JP7282382B2 - ゲノム編集植物の生産方法 - Google Patents
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Description
(a)ゲノム上の特定の遺伝子を標的化したゲノム編集酵素をコードする遺伝子および植物の再分化を誘導または促進するタンパク質をコードする遺伝子を発現する構築物を植物細胞に導入する工程、
(b)工程(a)で得られた植物細胞を培養し、再分化した個体を選抜する工程、および
(c)工程(b)で選抜した個体から、ゲノム編集酵素をコードする遺伝子および植物の再分化を誘導または促進するタンパク質をコードする遺伝子がゲノムに組み込まれていない個体を選抜する工程、を含む方法。
(a)ゲノム編集酵素によりゲノム上の特定の遺伝子に変異が導入されている
(b)ゲノム上に外来遺伝子が組み込まれていない
(c)ゲノム編集酵素によるゲノムの編集後に交配されていない
[8] 栄養繁殖性栽培品種を持つ植物である、[7]に記載のゲノム編集植物。
(a)ゲノム編集酵素によりゲノム上の特定の遺伝子に変異が導入されている
(b)ゲノム上に外来遺伝子が組み込まれていない
(c)ゲノム編集酵素によるゲノムの編集後に交配されていない
このようなゲノム編集植物は、品種維持などの観点から栄養繁殖を行う必要のある植物において、品種の同一性を維持しながらゲノム編集した個体が得られる点で有利である。このような観点から、本発明のゲノム編集植物は、栄養繁殖性栽培品種を持つ植物であることが好ましく、ジャガイモが特に好ましい。
(1)ipt遺伝子を含むベクター構築
Agrobacterium tumefaciens A281株のDNA(特許3905607号)を鋳型に、DDBJに登録されているipt遺伝子の配列(ACCESSION X17432)を基に合成したプライマーU1126:CACCGGTACCCGTTACAAGTATTGCACGTTTTGT(配列番号:1)、U1127:GGATCCATCGATTAAGTGATTATCGAACG(配列番号:2)を用いて、アニール温度55℃にてPCR(30サイクル、タカラバイオ社 PrimeStarを使用)を行い、遺伝子を増幅した。これをpENTR/D-TOPOベクター(サーモフィッシャー社)へクローニングして、遺伝子断片を取得した。
(1)で作製したベクターを凍結融解法により、アグロバクテリウム・ツメファシエンスGV3101株に導入した。ベクターを含むアグロバクテリウム・ツメファシエンスGV3110株を、50ppmのカナマイシンを含むYEB液体培地[5g/lビ-フエキス、1g/l酵母エキス、5g/lペプトン、5g/l蔗糖、2mM硫酸マグネシウム(pH7.2)]にて28℃、12時間振とう培養した。培養液1.5mlを10,000rpmで3分間遠心して集菌後、1.5mlの3%蔗糖を含むMS培地[Murashige & Skoog, Physiol. Plant., 15, 473-497 (1962)]に再懸濁し、感染用菌液とした。
再分化した個体からDNAを抽出した。得られた個体のゲノムに外来遺伝子が組み込まれているか否かは、外来遺伝子として用いたカナマイシン耐性遺伝子を指標に行った。具体的には、カナマイシン耐性遺伝子を特異的に増幅するプライマーTN5-1:CTCACCTTGCTCCTGCCGAGA(配列番号:3)およびTN5-2:CGCCTTGAGCCTGGCGAACAG(配列番号:4)を用い、アニール温度55℃にてPCR(30サイクル、タカラバイオ社 TakaraTaqを使用)を行うことで、個体のゲノムに組み込まれた当該遺伝子を検出した。
(1)bbm遺伝子を含むベクターの構築
シロイヌナズナ(エコタイプ コロンビア)の未熟種子から抽出した全RNAから合成されたcDNA(理化学研究所榊原圭子上級研究員より分与いただいた)を鋳型に、DDBJに登録されているbbm遺伝子の配列(ACCESSION NM_001343497)を基に合成したプライマーU1145:CACCTCTAGAATGAATCAAACCCAACGTTGG(配列番号:7)およびU1146:CTAAGTGTCGTTCCAAACTGAAAAC(配列番号:8)を用い、アニール温度55℃にてPCR(30サイクル、タカラバイオ社 PrimeStarを使用)を行い、遺伝子を増幅した。これをpENTR/D-TOPOベクター(サーモフィッシャー社)へクローニングして、遺伝子断片を取得した。バイナリーベクターpSuehiro105を基本として、カリフラワーモザイクウイルスの35S RNAプロモーター、シロイヌナズナ5’非翻訳配列、bbm遺伝子、シロイヌナズナHSP遺伝子ターミナーターを、それぞれ両端に設定した制限酵素部位を利用して連結し、植物形質転換用ベクターpSuehiro109を作成した(図1)。
(1)で作製したベクターを凍結融解法により、アグロバクテリウム・ツメファシエンスGV3101株に導入した。ベクターを含むアグロバクテリウム・ツメファシエンスGV3110株を、50ppmのカナマイシンを含むYEB液体培地[5g/lビ-フエキス、1g/l酵母エキス、5g/lペプトン、5g/l蔗糖、2mM硫酸マグネシウム(pH7.2)]にて28℃、12時間振とう培養した。培養液1.5mlを10,000rpmにて3分間遠心して集菌後、1.5mlの3%蔗糖を含むMS培地[Murashige & Skoog, Physiol. Plant., 15, 473-497 (1962)]に再懸濁し、感染用菌液とした。
再分化した個体からDNAを抽出した。得られた個体のゲノムに外来遺伝子が組み込まれているか否かは、外来遺伝子として用いたカナマイシン耐性遺伝子を指標に行った。具体的には、カナマイシン耐性遺伝子を特異的に増幅するプライマーTN5-1:CTCACCTTGCTCCTGCCGAGA(配列番号:3)およびTN5-2:CGCCTTGAGCCTGGCGAACAG(配列番号:4)を用い、アニール温度55℃にてPCR(30サイクル、タカラバイオ社 TakaraTaqを使用)を行うことで、個体のゲノムに組み込まれた当該遺伝子を検出した。
(1)再分化促進と形質転換体のネガティブ選抜マーカー遺伝子であるESR2遺伝子を含むベクター構築
シロイヌナズナ(エコタイプ コロンビア)の植物体から抽出した全ゲノムに対して、ESR2遺伝子にはイントロンがないことから、DDBJに登録されている配列(ACCESSION NM_102301)を基に合成したプライマーU1157:CACCTCTAGAATGGAAGAAGCAATCATGAGACT(配列番号:9)、U1158:CTAATAATCATCATGAAAGCAATACTGA(配列番号:10)を用いてアニール温度55℃でPCR(30サイクル、タカラバイオ社 PrimeStarを使用)によって遺伝子を増幅した。これをpENTR/D-TOPOベクター(サーモフィッシャー社)へクローニングし、遺伝子断片を取得した。両端に設定した制限酵素を用いてバイナリーベクターpSuehiro105を基本として、カリフラワーモザイクウイルスの35S RNAプロモーター、シロイヌナズナ5’非翻訳配列、当該遺伝子、シロイヌナズナHSP遺伝子ターミナーターを連結し、植物形質転換用ベクターpSuehiro112を作成した(図1)。
(1)で作製したベクターを凍結融解法により、アグロバクテリウム・ツメファシエンスGV3101株に導入した。ベクターを含むアグロバクテリウム・ツメファシエンスGV3110株を、50ppmのカナマイシンを含むYEB液体培地[5g/lビ-フエキス、1g/l酵母エキス、5g/lペプトン、5g/l蔗糖、2mM硫酸マグネシウム(pH7.2)]にて28℃、12時間振とう培養した。培養液1.5mlを10,000rpm、3分間遠心して集菌後、1.5mlの3%蔗糖を含むMS培地[Murashige & Skoog, Physiol. Plant., 15, 473-497 (1962)]に再懸濁し、感染用菌液とした。
再分化した個体からDNAを抽出した。各形質転換体の評価は外来遺伝子としてカナマイシン耐性遺伝子を含有する個体を、カナマイシン耐性遺伝子の配列を特異的に増幅するプライマーTN5-1:CTCACCTTGCTCCTGCCGAGA(配列番号:3)、及びTN5-2:CGCCTTGAGCCTGGCGAACAG(配列番号:4)を用いてアニール温度55℃でPCR(30サイクル、タカラバイオ社 TakaraTaqを使用)を行うことで検出し、該再分化植物体が形質転換植物体か否かを確認できる。ゲノム編集個体の評価はヘテロ二本鎖移動度分析(HMA:Heteroduplex Mobility Assay)を用いた。SSR2遺伝子の標的配列を挟んだプライマーU1131:TCACATCTTTGGATTGTTCTCTG(配列番号:5)、及びU1017:TGGACCATAAATCATGCCTTC(配列番号:6)を用いてアニール温度55℃でPCR(35サイクル、タカラバイオ社 TakaraTaqを使用)を行いマイクロチップ電気泳動装置 MultiNA(島津製作所)で解析を行った。再分化し供試した個体を確認することで、形質転換されていないがゲノム編集が起きている個体を得ることができる。また、品種の形質が維持され、同時に全アレルに変異が起き、かつ他の遺伝子に変異が入らず、かつステロイドグリコアルカロイドを極めて低下したジャガイモを得ることができる。
(1)再分化促進と形質転換体のネガティブ選抜マーカー遺伝子であるLEC2遺伝子を含むベクター構築
シロイヌナズナ(エコタイプ コロンビア)の未熟種子から抽出した全RNAから合成されたcDNAに対し、DDBJに登録されている配列(ACCESSION NM_102595)を基に合成したプライマーU1155:CCACTCTAGAATGGATAACTTCTTACCCTTTCCCT(配列番号:11)、U1156:TCACCACCACTCAAAGTCGTTAAA(配列番号:12)を用いてアニール温度55℃でPCR(30サイクル、タカラバイオ社 PrimeStarを使用)によって遺伝子を増幅した。これをpENTR/D-TOPOベクター(サーモフィッシャー社)へクローニングし、遺伝子断片を取得した。バイナリーベクターpSuehiro105を基本として、カリフラワーモザイクウイルスの35S RNAプロモーター、シロイヌナズナ5’非翻訳配列、当該遺伝子、シロイヌナズナHSP遺伝子ターミナーターを、それぞれ両端に設定した制限酵素部位を利用して連結し、植物形質転換用ベクターpSuehiro111を作成した(図1)。
(1)で作製したベクターを凍結融解法により、アグロバクテリウム・ツメファシエンスGV3101株に導入した。ベクターを含むアグロバクテリウム・ツメファシエンスGV3110株を、50ppmのカナマイシンを含むYEB液体培地[5g/lビ-フエキス、1g/l酵母エキス、5g/lペプトン、5g/l蔗糖、2mM硫酸マグネシウム(pH7.2)]にて28℃、12時間振とう培養した。培養液1.5mlを10,000rpm、3分間遠心して集菌後、1.5mlの3%蔗糖を含むMS培地[Murashige & Skoog, Physiol. Plant., 15, 473-497 (1962)]に再懸濁し、感染用菌液とした。
再分化した個体からDNAを抽出した。各形質転換体の評価は外来遺伝子としてカナマイシン耐性遺伝子を含有する個体を、カナマイシン耐性遺伝子の配列を特異的に増幅するプライマーTN5-1:CTCACCTTGCTCCTGCCGAGA(配列番号:3)、及びTN5-2:CGCCTTGAGCCTGGCGAACAG(配列番号:4)を用いてアニール温度55℃でPCR(30サイクル、タカラバイオ社 TakaraTaqを使用)を行うことで検出し、該再分化植物体が形質転換植物体か否かを確認できる。ゲノム編集個体の評価はヘテロ二本鎖移動度分析(HMA:Heteroduplex Mobility Assay)を用いた。SSR2遺伝子の標的配列を挟んだプライマーU1131:TCACATCTTTGGATTGTTCTCTG(配列番号:5)、及びU1017:TGGACCATAAATCATGCCTTC(配列番号:6)を用いてアニール温度55℃でPCR(35サイクル、タカラバイオ社 TakaraTaqを使用)を行いマイクロチップ電気泳動装置 MultiNA(島津製作所)で解析を行うことができる。再分化し供試した個体を確認することで、形質転換されていないがゲノム編集が起きている個体を得ることができる。また、品種の形質が維持され、同時に全アレルに変異が起き、かつ他の遺伝子に変異が入らず、かつステロイドグリコアルカロイドを極めて低下したジャガイモを得ることができる。
(1)再分化促進と形質転換体のネガティブ選抜マーカー遺伝子であるESR1遺伝子を含むベクター構築
シロイヌナズナ(エコタイプ コロンビア)の植物体から抽出した全ゲノムに対して、ESR1遺伝子にはイントロンがないことから、DDBJに登録されている配列(ACCESSION NM_101169)を基に合成したプライマーU1163:CACCTCTAGAATGGAAAAAGCCTTGAGAAACTT(配列番号:13)、U1164:CTATCCCCACGATCTTCGG(配列番号:14)を用いてアニール温度55℃でPCR(30サイクル、タカラバイオ社 PrimeStarを使用)によって遺伝子を増幅した。これをpENTR/D-TOPOベクター(サーモフィッシャー社)へクローニングし、遺伝子断片を取得した。バイナリーベクターpSuehiro105を基本として、カリフラワーモザイクウイルスの35S RNAプロモーター、シロイヌナズナ5’非翻訳配列、当該遺伝子、シロイヌナズナHSP遺伝子ターミナーターを、それぞれ両端に設定した制限酵素部位を利用して連結し、植物形質転換用ベクターpSuehiro114を作成した(図1)。
(1)で作製したベクターを凍結融解法により、アグロバクテリウム・ツメファシエンスGV3101株に導入した。ベクターを含むアグロバクテリウム・ツメファシエンスGV3110株を、50ppmのカナマイシンを含むYEB液体培地[5g/lビ-フエキス、1g/l酵母エキス、5g/lペプトン、5g/l蔗糖、2mM硫酸マグネシウム(pH7.2)]にて28℃、12時間振とう培養した。培養液1.5mlを10,000rpm、3分間遠心して集菌後、1.5mlの3%蔗糖を含むMS培地[Murashige & Skoog, Physiol. Plant., 15, 473-497 (1962)]に再懸濁し、感染用菌液とした。
再分化した個体からDNAを抽出した。得られた個体のゲノムに外来遺伝子が組み込まれているか否かは、外来遺伝子として用いたカナマイシン耐性遺伝子を指標に行った。具体的には、カナマイシン耐性遺伝子を特異的に増幅するプライマーTN5-1:CTCACCTTGCTCCTGCCGAGA(配列番号:3)およびTN5-2:CGCCTTGAGCCTGGCGAACAG(配列番号:4)を用い、アニール温度55℃にてPCR(30サイクル、タカラバイオ社 TakaraTaqを使用)を行うことで、個体のゲノムに組み込まれた当該遺伝子を検出した。
(1)再分化促進と形質転換体のネガティブ選抜マーカー遺伝子であるWUS遺伝子を含むベクター構築
シロイヌナズナ(エコタイプ コロンビア)の花茎から抽出した全RNAから合成されたcDNAに対し、DDBJに登録されているWUS遺伝子の配列(ACCESSION NM_127349)を基に合成したプライマーU1187:CACCACTAGTATGGAGCCGCCACAGCATCA(配列番号:15)、U1188:AGATCTAGTTCAGACGTAGCTCAAGAGAAG(配列番号:16)を用いてアニール温度55℃でPCR(30サイクル、タカラバイオ社 PrimeStarを使用)によって遺伝子を増幅した。これをpENTR/D-TOPOベクター(サーモフィッシャー社)へクローニングし、遺伝子断片を取得した。バイナリーベクターpSuehiro105を基本として、カリフラワーモザイクウイルスの35S RNAプロモーター、シロイヌナズナ5’非翻訳配列、当該遺伝子、カリフラワーモザイクウイルスの35S RNAターミナーターを、それぞれ両端に設定した制限酵素部位を利用して連結し、植物形質転換用ベクターpSuehiro119を作成した(図1)。
(1)で作製したベクターを凍結融解法により、アグロバクテリウム・ツメファシエンスGV3101株に導入した。ベクターを含むアグロバクテリウム・ツメファシエンスGV3110株を、50ppmのカナマイシンを含むYEB液体培地[5g/lビ-フエキス、1g/l酵母エキス、5g/lペプトン、5g/l蔗糖、2mM硫酸マグネシウム(pH7.2)]にて28℃、12時間振とう培養した。培養液1.5mlを10,000rpm、3分間遠心して集菌後、1.5mlの3%蔗糖を含むMS培地[Murashige & Skoog, Physiol. Plant., 15, 473-497 (1962)]に再懸濁し、感染用菌液とした。
再分化した個体からDNAを抽出した。各形質転換体の評価は外来遺伝子としてカナマイシン耐性遺伝子を含有する個体を、カナマイシン耐性遺伝子の配列を特異的に増幅するプライマーTN5-1:CTCACCTTGCTCCTGCCGAGA(配列番号:3)、及びTN5-2:CGCCTTGAGCCTGGCGAACAG(配列番号:4)を用いてアニール温度55℃でPCR(30サイクル、タカラバイオ社 TakaraTaqを使用)を行うことで検出し、該再分化植物体が形質転換植物体か否かを確認できる。ゲノム編集個体の評価はヘテロ二本鎖移動度分析(HMA:Heteroduplex Mobility Assay)を用いた。SSR2遺伝子の標的配列を挟んだプライマーU1131:TCACATCTTTGGATTGTTCTCTG(配列番号:5)、及びU1017:TGGACCATAAATCATGCCTTC(配列番号:6)を用いてアニール温度55℃でPCR(35サイクル、タカラバイオ社 TakaraTaqを使用)を行いマイクロチップ電気泳動装置 MultiNA(島津製作所)で解析を行うことができる。再分化し供試した個体を確認することで、形質転換されていないがゲノム編集が起きている個体を得ることができる。また、品種の形質が維持され、同時に全アレルに変異が起き、かつ他の遺伝子に変異が入らず、かつステロイドグリコアルカロイドを極めて低下したジャガイモを得ることができる。
<223> 人工的に合成されたプライマー配列
Claims (2)
- ゲノム上の特定の遺伝子に変異が導入され、かつ、ゲノム上に外来遺伝子が組み込まれていないゲノム編集植物を生産する方法であって、
(a)ゲノム上の特定の遺伝子を標的化したゲノム編集酵素をコードする第1の遺伝子および植物の再分化を誘導または促進するタンパク質をコードする第2の遺伝子を発現する構築物を、植物細胞に導入する工程、
(b)工程(a)で得られた植物細胞を植物ホルモンを含まない培地で培養し、第1の遺伝子および第2の遺伝子が一過的に発現してゲノムに組み込まれていない個体を選抜するために、第2の遺伝子が恒常的に発現する再分化した個体を形態異常を指標に排除し、形態異常が生じていない個体を選抜する工程、ならびに
(c)工程(b)で選抜した第1の遺伝子および第2の遺伝子が一過的に発現してゲノムに組み込まれていない個体から、ゲノム上の特定の遺伝子に変異が導入されたゲノム編集個体を選抜する工程を、含み、
第2の遺伝子が、ipt遺伝子、bbm遺伝子、ESR1遺伝子、ESR2遺伝子、LEC2遺伝子およびWUS遺伝子からなる群より選択される遺伝子であり、
前記植物ホルモンが、オーキシンおよびサイトカイニンであり、かつ
前記形態異常が、節間の短縮、多芽体の形成及びカルスの形成から選択される、少なくとも1の形態異常である、方法。 - 工程(a)における構築物の植物細胞への導入がアグロバクテリウム法により行われる、請求項1に記載の方法。
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