CN106978419A - 矮牵牛花药早期特异表达启动子pPhGRP的鉴定及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于植物基因工程领域，涉及矮牵牛花药发育早期特异表达启动子pPhGRP的鉴定及其应用。本发明分离的启动子的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。对该启动子驱动的矮牵牛内源基因的定量PCR检测表明，该启动子驱动的基因仅在花药发育早期特异表达，不在其他时期或其他组织中表达。生物功能验证和GUS染色检测表明，启动子pPhGRP驱动报告基因在拟南芥的根、叶和角果中均不表达，只在花药中特异表达；启动子pPhGRP驱动的毒素基因Barnase只在矮牵牛花药中特异表达，不在其他时期或其他组织中表达，获得其他器官发育正常的雄性不育株系。本发明的启动子可用于雄性不育基因工程及花药发育调控和杂种优势利用中。

Description

矮牵牛花药早期特异表达启动子pPhGRP的鉴定及其应用

技术领域

本发明属于植物基因工程技术领域，具体涉及一种矮牵牛花药早期特异表达启动子pPhGRP的鉴定及其应用。从矮牵牛植物中分离并克隆一个花药早期特异性表达的启动子，将其应用于构建特定的表达载体，可使特定的基因在花药中特异性表达，达到调控花药发育和创造基因工程雄性不育系等目的。

背景技术

基因的表达主要受转录水平上的调控，其上游启动子(promoter)和转录因子(transcription factor)结合，决定着基因的转录表达。启动子一般可以分为组成型启动子、诱导型启动子和组织特异型启动子三种。组成型启动子可以调控下游的基因在不同组织不同时间段比较恒定的表达，现在比较常用的是花椰菜花叶病毒的启动子(CaMV35S)，但是该启动子会因持续驱动目的基因在植物各个组织中表达而消耗植物体内过多的物质能量，并造成一系列不利的结果(Gittins et al 2000)，此外，还发现因组成型过表达目的基因而引起了基因沉默的现象(Kumpatla et al 1998)。相比之下，受某些外界信号刺激的诱导性启动子和在特定发育阶段的特异组织中起作用的特异性启动子，在应用上则有很大灵活性和目的性。

组织特异性启动子在转基因定向改良植物性状方面有着重要的意义，如茎特异启动子有助于培育矮化或长梗的花卉品种。花药特异性启动子最主要的用途在于创制雄性不育系，以利杂交制种。Mariani等最早将烟草绒毡层特异性启动子TA29融合Barnase核糖核酸酶基因导入烟草和油菜，通过Barnase在绒毡层特异表达，获得了雄性不育株系(Marianiet al 1990)。此后，该策略成功应用于辣椒在内的多种作物，拟南芥、大白菜、豌豆和水稻等都已开发用于雄性不育基因工程的花药特异启动子。Srinivasan等将红花线粒体编码的未编辑基因unedited nad3融合酵母信号肽序列后，在TA29启动子的驱动下转化烟草，也可获得雄性不育植株(Srinivasan et al 2015)。此外，用花药特异启动子高效表达目的基因，有助于研究后者在花药中的特定功能。可见，花药特异启动子在实践和理论上都有重要的意义。

矮牵牛(Mitchell)被誉为花坛之王，具有较强的杂种优势，目前市场流行的品种均为F₁代，每年的种子用量数以吨计，市场需求巨大。雄性不育是植物杂种优势利用的重要途径，利用雄性不育系创制杂交种对于矮牵牛的遗传改良具有重要的意义。因此，挖掘矮牵牛花药特异表达启动子，开展矮牵牛雄性不育相关基因功能验证和雄性不育系创制具有重要的应用价值。

发明内容

本发明的目的在于提供一个在矮牵牛花药发育早期特异性表达的启动子。本发明的启动子属于一种内源启动子，通过定量PCR检测表明该启动子驱动的内源基因只在花药发育早期表达，在其他时期或其他组织中均无表达。通过构建该启动子驱动的报告基因GUS及毒素基因Barnase的表达载体，分别转化拟南芥和矮牵牛，发现所述的启动子驱动的基因只在拟南芥的花药中表达，本发明成功获得了完全雄性不育的矮牵牛株系。本发明获得了矮牵牛花药特异表达的启动子，同时将该启动子应用于基因工程培育了矮牵牛雄性不育系，预示着该启动子在植物花药发育研究和开发中具有相当广阔的应用前景。

本发明的技术方案如下所述：

发明人构建了矮牵牛在短日照下形成的败育花与正常花的抑制差减文库，在败育花文库中筛选到一个差异表达显著的基因PhGRP。通过定量PCR检测时空表达分析表明，该基因只在矮牵牛花药发育早期特异性地表达(如图1所示)。通过PCR扩增得到了PhGRP基因的启动子pPhGRP，该启动子的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO：1所示(长度为1220bp)。

发明人通过构建由该启动子驱动的报告基因GUS的植物表达载体pPhGRP::GUS(见图2所示)，并将其异源转化到拟南芥(Columbia)中，得到转基因阳性拟南芥植株。通过GUS染色分析发现，该启动子只驱动GUS基因在花药中表达，在根、叶、角果、花瓣中均不表达(如图3所示)。

进一步，发明人通过构建由该启动子驱动的毒素基因Barnase的植物表达载体pPhGRP::Barnase(见图4)，并将其同源转化到矮牵牛中，得到转基因阳性矮牵牛植株。通过表型观测发现，该启动子只驱动Barnase基因在花药中表达，最终导致矮牵牛雄性不育，而矮牵牛的营养器官及花的其他器官均发育正常(图5)。

可以将本发明的启动子用于构建组织特异性表达载体。此外，还可以将目的基因可操作地连接到本发明的启动子之下，构建得到表达盒，进一步可将该表达盒导入植物表达载体，获得组织特异表达的重组表达载体。因此，本发明还包括由上述启动子构建的表达盒，以及含有上述表达载体或表达盒的表达载体或重组载体。

上述重组表达载体可通过使用Ti质粒、Ri质粒、植物病毒载体、直接DNA转化、显微注射、电导、农杆菌介导或基因枪等常规生物学方法转化植物细胞或组织或器官，得到转基因植物细胞或组织或器官及由此分化、再生的完整植株及其无性系或其后代。所述含有上述花药特异性启动子的工程菌以及转基因植物的细胞或组织或器官也属于本发明的保护范围。

应用本发明的启动子通过基因工程技术获得的植物雄性不育系也属于本发明的保护范围。

本发明的有益效果如下：

1.本发明的启动子在花药中能够特异性地表达，可以用于目的基因在花药中高效特异表达的功能研究。

2.本发明的启动子在花药发育早期特异性地表达，可以用于创建较为彻底的植物雄性不育系，为植物的遗传改良提供了新的遗传资源。

附图说明

序列表SEQ ID NO：1是本发明分离的启动子pPhGRP的核苷酸序列。

图1：矮牵牛PhGRP基因的时空定量表达分析。附图标记说明：图1中的a图是8个不同发育时期的花芽(0.2bud、0.3bud、0.5bud、1.0bud、1.5bud、2.0bud、2.5bud、3.5bud分别为来自去除花萼后高度为2mm、3mm、5mm、10mm、15mm、20mm、25mm、35mm的花芽)，图1中的b图是8个不同发育时期花芽中的花药，图1中的c图是四轮花器官以及根、茎、叶、开放的花朵的qPCR表达分析结果。

图2：植物表达载体pPhGRP::GUS的构建图。附图标记说明：图2中的a图是pCAMBIA1391Z载体物理图谱，图2中的b图是含有本发明的启动子pPhGRP的pPhGRP::GUS载体物理图。

图3：启动子pPhGRP驱动的GUS基因在拟南芥中的表达检测。附图标记说明：图3中的a图是GUS检测显示只在拟南芥的花药部位染色，图3中的b图是在拟南芥角果、叶和根中不染色。

图4：植物表达载体pPhGRP::BARNASE的构建图。附图标记说明：图4中的a图是BpFULL1::BARNASE载体物理图谱，图4中的b图是含有本发明的启动子pPhGRP的pPhGRP::BARNASE载体物理图。

图5：转pPhGRP::BARNASE的矮牵牛植株表型观测。附图标记说明：图5中的a图是与野生型(即非转基因，简称WT)矮牵牛相比，矮牵牛转基因株系1和转基因株系2的花药萎缩；图5中的b图是矮牵牛野生型(WT)与矮牵牛转基因株系1-4的花药大小的比较，不同的大写字母代表差异极显著；图5中的c图是矮牵牛野生型(WT)与矮牵牛转基因株系的花粉染色测试；图5中的d图是矮牵牛野生型(WT)与矮牵牛转基因株系1成熟花粉的扫描电镜观察；图5中的e图是矮牵牛野生型(WT)与矮牵牛转基因株系的开放花朵；图5中的f图是矮牵牛野生型(WT)与矮牵牛转基因株系1-4花朵大小的比较；图5中的g图是转基因株系1不同花药发育时期的半薄切片观察，分别为来自去除花萼后高度为2、3、6、8、13、25和65mm的花芽。

具体实施方式

以下实施例进一步定义本发明。根据以上的描述和这些实施例，本领域技术人员可以确定本发明的基本特征，并且在不偏离本发明精神和范围的情况下，可以对本发明作出各种改变和修改，以使其适用各种用途和条件。

实施例1：PhGRP基因的表达分析

①矮牵牛RNA的提取

矮牵牛RNA的提取采用液氮研磨法(具体方法参照Huang et al.2015)，所用EASYspin Plant RNA Kit试剂盒购自北京艾德莱公司。RNA分别提自8个不同发育时期的花芽(0.2bud、0.3bud、0.5bud、1.0bud、1.5bud、2.0bud、2.5bud、3.5bud分别为来自去除花萼后高度为2mm、3mm、5mm、10mm、15mm、20mm、25mm、35mm的花芽)、根、茎、叶、开放的花朵以及8个不同发育时期花芽中的花药。

②反转录合成第一链cDNA

使用北京全式金生物技术有限公司的一步法试剂盒合成矮牵牛各组织的第一链cDNA，该方法可在合成第一链cDNA的同时，可以去除RNA模板中残留的基因组DNA，无需对DNaseI进行热失活处理，从而降低了RNA在反转录过程中被污染的几率和损伤。

反转录体系：RNA总体系7μL；Anchored Oligo(dt)18Primer(0.5μg/μl)1μL；2×TSReaction Mix 10μL；RT/RI Enzyme Mix 1μL；gDNA Remover 1μL。

PCR程序：42℃反应30min；85℃加热5min。

③qPCR检测PhGRP基因的表达模式

试验方法中使用的仪器为ABI公司的7500Fast荧光定量PCR仪。PCR反应总体系为20μL，使用Takara公司的SYBR荧光染料。以各个物种间保守性都非常强的看家基因Beta-Actin作为内参，根据GenBank上同为茄科的番茄Beta-Actin(登陆号为U60482)和烟草Beta-Actin(登陆号为X69885)的保守区域设计一对特异引物(Beta-ActinF/Beta-ActinR)，将灭过菌的双蒸馏水作为阴性对照。通过溶解曲线法来确定引物的质量，每个样品进行3次重复实验。所用引物的序列如下：

qPhGRPF：GGGTATTGGAGGTTTTGGTTTT，

qPhGRPR：TCATTGCATATTTCTTGGGACTG；

Beta-ActinF：GTTGGACTCTGGTGATGGTGTG，

Beta-ActinR：CCGTTCAGCAGTGGTGGTG；

qPCR程序：95℃预变性30s，95℃变性3s，60℃退火30s，共40个循环。

通过qPCR检测，我们发现PhGRP基因是在矮牵牛花芽发育早期的特定时间段(0.3bud)突然上调表达的基因(图1中的a图)，因为矮牵牛花芽是由四轮花器官组成的，所以我们将0.3bud这一时期的花芽分成四个部分(花萼、花冠、花药、雌蕊)来进行该基因表达水平的检测。通过分析我们发现该基因在幼根、嫩茎、叶片、开放的花朵、花萼、花冠、雌蕊中都检测不到表达，只在花药中有着很高的表达水平(见图1中的c图)。也就是说PhGRP基因不仅具有花器官组织表达的特异性，而且还具有在花药中特异表达的特性。最后我们又探究了PhGRP基因在花药各个发育时期的表达情况，结果发现该基因在花药各个发育时期的表达模式与在花芽各时期中非常相似，都是在组织发育的初期达到了峰值(图1中的b图)，可见PhGRP基因具有发育时期的特异性。

实施例2：启动子pPhGRP的克隆

①矮牵牛基因组DNA提取

矮牵牛DNA的提取采用常规CTAB法，具体操作方法参照Huang et al.2015文献报道。

②启动子pPhGRP序列的获得

使用Primer 5软件进行引物的设计，用于扩增该启动子的引物序列如下：

pPhGRPF:GAAATGTTGTCATCACCCTCA，

pPhGRPR:TTTCTTCAATAGCAGTACTTGAGAG；

PCR反应体系：10×buffer 2μl；dNTP 0.4μl；上下游引物各0.2μM；Taq聚合酶0.2μl，加ddH₂O补足至20μl体系。

PCR程序：94℃预变性3min；94℃30sec，55℃30sec,72℃1min，28个循环；72℃延伸至7min。

通过PCR克隆我们成功的获得了长为1220bp的PhGRP基因的启动子，我们将该基因的启动子命名为pPhGRP，该启动子的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO：1所示。

实施例3：利用启动子表达载体pPhGRP::GUS载体转化拟南芥

①表达载体pPhGRP::GUS的构建

表达载体pPhGRP::GUS的构建是将启动子pPhGRP插入到含有GUS基因的pCAMBIA1391Z的质粒中去。使用Primer Premier 5软件设计引物，进行PCR反应，回收目的片段后进行BP反应，然后通过热激法转化大肠杆菌感受态细胞DH5α，挑取饱满的菌落进行PCR检测。

引物序列：

pPhGRPF:GAAATGTTGTCATCACCCTCA，

GUS-R：TTTTTGTCACGCGCTATCAG；

PCR反应体系：10×buffer 2μl；dNTP 0.4μl；上下游引物各0.2μl；Taq聚合酶0.2μl，加ddH₂O补足至20μl体系。

PCR反应程序：94℃预变性3min；94℃30sec，55℃30sec，72℃1min，25个循环；72℃延伸至7min。

挑取阳性菌落进行测序，从测序正确的单菌落中提取质粒，并同时提取载体质粒。酶切检测后重新连接启动子和线性化质粒，我们将构建好的表达载体命名为pPhGRP::GUS。

②利用表达载体转化农杆菌EHA105

利用目的质粒电转农杆菌EHA105，具体步骤如下：于-80℃中取出实验室保存的根癌农杆菌EHA105，放置冰上冻融大约5min，电转前将电转杯提前用95％的乙醇冲洗，将质粒和电转杯在冰上预冷；将1μL表达载体质粒轻轻加入感受态中，轻柔地吸打。将反应液吸入预冷的电转杯中电转，将电压调为2200V；调紧电转杯旋钮，按下start键，电转结束显示6ms；立即向电转杯中加入900μL液体LB(提前预热)，重悬后转移至1.5mL离心管中，于28℃摇床(200r/min)振荡1h；菌液4000r离心2min，弃掉800μL上清，涂于含有Km的LB培养皿上，培养室倒置培养3d；对长出的单菌落进行PCR检测，挑选阳性单菌落，摇菌，按照700μL菌液/300μL50％甘油的比例保菌，-80℃保存，用于下一步转化。

③利用农杆菌转化拟南芥Columbia

采用农杆菌介导的花器浸醮法转化拟南芥(Columbia)，具体步骤如下：挑取阳性单菌落于100ml液体LB(含有100μL卡那霉素即Km)中，28℃摇床200r·min-1摇动24h；摇浓后，分装至两个50ml离心管中，于4000r下离心10min，去上清，加入一定量的重悬液(5g蔗糖+50μL SilwetL-77，定容至100ml)振荡后至OD值为0.8。将拟南芥花序放入重悬液中，30s后取出，未能浸入重悬液中的花序可用棉花蘸取重悬液涂抹在花序上，或用移液枪滴加。为了确保每个枝条上的花序都完成侵染，用木棍将待试植株固定，套上黑色塑料袋，避光处理24h后恢复正常生长条件，1周后用相同的步骤重复侵染一次；在第二次侵染3周后，停止浇水，待植株干枯后收取种子，晾干后烘干，放入4℃冰箱中春化一周，开始筛选种子。

④GUS基因在拟南芥中表达的检测

将生殖生长时期转基因阳性植株的组织(例如根、茎、叶片、花芽)放入1.5ml离心管中，加入一定量的GUS染液，以淹没植物组织为准，放入37℃恒温箱中过夜；之后将GUS染液用移液器全部吸出，加入70％乙醇，脱色3-4次，直至植物组织呈白色。脱色完成后，将样品置于体视显微镜下拍照观察。

拟南芥的染色结果表明，pPhGRP驱动的GUS只在花药发育的初期被染上色(图3a)，而根、叶和角果均未染色(见图3中的b图)，证明了该启动子是花药组织特异性启动子，并具有物种间的通用性。

实施例4：利用启动子表达载体pPhGRP::Barnase转化矮牵牛

①表达载体pPhGRP::Barnase的构建

通过PCR反应，用限制性内切酶Sall和BamHl去除BpFULL1::Barnase表达载体中的BpFULL1启动子，然后将长度为1220bp的pPhGRP启动子(序列见序列表SEQ ID NO:1)连接上去，构建得到pPhGRP::Barnase表达载体。

上游引物序列：ATGTCGACGAAATGTTGTCATCACCCTCA，

下游引物序列：ATGGATCCTTTCTTCAATAGCAGTACTTGAGAG；

PCR反应体系：10×buffer 2μl；dNTP 0.4μl；上下游引物各0.2μl；Taq聚合酶0.2μl，加ddH₂O补足至20μl的反应体系中。

PCR反应程序：94℃预变性3min；94℃30sec，55℃30sec，72℃1min，25个循环；72℃延伸至7min。

②利用表达载体转化农杆菌EHA105

将目的质粒电转农杆菌EHA105。(具体方法参照实施例3中的步骤②)

③利用农杆菌转化矮牵牛Mitchell

采用叶盘法进行矮牵牛(Mitchell，Huang et al.2015)的遗传转化。培养条件为：培养温度为25℃，16h光照/8h黑暗的光周期，光照强度为7147lx，相对湿度保持在40％。具体步骤如下：挑取阳性农杆菌的单克隆菌落于添加100mg·L-1Km的5ml的液体LB培养基中，置于28℃，200r·min-1摇床中震荡培养过夜至OD值＝0.4；选取幼嫩的矮牵牛叶片(简称外植体)，流水冲洗叶片表面10min，在超净工作台中先用75％浓度的酒精消毒10s，再用无菌水冲洗2次，然后用0.1％升汞消毒30min，最后用无菌水冲洗3-5次，将外植体置于无菌滤纸上切成1.0cm×1.0cm大小方块。在超净工作台上向制备好的菌液中加入已灭菌的ddH₂O至50ml，添加100uMol·L^-1AS(乙酰丁香酮)500ul；将切好的矮牵牛叶片置于菌液中侵染30min，期间不断晃动锥形瓶。将侵染完成的叶片外植体取出放在已灭菌的滤纸上，吸尽多余的菌液后将被侵染的叶片远轴面朝下平放在共培培养基上，在25℃下暗培3d；然后将共培后的矮牵牛叶片转移到筛选培养基上，于25℃光下培养，两周更换一次培养皿，直至形成抗性芽。待抗性芽长至3cm左右，将其转移至生根培养基中诱导生根(将未生根的外植体叶片每20d左右用新鲜的筛选培养基继代培养一次)，去除假阳性苗，待抗性芽的根系长势良好，根长3cm，株高7cm左右时(约需要10d)打开瓶盖在室内炼苗3-5d。移栽时仔细去除再生小苗根上的培养基，将再生小苗栽于培养基质上(配方：泥炭土：蛭石：珍珠岩的体积比＝4：3：3)中保湿培养1-2d后送入温室内培养。待再生小苗生长健壮后移入常规园土中做常规养护管理。

培养基的配制：

共培培养基：MS+2％蔗糖+1％葡萄糖+0.75％琼脂+2.0mg·L^-1 6-BA+0.1mg·L^-1NAA+1.0mg·L^-1 ZT+2.0mMol·L^-1 AS；

筛选培养基：MS+2％蔗糖+1％葡萄糖+0.75％琼脂+2.0mg·L^-1 6-BA+0.1mg·L^-1NAA+1.0mg·L^-1 ZT+100mg·L^-1 Km+300mg·L^-1 Cef；

出芽培养基：MS+2％蔗糖+1％葡萄糖+0.75％琼脂+2.0mg·L^-1 6-BA+0.1mg·L^-1NAA+2.0mg·L^-1 ZT+100mg·L^-1 Km+300mg·L^-1 Cef；

生根培养基：MS+3％蔗糖+0.75％琼脂+0.1mg·L^-1 IBA+50mg·L^-1 Km+300mg·L^-1Cef

LB液体培养基：0.1％NaCl+0.05％酵母提取物+0.1％蛋白胨；

④转基因矮牵牛植株的阳性检测

分别采集矮牵牛转基因Km抗性苗及对照(CK)的嫩叶用于gDNA的提取。用特异性引物(PhGRP-pF和Barnase-R)对提取的DNA进行PCR扩增。

引物序列为：

PhGRP-pF：GAAATGTTGTCATCACCCTCA，

Barnase-R：CATATTGTTCATCTCCCATT；

PCR反应体系：10×buffer 2μl；dNTP 0.4μl；上下游引物各0.2μl；Taq聚合酶0.2μl，加ddH₂O补足至体系至20μl。

PCR程序：94℃预变性4min；94℃变性30S，59℃复性30S，72℃延伸1min，35个循环；72℃延伸至10min，20℃保温。

我们用pPhGRP::Barnase载体转化矮牵牛共获得10棵阳性植株，其中3株表现为完全的雄性不育，营养器官和其它3轮花器官的生长均未受到影响(图5)。

主要参考文献目录

Gittins JR,Pellny TK,Hiles ER,Rosa C,Biricolti S,James DJ(2000)Transgene expression driven by heterologous ribulose-1,5-bisphosphatecarboxylase/oxygenase small-subunit gene promoters in the vegetative tissuesof apple(Malus pumila Mill.).Planta 210:232–240.

Kumpatla SP,Chandrasekharan MB,Iyer LM et al.(1998).Genome intruderscanning and modulation systems and transgene silencing.Trends in PlantScience 3:97–104.

Mariani C,Beuckeleer MD,Truettner J,Leemans J,Goldberg RB(1990).Induction of male sterility in plants by a chimaeric ribonucleasegene.Nature 347:737-741.

Srinivasan A,Yamini KN,Reddy SS,Kumar VD(2015).Tapetum specificexpression of unedited nad3gene from safflower and targeting the protein intomitochondria induces male sterility in transgenic tobacco plants.Plant CellTissue and Organ Culture 120(1):387-398.

Xue Huang,Yuanzheng Yue,Jian Sun,Hao Peng,Zhaonan Yang,Manzhu Bao,Huirong Hu(2015).Characterization of a fertility-related SANT/MYB gene(PhRL)from petunia,Scientia Horticulturae 183:152-159。

SEQUENCE LISTING

<110> 华中农业大学

<120> 矮牵牛花药早期特异表达启动子pPhGRP的鉴定和应用

<130>

<141> 2017-03-14

<160> 1

<170> PatentIn version 3.1

<210> 1

<211> 1220

<212> DNA

<213> 矮牵牛（Petunia hybrida）

<400> 1

gaaatgttgt catcaccctc aatgaacaaa gatgaggaaa ttttaccact tagtcacgaa 60

attcatccaa aatttcagct gtcattagcc tatggaagga aggtcaaaac cttccaccat 120

gttcaaggat gactccaatg gctatggtgc taaaatttag tgaaatcttt aacatttagg 180

tattggttgt aagatatatg attattaaaa ggttcctcct ccttgattgt ttttagtcgg 240

ataatagatg ggggagtggt aaaagtaatg cccaccaata ttgtgcataa gtgttcaact 300

caaaattttg agactgcaga cgctagatgg taccatatct ctgtccttag aagccaaagt 360

ggaagtagga gaactctgtg ttagtataac gttgtactaa ggtttttgct gaacagtatc 420

tctttagcga acagcaaaat tgctcttagg tttcatggtt tcagtttaaa ccataacaag 480

ttgatgcact taatcatagc ttttgaagtt tgaagaagcg ttcttgagct tttttcttgt 540

ctctcttagt ccgggagaaa gggacttgga gtattttatt ttgtcttagt tgtatgaaag 600

tatatatgac gaactccatg aattggcaag aaatgctaaa aaaagtttaa tacctttaag 660

agtctgctat cactttcctt aatagaaact taatcctaag tttaactgtg acaatccaac 720

ttcccatcta ccttgatcat attgaggaaa atgcacgtgt gcataaaaca tgttggaagg 780

atttctaaat gagaagtgac actttttatt tacttaatga tatcttcaac tgttcttttt 840

acatgggact aacttcttag gctcgtggaa ttctttgatg aaagatttga tgtaaatctt 900

caggatgttt ctttggatgt gacctaagtg aataaaagat gtatatttga aggaataatt 960

gattagcttt gctgtaagga agaattaggt tgatcatgaa gttgagatgg tgagactgaa 1020

gtctctttct gtaaagacgt agttggcttc ttgttgtaaa caaaatatat gtacaataat 1080

agtgcacatt gcatgagttc ctaactatca cattcttcct tgctatttca cttccttagc 1140

tactataaaa catcaacttc caaactcaaa catctcacac tcaaaacatc ttttactctc 1200

aagtactgct attgaagaaa 1220

Claims (4)

1.一种只在矮牵牛花药中特异表达，不在其他时期或其他组织中表达的启动子pPhGRP，其核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。

2.如权利要求1所述的一种只在矮牵牛花药中特异表达，不在其他时期或其他组织中表达的启动子pPhGRP在调控植物花药发育中的应用。

3.如权利要求1所述的一种只在矮牵牛花药中特异表达，不在其他时期或其他组织中表达的启动子pPhGRP在调控植物培育雄性不育遗传资源中的应用。

4.如权利要求1所述的一种只在矮牵牛花药中特异表达，不在其他时期或其他组织中表达的启动子pPhGRP在调控植物杂种优势利用中的应用。