分離を5分間行い、かつ上清を廃棄した。
3)1mlのW5を加え、反転により混合し、内容物を(予め1mlのW5を加えておいた)6ウェルプレートに穏やかに移し、次いで23℃で一晩培養した。
アラビドプシス(Arabidopsis)プロトプラストの形質転換の48時間後にゲノムDNAを抽出し、これをPCR/RE(ポリメラーゼ連鎖反応/制限消化)実験解析用の鋳型として使用した。PCR/RE解析方法は、Shan, Q. et al. Rapid and efficient gene modification in rice and Brachypodium using TALENs. Molecular Plant(2013)に基づく。アラビドプシス(Arabidopsis)内在性遺伝子AtPTPA(GenBank登録番号AF360133)の標的断片(GenBank登録番号AF360133の351〜373位)は、制限エンドヌクレアーゼEcoRV認識配列(5’−GATATC−3’)を含むため、PCR/RE試験を行うために実験において制限エンドヌクレアーゼEcoRVを使用した。PCR増幅に使用したプライマーは、以下の通りであった:
PTPA−F:5’−GATGCTCCAGCCACCATATC−3’;
PTPA−R:5’−CAGTTCGGTACACCACTTATATCA−3’。
1)アラビドプシス(Arabidopsis)材料の調製
分枝し易くするために、アラビドプシス(Arabidopsis)の芽を最初の開花時に取り除いた。花序浸漬による形質転換の前に、長角果を切り落とした。
結果を図7に示す。これらの結果から、AtPTPA遺伝子の標的部位で変異が生じたことが判明した。図7中の未切断のバンドを回収してシーケンシングしたところ、これらのシーケンシング結果から、AtPTPA遺伝子の標的部位で挿入/欠失(インデル)が生じたことが判明した。
U6−26pと標的断片との間に配置されたpHSN401−1F/C2R:
HSN401−1F:5’−TGTCCCAGGATTAGAATGATTAGGC−3’;
C2R:5’−AAACACGATATCCGCCGATTTCAC−3’
理論的には、増幅される断片は約286bpであるはずであり、配列は、配列番号5の170〜455位に存在するはずである。配列番号5は、pHSN401−C2中のgDNAの部分配列である。
pHSN401−C2ベクターのCas9領域内に配置されたCAS9−2F/CAS9−2R:
CAS9−2F:5’−CTCCCTAAGCACTCGCTCCTGT−3’;
CAS9−2R:5’−TTCTGCGTGGTCTGATTCTCCC−3’
理論的には、増幅される断片は約794bpであるはずであり、配列は、配列番号4の1639〜2432位に存在するはずである。配列番号4は、pHSN401−C2中のCas9配列である。
pHSN401−C2上のプライマーpHSN401−1F/C2Rを用いたアラビドプシス(Arabidopsis)AtPTPA遺伝子変異体の増幅のゲル電気泳動図を、図8aに示す。pHSN401−C2上のプライマーCAS9−2F/CAS9−2Rを用いたアラビドプシス(Arabidopsis)AtPTPA遺伝子変異体の増幅のゲル電気泳動図を、図8bに示す。5)で得られたアラビドプシス(Arabidopsis)AtPTPA遺伝子変異体において標的バンドが増幅されなかったことが判明し、このことから、これらの変異体中にはgDNA:Cas9系のいかなる断片も存在しないことが判明した。
Claims (16)
- 完全な植物における標的遺伝子の標的断片に対して部位特異的改変を行うための方法であって、以下:
前記植物において配列特異的ヌクレアーゼを一過的に発現させるステップ
を含み、その際、一過性発現のための対象として完全な植物を使用し、前記配列特異的ヌクレアーゼが前記標的断片を標的としてこれを切断し、その結果、前記植物の自己DNA修復により前記部位特異的改変が達成される方法。 - 前記植物において前記部位特異的ヌクレアーゼを一過的に発現させるための方法が、以下:
a)前記配列特異的ヌクレアーゼまたは前記配列特異的ヌクレアーゼを発現させるための遺伝物質を前記植物に送達するステップ、および
b)ステップa)で得られた前記植物を選択圧の非存在下で生育させることにより、前記配列特異的ヌクレアーゼ、または前記植物の染色体に組み込まれていない前記遺伝物質を分解させるステップ
を含み、その際、前記遺伝物質は、組換えベクターまたは線状DNA断片またはインビトロ転写RNAであることを特徴とする、請求項1記載の方法。 - 前記配列特異的ヌクレアーゼまたは前記遺伝物質を、前記配列特異的ヌクレアーゼまたは前記遺伝物質の送達に使用しうる植物の任意の部分を通じて送達することを特徴とする、請求項2記載の方法。
- 送達のための植物の前記部分が、花粉管、花序、茎頂、子房、葉または送達に適した完全な植物の他の任意の部分であることを特徴とする、請求項3記載の方法。
- 植物の前記部分が花粉管であり、前記組換えベクターもしくは線状DNA断片もしくはインビトロ転写RNAを含む溶液または前記配列特異的ヌクレアーゼを含む溶液を受粉後に柱頭に注入することにより前記送達を行う;
植物の前記部分が花序であり、前記組換えベクターまたは線状DNA断片を保有するアグロバクテリウム・ツメファシエンス(Agrobacterium tumefaciens)の溶液に前記花序を浸漬させることにより前記送達を行う;
植物の前記部分が茎頂であり、前記組換えベクターまたは線状DNA断片を保有するアグロバクテリウム・ツメファシエンス(Agrobacterium tumefaciens)の溶液に前記茎頂を浸漬させることにより前記送達を行う;
植物の前記部分が子房であり、前記組換えベクターもしくは線状DNA断片もしくはインビトロ転写RNAを含む溶液もしくは前記配列特異的ヌクレアーゼを含む溶液を受粉後に前記子房に注入するか、または前記組換えベクターもしくは線状DNA断片を保有するアグロバクテリウム・ツメファシエンス(Agrobacterium tumefaciens)の溶液を受粉後に前記子房に注入することにより前記送達を行う;
植物の前記部分が葉であり、前記組換えベクターまたは線状DNA断片を保有するアグロバクテリウム・ツメファシエンス(Agrobacterium tumefaciens)の溶液を前記葉に注入することにより前記送達を行う
ことを特徴とする、請求項4記載の方法。 - 前記配列特異的ヌクレアーゼが、CRISPR/Cas9ヌクレアーゼ、TALENヌクレアーゼ、ジンクフィンガーヌクレアーゼまたはゲノム編集を達成しうる任意のヌクレアーゼであり、ここで、
前記配列特異的ヌクレアーゼがCRISPR/Cas9ヌクレアーゼであり、前記遺伝物質が、
ガイドRNAを転写しかつCas9タンパク質を発現することができる1つの組換えベクターもしくはDNA断片から構成されるか、または
ガイドRNAを転写しうる1つの組換えベクターもしくはDNA断片と、Cas9タンパク質を発現しうる1つの組換えベクターもしくはDNA断片もしくはRNAと、から構成されるか、または
ガイドRNAと、Cas9タンパク質を発現しうる1つの組換えベクターもしくはDNA断片もしくはRNAと、から構成され、
その際、前記ガイドRNAは、crRNAとtracrRNAとの間の部分的な塩基対形成により形成される回文構造を有するRNAであり、前記crRNAは、前記標的断片に相補的に結合しうるRNA断片を含む;
前記配列特異的ヌクレアーゼがTALENヌクレアーゼであり、前記遺伝物質が、対をなすTALENタンパク質を発現しうる1つの組換えベクターまたはDNA断片またはRNAであり、その際、前記TALENタンパク質は、前記標的部位を認識してこれに結合しうるDNA結合ドメインと、Fok Iドメインと、から構成される;
前記配列特異的ヌクレアーゼがジンクフィンガーヌクレアーゼであり、前記遺伝物質が、対をなすZFNタンパク質を発現しうる1つの組換えベクターまたはDNA断片またはRNAであり、その際、前記ZFNタンパク質は、前記標的部位を認識してこれに結合しうるDNA結合ドメインと、Fok Iドメインと、から構成される
ことを特徴とする、請求項1から5までのいずれか1項記載の方法。 - 前記部位特異的改変が、前記標的断片における挿入変異、欠失変異および/または置換変異であることを特徴とする、請求項1から6までのいずれか1項記載の方法。
- 導入遺伝子を含まない変異体植物および/またはその子孫であって、請求項1から7までのいずれか1項記載の方法を用いて対象の植物における標的遺伝子の標的断片に対して部位特異的改変を行って該標的遺伝子にその機能を喪失させることにより、該導入遺伝子を含まない変異体植物が得られることを特徴とする、導入遺伝子を含まない変異体植物および/またはその子孫。
- 導入遺伝子を含まない変異体植物の製造方法であって、以下:
請求項1から7までのいずれか1項記載の方法を用いて対象の植物における標的遺伝子の標的断片に対して部位特異的改変を行うことにより、該標的遺伝子の機能が喪失されており、かつ組み込まれた外来遺伝子を該植物のゲノムが含まない植物を得るステップ
を含む方法。 - 前記植物が、任意の遺伝子型の植物である、請求項1から9までのいずれか1項記載の方法または導入遺伝子を含まない変異体植物。
- 前記植物が、トウモロコシ、コムギ、ダイズ、綿花、タバコ、アラビドプシス(Arabidopsis)、ライムギ、ロサ・ロクスブンギー(Rosa roxbunghii)、エリオボトリャ・ジャポニカ(Eriobotrya japonica)、カリカ・パパイヤ(Carica papaya)、ロサ・カニナ(Rosa canina)、デンドロビウム・ノビル・リンドル(Dendrobium nobile Lindl.)、ブラッシカ・オレラセア(Brassica oleracea)、ファゴピルム・タタリクム(Fagopyrum tataricum)およびヘベア・ブラジリエンシス(Hevea brasiliensis)からなる群から選択される、請求項1から9までのいずれか1項記載の方法または導入遺伝子を含まない変異体植物。
- 前記植物がトウモロコシであり、前記配列特異的ヌクレアーゼがCRISPR/Cas9ヌクレアーゼであり、前記標的遺伝子がZmIPKである、請求項1から9までのいずれか1項記載の方法または導入遺伝子を含まない変異体植物。
- 前記標的断片が5’−AGCTCGACCACGCCGCCGAC−3’であり、前記ガイドRNAを転写するための組換えベクターが、5’−AGCAGTCGGCGGCGTGGTCGAGCT−3’のDNA断片をプラスミドpZmU3−gRNAの2つのBbsI制限部位の間に挿入することにより得られ、かつ前記CRISPR/Cas9ヌクレアーゼを発現させるための組換えベクターがpJIT163−Ubi−Cas9である、請求項12記載の方法または導入遺伝子を含まない変異体植物。
- 前記標的断片が5’−AGCTCGACCACGCCGCCGAC−3’であり、前記ガイドRNAを転写しかつCRISPR/Cas9ヌクレアーゼを発現させるための組換えベクターが、5’−AGCAGTCGGCGGCGTGGTCGAGCT−3’のDNA断片をプラスミドpBUE411の2つのBsaI制限部位の間に挿入することにより得られる、請求項12記載の方法または導入遺伝子を含まない変異体植物。
- 前記植物がアラビドプシス(Arabidopsis)であり、前記配列特異的ヌクレアーゼがCRISPR/Cas9ヌクレアーゼであり、前記標的遺伝子がAtPTPAである、請求項1から9までのいずれか1項記載の方法または導入遺伝子を含まない変異体植物。
- 前記標的断片が5’−AGCTCGACCACGCCGCCGAC−3’であり、前記ガイドRNAを転写しかつCRISPR/Cas9ヌクレアーゼを発現させるための組換えベクターが、5’−ATTGGTGAAATCGGCGGATATCGT−3’のDNA断片をプラスミドpHSN401の2つのBsaI制限部位の間に挿入することにより得られる、請求項15記載の方法または導入遺伝子を含まない変異体植物。
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